FI104180B - Menetelmä polypeptidin vasta-aineen ekä IL-4 välittämien tilojen hoitoon tarkoitetun seoksen valmistamiseksi - Google Patents

Description

, 104180

Menetelmä polypeptidin vasta-aineen sekä IL-4 välittämien tilojen hoitoon tarkoitetun seoksen valmistamiseksi - Förfarande för framställning av en polypeptid, en antikropp och komposition avsedd för skötsel av IL-4 förmed-lade tillständ 5 lnterleukiini-4 (IL-4) on proteiini, joka vaikuttaa laajaan joukkoon hematopoeet-tisia soluja fStrober et ai.. Pediatr. Res. 24:549 (1988)]. IL-4 tehostaa monia aktiivisuuksia, mukaan lukien maktrofaagien toimintaa, lgG:n ja lgE:n tuottoa ja immunoglobuliinilla stimuloituja B-solujen, antigeenillä stimuloitujen T-solujen 10 ja eytropoietiinilla stimuloitujen punaisten verisolujen esisolujen lisääntymistä. Se lisää myös IL-3:lla stimuloitujen syöttösolujen lisääntymistä.

Syöttösoluilla on yhdessä lgE:n kanssa keskeinen rooli allergisissa reaktioissa. Syöttösolut ovat jyväsiä sisältäviä sidekudoksen soluja, jotka sijaitsevat 15 kaikkialla kehossa lähellä kapillaareja. Erityisen suurissa konsentraatioissa niitä on keuhkoissa, iholla ja gastrointestinaalisissa ja urogenitaalisissa kanavissa. Antigeeniselle aineelle alttiiksi joutuvat kemiallisia välittäjiä, kuten histamiinia, serotiinia, hepariinia, prostagladiineja jne., jotka aiheuttavat allergia-reaktion.

20

Koska IL-4 vaikuttaa stimuloivasti lgE:n tuottoon ja syöttösolujen lisääntymiseen, IL-4: n antagonisti saattaisi olla hyödyllinen allergian hoidossa, koska se vähentäisi syöttösolujen ja lgE:n tuottoa.

25 Eräät tutkijat ovat käyttäneet vasta-aineita vastustamaan IL-4:n biologista aktiivisuutta. Esimerkiksi Finkelman et ai. TProc. Natl. Acad. Sei. USA 83:9675 (1986)] käytti monklonaalista vasta-ainetta BSF-1.a vastaan (tästä käytetään Λ : nykyään nimitystä IL-4) estääkseen IL-4:n indusoiman lgE:n tuoton hiirillä, jotka oli infektoitu sukkulamadon Niopostroavulus brasiliensis-parasiiteilla tai 30 jotka oli injisoitu hiiren lgD:n vastaisilla puhdistetulla vuohen vasta-aineella. Molempien käsittelyjen tiedettiin kiihottavan lgE:n tuottoa; jälkimmäisen käsittelyn tiedettiin myös stimuloivan IL-4:n erittymistä.

2 104180 Tämän jäkeen Chretien et ai. on raportoinut, että polyklonaalinen kaniinin antiseerumi osittain puhdistetuille ihmisen rekombinantti-IL-4:lle neutraloi osan IL-4:n biologisista aktiivisuuksista in vitro. Monoklonaaliset vasta-aineet synteettisille polypeptideille, joissa oli ihmisen valmiin IL-4:n ryhmiä 3-18, 31-46, 5 52-65 ja 112-127 vastaavia aminohapposekvenssejä, eivät kuitenkaan kyen neet neutraloimaan IL-4:n bioaktiivisuutta, vaikkakin ne sitoutuivat proteiiniin.

Tämän keksinnön kohteena on menetelmä polypeptidin valmistamiseksi, joka sisältää noin 5 - noin 26 aminohapporyhmää ja jolla on ihmisen IL-4:n amino-10 happoryhmien 61 - 82 sekvenssiä, tai näiden alasekvensslä tai ihmisen IL-4:n aminohapporyhmien 104-129 sekvenssiä vastaava aminohapposekvenssi, jolle menetelmälle on tunnusomaista se, että menetelmään kuuluu: kasvatetaan isäntäsolu, joka on transformoitu vektorilla, joka sisältää ja kykenee ilmentämään polypeptidiä koodaavan DNA-sekvenssin; ja 15 polypeptidin eristämisen kasvuväliaineesta.

Edullisesti polypeptidi on kytketty kovalenttisesti kantajamolekyyliin.

Keksinnössä käytetyn hyvänä pidetyn polypeptidin aminohapposekvenssi on 20

Lys-Asp-Thr-Arg-Cys,

Thr-Ala-GIn-GIn-Phe-His-Arg-His, 25 Lys-Asp-Thr-Arg-Cys-Leu-Gly-Ala-Thr-Ala-

Gln-GIn-Phe-His-Arg-His-Lys-GIn-Leu-lle-Arg-Phe tai

Ala-Asn-GIn-Ser-Thr-Leu-Glu-Asn-Phe-Leu-30 Glu-Arg-Leu-Lys-Thr-lle-Met-Arg-Glu-Lys- T yr-Ser-Lys-Cys-Ser-Ser.

3 104180 Tämä keksintö tuo edelleen esiin menetelmät, joilla valmistetaan vasta-aineita, jotka spesifisesti sitoutuvat solureseptoreihin ja estävät ihmisen IL-4:n sitoutumisen näihin, jossa menetelmässä annetaan eläimelle riittävä määrä polypepti-diä, joka sisältää noin 5 - noin 26 aminohapporyhmää ja jossa on ihmisen 5 IL-4:n aminohapporyhmien 61 - 82 tai 104-129 sekvenssiä tai tämän alasek-venssiä vastaava aminohapposekvenssi, minkä johdosta eläin tuottaa polypep-tidin vasta-aineita, jotka spesifisesti sitoutuvat ihmisen IL-4:an ja jotka estävät ihmisen IL-4:n sitoutumisen solureseptoreihin.

10 Keksinnön mukaiset vasta-aineantagonistit ovat hyödyllisiä reseptoreiden in vitro-sitoutumistutkimuksissa. joissa määritetään IL-4:n vaikutusmekanismi ja/tai tunnistetaan IL-4:n agonisteja tai muita antagonisteja. Edellä jo mainittiin, että ne voivat olla myös hyödyllisiä allergoiden hoidossa, koska ne vähentävät IL-4:lla stimuloitua syöttösolujen lisääntymistä ja lgE:n tuottoa.

15 Tämän keksinnön ymmärtämistä helpottavat oheiset kuviot, joissa:

Kuvio 1 esittää ihmisen valmiin IL-4:n aminohapposekvenssiä amino-päästä karboksyylipäähän.

20

Kuvio 2 esittää graafisesti, paljonko polypeptidin vastainen kaniinin IgG-jae sitoo IL-4:a (alempi käyrä) ja polypeptidiä n:o 7 (ylempi käyrä; kts. taulukko 1) suorissa ELISA-analyyseissä. Proteiinin/polypeptidin sitoutunut määrä pikomooleissa on esitetty 414 nm:ssa tapahtuvan 25 absorbanssin funktiona.

Kuvio 3 esittää graafisesti, paljonko polypeptidin n:o 7 vastainen kaniinin : IgG-jae estää 125l-IL-4:n spesifistä sitoutumista Daudi-soluihin spesi fisesti sitoutuneena radioaktiivisuusprosenttina kasvavan lgG:n ko-30 sentraation funktiona.

4 104180

Kuvio 4 esittää graafisesti, paljonko anti-idiotyyppinen antiseerumiyksikkö 1448 estää 125l-IL-4:n spesifisen sitoutumisen Daudi-soluihin spesifisesti sitoutuneen radioaktiivisuuden prosentuaalisena inhibitiona antiseerumin pienenevän kosentraation funktiona.

5

Kuvio 5 esittää graafisesti tuloksia epitooppianalyysistä, joka suoritettiin polypeptidin n:o 7 vastaisella kaniinin antiseerumilla. Kuviossa on esitetty ELISA-absorbanssi, jonka antiseerumin sitoutuminen analyysissä käytettyyn oktapeptidisarjaan aiheuttaa. Oktapeptidien nume-10 rot vastaavat taulukon 3 numeroita.

Kuvio 6 esittää graafisesti tuloksia epitooppianalyysistä, joka suoritettiin polypeptidin n:o 6 vastaisella kaniinin antiseerumilla. Kuviossa on esitetty ELISA-absorbanssi, jonka antiseerumin sitoutuminen anar 15 lyysissä käytettyyn oktapeptidisarjaan aiheuttaa. Ruudussa A esi tettyjen tulosten saamiseen käytetty antiseerumi kerättiin varhaisessa vaiheessa kaniinin immunisoinnin kuluessa, eikä se estänyt 125l-IL-4:n sitoutumista Daudi-soluihin. Ruudussa B käytetty antiseerumi kerättiin myöhemmin, ja se oli voimakas leimatun IL-4:n sitoutu-20 misen inhibiittori. Oktapeptidien numerot vastaavat taulukon 4 nume roita.

Kaikki tässä yhteydessä mainitut viitteet on otettu mukaan ainoastaan viitteinä. Annetut polypeptidien aminohapposekvenssit ovat yksikirjaimisessa tai kolmi-25 kirjaimisessa standardimuodossa (Lehningen, Principles of Biochemistry, 1982, Worth Publishers Inc., New York, s. 96).

Esillä oleva keksintö tuo esiin vasta-aineet, jotka vaikuttavat ihmisen IL-4:n solureseptoreihin sitoutumisen vastaisesti (a) yhdistymällä IL-4:n alueeseen, 30 joka ilmeisesti osallistuu vuorovaikutuksiin reseptoreiden kanssa, tai (b) matkimalla itse IL-4:a ja näin kilpailemalla sen kanssa sitoutumisesta solureseptoreihin. Koska IL-4 kiihottaa IgE-vasta-aineiden tuottoa ja syöttösolujen lisääntymistä, kahta allergeenisten reaktioiden aiheuttajaa, keksinnön mukaiset vasta- 5 104180 aineantagonistit ovat hyödyllisiä allergioiden hoidossa. Ne ovat myös hyödyllisiä in vitro IL-4:n reseptoreiden sitoutumissysteemeissä, kun halutaan selvittää IL-4:n vaikutusmekanismi tai seuloa muita IL-4:n antagonisteja tai agonisteja.

