JPH0730116B2

JPH0730116B2 - ヒトインターロイキン―４の抗体アンタゴニスト

Info

Publication number: JPH0730116B2
Application number: JP3502759A
Authority: JP
Inventors: ラマナサン，ラタ; シーリグ，ゲイル・エフ; トロッタ，ポール・ピー
Original assignee: Schering Plough Corp
Current assignee: Schering Plough Corp
Priority date: 1989-12-20
Filing date: 1990-12-18
Publication date: 1995-04-05
Anticipated expiration: 2010-04-05
Also published as: ATE136906T1; TW221675B; FI922847A0; KR920703642A; FI922847L; AU7176291A; PT96230A; ZA9010190B; HU215245B; SK279933B6; SK635290A3; WO1991009059A1; JPH04506359A; EP0506826B1; CZ283050B6; CA2071908C; CZ635290A3; FI104180B1; IE74708B1; IE904589A1

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景インターロイキン−４（IL−４）は、造血細胞の広範な
スペクトルに影響を及ぼすタンパク質である［ストロバ
ー（Strober）ら、Pediatr.Res.24:549（1988）］。IL
−４は、マクロファージ機能、IgGおよびIgE産生、並び
に免疫グロブリンに刺激されたＢ細胞、抗原に刺激され
たＴ細胞およびエリトロポイエチンに刺激された赤血球
前駆細胞の増殖を含む多数の活性を増大させる。更に、
それは、IL−３に刺激された肥満細胞の増殖を増大させ
る。

IgEと一緒に、肥満細胞はアレルギー反応において中心
的役割を果たしている。肥満細胞は、全身の毛細血管付
近に位置している顆粒含有結合組織細胞であり、特に、
肺、皮膚並びに胃腸管および尿生殖器管に高度に集中し
ている。抗原物質に暴露後に、肥満細胞は脱顆粒し且つ
化学的媒介物質、例えば、ヒスタミン、セロトニン、ヘ
パリン、プロスタグランジン等を放出してアレルギー反
応を生じさせる。

IgE産生および肥満細胞増殖に対するIL−４の刺激作用
ゆえに、IL−４のアンタゴニストは、肥満細胞増殖およ
びIgE産生を減少させることによってアレルギーを治療
するのに有用であることができる。

多くの研究者が、IL−４の生物活性に拮抗させるのに抗
体を用いてきた。例えば、フィンケルマン（Finkelma
n）ら［Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:9675（1986）］
は、BSF−１（ここでは、IL−４と称する）に対する単
クローン性抗体を用いて、ニッポストロンギルス・ブラ
シリエンシス（Nippostrongylus brasiliensis）に感染
させたまたはマウスIgDに対する精製ヤギ抗体を注射し
たマウスでのIL−４に誘発されたIgEの産生を阻害し
た。双方の処置はIgE産生を刺激することが知られてお
り；後者の処置は、更に、IL−４分泌を刺激することが
知られていた。

もっと最近では、クレティアン（Chretien）ら［J.Immu
nol.Meth/117:67（1986）］は、不完全に精製された組
換え体ヒトIL−４に対する多クローン性ウサギ抗血清
が、インビトロでのIL−４の若干の生物活性を中和する
ことを報告した。しかしながら、成熟ヒトIL−４の残基
３〜18、31〜46、52〜65および112〜127に対応するアミ
ノ酸配列を有する合成ポリペプチドに対する単クローン
性抗体は、IL−４の生物活性を中和することができない
が、それらはタンパク質に対して結合した。

発明の要約本明細書は、約５個〜約26個のアミノ酸残基を含み且つ
ヒトIL−４のアミノ酸残基61〜82または104〜129の配列
に対応するアミノ酸配列またはその部分配列を有するポ
リペプチドを提供する。好ましいポリペプチドは、アミ
ノ酸配列、 Lys−Asp−Thr−Arg−Cys、 Thr−Ala−Gln−Gln−Phe−His−Arg−His、 Lys−Asp−Thr−Arg−Cys−Leu−Gly−Ala−Thr−Ala−
Gln−Gln−Phe−His−Arg−His−Lys−Gln−Leu−Ile−
Arg−Pheおよび Ala−Asn−Gln−Ser−Thr−Leu−Glu−Asn−Phe−Leu−
Glu−Arg−Leu−Lys−Thr−Ile−Met−Arg−Glu−Lys−
Tyr−Ser−Lys−Cys−Ser−Ser を有する。

