ES3070865T3 - Glp-1 receptor ligand moiety conjugated oligonucleotides and uses thereof - Google Patents

Glp-1 receptor ligand moiety conjugated oligonucleotides and uses thereof

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ES3070865T3 ES17793322T ES17793322T ES3070865T3 ES 3070865 T3 ES3070865 T3 ES 3070865T3 ES 17793322 T ES17793322 T ES 17793322T ES 17793322 T ES17793322 T ES 17793322T ES 3070865 T3 ES3070865 T3 ES 3070865T3
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Brett Monia
Thazha Prakash
Garth Kinberger
Richard Lee
Punit Seth
Shalini Andersson
Eva Ämmälä
Daniel Knerr
Astrid Olwegard-Halvarsson
William Drury
Eric Valeur
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Abstract

Las presentes modalidades proporcionan compuestos y métodos para dirigir la acción a células que expresan el receptor GLP-1. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Oligonucleótidos conjugados con resto ligando del receptor del GLP-1 y utilización de los mismos
[0003] Listado de secuencias
[0004] La presente solicitud se presenta junto con un listado de secuencias en formato electrónico. El listado de secuencias se proporciona como un archivo titulado BIOL0303WOSEQ_ST25.txt creado el 27 de abril de 2017, que tiene un tamaño de 29 kb.
[0005] Campo
[0006] Las presentes realizaciones proporcionan compuestos y métodos para la localización específica de las células que expresan el receptor del GLP-1.
[0007] Antecedentes
[0008] El receptor del GLP-1 es un receptor acoplado a la proteína G de clase 2 que se acopla a la adenilato ciclasa a través de un receptor estimulador de la proteína G. La estimulación intestinal de los nutrientes conduce a la liberación del péptido-1 similar al glucagón en la circulación. El GLP-1 circulante se une al receptor del GLP-1 de las células beta de los islotes del páncreas. Esto activa el receptor del GLP-1, que induce una serie de eventos de señalización que dan como resultado la exocitosis de la insulina en las células beta de los islotes. La unión entre el GLP-1 y el receptor del GLP-1 conduce a la internalización del receptor en el citoplasma y, finalmente, a la clasificación en lisosomas (Kuna y col., 2013 Am J Physiol Endo Metab 305:E161-E170).
[0009] El documento US2012/329708 A1 describe péptidos y variantes de péptidos que presentan una actividad mejorada en el receptor del GLP-1, en comparación con el glucagón natural. Ming y col. (Nucleic Acids Res., 38(19), (2010), 6567-6576) describen el suministro intracelular de un oligonucleótido antisentido mediante endocitosis de un receptor acoplado a la proteína G. Liang y col. (Mol. Imaging Biol., 18(1), (2015), 79-89) describen el impacto cuantitativo del aclaramiento plasmático y la regulación a la baja en la obtención de imágenes moleculares del receptor del GLP-1. Brom y col. (Contrast Media Mol. Imaging, 7(2), (2012), 160-166) describen análogos del GLP-1 radiomarcados para la localización específicain vivode los insulinomas. Finan y col. (Nat. Med., 18 (2012), 1847-1856) describen el suministro de localización específica de estrógenos que revierte el síndrome metabólico. Wang y col. (Diabetes, 63(5), (2014), 1465-1474) describen nanopartículas magnéticas de localización específica del GLP-1R para la obtención de imágenes de los islotes pancreáticos. Hung y col. (Nucleic Acid Ther., 23 (6), (2013), 369-378) describen la caracterización de la reducción del ARNm diana mediante la hibridación in situ del ARN en múltiples sistemas de órganos tras un tratamiento antisentido sistémico en animales. Samuel y col. (Diabetes, 55(7), (2006), 2042-2050) describen que la localización específica del Foxo1 en ratones utilizando oligonucleótidos antisentido mejora la acción de la insulina hepática y periférica. El documento US2012/295958 A1 describe compuestos, composiciones y métodos para modular la expresión del receptor de glucagón. Körner y col. (J. Nucl. Med., 48(5), (2007), 736-743) describen la expresión del receptor del GLP-1 en tumores humanos y tejidos humanos normales, y el potencial para la localización específica in vivo.
[0010] Resumen
[0011] Las realizaciones proporcionadas en la presente memoria se refieren a compuestos diseñados para modular la expresión de un ácido nucleico diana en células que expresan el receptor del GLP-1.
[0012] En la presente memoria, se proporciona un oligonucleótido modificado, un conector del conjugado y un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1, en donde el oligonucleótido modificado es un oligonucleótido que comprende al menos un enlace internucleosídico modificado, al menos un azúcar modificado o al menos una nucleobase modificada en relación con el ADN o ARN no modificado; en donde el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases complementaria a la de un ácido nucleico diana, el ácido nucleico diana está en una célula que expresa el receptor del GLP-1 y el compuesto es capaz de hibridarse con el ácido nucleico diana, dando como resultado al menos una actividad antisentido.
[0013] En ciertas realizaciones, el conector del conjugado une el oligonucleótido modificado al resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1.
[0014] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado tiene una longitud de 15 a 30 nucleósidos unidos.
[0015] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende: un segmento de hueco que consiste en desoxinucleósidos unidos; un segmento de ala en 5' que consiste en nucleósidos unidos; y un segmento de ala en 3' que consiste en nucleósidos unidos; en donde el segmento de hueco se coloca inmediatamente adyacente al segmento de ala en 5' y al segmento de ala en 3' y entre ambos, y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
[0016] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado es monocatenario. En ciertas realizaciones, el compuesto comprende un dúplex bicatenario.
[0017] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado es complementario a un transcrito de ARN en una célula. En ciertas realizaciones, la célula es una célula pancreática o una célula beta de los islotes.
[0018] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 es un resto del conjugado de péptido, un resto del conjugado de molécula pequeña, un resto del conjugado de aptámero o un resto del conjugado de anticuerpo de localización específica del receptor del GLP-1. En ciertas realizaciones, el resto del conjugado de péptido es un resto del conjugado del péptido GLP-1 capaz de unirse al receptor del GLP-1. En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 comprende una porción de al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 aminoácidos contiguos que tiene al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % de homología o identidad con una porción de igual longitud de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de sec. n.°: 1-57. En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de sec. n.°: 1-57.
[0019] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 comprende la secuencia de aminoácidos:
[0020] (a) His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys (Id. de sec. n.°: 22), en donde Aib es ácido aminoisobutírico; o (b) His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Pen (Id. de sec. n.°: 23), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y Pen es penicilamina; o
[0021] (c) His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (Id. de sec. n.°: 1).
[0022] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 tiene una longitud de 8 a 50 aminoácidos y presenta al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % de homología en toda su longitud con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de sec. n.°: 1-57.
[0023] En ciertas realizaciones, el conector del conjugado comprende (a) 1-5 nucleósidos conectores; o (b) 3 nucleósidos conectores; o (c) 3 nucleósidos conectores que tienen un motivo TCA.
[0024] En ciertas realizaciones, el conector del conjugado comprende (a) un enlace disulfuro; o (b) un enlace disulfuro que comprende una penicilamina; o (c) un enlace disulfuro que comprende una cisteína; o (d) un grupo hexilamino; o (e) un grupo polietilenglicol; o (f) un grupo trietilenglicol; o (g) un grupo fosfato.
[0025] En ciertas realizaciones, el conector del conjugado comprende:
[0026] (a)
[0029]
[0031] en donde X se une directa o indirectamente al resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1, y en donde Y se une directa o indirectamente al oligonucleótido; o
[0032] (b)
[0035]
[0037] en donde
[0038] X comprende O y se une directa o indirectamente al resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1; e Y comprende un grupo fosfato y se une directa o indirectamente al oligonucleótido modificado; o
[0039] (c)
[0042]
[0044] en donde X comprende un enlace disulfuro y se une directa o indirectamente al resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1; y
[0045] en donde T<1>comprende el oligonucleótido modificado; y Bx es una nucleobase modificada o no modificada; o (d)
[0048]
[0050] en donde el grupo fosfato se conecta al oligonucleótido modificado e Y se conecta al grupo del conjugado; Y es un grupo fosfodiéster o amino (-NH-); Z es un grupo pirrolidinilo que tiene la fórmula:
[0053]
[0055] j es 0 o 1; n es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10; p es de 1 a aproximadamente 10; m es 0 o de 1 a 4; y cuando Y es amino, entonces m es 1; o
[0056] (e)
[0059]
[0061] En ciertas realizaciones, el contacto de una célula que expresa el receptor del GLP-1, tal como una célula beta de los islotes pancreáticos, con un compuesto proporcionado en la presente memoria modula la expresión de un ácido nucleico diana en la célula. En ciertas realizaciones, un compuesto que comprende un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 localiza específicamente y de manera selectiva o preferiblemente una célula que expresa el receptor del GLP-1 en comparación con una célula que no expresa el receptor del GLP-1. En ciertas realizaciones, un compuesto que comprende un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 localiza específicamente y de manera selectiva o preferiblemente una célula que expresa el receptor del GLP-1 en comparación con un compuesto que no comprende un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1.
[0062] También se proporciona en la presente memoria un compuesto descrito en la presente memoria para utilizar en el tratamiento del cáncer. También se proporciona en la presente memoria una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto descrito en la presente memoria y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
[0063] Breve descripción de las figuras
[0064] La figura 1 es un gráfico que muestra el porcentaje de ARNm de FOXO1 (figura 1A) y ARNm de MALAT1 (figura 1B) en relación con la concentración de oligonucleótidos antisentido (ASO, por sus siglas en inglés) en células HEK293 tratadas con ASO precursor no conjugado (ISIS 776102 o ISIS 556089) o ASO conjugado con GLP1 (ISIS 913193 o ISIS 816385).
[0065] La figura 2 es un gráfico que muestra los niveles de ARNm de MALAT1 en relación con la concentración de oligonucleótidos antisentido (ASO) en células HEK293 que sobreexpresan el receptor del GLP1 (figura 2A), células HEK293 silvestres (figura 2B) o células HEK293 que sobreexpresan GRP40 (figura 2C) tratadas con ASO precursor no conjugado contra MALAT1 (ISIS 556089) o ASO conjugado con GLP1 contra MALAT1 (ISIS 816385).
[0066] La figura 3 es un gráfico que muestra los niveles de ARNm de MALAT1 en islotes de ratón dispersos no tratados con ASO, ASO precursor no conjugado contra MALAT1 (ISIS 556089) o ASO conjugado con GLP1 contra MALAT1 (ISIS 816385) (figura 3A); niveles de ARNm de MALAT1 en islotes de ratón intactos no tratados con ASO, ASO precursor no conjugado contra MALAT1 (ISIS 556089) o ASO conjugado con GLP1 contra MALAT1 (ISIS 816385) (figura 3B); y niveles de ARNm de FOXO1 en islotes de ratón intactos no tratados con ASO, ASO precursor no conjugado contra FOXO1 (ISIS 776102), ASO revuelto conjugado con GLP1 contra FOXO1 (ION 913195) o ASO conjugado con GLP1 contra FOXO1 (ION 913193) (figura 3C).
[0067] Descripción detallada
[0068] Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son únicamente ilustrativas y explicativas, y no limitan las realizaciones, tal como se reivindica. En la presente memoria, el uso del singular incluye el plural salvo que se indique lo contrario de forma específica. Como se utiliza en la presente memoria, “o” se utiliza en el sentido de “y/o”, salvo que se indique lo contrario. Además, el término “que incluye”, así como otras formas tales como “incluye” e “incluido”, no son limitativos.
[0069] Los encabezados de sección utilizados en la presente memoria son únicamente para fines organizativos y no deben interpretarse como limitantes del tema descrito.
[0070] Se entiende que la secuencia expuesta en cada Id. de sec. n.° de un oligonucleótido en los ejemplos contenidos en la presente memoria es independiente de cualquier modificación en un resto de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Como tal, los oligonucleótidos definidos en una Id. de sec. n.° pueden comprender, independientemente, una o más modificaciones en un resto de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Los oligonucleótidos descritos con el número ISIS o ION (ISIS n.° o ION n.°) indican una combinación de secuencia de nucleobases, modificación química y motivo.
[0071] Se entiende que a lo largo de la memoria descriptiva, la primera letra de una secuencia peptídica es el primer aminoácido del péptido en el extremo N-terminal y la última letra de una secuencia peptídica es el último aminoácido del péptido en el extremo C-terminal, salvo que se indique lo contrario.
[0072] Salvo que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados:
[0073] “2'-desoxinucleósido” significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar 2'-H(H)furanosil, tal como se encuentra en los ácidos desoxirribonucleicos (ADN) de origen natural. En ciertas realizaciones, un 2'-desoxinucleósido puede comprender una nucleobase modificada o puede comprender una nucleobase de ARN (uracilo).
[0074] “2'-O-metoxietilo” (también 2'-MOE y 2'-O(CH<2>)<2>-OCH<3>) se refiere a una modificación de O-metoxietilo en la posición 2' de un anillo furanosilo. Un azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo es un azúcar modificado.
[0075] “Nucleósido 2'-MOE” (también nucleósido 2'-O-metoxietilo) significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar modificado con 2'-MOE.
[0076] “Nucleósido sustituido en 2'“ o “nucleósido modificado en 2” significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar sustituido en 2' o modificado en 2'. Como se utiliza en la presente memoria, “sustituido en 2'“ o “modificado en 2” en relación con un resto de azúcar significa un resto de azúcar que comprende al menos un grupo sustituyente en 2' distinto de H u OH.
[0077] “5-Metilcitosina” significa una citosina con un grupo metilo unido a la posición 5.
[0078] “Aproximadamente” significa dentro de un margen de ±10 % de un valor. Por ejemplo, si se afirma que “los compuestos indujeron una inhibición de aproximadamente el 70 % de un ácido nucleico diana”, se entiende que los niveles de ácido nucleico diana se inhiben dentro de un rango del 60 % y el 80 %.
[0079] “Administración” o “administrar” se refiere a las vías para introducir un compuesto o composición proporcionados en la presente memoria en un individuo para que cumpla la función prevista. Un ejemplo de una vía de administración que puede utilizarse incluye, pero no se limita a, la administración parenteral, tal como la inyección o infusión subcutánea, intravenosa o intramuscular.
[0080] “Ácido aminoisobutírico” o “Aib” significa ácido 2-aminoisobutírico que tiene la fórmula:
[0083]
[0085] salvo que se indique lo contrario:
[0086] “Animal” se refiere a un animal humano o no humano, que incluye, aunque no de forma limitativa, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, incluidos, entre otros, monos y chimpancés.
[0087] “Actividad antisentido” significa cualquier actividad detectable y/o medible atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido con su ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico diana o proteína codificada por tal ácido nucleico diana en comparación con los niveles de ácido nucleico diana o los niveles de proteína diana en ausencia del compuesto antisentido para la diana.
[0088] “Compuesto antisentido” significa un compuesto que comprende un oligonucleótido y, opcionalmente, una o más características adicionales, tales como un grupo del conjugado o un grupo terminal. Los ejemplos de compuestos antisentido incluyen compuestos monocatenarios y bicatenarios, tales como oligonucleótidos, ribozimas, ARNip, ARNhc, ARNmn y compuestos basados en la ocupación.
[0089] “Inhibición antisentido” significa la reducción de los niveles de ácido nucleico diana en presencia de un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico diana en comparación con los niveles de ácido nucleico diana en ausencia del compuesto antisentido.
[0090] “Mecanismos antisentido” se refiere a todos aquellos mecanismos que implican la hibridación de un compuesto con un ácido nucleico diana, en donde el resultado o efecto de la hibridación es la degradación de la diana o la ocupación de la diana con un estancamiento concomitante de la maquinaria celular que implica, por ejemplo, la transcripción o el empalme.
[0091] “Oligonucleótido antisentido” significa un oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleobases que es complementaria a un ácido nucleico diana o a una región o segmento del mismo. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido puede hibridarse específicamente con un ácido nucleico diana o una región o segmento del mismo.
[0092] “Nucleósido bicíclico” o “BNA” significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar bicíclico. “Azúcar bicíclico” o “resto de azúcar bicíclico” significa un resto de azúcar modificado que comprende dos anillos, en donde el segundo anillo se forma mediante un puente que conecta dos de los átomos del primer anillo, formando de este modo una estructura bicíclica. En ciertas realizaciones, el primer anillo del resto de azúcar bicíclico es un resto de furanosilo. En ciertas realizaciones, el resto de azúcar bicíclico no comprende un resto de furanosilo.
[0093] “Grupo ramificado” significa un grupo de átomos que tienen al menos 3 posiciones que son capaces de formar enlaces covalentes con al menos 3 grupos. En ciertas realizaciones, un grupo ramificado proporciona una pluralidad de sitios reactivos para conectar ligandos anclados a un oligonucleótido mediante un conector del conjugado y/o un resto escindible.
[0094] “Resto de localización específica de células” significa un grupo del conjugado o una porción de un grupo del conjugado que es capaz de unirse a un tipo de célula particular o a tipos de células particulares.
[0095] “cEt” o “etilo constreñido” significa un resto de azúcar de furanosilo bicíclico que comprende un puente que conecta el carbono en 4' y el carbono en 2', en donde el puente tiene la fórmula: 4'-CH(CH<3>)-O-2'.
[0096] La “modificación química” en un compuesto describe las sustituciones o cambios de cualquiera de las unidades del compuesto mediante una reacción química. “Nucleósido modificado” significa un nucleósido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado y/o una nucleobase modificada. “Oligonucleótido modificado” significa un oligonucleótido que comprende al menos un enlace internucleosídico modificado, un azúcar modificado y/o una nucleobase modificada.
[0097] “Región químicamente distinta” se refiere a una región de un compuesto que es de alguna manera químicamente diferente de otra región del mismo compuesto. Por ejemplo, una región que tiene nucleótidos de 2'-O-metoxietilo es químicamente distinta de una región que tiene nucleótidos sin modificaciones 2'-O-metoxietilo.
[0098] “Compuestos antisentido quiméricos” significa compuestos antisentido que tienen al menos 2 regiones químicamente distintas, teniendo cada posición una pluralidad de subunidades.
[0099] “Enlace escindible” significa cualquier enlace químico que pueda dividirse. En ciertas realizaciones, un enlace escindible se selecciona de entre: una amida, una poliamida, un éster, un éter, uno o ambos ésteres de un fosfodiéster, un éster de fosfato, un carbamato, un disulfuro o un péptido.
[0100] “Resto escindible” significa un enlace o grupo de átomos que se escinde en condiciones fisiológicas, por ejemplo, dentro de una célula, un animal o un ser humano.
[0101] “Complementario”, en relación con un oligonucleótido, significa que la secuencia de nucleobases de tal oligonucleótido o una o más regiones del mismo coincide con la secuencia de nucleobases de otro oligonucleótido o ácido nucleico o una o más regiones del mismo cuando las dos secuencias de nucleobases se alinean en direcciones opuestas. Las nucleobases coincidentes o nucleobases complementarias, como se describe en la presente memoria, se limitan a los siguientes pares: adenina (A) y timina (T), adenina (A) y uracilo (U), citosina (C) y guanina (G), y 5-metilcitosina (<m>C) y guanina (G), salvo que se indique lo contrario. Los oligonucleótidos y/o ácidos nucleicos complementarios no necesitan tener complementariedad de nucleobases en cada nucleósido y pueden incluir una o más faltas de coincidencia de nucleobases. Por el contrario, “totalmente complementario” o “100 % complementario”, en relación con los oligonucleótidos, significa que dichos oligonucleótidos tienen coincidencias de nucleobases en cada nucleósido sin ninguna falta de coincidencia de nucleobases.
[0102] “Grupo del conjugado” significa un grupo de átomos que se une a un oligonucleótido. Los grupos del conjugado incluyen un resto del conjugado y un conector del conjugado que une el resto del conjugado al oligonucleótido. “Conector del conjugado” significa un grupo de átomos que comprende al menos un enlace que conecta un resto del conjugado a un oligonucleótido.
[0103] “Resto del conjugado” significa un grupo de átomos que se une a un oligonucleótido mediante un conector del conjugado.
[0104] “Diseñar” o “diseñado para” se refiere al proceso de diseñar un compuesto que se hibrida específicamente con una molécula de ácido nucleico seleccionada.
[0105] “Modificado de forma diferente” se refiere a las modificaciones químicas o los sustituyentes químicos que son diferentes entre sí, incluida la ausencia de modificaciones. Así, por ejemplo, un nucleósido MOE y un nucleósido de ADN no modificado se “modifican de manera diferente”, aunque el nucleósido de ADN no esté modificado. De la misma manera, el ADN y el ARN se “modifican de manera diferente”, aunque ambos son nucleósidos no modificados de origen natural. Los nucleósidos que son iguales pero que comprenden diferentes nucleobases no se modifican de manera diferente. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un azúcar modificado con 2'-OMe y una nucleobase de adenina no modificada y un nucleósido que comprende un azúcar modificado con 2'-OMe y una nucleobase de timina no modificada no se modifican de manera diferente.
[0106] “Compuesto antisentido bicatenario” significa un compuesto antisentido que comprende dos compuestos oligoméricos que son complementarios entre sí y forman un dúplex, y en donde uno de dichos dos compuestos oligoméricos comprende un oligonucleótido.
[0107] “Expresión” abarca todas las funciones mediante las cuales la información codificada de un gen se convierte en estructuras que existen y funcionan dentro de una célula. Dichas estructuras incluyen, aunque no de forma limitativa, los productos de la transcripción y la traducción.
[0108] “Gapmer” significa un oligonucleótido que comprende una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que soportan la escisión de la RNasa H situada entre regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, en donde los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distintos del nucleósido o nucleósidos que comprenden las regiones externas. La región interna puede denominarse “hueco” y las regiones externas pueden denominarse “alas”.
[0109] “Hibridación” se refiere al recocido de oligonucleótidos y/o ácidos nucleicos. Si bien no se limita a un mecanismo particular, el mecanismo más común de hibridación implica enlaces de hidrógeno, que pueden ser enlaces de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen invertidos, entre nucleobases complementarias. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero no se limitan a, un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero no se limitan a, un oligonucleótido y un ácido nucleico diana.
[0110] “Inhibir la expresión o actividad” se refiere a una reducción o bloqueo de la expresión o actividad en relación con la expresión de la actividad en una muestra no tratada o de control y no indica necesariamente una eliminación total de la expresión o actividad.
[0111] “Enlace internucleosídico” significa un grupo o enlace que forma un enlace covalente entre nucleósidos adyacentes en un oligonucleótido. “Enlace internucleosídico modificado” significa cualquier enlace internucleosídico que no sea un enlace internucleosídico de fosfato de origen natural. Los enlaces que no son de fosfato reciben el nombre en la presente memoria de enlaces internucleosídicos modificados.
[0112] “Nucleósidos unidos” significa nucleósidos adyacentes unidos entre sí por un enlace internucleosídico.
[0113] “Nucleósido conector” significa un nucleósido que une un oligonucleótido a un resto del conjugado. Los nucleósidos conectores se encuentran dentro del conector del conjugado de un compuesto. Los nucleósidos conectores no se consideran parte de la porción de oligonucleótido de un compuesto, incluso si están contiguos al oligonucleótido. “Falta de coincidencia” o “falta de complementariedad” significa que una nucleobase de un primer oligonucleótido no es complementaria a la nucleobase correspondiente de un segundo oligonucleótido o al ácido nucleico diana cuando el primer y el segundo oligonucleótido se alinean. Por ejemplo, las nucleobases, incluidas, aunque no de forma limitativa, una nucleobase universal, la inosina y la hipoxantina, pueden hibridarse con al menos una nucleobase, pero siguen siendo no complementarias o no coinciden con respecto a la nucleobase con la que se hibridan. Como otro ejemplo, una nucleobase de un primer oligonucleótido que no es capaz de hibridarse con la nucleobase correspondiente de un segundo oligonucleótido o ácido nucleico diana cuando el primer y el segundo oligonucleótido se alinean es una nucleobase no complementaria o no coincidente.
[0114] “Modular” se refiere a cambiar o ajustar una característica en una célula, tejido, órgano u organismo. Por ejemplo, modular el ácido nucleico diana puede significar aumentar o disminuir el nivel de ácido nucleico diana en una célula, tejido, órgano u organismo. Un “modulador” efectúa el cambio en la célula, el tejido, el órgano o el organismo. Por ejemplo, un compuesto puede ser un modulador que disminuye la cantidad de ácido nucleico diana en una célula, tejido, órgano u organismo.
[0115] “MOE” significa metoxietilo.
[0116] “Monómero” se refiere a una sola unidad de un oligómero. Los monómeros incluyen, aunque no de forma limitativa, nucleósidos y nucleótidos.
[0117] “Motivo” significa el patrón de restos de azúcar, nucleobases y/o enlaces internucleosídicos no modificados y/o modificados en un oligonucleótido.
[0118] “Natural” o “de origen natural” significa que se encuentra en la naturaleza.
[0119] “Azúcar modificado no bicíclico” o “resto de azúcar modificado no bicíclico” significa un resto de azúcar modificado que comprende una modificación, tal como un sustituyente, que no forma un puente entre dos átomos del azúcar para formar un segundo anillo. “Ácido nucleico” se refiere a moléculas compuestas de nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye, pero no se limita a, ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos monocatenarios y ácidos nucleicos bicatenarios.
[0120] “Nucleobase” significa un resto heterocíclico capaz de aparearse con una base de otro ácido nucleico. Como se utiliza en la presente memoria, una “nucleobase de origen natural” es adenina (A), timina (T), citosina (C), uracilo (U) y guanina (G). Una “nucleobase modificada” es una nucleobase de origen natural que se modifica químicamente. Una “base universal” o “nucleobase universal” es una nucleobase distinta de una nucleobase natural y una nucleobase modificada, capaz de aparearse con cualquier nucleobase.
[0121] “Secuencia de nucleobases” significa el orden de las nucleobases contiguas en un ácido nucleico u oligonucleótido independiente de cualquier azúcar o enlace internucleósido.
[0122] “Nucleósido” significa un compuesto que comprende una nucleobase y un resto de azúcar. La nucleobase y el resto de azúcar están, cada uno de forma independiente, no modificados o modificados. “Nucleósido modificado” significa un nucleósido que comprende una nucleobase modificada y/o un resto de azúcar modificado. Los nucleósidos modificados incluyen nucleósidos abásicos, que carecen de una nucleobase.
[0123] “Compuesto oligomérico” significa un compuesto que comprende un único oligonucleótido y, opcionalmente, una o más características adicionales, tales como un grupo del conjugado o un grupo terminal.
[0124] “Oligonucleótido” significa un polímero de nucleósidos unidos, cada uno de los cuales puede estar modificado o no modificado, independientemente uno de otro. Salvo que se indique lo contrario, los oligonucleótidos consisten en 8-80 nucleósidos unidos. “Oligonucleótido modificado” significa un oligonucleótido en donde se modifica un azúcar, una nucleobase o un enlace internucleosídico. “Oligonucleótido no modificado” significa un oligonucleótido que no comprende ninguna modificación de azúcar, nucleobase o internucleósido.
[0125] “Oligonucleótido precursor” significa un oligonucleótido cuya secuencia se utiliza como la base del diseño para más oligonucleótidos de secuencia similar pero con diferentes longitudes, motivos y/o composiciones químicas. Los oligonucleótidos de nuevo diseño pueden tener la misma secuencia o una secuencia solapada con respecto al oligonucleótido precursor.
[0126] “Enlace fosforotioato” significa un enlace de fosfato modificado en el que uno de los átomos de oxígeno que no forman puente se reemplaza por un átomo de azufre. Un enlace internucleosídico fosforotioato es un enlace internucleosídico modificado.
[0127] “Resto de fósforo” significa un grupo de átomos que comprende un átomo de fósforo. En ciertas realizaciones, un resto de fósforo comprende un mono, di o trifosfato, o fosforotioato.
[0128] “Porción” significa un número definido de nucleobases contiguas (es decir, unidas) de un ácido nucleico. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto oligomérico.
[0129] “Reducir” significa disminuir a una menor medida, tamaño, cantidad o número
[0130] El término “compuesto de ARNi” significa un compuesto antisentido que actúa, al menos en parte, a través de RISC o Ago2, pero no a través de la RNasa H, para modular un ácido nucleico diana y/o una proteína codificada por un ácido nucleico diana. Los compuestos de ARNi incluyen, pero no se limitan a, ARNip bicatenario, ARN monocatenario (ARNmn) y microARN, incluidos los miméticos de microARN.
[0131] Los “segmentos” se definen como porciones más pequeñas o subporciones de regiones dentro de un ácido nucleico. “Selectivo”, con respecto a un efecto, se refiere a que un efecto sobre una cosa es mayor que sobre otra, en cualquier magnitud cuantitativa o diferencia relativa. Por ejemplo, un compuesto que comprende un resto del ligando del conjugado del receptor del GLP-1 que es “selectivo” para las células que expresan el receptor del GLP-1 o que localiza específicamente “de manera selectiva” las células que expresan el receptor del GLP-1, localiza específicamente las células que expresan el receptor del GLP-1 en mayor medida que un compuesto que no comprende un resto del ligando del conjugado del receptor del GLP-1. Como otro ejemplo, un compuesto que comprende un resto del ligando del conjugado del receptor del GLP-1 que es “selectivo” para las células que expresan el receptor del GLP-1 o que localiza específicamente “de manera selectiva” las células que expresan el receptor del GLP-1, localiza específicamente las células que expresan el receptor del GLP-1 en mayor medida que las células que no expresan o expresan niveles relativamente más bajos del receptor del GLP-1. Se entenderá que el término “selectivo” no requiere una selectividad absoluta de todo o nada.
[0132] “Monocatenario”, en relación con un compuesto, significa que el compuesto tiene solo un oligonucleótido. “Autocomplementario” significa un oligonucleótido que se hibrida al menos parcialmente consigo mismo. Un compuesto que consiste en un oligonucleótido, en donde el oligonucleótido del compuesto es autocomplementario, es un compuesto monocatenario. Un compuesto monocatenario puede ser capaz de unirse a un compuesto complementario para formar un dúplex.
[0133] Los “sitios” se definen como posiciones únicas de nucleobases dentro de un ácido nucleico diana.