5 Tässä yhteydessä käytettynä ihmisen "IL-4" tarkoittaa proteiinia, (a) jolla on aminohapposekvenssi, joka on oleellisesti identtinen kuviossa 1 esitetyn valmiin, ihmisen IL~4:n sekvenssin kanssa, ja (b) jolla on natiiville IL-4:Ile tavallinen biologinen aktiivisuus.

10 Aminohapposekvenssien oleellinen identtisyys tarkoittaa, että toisen IL-4:n sekvenssi kuvion 1 sekvenssiin verrattuna on identtinen tai eroaa yhden tai useamman aminohapon eron (deleetiot, additiot, substituutiot) kautta, jotka eivät oleellisesti haittaa biologista aktiivisuutta.

15 Edellä mainituilla IL-4-alueilla olevat aminohapposekvenssit voivat Luonnollisesti olla erilaisia oleellisesti identtisten IL-4-molekyylien tapauksessa.

Jäljempänä kuvatuilla synteettisillä.polypeptideillä tehdyt tutkimukset ovat osoittaneet, että ihmisen IL-4-molekyylissä on kaksi aluetta, jotka näyttävät 20 osallistuvan sitoutumiseen reseptorille. Näiden polypeptidien aminohapposekvenssit on jäljempänä määritelty yksinkertaisuuden vuoksi ryhmien asemina kuviossa 1 esitetyn valmiin ihmisen IL-4:n aminohapposekvenssissä, jolloin yksi on amino-terminaalinen histidiiniryhmä ja 129 on karboksyyliterminaalinen seriiniryhmä.

25 Näiden tutkimusten tuloksena on havaittu, että synteettisiä polypeptidejä, joilla on ihmisen IL-4:n ryhmien 52 - 82 ja 104-129 sekvenssejä tai näiden alasek-: venssejä vastaavia aminohapposekvenssejä, voidaan käyttää antigeeneinä ja aikaansaamaan eläimissä vasta-aineiden muodostuminen, jotka voivat sitoutua 30 polypetideihin ja ihmisen IL-4:an. Koska keksinnön mukaiset vasta-aineet kykenevät sitoutumaan tällaisiin spesifisiin IL-4:n alueisiin, ne estävät vähintään 60-prosenttisesti 125l-IL-4:n spesifisen sitoutumisen soluihin, joissa on reseptoreita IL-4: Ile.

6 104180

Suurin edellä olevista IL-4:n sitoutumisalueista (ryhmät 52 - 82) sisältää noin 30 aminohapporyhmää. Alalla on yleisesti tunnettua, että antigeeniset determinantit (epitoopit) yleensä sisältävät vähintään noin 5 aminohapporyhmää fOhno et ai.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:2945 (1985)]. Keksinnön mukaiset 5 polypeptidit käsittävät sen vuoksi noin 5 - noin 30 aminohapporyhmää, ja niissä on edellä mainitut aminohapposekvenssit. Tietyn polypeptidin kuuluminen tämän keksinnön piiriin voidaan helposti määrittää rutiinikokeilla käyttämällä jäljempänä kuvattuja menetelmiä.

10 Polypeptidit syntetisoidaan sopivalla menetelmällä, kuten ekslusiivisella kiin-teäfaasisella synteesillä, osittain kiinteäfaasisilla menetelmillä, fragmenttien kondensoinnilla tai klassisilla liuossynteeseillä. Polypeptidit valmistetaan mieluummin kiinteäfaasisella peptidisynteesillä, kuten Merrifield, J. Am. Chem.

Soc. 85:2149 /1963), on kuvannut. Synteesi suoritetaan aminohapoilla, jotka 15 on suojattu alfa-aminopäässä. Myös kolmifunktionaaliset aminohapot, joissa on pysymättömiä sivuketjuja, suojataan sopivilla ryhmillä ja estetään näin ei-toi-vottujen kemiallisten reaktioiden tapahtuminen polypeptidien kokoamisen aikana. Alfa-aminon suojaryhmä poistetaan selektiivisesti, jolloin seuraava reaktio voi tapahtua amino-päässä. Alfa-aminoryhmän suojaryhmän poistamis-20 olosuhteet eivät poista sivuketjujen suojaryhmiä.

Alfa-aminon suojaryhmät ovat ryhmiä, joiden tiedetään olevan hyödyllisiä polypeptidien portaattaisessa syntetisoinnissa, Näihin kuuluvat asyylityyppiset suojaryhmät (esim. formyyli, trifluoriasetyyli, asetyyli), aromaattiset uretaani-25 tyyppiset suojaryhmät [esim. bentsyylioksikarbonyyli (Cbz), substituoitu bent-syylioksikarbonyyli ja 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli (Fmoc)], alifaattiset uretaanisuojaryhmät [esim. t-butyylioksikarbonyyli (Boc), isopropyylioksikar-: bonyyli, sykloheksyylioksikarbonyyli] ja alkyylityyppiset suojaryhmät (esim.

bentsyyli, trifenyylimetyyli), suositeltu suojaryhmä on Boc. Sivuketjun suoja-30 ryhmiin Tynlle kuuluvat tetrahydropyranyyli, tert.-butyyli, trityyli, bentsyyli, Cbz, 4-Br-Cbz ja 2,6-diklooribentsyyli. 2,6-Diklooribentsyyli on suositeltu sivuketjun suojaryhmä Tyrlle. Sivuketjun suojaryhmiin Asp.lle kuuluvat bentsyyli, 2,6-diklooribentsyyli, metyyli, etyyli ja sykloheksyyli. Suositeltu sivuketjun suojaryh- 7 104180 mä Aspille on sykloheksyyli. Sivuketjun suojaryhmiin Thrlle ja Senile kuuluvat asetyyli, bentsoyyli, trityyli, tetrahydropyranyyli, bentsyyli, 2,6-diklooribentsyyli ja Cbz. Thrlle ja Senile suositeltu suojaryhmä on bentsyyli. Sivuketjun suoja-ryhmiä Argille ovat nitro, Tos, Cbz, adamantyylioksikarbonyyli ja Boc. Tos on 5 Argille suositeltu suojaryhmä. Lysin sivuketjun aminoryhmä voidaan suojata Cbzilla, 2-CI-Cbz::lla, Tosilla tai Bocilla. 2-CI-Cbz-ryhmä on suositeltu suoja-ryhmä Lysille.

Valittujen sivuketjun suojaryhmien on pysyttävä ennallaan kytkemisen aikana 10 eivätkä ne saa poistua aminopään suojaryhmän suojauksenpoiston aikana tai kytkentäolosuhteissa. Sivuketjun suojaryhmien on myös oltava poistettavissa synteesin lopussa käyttämällä reaktio-olosuhteita, jotka eivät muuta valmista polypeptidiä.

15 Kiinteäfaasinen synteesi suoritetaan tavallisesti karboksyylipäästä kytkemällä alfa-aminosuojattu (sivuketju on suojattu) aminohappo sopivaan kiinteään kantajaan. Kun kiinnittäminen tehdään kloorimetyyli- tai hydroksimetyylihart-siin, muodostuu esterisidos, ja saadussa polypeptidissä on vapaa karboksyyli-ryhmä C-päässä. Vaihtoehtoisesti käytettäessä bentshydryyliamiini- tai p-me-20 tyylibentshydryyliamiinihartsia, muodostuu amidisidos, ja saadussa polypeptidissä on karboksamidiryhmä C-päässä. Nämä hartsit ovat kaupallisesti saatavia, ja niiden valmistusta on kuvannut Stewart et ai.. "Solid Phase Peptide Synthesis" (2. painos), Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984.

25 C-terminaalinen aminohappo, joka on tarvittaessa suojattu sivuketjussa ja alfa-aminoryhmässä, kytketään bentshydryyliamiinihartsiin käyttämällä erilaisia aktivointiaineita, mukaanlukien disykloheksyylikarbodi-imidiä (DCC), Ν,Ν'-di-' isopropyylikarbodi-imidiä ja karbonyylidi-imidatsolia. Hartsikantajaan kiinnittä misen jälkeen poistetaan alfa-aminon suojaryhmä käyttämällä trifluorietikka-30 happoa (TFA) tai HCIia dioksaanissa lämpötilassa välillä 0°C ja 25°C. Trifluori-etikkahappoon lisätään dimetyylisulfidia mahdollisen S-alkylaation vähentämiseksi metioniinin (Met) lisäämisen jälkeen. Alfa-aminon suojaryhmän poistami- t 8 104180 sen jälkeen loput suojatut aminohapot kytketään vaiheittain halutussa järjestyksessä niin, että saadaan haluttu sekvenssi.

Kytkentäreaktioihin voidaan käyttää erilaisia aktivointiaineita mukaanlukien 5 DCC:a, Ν,Ν'-di-isopropyylikarbodi-imidiä, bentsotriatsol-1-yyli-oksi-tris-(di-metyyliamino)-fosfoniumheksafluorifosfaattia (BOP) ja DCC-hydroksibentsotri-atsolia (HOBt). Kutakin suojattua aminohappoa käytetäään ylimäärä (> 2,0 ekvivalenttia), ja kytkennät suoritetaan tavallisesti N-metyylipyrrolidonissa (NMP) tai DMF:ssa, CH2CI2:ssa tai näiden seoksissa. Kytkentäreaktion lop-10 puun tapahtumista seurataan kussakin vaiheessa, esim. Kaiser'in et ai,. Anal. Biochem. 34:595 (1970), kuvaamalla nininhydriinireaktiolla. Niissä tapauksissa, joissa kytkennän havaitaan olevan epätäydellinen, kytkentäreaktio toistetaan. Kytkentäreaktiot voidaan suorittaa automaattisesti kaupallisesti saatavilla laitteilla.

