ES3066905T3 - Methods of culturing a mammalian cell - Google Patents

Methods of culturing a mammalian cell

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ES3066905T3 ES15843061T ES15843061T ES3066905T3 ES 3066905 T3 ES3066905 T3 ES 3066905T3 ES 15843061 T ES15843061 T ES 15843061T ES 15843061 T ES15843061 T ES 15843061T ES 3066905 T3 ES3066905 T3 ES 3066905T3
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Cheng Cheng
Jonathan Wang
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Abstract

En el presente documento se describen métodos para cultivar células de mamíferos en un medio líquido que incluye poloxámero-188 a una concentración de 1,8 g/L o a una concentración mayor a 1,8 g/L, o un medio líquido que incluye una concentración de poloxámero-188 seleccionada en función de uno o más factores seleccionados del grupo de: tamaño de poro, tipo de poro, caudal de gas, densidad de células viables en el medio y marcadores relacionados con el estrés celular. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Procedimientos para el cultivo de una célula de mamífero
[0003] La presente divulgación se refiere a procedimientos de biotecnología y a la fabricación de proteínas recombinantes.
[0004] ESTADO DE LA TÉCNICA
[0005] Las células de mamíferos que contienen un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante se utilizan a menudo para producir proteínas de importancia terapéutica o comercial. En el contexto actual de una amplia gama de productos en desarrollo, las empresas de biotecnología se ven cada vez más impulsadas a desarrollar soluciones innovadoras para la fabricación altamente flexible y rentable de sustancias farmacológicas proteicas terapéuticas.
[0006] En la técnica se conocen procesos para el cultivo de células de mamíferos. Por ejemplo, Tördahl et al. describen un proceso de perfusión para el cultivo de células CHO productoras de IgG ("Study of a perfusión process of Chinese Hamster Ovary cells by ATF filtration in bioreactor" Bioprocess Technology Department, KTH, Estocolmo, 11 de septiembre de 2009); en ese proceso, se monitoriza la viabilidad y la densidad celular bajo diferentes condiciones de perfusión, incluidas condiciones en las que se añadió un surfactante (poloxámero-188). Tördahlet al.no describen el efecto del poloxámero-188 sobre la estabilidad de las proteínas, ni la adición de poloxámero-188 en concentraciones superiores a 5 g/L.
[0007] RESUMEN
[0008] La presente divulgación se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que las células de mamíferos que incluyen un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante son viables y proliferan en medios de cultivo que incluyen poloxámero-188 a una concentración de 1,8 o a una concentración mayor que 1,8 g/L (por ejemplo, mayor que 2,0 g/L, mayor que 2,5 g/L, mayor que 3,0 g/L, mayor que 3,5 g/L, mayor que 4,0 g/L, mayor que 4,5 g/L, mayor que 5,0 g/L, mayor que 5,5 g/L, mayor que 6,0 g/L, mayor que 6,5 g/L o mayor que 7,0 g/L de poloxámero-188), que el crecimiento celular óptimo se logra en una proporción particular de poloxámero-188 y antiespumante, y que se pueden lograr altas densidades celulares aumentando la concentración de poloxámero-188 en el cultivo celular en función de la densidad de las células viables, y que la concentración óptima de poloxámero-188 que se debe añadir a un cultivo celular para promover la proliferación celular depende de uno o más factores del grupo de: tamaño de poro, tipo de poro, caudal de gas, densidad de células viables en el medio y marcadores relacionados con el estrés celular.
[0009] La presente invención da a conocer procedimientos para el cultivo de células de mamíferos, tal como se describe en las reivindicaciones adjuntas. Ciertas realizaciones de los procedimientos de la invención se describen en las reivindicaciones dependientes y se ilustran en la siguiente descripción.
[0010] Se dan a conocer en el presente documento procedimientos para cultivar una célula de mamífero que incluyen: cultivar por perfusión una célula de mamífero que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante en condiciones suficientes para producir la proteína recombinante, donde: el cultivo por perfusión incluye el cultivo en un medio líquido que incluye poloxámero-188 a una concentración de 1,8 g/L o a una concentración mayor que 1,8 g/L; el poloxámero-188 está presente en el medio líquido y/o se añade al medio líquido antes de la etapa de cultivo y/o se añade al medio líquido durante la etapa de cultivo. El medio incluye poloxámero-188 a una concentración de 1,8 g/L o a una concentración mayor que 1,8 g/L (por ejemplo, a una concentración de 2,8 g/L o a una concentración mayor que 2,8 g/L, a una concentración de 4,0 g/L o a una concentración mayor que 4,0 g/L, a una concentración de 6,0 g/L o a una concentración mayor que 6,0 g/L, a una concentración de 8,0 g/L o a una concentración mayor que 8,0 g/L, o a una concentración de 10,0 g/L o a una concentración mayor que 10,0 g/L).
[0011] En algunos casos, el medio incluye además un antiespumante y la proporción de antiespumante (g/L) con respecto a poloxámero-188 (g/L) en el medio es de aproximadamente 0,5 % a aproximadamente 6,0 % (por ejemplo, de aproximadamente 1,0 % a aproximadamente 5,5 %, o de aproximadamente 1,5 % a aproximadamente 5,0 %) en el medio líquido. En algunas realizaciones de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el procedimiento incluye añadir poloxámero-188 al medio antes de la etapa de cultivo y/o añadir poloxámero-188 al medio durante la etapa de cultivo para proporcionar en el medio poloxámero-188 a una concentración de 1,8 g/L o a una concentración mayor que 1,8 g/L. En algunas realizaciones de cualquiera de los procedimientos proporcionados en el presente documento, el poloxámero-188 está presente en el medio. En algunos casos, el procedimiento incluye añadir poloxámero-188 al medio antes de la etapa de cultivo y/o añadir poloxámero-188 al medio durante la etapa de cultivo para proporcionar en el medio poloxámero-188 a una concentración de 2,8 g/L o a una concentración mayor que 2,8 g/L (por ejemplo, a una concentración de 4,0 g/L o a una concentración mayor que 4,0 g/L, a una concentración de 6,0 g/L o a una concentración mayor que 6,0 g/L, a una concentración de 8,0 g/L o a una concentración mayor que 8,0 g/L, o a una concentración de 10,0 g/L o a una concentración mayor que 10,0 g/L).
[0012] [0008] El procedimiento de la presente invención incluye aumentar la concentración de poloxámero-188 en el medio a lo largo del tiempo en función de la densidad de células viables en el medio. En algunos casos, el procedimiento incluye aumentar la concentración de poloxámero-188 en el medio a más de 1,8 g/L (por ejemplo, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, o entre aproximadamente 2,3 g/L y aproximadamente 3,0 g/L), cuando la densidad de células viables en el medio está entre aproximadamente 35 x 10<6>células/mL y aproximadamente 60 x 10<6>células/mL. En algunos casos, el procedimiento incluye aumentar la concentración de poloxámero-188 en el medio a más de 3,0 g/L (por ejemplo, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, o entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 6,0 g/L), cuando la densidad de células viables en el medio está entre aproximadamente 60 x 10<6>células /mL y aproximadamente 90 x 10<6>células /mL. El procedimiento de la presente invención también incluye aumentar la concentración de poloxámero-188 en el medio a más de 6,0 g/L (por ejemplo, más de 7,0 g/L, más de 8,0 g/L o más de 10,0 g/L), cuando la densidad de células viables en el medio es más de 90 x 10<6>células /mL. Algunos ejemplos de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento incluyen: aumentar la concentración de poloxámero-188 en el medio a entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 3,0 g/L cuando la densidad de células viables en el medio está entre aproximadamente 35 x 10<6>células /mL y aproximadamente 60 x 10<6>células /mL; aumentar la concentración de poloxámero-188 en el medio a entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 6,0 g/L cuando la densidad de células viables en el medio está entre aproximadamente 60 x 10<6>células /mL y aproximadamente 90 x 10<6>células /mL; y aumentar la concentración de poloxámero-188 en el medio a más de 6,0 g/L cuando la densidad de células viables en el medio es mayor que 90 x 10<6>células /mL. Algunos casos de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento también incluyen determinar la densidad de células viables en el medio en uno o más puntos de tiempo durante el cultivo.
[0014] En algunas realizaciones de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el cultivo por perfusión incluye: proporcionar un recipiente que incluye células de mamífero dispuestas en un primer medio líquido; incubar el recipiente con agitación durante un período de cultivo de al menos aproximadamente 7 días a una temperatura entre aproximadamente 32 °C y aproximadamente 40 °C; y, de forma continua o periódica, después de las primeras 48 a 96 horas del período de cultivo, extraer un primer volumen del primer medio líquido y añadir al primer medio líquido un segundo volumen de un segundo medio líquido, donde el primer y segundo volúmenes son aproximadamente iguales. En algunas realizaciones de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el segundo medio líquido contiene poloxámero-188 a una concentración mayor que en la del primer medio líquido. En algunas realizaciones de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el primer medio líquido incluye poloxámero-188 a una concentración de 1,8 g/L o a una concentración inferior a 1,8 g/L, y el segundo medio líquido comprende poloxámero-188 a una concentración mayor que 1,8 g/L (por ejemplo, una concentración mayor que 2,8 g/L, una concentración mayor que 4,0 g/L, una concentración mayor que 6,0 g/L, una concentración mayor que 8,0 g/L o una concentración mayor que 10,0 g/L). En algunos casos, el procedimiento incluye, antes o después de añadir el segundo volumen del segundo medio líquido al primer medio líquido, añadir poloxámero-188 al segundo medio líquido para proporcionar en el segundo medio poloxámero-188 a una concentración de 1,8 g/L o a una concentración mayor que 1,8 g/L (por ejemplo, a una concentración mayor que 2,8 g/L, a una concentración mayor que 4,0 g/L, a una concentración mayor que 6,0 g/L, a una concentración mayor que 8,0 g/L o a una concentración mayor que 10,0 g/L).
[0016] Algunas realizaciones de cualquiera de los procedimientos descritos en este documento incluyen además: recoger proteína recombinante de células de mamífero, del primer medio líquido, o del segundo medio líquido o de cualquier combinación de estos. Algunos casos de cualquiera de los procedimientos descritos en este documento incluyen además formular la proteína recombinante recogida en una composición farmacéutica. En algunos casos, la recogida se realiza después de que el cultivo alcance una densidad de células viables mayor que 30 x 10<6>células/mL (por ejemplo, mayor que 50 x 10<6>células/mL, mayor que 100 x 10<6>células/mL, mayor que 150 x 10<6>células/mL o mayor que 200 x 10<6>células/mL).
[0018] También se divulgan en el presente documento procedimientos para cultivar una célula de mamífero que incluyen: proporcionar un sistema de cultivo que incluye un recipiente, un medio líquido dispuesto dentro del recipiente y un difusor dispuesto dentro del recipiente que incluye una pluralidad de poros configurados para dispensar gas a través del difusor en el medio líquido; y cultivar por perfusión una célula de mamífero que incluye un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante en el sistema de cultivo bajo condiciones y un caudal de gas suficiente para producir la proteína recombinante en el sistema, donde el medio incluye una concentración de poloxámero-188 que se selecciona en función de uno o más factores seleccionados del grupo de: tamaño de poro, tipo de poro, caudal de gas, densidad de células viables en el medio y marcadores relacionados con el estrés celular. En algunos casos, la concentración de poloxámero-188 seleccionada se logra añadiendo poloxámero-188 al medio antes de la etapa de cultivo y/o añadiendo poloxámero-188 al medio durante la etapa de cultivo.
[0020] [0012] En algunos casos, el factor es el tipo de poro y el tipo de poro es un poro sinterizado o un poro perforado. En algunos casos, el procedimiento incluye seleccionar en función del tipo y tamaño del poro, poloxámero-188 a una concentración de entre aproximadamente 2,3 g/L y aproximadamente 3,3 g/L cuando el tipo de poro es un poro perforado y el tamaño del poro está entre aproximadamente 750 Tm y aproximadamente 1,5 mm o poloxámero-188 a una concentración de entre aproximadamente 2,5 g/L y aproximadamente 3,1 g/L cuando el tipo de poro es un poro perforado y el tamaño del poro está entre aproximadamente 900 Tm y aproximadamente 1,1 mm. En algunos casos, el procedimiento incluye seleccionar, en función del tipo y tamaño del poro, de poloxámero-188 a una concentración de entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 4,3 g/L cuando el tipo de poro es un poro perforado y el tamaño del poro está entre aproximadamente 250 Tm y aproximadamente 750 Tm, o poloxámero-188 a una concentración de entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 4,1 g/L cuando el tipo de poro es un poro perforado y el tamaño del poro está entre aproximadamente 400 Tm y aproximadamente 600 Tm. En algunos casos, el procedimiento incluye la selección, en función del tipo y tamaño del poro, de poloxámero-188 a una concentración mayor que 4,3 g/L (por ejemplo, a una concentración mayor que 5,0 g/L, a una concentración mayor que 6,0 g/L, a una concentración mayor que 8,0 g/L o a una concentración mayor que 10,0 g/L) cuando el tipo de poro es un poro perforado y el tamaño del poro está entre aproximadamente 1 Tm y aproximadamente 250 Tm (por ejemplo, entre aproximadamente 1 Tm y aproximadamente 200 Tm, entre aproximadamente 160 Tm y aproximadamente 190 Tm o entre aproximadamente 170 Tm y aproximadamente 180 Tm).
[0021] En algunos casos, el procedimiento incluye seleccionar, en función del tipo de poro y tamaño de poro, poloxámero-188 a una concentración de entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 3,3 g/L cuando el tipo de poro es un poro sinterizado y el tamaño de poro es mayor que 150 Tm. En algunos casos, el procedimiento incluye seleccionar, en función del tipo de poro y tamaño de poro, poloxámero-188 a una concentración de entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 4,3 g/L cuando el tipo de poro es un poro sinterizado y el tamaño de poro está entre aproximadamente 80 Tm y aproximadamente 150 Tm o poloxámero-188 a una concentración de entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 4,1 g/L cuando el tipo de poro es un poro sinterizado y el tamaño de poro está entre aproximadamente 90 Tm y aproximadamente 110 Tm. En algunos casos, el procedimiento incluye seleccionar, en función del tipo de poro y tamaño de poro, de poloxámero-188 a una concentración mayor que 4,5 g/L (por ejemplo, a una concentración mayor que 5,0 g/L, a una concentración mayor que 6,0 g/L, a una concentración mayor que 8,0 g/L o a una concentración mayor que 10,0 g/L), cuando el tipo de poro es un poro sinterizado y el tamaño del poro está entre aproximadamente 1 Tm y aproximadamente 80 Tm.
[0022] En algunos casos de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el cultivo por perfusión incluye: incubar el sistema de cultivo que incluye un primer medio líquido con agitación y durante un período de cultivo de al menos aproximadamente 7 días a una temperatura entre aproximadamente 32 °C y aproximadamente 40 °C; y de forma continua o periódica después de las primeras 48 a 96 horas del período de cultivo, extraer un primer volumen del primer medio líquido y añadir al primer medio líquido un segundo volumen de un segundo medio líquido. En algunos casos, el segundo medio líquido incluye poloxámero-188 a una concentración mayor que la concentración de poloxámero-188 en el primer medio líquido. En algunos casos, el segundo medio incluye la concentración de poloxámero-188 seleccionada.
[0023] Algunos casos incluyen además: recoger proteína recombinante del interior de las células de mamíferos, del primer medio líquido, o del segundo medio líquido o cualquier combinación de estos. Algunos casos incluyen además formular la proteína recombinante recogida en una composición farmacéutica.
[0024] En algunos casos de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el recipiente es un biorreactor de perfusión. En algunos casos, el biorreactor de perfusión tiene un volumen entre aproximadamente 1,5 L y aproximadamente 25.000 L. En algunos casos, el período de cultivo es mayor que 10 días. En algunos casos, la extracción del primer volumen del primer medio líquido y la adición del segundo volumen del segundo medio líquido en (c) se realiza de forma continua. En algunos casos, la extracción del primer volumen del primer medio líquido y la adición del segundo volumen del segundo medio líquido en (c) se realiza periódicamente. En algunos casos, el primer volumen del primer medio líquido extraído y el segundo volumen del segundo medio líquido añadido en (c) aumentan con el tiempo. En algunas realizaciones de cualquiera de los procedimientos descritos en este documento, el primer medio líquido y/o el segundo medio líquido se seleccionan del grupo de: un medio de cultivo líquido químicamente definido, un medio de cultivo líquido sin suero, un medio de cultivo líquido que contiene suero, un medio de cultivo líquido sin componentes de origen animal y un medio sin proteínas. En algunos casos, después de aproximadamente las primeras 48 a 96 horas del período de tiempo, en cada período de 24 horas, el primer volumen del primer medio líquido extraído y el segundo volumen del segundo medio líquido añadido en (c) es aproximadamente de 0,3x a aproximadamente 10x del volumen del primer medio líquido o del volumen del recipiente.
[0025] En algunas realizaciones de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, la célula de mamífero es una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula de riñón embrionario humano (HEK), una célula NSO, una célula de riñón de hámster bebé (BHK), una célula PerC6, una célula Vero o una línea celular HT-1080. En algunas realizaciones de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, la proteína recombinante es una inmunoglobulina, una enzima, un factor de crecimiento, un fragmento de proteína o una proteína modificada genéticamente.
[0026] Tal como se utiliza en el presente documento, la palabra "un" o “una” antes de un sustantivo representa uno o más del sustantivo particular. Por ejemplo, la frase "una célula de mamífero" representa "una o más células de mamífero".
[0027] El término “célula de mamífero” se refiere a cualquier célula de o derivada de cualquier mamífero (por ejemplo, un ser humano, un hámster, un ratón, un mono verde, una rata, un cerdo, una vaca o un conejo). Por ejemplo, una célula de mamífero puede ser una célula inmortalizada. En algunos casos, la célula de mamífero es una célula diferenciada o indiferenciada. En el presente documento se describen ejemplos no limitativos de células de mamífero. En la técnica se conocen otros ejemplos de células de mamífero.
[0028] El término "cultivo" o "cultivo celular" significa el mantenimiento o la proliferación de una célula de mamífero bajo un conjunto controlado de condiciones físicas.
[0029] El término "cultivo de células de mamíferos", "cultivo" o "cultivo celular" significa un medio líquido que contiene una pluralidad de células de mamíferos que se mantiene o prolifera bajo un conjunto controlado de condiciones físicas.
[0030] El término "medio de cultivo líquido" o "medio líquido" se refiere a un fluido que contiene nutrientes suficientes para permitir que una célula (por ejemplo, una célula de mamífero) crezca o proliferein vitro.Por ejemplo, un medio líquido puede contener uno o más de: aminoácidos (por ejemplo, 20 aminoácidos), una purina (por ejemplo, hipoxantina), una pirimidina (por ejemplo, timidina), colina, inositol, tiamina, ácido fólico, biotina, calcio, niacinamida, piridoxina, riboflavina, timidina, cianocobalamina, piruvato, ácido lipoico, magnesio, glucosa, sodio, potasio, hierro, cobre, zinc y bicarbonato de sodio. En algunos casos, un medio líquido puede contener suero de un mamífero. En algunos casos, un medio líquido no contiene suero ni otro extracto de un mamífero (un medio líquido definido). En algunos casos, un medio líquido puede contener oligoelementos, una hormona de crecimiento de mamíferos y/o un factor de crecimiento de mamíferos. Otro ejemplo de medio líquido es el medio mínimo (por ejemplo, un medio que contiene únicamente sales inorgánicas, una fuente de carbono y agua). En este documento se describen ejemplos no limitativos de medio líquido. En la técnica se conocen otros ejemplos de medio líquido y están disponibles comercialmente. Un medio líquido puede contener cualquier densidad de células de mamíferos. Por ejemplo, tal como se utiliza en este documento, un volumen de medio líquido extraído de un biorreactor puede estar sustancialmente libre de células de mamíferos.
[0031] El término "medio de cultivo líquido sin componentes de origen animal" significa un medio líquido que no contiene ningún componente (por ejemplo, proteínas o suero) derivado de un mamífero.
[0032] El término "medio de cultivo líquido sin suero" significa un medio líquido que no contiene suero de mamífero.
[0033] El término "medio de cultivo líquido que contiene suero" significa un medio líquido que contiene suero de mamífero.
[0034] El término “medio de cultivo líquido químicamente definido” es un término técnico que se refiere a un medio líquido cuyos componentes químicos son conocidos. Por ejemplo, un medio líquido químicamente definido no contiene suero fetal bovino, albúmina sérica bovina ni albúmina sérica humana, ya que estas preparaciones suelen contener una mezcla compleja de albúminas y lípidos.
[0035] El término "medio de cultivo líquido sin proteínas" significa un medio líquido que no contiene ninguna proteína (por ejemplo, ninguna proteína detectable).
[0036] El término “agitación” se refiere a remover o mover de cualquier otra forma una porción de medio líquido en un recipiente. Esto se realiza para, por ejemplo, aumentar la concentración de O<2>disuelto en el medio líquido de un biorreactor. La agitación puede realizarse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, un instrumento o una hélice. En la técnica se conocen dispositivos y procedimientos de ejemplo que pueden utilizarse para agitar una porción del medio líquido en un biorreactor.
[0037] El término "inmunoglobulina" se refiere a un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos de al menos 15 aminoácidos (por ejemplo, al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 aminoácidos) de una proteína inmunoglobulina (por ejemplo, una secuencia de dominio variable, una secuencia estructural (“framework”) o una secuencia de dominio constante). La inmunoglobulina puede incluir, por ejemplo, al menos 15 aminoácidos de una inmunoglobulina de cadena ligera, por ejemplo, al menos 15 aminoácidos de una inmunoglobulina de cadena pesada. La inmunoglobulina puede ser un anticuerpo aislado (por ejemplo, una IgG, IgE, IgD, IgA o IgM). La inmunoglobulina puede ser una subclase de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4). La inmunoglobulina puede ser un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')<2>o un fragmento scFv. La inmunoglobulina puede ser también un anticuerpo biespecífico o anticuerpo triespecífico, o un anticuerpo dímero, trímero o multímero, un diabody, un Affibody<®>o un Nanobody<®>. La inmunoglobulina también puede ser una proteína modificada genéticamente que contenga al menos un dominio de inmunoglobulina (por ejemplo, una proteína de fusión). En este documento se describen ejemplos no limitativos de inmunoglobulinas, y en la técnica se conocen otros ejemplos. Se puede producir una inmunoglobulina recombinante utilizando cualquiera de los procedimientos descritos en este documento.
[0038] [0030] El término "fragmento de proteína" o "fragmento de polipéptido" significa una porción de una secuencia de polipéptido que tiene al menos o aproximadamente 4 aminoácidos, al menos o aproximadamente 5 aminoácidos, al menos o aproximadamente 6 aminoácidos, al menos o aproximadamente 7 aminoácidos, al menos o aproximadamente 8 aminoácidos, al menos o aproximadamente 9 aminoácidos, al menos o aproximadamente 10 aminoácidos, al menos o aproximadamente 11 aminoácidos, al menos o aproximadamente 12 aminoácidos, al menos o aproximadamente 13 aminoácidos, al menos o aproximadamente 14 aminoácidos, al menos o aproximadamente 15 aminoácidos, al menos o aproximadamente 16 aminoácidos, al menos o aproximadamente 17 aminoácidos, al menos o aproximadamente 18 aminoácidos, al menos o aproximadamente 19 aminoácidos, o al menos o aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, o más de 20 aminoácidos de longitud. Un fragmento de proteína recombinante puede producirse utilizando cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento.
[0039] El término “proteína modificada genéticamente” se refiere a un polipéptido que no está codificado de forma natural por un ácido nucleico endógeno presente en un organismo (por ejemplo, un mamífero). Ejemplos de proteínas modificadas genéticamente incluyen enzimas (por ejemplo, con una o más sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones de aminoácidos que resultan en un aumento de la estabilidad y/o la actividad catalítica de la enzima modificada genéticamente), proteínas de fusión, anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos divalentes, anticuerpos trivalentes o un diabody) y proteínas de unión a antígenos que contienen al menos una secuencia de andamiaje recombinante. Una proteína modificada genéticamente recombinante puede producirse utilizando cualquiera de los procedimientos descritos en este documento.
[0040] El término “proteína secretada” o “proteína recombinante secretada” se refiere a una proteína (por ejemplo, una proteína recombinante) que originalmente contenía al menos una secuencia señal de secreción al ser traducida dentro de una célula de mamífero, y que, mediante la escisión enzimática de dicha secuencia señal de secreción en la célula de mamífero se secreta, al menos parcialmente, en el espacio extracelular (por ejemplo, a un medio líquido). Los expertos comprenderán que una proteína “secretada” no necesita disociarse completamente de la célula para ser considerada una proteína secretada.
[0041] El término "biorreactor de perfusión" se refiere a un biorreactor que contiene una pluralidad de células (por ejemplo, células de mamíferos) en un primer medio líquido, donde el cultivo de las células presentes en el biorreactor incluye la extracción periódica o continua del primer medio líquido y, al mismo tiempo o poco después, la adición de un volumen sustancialmente igual de un segundo medio líquido al biorreactor. En algunos ejemplos, hay un cambio incremental (por ejemplo, aumento o disminución) en el volumen del primer medio líquido extraído y añadido durante períodos incrementales (por ejemplo, un período de aproximadamente 24 horas, un período de entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 24 horas, o un período de más de 24 horas) durante el período de cultivo (por ejemplo, la tasa de realimentación del medio líquido diariamente). La fracción de medio extraído y reemplazado cada día puede variar dependiendo de las células particulares que se cultivan, la densidad de siembra inicial y la densidad celular en un tiempo determinado. "VR" o "volumen del reactor" se refiere al volumen del medio líquido presente al inicio del proceso de cultivo (por ejemplo, el volumen total del medio líquido presente después de la siembra).
[0042] El término “biorreactor discontinuo alimentado” es un término técnico que se refiere a un biorreactor que contiene una pluralidad de células (por ejemplo, células de mamíferos) en un primer medio líquido, donde el cultivo de las células presentes en el biorreactor incluye la adición periódica o continua de un segundo medio líquido al primer medio líquido, sin que se produzca una eliminación sustancial o significativa del primer medio líquido o segundo medio líquido del cultivo celular. El segundo medio líquido puede ser el mismo que el primer medio líquido. En algunos casos de cultivo discontinuo alimentado, el segundo medio líquido es una forma concentrada del primer medio líquido. En algunos ejemplos del cultivo discontinuo alimentado, el segundo medio líquido se añade en forma de polvo seco.
[0043] El término “difusor” es un término técnico y se refiere a un aparato con una entrada, un cuerpo y una superficie con uno o más poros, donde la entrada, el cuerpo y el uno o más poros están diseñados para permitir el flujo de gas a través de la entrada, a través del cuerpo y hacia afuera del uno o más poros. Cuando se utilizan difusores en un cultivo celular, uno del uno o más poros está en contacto con el cultivo, de manera que el gas fluye hacia afuera del al menos un poro y hacia adentro del cultivo. Los difusores suelen describirse por su tamaño de poro y el tipo de sus poros. En el presente documento se describen ejemplos no limitativos de difusores con diferentes combinaciones de tamaños de poro y tipos de poros.
[0044] El término "tamaño de poro" es un término técnico y se refiere al diámetro de un solo poro en un difusor que tiene un solo poro o a un diámetro promedio de dos o más poros en un difusor que tiene dos o más poros.
[0045] El término "marcador relacionado con el estrés celular" es un término técnico y significa una molécula biológica que es liberada por una célula bajo estrés fisiológico (por ejemplo, una célula que experimenta muerte celular necrótica o muerte celular apoptótica) en el medio líquido o una molécula biológica producida o que tiene niveles elevados en una célula bajo estrés fisiológico (por ejemplo, una célula que experimenta muerte celular necrótica o muerte celular apoptótica). Ejemplos no limitativos de marcadores relacionados con el estrés celular que son liberados por una célula bajo estrés fisiológico incluyen proteasas (por ejemplo, caspasas activadas), lactato deshidrogenasa, ADN genómico (por ejemplo, ADN nucleosomal), citocromo c y PARP activada. Ejemplos no limitativos de marcadores relacionados con el estrés celular que son producidos o tienen niveles elevados en una célula bajo estrés fisiológico incluyen caspasas activadas, citocromo c, PARP activada y fosfatidilserina externalizada.
[0046] La "tasa de productividad específica" o "TPE" es un término técnico y, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la masa o actividad enzimática de una proteína recombinante producida por célula de mamífero al día. La TPE de un anticuerpo terapéutico recombinante se suele medir como masa/célula/día. La TPE de una enzima terapéutica recombinante se suele medir como unidades/célula/día o (unidades/masa)/célula/día.
[0047] La "tasa de productividad volumétrica" o "TPV" es un término técnico y, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la masa o actividad enzimática de la proteína recombinante producida por volumen de cultivo (por ejemplo, por litro de biorreactor, recipiente o tubo) por día. La TPV de un anticuerpo terapéutico recombinante se suele medir como masa/litro/día. La TPV de una enzima terapéutica recombinante se suele medir como unidades/litro/día o masa/litro/día.
[0049] Las frases "poloxámero-188 a una concentración" y "concentración de poloxámero-188" se utilizan indistintamente en el presente documento. Las frases "poloxámero-188 de X g/L o más" y "poloxámero-188 a una concentración de X g/L o a una concentración mayor que X g/L" se utilizan indistintamente en el presente documento.
[0051] Salvo que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la materia a la que pertenece esta divulgación. Los procedimientos y materiales se describen en este documento para su uso en la presente divulgación; también pueden utilizarse otros procedimientos y materiales adecuados conocidos en la materia. Los materiales, procedimientos y ejemplos son meramente ilustrativos y no pretenden ser limitativos. En caso de conflicto con publicaciones, solicitudes de patente, patentes, secuencias, entradas de bases de datos y demás referencias aquí mencionadas, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluidas las definiciones.
[0053] Otras características y ventajas de la divulgación y la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y figuras, y de las reivindicaciones.
[0055] DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0057]
[0059] La Figura 1 es un gráfico de la densidad de células viables a lo largo del tiempo en una serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando un medio líquido que no contiene poloxámero-188 adicional durante todo el período de cultivo (una concentración constante de 1,8 g/L de poloxámero-188 durante todo el período de cultivo) (datos en gris) y una serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando medios de cultivo líquidos que contienen cantidades crecientes de poloxámero-188 durante todo el período de cultivo (aumentando de 1,8 g/L a 6,8 g/L de poloxámero-188 durante todo el período de cultivo) (datos en negro).
[0060] La Figura 2 es un gráfico de la tasa de crecimiento específica a lo largo del tiempo en una serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando medios de cultivo líquidos que contienen cantidades crecientes de poloxámero-188 durante el período de cultivo (aumentando de 1,8 g/L a 6,8 g/L de poloxámero-188 durante el período de cultivo). La Figura 3 es un gráfico del porcentaje de células viables en dos cultivos celulares por perfusión realizados utilizando un medio líquido que no contenía poloxámero-188 adicional durante el período de cultivo (una concentración constante de 1,8 g/L de poloxámero-188 durante el período de cultivo) (datos en gris) y una serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando medios de cultivo líquidos que contenían cantidades crecientes de poloxámero-188 durante el período de cultivo (aumentando de 1,8 g/L a 6,8 g/L de poloxámero-188 durante el período de cultivo) (datos en negro). La figura 4 es un gráfico de la productividad volumétrica a lo largo del tiempo en una serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando medios de cultivo líquidos que contienen cantidades crecientes de poloxámero-188 durante el período de cultivo (aumentando de 1,8 g/L a 6,8 g/L de poloxámero-188 durante el período de cultivo). La figura 5 es un gráfico de la productividad específica a lo largo del tiempo en una serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando medios de cultivo líquidos que contienen cantidades crecientes de poloxámero-188 durante el período de cultivo (aumentando de 1,8 g/L a 6,8 g/L de poloxámero-188 durante el período de cultivo).
[0061] La Figura 6 es un gel Bis-Tris que muestra los productos de degradación de un anticuerpo recombinante presente en: medio líquido clarificado recogido de un cultivo de células por perfusión que contiene 6,8 g/L de poloxámero-188 (carril 1); medio líquido clarificado recogido de un cultivo de células por perfusión que contiene 6,8 g/L de poloxámero-188 que se ha incubado durante 7 días a temperatura ambiente (carril 1a); medio líquido clarificado recogido de un cultivo de células por perfusión que contiene 3,95 g/L de poloxámero-188 (carril 2); medio líquido clarificado recogido de un cultivo de células de perfusión que contiene 3,95 g/L de poloxámero-188 e incubado durante 7 días a temperatura ambiente (carril 2a); medio líquido clarificado recogido de un cultivo de células por perfusión que contenía 3,95 g/L de poloxámero-188, suplementado con poloxámero-188 para alcanzar una concentración de 6,8 g/L de poloxámero-188, e incubado a temperatura ambiente durante 9 días (carril 2b); medio líquido clarificado recogido de un cultivo de células por perfusión que contenía 3,0 g/L de poloxámero-188 (carril 3); medio líquido clarificado recogido de un cultivo de células por perfusión que contenía 3,0 g/L de poloxámero-188 e incubado a temperatura ambiente durante 7 días (carril 3a); y medio líquido clarificado recogido de un cultivo de células por perfusión que contenía 3,0 g/L de poloxámero-188, suplementado con poloxámero-188 para alcanzar una concentración de 6,8 g/L de poloxámero-188, e incubado durante 9 días a temperatura ambiente (carril 3b).
