UA130718C2 - Анти-tl1a/анти-tnf-альфа біспецифічні антигензв'язуючі білки та їх застосування - Google Patents

Анти-tl1a/анти-tnf-альфа біспецифічні антигензв'язуючі білки та їх застосування

Info

Publication number
UA130718C2
UA130718C2 UAA201911907A UAA201911907A UA130718C2 UA 130718 C2 UA130718 C2 UA 130718C2 UA A201911907 A UAA201911907 A UA A201911907A UA A201911907 A UAA201911907 A UA A201911907A UA 130718 C2 UA130718 C2 UA 130718C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antigen
antibody
binding
heavy chain
amino acid
Prior art date
Application number
UAA201911907A
Other languages
English (en)
Inventor
Хайлінг Хсю
Хайлинг Хсю
Гунасекаран Каннан
Кеннет В. Уокер
Мішель Хорттер
Мишель Хорттер
Едвард Дж. Белускі
Эдвард Дж. Белуски
Original Assignee
Амджен Інк.
Амджен Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US2016/052006 external-priority patent/WO2017049004A1/en
Application filed by Амджен Інк., Амджен Инк. filed Critical Амджен Інк.
Publication of UA130718C2 publication Critical patent/UA130718C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/66—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a swap of domains, e.g. CH3-CH2, VH-CL or VL-CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1058—Directional evolution of libraries, e.g. evolution of libraries is achieved by mutagenesis and screening or selection of mixed population of organisms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Винахід стосується антигензв’язувальних білків, специфічних для TL1A, способу їх отримання та їх застосування для лікування запального захворювання кишечнику, хвороби Крона або виразкового коліту.