15

Sen jälkeen, kun koko haluttu polypeptidi on koottu, polypeptidi-hartsi lohkaistaan sellaisella reagenssilla kuin nestemäinen HF 1 - 2 tunnin aikana 0°C:ssa, mikä irrottaa polypeptidin hartsista ja poistaa kaikki sivuketjujen suojaryhmät. Nestemäisen fluorivedyn kanssa käytetään tavallisesti siepparia, kuten aniso-20 lia estämään lohkaisemisen aikana muodostuneet kationit-alkyloimasta poly-peptidissä olevat aminohapporyhmät. Haluttaessa voidaan polypeptidi-hartsis-ta poistaa suojaus TFA/ditioetaanilla ennen lohkaisemista.

Sivuketjun syklisoituminen sivuketjuksi kiinteällä kantajalla edellyttää ortoga-25 naalisen suojaussuunnitelman käyttämistä, mikä mahdollistaa happamien aminohappojen (esim. Asp) ja emäksisten aminohappojen (esim. Lys) sivuket-jufunktioiden selektiivisen lohkaisemisen. Tähän tarkoitukseen voidaan käyttää : 9-fluorenyylimetyyli (Fm)-suojaryhmää Asp:n sivuketjulle ja 9-fluorenyylimetyy- lioksikarbonyyli (Fmoc)-suojaryhmää Lys:n sivuketjulle. Näissä tapauksissa 30 poistetaan Boc:lla suojatun polypeptidihartsin sivuketjujen suojaryhmät selektiivisesti piperidiinillä d imetyyliformamidissa. Syklisointi saadaan aikaan kiinteällä kantajalla käyttämällä erilaisia aktivointiaineita, mukaanlukien DCC:a, 9 104180 DCC/H-OB:a tai BOP:a. HF-reaktio syklisoidulle polypeptidi-hartsille suoritetaan edellä kuvatulla tavalla.

Polypeptidin valmistamiseen voidaan käyttää myös rekombinanttiDNA-metodo-5 logiaa. Haluttuja aminohapposekvenssejä koodaavien oligonukleotidien synte-tisoimiseen voidaan käyttää tunnettua geneettistä koodia, haluttaessa räätälöitynä tunnetuilla hyvänä pidetyillä kodoneilla ekspressoitumisen tehostamiseksi tietyssä isäntäorganismissa. Tällaisiin synteeseihin voidaan käyttää Matteucci'n et ai. [J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981)] kiinteä-kantajaista 10 fosforiamidiitti-menetelmää tai muita tunnettuja menetelmiä. Saadut oligonuk-leotidit voidaan insertoida sopivaan vektoriin ja ekspressoida yhteensopivassa isäntäorganismissa.

Keksinnön mukaiset polypeptidit voidaan puhdistaa HPLC:lla, geelisuodatta-15 maila, ioninvaihdon avulla ja partitiokromatograafisesti vastavirtadistribuutio-menetelmällä tai muilla yleisesti tunnetuilla menetelmillä.

Vasta-aineet keksinnön mukaisia polypeptidejä vastaan voidaan valmistaa käyttämällä standardimenetelmiä. Tässä yhteydessä käytettynä nimitys "vasta-20 aine" tarkoittaa sekä polyklonaalisia että monoklonaalisia vasta-aineita. Se käsittää myös kokonaiset immunoglobuliinit ja niiden antigeenin sitovat fragmentit.

Polyklonaalisia vasta-aineita voidaan valmistaa immunisoimalla isäntäeläin, 25 kuten kaniini, rotta, vuohi, lammas, hiiri jne. jollakin polypeptideistä. Alkuruis-keen jälkeen annetaan mieluummin yksi tai useampi tehosteruiske vasta-aine-tiitterin nostamiseksi. Sen jälkeen eläimeltä otetaan verta ja valmistetaan see-rumi ja seulotaan standardimenetelmillä, kuten ELISA-menetelmällä (enzyme-linked immunosorbent assay) käyttämällä polypeptidiä antigeeninä.

Polypeptidien immunogeenisyyttä on suositeltavaa nostaa yhdistämällä ne apuaineen kanssa ja/tai muuntamalla suurempaan muotoon ennen immunisointia.

30 10 104180

Sopiviin eläinten rokotuksen apuaineisiin kuuluvat, näihin rajoittumatta, adju-vantti 65 (sisältää maapähkinäöljyä, mannidimono-oleaattia ja alumiinimono-stearaattia); Freund'in täydellinen tai epätäydellinen adjuvantti; mineraaligeelit, kuten alumiinihydroksidi, alumiinifosfaatti ja aluna, pinta-aktiiviset aineet, kuten 5 heksadekyyliamiini, oktadekyyliamiini, lysolesitiini, dimetyylidioktadekyyliam-moniumbromidi, N,N-dioktadekyyli-N',N'-bis(2-hydroksimetyyi)propaanidiamiini, metoksiheksadekyyliglyseroli ja pluronipolyolit; polyanionit, kuten pyraani, dekstraanisulfaatti, poly-IC, polyakryylihappo ja karbopol; peptidit, kuten mura-myylidipeptidi, dimetyyliglysiini ja tuftsiini; ja öljyemulsiot. Polypeptidiä voidaan 10 käyttää myös sen jälkeen, kun ne on laitettu liposomeihin tai muihin mikrokan- tajiin.

Polypeptidien immunogeenisyyttä voidaan myös tehostaa silloittamalla tai kytkemällä immunogeeniseen kantajamolekyyliin (so. makromolekyyliin, joka 15 kykenee itsenäisesti aiheuttamaan immunologisen reaktion isäntäeläimessä ja johon keksinnön mukaiset polypeptidit voidaan kovalenttisesti yhdistää). Sillas-taminen tai konjugointi kantajamolekyyliin voi olla tarpeen, koska pienet polypeptidit joskus toimivat hapteeneina (molekyyleinä, jotka kykenevät spesifisesti sitoutumaan vasta-aineeseen, mutta jotka eivät kykene aiheuttamaan vasta-20 aineen tuottoa, so. ne eivät ole immunogeenisiä). Tällaisten polypeptidien konjugointi immunogeeniseen kantajamolekyyliin tekee fragmentit immunogee-nisiksi yleisesti "kantajavaikutuksen" nimellä tunneteun tapahtuman kautta.

Sopiviin kantajamolekyyleihin kuuluvat esimerkiksi proteiinit ja luonnonmukai-25 set tai synteettiset polymeeriset yhdisteet, kuten polypeptidit, polysakkaridit, lipopolysakkaridit jne. Eräs hyödyllinen kantaja on Quil A.:na tunnettu glyko-sidi, jonka on kuvannut Morein et ai.. Nature 308.457 (1984). Erityisen hyvänä : pidettyjä ovat proteiinitkantajamolekyylit, mukaanlukien, mutta ei näihin rajoit tuen, keyhole-maljakotelon hemosyaniini ja nisäkässeerumin proteiinit, kuten 30 ihmisen tai naudan gammaglobuliini, ihmisen, naudan tai kaniinin seerumi-albumiini tai näiden proteiinien metyloidut tai muut johdokset. Muut proteiini-kantajat ovat ilmeisiä alan ammattimiehille.

11 104180

Proteiinikantaja on mieluummin, mutta ei välttämättä, vieras isäntäeläimelle, jossa polypeptidien vastaiset vasta-aineet on tarkoitus tuottaa.

Kovalenttinen kytkentä kantajamolekyyliin voidaan suorittaa käyttämällä alalla 5 yleisesti tunnettuja menetelmiä, joiden täsmällinen valinta määräytyy käytetyn kantajamolekyylin laadun perusteella. Kun immunogeeninen kantajamolekyyli on proteiini, keksinnön mukaiset polymeerit voidaan kytkeä, esimerkiksi käyttämällä vesiliukoisia karbodi-imidejä, kuten disykloheksyylikarbodi-imidiä tai glutaraldehydiä.

10 Tällaisia kytkentäaineita voidaan myös käyttää sillastamaan polypeptidit itseensä käyttämättä erillistä kantajamolekyyliä. Tällainen sillastaminen aggregaateiksi voi myös lisätä immunogeenisyyttä.

15 Näin immunisoiduista eläimistä tuotettu seerumi voidaan käyttää suoraan. Vaihtoehtoisesti voidaan seerumista erottaa IgG-jae käyttämällä standardimenetelmiä, kuten plasmaforeesia tai adsorptiokromatografiaa käyttämällä IgG-spesifisiä absorbenttejä, kuten immobilisoitua proteiini A:ta.

20 Monoklonaalisia vasta-aineita voidaan valmistaa käyttämällä standardimenetelmiä, esimerkiksi Kohler'in et ai.. [Nature 258:495 (1975); Eur. J. Immunol.

6:511 (1976)], kuvaamia. Oleellista on, että eläin immunisoidaan edellä kuva-' ' tulla tavalla niin, että se tuottaa vasta-ainetta erittäviä somaattisia soluja. Sen jälkeen nämä solut poistetaan immunisoidusta eläimestä ja fuusioidaan mye-25 loomasoluihin.

Myeloomasolulinjan kanssa fuusioimiseen sopivia ovat somaattiset solut, jotka * #’ * kykenevät tuottamaan vasta-aineita, erityisesti B-solut. Näitä somaattisia soluja voidaan saada priimattujen eläinten imusolmukkeista, pernoista ja periferisestä 30 verestä. Tämän keksinnön esimerkkimäisessä suoritusmuodossa käytetään hiiren pernasoluja, osaksi, koska nämä solut tuottavat suhteellisen suuren prosentuaalisen määrän stabiileja fuusioita hiiren myeloomalinjojen kanssa.

12 104180

Kuitenkin niiden asemesta voitaisiin käyttää rotan, kaniinin, sammakon soluja tai muita soluja.