[0062] La Figura 7 es un gráfico de la densidad de células viables a lo largo del tiempo para una serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando un difusor con un poro sinterizado de 20 Tm y medios de cultivo que contienen cantidades crecientes de poloxámero-188 durante el período de cultivo (aumentando de 1,8 g/L a 5,8 g/L de poloxámero-188 durante el período de cultivo) (cuadrados); una serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando un difusor con un poro perforado de 200 Tm y medios de cultivo que contienen cantidades crecientes de poloxámero-188 durante el período de cultivo (aumentando de 1,8 g/L a 4,8 g/L durante el período de cultivo) (triángulos); y una serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando un difusor con un poro perforado de 500 Tm y medios de cultivo que contienen cantidades crecientes de poloxámero-188 durante el período de cultivo (que aumentan de 1,8 g/L a 3,8 g/L) (círculos).
[0063] La figura 8 es un gráfico de la tasa de crecimiento específica a lo largo del tiempo para una serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando un difusor con un poro sinterizado de 20 Tm y medios de cultivo que contienen cantidades crecientes de poloxámero-188 durante el período de cultivo (aumentando de 1,8 g/L a 5,8 g/L de poloxámero-188 durante el período de cultivo) (cuadrados); una serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando un difusor con un poro perforado de 200 Tm y medios de cultivo que contienen cantidades crecientes de poloxámero-188 durante el período de cultivo (aumentando de 1,8 g/L a 4,8 g/L durante el período de cultivo) (triángulos); y una serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando un difusor con un poro perforado de 500 Tm y medios de cultivo que contienen cantidades crecientes de poloxámero-188 durante el período de cultivo (que aumentan de 1,8 g/L a 3,8 g/L) (círculos).
[0064] La figura 9 es un gráfico de la producción específica de lactosa deshidrogenasa a lo largo del tiempo para una serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando un difusor con un poro sinterizado de 20 Tm y medios de cultivo que contienen cantidades crecientes de poloxámero-188 durante el período de cultivo (aumentando de 1,8 g/L a 5,8 g/L de poloxámero-188 durante el período de cultivo) (cuadrados); una serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando un difusor con un poro perforado de 200 Tm y medios de cultivo que contienen cantidades crecientes de poloxámero-188 durante el período de cultivo (aumentando de 1,8 g/L a 4,8 g/L durante el período de cultivo) (triángulos); y una serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando un difusor con un poro perforado de 500 Tm y medios de cultivo que contienen cantidades crecientes de poloxámero-188 durante el período de cultivo (que aumentan de 1,8 g/L a 3,8 g/L) (círculos).
[0065] La Figura 10 es un gráfico del porcentaje de células viables a lo largo del tiempo para una serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando un difusor con un poro sinterizado de 20 Tm y medios de cultivo que contienen cantidades crecientes de poloxámero-188 durante el período de cultivo (aumentando de 1,8 g/L a 5,8 g/L de poloxámero-188 durante el período de cultivo) (cuadrados); una serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando un difusor con un poro perforado de 200 Tm y medios de cultivo que contienen cantidades crecientes de poloxámero-188 durante el período de cultivo (aumentando de 1,8 g/L a 4,8 g/L durante el período de cultivo) (triángulos); y una serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando un difusor con un poro perforado de 500 Tm y medios de cultivo que contienen cantidades crecientes de poloxámero-188 durante el período de cultivo (que aumentan de 1,8 g/L a 3,8 g/L) (círculos).
[0066] La Figura 11 es un gráfico de la producción específica de lactosa deshidrogenasa a lo largo del tiempo para una serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando un difusor con un poro sinterizado de 20 Tm y medios de cultivo que contienen 1,8 g/L de poloxámero-188 durante el período de cultivo (círculos no rellenos); una serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando un difusor con un poro sinterizado de 20 Tm y medios de cultivo que contienen cantidades crecientes de poloxámero-188 durante el período de cultivo (aumentando de 1,8 g/L a 5,8 g/L de poloxámero-188 durante el período de cultivo) (cuadrados); una serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando un difusor con un poro perforado de 200 Tm y medios de cultivo que contienen cantidades crecientes de poloxámero-188 durante el período de cultivo (aumentando de 1,8 g/L a 4,8 g/L durante el período de cultivo) (triángulos); y una serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando un difusor con un poro perforado de 500 Tm y medios de cultivo que contienen cantidades crecientes de poloxámero-188 durante el período de cultivo (aumentando de 1,8 g/L a 3,8 g/L) (círculos rellenos).
[0067] La Figura 12 es un gráfico de la productividad volumétrica a lo largo del tiempo para una serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando un difusor con un poro sinterizado de un tamaño de 20 Tm y medios de cultivo que contienen cantidades crecientes de poloxámero-188 a lo largo del período de cultivo (aumentando de 1,8 g/L a 5,8 g/L de poloxámero-188 a lo largo del período de cultivo) (cuadrados); una serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando un difusor con un poro perforado de un tamaño de 200 Tm y medios de cultivo que contienen cantidades crecientes de poloxámero-188 a lo largo del período de cultivo (aumentando de 1,8 g/L a 4,8 g/L a lo largo del período de cultivo) (triángulos); y una serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando un difusor con un poro perforado de 500 Tm y medios de cultivo que contienen cantidades crecientes de poloxámero-188 durante el período de cultivo (que aumentan de 1,8 g/L a 3,8 g/L) (círculos).
[0068] La Figura 13 es un gráfico del consumo aeróbico de glucosa a lo largo del tiempo para una serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando un difusor con un poro sinterizado de un tamaño de 20 Tm y medios de cultivo que contienen cantidades crecientes de poloxámero-188 durante el período de cultivo (aumentando de 1,8 g/L a 5,8 g/L de poloxámero-188 durante el período de cultivo) (cuadrados); una serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando un difusor con un poro perforado de un tamaño de 200 Tm y medios de cultivo que contienen cantidades crecientes de poloxámero-188 durante el período de cultivo (aumentando de 1,8 g/L a 4,8 g/L durante el período de cultivo) (triángulos); y una serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando un difusor con un poro perforado de 500 Tm y medios de cultivo que contienen cantidades crecientes de poloxámero-188 durante el período de cultivo (que aumentan de 1,8 g/L a 3,8 g/L) (círculos).
[0069] La Figura 14 es un gráfico de la densidad de células viables a lo largo del tiempo para series de diferentes cultivos celulares en matraces de agitación por lotes realizadas utilizando medio líquido CD-CHO que contiene una proporción de 0 % de antiespumante-c con respecto a poloxámero-188 (círculos rellenos), una proporción de 5,6 % de antiespumante-c con respecto a poloxámero-188 (círculos no rellenos), una proporción de 11,1 % de antiespumantec con respecto a poloxámero-188 (cuadrados rellenos), una proporción de 27,8 % de antiespumante-c con respecto a poloxámero-188 (cuadrados no rellenos) o una proporción de 55,6 % de antiespumante-c con respecto a poloxámero-188 (triángulos rellenos).
[0070] La Figura 15 es un gráfico de la tasa de producción específica de lactato deshidrogenasa a lo largo del tiempo para series de diferentes cultivos celulares en matraces de agitación por lotes realizadas utilizando medio líquido CD-CHO que contiene una proporción de 0 % de antiespumante-c con respecto a poloxámero-188 (círculos rellenos), una proporción de 5,6 % de antiespumante-c con respecto a poloxámero-188 (círculos no rellenos), una proporción de 11,1 % de antiespumante-c con respecto a poloxámero-188 (cuadrados rellenos), una proporción de 27,8 % de antiespumante-c con respecto a poloxámero-188 (cuadrados vacíos) o una proporción de 55,6 % de antiespumante-c con respecto a poloxámero-188 (triángulos rellenos).
[0072] DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0074] En el presente documento se describen procedimientos para cultivar una célula de mamífero que incluyen cultivar una célula de mamífero que contiene un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante en condiciones suficientes para producir la proteína recombinante, donde el cultivo incluye cultivar en un medio líquido que contiene poloxámero-188 a una concentración de 1,8 g/L o a una concentración mayor que 1,8 g/L y donde el poloxámero-188 está presente en el medio y/o se añade al medio antes de la etapa de cultivo y/o se añade al medio durante la etapa de cultivo. También se describen en el presente documento (aunque no se mencionan en las reivindicaciones) procedimientos para cultivar una célula de mamífero que incluyen un sistema de cultivo que incluye un recipiente, un medio líquido dispuesto dentro del recipiente y un difusor dispuesto dentro del recipiente que incluye una pluralidad de poros configurados para distribuir gas a través del difusor en el medio líquido, y cultivar una célula de mamífero que incluye un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante en el sistema de cultivo, bajo condiciones y con un caudal de gas suficientes para producir la proteína recombinante en el sistema, donde el medio incluye una concentración de poloxámero-188 que se selecciona en función de uno o más factores seleccionados del grupo de: tamaño de poro, tipo de poro, caudal de gas, densidad de células viables en el medio y marcadores relacionados con el estrés celular. A continuación se describen aspectos de ejemplo no limitativos de estos procedimientos.
[0076] En algunos casos, los procedimientos proporcionados en el presente documento pueden lograr un cultivo celular con una densidad de células viables mayor que 20 x 10<6>células/mL, mayor que 25 x 10<6>células/mL, mayor que 30 x 10<6>células/mL, mayor que 35 x 10<6>células/mL, mayor que 40 x 10<6>células/mL, mayor que 45 x 10<6>células/mL, mayor que 50 x 10<6>células/mL, mayor que 55 x 10<6>células/mL, mayor que 60 x 10<6>células/mL, mayor que 65 x 10<6>células/mL, mayor que 70 x 10<6>células/mL, mayor que 75 x 10<6>células/mL, mayor que 80 x 10<6>células/mL, mayor que 85 x 10<6>células/mL, mayor que 90 x 10<6>células/mL, mayor que 95 x 10<6>células/mL, mayor que 100 x 10<6>células/mL, mayor que 105 x 10<6>células/mL, mayor que 110x 10<6>células/mL, mayor que 115 x 10<6>células/mL, mayor que 120 x 10<6>células/mL, mayor que 125 x 10<6>células/mL, mayor que 130 x 10<6>células/mL, mayor que 135 x 10<6>células/mL, mayor que 140 x 10<6>células/mL, mayor que 145 x 10<6>células/mL, mayor que 150 x 10<6>células/mL, mayor que 155 x 10<6>células/mL, mayor que 160 x 10<6>células/mL, mayor que 165 x 10<6>células/mL, mayor que 170 x 10<6>células/mL, mayor que 175 x 10<6>células/mL, mayor que 180 x 10<6>células/mL, mayor que 185 x 10<6>células/mL, mayor que 190 x 10<6>células/mL, mayor que 195 x 10<6>células/mL, mayor que 200 x 10<6>células/mL, mayor que 205 x 10<6>células/mL, mayor que 210x 10<6>células/mL, mayor que 215 x 10<6>células/mL, mayor que 220 x 10<6>células/mL, mayor que 225 x 10<6>células/mL, mayor que 230 x 10<6>células/mL, mayor que 235 x 10<6>células/mL, mayor que 240 x 10<6>células/mL, mayor que 245 x 10<6>células/mL o mayor que 250 x 10<6>células/mL. Los procedimientos para determinar la densidad de células viables de un cultivo celular son bien conocidos en la técnica.
[0078] En algunos casos, los procedimientos proporcionados en el presente documento proporcionan un cultivo celular con un porcentaje de viabilidad celular mayor que el 75 % (por ejemplo, mayor que el 80 %, mayor que el 85 % o mayor que el 90 %) durante un período de cultivo de al menos 5 días (por ejemplo, al menos 10 días, al menos 15 días, al menos 20 días, al menos 25 días, al menos 30 días, al menos 35 días, al menos 40 días, al menos 45 días, al menos 50 días, al menos 55 días, al menos 60 días, al menos 65 días o al menos 70 días).
[0080] En algunos casos, el procedimiento proporcionado en el presente documento puede lograr un cultivo con una tasa de productividad volumétrica (TPV) de al menos 1,5 g/L/d (por ejemplo, al menos 1,6 g/L/d, al menos 1,7 g/L/d, al menos 1,8 g/L/d, al menos 1,9 g/L/d, al menos 2,0 g/L/d, al menos 2,1 g/L/d, al menos 2,2 g/L/día, al menos 2,3 g/L/d, al menos 2,4 g/L/d, al menos 2,5 g/L/d, al menos 2,6 g/L/d, al menos 2,7 g/L/d, al menos 2,8 g/L/d, al menos 2,9 g/L/d, al menos 3,0 g/L/d, al menos 3,1 g/L/d, al menos 3,2 g/L/d, al menos 3,3 g/L/d, al menos 3,4 g/L/d, al menos 3,5 g/L/d, al menos 3,6 g/L/d, al menos 3,7 g/L/d, al menos 3,8 g/L/d, al menos 3,9 g/L/d, al menos 4,0 g/L/d, al menos 4,1 g/L/d, al menos 4,2 g/L/d, al menos 4,3 g/L/d, al menos 4,4 g/L/d o al menos 4,5 g/L/d) durante al menos 5 días (por ejemplo, al menos 10 días, al menos 15 días, al menos 20 días, al menos 25 días, al menos 30 días, al menos 35 días, al menos 40 días, al menos 45 días, al menos 50 días, al menos 55 días, al menos 60 días, al menos 65 días o al menos 70 días) comenzando en cualquier momento durante el período de cultivo.
[0082] [0048] En algunos casos, los procedimientos proporcionados en el presente documento dan como resultado la producción de una proteína recombinante que cuando se recoge tiene un nivel disminuido (por ejemplo, una disminución de aproximadamente o menos del 5 %, una disminución de aproximadamente o menos del 10 %, una disminución de aproximadamente o menos del 15 %, una disminución de aproximadamente o menos del 20 %, una disminución de aproximadamente o menos del 25 %, una disminución de aproximadamente o menos del 30 %, una disminución de aproximadamente o menos del 35 %, una disminución de aproximadamente o menos del 40 %, una disminución de aproximadamente o menos del 45 %, una disminución de aproximadamente o menos del 50 %, una disminución de aproximadamente o menos del 55 %, una disminución de aproximadamente o menos del 60 %, una disminución de aproximadamente o menos del 65 %, una disminución de aproximadamente o menos del 70 %, una disminución de aproximadamente o menos del 75 %, una disminución de aproximadamente o menos del 80 %, una disminución de aproximadamente o menos del 80 %, una disminución de aproximadamente o menos del 85 %, o una disminución de aproximadamente el 90 % o menos, de la degradación (en comparación con una proteína recombinante producida mediante un procedimiento similar que no incluya el cultivo en un medio líquido con 1,8 g/L o más de poloxámero-188). El nivel de degradación de una proteína recombinante recogida de un cultivo celular puede detectarse, por ejemplo, mediante electroforesis en gel y/o inmunotransferencia.
[0084] En algunos casos, los procedimientos dan como resultado un cultivo celular que tiene una producción específica de lactato deshidrogenasa de menos de 60 nU/célula/día (por ejemplo, menos de 55 nU/célula/día, menos de 50 nU/célula/día, menos de 45 nU/célula/día, menos de 40 nU/célula/día, menos de 35 nU/célula/día, menos de 30 nU/célula/día, menos de 25 nU/célula/día o menos de 20 nU/célula/día) durante al menos aproximadamente 5 (por ejemplo, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 55, al menos 60, al menos 65 o al menos 70) días continuos que comienzan en cualquier momento dentro del período de cultivo.
[0086] En algunos casos, los procedimientos dan como resultado el mantenimiento de las células en un estado estacionario (fase estacionaria) durante al menos 5 días (por ejemplo, al menos 10 días, al menos 15 días, al menos 20 días, al menos 25 días, al menos 30 días, al menos 35 días, al menos 40 días, al menos 45 días o al menos 50 días), por ejemplo, a una densidad de células viables de aproximadamente o mayor que 30 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 35 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 40 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 45 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 50 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 55 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 60 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 65 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 70 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 75 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 80 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 85 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 90 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 95 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 100 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 105 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 110x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 115 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 120 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 125 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 130 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 135 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 140 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 145 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 150 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 155 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 160 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 165 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 170 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 175 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 180 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 185 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 190 x 10<6>células/mL, aproximadamente o mayor que 195 x 10<6>células/mL, o aproximadamente o mayor que 200 x 10<6>células/mL.
[0088] Volúmenes de cultivo
[0090] [0051] La etapa de cultivo (por ejemplo, la etapa de cultivo por perfusión) en cualquiera de los procedimientos descritos puede incluir la incubación de un cultivo celular con un volumen de entre 20 L y aproximadamente 8.000 L (por ejemplo, entre aproximadamente 20 L y aproximadamente 7.000 L, entre aproximadamente 20 L y aproximadamente 6.000 L, entre aproximadamente 20 L y aproximadamente 5.000 L, entre aproximadamente 20 L y aproximadamente 4.000 L, entre aproximadamente 20 L y aproximadamente 3.000 L, entre aproximadamente 20 L y aproximadamente 2.500 L, entre aproximadamente 20 L y aproximadamente 2000 L, entre aproximadamente 20 L y aproximadamente 1.500 L, entre aproximadamente 20 L y aproximadamente 1.000 L, entre aproximadamente 20 L y aproximadamente 500 L, entre aproximadamente 20 L y aproximadamente 200 L, entre aproximadamente 20 L y aproximadamente 100 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 8.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 7.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 6.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 5.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 4.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 3.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 2.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 1.500 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 1.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 800 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 700 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 600 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 500 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 400 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 300 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 200 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 8.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 7.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 6.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 5.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 4.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 3.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 2.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 1.500 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 1.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 750 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 8.000 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 7.000 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 6.000 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 5000 L, entre aproximadamente 1000 L y aproximadamente 4000 L, entre aproximadamente 1000 L y aproximadamente 3000 L, entre aproximadamente 1000 L y aproximadamente 2000 L, entre aproximadamente 1000 L y aproximadamente 1500 L, entre aproximadamente 2000 L y aproximadamente 8000 L, entre aproximadamente 2000 L y aproximadamente 7000 L, entre aproximadamente 2000 L y aproximadamente 6000 L, entre aproximadamente 2000 L y aproximadamente 5000 L, entre aproximadamente 2000 L y aproximadamente 4000 L, entre aproximadamente 2000 L y aproximadamente 3000 L, entre aproximadamente 3000 L y aproximadamente 8000 L, entre aproximadamente 3000 L y aproximadamente 7000 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 6.000 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 5.000 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 4.000 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 8.000 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 7.000 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 6.000 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 5.000 L, entre aproximadamente 5.000 L y aproximadamente 8.000 L, entre aproximadamente 5.000 L y aproximadamente 7.000 L, entre aproximadamente 5.000 L y aproximadamente 6.000 L, entre aproximadamente 6.000 L y aproximadamente 8.000 L, entre aproximadamente 6.000 L y aproximadamente 7.000 L, o entre aproximadamente 7.000 L o aproximadamente 8.000 L) en condiciones que permitan el mantenimiento y la proliferación celular en el cultivo.
[0092] Como es sabido en la técnica, el volumen de un cultivo celular puede permanecer sustancialmente igual o puede aumentar con el tiempo durante el período de cultivo (por ejemplo, tal como se describe a continuación).
[0093] Período de cultivo
[0095] [0053] El cultivo (por ejemplo, cultivo por perfusión) en cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento se puede realizar durante un período de tiempo de entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 100 días (por ejemplo, entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 95 días, entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 90 días, entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 85 días, entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 80 días, entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 75 días, entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 70 días, entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 65 días, entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 60 días, entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 55 días, entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 50 días, entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 45 días, entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 40 días, entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 35 días, entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 30 días, entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 25 días, entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 20 días, entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 15 días, entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 10 días, entre aproximadamente 5 días y aproximadamente 100 días, entre aproximadamente 5 días y aproximadamente 95 días, entre aproximadamente 5 días y aproximadamente 90 días, entre aproximadamente 5 días y aproximadamente 85 días, entre aproximadamente 5 días y aproximadamente 80 días, entre aproximadamente 5 días y aproximadamente 75 días, entre aproximadamente 5 días y aproximadamente 70 días, entre aproximadamente 5 días y aproximadamente 65 días, entre aproximadamente 5 días y aproximadamente 60 días, entre aproximadamente 5 días y aproximadamente 55 días, entre aproximadamente 5 días y aproximadamente 50 días, entre aproximadamente 5 días y aproximadamente 45 días, entre aproximadamente 5 días y aproximadamente 40 días, entre aproximadamente 5 días y aproximadamente 35 días, entre aproximadamente 5 días y aproximadamente 30 días, entre aproximadamente 5 días y aproximadamente 25 días, entre aproximadamente 5 días y aproximadamente 20 días, entre aproximadamente 5 días y aproximadamente 15 días, entre aproximadamente 5 días y aproximadamente 10 días, entre aproximadamente 10 días y aproximadamente 100 días, entre aproximadamente 10 días y aproximadamente 95 días, entre aproximadamente 10 días y aproximadamente 90 días, entre aproximadamente 10 días y aproximadamente 85 días, entre aproximadamente 10 días y aproximadamente 80 días, entre aproximadamente 10 días y aproximadamente 75 días, entre aproximadamente 10 días y aproximadamente 70 días, entre aproximadamente 10 días y aproximadamente 65 días, entre aproximadamente 10 días y aproximadamente 60 días, entre aproximadamente 10 días y aproximadamente 55 días, entre aproximadamente 10 días y aproximadamente 50 días, entre aproximadamente 10 días y aproximadamente 45 días, entre aproximadamente 10 días y aproximadamente 40 días, entre aproximadamente 10 días y aproximadamente 35 días, entre aproximadamente 10 días y aproximadamente 30 días, entre aproximadamente 10 días y aproximadamente 25 días, entre aproximadamente 10 días y aproximadamente 20 días, entre aproximadamente 10 días y aproximadamente 15 días, entre aproximadamente 15 días y aproximadamente 100 días, entre aproximadamente 15 días y aproximadamente 95 días, entre aproximadamente 15 días y aproximadamente 90 días, entre aproximadamente 15 días y aproximadamente 85 días, entre aproximadamente 15 días y aproximadamente 80 días, entre aproximadamente 15 días y aproximadamente 75 días, entre aproximadamente 15 días y aproximadamente 70 días, entre aproximadamente 15 días y aproximadamente 65 días, entre aproximadamente 15 días y aproximadamente 60 días, entre aproximadamente 15 días y aproximadamente 55 días, entre aproximadamente 15 días y aproximadamente 50 días, entre aproximadamente 15 días y aproximadamente 45 días, entre aproximadamente 15 días y aproximadamente 40 días, entre aproximadamente 15 días y aproximadamente 35 días, entre aproximadamente 15 días y aproximadamente 30 días, entre aproximadamente 15 días y aproximadamente 25 días, entre aproximadamente 15 días y aproximadamente 20 días, entre aproximadamente 20 días y aproximadamente 100 días, entre aproximadamente 20 días y aproximadamente 95 días, entre aproximadamente 20 días y aproximadamente 90 días, entre aproximadamente 20 días y aproximadamente 85 días, entre aproximadamente 20 días y aproximadamente 80 días, entre aproximadamente 20 días y aproximadamente 75 días, entre aproximadamente 20 días y aproximadamente 70 días, entre aproximadamente 20 días y aproximadamente 65 días, entre aproximadamente 20 días y aproximadamente 60 días, entre aproximadamente 20 días y aproximadamente 55 días, entre aproximadamente 20 días y aproximadamente 50 días, entre aproximadamente 20 días y aproximadamente 45 días, entre aproximadamente 20 días y aproximadamente 40 días, entre aproximadamente 20 días y aproximadamente 35 días, entre aproximadamente 20 días y aproximadamente 30 días, entre aproximadamente 20 días y aproximadamente 25 días, entre aproximadamente 25 días y aproximadamente 100 días, entre aproximadamente 25 días y aproximadamente 95 días, entre aproximadamente 25 días y aproximadamente 90 días, entre aproximadamente 25 días y aproximadamente 85 días, entre aproximadamente 25 días y aproximadamente 80 días, entre aproximadamente 25 días y aproximadamente 75 días, entre aproximadamente 25 días y aproximadamente 70 días, entre aproximadamente 25 días y aproximadamente 65 días, entre aproximadamente 25 días y aproximadamente 60 días, entre aproximadamente 25 días y aproximadamente 55 días, entre aproximadamente 25 días y aproximadamente 50 días, entre aproximadamente 25 días y aproximadamente 45 días, entre aproximadamente 25 días y aproximadamente 40 días, entre aproximadamente 25 días y aproximadamente 35 días, entre aproximadamente 25 días y aproximadamente 30 días, entre aproximadamente 30 días y aproximadamente 100 días, entre aproximadamente 30 días y aproximadamente 90 días, entre aproximadamente 30 días y aproximadamente 80 días, entre aproximadamente 30 días y aproximadamente 70 días, entre aproximadamente 30 días y aproximadamente 60 días, entre aproximadamente 30 días y aproximadamente 50 días, entre aproximadamente 30 días y aproximadamente 40 días, entre aproximadamente 40 días y aproximadamente 100 días, entre aproximadamente 40 días y aproximadamente 90 días, entre aproximadamente 40 días y aproximadamente 80 días, entre aproximadamente 40 días y aproximadamente 70 días, entre aproximadamente 40 días y aproximadamente 60 días, entre aproximadamente 40 días y aproximadamente 50 días, entre aproximadamente 50 días y aproximadamente 100 días, entre aproximadamente 50 días y aproximadamente 90 días, entre aproximadamente 50 días y aproximadamente 80 días, entre aproximadamente 50 días y aproximadamente 70 días, entre aproximadamente 50 días y aproximadamente 60 días, entre aproximadamente 60 días y aproximadamente 100 días, entre aproximadamente 60 días y aproximadamente 90 días, entre aproximadamente 60 días y aproximadamente 80 días, entre aproximadamente 60 días y aproximadamente 70 días, entre aproximadamente 70 días y aproximadamente 100 días, entre aproximadamente 70 días y aproximadamente 90 días, entre aproximadamente 70 días y aproximadamente 80 días, entre aproximadamente 80 días y aproximadamente 100 días, entre aproximadamente 80 días y aproximadamente 90 días, o entre aproximadamente 90 días y aproximadamente 100 días).
[0097] Células de mamíferos
[0099] La célula de mamífero cultivada (por ejemplo, cultivada por perfusión) en los procedimientos proporcionados en el presente documento puede ser una célula que crece en suspensión o una célula adherente. Ejemplos no limitativos de células de mamífero que pueden cultivarse en cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento incluyen: células de ovario de hámster chino (CHO) (por ejemplo, células CHO DG44 o células CHO-K1s), Sp2.0, células de mieloma (por ejemplo, NS/0), células B, células de hibridoma, células T, células de riñón embrionario humano (HEK) (por ejemplo, HEK 293E y HEK 293F), células epiteliales de riñón de mono verde africano (Vero), una célula NSO, una célula de riñón de hámster bebé (BHK), una célula PerC6, células Vero, una célula HT-1080 y células epiteliales de riñón canino Madin-Darby (Cocker Spaniel) (MDCK). En algunos ejemplos donde se cultiva una célula adherente, el cultivo puede contener también una pluralidad de microportadores (por ejemplo, microportadores que contienen uno o más poros). En la técnica se conocen otras células de mamíferos que pueden cultivarse mediante cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento.
[0101] La célula de mamífero contiene un ácido nucleico recombinante (por ejemplo, un ácido nucleico integrado de forma estable en el genoma de la célula de mamífero) que codifica una proteína recombinante. A continuación se describen ejemplos no limitativos de ácidos nucleicos recombinantes que codifican proteínas recombinantes de ejemplo, así como proteínas recombinantes que pueden producirse utilizando los procedimientos descritos en este documento. En algunos casos, la célula de mamífero que se cultiva en un biorreactor (por ejemplo, cualquiera de los biorreactores descritos en este documento) se obtuvo de un cultivo más grande.
[0103] Un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante puede introducirse en una célula de mamífero utilizando una amplia variedad de procedimientos conocidos en biología molecular y genética molecular. Algunos ejemplos no limitativos incluyen la transfección (por ejemplo, lipofección), la transducción (por ejemplo, infección por lentivirus, adenovirus o retrovirus) y la electroporación. En algunos casos, el ácido nucleico que codifica una proteína recombinante no se integra de forma estable en un cromosoma de la célula de mamífero (transfección transitoria), mientras que en otros sí se integra el ácido nucleico. De forma alternativa o complementaria, el ácido nucleico que codifica una proteína recombinante puede estar presente en un plásmido y/o en un cromosoma artificial de mamífero (por ejemplo, un cromosoma artificial humano). De forma alternativa o complementaria, el ácido nucleico puede introducirse en la célula utilizando un vector viral (por ejemplo, un vector de lentivirus, retrovirus o adenovirus). El ácido nucleico puede estar unido operativamente a una secuencia promotora (por ejemplo, un promotor fuerte, tal como un promotor de β-actina y un promotor CMV, o un promotor inducible). Un vector que contenga el ácido nucleico también puede, si se desea, contener un marcador seleccionable (por ejemplo, un gen que confiera resistencia a la higromicina, la puromicina o la neomicina a la célula de mamífero).
[0105] [0057] En algunos casos, la proteína recombinante es una proteína secretada y es liberada por la célula de mamífero al medio extracelular (por ejemplo, el primer y/o segundo medio líquido en el cultivo por perfusión o el primer medio líquido y/o el medio líquido de alimentación en el cultivo de alimentación discontinua). Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína recombinante soluble puede contener una secuencia que codifica un péptido señal de secreción en el extremo N o C de la proteína recombinante, que es escindido por una enzima presente en la célula de mamífero y posteriormente liberado al medio extracelular (por ejemplo, el primer y/o segundo medio líquido).
[0107] Biorreactores
[0109] [0058] La etapa de cultivo en cualquiera de los procedimientos descritos en este documento puede realizarse utilizando un biorreactor (por ejemplo, un biorreactor de perfusión o un biorreactor de cultivo de alimentación discontinua). Un biorreactor (por ejemplo, un biorreactor de perfusión o un biorreactor de alimentación discontinua) utilizado para realizar la etapa de cultivo puede tener un volumen interno (capacidad) de entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 25.000 L (por ejemplo, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 20.000 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 15.000 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 9.500 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 9.000 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 8.500 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 8.000 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 7.500 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 7.000 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 6.500 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 6.000 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 5.500 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 5.000 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 4.500 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 4.000 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 3.500 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 3.000 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 2.500 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 2.000 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 1.500 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 1.000 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 900 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 800 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 700 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 600 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 500 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 400 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 300 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 200 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 100 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 25.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 20.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 15.000, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 9.500 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 9.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 8.500 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 8.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 7.500 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 7.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 6.500 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 6.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 5.500 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 5.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 4.500 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 4.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 3.500 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 3.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 2.500 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 2.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 1.500 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 1.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 900 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 800 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 700 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 600 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 500 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 400 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 300 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 200 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 25.000 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 20.000 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 15.000 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 9.500 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 9.000 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 8.500 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 8.000 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 7.500 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 7.000 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 6.500 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 6.000 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 5.500 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 5.000 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 4.500 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 4.000 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 3.500 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 3.000 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 2.500 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 2.000 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 1.500 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 1.000 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 900 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 800 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 700 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 600 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 500 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 400 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 300 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 25.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 20.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 15.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 9.500 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 9.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 8.500 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 8.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 7.500 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 7.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 6.500 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 6.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 5.500 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 5.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 4.500 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 4.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 3.500 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 3.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 2.500 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 2.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 1.500 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 1.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 900 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 800 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 700 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 600 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 25.000 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 20.000 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 15.000 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 9.500 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 9.000 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 8.500 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 8.000 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 7.500 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 7.000 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 6.500 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 6.000 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 5.500 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 5.000 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 4.500 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 4.000 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 3.500 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 3.000 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 2.500 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 2.000 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 1.500 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 25.000 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 20.000 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 15.000 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 9.500 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 9.000 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 8.500 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 8.000 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 7.500 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 7.000 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 6.500 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 6.000 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 5.500 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 5.000 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 4.500 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 4.000 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 3.500 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 3.000 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 2.500 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 25.000 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 20.000 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 15.000 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 9.500 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 9.000 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 8.500 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 8.000 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 7.500 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 7.000 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 6.500 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 6.000 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 5.500 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 5.000 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 4.500 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 4.000 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 3.500 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 9.000 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 25.000 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 20.000 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 15.000 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 9.500 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 9.000 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 8.500 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 8.000 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 7.500 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 7.000 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 6.500 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 6.000 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 5.500 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 5.000 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 4.500 L, entre aproximadamente 5.000 L y aproximadamente 25.000 L, entre aproximadamente 5.000 L y aproximadamente 20.000 L, entre aproximadamente 5.000 L y aproximadamente 15.000 L, entre aproximadamente 5.000 L y aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 5.000 L y aproximadamente 9.500 L, entre aproximadamente 5.000 L y aproximadamente 9.000 L, entre aproximadamente 5.000 L y aproximadamente 8.500 L, entre aproximadamente 5.000 L y aproximadamente 8.000 L, entre aproximadamente 5.000 L y aproximadamente 7.500 L, entre aproximadamente 5.000 L y aproximadamente 7.000 L, entre aproximadamente 5.000 L y aproximadamente 6.500 L, entre aproximadamente 5.000 L y aproximadamente 6.000 L, entre aproximadamente 5.000 L y aproximadamente 5.500 L, entre aproximadamente 6.000 L y aproximadamente 25.000 L, entre aproximadamente 6.000 L y aproximadamente 20.000 L, entre aproximadamente 6.000 L y aproximadamente 15.000 L, entre aproximadamente 6.000 L y aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 6.000 L y aproximadamente 9.500 L, entre aproximadamente 6.000 L y aproximadamente 9.000 L, entre aproximadamente 6.000 L y aproximadamente 8.500 L, entre aproximadamente 6.000 L y aproximadamente 8.000 L, entre aproximadamente 6.000 L y aproximadamente 7.500 L, entre aproximadamente 6.000 L y aproximadamente 7.000 L, entre aproximadamente 6.000 L y aproximadamente 6.500 L, entre 7.000 L y aproximadamente 25.000 L, entre aproximadamente 7.000 L y aproximadamente 20.000 L, entre aproximadamente 7.000 L y aproximadamente 15.000 L, entre aproximadamente 7.000 L y aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 7.000 L y aproximadamente 9.500 L, entre aproximadamente 7.000 L y aproximadamente 9.000 L, entre aproximadamente 7.000 L y aproximadamente 8.500 L, entre aproximadamente 7.000 L y aproximadamente 8.000 L, entre aproximadamente 7.000 L y aproximadamente 7.500 L, entre aproximadamente 8.000 L y aproximadamente 25.000 L, entre aproximadamente 8.000 L y aproximadamente 20.000 L, entre aproximadamente 8.000 L y aproximadamente 15.000 L, entre aproximadamente 8.000 L y aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 8.000 L y aproximadamente 9.500 L, entre aproximadamente 8.000 L y aproximadamente 9.000 L, entre aproximadamente 8.000 L y aproximadamente 8.500 L, entre aproximadamente 9.000 L y aproximadamente 25.000 L, entre aproximadamente 9.000 L y aproximadamente 20.000 L, entre aproximadamente 9.000 L y aproximadamente 15.000 L, entre aproximadamente 9.000 L y aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 9.000 L y aproximadamente 9.500 L, entre aproximadamente 10.000 L y aproximadamente 25.000 L, entre aproximadamente 10.000 L y aproximadamente 20.000 L, entre aproximadamente 10.000 L y aproximadamente 15.000 L, entre aproximadamente 15.000 L y aproximadamente 25.000 L, entre aproximadamente 15.000 L y aproximadamente 20.000 L, o entre aproximadamente 20.000 L y aproximadamente 25.000 L).