Description

Перехресне посилання на спорідненні заявки
Ця заявка заявляє пріоритет заявки Мо РСТ/І52016/052006, поданої 15 вересня 2016 року, і попередніх заявок США Мо 62/268432, поданої 16 грудня 2015 року, і 62/333063, поданої 6 травня 2016 року. Кожна з вищевказаних заявок таким чином включена до цього документу шляхом посилання в повному обсязі.
Галузь техніки
Цей винахід відноситься до біофармацевтичних препаратів, зокрема до терапевтичних антигензв'язуючих білків, способів їх застосування, фармацевтичних композицій на їх основі і способів їх одержання. Зокрема, цей винахід відноситься до терапевтичних антигензв'язуючих білків, які здатні зв'язуватися з цитокінами ТІ1А і ТМЕ-с.
Короткий опис переліку послідовностей
До цього документу шляхом посилання в повному обсязі включений Перелік послідовностей під назвою «А-1937-М/О-РСТ 5Т25.хї», що містить від 5ЕО ІЮО МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 2136, який включає послідовності нуклеїнових кислот і/або амінокислотні послідовності, розкриті в цьому документі.
Перелік послідовностей поданий згідно з цим документом в текстовому форматі А5СІЇ через файлову систему ЕЕЗ і, таким чином, становить як паперову, так і машинозчитувану його форму. Перелік послідовностей був уперше створений із застосуванням Раїепіїп 22 листопада 2016 року і має розмір 3,45 МБ.
Рівень техніки
Цитокіни являють собою розчинні білки невеликого розміру, які опосередковують численні біологічні ефекти, що стосуються імунної системи. Такі біологічні ефекти включають індукцію проліферації, розвитку, диференціації і/або міграції імунних клітин; регулювання росту і диференціації багатьох типів клітин; запальну відповідь через локальне або системне накопичення імунних клітин; і дії по захисту хазяїна. Див., наприклад, Агаї еїаїЇ., Аппи. Кеу. Віоспет. 59: 783 (1990); Мозтапп, Ситгт. Оріп. Іттипої. 3: 311 (1991); Раші еї аї., СеїІ, 76: 241 (1994)). Такі імунні ефекти можуть спричиняти патологічні наслідки, коли ефект призводить до надмірного і/або хронічного запалення, як при аутоімунних розладах (таких як множинний склероз) і ракових/неопластичних захворюваннях. Оррепнеїт еї аї., едв., СуюоКіпе Веїегепсе, Асадетіс Ргез5, Зап Оіедо, Саїїї. (2001); моп Апаїгіап еї аї., Мем Еподі. У. Меад., 343: 1020 (2000); баміазоп еї а!., Мем Епаї. У. Мей., 345: 340 (2001); и еї аї., Мої. Сапсег Везв., 4:221 (2006); Ваїдівїзн еї а!., Сапсег Тгеаї Нез., 130: 1 (2006).
ТИТА (ТМЕ5Е15) являє собою цитокін, член родини ТМЕ-со, який бере участь в активації Т-клітин (Віснага еї аї., ) ГешКос Віої. 2015 бер, 98(3): 333-45). Це ліганд для Юеаїй Кесеріог З (ОКЗ), також відомого як ТМЕКЗЕ25. ТІ1А в основному експресується на низькому базальному рівні в моноцитах, дендритних клітинах і ендотеліальних клітинах, але високою мірою індукується після стимуляції імунним комплексом та цитокінами і мікробами. У декількох дослідженнях, присвячених повногеномному пошуку асоціацій, ПГПА (СБУМА5), був продемонстрований однонуклеотидний поліморфізм, ОНП (ЗМР) ТІ1ТА, пов'язаний з хворобою Крона в різних етнічних групах. Крім того, повідомлялося про зв'язок ОНП ТІЛА, що асоціюються з ризиком запального захворювання кишечнику, ЗЗК (ІВО), зі ступенем тяжкості хвороби Крона (Нігапо, ІВО 19: 526, 2013). У доклінічних дослідженнях введення білка ТІ ТА погіршувало розвиток коліту у схильних до коліту мишей тата -/-, але не у мишей дикого типу. В цілому дані про геном людини та дані доклінічної моделі коліту демонструють, що ТІ1А відіграє важливу роль в розвитку ЗЗК, і його блокування буде здійснювати сприятливий вплив при лікуванні ЗЗК.
Фактор некрозу пухлини о(ТМЕ-о) являє собою цитокін, який бере участь в регуляції різних фізіологічних і патологічних процесів (Виейег, еї аї., У Кпештайо! Зиррі. 57: 16-21, 1999). Вони пов'язані з регресією пухлин, септичним шоком, кахексією і рядом запальних та аутоїмунних станів. Егапзеп еї а. (червень 1985 г.), «МоЇІесцшіаг сіопіпд ої тойзе їшШтог песгов5із Тасіогї СОМА апа й5 еиКагуойс ехргезвіоп», Мисівеіс Асід5 Кев5. 13 (12): 4417-29; Кпедіег еї а. (Арг! 1988), «А поме! Тогт ої ТМЕ- о/саснпесіїп і5 а сеї! зипїасе суїїюхіс іапотетбгапе ргоївіп: гатіїйсайоп5 Тог Ше сотріех рпузіоіоду ої
ТМЕ-о», Сеїї! 53 (1): 45-53. Інгібітори ТМЕ-с являють собою клас терапевтичних засобів, схвалених для лікування ревматоїдного артриту, псоріатичного артриту, ювенільного ідіопатичного артриту, анкілозивного спондилоартриту, бляшкового псоріазу, хвороби Крона і виразкового коліту (Зеїйі еї аї.,
Айм Ехр Мей Віої. 2009; 647: 37-51). Інгібітори ТМЕ-х включають етанерсепт, адалімумаб, сертолізумаб пегол, інфліксимаб і голімумаб.
Близько 50 95 пацієнтів відповідають на лікування інгібіторами ТМРЕ. Однак тільки у близько 40 95 із цих пацієнтів відповідь зберігається після одного року лікування. Тому існує нагальна потреба у терапевтичних засобах з більш вираженим ефектом і довготривалою відповіддю. Ми висуваємо гіпотезу про те, що спрямована дія на більшу кількість запальних шляхів, таких як ТМЕ ї ТІЛА, ймовірно, приведе до збільшення ступеня вираженості ефекту з передбаченим профілем безпечності.
Короткий опис суті винаходу
Цей винахід відноситься до розробки антигензв'язуючих білків, особливо повністю людських антитіл, які специфічно зв'язуються з ТІ 1А. Переважні антигензв'язуючі білки мають високу афінність зв'язування з ТІ1А людини і яванського макака і блокують опосередковану ТІ1ТА активацію МЕ-КВ і активацію Т-клітин. Зазначені антигензв'язуючі білки можна застосовувати як терапевтичні засоби для лікування запального захворювання кишечнику (ЗЗК) та інших аутоімунних і запальних станів.
Винахід додатково відноситься до біспецифічних антигензв'язуючих білків, особливо до біспецифічних антитіл. Біспецифічні антигензв'язуючі білки за винаходом містять одиницю, що зв'язується з ТІ1А, і одиницю, що зв'язується з ТМЕ-сх. Блокуючі ТІ1А білки і блокуючі ТМЕ-о; білки здійснюють різний вплив у дослідженнях, в яких вимірюють інгібування індукції цитокінів ІЕМУу, ПІ -5, ЇЇ - б, 1-8 і 11-10. ТІ1А, але не ТМЕ-с, індукує активацію Т-клітин іп мімо. ТІТА і ТМЕ-с індукують МЕ-кВ в різних типах клітин у моноцитах периферичної крові людини, МПК (РВМО). Крім того, ТІЛА ії ТМЕ-о; індукують різні цитокіни в МПК людини. ТІЛА ії ТМЕ-о індукують деякі з одних і тих же генів, але в різних типах клітин (16 генів, що перекриваються, індуковані ТІ ТА в суцільній крові і ТМЕ-о в клітинах
МОМ460, 13 генів, що перекриваються, індуковані ТІЛА в суцільній крові і ТМЕ-осх в МПК). Існує виражений генетичний зв'язок між ТІ ТА і запальним захворюванням кишечнику (ЗЗК), причому агенти проти ТМЕ клінічно валідовані для лікування ЗЗК. Зазначені біспецифічні антигензв'язуючі білки, таким чином, є придатними для лікування ЗЗ3К та інших аутоїмунних і запальних станів. З цих та інших причин біспецифічні антигензв'язуючі білки, які специфічно зв'язуються з ТІТА і ТМЕ-о, є переважними.
Одним з форматів таких біспецифічних антигензв'язуючих білків є гетеродимерні імуноглобуліни (гетеро Ід). Такі антигензв'язуючі білки гетеро Ід містять одну пару важкого ланцюга-легкого ланцюга, що спрямовано діє на ТІ ТА, та іншу, що спрямовано діє на ТМЕ-с.
Іншим форматом таких біспецифічних антигензв'язуючих білків є молекули ІдО-5сЕмУ. У Ідб-5сЕм кожен важкий ланцюг антитіла, яка специфічно зв'язується з однією мішенню, з'єднаний з одноланцюговим антитілом (зсЕм), яке специфічно зв'язується з іншою мішенню. Частина зсЕм може бути з'єднана з важким ланцюгом частини ІдсС безпосередньо або через пептидний лінкер. У форматі
Ідй-5сЕм дб спрямовано діє на ТІ1А, а частина 5сЕм - на ТМЕ-о, або навпаки. Біспецифічні антигензв'язуючі білки в форматі Ідо-5сЕм мають перевагу бівалентності по відношенню до їх цільових антигенів.
Додатковим форматом таких біспецифічних антигензв'язуючих білків є молекули ІЇдО-Раб. У цьому форматі антигензв'язуючий білок має таку структуру, що молекула Бар, що зв'язується з однією мішенню, поєднана з кожним важким ланцюгом молекули Ідс, що зв'язується з іншою мішенню. Один ланцюг частини Баб може бути з'єднаний, безпосередньо або через пептидний лінкер, із С-кінцем важкого ланцюга частини дб. Одержана молекула має перевагу чотирьохвалентності і біспецифічності. Всі варіації формату ІдДс-Бар переважно містять послідовності СОК з Табл. 21.2А і 21.28, наведених нижче. Переважні послідовності важкого і легкого ланцюгів молекул Ідс-Рар представлені у Табл. 21.1 нижче.
Інші формати біспецифічних антигензв'язуючих білків також включені до цього винаходу. Одним з таких форматів є молекули Ідо-Раб. У цьому форматі кожен важкий ланцюг антитіла, що специфічно зв'язується з однією мішенню, з'єднаний з фрагментом ЕБаб, що специфічно зв'язується з іншою мішенню. У форматі Ідо-Раб Ідс спрямовано діє на ТІ ТА, а частина Раб - на ТМЕ-с, і навпаки.
Біспецифічні антигензв'язуючі білки в форматі Ідс-Бар мають перевагу бівалентності по відношенню до їх цільових антигенів. Інші формати біспецифічних антигензв'язуючих білків, включені до цього винаходу, описані нижче.
Крім того, винахід відноситься до виділених нуклеїнових кислот, які кодують ТІТА-специфічні антигензв'язуючі білки за винаходом, а також до векторів, що містять нуклеїнові кислоти, клітин-хазяїв, що містять вектори, і способів одержання та застосування ТіІЛ1А-специфічних антигензв'язуючих білків.
Винахід додатково відноситься до виділених нуклеїнових кислот, які кодують біспецифічні антигензв'язуючі білки за винаходом, а також до векторів, що містять нуклеїнові кислоти, клітин-хазяїв, що містять вектори, і способів одержання та застосування біспецифічних антигензв'язуючих білків.
В інших варіантах реалізації цей винахід відноситься до композицій, які містять ТІ 1А-специфічні антигензв'язуючі білки, біспецифічні антигензв'язуючі білки, і набори, що містять анти-Т/ТА або біспецифічні антигензв'язуючі білки, а також промислових виробів, що містять анти-ТІ/1А або біспецифічні антигензв'язуючі білки.
ТІ ТА-специфічні антигензв'язуючі білки і біспецифічні антигензв'язуючі білки, описані в цьому документі, можна застосовувати для виготовлення фармацевтичних композицій або лікарських засобів для лікування станів, пов'язаних з ТІ 14, і/або, в разі біспецифічних антигензв'язуючих білків, станів, пов'язаних з ТМЕ-х. Таким чином, в даному винаході додатково пропонуються фармацевтичні композиції що містять ТІ ТА-специфічний антигензв'язуючий білок або біспецифічний антигензв'язуючий білок і фармацевтично прийнятний розчинник, допоміжну речовину або носій.
Крім того, винахід відноситься до способів лікування із застосуванням Ті 1А-специфічних антигензв'язуючих білків. ТІ ТА-специфічні антигензв'язуючі білки за цим винаходом є придатними для інгібування прозапальних цитокінів ТІ 1А. Антитіла можна застосовувати для зменшення, обмеження, нейтралізації або блокування прозапальних ефектів ТІ1А. Таким чином, у деяких варіантах реалізації винахід відноситься до лікування ЗЗК та інших аутоїмунних або запальних станів із застосуванням
ТІТА-специфічних антигензв'язуючих білків.
Винахід додатково відноситься до способів лікування із застосуванням біспецифічних антигензв'язуючих білків. Біспецифічні антигензв'язуючі білки за цим винаходом придатні для інгібування прозапальних цитокінів, ТІ1А ії ТМЕ-с. Біспецифічні зв'язуючі білки можна застосовувати для зменшення, обмеження, нейтралізації або блокування прозапальних ефектів ТІ/ТА. Подібним чином, біспецифічні антигензв'язуючі білки можна застосовувати для зменшення, обмеження, нейтралізації або блокування прозапальних ефектів ТМЕ-осх. Таким чином, у деяких варіантах реалізації винахід відноситься до лікування ЗЗК та інших аутоїмунних або запальних станів із застосуванням ТІ Т1А-специфічних/ МЕ-специфічних антигензв'язуючих білків.
Короткий опис графічних матеріалів
На Фіг. 1 наведено схематичне зображення чотирьох форматів біспецифічних гетеро-Ід, що застосовуються для генерації анти-ТІ1А/анти-ТМЕ-о біспецифічних антигензв'язуючих білків. Як проілюстровано, важкий ланцюг, що спрямовано діє на один антиген, з'єднаний дисульфідним зв'язком з важким ланцюгом, що спрямовано діє на інший антиген. Легкий ланцюг для кожного антигену з'єднаний дисульфідним зв'язком з важким ланцюгом для відповідного антигену. На Фіг. 1 зображений переважний варіант реалізації винаходу, в якому важкий і легкий ланцюги містять зарядові мутації, що сприяють правильній асоціації важких і легких ланцюгів. Схема нумерації за
Кабатом-БІШ застосовується для позначення положення мутацій зарядових пар у кожному з ланцюгів і для всіх послідовностей в цьому документі. Зазначений формат Ідс-подібного біспецифічного антигензв'язуючого білка являє собою гетеротетрамер, що містить два різних легких ланцюги і два різних важких ланцюги. НОСІ і ЇС1 відносяться до важкого ланцюга і легкого ланцюга, відповідно, одного зв'язуючого плеча Раб, а НС2 ії 102 відносяться до важкого ланцюга і легкого ланцюга, відповідно, другого зв'язуючого плеча Бар. Наприклад, схематично, НС1 іЇїС1 відповідають зв'язуючому плечу проти рецептора ТІЛА, а НС2 і І С2 відповідають зв'язуючому плечу проти ТМЕ-с.
Однак два зв'язуючих плеча можна перемикати таким чином, що НС1 і ЇС1 будуть відповідати зв'язуючому плечу проти ТМЕ-с, а НС2 і ГС2 будуть відповідати зв'язуючому плечу проти рецептора
ТІЛА.
На Фіг. 2 наведено схематичне зображення формату Ідб-5сЕм, що застосовується для генерації анти-ТІ Т1А/анти-ТМЕ-с біспецифічних антигензв'язуючих білків. Як проілюстровано, структура включає повний тетрамерний дб, що спрямовано діє на один антиген. Одноланцюговий варіабельний фрагмент (з5сЕм), який містить варіабельні домени з другого антитіла, з'єднані разом гліцин-сериновим лінкером, злитий з карбоксильним кінцем важкого ланцюга першого антитіла через пептидний лінкер з утворенням модифікованого важкого ланцюга. Хоча проілюстрована орієнтація МН-МІ. варіабельних доменів у зсЕм, варіабельні домени також можуть бути організовані в орієнтації МІ -МН. Повнорозмірна молекула являє собою мультимер, що містить два важких ланцюги (але одну унікальну послідовність важкого ланцюга) і два легких ланцюги (але одну унікальну послідовність легкого ланцюга) з першого антитіла.
Фіг. З відноситься до афінної хроматографії Марзеїесї ЗиКе анти-ТІ ТА/анти- ГМЕ-о-гетеро-Ід. На ній зображена типова хроматограма визначення афінного захоплення на білку А методом рідинної експрес-хроматографії білків, РЕХБ (ЕРІ С) для анти-ТІ ТА/анти-ТМЕ-ос гетеро-Ід. Білок елюювали із ступінчастим градієнтом 100 мМ оцтової кислоти (провідність: чорний слід, пунктир), рН 3,6, і об'єднували в пул на базі А280 (чорний слід, тверда речовина).
На Фіг. 4 зображена типова хроматограма з високою роздільною здатністю очищення на сефарозі методом РЕХБ з сильною катіонообмінною колонкою (5Р) для анти-ТІ ТА/анти- ТМЕ-о гетеро-Ід. Білок елюювали із зростаючим градієнтом солі (провідність: чорний слід, пунктир) і об'єднували в пул на базі профілю елюації А280 (чорний слід, тверда речовина) і аналізу фракцій за допомогою Саїїірег
Гарснпір.
На Фіг. 5 зображена типова хроматограма з високою роздільною здатністю очищення на сефарозі методом РЕХБ 5Р для анти-ТІА/анти-ТМЕ-х гетеро-Ід. Білок елюювали із градієнтом амоній сульфату, що знижується (провідність: чорний слід, пунктир), і об'єднували в пул на базі профілю елюації А280 (чорний слід, тверда речовина) і аналізу фракцій за допомогою Саїїрег Гарспір.
Фіг. 6 відноситься до аналізу Саїїрег Т/ЛА/ТМЕ-о; гетеро-Ід. На ній зображений невідновлювальний і відновлювальний аналіз Саїїрег для анти-ТІ ТА/анти- ТМЕ-о; гетеро-1д.
Фіг. 7 відноситься до аналізу методом ексклюзійної ВЕРХ (ЗЕ-НРІ С) анти-ТІТА/анти- ГМЕ-о; гетеро-Ід. На ній зображена ексклюзійна хроматографія на 30 мкг кінцевого антитіла проти ТІ Т1А/анти-
ТМЕ-о гетеро-Ід, інжектованого на колонку Зерах 7епіх-С 5ЕС-300 (7,8 х 300 мм) в 50 мМ МаНгРо», 250 мМ масі, рН 6,9, при 1 мл/хв, з реєстрацією поглинання на довжині хвилі 280 нм (чорний слід).
Фіг. 8 відноситься до РХ-МС (І С-М5) невідновленого гетеро-Ід (теоретична маса: 145495 Да). На
Фіг. 8 зображений аналіз маси 20 мкг невідновленого анти-ТІ ТА/анти- ТМЕ-ос гетеро-Ід, елюйованого обернено-фазовою ВЕРХ з градієнтом, із застосуванням колонки Адііепі 7ограх 30058-28 (2,1 х 50 мм 3,5 мкм) і рухомих фаз 0,1 95 ТФУ і 90 95 н-пропанолу/0,1 95 ТФУ (рухомі фази А і В, відповідно), обладнаної мас-спектрометром Адіепі 6230 для часопролітної мас-спектроскопії з іонізацією електророзпиленням, ІЕР-ЧП (ЕБ5І-ТОРЕ).
На Фіг. 9 зображений аналіз маси 20 мкг Т/ЛА/ТМЕ-сх гетеро-Ід після обмеженого розщеплення лізилендопротеїназою С протягом 30 хвилин в 100 мМ ТРИС, рН 8. Обернено-фазову ВЕРХ проводили із застосуванням колонки Адіїепі 7ограх 30058-С8 (2,1 х 50 мм 3,5 мкм) і рухомих фаз 0,1
Фо ТФУ ї 90 95 н-пропанолу/0,1 95 ТФУ (рухомі фази А і В, відповідно) з детектуванням маси на мас- спектрометрі Адіїепі 6230 ІЕР-ЧП. Теоретична маса для ТІ1А Раб, ТМЕ Раб і Ес становить 47350 Да, 48002 Да і 50175 Да, відповідно.
Фіг. 10 відноситься до афінної хроматографії Марзеїесї ЗиКе анти-ТІ ТА/анти- ТМЕ-с Ід(-5сЕм. На ній зображена типова хроматограма визначення афінного захоплення на білку А методом РЕХБ для анти-ТІ ТА/анти-ТМЕ-с ІдДа-5сРу. Білок елюювали із ступінчастим градієнтом 100 мм оцтової кислоти, рН 3,6, і об'єднували в пул на базі А280 (чорний слід).
Фіг. 11 відноситься до хроматографії з високою роздільною здатністю очищення на сефарозі 5Р для анти-ТІ ТА/анти- ТМЕ-с ІдДС-5сЕУ. На ній зображена типова хроматограма очищення методом РЕХБ зирегдех 200 для анти-ТІ 1А/анти- ТМЕ-о; ІДа-5СЕм. Білок елюювали з ізократичним градієнтом буфера і об'єднували в пул на базі профілю елюації А280 (чорний слід) і аналізу фракцій ексклюзійною ВЕРХ.
На Фіг. 12 зображений невідновлювальний і відновлювальний аналіз Саїїрег для анти-ТІ 1А/анти-
ТМЕ-о ІдДО-5сЕм.
Фіг. 13 відноситься до аналізу анти-ТІ ТА/анти- ТМЕ-с ІдДС-5сЕм методом ексклюзійної ВЕРХ. На ній зображена ексклюзійна хроматографія на 30 мкг кінцевого продукту анти-ТІ ТА/анти- ТМЕ-о ІдДС-5СЕм, інжектованого на колонку Зерах 7епіх-С 5ЕС-300 (7,8 х 300 мм) в 50 мМ МаНегРоОх», 250 мм Масі, рн 6,9, при 1 мл/хв, з реєстрацією поглинання на довжині повні 280 нм.
Фіг. 14 відноситься до розщеплення протеазою Іде Ід-5сЕм. На ній зображений аналіз маси на 20 мкг Ід-5сЕм із застосуванням розділення обернено-фазовою ВЕРХ на колонці Адііепі 7ограх 30058 (2,1 х 50 мм, 3,5 мкм) з рухомими фазами 0,1 95 ТФУ ії 90 95 н-пропанолу/0,1 95 ТФУ (рухомі фази А і В, відповідно) і детектування на мас-спектрометрі Адіїепї 6230 ІЕР-ЧП.
На Фіг. 15 зображено генотипування ОНП ТІ ТА. Щоб оцінити потенційний зв'язок генотипу ТІЛА з експресією, геномну ДНК (ГДНК) виділяють з МПК (РВМС) здорових донорів із застосуванням набору
Сепіга Ригедепе Тіззцие виробництва Оіадеп. Геномну ДНК генотипують із застосуванням аналізів генотипування ОНП ТадМап для г57848647, г56478109, г56478108 і г53810936 аналізів виробництва
ІетТесі і стандартних протоколів на платформі цифрової крапельної ПЛР Віо-Кай. Донорів відносять до гомозиготного гаплотипу ризику, якщо тільки алелі ризику присутні у всіх 4 генотипованих ОНП (гї5:7848647, г56478109, г56478108 і г53810936). Донорів відносять до гомозиготного безризикового гаплотипу, якщо у всіх 4 генотипованих ОНП присутні тільки безризикові алелі. Донорів відносять до гетерозиготного гаплотипу, якщо як алелі ризику, так і безризикові алелі присутні у всіх 4 генотипованих ОНП. У донорів, яких відносять до «рекомбінантних», присутні тільки гомозиготні алелі ризику в г57848647, 56478109 і г56478108, але вони є гетерозиготними (присутні алелі ризику і безризикові алелі) за 53810936.
На Фіг. 16А і 168 зображена більш висока кратність індукції алелем ризику ТІ1А, в порівнянні з безризиковим алелем, в дослідженні гетерозиготних МПК ГКІ. Частоту використання алелів ризику проти безризикових алелів у гетерозиготних МПК на базальному рівні або після стимуляції імунним комплексом в різні моменти часу досліджують методом цифрової крапельної ПЛР (цкПЛР) із застосуванням синонімічних ОНП (153810936) алельспецифічних флуоресцентних зондів.
Співвідношення експресії алелів обчислюють шляхом поділу кількості копій алеля ризику/мл на кількість копій безризикового алеля/мл. Загальну кількість копій кожного алеля нормують за кількістю
КДНК на вході (кількість копій/нг), а кратність індукції для кожного алеля в кожен момент часу обчислюють шляхом поділу кількості копій/нг в момент часу, що представляє інтерес, на початкову кількість копій/нг (0 годин).
На Фіг. 17 проілюстровано, що ОНП ТІТА в промоторі та інтроні вносять вклад в регулювання дисбалансу алельної експресії. Винахідник(-и) ідентифікував(-ли) невелику кількість донорів, гомозиготних за алелями ризику в г57848647, г56478109 і геб6478108, але гетерозиготних за г53810936, ймовірно, через рекомбінації між г56478109 і синонімічним ОНП г53810936. Частоту використання алелів ризику проти безризикових алелів в гетерозиготних або рекомбінантних донорських МПК вивчали методом цифрової крапельної ПЛР (цкПЛР) із застосуванням синонімічних ОНП (53810936) алельспецифічних флуоресцентних зондів. У порівнянні з гетерозиготними донорами, у таких рекомбінантних індивідуумів до або після стимуляції імунним комплексом не було виявлено дисбалансу експресії алелів.
На Фіг. 18А і 188 проілюстровано, що ОНП ризику ТІ1ТА пов'язані з експресією локусів кількісних ознак (еЛКО). Донорам МПК з гомозиготним алелем ризику ТІТА, гомозиготними безризиковими алелями або гетерозиготними алелями вводили імунний комплекс. Загальну експресію ТІЛА (ТМЕ5Е15) у кожного донора визначають за допомогою цифрової ПЛР. Якщо коротко, КкДНК з кожного зразка змішують з ЯаРСК Зирептіх для зондів (Віо-Кай) і аналізом РіітеТітеб (кКПЛР) ІЮ
Неь.РТ.5ба.41003970. Краплі генерують для кожної реакції за допомогою генератора крапель ОХТО0 ТМ (Віо-Каад) і піддають циклічній термообробці на термоблоці для проведення реакцій С1000О Тоисп м (Віо-Кад). Після ампліфікації флуоресценцію крапель зчитують на крапельному зчитувачі ОХ100 ТМ (Віо-Кад). Дані аналізують із застосуванням програмного забезпечення Оцапіабой (Віо-Кад), а кількість копій ТІ Т1А/мкл визначають і нормують за кількістю кКДНК на вході (кількість копій/нг).
Значення Р для відмінностей у рівнях експресії ТІ1А між різними гаплотипами ТМЕ5Е15 визначають із застосуванням І-критерію Стьюдента. На базальному рівні, МПК донорів, гомозиготних за ОНП ризику
ТІЛА, містять менше мРНК ТІ ТА в порівнянні з гомозиготними безризиковими донорами. Однак після стимуляції імунним комплексом в МПК донорів, гомозиготних за ОНП ризику ТІ1А, присутня більш висока експресія ТІ 1А в порівнянні з гомозиготними безризиковими донорами.
На Фіг. 19А і 198 зображена специфічна для клітинного типу регуляція дисбалансу експресії алелів синонімічного ОНП ТІТА. Клітини НОМЕС від різних донорів генотипують, як було описано раніше.
Генотиповані клітини НОМЕС від різних донорів обробляють ІЇ/-1 в різні моменти часу. Загальну кількість копій кожного алеля вимірюють, як було описано раніше. Співвідношення експресії алелів обчислюють шляхом поділу кількості копій алеля ризику/мл на кількість копій безризикового алеля/мл.
У клітинах НОМЕС з обробкою або без обробки ІІ -1 дисбаланс експресії алелів не спостерігався.
На Фіг. 20А ї 208 проілюстровано, що профілактичне лікування моноклональним антитілом проти
ТІЛА інгібує розвиток спонтанного коліту у мишей тага-/-. Миші (п - 10, вік 6-7 тижнів) були рандомізовані в різні групи і одержували внутрішньоочеревинно один раз в тиждень 500 мкг антитіла проти мишачого ТІ1А, антитіла проти І/23р19, антитіла проти мишачого І/17КА або мишачого контрольного ізотипу або не одержували нічого один раз на тиждень протягом 8 тижнів. Моніторинг активності клінічного захворювання проводять шляхом оцінки анального запалення і консистенції випорожнень. Зрізи кишечнику піддають гістопатологічному аналізу. Статистичний аналіз проводять із застосуванням одностороннього дисперсійного аналізу (АМОМА) з критерієм Даннетта в порівнянні з групою тідс1.
На Фіг. 21А і 218 проілюстровано, що ТІ1А погіршує коліт у мишей тапахт. Мишам тага-/- або контрольним мишам дикого типу у віці 6-8 тижнів вводять внутрішньоочеревинно один раз в тиждень 150 мкг рекомбінантного гібридного білка тЕс-ТІ 1А або контрольний ізотип тричі на тиждень протягом 4 тижнів. Моніторинг активності клінічного захворювання проводять шляхом оцінки анального запалення і консистенції випорожнень, як було описано раніше. Через 4 тижні лікування мишей умертвляють, зрізи кишечнику піддають гістопатологічному аналізу. Статистичний аналіз проводять із застосуванням одностороннього АМОМА з критерієм Даннетта в порівнянні з групою тідс1.
На Фіг. 22А-22Е проілюстровано підвищену кількість запальних клітин у зразках власної пластинки слизової оболонки мишей таї"а-/-, яким вводили Ес-ТІ ТА. Мишам таїга-/- або контрольним мишам дикого типу у віці 6-8 тижнів вводять внутрішньоочеревинно один раз на тиждень 150 мкг рекомбінантного гібридного білка тЕс-ТІТА або контрольний ізотип тричі на тиждень протягом 4 тижнів. Лімфоцити власної пластинки слизової оболонки виділяють, фарбують щодо поверхневих антигенів і аналізують методом проточної цитометрії (ЕАС5). Введення ТІЛА мишам тапмпа-/- призводить до підвищення кількості запальних клітин у власній пластинці слизової оболонки.
На Фіг. 23А-23Е проілюстрована чітко виражена індукція цитокінів у мишей при введенні ТІЛА і
ТМЕ. Щоб оцінити, чи призводить введення ТІ1А і ТМЕ до подібних або різних фармакодинамічних ефектів, мишам С57В1І/6Є (8 тижнів, самки) спочатку вводять внутрішньоочеревинною ін'єкцією 500 мкг/мишу антитіла проти мишачого ТІ14А, антитіла проти мишачого ТМЕ-сх або фосфатно-сольового буфера, ФСБ (РВ5). Через 4 години мишам вводять 100 мкг/мишу ТІЛА або 10 мкг/мишу ТМЕ-с або залишають без введення. Сироватку одержують через 24 години. Цитокіни вимірюють за допомогою мас-селективного детектора, МСД (М50) (1-22 вимірюють за допомогою імуноферментного аналізу.
ІФА (ЕГІЗА)).
На Фіг. 24А-24Е проілюстрована чітко виражена індукція цитокінів в МПК людини при обробці ТІ 1А і ТМЕ. Свіжовиділені МПК з крові людини культивують в середовищах (КРМІ1640 з додаванням 10 95 сироватки телячого ембріона (СТЕ), 2 мМ глютаміну, 1 мМ натрій пірувату, 5 х 10-5 М 2-МЕ і антибіотиків) в присутності 100 нг/мл Т/1ТА або ТМЕ-а людини. Супернатант збирають через 72 години.
Цитокіни в супернатанті вимірюють за допомогою МОД (1-22 вимірюють за допомогою ІФА).
На Фіг. 25 зображено схематичне представлення формату біспецифічного Ідо-Рабр для анти-ТІ Т1А- анти-ТМЕ-о біспецифічного антигензв'язуючого білка згідно з цим винаходом. У цьому форматі один поліпептидний ланцюг фрагмента Раб з другого антитіла (наприклад, важкий ланцюг (МН2-СНІ1)
поєднаний з карбоксильним кінцем кожного важкого ланцюга першого антитіла через пептидний лінкер, з утворенням модифікованого важкого ланцюга. Повнорозмірна молекула являє собою гомогексамер, що містить два модифікованих важких ланцюги, два легких ланцюги з першого антитіла і два поліпептидних ланцюги, що містять другу половину фрагмента Раб з другого антитіла (наприклад, легкий ланцюг (МІ 2-1 )).
Мутації зарядових пар (представлені колами) можуть бути введені в ділянки баб першого антитіла (Раб 1) і/або другого антитіла (баб 2) для сприяння правильному спаровуванню важкого ланцюга- легкого ланцюга.
На Фіг. 26 зображено схематичне представлення формату біспецифічного Ідо-Рабр для анти-ТІ Т1А- анти-ТМЕ-о біспецифічного антигензв'язуючого білка в відповідно до цього винаходу із застосуванням кросовера доменів імуноглобуліну. у цій варіації формату Ідб-Бар один поліпептидний ланцюг фрагмента Раб з другого антитіла (наприклад, важкий ланцюг (МН2-СНІ)) злитий через пептидний лінкер з карбоксильним кінцем важкого ланцюга, що містить СІ. замість домену СНІ першого антитіла, з утворенням модифікованого важкого ланцюга. Таким чином, домени СНІ і Сі з Раб 1 «поміняні місцями». Така зміна місць називається «обміном Барбі» або М-кінцевим обміном. Повнорозмірна молекула являє собою гомогексамер, що містить два модифікованих важких ланцюги, два легких ланцюги з першого антитіла, що містять домен СНІ замість домену СІ, їі два поліпептидних ланцюги, що містять другу половину фрагмента Раб з другого антитіла (наприклад, легкий ланцюг (МІ 2-СІ)).
Мутації зарядової пари (представлені колами) можуть бути введені в ділянки Гар першого антитіла (Раб 1) і/або другого антитіла (Раб 2), для сприяння правильному спаровуванню важкого ланцюга- легкого ланцюга. Не зображені, але також включені до цього винаходу молекули Ідс-Раб, в яких (Її) домени СНІ і СІ Раб 2 поміняні місцями замість Раб 1 (в цьому документі називається обміном Раб 2 або С-кінцевим обміном) або (ії) поміняні місцями як домени СНІ і СІ. Раб 1, так і домени СНІ і СІ. Бар 2 (в цьому документі називається подвійним обміном).
На Фіг. 27 зображено порівняння титру експресії Ї(до-Раб на базі формату обміну доменів.
На Фіг. 28 зображене порівняння титру експресії І(до-РаБ на базі типу мутації(-й) зарядової пари.
На Фіг. 29 зображено порівняння чистоти Ідо-Раб на базі формату обміну доменів.
На Фіг. 30 зображено порівняння анти-ТІ 1А активності Ідо-Раь на базі формату обміну доменів.
На Фіг. 31 зображено порівняння анти- ТМЕ-о активності Ідо-Раб на базі формату обміну доменів.
ІО0О51| На Фіг. 32 зображено порівняння анти-ТІ ТА активності (9-Баб на базі типу мутації(-й) зарядової пари. 0052 На Фіг. 33 зображено порівняння анти-ТМЕ-ох активності (Д0-Рар на базі типу мутації(-й) зарядової пари.
Детальний опис винаходу
Визначення термінів
В подальшому описі широко використовується ряд термінів. Для полегшення розуміння винаходу наведені наступні визначення.
Якщо в тексті прямо не вказано зворотне, то форма однини іменників і вираз «щонайменше один» використовуються взаємозамінним чином і означають один або більшу кількість. «Зв'язуюча одиниця», як використовується в цьому документі, означає будь-який мономерний або мультимерний білок або фрагмент білка, який специфічно зв'язується із зазначеним цільовим антигеном. Термін «зв'язуюча одиниця» включає, але не обмежуючись цим, антитіла і їх зв'язуючі частини, такі як імунологічно функціональні фрагменти. Пептитіла і пептиди являють собою інші приклади зв'язуючих одиниць. Термін «імунологічно функціональний фрагмент» (або просто «фрагмент») зв'язуючої одиниці антитіла або імуноглобулінового ланцюга (важкий або легкий ланцюг), як використовується в цьому документі, являє собою вид зв'язуючої одиниці, що містить частину (незалежно від того, яким чином ця частина одержана або синтезована) антитіла, яка не містить щонайменше деяких амінокислот, присутніх в повнорозмірному ланцюгу, але яка все ще здатна специфічно зв'язуватися з антигеном. Такі фрагменти є біологічно активними в тому відношенні, що вони зв'язуються з цільовим антигеном і можуть конкурувати з іншими зв'язуючими одиницями, включаючи інтактні антитіла, за зв'язування з конкретним епітопом. У деяких варіантах реалізації винаходу фрагменти є нейтралізуючими фрагментами. У деяких варіантах реалізації винаходу фрагменти можуть блокувати або зменшувати ймовірність взаємодії між цільовим антигеном (ТІЛА або ТМЕ-о) і його рецептором. В одному аспекті такий фрагмент зберігає щонайменше одну ділянку визначення комплементарності (СОК), присутню в повнорозмірному легкому або важкому ланцюгу, а в деяких варіантах реалізації винаходу буде містити один важкий ланцюг і/або легкий ланцюг або його частину. Ці біологічно активні фрагменти можуть бути одержані методами рекомбінантних ДНК або можуть бути одержані шляхом ферментативного або хімічного розщеплення зв'язуючих молекул, включаючи інтактні антитіла. Імунологічно функціональні фрагменти імуноглобуліну включають, але не обмежуючись цим, Раб, діатіло (варіабельний домен важкого ланцюга в тому ж поліпептиді, що і варіабельний домен легкого ланцюга, з'єднані за допомогою короткого пептидного лінкера, що є занадто коротким, щоб забезпечити спаровування міх двома доменами в одному ланцюгу), Раб,
К(аб)2, Гм, доменні антитіла і одноланцюгові антитіла і можуть бути одержані з будь-якого ссавцевого джерела, включаючи, але не обмежуючись цим, людину, мишу, щура, верблюда або кролика. Крім того, передбачається, що функціональна частина зв'язуючих молекул, розкритих в цьому документі, наприклад, один або більша кількість СОК, може бути ковалентно зв'язана з другим білком або із молекулою невеликого розміру з одержанням терапевтичного агента, що спрямовано діє на конкретну мішень в організмі, який володіє біфункціональними терапевтичними властивостями або пролонгованим періодом напіввиведення із сироватки. Як буде зрозуміло фахівцю в цій галузі техніки, зв'язуюча молекула може містити небілкові компоненти. У деяких розділах цього документа приклади зв'язуючих молекул названі в цьому документі в термінах «число/літера/число» (наприклад, 2383), причому деякі зв'язуючі молекули додатково ідентифіковані за допомогою додаткових комбінацій літер/цифр (наприклад, МН4). У цих випадках точне позначення означає конкретне антитіло. Тобто, зв'язуюча молекула з назвою 2383 може володіти певною мірою ідентичності послідовності, але не співпадає з антитілом, названим 2383 МН4А (якщо тільки вони не були чітко позначені в описі як однакові). «Одиниця, що зв'язується з ТІ 1А» являє собою зв'язуючу одиницю, що специфічно зв'язується з
ТІЛА людини; тобто, зв'язуючу одиницю, для якої ТІ ТА людини є цільовим антигеном. «Одиниця, що зв'язується з ТМЕ», являє собою зв'язуючу одиницю, що специфічно зв'язується з
ТМЕ-о людини; тобто, зв'язуючу одиницю, для якої ТМЕ-ох людини є цільовим антигеном. «Антигензв'язуючий білок» відноситься до білка або поліпептиду, що містить антигензв'язуючу ділянку або антигензв'язуючу частину, що володіє вираженою афінністю до іншої молекули, з якою вона зв'язується (антиген). Антигензв'язуючібілки включають антитіла, пептитіла, фрагменти антитіл, похідні антитіл, аналоги антитіл, гібридні білки і антигенні рецептори, включаючи химерні антигенні рецептори, ХАР (САК). «Антитіла» (АБ) і «Імуноглобуліни» (Ід) являють собою глікопротеїни з однаковими структурними характеристиками. Хоча антитіла виявляють специфічність зв'язування з конкретним антигеном, імуноглобуліни включають як антитіла, так і інші антитілоподібні молекули, що не володіють антигенною специфічністю. Поліпептиди останнього типу, наприклад, продукуються з низькими рівнями лімфатичною системою і з підвищеними рівнями при мієломі. Таким чином, як використовується в цьому документі, термін «антитіло» або «пептид(и) антитіла» відноситься до інтактного антитіла, антитіла, яке конкурує за специфічне зв'язування з антитілом, розкритим в цьому документі, або його антигензв'язуючого фрагменту, який конкурує з інтактним антитілом за специфічне зв'язування, і включає гібридні, гуманізовані, повністю людські і біспецифічні антитіла. У деяких варіантах реалізації винаходу антигензв'язуючі фрагменти одержують, наприклад, методами рекомбінантної ДНК. У додаткових варіантах реалізації винаходу антигензв'язуючі фрагменти одержують шляхом ферментативного або хімічного розщеплення інтактних антитіл. Антигензв'язуючі фрагменти включають, але не обмежуючись цим, Бар, Раб, Е(ар)2, Е(ар)2, Ем і одноланцюгові антитіла.
Як використовується в цьому документі, термін «виділене антитіло» відноситься до антитіла, яке було ідентифіковано, виділено і/або вилучено з компонента його природного середовища.
Забруднюючими компонентами його природного середовища є матеріали, які будуть заважати діагностичному або терапевтичному застосуванню антитіла і можуть включати ферменти, гормони та інші білкові або небілкові розчинені речовини. У переважних варіантах реалізації винаходу антитіло буде очищено (1) до більш ніж 95 95 мас. антитіла, за даними методу Лоурі, і найбільш переважно, до більш ніж 99 95 мас., (2) до ступеня, достатнього для одержання щонайменше 15 залишків М-кінцевої або внутрішньої послідовності амінокислот, за допомогою секвенатора із склянкою, що обертається, або (3) до гомогенності за даними НДО-ПАГЕ у відновлювальних або невідновлювальних умовах із застосуванням Кумасі синього або, переважно, сріблянки. Виділене антитіло включає антитіло іп 5йи В рекомбінантних клітинах, оскільки щонайменше один компонент природного середовища антитіла буде відсутнім. Зазвичай, однак, виділене антитіло буде одержано за допомогою щонайменше однієї стадії очищення.
Термін «агоніст» відноситься до будь-якої сполуки, включаючи білок, поліпептид, пептид, антитіло, фрагмент антитіла, молекулу великого розміру або молекулу невеликого розміру (менше 10 кДа), яка підсилює активність, активацію або функцію іншої молекули.
Термін «антагоніст» відноситься до будь-якої сполуки, включаючи білок, поліпептид, пептид, антитіло, фрагмент антитіла, молекулу великого розміру або молекулу невеликого розміру (менше 10 кДа), яка ослаблює активність, активацію або функцію іншої молекули.
Термін «зв'язувати(-ння)» антиген(-у) або інший(-ого) поліпептид(-у) включає, але не обмежуючись цим, зв'язування лігандного поліпептиду за цим винаходом з рецептором; зв'язування рецепторного поліпептиду за цим винаходом з лігандом; зв'язування антитіла за цим винаходом з антигеном або епітопом; зв'язування антигену або епітопу за цим винаходом з антитілом; зв'язування антитіла за цим винаходом з антиідіотиповим антитілом; зв'язування антиіїдіотипового антитіла за цим винаходом з лігандом; зв'язування антиїдіотипового антитіла за цим винаходом з рецептором; зв'язування антиїдіотипового антитіла за цим винаходом з лігандом, «Біспецифічний» антигензв'язуючий білок являє собою молекулу зі зв'язуючими одиницями, одержану з першого антигензв'язуючого білка (наприклад, антитіло), який специфічно зв'язується з першою молекулою-мішенню, що представляє інтерес, і другого антигензв'язуючого білка (наприклад, антитіло), який специфічно зв'язується з другою молекулою-мішенню, що представляє інтерес. Біспецифічні антигензв'язуючі білки можуть бути одержані різними способами, включаючи, але не обмежуючись цим, злиття гібридом або з'єднання Раб'-фрагментів. Див., наприклад, Зоповіміїаі еї аї., Сіїп. Ехр. Ітітипої., 79:315-321 (1990);
КозігеіІпу еї аї., У. Іттипої., 148:1547-1553 (1992), включені до цього документу шляхом посилання.
Молекули в форматах, зображених на фіг. 1 і 2, являють собою біспецифічні антигензв'язуючі білки у відповідності до цього визначення. Різні додаткові формати біспецифічних антигензв'язуючих білків в межах даного визначення розкриті у МО 2014/159725; УМО 2013/041687; патенті США Мо 8945553; патенті США Мо 8945553; патенті США Мо 8258268; патентній заявці США Мо 2012/0195900;
Міжнародній патентній заявці М/О 2012/088302; попередній заявці США 62/218977; Різспег апа І едег (2007), РаїйобіоІоду 74: 3-14; мап 5ріїв! єї а!. (2000), Іттипоіоду Тодау 21(8): 391-7; Китег еї а!. (2004),
Тгепаз іп Віоїесппоіоду 22(5): 238-44; Вуте еї аї. (2013), Тгепавз іп Віотесппоіоду 31(11): 621-31; Миїег апа Копіептапп (2010), Віодгид5 245(2): 89-98; Снатез апа Вау (2009), пор:/ах.аоі.огд/10.41 б1/парвз.1.6.10015; Копіентапп (2012), пОр///ах.аоі.огд/10.4161/парз.4.2.19000;
Ноїїїдег еї аї. (1993), Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА 90: 6444-86; 5реїівз еї аї!., Мої. Іттипої. (2015), 67: 95- 106, нир/ах.аоі.огд/10.1016/).тоїїтт.2015.01.003; Ноїїдег еї аІ. (1993), Ргос. Маї!. Асай. сі. ОБА 90: 6444-8; бреїів5 єї аї., Мої. Іттипої. (2015), нер //ах.доїі.ога/10.1016/.тоїйтт.2015.01.003; Віддмау еї аї, (1996), Ргоївіп Епа. 9: 617; СипазекКагап еї а! (2010), 9. Віої. Снет. 285: 19637; Рамів (2010), Ргоївіп
Епа. Оевз. б 5еї. 23: 195; рібіаттагніпо еї аї. (2012), Меїйод5 Мої. Віої. 899: 145, 2012); І іпаноїег еї а. (1995), 9. Іттипої. 155: 219: 5сНнаеєтег еї аї. (2011), Ргос. Маї!. Асай. бсі. ОБА, 108: 11187; Ведшіа еї аї, патентній заявці США Мо 2010/0322934; Вовігот еї аї. (2009), 5сіепсе 323:1610; патентній заявці США
Мо 2011/0076722; Коззві єї а. (2008), Сапсег Кев. 68: 8384; кожен з яких включений до цього документу шляхом посилання.
Термін «епітоп» відноситься до частини антигену, з якою специфічно зв'язується антитіло. Таким чином, термін «епітоп» включає будь-яку білкову детермінанту, здатну специфічно зв'язуватися з імуноглобуліновім або Т-клітинним рецептором. Епітопні детермінанти зазвичай складаються з хімічно активних поверхневих груп молекул, таких як амінокислоти або бічні ланцюги цукру, і зазвичай мають специфічні характеристики тривимірної структури, а також специфічні характеристики заряду. Більш конкретно, термін «епітоп ІЇ/-17», «епітоп ТМЕ-ох» і/або «епітоп р19/ТМЕ-х», як використовується в цьому документі, відноситься до частини відповідного поліпептиду, що володіє антигенною або імуногенною активністю в організмі тварини, переважно в організмі ссавців і найбільш переважно в організмі миші або людини. Епітоп, що володіє імуногенною активністю, являє собою частину, наприклад, поліпептиду 1 -17А або І-17Е або ТМЕ-о/р19, який спричиняє відповідь у формі антитіл в організмі тварини. Епітоп, що володіє антигенною активністю, являє собою частину, наприклад, поліпептиду 1І-17А або ІІ -17Е або ТМЕ-со/р19, з яким антитіло імуноспецифічно зв'язується, за даними будь-якого способу, добре відомого в цій галузі техніки, наприклад, імунологічних аналізів, розщеплення протеазою, кристалографії або НІО-Ехспапде. Антигенні епітопи необов'язково повинні бути імуногенними. Такі епітопи можуть бути лінійними за своєю природою або можуть являти собою переривчастий епітоп. Таким чином, як використовується в цьому документі, термін «конформаційний епітоп» відноситься до переривчастого епітопу, утвореного просторовим взаємовідношенням між амінокислотами антигену, що відрізняється від безперервної серії амінокислот.
Термін «імуноглобулін» відноситься до білка, що складається з одного або більшої кількості поліпептидів, по суті кодованих генами імуноглобуліну. Одна з форм імуноглобуліну складає основну структурну одиницю антитіла. Ця форма являє собою тетрамер і складається з двох ідентичних пар ланцюгів імуноглобуліну, кожен з яких містить один легкий і один важкий ланцюг. У кожній парі варіабельні ділянки легкого і важкого ланцюга спільно є відповідальними за зв'язування з антигеном, а константні ділянки є відповідальними за ефекторні функції антитіла.
Повнорозмірні «легкі ланцюга» імуноглобуліну (близько 25 кДа або близько 214 амінокислот) кодуються геном варіабельної ділянки на МН2-кінці (близько 110 амінокислот) і геном константної ділянки капа або лямбда на СООН-кінці. Повнорозмірні «важкі ланцюги» імуноглобуліну (близько 50 кДа або близько 446 амінокислот) аналогічним чином кодуються геном варіабельної ділянки (близько 116 амінокислот) і одним з інших вищезазначених генів константної ділянки (близько 330 амінокислот).
Важкі ланцюги класифікуються як гама, мю, альфа, дельта або іпсилон і визначають ізотип антитіла як
Іо (такий як ІдО1, Ідс2, ІдДОЗ і Ідс4), ІЧ9ЗМ, ІдА, Ід і ІЗ9Е, відповідно. У легкому і важкому ланцюгах варіабельна і константна ділянки з'єднані ділянкою «)» розміром близько 12 або більшої кількості амінокислот, причому важкий ланцюг додатково містить ділянку «ОО», що складається з близько 10 амінокислот. (загалом, див. Рипдатепіа! Іттипоіоду (Раш, МУ., еа., 2п4 Еайіоп, Камеп Ргез5, МУ (1989)), Глава 7 (включена шляхом посилання в повному обсязі для всіх цілей).
Варіабельна ділянка легкого або важкого ланцюга імуноглобуліну складається з «каркасної» ділянки, що переривається трьома гіперваріабельними ділянками. Таким чином, термін «гіперваріабельна ділянка» відноситься до амінокислотних залишків антитіла, що є відповідальними за зв'язування з антигеном. Гіперваріабельна ділянка містить амінокислотні залишки з «ділянки, що визначає комплементарність» або «СОК» (КарБбаї єї а!., Зедоепсез ої Ргоївїіп5 ої Іттипоіодісаї Іпіегеві,
БІ Едайіоп, Рибіїс Неакй Зегуісе, Майопаї Іпзійшез ої Неакй, Ветезаа, Ма. (1991)) та/або такі залишки з «гіперваріабельної петлі» (Споїпіа еї аї!., У. Мої. Віої!. 196: 901-917 (1987)) (обидва з яких включені до цього документу шляхом посилання). Залишки «каркасної ділянки» або «ЕК» являють собою такі залишки варіабельної ділянки, відмінні від залишків гіперваріабельної ділянки, як визначено в цьому документі. Послідовності каркасних ділянок різних легких або важких ланцюгів є відносно консервативними всередині виду. Таким чином, «каркасна ділянка людини» являє собою каркасну ділянку, що по суті є ідентичною (близько 85 95 або більше, зазвичай 90-95 95 або більше) каркасній ділянці імуноглобуліну людини, що зустрічається в природі. Каркасна ділянка антитіла, тобто об'єднані каркасні ділянки складових легких і важких ланцюгів, служить меті позиціонування і вирівнювання
СО. СОК в першу чергу є відповідальними за зв'язування з епітопом антигену. Відповідно, термін «гуманізований» імуноглобулін відноситься до імуноглобуліну, який містить каркасну ділянку людини і один або більшу кількість СОК з нелюдського імуноглобуліну (зазвичай миші або щура). Нелюдський імуноглобулін, який надає СОК, називається «донором», а імуноглобулін людини, що надає каркас, називається «акцептором». Константні ділянки не обов'язково повинні бути присутніми, але якщо вони є, вони повинні бути по суті ідентичними константним областям імуноглобуліну людини, тобто, ідентичними щонайменше на близько 85-90 95, переважно на близько 95 95 або більше. Отже, всі частини гуманізованого імуноглобуліну, за винятком, можливо, СОК, по суті є ідентичними відповідним частинам природних послідовностей імуноглобуліну людини. Крім того, один або більша кількість залишків в каркасній ділянці людини можуть бути зворотно мутовані в батьківську послідовність для збереження оптимальної антигензв'язуючої афінності і специфічності. Таким чином, деякі гуманізовані антитіла зберігають певні каркасні залишки батьківських нелюдських антитіл, щоб зберегти зв'язуючі властивості батьківського антитіла при мінімізації його імуногенності. Як використовується в цьому документі, термін «каркасна ділянка людини» включає ділянки з такими зворотними мутаціями. «Гуманізоване антитіла» являє собою антитіло, що містить гуманізований легкий ланцюг і гуманізований важкий ланцюг імуноглобуліну. Наприклад, гуманізоване антитіло не включатиме типового гібридного антитіла, як визначено вище, наприклад, оскільки вся варіабельна ділянка гібридного антитіла не є людською.
Як використовується в цьому документі, термін «модифікований важкий ланцюг» відноситься до гіоридного білка, що містить важкий ланцюг імуноглобуліну, зокрема важкий ланцюг Їд01 людини або важкий ланцюг Ідс2 людини, і фрагмент функціонального антитіла (наприклад, Раб або 5сЕу) або його частину (наприклад, легкий ланцюг імуноглобуліну або фрагмент Ба), причому фрагмент або його частина злиті на своєму М-кінці, необов'язково через пептидний лінкер, із С-кінцем важкого ланцюга.
Термін «гуманізований» імуноглобулін відноситься до імуноглобуліну, що містить каркасну область людини і один або більшу кількість СОМ з нелюдського, наприклад, мишачого, щурячого або кролячого, імуноглобуліну. Нелюдський імуноглобулін, що надає СОК, називається «донором», а людський імуноглобулін, що надає каркас, називається «акцептором». Константні ділянки не обов'язково повинні бути присутніми, але якщо вони є, вони повинні бути по суті ідентичними константним ділянкам імуноглобуліну людини, тобто, ідентичними щонайменше на близько 85-90 95, переважно на близько 95 95 або більше. Отже, всі частини гуманізованого імуноглобуліну, за винятком, можливо, СОК і, можливо, декількох зворотно мутованих амінокислотних залишків в каркасній ділянці (наприклад, 1-15 залишків), по суті є ідентичними відповідним частинам природної послідовності людського імуноглобуліну. «Гуманізоване антитіло» являє собою антитіло, що містить гуманізований легкий ланцюг і гуманізований важкий ланцюг імуноглобуліну. Наприклад, гуманізоване антитіло не включатиме типове химерне антитіло, як визначено вище, наприклад, оскільки вся варіабельна область химерного антитіла не є людською.
Кожен з термінів «людське антитіло» і «повністю людське антитіло» відноситься до антитіла з амінокислотною послідовністю людського імуноглобуліну, включаючи антитіла, виділені з бібліотек імуноглобуліну людини або з організму тварин, трансгенних за одним або більшою кількістю імуноглобулінів людини, які не експресують ендогенних імуноглобулінів; наприклад, антитіла
Хепотоисвзе і антитіла, описані Киспепгіараї еї а. в патенті США Мо 5939598.
Термін «генетично модифіковані антитіла» означає антитіла, в яких амінокислотна послідовність відрізняється від амінокислотної послідовності природного антитіла. Внаслідок значущості методів рекомбінантної ДНК при генерації антитіл, не слід обмежуватися амінокислотними послідовностями, виявленими в природних антитілах; оскільки антитіла можуть бути перероблені для одержання бажаних характеристик. Можливі варіації є численними і варіюються від модифікації всього однієї або більшої кількості амінокислот до повної переробки, наприклад, варіабельної і/або константної ділянки.
Модифікації константної ділянки, загалом, будуть здійснені з метою покращення або модифікації характеристик, таких як фіксація комплементу, взаємодія з мембранами та інші ефекторні функції.
Модифікації варіабельної ділянки будуть здійснені з метою покращення характеристик зв'язування з антигеном. «Фрагмент Раб» складається з одного легкого ланцюга і Сні і варіабельних ділянок одного важкого ланцюга. Важкий ланцюг молекули Бар не може утворювати дисульфідний зв'язок з іншою молекулою важкого ланцюга.
Фрагмент «Рабр'» містить один легкий ланцюг і один важкий ланцюг, який містить більшу частину константної ділянки, між доменами Сні ії Снг, таким чином, що між двома важкими ланцюгами може бути утворений міжланцюговий дисульфідний зв'язок з утворенням молекули Е(аб')».
Фрагмент «РЕ(аб)г» містить два легких ланцюги і два важких ланцюги, що містять частину константної ділянки між доменами Сні і Снг, таким чином, що між двома важкими ланцюгами утворюється міжланцюговий дисульфідний зв'язок.
І0076)| Термін «нативний Ес» відноситься до молекули або послідовності, яка містить послідовність не-антигензв'язуючого фрагмента, що є результатом розщеплення повнорозмірного антитіла, як в мономерній, так і в мультимерній формі. Вихідне імуноглобулінове джерело нативного Ес переважно має людське походження і може бути будь-яким з імуноглобулінів, хоча переважними є Ідс1, Ідсе2 і
Іде4. Нативні Ес складаються з мономерних поліпептидів, які можуть бути з'єднані в димерні або мультимерні форми ковалентною (тобто, дисульфідними зв'язками) і нековалентною асоціацією.
Кількість міжмолекулярних дисульфідних зв'язків між мономерними субодиницями нативних молекул
Ес коливається від 1 до 4 залежно від класу (наприклад, Ідс, ІдА, ІЧ9Е) або підкласу (наприклад, Ідс1,
ІЧО2, ІдЗ, Ід04, ІДА1, ІДСАг). Одним із прикладів нативного Ес є з'єднаний дисульфідними зв'язками димер, одержаний в результаті розщеплення Ідс папаїном (див. ЕЇзоп еї аї. (1982), Мисівїс Асід5 Кезв. 10: 4071-93. Як використовується в цьому документі, термін «нативний Ес» є спільним для мономерних, димерних і мультимерних форм.
Термін «варіант Ес» відноситься до молекули або послідовності, яка модифікована з нативного Ес, але як і раніше містить сайт зв'язування з рецептором реутилізації ЕсКп. У Міжнародних заявках МО 97/34631 (опублікована 25 вересня 1997 г.) і МО 96/32478, які включені до цього документу шляхом посилання, описані типові варіанти Ес, а також взаємодія з рецептором реутилізації. Таким чином, термін «варіант Ес» включає молекулу або послідовність, яка гуманізована з нелюдського нативного
Ес. Крім того, нативний Ес містить сайти, які можуть бути видалені, оскільки вони забезпечують структурні ознаки або біологічну активність, непотрібні для гібридних молекул за цим винаходом.
Таким чином, термін «варіант Ес» включає молекулу або послідовність, в якій відсутні один або більша кількість сайтів нативного Ес або залишків, що впливають або беруть участь в (1) утворенні дисульфідного зв'язку, (2) несумісності з вибраною клітиною-хазяїном (3) М-кінцевій гетерогенності при експресії у вибраній клітині-хазяїні, (4) глікозилюванні, (5) взаємодії з комплементом, (б) зв'язуванні з рецептором Ес, відмінним від рецептора реутилізації або (7) антитілозалежній клітинній цитотоксичності, АЗКЦ (АОСС). Варіанти Ес більш детально описані нижче.
Термін «домен Ес» включає молекули і послідовності нативного Ес і варіантів Ес, як визначено вище. Як і у випадку варіантів Ес і нативних Ес, термін «домен Ес» включає молекули в мономерній або мультимерній формі, незалежно від того, одержані вони розщепленням повнорозмірного антитіла чи іншими способами.
Термін «мультимер» відносно доменів Ес або молекул, що містять домени Ес, відноситься до молекул, які містять два або більшу кількість поліпептидних ланцюгів, з'єднаних за допомогою ковалентної, нековалентної або ковалентної і нековалентної взаємодії. Молекули ІдсС зазвичай утворюють димери; ІДМ, пентамери; ІдО, димери; і ІДА, мономери, димери, тримери або тетрамери.
Мультимери можуть бути утворені шляхом використання послідовності і результуючої активності нативного Ід-джерела Ес або дериватизації (як визначено нижче) такого нативного Ес.
Термін «димер» відносно доменів Ес або молекул, що містять домени Ес, відноситься до молекул, які містять два поліпептидних ланцюги, з'єднані ковалентним або нековалентним способом. Таким чином, типові димери в межах цього винаходу зображені на фіг. 2.
Терміни «фрагмент Ем» і «одноланцюгове антитіло» відносяться до поліпептидів, що містить варіабельні ділянки антитіла як з важких, так і легких ланцюгів, але не містять константних ділянок.
Подібно до повнорозмірного антитіла, він здатний вибірково зв'язуватися з конкретним антигеном. При молекулярній масі всього близько 25 кДа фрагменти Ем набагато менший за звичайні антитіла (150- 160 кДа), які складаються з двох важких білкових ланцюгів і двох легких ланцюгів, і навіть менший за фрагменти Раб (близько 50 кДа, один легкий ланцюг і половина важкого ланцюга). «Однодоменне антитіло» являє собою фрагмент антитіла, що складається з однодоменного блоку Ем, наприклад, МН або МІ. Подібно до повнорозмірного антитіла, воно здатне вибірково зв'язуватися з конкретним антигеном. При молекулярній масі всього лише 12-15 кДа однодоменні антитіла набагато менші за звичайні антитіла (150-160 кДа), які складаються з двох важких білкових ланцюгів і двох легких ланцюгів, і навіть менші за фрагменти Раб (близько 50 кДа, один легкий ланцюг і половина важкого ланцюга) і одноланцюгові варіабельні фрагменти (близько 25 кДа, два варіабельних домени, один з легкого і один з важкого ланцюга). Перші однодоменні антитіла були сконструйовані з антитіл, що містять тільки важкий ланцюг, які виявлені у верблюжих. Хоча більшість досліджень однодоменних антитіл в цей час базується на варіабельних доменах важкого ланцюга, також показано, що варіабельні домени легкого ланцюга і наночастинки, одержані з легких ланцюгів, специфічно зв'язуються з цільовими епітопами.
Як використовується в цьому документі, термін «моноклональне антитіло» не обмежується антитілами, одержаними за допомогою гібридомної технології. Термін «моноклональне антитіло» відноситься до антитіла, що одержане з одного клону, включаючи будь-який еукаріотичний, прокаріотичний або фаговий клон, а не до способу його одержання.
У деяких варіантах реалізації винаходу анти-ТІ/ТЛА антигензв'язуючий білок, біспецифічний антигензв'язуючий білок або функціональний фрагмент будь-якого з них, з якого одержаний анти-ТІ ТА зв'язуючий домен, вибірково інгібує ТІ1А людини відносно лігандів суперродини ТМЕ. Антитіло або його функціональний фрагмент «вибірково інгібує» конкретний рецептор або ліганд в порівнянні з іншими рецепторами або лігандами, якщо ІС50 антитіла в аналізі інгібування конкретного рецептора щонайменше в 50 разів нижче, ніж ІС50 в аналізі інгібування іншого «референтного» ліганду або рецептора. «ІС5О» являє собою дозу/концентрацію, необхідну для досягнення 50 95 інгібування біологічної або біохімічної функції. У разі радіоактивних лігандів ІЇС50 є концентрацію конкуруючого ліганду, який витісняє 50 95 специфічного зв'язування радіоактивного ліганду. ІС50 будь-якої конкретної речовини або антагоніста можна визначити, побудувавши криву дози-відповіді і досліджуючи вплив різних концентрацій лікарського засобу або антагоніста на реверсуючу активність агоніста в конкретному функціональному аналізі. Значення ІС5О можуть бути обчислені для конкретного антагоніста або лікарського засобу шляхом визначення концентрації, необхідної для інгібування половини максимальної біологічної відповіді агоніста. Таким чином, значення ІС5О для будь-якого антитіла проти Т/1ТА або його функціонального фрагмента може бути обчислене шляхом визначення концентрації антитіла або фрагмента, необхідних для інгібування половини максимальної біологічної відповіді ТЛА при активації рецептора ТІЛА людини в будь-якому функціональному аналізі, такому як аналіз, описаний у Прикладі 14 нижче. Під антитілом або його функціональним фрагментом, що вибірково інгібує конкретний ліганд або рецептор, мається на увазі нейтралізуюче антитіло або нейтралізуючий фрагмент по відношенню до цього ліганду або рецептора. Таким чином, в деяких варіантах реалізації винаходу антитіло проти ТІ1А або його функціональний фрагмент, з якого одержаний анти-ТІ ТА зв'язуючий домен біспецифічних антигензв'язуючих білків за винаходом, є антитілом або фрагментом, що нейтралізує ТІ/1А людини.
Варіабельні ділянки або ділянки СОК будь-якого антитіла проти ТІ ТА або його функціонального фрагмента можна застосовувати для конструювання зв'язуючої анти-ТІТА одиниці будь-якого з біспецифічних антигензв'язуючих білків, описаних в цьому документі. Подібним чином, варіабельні ділянки або послідовності СОК будь-якого антитіла проти ТМЕ-о або його функціонального фрагмента можна застосовувати для конструювання зв'язуючої анти- ТМЕ-х одиниці будь-якого з описаних в цьому документі біспецифічних антигензв'язуючих білків. Наприклад, зв'язуючий анти-ТІ1А домен біспецифічних антигензв'язуючих білків за винаходом може містити ділянки УН і/або МІ. або один або більшу кількість СОК з будь-якого з антитіл проти ТІ1А людини, описаних в патенті США Мо 7820798; патентній заявці США Мо 2008/0003221; патенті США Мо 8263743; патентній заявці США Мо 2011/0217310; патентній заявці США Мо. 2012/0263718; патентній заявці США Мо 2014/0308271; УМО 2012/161856; УМО 2013/044298; МО 2005/018571; патентній заявці США Мо 2014/0120109; патенті США
Мо 6521422; патентній заявці США Мо 2014/0255302; і патентній заявці США Мо 2015/0132311; кожен з яких включений до цього документу шляхом посилання в повному обсязі. У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло проти ТІ ТА, з якого одержана зв'язуюча анти-ТІ 1А одиниця, перехресно блокує одне або більшу кількість антитіл проти ТІ1А людини, описаних в одному із згаданих посилань, або одне або більшу кількість антитіл проти Т/ТА людини, описаних нижче. Терміни «перехресно блокувати», «перехресно блокований» і «перехресно блокуючий» використовуються в цьому документі взаємозамінним чином для позначення здатності антитіла перешкоджати зв'язуванню інших антитіл або зв'язуючих одиниць з мішенню (наприклад, ТІ/ТА людини). Ступінь, в якому антитіло або зв'язуюча одиниця може перешкодити зв'язування іншого з мішенню (наприклад, ТІ/1А людини) і, отже, чи можна його віднести до перехресно блокуючих, може бути визначений із застосуванням аналізів конкурентного зв'язування. У деяких варіантах реалізації винаходу перехресно блокуюче антитіло або його зв'язуюча одиниця зменшує зв'язування ТІ1А людини з референтним антитілом на від близько 40 95 до 100 95, наприклад, на близько 60 95 і близько 100 95, особливо переважно на від близько 70 95 до 100 95, і конкретно більш переважно на від близько 80 95 до 100 95. В особливо придатному кількісному аналізі для виявлення перехресного блокування застосовується апарат
Віасоге, який вимірює ступінь взаємодії із застосуванням технології поверхневого плазмонного резонансу. В іншому придатному кількісному аналізі перехресного блокування застосовується підхід на базі ЕАС5 для вимірювання конкуренції між антитілами в показниках їх зв'язування з ТІ/1А людини.
Типовий аналіз для такого перехресного блокування наведений у патентній заявці США Мо 2015/0132311, Приклад 2, абзаци (09221-(09241, які включені до цього документу шляхом посилання.
Термін «нуклеїнова кислота» або «молекула нуклеїнової кислоти» відноситься до полінуклеотидів, таких як дезоксирибонуклеїнова кислота (ДНК) або рибонуклеїнова кислота (РНК), олігонуклеотидів, фрагментів, одержаних полімеразною ланцюговою реакцією (ПЛР), і фрагментів, одержаних будь- яким з лігування, розщеплення, впливу ендонуклеази і впливу екзонуклеази. Молекули нуклеїнової кислоти можуть складатися з мономерів, які є природними нуклеотидами (таких як ДНК і РНК) або аналогами нуклеотидів, зустрічаються в природі (наприклад, а-енантіомерної форми природних нуклеотидів), або комбінацією обох. Модифіковані нуклеотиди можуть містити модифікації в цукрових фрагментах і/або у фрагментах піримідинових або пуринових основ. Модифікації цукрів включають, наприклад, заміну однієї або більшої кількості гідроксильних груп галогенами, алкільними групами, амінами і азидогрупами, або цукри можуть бути функціоналізованими з утворенням етерів або естерів.
Більше того, весь цукровий фрагмент може бути замінений подібними із стеричної та електронної точки зору структурами, такими як аза-цукри і карбоциклічні аналоги цукрів. Приклади модифікацій у фрагменті основи включають алкільовані пурини і піримідини, ацильовані пурини або піримідини або інші добре відомі гетероциклічні замісники. Молекули нуклеїнової кислоти можуть бути з'єднані фосфодієстерними зв'язками або аналогами таких зв'язків. Аналоги фосфодіестерних зв'язків включають фосфоротіоат, фосфородитіосат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанілотіоат, фосфороанілідат, фосфороамідат і т.п. Термін «молекула нуклеїнової кислоти» додатково включає так звані «пептидні нуклеїнові кислоти», що містять природні або модифіковані основи нуклеїнових кислот, приєднані до поліамідного скелету. Нуклеїнові кислоти можуть бути одноланцюговими або двохланцюговими.
Термін «молекула, комплементарна молекулі нуклеїнової кислоти», відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, що має комплементарну нуклеотидну послідовність і зворотну орієнтацію в порівнянні з референтною нуклеотидною послідовністю.
Термін «вироджена нуклеотидна послідовність» позначає послідовність нуклеотидів, яка містить один або більшу кількість вироджених кодонів в порівнянні з референтною молекулою нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид. Вироджені кодони містять інші триплети нуклеотидів, але кодують один і той же амінокислотний залишок (тобто, кожен з триплетів СА і САС кодує Авзр). «Виділена молекула нуклеїнової кислоти» являє собою молекулу нуклеїнової кислоти, яка не інтегрована в геномну ДНК організму. Наприклад, молекула ДНК, яка кодує фактор росту, виділена з геномної ДНК клітини, являє собою виділену молекулу ДНК. Іншим прикладом виділеної молекули нуклеїнової кислоти є хімічно синтезована молекула нуклеїнової кислоти, яка не інтегрована в геном організму. Молекула нуклеїнової кислоти, яка була виділена з конкретного виду, є меншою, ніж повнорозмірна молекула ДНК хромосоми цього виду. «Конструкція молекули нуклеїнової кислоти» являє собою молекулу нуклеїнової кислоти, як одно-, так і двохланцюгову, яка була модифікована втручанням людини, таким чином, що вона містить сегменти нуклеїнової кислоти, об'єднані і співставлені в послідовності, що не існує в природі.
І0091| «Комплементарна ДНК (кКДНК)» являє собою одноланцюгову молекулу ДНК, яка утворена з матриці мРНК ферментом зворотною транскриптазою. Як правило, для ініціювання зворотної транскрипції застосовують праймер, комплементарний частинам мРНК. Фахівці в цій галузі техніки додатково використовують термін «КДНК» для позначення двохланцюгової молекули ДНК, що складається з такої одноланцюгової молекули ДНК і комплементарного до неї ланцюга ДНК. Крім того, термін «кКДНК» відноситься до клону молекули кКДНК, синтезованого з шаблону РНК. «Промотор» являє собою нуклеотидну послідовність, що спрямовує транскрипцію структурного гена. Як правило, промотор розташований в 5'-некодуючій області гена, проксимально відносно сайту початку транскрипції структурного гена. Елементи послідовності всередині промоторів, які функціонують при ініціюванні транскрипції, часто характеризуються консенсусними послідовностями нуклеотидів. Ці промоторні елементи включають сайти зв'язування з РНК-полімеразою, послідовності
ТАТА, послідовності СААТ, специфічні для диференціації елементи (О5Е, МсОСепее еї аї., Мої.
Епадостіпо!., 7:551 (1993)), елементи відповіді на циклічний АМФ (СКЕ), елементи сироваткової відповіді (5КЕ, Тгеізтап, зетіпаг: іп Сапсег Віої., 1:47 (1990)), елементи глюкокортикоїдної відповіді (ОРКЕ) і сайти зв'язування з іншими факторами транскрипції, такими як СКЕ/АТЕ (О'КеїйУ еї аї.,.. Віої.
Спет., 267:19938 (1992)), АР2 (Уе еї аї., 9. ВіоЇ. Спет., 269:25728 (1994)), 5Р1, білок, що зв'язує елемент відповіді ЦАМФ (СКЕВ; І оеКеп, Сепе Ехрг., 3:253 (1993)) і октамерних факторів (загалом див.
М/аїзоп еї аї., еавз., МоіІесшаг Віоїоду ої Ше Сепе, 4 Еайіоп, Те Вепіатіп/Ситтіпд5 Рибіївпіпа
Сотрапу, Іпс. (1987), і Гетаїдге еї аї., Віоспет. -., 303:1 (1994)). Якщо промотор є індуцибельним промотором, то швидкість транскрипції зростає у відповідь на індукуючий агент. Навпаки, швидкість транскрипції не регулюється індукуючим агентом, якщо промотор є конститутивним промотором.
Відомі також заборонні промотори.
«Регуляторний елемент» являє собою нуклеотидну послідовність, яка модулює активність основного промотору. Наприклад, регуляторний елемент може містити нуклеотидну послідовність, яка зв'язується з клітинними факторами, що забезпечують транскрипцію виключно або переважно в певних клітинах, тканинах або органелах. Ці типи регуляторних елементів зазвичай пов'язані з генами, які експресуються «клітиноспецифічним», «тканиноспецифічним» або «органелоспецифічним» чином. «Енхансер» являє собою тип регуляторного елемента, який може підвищити ефективність транскрипції, незалежно від відстані або орієнтації енхансера відносно сайту початку транскрипції. «Гетерологічні ДНК» відноситься до молекули ДНК або популяції молекул ДНК, яка від природи не існує в даній клітині-хазяїні. Молекули ДНК, гетерологічні відносно конкретної клітини-хазяїна, можуть містити ДНК, одержану з виду клітини-хазяїна (тобто, ендогенну ДНК), до тих пір, поки така ДНК хазяїна поєднується з ДНК, яка не відноситься до хазяїна (тобто, екзогенною ДНК). Наприклад, молекула ДНК, що містить сегмент ДНК, яка не відноситься до хазяїна, що кодує поліпептид, функціонально пов'язаний з сегментом ДНК хазяїна, який містить транскрипційний промотор, вважається гетерологічною молекулою ДНК. | навпаки, гетерологічна молекула ДНК може містити ендогенний ген, функціонально пов'язаний з екзогенним промотором. Як ще одна ілюстрація, молекула ДНК, що містить ген, одержаний з клітини дикого типу, вважається гетерологічною ДНК, якщо зазначену молекулу ДНК вводять в мутантну клітину, в якій відсутній ген дикого типу. «Вектор експресії» являє собою молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує ген, який експресується в клітині-хазяїні. Зазвичай вектор експресії містить промотор транскрипції, ген і термінатор транскрипції.
Експресію гена зазвичай проводять під контролем промотору, і такий ген називають «функціонально пов'язаним 3» промотором. Подібним чином, регуляторний елемент і основний промотор функціонально пов'язані, якщо регуляторний елемент модулює активність основного промотору. «Рекомбінантний хазяїн» являє собою клітину, що містить молекулу гетерологічної нуклеїнової кислоти, таку як вектор клонування або вектор експресії В даному контексті прикладом рекомбінантного хазяїна є клітина, яка продукує антагоніст за цим винаходом з вектора експресії.
Навпаки, такий антагоніст може бути продукований клітиною, яка є «природним джерелом» зазначеного антагоніста і яка не містить вектора експресії.
Терміни «аміно-кінцевий» і «карбокси-кінцевий» використовуються в цьому документі для позначення положень всередині поліпептидів. Якщо контекст дозволяє, ці терміни використовуються з посиланням на конкретну послідовність або частину поліпептиду для позначення близькості або відносного положення. Наприклад, певна послідовність, розміщена в напрямку карбокси-кінця відносно референтної послідовності всередині поліпептиду, розташована ближче до карбоксильного кінця референтної послідовності, але необов'язково знаходиться на карбоксильному кінці повнорозмірного поліпептиду. «Химерний білок» являє собою гібридний білок, експресований молекулою нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидні послідовності щонайменше з двох генів. Наприклад, химерний білок може містити щонайменше частину поліпептиду 1 -17КА, злиту з поліпептидом, який зв'язується з афінною матрицею. Такий химерний білок забезпечує засіб для виділення великих кількостей І/-17А з застосуванням афінної хроматографії.
Термін «рецептор» позначає пов'язаний з клітиною білок, який зв'язується з біоактивною молекулою під назвою «ліганд». Ця взаємодія опосередковує вплив ліганду на клітину. Рецептори можуть бути мембранозв'язаними, цитозольними або ядерними; мономерними (наприклад, рецептор тиреотропного гормону, бета-адренергічний рецептор) або мультимерними (наприклад, рецептор
РОСЕ, рецептор гормону росту, рецептор ІЇ/-3, рецептор ЗМ-С5Е, рецептор О-С5КЕ, рецептор еритропоетину і рецептор 1І/-6). Мембранозв'язані рецептори характеризуються багатодоменною структурою, що включає позаклітинний лігандзв'язуючий домен і внутрішньоклітинний ефекторний домен, який зазвичай бере участь у передачі сигналу. У деяких мембранозв'язаних рецепторах позаклітинний лігандзв'язуючий домен і внутрішньоклітинний ефекторний домен розташовані в окремих поліпептидах, які складають повнофункціональний рецептор. Загалом, зв'язування ліганду з рецептором призводить до конформаційної зміни рецептора, яка спричиняє взаємодію між ефекторним доменом та іншою(-ими) молекулою(-ами) в клітині, що, в свою чергу, призводить до модифікації метаболізму клітини. Метаболічні події, які часто пов'язані з взаємодіями рецептора- ліганду, включають транскрипцію генів, фосфорилування, дефосфорилування, підвищення продукування циклічного АМФ, мобілізацію клітинного кальцію, мобілізацію мембранних ліпідів, клітинну адгезію, гідроліз інозитолліпідів і гідроліз фосфоліпідів.
Термін «експресія» відноситься до біосинтезу генного продукту. Наприклад, в разі структурного гена експресія включає транскрипцію структурного гена в мРНК і трансляцію мРНК в один або більшу кількість поліпептидів.
Термін «пара комплементарного/анти-комплементарного» позначає неідентичні фрагменти, які за відповідних умов утворюють з'єднану придатним ковалентним зв'язком стійку пару. Наприклад, біотин і оавідин (або стрептавідин) є прототиповими членами пари комплементарного/анти- комплементарного. Інші типові пари комплементарного/"анти-комплементарного включають пари рецепторів/лігандів, пари антитіла/антигену (або гаптен або епітоп), пари смислових/антисмислових полінуклеотидів і т.п. Якщо бажаною є подальша дисоціація пари комплементарного/анти- комплементарного, то пара комплементарного/"анти-комплементарного переважно має афінність зв'язування менше 109 М". «Детектована мітка» являє собою молекулу або атом, які можуть бути кон'юговані з фрагментом антитіла для одержання молекули, придатної для діагностики. Приклади детектованих міток включають хелатор, фотоактивні агенти, радіоїзотопи, флуоресцентні агенти, парамагнітні іони або інші маркерні фрагменти.
Термін «афінна мітка» використовується в цьому документі для позначення сегмента поліпептиду, який може бути приєднаний до другого поліпептиду, щоб забезпечити очищення або детектування другого поліпептиду або забезпечити сайти для приєднання другого поліпептиду до субстрату. В принципі, будь-який пептид або білок, для якого антитіло або інший специфічний зв'язуючий агент є доступним, можна застосовувати як афінну мітку. Афінні мітки включають полігістидиновий тракт, білок А (Міі550п єї аІ., ЕМВО .., 4: 1075 (1985); Міїзоп еї аї., Меїйодз Епгутої., 198: З (1991)), глутатіон о-трансферазу (тій еї а!., Сепе, 67: 31 (1988)), афінну мітку Сіш-Сіи (Стиззепітеуег еї а!., Ргос. Маї!.
Асад. 5сі. ОБА, 82: 7952 (1985)), речовину Р, пептид РІГ АСОФ (Норр еї аї., Віотесппоіоду, 6:1204 (1988)), пептид або інший антигенний епітоп або зв'язуючий домен, що зв'язується із стрептавідином. Загалом, див. Еога еї аї., Ргоївіп Ехргезвіоп апа Ригіїсайоп, 2: 95 (1991). Молекули ДНК, що кодують афінні мітки, доступні від комерційних постачальників (наприклад, Ріпаптасіа Віоїесі, Піскатауей, штат Нью-
Джерсі).
Термін «кислий залишок» відноситься до амінокислотних залишків, у яких присутні бічні ланцюги, що містять кислотні групи. Приклади кислих залишків включають О і Е.
Термін «амідний залишок» відноситься до амінокислот, в яких присутні бічні ланцюги, що містять амідні похідні кислотних груп. Типові залишки включають М і 0).
Термін «ароматичний залишок» відноситься до амінокислотних залишків, у яких присутні бічні ланцюги, що містять ароматичні групи. Типові ароматичні залишки включають ЕК, У і УУ.
Термін «основний залишок» відноситься до амінокислотних залишків, у яких присутні бічні ланцюги, що містять основні групи. Типові основні залишки включають Н, К і К.
Термін «гідрофільний залишок» відноситься до амінокислотних залишків, у яких присутні бічні ланцюги, що містять полярні групи. Типові гідрофільні залишки включають С, 5, Т, Мі с).
Термін «нефункціональний залишок» відноситься до амінокислотних залишків, у яких присутні бічні ланцюги, що не містять кислотних, основних або ароматичних груп. Типові нефункціональні амінокислотні залишки включають М, с, А, М, І, І і норлейцин (Міе).
В даному винаході може застосовуватися індекс ЕМО, як у в Кабаї еї аїІ. (1991), Зедиепсе5 ої
Ргоївіп5 ої Іттипоіодіса! Іпіегеві, Бій Ед. Рибіїс Неайй 5егуісе, Маїопаї! Іп5ійшевз ої Неацйн, Веїпезаа,
МО, ї схеми нумерації АНо (Нопеддег апа РійсКкійпип (2001), У Мої Віої. 8; 309(3): 657-70). Положення амінокислот та СОК і ЕК даного антитіла можуть бути ідентифіковані із застосуванням будь-якої системи. Наприклад, положення важкого ланцюга ЕМО 39, 44, 183, 356, 357, 370, 392, 399 і 409 еквівалентні положенням важкого ланцюга АНо 46, 51, 230, 484, 485, 501, 528, 535 і 551, відповідно.
Подібним чином, положення легкого ланцюга Є 38, 100 і 176 є еквівалентними положенням легкого ланцюга АНО 46, 141 і 230, відповідно. Табл. (і), (ії) ії (її) нижче демонструють еквівалентність між позиціями нумерації для версій положення заряду м1, м2 і м3 з метою забезпечення правильного складання, наприклад, біспецифічних антигензв'язуючих білків ІД0-Рар.
Таблиця|і) - мі
Ланцюг | Домен | Мутаця | МеАНо | МеБО | Мезакабатом
Таблицяції) - м2 о Ланцюг | Домен | Мутаця / МеАНо | МБО | МезаКабатом ск і
Таблицяції) - м2
Ланцюг | Домен | Мутаця / МеАНо | МБО | МезаКабатом 111 (е111111171171111111Е | 23017183 |7771717111881 ще і
Таблиця (її) - УЗ
Ланцюг | Домен | Мутаця )/ МеАНо )| Ме | МозаКабатом/
СЕ і
НС і
Формати біспецифічних антигензв'язуючих білків за винаходом
Один аспект винаходу відноситься до нових ТІ ТА-специфічних антигензв'язуючих білків і антитіл.
Такі антитіла є придатними для лікування станів, відомих в цій галузі техніки і описаних нижче, які піддаються лікуванню шляхом інгібування біологічної активності ТІ 1ТА.
Інший аспект винаходу відноситься до біспецифічних антигензв'язуючих білків, в яких одна пара легкого ланцюга-важкого ланцюга специфічно зв'язується з ТІ1А, а інша пара легкого ланцюга- важкого ланцюга зв'язується з ТМЕ-о. Такі біспецифічні антигензв'язуючі білки можуть бути повнорозмірними антитілами (див. Фіг. 1) або фрагментами К(аб')». В цьому аспекті винаходу одиниця, що зв'язується з ТІ ТА, є одновалентною по відношенню до ТІЛА, а одиниця, що зв'язується з ТМЕ-со, є одновалентною по відношенню до ТМЕ-с.
В іншому варіанті реалізації біспецифічного антигензв'язуючого білка одиниця, що зв'язується з
ТІЛА, і одиниця, що зв'язується з ТМЕ-о, розташовані в загальній структурі, позначеній в цьому документі як Ї90-5сЕм. У цьому варіанті реалізації винаходу перша зв'язуюча одиниця має структуру антитіла, тобто, дві пари імуноглобулінових ланцюгів, причому кожна пара містить один легкий ланцюг і один важкий ланцюг. Друга зв'язуюча одиниця містить структуру пари блоків Ем - тобто, кожен елемент пари містить варіабельний домен з важкого ланцюга і варіабельний домен з легкого ланцюга, з'єднані в тандемі у вигляді одного ланцюга. У конфігурації І(дб-5сЕм кожен блок Ем ковалентно з'єднаний з С-кінцем константного домену важкого ланцюга (Ес) першої зв'язуючої одиниці (див. Фіг. 2). Кожен блок Гм може бути з'єднаний з доменом Ес першої зв'язуючої одиниці безпосередньо або через лінкер. У цьому варіанті реалізації винаходу кожна зв'язуюча одиниця є двохвалентною по відношенню до свого цільового антигену. В переважному варіанті реалізації винаходу одиниця, що зв'язується з ТІ/1А, має структуру антитіла, а одиниця, що зв'язується з ТМЕ-сх, має структуру пари блоків Гм.