Lymfosyyttisistä kasvaimista on kehitetty erikoistuneita myeloomasolulinjoja 5 käytettäväksi hybridomien tuottamiseen tarkoitetuissa fuusiointimenetelmissä [Kohler ja Milstein,.Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Shulman et ai.. Nature 276:269 (1978); Volk et ai.. J. Virol. 42:220 (1982)]. Nämä solulinjat on kehitetty vähintään kolmesta syystä. Ensiksikin on haluttu helpottaa fuusioitujen hybridomien valitsemista fuusioimattomista ja samoin äärettömästi itselisäänty-10 vistä myeloomasoluista. Tavallisesti tämä saadaan aikaan käyttämällä myeloo-mia, joilla on entsyymivajauksia, jotka tekevät ne kyvyttömiksi kasvamaan tietyissä selektiivisissä alustoissa, jotka tukevat hybridomien kasvua. Toinen syy johtuu lymfosyyttisen kasvainsolujen niille ominaisesta kyvystä tuottaa omia vasta-aineitaan. Monoklonaalisten tekniikoiden tarkoituksena on saada fuusioi-15 tuja hybridisolulinjoja, joilla on rajoittamattomat eliniät ja jotka tuottavat yhtä ainoaa haluttua vasta-ainetta hybridoman somaattisen solukomponentin geneettisen kontrollin alaisena. Jotta hybridomat estettäisiin tuottamasta kasvain-soluvasta-aineita, käytetään myeloomasolulinjoja, jotka eivät kykene tuottamaan kevyitä tai raskaita immunoglobuliiniketjuja tai joilla on puutteellisia 20 vasta-aineen eritysmekanismeja. Kolmas syy näiden solulinjojen valintaan on niiden sopivuus ja tehokkuus fuusiointiin.

Fuusioitujen soluhybridien tuottamiseen voidaan käyttää monia myeloomasolulinjoja, mukaanlukien esimerkiksi seuraavat: P3X63-Ag8, P3/NS1-Ag4-1 (NS-I), 25 Sp2/0-Ag14ja S194/5.XXO.Bu.1. Kohler ja Milstein, [Eur. J. Immunol. 6:511 (1976)], ovat kuvanneet P3X63-Ag8-ja NS-1-solulinjat. Shulman et ai. [Nature 276:269 (1978)] kehitti Sp2/0-Ag14-myeloomalinjan. S194/5.XXO.Bu.1-linjasta ‘ raportoi Trowbridge [J. Exp. Med. 148:313 (1979)].

30 Menetelmissä, joilla muodostetaan vasta-ainetta tuottavien perna- tai imusol-mukesolujen ja myeloomasolujen hybridejä, tavallisesti sekoitetaan somaattisia soluja myeloomasolujen kanssa suhteessa 10:1 (vaikkakin suhde voi vaihdella välillä noin 20:1 - noin 1:1), solumembraanien fuusioitumista edistävän aineen t 13 104180 tai aineiden (kemiallinen, viraalisten tai sähköisten) läsnäollessa. Fuusiointi-menetelmiä ovat kuvanneet Kohler ja Milstein, supra. Gefter et ai. [Somatic Cell Genet. 3:231 (1977)] ja Volk etaL (J. Virol. 42:220 (1982)]. Näiden tutkijoiden käyttämiä fuusioitumista edistäviä aineita olivat Sendai-virus ja polyety-5 leeniglykoli (PEG). Esillä olevan keksinnön esimerkin fuusiointimenetelmässä käytetään polyetyleeniglykolia.

Koska fuusiointimenetelmät tuottavat eläviä hybridejä hyvin alhaisella esiinty-mistaajuudella (esim. kun somaattisten solujen lähteinä käytetään pernoja, 10 saadaan vain yksi hybridi karkeasti sanoen jokaista 1 x 105 pernasolua kohti), on oleellista, että käytettävissä on keino, jolla fuusioidut soluhybridit valitaan jäljelle jääneistä fuusioitumattomista soluista, erityisesti fuusioitumattomista myeloomasoluista. Lisäksi tarvitaan keino, jolla halutut vasta-ainetta tuottavat hybridomat detektoidaan muista saaduista fuusioituneista soluhybrideistä.

15

Fuusioitujen soluhybridien valinta suoritetaan yleensä viljelemällä soluja alustoissa, jotka tukevat hybridomien kasvua, mutta jotka estävät fuusioitumatto-mien myeloomasolujen, jotka tavallisesti jatkaisivat äärettömästi jakaantumista, kasvun. Fuusioinnissa käytetyt somaattiset solut eivät säily pitkään elossa 20 in vitro-vilielmässä. eivätkä ne siten muodostu ongelmaksi. Esillä olevan keksinnön mukaisessa esimerkissä käytettiin myeloomasoluja, joilta puuttui hypo-ksantiinifosfotribosyylitransferaasi (HPRT-negatiivisia soluja). Valinta näitä soluja vastaan tehdään hypoksantiini/aminopteriini/ tymidiini (HAT)-alustassa, alustassa, jossa fuusioituneet soluhybridit pysyvät elossa pernasolujen HPRT-25 positiivisen genotyypin johdosta. Mahdollista on myös käyttää myeloomasoluja, joilla on erilaisia geneettisiä vajavuuksia (lääkeherkkyyksiä jne.) ja joita vastaan selektointi voidaan suorittaa alustoissa, jotka tukevat genotyyppisesti täy- « dellisten hybridien kasvua.

30 Fuusioitujen soluhybridien selektiiviseen viljelyyn tarvitaan useita viikkoja. Jo varhain tämän ajan kuluessa on tunnistettava ne hybridit, jotka tuottavat haluttua vasta-ainetta, jotta ne voidaan myöhemmin kloonata ja viljellä. Yleensä noin 10 % saaduista hybrideistä tuottaa haluttua vasta-ainetta, vaikkakin noin 14 104180 1 - noin 30 % väli on tavanomainen. Vasta-ainetta tuottavien hybridien detek-tointi voidaan tehdä millä tahansa normaalilla standardimääritysmenetelmällä, mukaan lukien ELISA-tekniikalla ja radioimmunotekniikalla, joita on kuvattu kirjallisuudessa [kts. esim. Kennet et ai. (toim.), Monoclonal Antibodies and 5 Hybridomas: A New Dimension in biological Analyses, s. 376-384, Plenum Press, New York (1980)].

Kun halutut fuusioituneet soluhybridit on selektoitu ja kloonattu yksittäisiin vasta-ainetta tuottaviin solulinjoihin, kukin solulinja voidaan lisäännyttää jom-10 maila kummalla kahdesta standarditavasta. Hybridomasolujen suspensio voidaan injisoida kudossopivaan eläimeen. Injisoitu eläin kehittää sen jälkeen kasvaimia, jotka erittävät fuusioituneen soluhybridin tuottamaa spesifistä mo-noklonaaiista vasta-ainetta. Eläimen kehonesteet, kuten seerumi tai askites-neste voidaan kerätä, jolloin saadaan monoklonaalisia vasta-aineita suuri 15 konsentraatio. Vaihtoehtoisesti voidaan yksittäisiä solulinjoja lisäännyttää in vitro-laboratorioviljelyastioissa. Viljelyalusta, joka sisältää suuria-konsent-raatioita yhtä ainoaa spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta, voidaan kerätä dekantoimalla, suodattamalla tai sentrifugoimalla.

20 Se, sopivatko edellä kuvatulla tavalla valmistetut antipolypeptidi-vasta-aineet käytettäväksi tässä keksinnössä, määritetään kaksiosaisella seulontamenetelmällä, jossa (a) suoritetaan ELISA-analyysi käyttämällä immunisoivaa polypep-? tidiä ja ihmisen IL-4:a antigeeneinä ja (b) analysoidaan radioligandin sitoutumi nen reseptoriin, jossa analyysissä mitataan 125l-IL-4:n spesifinen sitoutuminen 25 solureseptoreihin.

Tällaisissa menetelmissä käytettävä ihmisen rekombinantti-IL-4 on kaupallinen artikkeli, joka on saatavissa esimerkiksi Genzyme Corporation-yhtiöltä, Boston, MA. Vaihtoehtoisesti se voidaan valmistaa käyttämällä tunnettua IL-4-geenin 30 nukleotidisekvenssiä [Yokoto et ai.. Proc. Natl. Acad. Sei USA 83:5894 (1986)] ja normaaleja rekombinantti-DNA-menetelmiä [kts. esim. kansainvälinen patenttihakemus n:o WO 87/02990; Kimmenade et ai.. Eur. J. Biochem. 173:109 (1988)].

15 104180 ELISA-analyysi suoritetaan standardimenetelmillä, kuten Chretien et ai..

[J. Immunol. Meth. 117:67 (1989)], menetelmällä käyttämällä mikrotiitterilevyIle adsorboitua polypeptidiä tai IL-4:a. Immobilisoituun polypeptidiin tai proteiiniin sitoutuneiden vasta-aineiden mukanaolo detektoidaan leimatulla toisella anti-5 IgG-vasta-aineella. Tällaiset toiset vasta-aineet leimataan suositellusti entsyymillä, kuten peroksidaasilla, glukoosioksidaasilla, b-galaktosidaasilla tai alkali-sella fosfataasilla. Piparjuuriperoksidaasi voidaan detektoida analysoimalla sen aktiivisuus spektrofotometrisesti substraatilla, kuten pyrogallolilla, o-feny-leenidiamiinilla tai 2,2'-atsino-bis(3-etyyli-bentstiatsoliini-6-sulfonihapolla).

10

Vasta-aineista, joiden on havaittu spesifisesti sitoutuvan sekä immunisoivaan polypeptidiin että IL-4:an, arvioidaan edelleen niiden kyky inhiboida leimatun IL-4:n spesifistä sitoutumista sopivilla kohdesoluilla oleviin reseptoreihin. Keksinnön mukaisille anti-polypeptidi-vasta-aineille on tunnusomaista kyky estää 15 tällainen sitoutuminen vähintään 60-prosenttisesti.

Sitoutumisanalyysin suorittamiseen voidaan käyttää mitä tahansa soluja, joissa on IL-4:n reseptoreita, kuten Jijoye-, U-937-, CCRF-CEM-ja CEM-CM3-soluja, mutta Daudi-solut ovat sopivia ja niitä on helposti saatavissa. Daudi-solut ovat 20 Burkitfin lymfoma-potilaalta saatu hyvin karakterisoitu B-lymfoblastien solulin-ja, joka voidaan ostaa American Type Collection-kokoelmasta tallennusnume-rolla ATCC CCL 213. Menetelmässä käytettävä 125l-!L-4 voidaan valmistaa leimaamalla IL-4 jodi125:lla käyttämällä esimerkiksi laktoperoksidaasimenetel-mää [David et ai.. Biochemistry 13:1014 (1974)] tai Bolton'in et ai.. [Biochem. 25 J. 133:529 (1973)], menetelmää. Ihmisen glykolysoitu rekombinantti-IL-4 on kaupallinen artikkeli, joka voidaan ostaa esimerkiksi Genzyme Corporation-yhtiöltä, Boston, MA.