[0111] Sistemas de cultivo
[0113] [0059] Algunos de los procedimientos descritos en este documento utilizan un sistema de cultivo (por ejemplo, un sistema de cultivo por perfusión) que incluye un recipiente, un medio líquido dispuesto dentro del recipiente (por ejemplo, cualquiera de los medios de cultivo descritos en este documento) y un difusor dispuesto dentro del recipiente que incluye una pluralidad de poros configurados para dispensar gas a través del difusor hacia el medio líquido. El recipiente puede tener un volumen interno (capacidad) de entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 20.000 L (por ejemplo, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 15.000 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 9.500 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 9.000 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 8.500 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 8.000 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 7.500 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 7.000 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 6.500 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 6.000 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 5.500 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 5.000 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 4.500 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 4.000 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 3.500 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 3.000 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 2.500 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 2.000 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 1.500 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 1.000 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 900 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 800 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 700 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 600 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 500 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 400 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 300 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 200 L, entre aproximadamente 24 L y aproximadamente 100 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 20.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 15.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 9.500 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 9.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 8.500 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 8.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 7.500 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 7.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 6.500 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 6.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 5.500 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 5.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 4.500 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 4.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 3.500 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 3.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 2.500 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 2.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 1.500 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 1.000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 900 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 800 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 700 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 600 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 500 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 400 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 300 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 200 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 20.000 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 15.000 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 9.500 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 9.000 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 8.500 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 8.000 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 7.500 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 7.000 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 6.500 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 6.000 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 5.500 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 5.000 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 4.500 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 4.000 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 3.500 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 3.000 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 2.500 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 2.000 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 1.500 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 1.000 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 900 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 800 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 700 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 600 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 500 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 400 L, entre aproximadamente 200 L y aproximadamente 300 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 20.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 15.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 9.500 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 9.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 8.500 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 8.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 7.500 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 7.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 6.500 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 6.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 5.500 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 5.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 4.500 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 4.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 3.500 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 3.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 2.500 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 2.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 1.500 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 1.000 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 900 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 800 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 700 L, entre aproximadamente 500 L y aproximadamente 600 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 25.000 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 20.000 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 15.000 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 9.500 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 9.000 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 8.500 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 8.000 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 7.500 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 7.000 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 6.500 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 6.000 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 5.500 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 5.000 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 4.500 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 4.000 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 3.500 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 3.000 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 2.500 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 2.000 L, entre aproximadamente 1.000 L y aproximadamente 1.500 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 20.000 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 15.000 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 9.500 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 9.000 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 8.500 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 8.000 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 7.500 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 7.000 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 6.500 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 6.000 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 5.500 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 5.000 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 4.500 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 4.000 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 3.500 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 3.000 L, entre aproximadamente 2.000 L y aproximadamente 2.500 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 20.000 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 15.000 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 9.500 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 9.000 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 8.500 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 8.000 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 7.500 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 7.000 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 6.500 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 6.000 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 5.500 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 5.000 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 4.500 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 4.000 L, entre aproximadamente 3.000 L y aproximadamente 3.500 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 20.000 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 15.000 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 9.500 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 9.000 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 8.500 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 8.000 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 7.500 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 7.000 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 6.500 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 6.000 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 5.500 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 5.000 L, entre aproximadamente 4.000 L y aproximadamente 4.500 L, entre aproximadamente 5.000 L y aproximadamente 20.000 L, entre aproximadamente 5.000 L y aproximadamente 15.000 L, entre aproximadamente 5.000 L y aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 5.000 L y aproximadamente 9.500 L, entre aproximadamente 5.000 L y aproximadamente 9.000 L, entre aproximadamente 5.000 L y aproximadamente 8.500 L, entre aproximadamente 5.000 L y aproximadamente 8.000 L, entre aproximadamente 5.000 L y aproximadamente 7.500 L, entre aproximadamente 5.000 L y aproximadamente 7.000 L, entre aproximadamente 5.000 L y aproximadamente 6.500 L, entre aproximadamente 5.000 L y aproximadamente 6.000 L, entre aproximadamente 5.000 L y aproximadamente 5.500 L, entre aproximadamente 6.000 L y aproximadamente 20.000 L, entre aproximadamente 6.000 L y aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 6.000 L y aproximadamente 9.500 L, entre aproximadamente 6.000 L y aproximadamente 9.000 L, entre aproximadamente 6.000 L y aproximadamente 8.500 L, entre aproximadamente 6.000 L y aproximadamente 8.000 L, entre aproximadamente 6.000 L y aproximadamente 7.500 L, entre aproximadamente 6.000 L y aproximadamente 7.000 L, entre aproximadamente 6.000 L y aproximadamente 6.500 L, entre aproximadamente 7.000 L y aproximadamente 20.000 L, entre aproximadamente 7.000 L y aproximadamente 15.000 L, entre aproximadamente 7.000 L y aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 7.000 L y aproximadamente 9.500 L, entre aproximadamente 7.000 L y aproximadamente 9.000 L, entre aproximadamente 7.000 L y aproximadamente 8.500 L, entre aproximadamente 7.000 L y aproximadamente 8.000 L, entre aproximadamente 7.000 L y aproximadamente 7.500 L, entre aproximadamente 8.000 L y aproximadamente 20.000 L, entre aproximadamente 8.000 L y aproximadamente 15.000 L, entre aproximadamente 8.000 L y aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 8.000 L y aproximadamente 9.500 L, entre aproximadamente 8.000 L y aproximadamente 9.000 L, entre aproximadamente 8.000 L y aproximadamente 8.500 L, entre aproximadamente 9.000 L y aproximadamente 20.000 L, entre aproximadamente 9.000 L y aproximadamente 15.000 L, entre aproximadamente 9.000 L y aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 9.000 L y aproximadamente 9.500 L, entre aproximadamente 10.000 L y aproximadamente 20.000 L, entre aproximadamente 10.000 L y aproximadamente 15.000 L, o entre aproximadamente 15.000 L y aproximadamente 20.000 L). El recipiente puede estar fabricado de metal (por ejemplo, acero inoxidable), plástico o vidrio, o cualquier combinación de los mismos.
[0114] [0060] En algunos casos, el uno o más poros del difusor pueden tener un tamaño de poro de entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 1,5 mm (por ejemplo, entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 1,45 mm, entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 1,4 mm, entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 1,35 mm, entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 1,3 mm, entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 1,25 mm, entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 1,2 mm, entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 1,15 mm, entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 1,1 mm, entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 1,05 mm, entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 1,0 mm, entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 950 µm, entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 900 µm, entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 850 µm, entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 800 µm, entre aproximadamente 800 µm y aproximadamente 1,5 mm, entre aproximadamente 800 µm y aproximadamente 1,45 mm, entre aproximadamente 800 µm y aproximadamente 1,4 mm, entre aproximadamente 800 µm y aproximadamente 1,35 mm, entre aproximadamente 800 µm y aproximadamente 1,3 mm, entre aproximadamente 800 µm y aproximadamente 1,25 mm, entre aproximadamente 800 µm y aproximadamente 1,2 mm, entre aproximadamente 800 µm y aproximadamente 1,15 mm, entre aproximadamente 800 µm y aproximadamente 1,1 mm, entre aproximadamente 800 µm y aproximadamente 1,05 mm, entre aproximadamente 800 µm y aproximadamente 1,0 mm, entre aproximadamente 800 µm y aproximadamente 950 µm, entre aproximadamente 800 µm y aproximadamente 900 µm, entre aproximadamente 800 µm y aproximadamente 850 µm, entre aproximadamente 850 µm y aproximadamente 1,5 mm, entre aproximadamente 850 µm y aproximadamente 1,45 mm, entre aproximadamente 850 µm y aproximadamente 1,4 mm, entre aproximadamente 850 µm y aproximadamente 1,35 mm, entre aproximadamente 850 µm y aproximadamente 1,3 mm, entre aproximadamente 850 µm y aproximadamente 1,25 mm, entre aproximadamente 850 µm y aproximadamente 1,2 mm, entre aproximadamente 850 µm y aproximadamente 1,15 mm, entre aproximadamente 850 µm y aproximadamente 1,1 mm, entre aproximadamente 850 µm y aproximadamente 1,05 mm, entre aproximadamente 850 µm y aproximadamente 1,0 mm, entre aproximadamente 850 µm y aproximadamente 950 µm, entre aproximadamente 850 µm y aproximadamente 900 µm, entre aproximadamente 900 µm y aproximadamente 1,5 mm, entre aproximadamente 900 µm y aproximadamente 1,45 mm, entre aproximadamente 900 µm y aproximadamente 1,4 mm, entre aproximadamente 900 µm y aproximadamente 1,35 mm, entre aproximadamente 900 µm y aproximadamente 1,3 mm, entre aproximadamente 900 µm y aproximadamente 1,25 mm, entre aproximadamente 900 µm y aproximadamente 1,2 mm, entre aproximadamente 900 µm y aproximadamente 1,15 mm, entre aproximadamente 900 µm y aproximadamente 1,1 mm, entre aproximadamente 900 µm y aproximadamente 1,05 mm, entre aproximadamente 900 µm y aproximadamente 1,0 mm, entre aproximadamente 900 µm y aproximadamente 950 µm, entre aproximadamente 950 µm y aproximadamente 1,5 mm, entre aproximadamente 950 µm y aproximadamente 1,45 mm, entre aproximadamente 950 µm y aproximadamente 1,4 mm, entre aproximadamente 950 µm y aproximadamente 1,35 mm, entre aproximadamente 950 µm y aproximadamente 1,3 mm, entre aproximadamente 950 µm y aproximadamente 1,25 mm, entre aproximadamente 950 µm y aproximadamente 1,2 mm, entre aproximadamente 950 µm y aproximadamente 1,15 mm, entre aproximadamente 950 µm y aproximadamente 1,1 mm, entre aproximadamente 950 µm y aproximadamente 1,05 mm, entre aproximadamente 950 µm y aproximadamente 1,0 mm, entre aproximadamente 1,0 mm y aproximadamente 1,5 mm, entre aproximadamente 1,0 mm y aproximadamente 1,45 mm, entre aproximadamente 1,0 mm y aproximadamente 1,4 mm, entre aproximadamente 1,0 mm y aproximadamente 1,35 mm, entre aproximadamente 1,0 mm y aproximadamente 1,3 mm, entre aproximadamente 1,0 mm y aproximadamente 1,25 mm, entre aproximadamente 1,0 mm y aproximadamente 1,2 mm, entre aproximadamente 1,0 mm y aproximadamente 1,15 mm, entre aproximadamente 1,0 mm y aproximadamente 1.1 mm, entre aproximadamente 1,0 mm y aproximadamente 1,05 mm, entre aproximadamente 1,05 mm y aproximadamente 1,5 mm, entre aproximadamente 1,05 mm y aproximadamente 1,45 mm, entre aproximadamente 1,05 mm y aproximadamente 1,4 mm, entre aproximadamente 1,05 mm y aproximadamente 1,35 mm, entre aproximadamente 1,05 mm y aproximadamente 1,3 mm, entre aproximadamente 1,05 mm y aproximadamente 1,25 mm, entre aproximadamente 1,05 mm y aproximadamente 1,2 mm, entre aproximadamente 1,05 mm y aproximadamente 1,15 mm, entre aproximadamente 1,05 mm y aproximadamente 1,1 mm, entre aproximadamente 1,1 mm y aproximadamente 1,5 mm, entre aproximadamente 1,1 mm y aproximadamente 1,45 mm, entre aproximadamente 1,1 mm y aproximadamente 1,4 mm, entre aproximadamente 1,1 mm y aproximadamente 1,35 mm, entre aproximadamente 1,1 mm y aproximadamente 1,3 mm, entre aproximadamente 1,1 mm y aproximadamente 1,25 mm, entre aproximadamente 1,1 mm y aproximadamente 1,2 mm, entre aproximadamente 1,1 mm y aproximadamente 1,15 mm, entre aproximadamente 1,15 mm y aproximadamente 1,5 mm, entre aproximadamente 1,15 mm y aproximadamente 1,45 mm, entre aproximadamente 1,15 mm y aproximadamente 1,4 mm, entre aproximadamente 1,15 mm y aproximadamente 1,35 mm, entre aproximadamente 1,15 mm y aproximadamente 1,3 mm, entre aproximadamente 1,15 mm y aproximadamente 1,25 mm, entre aproximadamente 1,15 mm y aproximadamente 1,2 mm, entre aproximadamente 1,2 mm y aproximadamente 1,5 mm, entre aproximadamente 1,2 mm y aproximadamente 1,45 mm, entre aproximadamente 1,2 mm y aproximadamente 1,4 mm, entre aproximadamente 1,2 mm y aproximadamente 1,35 mm, entre aproximadamente 1,2 mm y aproximadamente 1,3 mm, entre aproximadamente 1,2 mm y aproximadamente 1,25 mm, entre aproximadamente 1,25 mm y aproximadamente 1,5 mm, entre aproximadamente 1,25 mm y aproximadamente 1,45 mm, entre aproximadamente 1,25 mm y aproximadamente 1,4 mm, entre aproximadamente 1,25 mm y aproximadamente 1,35 mm, entre aproximadamente 1,25 mm y aproximadamente 1,3 mm, entre aproximadamente 1,3 mm y aproximadamente 1,5 mm, entre aproximadamente 1,3 mm y aproximadamente 1,45 mm, entre aproximadamente 1,3 mm y aproximadamente 1,4 mm, entre aproximadamente 1,3 mm y aproximadamente 1,35 mm, entre aproximadamente 1,35 mm y aproximadamente 1,5 mm, entre aproximadamente 1,35 mm y aproximadamente 1,45 mm, entre aproximadamente 1,35 mm y aproximadamente 1,4 mm, entre aproximadamente 1,4 mm y aproximadamente 1,5 mm, entre aproximadamente 1,4 mm y aproximadamente 1,45 mm, o entre aproximadamente 1,45 mm y aproximadamente 1,5 mm).
[0116] En algunos casos, el uno o más poros del difusor pueden tener un tamaño de poro de entre aproximadamente 250 µm y aproximadamente 750 µm (por ejemplo, entre aproximadamente 250 µm y aproximadamente 700 µm, entre aproximadamente 250 µm y aproximadamente 650 µm, entre aproximadamente 250 µm y aproximadamente 600 µm, entre aproximadamente 250 µm y aproximadamente 550 µm, entre aproximadamente 250 µm y aproximadamente 500 µm, entre aproximadamente 250 µm y aproximadamente 450 µm, entre aproximadamente 250 µm y aproximadamente 400 µm, entre aproximadamente 250 µm y aproximadamente 350 µm, entre aproximadamente 250 µm y aproximadamente 300 µm, entre aproximadamente 300 µm y aproximadamente 750 µm, entre aproximadamente 300 µm y aproximadamente 650 µm, entre aproximadamente 300 µm y aproximadamente 600 µm, entre aproximadamente 300 µm y aproximadamente 550 µm, entre aproximadamente 300 µm y aproximadamente 500 µm, entre aproximadamente 300 µm y aproximadamente 450 µm, entre aproximadamente 300 µm y aproximadamente 400 µm, entre aproximadamente 300 µm y aproximadamente 350 µm, entre aproximadamente 350 µm y aproximadamente 750 µm, entre aproximadamente 350 µm y aproximadamente 700 µm, entre aproximadamente 350 µm y aproximadamente 650 µm, entre aproximadamente 350 µm y aproximadamente 600 µm, entre aproximadamente 350 µm y aproximadamente 550 µm, entre aproximadamente 350 µm y aproximadamente 500 µm, entre aproximadamente 350 µm y aproximadamente 450 µm, entre aproximadamente 350 µm y aproximadamente 400 µm, entre aproximadamente 400 µm y aproximadamente 750 µm, entre aproximadamente 400 µm y aproximadamente 700 µm, entre aproximadamente 400 µm y aproximadamente 650 µm, entre aproximadamente 400 µm y aproximadamente 600 µm, entre aproximadamente 400 µm y aproximadamente 550 µm, entre aproximadamente 400 µm y aproximadamente 500 µm, entre aproximadamente 400 µm y aproximadamente 450 µm, entre aproximadamente 450 µm y aproximadamente 750 µm, entre aproximadamente 450 µm y aproximadamente 700 µm, entre aproximadamente 450 µm y aproximadamente 650 µm, entre aproximadamente 450 µm y aproximadamente 600 µm, entre aproximadamente 450 µm y aproximadamente 550 µm, entre aproximadamente 450 µm y aproximadamente 500 µm, entre aproximadamente 500 µm y aproximadamente 750 µm, entre aproximadamente 500 µm y aproximadamente 700 µm, entre aproximadamente 500 µm y aproximadamente 650 µm, entre aproximadamente 500 µm y aproximadamente 600 µm, entre aproximadamente 500 µm y aproximadamente 550 µm, entre aproximadamente 550 µm y aproximadamente 750 µm, entre aproximadamente 550 µm y aproximadamente 700 µm, entre aproximadamente 550 µm y aproximadamente 650 µm, entre aproximadamente 550 µm y aproximadamente 600 µm, entre aproximadamente 600 µm y aproximadamente 750 µm, entre aproximadamente 600 µm y aproximadamente 700 µm, entre aproximadamente 600 µm y aproximadamente 650 µm, entre aproximadamente 650 µm y aproximadamente 750 µm, entre aproximadamente 650 µm y aproximadamente 700 µm, o entre aproximadamente 700 µm y aproximadamente 750 µm).
[0118] [0062] En algunos casos, el uno o más poros del difusor pueden tener un tamaño de poro de entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 250 µm (por ejemplo, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 240 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 230 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 220 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 210 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 200 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 190 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 180 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 170 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 160 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 140 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 130 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 125 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 120 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 115 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 110 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 105 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 100 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 95 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 90 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 85 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 80 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 75 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 70 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 65 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 60 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 55 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 50 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 45 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 40 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 35 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 30 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 25 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 20 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 15 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 10 µm, entre 1 µm y aproximadamente 5 µm, entre 10 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 240 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 230 µm, entre 10 µm y aproximadamente 220 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 210 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 200 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 190 µm, entre 10 µm y aproximadamente 180 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 170 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 160 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 140 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 130 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 120 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 110 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 100 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 90 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 80 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 70 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 60 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 50 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 40 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 30 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 20 µm, entre aproximadamente 20 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 20 µm y aproximadamente 240 µm, entre aproximadamente 20 µm y aproximadamente 230 µm, entre aproximadamente 20 µm y aproximadamente 220 µm, entre aproximadamente 20 µm y aproximadamente 210 µm, entre aproximadamente 20 µm y aproximadamente 200 µm, entre aproximadamente 20 µm y aproximadamente 190 µm, entre aproximadamente 20 µm y aproximadamente 180 µm, entre aproximadamente 20 µm y aproximadamente 170 µm, entre aproximadamente 20 µm y aproximadamente 160 µm, entre aproximadamente 20 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 20 µm y aproximadamente 140 µm, entre aproximadamente 20 µm y aproximadamente 130 µm, entre aproximadamente 20 µm y aproximadamente 120 µm, entre aproximadamente 20 µm y aproximadamente 110 µm, entre aproximadamente 20 µm y aproximadamente 100 µm, entre aproximadamente 20 µm y aproximadamente 90 µm, entre aproximadamente 20 µm y aproximadamente 80 µm, entre aproximadamente 20 µm y aproximadamente 70 µm, entre aproximadamente 20 µm y aproximadamente 60 µm, entre aproximadamente 20 µm y aproximadamente 50 µm, entre aproximadamente 20 µm y aproximadamente 40 µm, entre aproximadamente 20 µm y aproximadamente 30 µm, entre aproximadamente 30 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 30 µm y aproximadamente 240 µm, entre aproximadamente 30 µm y aproximadamente 230 µm, entre aproximadamente 30 µm y aproximadamente 220 µm, entre aproximadamente 30 µm y aproximadamente 210 µm, entre aproximadamente 30 µm y aproximadamente 200 µm, entre aproximadamente 30 µm y aproximadamente 190 µm, entre aproximadamente 30 µm y aproximadamente 180 µm, entre aproximadamente 30 µm y aproximadamente 170 µm, entre aproximadamente 30 µm y aproximadamente 160 µm, entre aproximadamente 30 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 30 µm y aproximadamente 140 µm, entre aproximadamente 30 µm y aproximadamente 130 µm, entre aproximadamente 30 µm y aproximadamente 120 µm, entre aproximadamente 30 µm y aproximadamente 110 µm, entre aproximadamente 30 µm y aproximadamente 110 µm, entre aproximadamente 30 µm y aproximadamente 100 µm, entre aproximadamente 30 µm y aproximadamente 90 µm, entre aproximadamente 30 µm y aproximadamente 80 µm, entre aproximadamente 30 µm y aproximadamente 70 µm, entre aproximadamente 30 µm y aproximadamente 60 µm, entre aproximadamente 30 µm y aproximadamente 50 µm, entre aproximadamente 30 µm y aproximadamente 40 µm, entre aproximadamente 40 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 40 µ y aproximadamente 240 µm, entre aproximadamente 40 µm y aproximadamente 230 µm, entre aproximadamente 40 µm y aproximadamente 220 µm, entre aproximadamente 40 µm y aproximadamente 210 µm, entre aproximadamente 40 µm y aproximadamente 200 µm, entre aproximadamente 40 µm y aproximadamente 190 µm, entre aproximadamente 40 µm y aproximadamente 180 µm, entre aproximadamente 40 µm y aproximadamente 170 µm, entre aproximadamente 40 µm y aproximadamente 160 µm, entre aproximadamente 40 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 40 µm y aproximadamente 140 µm, entre aproximadamente 40 µm y aproximadamente 130 µm, entre aproximadamente 40 µm y aproximadamente 120 µm, entre aproximadamente 40 µm y aproximadamente 110 µm, entre aproximadamente 40 µm y aproximadamente 100 µm, entre aproximadamente 40 µm y aproximadamente 90 µm, entre aproximadamente 40 µm y aproximadamente 80 µm, entre aproximadamente 40 µm y aproximadamente 70 µm, entre aproximadamente 40 µm y aproximadamente 60 µm, entre aproximadamente 40 µm y aproximadamente 50 µm, entre aproximadamente 50 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 50 µm y aproximadamente 240 µm, entre aproximadamente 50 µm y aproximadamente 230 µm, entre aproximadamente 50 µm y aproximadamente 220 µm, entre aproximadamente 50 µm y aproximadamente 210 µm, entre aproximadamente 50 µm y aproximadamente 200 µm, entre aproximadamente 50 µm y aproximadamente 190 µm, entre aproximadamente 50 µm y aproximadamente 180 µm, entre aproximadamente 50 µm y aproximadamente 170 µm, entre aproximadamente 50 µm y aproximadamente 160 µm, entre aproximadamente 50 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 50 µm y aproximadamente 140 µm, entre aproximadamente 50 µm y aproximadamente 130 µm, entre aproximadamente 50 µm y aproximadamente 120 µm, entre aproximadamente 50 µm y aproximadamente 110 µm, entre aproximadamente 50 µm y aproximadamente 100 µm, entre aproximadamente 50 µm y aproximadamente 90 µm, entre aproximadamente 50 µm y aproximadamente 80 µm, entre aproximadamente 50 µm y aproximadamente 70 µm, entre aproximadamente 50 µm y aproximadamente 60 µm, entre aproximadamente 60 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 60 µm y aproximadamente 240 µm, entre aproximadamente 60 µm y aproximadamente 230 µm, entre aproximadamente 60 µm y aproximadamente 220 µm, entre aproximadamente 60 µm y aproximadamente 210 µm, entre aproximadamente 60 µm y aproximadamente 200 µm, entre aproximadamente 60 µm y aproximadamente 190 µm, entre aproximadamente 60 µm y aproximadamente 180 µm, entre aproximadamente 60 µm y aproximadamente 170 µm, entre aproximadamente 60 µm y aproximadamente 160 µm, entre aproximadamente 60 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 60 µm y aproximadamente 140 µm, entre aproximadamente 60 µm y aproximadamente 130 µm, entre aproximadamente 60 µm y aproximadamente 120 µm, entre aproximadamente 60 µm y aproximadamente 110 µm, entre aproximadamente 60 µm y aproximadamente 100 µm, entre aproximadamente 60 µm y aproximadamente 90 µm, entre aproximadamente 60 µm y aproximadamente 80 µm, entre aproximadamente 60 µm y aproximadamente 70 µm, entre aproximadamente 70 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 70 µm y aproximadamente 240 µm, entre aproximadamente 70 µm y aproximadamente 230 µm, entre aproximadamente 70 µm y aproximadamente 220 µm, entre aproximadamente 70 µm y aproximadamente 210 µm, entre aproximadamente 70 µm y aproximadamente 200 µm, entre aproximadamente 70 µm y aproximadamente 190 µm, entre aproximadamente 70 µm y aproximadamente 180 µm, entre aproximadamente 70 µm y aproximadamente 170 µm, entre aproximadamente 70 µm y aproximadamente 160 µm, entre aproximadamente 70 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 70 µm y aproximadamente 140 µm, entre aproximadamente 70 µm y aproximadamente 130 µm, entre aproximadamente 70 µm y aproximadamente 120 µm, entre aproximadamente 70 µm y aproximadamente 110 µm, entre aproximadamente 70 µm y aproximadamente 100 µm, entre aproximadamente 70 µm y aproximadamente 90 µm, entre aproximadamente 70 µm y aproximadamente 80 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 240 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 230 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 220 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 210 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 200 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 190 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 180 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 170 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 160 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 140 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 130 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 120 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 110 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 100 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 90 µm, entre aproximadamente 90 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 90 µm y aproximadamente 240 µm, entre aproximadamente 90 µm y aproximadamente 230 µm, entre aproximadamente 90 µm y aproximadamente 220 µm, entre aproximadamente 90 µm y aproximadamente 210 µm, entre aproximadamente 90 µm y aproximadamente 200 µm, entre aproximadamente 90 µm y aproximadamente 190 µm, entre aproximadamente 90 µm y aproximadamente 180 µm, entre aproximadamente 90 µm y aproximadamente 170 µm, entre aproximadamente 90 µm y aproximadamente 160 µm, entre aproximadamente 90 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 90 µm y aproximadamente 140 µm, entre aproximadamente 90 µm y aproximadamente 130 µm, entre aproximadamente 90 µm y aproximadamente 120 µm, entre aproximadamente 90 µm y aproximadamente 110 µm, entre aproximadamente 90 µm y aproximadamente 100 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 240 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 230 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 220 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 210 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 200 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 190 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 180 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 170 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 160 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 140 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 130 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 120 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 110 µm, entre aproximadamente 110 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 110 µm y aproximadamente 240 µm, entre aproximadamente 110 µm y aproximadamente 230 µm, entre aproximadamente 110 µm y aproximadamente 220 µm, entre aproximadamente 110 µm y aproximadamente 210 µm, entre aproximadamente 110 µm y aproximadamente 200 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 190 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 180 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 170 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 160 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 140 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 130 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 120 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 110 µm, entre aproximadamente 110 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 110 µm y aproximadamente 240 µm, entre aproximadamente 110 µm y aproximadamente 230 µm, entre aproximadamente 110 µm y aproximadamente 220 µm, entre aproximadamente 110 µm y aproximadamente 210 µm, entre aproximadamente 110 µm y aproximadamente 200 µm, entre aproximadamente 110 µm y aproximadamente 190 µm, entre aproximadamente 110 µm y aproximadamente 180 µm, entre aproximadamente 110 µm y aproximadamente 170 µm, entre aproximadamente 110 µm y aproximadamente 160 µm, entre aproximadamente 110 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 110 µm y aproximadamente 140 µm, entre aproximadamente 110 µm y aproximadamente 130 µm, entre aproximadamente 110 µm y aproximadamente 120 µm, entre aproximadamente 120 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 120 µm y aproximadamente 240 µm, entre aproximadamente 120 µm y aproximadamente 230 µm, entre aproximadamente 120 µm y aproximadamente 220 µm, entre aproximadamente 120 µm y aproximadamente 210 µm, entre aproximadamente 120 µm y aproximadamente 200 µm, entre aproximadamente 120 µm y aproximadamente 190 µm, entre aproximadamente 120 µm y aproximadamente 180 µm, entre aproximadamente 120 µm y aproximadamente 170 µm, entre aproximadamente 120 µm y aproximadamente 160 µm, entre aproximadamente 120 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 120 µm y aproximadamente 140 µm, entre aproximadamente 120 µm y aproximadamente 130 µm, entre aproximadamente 130 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 130 µm y aproximadamente 240 µm, entre aproximadamente 130 µm y aproximadamente 230 µm, entre aproximadamente 130 µm y aproximadamente 220 µm, entre aproximadamente 130 µm y aproximadamente 210 µm, entre aproximadamente 130 µm y aproximadamente 200 µm, entre aproximadamente 130 µm y aproximadamente 190 µm, entre aproximadamente 130 µm y aproximadamente 180 µm, entre aproximadamente 130 µm y aproximadamente 170 µm, entre aproximadamente 130 µm y aproximadamente 160 µm, entre aproximadamente 130 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 130 µm y aproximadamente 140 µm, entre aproximadamente 140 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 140 µm y aproximadamente 240 µm, entre aproximadamente 140 µm y aproximadamente 230 µm, entre aproximadamente 140 µm y aproximadamente 220 µm, entre aproximadamente 140 µm y aproximadamente 210 µm, entre aproximadamente 140 µm y aproximadamente 200 µm, entre aproximadamente 140 µm y aproximadamente 190 µm, entre aproximadamente 140 µm y aproximadamente 180 µm, entre aproximadamente 140 µm y aproximadamente 170 µm, entre aproximadamente 140 µm y aproximadamente 160 µm, entre aproximadamente 140 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 150 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 150 µm y aproximadamente 240 µm, entre aproximadamente 150 µm y aproximadamente 230 µm, entre aproximadamente 150 µm y aproximadamente 220 µm, entre aproximadamente 150 µm y aproximadamente 210 µm, entre aproximadamente 150 µm y aproximadamente 200 µm, entre aproximadamente 150 µm y aproximadamente 190 µm, entre aproximadamente 150 µm y aproximadamente 180 µm, entre aproximadamente 150 µm y aproximadamente 170 µm, entre aproximadamente 150 µm y aproximadamente 160 µm, entre aproximadamente 160 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 160 µm y aproximadamente 240 µm, entre aproximadamente 160 µm y aproximadamente 230 µm, entre aproximadamente 160 µm y aproximadamente 220 µm, entre aproximadamente 160 µm y aproximadamente 210 µm, entre aproximadamente 160 µm y aproximadamente 200 µm, entre aproximadamente 160 µm y aproximadamente 190 µm, entre aproximadamente 160 µm y aproximadamente 180 µm, entre aproximadamente 160 µm y aproximadamente 170 µm, entre aproximadamente 170 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 170 µm y aproximadamente 240 µm, entre aproximadamente 170 µm y aproximadamente 230 µm, entre aproximadamente 170 µm y aproximadamente 220 µm, entre aproximadamente 170 µm y aproximadamente 210 µm, entre aproximadamente 170 µm y aproximadamente 200 µm, entre aproximadamente 170 µm y aproximadamente 190 µm, entre aproximadamente 170 µm y aproximadamente 180 µm, entre aproximadamente 180 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 180 µm y aproximadamente 240 µm, entre aproximadamente 180 µm y aproximadamente 230 µm, entre aproximadamente 180 µm y aproximadamente 220 µm, entre aproximadamente 180 µm y aproximadamente 210 µm, entre aproximadamente 180 µm y aproximadamente 200 µm, entre aproximadamente 180 µm y aproximadamente 190 µm, entre aproximadamente 190 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 190 µm y aproximadamente 240 µm, entre aproximadamente 190 µm y aproximadamente 230 µm, entre aproximadamente 190 µm y aproximadamente 220 µm, entre aproximadamente 190 µm y aproximadamente 210 µm, entre aproximadamente 190 µm y aproximadamente 200 µm, entre aproximadamente 200 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 200 µm y aproximadamente 240 µm, entre aproximadamente 200 µm y aproximadamente 230 µm, entre aproximadamente 200 µm y aproximadamente 220 µm, entre aproximadamente 200 µm y aproximadamente 210 µm, entre aproximadamente 210 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 210 µm y aproximadamente 240 µm, entre aproximadamente 210 µm y aproximadamente 230 µm, entre aproximadamente 210 µm y aproximadamente 220 µm, entre aproximadamente 220 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 220 µm y aproximadamente 240 µm, entre aproximadamente 220 µm y aproximadamente 230 µm, entre aproximadamente 230 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 230 µm y aproximadamente 240 µm, o entre aproximadamente 240 µm y aproximadamente 250 µm).