Винахід додатково відноситься до біспецифічних антитіл з мутаціями для забезпечення правильного спарювання важкого-важкого і важкого-легкого ланцюга. Такі мутації описані в патенті
США 8592562; УМО 2009/089004; УМО 2006/106905; УМО 2014/4082179; УМО 2014/081955; 5реїів5 еї аї.,
Мої. Іттипої. (2015), пер://ах.дої.огд/10.1016/).тоїїтт.2015.01.003; кожен з яких включений до цього документу шляхом посилання.
Крім того, винахід відноситься до одиниці, що зв'язується з ТІЛА, і одиниці, що зв'язується з ТМЕ- о, згрупованих в інших форматах біспецифічних антигензв'язуючих білків, відомих в цій галузі техніки.
Конкретно, винахід відноситься до одиниць, що зв'язуються з ТІЛА і ТМЕ-с, у форматах, описаних у
МО 2014/159725; МО 2013/041687; патенті США Мо 8945553; патенті США Мо 8945553; патенті США Мо 8258268; патентній заявці США Мо 2012/0195900; Міжнародній патентній заявці УМО 2012/088302; попередній заявці США 62/218977; Різспег апа І едег (2007), Раїйобіоіоду 74: 3-14; мап Зргів! еї аї. (2000), Іттипоіоду Тодау 21(8): 391-7; Китег єї а!. (2004), Тгепавз іп ВіоїесппоЇоду 22(5): 238-44; Вугпе еї а. (2013), Тгепавз іп Віотесппоіоду 31(11): 621-31; МиПег апа Копіептапп (2010), Віодгид5 24(2): 89-98;
Спате5 апа Вау (2009), пер //ах.аоі.огд/10.4161/тарвь.1.6.10015; / Копіеттапп (2012), пир/ах.аоі.ого/10.41 61/парз.4.2.19000; Ноїїїдег еї а. (1993), Ргос. Май). Асай. 5сі. ОБА 90: 6444-8;
Зреїз5 еї аЇ., Мої. Іттипої. (2015), нНр//ах.аоі.огд/10.101 6/.тоїйтт.2015.01.003; МО 2009/089004, опублікованій 16 липня 2009 р.; Ноїїдег еї аї. (1993), Ргос. Маїй!. Асай. 5сі. О5А 90: 6444-86; бреїів5 еї аї.,
МОЇ. Іттипої. (2015), пир:/ах.аоі.огд/10.1016/).тоїїтт.2015.01.003; Ніддугау еї аї, (1996), Ргоївіп Епод. 9: 617; СипазекКагап еї а! (2010), 9. Віої. Снет. 285: 19637; Юамів (2010), Ргоївїп Епд. Оев. б 5еї. 23: 195; рідіаттагіпо еї аї. (2012), Меїнод» Мо). Віої. 899: 145, 2012); І іпаногег еї аї. (1995), у). Іттипої. 155: 219; 5спаетег еї аї. (2011), Ргос. Маї). Асад. сі. О5А, 108: 11187; Кедшіа еї а, патентній заявці США Мо: 2010/0322934; Вовігот еї а!. (2009), 5сіепсе 323:1610; патентній заявці США Мо 2011/0076722; Козві еї а!. (2008), Сапсег Кез. 68: 8384; кожен з яких включений до цього документу шляхом посилання.
Переважні варіанти реалізації винаходу
Амінокислотні послідовності антигензв'язуючих білків і зв'язуючих одиниць переважно базуються на послідовності людських і/або гуманізованих моноклональних антитіл проти ТІ ТА і ТМЕ-с. Крім того, винахід включає послідовності, що володіють ідентичністю послідовності щонайменше 90 95, щонайменше 95 956 або щонайменше 99 95 з переважними послідовностями, зазначеними нижче.
Амінокислотні послідовності, представлені в наступних таблицях, є переважними для антигензв'язуючих білків за цим винаходом, включаючи біспецифічні антигензв'язуючі білки в будь- якому форматі.
ТІ ТА-специфічні антигензв'язуючі білки
ТІ ТА-специфічні антигензв'язуючі білки і антигензв'язуючі одиниці переважно містять послідовності ділянки, що визначає компліментарність (СОК), одержані з переважних антитіл проти
ТІЛА, описаних в цьому документі. В Табл. А представлені переважні послідовності СОК поряд з переважними антитілами, з яких вони були одержані. ЇСОМК1, СОМК2 і І СОМКЗ скрізь відносяться до
СОК легкого ланцюга; НСОКІ, НСОКЗ2 ії НСОКЗ - до СОК важкого ланцюга. Ідентифікаційний номер послідовності (ЗЕО ІЮ МО) для кожної послідовності скрізь наведено в круглих дужках після послідовності в таблиці.
Таблиця А
Переважні ТІ ТА-зв'язуючі послідовності СОК означення І СОВІ (ЗЕО | СОВ2 (ЗЕО І СОВЗ (ЕО|НСОВІ (ЗЕО|НСОВ2 (5ЕО)| НСОВЗ (5ЕО вн ІО МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) антитіла зсв АТ5ОСІНО |САББОЗОБ 1ОНМ5УР |5УОМН мк уТОе РТМТІ МУ рга (98) (100) РєРТ(102) (164) УКе (166) УусМмоМ (168) обі1 |ВАБОВІММ (АТОБІО5 005У5ТР |8УРМУ5 уМрерк о БІОБУХОЄ
МІ Щ110) (106) вТ(108) (170) (172) рм(174) осв ВАБОВІММ ААВОє 005У5ТР |БУРУВ (со |ЕТОВУТО
МІ Щ110) (112) вТ(108) (170) (178) ЕОМ(180)
КОМІ. ВТМУВА5К 1ЕОСОБУУ 2383 У5БЗММКМ п ст п МУМОМАМ |ВУОоМрУ
МІ М(116) ЗУК5 (184) |(186)
А5БОБМІ. ВТМУВА5К 1ЕОСОБУУ 2383 НА | У55ММКМ п ст п МУМОМАМ |ВУОоМрУ
М Мщ(128) ЗІ К5(196) |(186)
А5БОБМІ. ВТМУВА5К 1ЕОСОБУУ 23833УНІЗ | У5ЗММКМ п ст п МУМОМАМ |ВУОоМрУ
МІ М(128) ЗУКа (202) | (186)
ЕІМНАСМ зв3 ВАБОБУА |Б0АБЗ5ААТ фО0О0МОа55Р |СУУМ/М ТМУМРОЇ. аУсСА5тТ
ЗОМ А (122) | (124) Тт(126) (188) СУвРОМ (192)
К5(190) вс ВАВОБУА |САОААТ |00Ус55Р |сУУУМ (КИЙ. СсУСАВТТ
ЗОМ А (122) | (124) Тт(126) (188) (483) СУвРОМ (192)
ВАБОСІВ |ААВІОя 1ОНМеУР |8усмно |ММ5ТООМ ГОЄТЕТУ 17Е9 МОГА (469). | (112) РТ(102) (164) МКІ МАО |МУМаЦІрМУ
УКО (485) |(489)
Таблиця А
Переважні ТІ ТА-зв'язуючі послідовності СОК означення І СОВІ (5ЕО| І СОВ2 (5ЕО І СОВЗ (ЗЕОНСОВІ (ЗЕОЇНСОВ2 (ЗЕОЇ НСОВЗ (5ЕО дн І МО) І МО) І МО) Ю МО) І МО) І МО) антитіла 555 5555552 ТОВІААРСТ 5зр3 0 |У5МОУМУ вв Стів ТУУМВ5 (777) МУАОВУК С УУУУОМО (о (683) (779) м(781)
КеБОМІУ МІМ/УОС25 ТЕЕВОбУУ
БаЕБ | 55ММКМУ п Мт (693). пв3 МКоУАО5 |НУСМОМ
ІА (689) уке(785) (787)
К55О5М. МІМ/УОС5 ТЕЕВОбУУ 5бЕЇ 0 У55ММКМ п Мт (693). У МКоУАО5 |НУСМОМ
МА (235) Уке (785) (787)
ТО555МІС уІва5ос Ост МУУу
БТАВ 0 |АСУМУН в ВОМУ (7 я в сТУУАрЯ УУЗОМОУ (697) ука(794) (796) во АН СМеНАРЯ |О5У0551 |МУАМ5 КиАОе ОСУ58АМУ ав) (705) ЗСУ (707) | (798) ково) УРОУ (802) вості оАсчОМН сМеНАРЯ (О5У0881 |МУАММ еиуАОе ОСУ58АМУ (ов) (705) ЗСУ (707) | (804) Укоівоо) РОМ (807) засо |ВАВОЗЕ5 |ААБВІОЄ 005У5ТР. | З55АТИМ ком ЕМАСРА
ЗУ М(713). | (112) ве(717) (809) бук (В) УРОР (ВІЗ) вда |ВАБОБУТ ТАББІОВ |005У8ТР. | ЗМАТММ плочеи ЕМАСРА
ЗУ М(719). (721) ве(717) (815) сука (ві7) /УРОР (В13) трі» ЗЕЗМБОЮ 8ММКАРБ |АТМООМІ. |СЕУМН СТМУАОК ЕСІАУАІ Т У
ТМАУМ (723) (725) МОРІ. (727) | (819) Росіво 823) внії |ВАОБІБ5 МАББІОЄ 005У5МР. |СУУМВ Емнве, О5СМ/НЕВ уіМм(229) (731) ОЕСЗ (733) | (265) ква ОО 828) ввне ВАОСІЙ ААВСІОС ОНМБУР. |5УСМН МКууАое ЕВМУЕСЕЇ.
МО о (226). | (737) туут(739) (164) кова) ОХ (834) воно 0 ВАБОБІЗУ ААЗВІОЄ 005УБ58ІТ | ЗУАМ5 сумо ЕМАСАЄО
МІМм(741). (12) (745) (в36) кова) 840) віру |ВАЗОМІЗЗ ТАбБІОЄ |005У5МР. |СУУМУВ УКРЕІК є оМемНУу мім(747) (749) РЕ55 (751). | (265) (в) АЕОІ (845)
А55О5ІМ Ікувмм/р |мМостНм Р | АУУМН ММРМЗО )соемЕс вето ст |УВОСМТУ ев) (75т (ват) ОТАК ом вви)
ЇМ (753) гне (849) дів10 со ВАБОВІЗ5 (АТО | 0О805ТР ТІ АУУМН СТМУАОК СОС 21 міг) (781) (763) (в47) рнс(в9) ОБ) зісв ВАБОВІЗЄ |ААБЕІО8 (ОО5Е8ТІТ | 5УАМ5 ок Аве ЕМАСАЕОІ
Уім(229). | (112) (767) (836) уко(в5а) 055)
Таблиця А
Переважні ТІ ТА-зв'язуючі послідовності СОК . ІО МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) антитіла
ММ (229) (769) (771) (857) ОС (859) ру(861)
ММ (773) (112) (775) (836) УКке (864) (855)
Кожна з наведених вище послідовностей кодується нуклеотидною послідовністю, що безпосередньо передує їй в Переліку послідовностей. Послідовності з антитіл 9С8 і 3ЗВ3 скрізь є переважними.
В антигензв'язуючих білках за цим винаходом бажано уникати сайтів ізомеризації. Послідовності з двох амінокислот ОС, ОН, 05 і ОТ є відомими сайтами ізомеризації. Даний винахід додатково відноситься до антигензв'язуючих білків, в яких послідовності вихідного антитіла, включаючи послідовності СОК, модифіковані для усунення сайтів ізомеризації. З огляду на це винахід відноситься до антигензв'язуючих білків, в яких НСОК2 є модифікованою формою НСОКЗ2 з вихідного антитіла
ЗС6, що має послідовність МІЗУМОХММКІ УТОХМКО (5ЕО ІО МО: 204), де кожен Х незалежно являє собою залишок, відмінний від б, Н, 5, або Т (тобто, А, С.О, Е, Б, І, К.Г, М, М, Р, 0, К, МУ, УМ або У), причому переважним є А. Крім того, винахід відноситься до антигензв'язуючих білків, в яких НСОК2 є модифікованою формою НОСОК з вихідного антитіла ЗС6, в якому кислий залишок О замінений на Е, щоб видалити сайти ізомеризації, що дає послідовність МІЗМЕСММКІ МТЕБУКИ (5ЕО І МО: 678).
Винахід додатково відноситься до антигензв'язуючих білків, у яких НСОКЗ є модифікованою формою
НСОКЗ з вихідного антитіла 2383, що має послідовність ЕОСОХУУКУСМОМ (ЗЕО ІО МО: 676). Крім того, винахід відноситься до антигензв'язуючих білків, у яких сайт ізомеризації НСОКЗ з вихідного антитіла 2383 видалений шляхом заміни кислого залишку О на Е, що дає послідовність
ЕЕСЕБУУВМОМОМ (5ЕО ІО МО: 657).
В антигензв'язуючого білках за цим винаходом переважним є уникати сайтів дезамідування.
Послідовності з двох амінокислот МО, МН, М5 і МТ є відомими сайтами дезамідування. Цей винахід також стосується антигензв'язуючих білків, в яких послідовності вихідного антитіла, включаючи послідовності СОК, модифіковані для усунення сайтів дезамідування. Одним із способів усунення сайтів дезамідування є заміна другого амінокислотного залишку в сайтах МО, МН, М5 і МТ залишком, відмінним від С, Н, 5 або Т (тобто, А, С.О, Е, ГЕ, І, К, С, М, М, Р, о, К, М, М/ або У). Переважним способом усунення сайтів дезамідування є заміна М в МО, МН, М5 ії МТ на 0. З огляду на це винахід відноситься до антигензв'язуючих білків, які мають наступну послідовність, на додаток до наведених у
Табл. А:
ІСОКЗ може мати послідовність ОНОБУРРТ (5ЕО ІО МО: 631) на базі модифікації послідовності з вихідного антитіла ЗС6;
НОСОК може мати послідовність ТОБМАМУМ (ЗЕО ІО МО: 632) на базі модифікації послідовності з вихідного антитіла 2383 УНА;
НСОК? може мати послідовність ХІМУ5СОТКУМРБІКЗ (ЗЕБЕО ІО МО: 633) або
ЕІОНАСОТМУМРБЇ КБ (5ЕО І МО: 677) на базі модифікації послідовностей з вихідних антитіл 9С8 і
ЗВ, відповідно.
Антигензв'язуючі білки за цим винаходом додатково можуть бути результатом заміщення кислого залишку іншим кислим залишком, амідного залишку іншим амідним залишком і аналогічно для ароматичних залишків, основних залишків, гідрофільних залишків, нефункціональних залишків, нейтральних полярних залишків і полярних гідрофобних залишків. Таке заміщення нефункціональних залишків СОК вихідного антитіла дає послідовності за винаходом, представлені у Табл. В, в яких кожен Х незалежно являє собою М, о, А, М, І або Ї.
Таблиця В
ТІЛА-зв'язуючі послідовності СОК із заміною
! Іо МО) Іо МО) І МО) Іо МО) Іо МО) Іо МО) антитіла
ХХ5УОХМ
МКХУТОХ
ХКХ (640),
ХОНОБУР МІЗУОХММ
РТ (637), КІУТОХМ етхтхху вт5орхв |рх55105 |ХОНМХУР Ка (204), 306 ТррІх (635) | (636) Рт(в38), СН (639) 5УєСМ в
ІОНОБУР МКІ УТЕ5
РТ(631), УКО (678),
ХХ5УЕХМ
МКІ УТЕ5
ХКХ (679)
УХУУХ5 вхоЗхМ |ХТ85ХО5 |ОО5У5тТР ЕХХЗУУХ 2511 5УРМІВ (170) ТМУМРБХ ви ІММТЮ б ММ етьептілех (БУК
УХУУВХО
ТКУМРОХ
КЗ (648),
УХУУВХМ вхоЗхМ |ХХ55ХОо5 |ОО5У5тТР ЕТХ5УУХ зов МУХМ (646). | (647) вт(108) булув пл ЕОУ (650) (649),
УмУВСОТ
КУМРБІК 5 (633)
ЕОХОБУУ
ВУХХОМ
(657), тО5ХХМУМ ЕОСОХУУ (654), ВУСМОУ
К5ЗБО5УХ М/хетВЕ5 ООУууктР о |тмхххмум |НТХУНЗКО | (вт), 2383 |У55ММКМ УУМОУХУ уххівві) 652) ХТ (653) (655), ехке (656) | ЕЕОЕБУУ
ТОБМАМУМ ВУСМОУ
(632) (680),
ЕЕХЕЗУУ
ВУХХОХ
(681)
ЕОХОБУУ
ВУХХОМ
(657), тО5ХХМУМ ЕОСОХУУ (654), ВУСМОУ
НЗЗОЗУХ М/хетвєв |ООУУКТР тТМХххмУМ ВТХНЗКО вв, 2383 УНА./ | У55ММКМ МУМОУХХ ухх(вБа) 652) ХТ (653) (655), вхке (659) | ЕЕОЕВУУ
ТОБМАМУМ ВУСМОУ
(632) (680),
ЕЕХЕЗУУ
ВУХХОХ
Таблиця В
ТІЛА-зв'язуючі послідовності СОК із заміною . ІО МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) антитіла
ЕОХОБУУ
ВУхХХОМ (657),
ТтОБХХММ ЕОСОХУУ 654), вУаМоМ
ЗЗОБУХ М/Х5ТВЕБ |ООМУКТР пІХХхММ ВТУУНЗК (676), 2383 УНЗ | У5Б5ММКМ М УМОМХХ
УХХ (658) (652) ХТт (653) (655), УКХ (660) ЕЕСЕБУУ
ТОБМАМ/М вУаМоМ (632) (680),
ЕЕХЕБТУУ
ВУХХОоХ (681)
ЕХОНХХО
ТМУМРОХ
К5 (665), зв3 ВхХБОБУВ |ХХ55АХтТ ОООУХ55Р ТТ | ХУУМУМ ЕУМрех хХУСсН5тТТ
ЗБУХХ (661) | (662) (663) (664) ке (666) СУБОМ (667)
ЕІОНАСО
ТМММРБІ.
К5 (677)
ЕХМХ5ХХ
ТМУМРОХ
Ке(114),
БСА ВхБОБХА |ХХ55АХтТ ОООУХ55Р ТТ | ХУУМУМ ний в хХУСсН5тТТ
ЗБУХХ (668) | (662) (663) (664) (227) СУБОМ (667) хХОНОХХт
МУМРБ5ОХК 5 (230)
УМБМОоХМ
МКІ МАХ
Ука (691),
УММ5МЕОМ хХОНОБУР МКІ МАЕ5
РЕТЕТХУ вВхБОоХХ5 |ХХ55ХО5 РТ (637), УКка (715), 17Е9 МОХ (646) (647) ХОНМБУР ЗУХХН (639) ХХХ вт
РТ (233) МкХУхХО5
ХХ (669),
ХХБМУЕХМ
МКХУХЕ5
ХКХ (711)
Таблиця В
ТІЛА-зв'язуючі послідовності СОК із заміною . ІО МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) антитіла 5І555551Е
ІУМАОХУК
Фщ4(971), 855О5ХХ 5І555551Е
У5МХУМУ ІУМАЕБУК С
ХО (759), (972), 85505111. ЗХх55555 ОВХХХРХ 5303 УБОСУМУ па кт 40) ТУУХ5 (955) ЕХУУХО5 ТУУМУХХ
ГО (743), ХКХ (973), рх (976) 855О5ХХ ЗХх55555
УБОХУМУ ЕХУУХЕ5 хо (765) ХКХ (974),
ЗХх55555
ЕХУУХОХ
ХКХ (975)
УМУчУЮх5
МКОМАОХ
Ука (980),
МІМ/МЕС5
МКОМАЕ5
Ука (981),
К5БОМХІ. ХХМчОоХ5 |ЕЕВОБУУ
БАЕ5 У5БЗММКМ в Мт 978). ТУХХНн (979) | МКОУХО5 НУХХОХ
УХХ (977) ХКХ (982), (985) хХХМмчохХ5
МкКОоМХОоХ
Ука (983),
ХХММЕХ5
МКОМХЕБ5 хка (984)
УМУчУЮх5
МКОМАОХ
Ука (980),
МІМ/МЕС5
МКОМАЕ5
Ука (981), к5Б5ОБХХ ХХМчОоХ5 |ЕЕВОБУУ
БбЕ1 УБОММКМ в Мт 978). ЗУХХН (639)! МКОУХО5 нНУХХОоХ
УХХ (986) ХКХ (982), (985) хХХМмчохХ5
МкКОоМХОоХ
Ука (983),
ХХММЕХ5
МКОМХЕБ5 хка (984)
Таблиця В
ТІЛА-зв'язуючі послідовності СОК із заміною означення І СОВІ (ЗЕО І СОВ2 (5ЕО І СОВЗ (ЗЕО |ІНСОВІ (ЗЕО|ЇНСОВ2 (ЗЕО|НСОВЗ (5ЕО дн Іо МО) Іо МО) Іо МО) Іо МО) Іо МО) Іо МО) антитіла
Уізо5оа вТУХУАОХ
УКО (995),
О5УрХІ. міЗОЗОС
ЗОМУМ (989), ЗТУХАЕ5
О5УЕ58І. УКО (996),
ЗОМУМ (990), ХХеХХХ (987) (988) ЗХМУХ (991), ХКХ (000;
О5УрХеХ (997),ХХ5
ЗХМУМ (992), ХОХХетТУ
О5УЕ5ОХ уУХОоХХКХ
ЗХМУМ (993) (998),
ХХеХХХ
ЗТУУХЕВ
ХКХ (999)
О5УрХві. 008) ов рХУ55АМ/
ХМХНАР ' МЕОУ (1012), (1002), УЕЗВІ ЗО ЕСУ95АМ/
ТХЗЗ5МХ о со5НнвРЯ |М0006), |муххв ХХВХНХХ ТуУрру (1013)
Бво5 ОІХХХУОХНОО 100) ОБУ 010) ЗТУУХОВ охувехМ (1001) ХовнвР | ЗХУХ (1007), хКх (1011). | Уеру (1014)
О5УрХеХ ' (1004) ЕХУ5З5ХМУ
ЗХУХ (1008), УЕОУ (1015)
О5УЕВОХ
ЗХУХ (1009)
ХМЗНАР5 РХУЗ5АМІ (1002), ЕЕОУ (1018), вості нн СО5НВРУ Оо5Ур5еХ |МУХХМ стиикое ЕСУЗ5АМІ отв) (1003), 5ХУХ (1007) | (1017) Хкх (1011) | ЕОУ (1019),
ХОЗНАР5 рхУ5ОХМІ (1004) ЕЕРОМ (1020) втУОВ5К вхо |ХХе5ХО5 | 559ХТМ/М ЕХХХХРВ ло (КК (1021). (647) івдетня о ХК 023) М/ЕОР (1024)
ЗМОХ ТММ
(1027), вда |ВХВОВХТ |ТХ88ХО 0 дсутя) | ЗОВАТИМ НАВ ЕХХХХРВ 5УХМ (1025) | (1026) дсу (1028) єхк5 (1030) УРОР (1024)
О5ХТММ
Таблиця В
ТІЛА-зв'язуючі послідовності СОК із заміною означення І СОВІ (ЗЕО І СОВ2 (5ЕО І СОВЗ (ЗЕО |ІНСОВІ (ЗЕО|ЇНСОВ2 (ЗЕО|НСОВЗ (5ЕО що Іо МО) Іо МО) Іо МО) Іо МО) Іо МО) Іо МО) антитіла
МПМРОХО
СтмУАОК гОС (1038),
ЗЕЗМХОХ МИМРЕЗО кто ктноои стнн,
ЗЕВОВОЇ АТОМ ХЕУХН МІХМРОВХ. ЕХХХХХХ
ТТо12 пог (відсутня) Дорі (1035)) (1037) гОХ (1040) тУ(1043)
ЗЕВЗОВОХ хлуОрих М/ХМРОХХ
ХтМХХМ ОХРХ (1036) ХТМУХОК (1033) ЕОХ (1041),
М/ХМРЕВХ
ХТМУХОК
ЕОХ (1042)
ЕХМХЗХА | охомнЕ5
ТМУМРОХ ер (1049),
КЗ(И1046), |Е5СМНЕ5 вн: ОО ВХВОВХВ ХХБВХОВ | одоутя ХВ Екс, ЕОІ (1050), 5УХМ (1044) | (647) асу (1045) кв(047) 0 О8ХМНЕВ
ЕХОНОХА геХМНЕе.
ТМУМРОХ | РоХ (1052)
Ка(1048)
МІМЕрХЗ
МЕУУАЮХ
УКО (1058),
МІМЄЕС5
МЕУУАОВ
МТ (То55) УК (1059), вхвоххВ ХХеХХОоХ ОНОБУР. УМО ГеВМЕХЕХ 88 МОХ (1053) (1054) тмут (1056) | У ХХН (639) уко (1060) ХО (1063)
ХОНОБУР ММЕвОВ
ТМУТ (1057) МЕУУАЕе
УКО (1061),
ХМЕОХОМ
ЕУУХОВХ кх(1062)
Таблиця В
ТІЛА-зв'язуючі послідовності СОК із заміною , ІО МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) антитіла сІіБССОС
ЗГУМАОХ ука (1066),015 саАаса5тгУ
МАЕБУКО
(1067),
ХХБХХХХ
ВхБОоБ5Х5 |ХХ55ХО5 ОО5У55Х ЕХХХХЕО 89нУ ЗУХХ5 (994)| БТ УХО5
МУХМ (1064) | (647) Т(1065) ХКХ (1068), Хх(1071)
ХХБХХХХ
5ТМУхХоХ
ХХ
(1069),ХХ
ЗХХХХ5Т
МУХЕБХК х(1070) оМХМнНУХ
РОХ (1075), ото7 |ВХВОМХе |ТХ8ВХО8 о доутяр ХЛ ЕАУКРеХ РОСМУНУ
ЗУХМ (1072) | (1073) (1045) к(1074) АРБОІ (1076), рОХМУНУ
ХРЕОХ (1077) в55055Х ОВК. МХМРМХХ
УБОоХМТУ ЗММУЕВ ХТМУХОК хХМ(1078), (1082) ЕВХ (1088),
ЗОБУ КХО5ММУО5 |ХОХТНМР |ХУУХН УМРОБО ХХБМЕХЕ 9110 1С1 | м5ОСОТУ аТМмМАОК /М(1079), (1083), (1086) (1087) ЕВС (1089), рх(1091)
КХх5ММОХ в55055Х (1084) МХМРОБХ
УБОоХОТУ КХеММЕВ ХТМУХОК хМ(1080) (1085) ЕВХ (1090)
МХМРМХХ хХТМУХОК
ЕВХ (1088),
ЕЕ 12 вхБОоВ5Х5 ІХХ5АХОЗ |00505тТ1Р |ІХУУХН отМУАаК ХХБМЕХЕ
ЗУХМ (1044) | (1092) ХТ (1093) (1087) ЕВС (1089), рх(1091)
МХМРОБХ хХТМУХОК
ЕАХ (1090)
Таблиця В
ТІЛА-зв'язуючі послідовності СОК із заміною . ІО МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) антитіла вІБОБОС
ЗАУМАОХ
Ука (1095),
ХХБХБХХ
ВхБОоБ5Х5 |ХХ55ХО5 ООБЕБТХ ЕХХХХЕО 9128 ЗУХХ5 (994)| БНУУХО5
ЗУХМ (1044) | (647) Т(1094) ХКХ (1096), х(1071)
ХХБХБХХ
5АУУХоХ
ХКХ (1097)
МХХРМХХ
ООБОХТР ІТ хтмухОК
ЕОХ (1102), (1099), УЛІРОЗС 9203 вВх5ОоБ5Х5 ІХХ5АХОБ 1О0О0О50ГТР | ХУУХН СТМУАОК Х5ЗМЕХЕ
ЗУХМ (1044) | (1098) ХТ (1100), (1087) рх(1105)
ООЗОХТР ЕОа (1103),
Хт (101) МХХРОБХ хХТМУХОК
ЕОХ (1104) вІБОВНОС
ЗГУМАОХ
Ука (1108), вІБОВНОС
ЗГУМАЕ5
Ука (1109).
ХХБХНХХ
ВхБОоБ5Х5 |ХХ55ХО5 ООБЕ55Х 5ТМУхХо5 ЕХХХХЕО
ЗгЕ5 НУХМ (1106) | (647) Т(1107) ЗУХХ5 (994) МКХ (1110), | Х(1071)
ХХБХНХХ
5ТМУхХоХ
УКХ
(1117),ХХ
ЗХАХХ5тТ
МУХЕБМК Х
(1112)
Крім того, переважними є антигензв'язуючі білки, що містять послідовності СОК зародкової лінії, з'єднані з антитілами, представленими в Табл. А. Такі послідовності представлені у Табл. С.
Таблиця С
Послідовності антитіл проти ТІ1А, споріднених із СОК зародкової лінії
Позначення антитіла, спорідненого | СОВА (5ЕО) І СОВ2 (5ЕО 1 СОВЗ (5ЕОІНСОВІ1 (5ЕО|НСОНВ2 (ЗЕО|НСОВЗ (5ЕО із ІО МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) зародковою лінією мера ТТУТУМУ
Ука (254) (255)
Таблиця С
Послідовності антитіл проти ТІ1А, споріднених із СОК зародкової лінії
Позначення антитіла, спорідненого | СОВА (5ЕО) І СОВ2 (5ЕО 1 СОВЗ (5ЕОІНСОВІ1 (5ЕО|НСОНВ2 (ЗЕО|НСОВЗ (5ЕО із І МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) зародковою лінією осі1 ВАБОБІЗВ |ААБІОЄ |005У5ТР |5УУМВ МА ЗУУУЕО
УМ (229) (112) УМт(231) (256) (172) (258) осв ВАБОБІЗ5 |ААВІОЄ |005У5ТР | 5УУМУВ МемреіКе ітоУвО
УМ (229) (112) УТ (234) (259) (260) (261)
К5БОБМІ. ВТУУВ5К драму 2383 У5БОММКМ п по 87 Р ов) Ам МУМОМАМ |УКУаМО
МІ А (235) ЗУК5 (184) | (264) озвзуна ВАБОСІЗ |ААБТОВ |ОКУМБАР./ |8О5УУМУВ МАКИ МитоМО
ММІ А (241). |(242) ІТ (243) (268) (269) (270)
ІїмБасеТУ |НООУМУУ
ВАБОСІБ ААБ5ТІ 05 ОКУМ5АР 2383 УНЗ ЗМУМ5 (271) МАОБ5УКОа |УУУУаМО пвоуюо миле ее) сте) вит) (272) (273) звз |ВАБО5У8 |САБ5ВАТ | 00УС8Р П|СУУМВ МКК СО З
ЗОЗМІ А (238) | (124) (240) (265) (266) (267) 5б4 ВАБОЗУЗ САВОВАТ /|ООХОБОР ІТ СУУМУ МКК Со
ЗОЗМІ А (238) | (124) (240) (265) (266) (672)
МІБЗМРрО5 аттатТУУ 17Е9 МО (22в) терни ге М ЗМУАМН (253) МКУМАО5 | УУУамМОМ ка (254) (675) 8550511. 5І55555У щ |СІАААСУ 5303 НОМаУМУ (935), АБ мо (936). Р ЗУ5БММ (950)1иМАОБУК |УУУМамМОо М
ГО (1113) (щ(951) (952)
К5БОБМІ. мжмухУроБ ЕМ5555У
БАЕ5 У5БОММКМ п мтв3в) ва МКУМАре |мУУаМо
МІ А (235) УКОа (953) |М(954)
К5БОБМІ. мжмухУроБ ЕМ5555У 5бЕ1 У5БОММКМ п Мт 938). в МКУМАре |мУУаМо
МІ А (235) УКОа (953) |М(954) тТОа555МІ дІЗОаБОС аттатТУУ 57АВ вАСУрУН па ВОМ (7 1) ЗМУАМ5 (836) БТУМАО5 УуУчамом (146) ка (956) (675) тТОа555МІ дІЗОаБОС 58О5 вАСУрУН па вому 07 ЗМУАМ5 (836) БТУМАО5 во (858). (146) ка (956) тТОа555МІ дІЗОаБОС 6оа11 вАСУрУН па вому 07 ЗМУАМ5 (836) БТУМАО5 во (858). (146) ка (956) тасо ВАВОВБІБВ |ААББІОЄ |(005У5ТР | ЗМЗААММ я СІАУАОМ
УМ (229) (112) УТ (234) (262) УКВ (184) М/РГОР (961)
Таблиця С
Послідовності антитіл проти ТІ1А, споріднених із СОК зародкової лінії
Позначення антитіла, спорідненого | СОВА (5ЕО) І СОВ2 (5ЕО 1 СОВЗ (5ЕОІНСОВІ1 (5ЕО|НСОНВ2 (ЗЕО|НСОВЗ (5ЕО із ІЮ МО) Ю МО) ІЮ МО) Ю МО) Ю МО) Ю МО) зародковою лінією твда ВАБОБІБ5 |ААЗБІОЄ |005У5ТР | ЗМБААМ/М я СІАМАОМ
Уимі(229). | (112) Уут(234) (262) вукв (ів) УРОР (6) тріо ко ЗММОВРУ |ААМ/ООвЇ |СУУМН СТМУАОК ЗІДАВАЕУ (947) (948) МС (949). | (857) Росіеєе ОН (964) втнії ВАВОБІЗЄ ААІОя |005У5ТР |ОУУМВ МКК ОУСОУОА
Уимі(229). | (112) Уут(234) (265) (вв) ЕОІ (966) ввно ВАЗОСІВ ААВІОЄ ОНМеУР |5УСМН КУА ВУЛ ОГУЕ
МОГ а (226). | (112) мут(228). (164) уко(а5а) 067) дІЗО5ОС
ВАЗОЗІЗ5 |ААБІІО5 | ОО5У5ТРІ т МЕМАТ І ОА воно 5УАМ5 (836) 5ТУУАО5
Що л-м(ггв) Да) (Зла) вилив за Ука (956) рі (968) зіру |ВАБОВІЄВ ААБІОЄ 005УВТР |У МКК ОУСОУрА
Уимі(229). | (112) Уут(234) (265) (вв) ЕОІ (966)
АЗБОБМ Кувмвно5 омостнму |сУУМН УМРМЗО |сувусуу
Фіто с УБООМТУ |З) РЕтія (857) ОТАК |У (968)
Їм (753) РОС (963) зівї0 со ВАВОВІЗ5 |ААБЕІО5 |005У5ТРІ. |СУУМН СТМУАОК СУЗУСУУ - Уимі(229). | (112) т(942) (857) Росеєз РО 969) дІЗО5ОС
ВАЗОЗІЗ5 |ААБІІО5 | ОО5У5ТРІ т ЗІААВОАЕ ПІ 9168 5УАМ5 (836) 5ТУУАО5 нев л-м(ггв) Да) (Зла) вимова Ука (956) (970) з2рз | ВАБОБІЗВ |ААБІОЄ О05У5ТРІ | СХУУМН СТМУАОК СУВЗУСУУ
Уімі(229) | (112) т(942) (857) Росеєз РО 969) діІЗО5ОС
ВАЗОЗІЗ5 |ААБІІО5 | ОО5У5ТРІ т ЗІААВОАЕ ПІ 925 5УАМ5 (836) 5ТУУАО5
ЩЕ пом(етв) (19) (ла) вилив, уУка (956) (970) ввне ВАЗОСІВ ААВОЄ ОНМеУР |5УСМН МКууАОВ ВУЛ ОГУЕ
МОГ а (226). | (112) мут(228). (164) уко(58) ОХ 967)
К55О5М УМ/УрО5 ТЕМ5555У
БАЕБ У55ММКМ п Мт 938). в МКУУАре |УУУУоМО
МА (235) Ука(953) | М(954)
К55О5М. УМ/УрО5 ТЕУ95555У
БбЕї /|У55ММКМ п Мт 938). в МКУУАре |УУУУоМО
МА (235) Ука(953) | М(954) 8555 5І55555У ІОСІАААСУ 5ЗОЗ 0 НеМсУМУ в (тв). Р |вувмм(95О) УУАОвУК | УУУУСМО
Го (1113) (951) м(952)
Таблиця С
Послідовності антитіл проти ТІ1А, споріднених із СОК зародкової лінії
Позначення антитіла, спорідненого | СОВА (5ЕО) І СОВ2 (5ЕО 1 СОВЗ (5ЕОІНСОВІ1 (5ЕО|НСОНВ2 (ЗЕО|НСОВЗ (5ЕО із ІО МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) зародковою лінією дІЗаБИаС
ВАБОБІ55 |ААББІ ОБ ОО5У5ТРІ МЕМАТІВА 89нУ ЗУАМ5 (836)! БТУМАО5
Що ММ (229) (112) (942) уки вв УКО (956) ЕОІ (968) дІЗаБИаС
ВАБОБІ5О |ААББІ ОБ ОО5У5ТРІ ЗІААНОАЕ ОЇ 9128 ЗУАМ5 (836)! БТУМАО5 тов | м е2 0 КИ Гог) ням во) УКО (956) (870) дІЗаБИаС
ВАБОБІ5О |ААББІ ОБ ОО5У5ТРІ Т 9ЗІААВОАЕ 92Е5 ЗУАМ5 (836) БТУМАО5 зе | еВ ОВ шо сем) Уко(ввв) д»2рз |ВАБОБІЗЗ ААЗВІО |005У8ТРІ. |СУУМН СТМУАОК сУвУСУУ
ММ (229) (112) (942) (857) РОС (963) ЕОМ (969) візо со ВАБОВІЗ5 |ААЗБІО5 | 005У8ТРІ ТСУУМН СТУЛОК СУЗУСУУ - ММ (229) (112) (942) (857) РОС (963) ЕОМ (969) зіру |ВАБОВІЄВ ААБІОЄ 005УВТР |У МКК ОУСОУОА
ММ (229) (112) УТ (234) (265) (266) ЕОІ (966) вда ВАБОВІЗ5 |ААВІОЄ |005У5ТР | ЗМОААМ/М крему |ВІАУАОМ
ММ (229) (112) УТ (234) (262) УКВ (184) М/ЕОР (961) втнії |ВАБОВІЗ5 ААВІОє (005У5ТР |сУУМЯ Кров |ОУСОУОА
ММ (229) (112) УТ (234) (265) (266) ЕОІ (966) вВтУУвВоК 7362 ВАБОБІ5О |ААББІ ОБ ООБУБТР |5М5ААМУМ |МУМОМАМ |СІАМАОМ
ММ (229) (112) УТ (234) (262) 5УК5 М/ЕОР (961) (184)
ЗОБУ кКУ5МНО5 |МмОаТтТнУ СУУмМНн УЛМРМ5О вУБУСУУ 9110 ІС 1 | М5ООМТУ (943) РІ-Т (944) (857) етТМудОоКк ЕОУ (969)
ЇМ (753) ЕОа (963) тТОа555МІ дІЗаБИаС 611 вАаУрУН п вому 707) ЗУАМ5 (836)! БТУМАО5 во (858). (146) мука (956) тТОа555МІ дІЗаБИаС
БВО5 0 |САСУОУН па вому 07 5УАМ5 (836) 5ТУУАО5 Ох (958). (146) Ука (956) тТОа555МІ дІЗаБИаС сттатТУУ 57А8 вАаУрУН па ВОМ (7 1) ЗУАМ5 (836)! БТУМАО5 УуУчхамоми (146) мука (956) (675) 77012 ко ЗММОВРО |ААМООбІ |сУММНн СТМУАОК 9ЗІАДАВАЕУ (947) (948) МОаму (142) 1(857) РОС (963) ЕОН (964)
Додатково переважними є антигензв'язуючих білки, що містять послідовності варіабельних доменів бажаних антитіл проти ТА, як представлено в Табл. О. «МН», як представлено в Табл. 0, скрізь відноситься до варіабельного домену важкого ланцюга, «Мі» - легкого ланцюга. Молекули в об'ємі цього винаходу можуть містити модифікації послідовностей, представлених у Табл. 0, включаючи укорочення або заміни з метою забезпечення стабільності або інших функціональних можливостей або видалення гарячих точок мутагенезу (хімічна або фізична модифікація амінокислот).
До винаходу додатково включені молекули, що володіють ідентичністю послідовності щонайменше 90 до з послідовностями, представленими в Табл. 0.
Таблиця Ю
Послідовності варіабельного домену бажаних анти-ТІ 1А антитіл
Позначення . . .
Амінокислотна послідовність (5ЕО ІЮ МО) антитіла
ГлОМТОВРЕБІ БАБУСОВУ ТТ СТ ЗОСВОГ УТ СОЮКРОКАРКВ ПА
ЗОбМІ. ОО УеаиКВОВОБОаТеЕКТті ПО ОРЕОКАТУУСІ СОМНОБУВЕТЕСМЗТ КМ ків
СОУС УКОСУ УОРОНВ КІ ВСААВОКТ РОЗУМУ У ОАРОКОЕУУУАУ
ЗзобУН мсек УТоУКОаВЕ пек аКОТ У СММО КАСКО ТАУУСАВСВТУТ
СУТ ОМОМмАНІ ТТ УТУ ВВ В
СОМ ТОВ БИ ЗАВУСВВУ ТТ ОКАБОВІЧН МУ УООКРОАРКИ МАТОМ
211 мМ. сшаОУуаКеОаО ОКО ПІБ ОРЕОСКАТУКСОСОУ ВІКО КУЄ
С
БУС кВОаОо УКеВЕТ ВТО УВС Ома УМАКИаее КС КУ 2511 УН ЗІ УМРІ КОМУ МОТКІВ УТААСОСТАМУУСАКЕНУВУ ОМ
А ОСБАГС МТУ 15)
ГОМ ЗЕ БАБУ ОСКУПТОСВАБОВБИЧМУМУУУ СОМВРОКАВКЦІААВВЗ
9С8М ОБО УРаКРС ВО ТЕ ПО ОРОС АТ СОУ ТЕКС ТК
Ка
ЗУ ОЕВБОРО УРОК ВТС УСС НОВУ Оу КОВО КС ЕМО У У 9с8Ун БОМІКМР КОКУТ НТ КОВКИ ЗБУТААСТАМ ТУ САВНЕТОВ ОКО чув УТУБ 16
ПРУМТОЗРОВ АУБ ОЄКАТІНСКОВО ВУ УВК УУУу ВОК Кі 2383 МІ М УУУАВТКЕВБЗУРОВЕВОСВОБОСТОЄТІ ПО ОАКБОУАУУОСНУКТ ТЗ
ОСТ КМЕІК В
СМС ОСС УКРВОТІ В ТОМІ ОБУ ТВ УА МАО ЕУМ
2383 УНН КУТКУ МОТАУБУКОВКІ НОТ ОКО ОНЕУ ТРЕВТАУТУСАВЕКО спеку сМОоУУй ост гУТУВО ОЦ
ЕТО ВРОТП В ВРОЄКАТ ЕСКАБОЗУВООИ ААУ СОКЕЗОАВВ УА
Зв МІ. БЕАТОНВОВЕ ВО ВОВО ТОК ПІБ ЕРЕПКАУУ СОУ ОВЕС КІ
Кі
УСІ СЮУУСВАСНІ КВТ ВІ ТОАУНОСВЗЕО УААН ОВВО КОСІ КУЛОН
Зв МН ЧНАСМІМУМе І КЗКУТІВІ СТОКОВЕ ЗУТААТАУТУ САНОК
УКОСУ ТУ ВВ рюмМтОРЕБ БАБУСІ У ПТС У ВОК УС КРОКУРКІ 2383 МНА МІ | ДАТ КЕВОУРЕНЕ ВОВК ПОВ ОРЕОУАТУ ОККО
ЗОеТиУЕЖК ОВ
Таблиця Ю
Послідовності варіабельного домену бажаних анти-ТІ ТА антитіл
ЗзУсСЕЗОРСО УКВ СТО ВУ З ВЗУАЛУАУАКОаРРОВБОКУЛОМ
ПЕЖУВУСМОУУчОСО ТУТУВО (28) рюмМТОоБРОБООАВБУОКУ ПТОМКОВОЗУМ ТОЗММКМУ УУУУСЮКРОКУРКІ
ЗаТеЕМЕК
ВУС ЕЕ ВО СО МОРОЗСВІ КІ ВСАА ВО ПУТ МОМАМНААМНОАРОКОЇ ЕУУУВ оБтУКтТаМОУУцаТ ТУГУ
ЕУСТОБРОТІ БСБРОЄКУ ПООСКАБОЗУВЗО САМУ ОСОМАСОЮАРК ТЗАВ адм ЗВАТОІРОКЕБОСВСЗОТОП ТК ЕРЕЙВКАЧУ СОУ ОЗ КОМО ТАКЕ
КАТ
ПУСКОМ САСЄСКРЕЕТ БСТСЮМУаБЕБО УМА КОВО КОЕУЛОКІ
СЕЗ Мт ум
Ома БАБУ У ПОСВАБОСТІМО АМУУООКРОКАРККИЛЕААВВ
ЗУЄ УВО ОВ УУ ЄВРО ВСААВОКТІ ЗБВ'СМНУУУКОАРОКОСЕУУУАУ 17ЕОУН МАО ММК УАПВУУКСОСВЕ ТЕНТ ОМ КАКЄОТАУТСАКОКТЕ
ТУУууУ НИК ОЗТТУТУБО (497)
СУМ ТОРІ В РУТВОЕРАБІЗСВУ В КО МОУМУ СМУТОК РОСОРОЦІ
ОТКУВК (ОВ)
ЕУССУКООООСУКРОСЕ КО ОЗСААЗЕКТЕОТ ТУ МЗУУУКОАРОКСЬЕУУМОКИ
5303 УН ЗВБББЕРТАВЗУКОВЕТУКОМАКМО УК ОМ КАКОТАУУ УСАКОМІДАР
ТУ УОМОоОУМСОТ ТУТ УВО
СУМТОКРОБАУМ ОЄКАТМСКЮВБОМН УВО М У АУУУВОКРОСВРЕІ аку
ОУСІУЕВОСОУМОРОВБІ КІ БСЛАВСЕТК ЕТ УСМНУУКОАРОКОСКАМАУ
Б5АЕ5 УН ВУС БМЧКОХАВЗУКСОКЕ УБКОМОЗКОТ МОМ КАЕСТАУТУСАВСЕК
ОУН МОУУчОцО гм УВО (2)
ОІУМТОВРОБІТУВСОБОАТІМСКОВОБМІ УБЗММКМУ АМУТООКРООРЕВІ. 56Е1 МІ МУУУАВБТКЕЗОУРОВЕВОВОБОТОЄТ ПЗ ОАЕОУАУУ СОДУ Мет
ООТКкУКІК (87
Таблиця Ю
Послідовності варіабельного домену бажаних анти-ТІ 1А антитіл антитіла
УСІ УМЕВОСОЮУМОРОВО НІ ЗСААВБОКІКБУОМНУ УКОАРОКСКУУУАХ
ВеУНУСМОУУчЧОСО туту (876
СОМ ТИРВБУВОАРООВНУ ТЕСТ ОВБООМЗАСУМУНУУУ ОС РОТАВК ТО
57АВМІ. МиМеРОСУРОКРОООБОО ЗАЧ АТ ОС Т ЧКАВТ СОУ МВВ БОУУУКО
ОК МІ (878)
ЕЕ ЕБООЗЄН УСС НІ БОУАЗОКТЕВВТУМБУУКОДРОКСН ЕМВ
УутуБОоМмОУУМсООТтутуУєа (ВО
ОВМТОРРЗУЦОАРООКУ ПОСТОВУЗМЮАВУОУНУ ОСІ РОТАВКЦМО
58Оа5МІ МанНАеРЗОУРОВКЕСВКОСТОЗАУЧМ АТС ЗАСОБАМ Оу
ОТКУТМ (ВУ)
ЕМО ЕЕ БОС МО РОВІ КЕ ЗСААОВЕТЕ ОВТ АМОУУУКОАРОБОСМУУ ВИ
Ду ТУТ УС СОЯ)
Ом ее ЗУзалОо ВУ ТО ЗО НОАО УНУС РОТАРКЦ ТО
СКУ ВО
ЕМО ЕВБООС МОРОСВ ВІ ЗСААБОКТЕУЧУ АММУУУ КОЛ ВООКОЕ ДАРИ
АУЧЕКОТУУуВОСТ ТУ (ВВА рюмтавРОВчАЗУСОВУ ПТ СНАВОБК БО НУУТООСКРОКАРЕЦІХААВО
Кк (ВО
СОУС ОО БОРОСУКРВОТ ВТ САБО, ОА ГАМУ КОВРІНОС КУ
УАБРЕАРТОРУУЧСОСТ МТУ В (95
Юм ОБО ЗАЗМОЮКУПТОВАЗОЗУ ТОМ МУ ООКРОКАРКІУТАВО 76АЗМІ. ГОББСА БОТОКТ ІЗ ОРЕСКАТУКСООСсВТЕМЕРОСОТКІ КІ и деечнеектиткотикисюєнтнсмя
Уа КОоУКРаТЦе САПЗОЮВУ ЧО УУМУЛНО ВОГОНЬ ЕУМ ОО 76А4УН ВТК ЧОТАУВУКВВИ ПУРОТаЕКНОКВІ ОС МІУТРЕЙТАУУСАКЕУУ
АОРБУУКОРУВЗСВ ТТ УТУВБ (ВО
СОМ ТОРВБАВОТРООКУ ПООСЗЕБМООЮТМАУМУ УСОКРОТАВКЕ БУ
77т7012М1 ККЗ МРОКи ВОСКУ ВАВ АБО ОЗЕВЕАВУУСАТАВОМ МО КСО
ТКУ (ОЮ
Таблиця Ю
Послідовності варіабельного домену бажаних анти-ТІ ТА антитіл
ОМОГУСАОСАБУККРОАВУВУВСКАВОТ ТК ТОК УМНАУВИАРООСІ ЕУУМО
АУАСТУУЧЧООСТІ МТУ ВО (900
ПІЮМТОБРЗВІБАЧУСОВУТТОРАБОБІЗВУМУУУООКРОКАРКЦ ТУЯ
ЦЕ (902)
ОКОМ АСИ КРУТ ЗТ САУ ТВО ОМ ВАНОРРОКО УМОВІ
87нНІї1УнНО | МНОСВТМУМРЕ КОВУТІЗУЮТЯКМОКВІ КІ ОБМТААОТАУУУСАВОВОМУНЕ
ЗЕСПАООЮСТМУТУ ВВ (904)
ОКІМТОЗРОБЗІ ЗАЗУСОВМ ПТСВАЗОВІНМОСОУУТОЕКРОКАРКВИТААВО
ЕКОН
СУС УКООСАСУУОРОВОВ ВСАА ТРУВУСМНУУНОАРОМОГЕУУУАМ
ОЕЦОУУУСВОСТІ УТУВВ (908)
ГОМ ВР ЗВ ЗАВУВОВУ ПТСВАБОВІВ Є МАУ ДОКЕОКАРКК ТАКА вономі | ОЗОУРОВЕВОВОЗОТОКТ ІЗ ОРЕОКАТУУССЮВУВВІТКООСТК ЕК нен. | ответ кто яння
ЕУНЦЕВОСОГУОРООЗКОСААВОКТРВБУАМОУУУВОАРОКОМЕУУВОЇ
РЕНУУЧВОСТМУТУВЗВ (91)
ГОМТОЗРОВІАВЗУВОВУТ СВАВОМІЗВУ С МАУТООБРОКАРМ ЕЕ КТАВО
ВІКО
ОМОГОСУЗАСИКРОЕ ПО ТО УООВЕЗОТУ КВУ РОКО УМОВІ
АЕОПАНЗООСТМУТУВО ОТВ
ПУУМТОЗРІ З РУТ ООБАВЗСВІЗОВУТВООМТ У МАКООКРОКОРАВ
ОООСУЗВОАЕУККРОАВУКУВСОАООУТЕТАХУМНУУВОАРОВОС ЕМО
УУЄОЕПУУВОСТІ УТ (920)
ОРюЮМТО5РОБІ ЗАЗУВОВУТТ САБО МАЖООКЕОКАРКР ГУЛАБВ 9110 сг М ГО5СУВВВЕВОВОВОТОКТ ТОВ ОРЕОКАТУУСЮСВЗОВОВТЕТКОООТКЕЇ
Таблиця Ю
Послідовності варіабельного домену бажаних анти-ТІ 1А антитіл
Амінокислотна послідовність (5ЕО ІЮ МО) антитіла
СОС МО ВОАЕУККРОАВУКУ ВСАА ТЕТАТУ МН АУУВОАРСЮ СО КЕУУМО
9110 1 С2 МН УЛ О ТМ АОКЕКОВУ ТМ КОТА УМЕ ЗК КЗОСТАУТУСАТОСВ
УСС УУВат УТ (20
ГОМІО5РЕОВІ ЗАБУВОВМ ПТОВАЗОВІОВИ МУУТООКРОКАРКР У ААВЯ 9128МІ. СКЗ УВК БО ОК НМ СРЕОКАТ У СОС МТС КК (А)
ЕС ЕС МОУ ВІ ЗСУАВОЕТКЕЯВАМОУУВОАВО КО ЕК АМС
918Ун ОО Є У АЙБУКСВЕ ПОВОМОКМ ПУ ОММОКАКОТАУТУСАКУАСА
РОМЕО МУ ТУЮ (ОВ)
СМТ ОБР БАЗУ УТТОКАБОБІООТ МУ СОЦДКРОТАВКР ГУ ОА
9203М. ОБО УРБВЕВОВОВОТОРТ ПОЗ ОРЕОКАТУ СОСОК КЕ ків
СМС УЛОВАЄУККРОАБУВУВСКАВСУТЕТОУУМНАЙВОАРООО УЛ УУ
9203УН ПРЕМЕООССТМУАОККОСКУТ МОТО ВТАУМЕС ОВ КБОЮТАУУ УСАТОЗОМУУ
КОКСУ УУСОСТЬ МТМО (930
ТОМІ БРЗБІ ЗАБУВ УТТСНАБОВМОНУ МУУУСВОКРОКАРКЕИТААВЕ
92ЕБМІ. ощБаУувеАЕеаа ЕТ ТВО ОРЕОКАТУ СОБКО (а32
ЕУНЦ ЕС МОРС ВІ ЗСААВОКТЕ БВ АМБУ УКОСУ КО С ЕУУЖ ОСИ
92ЕБУН БавООсаТеУАЙЗУКОСВЕТВВОМОКМТ М ОМОБКАССТАУУМСАНМАСА
КОМАОСТМУТУВО (34
Кожен з наведених вище поліпептидів кодується нуклеїновою кислотою, яка має нуклеотидну послідовність, що безпосередньо передує поліпептидній послідовності в Переліку послідовностей.
Переважними є послідовності з антитіл 9С8 і 383.
Повнорозмірні послідовності антитіл проти ТІ1А, представлені у Табл. Е, є переважними для антитіл проти ТІЛА. С відноситься до легкого ланцюга антитіла, НС - до важкого ланцюга. До винаходу додатково включені молекули, що володіють ідентичністю послідовності щонайменше 90 905 з однією або обома послідовностями легкого ланцюга і важкого ланцюга із Табл. Е.
Таблиця Е
Переважні анти-ТІ ТА-антитіла о Повнячення Ледий ланцюг 5ЕО ІО МО| Важкий ланцюг 5ЕО ІЮ МО антитіла молекули) 284112 2011 285396 17968. | 75877777 77717171717171171607771717с721С у 285412 2383 290043 383 | 7777/7667 7771717171717168 42 308844 2383 НС 325246 2383 НСЗ 325336
Таблиця Е
Переважні анти-ТІ ТА-антитіла
І Легкий ланцюг 5ЕО ІО МО) Важкий ланцюг 5ЕО ІЮ МО антитіла молекули)
Кожна з амінокислотних послідовностей в Табл. Е кодується послідовністю нуклеїнової кислоти, що безпосередньо передує їй в Переліку послідовностей. Переважними є послідовності з антитіл 9С8 і
ЗВ3.
Наведені вище послідовності антитіл проти ТІТА можна застосовувати в біспецифічних антигензв'язуючого білках будь-якого з описаних в цьому документі форматів. Переважно такі послідовності застосовують в антигензв'язуючого білках гетеро Ід і біспецифічних антигензв'язуючих білках Ід0-5сСРм, як описано в цьому документі.
Гетеро Ід біспецифічні антигензв'язуючі білки
Винахід додатково відноситься до біспецифічних антигензв'язуючих білків гетеро Ід, як зображено на Фіг. 1, що містять одиниці, які специфічно зв'язуються з ТІ1ТА. Структурно, біспецифічні антигензв'язуючі білки гетеро Ід містять: (а) варіабельний домен легкого ланцюга одиниці, що зв'язується з ТІ ТА, який міститься в легкому ланцюгу, окремо від варіабельного домену важкого ланцюга одиниці, що зв'язується з ТІЛА, варіабельного домену важкого ланцюга, спрямовано діючого на інший антиген (наприклад, ТМЕ-о), і варіабельного домену легкого ланцюга зв'язуючої одиниці, спрямовано діючої на інший антиген; р) варіабельний домен важкого ланцюга одиниці, що зв'язується з ТІ ТА, який міститься у важкому ланцюгу окремо від варіабельного домену легкого ланцюга одиниці, що зв'язується з ТІЛА, варіабельного домену важкого ланцюга, спрямовано діючого на інший антиген, і варіабельного домену легкого ланцюга, спрямовано діючого на інший антиген; (с) варіабельний домен важкого ланцюга, спрямовано діючого на інший антиген, який міститься у важкому ланцюгу окремо від домену легкого ланцюга, спрямовано діючого на вказаний інший антиген, варіабельного домену важкого ланцюга одиниці, що зв'язується з ТІЛА, і варіабельного домену легкого ланцюга одиниці, що зв'язується з ТІ ТА; (4) важкий ланцюг, що містить варіабельний домен важкого ланцюга одиниці, що зв'язується з
ТІЛА, ковалентно з'єднаний з легсим ланцюгом, який містить варіабельний домен легкого ланцюга одиниці, що зв'язується з ТІ ТА; (є) важкий ланцюг, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, спрямовано діючого на вказаний інший антиген, ковалентно з'єднаний з легсим ланцюгом, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, спрямовано діючого на інший антиген; і () важкий ланцюг, що містить варіабельний домен важкого ланцюга одиниці, що зв'язується з
ТІЛА, ковалентно з'єднаний з важким ланцюгом, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, спрямовано діючого на інший антиген.
Для таких біспецифічних антитіл гетеро Ід, одиниці, що специфічно зв'язуються з ТІ1А, переважно містять один або більшу кількість СОМ, наведених у Табл. А. Можна застосовувати домени варіабельних ділянок з Табл. ЮО, але переважним є, щоб одиниця, яка зв'язується з ТІ1А, містила заряджені амінокислоти, що сприяють правильному збиранню біспецифічного антигензв'язуючого білка гетеро Ід (див. Фіг. 1). Послідовності варіабельної ділянки, переважні для біспецифічних антитіл гетеро Ід, представлені у Табл. Р. Як і раніше, МІ в Табл. Е відноситься до варіабельної ділянки легкого ланцюга, УН до варіабельної ділянки важкого ланцюга. 5ЕО ІО МО з Переліку послідовностей наведені після кожної послідовності в Табл. Е.
Таблиця Е
ТІ1 А-специфічні варіабельні ділянки гетеро Ід
Амінокислотна послідовність (5ЕО 1Ю МО)
ЕМЕТОБЕТ В ЯРОЄКАТ ВОСВАБОВУВОВИ АУУУОСКРОЗАВВ ТАБ
78 варент | ЗНАТСІРОНЕВОВОВОТОКТІ ТІЗНІЦЕРЕОБАМУУСОЮТОВВеТЕОО СТА кеВ
СУС ООУУВАСИКРВЕ ТІ БІТСАУНООЗРООУ УУМУМУЛВОРВОКСМЕУМОВІ що м МНАСТЕМУМР КОКУ ТВ ЗТ ЗКМОКВ КТ ОУТААСТАУТУСАНОУСВВТ
СТО моОст УтУкО (2
ПОМТОЗРУВ ЗАБУСОВУ ПТСВАБОБММУ МУ ОСОКРЕКАРК АТО
2911 верент о8ОсУРВВЕВОВОВОТОРВІТІЗВЦОРЕОБАТУКСООВУВТРАТЕООЮТКУВІ кН
СУС ОВО РОУКРЗЕТ ВІ ТСТУВОСЄВВУРУВУЛКОВИОКОС АОС
7 м вОБІМУМРЕКОКУТМОЮТОКМОКО КІ ЗБУТААЮТАУ УААН УСКО
АКОТ У ТУ ОА рюМмтТавиБОБАСУСОВУТТСКОМОВУ У БМК ЛА ОСКРОКУРКІ 2383 МНА МІ | УРИУАЗТ КЕВСУРЗНКБОБОБОТОК ТЕ ПЗВ ОРЕСУА ТС УТРО атм Кк а
СО ОЕБОРОГ УКР Н ТС УВ МУ ААУ В ОРВОКС ЕМ
2383 МНА МН | ТтУКОКУУУМОХАУВКЗАУТЕРОТ ОКОМ КІ ЗЗУТААВТАМУ УСАКЕСНХ реБУтТкТОМОУуУСт у УЄа (258)
СІОМТОаБеВВ ЗАБУСОКУ ПТ СКОБУ УЗОММАМУ УУУУОСКВОКУРКІ 2383 МНЗ МІ | ТУУТАВТВЕВОУВВВЕ ВООЗ ТОК ТЗ ОРЕОКАТУУСОСУУКТР ТЕО
ЗаТКкУЄІК (а
МОЦ ЕБОООСУОРООСВЕВ САЇЗОВВУВІ МОУАУЧМАННОАРОКОС КУТУ
2383 УНЗ МН | ЕТ ЗКУ УМОУАУВУКОВАЕ ПРОТ ЕМ СМР МАКЕТА САКЕ
ОБУ УМОУУуєсюС ТУГУ ІЗ
СОМИ ЗАБУСЮВУ ПС ВОВКОМ ОУУУООЮКРОКАРК ТУСАБО св чІрант | ГавоУввеквОоВОоОтТЕКТІТВВІОРЕОБАТУХСЬОНМЕУРеТЕВООТКУ І
Кк
СУС УВО ОСУМОРОВО ВІ ЗСААВОКТЕ ВОД МНУ УКОАРОКСЕ ЕУУУАУ св черант ПЕуроммкіуточУКОВЕТІВнОреКВ ПЛ ОММВІКАЕОТАУУУСАВОВТУТ
СТУ ОМО АС ОСТТУ Уа ЗОВ)
Таблиця Е
ТІ1 А-специфічні варіабельні ділянки гетеро Ід
Амінокислотна послідовність (5ЕО ІЮ МО) антитіла
ОМ ТОБРОБІ БАБУВОВУТ ТТ СВТ ОС ОВ ОУУОСКРОКАРККО т ОА
Зоб М ОБУ БОВБОВБОТЕКТ ТІВ ОРЕОБАТУ УСІ ОН ТЕССОТКУК!
КОЮ
СУМИ ЕВ Оу УСДРОМКЕ МІ ЗСААВОКТЕЗО ОМА ОАРОКСО БУТУАМ 306 УНН БУСОМУК УТОБУуКОаВеТІЗКООБКЕ ТИ ОМ КАЕОТАУТСАКОВТУТ ууУУтоМмОоУмОоОс ТУГУ 30
Кожен з поліпептидів у Табл. Е кодується нуклеїновою кислотою, яка має послідовність, що безпосередньо передує поліпептидній послідовності в Переліку послідовностей.
До обсягу цього винаходу входять молекули гетеро дО з ТМЕ-специфічною зв'язуючою одиницею, переважно разом із ТІ ТА-специфічною зв'язуючою одиницею. ТМЕ-специфічна зв'язуюча одиниця переважно містить одну або більшу кількість послідовностей СОК або варіабельних доменів антитіл 3.2 (описаних нижче), 234 (описаних нижче), сертолізумабу, адалімумабу, інфліксимабу, голімумабу та антитіл, розкритих в патенті США Мо 7285269, який включений до цього документу шляхом посилання.
По всьому тексту цього документа «сертолізумаб» відноситься до антитіла, що містить послідовності варіабельних ділянок, одержані з сертолізумаб пеголу. Переважні послідовності, що базуються на таких СОК, представлені у Табл. 0.
Таблиця С
Переважні послідовності СОК з антитіл проти ТМЕ-о
Позначення І! СОВІ(5ЕОЇ ІСОВ82 І СОВЗ (ЗЕО|НСОВІ (5ЗЕОЇНСОНВ2 (5ЕОІНСОВЗ (5ЕО антитіла ІО МО) (ЗЕО ІЮ МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) ІО МО) адапімумаб ВАБОСІВ АА5ТО5 |ОВУМААР |ОМАМН НОМУ МБУІ ЗТА
А У ММ А (92) (242) "т (96) (158) ЕС (160) ЗО ОМ (162) сеотопізума б КАБОММУС |5АБРІ УЗ |ООММІМРІ | ОМОаММ рАремКОо СУА5УАМ
Р У ТММА (152) |(154) Т(156) (218) (220) р (222) соза ВАБОСІВ О|ААБВІО ОПОНМеУР о5У0МНО | Ар о
МОГ а (140) | (112) ІТ (144) (206) Ка (208) Мм(210) тазвБемі М 2050 3.2 сламрун пав З ВОМ БО) ЗУМИ (212)| ТАУ5РОЕ в (146) Оса (214)
Кожен з поліпептидів у Табл. б кодується нуклеїновою кислотою, яка має послідовність, що безпосередньо передує послідовності поліпептиду в Переліку послідовностей. Послідовності з Табл. б можна застосовувати в будь-якому форматі біспецифічних антигензв'язуючих білків, переважно у форматі гетеро Ід або Ідо-5сЕм і переважно разом з антигензв'язуючою одиницею проти ТІ ТА.
Одиниці біспецифічних антигензв'язуючих білків, що зв'язуються з ТМЕ, більш переважно містять послідовності варіабельної ділянки вибраних антитіл проти ТМЕ. Послідовності таких варіабельних ділянок наведені в Табл. Н. Як і раніше, МІ. відноситься до варіабельної ділянки легкого ланцюга, а МН відноситься до варіабельної ділянки важкого ланцюга. Крім того, винахід включає молекули, послідовності яких щонайменше на близько 90 95 є ідентичними будь-якій із послідовностей, представлених у Табл. Н.
Таблиця Н
Послідовності варіабельних доменів переважних антитіл проти ТМЕ -о;
Позначення вихідного Амінокислотна послідовність (5ЕО 1О МО) антитіла
СО МТОВе ЗВ ЗАВУВОКУПТОКАВОСТЕМ У АУУТУСОЮКРОКАРКИ ГУААВТ плалнея ОоБаукаКеЗма а ОТ ЛОНО РЕВУАТУУСОНУМКАРУТКООСТЕУ
Кі
КУСМСУКВОООСУВРОБЯ ВІ ЗСААВОВТКЕОСТАМНУУУВОАРОКСОЇ КУУУВАЇ адалімумаб |. хі пух ек ррн ть рчя деку чу чу вад хо их оч ери хі ик А в ик та
А МА ТАУМООНОТАВОУКОКРТЗЇКОМАКНОВ М ОММОКАКВТАУСАКУВУ З
ТАБЛО ПМ МЕНІ С
Юм ЗАВУВОВУ ТТ ОКАВОМУВТ МУЛУ УООЮКРОКАРКАЦ УВА сертомвума о БУРЕ ОВОВОаТОКТ ТІВ ОРЕОБАТТУСООСУМ ТЕ вОСТКУЄ!
Кк
ЕМО УЕВСОС МОРОЗІ ВІ БСААВОУ УТ ОММУ У ОА КОСЕУУМО
Ти б уЯМТУЮЕРІУАОВУКОКЕТЕВ ОТЗКОТАТ ОММВІВАЕОТАУУУСАВОУВ
УАМОМАЮВОСТЬУТУВВ (44)
ЮюЮМТО5РЕБЗАУОВВУ ПТСКАБОМУСТ УА У СОКРОКАРКАУ АВ сертолізума бі су усу ру СВО ВОТОКТІ ПОС ОРЕОКАТУУСОСУМУРІ ТЕ ООСТКУЄІ варіант МІ.
Кі
ЕУСЕУЄВОСС МЕС РО БСААБОУ У ТО СУММУУУВОАРОКОЇ ЕМ
"варіа нт ун о ТДУТУ ЕРА УКОВЕТ ПТОКОТА ОМ КАКСТАУТУСАВОУНОУ
АМОТУЧУООСТОУ ТУ (З
ОМ ТОРБУ БОАРСОМВУ ПЗСТОЗБЕМСАСОУОУНУ УДО ТАРК ЦО
3.2 М. МЗМКРОСУРОКЕБОЗКООТ ВААС АЕОБАВУУСОСВ В ЗОЗУКОС
УСС МОЗОАЕУККР.ОВВ КІОСКУ ЕТ ВУУ ЛУ УВО МиОКО СУММУ 3.2 ун ГОЮ ВВР ОСОУ ПІДКОВА СОМ КАВБОТАМУ САМУ уст УТ СНИ
ОМ ОН ОМ М СОСКУ ПИ СКАЗСВНКМОСОУУ У СКК ОКАРЕКТАДЗО с234 МІ. ЦаБОМРЕКЕВБОВОВОРЕЄТЬ ПОМ ОВЕМЛКБАТУУ С ОНМаУРІі ТОК кіз
ОО УКОСУ ИРОМКОЦІ ВСААВСКТЕ ЗО ОМАР ОАРОКОБУУМАУ
С234 УН ІВ НК У АВОУКОСВЕТ ОКОМ Я СУМ КАЄОТАУУСАНЕУКАЮ віттТтУВМсУКОСІТУТУВ СЕМ
Кожен з вищевказаних поліпептидів кодується нуклеїновою кислотою, яка має нуклеотидну послідовність, що безпосередньо передує послідовності поліпептиду в Переліку послідовностей.
Переважні анти-ТІ11А/анти-ТМЕ біспецифічні антитіла гетеро Ідс представлені у Табл. І.
Позначення молекули гетеро Ід базується на вищевказаних позначеннях вихідних антитіл, які застосовуються для конструювання молекули гетеро Ід. В молекулі, позначеній як варіант «сертолізумаб/383», наприклад, використовуються поліпептиди з послідовностями із антитіл, позначених в цьому документі як сертолізумаб і варіант 383. Як і раніше, Мі відноситься до варіабельної ділянки легкого ланцюга, МН - до варіабельної ділянки важкого ланцюга. Такі молекули можуть включати «С-зажим», введений шляхом заміни молекули цистеїну в послідовності для забезпечення додаткового дисульфідного зв'язку з метою стабілізації. Такі цистеїнові заміни переважно вводять на межі МІ-УН, в положеннях 44 у МН і 100 у МІ в схемі нумерації за Кабатом.
Додаткові заміни можуть бути здійснені з метою стабільності або для введення інших функціональних груп. Варіанти реалізації винаходу включають молекули, ідентичні щонайменше на 90 95 будь-якій із послідовностей, представлених у Табл. І.
Таблиця
Послідовності варіабельних ділянок молекул анти-ТІ 1А/анти- ТМЕ-о; гетеро ЇДО молекули гетеро Ід варіант ЗВЗ3
Сертолізумаб/
Сертолізумаб/ 2383
Сертолізумаб/ 2383 варіант 306
Варіант варіант ЗВЗ3
Варіант варіант 20511
Варіант сертолізумабу/ 42 318 296 298 шия |в
Варіант варіант 306
Варіант
Кожен з наведених вище поліпептидів кодується нуклеїновою кислотою, яка має нуклеотидну послідовність, що безпосередньо передує амінокислотній послідовності поліпептиду в Переліку послідовностей.
В Табл. У наведені послідовності повнорозмірного легкого ланцюга і важкого ланцюга переважних гетеро Ід біспецифічних антигензв'язуючих білків відповідно до цього винаходу. Наведені послідовності є переважними для всіх молекул гетеро Ід, незалежно від того, чи знаходяться вони в наведених комбінаціях. Наведені комбінації є ще більш переважними. «Вар» в позначенні молекули відноситься до варіанту. Такі молекули можуть включати зарядові варіанти для полегшення складання, як описано, наприклад, у УМО 2009/089004, опублікованій 16 липня 2009 року, яка включена до цього документу шляхом посилання.
Таблиця .)
Повнорозмірні послідовності молекул анти-ТІ ТА/анти- ТМЕ-о; гетеро до
Анти-ТМЕзх зв'язуюча | тА зв'язуюча одиниця
Позначення молекули А 7 В гетеро Ід Легкий ланцюг ланцюг 5ЕО Легкий ланцюг пан сьо молекули
ЗЕОЇІЮ МО Юр Мо ЗЕОІЮ МО рю МО (Р Мо) сертолізумаб/ 132 136 239 138 340595 еарга11 сертолізумаб/ 3С6 340599 3.2/ вар ЗВ3 340601 3.2/ варгст1 340602 3.2/ 2383 УНА 340603 3.2/ 2383 УНЗ 340604 3.2/ вар ЗС6 340605 3.2/ ЗС6 340606 вар сертолізумабу / 132 316 134 130 340607 вар ЗВ3 вар сертолізумабу / 132 316 239 198 340608 еарга11 вар сертолізумабу / 2383 НА зловсо вар сертолізумабу / 132 316 335 329 340611 вар 306 вар сертолізумабу / 333 316 134 130 340612 вар ЗВЗ3 вар сертолізумабу / 333 316 239 138 340613 еарга11 вар сертолізумабу / 2383 НА Зловти вар сертолізумабу / 333 316 381 329 340615 вар 306 вар сертолізумабу / 333 463 134 130 340617 вар ЗВ3 вар сертолізумабу / 333 463 239 138 340618 еарга11 вар сертолізумабу / 2383 НА Зло вар сертолізумабу / 333 463 381 329 340620 вар 306
Таблиця .)
Повнорозмірні послідовності молекул анти-ТІ ТА/анти- ТМЕ-о; гетеро до плита та вв нзуюча Анти-ТІ ТА зв'язуюча одиниця
Позначення молекули диниц Важкий Важкий гетеро Ід Легкий ланцюг ланцюг ЗЕО Легкий ланцюг ланцюг ЗЕО молекули
ЗЕОЇІЮ МО ІЮ Мо ЗЕОЇІЮ МО І Мо (РБ Ме)
С234/ вар ЗВ3 349421
С234/ вар2о11 349425
С234/ 2383 УНА 349428
Сс234/ 2383 УНЗ 349431
С234/ вар 306 349433 с234/ ЗС6 349435 сертолізумаб/ сертолізумаб/ 3С6 349448 3.2/ вар ЗВ3 349451 3.2/ варгст 1 349453 3.2/ 2383 УНА 349455 3.2/ 2383 УНЗ 349456 3.2/ вар ЗС6 349457 3.2/ З3С6 349458 вар сертолізумабу / 50 573 ві? 5БББ5 349460 вар ЗВ3
Вар сертолізумабу /
Варгс11 510 573 541 558 349461 вар сертолізумабу / вар сертолізумабу / 50 573 БАЗ 568 349465 вар 306 вар сертолізумабу / БО 573 ві? 5БББ5 349468 вар ЗВ3 вар сертолізумабу / 5АО 573 БА 558 349470 еарга11 вар сертолізумабу / вар сертолізумабу / БО 573 БАЗ 568 349473 вар 306 вар сертолізумабу / БО 487 ві? 5БББ5 349476 вар ЗВ3
Таблиця .)
Повнорозмірні послідовності молекул анти-ТІ ТА/анти- ТМЕ-о; гетеро до
Анти-ТМЕзх зв'язуюча | ТІЛА зв'язуюча одиниця
Позначення молекули одиниця - - гетеро Ід Легкий ланцюг Важкий Легкий ланцюг Важкий молекули ланцюг 5ЕО ланцюг 5ЕО й
ЗЕОЇІЮ МО Юр Мо ЗЕОЇІЮ МО рю МО (Р Ме) вар сертолізумабу / БО 487 БА 5БВ 349479 еарга11 вар сертолізумабу / 2383 МНА малі вар сертолізумабу / 5АО 487 БАЗ 568 349482 вар 306
С234/ вар ЗВ3 349485
С234/ Вар2о11 349486
С234/ 2383 УНА 349487 с234/ 2383 УНЗ 349488
С234/ вар ЗС6 349489 с2за4/ ЗС6 349490 сертолізумаб/ 5АБ 578 5АВ БВ? 349492 еарга11 сертолізумаб/ ЗС6 349498
С234/ вар ЗВ3 349499 сС234/ Варгої 1 349501 с234/ 2383 УНА 349502 с234/ 2383 УНЗ 349503
С234/ вар ЗС6 349504 с2за4/ ЗС6 349505 сертолізумаб/ 132 599 239 601 349507 еарга11 сертолізумаб/ 2383 132 5ОЗ 327 605 349509
УНЗ сертолізумаб/ ЗС6 349511 32/вар3в3 | 337 | 609 | 134 | 5982 | 349512 32/Вараст! | 9337. | 609 | 239. | 601 349513
З2/е3в3УНА | 337 | 609 | 323 | 603 | 349514
З2/г3взУнЗ | 337. | 609 | 327 | 605 | 349515 3.2/3Сбваріаант | 337 | 609 | 331 | 607 | 349516
Таблиця .)
Повнорозмірні послідовності молекул анти-ТІ ТА/анти- ТМЕ-о; гетеро до плита та звязуюча Іднти-ТІ ТА зв'язуюча одиниця
Позначення молекули диниця 7 гетеро Ід Легкий ланцюг ланцюг БО Легкий ланцюг ланцюг ЗБО молекули
ЗЕОЇІЮ МО ІЮ Мо ЗЕОЇІЮ МО І Мо (Р Мо) 3.2/ 3С6 837. | 609 | 335 | 607 | 349517 вар сертолізумабу / 132 611 134 5БОВ 349518 вар ЗВ3 вар сертолізумабу / 132 611 239 бої 349519 еарга11 вар сертолізумабу / вар сертолізумабу / 132 611 381 607 349521 вар 306 вар сертолізумабу / 333 611 134 5БОВ 349523 вар ЗВ3 вар сертолізумабу / 333 611 239 бої 349524 еарга11 вар сертолізумабу / вар сертолізумабу / 333 611 381 607 349526 вар 306 вар сертолізумабу / 333 8613 134 5БОВ 349528 вар ЗВ3 вар сертолізумабу / 333 613 239 бої 349529 еарга11 вар сертолізумабу / вар сертолізумабу / 333 813 335 607 349531 вар 306
С234/ Вар2о11 349533
С234/ 2383 УНА 349534 с234/ 2383 УНЗ 349535
С234/ вар ЗС6 349536 с2за4/ ЗС6 349537 вар сертолізумабу/ 333 813 381 607 349539 вар 306 вар сертолізумабу / 132 463 239 198 361830 еарга11 вар сертолізумабу / 132 463 331 329 361831 вар 306 вар сертолізумабу / 5і0 487 512 555 361833 вар ЗВЗ3
Таблиця .)
Повнорозмірні послідовності молекул анти-ТІ ТА/анти- ТМЕ-о; гетеро до плита та зв язуюча Анти-ТІ ЛА зв'язуюча одиниця
Позначення молекули диниця - гетеро Ід Легкий ланцюг ланцюг БО Легкий ланцюг ланцюг ЗБО молекули
ЗЕОЇІЮ МО ІЮ Мо ЗЕОЇІЮ МО рю МО (РБ Ме) вар сертолізумабу / 50 487 БА 5БВ 361834 еарга11 вар сертолізумабу / 2383 НА З61835 вар сертолізумабу / 510 487 БАЗ 568 361836 вар 306 вар сертолізумабу / 132 613 134 5ОВ 361838 вар ЗВЗ3 вар сертолізумабу / вар сертолізумабу / 132 813 331 607 361840 вар 306 вар сертолізумабу / 132 463 134 130 361842 вар ЗВЗ3 вар сертолізумабу/ БО 616 ві? 5ОВ 381084 вар ЗВЗ3 вар сертолізумабу / БО 62о ві? 5ОВ 381089 вар ЗВЗ3 вар сертолізумабу / вар сертолізумабу / вар сертолізумабу / 2383 НА вто вар сертолізумабу / 2383 НА Зв1тто
С234 вар/ вар ЗВ3 З81102
С234 вар/ вар ЗВ3 381109 вар сертолізумабу / 5БАв 514 194 535 381208 вар ЗВЗ3 вар сертолізумабу / 536 616 194 535 381216 вар ЗВЗ3 вар сертолізумабу / 5БАв 487 194 535 381222 вар ЗВЗ3 вар сертолізумабу / 479 477 473 198 381300 вар ЗВЗ3
Таблиця .)
Повнорозмірні послідовності молекул анти-ТІ ТА/анти- ТМЕ-о; гетеро до пнлитв та яв язуюча Іднти-тІ ТА зв'язуюча одиниця
Позначення молекули диниця - - гетеро Ід Легкий ланцюг ланцюг БО Легкий ланцюг ланцюг ЗБО молекули
ЗЕОЇІЮ МО ІЮ Мо ЗЕОЇІЮ МО І Мо (Р Мо) вар сертолізумабу / 475 477 Б2гО 198 381312 вар ЗВЗ3 вар сертолізумабу / дт 463 473 198 381316 вар ЗВЗ3 вар сертолізумабу / 176 463 570 198 381318 вар ЗВЗ3 вар сертолізумабу / 47 465 473 198 381320 вар ЗВЗ3 вар сертолізумабу / 176 465 Б2гО 198 381325 вар ЗВЗ3
С234/ варіант ЗВЗ3 376542 сертолізумаб/ варіант 50 5Ів ві? 5ОВ 376543
Зв
Кожен з наведених вище поліпептидів кодується нуклетїновою кислотою, яка має нуклеотидну послідовність, що безпосередньо передує амінокислотній послідовності поліпептиду в Переліку послідовностей, за винятком випадків, зазначених у Табл. .)-1.
Таблиця .-1
Нуклеїнові кислоти, що кодують поліпептиди з Табл. .)
Поліпептид ЗЕО ІЮО МО: Кодуюча нуклеїнова кислота 5ЕО ІЮ МО:
Таблиця .-1
Нуклеїнові кислоти, що кодують поліпептиди з Табл. .)
Біспецифічні антигензв'язуючі білки ЇД06-5сЕмМ
Антигензв'язуючі білки (Д0-ЗсЕм мають структуру, зображену на Фіг. 2. Такі молекули містять важкий і легкий ланцюги антитіла (до частина молекули), яке містить першу антигензв'язуючу одиницю молекули ІдО-5сЕму. Такі молекули додатково містять 5сЕм - гібридний білок, що містить в одному ланцюгу варіабельний домен важкого ланцюга і варіабельний домен легкого ланцюга другого антитіла. Ця частина 5сЕм молекули містить другу антигензв'язуючу одиницю молекули Ідс-5сгУ.
Частина 5сЕм злита з кожним важким ланцюгом до частини молекули.
Антигензв'язуючий білок Їд0-5сЕм за винаходом містить зв'язуючу анти-ТІ ТА одиницю, зокрема амінокислотні послідовності анти-Т/ТЛА зв'язуючих одиниць, як описано вище. Переважні антигензв'язуючі білки Їд0-5сЕм містять послідовності анти-ТІТА СОК, як описано в Табл. А, В і С, причому послідовності з Табл. А є найбільш переважними. Більш переважні антигензв'язуючі білки
Іда-5сЕм містять послідовності анти-ТІ ТА варіабельного домену з Табл. ОЮ. Додатково переважними є антигензв'язуючі білки Їус-5сЕм, що містять повнорозмірні послідовності антитіл з Табл. Е.
Цей документ також стосується молекул ІдбС-5сЕм, що містять анти-ТМЕ-х антигензв'язуючу одиницю, що переважно містить послідовності СОР, як описано в Табл. б. Крім того, переважними є молекули Ідо-5сЕм, що містять послідовності анти- ТМЕ-о; варіабельних доменів, як описано в Табл. Н.
Додатково переважними є молекули Ідо-5сЕм, що містять повнорозмірні амінокислотні послідовності антитіл проти ТМЕ-с, як описано в Табл. К.
Таблиця К
Переважні антитіла проти ТМЕ-о; . Легкий ланцюг Важкий ланцюг 5ЕО . 11116234 7777777 |77711117787777717|7771717111801711111 17111 3301940 08277711 1771717171717178477711171771717171178617711111|17111330237Г
11111 сертолзумаб./// | 8877777 | 77717907 | 333788..ШЧУЬ
Кожна з амінокислотних послідовностей в Табл. К кодується послідовністю нуклеїнової кислоти, що безпосередньо передує їй в Переліку послідовностей.
У деяких варіантах реалізації винаходу важкий ланцюг частини дос злитий з частиною 5сЕм через пептидний лінкер. У деяких варіантах реалізації винаходу пептидний лінкер містить послідовність, вибрану з групи, що складається із (Сіузбег)2, (Сіу«зег)», (Спіузвег)з, (СПуг«о5ег)з, (Сіузбег)а, (Сіу«5ега, (Сіузбег)», (Спу«бег)о, (Спузбег)в і (СІу«5еЕ1Г) в.
Крім того, переважними є антигензв'язуючі білки ЇдС-5сЕм, що містять послідовності важкого і легкого ланцюгів, як описано в Табл. І і М. Послідовності важкого ланцюга в Табл. І і М містять СЕМ частину молекули, злиту з важким ланцюгом дО частини молекули. УВ позначенні молекули в лівому стовпчику цих таблиць назва першого антитіла ідентифікує ЇдС частину молекули, таким чином, що молекула Ідо-5сЕм містить повнорозмірні послідовності важких і легких ланцюгів зазначеного антитіла.
Назва другого антитіла ідентифікує 5сЕм частину молекули, таким чином, що послідовність важкого ланцюга містить варіабельний домен важкого ланцюга і послідовності варіабельного домену легкого ланцюга, як описано в цьому документі вище. Таким чином, «адалімумаб Ід2-9028 5сЕму» містить легкий ланцюг адалімумабу і важкий ланцюг адалімумабу, злитий з варіабельною ділянкою важкого ланцюга і варіабельною ділянкою легкого ланцюга антитіла 9С8. «СС» в позначеннях молекул в Табл.
І ї М відноситься до цистеїнового зажиму; молекули, позначення яких включає СС, були модифіковані таким чином, що вони містять додатковий цистеїновий дисульфідний зв'язок. Такі цистеїнові заміни переважно вводять на межі МІ-УН, в положеннях 44 у МН і 100 у МІ в схемі нумерації за Кабатом. «Вар» у Табл. | означає варіант.
Таблиця І.
Переважні антигензв'язуючі білки 5сЕм, що містять ТІ Т1А-зв'язуючу одиницю
Іда-ТМЕ-о зв'язуючу одиницю
Важкий ланцюг | Легкий ланцюг ,
Таблиця І.
Переважні антигензв'язуючі білки 5сЕм, що містять ТІ Т1А-зв'язуючу одиницю
Іда-ТМЕ-о зв'язуючу одиницю
Важкий ланцюг | Легкий ланцюг ,
Кожен з поліпептидів у Табл. | кодується нуклеїновою кислотою, яка має нуклеотидну послідовність, що безпосередньо передує поліпептидній послідовності в Переліку послідовностей.
Таблиця М
Переважні антигензв'язуючі білки 5сЕм, що містять ТМЕ-о-зв'язуючу одиницю
Ідс-ТІ1А- зв'язуючу одиницю
ЗЕОЇІЮ МО ЗЕОІЮ МО
Кожен з поліпептидів у Табл. М кодується нуклеїновою кислотою, яка має нуклеотидну послідовність, що безпосередньо передує поліпептидній послідовності в Переліку послідовностей.
Біспецифічні антигензв'язуючі білки Їдо-Рар
У форматі ІдбС-Бар біспецифічний, полівалентний антигензв'язуючий білок містить () перший поліпептид, що містить перший важкий ланцюг (МН2-СНІ-СН2-СНЗ) з першого антитіла, причому перший важкий ланцюг злитий на своєму карбоксильному кінці (необов'язково через пептидний лінкер) з поліпептидом, що містить домени МН2-СНІ другого антитіла з утворенням модифікованого важкого ланцюга, (ії) другий поліпептид, що містить легкий ланцюг із першого антитіла (МІ-1-СІ) і (іїї) третій поліпептид, що містить домени МІ 2-СІ. другого антитіла. У деяких варіантах реалізації винаходу домени Сі ї СНІ першого антитіла можуть бути переключені («поміняні місцями») між першим і другим поліпептидом. У таких варіантах реалізації винаходу другий поліпептид містить МІ 1-СНІ, тоді як перший поліпептид містить МН1-СІ -СН2-СНЗ-МН2г-СНІ, з МНІ1-СІ -СН2-СНЗ, злитий на своєму С- кінці з МН2-СНІ, необов'язково через пептидний лінкер. Третій поліпептид містить МІ/2-СІ. Як альтернатива, домени Сі і СНІ другого антитіла можуть бути переключені в деяких варіантах реалізації винаходу між першим і третім поліпептидом. У таких варіантах реалізації винаходу третій поліпептид містить МІ 2-СНІ, тоді як перший поліпептид містить МН1-СНІ-СН2г-СНЗ-МН2-СІ, причому
МНІ-СНІ-СН2-СНІ злитий на своєму С-кінці з МН2-СІ, необов'язково через пептидний лінкер. Другий поліпептид містить МІ 1-СІ. У ще одному варіанті реалізації винаходу домени Сі і СНІ обох антитіл перемикають між першим, другим і третім поліпептидом. У таких варіантах реалізації винаходу перший поліпептид містить МН1-СІ -СН2-СНЗ-МН2г-Сі, причому МНІ1-СІ-СН2-СНЗ, необов'язково злитий на своєму С-кінці з МН2-СІ, другий поліпептид містить МІ1-СНІ, а третій поліпептид містить
МІ 2-СНІ. До обсягу цього винаходу включені такі молекули Ідс-Рар, в яких перше антитіло містить одиницю, що зв'язується з ТІ14А, а друге антитіло містить одиницю, що зв'язується з ТМЕ-сх. Подібним чином, до обсягу цього винаходу включені такі молекули ЇдС-Бар, в яких перше антитіло містить одиницю, що зв'язується з ТМЕ-со, а друге антитіло містить одиницю, що зв'язується з ТІЛА. Вираз, який має таке ж значення, що і два останніх речення, полягає в тому, що перше антитіло містить одну з одиниці, що зв'язується з ТІ1А, або одиниці, що зв'язується з ТМЕ-с, а друге антитіло містить іншу з них.
В одному аспекті формату ІдО-Раб в рамках цього винаходу біспецифічний, чотирьохвалентний антигензв'язуючий білок містить а) перший важкий ланцюг першого антитіла (МНІ), причому перше антитіло специфічно зв'язується з першим антигеном і, при цьому, перший важкий ланцюг злитий на своєму С-кінці з М-кінцем фрагмента, що містить другий важкий ланцюг другого антитіла (МН), притому, що друге антитіло специфічно зв'язується з другим антигеном; Б) два легких ланцюги першого антитіла з а); і с) два легких ланцюги другого антитіла з а). В межах цього винаходу перше антитіло може специфічно зв'язуватися з ТІ1А, а друге може специфічно зв'язуватися з ТМЕ-х або навпаки.
В іншому аспекті формату ІдОо-Рабр в межах цього винаходу біспецифічний антигензв'язуючий білок містить () перший зв'язуючий домен, який специфічно зв'язується з першим антигеном, що містить першу варіабельну ділянку легкого ланцюга імуноглобуліну (МІ7) і варіабельну ділянку першого важкого ланцюга імуноглобуліну (МНТІ); (її) другий зв'язуючий домен, який специфічно зв'язується з другим антигеном, що містить другу варіабельну ділянку легкого ланцюга імуноглобуліну (МІ 2) і другу варіабельну ділянку важкого ланцюга імуноглобуліну (МН); і (ії) ділянку Ес імуноглобуліну людини, в якій один із зв'язуючих доменів розташований на аміно-кінці ділянки Ес, а інший зв'язуючий домен розташований на карбоксильному кінці ділянки Ес, і, при цьому, карбокси-кінцевий зв'язуючий домен являє собою Раб і злитий через пептидний лінкер з карбоксильним кінцем ділянки Ес, притому, що Бар злитий з ділянкою Ес на аміно-кінці ділянки МН Раб. В межах цього винаходу перший антиген може являти собою ТІ 1А, а другий - ТМЕ-с, або навпаки.
В іншому аспекті формату Ідб-Раб біспецифічний, чотирьохвалентний антигензв'язуючий білок містить: а) перший поліпептид, що містить перший важкий ланцюг першого антитіла, який містить першу варіабельну ділянку важкого ланцюга (УНІ) і перший домен СНІ, причому перше антитіло специфічно зв'язується з першим антигеном, і, при цьому, перший важкий ланцюг злитий на своєму С-кінці з М- кінцем поліпептиду, що містить другу варіабельну ділянку важкого ланцюга другого антитіла (МН), притому, що МН2 злитий на своєму С-кінці з М-кінцем другого домену СНІ, причому друге антитіло специфічно зв'язується з другим антигеном; і, при цьому:
ЇЇ МНІ або перший домен СНІ містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення зарядженої (наприклад, позитивно зарядженої) амінокислоти в положенні залишку, вибраному з групи, що складається із положень 39, 44 і 183 відповідно до нумерації ЕО; і ії) домен МН2 або другий СНІ містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення зарядженої (переважно із зарядом, протилежним заряду зазначеної в і) вище) амінокислоти в положенні залишку, вибраному з групи, що складається із залишку, який відповідає положенням 39, 44 і 183 відповідно до нумерації ЕО, причому заряд є протилежним заряду заміненого залишку УНІ або першого СНІ першого важкого ланцюга; і
Б) другий поліпептид, що містить перший легкий ланцюг першого антитіла з а), причому перший легкий ланцюг містить першу варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ1) і першу ділянку Сі; і, при цьому, домен М/1 або перший Сі містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення зарядженої амінокислоти в положенні залишку, вибраному з групи, що складається із положень 38, 100 ї 176 відповідно до нумерації ЄЮ, притому, що заряд в положенні 38 є протилежним заряду заміненого залишку МНІ або першого СНІ першого важкого ланцюга в положенні 39; заряд в положенні 100 є протилежним заряду заміненого залишку МНІ або першого СНІ першого важкого ланцюга в положенні 44; заряд в положенні 176 є протилежним заряду заміненого залишку УНІ або першого СНІ першого важкого ланцюга в положенні 183; і (с) третій поліпептид, що містить другий легкий ланцюг другого антитіла з а), причому другий легкий ланцюг містить другу варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ2) і другу ділянку Сі; і, при цьому, домен МІ 2 або другий домен СІ містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення зарядженої амінокислоти в положенні залишку, вибраному з групи, що складається із положень 38, 100 ї 176 відповідно до нумерації ЄЮ, притому, що заряд в положенні 38 є протилежним заряду заміненого залишку УН2 або другого СНІ другого важкого ланцюга в положенні 39; заряд в положенні 100 є протилежним заряду заміненого залишку МН2 або другого СНІ другого важкого ланцюга в положенні 44; заряд в положенні 176 є протилежним заряду заміненого залишку УН2 або другого СНІ1 другого важкого ланцюга в положенні 183.
В межах цього винаходу перший антиген в підпункті а) вище може бути одним з ТІ1А і ТМЕ-о, а другий антиген може бути іншим з них. Інший спосіб заявити цю ж специфічність зв'язування полягає в тому, щоб сказати, що перше антитіло в підпункті а) містить одну з одиниці, що зв'язується з ТІ 14А, або одиниці, що зв'язується з ТМЕ-с, а друге антитіло містить іншу з них.
У деяких варіантах реалізації біспецифічних антигензв'язуючих білків за винаходом, в яких карбокси-кінцевий зв'язуючий домен являє собою фрагмент Раб, зв'язуючий домен, розташований на аміно-кінці ділянки Ес (тобто, аміно-кінцевий зв'язуючий домен) також є фрагментом Рар. Аміно- кінцевий фрагмент Бар може бути злитий з аміно-кінцем ділянки Ес через пептидний лінкер або область шарніра імуноглобуліну, описану в цьому документі. У деяких варіантах реалізації винаходу аміно-кінневий фрагмент Бар з'єднаний з аміно-кінцем ділянки Ес через шарнірну область Їдс1 людини. В інших варіантах реалізації винаходу аміно-кінцевий фрагмент Раб з'єднаний з аміно-кінцем ділянки Ес через шарнірну область ї(д52 людини. В одному варіанті реалізації винаходу аміно- кінцевий фрагмент Раб злитий з ділянкою Ес через карбоксильний кінець ділянки СНІ Раб.
У деяких варіантах реалізації винаходу біспецифічний антигензв'язуючий білок за винаходом містить перше антитіло, яке специфічно зв'язується з першою мішенню, причому один поліпептидний ланцюг (наприклад, важкий ланцюг (МН2-СНІ)) фрагмента Раб з другого антитіла, яке специфічно зв'язується з другою мішенню, злитий з карбоксильним кінцем важкого ланцюга першого антитіла.
Біспецифічний антигензв'язуючий білок в таких варіантах реалізації винаходу додатково містить поліпептидний ланцюг, що містить другу половину фрагмента Раб із другого антитіла (наприклад, легкий ланцюг (МІ 2-СІ)3). Цей формат згадується в цьому документі як формат «ІдО-Рабр», і один варіант реалізації такого типу молекули схематично зображений на Фіг. 25. Таким чином, в деяких варіантах реалізації цей винахід включає біспецифічний, полівалентний антигензв'язуючий білок, що містить: (ї) легкий ланцюг із першого антитіла, (ії) важкий ланцюг із першого антитіла, причому важкий ланцюг злитий на своєму карбоксильному кінці через пептидний лінкер з першим поліпептидом, що містить домени МН-СНІ другого антитіла, з утворенням модифікованого важкого ланцюга, і (ії) другий поліпептид, що містить домени МІ-Сі другого антитіла. У димеризованому стані біспецифічний антигензв'язуючий білок являє собою гомогексамер, що містить два модифікованих важких ланцюги, два легких ланцюги з першого антитіла і два поліпептидних ланцюги, що містять другу половину фрагмента Раб із другого антитіла (фрагмент Ба). В одному варіанті реалізації винаходу перший поліпептид, який злитий з карбоксильним кінцем важкого ланцюга, містить домени МН і СНІ з другого антитіла, а другий поліпептид містить домени МІ і Сі. з другого антитіла.
В деяких варіантах реалізації винаходу антигензв'язуючі білки за винаходом містять (ї) перший зв'язуючий домен, який специфічно зв'язується з першим цільовим антигеном, (ії) другий зв'язуючий домен, який специфічно зв'язується з другим цільовим антигеном, і (ії) ділянку Ес імуноглобуліну людини, причому один із зв'язуючих зв'язуючих доменів розташований на аміно-кінці ділянки Ес, а інший зв'язуючий домен розташований на карбоксильному кінці ділянки Ес. У деяких таких варіантах реалізації винаходу кожен з першого і другого зв'язуючих доменів містить варіабельні ділянки імуноглобуліну. Наприклад, у деяких варіантах реалізації винаходу перший зв'язуючий домен містить першу варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ 1) і першу варіабельну ділянка важкого ланцюга (УНІ) з антитіла проти першого цільового антигену, а другий зв'язуючий домен містить другу варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ 2) і другу варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН2) з антитіла проти другого цільового антигену.
В деяких варіантах реалізації біспецифічних антигензв'язуючих білків за винаходом зв'язуючий домен, розташований на аміно-кінці ділянки Ес (тобто, аміно-кінцевий зв'язуючий домен), являє собою фрагмент Раб, злитий з аміно-кінцем ділянки Ес через пептидний лінкер, описаний в цьому документі, або через шарнірну область імуноглобуліну. «Шарнірна область імуноглобуліну» відноситься до амінокислотної послідовності, яка з'єднує домен СНІ і домен СН2 важкого ланцюга імуноглобуліну.
Шарнірна область ІЇдС1 людини зазвичай визначається як амінокислотна послідовність від близько
Сіц216 або близько Суз226 до близько Рго230. Шарнірні області інших ізотипів ЇДО можуть бути вирівняні з послідовністю ДС! шляхом розміщення першого і останнього залишків цистеїну, що утворюють дисульфідні зв'язки між важкими ланцюгами, в однакових положеннях і можуть бути визначені фахівцями в цій галузі техніки. У деяких варіантах реалізації винаходу аміно-кінцевий зв'язуючий домен з'єднують з аміно-кінцем ділянки Ес через шарнірну область ЇдО1 людини. В інших варіантах реалізації винаходу аміно-кінцевий зв'язуючий домен з'єднують з аміно-кінцем ділянки Ес через шарнірну область Ідб2 людини. В одному варіанті реалізації винаходу аміно-кінцевий зв'язуючий домен (наприклад, фрагмент Бар) злитий з ділянкою Ес через карбоксильний кінець ділянки СНІ Еар.
В деяких варіантах реалізації антигензв'язуючих білків за винаходом зв'язуючий домен, розташований на карбоксильному кінці ділянки Ес (тобто, карбокси-кінцевий зв'язуючий домен), являє собою фрагмент Раб. У таких варіантах реалізації винаходу Раб злитий або іншим чином з'єднаний з карбоксильним кінцем ділянки Ес (наприклад, карбоксильний кінець домену СНЗ) за допомогою пептидного лінкера через аміно-кінець ділянки МН фрагмента Рар. Таким чином, в одному варіанті реалізації винаходу Бар злитий з ділянкою Ес через аміно-кінець ділянки МН Раб, таким чином, що одержаний гібридний білок містить, від М-кінця до С-кінця: домен СН2, домен СНЗ, пептидний лінкер, ділянку МН і ділянку СНІ.
В деяких варіантах реалізації винаходу перший важкий ланцюг антигензв'язуючого білка за цим винаходом злитий з УНЗ2 через пептидний лінкер.
У деяких варіантах реалізації винаходу пептидний лінкер містить послідовність, вибрану з групи, що складається із (Сіузбег)», (Спіу«бег)2, (Сіузбег)з, (Сіу-5ег)з, (Спіузбег)ї, (Суіу«Зег)я, (СПіузбепв, (Спу«5ег)», (СПузбег)в і (СІу«5ег)в. Зазначені послідовності додатково можуть бути записані як: ссавБОссаивз(5ЕО1Ю МО: 673), ссасзасацав(5ЕО ІО МО: 695), ссавассОовБасоив(5ЕОО МО: 703), соасзасвавасоасе (5ЕО 10 МО: 729), ссазсаозасиавасвав (5ЕОІЮ МО: 735), совасзасвазасасввасво(е (5ЕОО МО: 825), ссвазасаозасоВасавасав (ЕО О МО: 937), свасзасвазасааЗасасвасвиасе (ЕО ІЮ МО: 939), ссазасавозасозасавасавасиов(ЗЕО ЇО МО: 941), і свасзасвазасааЗасасвасвиасе (ЕО ІЮ МО: 945).
Пептидний лінкер, що з'єднує ділянку Ес з карбокси-кінцевим Бар, може бути будь-яким з пептидних лінкерів, описаних в цьому документі. В конкретних варіантах реалізації винаходу довжина пептидного лінкера, що з'єднує ділянку Ес з карбокси-кінцевим фрагментом ар, становить щонайменше 5 амінокислот. В інших варіантах реалізації винаходу довжина пептидного лінкера, що з'єднує ділянку Ес з карбокси-кінневим фрагментом Бар, становить щонайменше 8 амінокислот.
Особливо придатними пептидними лінкерами для приєднання ділянки Ес до карбокси-кінцевого фрагменту Ра є гліцин-серинові лінкери, такі як (Сіухоег)п, дех « Забо4,іп -2, 3,4, 5абоб. В одному варіанті реалізації винаходу пептидний лінкер, що з'єднує ділянку Ес з карбокси-кінцевим фрагментом Раб, являє собою лінкер 110 (545)2. В іншому варіанті реалізації винаходу пептидний лінкер, що з'єднує ділянку Ес з карбокси-кіндцевим фрагментом Бар, являє собою лінкер 19 або сзба45І(сспо5асОасе, 5ЕО ІО МО: 946).
Мутації ланцюга
В конкретних варіантах реалізації винаходу біспецифічні антигензв'язуючі білки, описані в цьому документі, містять ділянку Ес з антитіла людини Їдс1, модифіковану таким чином, щоб виключити ефекторні функції. Такі модифіковані ділянки Ес Ідс1 містять заміни К292С і М302С. У таких варіантах реалізації винаходу ділянка Ес може додатково містити заміну М297 (відому як «сскаффолд» ЗЕРІ 2).
Переважні варіанти реалізації винаходу додатково включають мутації у важкому та легкому ланцюгах, що сприяють правильному збиранню гетеро дО біспецифічного антигензв'язуючого білка.
Підхід, що сприяє утворенню гетеродимерів, щоб виключити утворення гомодимерів, передбачає використання електростатичного механізму управління (див. СипазекКагап еї аї!. (2010), 9. Віо!Ї. Снет.,
Мої. 285: 19637-19646, який включений до цього документу шляхом посилання в повному обсязі). Цей підхід включає введення або використання заряджених залишків в домені СНЗ кожного важкого ланцюга, таким чином, що два різних важких ланцюги зв'язуються через протилежні заряди, які спричиняють електростатичне тяжіння. Гомодимеризація однакових важких ланцюгів невиграшна, оскільки однакові важкі ланцюги мають однаковий заряд і тому відштовхуються. Цей же метод електростатичного управління можна застосовувати для запобігання неправильному спаровуванню легких ланцюгів з невідповідними важкими ланцюгами шляхом введення залишків з протилежними зарядами в правильну пару легкого ланцюга-важкого ланцюга на межі зв'язування. Методика електростатичного управління і відповідні мутації зарядових пар, що сприяють утворенню гетеродимерів і правильному спаровуванню легкого ланцюга-важкого ланцюга, описані у
МО2009/089004 і УМО2014/081955, обидва з яких включені до цього документу шляхом посилання в повному обсязі.
У варіантах реалізації винаходу, в яких біспецифічні антигензв'язуючібілки за винаходом являють собою гетеродимерні антитіла, що містять перший легкий ланцюг (І С1) і перший важкий ланцюг (НС1) з першого антитіла, яке специфічно зв'язується з першим цільовим антигеном, і другий легкий ланцюг (2) і другий важкий ланцюг (НС) з другого антитіла, яке специфічно зв'язується з другою мішенню,
НСІ1 або НС2 може містити одну або більшу кількість амінокислотних замін, щоб замінити позитивно заряджену амінокислоту негативно зарядженою амінокислотою. Наприклад, в одному варіанті реалізації винаходу домен СНЗ НС1 або домен СНЗ НС2 містить амінокислотну послідовність, що відрізняється від амінокислотної послідовності (ДС дикого типу, таким чином, що одна або більша кількість позитивно заряджених амінокислот (наприклад, лізин, гістидин і аргінін) в амінокислотній послідовності людського Їдс дикого типу замінені однією або більшою кількістю негативно заряджених амінокислот (наприклад, аспарагіновою кислотою і глютаміновою кислотою) у відповідному(-их) положенні(-ях) в домені СНЗ. У цих та інших варіантах реалізації винаходу амінокислоти (наприклад, лізин) в одному або більшій кількості положень, вибраних із 370, 392 і 409 (система нумерації ЕМ), замінюють негативно зарядженою амінокислотою (наприклад, аспарагіновою кислотою і глютаміновою кислотою). Заміна амінокислоти в амінокислотній послідовності зазвичай позначається в цьому документі однолітерною абревіатурою для амінокислотного залишку в певному положенні, за якою слідує чисельне позначення положення амінокислоти відносно вихідної послідовності, яка представляє інтерес, і далі слідує однолітерний символ для замінюючого амінокислотного залишку.
Наприклад, «Т30О0» символізує заміну треонінового залишку залишком аспартату в положенні амінокислоти 30 відносно вихідної послідовності, що представляє інтерес. Інший приклад: «52180» символізує заміну залишку серину гліциновим залишком в положенні амінокислоти 218 відносно вихідної амінокислотної послідовності, що представляє інтерес.
В деяких варіантах реалізації винаходу НСІ1 або НС2 гетеродимерних антитіл можуть містити одну або більшу кількість амінокислотних замін для заміни негативно зарядженої амінокислоти позитивно зарядженою амінокислотою. Наприклад, в одному варіанті реалізації винаходу домен СНЗ НС1 або домен СНЗ НС2 містить амінокислотну послідовність, що відрізняється від амінокислотної послідовності (Дб дикого типу, таким чином, що одна або більша кількість негативно заряджених амінокислот в амінокислотній послідовності (Дб людини дикого типу замінені однією або більшою кількістю позитивно заряджених амінокислот у відповідному(-их) положенні(-ях) домену СНЗ. В цих та інших варіантах реалізації винаходу амінокислоти (наприклад, аспарагінова кислота або глютамінова кислота) в одному або більшій кількості положень, вибраних з 356, 357 і 399 (система нумерації ЕМ) домену СНЗ, замінюють позитивно зарядженою амінокислотою (наприклад, лізином, гістидином і аргініном).
В конкретних варіантах реалізації винаходу гетеродимерне антитіло містить перший важкий ланцюг, що містить негативно заряджені амінокислоти в положеннях 392 і 409 (наприклад, заміни
КЗ3920 ї К4090)), і другий важкий ланцюг, що містить позитивно заряджені амінокислоти в положеннях 356 і 399 (наприклад, заміни ЕЗ56ЄК і 0399К). В інших конкретних варіантах реалізації винаходу гетеродимерне антитіло містить перший важкий ланцюг, що містить негативно заряджені амінокислоти в положеннях 392, 409 і 370 (наприклад, заміни К3920, К4090 ії КЗ3700), і другий важкий ланцюг, що містить позитивно заряджені амінокислоти в положеннях 356, 399 і 357 (наприклад, заміни ЕЗ5бК,
О0399К ії ЕЗ57К). У споріднених варіантах реалізації винаходу перший важкий ланцюг походить з антитіла проти першого цільового антигену, а другий важкий ланцюг походить з антитіла проти другого цільового антигену.
Для полегшення асоціації конкретного важкого ланцюга з відповідним легким ланцюгом, як важкий, так і легкий ланцюги можуть містити комплементарні амінокислотні заміни. Як використовується в цьому документі, термін «комплементарні амінокислотні заміни» відноситься до заміни позитивно зарядженою амінокислотою в одному ланцюгу в парі із заміною негативно зарядженою амінокислотою в іншому ланцюгу. Наприклад, у деяких варіантах реалізації винаходу важкий ланцюг містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення зарядженої амінокислоти, а відповідний легкий ланцюг містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення зарядженої амінокислоти, причому заряджена амінокислота, введена до важкого ланцюга, має заряд, що є протилежним заряду амінокислоти, введеної до легкого ланцюга. В деяких варіантах реалізації винаходу один або більша кількість позитивно заряджених залишків (наприклад, лізин, гістидин або аргінін) можуть бути введені до першого легкого ланцюга (ЇС1), і один або більша кількість негативно заряджених залишків (наприклад, аспарагінова кислота або глютамінова кислота) можуть бути введені в парний до нього важкий ланцюг (НСІ) на межі зв'язування І С1/НС1, тоді як один або більша кількість негативно заряджених залишків (наприклад, аспарагінова кислота або глютамінова кислота) можуть бути введені до другого легкого ланцюга (І С2) і один або більша кількість позитивно заряджених залишків (наприклад, лізин, гістидин або аргінін) можуть бути введені в парний до нього важкий ланцюг (НС) на межі зв'язування І С2/НС2. Електростатичні взаємодії будуть спрямовувати І С1 для спарювання з
НСІ ї (02 для спарювання з НС2, оскільки протилежно заряджені залишки (полярність) на межі зв'язування притягуються. Пари важкого/легкого ланцюга, що містять залишки з однаковим зарядом (полярністю) на межі зв'язування (наприклад, І С1/НС2 і | С2/НС1), будуть відштовхуватися, що приводить до інгібування утворення небажаних пар НС/ С.
В цих та інших варіантах реалізації винаходу домен СНІ важкого ланцюга або домен Сі. легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, що відрізняється від амінокислотної послідовності (ДО дикого типу, таким чином, що одна або більша кількість позитивно заряджених амінокислот в амінокислотній послідовності дикого типу дО замінені однією або більшою кількістю негативно заряджених амінокислот. Як альтернатива, домен СНІ важкого ланцюга або домен Сі легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, що відрізняється від амінокислотної послідовності (ДО дикого типу, таким чином, що одна або більша кількість негативно заряджених амінокислот в амінокислотній послідовності ДС дикого типу замінені однією або більшою кількістю позитивно заряджених амінокислот. У деяких варіантах реалізації винаходу одна або більша кількість амінокислот в домені СНІ першого та/або другого важкого ланцюга в гетеродимерному антитілі у положенні відповідно до нумерації ЕО, вибраному з Е126, Р127, 1128, А141, І 145, К147, 0148, НІ168,
Е170, Р171, М173, 9175, 5176, 5183, М185 і К213 замінені зарядженою амінокислотою. В деяких варіантах реалізації винаходу залишком важкого ланцюга для заміни негативно або позитивно зарядженою амінокислотою є 5183 (система нумерації ЕО). В деяких варіантах реалізації винаходу 5183 замінюють позитивно зарядженою амінокислотою. В альтернативних варіантах реалізації винаходу 5183 замінюють негативно зарядженою амінокислотою. Наприклад, в одному варіанті реалізації винаходу в першому важкому ланцюгу 5183 замінений негативно зарядженою амінокислотою (наприклад, 5183Е), а в другому важкому ланцюгу 5183 замінений позитивно зарядженою амінокислотою (наприклад, 5183К).
У варіантах реалізації винаходу, в яких легкий ланцюг являє собою легкий ланцюг капа, одна або більша кількість амінокислот в домені СІ першого та/або другого легкого ланцюга в гетеродимерному антитілі в положенні (нумерація ЄЮ в легкому ланцюгу капа), вибраному з Е116, Е118, 5121, 0122,
Е123, 0124, 5131, М133, 1135, М137, М138, 9160, 5162, 1164, 5174 і 5176, замінені зарядженою амінокислотою. У варіантах реалізації винаходу, в яких легкий ланцюг являє собою легкий ланцюг лямбда, одна або більша кількість амінокислот в домені Сі першого та/або другого легкого ланцюга в гетеродимерному антитілі в положенні (ЕО-нумерація в ланцюзі лямбда), вибраному з Т116, Е118, 5121, Е123, Е124, К129, Т131, М133, 1135, 5137, Е160, 71162, 5165, 0167, А174, 5176 і 178, замінені зарядженою амінокислотою. У деяких варіантах реалізації винаходу залишком для заміни негативно або позитивно зарядженою амінокислотою є 5176 (система нумерації Е)) домену СІ. легкого ланцюга капа або лямбда. У деяких варіантах реалізації винаходу 5176 домену Сі замінений позитивно зарядженою амінокислотою. В альтернативних варіантах реалізації винаходу 5176 домену Сі. замінений негативно зарядженою амінокислотою. В одному варіанті реалізації винаходу в першому легкому ланцюгу 5176 замінений позитивно зарядженою амінокислотою (наприклад, 5176К), а в другому легкому ланцюгу 5176 замінений негативно зарядженою амінокислотою (наприклад, 51 76Е).