本明細書は、更に、細胞レセプターに対するヒトIL−４
の結合を阻害し、そしてこの種のIL−４に対して、並び
に約５個〜約26個のアミノ酸残基を含み且つヒトIL−４
のアミノ酸残基61〜82または104〜129の配列に対応する
アミノ酸配列またはその部分配列を有するポリペプチド
に対して特異的に結合する抗体であって、細胞レセプタ
ーに対するヒトIL−４の結合を阻害する前記の抗体を提
供する。

本明細書は、また更に、動物に対して、約５個〜約26個
のアミノ酸残基を含み且つヒトIL−４のアミノ酸残基61
〜82または104〜129の配列に対応するアミノ酸配列また
はその部分配列を有するポリペプチドの十分な量を投与
し、それによって、動物が、ヒトIL−４に特異的に結合
し且つ細胞レセプターに対するヒトIL−４の結合を阻害
するポリペプチドに対する抗体を産生することを含む、
ヒトIL−４に特異的に結合し且つ細胞レセプターに対す
るヒトIL−４の結合を阻害する抗体を製造する方法を提
供する。

また更に、本明細書は、前述の抗体に対する抗イディオ
タイプ抗体を提供する。これらの抗体は、おそらく、IL
−４が細胞レセプターに結合する場合にそれと競合する
ことによってIL−４の生物活性を拮抗する。

本明細書は、また更に、ヒトIL−４に対して、並びに約
５個〜約26個のアミノ酸残基を含み且つヒトIL−４のア
ミノ酸残基61〜82または104〜129の配列に対応するアミ
ノ酸配列またはその部分配列を有するポリペプチドに対
して特異的に結合する抗体であって、細胞レセプターに
対するヒトIL−４の結合を阻害する前記の抗体とヒトIL
−４とを接触させることを含む、細胞レセプターに対す
るヒトIL−４の結合を阻害する方法を提供する。

更にまた、本明細書は、ヒトIL−４に対して、並びに約
５個〜約26個のアミノ酸残基を含み且つヒトIL−４のア
ミノ酸残基61〜82または104〜129の配列に対応するアミ
ノ酸配列またはその部分配列を有するポリペプチドに対
して特異的に結合する抗体に対する抗イディオタイプ抗
体であって、細胞レセプターに対するヒトIL−４の結合
を阻害する前記の抗イディオタイプ抗体と、ヒトIL−４
のためのレセプターを有する細胞とを接触させることを
含む、細胞レセプターに対するヒトIL−４の結合を阻害
する方法を提供する。

本明細書の抗体アンタゴニストは、インビトロのレセプ
ター結合性の研究において、IL−４の作用機序を決定す
るおよび／またはIL−４のアゴニストまたは他のアンタ
ゴニストを同定するのに有用である。前述のように、そ
れらは、IL−４に刺激された肥満細胞増殖およびIgE産
生を減少させることによってアレルギーを治療するのに
も有用であることができる。

図面の簡単な説明本発明は、添付の図面を参照することにより一層容易に
理解することができる。

図１は、アミノ末端からカルボキシル末端までの成熟ヒ
トIL−４のアミノ酸配列を示す。

図２は、IL−４（下方の曲線）および第７番のポリペプ
チド（上方の曲線；表１を参照されたい）の結合を、直
接エライザ分析におけるポリペプチドに対するウサギIg
G画分によって示すグラフである。結合したタンパク質
／ポリペプチドのピコモルでの量を、414nmでの吸光度
の関数として示す。