[0120] El uno o más poros del difusor puede tener un tipo de poro de, por ejemplo, poro perforado o poro sinterizado. El sistema de cultivo puede incluir un dispositivo para agitar el medio líquido dispuesto dentro del recipiente (por ejemplo, un impulsor y un motor que hace girar el impulsor). El recipiente puede incluir uno o más puertos (y opcionalmente bombas) que permiten la adición de un material (por ejemplo, un medio líquido, poloxámero-188, base o ácido (según sea necesario para regular el pH) y/o antiespumante) al medio líquido dispuesto en el recipiente y/o la extracción de medio líquido (por ejemplo, un medio líquido clarificado o una muestra de cultivo celular). El sistema de cultivo también puede incluir uno o más sensores para monitorizar el pH, dO<2>, la temperatura y dCO<2>en el medio líquido durante un período de cultivo. El sistema de cultivo puede incluir un dispositivo de filtración (por ejemplo, un dispositivo que realiza filtración tangencial alterna o filtración de flujo tangencial) que procesa un volumen de cultivo celular para obtener un medio líquido clarificado que está sustancialmente libre de células. El sistema de cultivo también puede incluir un dispositivo de calentamiento/enfriamiento que permite regular la temperatura del medio líquido dispuesto en el recipiente. Otras características de los sistemas de cultivo celular son bien conocidas en la técnica.
[0122] Cultivo por perfusión
[0124] En cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, la etapa de cultivo puede ser el cultivo por perfusión. El procedimiento de la presente invención comprende el cultivo por perfusión de una célula de mamífero, tal como se describe en las reivindicaciones adjuntas. Como es sabido en la técnica, el cultivo por perfusión incluye extraer de un biorreactor un primer volumen de un primer medio líquido y añadir al biorreactor un segundo volumen de un segundo medio líquido, donde el primer volumen y el segundo volumen son aproximadamente iguales. Las células de mamífero se retienen en el biorreactor mediante algún dispositivo de retención celular o mediante técnicas, tales como la sedimentación celular en un cono de sedimentación.
[0126] Tal como es sabido en la técnica, el cultivo por perfusión es diferente del cultivo por alimentación discontinua, y los medios de cultivo y/o las condiciones de cultivo utilizados en el cultivo por perfusión suelen ser diferentes de los utilizados en el cultivo por alimentación discontinua.
[0128] La extracción y adición de medios en el cultivo por perfusión se puede realizar de forma simultánea o secuencial, o alguna combinación de ambos. Además, la extracción y adición se puede realizar de forma continua, tal como a una velocidad que extraiga y reemplace un volumen de entre 0,1 % y 800 %, entre 1 % y 700 %, entre 1 % y 600 %, entre 1 % y 500 %, entre 1 % y 400 %, entre 1 % y 350 %, entre 1 % y 300 %, entre 1 % y 250 %, entre 1 % y 100 %, entre 100 % y 200 %, entre 5 % y 150 %, entre 10 % y 50 %, entre 15 % y 40 %, entre 8 % y 80 %, o entre 4 % y 30 % del volumen del biorreactor.
[0130] [0067] El primer volumen del primer medio líquido extraído y el segundo volumen del segundo medio líquido añadido pueden, en algunos casos, mantenerse aproximadamente iguales durante cada período de 24 horas. Tal como es sabido en la técnica, la velocidad a la que se extrae el primer volumen del primer medio líquido (volumen/unidad de tiempo) y la velocidad a la que se añade el segundo volumen del segundo medio líquido (volumen/unidad de tiempo) pueden variar y dependen de las condiciones del sistema de cultivo celular en particular. La velocidad a la que se extrae el primer volumen del primer medio líquido (volumen/unidad de tiempo) y la velocidad a la que se añade el segundo volumen del segundo medio líquido (volumen/unidad de tiempo) pueden ser aproximadamente iguales o pueden ser diferentes.
[0131] Alternativamente, el volumen extraído y añadido puede cambiar aumentando gradualmente durante cada período de 24 horas. Por ejemplo, el volumen del primer medio líquido extraído y el volumen del segundo medio líquido añadido dentro de cada período de 24 horas pueden aumentarse durante el período de cultivo. El volumen puede aumentarse durante el período de cultivo desde un volumen que está entre el 0,5 % y aproximadamente el 20 % del volumen del biorreactor. El volumen puede aumentarse durante el período de cultivo hasta aproximadamente el 25 % o el 150 % de la capacidad del biorreactor o el volumen del cultivo celular al inicio del período de cultivo.
[0132] En algunos ejemplos de los procedimientos descritos en el presente documento, después de las primeras 48 a 96 horas del período de cultivo, en cada período de 24 horas (dentro del período de cultivo), el primer volumen del primer medio líquido extraído y el segundo volumen del segundo medio líquido añadido es de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 95 %, de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 20 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 30 %, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 40 %, de aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 50 %, de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 60 %, de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 70 %, de aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 80 %, de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 90 %, de aproximadamente el 85 % a aproximadamente el 95 %, de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 80 % o de aproximadamente el 70 % del volumen del cultivo celular al inicio del período de cultivo.
[0133] Los profesionales experimentados comprenderán que el primer medio líquido y el segundo medio líquido pueden ser del mismo tipo de medio. En otros casos, el primer medio líquido y el segundo medio líquido pueden ser diferentes. El segundo medio líquido puede estar más concentrado con respecto a uno o más componentes del medio.
[0134] El primer volumen del primer medio líquido puede extraerse utilizando cualquier sistema automatizado. Por ejemplo, se puede utilizar la filtración de flujo tangencial alterno. Alternativamente, el primer volumen del primer medio líquido puede extraerse por percolación o flujo por gravedad del primer volumen del primer medio líquido a través de una membrana estéril con un límite de exclusión por peso molecular que excluye la célula de mamífero. Alternativamente, el primer volumen del primer medio líquido puede extraerse deteniendo o disminuyendo significativamente la velocidad de agitación durante un período de al menos 1 minuto, al menos 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 25 minutos, 30 minutos, 40 minutos, 50 minutos o 1 hora, y extrayendo o aspirando el primer volumen del primer medio líquido desde la parte superior del biorreactor.
[0135] El segundo volumen del segundo medio líquido se puede añadir al primer medio líquido mediante una bomba. El segundo medio líquido se puede añadir al primer medio líquido manualmente, por ejemplo, mediante pipeteo o inyectando el segundo volumen del segundo medio líquido directamente sobre el primer medio líquido, o de forma automatizada.
[0136] Algunas realizaciones de los procedimientos descritos en el presente documento comprenden proporcionar un recipiente que contiene células de mamífero dispuestas en un primer medio líquido; incubar el recipiente con agitación y durante un período de cultivo de al menos aproximadamente 7 días a una temperatura entre aproximadamente 32 °C y aproximadamente 40 °C; y de forma continua o periódica después de las primeras 48 a 96 horas del período de cultivo extraer un primer volumen del primer medio líquido y añadir al primer medio líquido un segundo volumen de un segundo medio líquido, donde el primer y el segundo volumen son aproximadamente iguales. En algunos casos, después de aproximadamente las primeras 48 a 96 horas del período de cultivo, en cada período de 24 horas, el primer volumen del primer medio líquido extraído y el segundo volumen del segundo medio líquido añadido es de aproximadamente 0,3x a aproximadamente 10x del volumen del primer medio líquido o del volumen del recipiente.
[0137] Algunos ejemplos de cultivo por perfusión incluyen incubar un sistema de cultivo que contiene un primer medio líquido con agitación y durante un período de cultivo de al menos aproximadamente 7 días a una temperatura entre aproximadamente 32 °C y aproximadamente 40 °C; y de forma continua o periódica después de las primeras 48 a 96 horas del período de cultivo, extraer un primer volumen del primer medio líquido y añadir al primer medio líquido un segundo volumen de un segundo medio líquido.
[0138] Cultivo por alimentación discontinua
[0139] La etapa de cultivo en los procedimientos descritos en el presente documento puede incluir el cultivo por alimentación discontinua. Tal como es sabido en la técnica, el cultivo por alimentación discontinua incluye la adición incremental o continua de un medio líquido de alimentación a un cultivo celular inicial sin la extracción sustancial o significativa del primer medio líquido del cultivo celular. En algunos casos, el medio líquido de alimentación es el mismo que el primer medio líquido. El medio de alimentación puede estar en forma líquida (un medio líquido de alimentación) o en polvo seco. En otros casos, el medio líquido de alimentación es una forma concentrada del primer medio líquido y/o se añade como polvo seco.
[0140] El medio líquido de alimentación se puede añadir al cultivo celular inicial en un punto de tiempo específico o en varios puntos de tiempo durante el período de cultivo. Por ejemplo, el medio líquido de alimentación se puede añadir al cultivo celular inicial en un punto de tiempo que se encuentra entre 6 horas y 7 días, entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 6 días, entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 5 días, entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 4 días, entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 3 días, entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 2 días, entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 1 día, entre aproximadamente 12 horas y aproximadamente 7 días, entre aproximadamente 12 horas y aproximadamente 6 días, entre aproximadamente 12 horas y aproximadamente 5 días, entre aproximadamente 12 horas y aproximadamente 4 días, entre aproximadamente 12 horas y aproximadamente 3 días, entre aproximadamente 12 horas y aproximadamente 2 días, entre aproximadamente 1 día y aproximadamente 7 días, entre aproximadamente 1 día y aproximadamente 6 días, entre aproximadamente 1 día y aproximadamente 5 días, entre aproximadamente 1 día y aproximadamente 4 días, entre aproximadamente 1 día y aproximadamente 3 días, entre aproximadamente 1 día y aproximadamente 2 días, entre aproximadamente 2 días y aproximadamente 7 días, entre aproximadamente 2 días y aproximadamente 6 días, entre aproximadamente 2 días y aproximadamente 5 días, entre aproximadamente 2 días y aproximadamente 4 días, entre aproximadamente 2 días y aproximadamente 3 días, entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 7 días, entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 6 días, entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 5 días, entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 4 días, entre aproximadamente 4 días y aproximadamente 7 días, entre aproximadamente 4 días y aproximadamente 6 días, entre aproximadamente 4 días y aproximadamente 5 días, entre aproximadamente 5 días y aproximadamente 7 días, o entre aproximadamente 5 días y aproximadamente 6 días, después del inicio del período de cultivo.
[0142] El medio líquido de alimentación puede añadirse continuamente al cultivo celular inicial, o se puede añadir periódicamente (por ejemplo, diariamente) al cultivo celular inicial durante el periodo de cultivo. En algunos ejemplos, cuando el medio líquido de alimentación se añade periódicamente al cultivo celular inicial, el medio líquido de alimentación puede añadirse una, dos veces, tres veces, cuatro veces o cinco veces. El volumen del medio líquido de alimentación o la cantidad de medio sólido de alimentación añadido al cultivo celular inicial puede variar (por ejemplo, aumentar) durante el periodo de cultivo. El volumen del medio líquido de alimentación añadido al cultivo celular inicial en cualquier periodo de 24 horas durante el periodo de cultivo puede ser alguna fracción de la capacidad del biorreactor. El volumen de un medio líquido de alimentación añadido al cultivo celular inicial durante cualquier período de 24 horas durante el período de cultivo puede estar entre 0,01X y aproximadamente 0,3X (por ejemplo, entre aproximadamente 0,01X y aproximadamente 0,28X, entre aproximadamente 0,01X y aproximadamente 0,26X, entre aproximadamente 0,01X y aproximadamente 0,24X, entre aproximadamente 0,01X y aproximadamente 0,22X, entre aproximadamente 0,01X y aproximadamente 0,20X, entre aproximadamente 0,01X y aproximadamente 0,18X, entre aproximadamente 0,01X y aproximadamente 0,16X, entre aproximadamente 0,01X y aproximadamente 0,14X, entre aproximadamente 0,01X y aproximadamente 0,12X, entre aproximadamente 0,01X y aproximadamente 0,10X, entre aproximadamente 0,01X y aproximadamente 0,08X, entre aproximadamente 0,01X y aproximadamente 0,06X, entre aproximadamente 0,01X y aproximadamente 0,04X, entre aproximadamente 0,025X y aproximadamente 0,3X, entre aproximadamente 0,025X y aproximadamente 0,28X, entre aproximadamente 0,025X y aproximadamente 0,26X, entre aproximadamente 0,025X y aproximadamente 0,24X, entre aproximadamente 0,025X y aproximadamente 0,22X, entre aproximadamente 0,025X y aproximadamente 0,20X, entre aproximadamente 0,025X y aproximadamente 0,18X, entre aproximadamente 0,025X y aproximadamente 0,16X, entre aproximadamente 0,025X y aproximadamente 0,14X, entre aproximadamente 0,025X y aproximadamente 0,12X, entre aproximadamente 0,025X y aproximadamente 0,10X, entre aproximadamente 0,025X y aproximadamente 0,08X, entre aproximadamente 0,025X y aproximadamente 0,06X, entre aproximadamente 0,025X y aproximadamente 0,04X, entre aproximadamente 0,05X y aproximadamente 0,3X, entre aproximadamente 0,05X y aproximadamente 0,28X, entre aproximadamente 0,05X y aproximadamente 0,26X, entre aproximadamente 0,05X y aproximadamente 0,24X, entre aproximadamente 0,05X y aproximadamente 0,22X, entre aproximadamente 0,05X y aproximadamente 0,20X, entre aproximadamente 0,05X y aproximadamente 0,18X, entre aproximadamente 0,05X y aproximadamente 0,16X, entre aproximadamente 0,05X y aproximadamente 0,14X, entre aproximadamente 0,05X y aproximadamente 0,12X, entre aproximadamente 0,05X y aproximadamente 0,10X, entre aproximadamente 0,1X y aproximadamente 0,3X, entre aproximadamente 0,1X y aproximadamente 0,28X, entre aproximadamente 0,1X y aproximadamente 0,26X, entre aproximadamente 0,1X y aproximadamente 0,24X, entre aproximadamente 0,1X y aproximadamente 0,22X, entre aproximadamente 0,1X y aproximadamente 0,20X, entre aproximadamente 0,1X y aproximadamente 0,18X, entre aproximadamente 0,1X y aproximadamente 0,16X, entre aproximadamente 0,1X y aproximadamente 0,14X, entre aproximadamente 0,1X, entre aproximadamente 0,15X y aproximadamente 0,3X, entre aproximadamente 0,15X y aproximadamente 0,2X, entre aproximadamente 0,2X y aproximadamente 0,3X, o entre aproximadamente 0,25X y aproximadamente 0,3X) de la capacidad de un biorreactor que contiene el cultivo.
[0144] [0078] En otros casos, el volumen de un medio líquido de alimentación añadido al cultivo celular inicial durante cualquier período de 24 horas en el período de cultivo puede estar entre 0,02X y aproximadamente 1,0X (por ejemplo, entre aproximadamente 0,02X y aproximadamente 0,9X, entre aproximadamente 0,02X y aproximadamente 0,8X, entre aproximadamente 0,02X y aproximadamente 0,7X, entre aproximadamente 0,02X y aproximadamente 0,6X, entre aproximadamente 0,02X y aproximadamente 0,5X, entre aproximadamente 0,02X y aproximadamente 0,4X, entre aproximadamente 0,02X y aproximadamente 0,3X, entre aproximadamente 0,02X y aproximadamente 0,2X, entre aproximadamente 0,02X y aproximadamente 0,1X, entre aproximadamente 0,05X y aproximadamente 1,0X, entre aproximadamente 0,05X y aproximadamente 0,8X, entre aproximadamente 0,05X y aproximadamente 0,7X, entre aproximadamente 0,05X y aproximadamente 0,6X, entre aproximadamente 0,05X y aproximadamente 0,5X, entre aproximadamente 0,05X y aproximadamente 0,4X, entre aproximadamente 0,05X y aproximadamente 0,3X, entre aproximadamente 0,05X y aproximadamente 0,2X, entre aproximadamente 0,05X y aproximadamente 0,1X, entre aproximadamente 0,1X y aproximadamente 1,0X, entre aproximadamente 0,1X y aproximadamente 0,9X, entre aproximadamente 0,1X y aproximadamente 0,8X, entre aproximadamente 0,1X y aproximadamente 0,7X, entre aproximadamente 0,1X y aproximadamente 0,6X, entre aproximadamente 0,1X y aproximadamente 0,5X, entre aproximadamente 0,1X y aproximadamente 0,4X, entre aproximadamente 0,1X y aproximadamente 0,3X, entre aproximadamente 0,1X y aproximadamente 0,2X, entre aproximadamente 0,2X y aproximadamente 1,0X, entre aproximadamente 0,2X y aproximadamente 0,9X, entre aproximadamente 0,2X y aproximadamente 0,8X, entre aproximadamente 0,2X y aproximadamente 0,7X, entre aproximadamente 0,2X y aproximadamente 0,6X, entre aproximadamente 0,2X y aproximadamente 0,5X, o entre aproximadamente 0,2X y aproximadamente 0,4X) del volumen del cultivo celular al comienzo del período de cultivo.
[0146] Poloxámero-188
[0148] El poloxámero-188 es una molécula conocida en la técnica. Es un copolímero de bloques sintético no iónico de óxido de etileno y óxido de propileno. El poloxámero-188 tiene un peso molecular promedio de entre aproximadamente 7680 y aproximadamente 9510, y aproximadamente el 81,8 % ± 1,9 % de su composición en peso corresponde a oxietileno. Por ejemplo, el poloxámero-188 tiene la estructura que se muestra en la Fórmula I a continuación, donde a es 80 y b es 27. El número CAS del poloxámero-188 es 9003-11-6.
[0151]
[0153] (Fórmula I)
[0155] El poloxámero-188 está disponible comercialmente a través de varios proveedores diferentes, que incluyen, por ejemplo, Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Mediatech, Inc. (Manassas, VA), MAST Therapeutics, Inc. (San Diego, CA), EMD Millipore (Billerica, MA), BASF (Ludwigshafen, Alemania), Pluronic<®>F-68 Life Technologies (Carlsbad, CA) y PhytoTechnology Laboratories, LLC (Shawnee Mission, KS).
[0157] [0081] Los procedimientos proporcionados en el presente documento incluyen el cultivo de una célula de mamífero que incluye un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante en un medio líquido que incluye poloxámero-188 a una concentración de aproximadamente 1,8 g/L o a una concentración mayor que 1,8 g/L (por ejemplo, una concentración de aproximadamente 1,9 g/L o una concentración mayor que 1,9 g/L, una concentración de aproximadamente 2,0 g/L o una concentración mayor que 2,0 g/L, una concentración de aproximadamente 2,1 g/L o una concentración mayor que 2,1 g/L, una concentración de aproximadamente 2,2 g/L o una concentración mayor que 2,2 g/L, una concentración de aproximadamente 2,3 g/L o una concentración mayor que 2,3 g/L, una concentración de aproximadamente 2,4 g/L o una concentración mayor que 2,4 g/L, una concentración de aproximadamente 2,5 g/L o una concentración mayor que 2,5 g/L, una concentración de aproximadamente 2,6 g/L o una concentración mayor que 2,6 g/L, una concentración de aproximadamente 2,7 g/L o una concentración mayor que 2,7 g/L, una concentración de aproximadamente 2,8 g/L o una concentración mayor que 2,8 g/L, una concentración de aproximadamente 2,9 g/L o una concentración mayor que 2,9 g/L, una concentración de aproximadamente 3,0 g/L o una concentración mayor que 3,0 g/L, una concentración de aproximadamente 3,1 g/L o una concentración mayor que 3,1 g/L, una concentración de aproximadamente 3,2 g/L o una concentración mayor que 3,2 g/L, una concentración de aproximadamente 3,3 g/L o una concentración mayor que 3,3 g/L, una concentración de aproximadamente 3,4 g/L o una concentración mayor que 3,4 g/L, una concentración de aproximadamente 3,5 g/L o una concentración mayor que 3,5 g/L, una concentración de aproximadamente 3,6 g/L o una concentración mayor que 3,6 g/L, una concentración de aproximadamente 3,7 g/L o una concentración mayor que 3,7 g/L, una concentración de aproximadamente 3,8 g/L o una concentración mayor que 3,8 g/L, una concentración de aproximadamente 3,9 g/L o una concentración mayor que 3,9 g/L, una concentración de aproximadamente 4,0 g/L o una concentración mayor que 4,0 g/L, una concentración de aproximadamente 4,1 g/L o una concentración mayor que 4,1 g/L, una concentración de aproximadamente 4,2 g/L o una concentración mayor que 4,2 g/L, una concentración de aproximadamente 4,3 g/L o una concentración mayor que 4,3 g/L, una concentración de aproximadamente 4,4 g/L o una concentración mayor que 4,4 g/L, una concentración de aproximadamente 4,5 g/L o una concentración mayor que 4,5 g/L, una concentración de aproximadamente 4,6 g/L o una concentración mayor que 4,6 g/L, una concentración de aproximadamente 4,7 g/L o una concentración mayor que 4,7 g/L, una concentración de aproximadamente 4,8 g/L o una concentración mayor que 4,8 g/L, una concentración de aproximadamente 4,9 g/L o una concentración mayor que 4,9 g/L, una concentración de aproximadamente 5,0 g/L o una concentración mayor que 5,0 g/L, una concentración de aproximadamente 5,1 g/L o una concentración mayor que 5,1 g/L, una concentración de aproximadamente 5,2 g/L o una concentración mayor que 5,2 g/L, una concentración de aproximadamente 5,3 g/L o una concentración mayor que 5,3 g/L, una concentración de aproximadamente 5,4 g/L o una concentración mayor que 5,4 g/L, una concentración de aproximadamente 5,5 g/L o una concentración mayor que 5,5 g/L,una concentración de aproximadamente 5,6 g/L o una concentración mayor que 5,6 g/L, una concentración de aproximadamente 5,7 g/L o una concentración mayor que 5,7 g/L, una concentración de aproximadamente 5,8 g/L o una concentración mayor que 5,8 g/L, una concentración de aproximadamente 5,9 g/L o una concentración mayor que 5,9 g/L, una concentración de aproximadamente 6,0 g/L o una concentración mayor que 6,0 g/L, una concentración de aproximadamente 6,1 g/L o una concentración mayor que 6,1 g/L, una concentración de aproximadamente 6,2 g/L o una concentración mayor que 6,2 g/L, una concentración de aproximadamente 6,3 g/L o una concentración mayor que 6,3 g/L, una concentración de aproximadamente 6,4 g/L o una concentración mayor que 6,4 g/L, una concentración de aproximadamente 6,5 g/L o una concentración mayor que 6,5 g/L, una concentración de aproximadamente 6,6 g/L o una concentración mayor que 6,6 g/L, una concentración de aproximadamente 6,7 g/L o una concentración mayor que 6,7 g/L, una concentración de aproximadamente 6,8 g/L o una concentración mayor que 6,8 g/L, una concentración de aproximadamente 6,9 g/L o una concentración mayor que 6,9 g/L, una concentración de aproximadamente 7,0 g/L o una concentración mayor que 7,0 g/L, una concentración de aproximadamente 7,1 g/L o una concentración mayor que 7,1 g/L, una concentración de aproximadamente 7,2 g/L o una concentración mayor que 7,2 g/L, una concentración de aproximadamente 7,3 g/L o una concentración mayor que 7,3 g/L, una concentración de aproximadamente 7,4 g/L o una concentración mayor que 7,4 g/L, una concentración de aproximadamente 7,5 g/L o una concentración mayor que 7,5 g/L, una concentración de aproximadamente 7,6 g/L o una concentración mayor que 7,6 g/L, una concentración de aproximadamente 7,7 g/L o una concentración mayor que 7,7 g/L, una concentración de aproximadamente 7,8 g/L o una concentración mayor que 7,8 g/L, una concentración de aproximadamente 7,9 g/L o una concentración mayor que 7,9 g/L, una concentración de aproximadamente 8,0 g/L o una concentración mayor que 8,0 g/L, una concentración de aproximadamente 8,1 g/L o una concentración mayor que 8,1 g/L, una concentración de aproximadamente 8,2 g/L o una concentración mayor que 8,2 g/L, una concentración de aproximadamente 8,3 g/L o una concentración mayor que 8,3 g/L, una concentración de aproximadamente 8,4 g/L o una concentración mayor que 8,4 g/L, una concentración de aproximadamente 8,5 g/L o una concentración mayor que 8,5 g/L, una concentración de aproximadamente 8,6 g/L o una mayor concentración que 8,6 g/L, una concentración de aproximadamente 8,7 g/L o una concentración mayor que 8,7 g/L, una concentración de aproximadamente 8,8 g/L o una concentración mayor que 8,8 g/L, una concentración de aproximadamente 8,9 g/L o una concentración mayor que 8,9 g/L, una concentración de aproximadamente 9,0 g/L o una concentración mayor que 9,0 g/L, una concentración de aproximadamente 9,1 g/L o una concentración mayor que 9,1 g/L, una concentración de aproximadamente 9,2 g/L o una concentración mayor que 9,2 g/L, una concentración de aproximadamente 9,3 g/L o una concentración mayor que 9,3 g/L, una concentración de aproximadamente 9,4 g/L o una concentración mayor que 9,4 g/L, una concentración de aproximadamente 9,5 g/L o una concentración mayor que 9,5 g/L, una concentración de aproximadamente 9.6 g/L o una concentración mayor que 9,6 g/L, una concentración de aproximadamente 9,7 g/L o una concentración mayor que 9,7 g/L, una concentración de aproximadamente 9,8 g/L o una concentración mayor que 9,8 g/L, una concentración de aproximadamente 9,9 g/L o una concentración mayor que 9,9 g/L, una concentración de aproximadamente 10,0 g/L o una concentración mayor que 10,0 g/L, una concentración de aproximadamente 10,1 g/L o una concentración mayor que 10,1 g/L, una concentración de aproximadamente 10,2 g/L o una concentración mayor que 10,2 g/L, una concentración de aproximadamente 10,3 g/L o una concentración mayor que 10,3 g/L, una concentración de aproximadamente 10,4 g/L o una concentración mayor que 10,4 g/L, una concentración de aproximadamente 10,5 g/L o una concentración mayor que 10,5 g/L, una concentración de aproximadamente 10,6 g/L o una concentración mayor que 10,6 g/L, una concentración de aproximadamente 10,7 g/L o una concentración mayor que 10,7 g/L, una concentración de aproximadamente 10,8 g/L o una concentración mayor que 10,8 g/L, una concentración de aproximadamente 10,9 g/L o una concentración mayor que 10,9 g/L, una concentración de aproximadamente 11,0 g/L o una concentración mayor que 11,0 g/L, una concentración de aproximadamente 11,1 g/L o una concentración mayor que 11,1 g/L, una concentración de aproximadamente 11,2 g/L o una concentración mayor que 11,2 g/L, una concentración de aproximadamente 11,3 g/L o una concentración mayor que 11,3 g/L, una concentración de aproximadamente 11,4 g/L o una concentración mayor que 11,4 g/L, una concentración de aproximadamente 11,5 g/L o una concentración mayor que 11,5 g/L, una concentración de aproximadamente 11,6 g/L o una concentración mayor que 11,6 g/L, una concentración de aproximadamente 11,7 g/L o una concentración mayor que 11,7 g/L, una concentración de aproximadamente 11,8 g/L o una concentración mayor que 11,8 g/L, una concentración de aproximadamente 11,9 g/L o una concentración mayor que 11,9 g/L, una concentración de aproximadamente 12,0 g/L o una concentración mayor que 12,0 g/L, una concentración de aproximadamente 12,1 g/L o una concentración mayor que 12,1 g/L, una concentración de aproximadamente 12,2 g/L o una concentración mayor que 12,2 g/L, una concentración de aproximadamente 12,3 g/L o una concentración mayor que 12,3 g/L, una concentración de aproximadamente 12,4 g/L o una concentración mayor que 12,4 g/L, una concentración de aproximadamente 12,5 g/L o una concentración mayor que 12,5 g/L, una concentración de aproximadamente 12,6 g/L o una concentración mayor que 12,6 g/L, una concentración de aproximadamente 12,7 g/L o una concentración mayor que 12,7 g/L, una concentración de aproximadamente 12,8 g/L o una concentración mayor que 12,8 g/L, una concentración de aproximadamente 12,9 g/L o una concentración mayor que 12,9 g/L, una concentración de aproximadamente 13,0 g/L o una concentración mayor que 13,0 g/L, una concentración de aproximadamente 13,1 g/L o una concentración mayor que 13,1 g/L, una concentración de aproximadamente 13,2 g/L o una concentración mayor que 13,2 g/L, una concentración de aproximadamente 13,3 g/L o una concentración mayor que 13,3 g/L, una concentración de aproximadamente 13,4 g/L o una concentración mayor que 13,4 g/L, una concentración de aproximadamente 13,5 g/L o una concentración mayor que 13.5 g/L, una concentración de aproximadamente 13,6 g/L o una concentración mayor que 13,6 g/L, una concentración de aproximadamente 13,7 g/L o una concentración mayor que 13,7 g/L, una concentración de aproximadamente 13,8 g/L o una concentración mayor que 13,8 g/L, una concentración de aproximadamente 13,9 g/L o una concentración mayor que 13,9 g/L, una concentración de aproximadamente 14,0 g/L o una concentración mayor que 14,0 g/L, una concentración de aproximadamente 14,1 g/L o una concentración mayor que 14,1 g/L, una concentración de aproximadamente 14,2 g/L o una concentración mayor que 14,2 g/L, una concentración de aproximadamente 14,3 g/L o una concentración mayor que 14,3 g/L, una concentración de aproximadamente 14,4 g/L o una concentración mayor que 14,4 g/L, una concentración de aproximadamente 14,5 g/L o una concentración mayor que 14,5 g/L, una concentración de aproximadamente 14,6 g/L o una concentración mayor que 14,6 g/L, una concentración de aproximadamente 14,7 g/L o una concentración mayor que 14,7 g/L, una concentración de aproximadamente 14,8 g/L o una concentración mayor que 14,8 g/L, una concentración de aproximadamente 14,9 g/L o una concentración mayor que 14,9 g/L, o una concentración de aproximadamente 15,0 g/L o una concentración mayor que 15,0 g/L).