[0134] “Específicamente hibridable” se refiere a un oligonucleótido que tiene un grado suficiente de complementariedad entre el oligonucleótido y un ácido nucleico diana para inducir un efecto deseado, al tiempo que presenta efectos mínimos o nulos sobre ácidos nucleicos no diana. En ciertas realizaciones, la hibridación específica se produce en condiciones fisiológicas.
[0135] “Inhibir específicamente”, con referencia a un ácido nucleico diana, significa reducir o bloquear la expresión del ácido nucleico diana, con pocos, mínimos o ningún efecto sobre los ácidos nucleicos no diana. La reducción no indica necesariamente una eliminación total de la expresión del ácido nucleico diana.
[0136] “Ensayo celular estándar” significa el(los) ensayo(s) descrito(s) en los ejemplos y las variaciones razonables del(de los) mismo(s).
[0137] “Experimento in vivo estándar” significa el(los) procedimiento(s) descrito(s) en el(los) ejemplo(s) y las variaciones razonables del(de los) mismo(s).
[0138] “Resto de azúcar” significa un resto de azúcar no modificado o un resto de azúcar modificado. “Resto de azúcar no modificado” o “azúcar no modificado” significa un resto de 2'-OH(H)furanosilo, como se encuentra en el ARN (un “resto de azúcar de ARN no modificado”), o un resto de 2'-H(H), como se encuentra en el ADN (un “resto de azúcar de ADN no modificado”). Los restos de azúcar no modificados tienen un hidrógeno en cada una de las posiciones 1', 3' y 4', un oxígeno en la posición 3' y dos hidrógenos en la posición 5'. “Resto de azúcar modificado” o “azúcar modificado” significa un resto de azúcar de furanosilo modificado o un sustituto del azúcar. “Resto de azúcar de furanosilo modificado” significa un azúcar de furanosilo que comprende un sustituyente que no es hidrógeno en lugar de al menos un hidrógeno de un resto de azúcar no modificado. En ciertas realizaciones, un resto de azúcar de furanosilo modificado es un resto de azúcar sustituido en 2'. Tales restos de azúcar de furanosilo modificados incluyen azúcares bicíclicos y azúcares no bicíclicos.
[0139] “Sustituto de azúcar” significa un resto de azúcar modificado distinto de un resto de furanosilo que puede unir una nucleobase a otro grupo, tal como un enlace internucleosídico, un grupo del conjugado o un grupo terminal en un oligonucleótido. Los nucleósidos modificados que comprenden sustitutos del azúcar pueden incorporarse en una o más posiciones dentro de un oligonucleótido y tales oligonucleótidos son capaces de hibridarse con compuestos complementarios o ácidos nucleicos.
[0140] “Gen diana” se refiere a un gen que codifica una diana.
[0141] “Localización específica”, con respecto a un ácido nucleico diana, significa la hibridación específica de un oligonucleótido con dicho ácido nucleico diana para inducir un efecto deseado. “Localización específica”, con respecto a un receptor del GLP-1, significa la unión de un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 al receptor del GLP-1.
[0142] “Ácido nucleico diana”, “ARN diana”, “transcrito de ARN diana” y “ácido nucleico diana” significan todos un ácido nucleico que los compuestos descritos en la presente memoria pueden localizar específicamente.
[0143] “Región diana” significa una porción de un ácido nucleico diana que uno o más compuestos pueden localizar específicamente.
[0144] “Segmento diana” significa la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico diana que un compuesto puede localizar específicamente. “Sitio diana en 5'“ se refiere al nucleótido más en 5' de un segmento diana. “Sitio diana en 3'“ se refiere al nucleótido más en 3' de un segmento diana.
[0145] “Grupo terminal” significa un grupo químico o grupo de átomos que se une covalentemente a un extremo de un oligonucleótido.
[0146] Ciertas realizaciones
[0147] Un compuesto descrito en la presente memoria comprende un oligonucleótido y un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1. El oligonucleótido es un oligonucleótido modificado. El compuesto comprende además un conector del conjugado. En ciertas realizaciones, el conector del conjugado une el oligonucleótido al resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1.
[0148] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido tiene una longitud de 8 a 80 nucleósidos unidos, una longitud de 10 a 30 nucleósidos unidos, una longitud de 12 a 30 nucleósidos unidos o una longitud de 15 a 30 nucleósidos unidos. El oligonucleótido es un oligonucleótido modificado que comprende al menos un enlace internucleosídico modificado, al menos un azúcar modificado o al menos una nucleobase modificada. En ciertas realizaciones, el enlace internucleosídico modificado es un enlace internucleosídico fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico modificado del oligonucleótido modificado es un enlace internucleosídico fosforotioato.
[0149] En ciertas realizaciones, el azúcar modificado es un azúcar bicíclico, tal como 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); o 4'-CH(CH3)-O-2' (cEt). En ciertas realizaciones, el azúcar modificado es 2'-O-metoxietilo, 2'-F o 2'-OMe. En ciertas realizaciones, la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.
[0150] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende:
[0151] un segmento de hueco que consiste en desoxinucleósidos unidos;
[0152] un segmento de ala en 5' que consiste en nucleósidos unidos; y
[0153] un segmento de ala en 3' que consiste en nucleósidos unidos;
[0154] en donde el segmento de hueco se coloca inmediatamente adyacente al segmento de ala en 5' y al segmento de ala 3' y entre ambos, y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
[0155] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido es monocatenario.
[0156] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido es un oligonucleótido antisentido, un antagonista de miARN o un mimético de miARN.
[0157] En ciertas realizaciones, el compuesto comprende un dúplex bicatenario. En ciertas realizaciones, el dúplex bicatenario comprende una primera cadena que comprende el oligonucleótido modificado y una segunda cadena complementaria a la primera cadena. En ciertas realizaciones, la primera cadena que comprende el oligonucleótido modificado es complementaria a un transcrito de ARN. En ciertas realizaciones, la segunda cadena es complementaria a un transcrito de ARN. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un dúplex bicatenario que comprende (i) una primera cadena que comprende el oligonucleótido modificado, un conector del conjugado y el resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 y (ii) una segunda cadena complementaria a la primera cadena. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un dúplex bicatenario que comprende (i) una primera cadena que comprende el oligonucleótido modificado, un conector del conjugado y el resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 y (ii) una segunda cadena complementaria a la primera cadena; en donde la primera cadena es complementaria a un transcrito de ARN. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un dúplex bicatenario que comprende (i) una primera cadena que comprende el oligonucleótido modificado, un conector del conjugado y el resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 y (ii) una segunda cadena complementaria a la primera cadena; en donde la segunda cadena es complementaria a un transcrito de ARN.
[0158] En ciertas realizaciones, la etiqueta es un mimético de microARN.
[0159] En ciertas realizaciones, el compuesto comprende ribonucleótidos. En ciertas realizaciones, el compuesto comprende desoxirribonucleótidos.
[0160] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido es complementario a un transcrito de ARN en una célula, tal como una célula pancreática o una célula del islote beta pancreático.
[0161] En ciertas realizaciones, el transcrito de ARN es preARNm, ARNm, ARN no codificante o microARN.
[0162] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 es un resto del conjugado de péptido, un resto del conjugado de molécula pequeña, un resto del conjugado de aptámero o un resto del conjugado de anticuerpo de localización específica del receptor del GLP-1.
[0163] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado de péptido es un resto del conjugado del péptido GLP-1.
[0164] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 comprende una porción de al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 aminoácidos contiguos que presenta al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de homología con una porción de igual longitud de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de sec. n.°: 1-57.
[0165] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 comprende una porción de al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 aminoácidos contiguos que presenta al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad con una porción de igual longitud de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de sec. n.°: 1-57.
[0166] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 tiene una longitud de 8 a 50 aminoácidos y presenta al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de homología en toda su longitud con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de sec. n.°: 1-57. En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 presenta al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad en toda su longitud con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de sec. n.°: 1-57.
[0167] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 comprende una porción de al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 aminoácidos contiguos que presenta al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de homología con una porción de igual longitud de la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-37): HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG, que en el código convencional de tres letras es: His-Ala-Glu-Gly-ThrPhe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (Id. de sec. n.°: 1).
[0168] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 comprende una porción de al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 aminoácidos contiguos que presenta al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad con una porción de igual longitud de la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-37).
[0169] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 tiene una longitud de 8 a 50 aminoácidos y presenta al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de homología en toda su longitud con la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-37) (Id. de sec. n.°: 1).
[0170] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 comprende una sustitución conservadora de aminoácidos, un análogo de aminoácido o un derivado de aminoácido.
[0171] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 presenta al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad en toda su longitud con la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-37) (Id. de sec. n.°: 1).
[0172] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 comprende la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-37) (Id. de sec. n.°: 1).
[0173] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 consiste en la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-37) (Id. de sec. n.°: 1).
[0174] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 comprende la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-36)amida: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH<2>, que en el código convencional de tres letras es: His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH<2>(Id. de sec. n.°: 2).
[0175] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 consiste en la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-36)amida: que en el código convencional de tres letras es: His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH<2>(Id. de sec. n.°: 2).
[0176] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-36): HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR, que en el código convencional de tres letras es: His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (Id. de sec. n.°: 2).
[0177] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 comprende la secuencia de aminoácidos: EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKG, que en el código convencional de tres letras es: Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (Id. de sec. n.°: 3).
[0178] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 consiste en la secuencia de aminoácidos: EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKG, que en el código convencional de tres letras es: Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (Id. de sec. n.°: 3).
[0179] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 comprende la secuencia de aminoácidos: EGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKG, que en el código convencional de tres letras es: Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (Id. de sec. n.°: 4)
[0180] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 consiste en la secuencia de aminoácidos: EGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKG, que en el código convencional de tres letras es: Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (Id. de sec. n.°: 4).
[0181] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de sec. n.°: 1-57.
[0182] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de sec. n.°: 1-57.
[0183] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 puede ser una amida o un ácido en el extremo C-terminal de cualquiera de las Id. de sec. n.°: 1-57.
[0184] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 comprende la secuencia de aminoácidos: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys (Id. de sec. n.°: 22), en donde Aib es ácido aminoisobutírico.
[0185] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 consiste en la secuencia de aminoácidos: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys (Id. de sec. n.°: 22), en donde Aib es ácido aminoisobutírico.
[0186] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 comprende la secuencia de aminoácidos: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Pen (Id. de sec. n.°: 23), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y Pen es penicilamina.
[0187] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 consiste en la secuencia de aminoácidos: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Pen (Id. de sec. n.°: 23), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y Pen es penicilamina.
[0188] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del péptido GLP-1 es capaz de unirse al receptor del GLP-1.
[0189] En ciertas realizaciones, el receptor del GLP-1 se expresa en la superficie de una célula.
[0190] En ciertas realizaciones, la célula es una célula pancreática, tal como una célula beta de los islotes.
[0191] En ciertas realizaciones, la célula está en un animal.
[0192] En ciertas realizaciones, el compuesto comprende al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco restos del conjugado del ligando del receptor del GLP-1.
[0193] En ciertas realizaciones, el conector del conjugado une el resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 al extremo 5' del oligonucleótido.
[0194] En ciertas realizaciones, el conector del conjugado une el resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 al extremo 3' del oligonucleótido.
[0195] En ciertas realizaciones, el conector del conjugado es escindible.
[0196] En ciertas realizaciones, el conector del conjugado comprende un enlace disulfuro.
[0197] En ciertas realizaciones, el enlace disulfuro une el resto del conjugado del péptido GLP-1 al oligonucleótido.
[0198] En ciertas realizaciones, el enlace disulfuro une el extremo C-terminal del resto del conjugado del péptido GLP-1 al extremo 5' del oligonucleótido.
[0199] En ciertas realizaciones, el conector del conjugado comprende 1-5 nucleósidos conectores.
[0200] En ciertas realizaciones, el conector del conjugado comprende 3 nucleósidos conectores.
[0201] En ciertas realizaciones, los 3 nucleósidos conectores tienen un motivo TCA.
[0202] En ciertas realizaciones, los 1-5 nucleósidos conectores no comprenden un motivo TCA.
[0203] En ciertas realizaciones, el conector del conjugado comprende un grupo hexilamino.
[0204] En ciertas realizaciones, el conector del conjugado comprende un grupo polietilenglicol.
[0205] En ciertas realizaciones, el conector del conjugado comprende un grupo trietilenglicol.
[0206] En ciertas realizaciones, el conector del conjugado comprende un grupo fosfato.
[0207] En ciertas realizaciones, el conector del conjugado comprende:
[0210]
[0211] en donde X se une directa o indirectamente al resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1; y
[0212] Y se une directa o indirectamente al oligonucleótido modificado. En ciertas realizaciones, X comprende O. En ciertas realizaciones, Y comprende un grupo fosfato. En ciertas realizaciones, X se une al resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 mediante un enlace disulfuro.
[0213] En ciertas realizaciones, el conector del conjugado comprende:
[0216]
[0218] en donde X se une directa o indirectamente al resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1; y en donde T<1>comprende el oligonucleótido modificado; y Bx es una nucleobase modificada o no modificada. En ciertas realizaciones, X comprende un enlace disulfuro.
[0219] En ciertas realizaciones, el conector del conjugado comprende:
[0222]
[0224] en donde:
[0225] el grupo fosfato se conecta al oligonucleótido modificado e Y se conecta al grupo del conjugado;
[0226] Y es un grupo fosfodiéster o amino (-NH-);
[0227] Z es un grupo pirrolidinilo que tiene la fórmula:
[0230]
[0232] j es 0 o 1;
[0233] n es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10;
[0234] p es de 1 a aproximadamente 10;
[0235] m es 0 o de 1 a 4; y
[0236] cuando Y es amino, entonces m es 1.
[0237] En ciertas realizaciones, Y es un grupo amino (-NH-) o fosfodiéster. En ciertas realizaciones, n es 3 y p es 3. En ciertas realizaciones, n es 6 y p es 6. En ciertas realizaciones, n es de 2 a 10 y p es de 2 a 10. En ciertas realizaciones, n y p son diferentes. En ciertas realizaciones, n y p son iguales. En ciertas realizaciones, m es 0 o 1. En ciertas realizaciones, j es 0. En ciertas realizaciones, j es 1 y Z tiene la fórmula:
[0238]
[0240] En ciertas realizaciones, n es 2 y p es 3. En ciertas realizaciones, n es 5 y p es 6.
[0241] En ciertas realizaciones, el conector del conjugado comprende:
[0244]
[0246] En ciertas realizaciones, el conector del conjugado comprende:
[0249]
[0251] En ciertas realizaciones, el compuesto que comprende un conector del conjugado comprende:
[0254]
[0256] en donde
[0257] N-N=N representa un grupo azido del resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 y X se une directa o indirectamente al remanente del resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1; e
[0258] Y se une directa o indirectamente al oligonucleótido.
[0259] En ciertas realizaciones, el compuesto que comprende un conector del conjugado comprende:
[0262]
[0264] en donde
[0265] N-N=N representa un grupo azido del resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 y X se une directa o indirectamente al remanente del resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1; e
[0266] Y se une directa o indirectamente al oligonucleótido.
[0267] En ciertas realizaciones, el compuesto que comprende un conector del conjugado comprende:
[0270]
[0272] en donde
[0273] N-N=N representa un grupo azido del resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 y X se une directa o indirectamente al remanente del resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1; e
[0274] Y se une directa o indirectamente al oligonucleótido.
[0275] En ciertas realizaciones, una composición comprende al menos un compuesto descrito en la presente memoria. En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica comprende al menos un compuesto descrito en la presente memoria y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
[0276] También se describe en la presente memoria, un método para modular la expresión de un ácido nucleico diana en una célula, que comprende poner en contacto la célula con el compuesto de cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, modulando de este modo la expresión del ácido nucleico diana en la célula. En ciertas realizaciones, la célula expresa el receptor del GLP-1 en la superficie de la célula. En ciertas realizaciones, la célula es una célula pancreática, tal como una célula beta de los islotes. En ciertas realizaciones, la célula es una célula de la hipófisis, una célula de las leptomeninges, una célula del sistema nervioso central (SNC), una célula del estómago, una célula intestinal, una célula del duodeno, una célula del íleon, una célula del colon, una célula de la mama, una célula pulmonar, una célula del corazón, una célula tiroidea o una célula del riñón. En ciertas realizaciones, la célula que expresa el receptor del GLP-1 en su superficie es una célula cancerosa. En ciertas realizaciones, el cáncer es un cáncer endocrino que incluye, aunque no de forma limitativa, feocromocitoma, paraganglioma, carcinoma medular de tiroides, adenoma cortical suprarrenal, carcinoma paratiroideo y adenoma hipofisario. En ciertas realizaciones, el cáncer es un cáncer del sistema nervioso que incluye, aunque no de forma limitativa, meningioma, astrocitoma, glioblastoma, ependimoma y schwannoma. En ciertas realizaciones, el cáncer es un cáncer embrionario que incluye, aunque no de forma limitativa, meduloblastoma, nefroblastoma y neuroblastoma. En ciertas realizaciones, el cáncer incluye, aunque no de forma limitativa, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer colangiocelular, cáncer de hígado, cáncer de pulmón y linfoma. En ciertas realizaciones, la puesta en contacto de la célula con el compuesto de cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente inhibe la expresión del ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico diana es preARNm, ARNm, ARN no codificante o microARN. En ciertas realizaciones, la célula está en un animal.
[0277] También se describe en la presente memoria un método para modular la expresión de un ácido nucleico diana en un animal, que comprende administrar al animal el compuesto de cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, modulando de este modo la expresión del ácido nucleico diana en el animal. En ciertas realizaciones, la expresión del ácido nucleico diana se modula en una célula del animal que expresa el receptor del GLP-1 en la superficie de la célula. En ciertas realizaciones, la expresión del ácido nucleico diana se modula en una célula pancreática, tal como una célula beta de los islotes, del animal. En ciertas realizaciones, la célula es una célula pancreática, tal como una célula beta de los islotes. En ciertas realizaciones, la célula es una célula de la hipófisis, una célula de las leptomeninges, una célula del duodeno, una célula del íleon, una célula del colon, una célula de la mama, una célula del pulmón o una célula del riñón. En ciertas realizaciones, la célula que expresa el receptor del GLP-1 en su superficie es una célula cancerosa. En ciertas realizaciones, el cáncer es un cáncer endocrino que incluye, aunque no de forma limitativa, feocromocitoma, paraganglioma, carcinoma medular de tiroides, adenoma cortical suprarrenal, carcinoma paratiroideo y adenoma hipofisario. En ciertas realizaciones, el cáncer es un cáncer del sistema nervioso que incluye, aunque no de forma limitativa, meningioma, astrocitoma, glioblastoma, ependimoma y schwannoma. En ciertas realizaciones, el cáncer es un cáncer embrionario que incluye, aunque no de forma limitativa, meduloblastoma, nefroblastoma y neuroblastoma. En ciertas realizaciones, el cáncer incluye, pero no se limita a, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer colangiocelular, cáncer de hígado, cáncer de pulmón y linfoma. En ciertas realizaciones, la administración del compuesto inhibe la expresión del ácido nucleico diana en el animal. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico diana es preARNm, ARNm, ARN no codificante o microARN.
[0278] También se proporciona un compuesto tal como se describe en la presente memoria para utilizar en el tratamiento del cáncer.
[0279] En ciertas realizaciones, un método para preparar un compuesto comprende hacer reaccionar:
[0282]
[0284] con un péptido GLP-1; en donde X<1>es un oligonucleótido y el compuesto es un oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1.
[0285] En ciertas realizaciones, un método para preparar un compuesto comprende:
[0286] hacer reaccionar un oligonucleótido que comprende un conector de hexametilo y una amina terminal en el extremo 5' del oligonucleótido con éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 3-(2-piridilditiopropiónico) que tiene la fórmula:
[0289]
[0291] produciendo de este modo el compuesto 2 que tiene la fórmula:
[0294]
[0297] en donde X<1>es el oligonucleótido; y
[0298] hacer reaccionar el compuesto 2 con el péptido GLP-1, produciendo de este modo el oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1 que tiene la fórmula:
[0301]
[0304] en donde X<1>es el oligonucleótido y X<2>es el péptido GLP-1.
[0305] En ciertas realizaciones, un método para preparar un oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1 comprende: mezclar una solución que comprende un oligonucleótido que comprende un conector de hexametilo y una amina terminal en el extremo 5' del oligonucleótido con una solución que comprende éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 3-(2-piridilditiopropiónico) que tiene la fórmula:
[0308]
[0310] produciendo de este modo el compuesto 2 que tiene la fórmula:
[0313]
[0316] en donde X<1>es el oligonucleótido; y
[0317] mezclar una solución que comprende el compuesto 2 con una solución que comprende el péptido GLP-1, produciendo de este modo el oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1 que tiene la fórmula:
[0318]
[0321] en donde X<1>es el oligonucleótido y X<2>es el péptido GLP-1.
[0322] En ciertas realizaciones, la solución que comprende el oligonucleótido comprende un tampón de fosfato de sodio y la solución que comprende éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 3-(2-piridilditiopropiónico) comprende dimetilformamida.
[0323] En ciertas realizaciones, las soluciones se mezclan a temperatura ambiente.
[0324] En ciertas realizaciones, la solución que comprende el compuesto 2 comprende además acetonitrilo y NaHCO<3>y tiene un pH de aproximadamente 8,0.
[0325] En ciertas realizaciones, la solución que comprende el péptido GLP-1 comprende además dimetilformamida.
[0326] En cualquiera de los métodos anteriormente mencionados para preparar un compuesto u oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1, el péptido GLP-1 puede comprender una porción de al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 aminoácidos contiguos que presenta al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % de homología con una porción de igual longitud de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de sec. n.°: 1-57.
[0327] En cualquiera de los métodos anteriormente mencionados para preparar un compuesto u oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1, el péptido GLP-1 puede comprender una porción de al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 aminoácidos contiguos que presenta al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % de identidad con una porción de igual longitud de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de sec. n.°: 1-57.
[0328] En cualquiera de los métodos anteriormente mencionados para preparar un compuesto u oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1, el péptido GLP-1 puede tener una longitud de 8 a 50 aminoácidos y presentar al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % de homología en toda su longitud con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de sec. n.°: 1-57.
[0329] En cualquiera de los métodos anteriormente mencionados para preparar un compuesto u oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1, el péptido GLP-1 puede presentar al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % de identidad en toda su longitud con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de sec. n.°: 1-57.
[0330] En cualquiera de los métodos anteriormente mencionados para preparar un compuesto u oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1, el péptido GLP-1 puede comprender una porción de al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 aminoácidos contiguos que presenta al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % de homología con una porción de igual longitud de la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-37): HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG, que en el código convencional de tres letras es: His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (Id. de sec. n.°: 1).
[0331] En cualquiera de los métodos anteriormente mencionados para preparar un compuesto u oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1, el péptido GLP-1 puede comprender una porción de al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 aminoácidos contiguos que presenta al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % de identidad con una porción de igual longitud de la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-37).
[0332] En cualquiera de los métodos anteriormente mencionados para preparar un compuesto u oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1, el péptido GLP-1 puede tener una longitud de 8 a 50 aminoácidos y presentar al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % de homología en toda su longitud con la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-37) (Id. de sec. n.°: 1).
[0333] En cualquiera de los métodos anteriormente mencionados para preparar un compuesto u oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1, el péptido GLP-1 puede presentar al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % de identidad en toda su longitud con la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-37) (Id. de sec. n.°: 1).
[0334] En cualquiera de los métodos anteriormente mencionados para preparar un compuesto u oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1, el péptido GLP-1 puede comprender la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-37) (Id. de sec. n.°: 1).
[0335] En cualquiera de los métodos anteriormente mencionados para preparar un compuesto u oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1, el péptido GLP-1 puede consistir en la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-37) (Id. de sec. n.°: 1).
[0336] En cualquiera de los métodos anteriormente mencionados para preparar un compuesto u oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1, el péptido GLP-1 puede comprender la secuencia de aminoácidos de la GLP-1(7-36)amida: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH<2>, que en el código convencional de tres letras es: His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH<2>(Id. de sec. n.°: 2).
[0337] En cualquiera de los métodos anteriormente mencionados para preparar un compuesto u oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1, el péptido GLP-1 puede consistir en la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-36)amida (Id. de sec. n.°: 2).
[0338] En cualquiera de los métodos anteriormente mencionados para preparar un compuesto u oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1, el péptido GLP-1 puede comprender la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-36): HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR, que en el código convencional de tres letras es: His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (Id. de sec. n.°: 2).
[0339] En cualquiera de los métodos anteriormente mencionados para preparar un compuesto u oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1, el péptido GLP-1 puede comprender la secuencia de aminoácidos: EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKG, que en el código convencional de tres letras es: Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (Id. de sec. n.°: 3).
[0340] En cualquiera de los métodos anteriormente mencionados para preparar un compuesto u oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1, el péptido GLP-1 puede consistir en la secuencia de aminoácidos: EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKG, que en el código convencional de tres letras es: Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (Id. de sec. n.°: 3).
[0341] En cualquiera de los métodos anteriormente mencionados para preparar un compuesto u oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1, el péptido GLP-1 puede comprender la secuencia de aminoácidos: EGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKG, Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (Id. de sec. n.°: 4).
[0342] En cualquiera de los métodos anteriormente mencionados para preparar un compuesto u oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1, el péptido GLP-1 puede consistir en la secuencia de aminoácidos: EGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKG, Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (Id. de sec. n.°: 4).
[0343] En cualquiera de los métodos anteriormente mencionados para preparar un compuesto u oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1, el péptido GLP-1 puede comprender la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de sec. n.°: 1-57.
[0344] En cualquiera de los métodos anteriormente mencionados para preparar un compuesto u oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1, el péptido GLP-1 puede consistir en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de sec. n.°: 1-57.
[0345] En cualquiera de los métodos anteriormente mencionados para preparar un compuesto u oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1, el péptido GLP-1 puede comprender la secuencia de aminoácidos: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys (Id. de sec. n.°: 22), en donde Aib es ácido aminoisobutírico.
[0346] En cualquiera de los métodos anteriormente mencionados para preparar un compuesto u oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1, el péptido GLP-1 puede consistir en la secuencia de aminoácidos: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys (Id. de sec. n.°: 22), en donde Aib es ácido aminoisobutírico.
[0347] En cualquiera de los métodos anteriormente mencionados para preparar un compuesto u oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1, el péptido GLP-1 puede comprender la secuencia de aminoácidos: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Pen (Id. de sec. n.°: 23), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y Pen es penicilamina. En cualquiera de los métodos anteriormente mencionados para preparar un compuesto u oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1, el péptido GLP-1 puede consistir en la secuencia de aminoácidos: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Pen (Id. de sec. n.°: 23), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y Pen es penicilamina.
[0348] En cualquiera de los métodos anteriormente mencionados para preparar un compuesto u oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1, el péptido GLP-1 puede comprender un resto de azufre reactivo.
[0349] En cualquiera de los métodos anteriormente mencionados para preparar un compuesto u oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1, el péptido GLP-1 puede comprender penicilamina.
[0350] En cualquiera de los métodos anteriormente mencionados para preparar un compuesto u oligonucleótido conjugado con el péptido GLP-1, la penicilamina se puede unir al extremo C-terminal del péptido GLP-1.
[0351] Ciertos compuestos que comprenden un oligonucleótido
[0352] En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente memoria pueden ser compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, un compuesto descrito en la presente memoria comprende o consiste en un oligonucleótido modificado. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases complementaria a la de un ácido nucleico diana.
[0353] En ciertas realizaciones, un compuesto o compuesto antisentido es monocatenario. Dicho compuesto monocatenario o compuesto antisentido comprende o consiste en un compuesto oligomérico. Dicho compuesto oligomérico comprende o consiste en un oligonucleótido y un grupo del conjugado. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido es un oligonucleótido antisentido. El oligonucleótido está modificado. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido de un compuesto antisentido monocatenario o un compuesto oligomérico comprende una secuencia de nucleobases autocomplementaria.
[0354] En ciertas realizaciones, los compuestos son bicatenarios. Dichos compuestos bicatenarios comprenden un primer oligonucleótido modificado que tiene una región complementaria a un ácido nucleico diana y un segundo oligonucleótido modificado que tiene una región complementaria al primer oligonucleótido modificado. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado es un oligonucleótido de ARN. En tales realizaciones, la nucleobase de timina en el oligonucleótido modificado se reemplaza por una nucleobase de uracilo. El compuesto comprende un grupo del conjugado. En ciertas realizaciones, uno de los oligonucleótidos modificados está conjugado. En ciertas realizaciones, ambos oligonucleótidos modificados están conjugados. En ciertas realizaciones, el primer oligonucleótido modificado está conjugado. En ciertas realizaciones, el segundo oligonucleótido modificado está conjugado. En ciertas realizaciones, el primer oligonucleótido modificado tiene una longitud de 12-30 nucleósidos unidos y el segundo oligonucleótido modificado tiene una longitud de 12-30 nucleósidos unidos. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son bicatenarios. Dichos compuestos antisentido bicatenarios comprenden un primer compuesto oligomérico que tiene una región complementaria a un ácido nucleico diana y un segundo compuesto oligomérico que tiene una región complementaria al primer compuesto oligomérico. El primer compuesto oligomérico de dichos compuestos antisentido bicatenarios típicamente comprende o consiste en un oligonucleótido modificado y, opcionalmente, un grupo del conjugado. El oligonucleótido del segundo compuesto oligomérico de dicho compuesto antisentido bicatenario puede estar modificado o no modificado. Uno o ambos compuestos oligoméricos de un compuesto antisentido bicatenario pueden comprender un grupo del conjugado. Los compuestos oligoméricos de los compuestos antisentido bicatenarios pueden incluir nucleósidos solapados no complementarios.
[0355] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un dúplex bicatenario que comprende (i) una primera cadena que comprende un oligonucleótido modificado, un conector del conjugado y un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1, y (ii) una segunda cadena complementaria a la primera cadena. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un dúplex bicatenario que comprende (i) una primera cadena que comprende el oligonucleótido modificado, un conector del conjugado y un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1, y (ii) una segunda cadena complementaria a la primera cadena; en donde la primera cadena es complementaria a un transcrito de ARN. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un dúplex bicatenario que comprende (i) una primera cadena que comprende un oligonucleótido modificado, un conector del conjugado y un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1, y (ii) una segunda cadena complementaria a la primera cadena; en donde la segunda cadena es complementaria a un transcrito de ARN.