На додаток або як альтернатива комплементарним амінокислотним замінам в доменах СНІ і сі, варіабельні ділянки легкого і важкого ланцюгів в гетеродимерному антитілі можуть містити одну або більшу кількість комплементарних амінокислотних замін для введення заряджених амінокислот.
Наприклад, у деяких варіантах реалізації винаходу ділянка МН важкого ланцюга або ділянка МІ. легкого ланцюга гетеродимерного антитіла містить амінокислотну послідовність, що відрізняється від амінокислотної послідовності (ДО дикого типу, таким чином, що одна або більша кількість позитивно заряджених амінокислот в амінокислотній послідовності ЇдДО дикого типу замінені однією або більшою кількістю негативно заряджених амінокислот. В Як альтернатива, ділянка МН важкого ланцюга або ділянка МІ. легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, що відрізняється від амінокислотної послідовності (9 дикого типу, такому чином, що одна або більша кількість негативно заряджених амінокислот в амінокислотній послідовності (ДС дикого типу замінені однією або більшою кількістю позитивно заряджених амінокислот.
Залишки інтерфейсу ділянки М (тобто, амінокислотні залишки, які опосередковують збирання ділянок МН і МІ) в межах ділянки МН включають положення ЕИ 1, З, 35, 37, 39, 43, 44, 45, 46, 47, 50, 59, 89, 91 і 93. Один або більша кількість із цих залишків інтерфейсу на ділянці МН можуть бути замінені зарядженою (позитивно чи негативно зарядженою) амінокислотою. У деяких варіантах реалізації винаходу амінокислота в положенні ЄЮ 39 ділянки МН першого та/або другого важкого ланцюга замінена позитивно зарядженою амінокислотою, наприклад, лізином. В альтернативних варіантах реалізації винаходу амінокислота в положенні ЄЮ 39 ділянки МН першого та/або другого важкого ланцюга замінена негативно зарядженою амінокислотою, наприклад, глютаміновою кислотою.
У деяких варіантах реалізації винаходу амінокислота в положенні БО 39 ділянки МН першого важкого ланцюга замінена негативно зарядженою амінокислотою (наприклад, ОЗ39Е), а амінокислота в положенні ЕШО 39 ділянки МН другого важкого ланцюга замінена позитивно зарядженою амінокислотою (наприклад, 539К). У деяких варіантах реалізації винаходу амінокислота в положенні ЄЮ 44 ділянки
МН першого та/"або другого важкого ланцюга замінена позитивно зарядженою амінокислотою; наприклад, лізином. В альтернативних варіантах реалізації винаходу амінокислота в положенні БИ 44 ділянки МН першого та/або другого важкого ланцюга замінена негативно зарядженою амінокислотою; наприклад, глютаміновою кислотою. У деяких варіантах реалізації винаходу амінокислота в положенні
БО 44 ділянки МН першого важкого ланцюга замінена негативно зарядженою амінокислотою (наприклад, С44Е), а амінокислота в положенні ЕІ 44 в ділянки МН другого важкого ланцюга замінена позитивно зарядженою амінокислотою (наприклад, С44К).
Залишки інтерфейсу ділянки М (наприклад, амінокислотні залишки, які опосередковують збирання ділянок МН і МІ) в межах ділянки МІ, включають положення ЕИи 32, 34, 35, 36, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 4б, 48,49, 50, 51, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 85, 87, 89, 90, 91 їі 100. Один або більша кількість залишків інтерфейсу на ділянці Мі можуть бути замінені зарядженою амінокислотою, переважно амінокислотою, заряд якої є протилежним заряду амінокислот, введених в ділянку УН парного до неї важкого ланцюга. У деяких варіантах реалізації винаходу амінокислота в положенні ЕО 100 ділянки МІ. першого та/або другого легкого ланцюга замінена позитивно зарядженою амінокислотою; наприклад, лізином. В альтернативних варіантах реалізації винаходу амінокислота в положенні ЕО 100 ділянки МІ. першого та/або другого легкого ланцюга замінена негативно зарядженою амінокислотою; наприклад, глютаміновою кислотою. У деяких варіантах реалізації винаходу амінокислота в положенні ЕЮОЮ 100 ділянки МІ. першого легкого ланцюга замінена позитивно зарядженою амінокислотою (наприклад,
С100К), а амінокислота в положенні ЄЮ 100 ділянки МІ. другого легкого ланцюга замінена негативно зарядженою амінокислотою (наприклад, З100Е).
У деяких варіантах реалізації винаходу гетеродимерне антитіло за винаходом містить перший важкий ланцюг і другий важкий ланцюг і перший легкий ланцюг і другий легкий ланцюг, причому перший важкий ланцюг містить амінокислотні заміни в положеннях 44 (Е)О), 183 (ЕО), 392 (ЕЕ) і 409 (ЕУ), і, при цьому, другий важкий ланцюг містить амінокислотні заміни в положеннях 44 (Е)), 183 (ЕО), 356 (ЕЕ) і 399 (ЕЕ), притому, що перший і другий легкі ланцюги містять амінокислотні заміни в положеннях 100 (ЕМО) ї 176 (ЕО), причому амінокислотні заміни вводять в зазначене положення заряджену амінокислоту. У споріднених варіантах реалізації винаходу гліцин в положенні 44 (ЕЕ) першого важкого ланцюга замінений глютаміновою кислотою, гліцин в положенні 44 (ЕЕ) другого важкого ланцюга замінений лізином, гліцин в положенні 100 (Е)О) першого легкого ланцюга замінений лізином, гліцин в положенні 100 (ЕО) другого легкого ланцюга замінений глютаміновою кислотою, серин в положенні 176 (ЕЕ) першого легкого ланцюга замінений лізином, серин в положенні 176 (Е)) другого легкого ланцюга замінений глютаміновою кислотою, серин в положенні 183 (ЕО) першого важкого ланцюга замінений глютаміновою кислотою, лізин в положенні 392 (ЕІ) першого важкого ланцюга замінений аспарагіновою кислотою, лізин в положенні 409 (ЕЕ) першого важкого ланцюга замінений аспарагіновою кислотою, серин в положенні 183 (ЕЕ) другого важкого ланцюга замінений лізином, глютамінова кислота в положенні 356 (ЕМ) другого важкого ланцюга замінена лізином і/або аспарагінова кислота в положенні 399 (Е)) другого важкого ланцюга замінена лізином.
В інших варіантах реалізації винаходу гетеродимерні антитіла за винаходом містять перший важкий ланцюг і другий важкий ланцюг та перший легкий ланцюг і другий легкий ланцюг, причому перший важкий ланцюг містить амінокислотні заміни в положеннях 183 (ЕМО), 392 (Е) і 409 (ЕУ), і, при цьому, другий важкий ланцюг містить амінокислотні заміни в положеннях 183 (ЕМ), 356 (Е) і 399 (ЕМ), притому, що перший і другий легкі ланцюги містять амінокислотну заміну в положенні 176 (ЕМ), причому амінокислотні заміни вводять в зазначені положення заряджену амінокислоту. У споріднених варіантах реалізації винаходу серин в положенні 176 (ЕО)) першого легкого ланцюга замінений лізином, серин в положенні 176 (ЕМО) другого легкого ланцюга замінений глютаміновою кислотою, серин в положенні 183 (ЕЮ) першого важкого ланцюга замінений глютаміновою кислотою, лізин в положенні 392 (ЕОУ) першого важкого ланцюга замінений аспарагіновою кислотою, лізин в положенні 409 (ЕЕ) першого важкого ланцюга замінений аспарагіновою кислотою, серин в положенні 183 (ЕМ) другого важкого ланцюга замінений лізином, глютамінова кислота в положенні 356 (ЕМ) другого важкого ланцюга замінена лізином і/або аспарагінова кислота в положенні 399 (Е)) другого важкого ланцюга замінена лізином.
В інших варіантах реалізації винаходу гетеродимерне антитіло за винаходом містить перший важкий ланцюг і другий важкий ланцюг та перший легкий ланцюг і другий легкий ланцюг, причому перший важкий ланцюг містить амінокислотні заміни в положеннях 183 (ЕО), 392 (ЕЕ), 409 (ЕМ) ї 370 (ЕУ), ї, при цьому, другий важкий ланцюг містить амінокислотні заміни в положеннях 183 (ЕЕ), 356 (ЕФ), 399 (ЕЕ) ї 357 (ЕО), притому, що перший і другий легкі ланцюги містять амінокислотну заміну в положенні 176 (ЕМ), причому амінокислотні заміни вводять в зазначені положення заряджену амінокислоту. У споріднених варіантах реалізації винаходу серин в положенні 176 (ЕО) першого легкого ланцюга замінений лізином, серин в положенні 176 (Е)О) другого легкого ланцюга замінений глютаміновою кислотою, серин в положенні 183 (ЕМО) першого важкого ланцюга замінений глютаміновою кислотою, лізин в положенні 392 (БЕ) першого важкого ланцюга замінений аспарагіновою кислотою, лізин в положенні 409 (ЕО) першого важкого ланцюга замінений аспарагіновою кислотою, лізин в положенні 370 (ЕО) першого важкого ланцюга замінений аспарагіновою кислотою, серин в положенні 183 (ЕЕ) другого важкого ланцюга замінений лізином, глютамінова кислота в положенні 356 (Е)) другого важкого ланцюга замінена лізином, аспарагінова кислота в положенні 399 (Е)) другого важкого ланцюга замінена лізином, і/або глютамінова кислота в положенні 357 (ЕО) другого важкого ланцюга замінена лізином.
Будь-який з константних доменів може бути модифікований для введення однієї або більшої кількості мутацій зарядових пар, описаних вище, щоб полегшити правильне збирання гетеродимерного антитіла.
Гетеродимерні антитіла за винаходом додатково включають антитіла, що містять важкий ланцюг (ланцюги) і/або легкий ланцюг (ланцюги), в яких відсутні один, два, три, чотири або п'ять амінокислотних залишків на М-кінці або С-кінці або на обох, відносно будь-якого з важкого і легкого ланцюгів, наприклад, в результаті посттрансляційних модифікацій, спричинених типом клітини- хазяїна, в якій експресуються антитіла. Наприклад, клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО) часто відщеплюють С-кінцевий лізин від важких ланцюгів антитіл.
Мутації зарядової пари або комплементарні амінокислотні заміни, як описано в цьому документі, можуть бути введені на ділянках Габ першого антитіла (Раб 1) або другого антитіла (Раб 2), щоб сприяти правильному спаровуванню важкого ланцюга-легкого ланцюга. Наприклад, у деяких варіантах реалізації винаходу амінокислота в положенні ЕО 38 домену Мі в Бар 1 замінена негативно зарядженою амінокислотою (наприклад, глютаміновою кислотою), а амінокислота в положенні 39 Б домену МН в Раб 1 замінена позитивно зарядженою амінокислотою (наприклад, лізином). В інших варіантах реалізації винаходу амінокислота в положенні Є) 38 домену М. у Раб 1 замінена позитивно зарядженою амінокислотою (наприклад, лізином), а амінокислота в положенні ЄЮ 39 домену МН у Бар 1 замінена негативно зарядженою амінокислотою (наприклад, глютаміновою кислотою). У деяких варіантах реалізації винаходу амінокислота в положенні БО 38 домену МІ. в Раб 2 замінена негативно зарядженою амінокислотою (наприклад, глютаміновою кислотою), а амінокислота в положенні БЮ 39 домену МН в Раб 2 замінена позитивно зарядженою амінокислотою (наприклад, лізином). В інших варіантах реалізації винаходу амінокислота в положенні ЄЮ 38 домену Мі. в Раб 2 замінена позитивно зарядженою амінокислотою (наприклад, лізином), а амінокислота в положенні ЄЮ 39 домену МН в Бар 2 замінена негативно зарядженою амінокислотою (наприклад, глютаміновою кислотою).
У варіантах реалізації винаходу, в яких ділянка МН-СНІ (тобто, фрагмент Ба) з другого антитіла злита з важким ланцюгом першого антитіла, важкий ланцюг із першого антитіла містить мутацію 5183Е (нумерація ЕО), легкий ланцюг із першого антитіла містить мутацію 5176К (нумерація ЕМ), легкий ланцюг із другого антитіла містить мутацію 5176Е (нумерація ЕМО) і ділянка Ба з другого антитіла (яка злита із С-кінцем важкого ланцюга з першого антитіла) містить мутацію 5183К (нумерація ЕО). В інших варіантах реалізації винаходу важкий ланцюг із першого антитіла містить мутацію 544Е (ЕМО) і мутацію 5183Е (нумерація ЕО), легкий ланцюг із першого антитіла містить мутацію СТО0ОК (ЕМ) ії 5176К (нумерація ЕМ), легкий ланцюг із другого антитіла містить мутацію 5100Е (Е) ї мутацію 5176Е (нумерація ЕМ), а ділянка Ка із другого антитіла (яка злита із С-кінцем важкого ланцюга з першого антитіла) містить мутацію 544К (ЕМ) і мутацію 5183К (нумерація Е)). Знак зарядів у вищенаведених прикладах може бути змінений на зворотний, за умови, що знак заряду на відповідному легсому або важкому ланцюгу також буде змінений на зворотний, таким чином, що правильні пари важких/легких ланцюгів матимуть протилежний заряд.
В одному варіанті реалізації винахід відноситься до біспецифічного, чотирьохвалентного антигензв'язуючого білка, який містить: а) перший поліпептид, що містить перший важкий ланцюг першого антитіла, який містить першу варіабельну ділянку важкого ланцюга (УНІ) і перший домен СНІ, причому перше антитіло специфічно зв'язується з першим антигеном, і, при цьому, перший важкий ланцюг злитий на своєму С-кінці з М- кінцем поліпептиду, який містить другу варіабельну ділянку важкого ланцюга другого антитіла (МН), притому, що МН2 злитий на своєму С-кінці з М-кінцем другого домену СНІ, причому друге антитіло специфічно зв'язується з другим антигеном; і, при цьому
ЇЇ МНІ або перший домен СНІ містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення зарядженої (наприклад, позитивно зарядженої) амінокислоти в положенні залишку, вибраному з групи, що складається із положень 39, 44 і 183, відповідно до нумерації ЕШ; і ії) домен МН2 або другий СНІ містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення протилежно зарядженої (наприклад, негативно зарядженої) амінокислоти в положенні залишку, вибраному з групи, що складається із залишку, який відповідає положенням 39, 44 і 183 відповідно нумерації ЄО; і
Б) другий поліпептид, що містить перший легкий ланцюг першого антитіла з а), причому перший легкий ланцюг містить першу варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ1) і першу ділянку Сі; і, при цьому, домен М/1 або перший Сі містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення негативно зарядженої амінокислоти в положенні залишку, вибраному з групи, що складається із положень 38, 100 і 176 відповідно до нумерації ЕМ; і
(с) третій поліпептид, що містить другий легкий ланцюг другого антитіла з а), причому другий легкий ланцюг містить другу варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ2) і другу ділянку Сі; і, при цьому, домен М/1 або перший Сі містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення позитивно зарядженої амінокислоти в положенні залишку, вибраному з групи, що складається із положень 38, 100 і 176 відповідно до нумерації ЕО.
В обсязі цього винаходу перший антиген в підпункті а) вище може бути одним з ТІЛА і ТМЕ-о, а другий антиген може бути іншим з них. Інший спосіб заявити цю ж специфічність зв'язування полягає в тому, щоб сказати, що перше антитіло в підпункті а) містить одну з одиниці, що зв'язується з ТІ1А, або одиниці, що зв'язується з ТМЕ-с, а друге антитіло містить іншу з них. «Відповідає», при використанні у відношенні домену МН2 і другого домену СНІ означає, що амінокислотні залишки домену УНАІ і другого домену СНІ відраховуються від С-кінця першого важкого ланцюга, якщо відсутній лінкер. Якщо присутній пептидний лінкер, амінокислотні залишки домену МН2 і другого домену СНІ відраховують від С-кінця пептидного лінкера. В будь-якому випадку амінокислотні залишки не відраховуються від М-кінця першого важкого ланцюга. Скоріше, для домену
МУНАа ї другого домену СНІ відлік починається з першого амінокислотного залишку домену УНІ. Відлік амінокислотних залишків здійснюється із застосуванням конвенції ЄЮ або конвенції АНо.
В деяких варіантах реалізації винаходу: а) домен МНІ або перший домен СНІ містить мутацію, вибрану з групи, що складається із ОЗ9К, 44К і 5183К відповідно до нумерації ЕО; 5) домен МН2 або другий домен СНІ містить мутацію, вибрану з групи, що складається із ОЗ9Е, 544Е і 5183Е відповідно до нумерації ЕЮ; с) домен МІ/1 або перший домен Сі містить мутацію, вибрану з групи, що складається із ОЗ8Е, С100Е і 5176Е відповідно до нумерації ЕиШ; і 4) домен МІ 2 або другий домен Сі. містить мутацію, вибрану з групи, що складається із ОЗ38К, С100К і 5176К відповідно до нумерації ЕО.
У деяких варіантах реалізації винаходу: а) МНІ містить мутацію ОЗ39К, а перший домен СНІ1 містить мутацію 5183К відповідно до нумерації ЕО; 5) МН2 містить мутацію ОЗ9Е, а другий домен СНІ1 містить мутацію 5183Е відповідно до нумерації Є; с) МІ.1 містить мутацію ОЗ8Е, а перший домен Сі. містить мутацію 5176Е відповідно до нумерації ЕМ; ії 4) МІ 2 містить мутацію ОЗ8К, а другий домен Сі. містить мутацію 5176К відповідно до нумерації ЕО.
В деяких варіантах реалізації винаходу: а) перший домен СНІ містить мутації 544К і 5183К відповідно до нумерації ЕО; Б) другий домен СНІ містить мутації 544Е і 5183Е відповідно до нумерації ЕЮ; с) перший домен Сі містить мутації С100Е їі 5176Е відповідно до нумерації ЕЮ; ї а) другий домен Сі. містить мутації С1ОО0К ії 5176К відповідно до нумерації ЕО.
В одному варіанті реалізації винахід відноситься до біспецифічного, чотирьохвалентного антигензв'язуючого білка, який містить: а) перший поліпептид, що містить перший важкий ланцюг першого антитіла, який містить першу варіабельну ділянку важкого ланцюга (УНІ) і перший домен СНІ, причому перше антитіло специфічно зв'язується з першим антигеном і, при цьому, перший важкий ланцюг злитий на своєму С-кінці з М- кінцем поліпептиду, що містить другу варіабельну ділянку важкого ланцюга другого антитіла (МН), притому, що МН2 злитий на своєму С-кінці з М-кінцем другого домену СНІ, причому друге антитіло специфічно зв'язується з другим антигеном; і, при цьому:
ЇЇ МНІ або перший домен СНІ містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення негативно зарядженої амінокислоти в положенні залишку, вибраному з групи, що складається із положень 39, 44 і 183 відповідно до нумерації ЕМ; і ї) МН2 або другий домен СНІ містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення позитивно зарядженої амінокислоти в положенні залишку, вибраному з групи, що складається із залишку, який відповідає положенням 39, 44 і 183 відповідно до нумерації БО; і
Б) другий поліпептид, який містить перший легкий ланцюг першого антитіла з а), причому перший легкий ланцюг містить першу варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ1) і першу ділянку Сі; і, при цьому, МТ або перший домен Сі містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення позитивно зарядженої амінокислоти в положенні залишку, вибраному з групи, що складається із положень 38, 100 і 176 відповідно до нумерації ЕМ; і (с) третій поліпептид, що містить другий легкий ланцюг другого антитіла з а), причому другий легкий ланцюг містить другу варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ2) і другу ділянку Сі; і, при цьому, МТ або перший домен Сі містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення негативно зарядженої амінокислоти в положенні залишку, вибраному з групи, що складається із положень 38, 100 і 176 відповідно до нумерації ЕО.
В межах цього винаходу перший антиген в підпункті а) вище може бути одним з ТІ1А і ТМЕ-о, а другий антиген може бути іншим з них. Інший спосіб заявити цю ж специфічність зв'язування полягає в тому, щоб сказати, що перше антитіло в підпункті а) містить одну з одиниці, що зв'язується з ТІ1А, або одиниці, що зв'язується з ТМЕ-с, а друге антитіло містить іншу з них.
В деяких варіантах реалізації винаходу: а) домен УНІ або перший домен СНІ містить мутацію, вибрану з групи, що складається із ОЗ9Е, 544Е і 5183Е відповідно до нумерації Є; 5) домен МН2 або другий домен СНІ містить мутацію, вибрану з групи, що складається із ОЗОК, 544К і 5183К відповідно до нумерації ЕШ; с) домен МІ/1 або перший домен Сі містить мутацію, вибрану з групи, що складається із ОЗ8К, С100К і 5176К відповідно до нумерації ЕМ; і а) домен МІ2 або другий домен Сі. містить мутацію, вибрану з групи, що складається із ОЗ8Е, С100Е і 5176Е відповідно до нумерації Є).
В деяких варіантах реалізації винаходу: а) перший домен СНІ містить мутацію 5183Е відповідно до нумерації ЕШ; 5) другий домен СНІ містить мутацію 5183К відповідно до нумерації ЄЮ; с) перший домен Сі. містить мутацію 5176К відповідно до нумерації ЕІ; і 4) другий домен СІ. містить мутацію 5176Е відповідно до нумерації ЕО.
В деяких варіантах реалізації винаходу: а) МНІ містить мутацію ОЗ9Е, а перший домен СНІ містить мутацію 5183Е відповідно до нумерації ЕМО; 5) МН2 містить мутацію ОЗ9К, а другий домен СНІ містить мутацію 5183К відповідно до нумерації ЄЮ; с) МІ.1 містить мутацію ОЗ8К, а перший домен Сі. містить мутацію 5176К відповідно до нумерації ЕМ; ії 4) МІ 2 містить мутацію ОЗ8Е, а другий домен Сі. містить мутацію 5176Е відповідно до нумерації ЕО.
В деяких варіантах реалізації винаходу: а) перший домен СНІ містить мутації 544ЄЕ і 5183Е відповідно до нумерації ЕО; Б) другий домен СНІ містить мутації 544К і 5183К відповідно до нумерації ЕЮ; с) перший домен Сі містить мутації С1Т00К ї 5176К відповідно до нумерації ЕМ; і а) другий домен Сі. містить мутації С100Е і 51 76Е відповідно до нумерації ЕО.
В одному варіанті реалізації цей винахід спрямований на біспецифічний, чотирьохвалентний антигензв'язуючий білок, який містить: а) перший поліпептид, що містить перший важкий ланцюг першого антитіла, який містить першу варіабельну ділянку важкого ланцюга (УНІ) і перший домен СНІ, причому перше антитіло специфічно зв'язується з першим антигеном і, при цьому, перший важкий ланцюг злитий на своєму С-кінці з М- кінцем поліпептиду, що містить другу варіабельну ділянку важкого ланцюга другого антитіла (МН), притому, що МН2 злитий на своєму С-кінці з М-кінцем другого домену СНІ, причому друге антитіло специфічно зв'язується з другим антигеном; і, при цьому:
ЇЇ МНІ або перший домен СНІ містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення зарядженої амінокислоти в положенні залишку, вибраному з групи, що складається із положень 39, 44 і 183 відповідно до нумерації ЕО; і ї) МН2 або другий домен СНІ містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення зарядженої амінокислоти в положенні залишку, вибраному з групи, що складається із залишку, який відповідає положенням 39, 44 і 183 відповідно до нумерації ЕО, притому, що заряд є протилежним заряду заміненого залишку УНІ або першого СНІ першого важкого ланцюга; і (00247) Б) другий поліпептид містить перший легкий ланцюг першого антитіла з а), причому перший легкий ланцюг містить першу варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ 1) і першу ділянку Сі ; і, при цьому, МІ1 або перший домен СІ містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення зарядженої амінокислоти в положенні залишку, вибраному з групи, що складається із положень 38, 100 ї 176 відповідно до нумерації ЕО, притому, що заряд в положенні 38 є протилежним заряду заміненого залишку МНІ або першого СНІ першого важкого ланцюга в положенні 39; заряд в положенні 100 є протилежним заряду заміненого залишку
МНІ або першого СНІ першого важкого ланцюга в положенні 44; заряд в положенні 176 є протилежним заряду заміненого залишку МНІ або першого СНІ першого важкого ланцюга в положенні 183; і с) третій поліпептид, який містить другий легкий ланцюг другого антитіла з а), причому другий легкий ланцюг містить другу варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ2) і другу ділянку Сі; і, при цьому, М/2 або другий домен Сі містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення зарядженої амінокислоти в положенні залишку, вибраному з групи, що складається із положень 38, 100 їі 176, відповідно до нумерації ЕО, притому, що заряд в положенні 38 є протилежним заряду заміненого залишку МН2 або другого СНІ другого важкого ланцюга в положенні 39; заряд в положенні 100 є протилежним заряду заміненого залишку
МНІ2 або другого СНІ другого важкого ланцюга в положенні 44; заряд в положенні 176 є протилежним заряду заміненого залишку УН2 або другого СНІ другого важкого ланцюга в положенні 183.
В обсязі цього винаходу перший антиген в підпункті а) вище може бути одним з ТІЛА і ТМЕ-о, а другий антиген може бути іншим з них. Інший спосіб заявити цю ж специфічність зв'язування полягає в тому, щоб сказати, що перше антитіло в підпункті а) містить одну з одиниці, що зв'язується з ТІ1А, або одиниці, що зв'язується з ТМЕ-с, а друге антитіло містить іншу з них.
В деяких варіантах реалізації винаходу: а) МНІ містить мутацію ОЗ9Е, а перший домен СНІ1 містить мутацію 5183К відповідно до нумерації ЕМО; 5) МН2 містить мутацію ОЗ9К, а другий домен СНІ1 містить мутацію 5183Е відповідно до нумерації Є; с) МІ.1 містить мутацію ОЗ8К, а перший домен Сі. містить мутацію 5176Е відповідно до нумерації ЕМ; ії 4) МІ 2 містить мутацію ОЗ8Е, а другий домен Сі. містить мутацію 5176К відповідно до нумерації ЕО.
У деяких варіантах реалізації винаходу: а) перший домен СНІ містить мутації 544Е і 5183К відповідно до нумерації ЕО; Б) другий домен СНІ містить мутації 544К і 5183ЄЕ відповідно до нумерації ЕЮ; с) перший домен Сі містить мутації С100К ії 5176Е відповідно до нумерації ЕЮ; ї а) другий домен Сі. містить мутації С100Е і 5176К відповідно до нумерації ЕО.
В деяких варіантах реалізації винаходу: а) МНІ містить мутацію ОЗ9К, а перший домен СНІ містить мутацію 5183Е відповідно до нумерації ЕМО; 5) МН2 містить мутацію ОЗ9Е, а другий домен СНІ1 містить мутацію 5183К відповідно до нумерації ЄЮ; с) МІ.1 містить мутацію ОЗ8Е, а перший домен Сі. містить мутацію 5176К відповідно до нумерації ЕМ; ії 4) МІ 2 містить мутацію ОЗ8К, а другий домен Сі. містить мутацію 5176Е відповідно до нумерації ЕО.
В деяких варіантах реалізації винаходу: а) перший домен СНІ містить мутації 544К і 5183Е відповідно до нумерації ЕО; Б) другий домен СНІ містить мутації 544Е і 5183К відповідно до нумерації ЕЮ; с) перший домен Сі містить мутації С100Е ії 5176К відповідно до нумерації ЕЮ; ї а) другий домен Сі. містить мутації С1ОО0К ії 51 76Е відповідно до нумерації ЕО.
В одному варіанті реалізації винахід відноситься до способу одержання біспецифічного, чотирьохвалентного антигензв'язуючого білка, що включає: 1) спільну експресію в клітині-хазяїні: а) першого полінуклеотиду, причому перший полінуклеотид кодує перший поліпептид, що містить перший важкий ланцюг першого антитіла, який містить першу варіабельну ділянку важкого ланцюга (МНІ) і перший домен СНІ, і, при цьому, перше антитіло специфічно зв'язується з першим антигеном, притому, що перший важкий ланцюг злитий на своєму С-кінці з М-кінцем поліпептиду, що містить другу варіабельну ділянку важкого ланцюга другого антитіла (МН2), причому МНАО злитий на своєму С-кінці з
М-кінцем другого домену СНІ, і, при цьому, друге антитіло специфічно зв'язується з другим антигеном; притому, що:
Ї МНІ або перший домен СНІ містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення позитивно зарядженої амінокислоти в положенні залишку, вибраному з групи, що складається із положень 39, 44 і 183 відповідно до нумерації ЕМ; і ї) МН2 або другий домен СНІ містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення негативно зарядженої амінокислоти в положенні залишку, вибраному з групи, що складається із залишку, який відповідає положенням 39, 44 і 183 відповідно до нумерації ЄЮ; і
Б) другого полінуклеотиду, причому другий полінуклеотид кодує другий поліпептид, який містить легкий ланцюг першого антитіла з а), і при цьому, легкий ланцюг містить першу варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ/1) і першу ділянку Сі; притому, що МІ/1 або перший домен Сі містять щонайменше одну амінокислотну заміну для введення негативно зарядженої амінокислоти в положенні залишку, вибраному з групи, що складається із положень 38, 100 ї 176 відповідно до нумерації БО; с) третього полінуклеотиду, причому третій полінуклеотид кодує третій поліпептид, що містить легкий ланцюг другого антитіла з а), і, при цьому, легкий ланцюг містить другу варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ 2) і другу ділянку СІ; притому, що домен МІ/1 або перший домен Сі. містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення позитивно зарядженої амінокислоти в положенні залишку, вибраному з групи, що складається із положень 38, 100 ї 176 відповідно до нумерації БО; 2) культивування клітини-хазяїна в умовах, при яких утворюються поліпептиди; і 3) виділення антигензв'язуючого білка з клітини-хазяїна.
В межах цього винаходу перший антиген в підпункті а) вище може бути одним з ТІ1А і ТМЕ-о, а другий антиген може бути іншим з них. Інший спосіб заявити цю ж специфічність зв'язування полягає в тому, щоб сказати, що перше антитіло згідно з підпунктом а) містить одну з одиниці, що зв'язується з
ТІЛА, або одиниці, що зв'язується з ТМЕ-с, а друге антитіло містить іншу з них.
В одному варіанті реалізації цей винахід відноситься до способу одержання біспецифічного, чотирьохвалентного антигензв'язуючого білка, що включає: 1) спільну експресію в клітині-хазяїні: а) першого полінуклеотиду, причому перший полінуклеотид кодує перший поліпептид, що містить перший важкий ланцюг першого антитіла, який містить першу варіабельну ділянку важкого ланцюга (МНІ) і перший домен СНІ, і, при цьому, перше антитіло специфічно зв'язується з першим антигеном, притому, що перший важкий ланцюг злитий на своєму С-кінці з М-кінцем поліпептиду, що містить другу варіабельну ділянку важкого ланцюга другого антитіла (МН2), причому УНІ злитий на своєму С-кінці з
М-кінцем другого домену СНІ, і, при цьому, друге антитіло специфічно зв'язується з другим антигеном; притому, що:
ЇЇ МНІ або перший домен СНІ містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення негативно зарядженої амінокислоти в положенні залишку, вибраному з групи, що складається із положень 39, 44 і 183 відповідно до нумерації ЕМ; і ї) МН2 або другий домен СНІ містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення позитивно зарядженої амінокислоти в положенні залишку, вибраному з групи, що складається із залишку, який відповідає положенням 39, 44 і 183, відповідно до нумерації ЄШ; і
Б) другого полінуклеотиду, причому другий полінуклеотид кодує другий поліпептид, що містить перший легкий ланцюг першого антитіла з а), і, при цьому, перший легкий ланцюг містить першу варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ 1) і першу ділянку Сі; притому, що МІ 1 або перший домен Сі. містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення позитивно зарядженої амінокислоти в положенні залишку, вибраному з групи, що складається із положень 38, 100 ї 176 відповідно до нумерації ЄО; і (с) третього полінуклеотиду, причому третій полінуклеотид кодує третій поліпептид, який містить другий легкий ланцюг другого антитіла з а), і, при цьому, другий легкий ланцюг містить другу варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ 2) і другу ділянку СІ; притому, що МІ 1 або перший домен Сі. містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення негативно зарядженої амінокислоти в положенні залишку, вибраному з групи, що складається із положень 38, 100 ї 176 відповідно до нумерації БО; 2) культивування клітини-хазяїна в умовах, при яких утворюються поліпептиди; і 3) виділення антигензв'язуючого білка з клітини-хазяїна.
В межах цього винаходу перший антиген в підпункті а) вище може бути одним з ТІ1А і ТМЕ-о, а другий антиген може бути іншим з них. Інший спосіб заявити цю ж специфічність зв'язування полягає в тому, щоб сказати, що перше антитіло в підпункті а) містить одну з одиниці, що зв'язується з ТІ1А, або одиниці, що зв'язується з ТМЕ-с, а друге антитіло містить іншу з них.
В одному варіанті реалізації винахід відноситься до способу одержання біспецифічного, чотирьохвалентного антигензв'язуючого білка, який включає: 1) спільну експресію в клітині-хазяїні: а) першого полінуклеотиду, причому перший полінуклеотид кодує перший поліпептид, що містить перший важкий ланцюг першого антитіла, який містить першу варіабельну ділянку важкого ланцюга (МНІ) і перший домен СНІ, причому перше антитіло специфічно зв'язується з першим антигеном, і, при цьому, перший важкий ланцюг злитий на своєму С-кінці з М-кінцем поліпептиду, що містить другу варіабельну ділянку важкого ланцюга другого антитіла (МН2), притому, що УН2 злитий на своєму С- кінці з М-кінцем другого домену СНІ. причому друге антитіло специфічно зв'язується з другим антигеном; де
ЇЇ МНІ або перший домен СНІ містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення зарядженої амінокислоти в положенні залишку, вибраному з групи, що складається із положень 39, 44 і 183 відповідно до нумерації ЕО; і ї) МН2 або другий домен СНІ містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення зарядженої амінокислоти в положенні залишку, вибраному з групи, що складається із залишку, який відповідає положенням 39, 44 і 183 відповідно до нумерації ЕО, причому заряд є протилежним заряду заміненого залишку УНІ або першого СНІ першого важкого ланцюга; і
Б) другого полінуклеотиду, причому другий полінуклеотид кодує другий поліпептид, що містить легкий ланцюг першого антитіла з а), і, при цьому, легкий ланцюг містить першу варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ/1) і першу ділянку Сі; притому, що МІ!/71 або перший домен Сі містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення зарядженої амінокислоти в положенні залишку, вибраному з групи, що складається із положень 38, 100 і 176 відповідно до нумерації БО, причому заряд в положенні 38 є протилежним заряду заміненого залишку МНІ або першого СНІ першого важкого ланцюга в положенні 39; заряд в положенні 100 є протилежним заряду заміненого залишку
МНІ або першого СНІ першого важкого ланцюга в положенні 44; заряд в положенні 176 є протилежним заряду заміненого залишку МНІ або першого СНІ першого важкого ланцюга в положенні 183; і (с) третього полінуклеотиду, причому третій полінуклеотид кодує третій поліпептид, що містить легкий ланцюг другого антитіла з а), і, при цьому, легкий ланцюг містить другу варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ 2) і другу ділянку Сі; притому, що МІ 1 або перший домен СІ. містить щонайменше одну амінокислотну заміну для введення позитивно зарядженої амінокислоти в положенні залишку, вибраному з групи, що складається із положень 38, 100 і 176 відповідно до нумерації ЕО, причому заряд в положенні 38 є протилежним заряду заміненого залишку МН2 або другого СНІ другого важкого ланцюга в положенні 39; заряд в положенні 100 є протилежним заряду заміненого залишку
МНІ2 або другого СНІ другого важкого ланцюга в положенні 44; заряд в положенні 176 є протилежним заряду заміненого залишку УН2 або другого СНІ другого важкого ланцюга в положенні 183; 2) культивування клітини-хазяїна в умовах, при яких утворюються поліпептиди; і 3) виділення антигензв'язуючого білка з клітини-хазяїна.
В межах цього винаходу перший антиген в підпункті а) вище може бути одним з ТІ1А і ТМЕ-о, а другий антиген може бути іншим з них. Інший спосіб заявити цю ж специфічність зв'язування полягає в тому, щоб сказати, що перше антитіло в підпункті а) містить одну з одиниці, що зв'язується з ТІ1А, або одиниці, що зв'язується з ТМЕ-с, а друге антитіло містить іншу з них.
Додатково або як альтернатива, правильне спаровування важкого-легкого ланцюга може бути полегшено шляхом заміни доменів СНІ і Сі в карбокси-кінцевому зв'язуючому домені Бар. Як приклад, перший поліпептид, який злитий з карбоксильним кінцем важкого ланцюга, може містити домен МІ і домен СНІ з другого антитіла, а другий поліпептид може містити домен МН і домен СІ з другого антитіла, В іншому варіанті реалізації винаходу перший поліпептид, який злитий з карбоксильним кінцем важкого ланцюга, може містити домен МН і домен Сі. з другого антитіла, а другий поліпептид може містити домен МІ. і домен СНІ з другого антитіла.
Константні ділянки важкого ланцюга або ділянки Ес біспецифічних антигензв'язуючих білків, описані в цьому документі, можуть містити одну або більшу кількість амінокислотних замін, які впливають на глікозилювання і/"або ефекторну функцію антигензв'язуючого білка. Одна з функцій ділянки Ес імуноглобуліну полягає в тому, щоб повідомляти імунній системі, коли імуноглобулін зв'язується зі своєю мішенню. Це зазвичай називають «ефекторною функці .ю». Комунікація приводить до антитілозалежної клітинної цитотоксичності (АЗКЦ), антитілозалежного клітинного фагоцитозу (АЗКФ) і/або комплементзалежної цитотоксичності (КЗЦ). АЗКЦ і АЗКФ опосередковуються зв'язуванням ділянки Ес з рецепторами Ес на поверхні клітин імунної системи. КЗЦ опосередковується зв'язуванням Ес з білками системи комплементу, наприклад, С14. У деяких варіантах реалізації винаходу біспецифічні антигензв'язуючі білки за винаходом містять одну або більшу кількість амінокислотних замін в константній ділянці для підвищення ефекторної функції, включаючи активність
АЗКЦ, активність КЗЦ, активність АЗКФ, і/або кліренс або збільшення періоду напіввиведення антигензв'язуючого білка. Типові амінокислотні заміни (нумерація ЕЕ), які можуть підсилювати ефекторну функцію, включають, але не обмежуючись цим, Е2331,, І 2341, 1 234У, 12355, 5236А, 52390,
Е243І, Б243МУ, РгА7І, р28оОНн, К2905, К290ОЕ, К29ОМ, К290У, В292Р, Е2941, У296МУ, 5298А, 52980, 5298М, 52980, 52981, Т299А, М3001, М305І, О311М, КЗ2бА, КЗ2бЕ, КЗ2бМУ, АЗ305, АЗЗОЇ, АЗЗОМ,
АЗЗОР, І332Е, ОЗ3З3ЗА, Е3335, ЕЗЗЗА, КЗ334А, КЗ334У, АЗ3390, АЗ3390, РЗ396І. або комбінації будь-якого з наведених вище.
В інших варіантах реалізації винаходу біспецифічні антигензв'язуючі білки за винаходом містять одну або більшу кількість амінокислотних замін в константній ділянці для зниження ефекторної функції. Типові амінокислотні заміни (нумерація ЕО), які можуть знижувати ефекторну функцію, включають, але не обмежуючись цим, С2205, Сб2265, Сб2295, Е2ЗЗР, 1234А, І 234М, М234А, І 234Е,
І235А, 1235Е, сп237А, Р2г385, 5267Е, Н2680, М297А, М2970, М3091, ЕЗ18А, І 328Е, АЗ305, АЗЗ315,
РЗ3315 або комбінації будь-якого з наведених вище.
Типові заміни для забезпечення правильного складання молекул гетеро Ід зображені на Фіг. 1.
Переважні заміни для формату гетеро Ід зображені у (2) на фіг. 1 і наведені в Табл. М. Всі положення в Табл. М відповідають нумерації ЕО.
Таблиця М
Мутації в молекулах гетеро Ід о Ланцюг | Домен/// | Мутацяд///// | МБО важкий вв гля
ПИ ден 717171717171017186717171717171717171711111017117771111392 сн 7777111111В11111111111111111111111140811
Важкий ланцюг?
Переважні заряджені амінокислоти для формату Ідб-Бар, а також обміни доменів СН/СіІ, як описано в цьому документі для Фіг. 26, представлені у Табл. 0. «Раб 1» і «Раб 2» в Табл. О є такими, як зображено на фіг. 25 і 26. Раб 1 знаходиться на М-кінці молекули Ідо-Раб, а Раб 2 знаходиться на її
С-кінці. Ідентичність і положення заряджених амінокислот у Раб відображаються праворуч від домену, наведеного в Табл. 0. Всі положення відповідають нумерації Е0О.
Таблиця О
Мутації в молекулах Ідо-Рар о Позначення | Домен / Мутаця | Ме / Домен )| Мутаця | МеЕО габі
Габ 2 гарт і2 мя
Обмін СРМУ2 гав 1
Обмін СРМУ2
Га 9
Обмін СРМУ2 габті2
Ме
Обмін СРМУЗ гав 1 в
Афінність зв'язування і біологічна активність
В іншому варіанті реалізації вищеописаних аспектів винаходу анти-ТІА-антитіло (або його антигензв'язуючий фрагмент) або одиниця, що зв'язується з ТІ 1А, біспецифічного антигензв'язуючого білка гетеро Ід або антигензв'язуючого білка Ідс-5сЕм зв'язується з ТІ ТА з афінністю зв'язування (Ко!) щонайменше 1 х 1079 М", щонайменше 5 х 1079 М", щонайменше 1 х 179 М", щонайменше 5 х 1079
М-, щонайменше 8 х 1070 М' або щонайменше 1 х 1079 М", причому афінність зв'язування вимірюють методом поверхневого плазмонного резонансу, таким як Віасоге. Більш конкретно, винахід відноситься до наступних варіантів реалізації винаходу: антитіло проти ТІ1А (або його антигензв'язуючий фрагмент) зв'язується з ТІ/1А людини, притому, що антитіло іммобілізоване на сенсорному чіпі 5ХСМ5, з афінністю зв'язування КО від близько 1 до близько 5 пМ, або з ТІ1А яванського макака, притому, що антитіло іммобілізоване на сенсорному чіпі
СМ, з афінністю зв'язування КО від близько 1-10 до близько 7,579 М"; одиниця, що зв'язується з ТМЕ-со, біспецифічного антигензв'язуючого білка гетеро Ід зв'язується з
ТМЕ-х людини, притому, що антигензв'язуючий білок іммобілізований на сенсорному чіпі 5СМ5, з афінністю зв'язування КО від близько 1-10 до 579 М"пМ, переважно від близько 10 до близько 12 пМ; одиниця, що зв'язується з ТІ14А, біспецифічного антигензв'язуючого білка гетеро Ід зв'язується з
ТІЛА людини, притому, що антигензв'язуючий білок іммобілізований на сенсорному чіпі 5СМ5, з афінністю зв'язування КО від близько 2-10 до 6,579 М", переважно від близько 10 до близько 11 пМ; одиниця, що зв'язується з ТМЕ-о, біспецифічного антигензв'язуючого білка Їд0-5сЕм зв'язується з
ТМЕ-х людини, притому, що антигензв'язуючий білок іммобілізований на сенсорному чіпі 5СМ5, з афінністю зв'язування КО від близько 4,579 до близько 7,579 М", переважно від близько 10 до близько пМ;і одиниця, що зв'язується з ТІ1А, біспецифічного антигензв'язуючого білка ІдО-5сЕм зв'язується з
ТІЛА людини, притому, що антигензв'язуючий білок іммобілізований на сенсорному чіпі 5СМ5, з афінністю зв'язування КО від близько 1,5 до близько 160 пМ.
Більш детальна інформація про зв'язуванні з Т/1А і ТМЕ-х представлена у Прикладах 13 і 15 нижче.
В іншому варіанті реалізації вищеописаних аспектів одиниця, що зв'язується з ТМЕ-с, біспецифічного антигензв'язуючого білка Ідс-Бар зв'язується з тримером ТМЕ-ос з афінністю зв'язування (КОТ) 1 х 1079 М", щонайменше 5 х 1079 М", щонайменше 1 х 1079 М", щонайменше 5 х 1070 М", щонайменше 8 х 1079 М'або щонайменше 1х1079 М", причому афінність зв'язування вимірюють методом поверхневого плазмонного резонансу, таким як Віасоге.
В інших варіантах реалізації вищеописаних аспектів винаходу: антитіло проти ТІ1А (або його антигензв'язуючий фрагмент) нейтралізує або інгібує Т/1А людини в репортерній клітинній лінії ТЕ-1 МЕ-кВ з ІСхо від близько 0,08 до З НМ, з ТІ1ТА яванського макака в репортерній клітинній лінії ТЕ-1 МЕ-кВ з ІСвхо від близько 0,375 до близько 10 нм;
ТМЕ-а зв'язуюча одиниця біспецифічного антигензв'язуючого білка гетеро Ід нейтралізує або інгібує людський ТМЕ-о в репортерній клітинній лінії ТЕ-1 МЕ-кВ з ІСв5о від близько 50 до 550 пМ, переважно від близько 50 до 110 пМ; одиниця, що зв'язується з ТІ1А, біспецифічного антигензв'язуючого білка гетеро Ід, нейтралізує або інгібує ТІ1А людини в репортерній клітинній лінії ТЕ-1 МЕ-кВ з ІСво від близько 45 до близько 3500
ПМ, переважно від близько 45 до 190 пМ; одиниця, що зв'язується з ТМЕ-о, біспецифічного антигензв'язуючого білка Ідб-5сЕм нейтралізує або інгібує розчинний ТМЕ-ос людини в репортерній клітинній лінії ТЕ-1 МЕ-кВ з ІСзо від близько 20 до близько 75пМ; і одиниця, що зв'язується з ТІ 1А, біспецифічного зв'язуючого білка Ї3д-5сЕм нейтралізує або інгібує
ТІЛА людини в репортерній клітинній лінії ТЕ-1 МЕ-кВ з ІСзо від близько 19 до 200 пМ.
Більш детальна інформація про інгібування ТІ ТА та інгібування ТМЕ-х представлена у Прикладах 14 і 16 нижче.
Імунокон'югати, похідні, варіанти
Антитіла і біспецифічні антитіла за винаходом можна застосовувати окремо або у вигляді імунокон'югатів з терапевтичним агентом (наприклад, цитотоксичний агент). У деяких варіантах реалізації винаходу агент являє собою хіміотерапевтичний агент. У деяких варіантах реалізації винаходу агент являє собою радіоіїзотопи, включаючи, але не обмежуючись цим, свинець-212, вісмут- 212, астатин-211, йод-131, скандій-47, реній-186, реній-188, ітрій-90, йод-123, йод-125, бром-77, індій- 111 ї нукліди, що діляться, такі як бор-10 або актинідій. В інших варіантах реалізації винаходу агент являє собою токсин або цитотоксичний лікарський засіб, включаючи, але не обмежуючись цим, рицин, абрин, модифікований ентеротоксин А Рвгепдотопав5, екзотоксин Рвгепйдотопавх, каліхеаміцин, адріаміцин, 5-флуороурацил, дифтерійний токсин і т.п. Способи кон'югації антитіл з такими агентами відомі з літератури і включають пряму і непряму кон'югацію.
Придатні детектовані молекули можуть бути прямо або непрямо приєднані до антитіл і біспецифічних антитіл за цим винаходом. Придатні детектовані молекули включають радіонукліди, ферменти, субстрати, кофактори, інгібітори, флуоресцентні маркери, хемілюмінесцентні маркери, магнітні частинки і т.п. Для непрямого приєднання детектованої або цитотоксичної молекула, детектована або цитотоксична молекула може бути кон'югована з елементом комплементарної/анти- комплементарної пари, в якій інший елемент з'єднаний із зв'язуючим поліпептидом або частиною антитіла. Типовою комплементарною/анти-комплементарною парою для цих цілей (є біотин/стрептавідин.
Біспецифічні антитіла і антитіла за винаходом додатково включають похідні, модифіковані, наприклад, шляхом ковалентного приєднання будь-якого типу молекули до антитіла, таким чином, що ковалентне приєднання не перешкоджає зв'язуванню антитіла з його епітопом. Приклади придатних похідних включають, але не обмежуючись цим, антитіла або біспецифічні антитіла, які є фукозильованими, глікозильованими, ацетильованими, пегільованими, фосфорильованими або амідованими. Антитіла і біспецифічні антитіла і їх похідні за винаходом можуть самі по собі бути дериватизованими відомими захисними/локуючими групами, протеолітичним розщепленням, зв'язуванням з клітинним лігандом або іншими білками і т.п. У деяких варіантах реалізації винаходу щонайменше один важкий ланцюг антитіла або біспецифічного антигензв'язуючого білка є
ПЕГільованим. У деяких варіантах реалізації винаходу ПЕГілювання здійснюється шляхом М- приєднання або приєднання через бічний ланцюг амінокислоти (наприклад, лізину)
Глікозилювання може сприяти ефекторній функції антитіл, зокрема антитіл ЇдсС1. Таким чином, в деяких варіантах реалізації винаходу антигензв'язуючі білки за винаходом можуть містити одну або більшу кількість амінокислотних замін, які впливають на рівень або тип глікозилювання зв'язуючих зв'язуючих білків. Глікозилювання поліпептидів зазвичай є М-зв'язаним або О-зв'язаним. М-зв'язане відноситься до приєднання вуглеводного фрагмента до бічного ланцюга аспарагінового залишку.
Трипептидні послідовності аспарагін-Х-серин і аспарагін-Х-треонін, в яких Х являє собою будь-яку амінокислоту, крім проліну, є послідовностями розпізнавання для ферментативного приєднання вуглеводного фрагмента до бічного ланцюга аспарагіну. Таким чином, присутність будь-якої з цих трипептидних послідовностей в поліпептиді створює потенційний сайт глікозилювання. О-зв'язане глікозилювання відноситься до приєднання одного з цукрів М-ацетилгалактозаміну, галактози або ксилози до гідроксиамінокислоти, найчастіше до серину або треоніну, хоча також можна застосовувати 5-гідроксипролін або 5-гідроксилізин.
У деяких варіантах реалізації винаходу ступінь глікозилювання антигензв'язуючих білків, описаних в цьому документі, підвищують шляхом додавання одного або більшої кількості сайтів глікозилювання, наприклад, на ділянці Ес зв'язуючого білка. Додавання сайтів глікозилювання до антигензв'язуючого білка може бути з зручністю здійснено шляхом модифікації амінокислотної послідовності таким чином, щоб вона містила одну або більшу кількість описаних вище трипептидних послідовностей (для сайтів
М-зв'язаного глікозилювання). Крім того, модифікація може бути здійснена шляхом додавання або введення за допомогою заміни одного або більшої кількості залишків серину або треоніну у вихідну послідовність (для сайтів О-зв'язаного глікозилювання). Для зручності, амінокислотна послідовність антигензв'язуючого білка може бути модифікована за допомогою змін на рівні ДНК, зокрема, шляхом мутації ДНК, що кодує цільової поліпептид, в положенні заздалегідь вибраних основ, таким чином, що генеруються кодони, які будуть трансформуватися в бажані амінокислоти.
Винахід додатково включає одержання антигензв'язуючих білків з модифікованою вуглеводною структурою, що дає модифіковану ефекторну активність, включаючи антигензв'язуючі білки без фукозилювання або зі зменшеним фукозилюванням, які виявляють покращену активність АЗКЦ. В цій галузі техніки відомі різні способи зменшення або виключення фукозилювання. Наприклад, ефекторна активність АЗКЦ опосередковується зв'язуванням молекули антитіла з рецептором ЕсуКІПї, який, як було показано, залежить від вуглеводної структури М-зв'язаного глікозилювання у залишку М297 домену СН2. Нефукозильовані антитіла зв'язуються з цим рецептором з підвищеною афінністю і запускають ефекторні функції, опосередковувані ЕсуКІ, більш ефективно, ніж нативні, фукозильовані антитіла. Наприклад, рекомбінантне продукування нефукозильованого антитіла в клітинах СНО з нокаутом ферменту альфа-1,6-фукозилтрансферази дає антитіло із 100-разовим збільшенням активності АЗКЦ (див. УХатапе-ОпНпикі еї а!., Віоїеснпо! Віоепд. 87(5): 614-22, 2004). Подібні ефекти можуть бути досягнуті за рахунок зниження активності ферменту альфа-1,6-фукозилтрансферази або інших ферментів в шляху фукозилювання, наприклад, за допомогою обробки міРнНК або антисмисловою РНК сконструйованих клітинних ліній для нокауту ферменту(-ів) або культивування із селективними інгібіторами глікозилювання (див. Коїптап еї аї., Мої! Ітітипої. 26(12):1113-23, 1989).
Деякі штами клітин-хазяїнів, наприклад, І ес13 або клітинна лінія гібридоми щурів УВ2/0 природним чином продукують антитіла з більш низькими рівнями фукозилювання (див. Зпієїаз еї аї.,./ ВіоїЇ Спет. 277(30): 26733-40, 2002, і Нпіпкаула еї аїЇ., У Віої Сет. 278(5): 3466-73, 2003). Крім того, було визначено, що підвищення рівня розділених вуглеводів, наприклад, за допомогою рекомбінантного продукування антитіла в клітинах з підвищеною експресією ферменту СпТІій, збільшує активність
АЗКЦ (див. тапа еї а!., Маї Віотесппо). 1 7(2):176-80, 1999).
В інших варіантах реалізації винаходу глікозилювання антигензв'язуючих білків, описаних в цьому документі, зменшують або виключають шляхом видалення одного або більшої кількості сайтів глікозилювання, наприклад, на ділянці Ес зв'язуючого білка. Амінокислотні заміни, що виключають або модифікують М-зв'язані сайти глікозилювання, можуть зменшувати або виключати М-зв'язане глікозилювання антигензв'язуючого білка. В деяких варіантах реалізації винаходу описані в цьому документі біспецифічні антигензв'язуючі білки містять мутацію в положенні М297 (нумерація ЕМ), таку як М2970, М297А або М29765. В одному конкретному варіанті реалізації винаходу біспецифічні антигензв'язуючі білки за винаходом містять ділянку Ес з антитіла ЇД61 людини із мутацією М2970.
Для покращення стабільності молекул, що містять мутацію М297, ділянка Ес таких молекул може бути додатково модифікованою. Наприклад, у деяких варіантах реалізації винаходу одна або більша кількість амінокислот на ділянці Ес замінені цистеїном з метою сприяння утворенню дисульфідного зв'язку в димерному стані.
Таким чином, залишки, що відповідають 259, А287, К292, М302, І 306, М323 або 1332 (нумерація
ЕУ) ділянки Ес Ідс1, можуть бути замінені цистеїном. В одному варіанті реалізації винаходу конкретні пари залишків замінені цистеїном таким чином, що вони переважно утворюють дисульфідний зв'язок один з одним, таким чином обмежуючи або запобігаючи заплутуванню дисульфідних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу пари включають, але не обмежуючись цим, А287С і І 306С, М259С і
ІГ306С, кК292С і М302С і М323С і 13320. У конкретних варіантах реалізації винаходу біспецифічні антигензв'язуючі білки, описані в цьому документі, містять ділянку Ес з антитіла (91 людини з мутаціями в положеннях К292С і М302С. У таких варіантах реалізації винаходу ділянка Ес може додатково містити мутацію М2970.
І0О0О291| Крім того, можуть бути бажаними модифікації антигензв'язуючих білків за винаходом з метою збільшення періоду напіввиведення з сироватки, наприклад, шляхом введення або додавання епітопу, що зв'язується з рецептором реутилізації (наприклад, шляхом мутації відповідної ділянки або шляхом введення епітопу в пептидну мітку, для якої в подальшому здійснюють злиття з антигензв'язуючим білком на будь-якому кінці або в середині, наприклад, шляхом синтезу ДНК або пептиду, див., наприклад, УМО96/32478) або додавання молекул, таких як ПЕГ або інші водорозчинні полімери, включаючи полісахаридні полімери. Епітоп зв'язування з рецептором реутилізації переважно являє собою ділянку, в якій будь-які один або більша кількість амінокислотних залишків з однієї або двох петель ділянки Ес переносять в аналогічне положення антигензв'язуючого білка. В одному варіанті реалізації винаходу переносять три або більшу кількість залишків з однієї або двох петель ділянки Ес. В одному варіанті реалізації винаходу епітоп узятий з домену СН2 ділянки Ес (наприклад, ділянка Ес ІдсС) і перенесений на ділянку СНІ, СНЗ або МН або більш ніж одну таку ділянку антигензв'язуючого білка. Як альтернатива, епітоп узятий з домену СН2 ділянки Ес і перенесений на ділянку Сі або ділянку МІ або обидві ділянки антигензв'язуючого білка. Опис варіантів Ес і їх взаємодії з рецептором реутилізації див. у Міжнародних заявках М/О 97/34631 та УУМО 96/32478.
Біспецифічні антитіла і антитіла за винаходом включають варіанти, що містять одну або більша кількість амінокислотних замін, делецій, додавань або заміщень, які зберігають їх біологічні властивості (наприклад, блокування зв'язування ТІ1А і/або ТМЕ-о з їх відповідними рецепторами, інгібування біологічної активності ТІЛА і ТМЕ-о). Фахівець у даній галузі техніки зможе створити варіанти, що містять одну або більшу кількість амінокислотних замін, делецій, добавок або заміщень.
Такі варіанти можуть включати, серед іншого: (а) варіанти, в яких один або більша кількість амінокислотних залишків замінені консервативними або неконсервативними амінокислотами, (Б) варіанти, в яких одна або більша кількість амінокислот додані або видалені з поліпептиду, (с) варіанти, в яких одна або більша кількість амінокислот містять групу замісника, і (4) варіанти, в яких поліпептид злитий з іншим пептидом або поліпептидом, таким як партнер по злиттю, білкова мітка або інший хімічний фрагмент, який може забезпечувати поліпептиду корисні властивості, такі як, наприклад, епітоп для антитіла, полігістидинова послідовність, біотиновий фрагмент і т.п. Антитіла і біспецифічні антитіла за винаходом можуть включати варіанти, в яких амінокислотні залишки від одного виду замінені відповідним залишком іншого виду, в консервативних або неконсервативних положеннях. В іншому варіанті реалізації винаходу амінокислотні залишки в неконсервативних положеннях замінені консервативними або неконсервативними залишками. Методи одержання таких варіантів, включаючи генетичні (пригнічення, делеції, мутації і т.д.), хімічні та ферментативні методи, відомі звичайному фахівцеві в цій галузі техніки.
Нуклеїнові кислоти, вектори, клітини-хазяї
Винахід додатково включає виділені нуклеїнові кислоти, що кодують біспецифічні антитіла за винаходом, що включає, наприклад, легкий ланцюг, варіабельну ділянку легкого ланцюга, константну ділянку легкого ланцюга, важкий ланцюг, варіабельну ділянку важкого ланцюга, константну ділянку важкого ланцюга, лінкери та будь-які і всі компоненти і їх комбінації для біспецифічних антитіл, описаних в цьому документі. Нуклеїнові кислоти за винаходом включають нуклеїнові кислоти, що володіють гомологією щонайменше 80 95, більш переважно щонайменше близько 90 95, більш переважно щонайменше близько 95 95 і найбільш переважно щонайменше близько 98 95 з нуклетїновими кислотами за винаходом. Терміни «відсоток подібності», «відсоток ідентичності» і «відсоток гомології» при посиланні на конкретну послідовність використовуються, як зазначено в програмному забезпеченні ОСОФ Університету Вісконсіна. Крім того, нуклеїнові кислоти за винаходом включають комплементарні нуклеїнові кислоти. У деяких випадках послідовності будуть повністю комплементарними (без невідповідностей) при вирівнюванні. В інших випадках у послідовності може бути присутнім до 20 95 невідповідності. У деяких варіантах реалізації винаходу пропонуються нуклеїнові кислоти, що кодують як важкий ланцюг, так і легкий ланцюг антитіла за винаходом.
Нуклеїнові кислоти за винаходом можуть бути клоновані у вектор, такий як плазміда, косміди, бакміда, фаг, штучна хромосома (ВАС, УАС) або вірус, в які може бути вставлена інша генетична послідовність або елемент (ДНК або РНК), таким чином, щоб забезпечити реплікацію приєднаної послідовності або елемента. В деяких варіантах реалізації винаходу вектор експресії містить сегмент конститутивно активного промотору (такого як, але не обмежуючись цим, ЦМВ, 5М40, фактор елонгації або послідовність ІТК) або послідовність індуцибельного промотору, такого як індукований стероїдом вектор ріМмО (Іпийгодеп), таким чином, що експресію нуклеїнової кислоти можна регулювати.
Вектори експресії за винаходом можуть додатково містити регуляторні послідовності, наприклад, внутрішній сайт входу рибосоми. Наприклад, вектор експресії можна ввести в клітину шляхом трансфекції.
У разі біспецифічних антигензв'язуючих білків Їд0-Бар нуклеїнові кислоти, які кодують кожен із трьох компонентів, можуть бути клоновані в один і той же вектор експресії. У деяких варіантах реалізації винаходу нуклеїнову кислоту, яка кодує легсий ланцюг молекули Ідс-ЕаБб, і нуклеїнову кислоту, яка кодує другий поліпептид (що містить іншу половину С-кінцевого домену Раб), клонують в один вектор експресії, тоді як нуклеїнову кислоту, що кодує модифікований важкий ланцюг (гібридний білок, що містить важкий ланцюг і половину домену Раб) клонують в другий вектор експресії. У деяких варіантах реалізації винаходу всі компоненти біспецифічних антигензв'язуючих білків, описаних в цьому документі, експресуються з однієї і тієї ж популяції клітин-хазяїв. Наприклад, навіть якщо один або більша кількість компонентів клоновані в окремий вектор експресії, клітину-хазяїн спільно трансфектують обома векторами експресії, таким чином, що одна клітина продукує всі компоненти біспецифічних антигензв'язуючих білків.
В іншому варіанті реалізації винахід відноситься до вектору експресії, який містить наступні функціонально пов'язані елементи; промотор транскрипції; першу молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує важкий ланцюг біспецифічного антигензв'язуючого білка, антитіла або антигензв'язуючого фрагмента за винаходом; другу молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує легкий ланцюг біспецифічного антигензв'язуючого білка, антитіла або антигензв'язуючого фрагмента за винаходом; і термінатор транскрипції. В іншому варіанті реалізації цей винахід відноситься до вектору експресії, який містить наступні функціонально пов'язані елементи; перший промотор транскрипції; першу молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує важкий ланцюг біспецифічного антигензв'язуючого білка, антитіла або антигензв'язуючого фрагмента за винаходом; термінатор транскрипції; другий промотор транскрипції; другу молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує легкий ланцюг біспецифічного антигензв'язуючого білка, антитіла або антигензв'язуючого фрагмента за винаходом; і другий термінатор транскрипції.
Крім того, послідовність секреторного сигнального пептиду при бажанні може необов'язково кодуватися вектором експресії, функціонально пов'язаним з кодуючою послідовністю, що представляє інтерес, таким чином, що експресований поліпептид може секретуватися рекомбінантною клітиною- хазяїном для більш легкого виділення поліпептиду, що представляє інтерес, з клітини. Наприклад, у деяких варіантах реалізації винаходу послідовності сигнальних пептидів можуть бути приєднані/злиті з аміно-кінцем будь-якої з поліпептидних послідовностей, наведених у Табл. Е, 9), К і Її. У деяких варіантах реалізації винаходу сигнальний пептид, що має амінокислотну послідовність
МКНІМ/РР І МААРАМУМІ 5 (5ЕО 10 МО: 499) злитий з аміно-кінцем будь-якої з поліпептидних послідовностей з Табл. 0, І, У ії К. В інших варіантах реалізації винаходу сигнальний пептид, що має амінокислотну послідовність МЕТРА ЕС ЛУМСРОТТО (5ЕБО ІО МО: 501) злитий з аміно-кінцем будь-якої з поліпептидних послідовностей з Табл. Е, 9), Кі ЇЇ. У решті випадків реалізації винаходу сигнальний пептид, що має амінокислотну послідовність МОМАКМРАОГ СГ УМ КСАКС (ЗЕО ІЮ МО: 503), злитий з аміно-кінцем будь-якої з поліпептидних послідовностей з Табл. Е, У, Кі ЇЇ. Кожен з наведених вище сигнальних пептидів кодується нуклетновою кислотою з послідовністю, що безпосередньо передує йому в Переліку послідовностей. Інші придатні послідовності сигнальних пептидів, які можуть бути злиті з аміно-кінцем поліпептидних послідовностей, описаних в цьому документі, включають: МЕАРАОГ РІГ СУМ РОТТО (5ЕБО ІЮ МО: 504), МЕМ/ТМУ/КМІ Р, МАААТОАН5Ь (ЗЕБЕО ІО МО: 505) їі МЕМ/5УУМЕГ ЕР ЗМТТОМН (5ЕБО ІО МО: 506). Інші сигнальні пептиди відомі фахівцям в цій галузі техніки і можуть бути злиті з будь-яким з поліпептидних ланцюгів, наведених у
Табл. Е, у, К і Ї, наприклад, для полегшення або оптимізації експресії в конкретних клітинах -хазяях.
Крім того, передбачені рекомбінантні клітини-хазяї, що містять такі вектори і експресують важкий і легкий ланцюги.
Клітини, які продукують антитіла, і клітини, які продукують біспецифічні антигензв'язуючі білки, містять, в залежності від формату біспецифічного антигензв'язуючого білка, нуклеїнові кислоти, що кодують важкий ланцюг, легкий ланцюг, конструкцію важкого ланцюга-5сЕм, конструкцію важкого ланцюга-варіабельного домену ділянки важкого ланцюга Раб і варіабельний домен легкого ланцюга
ЕаБ. Такі нуклеїнові кислоти можна застосовувати для одержання антитіл або біспецифічних антитіл за винаходом відповідно до методів, відомих в цій галузі техніки. Цей винахід в одному варіанті реалізації відноситься до способу одержання біспецифічного антигензв'язуючого білка або антитіла,
що включає культивування рекомбінантної клітини-хазяїна, яка експресує важкий і легкий ланцюги або інші конструкції, зазначені вище, і виділення біспецифічного антигензв'язуючого білка або антитіла, що продукується клітиною.
Рекомбінантна клітина-хазяїн може бути прокаріотичною клітиною, наприклад, клітиною Е. сої, або еукаріотичною клітиною, наприклад, клітиною ссавця або дріжджовою клітиною. Дріжджові клітини включають клітини Засспаготусевз сегемізіае, Зспігозасспаготусез ротрбе і Ріспіа равіогі5. Клітини ссавців включають клітини МЕКО, Неї а, яєчника китайського хом'яка (СНО), М/138, нирки дитинчати хом'яка (ВНК), СО5-7, МОСК, лінію 293 ембріональних клітин нирки людини, лінії нормальних клітин нирки собаки, лінії нормальних клітин нирки кішки, клітини нирки мавпи, клітини нирки африканської зеленої мавпи, клітини СО5 і нетуморигенні клітини мишачих міобластів (58, лінії клітин фібробластів, лінії клітин мієломи, мишачі клітини МІН/З3Т3, клітини ГМТКЗ1, клітини Сертолі миші, клітини цервікальної карциноми людини, клітини печінки щурів лінії буффало, клітини легені людини, клітини печінки людини, пухлинні клітини молочної залози миші, клітини ТК, клітини МКО 5 і клітини Е54. Крім того, клітини, які продукують антитіла, і клітини, які продукують біспецифічні антигензв'язуючі білки за винаходом, включають будь-яку відому клітинну лінію експресії комах, таку як, наприклад, клітини зЗродоріега Ітидірегда. У переважному варіанті реалізації винаходу клітини є клітинами ссавця. У найбільш переважному варіанті реалізації винаходу клітини ссавця є клітинами СНО.
Клітини, які продукують антитіла, переважно є по суті вільними від конкурентів ТТА і ТМЕ-с. В переважних варіантах реалізації винаходу клітини, які продукують антитіла, містять менш ніж близько 95, переважно менш ніж близько 5 95, більш переважно менш ніж близько 1 95, більш переважно менш ніж близько 0,5 95, більш переважно менш ніж близько 0,1 95 і найбільш переважно 0 95 мас. зв'язуючих конкурентів Т/ТА або ТМЕ-с.. В деяких варіантах реалізації винаходу продуковані антитіла і біспецифічні антитіла по суті є вільними від конкурентів Т/1А і ТМЕ-ох. В переважних варіантах реалізації винаходу продуковані антитіла і біспецифічні антитіла містять менш ніж близько 10 95, переважно менш ніж близько 5 95, більш переважно менш ніж близько 1 95, більш переважно менш ніж близько 0,5 95, більш переважно менш ніж близько 0,1 95 і найбільш переважно 0 95 мас. зв'язуючих конкурентів як ТІ ТА, так і ТМЕ-с.
Очищення
Способи очищення антитіл відомі в цій галузі техніки і можуть застосовуватися при одержанні антитіл і біспецифічних антитіл за цим винаходом. У деяких варіантах реалізації винаходу способи очищення антитіл включають фільтрацію, афінну колонкову хроматографію, катіонообмінну хроматографію, аніонообмінну хроматографію і концентрацію. Стадія фільтрації переважно включає ультрафільтрацію і більш переважно ультрафільтрацію і діафільтрацію. Фільтрацію переважно проводять щонайменше близько 5-50 разів, більш переважно, від 10 до 30 разів і найбільш переважно 14-27 разів. Афінну колонкову хроматографію можна здійснювати, наприклад, як афінну хроматографію РКО5ЕРО (Міїїроге, Біллеріка, штат Массачусетс). У переважному варіанті реалізації винаходу афінна хроматографія включає колонкову хроматографію РКО5БЕРФ-мМА. Елюат можна промити розчинником-детергентом. Катіонообмінна хроматографія може включати, наприклад, катіонообмінну хроматографію 5Р-Зерпагозе. Аніонообмінна хроматографія може включати, наприклад, але не обмежуючись цим, аніонний обмін із швидким потоком О-Зерпагозе. Стадія обміну аніона переважно є не зв'язуючою, що дозволяє видалити відходи, включаючи ДНК і БСА. Продукт у формі антитіла переважно піддають нанофільтрації, наприклад, із застосуванням нанофільтру Раїї ОМ 20. Продукт у формі антитіла може бути концентрований, наприклад, із застосуванням ультрафільтрації та діафільтрації. Спосіб може додатково включати стадію ексклюзійної хроматографії для видалення агрегатів. Інші параметри очищення наводяться в робочих прикладах нижче.
Біспецифічні антитіла, антитіла або антигензв'язуючі фрагменти додатково можуть бути одержані іншими способами, відомими в цій галузі техніки, наприклад, шляхом хімічного сполучення антитіл і фрагментів антитіл
Застосування моноспецифічних і біспецифічних антитіл за винаходом
Біспецифічні антитіла і моноспеціфічні антитіла за цим винаходом є придатними, наприклад, для інгібування прозапальних цитокінів, таких як Т/ТА ії ТМЕ-с. Біспецифічні антитіла і моноспецифічні антитіла за винаходом можна застосовувати для лікування запальних захворювань і аутоїмунних захворювань, таких як запальне захворювання кишечнику (З3ЗК), хвороба Крона (БК), виразковий коліт (ЯК), синдром подразненого кишечнику (СРК), синдром сечового міхура/нтерстиціальний цистит, дисфункція сечового міхура/кишечнику (игіпагу роме! аізтипсіоп), сепсис, увеїт, енцефаломієліт, міастенія гравіс, синдром Шегрена (СШ), склеродермія, множинний склероз (РС), цистофіброз (ЦФ), запалення при хронічному захворюванні нирок (ЗХН), псоріаз (Псо), псоріатичний артрит (ПСА), анкілозивний спондилоартрит (АС), ревматоїдний артрит (РА), ювенільний ревматоїдний артрит (ЮРА), остеоартрит (ОА), спондилоартропатія, первинний склерозуючий холангіт, первинний біліарний цироз, атеросклероз, спленомегалія, запалення при хронічному захворюванні нирок (ЗХН),
атопічний дерматит (АД), екзематозний дерматит, контактний дерматит, системний склероз, системний червоний вовчак (ВКВ), вовчаковий нефрит (ВН), шкірний червоний вовчак, аутоїмунний тиреоїдит, ІдА нефропатія, діабетична нефропатія, пов'язаний з антинейтрофільними цитоплазматичними антитілами (АНЦА) васкуліт (ААВ), ідіопатичний нефротичний синдром (ліпоїдний нефроз), фокальний сегментарний гломерулосклероз (ФСГС), нефрогенний системний фіброз (М5БЕ), нефрогенна фіброзуюча дерматопатія, фіброзуючий холестатичний гепатит, еозинофільний фасцит (синдром Шульмана), склеромікседема (папульозний муциноз), склеродермія, склероатрофічний лишай, запальне ураження легенів, таке як ідіопатичний легеневий фіброз, астма, хронічне обструктивне захворювання легенів (ХОЗЛ) гіперчутливість дихальних шляхів, хронічний бронхіт, алергічна астма, екзема, інфекція Неїїсобасієг руїогі, внутрішньочеревинні спайки і/або абсцеси в результаті перитонеального запалення (наприклад, внаслідок інфекції, травми і т.д.), нефротичний синдром, ідіопатична демієлінізуюча полінейропатія, синдром Гійєна-Барре, відторгнення трансплантата, відторгнення алотрансплантата органу, хвороба «трансплантат проти хазяїна» (БТПХ) (наприклад, з трансплантата, такого як кров, кістковий мозок, нирка, підшлункова залоза, печінка, ортотопічна печінка, легеня, серце, кишечник, тонкий кишечник, товстий кишечник, тимус, алогенна стовбурова клітина, алогенна зі зниженою інтенсивністю, кістка, сухожилля, рогівка, шкіра, клапани серця, вени, артерії, кровоносні судини, шлунок і яєчко), (ДА нефропатія, діабетична нефропатія, цукровий діабет, ідіопатичний нефротичний синдром (ліпоїдний нефроз), нефрогенний системний фіброз (НСФ), нефрогенна фіброзна дермопатія, фіброзний холестатичний гепатит, еозинофільний фасцит (синдром Шульмана), склеромікседема (папульозний муциноз), склеродермія, склероатрофічний лишай, хвороба Такацукі (або РЕР-синдром), нефротичний синдром, РОЕМ5- синдром, синдром Кроу-Фукаса, нефротичний синдром, антинейтрофільні цитоплазматичні антитіла, васкуліт, гігантоклітинний артеріїт і спричинене множинною мієломою літичне захворювання кісток, індукований клітинною стінкою стрептококів (КСС) артрит, гінгівіт/лародонтит, герпетичний стромальний кератит, глютензалежна ентеропатія, рестеноз, хвороба Кавасакі та імуно- опосередковані захворювання нирок. Крім того, біспецифічні антитіла і моноспецифічні антитіла, описані в цьому документі, можна застосовувати для лікування раку, включаючи ангіогенез.
В одному варіанті реалізації винахід відноситься до способів лікування одного або більшої кількості з вищезазначених захворювань і розладів у ссавця, який потребує такого лікування, шляхом введення терапевтично ефективної кількості моноспецифічного або біспецифічного антигензв'язуючого білка за цим винаходом. У переважному варіанті реалізації винаходу ссавець є людиною. В іншому переважному варіанті реалізації винаходу захворювання або розлад являє собою
ЗЗК, БК або ЯК.
Винахід додатково відноситься до застосування біспецифічних і моноспецифічних антитіл за цим винаходом для лікування запальних захворювань, що характеризуються наявністю підвищених рівнів
ТІЛА або/в разі біспецифічних антитіл) ТМЕ-х, а також для лікування видів раку, що характеризуються наявністю підвищених рівнів ТІ ТА і/або ТМЕ-с.
Відповідно, в одному варіанті реалізації винахід відноситься до способу інгібування одного або більшої кількості прозапальних цитокінів, наприклад, ТІЛА і ТМЕ-ос, у ссавця, що потребує такого лікування, причому спосіб включає введення терапевтично ефективної кількості біспецифічного або моноспецифічного антитіла за винаходом ссавцю, який потребує такого лікування. В переважному варіанті реалізації винаходу ссавець є людиною. Спосіб можна застосовувати для лікування розладу, що характеризується підвищеною експресією або активністю ТІ1А або ТМЕ-х. Моноспецифічний або біспецифічний антигензв'язуючий білок можна вводити з іншим фармацевтичним агентом, в одному препараті або окремо.
В іншому варіанті реалізації цей винахід відноситься до композиції, що містить моноспецифічний або біспецифічний антигензв'язуючий білок, як описано в цьому документі, і фармацевтично прийнятний носій. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло, наприклад, біспецифічний антигензв'язуючий білок, за винаходом, може бути складена відповідно до відомих способів одержання фармацевтично придатних композицій, в яких терапевтичні антитіла об'єднують в суміші з фармацевтично прийнятним носієм. Кажуть, що композиція містить «фармацевтично прийнятний носій», якщо її введення може переноситися пацієнтом-реципієнтом. Стерильний, буферизований фосфатом фізіологічний розчин є одним із прикладів фармацевтично прийнятного носія. Інші придатні носії добре відомі фахівцям в цій галузі техніки. Див., наприклад, Сейтап), ейд., Кетіпдіоп'в
Рпаптасешісаї! бсіепсевз, 191й Еайіоп, Маск Рибіїзніпа Сотрапу (1995).
Для фармацевтичного застосування антитіло, наприклад, біспецифічний антигензв'язуючий білок за цим винаходом, складають для парентерального, зокрема внутрішньовенного або підшкірного введення, відповідно до звичайних способів. Внутрішньовенне введення може здійснюватися шляхом ін'єкції болюсу, контрольованого вивільнення, наприклад, із застосуванням міні-насосів або іншої придатної технології або шляхом інфузії, зазвичай протягом періоду від одного до декількох годин.
Загалом, фармацевтичні препарати будуть містити антитіло, наприклад, біспецифічний антигензв'язуючий білок, за винаходом, в поєднанні з фФфармацевтично прийнятним носієм, таким як фізіологічний розчин, буферизований фізіологічний розчин, 5 95 розчин декстрози у воді і т.п.
Препарати можуть додатково містити один або більшу кількість допоміжних речовин, консервантів, солюбілізаторів, буферних агентів, альбумін для запобігання втрати білка на поверхнях бульбашок і т.д. При застосуванні такої комбінованої терапії антитіла, які включають біспецифічні антитіла, можуть бути об'єднані в одному препараті або можуть бути введені у вигляді окремих препаратів. Способи складання добре відомі в цій галузі техніки і розкриті, наприклад, у Сеппаго, єд., Кетіпдіоп'5
РІНагтасеціїйса! 5сіепсе5, Маск Рибіїзпіпд Со., Еазіоп Ра. (1990), який включений до цього документу шляхом посилання. Терапевтичні дози зазвичай знаходяться в діапазоні від 0,1 до 100 мг/кг маси тіла пацієнта на добу, переважно 0,5-20 мг/кг на добу, причому точну дозу визначає клініцист відповідно до прийнятих стандартів, з урахуванням природи і ступеня тяжкості стану, що підлягає лікуванню, показників пацієнта і т.д. Визначення дози знаходиться в межах компетенції звичайного фахівця в цій галузі техніки. Найчастіше антитіла будуть вводитися протягом одного тижня або менше, часто протягом одного-трьох днів. Як правило, дози антитіл для введення будуть варіюватися в залежності від таких факторів, як вік, маса тіла, зріст, стать, загальний стан здоров'я і анамнез пацієнта. Як правило, бажано вводити реципієнту дозу антитіл, яка знаходиться в діапазоні від близько 1 пг/кг до мг/кг (кількість агента/масу тіла пацієнта), хоча більш низька або більш висока доза також може вводитися, якщо це диктується обставинами.
Введення антитіла, наприклад, біспецифічного антигензв'язуючого білка за винаходом, суб'єкту може здійснюватися внутрішньовенною, внутрішньоартеріальною, внутрішньочеревинною, внутрішньом'язовою, підшкірною, внутрішньоплевральною, інтратекальною ін'єкцією, шляхом перфузії через регіонарний катетер або шляхом прямої внутрішньовогнищевої ін'єкції. При введенні терапевтичних антитіл шляхом ін'єкції введення може здійснюватися шляхом безперервної інфузії або у вигляді одного або більшої кількості болюсів.
Додаткові способи введення включають пероральний, крізь слизову оболонку, легеневий і трансдермальний. Пероральне введення підходить для мікросфер з поліестеру, мікросфер із зеїну, протеноїдних мікросфер, поліціанакрилатних мікросфер і систем на базі ліпідів (див., наприклад, ріВвазе еї аї., «Ога! Оеїїмегу ої Місгоепсарзшціагейд Ргоївіп5», іп Запаегїз еї аї., едв., Ргоївіп Оеїїмегу:
РНузіса! Зузівтв, рр. 255-288, Ріепит Ргезз (1997)). Прикладом можливості інтраназального введення є такий спосіб введення інсуліну (див., наприклад, Ніпспсійе еї аїЇ., Аду. Огид Оеїїм. Кем., 35: 199 (1999)). Сухі або рідкі частинки, що містять антитіла за винаходом, можуть бути одержані і введені інгаляцією за допомогою диспергаторів сухого порошку, генераторів рідких аерозолів або небулайзера (наприклад, Реції еї аІ., ТІВТЕСН, 16: 343 (1998); Рацоп еї а!., Аду. Огид Оеїїм. Кем., 35: 235 (1999)).
Цей підхід ілюструється системою управління діабетом АЕКХФ, що являє собою ручний електронний інгалятор, який доставляє аерозольний інсулін в легені. Дослідження показали, що білки розміром до 48 000 кДа вводилися через шкіру в терапевтичних концентраціях за допомогою низькочастотного ультразвуку, що ілюструє можливість трансдермального введення (Міїгадоїгі еї аї., 5сіепсе, 269:850 (1995)). Трансдермальне введення за допомогою електропорації забезпечує інший засіб для введення молекули, що володіє активністю зв'язування з 1-17 ії ТМЕ-о/р19 (Роз еї а!., Рнатт. Віотесппо!., 10:213 (1997)).
З метою терапії композиції, що містять антитіло, наприклад, біспецифічний антигензв'язуючий білок, за винаходом і фармацевтично прийнятний носій, вводять пацієнту в терапевтично ефективній кількості. Кажуть, що комбінація антитіла, наприклад, біспецифічного антигензв'язуючого білка, за цим винаходом і фармацевтичні прийнятного носія, вводиться у «терапевтично ефективній кількості», якщо кількість для введення є фізіологічно значущою. Агент є фізіологічно значущим, якщо його присутність приводить до детектованої зміни фізіології пацієнта-реципієнта. Наприклад, агент, який застосовується для лікування запалення, є фізіологічно значущим, якщо його присутність пом'якшує запальну відповідь. Ефективне лікування можна оцінювати різними способами. В одному варіанті реалізації винаходу ефективне лікування визначається за зменшенням запалення. В інших варіантах реалізації винаходу ефективне лікування відзначається інгібуванням запалення. У ще інших варіантах реалізації винаходу ефективна терапія вимірюється збільшенням добробуту пацієнта, включаючи такі ознаки, як збільшення маси тіла, відновлення сили, зменшення болю, прогресуюче покращення і суб'єктивні показники у пацієнта з кращим станом здоров'я.
Фармацевтична композиція, яка містить антитіло, наприклад, біспецифічний антигензв'язуючий білок, за винаходом, може бути представлена у рідкій формі, у формі аерозолю або у твердій формі.
Типовими прикладами рідких форм є ін'єкційні розчини та суспензії для перорального застосування.
Типові тверді форми включають капсули, таблетки і форми з контрольованим вивільненням. Типовим прикладом останньої форми є мініосмотичні насоси та імпланти (Вгетег еї аїЇ., Рнпагт. Віоїесппої., 10:239 (1997); Кападе, «Ітріапів іп Огид Оеїїмегу», в Кападе еї аї., еаз., Огид Оеїїмегу Зузіетв, рр. 95- 123, СКС Ргезз (1995); Вгетег еї аї!., «Ргоївіп Оеїїмегу м/йй Іпїивіоп Ритрб5», в Запаегз5 еї аї., едв.,