[0159] [0082] En algunos casos, los procedimientos descritos en el presente documento incluyen el cultivo de una célula de mamífero (por ejemplo, una célula de mamífero que incluye un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante) en un medio líquido que incluye poloxámero-188 a una concentración de entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 16,0 g/L (por ejemplo, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 8,2 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 8,0 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 7,8 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 7,6 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 7,4 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 7,2 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 7,0 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 6,8 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 6,6 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 6,4 g/L, entre 1,8 g/L y aproximadamente 6,2 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 4,8 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 4,6 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 4,4 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 4,0 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 3,8 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 3,6 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 3,4 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 3,2 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 2,8 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 8,2 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 8,0 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 7,8 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 7,6 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 7,4 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 7,2 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 7,0 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 6,8 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 6,6 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 6,4 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 6,2 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 4,8 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 4,6 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 4,4 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 4,0 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 3,8 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 3,6 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 3,4 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 3,2 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 8,2 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 8,0 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 7,8 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 7,6 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 7,4 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 7,2 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 7,0 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 6,9 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 6,8 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 6,6 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 6,4 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 6,2 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 4,8 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 4,6 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 4,4 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 4,0 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 3,8 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 3,6 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 3,4 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 3,2 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 8,2 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 8,0 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 7,8 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 7,6 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 7,4 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 7,2 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 7,0 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 6,9 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 6,8 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 6,6 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 6,4 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 6,2 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 4,8 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 4,6 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 4,4 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 4,0 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 3,8 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 3,6 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 3,4 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 8,2 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 8,0 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 7,8 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 7,6 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 7,4 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 7,2 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 7,0 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 6,9 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 6,8 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 6,6 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 6,4 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 6,2 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 4,8 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 4,6 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 4,4 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 4,0 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 3,8 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 3,6 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 8,2 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 8,0 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 7,8 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 7,6 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 7,4 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 7,2 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 7,0 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 6,9 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 6,8 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 6,6 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 6,4 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 6,2 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 4,8 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 4,6 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 4,4 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 4,0 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 3,8 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 8,2 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 8,0 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 7,8 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 7,6 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 7,4 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 7,2 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 7,0 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 6,9 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 6,8 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 6,6 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 6,4 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 6,2 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 4,8 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 4,6 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 4,4 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 4,0 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 8,2 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 8,0 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 7,8 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 7,6 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 7,4 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 7,2 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 7,0 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 6,9 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 6,8 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 6,6 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 6,4 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 6,2 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 4,8 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 4,6 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 4,4 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 8,2 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 8,0 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 7,8 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 7,6 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 7,4 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 7,2 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 7,0 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 6,9 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 6,8 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 6,6 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 6,4 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 6,2 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 4,8 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 4,6 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 4,4 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 8,2 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 8,0 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 7,8 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 7,6 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 7,4 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 7,2 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 7,0 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 6,9 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 6,8 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 6,6 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 6,4 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 6,2 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 4,8 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 4,6 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 8,2 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 8,0 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 7,8 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 7,6 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 7,4 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 7,2 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 7,0 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 6,9 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 6,8 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 6,6 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 6,4 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 6,2 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 4,8 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y alrededor de 12,0 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y alrededor de 11,8 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y alrededor de 11,6 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y alrededor de 11,4 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 8,2 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 8,0 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 7,8 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 7,6 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 7,4 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 7,2 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 7,0 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 6,9 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 6,8 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 6,6 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 6,4 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 6,2 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 8,2 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 8,0 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 7,8 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 7,6 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 7,4 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 7,2 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 7,0 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 6,9 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 6,8 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 6,6 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 6,4 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 6,2 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 8,2 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 8,0 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 7,8 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 7,6 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 7,4 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 7,2 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 7,0 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 6,9 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 6,8 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 6,6 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 6,4 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 6,2 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 8,2 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 8,0 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 7,8 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 7,6 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 7,4 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 7,2 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 7,0 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 6,9 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 6,8 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 6,6 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 6,4 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 6,2 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 8,2 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 8,0 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 7,8 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 7,6 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 7,4 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 7,2 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 7,0 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 6,9 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 6,8 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 6,6 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 6,4 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 6,2 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 8,2 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 8,0 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 7,8 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 7,6 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 7,4 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 7,2 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 7,0 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 6,9 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 6,8 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 6,6 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 6,4 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 6,2 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 8,2 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 8,0 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 7,8 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 7,6 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 7,4 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 7,2 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 7,0 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 6,9 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 6,8 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 6,6 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 6,4 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 6,2 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 6,1 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 8,2 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 8,0 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 7,8 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 7,6 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 7,4 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 7,2 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 7,0 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 6,9 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 6,8 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 6,6 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 6,4 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 6,2 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 8,2 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 8,0 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 7,8 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 7,6 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 7,4 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 7,2 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 7,0 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 6,9 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 6,8 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 6,6 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 6,4 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 8,2 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 8,0 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 7,8 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 7,6 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 7,4 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 7,2 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 7,0 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 6,9 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 6,8 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 6,6 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 8,2 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 8,0 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 7,8 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 7,6 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 7,4 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 7,2 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 7,0 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 6,9 g/L, entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 6,8 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 8,2 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 8,0 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 7,8 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 7,6 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 7,4 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 7,2 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 7,0 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 6,0 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 8,2 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 8,0 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 7,8 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 7,6 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 7,4 g/L, entre aproximadamente 6,2 g/L y aproximadamente 7,2 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 6,4 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 6,4 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aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 8,2 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 8,0 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 7,8 g/L, entre aproximadamente 6,6 g/L y aproximadamente 7,6 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 8,2 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 8,0 g/L, entre aproximadamente 6,8 g/L y aproximadamente 7,8 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 8,2 g/L, entre aproximadamente 7,0 g/L y aproximadamente 8,0 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 7,2 g/L y aproximadamente 8,2 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y alrededor de 10,8 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 7,4 g/L y aproximadamente 8,4 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 7,6 g/L y aproximadamente 8,6 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 7,8 g/L y aproximadamente 8,8 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 15,8 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 15,6 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 15,4 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 15,2 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 14,8 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 14,6 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 14,4 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 14,2 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 13,8 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 13,6 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 13,4 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 13,2 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 12,8 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 12,6 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 12,4 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 12,2 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 11,8 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 11,6 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 11,4 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 11,2 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 10,8 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 10,6 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 10,4 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 10,2 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 9,8 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 9,6 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 9,4 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 9,2 g/L, entre aproximadamente 8,0 g/L y aproximadamente 9,0 g/L, entre aproximadamente 8,5 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 8,5 g/L y aproximadamente 15,5 g/L, entre aproximadamente 8,5 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 8,5 g/L y aproximadamente 14,5 g/L, entre aproximadamente 8,5 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 8,5 g/L y aproximadamente 13,5 g/L, entre aproximadamente 8,5 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 8,5 g/L y aproximadamente 12,5 g/L, entre aproximadamente 8,5 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 8,5 g/L y aproximadamente 11,5 g/L, entre aproximadamente 8,5 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 8,5 g/L y aproximadamente 10,5 g/L, entre aproximadamente 8,5 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 8,5 g/L y aproximadamente 9,5 g/L, entre aproximadamente 9,0 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 9,0 g/L y aproximadamente 15,5 g/L, entre aproximadamente 9,0 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 9,0 g/L y aproximadamente 14,5 g/L, entre aproximadamente 9,0 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 9,0 g/L y aproximadamente 13,5 g/L, entre aproximadamente 9,0 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 9,0 g/L y aproximadamente 12,5 g/L, entre aproximadamente 9,0 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 9,0 g/L y aproximadamente 11,5 g/L, entre aproximadamente 9,0 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 9,0 g/L y aproximadamente 10,5 g/L, entre aproximadamente 9,0 g/L y aproximadamente 10,0 g/L, entre aproximadamente 9,5 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 9,5 g/L y aproximadamente 15,5 g/L, entre aproximadamente 9,5 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 9,5 g/L y aproximadamente 14,5 g/L, entre aproximadamente 9,5 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 9,5 g/L y aproximadamente 13,5 g/L, entre aproximadamente 9,5 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 9,5 g/L y aproximadamente 12,5 g/L, entre aproximadamente 9,5 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 9,5 g/L y aproximadamente 11,5 g/L, entre aproximadamente 9,5 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 9,5 g/L y aproximadamente 10,5 g/L, entre aproximadamente 10,0 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 10,0 g/L y aproximadamente 15,5 g/L, entre aproximadamente 10,0 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 10,0 g/L y aproximadamente 14,5 g/L, entre aproximadamente 10,0 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 10,0 g/L y aproximadamente 13,5 g/L, entre aproximadamente 10,0 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 10,0 g/L y aproximadamente 12,5 g/L, entre aproximadamente 10,0 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 10,0 g/L y aproximadamente 11,5 g/L, entre aproximadamente 10,0 g/L y aproximadamente 11,0 g/L, entre aproximadamente 10,5 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 10,5 g/L y aproximadamente 15,5 g/L, entre aproximadamente 10,5 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 10,5 g/L y aproximadamente 14,5 g/L, entre aproximadamente 10,5 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 10,5 g/L y aproximadamente 13,5 g/L, entre aproximadamente 10,5 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 10,5 g/L y aproximadamente 12,5 g/L, entre aproximadamente 10,5 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 10,5 g/L y aproximadamente 11,5 g/L, entre aproximadamente 11,0 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 11,0 g/L y aproximadamente 15,5 g/L, entre aproximadamente 11,0 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 11,0 g/L y aproximadamente 14,5 g/L, entre aproximadamente 11,0 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 11,0 g/L y aproximadamente 13,5 g/L, entre aproximadamente 11,0 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 11,0 g/L y aproximadamente 12,5 g/L, entre aproximadamente 11,0 g/L y aproximadamente 12,0 g/L, entre aproximadamente 11,5 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 11,5 g/L y aproximadamente 15,5 g/L, entre aproximadamente 11,5 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 11,5 g/L y aproximadamente 14,5 g/L, entre aproximadamente 11,5 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 11,5 g/L y aproximadamente 13,5 g/L, entre aproximadamente 11,5 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 11,5 g/L y aproximadamente 12,5 g/L, entre aproximadamente 12,0 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 12,0 g/L y aproximadamente 15,5 g/L, entre aproximadamente 12,0 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 12,0 g/L y aproximadamente 14,5 g/L, entre aproximadamente 12,0 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 12,0 g/L y aproximadamente 13,5 g/L, entre aproximadamente 12,0 g/L y aproximadamente 13,0 g/L, entre aproximadamente 12,5 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 12,5 g/L y aproximadamente 15,5 g/L, entre aproximadamente 12,5 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 12,5 g/L y aproximadamente 14,5 g/L, entre aproximadamente 12,5 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 12,5 g/L y aproximadamente 13,5 g/L, entre aproximadamente 13,0 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 13,0 g/L y aproximadamente 15,5 g/L, entre aproximadamente 13,0 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 13,0 g/L y aproximadamente 14,5 g/L, entre aproximadamente 13,0 g/L y aproximadamente 14,0 g/L, entre aproximadamente 13,5 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 13,5 g/L y aproximadamente 15,5 g/L, entre aproximadamente 13,5 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 13,5 g/L y aproximadamente 14,5 g/L, entre aproximadamente 14,0 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 14,0 g/L y aproximadamente 15,5 g/L, entre aproximadamente 14,0 g/L y aproximadamente 15,0 g/L, entre aproximadamente 14,5 g/L y aproximadamente 16,0 g/L, entre aproximadamente 14,5 g/L y aproximadamente 15,5 g/L, o entre aproximadamente 15,0 g/L y aproximadamente 16,0 g/L).
[0161] En los procedimientos de la presente invención, el poloxámero-188 está presente en el medio y/o se añade al medio antes de la etapa de cultivo y/o se añade al medio durante la etapa de cultivo. Por ejemplo, los procedimientos proporcionados en el presente documento pueden incluir además la adición de poloxámero-188 antes y/o durante la etapa de cultivo para proporcionar una concentración de 1,8 g/L o más (por ejemplo, cualquiera de las concentraciones de ejemplo de poloxámero-188 o intervalos de poloxámero-188 descritos en este documento) en el medio. En algunos ejemplos, se añade poloxámero-188 adicional a un medio líquido que incluye algo de poloxámero-188 para proporcionar una concentración de 1,8 g/L o más poloxámero-188 (por ejemplo, cualquiera de las concentraciones de ejemplo de poloxámero-188 o intervalos de poloxámero-188 descritos en este documento). Por ejemplo, el poloxámero-188 se puede añadir a un primer medio líquido, a un segundo medio líquido y/o a un medio líquido de alimentación antes y/o durante la etapa de cultivo.
[0163] En algunos ejemplos, el poloxámero-188 se añade a un medio en una o más alícuotas (por ejemplo, dos, tres, cuatro o cinco) durante la etapa de cultivo. El poloxámero-188 puede añadirse al medio de forma continua. En algunos ejemplos, el primer medio líquido puede contener poloxámero-188, y se añade poloxámero-188 adicional al medio durante el período de cultivo. En algunas realizaciones, el poloxámero-188 está presente en el medio.
[0165] [0085] Cuando la etapa de cultivo incluye el cultivo por perfusión, el segundo medio líquido puede incluir poloxámero-188 en una concentración mayor que la del primer medio líquido. Por ejemplo, el primer medio líquido puede incluir poloxámero-188 a una concentración de 1,8 g/L o a una concentración inferior a 1,8 g/L, y el segundo medio líquido incluye poloxámero-188 a una concentración mayor que 1,8 g/L (por ejemplo, cualquiera de las concentraciones o intervalos de poloxámero-188 descritos en este documento, por ejemplo, una concentración mayor que 1,9 g/L, una concentración mayor que 2,0 g/L, una concentración mayor que 2,1 g/L, una concentración mayor que 2,2 g/L, una concentración mayor que 2,3 g/L, una concentración mayor que 2,4 g/L, una concentración mayor que 2,5 g/L, una concentración mayor que 2,6 g/L, una concentración mayor que 2,7 g/L, una concentración mayor que 2,8 g/L, una concentración mayor que 2,9 g/L, una concentración mayor que 3,0 g/L, una concentración mayor que 3,1 g/L, una concentración mayor que 3,2 g/L, una concentración mayor que 3,3 g/L, una concentración mayor que 3,4 g/L, una concentración mayor que 3,5 g/L, una concentración mayor que 3,6 g/L, una concentración mayor que 3,7 g/L, una concentración mayor que 3,8 g/L, una concentración mayor que 3,9 g/L, una concentración mayor que 4,0 g/L, una concentración mayor que 4,1 g/L, una concentración mayor que 4,2 g/L, una concentración mayor que 4,3 g/L, una concentración mayor que 4,4 g/L, una concentración mayor que 4,5 g/L, una concentración mayor que 4,6 g/L, una concentración mayor que 4,7 g/L, una concentración mayor que 4,8 g/L, una concentración mayor que 4,9 g/L, una concentración mayor que 5,0 g/L, una concentración mayor que 5,1 g/L, una mayor concentración mayor que 5,2 g/L, una concentración mayor que 5,3 g/L, una concentración mayor que 5,4 g/L, una concentración mayor que 5,5 g/L, una concentración mayor que 5,6 g/L, una concentración mayor que 5,7 g/L, una concentración mayor que 5,8 g/L, una concentración mayor que 5,9 g/L, una concentración mayor que 6,0 g/L, una concentración mayor que 6,1 g/L, una concentración mayor que 6,2 g/L, una concentración mayor que 6,3 g/L, una concentración mayor que 6,4 g/L, una concentración mayor que 6,5 g/L, una concentración mayor que 6,6 g/L, una concentración mayor que 6,7 g/L, una concentración mayor que 6,8 g/L, una concentración mayor que 6,9 g/L, una concentración mayor que 7,0 g/L, una concentración mayor que 7,1 g/L, una concentración mayor que 7,2 g/L, una concentración mayor que 7,3 g/L, una concentración mayor que 7,4 g/L, una concentración mayor que 7,5 g/L, una concentración mayor que 7,6 g/L, una concentración mayor que 7,7 g/L, una concentración mayor que 7,8 g/L, una concentración mayor que 7,9 g/L, una concentración mayor que 8,0 g/L, una concentración mayor que 8,1 g/L, una concentración mayor que 8,2 g/L, una concentración mayor que 8,3 g/L, una concentración mayor que 8,4 g/L, una concentración mayor que 8,5 g/L, una concentración mayor que 8,6 g/L, una concentración mayor que 8,7 g/L, una concentración mayor que 8,8 g/L, una concentración mayor que 8,9 g/L, una concentración mayor que 9,0 g/L, una concentración mayor que 9,1 g/L, una concentración mayor que 9,2 g/L, una concentración mayor que 9,3 g/L, una concentración mayor que 9,4 g/L, una concentración mayor que 9,5 g/L, una concentración mayor que 9,6 g/L, una concentración mayor que 9,7 g/L, una concentración mayor que 9,8 g/L, una concentración mayor que 9,9 g/L, una concentración mayor que 10,0 g/L, una concentración mayor que 10,1 g/L, una concentración mayor que 10,2 g/L, una concentración mayor que 10,3 g/L, una concentración mayor que 10,4 g/L, una mayor concentración que 10,5 g/L, mayor concentración que 10,6 g/L, mayor concentración que 10,7 g/L, mayor concentración que 10,8 g/L, mayor concentración que 10,9 g/L, mayor concentración que 11,0 g/L, mayor concentración que 11,1 g/L. una concentración mayor que 11,2 g/L, una concentración mayor que 11,3 g/L, una concentración mayor que 11,4 g/L, una concentración mayor que 11,5 g/L, una concentración mayor que 11,6 g/L, una concentración mayor que 11,7 g/L, una concentración mayor que 11,8 g/L, una concentración mayor que 11,9 g/L, una concentración mayor que 12,0 g/L, una concentración mayor que 12,1 g/L, una concentración mayor que 12,2 g/L, una concentración mayor que 12,3 g/L, una concentración mayor que 12,4 g/L, una concentración mayor que 12,5 g/L, una concentración mayor que 12,6 g/L, una concentración mayor que 12,7 g/L, una concentración mayor que 12,8 g/L, una concentración mayor que 12,9 g/L, una concentración mayor que 13,0 g/L, una concentración mayor que 13,1 g/L, una concentración mayor que 13,2 g/L, una concentración mayor que 13,3 g/L, una concentración mayor que 13,4 g/L, una concentración mayor que 13,5 g/L, una concentración mayor que 13,6 g/L, una concentración mayor que 13,7 g/L, una concentración mayor que 13,8 g/L, una concentración mayor que 13,9 g/L, una concentración mayor que 14,0 g/L, una concentración mayor que 14,1 g/L, una concentración mayor que 14,2 g/L, una concentración mayor que 14,3 g/L, una concentración mayor que 14,4 g/L, una concentración mayor que 14,5 g/L, una concentración mayor que 14,6 g/L, una concentración mayor que 14,7 g/L, una concentración mayor que 14,8 g/L, una concentración mayor que 14,9 g/L, una concentración mayor que 15,0 g/L, una concentración mayor que 15,1 g/L, una concentración mayor que 15,2 g/L, una concentración mayor que 15,3 g/L, una concentración mayor que 15,4 g/L, una concentración mayor que 15,5 g/L, una concentración mayor que 15,6 g/L, una concentración mayor que 15,7 g/L, una concentración mayor que 15,8 g/L, una concentración mayor que 15,9 g/L o una concentración mayor que 16,0 g/L de poloxámero-188).
[0167] Cuando la etapa de cultivo incluye el cultivo por alimentación discontinua, el medio líquido de alimentación puede incluir poloxámero-188 en una concentración mayor que en el primer medio líquido. Por ejemplo, el primer medio líquido puede incluir poloxámero-188 a una concentración de 1,8 g/L o a una concentración menor de 1,8 g/L, y el medio líquido de alimentación incluye poloxámero-188 a una concentración mayor que 1,8 g/L (por ejemplo, una concentración mayor que 2,0 g/L, una concentración mayor que 2,5 g/L, una concentración mayor que 3,0 g/L, una concentración mayor que 3,5 g/L, una concentración mayor que 4,0 g/L, una concentración mayor que 4,5 g/L, una concentración mayor que 5,0 g/L, una concentración mayor que 5,5 g/L, una concentración mayor que 6,0 g/L, una concentración mayor que 6,5 g/L, una concentración mayor que 7,0 g/L, una concentración mayor que 7,5 g/L, una concentración mayor que 8,0 g/L, una concentración mayor que 8,5 g/L, una concentración mayor que 9 g/L, una concentración mayor que 9,5 g/L, una concentración mayor que 10 g/L, una concentración mayor que 10,5 g/L, una concentración mayor que 11,0 g/L, una concentración mayor que 11,5 g/L, una concentración mayor que 12,0 g/L, una concentración mayor que 12,5 g/L, una concentración mayor que 13,0 g/L, una concentración mayor que 13,5 g/L, una concentración mayor que 14,0 g/L, una concentración mayor que 14,5 g/L, una concentración mayor que 15,0 g/L, una concentración mayor que 15,5 g/L, una concentración mayor que 16,0 g/L, una concentración mayor que 16,5 g/L, una concentración mayor que 17,0 g/L, una concentración mayor que 17,5 g/L, una concentración mayor que 18,0 g/L, una concentración mayor que 18,5 g/L, una concentración mayor que 19,0 g/L, una concentración mayor que 19,5 g/L, una concentración mayor que 20,0 g/L, una concentración mayor que 20,5 g/L, una concentración mayor que 21,0 g/L, una concentración mayor que 21,5 g/L, una concentración mayor que 22,0 g/L, una concentración mayor que 22,5 g/L, una concentración mayor que 23,0 g/L, una concentración mayor que 23,5 g/L, una concentración mayor que 24,0 g/L, una concentración mayor que 24,5 g/L, una concentración mayor que 25,0 g/L, una concentración mayor que 25,5 g/L, una concentración mayor que 26,0 g/L, una concentración mayor que 26,5 g/L, una concentración mayor que 27,0 g/L, una concentración mayor que 28,0 g/L, una concentración mayor que 28,5 g/L, una concentración mayor que 29,0 g/L, una concentración mayor que 29,5 g/L, una concentración mayor que 30,0 g/L, una concentración mayor que 30,5 g/L, una concentración mayor que 31,0 g/L, una concentración mayor que 31,5 g/L, una concentración mayor que 32,0 g/L, una concentración mayor que 32,5 g/L, una concentración mayor que 33,0 g/L, una concentración mayor que 33,5 g/L, una concentración mayor que 34,0 g/L, una concentración mayor que 34,5 g/L, una concentración mayor que 35,0 g/L, una concentración mayor que 35,5 g/L, una concentración mayor que 36,0 g/L, una concentración mayor que 36,5 g/L, una concentración mayor que 37,0 g/L, una concentración mayor que 37,5 g/L, una concentración mayor que 38,0 g/L, una concentración mayor que 38,5 g/L, una concentración mayor que 39,0 g/L, una concentración mayor que 39,5 g/L o una concentración mayor que 40,0 g/L).
[0169] Algunos casos de los procedimientos proporcionados en el presente documento incluyen el aumento de la concentración de poloxámero-188 en el cultivo a lo largo del tiempo. En algunos casos, el medio incluye una concentración de poloxámero-188 que se selecciona en función de uno o más factores seleccionados del grupo de: tamaño de poro, tipo de poro, caudal de gas, densidad de células viables en el medio y marcadores relacionados con el estrés celular. En estos procedimientos, la concentración de poloxámero-188 seleccionada en el medio se puede lograr añadiendo poloxámero-188 al medio antes de la etapa de cultivo y/o añadiendo poloxámero-188 al medio durante la etapa de cultivo. La concentración de poloxámero-188 seleccionada puede ser cualquiera de las concentraciones de ejemplo o intervalos de poloxámero-188 descritos en este documento.
[0171] Selección de la concentración de Poloxámero-188 en función de uno o más factores.
[0173] Algunos casos de los procedimientos descritos en el presente documento incluyen el cultivo de una célula de mamífero en un medio líquido que incluye una concentración de poloxámero-188 que se selecciona en función de uno o más factores seleccionados del grupo de: tamaño de poro, tipo de poro, caudal de gas, densidad de células viables en el medio y marcadores relacionados con el estrés celular. En el procedimiento de la presente invención, la concentración de poloxámero-188 se incrementa con el tiempo en función de la densidad de células viables en el medio.
[0175] En la técnica se conocen diferentes ejemplos de tipos de poros. Ejemplos no limitativos de tipos de poros son los poros sinterizados y los poros perforados.
[0177] [0090] En la técnica se conocen diversos caudales de gas adecuados para el cultivo celular. Generalmente, un caudal de gas más alto indica que se debe seleccionar una concentración más alta de poloxámero-188 (en comparación con una etapa de cultivo que utiliza un caudal de gas más bajo), y un caudal de gas más bajo indica que se debe seleccionar una concentración más baja de poloxámero-188 (en comparación con una etapa de cultivo que utiliza un caudal de gas más alto).
[0179] En este documento se describen diversas densidades de células viables no limitantes. En general, una mayor densidad de células viables indica que se debe seleccionar una mayor concentración de poloxámero-188 (en comparación con un medio que contiene una menor densidad de células viables), y una menor densidad de células viables indica que se debe seleccionar una menor concentración de poloxámero-188 (en comparación con un medio que contiene una mayor densidad de células viables). En el procedimiento según la presente invención, la concentración de poloxámero-188 se incrementa a más de 6,0 g/L cuando la densidad de células viables en el medio es mayor que 90 x 10<6>células/mL.
[0181] Los marcadores de ejemplo de estrés celular que son liberados por una célula bajo estrés fisiológico incluyen proteasas (por ejemplo, caspasas activadas), lactato deshidrogenasa, ADN genómico (por ejemplo, ADN nucleosomal), citocromo c y PARP activada. Ejemplos no limitativos de marcadores relacionados con el estrés celular que se producen o tienen niveles elevados en una célula bajo estrés fisiológico incluyen caspasas activadas, citocromo c, PARP activada y fosfatidilserina externalizada. Los niveles elevados de uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) de cualquiera de estos marcadores de estrés celular en comparación con un valor o valores de control indican que se debe seleccionar una concentración más alta de poloxámero-188. El nivel o niveles del uno o más marcadores de estrés celular en comparación con un valor o valores de control que son aproximadamente iguales o inferiores a un valor o valores de control indican que se debe seleccionar una concentración más baja de poloxámero-188. En cualquiera de los ejemplos descritos en el presente documento, el nivel de control puede ser un nivel en una célula de control que no esté experimentando apoptosis ni se cultive en condiciones que induzcan necrosis. Los procedimientos para detectar el nivel de uno o más marcadores de estrés celular son bien conocidos en la técnica. Existen kits comerciales disponibles para medir dicho uno o más marcadores de estrés celular.
[0183] [0093] En cualquiera de los casos descritos en este documento, la concentración de poloxámero-188 seleccionada se puede lograr añadiendo poloxámero-188 al medio antes de la etapa de cultivo y/o añadiendo poloxámero-188 al medio durante la etapa de cultivo. En algunos casos, los procedimientos incluyen seleccionar, en función del tipo de poro y tamaño de poro, una concentración de poloxámero-188 de entre aproximadamente 2,3 g/L y aproximadamente 3,3 g/L (por ejemplo, entre aproximadamente 2,3 g/L y aproximadamente 3,2 g/L, entre aproximadamente 2,3 g/L y aproximadamente 3,1 g/L, entre aproximadamente 2,3 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 2,3 g/L y aproximadamente 2,9 g/L, entre aproximadamente 2,3 g/L y aproximadamente 2,8 g/L, entre aproximadamente 2,3 g/L y aproximadamente 2,7 g/L, entre aproximadamente 2,3 g/L y aproximadamente 2,6 g/L, entre aproximadamente 2,3 g/L y aproximadamente 2,5 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 3,3 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 3,2 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 3,1 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 2,9 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 2,8 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 2,7 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 2,6 g/L, entre aproximadamente 2,5 g/L y aproximadamente 3,3 g/L, entre aproximadamente 2,5 g/L y aproximadamente 3,2 g/L, entre aproximadamente 2,5 g/L y aproximadamente 3,1 g/L, entre aproximadamente 2,5 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 2,5 g/L y aproximadamente 2,9 g/L, entre aproximadamente 2,5 g/L y aproximadamente 2,8 g/L, entre aproximadamente 2,5 g/L y aproximadamente 2,7 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 3,3 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 3,2 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 3,1 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 2,9 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 2,8 g/L, entre aproximadamente 2,7 g/L y aproximadamente 3,3 g/L, entre aproximadamente 2,7 g/L y aproximadamente 3,2 g/L, entre aproximadamente 2,7 g/L y aproximadamente 3,1 g/L, entre aproximadamente 2,7 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 2,7 g/L y aproximadamente 2,9 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 3,3 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 3,2 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 3,1 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 2,9 g/L y aproximadamente 3,3 g/L, entre aproximadamente 2,9 g/L y aproximadamente 3,2 g/L, entre aproximadamente 2,9 g/L y aproximadamente 3,1 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 3,3 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 3,2 g/L, o entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 3,3 g/L), cuando el tipo de poro es un poro perforado y el tamaño del poro está entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 1,5 mm (por ejemplo, entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 1,45 mm, entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 1,40 mm, entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 1,35 mm, entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 1,30 mm, entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 1,25 mm, entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 1,20 mm, entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 1,15 mm, entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 1,10 mm, entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 1,05 mm, entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 1,00 mm, entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 950 µm, entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 900 µm, entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 850 µm, entre aproximadamente 750 µm y aproximadamente 800 µm, entre aproximadamente 800 µm y aproximadamente 1,5 mm, entre aproximadamente 800 µm y aproximadamente 1,45 mm, entre aproximadamente 800 µm y aproximadamente 1,40 mm, entre aproximadamente 800 µm y aproximadamente 1,35 mm, entre aproximadamente 800 µm y aproximadamente 1,30 mm, entre aproximadamente 800 µm y aproximadamente 1,25 mm, entre aproximadamente 800 µm y aproximadamente 1,20 mm, entre aproximadamente 800 µm y aproximadamente 1,15 mm, entre aproximadamente 800 µm y aproximadamente 1,10 mm, entre aproximadamente 800 µm y aproximadamente 1,05 mm, entre aproximadamente 800 µm y aproximadamente 1,00 mm, entre aproximadamente 800 µm y aproximadamente 950 µm, entre aproximadamente 800 µm y aproximadamente 900 µm, entre aproximadamente 800 µm y aproximadamente 850 µm, entre aproximadamente 850 µm y aproximadamente 1,5 mm, entre aproximadamente 850 µm y aproximadamente 1,45 mm, entre aproximadamente 850 µm y aproximadamente 1,40 mm, entre aproximadamente 850 µm y aproximadamente 1,35 mm, entre aproximadamente 850 µm y aproximadamente 1,30 mm, entre aproximadamente 850 µm y aproximadamente 1,25 mm, entre aproximadamente 850 µm y aproximadamente 1,20 mm, entre aproximadamente 850 µm y aproximadamente 1,15 mm, entre aproximadamente 850 µm y aproximadamente 1,10 mm, entre aproximadamente 850 µm y aproximadamente 1,05 mm, entre aproximadamente 850 µm y aproximadamente 1,00 mm, entre aproximadamente 850 µm y aproximadamente 950 µm, entre aproximadamente 850 µm y aproximadamente 900 µm, entre aproximadamente 900 µm y aproximadamente 1,5 mm, entre aproximadamente 900 µm y aproximadamente 1,45 mm, entre aproximadamente 900 µm y aproximadamente 1,40 mm, entre aproximadamente 900 µm y aproximadamente 1,35 mm, entre aproximadamente 900 µm y aproximadamente 1,30 mm, entre aproximadamente 900 µm y aproximadamente 1,25 mm, entre aproximadamente 900 µm y aproximadamente 1,20 mm, entre aproximadamente 900 µm y aproximadamente 1,15 mm, entre aproximadamente 900 µm y aproximadamente 1,10 mm, entre aproximadamente 900 µm y aproximadamente 1,05 mm, entre aproximadamente 900 µm y aproximadamente 1,00 mm, entre aproximadamente 900 µm y aproximadamente 950 µm, entre aproximadamente 950 µm y aproximadamente 1,5 mm, entre aproximadamente 950 µm y aproximadamente 1,45 mm, entre aproximadamente 950 µm y aproximadamente 1,40 mm, entre aproximadamente 950 µm y aproximadamente 1,35 mm, entre aproximadamente 950 µm y aproximadamente 1,30 mm, entre aproximadamente 950 µm y aproximadamente 1,25 mm, entre aproximadamente 950 µm y aproximadamente 1,20 mm, entre aproximadamente 950 µm y aproximadamente 1,15 mm, entre aproximadamente 950 µm y aproximadamente 1,10 mm, entre aproximadamente 950 µm y aproximadamente 1,05 mm, entre aproximadamente 950 µm y aproximadamente 1,00 mm, entre aproximadamente 1,0 mm y aproximadamente 1,5 mm, entre aproximadamente 1,0 mm y aproximadamente 1,45 mm, entre aproximadamente 1,0 mm y aproximadamente 1,40 mm, entre aproximadamente 1,0 mm y aproximadamente 1,35 mm, entre aproximadamente 1,0 mm y aproximadamente 1,30 mm, entre aproximadamente 1,0 mm y aproximadamente 1,25 mm, entre aproximadamente 1,0 mm y aproximadamente 1,20 mm, entre aproximadamente 1,0 mm y aproximadamente 1,15 mm, entre aproximadamente 1,0 mm y aproximadamente 1,10 mm, entre aproximadamente 1,0 mm y aproximadamente 1,05 mm, entre aproximadamente 1,05 mm y aproximadamente 1,5 mm, entre aproximadamente 1,05 mm y aproximadamente 1,45 mm, entre aproximadamente 1,05 mm y aproximadamente 1,40 mm, entre aproximadamente 1,05 mm y aproximadamente 1,35 mm, entre aproximadamente 1,05 mm y aproximadamente 1,30 mm, entre aproximadamente 1,05 mm y aproximadamente 1,25 mm, entre aproximadamente 1,05 mm y aproximadamente 1,20 mm, entre aproximadamente 1,05 mm y aproximadamente 1,15 mm, entre aproximadamente 1,05 mm y aproximadamente 1,10 mm, entre aproximadamente 1,10 mm y aproximadamente 1,5 mm, entre aproximadamente 1,10 mm y aproximadamente 1,45 mm, entre aproximadamente 1,10 mm y aproximadamente 1,40 mm, entre aproximadamente 1,10 mm y aproximadamente 1,35 mm, entre aproximadamente 1,10 mm y aproximadamente 1,30 mm, entre aproximadamente 1,10 mm y aproximadamente 1,25 mm, entre aproximadamente 1,10 mm y aproximadamente 1,20 mm, entre aproximadamente 1,10 mm y aproximadamente 1,15 mm, entre aproximadamente 1,15 mm y aproximadamente 1.5 mm, entre aproximadamente 1,15 mm y aproximadamente 1,45 mm, entre aproximadamente 1,15 mm y aproximadamente 1,40 mm, entre aproximadamente 1,15 mm y aproximadamente 1,35 mm, entre aproximadamente 1,15 mm y aproximadamente 1,30 mm, entre aproximadamente 1,15 mm y aproximadamente 1,25 mm, entre aproximadamente 1,15 mm y aproximadamente 1,20 mm, entre aproximadamente 1,20 mm y aproximadamente 1,5 mm, entre aproximadamente 1,20 mm y aproximadamente 1,45 mm, entre aproximadamente 1,20 mm y aproximadamente 1,40 mm, entre aproximadamente 1,20 mm y aproximadamente 1,35 mm, entre aproximadamente 1,20 mm y aproximadamente 1,30 mm, entre aproximadamente 1,20 mm y aproximadamente 1,25 mm, entre aproximadamente 1,25 mm y aproximadamente 1,5 mm, entre aproximadamente 1,25 mm y aproximadamente 1,45 mm, entre aproximadamente 1,25 mm y aproximadamente 1,40 mm, entre aproximadamente 1,25 mm y aproximadamente 1,35 mm, entre aproximadamente 1,25 mm y aproximadamente 1,30 mm, entre aproximadamente 1,30 mm y aproximadamente 1,5 mm, entre aproximadamente 1,30 mm y aproximadamente 1,45 mm, entre aproximadamente 1,30 mm y aproximadamente 1,40 mm, entre aproximadamente 1,30 mm y aproximadamente 1,35 mm, entre aproximadamente 1,35 mm y aproximadamente 1,5 mm, entre aproximadamente 1,35 mm y aproximadamente 1,45 mm, entre aproximadamente 1,35 mm y aproximadamente 1,40 mm, entre aproximadamente 1,40 mm y aproximadamente 1,5 mm, entre aproximadamente 1,40 mm y aproximadamente 1,45 mm, o entre aproximadamente 1,45 mm y aproximadamente 1,50).