[0357] Los ejemplos de compuestos monocatenarios y bicatenarios incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos, ARNip, oligonucleótidos de localización específica de microARN y compuestos de ARNi monocatenarios, tales como ARN de horquilla pequeña (ARNhc), ARNip monocatenarios (ARNmn) y miméticos de microARN.
[0359] En ciertas realizaciones, un compuesto descrito en la presente memoria tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana que se busca localizar específicamente.
[0361] En ciertas realizaciones, un compuesto descrito en la presente memoria comprende un oligonucleótido que tiene una longitud de 10 a 30 subunidades unidas. En ciertas realizaciones, un compuesto descrito en la presente memoria comprende un oligonucleótido que tiene una longitud de 12 a 30 subunidades unidas. En ciertas realizaciones, un compuesto descrito en la presente memoria comprende un oligonucleótido que tiene una longitud de 12 a 22 subunidades unidas. En ciertas realizaciones, el compuesto descrito en la presente memoria comprende un oligonucleótido que tiene una longitud de 14 a 30 subunidades unidas. En ciertas realizaciones, el compuesto descrito en la presente memoria comprende un oligonucleótido que tiene una longitud de 14 a 20 subunidades unidas. En ciertas realizaciones, un compuesto descrito en la presente memoria comprende un oligonucleótido que tiene una longitud de 15 a 30 subunidades unidas. En ciertas realizaciones, un compuesto descrito en la presente memoria comprende un oligonucleótido que tiene una longitud de 15 a 20 subunidades unidas. En ciertas realizaciones, un compuesto descrito en la presente memoria comprende un oligonucleótido que tiene una longitud de 16 a 30 subunidades unidas. En ciertas realizaciones, un compuesto descrito en la presente memoria comprende un oligonucleótido que tiene una longitud de 16 a 20 subunidades unidas. En ciertas realizaciones, un compuesto descrito en la presente memoria comprende un oligonucleótido que tiene una longitud de 17 a 30 subunidades unidas. En ciertas realizaciones, un compuesto descrito en la presente memoria comprende un oligonucleótido que tiene una longitud de 17 a 20 subunidades unidas. En ciertas realizaciones, un compuesto descrito en la presente memoria comprende un oligonucleótido que tiene una longitud de 18 a 30 subunidades unidas. En ciertas realizaciones, un compuesto descrito en la presente memoria comprende un oligonucleótido que tiene una longitud de 18 a 21 subunidades unidas. En ciertas realizaciones, un compuesto descrito en la presente memoria comprende un oligonucleótido que tiene una longitud de 18 a 20 subunidades unidas. En ciertas realizaciones, un compuesto descrito en la presente memoria comprende un oligonucleótido que tiene una longitud de 20 a 30 subunidades unidas. En otras palabras, dichos oligonucleótidos tienen una longitud de 12 a 30 subunidades unidas, de 14 a 30 subunidades unidas, de 14 a 20 subunidades, de 15 a 30 subunidades, de 15 a 20 subunidades, de 16 a 30 subunidades, de 16 a 20 subunidades, de 17 a 30 subunidades, de 17 a 20 subunidades, de 18 a 30 subunidades, de 18 a 20 subunidades, de 18 a 21 subunidades, de 20 a 30 subunidades o de 12 a 22 subunidades unidas, respectivamente. En ciertas realizaciones, un compuesto descrito en la presente memoria comprende un oligonucleótido que tiene una longitud de 14 subunidades unidas. En ciertas realizaciones, un compuesto descrito en la presente memoria comprende un oligonucleótido que tiene una longitud de 16 subunidades unidas. En ciertas realizaciones, un compuesto descrito en la presente memoria comprende un oligonucleótido que tiene una longitud de 17 subunidades unidas. En ciertas realizaciones, un compuesto descrito en la presente memoria comprende un oligonucleótido que tiene una longitud de 18 subunidades unidas. En ciertas realizaciones, un compuesto descrito en la presente memoria comprende un oligonucleótido que tiene una longitud de 19 subunidades unidas. En ciertas realizaciones, un compuesto descrito en la presente memoria comprende un oligonucleótido que tiene una longitud de 20 subunidades unidas. En otras realizaciones, un compuesto descrito en la presente memoria comprende un oligonucleótido de 8 a 80, de 12 a 50, de 13 a 30, de 13 a 50, de 14 a 30, de 14 a 50, de 15 a 30, de 15 a 50, de 16 a 30, de 16 a 50, de 17 a 30, de 17 a 50, de 18 a 22, de 18 a 24, de 18 a 30, de 18 a 50, de 19 a 22, de 19 a 30, de 19 a 50 o de 20 a 30 subunidades unidas. En ciertas realizaciones de este tipo, el compuesto descrito en la presente memoria comprende un oligonucleótido que tiene una longitud de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 subunidades unidas, o un intervalo definido por dos de los valores anteriores. En algunas realizaciones, las subunidades unidas son nucleótidos, nucleósidos o nucleobases.
[0362] En ciertas realizaciones, el compuesto puede comprender además características o elementos adicionales, tales como un grupo del conjugado, que se unen al oligonucleótido. En ciertas realizaciones, dichos compuestos son compuestos antisentido. En las realizaciones donde un grupo del conjugado comprende un nucleósido (es decir, un nucleósido que une el grupo del conjugado al oligonucleótido), el nucleósido del grupo del conjugado no se incluye en la longitud del oligonucleótido.
[0364] En ciertas realizaciones, los compuestos pueden acortarse o truncarse. Por ejemplo, se puede eliminar una única subunidad del extremo 5' (truncamiento en 5') o, alternativamente, del extremo 3' (truncamiento en 3'). Un compuesto acortado o truncado para la localización específica de un ácido nucleico puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 5' o, alternativamente, puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 3' del compuesto. Alternativamente, los nucleósidos eliminados pueden dispersarse por todo el compuesto.
[0365] Cuando una única subunidad adicional está presente en un compuesto alargado, la subunidad adicional puede estar ubicada en el extremo 5' o 3' del compuesto. Cuando están presentes dos o más subunidades adicionales, las subunidades añadidas pueden estar adyacentes entre sí, por ejemplo, en un compuesto que tiene dos subunidades añadidas al extremo 5' (adición en 5'), o alternativamente al extremo 3' (adición en 3'), del compuesto. Alternativamente, las subunidades añadidas pueden dispersarse por todo el compuesto.
[0366] Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto, tal como un oligonucleótido, y/o introducir bases no coincidentes sin eliminar la actividad (Woolf y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992; Gautschi y col., J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, marzo de 2001; Maher y Dolnick, Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988). Sin embargo, cambios aparentemente menores en la secuencia, la química y el motivo de los oligonucleótidos pueden dar lugar a grandes diferencias en una o más de las muchas propiedades necesarias para el desarrollo clínico (Seth y col., J. Med. Chem.2009, 52, 10; Egli y col., J. Am. Chem. Soc.2011, 133, 16642).
[0367] En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente memoria son compuestos de ARN de interferencia (ARNi), que incluyen compuestos de ARN bicatenario (también denominados ARN de interferencia pequeño o ARNip) y compuestos de ARNi monocatenario (o ARNmc). Dichos compuestos actúan, al menos en parte, a través de la vía del RISC para degradar y/o secuestrar un ácido nucleico diana (por lo tanto, incluyen compuestos de microARN/miméticos de microARN). Como se utiliza en la presente memoria, el término ARNip pretende ser equivalente a otros términos utilizados para describir moléculas de ácido nucleico que son capaces de mediar en el ARNi específico de la secuencia, por ejemplo, el ARN de interferencia pequeño (ARNip), el ARN bicatenario (ARNbc), el microARN (miARN), el ARN de horquilla corta (ARNhc), el oligonucleótido de interferencia pequeño, el ácido nucleico de interferencia pequeño, el oligonucleótido modificado de interferencia pequeño, el ARNip modificado químicamente, el ARN de silenciamiento génico postranscripcional (ARNsgpt) y otros. Además, como se utiliza en la presente memoria, el término “ARNi” pretende ser equivalente a otros términos utilizados para describir la interferencia de ARN específica de secuencia, tal como el silenciamiento génico postranscripcional, la inhibición de la traducción o la epigenética.
[0368] En ciertas realizaciones, la primera cadena del compuesto es una cadena guía de ARNip y la segunda cadena del compuesto es una cadena pasajera de ARNip. En ciertas realizaciones, la segunda cadena del compuesto es complementaria a la primera cadena. En ciertas realizaciones, cada cadena del compuesto tiene una longitud de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 nucleósidos unidos. En ciertas realizaciones, la primera o la segunda cadena del compuesto puede comprender un grupo del conjugado.
[0369] Los compuestos descritos en la presente memoria comprenden oligonucleótidos modificados. Ciertos oligonucleótidos modificados tienen uno o más centros asimétricos y, por lo tanto, dan lugar a enantiómeros, diastereoisómeros y otras configuraciones estereoisoméricas que pueden definirse, en términos de estereoquímica absoluta, como (R) o (S), como α o β, tal como para los anómeros de azúcar, o como (D) o (L), tal como para los aminoácidos, etc. Los oligonucleótidos modificados que se proporcionan en la presente memoria incluyen todos estos posibles isómeros, incluidas sus formas racémicas y ópticamente puras, salvo que se indique lo contrario. De la misma manera, también se incluyen todos los isómeros cis y trans y las formas tautoméricas.
[0370] Los compuestos descritos en la presente memoria incluyen variaciones en las que uno o más átomos se reemplazan con un isótopo no radiactivo o un isótopo radiactivo del elemento indicado. Por ejemplo, los compuestos de la presente memoria que comprenden átomos de hidrógeno abarcan todas las posibles sustituciones de deuterio para cada uno de los átomos de hidrógeno de<1>H. Las sustituciones isotópicas comprendidas en los compuestos de la presente memoria incluyen, pero no se limitan a:<2>H o<3>H en lugar de<1>H,<13>C o<14>C en lugar de<12>C,<15>N en lugar de<14>N,<17>O o<18>O en lugar de<16>O, y<33>S,<34>S,<35>S o<36>S en lugar de<32>S. En ciertas realizaciones, las sustituciones isotópicas no radiactivas pueden conferir nuevas propiedades al compuesto que son beneficiosas en la utilización como herramienta terapéutica o de investigación. En ciertas realizaciones, las sustituciones isotópicas radiactivas pueden hacer que el compuesto sea adecuado para fines de investigación o diagnóstico, tales como un ensayo de obtención de imágenes. Ciertos mecanismos
[0371] Los compuestos descritos en la presente memoria son capaces de hibridarse con un ácido nucleico diana, lo que da como resultado al menos una actividad antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente memoria afectan selectivamente a uno o más ácidos nucleicos diana. Dichos compuestos comprenden una secuencia de nucleobases que se hibrida con uno o más ácidos nucleicos diana, lo que da como resultado una o más actividades antisentido deseadas y no se hibrida con uno o más ácidos nucleicos no diana o no se hibrida con uno o más ácidos nucleicos no diana de tal modo que dé como resultado una actividad antisentido no deseada significativa.
[0372] En ciertas actividades antisentido, la hibridación de un compuesto descrito en la presente memoria con un ácido nucleico diana da como resultado el reclutamiento de una proteína que escinde el ácido nucleico diana. Por ejemplo, ciertos compuestos descritos en la presente memoria dan como resultado la escisión mediada por la RNasa H del ácido nucleico diana. La RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN. El ADN en un dúplex de ARN:ADN de este tipo no necesita ser ADN no modificado. En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente memoria son lo suficientemente “similares al ADN” como para provocar la actividad de la RNasa H. Además, en ciertas realizaciones, se toleran uno o más nucleósidos no similares al ADN en el hueco de un gapmer.
[0373] En ciertas actividades antisentido, los compuestos descritos en la presente memoria o una porción del compuesto se cargan en un complejo silenciador inducido por ARN (RISC, por sus siglas en inglés), lo que finalmente da como resultado la escisión del ácido nucleico diana. Por ejemplo, ciertos compuestos descritos en la presente memoria provocan la escisión del ácido nucleico diana por acción de las proteínas Argonaute. Los compuestos que se cargan en el RISC son compuestos de ARNi. Los compuestos de ARNi pueden ser bicatenarios (ARNip) o monocatenarios (ARNmn).
[0374] En ciertas realizaciones, la hibridación de los compuestos descritos en la presente memoria con un ácido nucleico diana no da como resultado el reclutamiento de una proteína que escinda ese ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones de este tipo, la hibridación del compuesto con el ácido nucleico diana da como resultado la alteración del empalme del ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, la hibridación del compuesto con un ácido nucleico diana da como resultado la inhibición de una interacción de unión entre el ácido nucleico diana y una proteína u otro ácido nucleico. En ciertas realizaciones de este tipo, la hibridación del compuesto con un ácido nucleico diana da como resultado una alteración de la traducción del ácido nucleico diana.
[0375] Las actividades antisentido pueden observarse directa o indirectamente. En ciertas realizaciones, la observación o detección de una actividad antisentido implica la observación o detección de un cambio en la cantidad de un ácido nucleico o proteína diana codificados por dicho ácido nucleico diana, un cambio en la relación de variantes de empalme de un ácido nucleico o proteína, y/o un cambio fenotípico en una célula o animal.
[0376] Ácidos nucleicos diana, regiones diana y secuencias de nucleótidos
[0377] En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente memoria comprenden o consisten en un oligonucleótido que comprende una región que es complementaria a un ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico diana es una molécula de ARN endógena. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico diana es un ARN no codificante. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico diana codifica una proteína. En algunas realizaciones de este tipo, el ácido nucleico diana se selecciona de: un ARNm y un preARNm, incluidas las regiones intrónicas, exónicas y no traducidas. En ciertas realizaciones, el ARN diana es un ARNm. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico diana es un pre-ARNm. En ciertas realizaciones de este tipo, la región diana está completamente dentro de un intrón. En ciertas realizaciones, la región diana abarca una unión intrón/exón. En ciertas realizaciones, la región diana está al menos en un 50 % dentro de un intrón. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico diana está en una célula que expresa el receptor del GLP-1. En ciertas realizaciones, la célula que expresa el receptor del GLP-1 es una célula pancreática, tal como una célula beta de los islotes.
[0378] Hibridación
[0379] En algunas realizaciones, la hibridación se produce entre un compuesto descrito en la presente memoria y un ácido nucleico diana. El mecanismo más común de hibridación implica enlaces de hidrógeno (p. ej., enlaces de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen invertidos) entre nucleobases complementarias de las moléculas de ácido nucleico.
[0380] La hibridación puede producirse en condiciones variables. Las condiciones de hibridación dependen de la secuencia y están determinadas por la naturaleza y la composición de las moléculas de ácido nucleico que se hibridará.
[0381] Los métodos para determinar si una secuencia puede hibridarse específicamente con un ácido nucleico diana son bien conocidos en la técnica. En ciertas realizaciones, los compuestos proporcionados en la presente memoria pueden hibridarse específicamente con un ácido nucleico diana.
[0382] Complementariedad
[0383] Se dice que un oligonucleótido es complementario a otro ácido nucleico cuando la secuencia de nucleobases de dicho oligonucleótido o una o más regiones del mismo coincide con la secuencia de nucleobases de otro oligonucleótido o ácido nucleico o con una o más regiones de los mismos cuando las dos secuencias de nucleobases se alinean en direcciones opuestas. Las nucleobases coincidentes o nucleobases complementarias, como se describe en la presente memoria, se limitan a los siguientes pares: adenina (A) y timina (T), adenina (A) y uracilo (U), citosina (C) y guanina (G), y 5-metilcitosina (mC) y guanina (G), salvo que se indique lo contrario. Los oligonucleótidos y/o ácidos nucleicos complementarios no necesitan tener complementariedad de nucleobases en cada nucleósido y pueden incluir una o más faltas de coincidencia de nucleobases. Un oligonucleótido es totalmente complementario o 100 % complementario si dichos oligonucleótidos tienen coincidencias de nucleobases en cada nucleósido sin ninguna falta de coincidencia de nucleobases.
[0384] Las nucleobases no complementarias entre un compuesto y un ácido nucleico diana pueden tolerarse siempre que el compuesto siga siendo capaz de hibridarse específicamente con un ácido nucleico diana. Además, un compuesto puede hibridarse con uno o más segmentos de un ácido nucleico diana de tal modo que los segmentos intermedios o adyacentes no participen en el evento de hibridación (p. ej., una estructura de bucle, falta de coincidencia o estructura de horquilla).
[0386] En ciertas realizaciones, los compuestos proporcionados en la presente memoria, o una porción específica de los mismos, son al menos o son hasta un 70 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % complementarios a un ácido nucleico diana, una región diana, un segmento diana o una porción específica del mismo. En ciertas realizaciones, los compuestos proporcionados en la presente memoria, o una porción específica de los mismos, son del 70 % al 75 %, del 75 % al 80 %, del 80 % al 85 %, del 85 % al 90 %, del 90 % al 95 %, del 95 % al 100 %, o cualquier número entre estos intervalos, complementarios a un ácido nucleico diana, una región diana, un segmento diana o una porción específica del mismo. El porcentaje de complementariedad de un compuesto con un ácido nucleico diana puede determinarse utilizando métodos rutinarios.
[0387] Por ejemplo, un compuesto en el que 18 de las 20 nucleobases del compuesto son complementarias a una región diana y, por lo tanto, se hibridarían específicamente, representaría un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes pueden estar agrupadas o intercaladas con nucleobases complementarias y no es necesario que sean contiguas entre sí o a nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto de 18 nucleobases de longitud que tenga cuatro nucleobases no complementarias que estén flanqueadas por dos regiones de completa complementariedad con el ácido nucleico diana tendría una complementariedad global del 77,8 % con el ácido nucleico diana. El porcentaje de complementariedad de un compuesto con una región de un ácido nucleico diana puede determinarse de forma rutinaria utilizando los programas BLAST (herramientas básicas de búsqueda de alineamiento local) y los programas PowerBlast conocidos en la técnica (Altschul y col., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649656). El porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad puede determinarse, por ejemplo, mediante el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, Wisconsin), utilizando la configuración predeterminada, que utiliza el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482489).
[0389] En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente memoria, o porciones específicas de los mismos, son totalmente complementarios (es decir, 100 % complementarios) a un ácido nucleico diana o a una porción específica del mismo. Por ejemplo, un compuesto puede ser totalmente complementario a un ácido nucleico diana, o a una región diana, o a un segmento diana o secuencia diana del mismo. Como se utiliza en la presente memoria, “totalmente complementario” significa que cada nucleobase de un compuesto es complementaria a la nucleobase correspondiente de un ácido nucleico diana. Por ejemplo, un compuesto de 20 nucleobases es totalmente complementario a una secuencia diana que tiene 400 nucleobases de longitud, siempre que haya una porción correspondiente de 20 nucleobases del ácido nucleico diana que sea completamente complementaria al compuesto. El término “totalmente complementario” también se puede utilizar en relación con una porción específica del primer y/o segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 nucleobases de un compuesto de 30 nucleobases puede ser “totalmente complementaria” a una secuencia diana que tiene 400 nucleobases de longitud. La porción de 20 nucleobases del compuesto de 30 nucleobases es completamente complementaria a la secuencia diana si la secuencia diana tiene una porción correspondiente de 20 nucleobases en donde cada nucleobase es complementaria a la porción de 20 nucleobases del compuesto. Al mismo tiempo, todo el compuesto de 30 nucleobases puede o no ser totalmente complementario a la secuencia diana, dependiendo de si las 10 nucleobases restantes del compuesto también son complementarias a la secuencia diana.
[0391] En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente memoria comprenden una o más nucleobases no coincidentes en relación con el ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones de este tipo, la actividad antisentido contra la diana se reduce debido a dicha falta de coincidencia, pero la actividad contra una secuencia que no es la diana se reduce en una cantidad mayor. Por lo tanto, en ciertas realizaciones de este tipo se mejora la selectividad del compuesto. En ciertas realizaciones, la falta de coincidencia se encuentra específicamente dentro de un oligonucleótido que tiene un motivo gapmer. En ciertas realizaciones de este tipo, la falta de coincidencia está en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 desde el extremo 5' de la región de hueco. En ciertas realizaciones de este tipo, la falta de coincidencia está en la posición 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 desde el extremo 3' de la región de hueco. En ciertas realizaciones de este tipo, la falta de coincidencia se produce en la posición 1, 2, 3 o 4 desde el extremo 5' de la región de ala. En ciertas realizaciones de este tipo, la falta de coincidencia se produce en la posición 4, 3, 2 o 1 desde el extremo 3' de la región de ala. En ciertas realizaciones, la falta de coincidencia se encuentra específicamente dentro de un oligonucleótido que no tiene un motivo gapmer. En ciertas realizaciones de este tipo, la falta de coincidencia está en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 desde el extremo 5' del oligonucleótido. En ciertas realizaciones de este tipo, la falta de coincidencia está en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 desde el extremo 3' del oligonucleótido.
[0393] La ubicación de una nucleobase no complementaria puede estar en el extremo 5' o en el extremo 3' del compuesto. Alternativamente, la nucleobase o nucleobases no complementarias pueden estar en una posición interna del compuesto. Cuando están presentes dos o más nucleobases no complementarias, pueden estar contiguas (es decir, unidas) o no contiguas. En una realización, una nucleobase no complementaria se ubica en el segmento de ala de un oligonucleótido gapmer.
[0394] En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente memoria que tienen, o tienen una longitud de hasta 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases, comprenden no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 nucleobase(s) no complementaria(s) en relación con un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico diana, o una porción específica del mismo.
[0395] En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente memoria que tienen, o tienen una longitud de hasta 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleobases comprenden no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 nucleobase(s) no complementaria(s) en relación con un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico diana, o una porción específica del mismo.
[0396] En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente memoria también incluyen aquellos que son complementarios a una porción de un ácido nucleico diana. Como se utiliza en la presente memoria, “porción” se refiere a un número definido de nucleobases contiguas (es decir, unidas) dentro de una región o segmento de un ácido nucleico diana. Una “porción” también puede referirse a un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto. En ciertas realizaciones, los compuestos son complementarios a al menos una porción de 8 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos son complementarios a al menos una porción de 9 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos son complementarios a al menos una porción de 10 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos son complementarios a al menos una porción de 11 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos son complementarios a al menos una porción de 12 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos son complementarios a al menos una porción de 13 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos son complementarios a al menos una porción de 14 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos son complementarios a al menos una porción de 15 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos son complementarios a al menos una porción de 16 nucleobases de un segmento diana. También se contemplan compuestos que son complementarios a al menos una porción de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleobases de un segmento diana, o un intervalo definido por dos de estos valores.
[0397] Identidad
[0398] Los compuestos proporcionados en la presente memoria también pueden tener un porcentaje de identidad definido con una secuencia de nucleótidos particular, la Id. de sec. n.°, o un compuesto representado por un número ISIS o ION específico, o una porción del mismo. Como se utiliza en la presente memoria, un compuesto es idéntico a la secuencia descrita en la presente memoria si tiene la misma capacidad de apareamiento de nucleobases. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN descrita se consideraría idéntico a la secuencia de ADN, ya que tanto el uracilo como la timidina se aparean con la adenina. También se contemplan las versiones acortadas y alargadas de los compuestos descritos en la presente memoria, así como los compuestos que tienen bases no idénticas en relación con los compuestos proporcionados en la presente memoria. Las bases no idénticas pueden estar adyacentes entre sí o dispersas por todo el compuesto. El porcentaje de identidad de un compuesto se calcula según el número de bases que tienen un apareamiento de bases idéntico en relación con la secuencia con la que se está comparando.
[0399] En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente memoria, o porciones de los mismos, son, son al menos o son hasta un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticos a uno o más de los compuestos o Id. de sec. n.°, o una porción de los mismos, descritos en la presente memoria. En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente memoria son idénticos en aproximadamente un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %, o cualquier porcentaje entre dichos valores, con una secuencia de nucleótidos particular, Id. de sec. n.°, o compuesto representado por un número ISIS o ION específico, o una porción del mismo, donde los compuestos comprenden un oligonucleótido que tiene una o más nucleobases no coincidentes. En ciertas realizaciones de este tipo, la falta de coincidencia está en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 desde el extremo 5' del oligonucleótido. En ciertas realizaciones de este tipo, la falta de coincidencia está en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 desde el extremo 3' del oligonucleótido.
[0400] En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente memoria comprenden o consisten en compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, una porción del compuesto antisentido se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, una porción de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleobases se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana.
[0401] En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente memoria comprenden o consisten en oligonucleótidos. En ciertas realizaciones, una porción del oligonucleótido se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, una porción de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleobases se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana.
[0402] Ciertos compuestos modificados
[0403] En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente memoria comprenden o consisten en oligonucleótidos que consisten en nucleósidos unidos. Los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos no modificados (ARN o ADN) o pueden ser oligonucleótidos modificados. Los oligonucleótidos modificados comprenden al menos una modificación en relación con el ARN o ADN no modificado (es decir, comprenden al menos un nucleósido modificado [que comprende un resto de azúcar modificado y/o una nucleobase modificada] y/o al menos un enlace internucleosídico modificado).
[0404] A. Nucleósidos modificados
[0405] Los nucleósidos modificados comprenden un resto de azúcar modificado o una nucleobase modificada o tanto un resto de azúcar modificado como una nucleobase modificada.
[0406] 1. Restos de azúcar modificados
[0407] En ciertas realizaciones, los restos de azúcar son restos de azúcar modificados no bicíclicos. En ciertas realizaciones, los restos de azúcar modificados son restos de azúcar bicíclicos o tricíclicos. En ciertas realizaciones, los restos de azúcar modificados son sustitutos de azúcar. Dichos sustitutos de azúcar pueden comprender una o más sustituciones correspondientes a las de otros tipos de restos de azúcar modificados.
[0408] En ciertas realizaciones, los restos de azúcar modificados son restos de azúcar modificados no bicíclicos que comprenden un anillo furanosilo con uno o más sustituyentes acíclicos, que incluyen, aunque no de forma limitativa, los sustituyentes en las posiciones 2', 4' y/o 5'. En ciertas realizaciones, uno o más sustituyentes acíclicos de restos de azúcar modificados no bicíclicos están ramificados. Los ejemplos de grupos sustituyentes en 2' adecuados para restos de azúcar modificados no bicíclicos incluyen, pero no se limitan a: 2'-F, 2'-OCH<3>(“OMe” u “O-metilo”) y 2'-O(CH<2>)<2>OCH<3>(“MOE”). En ciertas realizaciones, los grupos sustituyentes en 2' se seleccionan de entre: halo, alilo, amino, azido, SH, CN, OCN, CF<3>, OCF<3>, O-alcoxi C<1>-C<10>, O-alcoxi C<1>-C<10>sustituido, O-alquilo C<1>-C<10>, O-alquilo C<1>-C<10>sustituido, S-alquilo, N(R<m>)-alquilo, O-alquenilo, S-alquenilo, N(R<m>)-alquenilo, O-alquinilo, S-alquinilo, N(R<m>)-alquinilo, O-alquilenil-O-alquilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo, O-aralquilo, O(CH<2>)<2>SCH<3>, O(CH<2>)<2>ON(R<m>)(R<n>) u OCH<2>C(=O)-N(R<m>)(R<n>), donde cada R<m>y R<n>es, independientemente, H, un grupo protector de amino, o alquilo C<1>-C<10>sustituido o no sustituido, y los grupos sustituyentes en 2' descritos en Cook y col., US-6.531.584; Cook y col., US-5.859.221; y Cook y col., US-6.005.087. Ciertas realizaciones de estos grupos sustituyentes en 2' pueden sustituirse además con uno o más grupos sustituyentes seleccionados independientemente de entre: hidroxilo, amino, alcoxi, carboxilo, bencilo, fenilo, nitro (NO<2>), tiol, tioalcoxi, tioalquilo, halógeno, alquilo, arilo, alquenilo y alquinilo. Los ejemplos de grupos sustituyentes en 4' adecuados para restos de azúcar modificados linealmente no bicíclicos incluyen, pero no se limitan a, alcoxi (p. ej., metoxi), alquilo y los descritos en Manoharan y col., WO 2015/106128. Los ejemplos de grupos sustituyentes en 5' adecuados para restos de azúcar modificados no bicíclicos incluyen, pero no se limitan a: 5'-metilo (R o S), 5'-vinilo y 5'-metoxi. En ciertas realizaciones, los azúcares modificados no bicíclicos comprenden más de un sustituyente de azúcar no puente, por ejemplo, los restos de azúcar 2'-F-5'-metilo y los restos de azúcar modificados y los nucleósidos modificados descritos en Migawa y col., WO 2008/101157 y Rajeev y col., US2013/0203836.
[0409] En ciertas realizaciones, un nucleósido sustituido en 2' o un nucleósido modificado no bicíclico en 2' comprende un resto de azúcar que comprende un grupo sustituyente en 2' lineal seleccionado de: F, NH<2>, N<3>, OCF<3>, OCH<3>, O(CH<2>)<3>NH<2>, CH<2>CH=CH<2>, OCH<2>CH=CH<2>, OCH<2>CH<2>OCH<3>, O(CH<2>)<2>SCH<3>, O(CH<2>)<2>ON(R<m>)(R<n>), O(CH<2>)<2>O(CH<2>)<2>N(CH<3>)<2>, y acetamida N-sustituida (OCH<2>C(=O)-N(R<m>)(R<n>)), donde cada R<m>y R<n>es, independientemente, H, un grupo protector de amino, o alquilo C<1>-C<10>sustituido o no sustituido.
[0410] En ciertas realizaciones, un nucleósido sustituido en 2' o un nucleósido modificado no bicíclico en 2' comprende un resto de azúcar que comprende un grupo sustituyente en 2' lineal seleccionado de: F, OCF<3>, OCH<3>, OCH<2>CH<2>OCH<3>, O(CH<2>)<2>SCH<3>, O(CH<2>)<2>ON(CH<3>)<2>, O(CH<2>)<2>O(CH<2>)<2>N(CH<3>)<2>y OCH<2>C(=O)-N(H)CH<3>(“NMA”).