; l

Keksinnön mukaiset anti-idiotyyppiset vasta-aineet kohdistuvat vasten vasta-30 aineita, jotka ovat spesifisiä keksinnön mukaisissa polypeptideissä oleville IL-4:n antigeenisille determinanteille. Tällaiset anti-idiotyyppiset vasta-aineet matkivat alkuperäisiä antigeenisiä determinantteja tai toimivat näiden kaltaisesti (kts. esim. US-patentti n:o 4,731,237, Reagan et ai.). Kuten myös itse 1β 104180 IL-4:n, näiden vasta-aineiden oletetaan sitoutuvan spesifisesti ja suoraan IL-4-reseptoreille. Antiidiotyyppisillä vasta-aineilla ei kuitenkaan ole IL-4:n biologista aktiivisuutta.

5 Tällaiset anti-idiotyyppiset vasta-aineet valmistetaan rokottamalla eläin keksinnön mukaisen pölypeptidin vastaisella vasta-aineella (polyklonaalisella tai monoklonaalisella). Ne voidaan ottaa talteen kokonaisena polyklonaalisena antiseerumina tai sen IgG-jakeena tai kloonattujen hybridomien edellä kuvatulla tavalla tuottamina monoklonaalisina vasta-aineina.

10

Voidaan valmistaa farmaseuttisia seoksia, jotka sisältävät tehokkaita määriä yhtä tai useampaa keksinnön mukaista vasta-ainetta ja fysiologisesti hyväksyttävää kantajaa. Tällaiset kantajat ovat alan ammattimiesten hyvin tuntemia.

Vasta-aineet voidaan antaa suoraan tai seoksena ihmispotilaalle allergioiden 15 tai muiden IL-4:n välittämien tilojen hoitamiseksi. Farmaseuttiset seokset valmistetaan sekoittamalla fysiologisesti hyväksyttävän kantajan kanssa tehokas määrä yhtä tai useampaa vasta-ainetta.

Keksinnön mukaisen vasta-aineen johonkin tiettyyn tilanteeseen tarkoitetun 20 oikean annostuksen määrittäminen kuuluu alan ammattimiehen taitoihin. Hoito aloitetaan yleensä alle optimia pienemmillä annostuksilla. Tämän jälkeen annostusta nostetaan pienin lisäyksin, kunnes on saavutettu näissä olosuhteissa optimaalinen teho. Päivittäinen kokonaisannostus voidaan käytön helpottamiseksi jakaa ja antaa haluttaessa erinä päivän aikana.

25

Keksinnön mukaisten vasta-aineiden antamismäärä ja -taajuus tapahtuu hoitavan lääkärin arvion perusteella ottamalla huomioon sellaiset tekijät kuin poti-• % :. laan ikä, kunto ja koko ja hoidettavan oireen (oireiden) vakavuus.

17 104180

ESIMERKIT

Ellei toisin ole mainittu, jäljempänä annetut prosenttimäärät kiinteille aineille kiinteissä seoksissa, nesteille nesteissä ja kiinteille aineille nesteissä ovat 5 vastaavasti lasketut paino/painona, tilavuus/tilavuutena ja paino/tilavuutena.

Proteiinimääritykset suoritettiin Lowry'n et al.-menetelmällä. [J. Biol. Chem.

193:265 (1951)], käyttämällä standardina naudan seerumialbumiinia. IL-4:n biomääritys suoritettiin Mossman'in, [J. Immunol. Methods 65:55 (1983)], ku-10 vaarnalla tavalla mittaamalla solujen lisääntymisen stimuloituminen MTT.n (3-[4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli]-2,5-difenyylitetratsoliumbromidi) ottona PHA:lla stimuloiduissa ihmisen periferiaveren lymfosyyteissä. Yksi IL-4-aktiivisuusyk-sikkö on se IL-4-määrä, joka -aiheuttaa määrityksessä puolet maksimaalisesta stimulaatiosta 2 x 105 solussa. Ihmisen puhtaan IL-4:n yhden mikrogramman 15 aktiivisuus on tässä määrityksessä noin 20.000 yksikköä.

Polypeptidin synteesi

Syntetisoitiin joukko polypeptidejä, joiden aminohapposekvenssit yhdessä 20 otettuna vastaavat ihmisen koko valmiin IL-4-proteiinin aminohapposekvenssiä.

Polypeptidit syntetisoitiin käyttämällä Merrifield'in, [J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963)], kiinteäfaasista menetelmää ja Applied, Biosystems Model 430A synte-25 tisointilaitetta. Aminon suojaryhmänä käytettiin t-butyylioksikarbonyyliä ja symmetrisiä anhydridejä. Suojaryhmän poistamisen jälkeen polypeptidit lohkaistiin hartsista fluorivedyllä.

P- 9 9

Polypeptidien puhdistus suoritettiin käänteisfaasi-HPLC:lla käyttämällä Rainin 30 Dynamax^ C-8-kolonnia, joka kehitettiin asetonitriiligradientilla 0,1 -prosenttisessa trifluorietikkahapossa. Eluaattia seurattiin UV-absorbanssin avulla 214 nm:ssa. Puhdistettujen polypeptidien identtisyydet vahvistettiin aminohap- * 18 104180 posekvensoimalla ja massaspektrianalyysin avulla käyttämällä standardi-menetelmiä.

Seuraavassa taulukossa 1 on annettu valmistetut polypeptidit, niiden amino-5 happosekvenssit ja ihmisen valmiin IL-4:n (so. ilman signaalipeptidiä; kts. kuvio 1) ne ryhmät, joita polypeptidisekvenssit vastaavat.

Taulukko 1 10 Synteettisten polypeptidien rakenteet

Polypeptidi Vastaavat jto _Sekvenssi_ IL-4-rvhmät I HKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTE 1-26 15 2 CDITLQEIIKTLNSLT 3-18 3 TEQKTLCTELTVTD 18-31 4 DIFAAS KNTTE KETFC 31-46 5 ETFSRAA7VLRQFYS1 43-57 6 LRQFYSHHEKDTRC 52-65 20 7 KDTRCLGATAQQFHRHKQLIRF 61-82 8 LKRLDRNLWGLAGLNSCPVK 83-102 9 AQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWG 70-92 10 CPVKEANQSTLEN 99-111 II ANQSTLENFLERLKTIMREKYSKCSS 104-129 25 12 FLERLKTIMREKYSKC 112-127 * Polypeptidin n:o 5 aminohapposekvenssi vastaa ihmisen IL-4:n ryhmiä . 43-57 paitsi, että ihmisen IL-4:n aseman 46 kysteiiniryhmä on korvattu polypeptidissä seriiniryhmällä.

Hopp'in et ai., [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:3824 (1981)], menetelmällä suoritettu ihmisen IL-4:n hydrofiilisyysanalyysi osoittaa, että polypeptidiä n:o 7 vastaava alue sisältää sekä hydrofiilisiä että hydrofobisia ryhmiä, jotka sekun- 30 19 104180 däärisen rakenteen mallit ennustavat mahdollisesti muodostavan alfakierukka-alueen IL-4:ssa.

Anti-polvoeptidi-vasta-aineiden valmistaminen ia karakterisointi 5

Kaksi milligrammaa ihmisen IL-4:n ryhmiä 61-82 vastaavaa polypeptidiä n:o 7 (taulukko 1) liuotettiin 0,4 ml:aan 0,5 M Tris-HCI, pH 6,8, -puskuriin ja 0,1 ml:aan hinkuyskärokotetta (lähteenä kanta 18334, tapettu lämmön avulla, 20 yksikköä/ml, laimennos 1/10.000 timersaali). Lisättiin Freund'in edellistä 10 adjuvanttia (0,5 ml) ja näyte homogenisoitiin ruiskussa. Jokainen valkoinen New Zealand-kaniini immunisoitiin intradermaalisilla ruiskeilla 1 ml: Ma näytettä, jonka pitoisuus oli 0,1 ml (200 pg polypeptidiä).

Noin neljän kuukauden kuluttua ja aika ajoin sen jälkeen annettiin tehosteruis-15 keet kuten edellä. Verta valutettiin aika ajoin kaniinien korvasta tai reisilaski-moista ja annettiin hyytyä.

Yhden kaniinin seerumista eristettiin IgG-jae adsorboimalla tämä Protein A-Sepharose^-pylvääseen (Pharmacia, Piscataway, NJ), joka oli tasapainoi-20 tettu 1,5 M glysiinipuskurilla, pH 8,9. Kromatografia suoritettiin Forton Biochem Co.:n standardimenetelmillä. Puhdistetun materiaalin arvioitiin olevan noin 98-prosenttisesti puhdasta lgG:a SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesin perusteella [Laemmli, Nature 227:680 (1970)]. Tälle materiaalille annettiin nimeksi antiseerumi 343-6 IgG-jae.

25

Samanlaisia menetelmiä käyttämällä valmistettiin myös antiseerumien IgG-jakeet muita taulukossa 1 annettuja polypeptidejä vastaan.

ELISA suoritettiin eristetyillä IgG-jakeilla päällystämällä 96-kaivoiset mikrotiit-30 terilevyt (Becton-Dickinson) noin 0,25 pg:lla eri polypeptidejä 50 pl:ssa,Tris-puskuroitua suolaliuosta (TBS; 50 nriM Tris, 0,15 M NaCI, pH 7,0) yhden tunnin 1 20 104180 ajan huoneen lämpötilassa. Tämän inkuboinnin jälkeen kaivot pestiin viisi kertaa TBS:lla, joka sisälsi 0,1 % Tween 20:a (polyoksietyleenisorbitaanimono-lauraatti).