図３は、ダウディ（Daudi）細胞に対する¹²⁵Ｉ−IL−４
の特異的結合の阻害を第７番のポリペプチドに対するウ
サギIgG画分によって示すグラフであり、特異的に結合
した放射能％を増加するIgG濃度の関数として示す。

図４は、ダウディ細胞に対する¹²⁵Ｉ−IL−４の特異的
結合の阻害を抗イディオタイプ抗血清1448によって示す
グラフであり、特異的に結合した放射能の阻害％を減少
する抗血清濃度の関数として示す。

図５は、第７番のポリペプチドに対するウサギ抗血清の
ついて行ったエピトープ分析の結果を示すグラフであ
る。分析で用いた一連のオクタペプチドに対する抗血清
の結合によって生じたエライザの吸光度を示す。オクタ
ペプチドの番号は表３での番号に対応する。

図６は、第６番のポリペプチドに対するウサギ抗血清に
ついて行ったエピトープ分析の結果を示すグラフであ
る。分析で用いた一連のオクタペプチドに対する抗血清
の結合によって生じたエライザの吸光度を示す。パネル
Ａで示した結果を得るのに用いた抗血清は、ウサギの免
疫化の進行中の初期に集められたものであり、ダウディ
細胞に対する¹²⁵Ｉ−IL−４の結合を阻害しなかった。
パネルＢにおいて用いた抗血清は後期に集められたもの
であり、標識IL−４の結合の強力な阻害剤であった。オ
クタペプチドの番号は表４での番号に対応する。

発明の説明本明細書で引用した参考文献はいずれも、全て参考文献
として後述される。示されたポリペプチドのアミノ酸配
列は、標準的な一文字表記または三文字表記である［レ
ーニンジャー（Lehninger）、Princeples of Biochemis
try,1982,ワース・パブリッシャーズ・インコーポレー
テッド（Worth Publishers Inc.），ニューヨーク,96
頁］。

本明細書は、（ａ）細胞レセプターとの相互作用に明ら
かに関与しているIL−４の領域と結合することによって
または（ｂ）IL−４自体を凝態することによって、細胞
レセプターに対するヒトIL−４の結合と拮抗し、それに
よって細胞レセプターに対して結合する場合にそれと競
合する抗体を提供する。IL−４は、アレルギー反応の二
つのエフェクターであるIgE抗体の産生および肥満細胞
の増殖を刺激するので、本発明の抗体アンタゴニストは
アレルギーの治療において有用である。それらは、更
に、インビトロでのIL−４レセプター結合システムにお
いて、IL−４の作用機序を解明するのにまたは他のIL−
４アンタゴニストまたはアゴニストを選別するのに有用
である。

本明細書中で用いるヒト「IL−４」は、（ａ）図１に示
した成熟ヒトIL−４のアミノ酸配列と実質的に同一であ
る配列を有し且つ（ｂ）本来のIL−４に共通している生
物活性を有するタンパク質を意味する。

実質的に同一のアミノ酸配列とは、図１の配列と比較さ
れる別のIL−４の配列が、生物活性を実質的に損なわな
い１種類以上のアミノ酸変化（欠失、付加、置換）によ
って同一であるかまたは異なることを意味する。

当然ながら、前述のIL−４領域におけるアミノ酸配列
は、実質的に同一のIL−4sの場合に異なっていてよい。

以下に記載した合成ポリペプチドに関する研究により、
レセプター結合に関与していると考えられるヒトIL−４
分子内の２か所の領域が存在することが示された。好都
合な参考として、本明細書中では、これらのポリペプチ
ドのアミノ酸配列を、図１に示した成熟ヒトIL−４のア
ミノ酸配列における残基の位置によって定義しており、
１はアミノ末端のヒスチジン残基であり、129はカルボ
キシル末端のセリン残基である。

これらの研究の結果として、ヒトIL−４の残基52〜82お
よび104〜129のアミノ酸配列に対応する配列またはそれ
らの部分配列を有する合成ポリペプチドを抗原として用
いて、ポリペプチドおよびヒトIL−４に結合することが
できる抗体の動物における産生を誘発することができ
る。IL−４のこのような特異的領域に対して結合するそ
れらの能力ゆえに、本明細書の抗体は、IL−４のための
レセプターを有する細胞に対する¹²⁵Ｉ−IL−４の特異
的結合を少なくとも60％阻害する。