[0411] En ciertas realizaciones, un nucleósido sustituido en 2' o un nucleósido modificado no bicíclico en 2' comprende un resto de azúcar que comprende un grupo sustituyente en 2' lineal seleccionado de: F, OCH<3>y OCH<2>CH<2>OCH<3>. Los nucleósidos que comprenden restos de azúcar modificados, tales como los restos de azúcar modificados no bicíclicos, se denominan según la(s) posición(es) de la(s) sustitución(es) en el resto de azúcar del nucleósido. Por ejemplo, los nucleósidos que comprenden restos de azúcar sustituidos en 2' o modificados en 2 se denominan nucleósidos sustituidos en 2' o nucleósidos modificados en 2.
[0412] Ciertos restos de azúcar modificados comprenden un sustituyente de azúcar puente que forma un segundo anillo, dando como resultado un resto de azúcar bicíclico. En ciertas realizaciones de este tipo, el resto de azúcar bicíclico comprende un puente entre los átomos del anillo furanosa en 4' y en 2'. Los ejemplos de dichos sustituyentes de azúcar puente en 4' a 2' incluyen, pero no se limitan a: 4'-CH<2>-2', 4'-(CH<2>)<2>-2', 4'-(CH<2>)<3>-2', 4'-CH<2>-O-2' (“LNA”), 4'-CH<2>-S-2', 4'-(CH<2>)<2>-O-2' (“ENA”), 4'-CH(CH<3>)-O-2' (denominado “etilo constreñido”) o “cET” cuando está en la configuración S), 4'-CH<2>-O-CH<2>-2', 4'-CH<2>-N(R)-2, 4'-CH(CH<2>OCH<3>)-O-2' (“MOE restringido” o “cMOE”) y análogos de los mismos (ver, p. ej., Seth y col., US-7.399.845, Bhat y col., US-7.569.686, Swayze y col., US-7.741.457, y Swayze y col., US-8.022.193), 4'-C(CH<3>)(CH<3>)-O-2' y análogos de los mismos (ver, p. ej., Seth y col., US-8.278.283), 4'-CH<2>-N(OCH<3>)-2' y análogos de los mismos (ver, p. ej., Prakash y col., US-8.278.425), 4'-CH<2>-O-N(CH<3>)-2' (ver, p. ej., Allerson y col., US-7.696.345 y Allerson y col., US-8.124.745), 4'-CH<2>-C(H)(CH<3>)-2' (ver, p. ej., Zhou y col., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134), 4'-CH<2>-C(=CH<2>)-2' y análogos de los mismos (ver, p. ej., Seth y col., US-8.278.426), 4'-C(R<a>R<b>)-N(R)-O-2', 4'-C(R<a>R<b>)-O-N(R)-2', 4'-CH<2>-O-N(R)-2' y 4'-CH<2>-N(R)-O-2', en donde cada R, R<a>y R<b>es, independientemente, H, un grupo protector, o alquilo C<1>-C<12>(ver, p. ej., Imanishi y col., US-7.427.672).
[0413] En ciertas realizaciones, dichos puentes en 4' a 2' comprenden independientemente de 1 a 4 grupos unidos seleccionados independientemente de: -[C(R<a>)(R<b>)]<n>-, -[C(R<a>)(R<b>)]<n>-O-, -C(R<a>)=C(R<b>)-, -C(R<a>)=N-, -C(=NR<a>)-, - C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R<a>)<2>-, -S(=O)<x>- y -N(R<a>)-;
[0414] en donde:
[0415] x es 0, 1 o 2;
[0416] n es 1, 2, 3 o 4;
[0417] cada R<a>y R<b>es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C<1>-C<12>, alquilo C<1>-C<12>sustituido, alquenilo C<2>-C<12>, alquenilo C<2>-C<12>sustituido, alquinilo C<2>-C<12>, alquinilo C<2>-C<12>sustituido, arilo C<5>-C<20>, arilo C<5>-C<20>sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C<5>-C<7>, radical alicíclico C<5>-C<7>sustituido, halógeno, OJ<1>, NJ<1>J<2>, SJ<1>, N<3>, COOJ<1>, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)<2>-J<1>), o sulfoxilo (S(=O)-J<1>); y cada J<1>y J<2>es, independientemente, H, alquilo C<1>-C<12>, alquilo C<1>-C<12>sustituido, alquenilo C<2>-C<12>, alquenilo C<2>-C<12>sustituido, alquinilo C<2>-C<12>, alquinilo C<2>-C<12>sustituido, arilo C<5>-C<20>, arilo C<5>-C<20>sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C<1>-C<12>, aminoalquilo C<1>-C<12>sustituido, o un grupo protector.
[0418] En la técnica se conocen restos de azúcar bicíclicos adicionales, ver, por ejemplo: Freier y col., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443, Albaek y col., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740, Singh y col., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin y col., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar y col., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh y col., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava y col., J. Am. Chem. Soc., 20017, 129, 8362-8379; Elayadi y col., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch y col., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; Orum y col., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; Wengel y col., U.S.7.053.207, Imanishi y col., US-6.268.490, Imanishi y col. US- 6.770.748, Imanishi y col, US-RE44.779; Wengel y col., US-6.794.499; Wengel y col., US-6.670.461; Wengel y col, US-7.034.133, Wengel y col, US-8.080.644; Wengel y col., US-8.034.909; Wengel y col., US-8.153.365; Wengel y col., US-7.572.582 y Ramasamy y col., US-6.525.191, Torsten y col., WO 2004/106356, Wengel y col., WO 91999/014226; Seth y col., WO 2007/134181; Seth y col., US-7.547.684; Seth y col., US-7.666.854; Seth y col., US-8.088.746; Seth y col., US-7.750.131; Seth y col., US-8.030.467; Seth y col., US-8,268,980; Seth y col., US-8,546,556; Seth y col., US-8,530,640; Migawa y col., US-9,012,421; Seth y col., US-8,501,805, y las publicaciones de patente de Allerson y col., US-2008/0039618 y Migawa y col., US-2015/0191727.
[0419] En ciertas realizaciones, los restos de azúcar bicíclicos y los nucleósidos que incorporan dichos restos de azúcar bicíclicos se definen además mediante la configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido de LNA (descrito en la presente memoria) puede estar en la configuración α-L o en la configuración β-D.
[0422]
[0425] Los nucleósidos bicíclicos α-L-metilenoxi (4'-CH<2>-O-2') o α-L-LNA se han incorporado a oligonucleótidos que mostraron actividad antisentido (Frieden y col., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372). En la presente memoria, las descripciones generales de los nucleósidos bicíclicos incluyen ambas configuraciones isoméricas. Cuando las posiciones de nucleósidos bicíclicos específicos (p. ej., LNA o cET) se identifican en las realizaciones ilustradas en la presente memoria, están en la configuración β-D, salvo que se indique lo contrario.
[0426] En ciertas realizaciones, los restos de azúcar modificados comprenden uno o más sustituyentes de azúcar no puente y uno o más sustituyentes de azúcar puente (p. ej., azúcares sustituidos en 5' y azúcares puente 4'-2').
[0427] En ciertas realizaciones, los restos de azúcar modificados son sustitutos de azúcar. En ciertas realizaciones de este tipo, el átomo de oxígeno del resto de azúcar se reemplaza, p. ej., con un átomo de azufre, carbono o nitrógeno. En ciertas realizaciones de este tipo, tales restos de azúcar modificados también comprenden sustituyentes puente y/o no puente como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, ciertos sustitutos de azúcar comprenden un átomo de azufre en 4' y una sustitución en la posición 2' (ver, p. ej., Bhat y col., US-7.875.733 y Bhat y col., US-7.939.677) y/o la posición 5'.
[0428] En ciertas realizaciones, los sustitutos de azúcar comprenden anillos que tienen más de 5 átomos. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un sustituto de azúcar comprende un tetrahidropirano (“THP”) de seis miembros. Dichos tetrahidropiranos pueden modificarse o sustituirse adicionalmente. Los nucleósidos que comprenden dichos tetrahidropiranos modificados incluyen, pero no se limitan a, el ácido nucleico hexitol (“HNA”), el ácido nucleico anitol (“ANA”), el ácido nucleico manitol (“MNA”) (ver, p. ej., Leumann, CJ. Bioorg. & Med. Chem. 2002, 10, 841-854), el flúor HNA:
[0431]
[0434] (“F-HNA”, ver, p. ej., Swayze y col., US-8.088.904; Swayze y col., US-8.440.803; Swayze y col., U.S.; y Swayze y col., US-9.005.906; el F-HNA también puede denominarse F-THP o 3'-fluoro tetrahidropirano), y los nucleósidos que comprenden compuestos de THP modificados adicionales que tienen la fórmula:
[0437]
[0439] en donde, independientemente, para cada uno de dichos nucleósidos de THP modificado:
[0440] Bx es un resto de nucleobase;
[0441] T<3>y T<4>son cada uno, independientemente, un grupo de unión internucleosídico que une el nucleósido de THP modificado al resto de un oligonucleótido o uno de T<3>y T<4>es un grupo de unión internucleosídico que une el nucleósido de THP modificado al resto de un oligonucleótido y el otro de T<3>y T<4>es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo del conjugado unido o un grupo terminal 5' o 3'; q<1>, q<2>, q<3>, q<4>, q<5>, q<6>y q<7>son cada uno, independientemente, H, alquilo C<1>-C<6>, alquilo C<1>-C<6>sustituido, alquenilo C<2>-C<6>, alquenilo C<2>-C<6>sustituido, alquinilo C<2>-C<6>o alquinilo C<2>-C<6>sustituido; y cada uno de R<1>y R<2>se selecciona independientemente de entre: hidrógeno, halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ<1>J<2>, SJ<1>, N<3>, OC(=X)J<1>, OC(=X)NJ<1>J<2>, NJ<3>C(=X)NJ<1>J<2>y CN, en donde X es O, S o NJ<1>, y cada J<1>, J<2>y J<3>es, independientemente, H o alquilo C<1>-C<6>.
[0442] En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos de THP modificados, en donde q<1>, q<2>, q<3>, q<4>, q<5>, q<6>y q<7>son cada uno H. En ciertas realizaciones, al menos uno de q<1>, q<2>, q<3>, q<4>, q<5>, q<6>y q<7>es distinto de H. En ciertas realizaciones, al menos uno de q<1>, q<2>, q<3>, q<4>, q<5>, q<6>y q<7>es metilo. En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos de THP modificados, en donde uno de R<1>y R<2>es F. En ciertas realizaciones, R<1>es F y R<2>es H; en ciertas realizaciones, R<1>es metoxi y R<2>es H; y en ciertas realizaciones, R<1>es metoxietoxi y R<2>es H.
[0443] En ciertas realizaciones, los sustitutos de azúcar comprenden anillos que tienen más de 5 átomos y más de un heteroátomo. Por ejemplo, se han descrito nucleósidos que comprenden restos de azúcar morfolino y la utilización en oligonucleótidos (ver, p. ej., Braasch y col., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510 y Summerton y col., US-5.698.685; Summerton y col., US-5.166.315; Summerton y col., US-5.034.506). Como se utiliza en este punto, el término “morfolino” significa un sustituto de azúcar que tiene la siguiente estructura:
[0444]
[0446] En ciertas realizaciones, los morfolinos pueden modificarse, por ejemplo, añadiendo o alterando varios grupos sustituyentes de la estructura de morfolino anterior. Dichos sustitutos de azúcar reciben el nombre en la presente memoria de “morfolinos modificados”.
[0447] En ciertas realizaciones, los sustitutos de azúcar comprenden restos acíclicos. Los ejemplos de nucleósidos y oligonucleótidos que comprenden dichos sustitutos de azúcar acíclicos incluyen, pero no se limitan a: ácido nucleico peptídico (“PNA”), ácido nucleico butílico acíclico (ver, p. ej., Kumar y col., Org. Biomol. Chem., 2013, 11, 5853-5865), y los nucleósidos y oligonucleótidos descritos en Manoharan y col., WO2011/133876.
[0448] En la técnica se conocen muchos otros sistemas de anillos de azúcar y sustitutos de azúcar bicíclicos y tricíclicos que pueden utilizarse en nucleósidos modificados.
[0449] 2. Nucleobases modificadas
[0450] Las modificaciones o sustituciones de nucleobases (o bases) pueden distinguirse estructuralmente de nucleobases no modificadas, ya sean naturales o sintéticas, pero pueden intercambiarse funcionalmente con ellas. Tanto las nucleobases naturales como las modificadas son capaces de participar en los enlaces de hidrógeno. Dichas modificaciones de nucleobases pueden conferir estabilidad a las nucleasas, afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido.
[0451] Los compuestos descritos en la presente memoria comprenden oligonucleótidos modificados. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos modificados comprenden uno o más nucleósidos que comprenden una nucleobase no modificada. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos modificados comprenden uno o más nucleósidos que comprenden una nucleobase modificada. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos modificados comprenden uno o más nucleósidos que no comprenden una nucleobase, denominado nucleósido abásico.
[0452] En ciertas realizaciones, las nucleobases modificadas se seleccionan de: pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas, pirimidinas sustituidas con alquilo o alquinilo, purinas sustituidas con alquilo y purinas sustituidas con N-2, N-6 y O-6. En ciertas realizaciones, las nucleobases modificadas se seleccionan de: 2-aminopropiladenina, 5-hidroximetilcitosina, 5-metilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-N-metilguanina, 6-N-metiladenina, 2-propiladenina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-propinil (C=C-CH3) uracilo, 5-propinilcitosina, 6-azouracilo, 6-azocitosina, 6-azotimina, 5-ribosiluracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo, 8-aza y otras purinas 8-sustituidas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo, 5-halouracilo y 5-halocitosina, 7-metilguanina, 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-aminoadenina, 7-desazaguanina, 7-desazaadenina, 3-desazaguanina, 3-desazaadenina, 6-N-benzoiladenina, 2-N-isobutirilguanina, 4-N-benzoilcitosina, 4-N-benzoiluracilo, 5-metil 4-N-benzoilcitosina, 5-metil 4-N-benzoiluracilo, bases universales, bases hidrófobas, bases promiscuas, bases de tamaño expandido y bases fluoradas. Las nucleobases modificadas adicionales incluyen pirimidinas tricíclicas, tales como 1,3-diazafenoxazin-2-ona, 1,3-diazafenotiazin-2-ona y 9-(2-aminoetoxi)-1,3-diazafenoxazin-2-ona (pinza G). Las nucleobases modificadas también pueden incluir aquellas en las que la base de purina o pirimidina se reemplaza con otros heterociclos, por ejemplo 7-desaza-adenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Otras nucleobases incluyen las descritas en Merigan y col., US-3.687.808, las descritas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Kroschwitz, J.I., Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858-859; Englisch y col., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613; Sanghvi, Y. S., capítulo 15, Antisense Research and Applications, Crooke, S.T. y Lebleu, B., Eds., CRC Press, 1993, 273-288; y las descritas en los capítulos 6 y 15, Antisense Drug Technology, Crooke S.T., Ed., CRC Press, 2008, 163-166 y 442-443.
[0453] Las publicaciones que enseñan la preparación de algunas de las nucleobases modificadas indicadas anteriormente, así como de otras nucleobases modificadas, incluyen, sin limitación, Manoharan y col., US-2003/0158403, Manoharan y col., US-2003/0175906; Dinh y col., US-4.845.205: Spielvogel y col., US-5.130.302; Rogers y col., US-5.134.066; Bischofberger y col., US-5.175.273; Urdea y col., US-5.367.066; Benner y col., US-5.432.272; Matteucci y col., US-5.434.257; Gmeiner y col., US-5.457.187; Cook y col., US-5.459.255; Froehler y col., US-5.484.908; Matteucci y col., US-5.502.177; Hawkins y col., US-5.525.711; Haralambidis y col., US-552.540; Cook y col., US-5.587.469; Froehler y col., US-5.594.121; Switzer y col., US-5.596.091; Cook y col., US-5.614.617; Froehler y col., US-5.645.985; Cook y col., US-5.681.941; Cook y col., US-5.811.534; Cook y col., US-5.750.692; Cook y col., US-5.948.903; Cook y col., US-5.587.470; Cook y col., US-5.457.191; Matteucci y col., US-5.763.588; Froehler y col., US-5.830.653; Cook y col., US-5.808.027; Cook y col., 6.166.199; y Matteucci y col., US-6.005.096.
[0454] En ciertas realizaciones, los compuestos de localización específica de un ácido nucleico diana comprenden una o más nucleobases modificadas. En ciertas realizaciones, la nucleobase modificada es la 5-metilcitosina. En ciertas realizaciones, cada citosina es una 5-metilcitosina.
[0455] 3. Enlaces internucleosídicos modificados
[0456] El enlace internucleosídico natural del ARN y el ADN es un enlace fosfodiéster de 3' a 5'. En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente memoria que tienen uno o más enlaces internucleosídicos modificados, es decir, que no se originan de forma natural, se seleccionan frecuentemente en lugar de los compuestos que tienen enlaces internucleosídicos naturales debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, una mayor absorción celular, una mayor afinidad por los ácidos nucleotídicos diana y una mayor estabilidad en presencia de nucleasas.
[0457] En ciertas realizaciones, los compuestos de localización específica de un ácido nucleico diana comprenden uno o más enlaces internucleosídicos modificados. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos modificados son enlaces fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico de un compuesto antisentido es un enlace internucleosídico fosforotioato.
[0458] Los compuestos descritos en la presente memoria comprenden oligonucleótidos. Los oligonucleótidos que tienen enlaces internucleosídicos modificados incluyen enlaces internucleosídicos que retienen un átomo de fósforo, así como enlaces internucleosídicos que no tienen un átomo de fósforo. Los enlaces internucleosídicos representativos que contienen fósforo incluyen, pero no se limitan a, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato y fosforotioatos. Los métodos de preparación de enlaces que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos.
[0459] En ciertas realizaciones, los nucleósidos de los oligonucleótidos modificados pueden unirse entre sí utilizando cualquier enlace internucleosídico. Las dos clases principales de grupos de unión internucleosídicos se definen por la presencia o ausencia de un átomo de fósforo. Los enlaces internucleosídicos representativos que contienen fósforo incluyen, pero no se limitan a, fosfatos, que contienen un enlace fosfodiéster (“P=O”) (también denominados enlaces no modificados o de origen natural), fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidatos y fosforotioatos (“P=S”) y fosforoditioatos (“HS-P=S”). Los grupos de unión internucleosídicos representativos que no contienen fósforo incluyen, pero no se limitan a, metilenmetilimino (-CH2-N(CH3)-O-CH2-), tiodiéster, tionocarbamato (-O-C(=O)(NH)-S-); siloxano (-O-SiH2-O-); y N,N'-dimetilhidrazina (-CH2-N(CH3)-N(CH3)-). Los enlaces internucleosídicos modificados, en comparación con los enlaces fosfato de origen natural, pueden utilizarse para alterar, típicamente aumentar, la resistencia a las nucleasas del oligonucleótido. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos que tienen un átomo quiral pueden prepararse como una mezcla racémica o como enantiómeros separados. Los enlaces internucleosídicos quirales representativos incluyen, pero no se limitan a, alquilfosfonatos y fosforotioatos. Los expertos en la técnica conocen bien los métodos de preparación de enlaces internucleosídicos que contienen fósforo y que no contienen fósforo.
[0460] Los enlaces internucleosídicos neutros incluyen, sin limitación, fosfotriésteres, metilfosfonatos, MMI (3'-CH2-N(CH3)-O-5'), amida-3 (3'-CH2-C(=O)-N(H)-5'), amida-4 (3'-CH2-N(H)-C(=O)-5'), formacetal (3'-O-CH2-O-5'), metoxipropilo y tioformacetal (3'-S-CH2-O-5'). Otros enlaces internucleosídicos neutros incluyen enlaces no iónicos que comprenden siloxano (dialquilsiloxano), éster de carboxilato, carboxamida, sulfuro, éster de sulfonato y amidas (ver, por ejemplo: Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y.S. Sanghvi y P.D. Cook, Eds., volumen 580 de la ACS Symposium Series; capítulos 3 y 4, 40-65). Los enlaces internucleosídicos neutros adicionales incluyen enlaces no iónicos que comprenden partes componentes mixtas de N, O, S y CH2.
[0461] En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden enlaces internucleosídicos modificados dispuestos a lo largo del oligonucleótido o región del mismo en un patrón definido o motivo de enlace internucleosídico modificado. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos se disponen en un motivo con huecos. En tales realizaciones, los enlaces internucleosídicos en cada una de las dos regiones de ala son diferentes de los enlaces internucleosídicos en la región de hueco. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos en las alas son fosfodiéster y los enlaces internucleosídicos en el hueco son fosforotioato. El motivo nucleosídico se selecciona de forma independiente, por lo que dichos oligonucleótidos que tienen un motivo de enlace internucleosídico con hueco pueden tener o no un motivo nucleosídico con hueco y, si tienen un motivo nucleosídico con huecos, las longitudes del ala y del hueco pueden ser las mismas o no.
[0462] En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región que tiene un motivo de enlace internucleosídico alterno. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región de enlaces internucleosídicos modificados uniformemente. En ciertas realizaciones de este tipo, el oligonucleótido comprende una región que se une uniformemente mediante enlaces internucleosídicos fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido se une uniformemente mediante fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido se selecciona de fosfodiéster y fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido se selecciona de fosfodiéster y fosforotioato y al menos un enlace internucleosídico es fosforotioato.
[0463] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos 6 enlaces internucleosídicos fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos 8 enlaces internucleosídicos fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos 10 enlaces internucleosídicos fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 6 enlaces internucleosídicos fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 8 enlaces internucleosídicos fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 10 enlaces internucleosídicos fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 12 enlaces internucleosídicos fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones de este tipo, al menos uno de dichos bloques está ubicado en el extremo 3' del oligonucleótido. En ciertas realizaciones de este tipo, al menos uno de dichos bloques está ubicado dentro de los 3 nucleósidos del extremo 3' del oligonucleótido.
[0464] En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden uno o más enlaces metilfosfonato. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos que tienen un motivo nucleosídico gapmer comprenden un motivo de enlace que comprende todos los enlaces fosforotioato con la excepción de uno o dos enlaces metilfosfonato. En ciertas realizaciones, un enlace metilfosfonato está en el hueco central de un oligonucleótido que tiene un motivo nucleosídico gapmer.
[0465] En ciertas realizaciones, es deseable disponer el número de enlaces internucleosídicos fosforotioato y enlaces internucleosídicos fosfodiéster para mantener la resistencia a las nucleasas. En ciertas realizaciones, es deseable disponer el número y la posición de los enlaces internucleosídicos fosforotioato y el número y la posición de los enlaces internucleosídicos fosfodiéster para mantener la resistencia a las nucleasas. En ciertas realizaciones, el número de enlaces internucleosídicos fosforotioato puede disminuirse y el número de enlaces internucleosídicos fosfodiéster puede aumentarse. En ciertas realizaciones, el número de enlaces internucleosídicos fosforotioato puede disminuirse y el número de enlaces internucleosídicos fosfodiéster puede aumentarse, al tiempo que se mantiene la resistencia a las nucleasas. En ciertas realizaciones, es deseable disminuir el número de enlaces internucleosídicos fosforotioato, conservando al mismo tiempo la resistencia a las nucleasas. En ciertas realizaciones, es deseable aumentar el número de enlaces internucleosídicos fosfodiéster, conservando al mismo tiempo la resistencia a las nucleasas.
[0466] 4. Ciertos motivos
[0467] Los compuestos descritos en la presente memoria comprenden oligonucleótidos. Los oligonucleótidos pueden tener un motivo, p. ej., un patrón de restos de azúcar, nucleobases y/o enlaces internucleosídicos no modificados y/o modificados. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos modificados comprenden uno o más nucleósidos modificados que comprenden un azúcar modificado. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos modificados comprenden uno o más nucleósidos modificados que comprenden una nucleobase modificada. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos modificados comprenden uno o más enlaces internucleosídicos modificados. En tales realizaciones, los restos de azúcar, nucleobases y/o enlaces internucleosídicos modificados, no modificados y modificados de manera diferente de un oligonucleótido modificado definen un patrón o motivo. En ciertas realizaciones, los patrones de restos de azúcar, nucleobases y enlaces internucleosídicos son cada uno independientes entre sí. Por lo tanto, un oligonucleótido modificado puede describirse según su motivo de azúcar, motivo de nucleobase y/o motivo de enlace internucleosídico (como se utiliza en la presente memoria, el motivo de nucleobase describe las modificaciones en las nucleobases independientemente de la secuencia de nucleobases).
[0468] 1. Ciertos motivos de azúcar
[0469] En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden uno o más tipos de azúcar modificado y/o resto de azúcar no modificado dispuestos a lo largo del oligonucleótido o región del mismo en un patrón o motivo de azúcar definido. En ciertas realizaciones, dichos motivos de azúcar incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de las modificaciones de azúcar descritas en la presente memoria.
[0470] En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos modificados comprenden o consisten en una región que tiene un motivo gapmer, que comprende dos regiones externas o “alas” y una región central o interna o “hueco”. Las tres regiones de un motivo gapmer (el ala 5', el hueco y el ala 3') forman una secuencia contigua de nucleósidos en donde al menos algunos de los restos de azúcar de los nucleósidos de cada una de las alas difieren de al menos algunos de los restos de azúcar de los nucleósidos del hueco. Específicamente, al menos los restos de azúcar de los nucleósidos de cada ala que están más cerca del hueco (el nucleósido más 3' del ala 5' y el nucleósido más 5' del ala 3') difieren del resto de azúcar de los nucleósidos hueco contiguos, definiendo así el límite entre las alas y el hueco (es decir, la unión ala/hueco). En ciertas realizaciones, los restos de azúcar dentro del hueco son los mismos entre sí. En ciertas realizaciones, el hueco incluye uno o más nucleósidos que tienen un resto de azúcar que difiere del resto de azúcar de uno o más de los otros nucleósidos del hueco. En ciertas realizaciones, los motivos de azúcar de las dos alas son los mismos entre sí (gapmer simétrico). En ciertas realizaciones, el motivo de azúcar del ala en 5' difiere del motivo de azúcar del ala en 3' (gapmer asimétrico).
[0471] En ciertas realizaciones, las alas de un gapmer comprenden 1-5 nucleósidos. En ciertas realizaciones, las alas de un gapmer comprenden 2-5 nucleósidos. En ciertas realizaciones, las alas de un gapmer comprenden 3-5 nucleósidos. En ciertas realizaciones, los nucleósidos de un gapmer son todos nucleósidos modificados.
[0472] En ciertas realizaciones, el hueco de un gapmer comprende 7-12 nucleósidos. En ciertas realizaciones, el hueco de un gapmer comprende 7-10 nucleósidos. En ciertas realizaciones, el hueco de un gapmer comprende 8-10 nucleósidos. En ciertas realizaciones, el hueco de un gapmer comprende 10 nucleósidos. En ciertas realizaciones, cada nucleósido del hueco de un gapmer es un nucleósido 2'-desoxi no modificado.
[0473] En ciertas realizaciones, el gapmer es un gapmer de desoxi. En tales realizaciones, los nucleósidos en el lado del hueco de cada unión ala/hueco son nucleósidos 2'-desoxi no modificados y los nucleósidos en los lados del ala de cada unión ala/hueco son nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones de este tipo, cada nucleósido del hueco es un nucleósido 2'-desoxi no modificado. En ciertas realizaciones de este tipo, cada nucleósido de cada ala es un nucleósido modificado.
[0474] En ciertas realizaciones, un oligonucleótido modificado tiene un motivo de azúcar totalmente modificado, en donde cada nucleósido del oligonucleótido modificado comprende un resto de azúcar modificado. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos modificados comprenden o consisten en una región que tiene un motivo de azúcar totalmente modificado, en donde cada nucleósido de la región comprende un resto de azúcar modificado. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos modificados comprenden o consisten en una región que tiene un motivo de azúcar totalmente modificado, en donde cada nucleósido dentro de la región totalmente modificada comprende el mismo resto de azúcar modificado, denominado en la presente memoria un motivo de azúcar modificado uniformemente. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido totalmente modificado es un oligonucleótido modificado uniformemente. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de un oligonucleótido modificado uniformemente comprende la misma modificación en 2'.
[0475] 2. Ciertos motivos de nucleobase
[0476] En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden nucleobases modificadas y/o no modificadas dispuestas a lo largo del oligonucleótido o región del mismo en un patrón o motivo definido. En ciertas realizaciones, cada nucleobase se modifica. En ciertas realizaciones, ninguna de las nucleobases se modifica. En ciertas realizaciones, cada purina o cada pirimidina se modifica. En ciertas realizaciones, cada adenina se modifica. En ciertas realizaciones, cada guanina se modifica. En ciertas realizaciones, cada timina se modifica. En ciertas realizaciones, cada uracilo se modifica. En ciertas realizaciones, cada citosina se modifica. En ciertas realizaciones, algunas o todas las nucleobases de citosina en un oligonucleótido modificado son 5-metilcitosinas.
[0477] En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos modificados comprenden un bloque de nucleobases modificadas. En ciertas realizaciones de este tipo, el bloque está en el extremo 3' del oligonucleótido. En ciertas realizaciones, el bloque está dentro de los 3 nucleósidos del extremo 3' del oligonucleótido. En ciertas realizaciones, el bloque está en el extremo 5' del oligonucleótido. En ciertas realizaciones, el bloque está dentro de los 3 nucleósidos del extremo 5' del oligonucleótido.
[0478] En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos que tienen un motivo gapmer comprenden un nucleósido que comprende una nucleobase modificada. En ciertas realizaciones de este tipo, un nucleósido que comprende una nucleobase modificada está en el hueco central de un oligonucleótido que tiene un motivo gapmer. En ciertas realizaciones de este tipo, el resto de azúcar de dicho nucleósido es un resto de 2'-desoxirribosilo. En ciertas realizaciones, la nucleobase modificada se selecciona de: una 2-tiopirimidina y una 5-propinopirimidina.
[0479] 3. Ciertos motivos de enlace internucleosídico
[0480] En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden enlaces internucleosídicos modificados y/o no modificados dispuestos a lo largo del oligonucleótido o región del mismo en un patrón o motivo definido. En ciertas realizaciones, esencialmente cada grupo de unión internucleosídico es un enlace internucleosídico de fosfato (P=O). En ciertas realizaciones, cada grupo de unión internucleosídico de un oligonucleótido modificado es un fosforotioato (P=S). En ciertas realizaciones, cada grupo de unión internucleosídico de un oligonucleótido modificado se selecciona, independientemente entre sí, de un enlace internucleosídico fosforotioato y un enlace internucleosídico fosfato. En ciertas realizaciones, el motivo de azúcar de un oligonucleótido modificado es un gapmer y los enlaces internucleosídicos dentro del hueco están todos modificados. En ciertas realizaciones de este tipo, algunos o todos los enlaces internucleosídicos en las alas son enlaces fosfato no modificados. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos terminales se modifican.