[0185] [0094] En algunos casos, los procedimientos incluyen seleccionar, en función del tipo de poro y tamaño de poro, una concentración de poloxámero-188 de entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 4,3 g/L (por ejemplo, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 4,1 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 4,0 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 3,9 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 3,8 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 3,7 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 3,6 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 3,5 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 4,3 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 4,1 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 4,0 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 3,9 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 3,8 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 3,7 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 3,6 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 4,3 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 4,1 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 4,0 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 3,9 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 3,8 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 3,7 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 4,3 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 4,1 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 4,0 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 3,9 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 3,8 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 4,3 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 4,1 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 4,0 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 3,9 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 4,3 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 4,1 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 4,0 g/L, entre aproximadamente 3,9 g/L y aproximadamente 4,3 g/L, entre aproximadamente 3,9 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 3,9 g/L y aproximadamente 4,1 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 4,3 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, o entre aproximadamente 4,1 g/L y aproximadamente 4,3 g/L), cuando el tipo de poro es un poro perforado y el tamaño del poro está entre aproximadamente 250 µm y aproximadamente 750 µm (por ejemplo, entre aproximadamente 250 µm y aproximadamente 700 µm, entre aproximadamente 250 µm y aproximadamente 650 µm, entre aproximadamente 250 µm y aproximadamente 600 µm, entre aproximadamente 250 µm y aproximadamente 550 µm, entre aproximadamente 250 µm y aproximadamente 500 µm, entre aproximadamente 250 µm y aproximadamente 450 µm, entre aproximadamente 250 µm y aproximadamente 400 µm, entre aproximadamente 250 µm y aproximadamente 350 µm, entre aproximadamente 250 µm y aproximadamente 300 µm, entre aproximadamente 300 µm y aproximadamente 750 µm, entre aproximadamente 300 µm y aproximadamente 700 µm, entre aproximadamente 300 µm y aproximadamente 650 µm, entre aproximadamente 300 µm y aproximadamente 600 µm, entre aproximadamente 300 µm y aproximadamente 550 µm, entre aproximadamente 300 µm y aproximadamente 500 µm, entre aproximadamente 300 µm y aproximadamente 450 µm, entre aproximadamente 300 µm y aproximadamente 400 µm, entre aproximadamente 300 µm y aproximadamente 350 µm, entre aproximadamente 350 µm y aproximadamente 750 µm, entre aproximadamente 350 µm y aproximadamente 700 µm, entre aproximadamente 350 µm y aproximadamente 650 µm, entre aproximadamente 350 µm y aproximadamente 600 µm, entre aproximadamente 350 µm y aproximadamente 550 µm, entre aproximadamente 350 µm y aproximadamente 500 µm, entre aproximadamente 350 µm y aproximadamente 450 µm, entre aproximadamente 350 µm y aproximadamente 400 µm, entre aproximadamente 400 µm y aproximadamente 750 µm, entre aproximadamente 400 µm y aproximadamente 700 µm, entre aproximadamente 400 µm y aproximadamente 650 µm, entre aproximadamente 400 µm y aproximadamente 600 µm, entre aproximadamente 400 µm y aproximadamente 550 µm, entre aproximadamente 400 µm y aproximadamente 500 µm, entre aproximadamente 400 µm y aproximadamente 450 µm, entre aproximadamente 450 µm y aproximadamente 750 µm, entre aproximadamente 450 µm y aproximadamente 700 µm, entre aproximadamente 450 µm y aproximadamente 650 µm, entre aproximadamente 450 µm y aproximadamente 600 µm, entre aproximadamente 450 µm y aproximadamente 550 µm, entre aproximadamente 450 µm y aproximadamente 500 µm, entre aproximadamente 500 µm y aproximadamente 750 µm, entre aproximadamente 500 µm y aproximadamente 700 µm, entre aproximadamente 500 µm y aproximadamente 650 µm, entre aproximadamente 500 µm y aproximadamente 600 µm, entre aproximadamente 500 µm y aproximadamente 550 µm, entre aproximadamente 550 µm y aproximadamente 750 µm, entre aproximadamente 550 µm y aproximadamente 700 µm, entre aproximadamente 550 µm y aproximadamente 650 µm, entre aproximadamente 550 µm y aproximadamente 600 µm, entre aproximadamente 600 µm y aproximadamente 750 µm, entre aproximadamente 600 µm y aproximadamente 700 µm, entre aproximadamente 600 µm y aproximadamente 650 µm, entre aproximadamente 650 µm y aproximadamente 750 µm, entre aproximadamente 650 µm y aproximadamente 700 µm, o entre aproximadamente 700 µm y 750 µm).
[0187] [0095] Los procedimientos pueden incluir, por ejemplo, seleccionar en función del tipo de poro y tamaño de poro poloxámero-188 a una concentración mayor que aproximadamente 4,3 g/L (por ejemplo, una concentración mayor que aproximadamente 4,4 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 4,5 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 4,6 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 4,7 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 4,8 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 4,9 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 5,0 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 5,1 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 5,2 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 5,3 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 5,4 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 5,5 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 5,6 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 5,7 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 5,8 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 5,9 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 6,0 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 6,1 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 6,2 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 6,3 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 6,4 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 6,5 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 6,6 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 6,7 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 6,8 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 6,9 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 7,0 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 7,1 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 7,2 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 7,3 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 7,4 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 7,5 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 7,6 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 7,7 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 7,8 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 7,9 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 8,0 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 8,1 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 8,2 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 8,2 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 8,3 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 8,4 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 8,5 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 8,6 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 8,7 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 8,8 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 8,9 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 9,0 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 9,1 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 9,2 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 9,3 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 9,4 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 9,5 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 9,6 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 9,7 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 9,8 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 9,9 g/L o una concentración mayor que aproximadamente 10,0 g/L), cuando el tipo de poro es un poro perforado y el tamaño del poro está entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 250 µm (por ejemplo, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 200 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 100 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 50 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 25 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 200 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 100 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 50 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 25 µm, entre aproximadamente 25 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 25 µm y aproximadamente 200 µm, entre aproximadamente 25 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 25 µm y aproximadamente 100 µm, entre aproximadamente 25 µm y aproximadamente 50 µm, entre aproximadamente 50 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 50 µm y aproximadamente 200 µm, entre aproximadamente 50 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 50 µm y aproximadamente 100 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 200 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 150 µm y aproximadamente 250 µm, entre aproximadamente 150 µm y aproximadamente 200 µm, o entre aproximadamente 200 µm y aproximadamente 250 µm).
[0189] [0096] En algunos ejemplos, los procedimientos incluyen seleccionar en función del tipo de poro y el tamaño del poro poloxámero-188 a una concentración mayor que 4,3 g/L (por ejemplo, una concentración mayor que aproximadamente 4,4 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 4,5 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 4,6 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 4,7 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 4,8 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 4,9 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 5,0 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 5,1 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 5,2 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 5,3 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 5,4 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 5,5 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 5,6 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 5,7 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 5,8 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 5,9 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 6,0 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 6,1 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 6,2 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 6,3 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 6,4 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 6,5 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 6,6 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 6,7 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 6,8 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 6,9 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 7,0 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 7,1 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 7,2 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 7,3 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 7,4 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 7,5 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 7,6 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 7,7 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 7,8 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 7,9 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 8,0 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 8,1 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 8,2 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 8,2 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 8,3 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 8,4 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 8,5 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 8,6 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 8,7 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 8,8 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 8,9 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 9,0 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 9,1 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 9,2 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 9,3 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 9,4 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 9,5 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 9,6 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 9,7 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 9,8 g/L, una concentración mayor que aproximadamente 9,9 g/L o una concentración mayor que aproximadamente 10,0 g/L), cuando el tipo de poro es un poro perforado y el tamaño del poro está entre aproximadamente 160 µm y aproximadamente 190 µm (por ejemplo, entre aproximadamente 160 µm y aproximadamente 185 µm, entre aproximadamente 160 µm y aproximadamente 180 µm, entre aproximadamente 160 µm y aproximadamente 175 µm, entre aproximadamente 160 µm y aproximadamente 170 µm, entre aproximadamente 160 µm y aproximadamente 165 µm, entre aproximadamente 165 µm y aproximadamente 190 µm, entre aproximadamente 165 µm y aproximadamente 185 µm, entre aproximadamente 165 µm y aproximadamente 180 µm, entre aproximadamente 165 µm y aproximadamente 175 µm, entre aproximadamente 165 µm y aproximadamente 170 µm, entre aproximadamente 170 µm y aproximadamente 190 µm, entre aproximadamente 170 µm y aproximadamente 185 µm, entre aproximadamente 170 µm y aproximadamente 180 µm, entre aproximadamente 170 µm y aproximadamente 175 µm, entre aproximadamente 175 µm y aproximadamente 190 µm, entre aproximadamente 175 µm y aproximadamente 185 µm, entre aproximadamente 175 µm y aproximadamente 180 µm, entre aproximadamente 180 µm y aproximadamente 190 µm, entre aproximadamente 180 µm y aproximadamente 185 µm, o entre aproximadamente 185 µm y aproximadamente 190 µm).
[0191] [0097] En algunos casos, los procedimientos incluyen seleccionar en función del tipo de poro y el tamaño de poro poloxámero-188 a una concentración de entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 3,3 g/L (por ejemplo, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 3,2 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 3,1 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 2,9 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 2,8 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 2,7 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 2,6 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 2,5 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 2,4 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 2,3 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 2,2 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 2,1 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 2,0 g/L, entre aproximadamente 1,9 g/L y aproximadamente 3,3 g/L, entre aproximadamente 1,9 g/L y aproximadamente 3,2 g/L, entre aproximadamente 1,9 g/L y aproximadamente 3,1 g/L, entre aproximadamente 1,9 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 1,9 g/L y aproximadamente 2,9 g/L, entre aproximadamente 1,9 g/L y aproximadamente 2,8 g/L, entre aproximadamente 1,9 g/L y aproximadamente 2,7 g/L, entre aproximadamente 1,9 g/L y aproximadamente 2,6 g/L, entre aproximadamente 1,9 g/L y aproximadamente 2,5 g/L, entre aproximadamente 1,9 g/L y aproximadamente 2,4 g/L, entre aproximadamente 1,9 g/L y aproximadamente 2,3 g/L, entre aproximadamente 1,9 g/L y aproximadamente 2,2 g/L, entre aproximadamente 1,9 g/L y aproximadamente 2,1 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 3,3 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 3,2 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 3,1 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 2,9 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 2,8 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 2,7 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 2,6 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 2,5 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 2,4 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 2,3 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 2,2 g/L, entre aproximadamente 2,1 g/L y aproximadamente 3,3 g/L, entre aproximadamente 2,1 g/L y aproximadamente 3,2 g/L, entre aproximadamente 2,1 g/L y aproximadamente 3,1 g/L, entre aproximadamente 2,1 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 2,1 g/L y aproximadamente 2,9 g/L, entre aproximadamente 2,1 g/L y aproximadamente 2,8 g/L, entre aproximadamente 2,1 g/L y aproximadamente 2,7 g/L, entre aproximadamente 2,1 g/L y aproximadamente 2,6 g/L, entre aproximadamente 2,1 g/L y aproximadamente 2,5 g/L, entre aproximadamente 2,1 g/L y aproximadamente 2,4 g/L, entre aproximadamente 2,1 g/L y aproximadamente 2,3 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 3,3 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 3,2 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 3,1 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 2,9 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 2,8 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 2,7 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 2,6 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 2,5 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 2,4 g/L, entre aproximadamente 2,3 g/L y aproximadamente 3,3 g/L, entre aproximadamente 2,3 g/L y aproximadamente 3,2 g/L, entre aproximadamente 2,3 g/L y aproximadamente 3,1 g/L, entre aproximadamente 2,3 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 2,3 g/L y aproximadamente 2,9 g/L, entre aproximadamente 2,3 g/L y aproximadamente 2,8 g/L, entre aproximadamente 2,3 g/L y aproximadamente 2,7 g/L, entre aproximadamente 2,3 g/L y aproximadamente 2,6 g/L, entre aproximadamente 2,3 g/L y aproximadamente 2,5 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 3,3 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 3,2 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 3,1 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 2,9 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 2,8 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 2,7 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 2,6 g/L, entre aproximadamente 2,5 g/L y aproximadamente 3,3 g/L, entre aproximadamente 2,5 g/L y aproximadamente 3,2 g/L, entre aproximadamente 2,5 g/L y aproximadamente 3,1 g/L, entre aproximadamente 2,5 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 2,5 g/L y aproximadamente 2,9 g/L, entre aproximadamente 2,5 g/L y aproximadamente 2,8 g/L, entre aproximadamente 2,5 g/L y aproximadamente 2,7 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 3,3 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 3,2 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 3,1 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 2,9 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 2,8 g/L, entre aproximadamente 2,7 g/L y aproximadamente 3,3 g/L, entre aproximadamente 2,7 g/L y aproximadamente 3,2 g/L, entre aproximadamente 2,7 g/L y aproximadamente 3,1 g/L, entre aproximadamente 2,7 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 2,7 g/L y aproximadamente 2,9 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 3,3 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 3,2 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 3,1 g/L, entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 2,9 g/L y aproximadamente 3,3 g/L, entre aproximadamente 2,9 g/L y aproximadamente 3,2 g/L, entre aproximadamente 2,9 g/L y aproximadamente 3,1 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 3,3 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 3,2 g/L, o entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 3,3 g/L), cuando el tipo de poro es un poro sinterizado y el tamaño del poro es mayor que 150 µm (por ejemplo, mayor que 155 µm, mayor que 160 µm, mayor que 165 µm, mayor que 170 µm, mayor que 175 µm, mayor que aproximadamente 180 µm, mayor que 185 µm, mayor que aproximadamente 190 µm, mayor que aproximadamente 195 µm, mayor que aproximadamente 200 µm, mayor que aproximadamente 205 µm, mayor que aproximadamente 210 µm, mayor que aproximadamente 215 µm, mayor que aproximadamente 220 µm, mayor que aproximadamente 225 µm, mayor que aproximadamente 230 µm, mayor que aproximadamente 235 µm, mayor que aproximadamente 240 µm, mayor que aproximadamente 245 µm, mayor que aproximadamente 250 µm, mayor que aproximadamente 255 µm, mayor que aproximadamente 260 µm, mayor que aproximadamente 265 µm, mayor que aproximadamente 270 µm, mayor que aproximadamente 275 µm, mayor que aproximadamente 280 µm, mayor que aproximadamente 290 µm, mayor que aproximadamente 300 µm, mayor que aproximadamente 350 µm, mayor que aproximadamente 400 µm, mayor que aproximadamente 450 µm o mayor que aproximadamente 500 µm).
[0193] [0098] Los procedimientos pueden incluir, por ejemplo, seleccionar en función del tipo de poro y tamaño de poro poloxámero-188 a una concentración de entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 4,3 g/L (por ejemplo, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 4,1 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 4,0 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 3,9 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 3,8 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 3,7 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 3,6 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 3,5 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 4,3 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 4,1 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 4,0 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 3,9 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 3,8 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 3,7 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 3,6 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 4,3 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 4,1 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 4,0 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 3,9 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 3,8 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 3,7 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 4,3 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 4,1 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 4,0 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 3,9 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 3,8 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 4,3 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 4,1 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 4,0 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 3,9 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 4,3 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 4,1 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 4,0 g/L, entre aproximadamente 3,9 g/L y aproximadamente 4,3 g/L, entre aproximadamente 3,9 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 3,9 g/L y aproximadamente 4,1 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 4,3 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, o entre aproximadamente 4,1 g/L y aproximadamente 4,3 g/L), cuando el tipo de poro es un poro sinterizado y el tamaño del poro está entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 150 µm (por ejemplo, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 145 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 140 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 135 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 130 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 125 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 120 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 115 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 110 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 105 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 100 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 95 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 90 µm, entre aproximadamente 80 µm y aproximadamente 85 µm, entre aproximadamente 85 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 85 µm y aproximadamente 145 µm, entre aproximadamente 85 µm y aproximadamente 140 µm, entre aproximadamente 85 µm y aproximadamente 135 µm, entre aproximadamente 85 µm y aproximadamente 130 µm, entre aproximadamente 85 µm y aproximadamente 125 µm, entre aproximadamente 85 µm y aproximadamente 120 µm, entre aproximadamente 85 µm y aproximadamente 115 µm, entre aproximadamente 85 µm y aproximadamente 110 µm, entre aproximadamente 85 µm y aproximadamente 105 µm, entre aproximadamente 85 µm y aproximadamente 100 µm, entre aproximadamente 85 µm y aproximadamente 95 µm, entre aproximadamente 85 µm y aproximadamente 90 µm, entre aproximadamente 90 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 90 µm y aproximadamente 145 µm, entre aproximadamente 90 µm y aproximadamente 140 µm, entre aproximadamente 90 µm y aproximadamente 135 µm, entre aproximadamente 90 µm y aproximadamente 130 µm, entre aproximadamente 90 µm y aproximadamente 125 µm, entre aproximadamente 90 µm y aproximadamente 120 µm, entre aproximadamente 90 µm y aproximadamente 115 µm, entre aproximadamente 90 µm y aproximadamente 110 µm, entre aproximadamente 90 µm y aproximadamente 105 µm, entre aproximadamente 90 µm y aproximadamente 100 µm, entre aproximadamente 90 µm y aproximadamente 95 µm, entre aproximadamente 95 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 95 µm y aproximadamente 145 µm, entre aproximadamente 95 µm y aproximadamente 140 µm, entre aproximadamente 95 µm y aproximadamente 135 µm, entre aproximadamente 95 µm y aproximadamente 130 µm, entre aproximadamente 95 µm y aproximadamente 125 µm, entre aproximadamente 95 µm y aproximadamente 120 µm, entre aproximadamente 95 µm y aproximadamente 115 µm, entre aproximadamente 95 µm y aproximadamente 110 µm, entre aproximadamente 95 µm y aproximadamente 105 µm, entre aproximadamente 95 µm y aproximadamente 100 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 145 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 140 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 135 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 130 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 125 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 120 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 115 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 110 µm, entre aproximadamente 100 µm y aproximadamente 105 µm, entre aproximadamente 105 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 105 µm y aproximadamente 145 µm, entre aproximadamente 105 µm y aproximadamente 140 µm, entre aproximadamente 105 µm y aproximadamente 135 µm, entre aproximadamente 105 µm y aproximadamente 130 µm, entre aproximadamente 105 µm y aproximadamente 125 µm, entre aproximadamente 105 µm y aproximadamente 120 µm, entre aproximadamente 105 µm y aproximadamente 115 µm, entre aproximadamente 105 µm y aproximadamente 110 µm, entre aproximadamente 110 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 110 µm y aproximadamente 145 µm, entre aproximadamente 110 µm y aproximadamente 140 µm, entre aproximadamente 110 µm y aproximadamente 135 µm, entre aproximadamente 110 µm y aproximadamente 130 µm, entre aproximadamente 110 µm y aproximadamente 125 µm, entre aproximadamente 110 µm y aproximadamente 120 µm, entre aproximadamente 110 µm y aproximadamente 115 µm, entre aproximadamente 115 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 115 µm y aproximadamente 145 µm, entre aproximadamente 115 µm y aproximadamente 140 µm, entre aproximadamente 115 µm y aproximadamente 135 µm, entre aproximadamente 115 µm y aproximadamente 130 µm, entre aproximadamente 115 µm y aproximadamente 125 µm, entre aproximadamente 115 µm y aproximadamente 120 µm, entre aproximadamente 120 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 120 µm y aproximadamente 145 µm, entre aproximadamente 120 µm y aproximadamente 140 µm, entre aproximadamente 120 µm y aproximadamente 135 µm, entre aproximadamente 120 µm y aproximadamente 130 µm, entre aproximadamente 120 µm y aproximadamente 125 µm, entre aproximadamente 125 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 125 µm y aproximadamente 145 µm, entre aproximadamente 125 µm y aproximadamente 140 µm, entre aproximadamente 125 µm y aproximadamente 135 µm, entre aproximadamente 125 µm y aproximadamente 130 µm, entre aproximadamente 130 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 130 µm y aproximadamente 145 µm, entre aproximadamente 130 µm y aproximadamente 140 µm, entre aproximadamente 130 µm y aproximadamente 135 µm, entre aproximadamente 135 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 135 µm y aproximadamente 145 µm, entre aproximadamente 135 µm y aproximadamente 140 µm, entre aproximadamente 140 µm y aproximadamente 150 µm, entre aproximadamente 140 µm y aproximadamente 145 µm, o entre aproximadamente 145 µm y aproximadamente 150 µm).
[0195] [0099] Los procedimientos pueden incluir, por ejemplo, seleccionar en función del tipo de poro y el tamaño del poro poloxámero-188 a una concentración de aproximadamente 4,5 g/L o a una concentración mayor que aproximadamente 4,5 g/L (por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 4,6 g/L o a una concentración mayor que 4,6 g/L, a una concentración de aproximadamente 4,7 g/L o a una concentración mayor que 4,7 g/L, a una concentración de aproximadamente 4,8 g/L o a una concentración mayor que 4,8 g/L, a una concentración de aproximadamente 4,9 g/L o a una concentración mayor que 4,9 g/L, a una concentración de aproximadamente 5,0 g/L o a una concentración mayor que 5,0 g/L, a una concentración de aproximadamente 5,1 g/L o a una concentración mayor que 5,1 g/L, a una concentración de aproximadamente 5,2 g/L o a una concentración mayor que 5,2 g/L, a una concentración de aproximadamente 5,3 g/L o a una concentración mayor a 5,3 g/L, a una concentración de aproximadamente 5,4 g/L o a una concentración mayor a 5,4 g/L, a una concentración de aproximadamente 5,5 g/L o a una concentración mayor a 5,5 g/L, a una concentración de aproximadamente 5,6 g/L o a una concentración mayor a 5,6 g/L, a una concentración de aproximadamente 5,7 g/L o a una concentración mayor a 5,7 g/L, a una concentración de aproximadamente 5,8 g/L o a una concentración mayor a 5,8 g/L, a una concentración de aproximadamente 6,0 g/L o a una concentración mayor a 6,0 g/L, a una concentración de aproximadamente 6,1 g/L o a una concentración mayor a 6,1 g/L, a una concentración de aproximadamente 6,2 g/L o a una concentración mayor a 6,2 g/L, a una concentración de aproximadamente 6,3 g/L o a una concentración mayor que 6,3 g/L, a una concentración de aproximadamente 6,4 g/L o a una concentración mayor que 6,4 g/L, a una concentración de aproximadamente 6,5 g/L o a una concentración mayor que 6,5 g/L, a una concentración de aproximadamente 6,6 g/L o a una concentración mayor que 6,6 g/L, a una concentración de aproximadamente 6,7 g/L o a una concentración mayor que 6,7 g/L, a una concentración de aproximadamente 6,8 g/L o a una concentración mayor que 6,8 g/L, a una concentración de aproximadamente 6,9 g/L o a una concentración mayor que 6,9 g/L, a una concentración de aproximadamente 7,0 g/L o a una concentración mayor que 7,0 g/L, a una concentración de aproximadamente 7,1 g/L o a una concentración mayor que 7,1 g/L, a una concentración de aproximadamente 7,2 g/L o a una concentración mayor que 7,2 g/L, a una concentración de aproximadamente 7,3 g/L o a una concentración mayor que 7,3 g/L, a una concentración de aproximadamente 7,4 g/L o a una concentración mayor que 7,4 g/L, a una concentración de aproximadamente 7,5 g/L o a una concentración mayor que 7,5 g/L, a una concentración de aproximadamente 7,6 g/L o a una concentración mayor que 7,6 g/L, a una concentración de aproximadamente 7,7 g/L o a una concentración mayor que 7,7 g/L, a una concentración de aproximadamente 7,8 g/L o a una concentración mayor que 7,8 g/L, a una concentración de aproximadamente 7,9 g/L o a una concentración mayor que 7,9 g/L, a una concentración de aproximadamente 8,0 g/L o a una concentración mayor que 8.0 g/L, a una concentración de aproximadamente 8,1 g/L o a una concentración mayor que 8,1 g/L, a una concentración de aproximadamente 8,2 g/L o a una concentración mayor que 8,2 g/L, a una concentración de aproximadamente 8,3 g/L o a una concentración mayor que 8,3 g/L, a una concentración de aproximadamente 8,4 g/L o a una concentración mayor que 8,4 g/L, a una concentración de aproximadamente 8,5 g/L o a una concentración mayor que 8,5 g/L, a una concentración de aproximadamente 8,6 g/L o a una concentración mayor que 8,6 g/L, a una concentración de aproximadamente 8,7 g/L o a una concentración mayor que 8,7 g/L, a una concentración de aproximadamente 8,8 g/L o a una concentración mayor que 8,8 g/L, a una concentración de aproximadamente 8,9 g/L o a una concentración mayor que 8,9 g/L, a una concentración de aproximadamente 9,0 g/L o a una concentración mayor que 9,0 g/L, a una concentración de aproximadamente 9,1 g/L o a una concentración mayor que 9,1 g/L, a una concentración de aproximadamente 9,2 g/L o a una concentración mayor que 9,2 g/L, a una concentración de aproximadamente 9,3 g/L o a una concentración mayor que 9,3 g/L, a una concentración de aproximadamente 9,4 g/L o a una concentración mayor que 9,4 g/L, a una concentración de aproximadamente 9,5 g/L o a una concentración mayor que 9,5 g/L, a una concentración de aproximadamente 9,6 g/L o a una concentración mayor que 9,6 g/L, a una concentración de aproximadamente 9,7 g/L o a una concentración mayor que 9,7 g/L, a una concentración de aproximadamente 9,8 g/L o a una concentración mayor que 9,8 g/L, a una concentración de aproximadamente 9,9 g/L o a una concentración mayor que 9,9 g/L, o a una concentración de aproximadamente 10,0 g/L o a una concentración mayor que 10,0 g/L), cuando el tipo de poro es un poro sinterizado y el tamaño del poro está entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 80 µm (por ejemplo, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 50 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 25 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 10 µm, entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 5 µm, entre aproximadamente 5 µm y aproximadamente 80 µm, entre aproximadamente 5 µm y aproximadamente 50 µm, entre aproximadamente 5 µm y aproximadamente 25 µm, entre aproximadamente 5 µm y aproximadamente 10 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 80 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 50 µm, entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 25 µm, entre aproximadamente 25 µm y aproximadamente 80 µm, entre aproximadamente 25 µm y aproximadamente 50 µm, o entre aproximadamente 50 µm y aproximadamente 80 µm).
[0197] Cuando el cultivo es un cultivo por perfusión, el segundo medio líquido puede incluir la concentración seleccionada de poloxámero-188.
[0199] Incremento de la concentración de Poloxámero-188 en función de la densidad de células viables.