Ргоївіп Оевїїмегу: РНпузіса! 5узіетв, рр. 239-254, Ріепит Ргезз (1997); Уеугеу еї аї., «Оеєїїмегу ої Ргоївіп5 їгот а СопігоїІей Кеїеазе Іпіесїаріє Ітріапі», в Запаегз: еї аї., еавз., Ргоївіп Оеєїїмегу: Рпузіса! Зувіетв, рр. 93-117, Ріепит Ргезз (1997)).
Ліпосоми забезпечують один із засобів для введення терапевтичних поліпептидів суб'єкту внутрішньовенно, внутрішньоочеревинно, інтратекально, внутрішньом'язово, підшкірно або за допомогою перорального введення, інгаляції або інтраназального введення. Ліпосоми являють собою мікроскопічні везикули, що складаються з одного або більшої кількості ліпідних бішарів, що оточують водні відсіки (загалом див. ВаККег-У/опдепрбега еї а!., Єшг. У. Сіїп. Містобіо!. Іптесі. рів., 12 (5иррі. 1): 561 (1993), Кіт, Огидв, 46: 618 (1993), і Кападе, «Зйе-Зресіїс Огид Оеїїмегу Овіпда Прозотез аз Сагіегв», у
Вападе еї аї!., еаз., Огшд Оеїїмегу бузієтв, рр. 3-24, СКС Ргезз (1995)). Ліпосоми подібні за складом з клітинними мембранами, в результаті чого ліпосоми можуть безпечно вводитися і кшсє біорозкладуваними. В залежності від способу одержання ліпосоми можуть бути одношаровими або багатошаровими, а розмір ліпосоми може варіюватися в діапазоні від діаметру 0,02 до понад 10 мкм.
До ліпосом можуть бути вміщені різні агенти: розподіл гідрофобних агентів в бішарах і розподіл гідрофільних агентів у внутрішньому(-их) водному(-их) просторі(-ах) (див., наприклад, Масну еї аї.,
Прозотевз іп СеїІ Віоїоду апа Ріпапгтасоїоду, Щдопп І іБббеу (1987), і Овіго еї аІ., Атегісап -). Нозр. РІагт., 46: 1576 (1989)). Більш того, можна контролювати терапевтичну доступність інкапсульованого агента шляхом варіювання розміру ліпосом, кількості бішарів, складу ліпідів, а також характеристик заряду і поверхні ліпосом.
Ліпосоми можуть поглинатися практично будь-яким типом клітин і потім повільно вивільняти інкапсульований агент. Як альтернатива, поглинена ліпосома може бути піддана ендоцитозу в клітинах, що являють собою фагоцити. Ендоцитоз супроводжується внутрішньолізосомною деградацією ліпосомальних ліпідів і вивільненням інкапсульованих агентів (ЗсПпегрпої еї аї., Апп. М.У.
Асад. 5сі., 446: 368 (1985)). Після внутрішньовенного введення ліпосоми невеликого розміру (від 0,1 до 1,0 мкм) зазвичай захоплюються клітинами ретикулоендотеліальної системи, розташованими головним чином в печінці і селезінці, тоді як ліпосоми розміром більш ніж 3,0 мкм осідають в легені.
Таке переважне захоплення невеликих ліпосом клітинами ретикулоендотеліальної системи застосовувалося для доставки хіміотерапевтичних агентів у макрофаги і пухлини печінки.
Ретикулоендотеліальну систему можна обійти декількома способами, включаючи насичення великими дозами ліпосомних частинок або вибіркову інактивацію макрофагів фармакологічними засобами (Сіаахзеп еї аї., Віоспіт. Віорпуз. Асіа, 802: 428 (1984)). Крім того, було показано, що включення дериватизованих гліколіпідами або поліетиленгліколем фосфоліпідів у ліпосомні мембрани приводить до значного зменшення поглинання ретикулоендотеліальною системою (АїЙеп еї аї)Ї.,
Віоспіт. Віорпуз. Асіа, 1068: 133 (1991); АПеп еї а!., Віоспіт. Віорпуз. Асіа, 1150: 9 (1993)).
Ліпосоми додатково можуть бути складені для спрямованої дії на певні клітини або органи шляхом варіювання складу фосфоліпідів або шляхом введення в ліпосоми рецепторів або лігандів.
Наприклад, ліпосоми, складені з високим вмістом неіоногенної поверхнево-активної речовини, застосовували для спрямованої дії на печінку (НауаКаума еї а!., дарапезе Раїепі Мо. 04-244,018; Каю еї а!., Віої. Рпагт. Виїї., 16: 960 (1993)). Зазначені препарати складали шляхом змішування соєвого фосфатидилхоліну, альфа-токоферолу і етоксильованої гідрогенізованої рицинової олії (НСО-60) в метанолі, концентрування суміші під вакуумом і подальшого розведення суміші водою. Крім того, було показано, що ліпосомальний препарат дипальмітоїлфосфатидилхоліну (ДПФХ) із сумішшю одержаних з сої стерилглюкозидів (СГ) і холестерину (Х) спрямовано діє на печінку (ЗПіті?и еї аї., ВіоїЇ. Рпагт.
Виї., 20:881 (1997)).
Як альтернатива, з поверхнею ліпосоми можуть бути зв'язані різні спрямовано діючі ліганди, такі як антитіла, фрагменти антитіл, вуглеводи, вітаміни і транспортні білки. Наприклад, ліпосоми можуть бути модифіковані похідними галактозилліпідів розгалуженого типу для спрямованої дії на рецептори асіалоглікопротеїну (галактози), які експресуються виключно на поверхні клітин печінки (Каїо еї аї.,
Ст. Веу. Тег. Огид Сатіег 5увзі., 14: 287 (1997); Миганавні еї аї., Віої. Рнагпт. Виї!., 20: 259 (1997)).
Подібним чином, Уми еї аї!., Нерайшіоду, 27: 772 (1998), продемонстрували, що введення в ліпосоми асіалофетуїнової мітки приводило до зменшення періоду напіввиведення ліпосом з плазми і значного підсилення захоплення мічених асіалофетуїном ліпосом гепатоцитами. З іншого боку, накопичення в печінці ліпосом, що містять похідні галактозилліпідів розгалуженого типу, може |інгібуватися попередньою ін'єкцією асіалофетуїну (Мигапазні еї аї., ВіоЇ. Рпагт. ВиїЇ., 20:259 (1997)). Ліпосоми поліаконітильованого сироваткового альбуміну людини пропонують інший підхід до спрямованої дії ліпосом на клітини печінки (Катрзх еї а!., Ргос. Маг! Асад. 5сі. ОА, 94:11681 (1997)). Більшу того, сепо еї аіІ. в патенті США Мо 4603044 описують спрямовано діючу на гепатоцити систему доставки ліпосомних везикул, яка володіє специфічністю відносно гепатобіліарних рецепторів, зв'язаних зі спеціалізованими метаболічними клітинами печінки.
У більш загальному підході до спрямованої дії на тканини, клітини-мішені попередньо маркують біотинільованими антитілами, специфічними по відношенню до ліганда, що експресується клітиною- мішенню (Нагазут еї аї., Адм. Огид Оеїїм. Кем., 32: 99 (1998)). Після видалення з плазми незв'язаного антитіла вводять кон'юговані зі стрептавідином ліпосоми. В іншому підході спрямовано діючі антитіла безпосередньо приєднували до ліпосом (Нагазут еї а!ї., ду. Огид Оєїїм. Кем., 32: 99 (1998)).
Антитіла можуть бути інкапсульовані в ліпосоми із застосуванням стандартних методів мікрокапсулювання білка (див., наприклад, Апаег!зоп еї аї., Іптесії. Іттип., 31:1099 (1981), Апаегзоп єї а!., Сапсег Кев., 50:1853 (1990), і Сопеп еї аї., Віоспіт. Віорпуз. Асіа, 1063:95 (1991), АМіпд еї аї. «Ргерагайоп апа Ове ої І ірозотез іп Іттипоїіодіса! 5(цдіез», в Ссгедогіаді5, ед., Пірозоте Тесппоїіоду, 2па Еайоп, Мої. Ш, р. 317, СКС Ргезв (1993), УМаззеї еї аІ., Ме. Епгутої., 149:124 (1987)). Як зазначено вище, терапевтично придатні ліпосоми можуть містити численні компоненти. Наприклад, ліпосоми можуть містити ліпідні похідні полі(етиленгліколю) (АйПеп еї аї., Віоспіт. Віорпув. Асіа, 1150:9 (1993)).
Розкладувані полімерні мікросфери були розроблені для підтримання високих системних рівнів терапевтичних білків. Мікросфери одержують з розкладуваних полімерів, таких як полі(лактид-ко- гліколід) (ПЛГ), поліангідриди, полі(ортоетери), небіорозкладувані етилвінілацетатні полімери, в яких білки захоплені полімером (сСотрої? еї а!., Віосопіддаєе Спет., 6:332 (1995); Кападе, «Коїе ої Роїутеї5 іп Огид Оеїїмегу», в Кападе еї аї., еаз., Огид Оеїїмегу Зузіетв, рр. 51-93, САС Ргезз (1995); Во5Коз еї аІ., «Оедгадаріє Сопігоїей КеЇвеазе Зузіетв5 Озеїиці Гог Ргоївіп Оеїїмегу», в Ззапаегз еї аї., едв., Ргоїеіп
Оеїїмегу: Рпузіса! бузіет5, рр. 45-92, Ріепит Ргез5 (1997); Вапивз еї аї., 5сіепсе, 281: 1161 (1998);
Риїпеу еї аї., Маїиге ВіоїесппоЇІоду, 16: 153 (1998); Риїпеу, Сит. Оріп. Спет. Віо!., 2: 548 (1998)). Крім того, вкриті поліетиленгліколем (ПЕГ) наносфери можуть забезпечувати носій для внутрішньовенного введення терапевтичних білків (див., наприклад, Сгеї еї аі!., Рпагт. Віоїесппої., 10:167 (1996)).
При необхідності, композиція може додатково містити більш ніж одну активну сполуку для конкретного показання, що підлягає лікуванню, переважно з додатковими видами активності, які не здійснюють несприятливого впливу один на одного. Як альтернатива або додатково, композиція може містити агент, який підсилює її функцію, наприклад, цитотоксичний агент, цитокін, хіміотерапевтичний агент або інгібітор росту. Такі молекули придатним чином присутні в комбінації у кількостях, ефективних для досягнення передбаченої мети.
В одному варіанті реалізації винаходу антитіло, наприклад, біспецифічний антигензв'язуючий білок, за винаходом вводять у складі комбінованої терапії, тобто, в поєднанні з іншими агентами, наприклад, терапевтичними агентами, що є придатними для лікування патологічних станів або розладів, таких як аутоїмунні розлади і запальні захворювання. Термін «в комбінації» в цьому контексті означає, що агенти вводять по суті одночасно, паралельно або послідовно. При послідовному введенні, на момент початку введення другої сполуки першу з двох сполук переважно все ще можна знайти в ефективних концентраціях в місці лікування.
Наприклад, комбінована терапія може включати одне або більшу кількість антитіл, наприклад, біспецифічних антитіл, за винаходом, складених спільно і/або введених спільно з одним або більшою кількістю додаткових терапевтичних агентів, наприклад, одним або більшою кількістю інгібіторів цитокінів ії факторів росту, імуносупресантів, протизапальних агентів, інгібіторів метаболізму, інгібіторів ферментів і/або цитотоксичних або цитостатичних агентів, як описано більш детально нижче. Крім того, одне або більшу кількість антитіл, наприклад, біспецифічних антитіл, описаних в цьому документі, можна застосовувати в комбінації з двома або більшою кількістю терапевтичних агентів, описаних в цьому документі. В таких комбінованих схемах терапії переважно можна застосовувати більш низькі дози терапевтичних агентів для введення, таким чином уникаючи можливої токсичності або ускладнень, пов'язаних з різними видами монотерапії.
Переважними терапевтичними агентами для застосування в комбінації з антитілом, наприклад, біспецифічним антигензв'язуючим білком, за винаходом є такі агенти, які перешкоджають запальній відповіді на різних її стадіях. В одному варіанті реалізації винаходу одне або більшу кількість антитіл, наприклад, біспецифічних антитіл, описаних в цьому документі, можна складати разом і/або вводити спільно з одним або більшою кількістю додаткових агентів, таких як інші антагоністи цитокінів або факторів росту (наприклад, розчинні рецептори, пептидні інгібітори, молекули невеликого розміру, злиття лігандів); або антитіла або їх антигензв'язуючі фрагменти, які зв'язуються з іншими мішенями (наприклад, антитіла, які зв'язуються з іншими цитокінами або факторами росту, їх рецепторами або іншими молекулами клітинної поверхні); і протизапальні цитокіни або їх агоністи. Необмежуючі приклади агентів, які можна застосовувати в комбінації з антитілами, описаними в цьому документі, включають, але не обмежуючись цим, антагоністи одного або більшої кількості інтерлейкінів (І) або їх рецепторів, наприклад, антагоністи 1-1, Ії -2, ІС- 6, 1-7, 1-8, 11-12, 11-13, 11-15, 11-16, І 17 А-Е, ІІ -18, ІІ - 20, 1-21, 1-22, 1-25 і 1-31; антагоністи цитокінів або факторів росту або їх рецепторів, такі як І Т,
ЕМАРА-Ї, СМ-С5Е, ЕСЕ і РОСБЕ. Крім того, антитіла за винаходом можуть бути об'єднані з інгібіторами, наприклад, антагоністичними антитілами, молекул клітинної поверхні, таких як СО2, СОЗ, 204, СО8,
СО020 (наприклад, інгібітор СО20О ритуксимаб (КІТОХАМФ)), 2025, 2028, С030, 2040, С0р45, СОб69, сорво (87.1), 086 (87.2), СО90О або їх ліганди, включаючи СО154 (др39 або СО40І) або І ЕА-1/САМ-1 і М А-А/УСАМ-1 (мМизйц!-МакКадіапзаг еї а!., Мед. Рез. Веум., 22:146-167 (2002)). Перевага антагоністи, які можна застосовувати в комбінації з одним або більшою кількістю антитіл, наприклад, біспецифічних антитіл, описаних в цьому документі, включають антагоністи ІІ -1, 11 -6, 1-12, ТМЕ-о, 11-15, 11-18, І -20,
ІС-22 11-31.
Приклади таких агентів включають антагоністи ІІ-12, такі як химерні, гуманізовані, людські або одержані іп мйго антитіла (або їх антигензв'язуючі фрагменти), які зв'язуються з ІІ -12 (переважно 1-12 людини), наприклад, антитіло, розкрите у УМО 00/56772, інгібітори рецептора 1-12, наприклад, антитіла до рецептора ІЇ-12 людини; і до розчинних фрагментів рецептора 1-12, наприклад, рецептора 1-12 людини. Приклади антагоністів І/-15 включають антитіла (або їх антигензв'язуючі фрагменти) проти 1-15 або його рецептора, наприклад, химерні, гуманізовані, людські або одержані іп міго антитіла до ІЇ-15 людини або його рецептора, розчинних фрагментів рецептора ІЇІ--15 і білки, що зв'язуються з ІІ -15. Приклади антагоністів ІЇ/-17 включають бродалумаб, секукінумаб та іксекізумаб.
Приклади антагоністів Ї/-183 включають антитіла, наприклад, химерні, гуманізовані, людські або одержані іп мйго антитіла (або їх антигензв'язуючі фрагменти), до І--18 людини, розчинних фрагментів рецептора 1-18 і білків, що зв'язуються з ІІ/-18 (І/-18В8Р). Приклади антагоністів /-1 включають інгібітори інтерлейкін-1 перетворюючого ферменту (ІПФ), такі як Ух 740, антагоністи 1-1, наприклад, ПІ -- 1 КА (анакінра, Кіпегеф)), 5111 КІ! ії антитіла проти рецептора ІЇ--1 (або їх антигензв'язуючі фрагменти).
В інших варіантах реалізації винаходу одне або більшу кількість антитіл, наприклад, біспецифічних антитіл, описаних в цьому документі, можна вводити в комбінації з одним або більшою кількістю з наступного: антагоністи ІІ -13, наприклад, розчинні рецептори ІІ -13 (51І -13) і/або антитіла проти ІІ -13; антагоністи І/-2, наприклад, ОАВ 486-ІЇ-2 і/або ЮАВ 389-ІІ-2 (гібридні білки І/-2, Зегадеп) і/або антитіла до І/-2К, наприклад, анти-Тас (гуманізоване анти-іІЇ!-2К, Ргоївіп ЮОезідп Гаре5). Ще одна комбінація включає одне або більшу кількість антитіл, наприклад, біспецифічних антитіл, за винаходом, антагоністичні молекули невеликого розміру і/або інгібуючі антитіла в комбінації з невиснажуючими інгібіторами анти-СО04 (0ЕС-СЕ9.1/58 210396; невиснажуюче приматоване антитіло проти СО4, ІОЕС/5ЗтіїйКіїпе). Інші переважні комбінації включають антагоністи костимуляторного шляху СО80 (87.1) або СО86 (87.2), включаючи антитіла, розчинні рецептори або антагоністичні ліганди; а також глікопротеїновий ліганд р-селектину (РОЇ), протизапальні цитокіни, наприклад, 1-4 (ОМАХ/5енНегіпо); 1-10 (СН 52000, рекомбінантний 1-10 ОМАХ/5епНегіпо); 1-13 ії ТОЕ-бета, а також їх агоністи (наприклад, агоністичні антитіла).
В інших варіантах реалізації винаходу одне або більшу кількість антитіл, наприклад, біспецифічних антитіл, за винаходом, можна складати разом і/або вводити спільно з одним або більшою кількістю протизапальних лікарських засобів, імуносупресантів або інгібіторів метаболізму або ферментів.
Необмежуючі приклади лікарських засобів або інгібіторів, які можна застосовувати в поєднанні з антитілами, описаними в цьому документі, включають, але не обмежуючись цим, один або більшу кількість із: нестероїдних протизапальних препаратів (НПЗП), наприклад, ібупрофен, тенідап, напроксен, мелоксикам, піроксикам, диклофенак та індометацин; сульфасалазину; кортикостероїдів, таких як преднізолон; протизапальних препаратів, що пригнічують цитокіни (ПЗППЦ); інгібіторів біосинтезу нуклеотидів, наприклад, інгібіторів біосинтезу пурину, антагоністів фолату (наприклад, метотрексат (М- Ц|4-((2,4-діаміно-б-птеридиніл)метил|метиламіно|бензоїл|глютамінова кислота); та інгібітори біосинтезу піримідину, наприклад, інгібітори дигідрооротатдегідрогенази (ДГОДГ). Переважні терапевтичні агенти для застосування в комбінації з одним або більшою кількістю антитіл, наприклад, біспецифічних антитіл, за винаходом, включають інгібітори НПЗП, ПЗППЦ, інгібітори (ДГОДГ) (наприклад, лефлуномід) і антагоністи фолату (наприклад, метотрексат).
Приклади додаткових інгібіторів включають один або більшу кількість із: кортикостероїдів (пероральних, інгаляційних і для місцевої ін'єкції), імуносупресантів, наприклад, циклоспорин, такролімус (ЕК-506); та інгібіторів ТТОК, наприклад, сиролімус (рапаміцин - КАРАМОМЕФ або похідні рапаміцину, наприклад, розчинні похідні рапаміцину (наприклад, естерні похідні рапаміцину, наприклад, ССІ-779)); агентів, які перешкоджають передачі сигналів прозапальних цитокінів, таких як
І/-1 (наприклад, ІКАК, МІК, ІКК, р38 або інгібитори кінази МАР); інгібіторів ЦОГ-2, наприклад, целекоксиб, рофекоксиб та їх варіанти; інгібіторів фосфодіестерази, наприклад, К9У73401 (інгібітор фосфодіестерази типу ІМ); інгібіторів фосфоліпази, наприклад, інгібітори цитозольної фосфоліпази 2 (СРІА2) (наприклад, аналоги трифлуорометилкетону); інгібіторів фактора росту судинних ендотеліальних клітин або рецептора фактора росту, наприклад, інгібітор МЕСЕ і/або інгібітор МЕСЕ-
Е; та інгібіторів ангіогенезу. Переважними терапевтичними агентами для застосування в комбінації з антитілами за винаходом є імуносупресанти, наприклад, циклоспорин, такролімус (ЕК-506); інгібітори
ТОК, наприклад, сиролімус (рапаміцин) або похідні рапаміцину, наприклад, розчинні похідні рапаміцину (наприклад, естерні похідні рапаміцину, наприклад, ССІ-779); інгібітори ЦОГ-2, наприклад, целекоксиб, і їх варіанти; та інгібітори фосфоліпази, наприклад, інгібітори цитозольної фосфоліпази 2 (СР А2), наприклад, аналоги трифрлуорометилкетону.
Додаткові приклади терапевтичних агентів, які можна поєднувати з антитілом, наприклад, біспецифічних антигензв'язуючих білків, за винаходом, включають один або більшу кількість із: 6б- меркаптопурину (6-МП); азатіоприну; сульфасалазину; месалазину; олсалазину; хлорохіну/гідроксихлорохіну (РГАОШЕМІСФ); пеніциламіну; ауротіорналату (внутрішньом'язовий і пероральний); азатіоприну; колхіцину; агоністів бета-2 адренорецепторів (сальбутамол, тербуталін, салметераль); ксантинів (теофілін, амінофілін); кромоглікату; недокромілу; кетотіфену; іпратропію і окситропію; мікофенолят мофетилу; агоністів аденозину; антитромботичних агентів; інгібіторів комплементу; та адренергічних агентів.
Анти-ТІ ТА-антитіла за винаходом можна поєднувати з антагоністами ТМЕ-о для лікування тих же станів, які вказані в цьому документі для анти-ТІ1А/анти-ТМЕ-о біспецифічних антигензв'язуючих білків. Такі антагоністи ТМЕ-х включають, наприклад, етанерсепт, адалімумаб, інфліксімаб, голімумаб і сертолізумаб пегол.
Необмежуючі приклади агентів для лікування або попередження артритних розладів (наприклад, ревматоїдний артрит, запальний артрит, ревматоїдний артрит, ювенільний ревматоїдний артрит, остеоартрит і псоріатичний артрит), з якими можна поєднувати антитіло, наприклад, біспецифічний антигензв'язуючий білок, за винаходом, включають один або більшу кількість з наступного: антагоністи
І--12, як описано в цьому документі; НПЗП; ПЗППЦ; невиснажуючі анти-СО4-антитіла, як описано в цьому документі; антагоністи ІІ -2, як описано в цьому документі; протизапальні цитокіни, наприклад,
ІС -4, 11-10, 11-13 ії ТОв-о, або їх агоністи; антагоністи ІЇ/-1 або рецептора 1-1, як описано в цьому документі; інгібітори фосфодіестерази, як описано в цьому документі; інгібітори ЦОГ-2, як описано в цьому документі; ілопрост: метотрексат; талідомід і споріднені талідоміду лікарські засоби (наприклад,
СеїІдеп); лефлуномід; інгібітор активації плазміногену, наприклад, транексамову кислоту; інгібітор цитокіну, наприклад, Т-614; простагландин Еї1; азатіоприн; інгібітор інтерлейкін-1-перетворюючого ферменту (ІПФ); інгібітор 7ар-70 і/або 1 сК (інгібітор тирозинкінази 72ар-70 або 1 скК); інгібітор фактора росту судинних ендотеліальних клітин або рецептора фактора росту судинних ендотеліальних клітин, як описано в цьому документі; інгібітор ангіогенезу, як описано в цьому документі; кортикостероїдні протизапальні лікарські засоби (наприклад, 58203580); інгібітори ТМЕ-о-конвертази; 1-1; 1-13; інгібітори 1-17; золото; пеніциламін; хлорохін; гідроксихлорохін; хлорамбуцил; циклофосфамід; циклоспорин; тотальне опромінення лімфоїдної тканини; антитимоцитарний глобулін; СО5-токсини; пептиди і колаген для перорального введення; динатрій лобензарит; регулятори цитокінів (РЦ) НР228 і НРА66 (Ноцдніеп РНагтасеціїса!5, Іпс.); антисмислові фосфоротісатні олігодезоксинуклеотиди ІСАМ- 1 (1515 2302; Івіз Рпагтасеціїдса!5, Іпс.); розчинний рецептор 1 комплементу (ТР 10; Т СеїЇ бсіепсев,
Іпс.); преднізон; орготелін; глікозаміноглікан полісульфат; міноциклін "(МІМОСІМФ); антитіла проти
ІК; морські і ботанічні ліпіди (жирні кислоти риб і насіння рослин); ауранофін; фенілбутазон; меклофенамова кислота; флуфенамова кислота; внутрішньовенний імунний глобулін; зілейтон; мікофенолова кислота (К5-61443); такролімус (ЕК-506); сиролімус (рапаміцин); аміприлоза (терафектин); кладрибін (2-хлородезоксиаденозин); і азарибін. Переважні комбінації включають одне або більшу кількість антитіл, наприклад, біспецифічних антитіл, за винаходом, в поєднанні з метотрексатом або лефлуномідом, а також, у випадках помірного або тяжкого ревматоїдного артриту, із циклоспорином.
Переважні приклади інгібіторів для застосування в комбінації з одним або більшою кількістю антигензв'язуючих білків, наприклад, біспецифічних антигензв'язуючих білків, за винаходом для лікування артритних розладів, включають антагоністи 1-12, 11-15, 1-18, ІІ -22; виснажуючі Т-клітини і
В-клітини агенти (наприклад, антитіла проти СО4 або СО22); низькомолекулярні інгібітори, наприклад, метотрексат і лефлуномід; сиролімус (рапаміцин) і його аналоги, наприклад, ССІ-779; інгібітори ЦОГ-2 і СР А2; НПЗП; інгібітори р38, інгібітори ТРІ-2, МК-2 і МЕГ В; КАСЕ або розчинний КАСЕ; інгібітори Р- селектину або РБОЇ -1 (наприклад, низькомолекулярні інгібітори, антитіла до РОЇ -1, антитіла до Р- селектину); агоністи естрогенового рецептора бета (ЕРБ) або антагоністи ЕРБ-МЕГВ. Найбільш переважні додаткові терапевтичні агенти, які можна вводити спільно і/або складати разом з одним або більшою кількістю антитіл, наприклад, біспецифічних антитіл, за винаходом, являють собою один або більше з: метотрексату, лефлуноміду або сиролімусу (рапаміцин) або його аналога, наприклад, ССІ- 71789.
Необмежуючі приклади агентів для лікування або попередження запального захворювання або розладу (наприклад, ЗЗК, БК, ЯК, СРК), з якими можна поєднувати антитіло, наприклад, біспецифічний антигензв'язуючий білок, за винаходом, включають наступні: будесонід; епідермальний фактор росту; кортикостероїди; циклоспорин; сульфасалазин; аміносаліцилати; б-меркаптопурин; азатіоприн; метронідазол; інгібітори ліпоксигенази; мезаламін; олсалазин; балсалазид; антиоксиданти; інгібітори тромбоксану; антагоністи рецептора 1-1; моноклональні антитіла проти 1-1; моноклональні антитіла проти 1-6 (наприклад, антитіла проти рецептора ІІ -6 і антитіла проти 1І-6); фактори росту; інгібітори еластази; піридиніл-імідазольні сполуки; цитокіни 1-4, І/-10, І/-13 і/або ТОБЕ-бета або їх агоністи (наприклад, агоністичні антитіла); ІЇ/-11; глюкуронід- або декстран-кон'юговані проліки преднізолону, дексаметазону або будесоніду; антисмислового фосфоротіоатні олігодезоксинуклеотиди ІСАМ-1 (І5І5 2302; Ібзів РПагтасеціїсаІє, Іпс.); розчинний рецептор 1 комплементу (ТР10; Т СеїЇ Зсіепсе5, Іпс.); мезалазин сповільненого вивільнення; метотрексат; антагоністи фактора активації тромбоцитів (ФАТ); ципрофлоксацин; і лігнокаїн.
Необмежуючі приклади агентів для лікування або попередження множинного склерозу, які можна поєднувати з одним або більшою кількістю антитіл, наприклад, біспецифічних антитіл, за винаходом, включають наступне: інтерферони, наприклад, інтерферон-о (наприклад, АМОМЕХО, Віодеп) і інтерферон-15 (ВЕТАБЕКОМО), Спігоп/Ветіех); Кополімер 1 (Сор-1, СОРАХОМЕФ),, Тема РПагтасеціїсаї
Іпдивігіез, Іпс.-)) диметилфумарат (наприклад, ВОС-12; Віодеп); гіпербаричний оксиген; внутрішньовенний імуноглобулін; кладрибін; кортикостероїди; преднізолон; метилпреднізолон; азатіоприн; циклофосфамід; циклоспорин; циклоспорин А, метотрексат; 4-амінопіридин; і тізанідин.
Додаткові антагоністи, які можна застосовувати в комбінації з антитілами за винаходом, включають антитіла або антагоністи інших цитокінів людини або факторів росту, наприклад, ІТ, 11 -1, 1-2, І -6, БІ - 7, 1-8, 11-12 11-15, 11-16, 1-18, ЕМАР-11, СМ-С5Е, РОБ і РОСР. Антитіла, як описано в цьому документі, можна поєднувати з антитілами до молекул клітинної поверхні, таких як СО2, СОЗ, СО4, сбр8, с025, с028, с030, 2040, 2045, С069, СО80, СО086, С090 або їх ліганди. Крім того, одне або більшу кількість антитіл, наприклад, біспецифічних антитіл, за винаходом, можна поєднувати з агентами, такими як метотрексат, циклоспорин, ЕК5БОб, рапаміцин, мікофенолят мофетил, лефлуномід, нестероїдні протизапальні засоби, наприклад, ібупрофен, кортикостероїди, такі як преднізолон, інгібітори фосфодіестерази, агоністи аденозину, антитромботичні агенти, інгібітори комплементу, адренергічні агенти, агенти, що перешкоджають передачі сигналів прозапальних цитокінів, як описано в цьому документі, інгібітори ІЇ-1б-перетворюючого ферменту (наприклад,
Ух740), анти-Р75, РБОІ,, інгібітори ТАСЕ, інгібітори передачі сигналів Т-клітин, такі як інгібітори кінази, інгібітори металопротеїнази, сульфасалазин, азатіоприн, б-меркаптопурин, інгібітори ангіотензинперетворюючого ферменту, розчинні рецептори цитокінів та їх похідні, як описано в цьому документі, і протизапальні цитокіни (наприклад, ІІ -4, 1-10, 11-13 ї ТОБ).
Переважні приклади терапевтичних агентів проти множинного склерозу, з якими можна поєднувати антитіла за винаходом, включають диметилфумарат (наприклад, ВО-12, Віодеп), інтерферон-бета, наприклад, ІЕМ-Д-Та ії ІЄМ-Д-16; СОРАХОМЕФ, кортикостероїди, інгібітори 11/-1, антитіла до ліганду СО40 ії СОВ80О, антагоністи 1-12.
Необмежуючі приклади агентів для лікування або попередження псоріазу, з якими можна поєднувати антитіло, наприклад, біспецифічний антигензв'язуючий білок, за винаходом, включають наступні: кортикостероїди; вітамін ОЗ і його аналоги; ретиноїди (наприклад, соріатан); метотрексат; циклоспорин, б-тіогуанін; акутан; гідреа; гідроксисечовину; сульфасалазин; мікофенолят мофетил; азатіоприн; такролімус; естери фумарової кислоти; біологічні агенти, такі як АМЕМІМЕФ, Каріїма устекінумаб і ХР-828І; фототерапію; і фотохіміотерапію (наприклад, комбінація псоралену і фототерапія ультрафіолетом).
Необмежуючі приклади агентів для лікування або попередження запальних захворювань дихальних шляхів/респіраторних захворювань (наприклад, хронічного обструктивного захворювання легенів, астми), з якими можна поєднувати антитіло, наприклад, біспецифічний антигензв'язуючий білок, за винаходом, включають наступні: агоністи бета?2-адренорецепторів (наприклад, сальбутамол (альбутерол), левальбутерол, тербуталін, бітолтерол); агоністи бета2-адренорецепторів тривалої дії (наприклад, сальметерол, формотерол, бамбутерол); адренергічні агоністи (наприклад, інгаляційний адреналін і таблетки ефедрину); антихолінергічні препарати (наприклад, іпратропій бромід); комбінації інгаляційних стероїдів і бронходилататорів тривалої дії (наприклад, флутиказон/сальметерол (АОМАЇКФ в США і бегейде в Сполученому Королівстві)) або будесонід/формотерол (ЗУМВІСОКТФ)); інгаляційні глюкокортикоїди (наприклад, циклезонід, беклометазон, будесонід, флунізолід, флутиказон, мометазон, триамцинолон); модифікатори лейкотрієнів (наприклад, монтелукаст, зафірлукаст, пранлукаст і зілейтон); стабілізатори тучних клітин (наприклад, кромоглікат (кромолін) і недокроміл); антимускарини/антихолінергічні засоби (наприклад, іпратропій, окситропій, тіотропій); метилксантини (наприклад, теофілін, амінофілін); антигістамінні препарати; блокатори ІДЕ (наприклад, омалізумаб); МЗ3 мускаринові антагоністи (антихолінергічні засоби) (наприклад, іпратропій, тіотропій); кромони (наприклад, кромоглікат, недокроміл); ксантини (наприклад, теофілін); інгібітори 1-17 (наприклад, бродалумаб, секукінумаб, іксекізумаб), інгібітори І! -4; і інгібітори 1-13.
В одному варіанті реалізації винаходу антитіло, наприклад, біспецифічний антигензв'язуючий білок, за винаходом, можна застосовувати в комбінації з одним або більшою кількістю антитіл, спрямовано діючих на інші мішені, які беруть участь в регуляції імунних реакцій, наприклад, при відторгненні трансплантата.
Необмежуючі приклади агентів для лікування або попередження імунних реакцій, з якими можна поєднувати антитіло, наприклад, біспецифічний антигензв'язуючий білок, за винаходом, включають наступні: антитіла проти інших молекул поверхні клітин, включаючи, але не обмежуючись цим, СО25 (рецептор-с інтерлейкіну-2), СО1т1а (І БА-1), С0О54 (ІСАМ-1), 204, 6045, Ср28/СТІ А4 (С080 (87.1), наприклад, СТІ А4 Ід (абатасепт, ОКЕМСІАФ), ІСОБ5І, ІСО5 і/або СО86 (87.2). У ще одному варіанті реалізації винаходу антитіло за винаходом застосовують в комбінації з одним або більшою кількістю загальних імуносупресантів, таких як циклоспорин А або ЕК5БОб.
В інших варіантах реалізації винаходу антитіла застосовують як ад'ювант вакцини проти аутоїмунних захворювань, запальних захворювань і т. д. Комбінація ад'ювантів для лікування цих типів розладів підходить для застосування в поєднанні з широким спектром антигенів з числа спрямовано діючих аутоантигенів, тобто, аутоантигенів, що беруть участь в аутоїмунних процесах, наприклад, основний білок мієліну, запальні аутоантигени (наприклад, амілоїдний пептидний білок) або антигени трансплантата (наприклад, алоантигени). Антиген може містити пептиди або поліпептиди, одержані з білків, а також фрагменти будь-якого з наступного: сахариди, білки, полінуклеотиди або олігонуклеотиди, аутоантигени, амілоїдний пептидний білок, антигени трансплантата, алергени або інші макромолекулярні компоненти. В деяких випадках антигенна композиція містить більше одного антигену.
Наприклад, бажані вакцини для пом'якшення відповідей на алергени у хребетного хазяїна, які містять ад'ювантні комбінації за цим винаходом, включають такі, що містять алерген або його фрагмент. Приклади таких алергенів описані в патенті США Мо 5830877 і публікації РСТ Мо УУО 99/51259, які включені до цього документу шляхом посилання в повному обсязі, і включають пилок, отрути комах, лупу тварин, спори грибів і лікарські препарати (такі як пеніцилін). Вакцини перешкоджають продукуванню антитіл ІДЕ, відомої причини алергічних реакцій. В іншому прикладі бажані вакцини для попередження або лікування захворювань, що характеризуються відкладенням амілоїду у хребетного хазяїна, які містять ад'ювантні комбінації за цим винаходом, включають такі, що містять частини амілоїдного пептидного білка (АПІП). Це захворювання згадується по-різному як хвороба Альцгеймера, амілоїдоз або амілоїдогенне захворювання. Таким чином, вакцини за цим винаходом містять ад'ювантні комбінації за цим винаходом плюс А.бета. пептид, а також фрагменти пептиду АВ і антитіл до пептиду АД або його фрагментів.
В іншому варіанті реалізації винаходу фармацевтичні композиції можуть надаватися у вигляді набору, що включає ємність, яка містить антитіло, біспецифічний антигензв'язуючий білок або антигензв'язуючих фрагмент за винаходом. Антитіла, наприклад, біспецифічні антитіла за винаходом, можуть бути представлені у вигляді однодозового або багатодозового ін'єкційного розчину або у вигляді стерильного порошку для розведення перед ін'єкцією. Як альтернатива, такий набір може включати диспергатор сухого порошку, генератор рідкого аерозолю або небулайзер для введення антигензв'язуючого білка (наприклад, анти-ТІ 1А/анти- ТМЕ-о; біспецифічний антигензв'язуючий білок).
Такий набір може додатково містити письмову інформацію про показання і застосуванні фармацевтичної композиції. Більш того, така інформація може включати твердження про те, що композиція антитіла протипоказана пацієнтам з відомою гіперчутливістю до ТІТА і ТМЕ-с.
В іншому варіанті реалізації цей винахід відноситься до промислового виробу, який містить: (а) композицію речовини, що містить антитіло, біспецифічний антигензв'язуючий білок або антигензв'язуючий фрагмент, як описано в цьому документі; (Б) ємність, що містить зазначену композицію; і (с) етикетку, прикріплену до зазначеної ємності, або листок-вкладиш в упаковку, включений в зазначену ємність, який відноситься до застосування зазначеного антитіла для лікування пов'язаного з імунною системою захворювання.
В іншому аспекті композиція містить додатковий активний інгредієнт, який може бути, наприклад, додатковим антитілом або протизапальним, цитотоксичним або хіміотерапевтичним засобом.
Переважно композиція є стерильною.
Крім того, антитіла, наприклад, біспецифічні антитіла, як описано в цьому документі, є придатними для приготування лікарських засобів і медикаментів для лікування імунних і запальних захворювань, включаючи, наприклад, СРК, ЗЗК, БК, ЯК. В конкретному аспекті такі лікарські засоби і медикаменти містять терапевтично ефективну кількість біспецифічного антигензв'язуючого білка, антитіла або антигензв'язуючого фрагмента за винаходом з фармацевтично прийнятним носієм. У варіанті реалізації винаходу суміш є стерильною.
Біспецифічні антигензв'язуючі білки за винаходом є придатними для виявлення ТІ14А і/або ТМЕ-о в біологічних зразках та ідентифікації клітин або тканин, які експресують рецептор ОКЗ ТІЛА і/або рецептора ТМЕ-ох. Наприклад, біспецифічні антигензв'язуючі білки можна застосовувати в діагностичних аналізах, наприклад, аналізах зв'язування, для виявлення та/або кількісного визначення зв'язування і/або експресії в тканини або клітині Т/ТА і/або ТМЕ-х. Крім того, описані в цьому документі біспецифічні антигензв'язуючі білки можна застосовувати для інгібування утворення комплексу ТІ1А з його рецептором ЮОКЗ, таким чином модулюючи біологічну активність ТІ 1А або ОКЗ в клітині або тканині. Подібним чином, біспецифічні антигензв'язуючі білки, описані в цьому документі, можна застосовувати для інгібування утворення комплексу ТМЕ-х з його рецептором, таким чином модулюючи біологічну активність ТМЕ-о; або його рецептора в клітині або тканині. Типова активність, яку можна модулювати, включає, але не обмежуючись цим, інгібування і/або зменшення запалення.
Біспецифічні антигензв'язуючі білки, описані в цьому документі, можна застосовувати з діагностичною метою для виявлення, діагностики або моніторингу захворювань і/або станів, пов'язаних з ТІ1А і/або ТМЕ-х. Додатково представлені способи виявлення присутності ТІЛА і/або
ТМЕ-е; у зразку із застосуванням класичних імуногістологічних методів, відомих фахівцям в цій галузі техніки. Див., наприклад, Тііззеп (1993), Ргасіїсе апа Тпеогу ої Еп7гуте Іттипоаззауз, Мої 15 (Еадз К.Н.
Вигадоп апа Р.Н. мап Кпіррепрега, ЕІбемівї, Ат5іегаат); 20їа (1987), Мопосіопа! Апііродієв: А Мапаиаї ої
Тесппідневз, рр. 147-158 (СВО Ргезв, Іпс.); УЧаІкКапеп еї аї. (1985), 9. СеїІ. Вісі. 101: 976-985; даЇКапеп еї а!І. (1987), 9. Сеї! Віої. 105: 3087-3096. Детектування ТІЛА і/або ТМЕ-о можна здійснювати іп мімо або іп мігО.
Запропоноване в цьому документі діагностичне застосування включає застосування антигензв'язуючих білків для детектування експресії Т/1ТА і/або ТМЕ-о; і зв'язування цих лігандів з їх рецепторами. Приклади способів, придатних для детектування присутності ліганду, включають імуноаналізи, такі як імуноферментний аналіз (ІФА) і радіоїмуноаналіз (РІА).
Для діагностичного застосування в антигензв'язуючий білок зазвичай буде введена мітка у вигляді детектованої групи мітки. Придатні групи мітки включають, але не обмежуючись цим, наступні: радіоїзотопи або радіонукліди (наприклад, ЗН, 720, 15М, 555, 90, 99Тс, п, 125І, 1911), флуоресцентні групи (наприклад, ФІТЦ, родамін, люмінофори на базі комплексів лантанідів), ферментні групи (наприклад, пероксидаза хрону, ВД-галактозидаза, люцифераза, лужна фосфатаза), хемілюмінесцентні групи, біотінильні групи або попередньо визначені поліпептидні епітопи, які розпізнаються вторинним репортером (наприклад, послідовності пар лейцинового зіпера, сайти зв'язування для вторинних антитіл, сайти зв'язування з металом, епітопні мітки). В деяких варіантах реалізації винаходу група мітки з'єднана з антигензв'язуючим білком через спейсерні плечі різної довжини для зменшення потенційної стеричної перешкоди. Різні способи введення мітки в білки відомі в цій галузі техніки і можуть бути застосовані.
В іншому варіанті реалізації винаходу описаний в цьому документі біспецифічний антигензв'язуючий білок можна застосовувати для ідентифікації клітини або клітин, що експресують
ТІЛА і/або ТМЕ-со. В конкретному варіанті реалізації винаходу в антигензв'язуючий білок вводять мітку у формі групи мітки і виявляють зв'язування міченого антигензв'язуючого білка з ТІ1А і/або ТМЕ-с. У ще одному конкретному варіанті реалізації винаходу зв'язування антигензв'язуючого білка з ТІ 1А і/або
ТМЕ-х виявляють іп мімо. У ще одному конкретному варіанті реалізації винаходу біспецифічний антигензв'язуючий білок виділяють і проводять вимірювання із застосуванням методів, відомих в цій галузі техніки. Див., наприклад, Нагіоу апа І апе, 1988, Апіїбодієх: А ІГарогаїгу Мапиаї, Мем Могк: Соїа
Зргіпуд Нагбог (ред. 1991 и періодичні доповнення); ЧУойп Е. Соїїдап, ед., 1993, Сигпепі Ргоїосої5 Іп
ІттипоіЇоду Мем/ Моїк: допп УМіеу б 5оп5.
В іншому аспекті винаходу пропонується детектування присутності тестованої молекули, яка конкурує за зв'язування з ТІ1А і/або ТМЕ-о із антигензв'язуючими білками, описаними в цьому документі. Приклад одного з таких аналізів буде включати виявлення кількості незв'язаного антигензв'язуючого білка у розчині, що містить деяку кількість ТІ1А і/або ТМЕ-с, в присутності або за відсутності тестованої молекули. Збільшення кількості незв'язаного антигензв'язуючого білка (тобто, антигензв'язуючого білка, не зв'язаного з ТІ/1А і/або ТМЕ-о), вказує на те, що тестована молекула здатна конкурувати з біспецифічним антигензв'язуючим білком за зв'язування з ТІ1А і/або ТМЕ-с. В одному варіанті реалізації винаходу в антигензв'язуючий білок вводять мітку у вигляді групи мітки. Як альтернатива, мітку вводять в тестовану молекулу, і кількість незв'язаної тестованої молекули відстежують в присутності і за відсутності антигензв'язуючого білка.
Робочі приклади
Далі винахід проілюстровано наступними робочими прикладами, які ілюструють, але не обмежують обсягу винаходу.
Приклад 1
Одержання моноклональних антитіл проти ТІ ТА ХепоМоизефФ
Лінії мишей
Повністю людські антитіла до ТІ ТА людини були одержані шляхом імунізації трансгенних мишей
ХЕМОМОИШ5БЕФ. Патенти США МоМо 6114598; 6162963; 6833268; 7049426; 7064244, яківключенідо цього документу шляхом посилання в повному обсязі Сгеєп еї аіЇ. (1994), Маїшге Сепеїйсв 7: 13-21;
Мепаве? еї аї. (1997), Мате Сепеїїсв 15: 146-156; Стеєп апа УЧаКобоміїїз (1998), у. Ех. Меа, 188: 483- 495; КеПептап апа Стееп (2002), Ситепі Оріпіоп іп Віотесппоіоду 13, 593-597; кожен з яких включений до цього документу шляхом посилання в повному обсязі. Для імунізації у всіх випадках використовували тварин ліній ХЕМОМООЗЕФ ХМО1-КІ, ХМО2-К, ХМО2-К/Ваїрбс, ХМО2-КІ, ХМО4-К і
ХМО4-КІ.
Одержання імуногену ТІЛА
Поліпептиди ТІ ТА, що містять М-кінцеву мітку Ніз (Нб), в яких перші 22 амінокислоти є сигнальним пептидом МК, одержують шляхом тимчасової трансфекції клітин 293НЕК відповідними кКДНК. Для полегшення виявлення і подальшого очищення застосовують широко використовувану мітку роїуНів.
Клітини 293-6Е в кількості 9,48х105 клітин/мл трансфектують 0,5 мг/л ДНК (0,1 мг/л Ніз-ТІЛА у векторі рТТ5 з 0,4 мг/л порожнього вектора рТтТ5) (Оигоснег ей аї. (2002) МКСС, Мисівїс Асіав. Кев. 30,
е9) з З мл ПЕЇІ/мг ДНК в середовищі ЕгеесуЇе 293 (Іпийгодеп). Триптон М1 додають до культур через 1 годину після трансфекції. Клітини вирощують в суспензії в експресійному середовищі ЕгеесіуЇе 293, доповненому 0,1 95 Ріпгопіс Е68 і 50 мкг/мл генетицину протягом 7 днів і збирають для очищення.
Приклад 2
Генерація ТІЛА
Поліпептиди ТІ ТА, що містять М-кінцеву мітку Ніз (Нб), в яких перші 22 амінокислоти є сигнальним пептидом МК1), одержують шляхом тимчасової трансфекції клітин 293НЕК відповідними кКДНК. Для полегшення виявлення і подальшого очищення застосовують широко використовувану мітку роїуНіх
Клітини 293-6Е в кількості 9,48х10» клітин/мл трансфектують 0,5 мг/л ДНК (0,1 мг/л Нібз-ТІ ТА у векторі рТТ5 з 0,4 мг/л порожнього вектора ртТтТ5) (ЮОигоснег еї аі. МКСОС, Мисівїс Асіаз. Кев. (2002) 30, е9) із З мл ПЕЇ/мг ДНК в середовищі ЕгеезіуЇе 293 (Іпийгодеп). Триптон М1 додають до культур через 1 годину після трансфекції. Клітини вирощують в суспензії в експресійному середовищі Егеесіуіе 293, доповненому 0,1 95 Ріпгопіс Е68 і 50 мкг/мл генетицину протягом 7 днів і збирають для очищення.
Імунізація
Імунізацію проводять із застосуванням однієї або більшої кількості придатних форм антигену ТІЛА, включаючи рекомбінантний ТІ/1А людини, експресований на клітинах, і розчинний білок рекомбінантного ТІ 1А або їх комбінації.
Для початкової імунізації ХепомоцйзефФ застосовують придатну кількість імуногену (тобто, 10 мкг білка, що вводиться ін'єкцією в черевну порожнину). Після початкової імунізації подальшу бустерну імунізацію імуногеном (тобто, 2 х 10 еб клітин або 5 мкг білка) проводять за графіком протягом періоду часу, необхідного для індукції у мишей відповідного титру антитіла проти ТІ1А. Титри визначають будь-яким придатним способом, наприклад, за допомогою імуноферментного аналізу або проточної цитометрії (ЕАС5).
Для одержання імунних відповідей проти Т/1А людини застосовували численні імуногени і способи імунізації. З метою генетичної імунізації мишей імунізували 12-16 разів протягом 6-8 тижнів із застосуванням системи Неїїоз Сепе Сип відповідно до інструкцій виробника (ВіоКайд, Геркулес, штат
Каліфорнія). Якщо коротко, векторами експресії, що кодують ТІ1А дикого типу людини або яванського макака, вкривають гранули золота (ВіокКай, Геркулес, штат Каліфорнія) і вводять в епідерміс виголеного черева миші. З метою клітинної імунізації мишей імунізують адаптованою до суспензії клітинною лінією СНО-КІ (Іпуйтодеп, Карлсобад, штат Каліфорнія), стабільно трансфектованою вектором експресії, що кодує ТІ1А людини. Тварин імунізують клітинами, змішаними з алюмінієвим галуном, одержаним з калій алюміній сульфату (ЕМО СПпетісаїЇ5 Іпс., Гібстаун, Нью-Джерсі), і Сро-
ОМ (Ейтоїїпе МУУС Орегоп ГІС, Хантсвілл, штат Алабама) 10-12 разів протягом 6-8 тижнів, із застосуванням протоколу, в якому чергують підшкірні і внутрішньоочеревинні ін'єкції. Початковий бустер містить 4 х 105 клітин, в той час як наступні бустери містять 2 х 105 клітин. У разі імунізації розчинним рекомбінантним білком мишей імунізують бх міченою Ніз тримерною формою позаклітинного домену ТІ1А людини і яванського макака (амінокислоти 72-251 послідовностей ТІ А).
Тварин імунізують рекомбінантним білком, змішаним з алюмінієвим галуном, і Сро-О0ОМ, 8-12 разів протягом 4-8 тижнів із застосуванням підшкірних ін'єкцій. Початковий бустер містить 10 мкг, а наступні - 5 мкг. Специфічні по відношенню до ТІЛА людини титри сироватки контролюють за допомогою аналізу ЕАС5 із живими клітинами на проточному цитометрі Ассигі або РасзСаїїриг (ВО Віозсієпсев).
Тварин з найвищими антиген-специфічними титрами сироватки, спрямовано діючими на ТІ 1А людини і яванського макака, умертвляють і використовують для генерації гібридоми (Копіег апа Мі!Івівіп, 1975).
Приклад З
Одержання моноклональних антитіл
Генерація гібридоми
Ідентифікують тварин з придатними титрами, лімфоцити одержують з дренованих лімфатичних вузлів і, при необхідності, об'єднують в пул для кожної когорти. Об'єднані в пул лімфоцити (з кожної когорти імунізації) дисоціюють від лімфоїдної тканини шляхом подрібнення в придатному середовищі (наприклад, модифіковане Дульбекко середовище Ігла (МДСІ), Іпийгодеп, Карлсобад, штат Каліфорнія).
В-клітини можна відібрати і/або розвести із застосуванням придатного способу і здійснити злиття з відповідним партнером по злиттю; наприклад, клітинами несекреторної мієломи РЗхб3А9дв.653 (Американська Колекція Типових Культур СКІ. 1580, Кеагпеу еї аї, у. Іттипої!. 123, 1979, 1548-1550), із застосуванням способів, відомих в цій галузі техніки. В-клітини відбирають і/або розводять із застосуванням стандартних способів і здійснюють злиття з відповідним партнером по злиттю за допомогою методів, які відомі в цій галузі техніки.
В одному придатному способі злиття лімфоцити змішують з клітинами-партнерами по злиттю у співвідношенні 1:4. Суміш клітин обережно осаджують шляхом центрифугування при 400 х д протягом 4 хвилин, супернатант декантують, і суміш клітин обережно перемішують (наприклад, за допомогою піпетки місткістю 1 мл). Злиття індукують ПЕГ/ДМСО (поліетиленгліколь/диметилсульфоксид, доступні від зідта-Аїагісп, Сент-Луїс, штат Міссурі, 1 мл на мільйон лімфоцитів). ПЕГ/ДМСО повільно додають при обережному перемішуванні протягом однієї хвилини і перемішують ще одну хвилину. Потім додають МІСД (МДСІ без глютаміну, 2 мл на мільйон В-клітин) протягом 2 хвилин при обережному перемішуванні, з подальшим додаванням додаткової кількості МІСД (8 мл на мільйон В-клітин), яке проводять протягом З хвилин.
Гібридні клітини обережно гранулюють (400 х 4д, 6 хвилин) і ресуспендують у 20 мл селекційного середовища (наприклад, МДСІ, що містить азасерин і гіпоксантин |ІГК) і, при необхідності, інші додаткові матеріали) на мільйон В-клітин. Клітини інкубують протягом 20-30 хвилин при 37С, після чого ресуспендують у 200 мл селекційного середовища і культивують протягом трьох-чотирьох днів у колбах Т175 до нанесення на 96-лункові планшети.
Клітини розподіляють на 9б-лункових планшетах із застосуванням стандартних способів максимізації клонування одержаних колоній. Через декілька днів культивування супернатанти збирають і піддають скринінговим аналізам, як описано в прикладах нижче, включаючи підтвердження зв'язування з ТІ ТА людини, оцінку перехресної реактивності з ТІ1А інших видів (наприклад, ТІЛА яванського макака) і здатність пригнічувати активність ТІ ТА. Далі відбирають клітини з позитивними результатами і піддають стандартним методам клонування і субклонування. Клональні лінії можуть бути розведені іп міїго, і секретовані людські антитіла можуть бути одержані для аналізу.
Таким чином мишей імунізують рекомбінантним розчинним білком ТІ1ТА людини протягом в цілому імунізацій протягом близько 2 місяців; одержані декілька ліній клітин гібридоми, які секретують
ТІТА-специфічні антитіла, і антитіла додатково охарактеризовані. Їх послідовності представлені в
Переліку послідовностей і Табл. А, С і 0, а результати різних тестів із застосуванням цих антитіл представлені в цьому документі.
В Табл. А-Е цього документу представлені послідовності антитіл проти ТІ1А, одержаних відповідно до цього робочого прикладу.
Приклад 4
Антигенне збагачення гібридомних пулів
Як джерело матеріалу для збагачення на базі ЕАС5 використовують пули злитої гібридоми після вибіркового збирання імунної тканини. Для збагачення гібридом, що експресують антитіла, специфічні по відношенню до нативного (повнорозмірного, на клітинах) ТІЛА людини, одержують мембрани клітин 293Т, які тимчасово експресують конструкцію КДНК ТІЛА. Через 24 години після трансфекції із застосуванням 293ГРесіїп М (ТпептоРізпег Зсієпійс Іпс.) клітини біотинілюють за допомогою Е-7 зв'язку
МН5-І0-ІС-Біотин відповідно до рекомендацій виробника (ТпептоРізпег Зсіепіййс Іпс.). Після біотинілювання клітини гомогенізують за допомогою голки і шприца для одержання фрагментів мембран, які називають «препаратами мембран». Потім біотинільовані препарати мембран використовують для виявлення гібридом, що експресують поверхневі антитіла, специфічні по відношенню до цільової мішені, за допомогою стандартної хімії біотину-стрептавідину.
З метою збагачення гібридомних пулів антигеном, що представляє інтерес, їх спочатку інкубують із зондом мембранних препаратів. Потім незв'язаний зонд вимивають, а антигенспецифічні гібридоми ідентифікують шляхом одночасного виявлення поверхневого до (за допомогою кон'югованого з АіІеха 488 вторинного Сї антитіла проти Ес людини, ЧУаскзоп ІттипоКезеагсі) і зонда біотинільованого мембранного препарату ТІ1А (кон'югований з АІеха Рішог 647 стрептавідин, дхаскзоп ІттипоКезеагсі).
Гібридоми, що експресують поверхневий ІдсС і зв'язуть антиген, виявляють за допомогою аналізу
ЕАС5 на проточному цитометрі Ассигі. Подвійні позитивні події сортують як окремі клітини в 384- лункові планшети на сортувальнику клітин БАС5 Апйа (ВО Віозсіепсе5). Через декілька днів культивування супернатанти гібридоми, що містять моноклональні антитіла, збирають і використовують у скринінгових аналізах, описаних у прикладах нижче.
Приклад 5
Початкова селекція ТІ ТА-специфічних зв'язуючих антитіл
ТІЛА людини експресують на клітинах-хазяях ембріональної нирки 293 людини шляхом трансфекції із застосуванням вектора експресії, що експресує КДНК пПитІ1А, середовища Сібсо м Орії-
МЕМФ (бірсо, кат. Мо 31985088) і реагенту 293Ресійп'"м (Іпийгодеп, кат. Мо 12347019) відповідно до протоколу, встановленого виробником. Супернатанти гібридом піддають скринінгу щодо присутності пит ТА-специфічних моноклональних антитіл із застосуванням системи скринінгу ЕМАТ 8200 (МоІесшаг ЮОемісе5) і платформи для візуалізації з високим вмістом СейШпвіднім (ТнегтоРівНпег
Зсіепійс). Кількість пиТІ1А-позитивних лунок (тобто, таких, для яких сигнал перевищує сигнал супернатанта нерелевантної гібридоми) представлена у Табл. 5.1. Для скринів СейПШпвідні, 15 мкл/лунку супернатанта гібридоми (і позитивного і негативного контролю) вміщують на чорні 384- лункові планшети з прозорим дном (Согпіпд кат. Мо 3712), з подальшим додаванням 30 мкл/лунку суміші клітин Т/1А/293Т, ядерного барвника Ноезспї (Ріегсе, кат. Мо 62249) і АІеха 488-козиного антитіла проти дб людини (Н ї- Ї) (дасКбоп, кат. Мо 109-545-088). Через З години інкубації при кімнатній температурі планшети промивають 2 рази на пристрої для промивання планшетів АдвааМах 4000 (забезпеченому 384-лунковою голівкою для промивання клітин) і зчитують на приладі СеїІп5ідні відповідно до рекомендацій виробника. Для скринів на базі ЕМАТ, 20 мкл/лунку супернатанта гіоридоми (і позитивного і негативного контролю) вміщують на чорні 384-лункові планшети з прозорим дном, а потім додають 40 мкл/лунку суміші клітин ТІ 1А/293Т, батьківських клітин 2931 і Суб-козиного анти-людського дО (Ес) (дасквоп, кат. Мо 109-075). Через З години інкубації при кімнатній температурі планшети зчитують в системі ЕМАТ 8200 відповідно до рекомендацій виробника.
Таблиця 5.1
Відібрані ТІ ІА-специфічні антитіла 00021111 1ЕМАТ8200 77777717 Ї77717171717171717119001 10000611 фЕМАТ8гОС 77777777 77717171 488111С1С
Біотинільований пит 1А одержують введенням в реакцію 100 мкг/мл МН5 І С І С біотину (Ріегсе, кат. Мо 21338) і 100 мкг пиТІ1А (одержаний, як описано в Прикладі 2) в 1 мл ФСБ, рН 8,5, протягом 1 години при кімнатній температурі. Непрореагувавший біотин видаляють ультрафільтрацією із застосуванням спінової колонки Атісоп ОКга 5 кДа (Міййроге, кат. Мо ОРС8 005). Супернатанти гіоридоми, що містять пит ТА-зв'язуючі антитіла, аналізують щодо їх здатності блокувати зв'язування пиТІ1А з Оєай Кесеріог З людини (пиОКЗ) за допомогою аналізу рецептора-ліганду на базі ІФА.
Планшети ІФА (Согпіпо, кат. Мо 3702) вкривають 40 мкл/лунку химери ЮНАЗ3-Ес людини (1 мкг/мл) (КО бузієтв, кат. Мо 943-203) у вкриваючому буфері (їх ФОБ/О0,05 95 азиду), потім інкубують протягом ночі при 4 "С. Далі планшети З рази промивають водою і блокують 90 мл розбавлювача (їх ФОБ/1 965 молока) протягом 30 хв при кімнатній температурі. 15 мкл супернатанту гібридоми проти ТІЛА попередньо інкубують із 45 мкл біотинільованого ТІ ТА (кінцева концентрація 30 нг/мл) на 96-лункових планшетах для зберігання (Зідта, кат. Мо РЄ866б) в розбавлювачі для аналізу протягом 2 годин при кімнатній температурі перед додаванням на планшети ІФА з попередньо блокованим ОКЗ. Потім аналітичні планшети інкубують протягом 1 години при кімнатній температурі. далі планшети із зразками промивають З рази, після чого додають 40 мкл/лунку стрептавідину-ПХ (Ріегсе, кат. Мо 21126) і ще 1 годину інкубують при кімнатній температурі. Планшети промивають ще тричі і додають мкл ТМБ (Меодеп, кат. Мо 308177). Реакційну суміш з ТМБ інкубують протягом 30 хв при кімнатній температурі, і потім гасять 40 мкл/лунку 1 н соляної кислоти. В кінці, планшети зчитують на пристрої для зчитування ІФА планшетів на довжині хвилі 450 нм. Пороги встановлюють на рівні «х 38 905 від сигналу негативного контролю, нерелевантних ВСН (виснажених супернатантів). Кількість зразків, здатних блокувати взаємодію пит! Т1А-ОКЗ (визначена згідно із зазначеним порогом), наведена в
Табл. 6.1.
Таблиця 6.1
Вибрані блокатори ТІ ЛА/ОКЗ
Приклад 7
Аналізи функціонального блокування ТІЛА
Для скринінгу гібридом, здатних блокувати функціональну активність ТІ ТА, застосовують аналіз вивільнення ІЕМу з первинних Т-клітин або аналіз репортера МЕ-кВ у клітинах ТЕТ. Для аналізу вивільнення ІЕМу, очищені первинні Т-клітини людини (Віоіодіса! Зресіайу Согр., кат. Мо 215-01-10) стимулюють розчинним ТІЛА людини в присутності або за відсутності супернатантів гібридоми, специфічних по відношенню до ТІЛА. 2 х 107 первинних Т-клітин людини стимулюють 8-16 нг/мл ТІ/1А людини (Атдеп), 1-2 нг/мл 1ІЇ/-12 (Рергоїесп) і 0,5-1 нг/мл І/-18 (КО бБувзіет5) в присутності супернатантів гібридоми, що містять антитіла проти ТІ1А, на 96-лунковому круглодонному планшеті при 37 "С протягом 72 годин. Далі тестують рівень ІЕМу в супернатантах культур методом ІФА відповідно до інструкцій виробника (КО Бувіет5). Для аналізу чутливого репортера ТІ1А лінію репортерних клітин ТЕ-1 МЕ-кВ (Атдеп) стимулюють розчинним або мембранозв'язаним ТІ ТА людини або розчинним ТІ 1А яванського макака. 0,2-3 нМ або 2-20 нМ розчинної ТІ 1А людини або яванського макака (відповідно) інкубують з 104-105 репортерних клітин ТЕ-1 МЕ-кВ в присутності послідовно розведених супернатантів гібридоми (або контролю) на 96- або 384-лункових планшетах при 37 "С протягом ночі. Для тестування зразків проти мембранозв'язаного ТІЛА, аналіз активності проводять шляхом спільного культивування лінії репортерних клітин ТЕ-1 МЕ-кВ з експресуючими ТІ1ТА людини клітинами АМ1О. 105 репортерних клітин ТЕ-1 МЕ-кВ ії 103 клітин АМ1О спільно культивують в присутності 5 мкг/мл антитіла проти ТІТА (або контрольного) на 384-лунковому планшеті при 37 "С протягом ночі. Сигнал репортера в кожній лунці визначають із застосуванням системи аналізу люциферази 5бієаау-Сіо відповідно до рекомендацій виробника (Рготеда)
Приклад 8
Виділення молекул і секвенування антитіл, які блокують рецептор-ліганд ТІЛА
РНК (загальну або мРНК) очищують з лунок, що містять клітини гібридоми, які продукують нейтралізуючі ТІ1А антитіла, із застосуванням набору Оіадеп КМеазу тіпі або Іпуйгодеп тЕеЕМА саїспег ріиз. Очищену РНК використовують для ампліфікації генів варіабельної ділянки (М) важкого і легкого ланцюга антитіла із застосуванням синтезу КДНК за допомогою зворотної транскрипції з наступною полімеразною ланцюговою реакцією (ЗТ-ПЛР). Важкий ланцюг гама повністю людського антитіла одержують із застосуванням набору для ПЛР зі зворотною транскриптазою Оіадеп Опе 5іер (Оіадеп). Цей спосіб застосовують для одержання першого ланцюга кКДНК з шаблону РНК, а потім для ампліфікації варіабельної ділянки важкого ланцюга гама із застосуванням мультиплексної ПЛР (повний перелік праймерів, 5ЗЕО ІО МО: 1191-1252, відповідно, див. у Табл. 8.1). Специфічний по відношенню до гама-ланцюга 5'--праймер відпалюють до сигнальної послідовності важкого ланцюга антитіла, тоді як 3-праймер відпалюють до ділянки константного домену гама. Повністю людський легкий ланцюг капа одержують із застосуванням набору для ПЛР зі зворотною транскриптазою Оіадеп
Опе (ер (Оіадеп). Цей спосіб застосовують для одержання першого ланцюга кКДНК з шаблону РНК, а потім для ампліфікації варіабельної ділянки легкого ланцюга капа із застосуванням мультиплексної
ПЛР. Специфічний по відношенню до легкого ланцюга капа 5'-праймер відпалюють до сигнальної послідовності легкого ланцюга антитіла, в той час як 3'-праймер відпалюють до ділянки константного домену капа. Повністю людський легкий ланцюг лямбда одержують із застосуванням набору для ПЛР зі зворотною транскриптазою Оіадеп Опе 5іер (Оіадеп). Цей спосіб застосовують для одержання першого ланцюга кКДНК із шаблону РНК, а потім для ампліфікації варіабельної ділянки легкого ланцюга лямбда із застосуванням мультиплексної ПЛР. Специфічний по відношенню до легкого ланцюга лямбда 5'-праймер відпалюють до сигнальної послідовності легкого ланцюга, в той час як 3'- праймер відпалюють до ділянки константного домену лямбда.
Ампліфіковану кКДНК очищують ферментативно із застосуванням екзонуклеази ! і лужної фосфатази, і послідовність очищеного продукту ПЛР визначають прямим секвенуванням.
Амінокислотні послідовності виводять з відповідних послідовностей нуклеїнової кислоти біоінформативним способом. Для кожного зразка гібридоми здійснюють два додаткових незалежних, повних циклу ЗТ-ПЛР ампліфікації і секвенування, щоб підтвердити, що будь-які спостережувані мутації не є наслідком ПЛР. Потім одержані амінокислотні послідовності аналізують для визначення джерела послідовностей зародкової лінії антитіл і для ідентифікації відхилень від послідовності зародкової лінії. Амінокислотні послідовності, відповідні СОК секвенованих антитіл, вирівнюють, і результати такого вирівнювання використовують для групування клонів за подібністю.
Таблиця 8.1
Мультиплексні праймери, що застосовуються для ампліфікації генів М антитіла в" праймер
5' праймер 5' праймер
(дек - о т)
Приклад 9
Одержання конструкцій гетеро Ід
Генерація біспецифічного антитіла за допомогою спільної експресії двох різних антитіл дає відходи, що головним чином складаються з неправильно спарених важких і легких ланцюгів. Бажана біспеціфічна молекула гетеротетрамеру з двома різними важкими ланцюгами, з'єднаними із правильно спареними легкими ланцюгами, становить лише невелику частину від загальної кількості комбінацій, які можуть бути зібрані. Відходи виникають головним чином з двох причин. Перша причина полягає в тому, що важкий ланцюг, який об'єднується на ділянці Ес антитіла, може гомодимеризуватися, що дає звичайне моноспеціфічне антитіло, або гетеродимеризуватися, що дає потенційне біспеціфічне антитіло. Друга причина полягає в тому, що легкому ланцюгу не властива розбірливість і він може спаровуватися з будь-яким із важких ланцюгів, що призводить до помилкового збирання Раб з легкого-важкого ланцюга, яка не може зберегти зв'язування з бажаною мішенню. З цих причин конструювання біспецифічних молекул є двохстадійним процесом. Перша мета полягає в запобіганні гомодимеризації важких ланцюгів і сприянні гетеродимеризації. Це може бути досягнуте шляхом конструювання ділянки Ес антитіл із застосуванням, наприклад, стратегій виступів-у- западинах або мутацій зарядової пари. Друга мета полягає в конструюванні інтерфейсу легкого- важкого ланцюга таким чином, щоб легкий ланцюг специфічно пов'язувалася тільки із парним до нього важким ланцюгом.
В технології платформи «Негїего-Ід» (див., наприклад, УМО2009089004 і УМО2014081955, обидві з яких таким чином включені до цього документу шляхом посилання в повному обсязі) використовується перевага електростатичного керуючого механізму для подолання згаданих вище проблем спарювання. Зокрема, введені або використовувані заряджені залишки приводять до гетеродимеризації важкого ланцюга і правильному з'єднанню легкого-важкого ланцюга. Мутації зарядової пари (МЗП) в домені СНЗ ділянки Ес призводять до гетеродимеризації двох різних важких ланцюгів через протилежні заряди, які спричиняють електростатичне тяжіння (див., наприклад,
МО2009089004 і патент США Мо 8592562); дві ідентичні комбінації важких ланцюгів мають однакові співставні заряди і тому відштовхуються.
Правильне спарювання важкого ланцюга-легкого ланцюга може бути полегшене завдяки МЗП на інтерфейсі зв'язування НС/ С або інтерфейсі зв'язування НС1/НС2 (див. Фіг. 1). Правильні комбінації важкого ланцюга-легкого ланцюга матимуть протилежні заряди і тому будуть притягуватися один до одного, тоді як неправильні комбінації важкого ланцюга-легкого ланцюга матимуть однакові заряди, спіставні між собою, що приводить до відштовхування. На фіг. 1 правильно зібрані молекули гетеро Ід містять дві або три МЗП НС1/НС2 і від двох до чотирьох МЗП НС/ С, які спрямовують збирання переважного гетеротетрамеру, що містить два різних важких ланцюги і два різних легких ланцюга, таким чином, що гетеротетрамер буде основним компонентом, який генерується системою експресії.
ДНК, які кодують анти-ТІ 1А/анти- ТМЕ-о гетеро Ід, містять фрагменти, що кодують анти-ТІ/1А (або анти-ТМЕ-о) важкий ланцюг і анти-ТМЕ-о (або анти-Т/ТА) Бар. ДНК клонують у вектор рТтТ5.1. Ці вектори експресії в подальшому застосовують для трансфекції і експресії біспецифічних молекул анти-ТІ ТА/анти- ТМЕ-со; в клітинах людини 293 бЕ.
Антитіла проти ТМЕ-а 3.2, 234 і сертолізумаб застосовують з антитілами проти ТІ1А 3В3, 2011, 2383 МНЗ, 2383 МНА і 3Сбб для конструювання молекул гетеро Ід, як описано в Табл. ./, із застосуванням високопродуктивного клонування, експресії і очищення. Кожна з біспецифічних молекул гетеро Ід мала один з чотирьох форматів, зображених на Фіг. 1, із застосуванням позбавленого ефекторних функцій скаффолда ІдсС1 або скаффолда Ідс2. Переважні молекули дО містять зарядові мутації, зображені на Фіг. 1 (м2), які представлені у Табл. М. Позбавлений ефекторних функцій скаффолд Ідс1 містить заміни К292С і М302С і може також містити заміну М29705 (також відомий як скаффолд 5ЕРІ 2).
Приклад 10
Способ експресії і очищення молекул анти-ТІ ТА/анти- ТМЕ-о; гетеро-Ід
Експресію гетеро Ід здійснюють шляхом тимчасової трансфекції клітин 293-6Е. За один день до трансфекції культуру М-1 вміщують до одноразового біореактора фірми У/аме ємністю 20 л при 36-37 "б, 595 СО», перекривання 0,2 л/хв із загальним об'ємом 9 л культури при 8,5 Е5 життєздатних клітин/"мл у середовищах Егеевіуіе Е-17 (Тпепгто Різпег). Потім готують трансфекційний комплекс шляхом змішування середовища ЕгеезщцМіе Е-17, попередньо нагрітого з 0,5 мг/л ДНК для трансфекції, із співвідношенням ланцюгів плазмідної ДНК 1:1:1:1. Об'єм трансфекційного комплексу (середовища
ДНК я ПЕЇІ-реагент) становить 10 95 від кінцевого об'єму культури. Через чотири години після трансфекції додають підгодівлю з дріжджів і глюкози. Культуру збирають на шостий день при 2,11 Еб клітин/мл і життєздатності 78,2 95. Титр експресії вимірюють із застосуванням системи ЕопевВіо Осії 0 при 84,0 мг/л. Кондиційоване середовище збирають центрифугуванням і фільтрують із застосуванням фільтра з ацетату целюлози з розміром отворів 0,2 мкм, із застосуванням перистальтичного насоса.
Для очищення молекул гетеро-ІДд застосовують хроматографію афінного захоплення Марзеїесі
ЗМИКе (СЕ Пе бсієпсе5, Піскатауей, штат Нью-Джерсі), із застосуванням Дульбекко-ФСБ без двовалентних катіонів (Іпийгодеп, Карлсобад, штат Каліфорнія) як промивного буфера і 100 мМ оцтової кислоти, рН 3,6, як буфера для елюації (Фіг. 3). У всіх випадках виділення проводять при температурі навколишнього середовища. Пік елюації об'єднують на базі хроматограми, нейтралізують до рн 7,0 за допомогою основи 2 М трис, розбавляють 5 обсягами води і фільтрують крізь фільтр з ацетату целюлози з розміром отворів 0,22 мкм. Щоб видалити половинки антитіл, зразок далі завантажують на колонку сефарози 5Р-НР (СЕ І їе бсієпсез, Піскатауей, штат Нью-Джерсі) і промивають 8 об'ємами колонки 5Р-Буфера А (20 мМ натрій фосфат, рН 7,0), а потім елююють з градієнтом 20 об'ємів колонки до 60 95 ЗР-Буфера В (20 мм натрій фосфату, 1 М Масі, рн 7,0) (Фіг. 4). Пул одержують на базі хроматограми і аналізу фракцій Саїїрег І абсСпір (Регкіп ЕІтег, Уолтхем, штат Массачусетс). Пул кондиціонують рівним об'ємом 2Х буфера ХГВ (200 мм натрій фосфату, 1,5 М амоній сульфату, рн 7,0) ії фільтрують крізь фільтр з ацетату целюлози з розміром отворів 0,22 мкм. Щоб видалити неправильно спарені молекули, зразок вміщують на колонку із сефарозою ВищМІ-НР (СЕ І Те 5сіепсев,
Піскатауей, штат Нью-Джерсі) і промивають 8 об'ємами колонки Вшу! Буфера А (50 мМ натрій фосфату, 0,75 М амоній сульфату, рН 7, 0) з подальшою елюацією із застосуванням градієнта 20 об'ємів колонки до 100 95 Вшу! Буфера В (50 мм натрій фосфату, рН 7,0) (Фіг. 5). Пул одержують на базі хроматограми і аналізу фракцій Саїїрег ГарсСпір (Регкіп ЕІтег, Уолтхем, штат Массачусетс) в невідновлювальних і відновлювальних умовах. Пул обробляють діафільтрацією проти близько 30 об'ємів 10 мМ натрій ацетату, 9 95 сахарози, рН 5,2, із застосуванням діалізних касет 5бііде-А-І угег з граничним значенням мембрани 10 кДа (Ріегсе, Рокфорд, штат Іллінойс) і далі концентрують за допомогою центрифужного концентратора Мімазріп-20 з граничним значенням мембрани 10 кДа (Запогіив 5(едіт Віоїесі, Геттінген, Німеччина). Потім концентрований матеріал фільтрують крізь фільтр з ацетату целюлози з розміром отворів 0,8/0,2 мкм, і концентрацію визначають за поглинанням на довжині хвилі 280 нм із застосуванням коефіцієнта екстинкції близько 212000. Чистоту зразків визначають аналізом Саїїрег їарСпір у відновлювальних (з 2 95 2-меркаптоетанолу) і невідновлювальних (з 25 ММ йодацетаміду) умовах (Фіг. 6). Аналітичну ЕХ проводять із застосуванням колонки 7епіх-С 5ЕС-300 (Зерах Тесппоіодіез, Ньюарк, штат Делавер) з ізократичною елюацією у 50
ММ натрій фосфаті, 250 мМ масі, рН 6,9, на 18 дюймах (Фіг. 7).
Для оцінки як цілісності гетеро Ід, так і підтвердження спарювання важкого ланцюга-легкого ланцюга, проводили РХ-МС на невідновлених гетеро Ід, а також на гетеро Ід після обмеженої лізилендопротеїнази С (УМмако, Річмонд, штат Віргінія) для одержання ділянок гетеро-Ід Рар (антигензв'язуючий фрагмент) гетеро Ід. Аналіз невідновленого гетеро-Ід проводять простим розведенням 30 мкг нативного зразка гетеро-Ід, 1:1 в 0,1 95 ТФУ з інжекцією 20 мкг. Аналіз Бар проводять шляхом інкубації гетеро-ід в присутності лізилендопротеїнази С, із застосуванням співвідношення фермент/субстрат 1:400, в присутності 100 мм Трис, із корекцією рН до 8, протягом 30 хвилин при 37 "С. Потім реакцію зупиняють розведенням рівним об'ємом 0,1 95 ТФУ. Початкове розщеплення антитіла лізилендопротеїназою С знаходиться трохи вище за дисульфідні зв'язки шарніра після лізину в мотиві послідовності «СОК/ТНТСРРС, що дає фрагменти Еа і Ес.
Аналіз маси проводять із застосуванням мас-спектрометра Адіепі 6230 ІЕР-ЧП і чотирьохкомпонентної системи ВЕРХ 1260, обладнаної колонкою 7ограх 30058-С8, 2,1 х 50 мм 3,5 мкм (Адііїепі, Санта-Клара, штат Каліфорнія). Рухома фаза А складається з 0,1 95 ТФУ, а рухома фаза
В складається з 90 95 н-пропанолу, 0,1 95 ТФУ у воді. Умови хроматографічного градієнта для аналізу невідновленого гетеро-Ід є наступними: 20 95 рухомої фази В протягом 1 хвилини; 1-9 хв, 20-70 905 В; 9- хв, 70-100 95 В; 10-11 хв, 100 95 В. Температуру колонки підтримують на рівні 75 "С і постколонкове урівноваження при 20 95 рухомої фази В проводять протягом 7 хвилин перед інжекцією наступного зразка. Параметри ІЕР-ЧП є наступними: капілярні напруга, 5900 В; температура газу, 340 "С; сухий газ, 13 л/хв; тиск розпилювача, 25 фунт/кв.дюйм; напруга фрагментора 460 В і напруга скіммера, 95 В (Фіг. 8).
Аналіз гетеро-Ід, розщепленого лізилендопротеїназою С, проводять шляхом інжекції 20 мкг на колонку обернено-фазової ВЕРХ та елюації із застосуванням наступного градієнта РУХ: 2 95 рухомої фази витримують протягом 2 хвилин; 2-12 хв, 2-45 95 В; 12-16 хв, 45-90 95 В; 16-17 хв 90 95 В.
Температуру колонки підтримують на рівні 75 "С, а постколонкове урівноваження при 20 95 рухомої фази В проводять протягом 7 хвилин перед інжекцією наступного зразка (Фіг. 9).
Приклад 11
Одержання конструкцій І(д0-5сЕм
ІЇ00386| Кожен анти-ТІТА/анти-ТМЕ-х антигензв'язуючий білок ІдОб-5сЕм складається з двох антигензв'язуючих доменів, один спрямований проти ТІЛА, а інший проти ТМЕ-о. ДНК, які кодують анти-ТІ ТА/анти-ТМЕ-с ІдСі-5сЕм, містять фрагменти, що кодують анти-ТІ1А (або анти-ТМЕ-о) важкий ланцюг (НС), в якому С-кінець злитий з одноланцюговим Ем (5зсЕм) анти-ТМЕ-х (або анти-ТІ ТА) антитіла (див. Фіг. 2) з цистеїновим зажимом або без нього, з метою покращення біофізичних властивостей. Для введення цистеїнового зажиму, положення 44 (нумерація за Кабатом) МН і 100 (нумерація за Кабатом) МІ мутовані до цистеїну. ДНК клонують у вектор рТТ5.1. Зазначені вектори експресії в подальшому використовують для трансфекції та експресії анти-ТІЛА/анти- ГТМЕ-о біспецифічних молекул в клітинах людини 293-6Е. Повнорозмірні послідовності анти-ТІ 1А/анти- ТМЕ-о; антигензв'язуючих білків Ї3-5сЕм наведені в Табл. | і М.
ПРИКЛАД 12
Способ очищення анти-ТІ ТА/анти-ТМЕс молекул Іді -5сЕм
І00387| Експресію Ідо-5сЕм здійснюють шляхом тимчасового продукування в 293. За один день до трансфекції культури вміщують у вісім колб ємністю 5 л ТПпотрзоп ШГга Уівій загальним об'ємом 2250 л культури при концентрації 8,5Е5 життєздатних клітин/мл в середовищах Егеевіуіе Е-17 (Тпепто
Еізпег). Культури витримують при 36-37 "С, 5 95 СОг2г і струшуванні при 120 об/хв. Трансфекційний комплекс одержують шляхом змішування середовищ Егеевіуе Е-17 з 0,5 мг/л ДНК із застосуванням 20
Фо кодуючої плазміди і 80 95 порожнього вектора ртТТ5 і ПЕ! в кінцевому об'ємі 10 95 від об'єму культури. Через чотири години в кожну колбу додають підгодівлю з лізатом дріжджів і глюкозою. Через шість днів після трансфекції клітини збирають шляхом центрифугування, об'єднують в пул і фільтрують. Середній титр за даними Еоге Віо Осіеї становить 25 мг/л.
Молекули Ідб-5сЕм обробляють хроматографією з аффінним захопленням Марбеїесі 5иКе (СЕ
Ше Зсієпсез, Піскатауей, штат Нью-Джерсі), із застосуванням ФСБ Дульбекко без двовалентних катіонів (Іпийгодеп, Карлсобад, штат Каліфорнія) як промивного буфера і 100 мм оцтової кислоти, рн 3,6, як буфера для елюації (Фіг. 10). Афінне розділення проводять при температурі навколишнього середовища. Пік елюації об'єднують на базі хроматограми, нейтралізують до рН 7,0 за допомогою основи 2 М трис, розбавляють одним об'ємом 10 мМ цитрату, 75 мМ лізину, 4 95 трегалози, рН 7,0, і концентрують до близько 20 мг/мл за допомогою центрифужного концентратора МімасеїІ-100 з граничним значенням мембрани 30 кДа (Запогив біедіт Віоїеси, Геттінген, Німеччина). Для видалення високомолекулярних агрегатів зразок фільтрують крізь фільтр з ацетату целюлози з розміром отворів 0,8/0,ю2 мкм, потім вміщують на препаративну колонку Бирегдех 200 (СЕ Ше
Зсіепсе5, Піскатауей, штат Нью-Джерсі), врівноважену 10 мМ цитрату, 75 мМ лізину, 4 95 трегалози, рН 7,0, та елююють тим же буфером з ізократичним градієнтом (Фіг. 11). Розділення гель-фільтрацією проводять при близько 7 "С. Пул одержують на базі хроматограми і аналітичної ЕХ фракції із застосуванням колонки 7епіх-С 5ЕС-300 (Зерах Тесппоіодієх, Ньюарк, штат Делавер). Пул додатково концентрують за допомогою центрифужного концентратора Мімазріп-20 з граничним значенням мембрани 30 кДа (Запогіцв бієдіт Віоїесі, Геттінген, Німеччина) і фільтрують крізь фільтр з ацетату целюлози з розміром отворів 0,8/0,2 мкм. Концентрацію визначають за поглинанням на довжині хвилі 280 нм із застосуванням коефіцієнта екстинкції близько 341000. Чистоту зразків визначають методом аналізу Саїїрег І арСпір у відновлювальних (з 2 95 2-меркаптоетанолу) і невідновлювальних (з 25 ММ йодацетаміду) (Фіг. 12) умовах. Аналітичну ЕХ проводять за допомогою колонки 2епіх-«С 5ЕС-300 (Зерах ТесппоЇодієз, Ньюарк, штат Делавер) з ізократичною елюацією в 50 мМ натрій фосфату, 250
ММ масі, рн 6,9, на 18 дюймах (Фіг. 13).
Через великий розмір Ід-5сЕм - 200 кДа або більше - в аналізі маси ІЕР-ЧП точна маса не була одержана. З метою верифікації маси та оцінки якості, проводять аналіз Ід-5сЕм після розщеплення протеазою Ідез5 (Рготеда, Медісон, штат Вісконсін), яка здійснює розщеплення трохи нижче дисульфідних зв'язків шарніра ідо, між залишками гліцину в мотиві послідовності СРРСРАРЕЇГ І С/Р, даючи (Раб)2 і Ес, злитий на своєму С-кінці з 5сЕм. Ід-5сЕм інкубують в присутності протеази Ідез із застосуванням співвідношення ферменту/субстрату 1:10 на протягом 1 години при 37 "С. Потім зразок розбавляють 1:1 0,1 95 ТФУ і 20 мкг інжектують для РХ-МО.
Аналіз маси проводять із застосуванням мас-спектрометра Адіепі 6230 ІЕР-ЧП і чотирьохкомпонентної системи ВЕРХ 1260, обладнаної колонкою 2ограх 30058-С8, 2,1 х 50 мм 3,5 мкм (Санта-Клара, штат Каліфорнія). Рухома фаза А складається з 0,1 95 ТФУ, а рухома фаза В складається з 90 95 н-пропанолу, 0,1 95 ТФУ у воді. Аналіз Ід-5:СсСЕмМ, розщепленого протеазою Ідез, проводять шляхом інжекції 20 мкг і елюювання із застосуванням наступного градієнта РХ: 2 95 рухомої фази витримують протягом 2 хвилин; 2-12 хв, 2-45 95 В; 12-16 хв, 45-90 95 В; 16-17 хв, 90 95 В.
Температуру колонки підтримують на рівні 75 "С, а постколонкове урівноваження при 20 95 рухомої фази В проводять протягом 7 хвилин перед інжекцією наступного зразка (Фіг. 14).
Приклад 13
Аналіз зв'язування з ТІ/1А 00391) Козиний анти-людський Ес (дасКзоп І аб, кат. Мо 109-005-098) спочатку іммобілізують на сенсорному чіпі ЗСМ5 за допомогою амінного сполучення. Моноклональні антитіла проти ТІЛА, фрагмент Раб (із застосуванням антитіла проти пиБабр, СЕ НеайПсаге, кат. Мо 28-9583-25) або анти-
ТІ1А/анти-ТМЕ-о біспецифічні молекули інжектують на чіп зі швидкістю 10 мкл/хв протягом 1 хвилини,
Різні білка ТІ ТА людини або яванського макака від 0,78 до 25 НМ в буфері для зразків (ФСБ, 0,005 95
Р2О, 01 мг/мл БСА) інжектують при швидкості потоку 50 мкл/хв для З3З-хвилинної асоціації, 10- хвилинної дисоціації. Швидкість асоціації, швидкість дисоціації і рівноважну константу дисоціації обчислюють із застосуванням моделі зв'язування 1:1 у програмному забезпеченні ВіАємаїчайоп.
В Табл. 13.1-13.3 представлені дані зв'язування з ТІ1А для антитіл проти ТІ14А, біспецифічних антитіл гетеро Ід і біспецифічних антитіл ІДб-5сгЕУ.
Таблиця 13.1
Зв'язування антитіл проти ТІ/ТА з ТЛА
ТАБ проти . о ТІЛА людини ТІЛА яванця
ТІЛА Білок ЕО1О МО: Ка (1/Мс)| ка (1/с) | КО (М) | Ка(1/Мс) | ка (1/с) | КО (М)
РІ-39112 | 50,52. | НД |«5,0Б-05|«1,0Б-10) 5,7Е-05 | 1,4Е-03 | 2,4Е-09
Вихідне ЗВ3| РІ-39114 66, 68 4,0Е--05 | 9,5Е-05 | 2,4Б-10 | 2,5Е--05 | 1,4Е-04 | 5,7Б-10
РІ-39115 ) 455,457 | 5,0Е-05 | 1,8Е-04 | З,6БЕ-10 | 2,9Е05 | 1,9Е-04 ) 6,6Б-10 17Е9 РІ-39113 | 459,461 |2,5Е05 | 5,3Б-05 | 2,2Б-10 | 7,3Е-05 | 2,0Е-03 | 2,8Е-09
РІ-39116 | 58,60 |1,6Е05 | 5,3Е-05 | 3,4Е-10 | 9,4Е-04 | 6,9Е-05 | 7,3Е-10 2383 РІ -36543 62, 64 4,7Е-05 | 4,2Е-04 | 8,9Е-10 | 2,3Е-05 | 3,2Е-04 |) 1,4Е-09 2511 РІ -36544 54, 56 1,7Е--05 | 1,8Е-04 | 1,1Є-09 | 6,6Е--04 | 4,9Е-05 | 7,3Е-10
Варіант ЗВ3| РІ-36552 | 130,134 | 4,3Е05 | 2,2Е-04 | 5,0Е-10 | 2,8Е--05 | 1,4Е-04 | 50-10
Таблиця 13.2
Зв'язування анти-ТІ ТА фрагмента Раб з ТІЛА
Анти-ТІ ЛА Біпок Мо ТІЛА людини ТІЛА яванця
Еаб ОЇ Ка (1/Мос) ка (1/с) КО (М) Ка (1/Мс) | ка (1/с) КО (М)
РІ -39193 -5,0БЕ-05 | «1,0Е-10 НС до 100 НМ
Вихідне ЗВ3 | РІ-39195 | 41Е-05 1,6Е-04 4,0БЕ-10 3,5Е-05 1,8Е-04 51-10
РІ-39196 | 4,7Е-05 | 3,3Б-04 | 7,0Е-10 | 4405 | 1,6Е-04 | 3,7Е-10 17Е9 РІ--39194 -5,0Б-05 | «1,0БЕ-10 НС до 100 НМ
РІ--39197 -5,0Б-05 | «1,0БЕ-10 -5,0Б-05 | «1,0БЕ-10 2383 РІ-38024 | 7,6Е-05 6,4Е-04 8,5Е-10 5,3Е05 1,6Е-04 3,1Е-10 2411 РІ--38025 -5,0Б-05 | «3,0БЕ-10 -5,0Б-05 | «1,0БЕ-10
Варіант З3ВЗ3 | РІ-38026 | 3,8Е-05 4Л1Е-04 11-09 4,5Е-05 5,6Е-05 1,3Е-10
Таблиця 13.3
Зв'язування біспецифічних антитіл гетеро Ід з ТІЛА анти-ТІЛА кас/мсе) | ка (мс) ко (М) 376541 варіант 383 (322520) 7Л1ЕО5 2ЛЕ-04 З,ОЕ-10 сертолізумаб 376542 б2г34 варіант 383 (322520) 71Е-05 2ЛЕ-04 З,ОЕ-10 376543 варіант 383 (322520) 7,2Е--05 2,3Е-04 З,2Е-10 сертолізумабу 349461 варіант 2511 5АЕО5 1,3Е-04 2,5Е-10 сертолізумабу 349463 2383 УНА 6,ЗЕО5 4,0Е-04 64-10 сертолізумабу 371222 3.2/06 варіант 383 (322520) 6,6Е--05 1,4Е-04 21Е-10
Приклад 14
Аналіз активності ТІЛА
Аналіз активності ТІ1ТА проводять із застосуванням репортерної клітинної лінії ТЕ-1 МЕ-кВ. Якщо коротко, 30 нг/мл (ЕС90) ТІ 1А людини або яванського макака інкубують з 104 репортерних клітин ТЕ-1
МЕ-кВ в присутності послідовних розведень антитіл проти ТІТА або анти-ТІА/анти-ТМЕ-о біспецифічних молекул на 9б6-лунковому планшеті при 37 "С протягом ночі. В кожну лунку додають 50 мкл розчину для тестування люциферази 5бієаау-діо (Рготеда). Планшет накривають та інкубують при струшуванні протягом 10 хвилин. Активність люциферази аналізують за допомогою зчитувача мікробета.
В Табл. 14.1-14.3 представлений контроль якості (КЯ) анти-ТІ1А і дані активності для антитіл проти ТІ1А, біспецифічних антитіл гетеро Ід, біспецифічних антитіл ІдО-5сЕм і Раб з ТІ1А людини і яванського макака.
Таблиця 14.1
Анти-ТІ 1А активність антитіл проти ТА і фрагментів Бар пПитІ ЛА (0,2 НМ) ТІЛА яванця (2 НМ) тА т/га МЕ-КВ ІСво НМ МЕ-КВ ІСо НМ 0,153 0,162 0,168
ТЕЗ 70,83 0,083 0,595 ний мВ 0434 0,037 0,390 плели Мт 0,647 0,058 0,622 0,223 0,938 шо 0,5 1,637 0,131 0,721 0,089 0,619 в 2992 2,629
Таблиця 14.2
КЯ і активність біспецифічних антитіл гетеро Ід 11110110 ЕХВЕРХ | 0 Сайреб | Активність
Кінце/ Кін- Основні МІ Мі нс| нос сі тіла | те іРБ Ме ТІЛА тМЕ-х | ва |цевийї ВМ" | вВ| в п . і 12111 2 | (пм) | (пм) конц.!| вихід 1 2 (вихідний) (варіант) сне естоня воморенн я (и| зе во юри (варіант) (варіант) 4 зене стінні, р Ген жо ов зви яю юр нини в (варіант) (МНа) сеесви Гете зоре пер я|ною юн нн, (варіант) пек сення дані, вк Гея зве ер еяе в ве|от (варіант) (варіант)
Таблиця 14.3
КЯ і активність біспецифічних антитіл Ід-5сЕм 11111111 ЕКВЕРХ | Сайреб | Активність
- Кін-
Кін- . це- Основн ТІЛА ТМЕ-о вве етно ме МИТ конц. . вихід
ТМЕ-о ТІЛА
ТІТА (383 злету тен ДУ ев тю змо тою нні в|н| ю
ТМЕ-о ТІЛА зов петса ДАО свеіет те ряз тер тре в
ТМЕ-о ТІЛА
ТІЛА
ТІЛА (ЗВЗ ТМЕ-о; зпен|ер |ро вер ниір| в|е1 ві
ТІЛА (ЗВЗ ТМЕ-о; виведе тери ог те | ||»