[0481] 5. Ciertos oligonucleótidos modificados
[0482] En ciertas realizaciones, las modificaciones anteriores (azúcar, nucleobase, enlace internucleosídico) se incorporan en un oligonucleótido modificado. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos modificados se caracterizan por su modificación, motivos y longitudes totales. En ciertas realizaciones, dichos parámetros son cada uno independientes entre sí. Por lo tanto, salvo que se indique lo contrario, cada enlace internucleosídico de un oligonucleótido que tiene un motivo de azúcar gapmer puede modificarse o no modificarse y puede o no seguir el patrón de modificación de gapmer de las modificaciones de azúcar. Por ejemplo, los enlaces internucleosídicos dentro de las regiones de ala de un gapmer de azúcar pueden ser iguales o diferentes entre sí y pueden ser iguales o diferentes de los enlaces internucleosídicos de la región de hueco del motivo de azúcar. De la misma manera, dichos oligonucleótidos gapmer pueden comprender una o más nucleobases modificadas independientemente del patrón de gapmer de las modificaciones de azúcar. Además, en ciertos casos, un oligonucleótido se describe mediante una longitud o rango total y mediante longitudes o rangos de longitud de dos o más regiones (p. ej., regiones de nucleósidos que tienen modificaciones de azúcar específicas); en tales circunstancias puede ser posible seleccionar números para cada rango que den como resultado un oligonucleótido con una longitud total que quede fuera del rango especificado. En tales circunstancias, deben cumplirse ambos elementos. Por ejemplo, en ciertos casos, un oligonucleótido modificado consiste en 15-20 nucleósidos unidos y tiene un motivo de azúcar que consiste en tres regiones, A, B y C, en donde la región A consiste en 2-6 nucleósidos unidos que tienen un motivo de azúcar específico, la región B consiste en 6-10 nucleósidos unidos que tienen un motivo de azúcar específico y la región C consiste en 2-6 nucleósidos unidos que tienen un motivo de azúcar específico. Dichas realizaciones no incluyen oligonucleótidos modificados donde A y C consisten cada uno en 6 nucleósidos unidos y B consiste en 10 nucleósidos unidos (aunque esos números de nucleósidos están permitidos dentro de los requisitos para A, B y C) porque la longitud total de dicho oligonucleótido es 22, lo que supera el límite superior de la longitud total del oligonucleótido modificado (20). En este caso, si la descripción de un oligonucleótido no dice nada con respecto a uno o más parámetros, dicho parámetro no está limitado. Por lo tanto, un oligonucleótido modificado descrito solo por tener un motivo de azúcar de gapmer sin descripción adicional puede tener cualquier longitud, motivo de enlace internucleosídico y motivo de nucleobase. Salvo que se indique lo contrario, todas las modificaciones son independientes de la secuencia de nucleobases.
[0483] Ciertos compuestos conjugados
[0484] Los grupos del conjugado consisten en uno o más restos del conjugado y un conector del conjugado que une el resto del conjugado al oligonucleótido. Los grupos del conjugado pueden unirse a uno o ambos extremos de un oligonucleótido y/o en cualquier posición interna. En ciertas realizaciones, los grupos del conjugado se unen a la posición 2' de un nucleósido de un oligonucleótido modificado. En ciertas realizaciones, los grupos del conjugado que se unen a uno o ambos extremos de un oligonucleótido son grupos terminales. En ciertas realizaciones de este tipo, los grupos del conjugado o los grupos terminales se unen en el extremo 3' y/o 5' de los oligonucleótidos. En ciertas realizaciones de este tipo, los grupos del conjugado (o grupos terminales) se unen en el extremo 3' de los oligonucleótidos. En ciertas realizaciones, los grupos del conjugado se unen cerca del extremo 3' de los oligonucleótidos. En ciertas realizaciones, los grupos del conjugado (o grupos terminales) se unen en el extremo 5' de los oligonucleótidos. En ciertas realizaciones, los grupos del conjugado se unen cerca del extremo 5' de los oligonucleótidos.
[0485] Los ejemplos de grupos terminales incluyen, pero no se limitan a, grupos del conjugado, grupos de terminación, restos de fosfato, grupos protectores, nucleósidos modificados o no modificados y dos o más nucleósidos que se modifican o no de forma independiente.
[0486] Restos del conjugado del ligando del receptor del GLP-1
[0487] Un compuesto descrito en la presente memoria comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1. En ciertas realizaciones, el conector del conjugado une el resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 al oligonucleótido. El oligonucleótido es un oligonucleótido modificado. En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 comprende una molécula pequeña, un aptámero, un anticuerpo o un péptido.
[0488] 1. Ciertos restos del conjugado de molécula pequeña del receptor del GLP-1
[0489] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado de molécula pequeña capaz de unirse al receptor del GLP-1. El oligonucleótido es un oligonucleótido modificado.
[0490] Cualquier resto del conjugado de molécula pequeña capaz de unirse al receptor del GLP-1 conocido en la técnica puede utilizarse en varias realizaciones. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el resto del conjugado de molécula pequeña capaz de unirse al receptor del GLP-1 es un antagonista del receptor del GLP-1 de molécula pequeña descrito en Willard y col., “Small Molecule Drug Discovery at the Glucagon Like Peptide-1 Receptor”, Experimental Diabetes Research, vol. 2012, págs. 1-9; Sloop y col., “Novel Small Molecule Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Agonist Stimulates Insulin Secretion in Rodents and From Human Islets”, revista Diabetes, vol. 59, 2010, págs. 3099-3107; Knudsen y col., “Small-molecule agonists for the glucagon-like peptide 1 receptor”, PNAS 2007 16 de enero; 104(3):937-42; o Wang y col., “Non-peptidic glucose-like peptide-1 receptor agonists: aftermath of a serendipitous discovery”, Acta Pharmacologica Sinica (2010) 31: 1026-1030.
[0491] En ciertas realizaciones, el resto del conjugado de molécula pequeña capaz de unirse al receptor del GLP-1 tiene cualquiera de las siguientes fórmulas:
[0492]
[0493]
[0496] 2. Ciertos restos del conjugado de anticuerpo contra el receptor del GLP-1
[0497] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un anticuerpo o fragmento del mismo capaz de unirse al receptor del GLP-1. El oligonucleótido es un oligonucleótido modificado. Cualquier anticuerpo o fragmento del mismo capaz de unirse al receptor del GLP-1 conocido en la técnica puede utilizarse en varias realizaciones. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un anticuerpo o fragmento del mismo capaz de unirse al receptor del GLP-1 descrito en los documentos WO 2005018536, US 20060275288, US 8.389.689 o WO2011056644.
[0498] 3. Ciertos restos del conjugado del péptido GLP-1
[0499] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un péptido GLP-1 o un fragmento o mutante del mismo. El oligonucleótido es un oligonucleótido modificado. Cualquier péptido GLP-1 o fragmento o mutante del mismo conocido en la técnica puede utilizarse en varias realizaciones. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un péptido GLP-1 descritos en los documentos US 20140206607; US 9.187.522; US 8.329.419; o WO 2007/124461.
[0500] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende una porción de al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 aminoácidos contiguos que presenta al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % de homología con una porción de igual longitud de la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-37): HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG, que en el código convencional de tres letras es: His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (Id. de sec. n.°: 1). En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende una porción de al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 aminoácidos contiguos que presenta al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % de homología con una porción de igual longitud de la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-37): HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG-NH<2>(Id. de sec. n.°: 1), en donde NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal.
[0501] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende una porción de al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 aminoácidos contiguos que presenta al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % de identidad con una porción de igual longitud de la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-37).
[0502] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que tiene una longitud de 8 a 50 aminoácidos y presenta al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % de homología en toda su longitud con la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-37) (Id. de sec. n.°: 1).
[0503] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que tiene una longitud de 8 a 50 aminoácidos y presenta al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % de identidad en toda su longitud con la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-37) (Id. de sec. n.°: 1).
[0504] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-37) (Id. de sec. n.°: 1). En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que consiste en la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-37) (Id. de sec. n.°: 1). En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-36)amida: HAEGTFTSDV SSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH<2>, que en el código convencional de tres letras es: His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH<2>(Id. de sec. n.°: 2). En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-36):HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR, que en el código convencional de tres letras es: His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (Id. de sec. n.°: 2).
[0505] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que consiste en la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-36)amida (Id. de sec. n.°: 2). En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que consiste en la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-36) (Id. de sec. n.°: 2). En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende la secuencia de aminoácidos: EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKG, que en el código convencional de tres letras es: Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (Id. de sec. n.°: 3). En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende la secuencia de aminoácidos: EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKG-NH<2>(Id. de sec. n.°: 3), en donde NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal.
[0506] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que consiste en la secuencia de aminoácidos: EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKG, que en el código convencional de tres letras es: Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (Id. de sec. n.°: 3). En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que consiste en la secuencia de aminoácidos: EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKG-NH<2>(Id. de sec. n.°: 3), en donde NH<2>indica la amida C-terminal.
[0507] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende la secuencia de aminoácidos: EGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKG, que en el código convencional de tres letras es: Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (Id. de sec. n.°: 4). En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende la secuencia de aminoácidos: EGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKG-NH<2>(Id. de sec. n.°:<:>4), en donde NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal.
[0508] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que consiste en la secuencia de aminoácidos: EGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKG, que en el código convencional de tres letras es: Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (Id. de sec. n.°: 4). En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que consiste en la secuencia de aminoácidos: EGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKG-NH<2>(Id. de sec. n.°:<:>4), en donde NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal.
[0510] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un análogo del resto del conjugado del péptido GLP-1 que incluye, pero no se limita a, liraglutida (VICTOZA<®>de Novo Nordisk); albiglutida (SYNCRIA<®>de GlaxoSmithKline); taspoglutida (Hoffman La-Roche); LY2189265 (Eli Lilly and Company); LY2428757 (Eli Lilly y compañía); desamino- His7, Arg26, Lys34-(nε(γ-Glu(N-α-hexadecanoilo)))-GLP-1(7-37); desamino-His7, Arg26, Lys34(nε-octanoil)-GLP-1(7-37); Arg26,34, Lys38(Nε-(Ω-carboxipentadecanoílo))-GLP-1(7-38); Arg26,34, Lys36(Nε-(γ-Glu(N-α-hexadecanoilo)))-GLP-1(7-36); Aib8.35, Arg26,34, Phe31-GLP-1(7-36)) (Id. de sec. n.°: 5); HXaa8EGTFTSDVSSYLEXaa22Xaa23AAKEFIXaa30WLXaa33Xaa34G Xaa36Xaa37; en donde Xaa8 es A, V o G; Xaa22 es G, K o E; Xaa23 es Q o K; Xaa30 es A o E; Xaa33 es V o K; Xaa34 es K, N o R; Xaa36 es R o G; y Xaa37 es G, H, P o está ausente (Id. de sec. n.°: 6); Arg34-GLP-1(7-37) (Id. de sec. n.°: 7); Glu30-GLP-1(7-37) (Id. de sec. n.°: 8); Lys22-GLP-1(7-37) (Id. de sec. n.°: 9); Gly8.36, Glu22-GLP-1(7-37) (Id. de sec. n.°: 10); Val8, Glu22, Gly36-GLP-1(7-37) (Id. de sec. n.°: 11); Gly8.36, Glu22, Lys33, Asn34-GLP-1(7-37) (Id. de sec. n.°: 12); Val8, Glu22, Lys33, Asn34, Gly36-GLP-1(7-37) (Id. de sec. n.°: 13); Gly8.36, Glu22, Pro37-GLP-1(7-37) (Id. de sec. n.°: 14); Val8, Glu22, Gly36Pro37-GLP-1(7-37) (Id. de sec. n.°: 15); Gly8.36, Glu22, Lys33, Asn34, Pro37-GLP-1(7-37) (Id. de sec. n.°: 16); Val8, Glu22, Lys33, Asn34, Gly36Pro37-GLP-1(7-37) (Id. de sec. n.°: 17); Gly8.36, Glu22-GLP-1(7-36) (Id. de sec. n.°: 18); Val8, Glu22, Gly36-GLP-1(7-36) (Id. de sec. n.°: 19); Val8, Glu22, Asn34, Gly36-GLP-1(7-36) (Id. de sec. n.°: 20); Gly8.36, Glu22, Asn34-GLP-1(7-36) (Id. de sec. n.°: 21). Cualquiera de los análogos anteriores puede amidarse opcionalmente.
[0512] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un análogo del resto del conjugado del péptido GLP-1 que incluye, pero no se limita a, iraglutida, taspoglutida, exenatida, lixisenatida y semaglutida. Estos análogos se describen en Lorenz M y col., “Recent progress and future options in the development of GLP-1 receptor agonists for the treatment of diabesity”, Bioorg Med Chem Lett. 2013 julio 15;23(14):4011-8.
[0514] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: H-AibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSSGAPPPSC-NH<2>(Id. de sec. n.°: 22), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys (Id. de sec. n.°: 22) en donde Aib es ácido aminoisobutírico.
[0516] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: H-AibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSSGAPPPSX-NH<2>(Id. de sec. n.°: 23), en donde Aib es ácido aminoisobutírico, X es penicilamina y NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Pen (Id. de sec. n.°: 23), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y Pen es penicilamina.
[0518] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRC, que en el código convencional de tres letras es: His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Cys (Id. de sec. n.°: 24). En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRC-NH<2>(Id. de sec. n.°: 24), en donde NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal.
[0520] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS (Id. de sec. n.°: 25). En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH<2>(Id. de sec. n.°: 25), en donde H indica el extremo N-terminal y NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal.
[0522] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: AGEGTF TSDVSSYLEGQAAKEAIAWLVKGGPSSGAPPPSC, que en el código convencional de tres letras es: Ala-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-SerSer-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys (Id. de sec. n.°: 26). En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: AGEGTF TSDVSSYLEGQAAKEAIAWLVKGGPSSGAPPPSC-NH<2>(Id. de sec. n.°: 26), en donde NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal.
[0524] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: AGEGTF TSDVSSYLEGQAAKEAIAWLVKGGPSSGAPPPSX, en donde X es penicilamina, que en el código convencional de tres letras es: Ala-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Pen, en donde Pen es penacilamina (Id. de sec. n.°: 27). En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: AGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEAIAWLVKGGPSSGAPPPSX-NH<2>(Id. de sec. n.°: 27), en donde X es penicilamina y NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal.
[0526] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLV, que en el código convencional de tres letras es: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val (Id. de sec. n.°: 28), en donde Aib es ácido aminoisobutírico. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLV-NH<2>(Id. de sec. n.°: 28), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal.
[0528] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVK, que en el código convencional de tres letras es: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys (Id. de sec. n.°: 29), en donde Aib es ácido aminoisobutírico. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVK-NH<2>(Id. de sec. n.°: 29), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal.
[0530] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKG, que en el código convencional de tres letras es: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (Id. de sec. n.°: 30), en donde Aib es ácido aminoisobutírico. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKG-NH<2>(Id. de sec. n.°: 30), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal.
[0532] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGG, que en el código convencional de tres letras es: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly (Id. de sec. n.°: 31), en donde Aib es ácido aminoisobutírico. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGG-NH<2>(Id. de sec. n.°: 31), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal.
[0534] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGP, que en el código convencional de tres letras es: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro (Id. de sec. n.°: 32), en donde Aib es ácido aminoisobutírico. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGP-NH<2>, (Id. de sec. n.°: 32), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal.
[0536] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPS, que en el código convencional de tres letras es: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser (Id. de sec. n.°: 33), en donde Aib es ácido aminoisobutírico. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPS-NH<2>(Id. de sec. n.°: 33), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal.
[0537] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSS, que en el código convencional de tres letras es: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser (Id. de sec. n.°: 34), en donde Aib es ácido aminoisobutírico. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSS-NH<2>(Id. de sec. n.°: 34), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal.
[0538] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSSG, que en el código convencional de tres letras es: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly (Id. de sec. n.°: 35), en donde Aib es ácido aminoisobutírico. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSSG-NH<2>(Id. de sec. n.°: 35), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal.
[0539] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSSGA, que en el código convencional de tres letras es: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala (Id. de sec. n.°: 36), en donde Aib es ácido aminoisobutírico. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSSGA-NH<2>(Id. de sec. n.°: 36), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal.
[0540] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSSGAP, que en el código convencional de tres letras es: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro (Id. de sec. n.°: 37), en donde Aib es ácido aminoisobutírico. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSSGAP-NH<2>(Id. de sec. n.°: 37), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSZ, que en el código convencional de tres letras es: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Zaa (Id. de sec. n.°: 38), en donde Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0543]
[0545] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HGEGTFTSDLSKQMEEEA VRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSZ-NH<2>(Id. de sec. n.°: 38), en donde NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal y Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0546]
[0548] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRGZ, que en el código convencional de tres letras es: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-Zaa (Id. de sec. n.°: 39), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0551]
[0553] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRGZ-NH<2>(Id. de sec. n.°: 39), en donde Aib es ácido aminoisobutírico, NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal y Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0556]
[0558] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEGQAANXEFIAWLVRGRG, que en el código convencional de tres letras es: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Asn-Xaa-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly (Id. de sec. n.°: 40), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y X o Xaa es lisina (amida del ácido 5-azidopentanoico) que tiene la fórmula:
[0561]
[0563] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEGQAANXEFIAWLVRGRG-NH<2>(Id. de sec. n.°: 40), en donde Aib es ácido aminoisobutírico, NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal y X o Xaa es lisina (amida del ácido 5-azidopentanoico) que tiene la fórmula:
[0564]
[0566] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVK-AibRZ, que en el código convencional de tres letras es: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg-Zaa (Id. de sec. n.°: 41), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0569]
[0571] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVK-AibRZ-NH<2>(Id. de sec. n.°: 41), en donde Aib es ácido aminoisobutírico, NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal y Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0574]
[0576] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HSEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRZ, que en el código convencional de tres letras es: His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Zaa (Id. de sec. n.°: 42), en donde Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0579]
[0581] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HSEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRZ-NH<2>(Id. de sec. n.°: 42), en donde NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal y Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0584]
[0585] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSSGAPPZ, que en el código convencional de tres letras es: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Zaa (Id. de sec. n.°: 43), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0588]
[0590] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSSGAPPZ-NH<2>(Id. de sec. n.°: 43), en donde Aib es ácido aminoisobutírico, NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal y Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0593]
[0595] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSSZ, que en el código convencional de tres letras es: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Zaa (Id. de sec. n.°: 44), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0598]
[0600] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSSZ-NH<2>(Id. de sec. n.°: 44), en donde Aib es ácido aminoisobutírico, NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal y Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0603]
[0605] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKZ, que en el código convencional de tres letras es: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Zaa (Id. de sec. n.°: 45), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0606]
[0608] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKZ-NH<2>(Id. de sec. n.°: 45), en donde Aib es ácido aminoisobutírico, NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal y Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0611]
[0613] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVZ, que en el código convencional de tres letras es: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Zaa (Id. de sec. n.°: 46), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0616]
[0618] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVZ-NH<2>(Id. de sec. n.°<:>46), en donde Aib es ácido aminoisobutírico, NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal y Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0621]
[0623] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVC, que en el código convencional de tres letras es: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Cys (Id. de sec. n.°: 47), en donde Aib es ácido aminoisobutírico.
[0624] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVC-NH<2>(Id. de sec. n.°: 47), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal.
[0625] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLZ, que en el código convencional de tres letras es: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Zaa (Id. de sec. n.°: 48), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0626]
[0628] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLZ-NH<2>(Id. de sec. n.°: 48), en donde Aib es ácido aminoisobutírico, NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal y Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0631]
[0633] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWZ, que en el código convencional de tres letras es: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Zaa (Id. de sec. n.°: 49), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0636]
[0638] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWZ-NH<2>(Id. de sec. n.°: 49), en donde Aib es ácido aminoisobutírico, NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal y Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0641]
[0643] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAZ, que en el código convencional de tres letras es: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Zaa (Id. de sec. n.°: 50), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0646]
[0647] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAZ-NH<2>(Id. de sec. n.°: 50), en donde Aib es ácido aminoisobutírico, NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal y Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0650]
[0652] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGZ, que en el código convencional de tres letras es: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Zaa (Id. de sec. n.°: 51), en donde Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0655]
[0657] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGZ-NH<2>(Id. de sec. n.°: 51), en donde NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal, y Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0660]
[0662] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNZ, que en el código convencional de tres letras es: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Zaa (Id. de sec. n.°: 52), en donde Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0665]
[0667] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNZ-NH<2>(Id. de sec. n.°: 52), en donde NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal y Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0668]
[0670] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKZ, que en el código convencional de tres letras es: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Zaa (Id. de sec. n.°: 53), en donde Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0673]
[0675] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKZ-NH<2>(Id. de sec. n.°: 53), en donde NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal y Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0678]
[0680] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLZ, que en el código convencional de tres letras es: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Zaa (Id. de sec. n.°: 54), en donde Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0683]
[0685] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLZ-NH<2>(Id. de sec. n.°: 54), en donde NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal y Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0688]
[0689] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWZ, que en el código convencional de tres letras es: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Zaa (Id. de sec. n.°: 55), en donde Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0691]
[0693] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWZ-NH<2>(Id. de sec. n.°: 55), en donde NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal y Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0695]
[0697] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSSGAPPPSZ, que en el código convencional de tres letras es: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Zaa (Id. de sec. n.°: 56), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0699]
[0701] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSSGAPPPSZ-NH<2>(Id. de sec. n.°: 56), en donde Aib es ácido aminoisobutírico, NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal y Z o Zaa es 4-azidonorleucina que comprende:
[0703]
[0705] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSC, que en el código convencional de tres letras es: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys (Id. de sec. n.°: 57).
[0706] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos: HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSC-NH<2>(Id. de sec. n.°: 57), en donde NH<2>indica la amida en el extremo C-terminal.
[0707] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende una porción de al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 aminoácidos contiguos que tiene al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % de identidad con una porción de igual longitud de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de sec. n.°: 1-57.
[0708] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 de 8 a 50 aminoácidos de longitud que tiene al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % de homología en toda su longitud con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las Id. de sec. n.°: 1-57.
[0709] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que tiene una longitud de 8 a 50 aminoácidos y presenta al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % de identidad en toda su longitud con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las Id. de sec. n.°: 1-57.
[0710] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende una secuencia de aminoácidos con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 sustituciones, inserciones, deleciones de aminoácidos o una combinación de dos o más de las mismas, en comparación con la secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-37) (Id. de sec. n.°: 1).
[0711] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de sec. n.°: 1-57. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1 que comprende una secuencia de aminoácidos con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 sustituciones, inserciones, deleciones de aminoácidos o una combinación de dos o más de las mismas, en comparación con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de sec. n.°: 1-57.
[0712] En cualquiera de las realizaciones anteriores, el resto del conjugado del péptido GLP-1 puede comprender una sustitución conservadora de aminoácido, un análogo de aminoácido o un derivado de aminoácido. En ciertas realizaciones, la sustitución conservadora de aminoácido comprende el reemplazo de un aminoácido alifático por otro aminoácido alifático; el reemplazo de una serina con una treonina o viceversa; el reemplazo de un residuo ácido con otro residuo ácido; el reemplazo de un residuo que contiene un grupo amida con otro residuo que contiene un grupo amida; el intercambio de un residuo básico por otro residuo básico; o el reemplazo de un residuo aromático con otro residuo aromático, o una combinación de los mismos, y el residuo alifático comprende alanina, valina, leucina, isoleucina o un equivalente sintético de las mismas; el residuo ácido comprende ácido aspártico, ácido glutámico o un equivalente sintético de los mismos; el residuo que comprende un grupo amida comprende ácido aspártico, ácido glutámico o un equivalente sintético de los mismos; el residuo básico comprende lisina, arginina o un equivalente sintético de las mismas; o el residuo aromático comprende fenilalanina, tirosina o un equivalente sintético de las mismas.
[0713] En los documentos US 20140206607; US 9.187.522; WO 2007/124461; WO 2014/096179; WO 2009/030738; WO 2016/055610; y US 8.329.419 se describen restos o análogos adicionales del conjugado del péptido GLP-1 que pueden utilizarse en las realizaciones proporcionadas en la presente memoria.
[0714] Conectores de conjugado
[0715] En ciertas realizaciones, un conector del conjugado une un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 a un oligonucleótido. En ciertos compuestos, un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 se une a un oligonucleótido mediante un conector del conjugado a través de un enlace sencillo. En ciertas realizaciones, el conector del conjugado comprende una estructura de cadena, tal como una cadena de hidrocarbilo, o un oligómero de unidades repetitivas, tales como unidades de etilenglicol, nucleósidos o aminoácidos.
[0716] En ciertas realizaciones, un conector del conjugado comprende uno o más grupos seleccionados de alquilo, amino, oxo, amida, disulfuro, polietilenglicol, éter, tioéter e hidroxilamino. En ciertas realizaciones de este tipo, el conector del conjugado comprende grupos seleccionados de grupos alquilo, amino, oxo, amida y éter. En ciertas realizaciones, el conector del conjugado comprende grupos seleccionados entre grupos alquilo y amida. En ciertas realizaciones, el conector del conjugado comprende grupos seleccionados entre grupos alquilo y éter. En ciertas realizaciones, el conector del conjugado comprende al menos un resto de fósforo. En ciertas realizaciones, el conector del conjugado comprende al menos un grupo fosfato. En ciertas realizaciones, el conector del conjugado incluye al menos un grupo de unión neutro.
[0717] En ciertas realizaciones, los conectores del conjugado, incluidos los conectores del conjugado descritos anteriormente, son restos de unión bifuncionales, p. ej., aquellos conocidos en la técnica por ser útiles para unir grupos del conjugado a compuestos precursores, tales como los oligonucleótidos proporcionados en la presente memoria. Generalmente, un resto de unión bifuncional comprende al menos dos grupos funcionales. Uno de los grupos funcionales se selecciona para la unión a un sitio particular en un compuesto y el otro se selecciona para la unión a un grupo del conjugado. Los ejemplos de grupos funcionales utilizados en un resto de unión bifuncional incluyen, pero no se limitan a, electrófilos para la reacción con grupos nucleofílicos y nucleófilos para la reacción con grupos electrofílicos. En ciertas realizaciones, los restos de unión bifuncionales comprenden uno o más grupos seleccionados de amino, hidroxilo, ácido carboxílico, tiol, alquilo, alquenilo y alquinilo.
[0719] Los ejemplos de conectores del conjugado incluyen, pero no se limitan a, pirrolidina, ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (ADO), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC) y ácido 6-aminohexanoico (AHEX o AHA). Otros conectores del conjugado incluyen, pero no se limitan a, alquilo C<1>-C<10>sustituido o no sustituido, alquenilo C<2>-C<10>sustituido o no sustituido o alquinilo C<2>-C<10>sustituido o no sustituido, en donde una lista no limitativa de grupos sustituyentes preferidos incluye hidroxilo, amino, alcoxilo, carboxi, bencilo, fenilo, nitro, tiol, tioalcoxi, halógeno, alquilo, arilo, alquenilo y alquinilo.
[0721] En ciertas realizaciones, los conectores del conjugado comprenden 1-10 nucleósidos conectores. En ciertas realizaciones, dichos nucleósidos conectores son nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, dichos nucleósidos conectores comprenden un resto de azúcar modificado. En ciertas realizaciones, los nucleósidos conectores no están modificados. En ciertas realizaciones, los nucleósidos conectores comprenden una base heterocíclica opcionalmente protegida seleccionada de una purina, una purina sustituida, una pirimidina o una pirimidina sustituida. En ciertas realizaciones, un resto escindible es un nucleósido seleccionado de uracilo, timina, citosina, 4-N-benzoilcitosina, 5-metilcitosina, 4-N-benzoil-5-metilcitosina, adenina, 6-N-benzoiladenina, guanina y 2-N-isobutirilguanina. Típicamente, es deseable que los nucleósidos conectores se separen del compuesto después de que este alcance un tejido diana. En consecuencia, los nucleósidos conectores típicamente se unen entre sí y al resto del compuesto a través de enlaces escindibles. En ciertas realizaciones, dichos enlaces escindibles son enlaces fosfodiéster.
[0723] En este caso, los nucleósidos conectores no se consideran parte del oligonucleótido. En consecuencia, en las realizaciones en las que un compuesto comprende un oligonucleótido que consiste en un número o rango específico de nucleósidos unidos y/o un porcentaje específico de complementariedad con un ácido nucleico de referencia y el compuesto también comprende un grupo del conjugado que comprende un conector del conjugado que comprende nucleósidos conectores, esos nucleósidos conectores no se incluyen en la longitud del oligonucleótido y no se utilizan para determinar el porcentaje de complementariedad del oligonucleótido con el ácido nucleico de referencia. Por ejemplo, un compuesto puede comprender (1) un oligonucleótido modificado que consiste en 8-30 nucleósidos y (2) un grupo del conjugado que comprende 1-10 nucleósidos conectores que son contiguos a los nucleósidos del oligonucleótido modificado. El número total de nucleósidos unidos contiguos en un compuesto de este tipo es superior a 30. Alternativamente, un compuesto puede comprender un oligonucleótido modificado que consiste en 8-30 nucleósidos y ningún grupo del conjugado. El número total de nucleósidos unidos contiguos en un compuesto de este tipo no es superior a 30. Salvo que se indique lo contrario, los conectores del conjugado comprenden no más de 10 nucleósidos conectores. En ciertas realizaciones, los conectores del conjugado comprenden no más de 5 nucleósidos conectores. En ciertas realizaciones, los conectores del conjugado comprenden no más de 3 nucleósidos conectores. En ciertas realizaciones, los conectores del conjugado comprenden no más de 2 nucleósidos conectores. En ciertas realizaciones, los conectores del conjugado comprenden no más de 1 nucleósido conector.