5 Pestyt kaivot blokattiin 1-prosenttisella naudan seerumialbumiinilla (BSA) TBS:ssa 1 tunnin aikana huoneen lämpötilassa, pestiin viisi kertaa TBS:lla, blokattiin 0,1-prosenttisella epäspesifisellä IgGilla TBS:ssa 2 tunnin aikana huoneen lämpötilassa ja pestiin viisi kertaa edellä kuvatulla tavalla. Sen jälkeen kaivoihin lisättiin 50 μΙ IgG-jakeiden eri laimennuksia TBS:ssa ja levyjä 10 inkuboitiin huoneen lämpötilassa 1 tunti ja sen jälkeen pestiin samalla tavoin kuin aikaisemminkin.

Jokaiseen kaivoon lisättiin 50 μΙ TBS:a, joka sisälsi 2,5 ng piparjuuriperoksi-daasi-leimattua vuohen anti-kaniini IgG.a, ja levyjä inkuboitiin 1 tunti huoneen 15 lämpötilassa. Pestiin edellä kuvatulla tavalla, minkä jälkeen kaivot kehitettiin vetyperoksidilla ja 2,2-atsino-di-(3-etyyli-bentstiatsoliinisulfonaatilla).

Kehitettiin myös kontroliikaivot, joissa yksi kolmesta määrityskomponentista (so. antigeeni, vasta-aine tai leimattu toinen vasta-aine) oli jätetty pois. Näyt-20 teet luettiin Dynatech Model 650 spektrofotometrissä.

Kuviossa 2 on annettu tällaisen antiseerumi 343-6 IgG -jakeella suoritetun analyysin tulokset käyttämällä antigeeneinä polypeptidi n:o 7 (taulukko 1) ja ihmisen IL-4:a. Kuviosta, jossa on esitetty absorbanssi 414 nm:ssa,antigeenin 25 sitoutumisen mittana polypeptidin tai IL-4:n kaivoa kohti annetun määrän funktiona, voidaan havaita, että vasta-aineet sitoutuivat kumpaankin antigeeniin. Näiden tulosten saamiseksi laimennettiin antiseerumi 343-6 IgG-jae 1:200 ennen kuin kaivoille päällystettiin 50 μΙ erät.

30 Radioligandin sitoutumisanalyyseillä määritettiin, kykenevätkö anti-polypeptidi IgG-jakeissa olevat vasta-aineet sitoutuessaan spesifisesti ihmisen IL-4:an estämään tällä tavoin IL-4:n sitoutumisen solureseptoreihin.

9 · 21 104180 CHO-soluissa [Le et ai.. J. Biol. Chem. 263:10817 (1988)] ekspressoitu puhdistettu ihmisen rekombinantti-IL-4 leimattiin jodi-125:lla Bolton'in et.al.. [Biochem. J. 133:529 (1973)], modifioidulla menetelmällä käyttämällä Bolton'in ja Hunter'in reagenssia (DuPont-NEN, Boston, MA ). Lyhyesti sanottuna 2 mCi 5 Bolton'in ja Hunter'in reagenssia saatettiin reagoimaan 5,0 pg kanssa puhdistettua IL-4:a 100 pl:ssa 50 mM natriumfosfaattipuskuria, pH 8,0, 2 tunnin ajan 22°C:ssa. Reaktio sammutettiin 1 tunniksi lisäämällä yhtä suuri tilavuus 1,0 M glysiiniä.

10 Jodattu proteiini eristettiin geelisuodattamalla PD-1-pylväässä (Pharmacia, Piscataway, NJ), joka oli tasapainoitettu 0,2 % gelatiinilla 50 mM natriumfos-faatissa, pH 7,4. Pylvään tyhjötilavuudesta eluoitunut radioaktiivinen aine, kerättiin ja analysoitiin. Leimatun IL-4:n spesifinen radioaktiivisuus oli 1500 Ci/millimooli määritettynä Calvo'n et ai.. [Biochem. J. 212:259 (1983)], itsesyr-15 jäytys-menetelmällä, ja molaarinen liittymissuhde oli 0,68 moolia jodia proteiini-moolia kohti.

Tilavuudeltaan millilitran kymmenesosan suuruisia eri antipolypeptidi-IgG-jakeiden sarjalaimennuksia sitoutumisalustassa [RPM11640, jossa 10 % vasi-20 kansikiöseerumia (FCS)] inkuboitiin vakiona pysyvien määrien kanssa 125l-IL-4:a (noin 2 x 105 cpm) 1,0 ml:ssa sitoutumisalustaa 1,5 ml putkissa 18 tunnin ajan 4°C:ssa ennen sitoutumismääritysten suorittamista. Tämän esi-inkuboinnin jälkeen koeputkien sisällöt yhdistettiin 2 x 106 Daudi-solun kanssa ja seoksia inkuboitiin 2 tuntia 4°C:ssa.

25

Inkuboinnin jälkeen solut pelletoitiin sentrifugoimalla 800 tai 12.000 x g 30 sekuntia 4°C:ssa ja supernatantit heitettiin pois. Solut suspendoitiin uudelleen : 0,1 ml:aan uutta sitoutumisalustaa, jota ei oltu leimattu IL-4:lla, 4°C:ssa, pelle toitiin kuten edellä, suspendoitiin uudelleen 100 pl:aan määritysalustaa ja 30 laitettiin dibutyyliftalaatin ja dioktyyliftalaatin seoksen (100 μΙ, 1:1) päälle. Solut pelletoitiin sentrifugoimalla 13.000 x g 2 minuuttia, pakastettiin nestemäisessä typessäja sen jälkeen suoritettiin laskenta gammalaskimessa. Epäspesifinen • „ 104180 22 sitoutuminen määritettiin rinnakkaisnäytteissä, jotka sisälsivät 1,0 mg leimaa-matonta ihmisen IL-4:a.

Edellä olevien analyysien tulokset on annettu taulukossa 2 5

Taulukko 2

Anti-polypeptidi IqG-iakeiden analyysi 10 Antigeeninä Vasta-aineen 125l-IL-4:n käytetty reaktiivisuus*5 sitoutumisen polypeptidi3 polvoeptidin IL-4:n estvmis-% kanssa 1 + - 0 15 2 + + 0 3 + + 2,4 4 + + 0 5 + + 8,7 6 + + 76 20 7 ++ 78 8 + - 7,5 9 + + 39 10 + + 26 11 + + 60 25 12 + + 0 a Polypeptidien aminohapposekvenssit ja vastaavat alueet ihmisen IL-4-mole-kyylissä on annettu taulukossa 1.

30 b Vasta-aineen reaktiivisuuden määrityksessä + tarkoittaa 414 nm:ssa absor-banssia > 0,05 kontrollikaivojen absorbanssin vähentämisen jälkeen.

i 23 104180

Taulukon 2 arvot osoittavat, että vasta-aineet, jotka oli tuotettu ihmisen IL-4:n ryhmiä 52-65 (polypeptidi n:o 6), 61-82 (polypeptidi n:o 7) ja 104-129 (poly-peptidi n:o 11) vastaavia polypeptidejä vastaan, olivat voimakkaita inhibiittejä 125l-IL-4:n sitoutumiselle Daudi-soluihin. Nämä vasta-aineet sitoutuivat spesifi-5 sesti sekä immunisoiviin polypeptideihin että IL-4:an, vaikka esi-immuunisee-rumi ei sitoutunut kumpaankaan eikä sillä ollut vaikutusta sitoutumiseen reseptorille.

Taulukko 2 osoittaa lisäksi, että polypeptidien 6 ja 7 vastaiset vasta-aineet 10 estivät yhtä tehokkaasti leimatun IL-4:n sitoutumisen. Taulukko 1 osoittaa, että näillä polypeptideillä on yhteistä yhteinen KDTRC-aminohappoalasekvenssi. Nämä todisteet viittaavat yhdessä siihen, että tämä alasekvenssi voi muodostaa tärkeän epitoopin, ja tukevat keksinnön mukaisia polypeptidejä, jotka voivat sisältää niin vähän kuin 5 aminohapporyhmää.

15

Erityisen mielenkiintoinen on polypeptidin n:o 6 vastaisten polyklonaalisten vasta-aineiden aiheuttama sitoutumisen inhibitio. Edellä jo mainittiin, että Chretien et ai. havaitsi, että samaa polypeptidiä vastaan tuotettu monoklonaali-nen vasta-aine ei neutraloinut IL-4:n bioaktiivisuutta. Jäljempänä kuvattu myö-20 hempi epitooppianalyysi on kuitenkin osoittanut, että vasta-aine luultavasti kohdistuu polypeptidin aminohappopään puoleisia ryhmiä vastaan, eikä karbok-syylipäässä olevaa alasekvenssiä Lys-Asp-Thr-Arg-Cys vastaan. Tämän esimerkin polyklonaalinen antiseerumi esti IL-4:n sitoutumisen luultavasti siksi, että eräät sen vasta-aineista kohdistuivat tämän spesifisen alasekvenssin käsit-25 tävää epitooppia vastaan.

Tulokset, jotka saatiin antiseerumi 343-6 IgG-jakeella polypeptidiä n:o 7 vas- 0 m taan, on esitetty graafisesti kuviossa 3. 2 x 106 Daudi-solun kanssa inkuboitiin 50 pM 125l-IL-4:a ja annetut vasta-ainekonsentraatiot 2 tunnin ajan 4°C:ssa.

30 Spesifinen sitoutuminen oli 3.347 cpm ilman vasta-aineen läsnäoloa. Sitoutumisen havaittu voimakas inhibitio yhdessä sen seikan kanssa, että vasta-aineet sitoutuivat spesifisesti polypeptidiin n:o 7 ja IL-4:an, viittaa siihen, että • · 24 104180 aminohapporyhmät, joihin vasta-aineet kohdistuvat, ovat mahdollisesti IL-4:n pinnalla.

Monoklonaaliset anti-polvpeptidi-vasta-aineet 5

Monoklonaaliset vasta-aineet valmistettiin oleellisesti Kohler'in ja Milstein'in [Nature 256:495 (1975)] kuvaamalla tavalla. Kaikki inkubaatiot suoritettiin 37°C:ssa 5 % C02-inkubaattorissa.