ТМЕ-о; 370018 | ТІ ТА(2383) (адаліму- /11,59|1121| 22 96,5 1,5 |100 14 | 157 25 маб)
ТМЕ-о; 370021 | ТІ ТА (2383) | (адаліму- 15,29) 321 100,0 | 1,93 7 93 14 | 139 24 маб /СсС)
Приклад 15
Аналіз зв'язування з ТМЕ-о;
Козиний анти-людський Ес спочатку іммобілізують на сенсорному чіпі 5СМ5 за допомогою амінного сполучення. Моноклональні антитіла проти ТМЕ, фрагмент Раб або ТІ ТА/ТМЕ біспецифічні молекули інжектують на чіп зі швидкістю 10 мкл/хв протягом 1 хвилини, Різні білки ТМЕ людини або яванського макака від 0,78 до 25 НМ в буфері для зразків (ФСБ, 0,005 95 Р20, 0,1 мг/мл БСА) інжектують при швидкості потоку 50 мкл/хв для З-хвилинної асоціації, 10-хвилинної дисоціації.
Швидкість асоціації, швидкість дисоціації і рівноважну константу дисоціації обчислюють із застосуванням моделі зв'язування 1:1 у програмному забезпеченні ВіАємаїЇчайоп.
В Табл. 15.1-145.3 наведена активність зв'язування з ТМЕ-х для антитіл проти ТМЕ-о, біспецифічних антитіл гетеро Ід, біспецифічних антитіл Ідс-5сЕм і біспецифічних антитіл І(дс-Рарб.
Таблиця 15.1
Активність зв'язування антитіл і фрагмента Бар проти ТМЕ-о з ТМЕ-о;
ТМЕ-а людини
Ка (1/МС) Ка (1/с) КО (М) Ка (1/МС) Ка (1/с) КО(М) 82 15ЕО6 | 7,3Б-05 | 48-11 | 90ЕН0О5 | 9,9Б-05 ) 11-10
Раб | 015025 | | 77701505 414 5ЗЕНОБ | 81-05 | 12-10 | 35ЕНО5 | 1,0Б-04 | 29-10 аб | 701-505 | 77777711 505 |. 234 15ЕС06 | 7,9Б-05 | 5О2Б-11 0 12БЕ06 | 1006-04 | 87-11 аб | 701-505 | 77777711 505
Адалімумаб 7,305 | б1Б-05 | 86Б-11 | 64ЕНО5 | 5,5Б-05 | 87-11 даліму 45305 1,4Б-04 | 32Е-0 | 36Е5 | 8лЕО5 | 2,3Е-10 севтеьмне понеа 39406 62-05 | 16Б-11 | бАЕОЄ | 22-03 | З5Е-ЛО
Таблиця 15.2
Активність зв'язування біспецифічних антитіл гетеро Ід з ТМЕ-о; анти-ТІЛА ка(п/Мс) | каси) | КОМ) 376541 | РІ -42786 Сеат варіант 383 (322520)| 3,2ЕО6 | 44-05" | 14-11 376542 | РІ -42789 С2г34 варіант 383 (322520)| 2,3Е-06 11Е-04 48-11 376543 РІ-42790 са варіант 383 (322520)| 3,6Е06 | 5,5Б-05 |) 1,6Б-11 349461 рРі-42787| Сертолізумаб варіант 2211 3,4Ез06 64-05 | 19-11 варіант 349463 |РІ-42788 / Сертолізумаб 2383 НА 3АЕО6 | ББЕ-05 | 1,6Е-11 варіант
Таблиця 15.3
Активність зв'язування біспецифічних антитіл Ї905-5сЕм з ТМЕ-о ка п/мс) | ка (мс) | ко (М) 369989 | РІ -42765 ТМЕта ТІЛА (908) 12Е-06 | 7,6Е-05 6б,бБ-11 (Адалімумаб) 369992. РІ -42770 | ПМЕ-а ТІЛА (9С8/СС) 12ЕчО6 | ВАЕ-05 | 7,3Е-11 (Адалімумаб) 369995 | РІ -42779 | ТМЕ--а (3.2) ТІЛА (908) 1,7Е-06 | 7,7Е-05 4 А4Б-11 370001 | РІ -42767 | ТМЕ--а (С234) ТІЛА (908) 1,7Е-06 | 9,9Е-05 5,9Б-11 370004 | РІ -42785 | ТМЕ--а (С234) ТІ ТА (9С8/СС) 1,706 | 1,0Е-04 5,9Б-11 370013 | РІ -42781 | ТІ ТА (9С8) ТМЕ--а (3.2) 1,3Е-06 | 8,68Е-05 6,5Б-11 370018 | РІ -42763 | ТІ 1А (2383) ТМЕ--а (Адалімумаб) | 1,106 | 5,3Е-05 5,0Б-11 370021 | РІ--42778 | ТІЛА (2383) со (Ядалімумаб 3 Е.06 49-05 | 45-11
ТМЕ-а ТІЛА 371213 | РІ -42771 (Адалімумаб) (383.322520/СС) 1,3Е-06 | 8,2Е-05 6,5Б-11
ТІЛА
371217 | РІ -42782 | ТМЕ--а (С234) (383.322520/СС) 1,9Е-06 | 8,68Е-05 4, вБЕ-11 371219 | РІ -42774 | ТІ 1А (383.322520).. | ТМЕ--а (3.2) 1,3Е06 | 5,5Е-05 4,2Б-11 371222 | РІ -42783 | ТІ ТА (383.322520)./ | ТМЕ--а (3.2/СС) 1,3Е-06 | 6,З3Е-05 4,7Б-11
Приклад 16
Аналізи активності ТМЕ-о
Аналіз активності ТМЕ-о проводять із застосуванням репортерної клітинної лінії ТЕ-1 МЕ-кВ. Якщо коротко, 1 нг/мл (ЕС90) ТМЕ-о людини або яванського макака інкубують з 104 репортерних клітин ТЕ-1
МЕ-кВ в присутності послідовних розведень антитіл проти ТМЕ-ох або ТІ 1ТА/-ТМЕ-о біспецифічних молекул на 96-лунковому планшеті при 37 "С протягом ночі. В кожну лунку додають 50 мкл розчину для тестування люциферази 5ієаду-діо (Рготеда). Планшет накривають та інкубують при струшуванні протягом 10 хвилин. Активність люоциферази аналізують за допомогою зчитувача мікробета.
В Табл. 16.1 представлений контроль якості (КЯ) анти- ТМЕ-о; і дані активності для антитіл проти
ТМЕ. У Табл. 14.2 і 14.3 представлена активність зв'язування з ТМЕ-о біспецифічних антигензв'язуючих білків гетеро Ід і біспецифічних антигензв'язуючих білків Ід-5сЕм, відповідно.
Таблиця 16.1
Анти-ТМЕ-о; активність антитіл проти ТМЕ-о і фрагментів Бар людини (20 пМ) 1/С50 (ПМ) | яванського макака (20 пмМ)
нн МЕКВ ІС50 (ПМ) МЕКВ 3105 2027 адалімумаб ви 1800 1,38 мкм
Активність зв'язування біспецифічних антигензв'язуючих білків з ТІ1А і ТМЕ-о людини і яванського макака визначають, як описано у Прикладах 13 і 15. Дані наведені в Табл. 17.1.
Таблиця 17.1
Активність зв'язування з ТІ ТА і ТМЕ людини і яванського макака
Активний Активний , , . Зв'язування з ТІЛА | Зв'язування з ТМЕ (Ка
Зразки фрагмент | фрагмент ІРЗ5 Мо (ка пм) ПМ) проти ТІЛА |проти ТМЕ-а
ТІЛА
Ни ТІЛА Ни ТМЕ ТМЕ яванця яванця
Гетеро-д | ЗВЗУ2 376543 юс-всгм | 9С8/СО 381505 юС-всгм | 9С8/6С | С234 381489 дс-всгм |3В3 Уг/СС зві5із | 8 | 66 | 719 | 23
Блокуючу активність біспецифічних антигензв'язуючих білків проти ТІТА і ТМЕ-ох людини і яванського макака визначають, як описано у Прикладах 14 і 16. Дані наведені в Табл. 17.2.
Таблиця 17.2
Блокуюча активність проти ТІЛА і ТМЕ-о; людини і яванського макака - | Активний
Активний фрагмент
Зразок | фрагмент проти ІР5 Мо Аналіз ТІ ТА ІС5о пмМ Аналіз ТМЕ ІСво пмМ проти ТЛА ТМЕ-а розчин- розчин- розчин- й розчин- й . мем пи| ний . мем пи ний ний Пи ний Пи яванця яванця
Гетерої/ зв3уо | серто- 376543| 45,5 | БОМ | 497 | 1011 | 9426 | беим
Іа лізумаб
Ідсб-зсЕмМІ 9С8/СС | Сб234 |381489 639,2 | 157,2
Для оцінки потенційного зв'язку генотипів ТІ ТА з експресією, геномна ДНК (гДНК) була виділена у здорових донорів МПК за допомогою набору Сепіга Ригедепе Тіззце від Оіадеп. Геномну ДНК генотипують із застосуванням аналізів генотипування ОНП ТадМап для гз7848647, Іізб478109, г56478108 і г53810936 аналізів від І ШеТеспй і стандартних протоколів на платформі цифрової крапельної ПЛР Віо-Кай. Якщо коротко, 10 нг гДНК від кожного донора змішують з дпРСК М5ирептіх для зондів (Віо-Кай) і аналізом генотипування ОНП ТадМап (СеТесі) для кожного ОНП, що представляє інтерес. Краплі генерують для кожної реакції із застосуванням генератора крапель
ОХхтоо М (Віо-Кад) і піддають циклічній термообробці на термоблоці для проведення реакцій С1000
Тоцсн "М (Віо-Кад). Після ампліфікації флуоресценцію крапель зчитують на крапельному зчитувачі
ОХ100 "М (Віо-Кад), і дані аналізують із застосуванням програмного забезпечення Опцапіазої (Віо-
Кад). Донорів відносять до гомозиготного гаплотипу ризику, якщо тільки алелі ризику присутні у всіх 4 генотипованих ОНП (із7848647, г56478109, г56478108 і 53810936). Донорів відносять до гомозиготного безризикового гаплотипу, якщо у всіх 4 генотипованих ОНП присутні тільки безризикові алелі. Донорів відносять до гетерозиготного гаплотипу, якщо як алелі ризику, так і безризикові алелі є у всіх 4 генотипованих ОНП. У донорів, яких відносять до «рекомбінантних», присутні тільки гомозиготні алелі ризику в І57848647, г56478109 і г56478108, але вони є гетерозиготними (присутні алелі ризику і безризикові алелі) по г53810936.
Наявність синонімічних ОНП (53810936) в екзоні 4 гена ТІ/ТА дозволило нам відслідковувати експресію алелів ризику проти безризикових алелів за допомогою цифрової крапельної ПЛР (цкПЛР) із застосуванням алельспецифічних флуоресцентних зондів в дослідженні дисбалансу експресії алелів (ДЕА). Частоту використання алелів ризику в порівнянні з безризиковими алелями в гетерозиготних МПК на базальному рівні або після стимуляції імунним комплексом оцінювали в різні моменти часу. Якщо коротко, МПК, гетерозиготні за генотипом ТІ14А, обробляють імунним комплексом протягом різних проміжків часу. Потім РНК виділяють з МПК із застосуванням набору КМеавзу тіпі з одноколонковим розщепленням ДНКазою І від Оіадеп. РНК з кожного зразка перетворюють на кДНК із застосуванням високопродуктивного набору для зворотної транскрипції КДНК відповідно до інструкцій виробника (І еТесі). Алельспецифічну експресію при г53810936 визначають із застосуванням аналізу для генотипування ОНП Тадмап, специфічного по відношенню до г53810936 (І ІГеТесі) і стандартних протоколів на платформі цифрової крапельної ПЛР Віо-Кайд. Якщо коротко, кількість КДНК на вході спочатку оптимізують для експресії ТМЕ5БЕ15 в кожен момент часу, щоб підвищити точність, максимізуючи кількість позитивних крапель, підраховують для кожного зразка програмним забезпеченням Оцапіазой. Оптимальну кількість КДНК на зразок змішують з 4аРСЕ М Зирептіх для зондів (Віо-Кай) і аналізом для генотипування ОНП ТадМап (ШетТесі) для Із3810936. Краплі генерують для кожної реакції із застосуванням генератора крапель ОХ100"М (Віо-Вай) і піддають циклічній термообробці на термоблоці для проведення реакцій С1000 Тоисп"М (Віо-Бай). Після ампліфікації флуоресценцію крапель зчитують на крапельному зчитувачі ОХ1Т00"М (Віо-Бай). Дані аналізують із застосуванням програмного забезпечення Оцапіабоїй (Віо-Кад) і визначають кількість копій/мл кожного алеля в г53810936. Співвідношення експресії алелів обчислюють шляхом поділу кількості копій алеля ризику/мл на кількість копій безризикового алеля/мл. Загальна кількість копій кожного алеля нормалізують за кількістю кДНК на вході (кількість копій/нг), а кратність індукції для кожного алеля в кожен момент часу обчислюють шляхом поділу кількості копій/нг в момент часу, що представляє інтерес, на початкове значення кількості копій/нг (0 годин). В дослідженні дисбалансу експресії алелів спостерігався більш високий ступінь індукції алеля ризику ТІ1А в МПК після обробки імунним комплексом, в порівнянні з безризиковим алелем у гетерозиготних МПК.
Винахідник(-и) ідентифікував(-ли) невелику кількість донорів, гомозиготних по алелях ризику в г57848647, г56478109 і г56478108, але гетерозиготних по г53810936, ймовірно, через рекомбінації між г56478109 і синонімічним ОНП І53810936. Оскільки ці донори є гетерозиготними по синонімічному ОНП г5381093, винахідник(-и) можуть відслідковувати використання алелів ризику і безризикових алелів та оцінювати, чи зберігався у цих донорів як і раніше дисбаланс експресії алелів. Цікаво, що в порівнянні з гетерозиготними донорами у зазначених рекомбінантних індивідуумів не було виявлено дисбалансу експресії алелів до або після стимуляції імунним комплексом. Це демонструє, що синонімічний ОНП г5381093 сам по собі не несе відповідальності за регулювання дисбалансу алелів. Регуляторні ОНП, ймовірно, походять з г57848647, г56478109, г56478108 і/або інших ОНП, розташованих в напрямку 5' відносно синонімічного ОНП г53810936.
Щоб оцінити, чи корелюють дані дисбалансу експресії алелів ТІ ТА з експресією локусів кількісних ознак (еЛКО), донорам МПК з гомозиготним алелем ризику ТІТА, гомозиготними безризиковими алелями або гетерозиготними алелями вводили імунний комплекс. РНК з кожного зразка виділяють і потім перетворюють на кКДНК, як було описано раніше. Загальну експресію ТІ ТА (ТМЕ5Е15) у кожного донора визначають за допомогою цифрової ПЛР. Якщо коротко, кДНК з кожного зразка змішують із аарРсСаАМ Зирегтіх для зондів (Віо-Кад) і аналізом РгітеТітефФ (КПЛР) ІО Нз.РТ.5ба.41003970. Краплі генерують для кожної реакції із застосуванням генератора крапель ОХ100"М (Віо-Кай) і піддають циклічній термообробці на термоблоці для проведення реакцій С1000 Тоисп"М (Віо-Кай). Після ампліфікації флуоресценцію крапель зчитують на крапельному зчитувачі ОХ100 "М (Віо-Кай). Дані аналізують із застосуванням програмного забезпечення Оцапіабой (Віо-Кай), а кількість копій
ТІЛА/мкл визначають і нормують за кількістю КДНК на вході (кількість копій/нг)у. Значення Р для відмінностей в рівнях експресії ТІ1А між різними гаплотипами ТМЕ5Е15 визначають із застосуванням
І-критерію Стьюдента. ТІ1А експресується на дуже низькому базальному рівні в МПК, але високою мірою індукується після стимуляції імунним комплексом. На базальному рівні, МПК донорів,
гомозиготних по ОНП ризику ТІЛА, містять менше мРНК ТІЛА в порівнянні з гомозиготними безризиковими донорами, хоча при дуже низькій кількості копій, що узгоджується з даними дослідження дисбалансу експресії алелів, яке продемонструвало більш низьке співвідношення алеля ризику в порівнянні з безризиковим алелем без стимуляції. Однак після стимуляції імунним комплексом в МПК донорів, гомозиготних по ОНП ризику ТІ/ТА, присутня більше висока експресія
ТІЛА в порівнянні з гомозиготними безризиковими донорами. Ці дані разом продемонстрували, що
ОНП ризику ТІЛА регулюють вищу індукцію ТІ/ТА. Винахідник(-и) припускають, що при таких запальних станах, як ЗЗК, у донорів, які несуть ОНП ризику ТІ 14А, скоріше за все, розвивається більш високий ступінь індукції Т/1ТА після зіткнення зі стимулами, такими як цитокіни, опсонізовані або неопсонізовані мікроби. Таким чином, ОНП ризику Т/ТА можна використовувати для стратифікації пацієнтів для інгібітору ТІ1А або анти-ТІ 1А/анти- ТМЕ-о біспецифічних інгібіторів.
Щоб оцінити, чи є регуляція експресії, опосередкована генотипом ТІЛА, специфічною для тканин, клітини НОМЕС від різних донорів генотипують, як було описано раніше. Генотиповані клітини НОМЕС від різних донорів обробляють ІЇ-1 в різні моменти часу. Загальну кількість копій кожного алеля вимірюють, як було описано раніше. Співвідношення експресії алелів обчислюють шляхом поділу кількості копій алеля ризику/мл на кількість копій безризикового алеля/мл. У клітинах НОМЕС не спостерігається дисбалансу експресії алелів, з обробкою ЇЇ -1 або без неї.
Приклад 19
Мишачі моделі ЗЗК
Для оцінки ролі ТІ1А в ЗЗК була проведена серія доклінічних експериментів на мишачих моделях
ЗЗК. Вплив інгібування ТІ1ТА оцінювали на моделі спонтанного коліту у мишей тага-/-. Ген Мапа кодує ген стійкості до множинних лікарських засобів для Р-глікопротеїну 170. Миші з нокаутом гена тата схильні до розвитку спонтанного коліту з 12-тижневого віку через ослаблений кишковий бар'єр.
Перебіг захворювання залежить від кишкових мікробів. У нашому експерименті самки Магпа-/- або контрольні тварини дикого типу ЕМВ були одержані від Тасопіс у віці 4-6 тижнів. Масу тіла тварин і активність клінічного захворювання регулярно контролювали. Оцінку активності клінічного захворювання здійснюють за допомогою підсумовування одержаних балів оцінки анального запалення (0 - відсутнє, 1 - легке, 2 - помірне, З - тяжке, 4 - ректальний пролапс) і консистенції випорожнень (0 ж нормальні, 1 - вологі/липкі, 2 - м'які, З - діарея, 4 - з домішкою крові). Мишей (п - 10, вік 6-7 тижнів) рандомізують у різні групи на базі вихідних показників активності клінічного захворювання і лікують внутрішньоочеревинним введенням один раз на тиждень 500 мкг антитіла проти мишачого ТІЛА, антитіла проти І 23р19, антитіла проти мишачого І/17КА або мишачого контрольного ізотипу або залишають без щотижневого лікування протягом 8 тижнів. Потім мишей умертвляють, одержують зрізи кишечнику та обробляють, фарбуючи Г.Е, перед оцінкою балів захворювання патологоанатомом. Наступний бал визначають на підставі гістопатологіїї 0 - нормальний; 1 - мінімальний, інфільтрація моноядерними клітинами і/або епітеліальна гіпертрофія/гіперплазія; 2 - легкий, інфільтрація моноядерними клітинами і/або епітеліальна гіпертрофія/гіперплазія; З - помірний, інфільтрація моноядерними клітинами і/або епітеліальна гіпертрофія/гіперплазія з рідкісними абсцесами крипт; 4 - виражений, те ж саме, що для 3, плюс рясні абсцеси крипт і випадання крипт іл або вогнищеве утворення виразок; 5 - тяжкий, те ж саме, що для 4, але з великими ділянками випадання крипт і/або великими ділянками утворення виразок. Статистичний аналіз проводять із застосуванням одностороннього АМОМА з критерієм Даннетта в порівнянні з групою тідс1. На закінчення, профілактичне лікування тАб проти ТІЛА інгібувало спонтанний розвиток коліту у мишей тата-/-.
Крім того, винахідник(-и) оцінював(-ли), чи буде введення білка ТІ ТА підсилювати розвиток коліту у мишей татпач-/-, які схильні до розвитку спонтанного коліту з 12-тижневого віку через ослаблений кишковий бар'єр. Мишам тагпа-/- або контрольним мишам дикого типу у віці 6-8 тижнів вводять внутрішньоочеревинно один раз на тиждень 150 мкг рекомбінантного гібридного білка тЕс-ТІ1А або контрольний ізотип тричі на тиждень протягом 4 тижнів. Моніторинг активності клінічного захворювання здійснюють шляхом оцінки анального запалення і консистенції випорожнень, як було описано раніше. Через 4 тижні лікування мишей умертвляють, одержують зрізи кишечнику і обробляють, фарбуючи ГЕ, перед оцінкою балів захворювання, як було описано раніше.
Статистичний аналіз проводять із застосуванням одностороннього АМОМА з критерієм Даннетта в порівнянні з групою тідс1. Введення білка ТІ ТА значно підсилює розвиток коліту у мишей тагта-/-, але не у мишей дикого типу.
Винахідник(-и) додатково дослідив(-ли) вплив введення ТІ1А на лімфоцити власної пластинки слизової оболонки у мишей тага-/- в порівнянні з мишами дикого типу. Якщо коротко, лімфоцити власної пластинки слизової оболонки виділяють, як було описано раніше (0'Єо0ига МУ/М еї аї., 9І, М168: 5566-5572, 2002). Якщо коротко, кишечник витягають, розрізають в поздовжньому напрямку, промивають буфером і розрізають на шматочки 0,5 см. Потім їх двічі промивають ЕДТА і супернатанти відкидають. Шматочки промивають КРМІ та інкубують в колагеназі/ДНКазі протягом 30 хвилин.
Виділені клітини пропускають через градієнт перколла і клітини, зібрані на інтерфазі, рарбують щодо поверхневих антигенів і аналізують методом ЕАС5. Введення ТІТ1А у мишей таїа-/- приводило до збільшення вмісту запальних клітин у власній пластинці слизової оболонки.
Приклад 20
Фармакодинамічні дослідження
Щоб оцінити, чи спричиняє введення ТІТА і ТМЕ подібні або різні фармакодинамічні ефекти, мишам С57ВІ/6 (8 тижнів, самки) спочатку вводять внутрішньоочеревино 500 мкг/мишу антитіла проти мишачого ТІТА, антитіла проти мишачого ТМЕ-х або ФСБ. Через 4 години мишам вводять 100 мкг/мишу ТІ1А або 10 мкг/мишу ТМЕ-сх або залишають без введення. Сироватку збирають через 24 години. Цитокіни вимірюють за допомогою МСОД (1-22 вимірюють за допомогою ІФА). Введення білка
ТІЛА або ТМЕ у мишей приводило до індукції різних цитокінів. Введення ТІЛА індукувало головним чином ІЕМ-у і ІС-5, тоді як введення ТМЕ індукувало 1-6, ІІ -8 і 1-10.
Винахідник(-и) оцінював(-ли) індукцію цитокінів в МПК людини при обробці ТІ/ТА або ТМЕ. Якщо коротко, свіжовиділені МПК з крові людини культивують в середовищах (КРМІ1640 з додаванням 10 90
СТЕ, 2 мМ глютаміну, 1 мм натрій пірувату, 5 х 10-5 М 2-МЕ ії антибіотиків) в присутності 100 нг/мл
ТІЛА або ТМЕ-са людини. Супернатант збирають через 72 години. Цитокіни в супернатанті вимірюють за допомогою МСОД (11-22 вимірюють за допомогою ІФА). Подібно до експерименту з введенням мишам, обробка ТІЛА МПК людини приводила до індукції ІЕМ-у, І/-5 і І/-22, тоді як обробка ТМЕ приводила до підвищення рівня 1-8, 1-10 ії МСР-1. Таким чином, ТІЛА ї ТМЕ індукують різні профілі цитокінів в МПК людини.
Приклад 21
Молекули Ідо-Бар
Біспецифічні антигензв'язуючі білки були одержані з підмножиною антитіл проти ТМЕа і антитіл проти ТІ1А. В деяких варіантах реалізації такого формату Ідо-Раб, поліпептид, що містить домен МН-
СНІ з другого антитіла, злитий через пептидний лінкер з карбокси-кінцем важкого ланцюга першого антитіла з утворенням модифікованого важкого ланцюга. Поліпептид, що містить решту доменів фрагмента Раб з першого антитіла (тобто, домен МІ -СІ), експресують разом з легким ланцюгом першого антитіла і модифікованим важким ланцюгом для одержання повнорозмірної молекули.
Збирання повнорозмірної молекули дає чотирьохвалентний зв'язуючий білок, який містить два антигензв'язуючих домени проти першого антигену, розташовані на аміно-кінцевій стороні димеризованої ділянки Ес імуноглобуліну, і два антигензв'язуючих домени проти другого антигену, розташовані на карбокси-кінцевій стороні димеризованої ділянки Ес. (00424| ТМЕа/ГІ1А ІдсоС-Бар складається з двох антигензв'язуючих доменів, один спрямований проти ТМЕа, а інший проти ТІ1А. Молекули ДНК, які кодують молекули ТМЕеЕОо/ТІ1А ІдО-Раб, містять фрагменти, що кодують легкий ланцюг антитіла проти ТМЕс (або проти ТІ1А), важкий ланцюг антитіла проти ТМЕс (або проти ТІ 1А), злитий на своєму С-кінці з (ї) легким ланцюгом антитіла проти ТІ 1А (або проти ТМЕа) або (ії) анти-Т/1А (або анти-ТМЕсо) Ба (МН-СНІ) і третій поліпептид, що містить другу половину фрагмента Раб для завершення карбокси-кінцевого зв'язуючого домену; наприклад, (ї) анти-
ТІЛА (або анти-ТМЕа) Га або (ії) легкий ланцюг антитіла проти ТІ1А (або проти ТМЕа). Біспецифічні молекули Ідо-Раб містять мутації зарядової пари, що вводяться в домени СНІ і Сі. кожної ділянки Бар (Раб 1 ї Раб 2, як зображено на Фіг. 3). Зарядові пари призначені для забезпечення переважного збирання пари анти-ТМЕАК легкого ланцюгал/НеНІ (Ра) і пари анти-ТІ ТА легкого ланцюгал/НСНІ1 (г4). Як додатковий підхід, що сприяє правильному спарюванню пари легкого ланцюга/УнснІ (РЕ), для підмножини генерованих молекул Ідо-Раб, ділянки СІ і СНІ в карбокси-кінцевому Раб (тобто, Бар 2) були поміняні місцями таким чином, що поліпептид, злитий з карбокси-кінцевою ділянкою важкого ланцюга другого антитіла, містив ділянки МІ ї СНІ з першого антитіла, а другий поліпептид містив ділянки МН і СІ з першого антитіла, Див. молекули, наведені в Табл. 21.1 і 21.3, із СОК МІ ії МН, наведеними в Табл. 21.2А і 21.2В, і чистотою, зазначеною в Табл. 21.4. Молекули ДНК були одержані синтезованими ОВіоскК і клоновані у вектор рТТ5.1. Такі вектори експресії використовують для трансфекції та експресії біспецифічних молекул ТМЕа/ТІ1А в клітинах людини 293-6Е. Одержано 144 різних біспецифічних молекули Ідс-Бар. Повнорозмірні послідовності для кожної молекули представлені у Табл. 21.1 і в Переліку послідовностей.
Молекули Ідо-Раб очищують із застосуванням хроматографії з афінним захопленням Мабрзе!їесі
ЗИцКе (СЕ Ме Зсіепсе5, Піскатауей, штат Нью-Джерсі) за допомогою широкоформатного автосамплера (ІБА5, Атдеп, Іпс., Таузанд-Окс, штат Каліфорнія). Освітлені, кондиційовані середовища вміщують на колонку НіТтар Марзеїесі 5иКе 1 мл (СЕ І їе 5сіепсе5, Піскатауей, штат
Нью-Джерсі), врівноважену буферизованим фосфатом фізіологічним розчином Дульбекко без двовалентних катіонів (Д-ФСБ, І їе ТесппоЇодієз, Гранд-Айленд, штат Небраска).
Колонки МарзЗеІесїі промивають 8 об'ємами колонки Д-ФСБ та елююють 100 мМ оцтовою кислотою, рН 3,6. Якщо поглинання елюатів білка А на довжині хвилі 280 нм становить більш ніж 5
МЕП, (тА) то елюент безпосередньо вміщують на знесолювальну колонку НіТгар (СЕ І Ге Зсіепсев,
Піскатауей, штат Нью-Джерсі) і обробляють 1,2 об'ємами колонки 10 мМ натрій ацетату, 150 мм Масі,
рН 5.0. Якщо поглинання знесолених елюатів на довжині хвилі 280 нм становить більш ніж З МЕП (тА), то запускається збір зразків, і фракції збирають в 9б-лункові блоки з глибокими лунками до максимального об'єму 2 мл кожної. Чистоту зразка визначають аналізом Саїїрег ГарсСпір у відновлювальних (з 2 95 2-меркаптоетанолу) і невідновлювальних (з 25 мМ йодацетаміду) умовах.
Аналітичну ЕХ проводять із застосуванням колонки 7епіх-С 5ЕС-300 (Зерах Тесппоіодієх, Ньюарк, штат Делавер) з ізократичною елюацією в 50 мМ натрій фосфаті, 250 мМ Масі, рн 6,9, на 8 дюймах.
Молекули Ідо-БРар тестують щодо можливості експресії (титр і вихід) та активності. Результати представлені на Фіг. 27-33 і в Табл. 21.3. В Табл. 21.3 і всюди «ада» відноситься до адалімумабу.
Аналіз активності ТІ1ТА проводять із застосуванням репортерної клітинної лінії ТЕ-1 МЕ-кВ. Якщо коротко, 30 нг/мл (ЕС90) ТІ 1А людини або яванського макака інкубують з 104 репортерних клітин ТЕ-1
МЕ-кВ в присутності послідовних розведень антитіл проти ТІ/ТА або ТІТА/ТМЕ-о біспецифічних молекул на 96-лунковому планшеті при 37 "С протягом ночі. В кожну лунку додають 50 мкл розчину для тестування люциферази 5ієаду-діо (Рготеда). Планшет накривають та інкубують при струшуванні протягом 10 хвилин. Активність люциферази аналізують за допомогою зчитувача мікробета.
Аналіз активності ТМЕс; проводять із застосуванням репортерної клітинної лінії ТЕ-1 МЕ-КВ. Якщо коротко, 1 нг/мл (ЕС90) ТМЕ-о людини або яванського макака інкубують з 102 репортерних клітин ТЕ-1
МЕ-кВ в присутності послідовних розведень антитіл проти ТМЕ-х або ТІТЛА/ТМЕсо біспецифічних молекул на 96-лунковому планшеті при 37 "С протягом ночі. В кожну лунку додають 50 мкл розчину для тестування люциферази 5ієаду-діо (Рготеда). Планшет накривають та інкубують при струшуванні протягом 10 хвилин. Активність люоциферази аналізують за допомогою зчитувача мікробета.
Таблиця 21.1
Амінокислотні послідовності анти-ТІ1А анти- ТМЕ-о; молекули Ідо-Рар
Позначення Легкий Легкий Важкий молекул Джерело до, джерело Раб, ак заміни ланцюг 1 ланцюг 2 |ланцюг 5ЕО
Н(РЗ Ме) ЗЕО ПО МО | БЕО ІЮ МО Ір МО 001 Адалімумаб Ід0.001 3В3мУ2 376597 "МН СНІ(5183Е) 1254 1256 1258 002 Адалімумаб Ідс.001 9028 М 376601 Н СНІ (5183Е) 1260 1262 1264 003 Адалімумаб Іда.001 2383 376605 УнаА УНН. СНІ(5183Б) 1266 1268 1270 376609 004 3.2 ІДС.001 З3ВЗ3мМ2 МН СН 1(5183Е) 1272 1274 1276 376613 005 3.2 ІдДСс.001 908 МН СНІ (5183Е) 1278 1280 1282 376617 006 3.2 ІдДСс.001 2383 МНА МН. СНІ (5183Е) 1284 1286 1288 007 З383м2 Ід0.001 Адалімумаб 376621 "МН СНІ(8183Е) 1290 1292 1294 376625 008 З3В3м2 Ідс.001 3.2 МН СН 1(5183Е) 1296 1298 1300 009 9С8 Ід0.001 Адалімумаб У 376629 Н сНІ(5183Є) 1302 1304 1306 376633 010 9С8 Іда.001 3.2 МН СНІ (5183Е) 1308 1310 1312 011 2383 МУНА 190.001 Адалім 376637 умаб УН. СНІ(8183Є) 1314 1316 1318 376641 012 2383 УНА ІдС.001 3.2 МН. СНІ (5183Е) 1320 1322 1324 013 Адалімумаб СК(5176К) Ес 376645 /З3В3у2 МН СН 1 (5183Е) 1326 1328 1330 014 Адалімумаб СК(5176К) Ес 376651 есв УН СНІ (5183Є) 1332 1334 1336 015 Адалімумаб СК(5176К) Ес 376655 "2383 УН4А УН СН 1 (5183) 1338 1340 1342 016 3.2 СІ (5176К) Ес З3В3м2 У 376659 Н СНІ(5183Е) 1344 1346 1348 376665 017 3.2 СІ (5176К) Ре 968 МН. СНІ (5183Е) 1350 1352 1354 018 3.2 СІ (5176К) Ес 2383 У 376669 НА ун СНІ(5183Б) 1356 1358 1360
Таблиця 21.1
Амінокислотні послідовності анти-ТІ1А анти- ТМЕ-о; молекули Ідо-Рар
Позначення Легкий Легкий Важкий молекул Джерело до, джерело Раб, ак заміни ланцюг 1 ланцюг 2 |ланцюг 5ЕО
Н(РЗ Ме) ЗЕО ІО МО | БЕО ІЮ МО ІЮ МО 019 З3В3мМ2 СК(5176К) Ес 376673 Адалімумуб МН. СНІ(5183Е) 1362 1364 1366 020 3ВвЗ3мМ2 СК(5176К) Ес 3.2 376679 УН. СНІ(5183Е) 1368 1370 1372 021 9С8 СК(5176К) Ес Адалім 376683 умаб УН. СНІ(5183Є) 1374 1376 1378 376689 022 908 СК(5176К) Ре 3.2 МН. СНІ (5183ЄЕ) 1380 1382 1384 023 2383 УНА СК(5176К) Ес 376693 Адалімумаб. УН. СН 1 (5183Е) 1386 1388 1390 024 2383 УНА СК(5176К) Ес 376699 32 УН СНІ(5183Е) 1392 1394 1396 025 Адалімумаб Ідс.001 3ВЗмУ2 376703 "МН СК(5176Е) МА 1398 1400 1402 026 Адалімумаб Ід0.001 908 У 376709 Но сК(8176Е) 1404 1406 1408 027 Адалімумаб Ідс.001 2383 376715 Уна УН. СК(5176Е) 1410 1412 1414 376721 028 3.2 ІДа.001 З3В3мМ2 МН СК (5176Е) 1416 1418 1420 376725 029 3.2 ІДС.001 908 МН СК(5 176Е) 1422 1424 1426 376729 030 3.2 їдДСс.001 2383 МНЯА МН. СК(5176Е) 1428 1430 1432 031 383м2 Ід0.001 Адалімумаб 376733 ун сК(8176Е) 1434 1436 1438 376739 032 З3В3м2 Іда.001 3.2 МН СІ (5176Е) 1440 1442 1444 033 9С8 Ід0.001 Адалімумаб 376745 МН СК(8176Е) 1446 1448 1450 376750 034 908 Ідс.001 3.2 МН СІ (51 76Е) 1452 1454 1456 035 2383 УНА 190.001 Адалім 376755 умаб УН СК(5176Е) 1458 1460 1462 376760 036 2383 УНА Ідс.001 3.2 МН. Ш СІ(5176Е) 1464 1466 1468 037 Адалімумаб СК(5176К) Ес 383 м2 376765 УН СК(5 176Е) 1470 1472 1474 038 Адалімумаб СК(5176К) Ес 376770 с9с8 ун СК(5176Е) 1476 1478 1480 039 Адалімумаб СК(5176К) Ес 376775 2383 УНА МН СК(5 176Е) 1482 1484 1486 376779 040 3.2 С1(5176К) Рс 3В83м2 МН. СК(5176Е) 1488 1490 1492 376784 041 3.2 С1(5176К) с 908 МН. СК(5176Е) 1494 1496 1498 042 3.2 СІ (5176К) Ес 2383 У 376789 НА ун СК(5176Е) 1500 1502 1504 043 ЗВ3мМ2 СК(5176К) Ес 376793 Адалімумаб МН СК(5176Е) 1506 1508 1510 376797 044 3Вв3мМ2 СК(5176К) Ре 3.2 МН СІ (5176Е) 1512 1514 1516 045 9С8 СК(5176К) Ес Адалім 376801 умаб УН СК(5176Е) 1518 1520 1522 376806 046 908 СК(5176К) Ре 3.2 МН ШЩ СІ(5176Е) 1524 1526 1528 047 2383 УНА СК(5176К) Ес 376811 Адалімумаб УН. СК(8176Е) 15530 1552 1534 048 2383 УНА СК(5176К) Ес 376816 32 УН Су(8176Е) 1536 1538 1540
Таблиця 21.1
Амінокислотні послідовності анти-ТІ1А анти- ТМЕ-о; молекули Ідо-Рар
ДЮ втиенолюютькнню со ве и молекул Джерело до, джерело Раб, ак заміни ланцюг 1 ланцюг 2 |ланцюг 5ЕО
Н(РБ Мо) ЗЕО ПО МО | ЗЕО ІЮ МО І МО
Таблиця 21.1
Амінокислотні послідовності анти-ТІ1А анти- ТМЕ-о; молекули Ідо-Рар
Позначення Легкий Легкий Важкий молекул Джерело до, джерело Раб, ак заміни ланцюг 1 ланцюг 2 |ланцюг 5ЕО
Н(РЗ Ме) ЗЕО ІО МО | БЕО ІЮ МО ІЮ МО 085 Адалімумаб Ідс.002 2383 376955 УнНА УН. СК/(5 176Е).001 1698 1700 1702 376962 1086 3.2 Ідс.002 3ВЗм2 МН СК (5176Е).001 1704 1706 1708 376967 1087 3.2 Ід0.002 908 МН СК(5 176Е).001 1710 1712 1714 088 3.2 ІДа.002 2383 УНА УН 376972 /СК(8176Е).001 1716 1718 1720 089 3В3м2 Ідо.002 Адалімумаб 376976 "МН СК(5176Е).001 1722 1724 1726 376983 090 ЗВЗ3м2 Іда.002 3.2 МН СІ. (5176Е).001 1728 1730 1732 091 9С8 Ід0.002 Адалімумаб У 376990 Н СК(8176Е).001 1734 1736 1738 376995 092 908 Ідс.002 3.2 МН СІ (51 76ЄЕ).001 1740 1742 1744 093 2383 УНА 190.002 Адалім 377000 умаб УН. СК(5 176Е).001 1746 1748 1750 094 2383 УНА ІдО.002 3.2 УН 377005 Су(8176Е).001 1752 1754 1756 095 Адалімумаб СК(5176К) Ес. 001 383 377010 м2. ун. СК(5 176Е).001 1758 1760 1762 096 Адалімумаб СК(5176К) Ес. 377015 1001 9с8 УН СК(5176Е).001 1764 1766 1768 097 Адалімумаб СК(5176К) Ес. 001 2383 377020 УНА УН СК(8176Е). 001 1770 1772 1774 098 3.2 СІ (5176К) Ес.001 ЗВЗмУ 377025 2 УН СК(8176Е).001 1776 1778 1780 099 3.2 СІ (5176К) Рс.001 908 377030 УН. СК(8176Е).001 1782 1784 1786 100 3.2 СІ (5176К) ЕРс.001 2383 377035 "Уна МН СК(5 176Е).001 1788 1790 1792 101 3ВвЗм2 СК(5176К) Ес.001 377040 Адалімумаб УН СК(8176Е).001 1754 1796 1798 102 3ВвЗм2 СК(5176К) Ес.001 377045 32. УН. СЦ8176Е).001 1800 1802 1804 103 908 СК(5176К) Ес.001 377050 | ддалімумаб МН. СК(5 176Е).001 1806 1808 1810 104 908 СК(5176К) Ес.001 3.2 377055 "МН СІ(5176Е).001 1812 1814 1816 105 2383 УНА СК(5176К) Ес.001 377060 | ддалімумаб МН СК(5176Е). 001 1818 1820 1822 106 2383 УНА СК(5176К) Ес.001 377064 32 МН Су 176Е).001 1824 1826 1828 117 Адалімумаб Ідо.003 З3В3м2 377068 "МН СНІ(5183Е).002 1830 1832 1834 118 Адалімумаб Ідо.003 908 М 377072 Н СНІ(8183Е).002 1836 1838 1840 119 Адалімумаб Ідб.003 2383 УН4А УН СНІ 377077 (5183Е).002 1842 1844 1846 377082 120 3.2 ІДа.003 З3В3М2 УН СН 1(5183ЄЕ).002 1848 1850 1852 377087 121 3.2 ІДа.003 908 МН СНІ (5183ЄЕ).002 1854 1856 1858
Таблиця 21.1
Амінокислотні послідовності анти-ТІ1А анти- ТМЕ-о; молекули Ідо-Рар
Позначення Легкий Легкий Важкий молекул Джерело до, джерело Раб, ак заміни ланцюг 1 ланцюг 2 |ланцюг 5ЕО
Н(РЗ Ме) ЗЕО ПО МО | БЕО ІЮ МО ІЮ МО 122 3.2 ІдДа.003 2383 УНА УН 377092 /"СНІ(5183Е).002 1860 1862 1864 123 383У2 Ідс.003 Адалімумаб 377097 "МН СНІ(5183Е).002 1866 1868 1870 377102 1124 ЗВ3м2 ІдО.003 3.2 МН СН 1(5183Е).002 125 928 Ід0.003 Адалімумаб МУ 377107 Н СНІ(8183Е).002 1878 1880 1882 3771112. |126 928 Ід0.003 3.2 МН СНІ (5183Е).002 1884 1886 1888 127 2383 УНА Ідб.003 Адалім 377116 умаб УН. СНІ(5183Е).002 1890 1892 1894 128 2383 УНА Іда.003 3.2 УН 377121 "СНІ(8183є).002 1896 1898 1900 129 Адалімумаб СК(5176К) Ес. 002383 377126 у? ун. СН 1 (5183Е).002 1902 1904 1906 130 Адалімумаб СК(5176К) Ес. 377133 10029С8УНСНІ (5183Е).002 1908 1910 1912 131 Адалімумаб СК(5176К) Ес. 002 2383 377138 УНА УН СНІ(5183Е).002 1914 1916 1918 132 3.2 СІ (5176К) Ес.002 ЗВЗм 377142 2 УН СНІ(5183Е).002 1920 1922 1924 377148 133 3.2 СІ (5176К) 002 1926 1928 1930 134 3.2 СІ (5176К) Ес.002 2383 377152 "МНаА УН СНІ(5183Е).002 1932 1934 1936 135 3В83у2 СК(5176К) Ес.002 Адалімумаб 377156 УН СНІ(5183Е).002 1938 1940 1942 136 З3В3мМ2 СК(5176К) Рс.002 377162 3.2 УН. СНІ(5183Е).002 1944 1946 1948 137 908 СК(5176К) Ес.002 377166 Адалімумаб МН СН 1 (5183Е).002 1950 1952 1954 138 908 СК(5176К) ЕРс.002 3.2 139 2383 МНА СК(5176К) Рс.002
Адалімумаб МН СНІ(5183Е).002 1962 1964 1966 140 2383 УНА СК(5176К) Ес.0023.2УНСНІ
ЗГТ (вівЗЕ)О02 1368 141 Адалімумаб Ідо.003 З3ВЗм2 377186 "мн СК(5176Е).002 1974 1976 1978 142 Адалімумаб Ідо.003 908 М 377193 н сК(8176Е).002 1980 1982 1984 143 Адалімумаб ІдО.003 2383 377200 Уна УН. СК(5 176Е).002 1986 1988 1990 144 3.2 ІДа.003 ЗВ3М2 УН СК (5176Е).002 1992 1994 1996 377212 145 3.2 Ідс.003 908 МН СК(5 176Е).002 1998 2000 2002 146 3.2 ІдДа.003 2383 УНА УН "сК(8176Е).002 2004 2006 2008 147 383У2 Ідс.003 Адалімумаб 377222 "Мн СК(8176Е).002 2010 2012 2014 377229 148 З3ВЗ3м2 Іда.003 3.2 МН СІ. (5176Е).002 2016 2018 2020
Таблиця 21.1
Амінокислотні послідовності анти-ТІ1А анти- ТМЕ-о; молекули Ідо-Рар
Позначення Легкий Легкий Важкий молекул Джерело до, джерело Раб, ак заміни ланцюг 1 ланцюг 2 |ланцюг 5ЕО
Н(іРБ Ме) ЗЕО ПО МО | БЕО І МО ІО МО 149 928 І905.003 Адалімумаб М 377236 н сК(8176Е).002 2022 2024 2026 377241 150 928 Ід0.003 3.2 МН СІ (51 76Е).002 2028 2030 2032 151 2383 УНА ІдО.003 377246 |ддадлімумаб МН. СК(З5 176Є).002 2034 2036 2038 152 2383 УНА Іда.003 3.2 УН 377251 Су(8176є).002 2040 2042 2044 153 Адалімумаб СК(5176К) Ес. 377256 002 3В3ЗмМ2 МН СК(5176Е).002 2046 2048 2050 154 Адалімумаб СК(5176К) Ес. 377261 1002 9с8 МН СК(З 176Е).002 2052 2054 2056 155 Адалімумаб СК(5176К) Ес. 002 2383 377266 Уна ун СК(8176Е). 002 2058 2060 2062 156 3.2 СІ (5176К) Ес.002 ЗВЗмУ 2 МН СК(5176Е).002 2064 2066 2068 157 3.2 СІ (5176К) Рс.002 908 158 3.2 СІ (5176К) Рс.002 2383 УНА УН
ЗГТ2В1 ск(Б176Е)О02 гово 159 ЗВ3м2 СК(5176К) Ес.002 377286 Адалімумаб УН СК(8176Е).002 2082 2084 2086 160 3В3м2 СК(5176К) Ес.002 З 377290 -2 МН. С(8176Е).002 2088 2090 2092 161 908 СК(5176К) Ес.002 377295 Адалімумаб УН СК(8176Е).002 2094 2096 2098 162 908 СК(5176К) Ес.002 3.2 377300 "МН СІ(5176Е).002 2100 2102 2104 163 2383 УНА СК(5176К) Ес.002 377305 | ддалімумаб МН СК(5176Е). 002 2106 218 2710 164 2383 УН4А СК(5176К) 377310 Ес.002 3.2 МН СІ(5176БЕ).002 2112 2114 2116
Вищезазначені амінокислотні послідовності кодуються послідовностями нуклеїнової кислоти, що безпосередньо передують їм у Переліку послідовностей.
Послідовності СОК доменів М. і МН вищенаведеного представлені у Табл. 21.2А і 21.28 нижче.
Таблиця 21.2А послідовності СОК МІ. анти-ТДТА/анти- ТМЕ-с ІДа-Баб сові сові СоВІЗ
А ТЕ сас,абатоСсСАсааААТОоСО | ФОССасСсСтоСпАСТО | САСАСАТАСАдСС
НИ ІНК ОААТТАССТСОСА ТТСАСАСТ САССОССТТАСАСА
(дделім маб 5ЗЕОІО МО:957 5ЗЕОЮ МО: 959 5ЗЕОІЮ МО: 960
І даліму дк ВАбОСІВМУГА АА5ТІО5 ОВУМАВАРУТ 5ЗЕО ІЮ МО:92 ЗЕОЇІЮО МО: 242 ЗЕОЇЮ МО: 96
АСсСТааСАаСАСТТССААСАТ САаТтоСтТАТОАСАС днти-тМЕ- | 0 |СООСОСАОСТТАТСАТСТАС СОТ |САоСстоАСТОСТТ альфа (3.2) АС савата 5ЗЕО ІЮ МО:962 ЗЕО ІО МО: 965 ЗЕО ІО МО: 1189
АК емо ее ев
АСОСССАСТСАСАСТОТТА |ОСТОСАТССАОС |САССАСТАТОСТА
ТІТА(ЗВЗУ2)
АНТИ-ТІТА ко ІААСТАТТАМАХ ТОСАААСТ ТАССССТСОСАСО (9Сс8)
АК
"Є ВЕаіюмою вва омолта ото Мо о
АСОТССАОССАСАСТОТОТТ | ТОООСАТСТАССС | САССААТАТТАТАА нк о |АТАСАОСТОСААСААТААВА | СсдААТСС САСТОСТСТСАСТ
Анти-ТИА АСТАСТТАСТТ (2383)
Таблиця 21.28: послідовності СОК УН анти-ТІ ТА/анти- ТМЕ-со: ІДа-Раб
СССАТТАСОТОСААТА
НК АТ ТОСАСАСАСТОТОСА |ОСТТоОТСОСтТоОАСТАТ альфа ссос (Адалімумаб )
АТСАТСТАТСТТОСТО
АССТАСТОСАТСО |АСТСАСАТАССАСАТА | АСТААСТОСОСТСТТОА нк сс САССССОТССТТОСАА |СТАС альфа (32)
СААЛАТСААТСАТОСТО | ССАТАТТОТАСААСТАС
Анти-ТІЛА СССатссстсААСАСТ |С (3ВЗмг)
АСТТАСТТСТОСА | АТАТСТАТТАСАСТО | дААсТоССАССТАСТА нко сс СОСАСАССАДАТАСАА | СоостТтОАСТАС
Анти-ТІЛА ССССТОССТСААСАСТ (9с8)
АССАСАТАСТАСАССТ
АНТИ ТА АССААСАСТСТТО |ССААСТОСТАТААТСА | ЗО ОКТ (2383) НК |СтТосААС ТТАТо С АСТТТСТСТО |САСсТо
А АААСТ
Таблиця 21.28: послідовності СОК УН анти-ТІ ТА/анти- ТМЕ-со: ІДа-Раб сОоВвні совна совнЗ
ВАТУ КМУУМ ЮОМАМУ5
ТМ5МАМ/М ЕОСОЮБУУВУаМОМ
АК ІК5
ЗЕО ІЮ МО: 182 ЗЕОІЮ МО: 196 ЗЕО ІЮ МО: 186
Таблиця 21.3
Титр, вихід і активність Їд-Бар ' ' пОТТА по Та . Обмін Вихід пи ТІЛА - пи ТМЕа .
ЗМІНИ ЗМІНИ
376597 | /МРа 1 ПА 00 |вБезобміну | 63,5 |Ббоввов| 497,3 |3653704 875 0,603 448 (ада) (3В3м2) з7ввої Ра 0 )1ТЛА 0 Їрвезобмну | 494 |4446469| 436,5 0903974 965 0665517 (ада) (928) з7ввов |МРа |ТА | везобмну м 46 |37,35632 689,6 | 556129 | 941,7 |6494 483 (ада) (2383)
ТМЕа ТА '
ТМЕа ТА '
ТМЕга ТА ' з7б6б21 |НА О|ТМРа о |вБезобмну м 53 |5523171) 663 1227778) 333 |0229 655 (З383м2) )/(ада)
ТЛА (ТТМЕа ' з7ввго |ТА 0О|ТМРа | везобміну Їм ав |азио7о6| 4421 | 094106) 224 0154 483 (928) (ада)
ТЛА ТТМЕа ' 376637 |НА О|ТМРа о |вБезобмну м 459 |43,74483) 348,8 |2,812903| 27,5 |0,189 655 (2383) (ада)
ТЛА ТТМЕа ' з7ввав Ма 0 )плА 0 |Мкінцевий | БВ |леБовви| 4391 2575926) 131. 0,903 448 (ада) (З3В3М2) | обмін зубв5і |Мба |ТА 00|Мкінцевий | 57з | 783602 | 337,8 |2237086 157,5 1,086 207 (ада) (908) обмін з7бвв5 Ма 0 )ПлА 0 фМкінцевий |, 654 |6945786| 2002 |1614516 1985 1,368 966 (ада) (2383) обмін
ТМЕга ТІЛА М-кінцевий
ТМЕга ТІЛА М-кінцевий
ТМЕга ТІЛА М-кінцевий з76673 СА о ТМба 0 фМкінцевий |, 27,3 |2746576| 4825 |8935185 41,77 0,287 586 (З383м2) )/(ада) обмін
ТІЛА ТМга М-кінцевий з76683. | ПА Тмга М'кінцевий | 33,4 |28,83716| 414 |2,741722| 35,2 0242759 (908) (ада) обмін
ТІЛА ТМга М-кінцевий
ТІЛА ТМга М-кінцевий
ТІЛА ТМга М-кінцевий 376703 | МРа з плА |Сжінцевий | 392 |зо5Ві53| 4504 |2785185 786 0542069 (ада) (З3В3М2) | обмін 376709 |тМмРа |ТА 41,99633| 199,5 )|1,321192| 804 І|0,554483
Таблиця 21.3
Титр, вихід і активність Їд-Бар ' ' пОТОТА пи та . Обмін Вихід пи ТІЛА - пи ТМЕа . 77 ГМада)/ 00908) |обмн./ | | | ї/! / ЇЇ ЇЇ 376721 82) (зв8) 2491097| 213,2 звавав| 8281325 714
ТІЛА ТМга С-кінцевий 376745 (всв) (вда) 221839 | 108,7 |0,719868| 135,3 |0,933 103 376755 (233) (вда) 7361222| 271,5 |2189516| 4333 | 2988276 376760 (гав3) 82 БеЄОТІ7| 305,6 |2,464516| 1298 1,854 286 з7в7в5 |ПМба |ТА фОбидва (| зб |4304958| 343,6 6362963 182. 1255172 (ада) (З3В3м2) | поміняні
ТМЕга ТІЛА Обидва з7б775 | МРа ТА о фОбидва | 4989 |2967115| 38977 |3142742| 904 |0,623 448 (ада) (2383) поміняні
ТМЕга ТІЛА Обидва
ТМЕга ТІЛА Обидва
ТМЕга ТІЛА Обидва з7втез |НА |ТмМРа о фОбидва | 19,3 15,350241) 1937,5 |3587963| 3479 | 2,399 31 (З383м2) )/(ада) поміняні
ТІЛА ТМга Обидва зтвтвт | зву (92 (юмаян 111911 зуввої |ТА |ТмРа о фОбидва | 13,6 4114213) вв |4899338| 310 | 2137931 (908) (ада) поміняні
ТІЛА ТМга Обидва
ТІЛА ТМга Обидва
ЗТ6ВІ зв, зл ГГ
ТІЛА ТМга Обидва зтввіт |з (2 о (юмаян 1119111
Таблиця 21.3
Титр, вихід і активність Їд-Бар ' ' пОТОТА пи та . Обмін Вихід пи ТІЛА - пи ТМЕа .
ЗМІНИ ЗМІНИ
376872 (вда) (зву) БЗбоВББ| 27725 |0513426| 5195 3582759 376879 (вда) св) 2812933| 253,2 |1676821| 1732 17194483 376885 (вда) (г8в3) 2 БеРговБ| 310,3 |2502419| 9408 бАВВ276
ТМЕга ТІЛА М-кінцевий
ТМЕга ТІЛА М-кінцевий 376918 св) (вда) з118441| 203,6 |1348344| 17855 0123138 376925 (св) во 2725ВБА| 18965 | 125596 | 2935 0419286 376931 (гав3) (вда) 2043729| 7195 |Б5вога9| 26,77 | 0184621 376949 (вда) св) зБ043 | 48165 |0,318974) 49095 0338586 376955 (вда) (г8в3) 241244 | 333,95 |2,693145| 57/15 | 0394138
ТМЕга ТІЛА С-кінцевий 376972 82) (г8в3) 4419175| 42490 |100,7258| 7870. 1124286 376976 (3в3у з) (вда) 16,32049| 3131 0,5тев15| 1722 | 1187586
ТІЛА ТМга С-кінцевий
ТІЛА ТМга С-кінцевий 377001 (газ) (вда) 2549058| 41675 | 0336089 | 158,45 | 1,092759
ТІЛА ТМга С-кінцевий з77о11 |ПМРа ТЛА фОбидва (| 1 зБВЄТоВ| 2702 | 5003704| 3065,5 2114138 (ада) (З3В3м2) | поміняні 377015 | ГМРа ТЛА Обидва м? 3,2 | 3912442 14105 0 | 972,7586 (ада) (908) поміняні
ТМЕга ТІЛА Обидва зттого | да) вв) я ГТ
ТМЕга ТІЛА Обидва 377031 Ма |ТА 29402391 17640 11168212 12965 185,2143
Таблиця 21.3
Титр, вихід і активність Їд-Бар ' ' пОТОТА по Та . Обмін Вихід пи ТІЛА - пи ТМЕа . 132) (908) Іпомняїїу/ | 17711111
ТМЕга ТІЛА Обидва 377041 (зВ3У з) (вда) 10,82989 0 16895 3128704 | 2014,5 | 13,8931
ТІЛА ТМЕга Обидва зттоБо |ТА 0 |ТмРа о фОбидва (| 221 |чз688003| 269,05 |1,781788| 672 0463448 (908) (ада) поміняні
ТІЛА ТМЕга Обидва зитовв |всву (92 о (юмаян 219111 377060 (гав3) (вда) з78306 | 2371 |1912097 171,5 | 1182759
ТІЛА ТМЕга Обидва 377073 (вда) св) 57, 53099 | 4708 |0311788| 36795 0,253759 377082 82) (зв8) 5О01275| 194,9 | 3,609259| 1213,5 17,33571 377087 82) св) ззлвева| 448,8 | 0евБаз | 41555 0,593643 377092 (8 (2983) аз БІ | 598,5 |4826613| 38845 | 0,554929 377097 (зВ3У з) (вда) 7425303 | 3729 |0690556| 20,85 | 0143793 8377102 (зв3у з Що в423872| 31565 |0584537| 2998 0428286 877107 (св) (вда) 5ББРоББЯ| 7835 |0518874| 16775 |) 011569 877116 (гав3) (вда) 4402405 739 | овововв 15,23. | 0105034 877121 (гав3) 82 28,59812| в255 |0504435| 22,85 0326429
ТМЕга ТІЛА М-кінцевий
ТМЕга ТІЛА М-кінцевий 877142 82 (зву) 11,75934| 3278 |0,607037| 4534 | 0647714 377148 82) св) 13,07635| 9965 |0,659934 48495 | 0,692786 377152 82) (г8в3) 12,69725| 4651 |0375081| 3974 | 0567714 377156 (зв3у з (вда) 3483478 | 15845 | 2934259 ш-Н 8377162 (зВ3У з) 82 за440556| 2504 |46,37037| 24875 0355357 377166 (всв) (вда) 2676967 83 0.549669 16955 07116931 377176 |ТА ПМРа о р|Мкінцевий у 11,3 4148623) 5305 |42,78226| 2873 | 0198138 (2383) (ада) обмін
Таблиця 21.3
Титр, вихід і активність Їд-Бар ' ' пи ТОТА пи та . Обмін Вихід пи ТІЛА - пи ТМЕа .
ЗМІНИ ЗМІНИ
377182 (гав3) 82 15,5418 | ові85 |227298в4| 4817 0,688143 377186 (вда) (зв8) з6,6753 | 37,57 |0,695741| 35,75 | 0246552 377193 (вда) св) 28,52527 | 128,05 0,848013| 30,93 | 021331 377200 (вда) (г8в3) 436029 | 217,35 |) 1,752823| 38425 | 0,265 377208 82) (зв8) 26,10432| 212,35 | 3932407 | 170,15 | 2430714 377223 (3в3у з) (вда) 36,07182| 30175 | 0558796 1151724 377241 все) Що 8,490845 обов 4013245| 268,4 | 3834286 377246 (гав3) (вда) 2052445 687 0554032 18,5 |0,817 241 377252 (гав3) 82 БЕеОРгАЄ| 2198 |1,772581| 1381 19,72857
ТМЕга ТІЛА Обидва
ТМЕга ТІЛА Обидва
ТМЕга ТІЛА Обидва
ТМЕга ТІЛА Обидва з7727в |Пмба |ТА о фОбидва |у 14 |ч6о5в46| 12375 8195364| 3624 |57177 143 (3.2) (908) поміняні
ТМЕга ТІЛА Обидва з7т2ві | 2 сзв3) 13,70576| 19375 | 15625 | 28235 |4,033 571
Зз77овв |НА |ТМРа о фОбидва |у 25,5 |2940929| 486,7 |9012963| 521,5 |3596552 (З383м2) )/(ада) поміняні
ТІЛА ТМга Обидва зттаво | 9в8мг) (в) вом 377295 | ТЛА ТМга Обидва УЗ 26,35 |29,74724| 177,55 |1,175828| 132,35 | 0912759 (908) (ада) поміняні з77зо0 |ТА |ТМба о фОбидва |у з5В |4ЗББОЄВ| 17575 |116,3907| 69750 9964286 (908) (3.2) поміняні 377305 |НА |ТмРа о фОбидва |у 11 | 1360209 БОБ 4106897 (2383) (ада) поміняні
ТІЛА ТМга Обидва вттато |оеву |в) ой| || 1
Таблиця 21.4
Чистота анти-ТІ ТА/анти- ТМЕ-а Ід0-Бар
АТ БОБЕРХ дж р ярею т кт о| ка 376597| 3,832 | 96 | | 1 1 1 101 1 1 1 Го2о06897|0,793103
Таблиця 21.4
Чистота анти-ТІ ТА/анти- ТМЕ-а Ід0-Бар 00001111 ЕХВЕРХ | Невідновляні/// | 0 Відновлено 376601)! 2894| 97 | 1 ЇЇ ЮюЮщЩЮщЇ 10 1 1 1 юЮющ| | 035316 0,64684) 376605) 3,362 196634|..Й/-/: | 1 | ЇЇ 01 ЇЇ 1 376609) 1241 | 89 | 1 | ющЦ| | о риБзвавіював | 1 | щ "Ко 376613)! 1,838 98 | | 1 ЇЇ щЇ 0 1 1 1 юЮющ| | 0299658|0,701942) 376617! 162 | 89 | Щ | 1 ЇЇ ЇЇ 011 ЇЇ 1 зубб2т| 1827 19ви72 01101101 3303031 19111101 376625) 2,552| 97 | | 1 | (| | о |013650310,863497| | 0511494 |0.489506) 376629) 1,868 | 98 | 1 ЇЇ щЩЇ Ї0 1 1 1 юЮющ| 0521429 |0478571) 376633) 5854 | 84 | | 1 ЇЇ щЩЇ 1 0 1 1 1 юЮющм| ГГ о454225|0545775) 376637) 1,099 Г58901|. 171 17777717 70 1 1 1 1 | 0683333 |0,916667) 376641) 3255 196,745| | 1 | ЇЇ 0 1 1 1 ющ | | о44898|0,55102) 376645) 8,844 /63,754| | 1 | щЇ 10 1 1 1 юЮющ| | 0336066|0663934) 376651) 39,574| 60 | | 046 | 054 | | 0 | 1 | щЦ(| | 0364929 |б635О7І з76655| вл 191809. 17711111171111111170335052 |0,664948) 376659) 3,515 196485| | 091 | | | 009 Щ|007438|1092562| | 0,514599 |0.485401) 376665) 2981 | 97 | 1 ЇЇ щої 1 1 щ| Го498168|0501892) 376669) 2213 197787|.ЙЙ.ЙЦЦГ | 1 ЇЇ ЇЇ 011 1 11 376673| 4,635 |60842| 1 095 | | | бо5 фоллолівІрввеяяї! | 1 | 71 376679) 1,774 198226| | 07 | | | 03 (02494 02о3008І0673499Ї. 1 |... 376683) 5787 | 954 | 1 053 | 022 | | 025 | 1 | | | 0330189 |бевов 376689) 3,896 96104! 107 | | | 03 | 1 | юЮюЮщ| | 0209386 0790614) 376693) 2,32 |96131| 15481 08 | | |Д | 1! Її /! ! 1 376699| 127 | 99 | 075 | 0285 1 | ! 1 1 376703) 746 | 93 | | 1 | щЦ| | о ол64756І10,835244| | 0437086 |0562914) 376709) 8439| 92 | | 1 ЇЇ щЇ ї0 1 1 1 ющЮК| | бяз985 056015) 376715| 2451 | 98 | 104 | 06 | | 0 | 1 | ю Ющ| | 0285124|0,714876) 376721) 5,544 | 84456! | 085 | | | 05 (019759510,802405| | 0327751 |0,672249) 376725| 7,766 | 71445| (ЇЇ ЇЇ 10 1 1 1 ЮК Го0413333 |0,596667) 376729| 4728| 95 | | 1 ЇЇ щЩЇ 1 0 1 1 1 юЮющКК| | о14949,|0,585657) 3767331 5277 | 9 ЇЇ 1 17111710 1 1 1 10474359 |0,5о5бАІ 376739|11,358170083|.ЙЙЮЙЇ 7 77777171 17771171 10719481 |б28во519) 376745|18482| 82 | 171 17777717 70 11111117 10479675 |0,520325) 376750) 536 | 9464) | 1 | | | о олБ3БовІювавМІ | 1 | южщ 376755| 4451 | 96 | 1 ЇЇ щЩщЇ 1 0 1 1 1 юЮщ| | 0509225|0490775 376760) 6,609 153391! 171 77171011 11171111 1 376765) 4,751 57868) ..-Г| 1 ЇЇ щЦЇ 0 1 1 1 юЮюЮщ| | 0305136 |0694864) 376770) 7176 |5033|.ЙЮЙЮЙїЮ.Ї.Ю.Г її її 376775| 36 163705) -/ | ЇЇ ЇЇ 1 1 1 0527027 |0472973) 376779| 525 |9475| | 1 | | 0 1 1 ющ«| Гожетоу 0583899) 376785|19,124|80876Ї. | 1 | щющ(БЇ ЇЇ 0 1 1 юю | 0443333 |0556667) 376789) 2556 97 | | 1 ЇЇ що 1 1 1 | | оз85294|0614706) 376793| 561 179135) Й 1 | юЮюЮКрРрРЦ7771010110 долготігіввувяяї | 1 376797... ЇЇ ГГ 376801|16,037183963|Ї.ЙЦГ(/ 1 | | | 01 її 1 376806! 3911) 96 | ЇЇ 11111711 376811) 35557 Гйї522|..// 17717117 11711117 111 Ї111171ї1111711т1 г 376817! ГГ 376822| 367 | 96 | | 1 ЇЇ що 1 1 1 | | 0304688 |0695319) 376826| 1,521 198479) | 1 | (| | 0 |009779210,90022081 | 0487738 |0512262) з/6830| 3,377 (14015, 171 71117111 1011 11111111 1 1 376834) 3,397 196613| | 1 | 17770 0495667|0,5043931 | 0б,229858 10,7/0142) 376838) 2,644 157356! | 1 | (7 0 | 1 ЇЇ 17777711 беб5463 | 074597) 376842| 2839 57 | | 1 ЇЇ що 1 1 1 ющюК Голаввий 085123 376846)! 228 |9772| | 1 ЇЇ щ | 011 1 111 376850! 228 |9772| | 1 | щющЦ(Б 1 | 0 |0332192|0,6678081 | 0.735577 |бобачозі 376854) 0,963 199037) | 1 | Б ЇЇ 0 | 1 ЇЇ юЮюЮщ(| 0533951 0466049) 376858) 2903 197097) | 1 | що 1 1 1 ющ | | о5тзв89 мет 376862) 2,567 197433| | 1 | | | 0 | 1 | | | 0.666667 |0333339) 376867| 2062 197938|. | 1 | щ-(Ї ОЇ 0 1 17777177 1 0495702 |0504298) 376872|50192| 50 | 77711711 17711117 олилебя 0828746) 376879|10,705|65512|..Й.СХ! ЇЇ 17777771 71 1Ї1777771777777117о309207 |0696799) (376885) 202 |77072|.. | | 77177771 717177771171717717171717171 10232628 |0,767372)
Таблиця 21.4
Чистота анти-ТІ ТА/анти- ТМЕ-а Ід0-Бар 00011111 ЕХВЕРХ | Невідновляні/// | Відновлено з/6889| 5,579 183982|..-: | | | ЇЇ ЇЇ ЇЇ Її 0546 | 0454 зЗ/6897| 6197 193803. Її 77777177 17 177771117177111111 1 оБлотав6 |О4Бо854) 376902| 7,841 |921259|...-/:(/(/|ГССЇ17777ї1171Ї111171111 11111111 11 376907| 2,508 197492| | 081 | | | 09 |бет3946І10,7360541 | 0176152 |0,823848) 376913) 1,59 | 9841 | 1063763| | | 03621 |0,58909110,4109091 | 0.142539 |0,857461) 376918) 2689 97 | 10607 | | | 0599 1 | | | 0.310078 |бев99сгі 376925) 2701 157479) Її 71777777 17117111 7171 171777111717177111111 1 обеабг83 |ОИБАИ 376931) 3,825 | 1/ |2397лІ ви | | |05Ї 1 / 1 376937| 6425| 73 |67И7| 1 | | 011 1 11 376941) 609 9391) 109951 щю | | 0 ололабг|іввовоЯВІ | 0456731 |0,543269) 376949) 4,915 195085| 036 | 08051 | 00591 1 | | | бжза161 0567839) 376955) 3,589 9641) 1097 | 0287 1051| 0 | 1 | юЮющ(| | бегеви |0т777159) 376962| 5,594 | 86,48 | 7,926 10,636074|0,636074! |0363926|Ї 1 | | | 0.321678 (0678322) 376967| 6,547 193453|. | 1 | (Б ЇЇ 0 | 1 | ющ | (0486869 0519191) 376972| 3031 196969|.ЙШОСЬьЙьЬСССССЇ ССС 17771717117177111111 1 042549 | 057451) 376976| 338/ Г96613| | 71 77771777 70 11 1 1 717777 1 0487965 |б512035) 376983 34082! 66711111 11111111 376991) 5467 1590533) | 1 | щ(Ї ЇЇ 0 1 1 юю. 10501219 (0498781) 376995ЇДЙ 0 ГГ 11117111 377001) 2,545 197455| | 1 | щющ(:7 Ю.І 0 1 1 1 ЮюЮю | б519288 ово 377006! 0 |66136|33864Ї | 17777777 зо | 272 79 | 77777171 робаеааоя55о56Ї | б,е47312 |0,752688) 377015| 5233| 57 | / |! її ЇЇ 1 її 1110 377020) 7127 | 85 |55І ОЇ 1717 Г11171Г11117111111ї111г111г1 377025| 832 | 85 |15548Ї ГГ | 17771111 377031) 3524 | 91 | 77777777 17711171 домгзлаеровеввоі! | 0.577419 0422581) 377036! 3788| 96 | / |! її 1 ЇЇ 1 ЇЇ 1 377041 |16б,2361183982|. 171 77777170 доі5вивввигю! | 1 | 2.Ююоо 377045! ГГ 1 377050|11и64| 77 |10496Ї 1 | | | 01 ЇЇ Її 1 3756 ГГ Г11171Ї11117111Г1111гГ11гг1 377060) 7,075| 77 |533064Ї ГГ | Її ЇЇ (| 1 її 1 зов ГГ 377068)! 3292| 97 | 1 ЇЇ що 1 1 1 юю | оевета5/|07008551 377073) 1,927 198074). Й Ї 77177771 17177771171717771117171170376947 |0,623053) 377077| 2583 97 | ЇЇ 71777711 17177777 ол10749 |0889251) 377082| 1135) 89 | щ | 1 | ЮК, | 0 022508610,7749141 | 0.071429 0.928571) 377087| 2006 | 9,929|. ЙЙ..ГЦГ- | 1 ЇЇ юю 0 1 1 177 17027493 |0,725067) з77о92|тез41|98006|. 171 17777717 701 71 17777171 1 0.094995 |0,905605) 377097! 261 198739|.Й.ЙГ/Г | 1 | | | 011 ЇЇ її 1 377о2гІ 21 197767| | 1 | юЮюЮЦКМ,| | 0 олвлевова5ия91 | 0501919 (0499681) 37707! 501) 98 | 71 17717177 70 11 71 17771171 | олв5воз |бетАтол 37712| 3322 97 | 71771710 171 11717777 10468657 |0,531349 37716І! 265 | 97 | ! 1 ЩІ ЇЇ 0 1 1 1 ющЮК| | 0ьбтооз(о442997 37721 3284| 97 | ЇЇ 1 що 11 1 Юющм| | оа59701 |6540299 377126112404| 66 | ! /! Її ЇЇ 71 її 1 її 11 3771331 6553 57 | ! ЇЇ ЇЇ 1 1 1 | 0436508 (0563492 3771381 39881 73 | 77777777 71777171 1 о400932 |б599068 3771421 2077| 98 | ЇЇ 1 Її 01 1 1 щщ | обов! | б4и195 377481 3772| 96 | 1 ЇЇ ЩІ 0 1 1 1 ЮющЮК| | 0529745|0470255 377152| 436 99 | 1 2 ЮщЮЦ(Ї Ї0 1 1 1 1 | 050289 3771561 2614) 77 | (1 ЮюЮ| | о оллівузаювоємМЯ! | 1 | щ " 37762) 1394 198536)! | 064 | | | 093 |006546610145663| бмВь | 0172237 |0,827763 377166) 5,575 | 94 | 2313 0295 | 045 | | 0254| 1 | | | 0359116 |пбло884 377172! 3898 | 96 | | 0261 | 0325| |о044| 1 | (| | 0349393 |б,650667 377176|199999| 77 | 1 1 ЇЇ 011 1 171 377182132588| 50 | ! /! ЇЇ 11 1 111 3771861 683 93 | 1 | юЮюЮщ| | о олие75Іб8авогь|Ї | бблобя |до 3771931 1394 198,605| | 1 | (ЇЇ 0 1 1 1 юЮющ | | о46108 0559892 3772001 5103 | 95 | | 05 | 065 |0688| 0 | 1 | (| (Б | бз4448 |ббе5552 3772081 3092 | 97 | | 084 | | | 06 (|022978710,770213Ї | 0.338983 |0,661017 (377212|20005| 80 | | 0867 | | |053| 1 | | | олевев (бите
Таблиця 21.4
Чистота анти-ТІ ТА/анти- ТМЕ-а Ід0-Бар 00007111 ЕХВЕРХ | Невідновляні/// | 0 Відновлено 377217| 5089) 95 | |! 1 що 1 1 1 7 | 044709 |055251 3772231 745 | 93 | | 1 | (| | о |ообоБуяюзяяоєЇ | 0497423 |0,502577 377229120138| ба | ! / ЇЇ ЇЇ 71 її 1 її 1 377236І 844 | 82 | ЇЇ 1 ЇЇ 7717171 0 1 1 1 | олввав9 |б556
З772я1110022| 90 | 11711111 11171111 377246! 7 |92694| | 1 | (ЇЇ ЇЇ 0 1 1 1 юЮющЮК| | 0519878(0480122 3772521 16 |83804| бі ГГ 111 111171 сг111171ї1т1 її 3772561 0 | ло! ГГ 1171111171Гг111171ї1111171гГ111711т1 сг 3772611 0 | ло | Її 1 ГГ 71 10 1 1 11 3772661 0 | 700! ГГ 11717Ї1711171711111111171г1111711т 3772721 8675| 84 | ГГ озвуви об12158 3772761 11,006|188,626| | 1 | ЇЇ 0 1 1 1 ющ | | олвба86(|б519514 377281 4722 195279|.../ | 1 | (ЇЇ ЇЇ 0 1 1 1 юю ЮюЮщ| |в біт 377286| 5497| 64 | (1 1 10 0 олзазавіюве5ву| | 1 3772901 0 | лою | ГГ 377295113,8007|10899|.Й.Н-НАДА |! 1 | Ї! | 011 Ї її 1 3773001 6532) 87 | ! ЇЇ ЇЇ 11 1 1 | 0566553 |(пмззаи 377305111,808| 83 | ЇЇ 1 | щЦ| | о оззивІрвевхяа|! | 08125 | 01875 377910 0 | лою | ГГ
Всі публікації, патенти і патентні заявки, обговорювані і процитовані в цьому документі, включені до цього документу шляхом посилання в повному обсязі. Необхідно розуміти, що розкритий винахід не обмежується конкретною описаною методологією, протоколами і матеріалами, оскільки вони можуть варіюватися. Крім того, необхідно розуміти, що використовувана в цьому документі термінологія призначена тільки для опису конкретних варіантів реалізації винаходу і не призначена для обмеження обсягу доданої формули винаходу.
Фахівці в цій галузі техніки зможуть визначити чи встановити, використовуючи не більше ніж шаблонні експерименти, численні еквіваленти конкретних варіантів реалізації винаходу, описаних в цьому документі. Такі еквіваленти охоплюються наступною формулою винаходу.
Скорочення
Скорочені терміни, використовувані всюди в цьому документі, визначаються наступним чином. ак, АК амінокислота(-ний)
ДЕА дисбаланс експресії алелів
АМОМА дисперсійний аналіз
БСА бичачий сироватковий альбумін
СОК ділянки, що визначають компліментарність
СНО клітини яєчника китайського хом'яка
МЗП мутація зарядової пари
МДСЇ модифіковане Дульбекко середовище Ігла
ДМСО диметилсульфоксид
ІФА імуноферментний аналіз елко експресія локусу кількісної ознаки
ІЕР-ЧП іонізація електророзпиленням, часопролітна
ВСН виснажений супернатант
ЕАСЗ проточна цитометрія
СТЕ сироватка телячого ембріона
РЕХБ рідинна експрес-хроматографія білків
ЕМВ лінія мишей, інбредних по алеля вірусу лейкозу Френда 156 (Ем'1б)
ГЕ гематоксилін і еозин
ГК гіпоксантин
ХГВ хроматографія з гідрофобною взаємодією
ВЕРХ високоефективна рідинна хроматографія
ПХ пероксидаза хрону
НОМЕС епітеліальна клітина пупкової вени людини
ЗЗК запальне захворювання кишечнику
МІСД МДСІ без глютаміну
ІЕМ інтерферон
І. інтерлейкін
ХБМ хемотаксичний білок моноцитів
БДМС база даних макромолекулярної структури
НК нуклеїнова кислота
МПК моноядерні клітини периферичної крові
ФСБ фосфатно-сольовий буфер
ПЛР полімеразна ланцюгова реакція
ПЕГ поліетиленгліколь
ПЕТ поліетиленімін
ЛКО локус кількісної ознаки
ЕРМІ середовище, розроблене в Меморіальному Інституті Розвелла Парка
КТ-ПЛР полімеразна ланцюгова реакція при кімнатній температурі
ОНП однонуклеотидний поліморфізм
ТФУ трифлуоророцтова кислота
ТІЛА ТМЕ-подібний ліганд ТА (ТМЕ5Е15)
ТМБ тетраметилбензен
ТМЕ фактор некрозу пухлини-о;
педжвлптУ пИуеплтІуєвиуути Й пЕЕгжозіт ПпобіїдешиМОої ВЕ
КС лю Мито тк жд ВСЕМ ІКС.
ВВС БвізівБОІ пес. пвізішош
ШТММУМО пизє дще мщиде
КаиКАМ. Сопавехекат рен а Я жа ьк, вепивелй м. ших 24 ять
БСЕТІЕВ, Місве3їії12г плишот тт и то Же ощо шЕБОсСаекІ, ВОМ с. поря вити-тт вІднтим-тмЕ-влюЩВА БЛІСПЕИМеІННТ та вті ігІів/внІЙМЗІіМЕ-вснА ШшІЮМЕ ЕРА НІ виш тлвтущ шдУтутТ шт ВО СТУ сдвичвухтув іх впівювішплв нт чіІ ШіЛвМ ІВ 1 АСУ ШОУТИЯЮВ ру Ал ал ошиви чаш жита що КІ КА зр птізши да чАвом бвелшв,АЕ уд» студ їв; ав -лівтіштів гом. пет тд лою шко, ШЕ тіВів дпія-4В-о5 суд пит сл ве и дм чАвом о жЖоОтТлОвВеСій ВІКО тівіз шої а-п5-15 го ж хавст ше ех Диван Ту щеритід й Б
ВАШ ше оат ВшВТяМЖ 5. сла кт тт ша С кій» пщЩу ля г геї Ше попі шу са МВт ВВвІєг сатлх я «апа ї дана есгвада педа аатс дити чтвочу птинсщеит. пи тІМуИВ пот ищ цатеабссвва тоавсасватт зссво:сштся сгтвссвосо стдбосасав септдптовис ви вствсссчоо чадстлотсса соацпвазтсще вассатстотЯ тагошевося псванавотше пред длид стра дтп ід вон ли пуп пшлдеТвот пит сцавзецетат сцавацеттосо сбевлвасцот сппсооовсця Звсвцаціан опе соптох ху
В всацтбовчсс забсосапоот задпоасцоцвт стовогсбов савстоспсвя посусвосое ти я шок здо якщо зт диво тд пеитщ слив в ощотщот щовон хр що здаазаблттай справа тистоаташа тесватстщас саптвшашвт ЗІВА сопшцасазаваш зсдпацатстав то яд ши лм, - там о «Шіін 107 с - х хо д шілІтК хо Шиидт шщучі шод ж донт вві сао й
ІІ Е ав ті бів Ме Тл о біп о бех Бко Бех беїх Без беї Віз Еевх Уві біух і Б 135 1
Ав Вло Уві тїВйІ ТЗ ТБІ Сує Вкт вія Ббех піт с(іу 11 Ату деп ТУх ее шЕ 38 пес Від ТЕв отТУкЕ ців іп Був БРко Бі Був Вів Рекс Був Бей Без Вів
ЗЕ зо а
Тук вів вів беж ТЕТ Бер біб бйеху іє Сві БЕс Бех Вк ББае беїх 15 ви Бе во
Бах піс бек бі Тек Ар о Ббє ТБх о Бе: ТБ Тів бетх бвх пез бів БЕФ в та 75 в біс дв Уві АіЗ1а ТвІ Тух ТУух Су іп Ак Тух Аза Ак вза Бко ТтЕ ві зе
ТВпІ Епе біс бів біт ТБ о Був Уві бій Тл Муз іп іпЕ «іп З «Вії» да «дів дНЕ «гій Бошо звріяте «зост 8 чадштасават свосааатс засптазводе бо ешезос сода двЧатвс десседцеве ща васошщьсгуд сабспопазо бастбосодав сабса:ассра сцасаБецоедо ссодсаваавуєа 172 сетосдававац сдоастсочвцяЗ заведе ов асбвсЯбода втсазсодася свиссввевт 155 чсазасвиби осаовпослсаз всїсавсвасс сгасцдачаса згосбвадвве садцесопове до соссвсчасда астосвсьбсз счсосаасца; вссессзсао встасьчоцот сваацбоебсо зо
Евксузавста саедоесиообо чдосродастай іцлшосваз чвесаевоацє свосавсюх
Зо зах зе саілв 4 сеї ії «вів Білок «іш БКожо заріяпе сала тах тло - р кт ж т ях тили т жк сту ТТ ще лк З
Біш Уві піп бен» о Заї бів Шех БІ біу Бі Пез Уві зів Бк 5іУ дкщ ї Е і: ї15 ш т ку -х 2. їх Віа ЩІ Шон Іл шо й - : Фо Кт бот Пера
Шекх Мей Ака Бей йех Суз віза йїв бет біу ББе ТБх ВБе Ав о блр Тух тп т да шо -к кА хі - ші щ т ЧА ху п т -е ли Тохещо Пе Т7овли ЛІ тат уд
А1їв Ме Пі Ткр Уві дко Сів дїа Бк осіу Був Бі Бец о біз їхю вії «г хг де 15 В я дру вів ті т те шву пла ШПлдшо Ті ет Тлую плід о бду Жах луді
Зехк дів т11е ТБ ТІб Ап обеї ЗіУ Ніз Ті дер Тух Вів Ас швзІ Уві
БО ЗЕ ОЗ тлу. т о с Фліт тт а Ку пкодх Я о тях Ваше Фон тод тож
Біб Бі ВкЕд Бе ТБЕ Ті беїх вх Ав вай вів Бу Ав обех Бе) ТЕ
Б то те Зо
То Як Хто шт х. а я тиж Лл тля т ть з т пад Тихо тех Єжт. їівш бів Мет Ав обвЕ бен дя Бів тій Баш ТУ Вів ЗМаї тТх ТЕЖ був 5 ЗЕ 75 Тотал дв Пк я с, с ті че Б дек кт. яхт З Тиве о ану 03 пл
Віз бує хаї бех ТУЕ Бек Шех ТБт дід бетх Ббвк Бей дв Тут ТІВ бі і25 118 піп Бі ЖБЕ Бе Уаї Тех Сбві бех Єву їі5 125 «ді.н Б хім 824 тт ще «шій дик зе педлвто швея до хтїйМ Пото заріпе «4аво»х часасбссзоаз здасссвцтс оссавссотсг спаяаботаса спурбзвоадача свозабсасо ях о абсассшис дзвсвацтьсв ззасвесвчЧа сабцасосва дошшстабсв дтазвавося їх чацдавадтсс ставцепост зсзбстабцат спгабвосвзцо зпосзвавчішея сцпісесайсв 155 ашстссвцев дсаспрбоцаєс Здпоацасацавз бісвстовсв свассадсви ссузсашесь я цевздасиБи саезсзрабоа сіспкотасву свбаавтазей встотесово тс цосав зад цосассвазоа гопнавссва вся зга
-іпВ є -шії2 307 «ігз Білою кі Нослю зврієдав аа є
Ав о ї12е зЗзіп Ме ІБ бів Бех Бхо Бех Зеї Бей цех Вів Шех Уві зіх 1 5 І 15 аАвв Вт Хві ТБЕ Ті ТІ Стє АтУ Тв бех Сі дев їі дк5 бер АВ ей те пл ой жд ко
Тев біт Тхв ТУкЕ о біт шій Бує БЕжо Сі тя Вів РЕЗ Був дж зи тів
В 0 5
Тут ар в1і5 бек бек Ми біп Бех пі Меї Бко Бех Бк Ве бвкх пі
З ва о
Вавк оті бек ші ТвК ошжіЗ ЕББе ТБ о Меп ТБт о Іівз Бех Бех Ге» бів БЕЗ ве тв 7 Еб бі: Ав о Ббе дів ТБІ ТУх ТУуїг Суя Ме) сія Ніз АзпоКех їмт ро ВтаЗ ва 5
Так Бпе іт іт озіє ТБ о Буз Зді Бій Бів їлев 1852 і95 ча 7 екіїв ЯЗ «їйх ДНК «іа» пово заріавва хепйми т свадиочеедт сопоошвасс зоедпадвасе дешевствиє стосдвоудос вебшашесве жа
БсгодЕцсвв севесвераво савесстбсаезс вястабацев басвевбацас сезсеводее їіхо ствпеасаваєш часоопвоба чеопоасвоавс всарсасабо асусввасва севвасостави 155 всецавитсся зцавзцоссз акпсассвто бссвсацеся асосевацва сесцебашає ти ях «кЕпсаавассв асассстьпаз адстяпаоуцдас асосдековоб ассвекавос дадаеацдасоосв а всаобвасше сстаставссв совсаоцсату засорсоаоу доесвводавс сесоудеосвис
Ех віх ї- ! АК ї : і Я і їх?) (23) (а)
Б А Я Я а йо МК оку в Кох Ко їж ХВ ТО ОА БО ! я пі сія пк
Ж Я, КО г сш я и ч і ще Б в це КО у ще 7щ ще ж Б яр шк х у ЕК с КІ
МК ЛО : Я
А і А і. щі кю г РЕК кача р рЕоек кава во зок ша 5 ково ду ярих кавер Кз пнюк ка Ху пасок КБ Кри
З Ук Кия укав пити ше КХ Мом ХК
МСь Ба нс сок Шо х нНСісцек він Сік
НС ІЗ Сх ОО б 13 НО Одає а БЕ СЯ ЗЕ ча вжи ие ру м РИ г з аа сф до пожежах
С тає СТЕ В І ТЕ М ОБ УК п 5рлає са іТК шовк ве су дівою ві тнЕ інж
Фіг. 1
ТК я яке
Ще й КА ро У Ж ої ко ша й я м їх ни АніАна й
КК, ше ще ; б КЕ ск Я ой
У ща шк пи Кк вав а, х шк. х в Же о
КЯ дя ших: Ме
Яни Е м.
Є
ЯК щі: й. сен Ще
З Я ї
Ех ху щей у сет ях р 1 ГЕН а і х ї ВМ І Как ДЕ З ї 1 МУтиУ ах шити кА и
БМ нн С и МУ ! ух чини бр й дя он
З - Ід шарнір
ГО ж вептидний лінкер ри -е БЕЖ. Є ік у» ЦоМ),зег,лінкер и :
Фіг. 2
МОГ ОопА ЦІ: лова: і ! її І
І г і : К Я і ! І
За: і і і п ї І І : й | І і
Зо: ! : : і : ! ; : і че | 1 і ! ! й ' : ї 5 5 в : | І ї і ще наш у / Х кА : й ДИ ей ян жи т пек мол ту Я К. 1 і й злу едюю шжжи жжтж кали плтт
Ме тем сне ее же же же ек жене лек для сову і пен а Ї ,
Ти ВК душ. ВІДХОДИ ож М нене нові ДК ВУ ВІДКОДИ 00000. важ пхко 15150 то т1л2оо зо твоо ово Щл
Фіг: З
МОП вже: і г Що ї Бі : Ї Ї і ! : НИ : 1 І дов: і і і у і і: : і і і ї і з і
Я і З І м : Роз : р їі
Я ї З : і і і і ра заа. і ще
З яко: ПИШЕ ї В сив і / КЕ ! : ; Її і : ГІ ; і вк: : ше ' : | д А шк !
Я ! кет І : ! і КО :
Я ї і : І і ки" АХ і жовт т дово «в-во ж . КУ ПОВ дере 0 Води а: вини ОТ г. зав зов яю вар тк зва мл
Фіг. 4
Опт АЦЬ вп : яка : І ї : Н і : у І : : : 4 : чо: | і і : і ' зда: і і : | ' : т
Во: шо ! ! чу : і од : те : ; з, не: ; у : і у пу
І х Зк : Я ча и
ЩО зляллю уміла іт ТАТА ТТ АТ ХХАА АХА МТВ АХ АХА АААААХААААААХААААААХААААААХААААААХААААААХАКААААХАКААКАКАААААААЬ : попе рост А Сотня г. : : ПІІ ІІІ ІБІ:ІЄІФПІІЬ т йІПІйЦПЬ: х й ї . : кВ. ВНАА Кене НЕННЯ НОЮ 00овідхВДИ ТОЛЯ Відходи 00 2 ван тоди тво ММ МЕ
Фіг. 5
ПЛИТИ КИ КК КВК Ж ЖИ ЛК КИ КК Кн,
ТІЛЕДШНИОЛИИМІ ПИСЛИМИКИ МИ КИ ИН ДИ ГПО ИН,
МЕДИ КЕМТКИИНМ ШИ МИ
ШМЛЄМИМИ по о я
ПИППНОВИНИИ ДИИШИМИ ЖИ АЕН - ПИПОПУХНИНИВИИМИИ
ПЕН СИНАМИ МИ ПИВ ШИИ с 0ОСИИЕИ НИК,
ШИК ЕНН ПОКОК Ко 00 КОЖ
ШЕ ИК ПИВ НЕ ЕТИКИ
ДПК ЖЕК ПЕК ІК ПЕК
МЕН ой ШВОМ М жк ПЕЕЕИШИИ КЕ
МИЙКИ - ІЕМ КИМ КИ їх ПШОНА ан о о НК Ноя
КК нжжаж ЯК ТИМ КН ІШЛЕКИ МЕМ
ШУМИЦМЛИШК: Ж МОВО КК НИКИ З ХЕШНИИШКНО
КЕПНИИ, МИМО ДИКИМ
В он НН НН пе ке в ШИНИ Я тЕвкн Я ЖД ПЕМОКНК Низ ОК Е
В ге ОПЕК МИКОЛИ
ПЛИНИ в МО ЛЕ ЖЕ ЕМ
ПОШО Мер ве о фу Я
ІФІЛЛИИШИИКИ, Х и ПОЛЕМ ПЕ ПДВ НИКИ їх ШК МИЦИЧИМЦИШИ
Екшн ШК КО т 0 МК
ШИШИЕМСК, М ПИШНЕ КН І. ШВИ
ПИШЕМО УЖЕ КОШИК Я ОО мЕшиюко
ПОС ННМ «и МПК ВИННИК и ек ЗИМ
ПИХИЖЛАИМИИИИ я М
ЗОНИ ПК Ки КОШИК и ПЕВ нн фак ОПН
БО Ве НН я
ПОЛИН ПШЛИПИМЦИ ПЙКИИ. ПКТ ПИШИ, ПІІЛЕКИЛИИКИ
ТІ ПИ Мне ПОН
КЕ Ккии ЕК МЕЛЕНИХ
ЕКО КК ПК ЕК,
ЗАЦЕМККККК,
МА КК
ІКШТУ НИКИ ВМ КИ ія ше КЕ я Же
ЕЕ СВ
Ним ом М. я па
Ме ПЕК КК УК КК КК кон. ВХ
МОМ ИМЕНИ МКМ ММК
Код ел
М МОХ. жк ко
Кк ж
ХОЛОД К КИНЕ КК КК КК КК КИ КИ АН КК ОК КК К НКИ г. ; Не
Фіг. 6
, З - мМОг(тАЦ) ; 5 160 5 ті 3 х у ї ї Е а З Б 140 5 ї я ї ї г
НІ то 1 її - їх
З хі і Її
З і
Е во і , : с
БО ях 1: 1 п щк 1 ві її
Т і
З НЕ
І ії 7 Фі 4 іх я Кох й У ухил ЖК Ж же мк даху кт к кети их Вин З Охмкукк кореню» мшжет жує Ми сх УААН
Кі
Й анонс кнноосуроасон орнамент нер опноісвоеринеосн осо рссотн нор ноут упора рнонк со драсегнеогрнннснсне с 4 ; 5 10 15 ха тріг. 7
ЗВНЕК додасте свамнилтяік сеоаловя ек емо ОНА
ЯНА піна рови В Ним а деМОонво ШВИ ркна, сх Ї
ЄС ісСкавя ПІБ в'ї на Ве МНКНЯ МВВ рова ізотопу я
Мав ї 12: г ї р . : щ - Ї з рі щ-е Маса відповідає теоретичній масі гетеро-ід Ї 14 ї дин " ї рони Її
Ше . : р Ї п і і і ї р і х : х ї Мч ї ща і о ї нн Пика кнннкнн нн ВМ, ї
ММК ЕМ ІН МИ ЕЕ ЧИЮ ІК І НЕО МІ ЖІ НУМО ВИ ПМ І МЕ А В М ВКМ НИ
Імпульси проти декомвольованої маси га ом.
Фіг. 8 калі ЧЕР пе позов ва Я тватоов ву ЕВ Сі ета веди МеКОННОЙ, Ширина хв ;
ОРЕ бкан о" в'бни7 вовано " ізотопу ! : зх х ме ї ; зала і 45 7 ї : ї ї з і у ші ШАР
ТУ : Мч ; ї : | ТМЕ Таб . що : , се ї і ї | Зі Кк х зх ї ВИЗ В х хо х х х і ; ї ї 1 ї ї а ї х х х ї х їх ї Н 5 хт ! : Е оовщои і : ! З 1 вс омінує й С-кінцених АК ОЇ ї х ї ї Я 242. кв в ї т -ї : ї пелярозщеплення ує ої ї
ЩЕ З ї з ї ї дк ї Е т Ж ї з Я ї ЩІ ї : З ї во их х ї БІ ї ДЯ ВХ п: х : гя зх Ії ї 3 Ж Ж Е ще :
У М в В В В В В
ЗВСКІ яаО ДЕ «ТО БО «250О АВМ; ЗНО ЗИ АБжОЄ ЗИМІ УККЖ ЖІ ЗО «в; МАМ ИМСЮ ще ОЗ ЗМюВ Іжа ЕЕ імпульси проти дехонвольсваної маси са...
Фіг. З
МОНА: : и З тк : : І а: ї і ! ! В і : і і
Я Е і : ї Її і : Я ! Е : 7 і як ! : і рі : ї : | н і
ТУ оте о ответ ежсткттнттв, 1 їх і : і Ї І дов: і й і : М : : : І
Ге : ' | 1 і : | 1 і і : НЕ і: : І | КЕ ,
ЗК ї | З і : ' | ; ! : і , : Б з : І рі ї : Е 1 ї ушцтктт тот дет пгт тек І ТИ ТИ ен яюК я її Таконія зля ли хчк пи кю я | Пттепджєююннн. Я ОД уж 5 : 7 ли ї : Ту тт у Дюка важижаьваьиьиь : ЕХ ши с КВ ВК ДИ АК Мелі ваті відходи Види ВІДХОДИ , зо 188О3 дО жо Мд
Фіг. 10
МОГ ВАШ а пьда: я ! ! ПИ і к НЕ : НЕ ї й : Ї Кі заз: р! емо; ; І і і
І
' Із ї Но пе і і 1595: ; І «1 ! он ; Ні, ром є 3; : ї ФОР дюн ять тю тиеті ж няття тя птн пд і і . : пав Зддй, ї пня вті тет пн петее етнос, і ск ! и и х / хі і шт р
Ще хи Ра Й 1003: - їі 3: ! о : ' Гу ! рі : : і І ще їі я д і
І і. ї ; з ! / у г и ІН
ТО і удддинцнниннцниннттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттня ЗИ припої. г
ЗО Сікйвве вно ВІ ХОДИ 0002 ВІДХОДИ, й БО їо іо то ЗВ заю зо ва
Фіг. 11 ще хі ще певна тел Я
Я ВЕЖ певЕ юне ВО в ЗНУ ВО ОВЕН
Фіг. 15 т дтч й є мога 4 г
Й гу
КО 4 Е
Ж ї їЕ аг А й 130 я В
Ії 4 й ї2о З І хх я 1:
М - її . її
Ії по т:
Тк хх . її
БО г. й їх - її
Зх 55 її хх 7 ш ї 4 5 її з те
Х кч їх п рн ннвнннтентнкехеВя о Кетанов нку нн еувнваненнтнвенн пічне ен в пок пак нат нафту нік ку, нкктрентнннку? пікнік Кф кіски Ак тк тя кдукіттіннікьніня х 4 Кк
З їз 15 хв
Фіг. 13 «І СКаН стлхчдсвіу ва СК су олив оозя дата ноті о ДеКОМВОЛО Ширина 0000000
ЕТ те ПАТ Хв Є почу і УВ А АИ УМОВІ І о КНЕ ї пи ее НИ ? зовано "б ізотопу : ї : ше ТОМИ. : й і ке ЦЯ р ясву : й і : т її : Н ки : Н т ї ї я ; Ї їх : ї я 3 ї
ХАКЕ з :
КЕ : ї - : ї
ТЕ ї ї
ШЕ і Її сн ї хх ї
ЛУК ! їЕ : ї і каві: : : я й Е оз. ї ї з Ї юка В ї дош ї 1 і ве і : гри Й да у ї
МЖК ООяЩЕМИХ осот депо дднод ня і Ї її й ЗЛИХ УК В В й і ОІД ТА ТОВ, таз :
У ЕВ У ок,
ЩМЖЮ ОО ЖАКК ЖХЕ З Же ще ША Же ХУ; НУК КМ ОМЕК осЗБюОЮ ЗХ БЖЮ ї я а с Н т вик жк
Змпулься проти деконвольованої мери гео м)
Фіг. 14
УНИЗ ИЯ ВЕНА НОМ ХВО КЕ я шин нн ос нн я і ФМГ етТНн Бик БОЖУ оон що В ооо пеннтнденннтенн ВВ ен НКОВКЗНКН, ВКНК ж Як Е
Як В й : о конк шо доеки са Ж г ст ши ск с м ННЯ омозжгетні безризикові ЖЖ конку Фо одееооке писок кн яй і шин нен шен ше:
ЖЖ Ж КЗ сковно щен кое пе онко
Гетер саргеОтні нан нн ОО я НН С НН ОС ПО пннннннненннен ВОВК НННВ НКВ, жо - з совно 5 ме ж сан кв нини нн с нн я я
Жкех Дт рак как їз о. НН х сто МН ск що скул
Мекоменантні пн АВВВВВВВВК, сн ВВА, ВВВВН. вевнен, я ж Як г
Фіг. 15 а нх щ З Денор! б 15 й «Донор
В є о а ДенопЗ ж - во ; Денсою
ФО фаянс В.О Х вх А га її: зач зок вежа на СЕ - с у ов 2 Пе в її А Десни е й А вх х д з 054 У о 13 її
Дао бідну
Ї- ь З (о вок ов хг
Чає після стимуляції годі
Фіг. 15А
МК я дк і : 8. ВПелЛь оо. я- ВЩЮ і ТТ ризику 5
Я ж ік «в- пбезризиковний ді де их апель що
БООБО0ОЯ ох Ах я її і: а ад з ж СІВ, з
Во же Є жо ОО : х ї Ї у квт с У а а 8 72 1858
Час після стимуляції (Кк (годі
Фіг. 158 х і хо і вв. 7 ше У 3 я в . ха
ФО ж е Гетерозиготні вк 1.5. . я Кекомоїнантні пи і я 5 го о : що. ж ж в
ЕЕ | - Ж же взяв ж ж а ще -ве : ! - а. ї ок ж
Баш з » с 2
Годиви пісня стимугкції
Фіг. 17 й ! Ж й т я жі що ча Е то -Й І «і ; мах | 1 щ Ї янв со чере -- ризик безризикові гомо гетеро ГО
Фіг. 18ДА з птн дання це одини вен ні п. ЯКОЮ я ВЕК 1 і 1 з : я ;
Е : ! ха Б щ ЮК Я а ї-у ї се і : я о і- і : що нки . ши чи щ ох . -й ее й | | й... ме є : тн НИЗЯ Кк сект везризикові ризи гетеро ТИ ЗИКе гомо " тОомМо
Фіг. 188
В
ЕЕ фо 20
Ки о Лео лк ше МЕеувхух
ФфоООї5я по Денор2
ЗШ Ф а Донор а ' 2 ЙО дей чт Донор
Сон 1 ее з и и й тре з жк за я Аовор 5 ж а в с-я ро дж 2
ЕЕ ш бо т ;
Е їх ї їх ї -
З в. око,
Час піспя стимуляції (годі
Фіг. 19А я 5 . Донорі
З зх жо Довнорі а т й Мовор 3
З і жо Донор а : І а зані охо Ж й ль хм З вах с» а рег с я те я я т? ж що
В во б ш
Я
ШЕ б Вже
Час після стимуляції (годі
Фіг. 19Е
Клінічний бал
Ж
Еш МОВ КЕНЕ Я я хисдккх чех кекккюкикюкх Е а се пе и а і жк х ї ;
Ж МАЮ
Е ж зе. ЖЖ т о жи а ща чинній нен Ф -і - УМО я пенні ВВ нен кдд дня с хх ек 0 (5 й і Я Ко ; с КК кг -к « Ех М ке ме де що -К У що й ее Ка ж Же Я
Ко У я Я се де х ме щх в" Ф Ф є
Фіг. 20А
Гтопаталогія к- Б -к й
М ж ща ке ЕЕ КЕ же а. ЗМ;
ВК зд
СК дя ї
АК ї МЕ 7 ж г 8: пеиіуннх я т
ЕВ | . ; - софох їх з ях ща що. і
В
Сх ї ххе
СК щ- вед їх
Же ї х е жк шен 7 о я в Ме ше де
Ка КМ ях й З АК що
Як нм ще є Як ми М - се 2 же «сок е я
Фіг. 208
Клінічний бал
Є АГ ж
Ж
« Ж ван я ПО е Ак. й
Я ля дон Кай дО о З ей хх ще 5
Ж ч - й з
Ж ех ї ї няні й Я: ї с еннй Є вв Я х В
Е у че Ж и. жене ке Ж ких, ї де Е
Я ї Ж нн хе й х
Ж ХК дими МУ кн жит Х Ух як р ша хе с шк
Фіг. 21А
Гістопатопогія
З : Я що опвкдкют. оо ЕЕ іже ак є теософетех -- Ха 5 : щ Ж в хойююх
Т. й жен литасі БеТЬТА спа! БеПЛА жів РТ З : сяк і
МЕНШЕ А Ра зу в-- МИ
Фіг. 21 ї я я і в кВ в пох чик же кн - МІЯ
Витягти товсту кишку
Виділити клітини. власної ппастинки слизової оболонки
Фенотипування клітин методом протачної цитометрії
Фіг. 22А
Т-клітини
Якій і ж 2 дк
В. ч У
З же пере» з : х
Ж и піхви
Ух В ! . я щих К-Я У і . й я ХК спераюнфиснкмком тасві ве-Тяд те РОТА фоновий Й юеннюнннстюннннетнсюнкеннннЇ миіві дт Мі а-і. мищі
Фіг. 228 б-клітина
ЯкЕКУ в
Е і шо зи че хе Зх їх КАМ і ж -к км хі хе а х і щХ | є а ж т
Ж КК Ше деко в «хх
КО опжниюмфонмкх шен снннндк ни у ге і і , Ж ве ; Пе есеете нео стосоврейсоевовоях -
КУ кі сх. -хх н ум сі Е ще х як Ж вав Бета мів БетілЛА
ВД о плжажччнчкччтрчтннчтсчанн Я. Код пгЙ миші дт Магіау-мищі Дт
Фіг. 220
ЦИ ж ж шо чер т
Е І зеедек» пак хх мо Зхіб . «і | онко і їх іш З ! 5
МЕ й 2
ЛНУ, оленя
Ж. с є - о м дет Е ще А а щіезі ве-ТіА тю кет
Миші дт Ме іа--мМищі
Фіг. 220 макрафаг ;
Е 3 : е я че .
ЧЕ є за зеоетютюсі нетто в я ; щ | - жк я | КЗ - ож КК хх Ж зиск. Сех а обро фі нен кни нене КД ДУ нннннннннтнренннннннте ті! вБО-ТЯА Мазі БЕТА даю, -ї Бажжлнкккжкжях ко теоєткяхня ки нкникй . бен еко йн ВИМ миші дт КЛИГ ані» мив
Фіг. 22Е г НК вх іЇої : ек Ж
Ж Ф я. гі до Як яке
КЕ 7 а х шк дае т я : ко і чек
Е моеухехх поеовебодееесмнся ення х
Я сх ее кн а я «б уакалотюннндятотриаааккння пт - «би ше АВ щі БО-ТЛА штщеї БеТЛА миші дт Магта-» миці
Фіг. 22Е ве зх де хх 515 і. овес я ше 1. . ад ші ші. . 7 З і Ж г ї Х й ані а екю ок Су ее са ке ве ще МЕ дк « «ЕЕ бака аж жа є Ат уе А я ок Кен 4 улллялляллялляллялляхляхлхлхлхнК 0 Мегоголололотлтлтлтолтелчлнни) 00/- Кесеесеесееееесеесессессессссссссссоов
Кент роть ТМЕсЄ ТІЛА введення введення
Фіг. 23А 400. 400- ех с 500 0. 190 і.
З ЗБ
«7 | Кс «ЕЕ ще Кз КЕ «Й ЗИ г
КАМ ККУ ям о ож А
Конероль МЕ: ТЛА введення введення
Фіг. 2383 о я 20б- й ; З 3 о | . -і ше. 7 10004 .
С КО
Ж фот ба де
ОВ и НИ е одолььььсьюьии) Кокккксккккк ск скккккккскхкхкк Ккаккиккксккиккикиккиккиккикиккикио?
Кентроль ТМЧЕх ТА введення введення
Фіг. 230 15004 те 1030 ї п
З . . ще -і 800 : - с і . . - хе КУ ке, ол с п вв, сін КК ке У Кк ке й ще ке
Е я їх КЗ ж м «Є ще я Б ж
КК ВК,
Контроль ТМЕє тіла
Фіг. 230
У5О0- 20005 ї 1500- Ії їх х : 5 х -е З є 1000- т ОО М ї - ; 5ОЮ. с зажим Ж дм ко Ки як з хх Е 3 Боолдлялянлянаялнлянанлнлякннняки,
Конероль ТМЕе ПА введення ввадення
Фіг. 23Е 104 ві ї
Фо «у | З овоаах чен В й МОМ 8 й МЕЖА
СЕПеДО ов ж ви ще ТМ г ТА
Фіг. 24А
БО во жк " Середа ектів "вище МБ ТЛА
Фіг. 24Б вач сере ле :
В Е аю см т Е Б
СІ ява Б х ОО
Е а
ОХ середо Тука ТІЛА
Фіг. 24С що ких -х 15000 о - ОКО кп. ОКХ щ МОХ ща аю
З КО
-4 В. я о
ОККО ф. оббзвву п Ван середо ТМЕш ТІЛА вище т пове - 100. с
Е ЗШ ОО
ОК зн КО ОК ж ; ОМ
ОХ
ОКУ ве тМЕау ТІЛА вЯще ТЕХ в.
; Зх 1: ті о ш ВК з МУ " го» Ох
ОВ
. . ЗМО МБО
З З МО
ЖЕ 5505 п ТМЕо ТІ ТА ище чо
Фіг. 24Е
Біспацифичний |ВО-гай . ТК я а
Ох я ї и ах ке Ку Її с ке Ку зна ще я з У ї і й ее Хр х ОВК КЕ
ГавВЕ А б КЕ;
ТК Ух Ко КИ ди ф
ОО ї
У М
Ко у песх Ер
ЗХ :
ЕК ї
А /-- же У У я ет со хо ее
ОК т хна В гав Яся Кз ке зи дан нау / СЯ ща 7 ОВ ко ок з «шаерні чарядженя
Е Бош МО З ї кв ші види шу я рик шарнею « вмінокиспата : вептптидний е дмінокистота з
Ї ОО ких в ій - еккех вич : т лЛІНКЕ ностилежним зарядом
Фіг. 25
БіспецифичнийІшс-Раб, СНІ/СІ, обмін же Шк 4 З ех кА ОК !
Є МНЕ Али че і їй я і сну уч Й ит я Хшя Ж
Бав2-/ йо ке оте жо КО
Є СЕК Ов
Є і. |і с.
Еф зів шарнір ж амінокиспота . і дпептидний а Амінакислота з : ти .шНКер протилежним зарядом
Фіг. 26
Титріда-кав: сбмін пзнцюгів - . зоре дак :
Титев експресії (2953-62 та обмін панцюгів : СфОбидві помінані місця
НЯ Монте с
Нй Єускінц; обмін й ій: ЩІ ші
НВ ИчУкінн СОМ
ЯК и І
ІЕЕ ТИЙ ее ай
Не. Без обамену кину я
УЯВИ ЕЕ як ТЕБЕ ЯК ЕЕ
НЕ ЯК ВЕК вх ун ТЕКУ И Я КЕ НВО вх пе не ЕН КК я кан яв ЕЕ ВВА Й АВ НУ щі | Ес и ЕВ ВЕТЕ ОЗ ЕК ща Кл к ув в І ЗИ ІИК ВИК ко | У ЕНН и НК
Е Я ген ви МО КВ КК ж їж ІЕЕ ВІ ХВ ВОВ М ОКО
КЕ ЕВК ІАЕ ВЖИ ІДІІХЗИІВ ке ЕК я у Ко ЕВ х у из хе сх й Ж ХЕВШІЖ|Ж ХК КОЖ сх. усна каси КВН КИ ко ВЕК КЕ се
ВЕ КК І БЖ зи Ї Мих ЗЕ сивих
ЕК ЗЕ ВЕ НІ ОН ЧТ
ННІ НВ НЕ и І ЕЕ
ІІ х ЕХ ЗНО М ЗЕБКСН ВОК КК К хх
ЕЕ ЗЕ ЗОН ооо ОК КЕ В ВОНО о ! еЕСжЯя ЕЕ ЗОНА НИК вв еВ В ОВК
У т ЕС хи ЗОВ ОНИ КК КВ КВК АВ т ЕВ,
Ж ке МЕ ще ККУ У ЗХ МІХОВ Хе ОКХ ХОМЕВСиИ ВИВИХ ПИ
Я ЕЖ: ЕЕ ик Ж шк и ки ж У о КВК ВВ Кв снх
ЯЗ КК ск Ми ХВ Жи ВК КВ ЕК ож.
Я в ЗЕБОЖЕВІ алу Жи ЖК ВХ ВЕІНЕВ ВІ ВЕ КВ ШВА ВК ВЕ
Ж вх ХЕ ШЕ Ж ЖЖ ЖІ Вис с ! ЖИ ПОКИ Жук "НОЯ ниж ХИНХІМИКІВ КНИШ ВІВ В КЕКВ ЕН Б СИЖЕОКОКОВОКВ ХА Мушу ом ве дм жом м шодо Мом МО ТОМІ ЖК З о Ух УК КОМ У Ак Фо за Іо опо Ева сао
ПЕКККЕКЕККСКЕКЕКНВК С се сКЕСЕСКСВЕАКВВКА ЕЕ вккяКик хом мо т М мо и Ж у Ж Момот що мом ов мо КМ моб Мк Я М ЖоЗу м в мо ша ої ОМ ОБО М Ж З 0 ШМК ОО ЖОВ М о ЖЖ ОО ВК Од св 0 0 Ж ме Яков ХВ Шо ко да 5 М. ко ща ОМ ЕВ
ЕК ВКаУХКккАКакссаксЕс:кккккЕІсЕкакккикк ї і какая їря
Фіг. 27
Титр ідз-Каб: мутації зарядових пар зач ване діт фіат ока
Тито експресії (233 Ма я Оу 5 ї з у
Б. ее:
ВЕЖ СЕК
ЗЕМ
ЕВ У ВЕК дк
ОМ ех 03 Я и пи и п В
Вес ВМЕ ви
ЕХО ЖЕК КВ с с ї о ОН - ЗМК вав В - ПЕВ КІВ, - ВОВК во в ЕК я сон о о «ЩЕ ша М ВМІВ
ПЕ Е КВК Кох ря Я ВІВ КПВВ ЗК Ж ХЕ Ой жо : сивих 5 ен Б , ВОВОмли в Х КИЛИМІВ ВЕК нови т п о ОО її і
ВК В Во в Вес
ЗАВ Вино о ТЕЗ ВОК дю
УК и и В у КК І Я КО КИК Ж с. ОО о их
Пес и ВМ ВК ОВ о ЕКС КО Кан о Б, о я 0. м
МЖК вс ВК ис ВК
ОВС ВиЕ Ки о ОЕМ КК
КОВКА ВВЕ КВК я о х3 ЕІ Ж
ОІВ ХК с Ох Я «БО ПІК ВЕ хо КК МО МИ
УМОВ ЗК ЕК ІМ к ЖЕК МЕТО БК х КВ в о
ПЕТТІ викиди КЕ ВВ ЖИМ,
З КК її ТЕ ПЕ ЕЕУ СОКУ А МІК щК п ях В КВ В ї МЕ Сх ЕЕ ше ТУ НИ НВ і Каву її КЕКВ о Я, Ох шо Вена ку ЖЕНА ВВ ВИ Ве І с ЯКІВ КОНЮ пн Я ВВ ех» ща т мож Ж що т У У Ж ДОМ дО б КОМ хо МЕ Кот ЗУ у М Ж ге БК Я зи 0 ОМ У Ох В Я ДО Ж В ета й зо опе
СЕСЕТЕКККІТХРІоВ ЕЕ кс ЕЕ ЕЕ
Бр щомо 5 ОХ М Ерх о в О М о к кіма З М КО вБапиипнвкх
МО Ж ха ОО з фе М Р А о КМ М Ж Ж УК ок МОЮ ШКО Ж и М ЕОМ Ж КУ ЩА Ж ща Ж об М хе
Ех іхкукіаккахниккоекккакаккксиІікЕвЕвкаакЕнхЕ
Ір
Фіг. 28
: ке
Й пииих : т | ке : ШОК і : КЕ , в : т Шу, : : : : ДИМ : : : : КИ : дня, : І лк ї ї : МОН : : се : ОХ : до п. шк 5; ТО: о : : яв о М
З о оо Ох ка ЕК ХО . г МК и ХО ПЕ КК ОО хх : : о с 0 с о г | : ПО В У еВ ЗО й | о о шо хх ЗЕ ОХ СКК о. п ОО ЗО МИ У : ПАН, р ОО ЗК ПЕК ОО МІШОК п С : ОН: БО шо С А і о: в пи : ОО п с о : в В с о : шо ОО по ОО ПВНК М ОКО : змо да ПЕ ХО ОЗ ОКО М о с : КОКС КЕ вимо п У с с с о ПЕЖО ОООн ПОВ ЕМКОН М МОМ УМО : ОК ЗЗКОХ ОХ ОО. о у ОК ВВ ВВ : с о. с о. ов
В: ООН що ОО КБ ВОК ! сн : ПК кін зввий обмін Мкінце ше щ іє - стуку са
Без обміну и ще сібмін пакцюг
Фіг. 28 ість їдсекав ТОТА: сом
Активність Тс з Та лачцюпе ТІЛА й їй є щ . Ще во -к т в
І 5 ХЕ : ЩЕ - : ! с і КЕ
Ме ще Кі ще. . в за 5 те КЕ і. 4 : " У ве з з йо н ха - | 5 во ї " вва Я т . з. в т «а, вже че щ 5 з о щ о 7 й КО ще Й . : й . т Я паж ЖАЄ КВТ КА КААЖКАІЮЮЮАВ АХ й ; ; калюж кл лі АЛ АЮАЖ ВАЖКА АТАКА КАЖКАТЖЯ ще
З ' ТУ Ба с. ех пил юАУКХАХХ В
В во - Страж с з г !
ЗКУ М укклялллудйду Ин те - 7 | | і щ -е з жо 8 «З х в В в є г г с с :
Як с і 4. сужю. ДеДеДеДЯ : пом юєивекоКя пет ек ши ами нКиМиМм ЕЕ Зах
ЗКУ КЕ З; ДИВ ВЕС ВОД от Ден фено в ее М п, о
ТЕМУ ШІ ЖЕК ПОЖНЕШ МО МИВ МОІДоХ І и Ед хе КІ ХІІІ ЕВ КУМ МНМ ШЕ ВМ ВИНО КМ
ЖІ ЕЕ КОН вав шИшиваМих ще пиши ше я
МЕМ те ке вача пЕше ТЕ ому І ЕСЕ се Я Же КК Киев ще У 5 их й У Я го МЕ ж В. ЕЕ ЗЕ Б шк МІХ и М У що 5
Фіг. 30 п сін дав тю й
Активність КЗ-Бар ТМЕд: обмін сполвич КА ланцюпв МЕ
КО сбидві вомічяні міцяМи щу м ЩО сС-кінцевий обміні
БИ У пд г. си «Ех. я а . шоси же о є М-кінцевий всміу -
Б
Ж їй Без обмі
Ж : Без обміну ні -
ЖЕ і
Ех її в , З г о що с к.з 5 я ж 8
КЕ - з же Кз - х ш - ХХ ше р ті - В е як я що чат: ще що См. хх
Ж се. 5 Ех , ; фе Око ке «жах шк М
ОК сонна оон с В В доня В ВВ, оон дриля дол вд
КО я В: х У ТЗ Те КОЯ ТЕ ет Бон ся ка нак х я сі Я шій й ШИ ШЕ - в. З х У шк с с. Ох 7 ях ся те в бе ва 7 - з. « шк « г Зва З»
СУ ї З
У я х - пп КТ т тр т тт р т тт КТ Дт ТТ т тт тр рт т тт тд т тт тт зро ХУ, МЕККА КК МО вона сумом о саше тири шими
МЕ, Межа ІІ І КО МТ КМ и М ВВС М КІ КО М ВЕ ПЕ КИ ІК І КІМ І ЕЕ МІ ВК ВИ шоком ик ква иАЕиннЕ Ким
ШИХ, КИ В по ву Ед и ВЕ КМ ІМ У ЕК ХА НМ А ВІК КАТ ДЦ ВО МИ ДІ ТО ДО ТМ НК ВИ ДЕ
ПОМ ОВ В в иМ И М В В И в тоМ ПОВ и В В Ин МО ра и м вен
ДОБ ЛЬ вм льох мМ ех ДЕН КК ВЕ У М МУ СоіШТА ЛЬ Пра Мам» Бош Мои М й М ДМ ПУ ЕМ до ТЕМУ» іа
Фіг. 31 ші меожаеоті дове ті я
Активність а» ТАТА МЗП ЛА і
Що ж : шиї «Кк Ех
І ЛИ що БУ Я дії - шх ж як шо г і що ля я ше,
У Н - ХЕ «У ве ; - г ї я як
БО і: г : і о й е- Е з Бя
ВЕ жі - 2 в ши як -к 5 У .
Ме: с Б ; що З т ще
ОС 7 - -
В І - ще Я ох же Е5Я 8 з е ї Я я пе Б с Щ с З : я і З ОКО Ж до що У Я щ- : с АК МК що же . шк В ; : я Жов с Б г « 8 в щі о Я ден В ВО аю З
МК я-е я пах в. ЩЕ г о Оп в А і а В п ПО о а са
І о с р З. «Ж х
Н ШО - я . м к МК о с ж ! що ЗЕ ШЕ: «г 5 БО ва ; ї Ес щ ; ї що « КЗ ї те ЗК ; ще лин ни и в нн і и кн и ни м и п п ши Ж ших пики Нв М ВК КК КК Ки МА А АХ ЕК КЕЕ
МК и А М НЕ ВІК ХП АК В и КИ І А В М В и МИ и ТИ НЕ ВХ
ЧТ ВИ и Км А І ІІ ВМТ КЕ М В в ММК
ХМК МІ ух ПЕК Ки я М КИ о КО у Му МЕ ЕК Ким УМ МЕ І КЕ В І ОХ Ме МО МИ МЕ и МК ШОКОМ
Пн ов МАХ ВЕЛО ЛЬ вовна М МИ Ки ЕК Поет ВЛ Кн ВК ВОК ОХ сяк
Фіг. 32
. с-г со вет ;
Активність шо-тав ТМЕо: МЗП ТМЕВ : КИ ! ДЕК я Х і ше х : лю : 4 Ох тк
УЖЕ МОХ з с -к Ві СО «к жо ТУ и ще І ще іе- --е і
Іі і г І з і ах .
В Б в в.
Ж уві Б : щ я
Що к: БУ жо А й що
ОО Кл сх ЩО яко о ЕЕ -- : Я ! . шк ж. х Я х З 1 шк ШЕ У я ЕОЯ М з 1 ОО єи й : Ж КЕ в щі - с ОКО ях х щі Сх ЕК Шо 0 Оу Зк ок хх з 7
З ЖК: ОХ ОК ЗК шою З хх М ЕЕ 5 вот Десеточететн сонне К Вфісюодонетен т нер нт етері нт сннісспттснтнтон Я ВВ петопеетн тік ннісостіссесісвсвотіоосоороіттс фену я 1 я ше ЖИ ік АЖ . км є к я хі ЗХ сей же ши ОВ ж. . я : ж : т ПИЛОК у ПИ о ЖК. « о ц ся 1 п Ох їх с 5 У х й
Н ШЕ че: я ве і хе СКК пк сої ;
Н ХХ ох щ ще ща ще я з і Ф що БУ пен
Ж ; : ;
І песня нудно нотному урну тя фуд рин ор чек нт нд нин дя Кк дн ди коди дно трясти у дану у пу пд ри дон прик тр р пет нки жерканння чи кому м М Ко де ум Же ис М о МЕМ М СЕК ОВ ВОМУ Ти М Ве Ви БІ мо Мо пек ВУ КВ М ВМ УНН имеет икиКЕВВЕЕВрпВИ мимо МЕ
ЩІ по м и щи Я ша Х й МКМ
МІШОК и нни е НХ Фе ШИХ ЩЕ ПУСК КАМИ КМ ЕЕ ПЕОМ ДІДеКо Меки пове КК ТИМ ТИХ М як В ЕМВ ОВ ее в В ще
АК и о и
М Я в ЕЕ А ДЕ КЕ зуих
У
Фіг. 33