[0725] En ciertas realizaciones, es deseable escindir un grupo del conjugado del oligonucleótido. Por ejemplo, en ciertas circunstancias, los compuestos que comprenden un resto del conjugado particular son absorbidos mejor por un tipo de célula particular, pero una vez que el compuesto ha sido absorbido, es deseable que el grupo del conjugado se escinda para liberar el oligonucleótido precursor o no conjugado. Por lo tanto, cierto conjugado puede comprender uno o más restos escindibles, típicamente dentro del conector del conjugado. En ciertas realizaciones, un resto escindible es un enlace escindible. En ciertas realizaciones, un resto escindible es un grupo de átomos que comprende al menos un enlace escindible. En ciertas realizaciones, un resto escindible comprende un grupo de átomos que tienen uno, dos, tres, cuatro o más de cuatro enlaces escindibles. En ciertas realizaciones, un resto escindible se escinde selectivamente dentro de una célula o un compartimento subcelular, tal como un lisosoma. En ciertas realizaciones, un resto escindible se escinde selectivamente mediante enzimas endógenas, tales como las nucleasas.
[0727] En ciertas realizaciones, un enlace escindible se selecciona de entre: una amida, un éster, un éter, uno o ambos ésteres de un fosfodiéster, un éster de fosfato, un carbamato o un disulfuro. En ciertas realizaciones, un enlace escindible es uno o ambos ésteres de un fosfodiéster. En ciertas realizaciones, un resto escindible comprende un fosfato o fosfodiéster. En ciertas realizaciones, el resto escindible es un enlace fosfato entre un oligonucleótido y un resto del conjugado o grupo del conjugado.
[0729] En ciertas realizaciones, un resto escindible comprende o consiste en uno o más nucleósidos conectores. En ciertas realizaciones de este tipo, uno o más nucleósidos conectores se unen entre sí y/o al resto del compuesto a través de enlaces escindibles. En ciertas realizaciones, dichos enlaces escindibles son enlaces fosfodiéster no modificados. En ciertas realizaciones, un resto escindible es un nucleósido 2'-desoxi que se une al nucleósido terminal 3' o 5' de un oligonucleótido mediante un enlace internucleosídico fosfato y se une covalentemente al remanente del conector del conjugado o al resto del conjugado mediante un enlace fosfato o fosforotioato. En ciertas realizaciones de este tipo, el resto escindible es la 2'-desoxiadenosina.
[0730] 1. Ciertos conectores de hexilamino
[0731] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido unido a un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 mediante un conector del conjugado seleccionado de las siguientes estructuras:
[0734]
[0737] en donde cada n se selecciona, independientemente entre sí, de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7.
[0738] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido unido a un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 mediante un conector de conjugado seleccionado de las siguientes estructuras:
[0741]
[0742]
[0744] en donde cada n es, independientemente, de 1 a 20; y p es de 1 a 6.
[0745] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido unido a un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 mediante un conector de conjugado seleccionado de las siguientes estructuras:
[0747]
[0748]
[0751] en donde cada n es, independientemente, de 1 a 20.
[0753] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido unido a un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 mediante un conector del conjugado seleccionado de las siguientes estructuras:
[0755]
[0758] en donde cada n es, independientemente, de 1 a 20.
[0760] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido unido a un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 mediante un conector del conjugado seleccionado de las siguientes estructuras:
[0761]
[0763] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido unido a un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 mediante un conector del conjugado seleccionado de las siguientes estructuras:
[0765]
[0766]
[0768] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido unido a un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 mediante un conector del conjugado seleccionado de las siguientes estructuras:
[0771]
[0774] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido unido a un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 mediante un conector del conjugado que tiene la siguiente estructura:
[0777]
[0779] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido unido a un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 mediante un conector del conjugado que tiene la siguiente estructura:
[0782]
[0784] en donde
[0785] X se une directa o indirectamente al resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1; y
[0786] Y se une directa o indirectamente al oligonucleótido modificado.
[0787] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido unido a un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 mediante cualquier conector del conjugado descrito en el documento WO 2014/179620.
[0788] 2. Ciertos conectores de fosfato de alquilo
[0789] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido unido a un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 mediante un conector del conjugado que tiene la siguiente estructura:
[0790]
[0792] en donde:
[0793] el grupo fosfato se conecta al oligonucleótido modificado e Y se conecta al grupo del conjugado;
[0794] Y es un grupo fosfodiéster o amino (-NH-);
[0795] Z es un grupo pirrolidinilo que tiene la fórmula:
[0798]
[0800] j es 0 o 1;
[0801] n es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10;
[0802] p es de 1 a aproximadamente 10;
[0803] m es 0 o de 1 a 4; y
[0804] cuando Y es amino, entonces m es 1.
[0805] En ciertas realizaciones, Y es amino (-NH-). En ciertas realizaciones, Y es un grupo fosfodiéster. En ciertas realizaciones, n es 3 y p es 3. En ciertas realizaciones, n es 6 y p es 6. En ciertas realizaciones, n es de 2 a 10 y p es de 2 a 10. En ciertas realizaciones, n y p son diferentes. En ciertas realizaciones, n y p son iguales. En ciertas realizaciones, m es 0. En ciertas realizaciones, m es 1. En ciertas realizaciones, j es 0. En ciertas realizaciones, j es 1 y Z tiene la fórmula:
[0808]
[0810] En ciertas realizaciones, en donde n es 2 y p es 3. En ciertas realizaciones, n es 5 y p es 6.
[0811] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido unido a un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 mediante un conector del conjugado que tiene la siguiente estructura:
[0814]
[0816] en donde X se une directa o indirectamente al resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1; y
[0817] en donde T<1>comprende el oligonucleótido modificado; y Bx es una nucleobase modificada o no modificada.
[0818] 3. Ciertos conectores de química clic
[0819] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido unido a un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 mediante un conector del conjugado, en donde el conector del conjugado se prepara utilizando la química clic conocida en la técnica. Los compuestos se han preparado utilizando la química clic, en donde los enlaces internucleosídicos de fosfonato de alquinilo en un compuesto oligomérico unido a un soporte sólido se convierten en los enlaces internucleosídicos de 1,2,3-triazolilfosfonato y, a continuación, se escinden del soporte sólido (Krishna y col., J. Am. Chem. Soc. 2012, 134(28), 11618-11631). Los conectores adicionales adecuados para utilizar en varias realizaciones pueden prepararse mediante la química clic, descrita en “Click Chemistry for Biotechnology and Materials Science”, Ed. Joerg Laham, Wiley 2009.
[0820] En ciertas realizaciones, se puede utilizar una reacción de clic para unir un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 y un oligonucleótido haciendo reaccionar:
[0823]
[0825] con un oligonucleótido que tiene una amina terminal, que incluye, aunque no de forma limitativa, el siguiente compuesto:
[0828]
[0830] en donde Y se une directa o indirectamente al oligonucleótido, para producir:
[0833]
[0835] que se puede hacer reaccionar con un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 que tiene una azida para producir:
[0838]
[0840] en donde N-N=N representa un grupo azido del resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 y X se une directa o indirectamente al remanente del resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1.
[0841] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido unido a un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 mediante un conector del conjugado, en donde el conector del conjugado se prepara a partir del siguiente compuesto:
[0844]
[0846] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido unido a un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 mediante un conector del conjugado, en donde el conector del conjugado comprende:
[0849]
[0850] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido unido a un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 mediante un conector del conjugado, en donde el conector del conjugado comprende:
[0853]
[0855] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido unido a un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 mediante un conector del conjugado, en donde el compuesto comprende:
[0858]
[0860] en donde N-N=N representa un grupo azido del resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 y X se une directa o indirectamente al remanente del resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1; y
[0861] Y se une directa o indirectamente al oligonucleótido.
[0862] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido unido a un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 mediante un conector del conjugado, en donde el compuesto comprende:
[0865]
[0867] en donde N-N=N representa un grupo azido del resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 y X se une directa o indirectamente al remanente del resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1; y
[0868] Y se une directa o indirectamente al oligonucleótido.
[0869] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido unido a un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 mediante un conector del conjugado, en donde el compuesto comprende:
[0872]
[0874] en donde N-N=N representa un grupo azido del resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 y X se une directa o indirectamente al remanente del resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1; y
[0875] Y se une directa o indirectamente al oligonucleótido.
[0876] 4. Ciertos conectores de maleimida
[0877] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido unido a un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 mediante un conector del conjugado, en donde el conector del conjugado comprende:
[0880]
[0882] X se une directa o indirectamente al resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1; y
[0883] Y se une directa o indirectamente al oligonucleótido.
[0884] En ciertas realizaciones, el conector del conjugado anterior puede unir un péptido a un oligonucleótido. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido unido a un péptido mediante un conector del conjugado, en donde el conector del conjugado comprende:
[0887]
[0889] X se une directa o indirectamente al péptido; y
[0890] Y se une directa o indirectamente al oligonucleótido.
[0891] 5. Ciertos enlaces disulfuro
[0892] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido unido a un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 mediante un conector del conjugado, en donde el conector del conjugado comprende un enlace disulfuro. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden disulfuros activados que forman un enlace disulfuro con un resto del conjugado del péptido GLP-1. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido que comprende un resto disulfuro activado capaz de formar un enlace escindible o reversible con un resto del conjugado del péptido GLP-1. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido directamente unido a un resto del conjugado del péptido GLP-1 mediante un enlace disulfuro sin un conector del conjugado.
[0893] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un conector entre un oligonucleótido y un resto disulfuro activado. En otra realización, el resto disulfuro activado tiene la fórmula alquilo C1-C12 sustituido con -S-S(O)2- o no sustituido o alquilo C1-C12 sustituido con -S-S-C(O)O- o no sustituido. Las restos disulfuro activados preferidos son tiosulfonato de metano y ditiocarbometoxi. En otras realizaciones, el disulfuro activado es ditiopiridilo sustituido o no sustituido, ditiobenzotiazolilo sustituido o no sustituido, o ditiotetrazolilo sustituido o no sustituido. Los disulfuros activados preferidos son 2-ditiopiridilo, 2-ditio-3-nitropiridilo, 2-ditio-5-nitropiridilo, 2-ditiobenzotiazolilo, N-(alquilo C1-C12)-2-ditiopiridilo, 2-ditiopiridil-N-óxido o 2-ditio-1-metil-1H-tetrazolilo.
[0894] En algunas realizaciones, el resto disulfuro activado tiene la fórmula -S-S(O)<n>-R<1>, en donde
[0895] n es 0, 1 o 2; y
[0896] R<1>se selecciona de heterocíclico sustituido o no sustituido, alifático sustituido o no sustituido o -C(O)O-R<2>, en donde R<2>es alifático sustituido o no sustituido.
[0897] En otra realización, el resto disulfuro activado tiene la fórmula -S-S(O)<2>-alquilo C<1>-C<12>sustituido o no sustituido o -S-S-C(O)O-alquilo C<1>-C<12>sustituido o no sustituido. En ciertas realizaciones, los restos disulfuro activados incluyen tiosulfonato de metano y ditiocarbometoxi. En otras realizaciones, el disulfuro activado puede ser ditiopiridilo sustituido o no sustituido, ditiobenzotiazolilo sustituido o no sustituido, o ditiotetrazolilo sustituido o no sustituido. Otros ejemplos de disulfuros activados incluyen, pero no se limitan a, 2-ditiopiridilo, 2-ditio-3-nitropiridilo, 2-ditio-5-nitropiridilo, 2-ditiobenzotiazolilo, N-(alquilo C<1>-C<12>)-2-ditiopiridilo, 2-ditiopiridil-N-óxido y 2-ditio-1-metil-1H-tetrazolilo.
[0898] En algunas realizaciones, el grupo de enlace bivalente es un grupo alifático bivalente sustituido o no sustituido. En otra realización, el grupo de enlace bivalente tiene la fórmula -Q<1>-G-Q<2>-, en donde
[0899] Q<1>y Q<2>están independientemente ausentes o se seleccionan de alquileno C<1>-C<12>sustituido o no sustituido, alcarileno sustituido o no sustituido o -(CH<2>)<m>-O-(CH<2>)<p>-, en donde
[0900] cada m y p son, independientemente, un entero de 1 a aproximadamente 10;
[0901] G es -NH-C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(S)-NH-, -NH-O-, NH-C(O)-O- u -O-CH<2>-C(O)-NH-.
[0902] Los ejemplos de grupos de unión bivalentes incluyen, pero no se limitan a:
[0903]
[0906] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido unido a un resto del conjugado del péptido GLP-1 mediante un enlace disulfuro descrito en el documento US 7.713.944. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido unido a un resto del conjugado del péptido GLP-1 en donde el oligonucleótido comprende un disulfuro activado descrito en el documento US 7.713.944.
[0908] En ciertas realizaciones, cualquiera de los compuestos anteriores que comprenden un oligonucleótido unido a un resto del conjugado del péptido GLP-1 mediante un enlace disulfuro, ya sea directamente o mediante un conector del conjugado descrito en la presente memoria, puede comprender un enlace disulfuro entre un resto de cisteína, penicilamina, homocisteína, ácido mercaptopropiónico o ácido β-mercapto-β,β,-ciclopentametilenpropiónico del resto del conjugado del péptido GLP-1 y el oligonucleótido o conector del conjugado. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido directamente unido a un resto del conjugado del péptido GLP-1 mediante un enlace disulfuro. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido directamente unido a un resto del conjugado del péptido GLP-1 mediante un enlace disulfuro, en donde el enlace disulfuro está entre el oligonucleótido y un resto de cisteína, penicilamina, homocisteína, ácido mercaptopropiónico o ácido β-mercapto-β,β,-ciclopentametilenpropiónico del resto del conjugado del péptido GLP-1. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1, en donde un enlace disulfuro une el conector del conjugado y el resto del conjugado del péptido GLP-1, y el oligonucleótido se une al conector del conjugado. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido, un conector del conjugado y un resto del conjugado del péptido GLP-1, en donde un enlace disulfuro une el conector del conjugado a un resto de cisteína, penicilamina, homocisteína, ácido mercaptopropiónico o ácido β-mercapto-β,β,-ciclopentametilenpropiónico del resto del conjugado del péptido GLP-1, y el oligonucleótido se une al conector del conjugado. En ciertas realizaciones, el resto de cisteína, penicilamina, homocisteína, ácido mercaptopropiónico o ácido β-mercapto-β,β,-ciclopentametilenpropiónico se encuentra en el extremo N-terminal, el extremo C-terminal, la cadena lateral o la posición de aminoácido interno del resto del conjugado del péptido GLP-1.
[0910] 6. Ciertos enlaces escindibles por enzimas
[0912] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido unido a un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 mediante un conector del conjugado, en donde el conector del conjugado comprende un resto escindible por enzimas. En ciertas realizaciones, el resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 es un resto del conjugado del péptido GLP-1. En ciertas realizaciones, el resto escindible por enzimas es un péptido, tal como un dipéptido.
[0914] Las enzimas conocidas en la técnica para utilizar en la activación de profármacos pueden utilizarse para escindir un resto escindible por enzimas proporcionado en ciertas realizaciones. En ciertas realizaciones, un resto escindible por enzimas puede escindirse mediante la diaforasa DT, la plasmina, la carboxipeptidasa G2, la timidina quinasa (viral), la citosina desaminasa, la glucosa oxidasa, la xantina oxidasa, la carboxipeptidasa A, la α-galactosidasa, la βglucosidasa, la azorreductasa, la γ-glutamiltransferasa, la β-glucuronidasa, la β-lactamasa, la fosfatasa alcalina, la aminopeptidasa, la penicilina la amidasa o la nitorreductasa.
[0916] En ciertas realizaciones, el resto escindible por enzimas es escindible por una proteasa o peptidasa. En ciertas realizaciones, la porción escindible por la enzima es escindible por una proteasa o peptidasa seleccionada de entre: gastricsina, memapsina-2, quimosina, renina, renina-2, catepsina D, catepsina E, penicilopepsina, rizopuspepsina, mucorpepsina, barrierpepsina, aspergillopepsina I, endotiapepsina, sacaropepsina, fitepsina, plasmepsina-1, plasmepsina-2, yapsina-1, yapsina-2, nepentesina, memapsina-1, napsina A, retropepsina del VIH-1, retropepsina del VIH-2, retropepsina del virus de la inmunodeficiencia símica, retropepsina del virus de la anemia infecciosa equina, retropepsina del virus de la inmunodeficiencia felina, retropepsina del virus de la leucemia murina, retropepsina del virus de la leucemia Mason-Pfizer, retropepsina del retrovirus endógeno humano K, retropepsina (virus de la leucemia de células T humanas), retropepsina del virus de la leucemia bovina, retropepsina del virus del sarcoma de Rous, peptidasa escitalidoglutámica, peptidasa aspergiloglutámica, termopsina, peptidasa señal II, espumapepsina, peptidasa prepilina tipo 4 1, omptina, activador del plasminógeno Pla, papaína, quimopapaína, caricaína, endopeptidasa de glicil, bromelina del tallo, ficaína, actinidaína, catepsina V, vignaína, catepsina X, zingipaína, catepsina F, ananaína, bromelina de la fruta, catepsina L, catepsina L1 (Fasciola sp.), catepsina S, catepsina K, catepsina H, aleuraína, histolisina, catepsina B, dipeptidil-peptidasa I, peptidasa 1 (ácaro), peptidasa CPB, cruzipaína, peptidasa V-cath, hidrolasa de bleomicina (animal), hidrolasa de bleomicina (levadura), aminopeptidasa C, peptidasa CPC, calpaína-1, calpaína-2, calpaína-3, peptidasa Tpr (Porphyromonas gingivalis), picornaína 3C tipo poliovirus, picornaína 3C tipo virus de la hepatitis A, picornaína 3C tipo rinovirus humano 2, picornaína 3C virus de la fiebre aftosa, picornaína 2A enterovirus, picornaína 2A rinovirus, peptidasa de inclusión nuclear-a (virus de la viruela de la ciruela), peptidasa NIa virus del grabado del tabaco, adenaína, peptidasa del componente auxiliar tipo Y del virus de la patata, nsP2 tipo virus sindbis peptidasa, estreptopaína, clostripaína, ubiquitinil hidrolasa-L1, ubiquitinil hidrolasa-L3, legumaína (forma beta vegetal), legumaína, tipo animal, caspasa-1, caspasa-3, caspasa-7, caspasa-6, caspasa-8, caspasa-9, piroglutamil-peptidasa I (procariota), piroglutamil-peptidasa I (cordado), peptidasa 1 similar a la papaína del coronavirus de la hepatitis murina, peptidasa 5 específica de ubiquitina, peptidasa del timovirus, peptidasa similar a la 3C del virus de la enfermedad hemorrágica del conejo, gingipaína RgpA, gingipaína Kgp, gamma-glutamil hidrolasa, peptidasa L del virus de la fiebre aftosa, peptidasa principal tipo virus de la gastroenteritis transmisible porcina, calicivirina, estafopaína A, peptidasa Ulp1, separasa (tipo levadura), proteína YopJ, peptidasa PfpI, sortasa A (tipo estafilococo), aminopeptidasa N, lisil aminopeptidasa (bacterias), aminopeptidasa A, hidrolasa de leucotrieno A4, piroglutamil-peptidasa II, alanil aminopeptidasa citosólica, cistinil aminopeptidasa, aminopeptidasa B, aminopeptidasa Ey, unidad 1 de peptidasa de la enzima convertidora de angiotensina, peptidil-dipeptidasa Acer, unidad 2 de peptidasa de la enzima convertidora de angiotensina, enzima convertidora de angiotensina-2, oligopeptidasa timeto, neurolisina, sacarolisina, oligopeptidasa A, peptidil-dipeptidasa Dcp, intermediario mitocondrial peptidasa, oligopeptidasa F, termolisina, vibriolisina, pseudolisina, cocolisina, aureolisina, estearolisina, micolisina, snapalisina, leishmanolisina, colagenasa bacteriana V, colagenasa bacteriana G/A, metaloproteinasa de matriz-1, metaloproteinasa de matriz-8, metaloproteinasa de matriz-2, metaloproteinasa de matriz-9, metaloproteinasa de matriz-3, metaloproteinasa de matriz-10 (tipo Homo sapiens), metaloproteinasa de matriz-11, metaloproteinasa de matriz-7, metaloproteinasa de matriz-12, envelisina, metaloproteinasa de matriz-13, metaloproteinasa de matriz de tipo membrana-1, metaloproteinasa de matriz de tipo membrana-2, metaloproteinasa de matriz-20, fragilisina, metaloproteinasa de matriz-26, serralisina, aeruginolisina, gametolisina, astacina, subunidad alfa de meprina, procolágeno C-peptidasa, coriolisina L, coriolisina H, flavastacina, fibrolasa, jararhagina, adamalisina, atrolisina A, atrolisina B, atrolisina C, atrolisina E, atroxasa, russellisina, peptidasa ADAM1, peptidasa ADAM9, peptidasa ADAM10, peptidasa de Kuzbania (no mamífera), peptidasa ADAM12, peptidasa ADAM17, peptidasa ADAMTS4, peptidasa ADAMTS1, peptidasa ADAMTS5, peptidasa ADAMTS13, procolágeno I N-peptidasa, neprilisina, enzima convertidora de endotelina 1, oligopeptidasa O1, neprilisina-2, peptidasa PHEX, carboxipeptidasa A1, carboxipeptidasa A2, carboxipeptidasa B, carboxipeptidasa N, carboxipeptidasa E, carboxipeptidasa M, carboxipeptidasa T, carboxipeptidasa B2, carboxipeptidasa A3, metalocarboxipeptidasa D unidad peptidasa 1, metalocarboxipeptidasa D unidad peptidasa 2, zinc D-Ala-D-Ala carboxipeptidasa (tipo Streptomyces), vanY D-Ala-D-Ala carboxipeptidasa, vanX D-Ala-D-Ala dipeptidasa, pitrilisina, insulisina, subunidad beta de la peptidasa de procesamiento mitocondrial, nardilisina, leucina aminopeptidasa 3, leucil aminopeptidasa (tipo vegetal), aminopeptidasa I, aspartil aminopeptidasa, dipeptidasa de membrana, glutamato carboxipeptidasa, peptidasa T, carboxipeptidasa Ss1, metalopeptidasa beta-lítica, estafilolisina, lisostafina, metionil aminopeptidasa 1 (tipo Escherichia), metionil aminopeptidasa 2, dipeptidasa Xaa-Pro (tipo bacteriano), aminopeptidasa P (bacterias), aminopeptidasa P2, dipeptidasa Xaa-Pro (eucariota), metalopeptidasa específica de IgA1, tentoxilisina, bontoxilisina, aminopeptidasa Y, aminopeptidasa Ap1, aminopeptidasa S (tipo Streptomyces), glutamato carboxipeptidasa II, carboxipeptidasa Taq, factor letal del ántrax, deuterolisina, peptidil-Lys metalopeptidasa, peptidasa FtsH, peptidasa m-AAA, peptidasa i-AAA, peptidasa AtFtsH2, pappalisina-1, Ste24 peptidasa, dipeptidil-peptidasa III, peptidasa del sitio 2, factor de esporulación SpoIVFB, peptidasa HybD, peptidasa gpr, quimotripsina A (tipo bovino), granzima B (tipo Homo sapiens), peptidasa activadora del factor VII, tripsina (tipo Streptomyces griseus), hipodermina C, elastasa-2, catepsina G, mieloblastina, granzima A, granzima M, quimasa (tipo Homo sapiens), peptidasa de mastocitos 1 (tipo Rattus), duodenasa, triptasa alfa, granzima K, peptidasa de mastocitos 5 (numeración de ratón), tripsina 1, quimotripsina B, elastasa-1, endopeptidasa pancreática E, elastasa pancreática II, enteropeptidasa, quimotripsina C, prostasina, calicreína 1, peptidasa relacionada con la calicreína 2, peptidasa relacionada con la calicreína 3, calicreína 1 (Mus musculus), peptidasa b3 relacionada con la calicreína 1, peptidasa c2 relacionada con la calicreína 1 (Rattus norvegicus), calicreína 13 (Mus musculus), ancrod, botrombina, factor D del complemento, componente del complemento activado C1r, componente del complemento activado C1s, factor Bb del complemento, peptidasa de serina 1 asociada a la lectina de unión a manano, factor I del complemento, factor XIIa de la coagulación, calicreína plasmática, factor XIa de la coagulación, factor IXa de la coagulación, factor VIIa de la coagulación, factor Xa de la coagulación, trombina, proteína C (activada), factor C de la coagulación (Limulus, Tachypleus), activado, factor B de la coagulación (Limulus, Tachypleus), activado, enzima de coagulación (tipo Tachypleus), acrosina, hepsina, peptidasa de serina 2 asociada a la lectina de unión a manano, activador del plasminógeno de tipo uroquinasa, activador del plasminógeno t, plasmina, peptidasa relacionada con la calicreína 6, activador del plasminógeno (tipo Desmodus), peptidasa relacionada con la calicreína 8, peptidasa relacionada con la calicreína 4, estreptogrisina A, estreptogrisina B, estreptogrisina E, endopeptidasa alfa-lítica, peptidasa glutamil I, peptidasa DegP, peptidasa HtrA2, endopeptidasa lisil (bacterias), peptidasa relacionada con la calicreína 7, matriptasa, togavirina, peptidasa de serina específica de IgA1 (tipo Neisseria), flavivirina, subtilisina Carlsberg, subtilisina lentus, termitasa, subtilisina Ak1, lactocepina I, peptidasa C5a, dentilisina, subtilisina BPN', subtilisina E, aqualisina 1, cerevisia, orizina, endopeptidasa K, termomicolina, peptidasa del sitio 1, kexina, furina, peptidasa PCSK1, peptidasa PCSK2, peptidasa PCSK4, peptidasa PCSK6, peptidasa PCSK5, peptidasa PCSK7, tripeptidil-peptidasa II, cucumisina, prolil oligopeptidasa, dipeptidil-peptidasa IV (eucariota), acilaminoacil-peptidasa, subunidad alfa de la proteína de activación de fibroblastos, oligopeptidasa B, carboxipeptidasa Y, serina carboxipeptidasa A, serina carboxipeptidasa C, serina carboxipeptidasa D, carboxipeptidasa kex, carboxipeptidasa D-Ala-D-Ala A, transpeptidasa DD tipo K15, carboxipeptidasa D-Ala-D-Ala B, aminopeptidasa DmpB, peptidasa D-Ala-D-Ala C, peptidasa Clp (tipo 1), dipeptidil-peptidasa Xaa-Pro, peptidasa Lon-A, peptidasa PIM1, assemblina, assemblina de citomegalovirus, assemblina de tipo 8 de herpesvirus, represor LexA, proteína UmuD, peptidasa de señal I, peptidasa de membrana interna mitocondrial 1, peptidasa de señal SipS, componente de señalasa (animal) de 21 kDa, carboxipeptidasa lisosomal Pro-Xaa, dipeptidil-peptidasa II, hepacivirina, peptidasa P1 del potyvirus, peptidasa de la poliproteína NS3 del pestivirus, serina peptidasa del virus de la arteritis equina, prolil aminopeptidasa, peptidasa de procesamiento C-terminal-1, peptidasa de procesamiento C-terminal-2, peptidasa del núcleo tricorn (arqueas), peptidasa del péptido señal A, peptidasa Vp4 del birnavirus de la necrosis pancreática infecciosa, dipeptidasa E, sedolisina, sedolisina-B, tripeptidil-peptidasa I, kumamolisina, fisarolisina, peptidasa SpolVB, proteasoma arqueano, componente beta, proteasoma bacteriano, componente beta, componente HslV de la peptidasa HslUV, subunidad catalítica 1 del proteasoma constitutivo, subunidad catalítica 2 del proteasoma constitutivo, subunidad catalítica del proteasoma constitutivo 3, gamma-glutamiltransferasa 1 (tipo bacteriano), mureína tetrapeptidasa LD-carboxipeptidasa (tipo Escherichia), aminopeptidasa PepA, presenilina 1, poliporopepsina, canditropsina, candidapepsina SAP2, caspasa-2, peptidasa tipo caspasa DRONC (Drosophila melanogaster), peptidasa específica de ubiquitina 7, peptidasa principal del coronavirus humano 229E, peptidasa similar a la picornaína 3C del coronavirus SARS, peptidasa AvrPphB, sortasa B, metalopeptidasa alcalina psicrófila (Pseudomonas sp.), acutolisina A, aminopeptidasa S (tipo Staphylococcus), carboxipeptidasa Pfu, isoaspartil dipeptidasa (tipo metalo), D-aminopeptidasa DppA y mureína endopeptidasa. En ciertas realizaciones, el resto escindible por enzimas es escindible por una catepsina, proteasa o peptidasa.
[0918] Composiciones y métodos para formular composiciones farmacéuticas
[0920] Los compuestos descritos en la presente memoria pueden mezclarse con sustancias activas o inertes farmacéuticamente aceptables para la preparación de composiciones o formulaciones farmacéuticas. Las composiciones y los métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de una serie de criterios, que incluyen, pero no se limitan a, la vía de administración, el grado de la enfermedad o la dosis que se ha de administrar.
[0922] Ciertas realizaciones proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más compuestos o una sal de los mismos. En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica comprende un compuesto descrito en la presente memoria y un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica comprende una solución salina estéril y uno o más compuestos descritos en la presente memoria. En ciertas realizaciones, dicha composición farmacéutica consiste en una solución salina estéril y uno o más compuestos. En ciertas realizaciones, la solución salina estéril es solución salina de grado farmacéutico. En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica comprende uno o más compuestos descritos en la presente memoria y agua estéril. En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica consiste en un compuesto descrito en la presente memoria y agua estéril. En ciertas realizaciones, el agua estéril es agua de grado farmacéutico. En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica comprende uno o más compuestos descritos en la presente memoria y una solución salina tamponada con fosfato (PBS). En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica consiste en uno o más compuestos descritos en la presente memoria y PBS estéril. En ciertas realizaciones, el PBS estéril es PBS de grado farmacéutico.
[0924] Las composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos descritos en la presente memoria abarcan cualquier sal, éster o sales de dicho éster farmacéuticamente aceptables, o cualquier otro oligonucleótido que, tras la administración a un animal, incluido un ser humano, sea capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o el residuo del mismo. Ciertas realizaciones se refieren a sales farmacéuticamente aceptables de compuestos, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de dichos profármacos y otros bioequivalentes. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sales de sodio y potasio.