10 Balb/c-hiiret (Charles River) herkistettiin immunologisesti antamalla intraperi-toneaalisesti (i.p.) 500 pl 2,6,10,14-tetrametyylipentadekaania (pristaani). Noin 4 päivän kuluttua liuotettiin 250 pg polypeptidiä n:o 7 (taulukko 1; vastaa ihmisen IL-4:n ryhmiä 61-82) 250 pl suuruisiin tilavuuksiin fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), lisättiin 250 μΙ erät Freund'in täydellistä adjuvanttia ja .

15 seokset homogenisoitiin ja annettiin jokaiselle hiirelle i.p. Noin kuukauden kuluttua annettiin i.p. tehosteruiskeet, jotka sisälsivät 125 pg polypeptidiä 1:1 laimennetussa Freund'in epätäydellisessä adjuvantissa.

Kolmen tai neljän viikon kuluttua annettiin viimeiset i.p. ruiskeet, jotka sisälsi-20 vät 250 pg polypeptidiä n:o 7 PBS:ssa.

Aika ajoin immunisoinnin kuluessa valutettiin häntälaskimoista verta testeihin ja analysoitiin ELISA-menetelmällä edellä kuvatulla tavalla. Neljän päivän kuluttua viimeisistä immunisoinneista eläimet tapettiin ja niiden pernat poistet-25 tiin.

Pernat maseroitiin kahden levyn välissä tuoreessa RPMI 1640-alustassa, joka sisälsi 100 pg/ml streptomysiiniä ja 100 yksikköä/ml penisilliiniä (RPMI pen/strep-alusta), ja siirrettiin sen jälkeen suureen koeputkeen. Jäännösten 30 annettiin laskeutua 1 minuutin, minkä jälkeen koeputken ylemmässä kerroksessa olevat solut siirrettiin 5 ml koeputkeen. Lisättiin 4 ml RPMI pen/strep-alustaa ja solut suspendoitiin ja tämän jälkeen sedimentoitiin sentrifugoimalla noin 300 x g 8 minuuttia.

25 104180

Valmistettiin 5:1 seos pernasoluista ja NS-1 hiiren myeloomasoluista (ATCC TIB 18) ja pestiin kerran RPMI pen/strep-alustalla. solut pelletoitiin samalla tavoin kuin edellä ja alusta heitettiin pois, minkä jälkeen lisättiin 1 minuutin aikana 37°C:ssa tipoittain 0,5 ml PEG:a (2 g/litra 75 mM HEPES-puskurissa), 5 jonka molekyylipaino oli noin 1500 daltonia, varovasti sekoittaen joka 20. sekunti. PEG:n lisäys toistettiin, ensin lisättiin 0,5 ml ja sen jälkeen 1,0 ml PEG-liuosta.

Fuusioinnin jälkeen solut sedimentoitiin ja pestiin kulloinkin 1 minuutti seuraa-10 villa RPMI pen/strep-alustamäärillä: 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0, 16,0 ja 32,0 ml.

Fuusiosolut sedimentoitiin edellä kuvatulla tavalla ja alusta heitettiin pois, minkä jälkeen lisättiin syöttösoluina noin 1 x 105 käsittelemättömästä hiirestä saatua pernasolua RPMI pen/strep-alustassa, joka sisälsi 0,2933 mg/ml glutamii-nia ja 10 % vasikansikiöseerumia (FCS)ja solut sekoitettiin ja sen jälkeen 15 sedimentoitiin kuten edellä. Edellisenä päivänä hiirestä eristämisen jälkeen syöttösplenosyyttejä oli inkuboitu yön yli 37°C:ssa RPMI pen/strep-alustassa, joka sisälsi glutamiinia ja FCS:a.

Fuusio-ja syöttösoluja kasvatettiin yhdessä 7 päivää RPMI pen/strep-alustas-20 sa, joka sisälsi 0,2933 mg/ml glutamiinia, 10 % FCS:a, 1 x 10‘2 M hypoksantii-nia, 4 x 10'5 M aminopteriiniä ja 1,6 x 10'3 M-tymidiiniä (HAT-alusta), 96-kaivoi-silla tasapohjaisilla mikrotiitterilevyillä (COSTAR), 150 μΙ alustaa kaivoa kohti. Tämän inkubointijakson jälkeen korvattiin kunkin kaivon alusta HT-alustalla (HAT-alusta, jossa ei ollut aminopteriiniä) ja jatkettiin inkubointia.

25

Usean päivän kuluttua hybridoma-supernatanteille tehtiin ELISA-analyysi edellä kuvatulla tavalla paitsi, että käytettiin leimattua anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta.

„ «

Positiivisten kaivojen hybridomat kloonattiin rajalaimennuksella HT-alustassa.

30 Tällä tavoin saatiin yhteensä 382 kloonattua hybridomaa, jotka kaikki tuottivat monoklonaalisia vasta-aineita. Nämä hybridomat seulottiin ELISA-menetelmäl-lä käyttämällä antigeeninä polypeptidiä n:o 7, jolloin tunnistettiin 12 positiivista * * 26 104180 solulinjaa. Näistä havaittiin positiivisiksi 10 seulomalla ELISA-menetelmällä IL-4:a vastaan.

8 positiivista kloonia seulottiin Ouchterlony'n menetelmällä agarilla standardi-5 menetelmillä käyttämällä immunoglobuliinille spesifisiä antiseerumeja. Seulonta osoitti, että 6 kloonia tuotti lgG1-, yksi tuotti lgG2a- ja yksi tuotti IgM-vasta-aineita.

Anti-idiotvvppisten vasta-aineiden valmistaminen 10

Anti-idiotyyppisten vasta-aineiden valmistamiseksi lisättiin 1,5 mg edellä kuvattua antiseerumi 343-6 IgG-jaetta 0,5 ml:ssa fosfaattipuskuroitua suolaliuosta 0,5 ml:aan Freund'in täydellistä adjuvanttia ja sekoitettiin hyvin niin, että muodostui emulsio. Tästä näyte injisoitiin subkutaanisti lampaaseen (Dorset-ristisii-15 tos). Tämän jälkeen annettiin useiden viikkojen välein tehosterokotteita samalla tavalla paitsi, että käytettiin Freund'in epätäydellistä adjuvanttia.

Immunisoinnin aikana silloin tällöin otetuille verinäytteille tehtiin edellä kuvatulla tavalla ELISA-analyysit käyttämällä antigeeninä antiseerumi 343-6 IgG-20 jaetta paitsi, että immunoglobuliinin blokkaus jätettiin pois ja toisena vasta-aineena käytettiin 5,0 ng piparjuuriperoksidaasi-leimattua apinan antilammas-IgG.a. Näin saadun lampaan antiseerumin (antiseerumi 1448) havaittiin sitoutuvan spesifisesti kaniinin antiseerumi 343-6 IgG-jakeeseen, mutta ei IL-4:an tai polypeptidiin n:o 7.

25

Sen määrittämiseksi, sisälsikö lampaan antiseerumi 1448 todellakin anti-idio-tyyppisiä vasta-aineita, antiseerumin sarjalaimennokselle tehtiin radioligandin : reseptorille sitoutumisanalyysi käyttämällä 125l-IL-4:a ja Daudi-soluja kuten edellä. Tulokset on annettu kuviossa 4. Jokainen määrityksen näyte sisälsi 30 2 x 106 solua ja 50 pM 125l-IL-4:a (2 x 105 cpm). Spesifinen sitoutuminen oli 5.931 cpm, kun antiseerumia ei ollut mukana.

• 27 104180

Kuviosta 4 käy ilmi, että lampaan antiseerumi 1448 oli voimakas kilpaileva inhibiittori leimatun IL-4:n sitoutumiselle soluihin. Alhaisessa laimennoksessa se esti spesifisen sitoutumisen yli 80-prosenttisesti. Sitä vastoin lampaan esi-immuniseerumilla ei ollut mitään vaikutusta IL-4:n sitotutumiseen.

5

Epitooppianalvvsi

Sen määrittämiseksi, mitkä aminohapporyhmät polypeptideissä n:ot 6 ja 7 olivat kriittisiä sellaisten vasta-aineiden tuotolle, jotka kykenivät estämään 10 IL-4:n sitoutumisen solureseptoreihin, suoritettiin epitooppianalyysit oleellisesti Geysen'in et ai.. [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:3998 (1984)] kuvaamalla tavalla.

Geysen'in et ai.-menetelmä mahdollistaa satojen pienten polypeptidien, jotka 15 ovat puhtaudeltaan ja määrältään riittäviä ELISA-menetelmän suorittamiseen, nopean vastavirtasynteesin kiinteillä tukiaineilla, samalla kun ELISA:n aikana polypeptidit ovat yhä kiinni kiinteissä tukiaineissa, joiden päällä ne syntetisoitiin.

20 Periaatteessa ELISA suoritetaan tällaisille polypeptideille käyttämällä vasta-aineita, jotka on valmistettu suurempaa polypeptidiä tai proteiinia vasten, jolla on aminohapposekvenssi, joka sisältää sarjan pieniä polypeptidejä. Jos vasta-aineet ovat spesifisiä epitoopille pienten synteettisten polypeptidien muodostamassa suuremmassa immunogeenissä, vasta-aineet sitoutuvat polypeptidei-25 hin, ja ne voidaan havaita ELISA-menetelmällä.

Geysen'in et ai., supra, menetelmää käyttämällä syntetisoitiin 15 oktapeptidin \ sarja polyetyleenisauvailla (Cambridge Research Biochemicals. Inc., Valley

Stream, N.Y.). Niiden aminohapposekvenssit ulottuivat aggregaattina yli, kaik-30 kien polypeptidin n:o 7 ryhmien (vastaten ihmisen valmiin IL-4:n ryhmiä 61-82). Näiden oktapeptidien sekvenssit on esitetty taulukossa 3.