[0201] [0101] El procedimiento de la invención incluye aumentar la concentración de poloxámero-188 en el medio a lo largo del tiempo en función de la densidad de células viables en el medio. El procedimiento de la presente invención comprende aumentar la concentración de poloxámero-188 en el medio a más de 6,0 g/L cuando la densidad de células viables en el medio es mayor que 90 x 10<6>células/mL. De manera más general, sin embargo, cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento puede incluir aumentar la concentración de poloxámero-188 en el medio a más de 1,8 g/L (por ejemplo, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 2,9 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 2,8 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 2,7 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 2,5 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 2,4 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 2,3 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 2,2 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 2,1 g/L, entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 2,0 g/L, entre aproximadamente 1,9 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 1,9 g/L y aproximadamente 2,9 g/L, entre aproximadamente 1,9 g/L y aproximadamente 2,8 g/L, entre aproximadamente 1,9 g/L y aproximadamente 2,7 g/L, entre aproximadamente 1,9 g/L y aproximadamente 2,6 g/L, entre aproximadamente 1,9 g/L y aproximadamente 2,5 g/L, entre aproximadamente 1,9 g/L y aproximadamente 2,4 g/L, entre aproximadamente 1,9 g/L y aproximadamente 2,3 g/L, entre aproximadamente 1,9 g/L y aproximadamente 2,2 g/L, entre aproximadamente 1,9 g/L y aproximadamente 2,1 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 2,9 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 2,8 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 2,7 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 2,6 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 2,5 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 2,4 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 2,3 g/L, entre aproximadamente 2,0 g/L y aproximadamente 2,2 g/L, entre aproximadamente 2,1 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 2,1 g/L y aproximadamente 2,9 g/L, entre aproximadamente 2,1 g/L y aproximadamente 2,8 g/L, entre aproximadamente 2,1 g/L y aproximadamente 2,7 g/L, entre aproximadamente 2,1 g/L y aproximadamente 2,6 g/L, entre aproximadamente 2,1 g/L y aproximadamente 2,5 g/L, entre aproximadamente 2,1 g/L y aproximadamente 2,4 g/L, entre aproximadamente 2,1 g/L y aproximadamente 2,3 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 2,9 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 2,8 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 2,7 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 2,6 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 2,5 g/L, entre aproximadamente 2,2 g/L y aproximadamente 2,4 g/L, entre aproximadamente 2,3 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 2,3 g/L y aproximadamente 2,9 g/L, entre aproximadamente 2,3 g/L y aproximadamente 2,8 g/L, entre aproximadamente 2,3 g/L y aproximadamente 2,7 g/L, entre aproximadamente 2,3 g/L y aproximadamente 2,6 g/L, entre aproximadamente 2,3 g/L y aproximadamente 2,5 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 2,9 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 2,8 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 2,7 g/L, entre aproximadamente 2,4 g/L y aproximadamente 2,6 g/L, entre aproximadamente 2,5 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 2,5 g/L y aproximadamente 2,9 g/L, entre aproximadamente 2,5 g/L y aproximadamente 2,8 g/L, entre aproximadamente 2,5 g/L y aproximadamente 2,7 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 2,9 g/L, entre aproximadamente 2,6 g/L y aproximadamente 2,8 g/L, entre aproximadamente 2,7 g/L y aproximadamente 3,0 g/L, entre aproximadamente 2,7 g/L y aproximadamente 2,9 g/L, o entre aproximadamente 2,8 g/L y aproximadamente 3,0 g/L) cuando la densidad de células viables en el medio está entre aproximadamente 20 x 10<6>células/mL y aproximadamente 60 x 10<6>células/mL (por ejemplo, entre aproximadamente 20 x 10<6>células/mL y aproximadamente 58 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 20 x 10<6>células/mL y aproximadamente 56 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 20 x 10<6>células/mL y aproximadamente 54 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 20 x 10<6>células/mL y aproximadamente 52 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 20 x 10<6>células/mL y aproximadamente 50 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 20 x 10<6>células/mL y aproximadamente 48 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 20 x 10<6>células/mL y aproximadamente 46 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 20 x 10<6>células/mL y aproximadamente 44 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 20 x 10<6>células/mL y aproximadamente 42 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 20 x 10<6>células/mL y aproximadamente 40 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 20 x 10<6>células/mL y aproximadamente 38 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 20 x 10<6>células/mL y aproximadamente 36 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 20 x 10<6>células/mL y aproximadamente 34 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 20 x 10<6>células/mL y aproximadamente 32 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 20 x 10<6>células/mL y aproximadamente 30 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 20 x 10<6>células/mL y aproximadamente 28 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 20 x 10<6>células/mL y aproximadamente 26 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 20 x 10<6>células/mL y aproximadamente 24 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 20 x 10<6>células/mL y aproximadamente 22 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 22 x 10<6>células/mL y aproximadamente 60 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 22 x 10<6>células/mL y aproximadamente 58 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 22 x 10<6>células/mL y aproximadamente 56 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 22 x 10<6>células/mL y aproximadamente 54 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 22 x 10<6>células/mL y aproximadamente 52 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 22 x 10<6>células/mL y aproximadamente 50 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 22 x 10<6>células/mL y aproximadamente 48 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 22 x 10<6>células/mL y aproximadamente 46 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 22 x 10<6>células/mL y aproximadamente 44 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 22 x 10<6>células/mL y aproximadamente 42 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 22 x 10<6>células/mL y aproximadamente 40 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 22 x 10<6>células/mL y aproximadamente 38 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 22 x 10<6>células/mL y aproximadamente 36 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 22 x 10<6>células/mL y aproximadamente 34 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 22 x 10<6>células/mL y aproximadamente 32 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 22 x 10<6>células/mL y aproximadamente 30 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 22 x 10<6>células/mL y aproximadamente 28 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 22 x 10<6>células/mL y aproximadamente 26 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 22 x 10<6>células/mL y aproximadamente 24 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 24 x 10<6>células/mL y aproximadamente 60 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 24 x 10<6>células/mL y aproximadamente 58 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 24 x 10<6>células/mL y aproximadamente 56 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 24 x 10<6>células/mL y aproximadamente 54 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 24 x 10<6>células/mL y aproximadamente 52 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 24 x 10<6>células/mL y aproximadamente 50 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 24 x 10<6>células/mL y aproximadamente 48 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 24 x 10<6>células/mL y aproximadamente 46 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 24 x 10<6>células/mL y aproximadamente 44 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 24 x 10<6>células/mL y aproximadamente 42 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 24 x 10<6>células/mL y aproximadamente 40 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 24 x 10<6>células/mL y aproximadamente 38 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 24 x 10<6>células/mL y aproximadamente 36 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 24 x 10<6>células/mL y aproximadamente 34 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 24 x 10<6>células/mL y aproximadamente 32 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 24 x 10<6>células/mL y aproximadamente 30 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 24 x 10<6>células/mL y aproximadamente 28 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 24 x 10<6>células/mL y aproximadamente 26 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 26 x 10<6>células/mL y aproximadamente 60 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 26 x 10<6>células/mL y aproximadamente 58 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 26 x 10<6>células/mL y aproximadamente 56 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 26 x 10<6>células/mL y aproximadamente 54 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 26 x 10<6>células/mL y aproximadamente 52 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 26 x 10<6>células/mL y aproximadamente 50 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 26 x 10<6>células/mL y aproximadamente 48 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 26 x 10<6>células/mL y aproximadamente 46 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 26 x 10<6>células/mL y aproximadamente 44 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 26 x 10<6>células/mL y aproximadamente 42 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 26 x 10<6>células/mL y aproximadamente 40 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 26 x 10<6>células/mL y aproximadamente 38 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 26 x 10<6>células/mL y aproximadamente 36 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 26 x 10<6>células/mL y aproximadamente 34 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 26 x 10<6>células/mL y aproximadamente 32 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 26 x 10<6>células/mL y aproximadamente 30 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 26 x 10<6>células/mL y aproximadamente 28 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 28 x 10<6>células/mL y aproximadamente 60 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 28 x 10<6>células/mL y aproximadamente 58 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 28 x 10<6>células/mL y aproximadamente 56 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 28 x 10<6>células/mL y aproximadamente 54 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 28 x 10<6>células/mL y aproximadamente 52 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 28 x 10<6>células/mL y aproximadamente 50 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 28 x 10<6>células/mL y aproximadamente 48 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 28 x 10<6>células/mL y aproximadamente 46 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 28 x 10<6>células/mL y aproximadamente 44 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 28 x 10<6>células/mL y aproximadamente 42 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 28 x 10<6>células/mL y aproximadamente 40 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 28 x 10<6>células/mL y aproximadamente 38 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 28 x 10<6>células/mL y aproximadamente 36 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 28 x 10<6>células/mL y aproximadamente 34 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 28 x 10<6>células/mL y aproximadamente 32 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 28 x 10<6>células/mL y aproximadamente 30 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 30 x 10<6>células/mL y aproximadamente 60 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 30 x 10<6>células/mL y aproximadamente 58 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 30 x 10<6>células/mL y aproximadamente 56 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 30 x 10<6>células/mL y aproximadamente 54 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 30 x 10<6>células/mL y aproximadamente 52 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 30 x 10<6>células/mL y aproximadamente 50 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 30 x 10<6>células/mL y aproximadamente 48 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 30 x 10<6>células/mL y aproximadamente 46 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 30 x 10<6>células/mL y aproximadamente 44 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 30 x 10<6>células/mL y aproximadamente 42 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 30 x 10<6>células/mL y aproximadamente 40 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 30 x 10<6>células/mL y aproximadamente 38 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 30 x 10<6>células/mL y aproximadamente 36 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 30 x 10<6>células/mL y aproximadamente 34 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 30 x 10<6>células/mL y aproximadamente 32 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 32 x 10<6>células/mL y aproximadamente 60 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 32 x 10<6>células/mL y aproximadamente 58 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 32 x 10<6>células/mL y aproximadamente 56 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 32 x 10<6>células/mL y aproximadamente 54 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 32 x 10<6>células/mL y aproximadamente 52 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 32 x 10<6>células/mL y aproximadamente 50 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 32 x 10<6>células/mL y aproximadamente 48 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 32 x 10<6>células/mL y aproximadamente 46 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 32 x 10<6>células/mL y aproximadamente 44 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 32 x 10<6>células/mL y aproximadamente 42 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 32 x 10<6>células/mL y aproximadamente 40 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 32 x 10<6>células/mL y aproximadamente 38 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 32 x 10<6>células/mL y aproximadamente 36 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 32 x 10<6>células/mL y aproximadamente 34 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 34 x 10<6>células/mL y aproximadamente 60 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 34 x 10<6>células/mL y aproximadamente 58 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 34 x 10<6>células/mL y aproximadamente 56 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 34 x 10<6>células/mL y aproximadamente 54 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 34 x 10<6>células/mL y aproximadamente 52 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 34 x 10<6>células/mL y aproximadamente 50 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 34 x 10<6>células/mL y aproximadamente 48 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 34 x 10<6>células/mL y aproximadamente 46 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 34 x 10<6>células/mL y aproximadamente 44 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 34 x 10<6>células/mL y aproximadamente 42 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 34 x 10<6>células/mL y aproximadamente 40 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 34 x 10<6>células/mL y aproximadamente 38 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 34 x 10<6>células/mL y aproximadamente 36 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 36 x 10<6>células/mL y aproximadamente 60 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 36 x 10<6>células/mL y aproximadamente 58 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 36 x 10<6>células/mL y aproximadamente 56 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 36 x 10<6>células/mL y aproximadamente 54 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 36 x 10<6>células/mL y aproximadamente 52 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 36 x 10<6>células/mL y aproximadamente 50 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 36 x 10<6>células/mL y aproximadamente 48 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 36 x 10<6>células/mL y aproximadamente 46 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 36 x 10<6>células/mL y aproximadamente 44 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 36 x 10<6>células/mL y aproximadamente 42 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 36 x 10<6>células/mL y aproximadamente 40 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 36 x 10<6>células/mL y aproximadamente 38 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 38 x 10<6>células/mL y aproximadamente 60 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 38 x 10<6>células/mL y aproximadamente 58 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 38 x 10<6>células/mL y aproximadamente 56 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 38 x 10<6>células/mL y aproximadamente 54 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 38 x 10<6>células/mL y aproximadamente 52 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 38 x 10<6>células/mL y aproximadamente 50 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 38 x 10<6>células/mL y aproximadamente 48 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 38 x 10<6>células/mL y aproximadamente 46 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 38 x 10<6>células/mL y aproximadamente 44 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 38 x 10<6>células/mL y aproximadamente 42 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 38 x 10<6>células/mL y aproximadamente 40 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 40 x 10<6>células/mL y aproximadamente 60 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 40 x 10<6>células/mL y aproximadamente 58 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 40 x 10<6>células/mL a aproximadamente 56 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 40 x 10<6>células/mL y aproximadamente 54 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 40 x 10<6>células/mL y aproximadamente 52 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 40 x 10<6>células/mL y aproximadamente 50 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 40 x 10<6>células/mL y aproximadamente 48 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 40 x 10<6>células/mL y aproximadamente 46 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 40 x 10<6>células/mL y aproximadamente 44 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 40 x 10<6>células/mL y aproximadamente 42 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 42 x 10<6>células/mL y aproximadamente 60 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 42 x 10<6>células/mL y aproximadamente 58 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 42 x 10<6>células/mL y aproximadamente 56 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 42 x 10<6>células/mL y aproximadamente 54 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 42 x 10<6>células/mL y aproximadamente 52 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 42 x 10<6>células/mL y aproximadamente 50 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 42 x 10<6>células/mL y aproximadamente 48 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 42 x 10<6>células/mL y aproximadamente 46 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 42 x 10<6>células/mL y aproximadamente 44 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 44 x 10<6>células/mL y aproximadamente 60 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 44 x 10<6>células/mL y aproximadamente 58 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 44 x 10<6>células/mL y aproximadamente 56 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 44 x 10<6>células/mL y aproximadamente 54 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 44 x 10<6>células/mL y aproximadamente 52 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 44 x 10<6>células/mL y aproximadamente 50 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 44 x 10<6>células/mL y aproximadamente 48 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 44 x 10<6>células/mL y aproximadamente 46 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 46 x 10<6>células/mL y aproximadamente 60 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 46 x 10<6>células/mL y aproximadamente 58 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 46 x 10<6>células/mL y aproximadamente 56 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 46 x 10<6>células/mL y aproximadamente 54 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 46 x 10<6>células/mL y aproximadamente 52 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 46 x 10<6>células/mL y aproximadamente 50 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 46 x 10<6>células/mL y aproximadamente 48 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 48 x 10<6>células/mL y aproximadamente 60 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 48 x 10<6>células/mL y aproximadamente 58 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 48 x 10<6>células/mL y aproximadamente 56 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 48 x 10<6>células/mL y aproximadamente 54 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 48 x 10<6>células/mL y aproximadamente 52 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 48 x 10<6>células/mL y aproximadamente 50 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 50 x 10<6>células/mL y aproximadamente 60 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 50 x 10<6>células/mL y aproximadamente 58 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 50 x 10<6>células/mL y aproximadamente 56 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 50 x 10<6>células/mL y aproximadamente 54 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 50 x 10<6>células/mL y aproximadamente 52 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 52 x 10<6>células/mL y aproximadamente 60 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 52 x 10<6>células/mL y aproximadamente 58 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 52 x 10<6>células/mL a aproximadamente 56 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 52 x 10<6>células/mL y aproximadamente 54 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 54 x 10<6>células/mL y aproximadamente 60 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 54 x 10<6>células/mL y aproximadamente 58 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 54 x 10<6>células/mL a aproximadamente 56 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 56 x 10<6>células/mL y aproximadamente 60 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 56 x 10<6>células/mL y aproximadamente 58 x 10<6>células/mL, o entre aproximadamente 58 x 10<6>células/mL y aproximadamente 60 x 10<6>células/mL).
[0203] [0102] Cualquiera de los procedimientos descritos en este documento puede incluir aumentar la concentración de poloxámero-188 en el medio a entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 6,0 g/L (por ejemplo, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 5,9 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 5,7 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 5,5 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 5,3 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 5,1 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 4,9 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 4,8 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 4,7 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 4,6 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 4,5 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 4,4 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 4,3 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 4,1 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 4,0 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 3,9 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 3,8 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 3,7 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 3,6 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 3,5 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 3,4 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 3,3 g/L, entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 3,2 g/L, entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 5,9 g/L, entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 5,7 g/L, entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 5,5 g/L, entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 5,3 g/L, entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 5,1 g/L, entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 4,9 g/L, entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 4,8 g/L, entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 4,7 g/L, entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 4,6 g/L, entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 4,5 g/L, entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 4,4 g/L, entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 4,3 g/L, entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 4,1 g/L, entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 4,0 g/L, entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 3,9 g/L, entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 3,8 g/L, entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 3,7 g/L, entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 3,6 g/L, entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 3,5 g/L, entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 3,4 g/L, entre aproximadamente 3,1 g/L y aproximadamente 3,3 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 5,9 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 5,7 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 5,5 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 5,3 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 5,1 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 4,9 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 4,8 g/L, entre aproximadamente 3.2 g/L y aproximadamente 4,7 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 4,6 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 4,5 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 4,4 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 4,3 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 4,1 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 4,0 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 3,9 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 3,8 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 3,7 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 3,6 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 3,5 g/L, entre aproximadamente 3,2 g/L y aproximadamente 3,4 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 5,9 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 5,7 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 5,5 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 5,3 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 5,1 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 4,9 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 4,8 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 4,7 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 4,6 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 4,5 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 4,4 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 4,3 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 4,1 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 4,0 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 3,9 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 3,8 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 3,7 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 3,6 g/L, entre aproximadamente 3,3 g/L y aproximadamente 3,5 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 5,9 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 5,7 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 5,5 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 5,3 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 5,1 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 4,9 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 4,8 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 4,7 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 4,6 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 4,5 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 4,4 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 4,3 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 4,1 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 4,0 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 3,9 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 3,8 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 3,7 g/L, entre aproximadamente 3,4 g/L y aproximadamente 3,6 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 5,9 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 5,7 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 5,5 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 5,3 g/L, entre aproximadamente 3.5 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 5,1 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 4,9 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 4,8 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 4,7 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 4,6 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 4,5 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 4,4 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 4,3 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 4,1 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 4,0 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 3,9 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 3,8 g/L, entre aproximadamente 3,5 g/L y aproximadamente 3,7 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 5,9 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 5,7 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 5,5 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 5,3 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 5,1 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 4,9 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 4,8 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 4,7 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 4,6 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 4,5 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 4,4 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 4,3 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 4,1 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 4,0 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 3,9 g/L, entre aproximadamente 3,6 g/L y aproximadamente 3,8 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 5,9 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 5,7 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 5,5 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 5,3 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 5,1 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 4,9 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 4,8 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 4,7 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 4,6 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 4,5 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 4,4 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 4,3 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 4,1 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 4,0 g/L, entre aproximadamente 3,7 g/L y aproximadamente 3,9 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 5,9 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 5,7 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 5,5 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 5,3 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 5,1 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 4,9 g/L, entre aproximadamente 3.8 g/L y aproximadamente 4,8 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 4,7 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 4,6 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 4,5 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 4,4 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 4,3 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 4,1 g/L, entre aproximadamente 3,8 g/L y aproximadamente 4,0 g/L, entre aproximadamente 3,9 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 3,9 g/L y aproximadamente 5,9 g/L, entre aproximadamente 3,9 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 3,9 g/L y aproximadamente 5,7 g/L, entre aproximadamente 3,9 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 3,9 g/L y aproximadamente 5,5 g/L, entre aproximadamente 3,9 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 3,9 g/L y aproximadamente 5,3 g/L, entre aproximadamente 3,9 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 3,9 g/L y aproximadamente 5,1 g/L, entre aproximadamente 3,9 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 3,9 g/L y aproximadamente 4,9 g/L, entre aproximadamente 3,9 g/L y aproximadamente 4,8 g/L, entre aproximadamente 3,9 g/L y aproximadamente 4,7 g/L, entre aproximadamente 3,9 g/L y aproximadamente 4,6 g/L, entre aproximadamente 3,9 g/L y aproximadamente 4,5 g/L, entre aproximadamente 3,9 g/L y aproximadamente 4,4 g/L, entre aproximadamente 3,9 g/L y aproximadamente 4,3 g/L, entre aproximadamente 3,9 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 3,9 g/L y aproximadamente 4,1 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 5,9 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 5,7 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 5,5 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 5,3 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 5,1 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 4,9 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 4,8 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 4,7 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 4,6 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 4,5 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 4,4 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 4,3 g/L, entre aproximadamente 4,0 g/L y aproximadamente 4,2 g/L, entre aproximadamente 4,1 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 4,1 g/L y aproximadamente 5,9 g/L, entre aproximadamente 4,1 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 4,1 g/L y aproximadamente 5,7 g/L, entre aproximadamente 4,1 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 4,1 g/L y aproximadamente 5,5 g/L, entre aproximadamente 4,1 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 4,1 g/L y aproximadamente 5,3 g/L, entre aproximadamente 4,1 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 4,1 g/L y aproximadamente 5,1 g/L, entre aproximadamente 4,1 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 4,1 g/L y aproximadamente 4,9 g/L, entre aproximadamente 4,1 g/L y aproximadamente 4,8 g/L, entre aproximadamente 4,1 g/L y aproximadamente 4,7 g/L, entre aproximadamente 4,1 g/L y aproximadamente 4,6 g/L, entre aproximadamente 4,1 g/L y aproximadamente 4,5 g/L, entre aproximadamente 4,1 g/L y aproximadamente 4,4 g/L, entre aproximadamente 4,1 g/L y aproximadamente 4,3 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 5,9 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 5,7 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 5,5 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 4.2 g/L y aproximadamente 5,3 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 5,1 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 4,9 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 4,8 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 4,7 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 4,6 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 4,5 g/L, entre aproximadamente 4,2 g/L y aproximadamente 4,4 g/L, entre aproximadamente 4,3 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 4,3 g/L y aproximadamente 5,9 g/L, entre aproximadamente 4,3 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 4,3 g/L y aproximadamente 5,7 g/L, entre aproximadamente 4,3 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 4,3 g/L y aproximadamente 5,5 g/L, entre aproximadamente 4,3 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 4,3 g/L y aproximadamente 5,3 g/L, entre aproximadamente 4,3 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 4,3 g/L y aproximadamente 5,1 g/L, entre aproximadamente 4,3 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 4,3 g/L y aproximadamente 4,9 g/L, entre aproximadamente 4,3 g/L y aproximadamente 4,8 g/L, entre aproximadamente 4,3 g/L y aproximadamente 4,7 g/L, entre aproximadamente 4,3 g/L y aproximadamente 4,6 g/L, entre aproximadamente 4,3 g/L y aproximadamente 4,5 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 5,9 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 5,7 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 5,5 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 5,3 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 5,1 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 4,9 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 4,8 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 4,7 g/L, entre aproximadamente 4,4 g/L y aproximadamente 4,6 g/L, entre aproximadamente 4,5 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 4,5 g/L y aproximadamente 5,9 g/L, entre aproximadamente 4,5 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 4,5 g/L y aproximadamente 5,7 g/L, entre aproximadamente 4,5 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 4,5 g/L y aproximadamente 5,5 g/L, entre aproximadamente 4,5 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 4,5 g/L y aproximadamente 5,3 g/L, entre aproximadamente 4,5 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 4,5 g/L y aproximadamente 5,1 g/L, entre aproximadamente 4,5 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 4,5 g/L y aproximadamente 4,9 g/L, entre aproximadamente 4,5 g/L y aproximadamente 4,8 g/L, entre aproximadamente 4,5 g/L y aproximadamente 4,7 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 5,9 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 5,7 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 5,5 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 5,3 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 5,1 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 4,9 g/L, entre aproximadamente 4,6 g/L y aproximadamente 4,8 g/L, entre aproximadamente 4,7 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 4,7 g/L y aproximadamente 5,9 g/L, entre aproximadamente 4,7 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 4,7 g/L y aproximadamente 5,7 g/L, entre aproximadamente 4,7 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 4.7 g/L y aproximadamente 5,5 g/L, entre aproximadamente 4,7 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 4,7 g/L y aproximadamente 5,3 g/L, entre aproximadamente 4,7 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 4,7 g/L y aproximadamente 5,1 g/L, entre aproximadamente 4,7 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 4,7 g/L y aproximadamente 4,9 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 5,9 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 5,7 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 5,5 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 5,3 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 5,1 g/L, entre aproximadamente 4,8 g/L y aproximadamente 5,0 g/L, entre aproximadamente 4,9 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 4,9 g/L y aproximadamente 5,9 g/L, entre aproximadamente 4,9 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 4,9 g/L y aproximadamente 5,7 g/L, entre aproximadamente 4,9 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 4,9 g/L y aproximadamente 5,5 g/L, entre aproximadamente 4,9 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 4,9 g/L y aproximadamente 5,3 g/L, entre aproximadamente 4,9 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 4,9 g/L y aproximadamente 5,1 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 5,9 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 5,7 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 5,5 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 5,3 g/L, entre aproximadamente 5,0 g/L y aproximadamente 5,2 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 5,9 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 5,7 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 5,5 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 5,1 g/L y aproximadamente 5,3 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 5,9 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 5,7 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 5,5 g/L, entre aproximadamente 5,2 g/L y aproximadamente 5,4 g/L, entre aproximadamente 5,3 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 5,3 g/L y aproximadamente 5,9 g/L, entre aproximadamente 5,3 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 5,3 g/L y aproximadamente 5,7 g/L, entre aproximadamente 5,3 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 5,3 g/L y aproximadamente 5,5 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 5,9 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 5,7 g/L, entre aproximadamente 5,4 g/L y aproximadamente 5,6 g/L, entre aproximadamente 5,5 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 5,5 g/L y aproximadamente 5,9 g/L, entre aproximadamente 5,5 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 5,5 g/L y aproximadamente 5,7 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 5,9 g/L, entre aproximadamente 5,6 g/L y aproximadamente 5,8 g/L, entre aproximadamente 5,7 g/L y aproximadamente 6,0 g/L, entre aproximadamente 5,7 g/L y aproximadamente 5,9 g/L, o entre aproximadamente 5,8 g/L y aproximadamente 6,0 g/L) cuando la densidad de células viables en el medio está entre aproximadamente 60 x 10<6>células/mL a aproximadamente 90 x 10<6>células/mL (por ejemplo, entre aproximadamente 60 x 10<6>células/mL y aproximadamente 88 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 60 x 10<6>células/mL y aproximadamente 86 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 60 x 10<6>células/mL y aproximadamente 84 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 60 x 10<6>células/mL y aproximadamente 82 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 60 x 10<6>células/mL y aproximadamente 80 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 60 x 10<6>células/mL y aproximadamente 78 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 60 x 10<6>células/mL y aproximadamente 76 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 60 x 10<6>células/mL y aproximadamente 74 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 60 x 10<6>células/mL y aproximadamente 72 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 60 x 10<6>células/mL y aproximadamente 70 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 60 x 10<6>células/mL y aproximadamente 68 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 60 x 10<6>células/mL y aproximadamente 66 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 60 x 10<6>células/mL y aproximadamente 64 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 60 x 10<6>células/mL y aproximadamente 62 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 62 x 10<6>células/mL y aproximadamente 90 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 62 x 10<6>células/mL y aproximadamente 88 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 62 x 10<6>células/mL y aproximadamente 86 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 62 x 10<6>células/mL y aproximadamente 84 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 62 x 10<6>células/mL y aproximadamente 82 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 62 x 10<6>células/mL y aproximadamente 80 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 62 x 10<6>células/mL y aproximadamente 78 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 62 x 10<6>células/mL y aproximadamente 76 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 62 x 10<6>células/mL y aproximadamente 74 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 62 x 10<6>células/mL y aproximadamente 72 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 62 x 10<6>células/mL y aproximadamente 70 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 62 x 10<6>células/mL y aproximadamente 68 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 62 x 10<6>células/mL y aproximadamente 66 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 62 x 10<6>células/mL y aproximadamente 64 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 64 x 10<6>células/mL y aproximadamente 90 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 64 x 10<6>células/mL y aproximadamente 88 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 64 x 10<6>células/mL y aproximadamente 86 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 64 x 10<6>células/mL y aproximadamente 84 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 64 x 10<6>células/mL y aproximadamente 82 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 64 x 10<6>células/mL y aproximadamente 80 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 64 x 10<6>células/mL y aproximadamente 78 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 64 x 10<6>células/mL y aproximadamente 76 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 64 x 10<6>células/mL y aproximadamente 74 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 64 x 10<6>células/mL y aproximadamente 72 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 64 x 10<6>células/mL y aproximadamente 70 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 64 x 10<6>células/mL y aproximadamente 68 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 64 x 10<6>células/mL y aproximadamente 66 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 66 x 10<6>células/mL y aproximadamente 90 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 66 x 10<6>células/mL y aproximadamente 88 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 66 x 10<6>células/mL y aproximadamente 86 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 66 x 10<6>células/mL y aproximadamente 84 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 66 x 10<6>células/mL y aproximadamente 82 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 66 x 10<6>células/mL y aproximadamente 80 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 66 x 10<6>células/mL y aproximadamente 78 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 66 x 10<6>células/mL y aproximadamente 76 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 66 x 10<6>células/mL y aproximadamente 74 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 66 x 10<6>células/mL y aproximadamente 72 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 66 x 10<6>células/mL y aproximadamente 70 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 66 x 10<6>células/mL y aproximadamente 68 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 68 x 10<6>células/mL y aproximadamente 90 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 68 x 10<6>células/mL y aproximadamente 88 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 68 x 10<6>células/mL y aproximadamente 86 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 68 x 10<6>células/mL y aproximadamente 84 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 68 x 10<6>células/mL y aproximadamente 82 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 68 x 10<6>células/mL y aproximadamente 80 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 68 x 10<6>células/mL y aproximadamente 78 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 68 x 10<6>células/mL y aproximadamente 76 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 68 x 10<6>células/mL y aproximadamente 74 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 68 x 10<6>células/mL y aproximadamente 72 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 68 x 10<6>células/mL y aproximadamente 70 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 70 x 10<6>células/mL y aproximadamente 90 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 70 x 10<6>células/mL y aproximadamente 88 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 70 x 10<6>células/mL y aproximadamente 86 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 70 x 10<6>células/mL y aproximadamente 84 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 70 x 10<6>células/mL y aproximadamente 82 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 70 x 10<6>células/mL y aproximadamente 80 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 70 x 10<6>células/mL y aproximadamente 78 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 70 x 10<6>células/mL y aproximadamente 76 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 70 x 10<6>células/mL y aproximadamente 74 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 70 x 10<6>células/mL y aproximadamente 72 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 72 x 10<6>células/mL y aproximadamente 90 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 72 x 10<6>células/mL y aproximadamente 88 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 72 x 10<6>células/mL y aproximadamente 86 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 72 x 10<6>células/mL y aproximadamente 84 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 72 x 10<6>células/mL y aproximadamente 82 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 72 x 10<6>células/mL y aproximadamente 80 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 72 x 10<6>células/mL y aproximadamente 78 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 72 x 10<6>células/mL y aproximadamente 76 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 72 x 10<6>células/mL y aproximadamente 74 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 74 x 10<6>células/mL y aproximadamente 90 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 74 x 10<6>células/mL y aproximadamente 88 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 74 x 10<6>células/mL y aproximadamente 86 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 74 x 10<6>células/mL y aproximadamente 84 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 74 x 10<6>células/mL y aproximadamente 82 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 74 x 10<6>células/mL y aproximadamente 80 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 74 x 10<6>células/mL y aproximadamente 78 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 74 x 10<6>células/mL y aproximadamente 76 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 76 x 10<6>células/mL y aproximadamente 90 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 76 x 10<6>células/mL y aproximadamente 88 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 76 x 10<6>células/mL y aproximadamente 86 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 76 x 10<6>células/mL y aproximadamente 84 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 76 x 10<6>células/mL y aproximadamente 82 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 76 x 10<6>células/mL y aproximadamente 80 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 76 x 10<6>células/mL y aproximadamente 78 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 78 x 10<6>células/mL y aproximadamente 90 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 78 x 10<6>células/mL y aproximadamente 88 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 78 x 10<6>células/mL y aproximadamente 86 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 78 x 10<6>células/mL y aproximadamente 84 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 78 x 10<6>células/mL y aproximadamente 82 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 78 x 10<6>células/mL y aproximadamente 80 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 80 x 10<6>células/mL y aproximadamente 90 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 80 x 10<6>células/mL y aproximadamente 88 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 80 x 10<6>células/mL y aproximadamente 86 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 80 x 10<6>células/mL y aproximadamente 84 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 80 x 10<6>células/mL y aproximadamente 82 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 82 x 10<6>células/mL y aproximadamente 90 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 82 x 10<6>células/mL y aproximadamente 88 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 82 x 10<6>células/mL y aproximadamente 86 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 82 x 10<6>células/mL y aproximadamente 84 x 10<6>células/mL, entre aproximadamente 84 x 10⁶ células/mL y aproximadamente 90 x 10⁶ células</>mL, entre aproximadamente 84 x 10⁶ células /mL y aproximadamente 88 x 10⁶ células /mL, entre aproximadamente 84 x 10⁶ células /mL y aproximadamente 86 x 10⁶ células /mL, entre aproximadamente 86 x 10⁶ células /mL y aproximadamente 90 x 10⁶ células /mL, entre aproximadamente 86 x<10⁶>células/mL y aproximadamente 88 x 10⁶ células /mL, o entre aproximadamente 88 x 10⁶ células /mL y aproximadamente 90 x 10⁶ células /mL).
[0205] [0103] Cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento puede incluir aumentar la concentración de poloxámero-188 en el medio a más de 6,0 g/L (por ejemplo, mayor que 6,1 g/L, mayor que 6,2 g/L, mayor que 6,3 g/L, mayor que 6,4 g/L, mayor que 6,5 g/L, mayor que 6,6 g/L, mayor que 6,7 g/L, mayor que 6,8 g/L, mayor que 6,9 g/L, mayor que 7,0 g/L, mayor que 7,1 g/L, mayor que 7,2 g/L, mayor que 7,3 g/L, mayor que 7,4 g/L, mayor que 7,5 g/L, mayor que 7,6 g/L, mayor que 7,7 g/L, mayor que 7,8 g/L, mayor que 7,9 g/L, mayor que 8,0 g/L, mayor que 8,1 g/L, mayor que 8,2 g/L, mayor que 8,3 g/L, mayor que 8,4 g/L, mayor que 8,5 g/L, mayor que 8,6 g/L, mayor que 8,7 g/L, mayor que 8,8 g/L, mayor que 8,9 g/L, mayor que 9,0 g/L, mayor que 9,1 g/L, mayor que 9,2 g/L, mayor que 9,3 g/L, mayor que 9,4 g/L, mayor que 9,5 g/L, mayor que 9,6 g/L, mayor que 9,7 g/L, mayor que 9,8 g/L, mayor que 9,9 g/L, mayor que 10,0 g/L, mayor que aproximadamente 10,1 g/L, mayor que aproximadamente 10,2 g/L, mayor que aproximadamente 10,3 g/L, mayor que aproximadamente 10,4 g/L, mayor que aproximadamente 10,5 g/L, mayor que aproximadamente 10,6 g/L, mayor que aproximadamente 10,7 g/L, mayor que aproximadamente 10,8 g/L, mayor que aproximadamente 10,9 g/L o mayor que aproximadamente 11,0 g/L) poloxámero-188, cuando la densidad de células viables en el medio es mayor que aproximadamente 90 x 10<6>células/mL (por ejemplo, mayor que aproximadamente 91 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 92 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 93 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 94 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 95 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 96 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 97 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 98 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 99 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 100 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 101 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 102 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 103 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 104 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 105 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 106 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 107 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 108 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 109 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 110x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 111 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 112 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 113 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 114 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 115 x 10⁶ células /mL, mayor que aproximadamente 116 x 10⁶ células /mL, mayor que aproximadamente 117 x 10⁶ células /mL, mayor que aproximadamente 118 x 10⁶ células /mL, mayor que aproximadamente 119 x 10⁶ células /mL o mayor que aproximadamente 120 x 10⁶ células /mL).
[0207] En algunos casos, los procedimientos incluyen: aumentar la concentración de poloxámero-188 en el medio a entre aproximadamente 1,8 g/L y aproximadamente 3,0 g/L (por ejemplo, cualquiera de los intervalos intermedios descritos en el presente documento) cuando la densidad de células viables en el medio está entre aproximadamente 35 x 10<6>células/mL y aproximadamente 60 x 10<6>células/mL (por ejemplo, o cualquiera de los intervalos intermedios descritos en el presente documento); aumentar la concentración de poloxámero-188 en el medio a entre aproximadamente 3,0 g/L y aproximadamente 6,0 g/L (por ejemplo, cualquiera de los intervalos intermedios descritos en el presente documento) cuando la densidad de concentración de células viables en el medio está entre aproximadamente 60 x 10<6>células/mL y aproximadamente 90 x 10<6>células/mL (por ejemplo, cualquiera de los intervalos intermedios descritos en el presente documento); y aumentar la concentración de poloxámero-188 en el medio a más de 6,0 g/L (por ejemplo, cualquiera de las concentraciones mayores de 6,0 g/L descritas en el presente documento) cuando la concentración de densidad de células viables en el medio sea mayor de 90 x 10<6>células/mL (por ejemplo, cualquiera de las densidades de células viables mayores de 90 x 10<6>células/mL descritas en el presente documento). Algunos casos de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento incluyen además la determinación de la densidad de células viables en el medio en uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve o veinte) puntos de tiempo durante el cultivo.