[0926] Descripción no limitativa
[0928] Si bien ciertos compuestos, composiciones y métodos descritos en la presente memoria se han descrito con especificidad según ciertas realizaciones, los siguientes ejemplos se proporcionan únicamente para ilustrar los compuestos descritos en la presente memoria y no pretenden limitarlos.
[0930] Aunque el listado de secuencias que acompaña a este archivo identifica cada secuencia como “ARN” o “ADN”, según sea necesario, en realidad, esas secuencias pueden modificarse con cualquier combinación de modificaciones químicas. Un experto en la técnica apreciará fácilmente que tal designación como “ARN” o “ADN” para describir los oligonucleótidos modificados es, en ciertos casos, arbitraria. Por ejemplo, un oligonucleótido que comprende un nucleósido que comprende un resto de azúcar 2'-OH y una base de timina podría describirse como un ADN que tiene un azúcar modificado (2'-OH en lugar de un 2'-H de ADN) o como un ARN que tiene una base modificada (timina (uracilo metilado) en lugar de un uracilo de ARN). En consecuencia, las secuencias de ácidos nucleicos proporcionadas en la presente memoria, que incluyen, aunque no de forma limitativa, las del listado de secuencias, pretenden abarcar ácidos nucleicos que contienen cualquier combinación de ARN y/o ADN natural o modificado, que incluyen, aunque no de forma limitativa, dichos ácidos nucleicos que tienen nucleobases modificadas. A modo de ejemplo adicional y sin limitación, un compuesto oligomérico que tiene la secuencia de nucleobases “ATCGATCG” abarca cualquier compuesto oligomérico que tenga dicha secuencia de nucleobases, ya sea modificada o no modificada, que incluye, aunque no de forma limitativa, compuestos que comprenden bases de ARN, tales como los que tienen la secuencia “AUCGAUCG” y los que tienen algunas bases de ADN y algunas bases de ARN, tales como “AUCGATCG” y compuestos oligoméricos que tiene otras nucleobases modificadas, tales como “ATmCGAUCG”, en donde mC indica una base de citosina que comprende un grupo metilo en la posición 5.
[0931] Los compuestos descritos en la presente memoria incluyen (R) o (S), como α o β, tal como para los anómeros de azúcar, o como (D) o (L), tal como para los aminoácidos, etc. En los compuestos proporcionados en la presente memoria se incluyen todos los posibles isómeros, incluidas sus formas racémicas y ópticamente puras, salvo que se indique lo contrario. De la misma manera, también se incluyen todos los isómeros cis y trans y las formas tautoméricas. Los compuestos descritos en la presente memoria incluyen mezclas quiralmente puras o enriquecidas, así como mezclas racémicas. Por ejemplo, los oligonucleótidos que tienen una pluralidad de enlaces internucleosídicos fosforotioato incluyen compuestos en los que la quiralidad de los enlaces internucleosídicos fosforotioato está controlada o es aleatoria.
[0932] Salvo que se indique lo contrario, cualquier compuesto, incluidos los compuestos oligoméricos, descrito en la presente memoria incluye una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
[0933] Los compuestos descritos en la presente memoria incluyen variaciones en las que uno o más átomos se reemplazan por un isótopo no radiactivo o un isótopo radiactivo del elemento indicado. Por ejemplo, los compuestos de la presente memoria que comprenden átomos de hidrógeno abarcan todas las posibles sustituciones de deuterio para cada uno de los átomos de hidrógeno de<1>H. Las sustituciones isotópicas comprendidas en los compuestos de la presente memoria incluyen, pero no se limitan a:<2>H o<3>H en lugar de<1>H,<13>C o<14>C en lugar de<12>C,<15>N en lugar de<14>N,<17>O o<18>O en lugar de<16>O, y<33>S,<34>S,<35>S o<36>S en lugar de<32>S.
[0934] Ejemplos
[0935] Ejemplo 1: Preparación de un oligonucleótido antisentido (ASO) de localización específica de MALAT1 conjugado con el péptido GLP-1
[0936] Método para la preparación de oligonucleótidos modificados conjugados que comprenden GLP-1 en la posición 5' conjugados mediante un conector de 3-mercaptopropionato.
[0937] Salvo que se indique lo contrario, todos los reactivos y soluciones utilizados para la síntesis de compuestos oligoméricos se adquieren de fuentes comerciales. Para la incorporación de residuos de nucleósidos, que incluyen, por ejemplo, residuos T, A, G y mC, se utilizan bloques de construcción de fosforamidita estándar y soportes sólidos. Se utilizó una solución 0,1 M de fosforamidita en acetonitrilo anhidro para el 2'-desoxirribonucleósido, los nucleósidos de BNA de cEt y el 6-amino-hexanol protegido adecuadamente.
[0938]
[0941] Se sintetizó y purificó un oligonucleótido modificado con 5'-hexilamino (ISIS 786434) (secuencia de nucleobases: TCAGCATTCTAATAGCAGC (Id. de sec. n.°: 38) utilizando procedimientos estándar de oligonucleótidos en fase sólida. El extremo 5' del oligonucleótido modificado comprende un conector de hexametileno y una amina terminal. El compuesto 1 (éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 3-(2-piridilditiopropiónico) se obtuvo de Chem-Impex (cat n.° 11566). El oligonucleótido modificado (~6 µmol) se disolvió en 125 µl de tampón de fosfato de sodio, pH de 8 y 12 µmol del compuesto 1 se disolvieron en DMF. La solución del compuesto 1 se añadió gota a gota a la solución de oligonucleótido modificado y se dejó reaccionar a temperatura ambiente. La reacción se completó después de 2-3 horas y el producto 2 se purificó por HPLC en la resina fuente 30Q con tampón A de NH<4>OAc 100 mM/ACN al 30 %/H<2>O y tampón B de NH<4>OAc 100 mM/ACN al 30 %/H<2>O NaBr 1,5 M, y se destiló mediante HPLC en una columna de fase inversa. Las fracciones del producto se concentraron y se almacenaron a -20 °C.
[0943] El compuesto 2 se utilizó como material de partida para la reacción con el péptido GLP-1 HisAibGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGluGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyG lyProSerSerAlaProProProSerCys-NH<2>(Id. de sec. n.°: 22), que se sintetizó mediante síntesis de péptidos en fase sólida estándar. Aib es ácido 2-aminoisobutírico. El compuesto 2 se disolvió en agua desgasificada y se añadió NaHCO<3>0,1 M para ajustar el pH hasta ~8,0. El péptido GLP-1 se disolvió en NaHCO<3>0,1 M (pH 8):DMF 50/50 (dimetilformamida). La solución de péptido se añadió al compuesto 2 en pequeñas porciones (30 % del volumen total cada vez) en intervalos de 5 minutos. Después de aproximadamente 1 hora, la mezcla de reacción se diluyó con agua (5 veces el volumen de la solución de reacción V/V) y los productos se purificaron por HPLC en la resina fuente 30Q con tampón A de NH<4>OAc 100 mM/ACN al 30 %/H<2>O y tampón B de NH<4>OAc 100 mM/ACN al 30 %/H<2>O NaBr 1,5 M. Las fracciones de producto se desalaron mediante HPLC en una columna de fase inversa para producir ISIS 816385.
[0945] Ejemplo 2: Preparación de un oligonucleótido antisentido (ASO) de localización específica de MALAT1 conjugado con el péptido GLP-1
[0946] Método para la preparación de oligonucleótidos modificados conjugados que comprenden GLP-1 en la posición 5' conjugado mediante un conector de 3-mercaptopropionato con penicilamina C-terminal.
[0949]
[0952] El compuesto 2 se sintetizó como en el ejemplo 1 y se utilizó como material de partida para la reacción con el péptido GLP-1: HisAibGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGluGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyG lyProSerSerAlaProProProSerPen-NH<2>(Id. de sec. n.°: 23), que se sintetizó mediante síntesis de péptidos en fase sólida estándar. Aib es ácido 2-aminoisobutírico y Pen es penicilamina. El compuesto 2 se disolvió en agua desgasificada y se añadió NaHCO<3>0,1 M para ajustar el pH hasta ~8,0. El péptido GLP-1 se disolvió en agua desgasificada. La solución del compuesto 2 y la solución de péptido se mezclaron con agitación suave en Vortex y se comprobó el pH. Se añadió NaHCO<3>0,1 M para ajustar el pH hasta ~7,5. Después de aproximadamente 2 h, se añadió péptido adicional y se añadió NaHCO<3>para ajustar el pH al alza. La reacción se transfirió a 4 °C durante aproximadamente 65 horas y el producto se purificó por HPLC como se describe en el ejemplo 1.
[0953] Ejemplo 3: Preparación de oligonucleótido antisentido (ASO) de localización específica de FOXO1 conjugado con el péptido GLP-1
[0954] Método para la preparación de oligonucleótidos modificados conjugados que comprenden GLP-1 en la posición 5' conjugados mediante un conector de 3-mercaptopropionato.
[0955] ION 913193, un ASO conjugado con el péptido 5'-GLP-1 de localización específica de FOXO1, se preparó según el procedimiento del ejemplo 1, a partir de un oligonucleótido modificado con 5'-hexilamino (ION 913192) (secuencia de nucleobases: TCATCTTCTTAAAATACCC (Id. de sec. n.°: 59) con las siguientes modificaciones químicas: Tdo mCdo Ado Tks mCks Tds Tds mCds Tds Tds Ads Ads Ads Aks Tes Aks mCes mCks mCk (k = cEt; d = 2'-desoxi; e = 2'-MOE; mC = 5-metilcitosina; o = fosfodiéster; y s = fosforotioato).
[0956] El ION 913195, un ASO conjugado con el péptido 5'-GLP-1 de control que tiene una secuencia de nucleobases que no coincide con la de FOXO 1, se preparó según el procedimiento del ejemplo 1, a partir de un oligonucleótido modificado con 5'-hexilamino (ION 913194) (secuencia de nucleobases: TCAGGCCAATACGCCGTCA (Id. de sec. n.°: 60) con las siguientes modificaciones químicas: Tdo mCdo Ado Gks Gks mCks mCds Ads Ads Tds Ads mCds Gds mCds mCds Gds Tks mCks Ak (k = cEt; d = 2'-desoxi; e = 2'-MOE; mC = 5-metilcitosina; o = fosfodiéster; y s = fosforotioato).
[0957] Ejemplo 4: Preparación de un oligonucleótido antisentido (ASO) de localización específica de la insulina conjugada con el péptido GLP-1
[0958] Método para la preparación de oligonucleótidos modificados conjugados que comprenden GLP-1 en la posición 5' conjugados mediante un conector de mercaptopropionato.
[0959] El ION 919553, un ASO conjugado con el péptido 5'-GLP-1 de localización específica de la insulina, se preparó según el procedimiento del ejemplo 1, a partir de un oligonucleótido modificado con 5'-hexilamino (ION 919553) (secuencia de nucleobases: TCAGCCAAGGTCTGAAGGTCACC (Id. de sec. n.°: 61) con las siguientes modificaciones químicas: Tdo mCdo Ado Ges mCes mCes Aes Aes Gds Gds Tds mCds Tds Gds Ads Ads Gds Gds Tes mCes Aes mCes mCe (k = cEt; d = 2'-desoxi; e = 2'-MOE; mC = 5-metilcitosina; o = fosfodiéster; y s = fosforotioato).
[0960] Ejemplo 5: Preparación de un dúplex de oligonucleótido antisentido (ASO) de localización específica de MALAT1 conjugado con el péptido GLP-1
[0961] El ION 951976 (secuencia de nucleobases: GCTGCTATTAGAATGC (Id. de sec. n.°: 62) con las siguientes modificaciones químicas: Ges mCeo Tdo Gdo mCdo Tdo Ado Tdo Tdo Ado Gdo Ado Ado Tds Ges mCe (d = 2'-desoxi; e = 2'-MOE; mC = 5-metilcitosina; o = fosfodiéster; y s = fosforotioato), se sintetizó y purificó utilizando procedimientos estándar de oligonucleótidos en fase sólida. El ISIS 816385 descrito en el ejemplo 1 se hibridó con ION 951976, generando un dúplex de los dos oligonucleótidos.
[0962] Ejemplo 6: Localización específica de las células beta de los islotes pancreáticos in vivo mediante ASO conjugados con el péptido GLP-1
[0963] Estudio 1
[0964] Para determinar si la conjugación del péptido GLP-1 con ASO aumenta el suministro de ASO al páncreas, se administraron a los ratones C57BL/6 machos alimentados con una dieta de pienso 2 inyecciones intravenosas de un ASO cEt 3-10-3 de localización específica de MALAT1 murino (ISIS 556089) (secuencia nucleobases: GCATTCTAATAGCAGC) (Id. de sec. n.°: 63) o un ASO conjugado con GLP-1 contra MALAT1 (ISIS 816385) descrito en el ejemplo 1, a concentraciones de 1,8, 0,6 o 0,2 µmol/kg. Los tejidos se recogieron 72 horas después de la inyección final para evaluar el suministro y la potencia de los compuestos.
[0965] La expresión de MALAT1 se detectó utilizando el ensayo de tejido QuantiGene ViewRNA (Affymetrix, cat. n.° QVT0011). Las sondas MALAT1 específicas para cada especie se adquirieron en Affymetrix (cat. n.° VB-11110-01/ratón; VF1-13963/mono). En resumen, los tejidos de los ratones se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 % y se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 4 mm. Tras la desparafinización, los portaobjetos de tejido se hirvieron en una solución de pretratamiento de Affymetrix durante 10-30 minutos, seguidos de un tratamiento con proteasa a 40 °C durante 10 a 40 minutos, dependiendo del tejido. La sonda de ARN MALAT1 se utilizó a una dilución de 1:40 y se incubó con la muestra a 40 °C durante 120 minutos. Tras el lavado, el complejo ARN/sonda contra MALAT1 se hibridó con preamplificador, amplificador y AP-oligonucleótidos a 40 °C durante 25, 15 y 15 minutos, respectivamente. Tras la eliminación del AP oligonucleótido libre mediante el lavado en PBS, el portaobjetos se incubó con sustrato Fast Red a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las imágenes de tejido se adquirieron utilizando un escáner Aperio. Hung y col., 2013 Nuc Acid Ther.369-78.
[0966] El análisis de hibridación in situ indicó que la conjugación del péptido GLP-1 redujo la tinción de MALAT1 en las células beta de los islotes, pero no en las células acinares, del páncreas. La tinción con ASO de las secciones pancreáticas demostró que el conjugado de GLP-1 mejoraba la potencia al aumentar el suministro de ASO al tejido. Los ratones tratados con ASO conjugado con GLP-1 contra MALAT1 (ISIS 816385), pero no los ratones tratados con ASO no conjugado contra MALAT1 (ISIS 556089), presentaron una expresión reducida de MALAT1 en las células beta de los islotes pancreáticos. Los ratones tratados con diversas dosis de ISIS 816385 presentaron una expresión reducida de MALAT1 en las células beta de los islotes pancreáticos. Los ratones tratados con ASO conjugado con GLP-1 contra MALAT1 (ISIS 816385), pero no los ratones tratados con ASO no conjugado contra MALAT1 (ISIS 556089), presentaron acumulación de ASO en las células beta de los islotes pancreáticos. El ASO conjugado con GLP-1 contra MALAT1 (ISIS 816385) se acumuló de una manera dependiente de la dosis en las células beta de los islotes pancreáticos de los ratones tratados.
[0967] Estudio 2
[0968] Para determinar la respuesta a la dosis de un ASO conjugado con GLP-1 contra MALAT1 (ISIS 816385), como se describe en el ejemplo 1, sobre la expresión de MALAT1 pancreático, se administró a los ratones C57BL/6 machos alimentados con una dieta de pienso una única inyección intravenosa de ISIS 816385 o un ASO no conjugado contra MALAT1 (ISIS 556089) descrito anteriormente a concentraciones de 0,2, 0,06 y 0,02 µmol/kg.
[0969] La expresión de MALAT1 se detectó utilizando el ensayo de tejido QuantiGene ViewRNA descrito anteriormente. El análisis de hibridación in situ indicó que la conjugación del péptido GLP-1 redujo la tinción de MALAT1 en las células beta de los islotes del páncreas a la dosis de 0,2 µmol/kg y a la dosis de 0,06 µmol/kg. No se observó ningún efecto observable de ISIS 816385 o ISIS 556089 en el hígado para ninguna de las dosis.
[0970] Ejemplo 7: Inhibición antisentido de MALAT1 y FOXO1 con oligonucleótidos antisentido conjugados con el péptido GLP-1 en células HEK293 que sobreexpresan el receptor del GLP-1 humano
[0971] Los oligonucleótidos antisentido diseñados para la localización específica de MALAT1 y FOXO1 se conjugaron con un agonista peptídico del receptor del péptido similar al glucagón 1 (péptido GLP-1) y se analizaron para determinar su efecto sobre la expresión del gen diana humano utilizando una línea celular HEK293 con expresión constitutiva estable del receptor del GLP-1 humano (hGLP1R-HEK).
[0972] La línea celular HGLP1R-HEK se generó mediante la expresión de hGLP1R en células FLP-IN™ 293. Las células hGLP1R-HEK cultivadas se sembraron a una densidad de 30.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos y solución salina, 100 nM o 10 µM del oligonucleótido antisentido precursor no conjugado ISIS 556089 de localización específica de MALAT1 descrito anteriormente o ISIS 776102 (secuencia de nucleobases: TCTTCTTAAAATACCC) (Id. de sec. n.°: 64) de localización específica de FOXO1, u oligonucleótidos antisentido conjugados con el péptido GLP-1 correspondientes (ISIS 816385 de localización específica de MALAT1 descrito anteriormente o ION 913193 de localización específica de FOXO1 descrito anteriormente) durante aproximadamente 24 horas. Tras el período de tratamiento, se recolectaron las células, se aisló el ARNm y se ajustó al contenido total de ARN medido mediante un espectrofotómetro UV-Vis nanadrop. Los niveles de ARNm de MALAT1 o FOXO1 se midieron mediante la PCR cuantitativa en tiempo real y se normalizaron con respecto a los niveles de ARNm del gen constitutivo (RPLP0) en las mismas muestras. Los niveles de ARNm de MALAT1 humano se midieron utilizando los ensayos de expresión génica HS00273907 y los niveles de ARNm de FOXO1 se midieron utilizando el ensayo Hs01054576 (Applied Biosystems). El nivel de ARNm del gen constitutivo RPLP0 se midió utilizando un conjunto de cebador y sonda con la secuencia directa CCATTCTATCATCAACGGGTACAA (Id. de sec. n.°: 66), una secuencia inversa AGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC (Id. de sec. n.°: 67).
[0973] Los datos se presentan como porcentaje de inhibición del ARNm de MALAT1 o FOXO1 en relación con las células de control no tratadas. Los símbolos abiertos representan el tratamiento con oligonucleótidos antisentido precursores, mientras que los símbolos cerrados representan el tratamiento con nucleótidos antisentido conjugados con un péptido GLP-1. Como se ilustra en la figura 1, en la línea celular hGLP1R-HEK, los oligonucleótidos antisentido fueron más potentes para inhibir el ARNm de MALAT1 o FOXO1 cuando se conjugaron con el péptido GLP-1 en comparación con los oligonucleótidos antisentido precursores.
[0974] Ejemplo 8: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de MALAT-1 tras el tratamiento con oligonucleótidos antisentido precursores no conjugados o conjugados con el péptido GLP-1 en células HEK293 de tipo silvestre y células HEK293 que sobreexpresan los receptores de GPR40 o GLP-1 humanos
[0975] Los oligonucleótidos antisentido contra MALAT1 del ejemplo 7 se analizaron adicionalmente a diversas concentraciones en células HEK silvestres, HEK que expresan hGPR40 y HEK que expresan hGLP1R.
[0976] Se sembraron células hGLP1R-HEK cultivadas, HEK293 de tipo silvestre (WT HEK293) o células que expresan el receptor hGPR40 a una densidad de 30.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos y se trataron con 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 o 30 µM de oligonucleótido antisentido, concentraciones como las indicadas en la figura 2, durante aproximadamente 24 horas. Tras el período de tratamiento, se recolectaron las células, se aisló el ARNm y se midieron los niveles de ARNm de MALAT1 mediante la PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el conjunto de cebador y sonda tal como se describe en la presente memoria (ejemplo 7). Los datos se presentan como niveles de ARNm de MALAT1 normalizados en relación con un gen constitutivo (RPLPO). Los símbolos abiertos representan el tratamiento con el oligonucleótido antisentido original de localización específica de MALAT1 (ISIS 556089), mientras que los símbolos cerrados representan el tratamiento con el mismo nucleótido antisentido conjugado con un péptido GLP-1 (ISIS 816385).
[0977] La concentración inhibitoria media máxima (CI50) de cada oligonucleótido se presenta en la tabla siguiente.
[0978] Tabla 1
[0979]
[0981] El oligonucleótido antisentido fue 40 veces más potente para inhibir la expresión del gen MALAT1 cuando se conjugó con el agonista del péptido GLP-1 en la línea celular hGLP1R-HEK (figura 2A) y no en las líneas celulares WT HEK293 (figura 2B) o HGPR40-HEK (figura 2C).
[0982] Ejemplo 9: Inhibición antisentido de MALAT1 y FOXO1 en islotes primarios de Langerhans de ratón tras el tratamiento con oligonucleótidos antisentido precursores no conjugados o conjugados con el péptido GLP-1
[0983] Los oligonucleótidos antisentido de localización específica de MALAT1 y FOXO1 se analizaron adicionalmente en islotes primarios de Langerhans de ratón para determinar la capacidad para reducir la expresión génica.
[0984] Los islotes pancreáticos se aislaron mediante digestión con colagenasa del páncreas recolectado de ratones C57bl/6crl hembra desangrados de 12 a 15 semanas de edad. Los islotes se mantuvieron en cultivo de tejido hasta la utilización. Los islotes se disociaron en células individuales agitándolos en un medio que contenía una baja concentración de calcio extracelular. Se colocaron de 10 a 20 islotes intactos o disociados en placas de Petri de plástico y se trataron con 10 µM de oligonucleótidos antisentido durante aproximadamente 24 horas. Tras el período de tratamiento, se recolectaron las células, se aisló el ARN y se ajustó al contenido total de ARN, medido con Ribogreen<®>. Niveles de ARNm de MALAT1 o FOXO1 medidos mediante la PCR cuantitativa en tiempo real. Los niveles de ARNm de MALAT1 en ratón se midieron utilizando el ensayo de expresión génica Mm01227912_s1 de Applied Biosystems, mientras que los niveles de ARNm de FOXO1 en ratón se midieron utilizando un conjunto de cebador y sonda con la secuencia directa CAGTCACATACGGCCAATCC (Id. de sec. n.°: 68), una secuencia inversa CGTAACTTGATTTGCTGTCCTGAA (Id. de sec. n.°: 69) y una secuencia TGAGCCCTTTGCCCCAGATGCCTAT (Id. de sec. n.°: 70). Todos los datos se normalizaron con respecto al nivel de ARNm del gen constitutivo (RPLP0) en la misma muestra, y se midieron utilizando un conjunto de cebador y sonda con la secuencia directa GAGGAATCAGATGAGGATATGGGA (Id. de sec. n.°: 71), una secuencia inversa AAGCAGGCTGACTTGGTTGC (Id. de sec. n.°: 72) y una secuencia de sonda TCGGTCTCTTCGACTAATCCCGCCAA (Id. de sec. n.°: 73).
[0985] Los datos se presentan en la figura 3 como niveles de ARNm de MALAT1 o FOXO1 en relación con el gen constitutivo (RPLPO). Los símbolos en forma de estrella representan la ausencia de tratamiento, los círculos abiertos el tratamiento con oligonucleótidos antisentido precursores no conjugados (ISIS 556089 de localización específica de MALAT1 o ISIS 776102 de localización específica de FOXO1), los cuadrados abiertos el tratamiento con la secuencia de oligonucleótido antisentido revuelta conjugada con el péptido GLP1 contra FOXO1 (ION 913195), mientras que los símbolos cerrados representan el tratamiento con oligonucleótidos antisentido conjugados con el péptido GLP1 contra MALAT1 (ISIS 816385) o FOXO1 (ISIS 919193).
[0986] Ejemplo 10: Inhibición antisentido del FOXO1 y reducción de la proteína FOXO1 en los islotes primarios de Langerhans de ratón tras el tratamiento con oligonucleótidos antisentido precursores no conjugados y conjugados con el péptido GLP-1
[0987] Se analizaron oligonucleótidos antisentido de localización específica de FOXO1 en islotes primarios de Langerhans de ratón para determinar la capacidad para reducir los niveles de proteína.
[0988] Los islotes pancreáticos se aislaron mediante digestión con colagenasa del páncreas extraído de ratones B6.Cg-Lepob/J hembra de 12 a 15 semanas de edad sacrificados y se mantuvieron en cultivo de tejido hasta la utilización.
[0989] 150 islotes intactos se colocaron en placas de Petri de plástico y se trataron con 1 µM de oligonucleótidos antisentido durante 3 horas cada 24 horas, y se recolectaron aproximadamente a las 24 horas, 48 horas o 96 horas del tiempo total de tratamiento, respectivamente. Tras el período de tratamiento, se recolectaron los islotes y la mitad de los islotes se utilizaron para medir los niveles de ARNm de FOXO1 como se describe en la presente memoria (ejemplo 9). La mitad de los islotes se homogeneizaron en el reactivo de extracción de proteínas M-PER (Thermo Scientific) que contenía un cóctel de inhibidores de proteasas (Complete Mini y PhosphoStop, Roche Diagnostics). El contenido de proteína de los lisados se cuantificó utilizando el reactivo de ensayo BCA (Pierce). La proteína FOXO1 se detectó mediante el análisis de transferencia de Western, utilizando los anticuerpos primarios C29H4 para FOXO1 (Cell Signalling, n.° 2880), la α-tubulina se midió como control para la carga de la muestra en gel, utilizando un anticuerpo primario de Sigma (n.° T6074). Para el anticuerpo contra FOXO1, el anticuerpo secundario fue el anticuerpo policlonal de cabra conjugado con HRP anti-conejo P0448 (DAKO), y para el anticuerpo contra la α-tubulina, el anticuerpo secundario fue el anticuerpo policlonal de cabra conjugado con HRP anti-ratón P0447 (DAKO). Se utilizaron reactivos de quimioluminiscencia mejorados (Pierce) para la detección.
[0990] La inhibición del ARNm de FOXO1 se presenta como ARNm de FOXO1 en relación con el gen constitutivo, expresado como porcentaje de células no tratadas en la tabla siguiente, y se observa una reducción marginal del ARNm con el oligonucleótido antisentido no conjugado (ISIS 776102) y una reducción de más del 70 % con el oligonucleótido antisentido conjugado con GLP-1 (ION 913193).
[0991] Tabla 2
[0994]
[0996] El análisis de transferencia de Western mostró una reducción en los niveles de la proteína FOXO1, según lo medido en los islotes tratados con un vehículo o un oligonucleótido antisentido durante 96 horas. Los niveles de proteína se cuantificaron midiendo la intensidad de las bandas en el gel, se normalizaron con respecto a la intensidad de la αtubulina y se expresaron como porcentaje de islotes tratados con vehículo. Los niveles de proteína FOXO1 se establecieron en el 100 % en los islotes tratados con vehículo. Por el contrario, los niveles de proteína FOXO1 fueron del 5 % en los islotes tratados con ASO GLP-1 para FOXO1.
[0997] Ejemplo 11: Captación de oligonucleótidos antisentido en el islote de Langerhans in situ en el páncreas tras la administración de oligonucleótidos antisentido precursores no conjugados o conjugados con el péptido GLP-1 de localización específica de MALAT1 a ratones C57BL/6CrL
[0998] Los oligonucleótidos antisentido precursores no conjugados y conjugados con el péptido GLP-1 de localización específica de MALAT1 se analizaron adicionalmente in vivo para evaluar la captación de oligonucleótidos antisentido en los islotes pancreáticos después de la administración intravenosa o subcutánea de los tratamientos.
[0999] Los ratones hembra C57BL/6Crl se asignaron a cinco grupos de tratamiento. Dos grupos recibieron un vehículo (solución salina) o un oligonucleótido antisentido conjugado con GLP-1 de 2 µmol/kg (ISIS 816385) mediante inyección en la vena caudal. Tres grupos recibieron solución salina, 2 µmol/kg de oligonucleótido antisentido precursor no conjugado (ISIS 556089) o 2 µmol/kg de oligonucleótido antisentido conjugado con GLP-1 (ISIS 816385) mediante administración subcutánea dos veces por semana durante dos semanas. Todos los animales se sacrificaron aproximadamente 72 horas después de la última dosis y se extrajo el páncreas para el análisis ex vivo de la captación de oligonucleótidos antisentido mediante inmunohistoquímica.
[1000] Todos los tejidos se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 % durante 32 horas a temperatura ambiente. Tras la fijación, las muestras se deshidrataron utilizando series de etanol estándar seguidas de xileno y se incluyeron en parafina. Se cortaron secciones de tejido de 4 µm de espesor, se montaron en portaobjetos Superfrost<®>Plus y, a continuación, se hornearon en un horno seco durante 1 hora a 60 °C. La inmunohistoquímica para la detección del oligonucleótido antisentido se realizó utilizando el sistema de inmunotinción Ventana Discovery XT (Ventana Medical System, Inc.) según las recomendaciones del fabricante, y todos los reactivos utilizados fueron productos de Ventana (Roche Diagnostics, Basilea, Suiza). La proteasa 1 se utilizó como enzima para la recuperación de antígenos, con una incubación de 8 minutos. Se añadió un bloqueador de anticuerpo para reducir el fondo durante 4 minutos, seguido de la adición de anti-ASO 2.5 de conejo durante 1 hora a 37 °C (dilución 1:5000, Ionis Pharmaceuticals). Para la detección secundaria, se incubó el anti-conejo HRP de OmiMap durante 16 minutos, seguida de una detección cromogénica con el kit DISCOVERY ChromoMap DAB (RUO). En los portaobjetos, se realizó una contratinción con hematoxilina durante 4 minutos, seguida del proceso de azulado durante 4 minutos. Los portaobjetos teñidos se analizaron con un microscopio de campo claro estándar.
[1001] Se detectó un oligonucleótido antisentido en el islote pancreático de Langerhans de animales tratados con ISIS 816385, mediante la administración de dosis subcutánea o intravenosa. No se detectó ningún oligonucleótido antisentido en los islotes de Langerhans en animales tratados por vía subcutánea con ISIS 556089.