Claims (21)

1. Антигензв'язувальний білок, специфічний для ТІЛА, де: антигензв'язувальний білок має комбінацію послідовностей для ІСОКІ, СОВ2, ПСОКЗ, НСОКІ, НСОК2О 1 НОСОВУ, вибраних із таблиці нижче: ІСОКІ ГсоКО ІСОВЗ НСОКІ нНСоКаО НСОоКЗ (во І КО І |(5ЕО І (5ЕО ІВ )|(5ЕО 1 МО) (5БЕО І МО) МО) МО) МО) МО) КА5ЗОЗУК5ЬО | САЗЗКАТ |ООХУО55РІ | СУУММ | ЕІМНАОМТМУМР | СУСК5ТТСУ КА5ЗОБІММ | АА55ЬІО5 | ОО5У5ТРКТ | БУ ЕМ5 УТХУ5ОМТКУМР | ЕТО5УУСРрУ
2. Антигензв'язувальний білок за п. І, який містить послідовності варіабельних доменів легкого і важкого ланцюгів антитіла 3ЗВ3 (5ЕО ІЮ МО: 22 1 24) або антитіла 9С8 (5ЕО І МО: 141 16).
3. Антигензв'язувальний білок за п. І, який містить комбінацію послідовностей легкого 1 важкого ланцюгів, що мають щонайменше 90 90 ідентичності послідовностей із послідовностями 5ЕО ІЮ МО: 66 1 68 або 5ЕО ІЮ МОЗ: 58 1 60.
4. Антигензв'язувальний білок за п. 3, який містить послідовності легкого і важкого ланцюгів 5ЕО ІЮ МО»: 66 1 68 або БЕО ІЮ МОЗ: 58 1 60.
5. Антигензв'язувальний білок за будь-яким із пп. 1-4, де антигензв'язувальний білок є антитілом.
б. Антигензв'язувальний білок за будь-яким із пп. 1-4, де антигензв'язувальний білок містить фрагмент антитіла.
7. Антигензв'язувальний білок, який перехресно блокує антигензв'язувальний білок, вибраний із будь-якого з пп. 1-6.
8. Виділена нуклеїнова кислота, яка кодує антигензв'язувальний білок за будь-яким із пп. 1-7.
9. Вектор експресії, який містить нуклеїнову кислоту або кислоти за п. 8.
10. Клітина-хазяїн, яка містить один або декілька векторів експресії за п. 9.
11. Спосіб отримання антигензв'язувального білка, який включає: а) культивування клітини-хазяїна за п. 10 в умовах, які дозволяють експресію антигензв'язувального білка; 1 Ь) виділення антигензв'язувального білка з культури.
12. Фармацевтична композиція, яка містить антигензв'язувальний білок за будь-яким із пп. 1- 7 1 фармацевтично прийнятний розріджувач, допоміжну речовину або носій.
13. Застосування антигензв'язувального білка за будь-яким із пп. 1-7 у виготовленні лікарського засобу для лікування запального захворювання кишечнику, хвороби Крона або виразкового коліту.
14. Застосування фармацевтичної композиції за п. 12 у виготовленні лікарського засобу для лікування запального захворювання кишечнику, хвороби Крона або виразкового коліту.
15. Застосування за п. 13 або 14, де станом є запальне захворювання кишечнику.
16. Спосіб лікування запального захворювання кишечнику, хвороби Крона або виразкового коліту за допомогою ТІЛА у пацієнта, який потребує цього, що включає введення пацієнту ефективної кількості антигензв'язувального білка за будь-яким із пп. 1-7.
17. Спосіб за п. 16, де станом є запальне захворювання кишечнику.
18. Застосування антигензв'язувального білка за будь-яким із пп. 1-7 у приготуванні лікарського засобу для лікування запального захворювання кишечнику, хвороби Крона або виразкового коліту у пацієнта, який потребує цього.
19. Застосування за п. 18, де станом є запальне захворювання кишечнику.
20. Застосування антигензв'язувального білка за будь-яким із пп. 1-7 у способі лікування запального захворювання кишечнику, хвороби Крона або виразкового коліту у пацієнта, який потребує цього.
21. Застосування за п. 20, де станом є запальне захворювання кишечнику.
UAA201911907A 2015-12-16 2016-12-14 Анти-tl1a/анти-tnf-альфа біспецифічні антигензв'язуючі білки та їх застосування UA130718C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562268432P 2015-12-16 2015-12-16
US201662333063P 2016-05-06 2016-05-06
PCT/US2016/052006 WO2017049004A1 (en) 2015-09-15 2016-09-15 Tetravalent bispecific and tetraspecific antigen binding proteins and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA130718C2 true UA130718C2 (uk) 2026-04-29