· 0 28 104180

Taulukko 3

Ihmisen valmiin IL-4:n ryhmiin 61-82 perustuvat oktapeptidit 5

Oktapep- Vastaavat Keskus tidi-n:o Sekvenssi IL-4-rvhmät ryhmä* 1 KDTRCLGA 61-68 65 2 DTRCLGAT 62-69 66 10 3 TRCLGATA 63-70 67 4 RCLGATAQ 64-71 68 5 CLGATAQQ 65-72 69 6 LGATAQQF 66-73 70 7 GATAQQFH 67-74 71 15 8 ATAQQFHR 68-75 72 9 TAQQFHRH 69-76 73 10 AQQFHRHK 70-77 74 11 QQFHRHKQ 71-78 75 12 QFHRHKQL 72-79 76 20 13 FHRHKQLI 73-80 77 14 HRHKQLIR 74-81 78 15 RHKQLIRF 75-82 79 * Oktapeptidien keskusryhmät määritettiin mielivaltaisesti lisäämällä neljä 25 ihmisen valmiin IL-4:n sen ryhmän asemaan, jota kunkin oktapeptidin N-termi-naalinen ryhmä vastasi.

Samalla tavoin valmistettiin sarja 17 sauvalle immobolisioitua oktapeptidiä, jotka yhdessä ulottuivat yli kaikkien valmiin ihmisen IL-4:n ryhmiä 47-70 vas-30 taavien ryhmien. Näiden oktapeptidien aminohapposekvenssit on esitetty taulukossa 4.

« « 29 104180

Taulukko 4

Ihmisen valmiin IL-4:n ryhmiin 47-70 perustuvat oktapeptidit 5

Oktapep- Vastaavat Keskus tidi n:o Sekvenssi IL-4-rvhmät rvhmä* 1 RAATVLRQ 47-54 51 2 AATVLRQF 48-55 52 10 3 ATVLRQFY 49-56 53 4 TVLRQFYS 50-57 54 5 VLRQFYSH 51-58 55 6 LRQFYSHH 52-59 56 7 RQFYSHHE 53-60 57 15 8 QFYSHHEK 54-61 58 9 FYSHHEKD 55-62 59 10 YSHHEKDT 56-63 60 11 SHHEKDTR 57-64 61 12 HHEKDTRC 58-65 62 20 13 HEKDTRCL 59-66 63 14 EKDTRCLG 60-67 64 : 15 KDTRCLGA 61-68 65 16 DTRCLGAT 62-69 66 17 TRCLGATA 63-70 67 25 * Oktapeptidien keskusryhmät määritettiin mielivaltaisesti lisäämällä neljä ihmisen valmiin IL-4:n sen ryhmän asemaan, jota kunkin oktapeptidin N-ter-minaalinen ryhmä vastasi.

30 Epitooppianalyysin suorittamiseksi polypeptidille n:o 7 suoritettiin ELISA-määri-tys kaniinista, joka oli immunisoitu edellä kuvatulla polypeptidillä, saadulle anti-seerumille, jolle annettiin nimeksi 129-88. Menetelmässä käytettiin antigeeninä 30 104180 taulukossa 3 annettuja polyetyleenisauvoille immobilisoituja oktapeptidejä. Tämän antiseerumin havaittiin inhiboivan voimakkaasti 125l-IL-4:n sitoutumista Daudi-soluihin edellä kuvatulla tavalla suoritetussa määrityksessä. ELISA suoritettiin antiseerumille 129-88 oleellisesti edellä kuvatulla tavalla 96-kaivoi-5 silla mikrotiitterilevyillä paitsi, että kaivoissa käytettiin sauvoja sen sijaan, että vapaa antigeeni olisi päällystetty kaivoille. Sauvat poistettiin kaivoista, ennen kuin värin kehittyminen luettiin lukulaitteella (Titertek MCC 340 ELISA plate reader).

10 Tämän analyysin tulokset on annettu kuviossa 5, jossa on esitetty kunkin okta-peptidin absorbanssi 414 nm:ssa. Kuviossa 5 annetut oktapeptidien numerot vastaavat taulukon 3 numeroita. Kuviosta 5 voidaan havaita vasta-aineiden sitoutuvan voimakkaasti oktapeptideihin 5-12. Taulukkoon 3 viitaten voidaan havaita, että näiden oktapeptidien arvioidut keskukset vastaavat ihmisen val-15 miin IL-4:n ryhmiä 69-76. Nämä arvot yhdessä sen seikan kanssa, että anti-seerumi 129-88 esti leimatun IL-4:n sitoutumisen solureseptoreihin, viittaavat siihen, että ihmisen valmiin (L-4:n ryhmät 69-76 muodostavat epitoopin (epi-tooppeja), jonka vastaiset vasta-aineet estävät IL-4:n sitoutumisen solureseptoreihin.

20

Samalla tavoin käytettiin taulukossa 4 esitettyjä immobilisoituja oktapeptidejä analysoimaan polypeptidiä n:o 6 vastaan tuotettu kaniinin antiseerumi. Tästä antiseerumista, jolle oli annettu nimeksi 342-6, arvioitiin kaksi kertaa sen kyky estää 125l-IL-4:n sitoutuminen Daudi-soluihin. Seeruminäytteet, jotka oli valmis-25 tettu immunisoinnin varhaisvaiheessa (varhainen antiseerumi 342-6), eivät estäneet leimatun IL-4:n sitoutumista; myöhemmin valmistetut näytteet (myöhempi antiseerumi 342-6) olivat voimakkaasti inhiboivia. Näiden analyysien tulokset on esitetty vastaavasti kuvioissa 6Aja B varhaiselle ja myöhemmälle antiseerumille. Kuviossa 6 esitetyt oktapeptidien numerot vastaavat taulukon 4 30 numeroita.

Kuten kuviosta 6A käy ilmi, ei-inhiboiva polypeptidin n:o 6 vastainen varhainen antiseerumi 342-6 sisälsi oktapeptidien 3-7 ja 9-13 kanssa reagoivia vasta- 31 104180 aineita. Taulukkoon 4 viitaten voidaan havaita, että näiden oktapeptidien keskukset vastasivat suurin piirtein vastaavasti ihmisen valmiin IL-4:n ryhmiä 53-57 ja 59-63.

5 Myöhempi inhiboiva antiseerumi 342-6 antoi samankaltaisen sitoutumiskuvion (kuvio 6B) paitsi, että se sisälsi myös vasta-aineita, jotka sitoutuivat voimakkaammin oktapeptideihin 11-16, joiden keskukset vastaavat ihmisen IL-4:n ryhmiä 61-66. Kuvion 6 ruutujen A ja B arvot yhdessä viittaavat siihen, että ihmisen valmiin IL-4:n ryhmät 61-66 muodostavat epitoopin, jonka vastaiset 10 vasta-aineet estävät ihmisen IL-4:n sitoutumisen solureseptoreihin.

Tätä päätelmää vahvistavat ELISA-tutkimukset, jotka suoritettiin edellä kuvatulla tavalla käyttämällä polypeptidejä n:ot 6 ja 7 ja yhtä polypeptidin n:o 7 vastaista monoklonaalista vasta-ainetta. Tämä vasta-aine sitoutui voimakkaasti 15 kumpaankin polypeptidiin. Se esti voimakkaasti myös 125l-IL-4:n sitoutumisen Daudi-soluihin. Ainoa yhteinen alasekvenssi polypeptideissä on KDTRC, joka vastaa ihmisen valmiin IL-4:n ryhmiä 61-65. Tästä seuraa, että tämän inhiboivan monoklonaalisen vasta-aineen täytyy olla kohdistunut tätä alasekvenssiä vastaan, ja että tämän alasekvenssin täytyy muodostaa tärkeä epitooppi.

20 Tähän keksintöön voidaan tehdä monia modifikaatioita ja muutoksia poikkeamatta sen hengestä ja alasta, kuten on ilmeistä alan ammattimiehille. Tässä kuvatut yksittäiset suoritusmuodot on annettu vain esimerkkimäisesti, ja keksintöä rajoittavat vain oheenliitetyt patenttivaatimukset.

25

Claims (7)

32 104180

1. Menetelmä polypeptidin valmistamiseksi, joka sisältää noin 5 - noin 26 aminohapporyhmää ja jolla on ihmisen IL-4:n aminohapporyhmien 61 - 82 5 sekvenssiä, tai näiden alasekvenssiä tai ihmisen IL-4:n aminohapporyhmien 104- 129 sekvenssiä vastaava aminohapposekvenssi, tunnettu siitä, että menetelmään kuuluu: kasvatetaan isäntäsolu, joka on transformoitu vektorilla, joka sisältää ja kykenee ilmentämään polypeptidiä koodaavan DNA-sekvenssin; ja 10 polypeptidin eristämisen kasvuväliaineesta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidi on kytketty kovalenttisesti kantajamolekyyliin.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että poly peptidin aminohapposekvenssi on Lys-Asp-Thr-Arg-Cys,

20 Thr-Ala-GIn-GIn-Phe-His-Arg-His, Lys-Asp-Thr-Arg-Cys-Leu-Gly-Ala-Thr-Ala-Gln-GIn-Phe-His-Arg-His-Lys-GIn-Leu-lle-Arg-Phe tai 25 Ala-Asn-GIn-Ser-Thr-Leu-Glu-Asn-Phe-Leu- Glu-Arg-Leu-Lys-Thr-lle-Met-Arg-Glu-Lys- Tyr-Ser-Lys-Cys-Ser-Ser.

4. Menetelmä vasta-aineiden valmistamiseksi, jotka sitoutuu spesifisesti ihmi sen IL-4:an ja inhiboi ihmisen IL-4:n sitoutumista reseptoreihin, tunnettu siitä, että inokuloidaan nisäkkääseen polypeptidi, joka on tuotettu jonkin patenttivaa- 33 104180 timuksen 1-3 mukaisella menetelmällä olosuhteissa, jossa nisäkäs tuottaa mainitun polypeptidin vasta-aineita; ja eristetään mainitut vasta-aineet.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aine 5 on polyklonaalinen.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aine on monoklonaalinen.

7. Menetelmä allergioiden ja muiden IL-4:n välittämien tilojen hoitamiseen tarkoitetun farmaseuttisen seoksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että sekoitetaan fysiologisesti hyväksyttävää kantajaa ja tehokas määrä yhtä tai useampaa jonkin patenttivaatimuksen 4-6 mukaisesti valmistettua vasta-ainetta. * * I 34 104180