[1002] Ejemplo 12: Inhibición antisentido de MALAT-1 en el islote de Langerhans in situ en el páncreas tras el suministro de oligonucleótidos antisentido precursores no conjugados o conjugados con el péptido GLP-1 en ratones C57BL/6Crl Los oligonucleótidos antisentido precursores no conjugados y conjugados con el péptido GLP-1 contra MALAT1 se analizaron adicionalmente in vivo para evaluar la inhibición antisentido de MALAT1 en el páncreas después de la administración intravenosa o subcutánea de los tratamientos.
[1003] Los ratones hembra C57BL/6crl se asignaron a cinco grupos de tratamiento como se describe en la presente memoria (ejemplo 11). Todos los animales se sacrificaron aproximadamente 72 horas después de la última dosis y se extrajo el páncreas para el análisis ex vivo de la expresión de MALAT1 mediante hibridación in situ.
[1004] Los tejidos se prepararon como se describe en la presente memoria, ejemplo 11. El proceso de amplificación y etiquetado del ARNm in situ se realizó en Ventana Discovery ULTRA, una plataforma de hibridación in situ automatizada (Ventana Medical System, Inc), utilizando el ensayo RNAscope<®>VS basado en Advanced Cell Diagnostics (ACD). Se obtuvieron sondas personalizadas de ACD para la detección del ARNm de MALAT1 y se analizaron varios parámetros para optimizar el nuevo método RNAscope para la ISH. La señal se amplificó utilizando múltiples pasos, seguidos de sondas etiquetadas y se detectó utilizando el kit de reactivos RNAscope<®>2.5 VS Reagent Kit-RED. Los portaobjetos teñidos se analizaron con un microscopio de campo claro estándar.
[1005] La expresión de MALAT1 se redujo en el islote pancreático de Langerhans, pero no en el tejido exocrino de animales tratados por vía subcutánea o intravenosa con el oligonucleótido antisentido conjugado con el péptido GLP-1 (ISIS 816385). La expresión de MALAT1 no se redujo en animales tratados por vía subcutánea con el oligonucleótido antisentido precursor no conjugado (ISIS 556089).
[1006] Ejemplo 13: Captación de oligonucleótidos antisentido en el hígado 72 horas después de la administración de oligonucleótidos antisentido precursores no conjugados o conjugados con el péptido GLP-1 de localización específica de MALAT1 a ratones C57BL/6Crl
[1007] Los oligonucleótidos antisentido precursores no conjugados y conjugados con el péptido GLP-1 contra MALAT1 se analizaron adicionalmente in vivo para evaluar la captación de los oligonucleótidos antisentido en el hígado mediante administración intravenosa o subcutánea.
[1008] Los animales se asignaron a grupos de tratamiento como se describe en la presente memoria, ejemplo 11. Todos los animales se sacrificaron aproximadamente 72 horas después de la última dosis, y se extrajo el hígado para el análisis ex vivo de la captación de oligonucleótidos antisentido mediante inmunohistoquímica.
[1009] Los tejidos se prepararon y la inmunohistoquímica se realizó como se describe en la presente memoria, ejemplo 12. Se detectó un oligonucleótido antisentido en hepatocitos y células de Kupffer en el hígado de animales tratados tanto con ISIS 816385 como con ISIS 556089, mediante la administración de dosis por vía subcutánea o intravenosa, según lo indicado.
[1010] Ejemplo 14: Inhibición antisentido de MALAT-1 en el hígado tras la administración de oligonucleótidos antisentido precursores no conjugados o conjugados con el péptido GLP-1 en ratones C57BL/6crl
[1011] Los oligonucleótidos antisentido precursores no conjugados (ISIS 556089) y conjugados con el péptido GLP-1 contra MALAT1 se analizaron adicionalmente in vivo para evaluar la inhibición antisentido de MALAT1 en el hígado mediante administración intravenosa y subcutánea.
[1012] Los ratones hembra C57BL/6crl se asignaron a cinco grupos de tratamiento como se describe en la presente memoria (ejemplo 13). Todos los animales se sacrificaron aproximadamente 72 horas después de la última vez, y se extrajo el hígado para el análisis ex vivo de la expresión de MALAT1 mediante hibridación in situ.
[1013] Se prepararon los tejidos y se realizó la hibridación in situ, como se describe en la presente memoria, ejemplo 12. La expresión de MALAT1 en el hígado se redujo en los hepatocitos de los animales tratados con ISIS 816385 en mayor medida que en los hepatocitos de los animales tratados con ISIS 556089, mediante administración de dosis por vía subcutánea. La expresión de MALAT1 en el hígado también se redujo en comparación con el control de vehículo en animales a los que se les administró ISIS 816385 por vía intravenosa.
[1014] Ejemplo 15: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de MALAT-1 en islotes aislados de Langerhans y en el hígado 72 horas después de la administración de una dosis única de oligonucleótidos antisentido precursores no conjugados y conjugados con el péptido GLP-1 en ratones C57BL/6Crl
[1015] Los oligonucleótidos antisentido precursores no conjugados y conjugados con el péptido GLP-1 se analizaron adicionalmente in vivo para evaluar la potencia de la inhibición antisentido de MALAT1 en islotes pancreáticos aislados de Langerhans en relación con el hígado 72 horas después de la administración subcutánea única.
[1016] Los ratones hembra C57BL/6Crl se asignaron a ocho grupos de tratamiento, los que recibieron una única inyección subcutánea de cualquiera de los vehículos, 0,01 µmol/kg, 0,03 µmol/kg, 0,1 µmol/kg o 1 µmol/kg de ISIS 816385; otros tres grupos de tratamiento recibieron 0,01 µmol/kg, 0,1 µmol/kg o 1 µmol/kg de ISIS 556089. Todos los animales se sacrificaron 72 horas después de la última dosis. Se recogieron muestras de hígado y se aislaron los islotes pancreáticos, como se describe en la presente memoria (ejemplo 9), para el análisis del ARNm. Los niveles de ARNm de MALAT1 se cuantificaron como se describe en la presente memoria (ejemplo 9) y se expresaron como porcentaje de animales tratados con vehículo (control).
[1017] No se observó ninguna inhibición antisentido significativa de MALAT1 en el hígado de ninguno de los grupos de tratamiento, ni en los islotes de Langerhans de animales tratados con el oligonucleótido antisentido precursor (ISIS 556089). El oligonucleótido antisentido conjugado con el péptido GLP-1 inhibió de forma dependiente de la dosis los niveles de ARNm de MALAT1 con una DE50 estimada de 0,07 µmol/kg.
[1018] Ejemplo 16: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de FOXO1 en islotes aislados de Langerhans y en el hígado 72 horas después de la administración de una dosis única de oligonucleótidos antisentido precursores no conjugados y conjugados con el péptido GLP-1 en ratones C57BL/6Crl
[1019] Los oligonucleótidos antisentido precursores no conjugados y conjugados con el péptido GLP-1 se analizaron adicionalmente in vivo para evaluar la potencia de la inhibición antisentido de FOXO1 en islotes pancreáticos aislados de Langerhans en relación con el hígado 72 horas después de la administración subcutánea de una dosis única. Los ratones hembra C57BL/6crl se asignaron a siete grupos de tratamiento, los que recibieron una única inyección subcutánea de cualquiera de los vehículos, 0,01 µmol/kg, 0,03 µmol/kg, 0,1 µmol/kg o 1 µmol/kg de ION 913193, y dos grupos de tratamiento recibieron 0,01 µmol/kg o 1 µmol/kg de ISIS 776102. Todos los animales se sacrificaron 72 horas después de la última dosis. Se recogieron muestras de hígado y se aislaron los islotes pancreáticos, como se describe en la presente memoria (ejemplo 9), para el análisis del ARNm. Los niveles de ARNm de FOXO1 se cuantificaron, como se describe en la presente memoria (ejemplo 9), y se expresaron como porcentaje de animales tratados con vehículo (control).
[1020] No se observó ninguna inhibición antisentido significativa de FOXO1 en el hígado en ninguno de los grupos de tratamiento, ni en el islote de Langerhans tratado con el oligonucleótido antisentido precursor (ISIS 776102). El oligonucleótido antisentido conjugado con el péptido GLP-1 inhibió de forma dependiente de la dosis los niveles de ARNm de FOXO1 con una DE50 estimada de 0,04 µmol/kg.
[1021] Ejemplo 17: Inhibición antisentido de FOXO1 en islotes aislados de Langerhans y en el hígado después de 6 semanas de administración repetida de oligonucleótidos antisentido precursores no conjugados o conjugados con el péptido GLP-1 a ratones ob/ob
[1022] Los oligonucleótidos antisentido precursores no conjugados y conjugados con el péptido GLP-1 se analizaron adicionalmente in vivo para evaluar la potencia de la inhibición antisentido de FOXO1 en islotes pancreáticos aislados de Langerhans en relación con el hígado después de 6 semanas de tratamiento.
[1023] Los ratones ob/ob machos (B6.V-Lepob/OlaHsd, Harlan) se asignaron a cinco grupos de tratamiento, los que recibieron cualquier vehículo, 0,1 µmol/kg de ISIS 776102, 0,1 µmol/kg de ION 913195, 0,03 de ION 913193 o 1 µmol/kg de ION 913193. Todos los animales se trataron una vez a la semana durante 6 semanas. Aproximadamente 120 horas después de la última dosis, se sacrificaron todos los animales, se recogieron muestras de hígado y se aislaron los islotes pancreáticos, como se describe en la presente memoria (ejemplo 9), para el análisis del ARNm. Los niveles de ARNm de FOXO1 se cuantificaron como se describe en la presente memoria (ejemplo 9) y los niveles de ARNm se expresaron en relación con el gen constitutivo en cada muestra (RPLPO).
[1024] No se observó ninguna inhibición antisentido significativa de FOXO1 en el hígado en ninguno de los grupos de tratamiento, ni en los islotes de Langerhans tratados con el oligonucleótido antisentido precursor (ISIS 776102) o con la secuencia de oligonucleótidos antisentido revuelta conjugada con el péptido GLP-1 para FOXO1 (ION 913195). Los animales tratados con oligonucleótidos antisentido conjugados con el péptido GLP-1 (ION 913193) redujeron los niveles de ARNm de FOXO1 en islotes aislados de Langerhans en ambos niveles de dosis analizados (reducción promedio del 42 % del ARNm de FOXO1 a 0,03 µmol/kg y reducción promedio del 72 % del ARNm de FOXO1 a 0,1 µmol/kg), lo que indica que la conjugación del péptido GLP-1 mejora la inhibición antisentido en los islotes pancreáticos de Langerhans in vivo.
[1025] Ejemplo 18: Reducción de los niveles de proteína FOXO1 en islotes de Langerhans aislados de ratones ob/ob tratados durante 6 semanas con oligonucleótidos antisentido precursores no conjugados o conjugados con el péptido GLP-1 Los oligonucleótidos antisentido precursores no conjugados y conjugados con el péptido GLP-1 se analizaron adicionalmente para determinar la capacidad de reducir los niveles de proteína FOXO1 en los islotes pancreáticos de Langerhans de ratón aislados de ratones ob/ob tratados durante 6 semanas.
[1026] Los ratones ob/ob machos se asignaron a cinco grupos de tratamiento como se describe en la presente memoria (ejemplo 17). Aproximadamente 120 horas después de la última dosis, se sacrificaron todos los animales y se aislaron los islotes pancreáticos para el análisis de la proteína FoxO1 como se describe en la presente memoria (ejemplo 10). Se seleccionaron muestras aleatorias de cada grupo de tratamiento y se cargaron en cada gel, de tal modo que al menos una muestra de cada grupo de tratamiento se analizara en los mismos geles. Los niveles de proteína FoxO1 se midieron cuantificando la intensidad y se normalizaron frente a los niveles de α-tubulina en la misma muestra. Todas las muestras dentro de los geles individuales se expresaron como porcentaje de los niveles medidos en islotes de animales que recibieron ION 913195.
[1027] Los niveles de proteína Foxo1 se redujeron en los animales tratados con ION 913193; en relación con ION 913195, en un 57 % y un 81 % en los animales que recibieron 0,03 µmol/kg y 0,1 µmol/kg respectivamente; y en relación con ISIS 776102, en un 64 % y un 36 % en los animales tratados con 0,1 µmol/kg.
[1028] Ejemplo 19: Preparación de un oligonucleótido antisentido conjugado con el péptido GLP-1 de localización específica de MALAT1
[1029] El ION 962963, un ASO conjugado con el péptido 5'-GLP-1 de localización específica de MALAT1, se preparó según el procedimiento del ejemplo 1, a partir de un oligonucleótido modificado con 5'-hexilamino (ISIS 722061) (secuencia de nucleobases: GCATTCTAATAGCAGC (Id. de sec. n.°: 65) con las modificaciones químicas Gks mCks Aks Tds Tds mCds Tds Ads Ads Tds Ads Gds mCds Aks Gks mCk (k = ceT; d = 2'-desoxi; e = 2'-MOE; mC = 5-metilcitosina; o = fosfodiéster; y s = fosforotioato).
[1030] Ejemplo 20: Preparación de un oligonucleótido antisentido de localización específica de MALAT1 conjugado con el péptido GLP-1 mediante un conector de clic
[1031] Método para la preparación de oligonucleótidos modificados conjugados que comprenden GLP-1 en la posición 5' conjugados mediante un conector de clic.
[1032] Preparación del oligonucleótido ISIS 791173 de localización específica dl 5'-BCN MALAT-1:
[1033] Se sintetizó y purificó un oligonucleótido modificado con 5'-hexilamino (ISIS 786434) (secuencia de nucleobases: TCAGCATTCTAATAGCAGC (Id. de sec. n.°: 58) se sintetizó y purificó utilizando procedimientos estándar de oligonucleótidos en fase sólida. El extremo 5' del oligonucleótido modificado comprende un conector de hexametileno y una amina terminal. El éster BCN-NHS (peso molecular de 291,11 g/mol, 744 (1R,8S,9s)-biciclo(6.1.0)non-4-in-9-ilmetilo N-succinimidilo carbonato) se obtuvo de Aldrich. El oligonucleótido modificado (~1 g) se disolvió en 5 ml de tampón de tetraborato de sodio, pH de 8,5. Se disolvieron 13,4 mg de éster de BCN-NHS en 10 ml de DMSO, se añadieron a la solución de ASO, y se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reacción se diluyó con una solución de NaCl 1 M y se desaló por HPLC en una columna de fase inversa.
[1034] Preparación de ASO conjugado con GLP-1 mediante clic (ION 1071996)
[1035] Se disolvieron 12 mg del oligonucleótido modificado ISIS 791173 en 1 ml de tetraborato de sodio 0,1 M, pH de 8,5 (solución ASO), y 12 mg del péptido N-terminal azido-GLP-1 se disolvieron en 400 ml de DMF (solución de péptido). La solución de péptido se añadió a la solución de ASO y se agitó a temperatura ambiente durante 18 h. A las 18 h, se observó un precipitado y se añadió 1 ml de DMF adicional. La reacción se dejó en agitación durante 5 adicionales. El producto se purificó mediante HPLC en una columna SAX con tampón A de NH4OAc 100 mM/ACN al 30 %/H<2>O y tampón B de NaBr 1,5 M/NH<4>OAc/ACN al 30 %/H<2>O, y se desaló mediante HPLC en una columna de fase inversa. Las fracciones del producto se recogieron y se liofilizaron para producir el ASO conjugado esperado, ION 1071996.
[1036]
[1039] Ejemplo 21: Inhibición antisentido de MALAT-1 en islotes primarios de Langerhans de ratón tras el tratamiento con ASO precursor no conjugado o conjugado con el péptido GLP-1 con varios conectores
[1040] Para determinar si la química de la conjugación del péptido GLP-1 con el ASO afecta al suministro de ASO en el páncreas, se administró a los ratones C57BL/6 machos una inyección intravenosa de 0,6 µmol/kg/semana una vez a la semana durante tres semanas de vehículo (solución salina), ISIS 556089 (ASO precursor no conjugado), ISIS 816395 (ASO conjugado con GLP-1 con un conector disulfuro y un conector TCA en 5'), ION 962963 (ASO conjugado con GLP-1 con un conector de disulfuro y sin espaciador de nucleótido en 5'), o ION 1071996 (ASO conjugado con GLP-1 conjugado mediante un conector de clic). Los tejidos se recogieron 72 horas después de la inyección final para evaluar el suministro y la potencia de los compuestos.
[1041] La expresión de MALAT1 se detectó como en el ejemplo 6. El análisis de hibridación in situ indicó que la expresión de MALAT1 en las células beta de los islotes se redujo en los ratones tratados con ASO conjugados con GLP-1 (ISIS 816385, ION 962963 e ION 1071996) en comparación con el control solución salina, pero no en los ratones tratados con ASO precursor no conjugado (ISIS 556089).
[1042] Ejemplo 22: Reducción dependiente de la dosis de la expresión de MALAT-1 en células LVX-GLP1R
[1043] Se generaron células HEK que expresan de manera estable el GLP1R etiquetado con FLAG mediante la infección de células HEK 293 con un lentivirus que contenía GLP1R etiquetado con FLAG, producido mediante la transfección de células 293T con pLVX-IRES-Puro (Clontech Laboratories Inc., Mountainview, CA) que albergaba el inserto FLAG-GLP1R. Las células infectadas se seleccionaron con puromicina (2 pg/ml) y, a continuación, se analizaron para determinar la expresión del receptor mediante la transferencia de Western y la inmunofluorescencia. Las células GLP1R cultivadas se colocaron en placas a una densidad de 10.000 células por pocillo y se trataron con 0,3, 1, 3, 9, 27, 82, 247, 741, 2222, 6667 y 20.000 nM de oligonucleótidos modificados durante aproximadamente 24 horas. Tras el período de tratamiento, se preparó el ARN total utilizando un minikit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA, EE. UU.) y se realizó la qRT-PCR utilizando el conjunto de cebador y sonda RTS2739 (secuencia directa: AGGCGTTGTGCGTAGAGGAT (Id. de sec. n.°: 74), secuencia inversa: AAAGGTTACCATAAGTAAGTTCCAGAAAA (Id. de sec. n.°: 75), secuencia de sonda: AGTGGTTGGTAAAAATCCGTGAGGTCGGX (Id. de sec. n.°: 76). En resumen, se mezclaron ~50 ng de ARN total en 5 µl de agua con conjuntos de sonda y cebador de 0,3 µl que contenían cebadores directos e inversos (10 µM de cada uno) y una sonda etiquetada con fluorescencia (3 µM), 0,3 µl de mezcla de enzimas RT (Qiagen), 4,4 µl de agua libre de RNasa y 10 µl de tampón de reacción de PCR 2x en una reacción de 20 µl. La transcripción inversa se realizó a 48 °C durante 10 min, se realizaron 40 ciclos de PCR a 94 °C durante 20 s y a 60 °C durante 20 s dentro de cada ciclo, utilizando el sistema StepOne Plus RT-PCR (Applied Biosystems, Phoenix, AZ, EE. UU.). Los niveles de ARNm se normalizaron con respecto a la cantidad de ARN total presente en cada reacción según lo determinado mediante el ensayo Ribogreen (Life Technologies) y se normalizaron con respecto al control solución salina (expresión del 100 %). Los resultados se muestran en la tabla siguiente e indican un aumento de la inhibición dependiente de la dosis de MALAT-1 con ASO complejado con GLP-1 con (816385) o sin (962963) un conector TCA.
[1044] Tabla 3: Porcentaje de inhibición de la expresión de MALAT-1 en células GLP1R HEK
[1047]
[1049] Ejemplo 23: Efecto de la longitud del péptido y la posición de la conjugación sobre la actividad in vitro del ASO conjugado con GLP-1 de localización específica de MALAT1
[1050] Para evaluar el efecto de la secuencia peptídica exacta, la longitud del péptido y la posición de la conjugación sobre la actividad in vitro de un ASO conjugado con GLP-1 complementario al MALAT1, se sintetizaron una serie de oligonucleótidos modificados mediante química de clic con variaciones en la secuencia peptídica. Todos los péptidos representan la amida en el extremo C-terminal. El ION 1083582 se sintetizó a partir del ION 791173 mediante una reacción de clic con un residuo de lisina modificado con ácido 5-azidopentanoico (X), como se muestra a continuación. Los otros compuestos se sintetizaron a partir del ION 791173 mediante una reacción de clic con una azidonorleucina (Z) en el extremo C-terminal, como se muestra en el ejemplo 20 anterior.
[1051]
[1054] Las células LVX-GLP1R (como se describe en el ejemplo 22) se colocaron en placas a una densidad de 10.000 células/pocillo y se incubaron con 7 dosis de ASO conjugados con péptidos en una serie de diluciones 1:4. Tras el período de tratamiento, se preparó el ARN total y se analizó como en el ejemplo 22 anterior. Las CI50 se muestran en la siguiente tabla.
[1056] Tabla 4: Efecto de la composición de péptido y el punto de unión sobre la actividad de ASO conjugado con péptido
[1059]
[1060]
[1062] Ejemplo 24: Preparación de un ARNip conjugado con GLP-1 de localización específica de PTEN
[1063] Método para la preparación de dúplex de nucleótidos de ARNip de localización específica de PTEN
[1064] ISIS 522247 (secuencia de nucleobases TTATCTATAATGATCAGGTAA (Id. de sec. n.°: 77) con las modificaciones químicas Txs Ufs Amo Ufs Cmo Ufs Amo Ufs Amo Afs Umo Gfs Amo Ufs Cms Afs Gms Gfs Ums Aes Ae (Tx=5'-(E)-vinilP-2'-O-metoxietil-timina, f=2'-α-Euoro-2'desoxirribosa, m=2'-O-metilribosa, e=2'-O-metoxietilribosa, o = fosfodiéster y s = fosforotioato) e ISIS 790973 (secuencia de nucleobases ACCTGATCATTATAGATAA [Id. de sec. n.°: 78] con las modificaciones químicas Afs Cms Cfo Umo Gfo Amo Ufo Cmo Afo Umo Ufo Amo Ufo Amo Gfo Amo Ufs Ams Af [como anteriormente]) se sintetizaron y purificaron utilizando procedimientos estándar de oligonucleótidos en fase sólida.
[1065] El ION 1055394 conjugado con GLP-1 se preparó según el procedimiento del ejemplo 1, a partir de un oligonucleótido modificado con 5'-hexilamino (ION 1055395) (secuencia de nucleobases ACCTGATCATTATAGATAA [Id. de sec. n.°: 78] con las modificaciones químicas Afs Cms Cfo Umo Gfo Amo Ufo Cmo Afo Umo Ufo Amo Ufo Amo Gfo Amo Ufs Ams Af [como anteriormente]) conjugado con un péptido GLP-1 con la secuencia HisAibGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGluGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyG lyProSerSerGlyAlaProProProSerCys que comprende una amina en el extremo N-terminal libre y una amida en el extremo C-terminal. El ISIS 522247 se hibridó con 790973, generando un dúplex de los dos oligonucleótidos. El ISIS 522247 se hibridó con 1055394, generando un dúplex de los dos oligonucleótidos.
[1066] Ejemplo 25: Preparación de un oligonucleótido conjugado con un antagonista del GLP-1
[1067] Método para la síntesis del oligonucleótido conjugado con un antagonista del GLP-1, DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSC-S-S-Propionoyl-HA-o-TdomCdoAdoGksmCksAks TdsTdsmCdsTdsAdsAdsTdsAdsGdsmCdsAksGksmCk (ION 998975).
[1068] Se disolvieron 38 mg del conector-ISIS 786434 (compuesto 2) descrito en el ejemplo 1, 1,5 ml de H<2>O, y se añadieron 0,5 ml de NaHCO<3>0,1 M/H<2>O para ajustar el pH a ~7,5-8,0 (solución de ASO).
[1069] 27,7 mg del péptido DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSC-NH<2>(Id. de sec. n.°: 79) se disolvieron en 2 ml de DMF:NaHCO<3>0,1 M (1:1) (solución de péptido). La solución de péptido se añadió lentamente a la solución de ASO y se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La reacción se monitorizó mediante LCMS y la agitación continuó durante 1 hora adicional. Se descubrió que la fracción principal era el producto esperado. El producto se diluyó con agua y se mantuvo a 4 °C hasta que se purificó mediante HPLC en una columna de intercambio aniónico fuerte (tampón A = acetato de amonio 100 mM en acetonitrilo acuoso al 30 %; tampón B: NaBr 1,5 M en A, 0 a 60 % de B en un volumen de columna de 28). Las fracciones que contenían ASO de longitud completa se combinaron, se diluyeron para obtener una concentración de acetonitrilo al 10 % y se desalaron mediante HPLC en una columna de fase inversa (tampón A, cloruro de sodio 0,1 M, B = agua, C = acetonitrilo al 50 % en agua). Las fracciones se combinaron y se evaporaron para producir el producto previsto, confirmado por LCMS.
[1070] Ejemplo 26: Método para la preparación de oligonucleótidos modificados conjugados que comprenden GLP-1 en la posición 5' conjugados mediante un conector de maleimida.
[1071] Se sintetizó y purificó un oligonucleótido modificado con hexilamino en 5' de localización específica de MALAT1 (ISIS 786434) como se describió anteriormente en la presente memoria. Se hizo reaccionar ISIS 786434 con 5 equivalentes de 3-maleimidopropionato de N-succinimidilo (PM 266,21 g/mol) en tampón de tetraborato de sodio a un pH de 7, temperatura ambiente, para producir ASO MALAT1 con 5'-(3-maleimdil)propionil-C6. El péptido GLP-1 que contenía una amida de cisteína en el extremo C-terminal (“péptido GLP-1-cisteinamida”, HAibEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSSGAPPPSC-NH2) se disolvió en fosfato de sodio 0,1 M, pH de 8,5/DMF y se añadió a una solución de ASO MALAT1 con 5'-(3-maleimdil)propionil-C6 mientras se agitaba a temperatura ambiente. Se formó el producto (ION 1086699).

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES
1. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado, un conector del conjugado y un resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1, en donde el oligonucleótido modificado es un oligonucleótido que comprende al menos un enlace internucleosídico modificado, al menos un azúcar modificado o al menos una nucleobase modificada con respecto al ADN o ARN no modificado;
en donde el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases complementaria a la de un ácido nucleico diana, el ácido nucleico diana está en una célula que expresa el receptor del GLP-1 y el compuesto es capaz de hibridarse con el ácido nucleico diana, dando como resultado al menos una actividad antisentido.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el conector del conjugado une el oligonucleótido modificado al resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1.
3. El compuesto de la reivindicación 1 o 2, en donde el oligonucleótido modificado tiene una longitud de 15 a 30 nucleósidos unidos.
4. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de hueco que consiste en desoxinucleósidos unidos;
un segmento de ala en 5' que consiste en nucleósidos unidos; y
un segmento de ala en 3' que consiste en nucleósidos unidos;
en donde el segmento de hueco se coloca inmediatamente adyacente al segmento de ala en 5' y al segmento de ala en 3' y entre ellos, en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
5. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el oligonucleótido modificado es monocatenario.
6. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el compuesto comprende un dúplex bicatenario.
7. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el oligonucleótido modificado es complementario a un transcrito de ARN en una célula.
8. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la célula es una célula pancreática o una célula beta de los islotes.
9. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1 es un resto del conjugado de péptido, un resto del conjugado de molécula pequeña, un resto del conjugado de aptámero o un resto del conjugado de anticuerpo de localización específica del receptor del GLP-1.
10. El compuesto de la reivindicación 9, en donde el resto del conjugado de péptido es un resto del conjugado del péptido GLP-1 capaz de unirse al receptor del GLP-1.
11. El compuesto de la reivindicación 10, en donde el resto del conjugado del péptido GLP-1 comprende una porción de al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 aminoácidos contiguos que presenta al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % de homología o identidad con una porción de igual longitud de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de sec. n.°: 1-57.
12. El compuesto de la reivindicación 10, en donde el resto del conjugado del péptido GLP-1 comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de sec. n.°: 1-57.
13. El compuesto de la reivindicación 10, en donde el resto del conjugado del péptido GLP-1 comprende la secuencia de aminoácidos:
(a) His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu- Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys (Id. de sec. n.°: 22), en donde Aib es ácido aminoisobutírico; o
(b) His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu- Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Pen (Id. de sec. n.°: 23), en donde Aib es ácido aminoisobutírico y Pen es penicilamina; o
(c) His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu- Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (Id. de sec. n.°: 1).
14. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 10, 12 y 13, en donde el resto del conjugado del péptido GLP-1 tiene una longitud de 8 a 50 aminoácidos y presenta al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % de homología en toda su longitud con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de sec. n.°: 1-57.
15. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde el conector del conjugado comprende (a) 1-5 nucleósidos conectores; o
(b) 3 nucleósidos conectores; o
(c) 3 nucleósidos conectores que tienen un motivo TCA.
16. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde el conector conjugado comprende (a) un enlace disulfuro; o
(b) un enlace disulfuro que comprende una penicilamina; o
(c) un enlace disulfuro que comprende una cisteína; o
(d) un grupo hexilamino; o
(e) un grupo polietilenglicol; o
(f) un grupo trietilenglicol; o
(g) un grupo fosfato.
17. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde el conector del conjugado comprende:
(a)
;
en donde X se une directa o indirectamente al resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1; y en donde Y se une directa o indirectamente al oligonucleótido; o
(b)
donde
X comprende O y se une directa o indirectamente al resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1; e
Y comprende un grupo fosfato y se une directa o indirectamente al oligonucleótido modificado; o
(c)
en donde X comprende un enlace disulfuro y se une directa o indirectamente al resto del conjugado del ligando del receptor del GLP-1; y
en donde T<1>comprende el oligonucleótido modificado; y Bx es una nucleobase modificada o no modificada; o (d)
en donde:
el grupo fosfato se conecta al oligonucleótido modificado e Y se colecta al grupo conjugado;
Y es un grupo fosfodiéster o amino (-NH-);
Z es un grupo pirrolidinilo que tiene la fórmula:
j es 0 o 1;
n es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10;
p es de 1 a aproximadamente 10;
M es 0 o de 1 a 4; y
cuando Y es amino, entonces m es 1; o
(e)
18. Un compuesto para utilizar en el tratamiento del cáncer, en donde el compuesto es el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-17.
19. Una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
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