Family

ID=59057540

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201911907A UA130718C2 (uk) 2015-12-16 2016-12-14 Анти-tl1a/анти-tnf-альфа біспецифічні антигензв'язуючі білки та їх застосування
UAA201806971A UA124305C2 (uk) 2015-12-16 2016-12-14 Анти-tl1a/анти-tnf-альфа біспецифічні антигензв'язуючі білки та їх застосування

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201806971A UA124305C2 (uk) 2015-12-16 2016-12-14 Анти-tl1a/анти-tnf-альфа біспецифічні антигензв'язуючі білки та їх застосування

Country Status (34)

Country Link
US (2) US11104745B2 (uk)
EP (2) EP4640705A3 (uk)
JP (1) JP7263007B2 (uk)
KR (1) KR20180099723A (uk)
CN (1) CN109311971B (uk)
AU (2) AU2016370659B2 (uk)
BR (1) BR112018012096A2 (uk)
CA (1) CA3008267A1 (uk)
CL (3) CL2018001596A1 (uk)
CO (1) CO2018007355A2 (uk)
CR (1) CR20180365A (uk)
DK (1) DK3390444T3 (uk)
EA (1) EA201891322A1 (uk)
ES (1) ES3064312T3 (uk)
FI (1) FI3390444T3 (uk)
HR (1) HRP20260195T1 (uk)
IL (2) IL314885A (uk)
JO (1) JO3816B1 (uk)
LT (1) LT3390444T (uk)
MA (1) MA44060B1 (uk)
MX (1) MX2018007424A (uk)
MY (1) MY205021A (uk)
PH (1) PH12018501284A1 (uk)
PT (1) PT3390444T (uk)
RS (1) RS67851B1 (uk)
SG (2) SG10201912002YA (uk)
SI (1) SI3390444T1 (uk)
SM (1) SMT202600071T1 (uk)
TN (1) TN2019000275A1 (uk)
TW (1) TWI799368B (uk)
UA (2) UA130718C2 (uk)
UY (1) UY37027A (uk)
WO (1) WO2017106383A1 (uk)
ZA (2) ZA201904491B (uk)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110229471A1 (en) 2008-11-26 2011-09-22 Cedars-Sinai Medical Center Methods of determining responsiveness to anti-tnf alpha therapy in inflammatory bowel disease
KR101982899B1 (ko) 2011-09-30 2019-05-27 테바 파마슈티컬즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디 ＴＬ1ａ에 대한 항체 및 그의 용도
UY35148A (es) * 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
KR20230109779A (ko) 2013-03-27 2023-07-20 세다르스-신나이 메디칼 센터 Tl1a 기능 및 관련된 신호전달 경로의 저해에 의한섬유증 및 염증의 완화 및 반전
ES2894963T3 (es) 2013-05-17 2022-02-16 Cedars Sinai Medical Center Variantes de TNFSF15 y DcR3 asociadas con la enfermedad de Crohn
EP3022295A4 (en) 2013-07-19 2017-03-01 Cedars-Sinai Medical Center Signature of tl1a (tnfsf15) signaling pathway
TWI703158B (zh) 2015-09-18 2020-09-01 美商希佛隆公司 特異性結合tl1a之抗體
CR20180365A (es) 2015-12-16 2018-09-28 Amgen Inc PROTEÍNAS DE UNIÓN AL ANTÍGENO BISPECÍFICO DE ANTI-TL1A/ANTI-TNF-a Y SUS USOS
GB201522394D0 (en) 2015-12-18 2016-02-03 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
KR20240095481A (ko) 2016-03-17 2024-06-25 세다르스-신나이 메디칼 센터 Rnaset2를 통한 염증성 장 질환의 진단 방법
KR20190082815A (ko) 2016-10-26 2019-07-10 세다르스-신나이 메디칼 센터 중화 항-tl1a 단일 클론 항체
TWI828625B (zh) 2017-06-25 2024-01-11 美商西雅圖免疫公司 引導及導航控制蛋白質以及彼之製造及使用方法
EP4424707A3 (en) * 2017-09-19 2024-11-13 Tillotts Pharma AG Antibody variants
MA51523A (fr) 2018-01-05 2020-11-11 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour des anticorps anti-virus du chikungunya
CN112585165B8 (zh) 2018-04-25 2025-02-14 普罗米修斯生物科学公司 优化的抗tl1a抗体
CN111909268B (zh) * 2019-05-07 2022-04-19 北京天成新脉生物技术有限公司 低免疫原性低ADCC/CDC功能抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060及其应用
AU2020275413A1 (en) * 2019-05-14 2021-12-23 Cedars-Sinai Medical Center TL1A patient selection methods, systems, and devices
JP7500619B2 (ja) 2019-05-30 2024-06-17 アムジエン・インコーポレーテツド 抗体の二量体化を促進するためのヒンジ領域の操作
CN112513097B (zh) * 2019-07-11 2021-10-29 武汉友芝友生物制药有限公司 四价对称双特异性抗体
CN114423787B (zh) 2019-07-19 2025-01-24 昂科里斯庞斯公司 免疫调节性抗体及其使用方法
JP7792330B2 (ja) * 2019-09-03 2025-12-25 アムジエン・インコーポレーテツド Ｉｌ－２２の経口、直腸内、又は他の消化管関連の組成物及びそれを使用する方法
NZ787680A (en) 2019-10-24 2026-02-27 Cedars Sinai Medical Center Humanized antibodies to tnf-like ligand 1a (tl1a) and uses thereof
CN113121696A (zh) * 2019-12-31 2021-07-16 周易 Fab改造诱导形成的双特异性抗体及其制备方法和用途
KR20210095781A (ko) 2020-01-24 2021-08-03 주식회사 에이프릴바이오 항원결합 단편 및 생리활성 이펙터 모이어티로 구성된 융합 컨스트럭트를 포함하는 다중결합항체 및 이를 포함하는 약학조성물
US20230159649A1 (en) * 2020-04-02 2023-05-25 La Jolla Institute For Immunology Methods and combinations for dual targeting of tnf family members
EP4153625A4 (en) * 2020-05-20 2024-09-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York STRONG NEUTRALISING ANTIBODIES AGAINST SARS-COV-2, THEIR PRODUCTION AND USE
CA3183367A1 (en) 2020-07-06 2022-01-13 Gevorg GRIGORYAN Antigen binding molecules targeting sars-cov-2
WO2022010912A1 (en) 2020-07-06 2022-01-13 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Antigen binding molecules targeting sars-cov-2
KR20230039734A (ko) 2020-07-23 2023-03-21 오타이르 프로테나 리미티드 항-Aβ 항체
US20230322955A1 (en) * 2020-08-20 2023-10-12 Amgen Inc. Antigen binding proteins with non-canonical disulfide in fab region
CN116528897A (zh) 2020-08-26 2023-08-01 旗舰开拓创新六世公司 靶向SARS-CoV-2的抗原结合分子
AU2021377688A1 (en) * 2020-11-13 2023-06-29 Cedars-Sinai Medical Center Methods, systems, and kits for treatment of inflammatory diseases targeting tl1a
CA3217487A1 (en) * 2021-04-23 2022-10-27 Chimagen Biosciences, Ltd Heterodimeric antibodies and antigen-binding fragment thereof
CN121843714A (zh) 2023-08-11 2026-04-10 派拉冈医疗公司 Tl1a结合抗体及使用方法
TW202535949A (zh) 2023-12-20 2025-09-16 美商必治妥美雅史谷比公司 靶向IL-18受體β(IL-18RB)之抗體及相關方法
TW202542181A (zh) * 2023-12-26 2025-11-01 俄羅斯聯邦商拜奧卡德聯合股份公司 特異性結合類ｔｎｆ配體１ａ（ｔｌ１ａ）之單株抗體或其抗原結合片段及其用途
WO2026019692A2 (en) * 2024-07-15 2026-01-22 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunomodulatory fusion proteins and related methods
WO2026035986A1 (en) 2024-08-07 2026-02-12 Bighat Biosciences, Inc. Humanized anti-cdh17 antibodies and use of the same

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4603044A (en) 1983-01-06 1986-07-29 Technology Unlimited, Inc. Hepatocyte Directed Vesicle delivery system
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
JP3202999B2 (ja) 1991-01-31 2001-08-27 協和醗酵工業株式会社 肝移行性リポソーム製剤
US5830877A (en) 1993-08-26 1998-11-03 The Regents Of The University Of California Method, compositions and devices for administration of naked polynucleotides which encode antigens and immunostimulatory
US7820798B2 (en) 1994-11-07 2010-10-26 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor-gamma
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
JP4046354B2 (ja) 1996-03-18 2008-02-13 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 増大した半減期を有する免疫グロブリン様ドメイン
CA2722378C (en) 1996-12-03 2015-02-03 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that bind tnf.alpha.
AU760549B2 (en) 1998-04-03 2003-05-15 University Of Iowa Research Foundation, The Methods and products for stimulating the immune system using immunotherapeutic oligonucleotides and cytokines
HUP0200575A3 (en) 1999-03-25 2004-11-29 Abbott Gmbh & Co Kg Human antibodies that bind human il-12 and methods for producing
US6833268B1 (en) 1999-06-10 2004-12-21 Abgenix, Inc. Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions
AU783682B2 (en) 1999-08-04 2005-11-24 Amgen, Inc. Fhm, a novel member of the TNF ligand supergene family
US7285269B2 (en) 2002-12-02 2007-10-23 Amgen Fremont, Inc. Antibodies directed to tumor necrosis factor
WO2005018571A2 (en) 2003-08-20 2005-03-03 University Of Miami Compositions and methods for treating inflammatory lung disease
AU2006232287B2 (en) 2005-03-31 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US20110217310A1 (en) 2007-01-10 2011-09-08 Siegel Richard M Blockade of tl1a-dr3 interactions to ameliorate t cell mediated disease pathology
UA104132C2 (en) 2007-11-13 2014-01-10 Тева Биофармасьютикалз Юесей, Инк. Humanized antibodies against tl1a
JP6157046B2 (ja) 2008-01-07 2017-07-05 アムジェン インコーポレイテッド 静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を用いた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための方法
JP5522405B2 (ja) 2008-04-25 2014-06-18 協和発酵キリン株式会社 安定な多価抗体
EP2417164A1 (en) 2009-04-07 2012-02-15 Roche Glycart AG Bispecific anti-erbb-2/anti-c-met antibodies
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
JO3375B1 (ar) * 2010-11-08 2019-03-13 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية للجين a1 الشبيه بعامل النخر الورمي (tl1a)
US20120201746A1 (en) 2010-12-22 2012-08-09 Abbott Laboratories Half immunoglobulin binding proteins and uses thereof
UY33826A (es) 2010-12-22 2012-07-31 Abbott Lab Proteínas de unión con dominios trivariables y sus usos
WO2012161856A1 (en) 2011-05-20 2012-11-29 Government Of The United States, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Blockade of tl1a-dr3 interactions to ameliorate t cell mediated disease pathology and antibodies thereof
CA2846432A1 (en) 2011-09-23 2013-03-28 Amgen Research (Munich) Gmbh Bispecific binding molecules for 5t4 and cd3
KR101982899B1 (ko) 2011-09-30 2019-05-27 테바 파마슈티컬즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디 ＴＬ1ａ에 대한 항체 및 그의 용도
US8945553B2 (en) 2012-05-22 2015-02-03 Bristol-Myers Squibb Company Bispecific antibodies to IL-23 and IL-17A/F
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
CN105026430B (zh) 2012-11-28 2025-03-25 酵活英属哥伦比亚有限公司 工程化免疫球蛋白重链-轻链对及其用途
WO2014106602A1 (en) 2013-01-02 2014-07-10 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Antibodies that bind to tl1a and their uses
TW201444867A (zh) 2013-03-08 2014-12-01 Lilly Co Eli 抗ｔｎｆ－抗ｉｌ－１７雙特異性抗體
PH12022550138A1 (en) 2013-03-13 2023-03-06 Amgen Inc Proteins specific for baff and b7rp1 and uses thereof
US9580486B2 (en) 2013-03-14 2017-02-28 Amgen Inc. Interleukin-2 muteins for the expansion of T-regulatory cells
JP2016514676A (ja) 2013-03-15 2016-05-23 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＭｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ 四価二重特異性抗体
US10150800B2 (en) * 2013-03-15 2018-12-11 Zyngenia, Inc. EGFR-binding modular recognition domains
UA118028C2 (uk) * 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
US9683998B2 (en) 2013-11-13 2017-06-20 Pfizer Inc. Tumor necrosis factor-like ligand 1A specific antibodies and compositions and uses thereof
US20160052006A1 (en) 2013-11-22 2016-02-25 Sheila S. Pirtle Spray Bottle
TWI703158B (zh) 2015-09-18 2020-09-01 美商希佛隆公司 特異性結合tl1a之抗體
CR20180365A (es) 2015-12-16 2018-09-28 Amgen Inc PROTEÍNAS DE UNIÓN AL ANTÍGENO BISPECÍFICO DE ANTI-TL1A/ANTI-TNF-a Y SUS USOS

Also Published As

Publication number Publication date
LT3390444T (lt) 2026-02-25
MA44060A (fr) 2018-10-24
SG10201912002YA (en) 2020-02-27
IL314885A (en) 2024-10-01
WO2017106383A4 (en) 2017-09-08
BR112018012096A2 (pt) 2018-11-27
ES3064312T3 (en) 2026-04-23
AU2016370659A1 (en) 2018-06-28
US20190119407A1 (en) 2019-04-25
CL2021001179A1 (es) 2021-11-19
SMT202600071T1 (it) 2026-03-09
CO2018007355A2 (es) 2018-07-19
PH12018501284A1 (en) 2019-01-28
EA201891322A1 (ru) 2019-01-31
IL259847A (en) 2018-07-31
CL2023002597A1 (es) 2024-03-15
DK3390444T3 (da) 2026-02-23
US12552877B2 (en) 2026-02-17
CN109311971B (zh) 2024-09-24
TWI799368B (zh) 2023-04-21
UY37027A (es) 2017-06-30
CL2018001596A1 (es) 2018-09-28
AU2016370659B2 (en) 2024-02-15
CA3008267A1 (en) 2017-06-22
US11104745B2 (en) 2021-08-31
US20220213226A1 (en) 2022-07-07
NZ783153A (en) 2025-07-25
UA124305C2 (uk) 2021-08-25
TN2019000275A1 (en) 2021-05-07
HRP20260195T1 (hr) 2026-03-27
KR20180099723A (ko) 2018-09-05
JP2019502692A (ja) 2019-01-31
ZA202003133B (en) 2025-06-25
AU2024200534A1 (en) 2024-04-11
RS67851B1 (sr) 2026-03-31
SI3390444T1 (sl) 2026-04-30
MY205021A (en) 2024-09-27
MX2018007424A (es) 2018-09-21
JO3816B1 (ar) 2021-01-31
CR20180365A (es) 2018-09-28
PT3390444T (pt) 2026-02-25
EP3390444A1 (en) 2018-10-24
ZA201904491B (en) 2020-03-25
MA44060B1 (fr) 2026-03-31
JP7263007B2 (ja) 2023-04-24
EP3390444B1 (en) 2025-11-19
SG11201804857WA (en) 2018-07-30
FI3390444T3 (fi) 2026-02-11
CN109311971A (zh) 2019-02-05
TW201731871A (zh) 2017-09-16
NZ743379A (en) 2025-07-25
WO2017106383A1 (en) 2017-06-22
EP4640705A3 (en) 2026-03-04
EP4640705A2 (en) 2025-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA130718C2 (uk) Анти-tl1a/анти-tnf-альфа біспецифічні антигензв'язуючі білки та їх застосування
TWI717375B (zh) Ｃｄ７０及ｃｄ３抗體構築體
CN107074952B (zh) 结合犬pd-l1的pd-l1抗体
TW201708257A (zh) Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
WO2020168555A1 (zh) Cd3抗原结合片段及其应用
US12024560B2 (en) Therapeutic agents and methods for enhancing immune responses in tumor microenvironment
CN102271708A (zh) Cd37免疫治疗联合疗法及其用途
CN107683289A (zh) IL13RAα2结合剂和其在癌症治疗中的用途
JP2021513848A (ja) Ｌａｇ３に結合する治療用分子
WO2017092375A1 (zh) 一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体及其应用
JP2010535763A (ja) 抗ｒａｎｔｅｓ抗体およびその使用の方法
EP4446342A1 (en) Multi-specific t cell engagers comprising lrrc15 antigen-binding domain
TWI862565B (zh) 雙特異性抗體
CN106883298B (zh) 双特异性偶联抗体及其制法和用途
CN102281898A (zh) Il-20拮抗剂在治疗类风湿性关节炎和骨质疏松症中的应用
US10479836B2 (en) Method for treating pulmonary hypertension with interleukin-5 receptor antibody
CN116419970B (zh) 低毒性抗ox40抗体、其药物组合物及应用
CN117337306A (zh) 靶向pd-l1和cd73的特异性结合蛋白
TWI833227B (zh) 靶向pd-l1和cd73的特異性結合蛋白及其應用
EP4640709A1 (en) Anti-human cx3cr1 antibody
CN112512572A (zh) 抗cd40抗体及其用途
TW202340256A (zh) 一種標靶ｃｄ４０的抗原結合蛋白及其製備和應用
HK40127219A (en) Anti-human cx3cr1 antibody
TW202611075A (zh) 以雙特異性BCMAxCD3抗體治療輕鏈類澱粉變性症之方法
CA2988085C (en) Interleukin-5 receptor antibodies for the treatment of pulmonary hypertension