[0209] Proporción entre Poloxámero-188 y Antiespumante
[0211] En cualquiera de los casos descritos en el presente documento, el medio líquido puede comprender antiespumante (por ejemplo, antiespumante-c) y la proporción de antiespumante (g/L) con respecto a poloxámero-188 (g/L) en el medio está entre aproximadamente 0,5 % y aproximadamente 6,0 % (por ejemplo, entre aproximadamente 0,5 % y aproximadamente 5,5 %, entre aproximadamente 0,5 % y aproximadamente 5,0 %, entre aproximadamente 0,5 % y aproximadamente 4,5 %, entre aproximadamente 0,5 % y aproximadamente 4,0 %, entre aproximadamente 0,5 % y aproximadamente 3,5 %, entre aproximadamente 0,5 % y aproximadamente 3,0 %, entre aproximadamente 0,5 % y aproximadamente 2,5 %, entre aproximadamente 0,5 % y aproximadamente 2,0 %, entre aproximadamente 0,5 % y aproximadamente 1,5 %, entre aproximadamente 0,5 % y aproximadamente 1,0 %, entre aproximadamente 1,0 % y aproximadamente 6,0 %, entre aproximadamente 1,0 % y aproximadamente 5,5 %, entre aproximadamente 1,0 % y aproximadamente 5,0 %, entre aproximadamente 1,0 % y aproximadamente 4,5 %, entre aproximadamente 1,0 % y aproximadamente 4,0 %, entre aproximadamente 1,0 % y aproximadamente 3,5 %, entre aproximadamente 1,0 % y aproximadamente 3,0 %, entre aproximadamente 1,0 % y aproximadamente 2,5 %, entre aproximadamente 1,0 % y aproximadamente 2,0 %, entre aproximadamente 1,0 % y aproximadamente 1,5 %, entre aproximadamente 2,0 % y aproximadamente 6,0 %, entre aproximadamente 2,0 % y aproximadamente 5,5 %, entre aproximadamente 2,0 % y aproximadamente 5,0 %, entre aproximadamente 2,0 % y aproximadamente 4,5 %, entre aproximadamente 2,0 % y aproximadamente 4,0 %, entre aproximadamente 2,0 % y aproximadamente 3,5 %, entre aproximadamente 2,0 % y aproximadamente 3,0 %, entre aproximadamente 2,0 % y aproximadamente 2,5 %, entre aproximadamente 2,5 % y aproximadamente 6,0 %, entre aproximadamente 2,5 % y aproximadamente 5,5 %, entre aproximadamente 2,5 % y aproximadamente 5,0 %, entre aproximadamente 2,5 % y aproximadamente 4,5 %, entre aproximadamente 2,5 % y aproximadamente 4,0 %, entre aproximadamente 2,5 % y aproximadamente 3,5 %, entre aproximadamente 2,5 % y aproximadamente 3,0 %, entre aproximadamente 3,0 % y aproximadamente 6,0 %, entre aproximadamente 3,0 % y aproximadamente 5,5 %, entre aproximadamente 3,0 % y aproximadamente 5,0 %, entre aproximadamente 3,0 % y aproximadamente 4,5 %, entre aproximadamente 3,0 % y aproximadamente 4,0 %, entre aproximadamente 3,0 % y aproximadamente 3,5 %, entre aproximadamente 3,5 % y aproximadamente 6,0 %, entre aproximadamente 3,5 % y aproximadamente 5,5 %, entre aproximadamente 3,5 % y aproximadamente 5,0 %, entre aproximadamente 3,5 % y aproximadamente 4,5 %, entre aproximadamente 3,5 % y aproximadamente 4,0 %, entre aproximadamente 4,0 % y aproximadamente 6,0 %, entre aproximadamente 4,0 % y aproximadamente 5,5 %, entre aproximadamente 4,0 % y aproximadamente 5,0 %, entre aproximadamente 4,0 % y aproximadamente 4,5 %, entre aproximadamente 4,5 % y aproximadamente 6,0 %, entre aproximadamente 4,5 % y aproximadamente 5,5 %, entre aproximadamente 4,5 % y aproximadamente 5,0 %, entre aproximadamente 5,0 % y aproximadamente 6,0 %, entre aproximadamente 5,0 % y aproximadamente 5,5 %, o entre aproximadamente 5,5 % y aproximadamente 6,0 %).
[0213] Medios de cultivo
[0215] En la técnica se conocen medios de cultivo líquidos. Los medios de cultivo líquidos (por ejemplo, un primer y/o segundo medio líquido) pueden complementarse con suero de mamífero (por ejemplo, suero fetal bovino y suero bovino) y/o una hormona de crecimiento o factor de crecimiento (por ejemplo, insulina, transferrina y factor de crecimiento epidérmico). De forma alternativa o adicional, los medios de cultivo líquidos (por ejemplo, un primer y/o segundo medio líquido) pueden ser un medio de cultivo líquido químicamente definido, un medio de cultivo líquido sin componentes de origen animal, un medio de cultivo líquido sin suero o un medio de cultivo líquido con suero. Existen ejemplos disponibles comercialmente no limitativos de medios de cultivo líquidos químicamente definidos, medios de cultivo líquidos sin componentes de origen animal, medios de cultivo líquidos sin suero o medios de cultivo líquidos con suero.
[0217] [0107] Un medio líquido generalmente contiene una fuente de energía (por ejemplo, un carbohidrato, tal como la glucosa), aminoácidos esenciales (por ejemplo, el conjunto básico de veinte aminoácidos más cisteína), vitaminas y/u otros compuestos orgánicos requeridos en bajas concentraciones, ácidos grasos libres y/u oligoelementos. Los medios de cultivo líquidos (por ejemplo, un primer y/o segundo medio líquido) pueden, si se desea, complementarse con, por ejemplo, una hormona o factor de crecimiento de mamíferos (por ejemplo, insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales y tampones (por ejemplo, sales de calcio, magnesio y fosfato), nucleósidos y bases (por ejemplo, adenosina, timidina e hipoxantina), hidrolizados de proteínas y tejidos, y/o cualquier combinación de estos aditivos.
[0218] En la técnica se conoce una amplia variedad de medios de cultivo líquidos que pueden utilizarse para cultivar células (por ejemplo, células de mamíferos) en cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento. Los componentes del medio que también pueden ser útiles en los presentes procesos incluyen, pero sin limitación, hidrolizados químicamente definidos (CD), por ejemplo, peptona CD, polipéptidos CD (dos o más aminoácidos) y factores de crecimiento CD. En la técnica se conocen ejemplos adicionales de medios líquidos y componentes de medios.
[0219] Los profesionales expertos comprenderán que el primer medio líquido y el segundo medio líquido o de alimentación descritos en este documento pueden ser del mismo tipo de medio o de medios diferentes.
[0220] El medio líquido obtenido de un cultivo celular puede filtrarse o clarificarse para obtener un medio líquido que está sustancialmente libre de células y/o virus. En la técnica se conocen procedimientos para filtrar o clarificar un medio líquido con el fin de extraer células (por ejemplo, filtración de 0,2 µm y filtración mediante un sistema de flujo tangencial alterno (ATFTM)). Las células de mamíferos también pueden extraerse del medio líquido mediante centrifugación y extrayendo el sobrenadante, que es el medio líquido que está sustancialmente libre de células, o bien permitiendo que las células se sedimenten en el fondo por gravedad de un recipiente o biorreactor que contenga el medio líquido, y extrayendo el medio líquido (el medio líquido que está sustancialmente libre de células) que se encuentra alejado de las células recombinantes sedimentadas.
[0221] Temperatura
[0222] La etapa de cultivo de células de mamíferos se puede realizar a una temperatura de aproximadamente 31 °C a aproximadamente 40 °C. Los profesionales experimentados comprenderán que la temperatura se puede cambiar en un punto o puntos de tiempo específicos durante la etapa de cultivo, por ejemplo, cada hora o diariamente. Por ejemplo, la temperatura se puede desplazar o modificar (por ejemplo, aumentar o disminuir) aproximadamente uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve días o aproximadamente veinte días o más después de la siembra inicial del biorreactor con la célula (por ejemplo, célula de mamífero). Por ejemplo, la temperatura se puede desplazar hacia arriba (por ejemplo, un cambio de hasta o aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o hasta o aproximadamente 20 grados C). Por ejemplo, la temperatura se puede desplazar hacia abajo (por ejemplo, un cambio de hasta o aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o hasta o aproximadamente 20 °C).
[0223] CO2
[0224] La etapa de cultivo descrita en el presente documento puede incluir además la exposición del medio líquido en el biorreactor a una atmósfera que contenga como máximo o aproximadamente un 15 % de CO<2>(por ejemplo, como máximo o aproximadamente un 14 % de CO<2>, 12 % de CO<2>, 10 % de CO<2>, 8 % de CO<2>, 6 % de CO<2>, 5 % de CO<2>, 4 % de CO<2>, 3 % de CO<2>, 2 % de CO<2>, o como máximo o aproximadamente un 1 % de CO<2>).
[0225] Proteínas recombinantes
[0226] [0113] Ejemplos no limitativos de proteínas recombinantes que pueden producirse mediante los procedimientos proporcionados en el presente documento incluyen inmunoglobulinas (incluidas las inmunoglobulinas de cadena ligera y pesada, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, cualquiera de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento), enzimas (por ejemplo, una galactosidasa (por ejemplo, una alfa-galactosidasa), Myozyme o Cerezyme), proteínas (por ejemplo, eritropoyetina humana, factor de necrosis tumoral (TNF) o un interferón alfa o beta), o proteínas o fragmentos de proteínas inmunogénicas o antigénicas (por ejemplo, proteínas para uso en una vacuna). La proteína recombinante puede ser un polipéptido de unión a antígeno modificado genéticamente que contiene al menos un andamio de proteína recombinante multifuncional (véase, por ejemplo, las proteínas recombinantes de unión a antígeno descritas en Gebauer et al., Current Opin. Chem. Biol. 13:245-255, 2009; y la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2012/0164066). Ejemplos no limitantes de proteínas recombinantes que son anticuerpos incluyen panitumumab, omalizumab, abagovomab, abciximab, actoxumab, adalimumab, adecatumumab, afelimomab, afutuzumab, alacizumab, alacizumab, alemtuzumab, alirocumab, altumomab, amatuximab, amatuximab, anatumomab, anrukinzumab, apolizumab, arcitumomab, atinumab, tocilizumab, basilizimab, bectumomab, belimumab, bevacizumab, besilesomab, bezlotoxumab, biciromab, canakinumab, certolizumab, cetuximab, cixutumumab, daclizumab, denosumab, densumab, eculizumab, edrecolomab, efalizumab, efungumab, epratuzumab, ertumaxomab, etaracizumab, figitumumab, golimumab, ibritumomab tiuxetan, igovomab, imgatuzumab, infliximab, inolimomab, inotuzumab, labetuzumab, lebrikizumab, moxetumomab, natalizumab, obinutuzumab, oregovomab, palivizumab, panitumumab, pertuzumab, ranibizumab, rituximab, tocilizumab, tositumomab, tralokinumab, tucotuzumab, trastuzumab, veltuzumab, zalutumumab y zatuximab. En la técnica se conocen ejemplos adicionales de anticuerpos recombinantes que pueden producirse mediante los procedimientos descritos en el presente documento. Otros ejemplos no limitativos de proteínas recombinantes que pueden producirse mediante los presentes procedimientos incluyen: alglucosidasa alfa, laronidasa, abatacept, galsulfasa, lutropina alfa, factor antihemofílico, agalsidasa beta, interferón beta-1a, darbepoetina alfa, tenecteplasa, etanercept, factor de coagulación IX, hormona foliculoestimulante, interferón beta-1a, imiglucerasa, dornasa alfa, epoetina alfa, insulina o análogos de insulina, mecasermina, factor VIII, factor VIIa, antitrombina III, proteína C, albúmina humana, eritropoyetina, factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, interleucina-11, laronidasa, idursulfasa, galsulfasa, inhibidor de α-1-proteinasa, lactasa, adenosina desaminasa, activador tisular del plasminógeno, tirotropina alfa (por ejemplo, Thyrogen<®>) y alteplasa. Ejemplos adicionales de proteínas recombinantes que pueden producirse mediante los presentes procedimientos incluyen α-glucosidasa ácida, alglucosidasa alfa (por ejemplo, Myozyme<®>y Lumizyme<®>), α-L-iduronidasa (por ejemplo, Aldurazyme<®>), iduronato sulfatasa, heparán N-sulfatasa, galactosa-6-sulfatasa, βgalactosidasa ácida, β-glucuronidasa, N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa, α-N-acetilgalactosaminidasa, lipasa ácida, ceramidasa ácida lisosomal, esfingomielinasa ácida, β-glucosidasa (por ejemplo, Cerezyme<®>y Ceredase<®>), galactosilceramidasa, α-galactosidasa-A (por ejemplo, Fabrazyme<®>), β-galactosidasa ácida, β-galactosidasa, neuraminidasa, hexosaminidasa A y hexosaminidasa B. En algunas realizaciones, la proteína recombinante es una enzima galactosidasa (por ejemplo, una enzima α-galactosidasa, tal como la α-galactosidasa A).
[0228] Una proteína recombinante soluble secretada puede recuperarse del medio líquido (por ejemplo, un primer y/o segundo medio líquido) extrayendo o de otro modo separando físicamente el medio líquido de las células (por ejemplo, células de mamíferos). En la técnica se conocen diversos procedimientos para extraer el medio líquido de las células (por ejemplo, células de mamíferos), que incluyen, por ejemplo, la centrifugación, la filtración, el pipeteo y/o la aspiración. La proteína recombinante secretada puede entonces recuperarse y purificarse aún más del medio líquido mediante diversas técnicas bioquímicas, que incluyen varios tipos de cromatografía (por ejemplo, cromatografía de afinidad, cromatografía de tamiz molecular, cromatografía de intercambio catiónico o cromatografía de intercambio aniónico) y/o filtración (por ejemplo, filtración con corte de peso molecular).
[0230] Recogida de la proteína recombinante
[0232] Algunas realizaciones incluyen además la recogida de la proteína recombinante (por ejemplo, cualquiera de las proteínas recombinantes descritas en este documento). En algunos ejemplos, la recogida incluye la lisis de las células de mamífero. En otros ejemplos, la recogida puede incluir la recogida de la proteína recombinante del medio (por ejemplo, uno o ambos del primer y segundo medio líquido cuando se realiza un cultivo por perfusión, o uno o ambos del primer medio líquido y el medio líquido de alimentación cuando se realiza un cultivo discontinuo).
[0234] [0116] La recogida se puede realizar después de que el cultivo alcance una densidad de células viables de, por ejemplo, mayor que aproximadamente 30 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 32 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 34 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 36 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 38 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 40 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 42 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 44 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 46 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 48 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 50 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 52 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 54 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 56 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 58 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 60 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 62 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 64 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 66 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 68 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 70 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 72 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 74 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 76 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 78 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 80 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 82 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 84 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 86 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 88 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 90 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 92 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 94 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 96 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 98 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 100 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 102 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 104 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 106 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 108 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 110 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 112 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 114 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 116 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 118 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 120 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 122 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 124 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 126 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 128 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 130 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 132 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 134 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 136 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 138 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 140 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 142 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 144 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 146 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 148 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 150 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 152 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 154 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 156 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 158 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 160 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 162 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 164 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 166 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 168 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 170 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 172 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 174 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 176 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 178 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 180 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 182 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 184 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 186 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 188 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 190 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 192 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 194 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 196 x 10<6>células/mL, mayor que aproximadamente 198 x 10<6>células/mL, o mayor que aproximadamente 200 x 10<6>células/mL).
[0235] Formulación de la proteína recombinante
[0236] Algunos casos de cualquiera de los procedimientos descritos en este documento incluyen, además, una etapa de formulación de la proteína recombinante (por ejemplo, proteína recombinante recogida) en una composición farmacéutica. Por ejemplo, la formulación puede incluir la adición de un excipiente farmacéuticamente aceptable a la proteína recombinante (por ejemplo, proteína recombinante recogida). La formulación puede incluir la mezcla de un excipiente farmacéuticamente aceptable con la proteína recombinante (por ejemplo, proteína recombinante recogida). Ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, excipientes farmacéuticamente aceptables no naturales) son bien conocidos en la técnica. En algunos casos, la proteína recombinante (por ejemplo, proteína recombinante recogida) se formula para su administración intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular.
[0237] EJEMPLOS
[0238] Ejemplo 1. Efecto del aumento de las concentraciones de Poloxámero-188 en un cultivo celular por perfusión que produce un anticuerpo recombinante secretado.
[0239] Este conjunto de experimentos se realizó para probar el efecto de concentraciones crecientes de poloxámero-188 en el crecimiento celular y la producción de anticuerpos recombinantes en un cultivo celular por perfusión que incluía células de mamífero que contenían un ácido nucleico que codificaba el anticuerpo recombinante. En estos experimentos, se realizó una primera serie de cultivo celular por perfusión que utilizó medio CD-CHO que contenía 1,8 g/L durante todo el período de cultivo y una segunda serie de cultivo celular por perfusión que se realizó utilizando medio CD-CHO que contenía concentraciones crecientes de poloxámero-188 durante el período de cultivo (aumentando de 1,8 g/L a 6,8 g/L de poloxámero-188 durante el período de cultivo). Para cada serie de cultivo celular, la perfusión se realizó a una tasa de 4 volúmenes de reactor (RV,reactor volume)/día desde el día 12 hasta el día 33 del cultivo, cambiando a una tasa de 6 RV/día desde el día 33 hasta el día 63 del cultivo, y cambiando a una tasa de 7 RV/día desde el día 63 hasta el día 72 del cultivo. La segunda serie de cultivo celular se realizó utilizando medio CD-CHO que contenía 1,8 g/L de poloxámero-188 desde el día 0 hasta el día 14 del cultivo, medio CD-CHO que contenía 2,8 g/L de poloxámero-188 desde el día 15 hasta el día 34 del cultivo, medio CD-CHO que contenía 3,8 g/L de poloxámero-188 desde el día 35 hasta el día 39 del cultivo, medio CD-CHO que contenía 4,8 g/L de poloxámero-188 desde el día 40 hasta el día 56 del cultivo, y medio CD-CHO que contenía 5,8 g/L de poloxámero-188 desde el día 57 hasta el día 72 del cultivo.
[0240] La densidad de células viables, la tasa de crecimiento específica, el porcentaje de células viables, la tasa de productividad volumétrica y la tasa de productividad específica se determinaron cada día para los primero y segundo cultivos por perfusión utilizando procedimientos bien conocidos.
[0241] Los datos muestran que se alcanzan densidades de células viables superiores a 100 x 10<6>células /mL al establecer una concentración de poloxámero-188 mayor que 1,8 g/L en el cultivo (Figura 1). En cambio, la primera serie de cultivo celular que utilizó solo 1,8 g/L de poloxámero-188 en el medio de cultivo solo alcanzó una densidad de células viables de 50 x 10<6>células/mL (Figura 1). Los datos para la segunda serie de cultivo celular también muestran que establecer una concentración de poloxámero-188 mayor que 1,8 g/L en el cultivo resulta en una tasa de crecimiento específica robusta, incluso cuando el cultivo celular tiene una densidad de células viables mayor que 100 x 10<6>células/mL (Figura 2). Los datos de la Figura 3 también muestran que establecer una concentración de poloxámero-188 mayor que 1,8 g/L en el cultivo da como resultado un porcentaje alto y constante de células viables (mayor que el 80 % durante todo el período de cultivo) en comparación con la serie de cultivo celular por perfusión que utilizó medios de cultivo que contenían 1,8 g/L de poloxámero-188 durante todo el período de cultivo (Figura 3).
[0242] [0121] Los datos de las figuras 4 y 5 también muestran que la segunda serie del cultivo celular por perfusión realizada con medios de cultivo que contienen concentraciones crecientes de poloxámero-188 durante el período de cultivo (aumentando de 1,8 g/L a 6,8 g/L de poloxámero-188) tiene altas tasas de productividad volumétrica (mayor que 3 g/L/d) y altas tasas de productividad específica (entre 15 pg/célula/día y 42 pg/célula/día), respectivamente.
[0243] Ejemplo 2. Efecto del aumento de las concentraciones de Poloxámero-188 sobre la estabilidad de un anticuerpo recombinante en medio líquido
[0244] Se realizó una serie de experimentos para determinar si concentraciones aumentadas de poloxámero-188 inhibirían la degradación de una proteína recombinante presente en un medio líquido clarificado después de la recogida de un cultivo celular. En estos experimentos, se realizó una serie de cultivo celular por perfusión similar a la segunda serie de cultivo celular por perfusión descrita en el Ejemplo 1, excepto que después de que el cultivo alcanzó una concentración de 6,8 g/L de poloxámero-188, la concentración de poloxámero-188 en el cultivo se redujo a 3,95 g/L de poloxámero-188, y a continuación se redujo una vez más a 3,0 g/L de poloxámero-188. En estos experimentos, se extrajeron dos o tres muestras del medio líquido del cultivo en los siguientes puntos de tiempo: un primer punto de tiempo cuando el cultivo contenía 6,8 g/L de poloxámero-188, un segundo punto de tiempo cuando el cultivo contenía una concentración de 3,95 g/L de poloxámero-188 y un tercer punto de tiempo cuando el cultivo contenía una concentración de 3,0 g/L de poloxámero-188. Una muestra recogida de cada uno de los puntos de tiempo se almacenó a 4 °C, una muestra recogida de cada uno de los puntos de tiempo se incubó durante 7 días a temperatura ambiente antes de almacenarla a 4 °C, y para cada uno de los segundos y terceros puntos de tiempo, una muestra se suplementó con poloxámero-188 para alcanzar una concentración de 6,8 g/L de poloxámero-188 en cada muestra, y a continuación cada muestra se incubó durante 9 días a temperatura ambiente antes de almacenarla a 4 °C. Las muestras resultantes, tanto sin tratar como tratadas, se analizaron mediante electroforesis en gel de bis-tris al 4-20 % y se tiñeron con azul de Coomassie.
[0245] Los datos de la Figura 6 muestran que las muestras no tratadas que contienen 6,8 g/L, 3,95 g/L o 3,0 g/L de poloxámero-188 mostraron una estabilidad del producto similar (carriles 1, 2 y 3). Los datos también muestran sorprendentemente que la muestra que contiene 6,8 g/L de poloxámero-188 no muestra una degradación sustancial después de una incubación de 7 días a temperatura ambiente, mientras que las muestras que contienen 3,0 g/L o 3,95 g/L de poloxámero-188 mostraron una degradación detectable después de la misma incubación (Figura 6; carriles 1a, 2a y 3a). Los datos también demuestran que la adición de poloxámero-188 a una muestra que contiene poco poloxámero-188 no mejora la estabilidad del producto (Figura 6; carriles 2b y 3b). Estos datos demuestran que el uso de concentraciones de poloxámero-188 superiores a 1,8 g/L en el cultivo puede reducir o inhibir la degradación de las proteínas recombinantes en el cultivo, e indican que el poloxámero-188 puede estar logrando este efecto al proporcionar un cultivo celular más saludable.
[0246] Ejemplo 3. Efecto del tipo y tamaño de los poros del difusor en la cantidad de poloxámero-188 necesaria para lograr un efecto beneficioso en el crecimiento y la productividad del cultivo celular
[0247] Se realizó una serie de experimentos para analizar el efecto del tipo y tamaño del poro del difusor en la cantidad de poloxámero-188 necesaria para lograr propiedades beneficiosas de crecimiento y productividad en un cultivo celular por perfusión. En estos experimentos, se realizaron diferentes series de cultivos celulares por perfusión utilizando diferentes difusores: un difusor con un poro sinterizado de un tamaño de 20 Tm (1 reactor); un difusor con un poro perforado de un tamaño de 200 Tm (2 reactores); o un difusor con un poro perforado de un tamaño de 500 Tm (1 reactor). Cada cultivo por perfusión utilizó inicialmente medio CD CHO que contenía 1,8 g/L de poloxámero-188 y el poloxámero-188 se añadió al cultivo en incrementos crecientes para mantener la viabilidad celular y minimizar la lisis celular, según fuera necesario. La densidad de células viables, la tasa de crecimiento específica, la tasa de producción específica de lactato deshidrogenasa, el porcentaje de células viables, la tasa de productividad volumétrica y el consumo aeróbico de glucosa para cada cultivo celular se determinaron en diferentes puntos de tiempo durante el período de cultivo utilizando procedimientos bien conocidos.
[0248] Los datos muestran que una concentración de 3,8 g/L de poloxámero-188 en el cultivo fue capaz de mantener la densidad de células viables en la serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando un difusor con un poro perforado con un tamaño de 500 Tm, una concentración de 4,8 g/L de poloxámero-188 fue capaz de mantener la densidad de células viables en la serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando un difusor con un poro perforado con un tamaño de 200 Tm, y una concentración de 5,8 g/L de poloxámero-188 fue capaz de mantener la densidad de células viables en la serie de cultivo celular por perfusión realizada utilizando un difusor con un poro sinterizado con un tamaño de 20 Tm (Figura 7).
[0249] Los datos también muestran que se lograron tasas de crecimiento específicas (Figura 8), tasas de producción específica de lactosa deshidrogenasa (Figuras 9 y 11), porcentajes de células viables (Figura 10), tasas de productividad volumétrica (Figura 12) y tasas de consumo aeróbico de glucosa (Figura 13) similares para la serie del cultivo celular por perfusión realizada utilizando 3,8 g/L de poloxámero-188 y un difusor con un poro perforado con un tamaño de 500 Tm, la serie del cultivo celular por perfusión realizada utilizando 4,8 g/L de poloxámero-188 y un difusor con un poro sinterizado con un tamaño de 200 Tm, y la serie del cultivo celular por perfusión realizada utilizando 5,8 g/L de poloxámero-188 y un difusor con un poro sinterizado con un tamaño de 20 Tm.
[0250] Los datos muestran que todos los difusores probados pueden utilizarse para lograr una densidad de células viables de 60 x 10<6>células/mL, cuando el poloxámero-188 está presente en una concentración mayor que 1,8 g/L en el cultivo. Por ejemplo, se puede lograr una densidad de células viables de más de 60 x 10<6>células/mL en: una serie de cultivo celular por perfusión utilizando un difusor con un poro perforado con un tamaño de 1 mm utilizando 2,8 g/L de poloxámero-188 en el cultivo, una serie de cultivo celular por perfusión utilizando un difusor con un poro perforado con un tamaño de 500 Tm utilizando 3,8 g/L de poloxámero-188 en el cultivo, una serie de cultivo celular por perfusión utilizando un difusor con un poro perforado con un tamaño de 200 Tm utilizando 4,8 g/L de poloxámero-188 en el cultivo, una serie de cultivo celular por perfusión utilizando un difusor con un poro sinterizado con un tamaño de 100 Tm utilizando 3,8 g/L de poloxámero-188 en el cultivo, y una serie de cultivo por perfusión utilizando un difusor con un poro sinterizado con un tamaño de 20 Tm utilizando 5,8 g/L de poloxámero-188 en el cultivo. Los datos indican que cuanto menor sea el tamaño del poro, mayor será la cantidad de poloxámero-188 necesaria para mantener un cultivo saludable.
[0251] Ejemplo 4. Efecto del tipo de poro del difusor, el tamaño del poro y la proporción antiespumante/poloxámero-188 en el crecimiento celular en cultivos por perfusión.
[0252] Se realizó un conjunto adicional de experimentos para determinar el crecimiento celular en estado estacionario en cultivos por perfusión utilizando difusores con diferentes tipos y tamaños de poros y diferentes proporciones de antiespumante con respecto a poloxámero-188 en el cultivo (mostrados en la Tabla 1 a continuación).
[0253] Los datos de la Tabla 1 muestran que un tamaño de poro más pequeño requiere que se agregue más antiespumante-c al cultivo para mitigar la generación de espuma, que se necesita antiespumante-c adicional a medida que aumenta la tasa de burbujeo, y que la proporción óptima de antiespumante-c con respecto a poloxámero-188 puede estar entre 0 y < 5 % (por ejemplo, entre aproximadamente 1 % y aproximadamente 3 %).
[0254] Tabla 1. Densidad de células viables en estado estacionario alcanzada para cultivos por perfusión bajo análisis
[0256]
[0258] Ejemplo 5. Efecto de la proporción Antiespumante-C/Poloxámero-188 en el crecimiento celular en series de cultivos celulares discontinuos
[0259] Se realizó un conjunto de experimentos para analizar el efecto de la proporción antiespumante-c/poloxámero-188 en el crecimiento celular en series de cultivos celulares discontinuos en matraces de agitación utilizando medio CD-CHO que contenía una proporción antiespumante-c/poloxámero-188 del 0 %, una proporción antiespumantec/poloxámero-188 del 5,6 %, una proporción antiespumante-c/poloxámero-188 del 11,1 %, una proporción antiespumante-c/poloxámero-188 del 27,8 % o una proporción antiespumante-c/poloxámero-188 del 55,6 %. Los cultivos celulares en matraces de agitación contaban con deflectores para generar burbujas pasivamente y simular un biorreactor. La densidad de células viables y la tasa de producción específica de lactato deshidrogenasa en cada serie de cultivo celular se determinaron diariamente durante el período de cultivo utilizando procedimientos bien conocidos.
[0261] Los datos muestran que proporciones más bajas de antiespumante-c con respecto a poloxámero-188 demuestran densidades de células viables mejoradas (Figura 14) y tasas de producción de lactato deshidrogenasa específicas más bajas (Figura 15). Estos datos sugieren además que la proporción óptima de antiespumante-c con respecto a poloxámero-188 en un cultivo se encuentra entre 0 y menos de aproximadamente el 5 % (por ejemplo, entre aproximadamente el 1 % y aproximadamente el 3 %).

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para cultivar una célula de mamífero, que comprende:
cultivar por perfusión una célula de mamífero que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante en condiciones suficientes para producir la proteína recombinante, en el que:
el cultivo por perfusión comprende cultivar en un medio líquido que comprende poloxámero-188 a una concentración de 1,8 g/L o a una concentración mayor que 1,8 g/L;
el procedimiento comprende aumentar la concentración de poloxámero-188 en el medio con el tiempo en función de la densidad de células viables en el medio;
el poloxámero-188 está presente en el medio líquido y/o se añade al medio líquido antes de la etapa de cultivo y/o se añade al medio líquido durante la etapa de cultivo; y
el procedimiento comprende aumentar la concentración de poloxámero-188 en el medio a más de 6,0 g/L, cuando la densidad de células viables en el medio es mayor que 90 x 10<6>células/mL.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el procedimiento comprende añadir poloxámero-188 al medio líquido antes de la etapa de cultivo.
3. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el procedimiento comprende añadir poloxámero-188 al medio líquido durante la etapa de cultivo.
4. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el procedimiento comprende añadir poloxámero-188 al medio líquido antes de la etapa de cultivo y añadir poloxámero-188 al medio durante la etapa de cultivo.
5. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el poloxámero-188 está presente en el medio líquido.
6. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el cultivo por perfusión comprende: proporcionar un recipiente que comprende células de mamífero dispuestas en un primer medio líquido;
incubar el recipiente con agitación y durante un período de cultivo de al menos aproximadamente 7 días a una temperatura entre aproximadamente 32 °C y aproximadamente 40 °C; y
de forma continua o periódica después de las primeras 48 a 96 horas del período de cultivo, extraer un primer volumen del primer medio líquido y añadir al primer medio líquido un segundo volumen de un segundo medio líquido, en el que el primer y el segundo volúmenes son aproximadamente iguales.
7. Procedimiento, según la reivindicación 6, en el que el segundo medio líquido comprende poloxámero-188 en una concentración mayor que la del primer medio líquido.
8. Procedimiento, según la reivindicación 6 o 7, en el que el primer medio líquido comprende poloxámero-188 a una concentración de 1,8 g/L o a una concentración inferior a 1,8 g/L, y el segundo medio líquido comprende poloxámero-188 a una concentración mayor que 1,8 g/L.
9. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, que comprende además:
recoger proteína recombinante de las células de mamíferos, del primer medio líquido, o del segundo medio líquido, o cualquier combinación de los mismos.
10. Procedimiento, según la reivindicación 6, en el que el primer medio líquido y/o el segundo medio líquido se seleccionan del grupo que consiste en: un medio de cultivo líquido químicamente definido, un medio de cultivo líquido sin suero, un medio de cultivo líquido que contiene suero, un medio de cultivo líquido sin componentes de origen animal y un medio sin proteínas.
11. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la célula de mamífero es una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula de riñón embrionario humano (HEK), una célula NSO, una célula de riñón de hámster bebé (BHK), una célula PerC6, una célula Vero o una línea celular HT-1080.
12. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la proteína recombinante es una inmunoglobulina, una enzima, un factor de crecimiento, un fragmento de proteína o una proteína modificada genéticamente.
13. Procedimiento, según la reivindicación 12, en el que la enzima es una galactosidasa.
14. Procedimiento, según la reivindicación 13, en el que la galactosidasa es una α-galactosidasa.
15. Procedimiento, según la reivindicación 14, en el que la α-galactosidasa es α-galactosidasa-A.
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