前述のIL−４の最大の結合領域（残基52〜82）は約30個
のアミノ酸残基を含む。当該技術分野において、抗原決
定基（エピトープ）は、概して、少なくとも５個のアミ
ノ酸残基を含むということは周知である［オーノ（Ohn
o）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:2945（1985）］。
したがって、本明細書のポリペプチドは、約５個〜約30
個のアミノ酸残基を含み且つ前述のアミノ酸配列を有す
る。ある与えられたポリペプチドが本発明の範囲内であ
るか否かということは、下記に記載した方法を用いる日
常的な実験によって容易に決定することができる。

ポリペプチドは、適当な方法、例えば、排他的固相合成
法、部分固相法、フラグメント縮合または古典的溶液合
成法によって合成される。好ましくは、ポリペプチド
は、メリフィールド（Merrifield）によってJ.Am.Chem.
Soc.85:2149（1963）に記載されたような固相ペプチド
合成法によって製造される。合成は、α−アミノ末端が
保護されているアミノ酸を用いて行う。側鎖が不安定な
三官能性アミノ酸は、更に、ポリペプチドのアッセンブ
リーの際に望ましくない化学反応が生じるのを妨げるの
に適当な基で保護される。α−アミノ保護基は選択的に
除去されて、次の反応がアミノ末端で生じるのを可能に
する。α−アミノ保護基を除去するための条件では、側
鎖保護基は除去されない。

α−アミノ保護基は、段階的ポリペプチド合成の技術分
野において有用であることが知られているものである。
例えば、アシル型保護基（例えば、ホルミル、トリフル
オロアセチル、アセチル）、芳香族ウレタン型保護基
［例えば、ベンジルオキシカルボニル（Cbz）、置換ベ
ンジルオキシカルボニルおよび９−フルオレニルメチル
オキシカルボニル（Fmoc）］、脂肪族ウレタン保護基
［例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Boc）、イソ
プロピルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカル
ボニル］並びにアルキル型保護基（例えば、ベンジル、
トリフェニルメチル）がある。好ましい保護基はBocで
ある。Tyrに対する側鎖保護基としては、テトラヒドロ
ピラニル、第三ブチル、トリチル、ベンジル、Cbz、４
−Br−Cbzおよび2,6−ジクロロベンジルがある。Tyrに
好ましい側鎖保護基は2,6−ジクロロベンジルである。A
spに対する側鎖保護基としては、ベンジル、2,6−ジク
ロロベンジル、メチル、エチルおよびシクロヘキシルが
ある。Aspに好ましい側鎖保護基はシクロヘキシルであ
る。ThrおよびSerに対する側鎖保護基としては、アセチ
ル、ベンゾイル、トリチル、テトラヒドロピラニル、ベ
ンジル、2,6−ジクロロベンジルおよびCbzがある。Thr
およびSerに好ましい側鎖保護基はベンジルである。Arg
に対する側鎖保護基としては、ニトロ、Tos、Cbz、アダ
マンチロキシカルボニルおよびBocがある。Argに好まし
い保護基はTosである。Lysの側鎖アミノ基は、Cbz、２
−Cl−Cbz、TosまたはBocで保護されることができる。
２−Cl−Cbz基がLysに好ましい保護基である。

選択された側鎖保護基は、カップリングの際にそのまま
残っていなければならないし、アミノ末端保護基の脱保
護の際にまたはカップリング条件の際に除去されてはな
らない。側鎖保護基は、更に、合成が完了した際に、完
成したポリペプチドを変化させない反応条件を用いて除
去することができなければならない。

固相合成法は、通常、α−アミノ保護（側鎖が保護され
た）アミノ酸を適当な固体支持体にカップリングさせる
ことによってカルボキシル末端から行われる。エステル
結合は、結合がクロロメチル樹脂またはヒドロキシメチ
ル樹脂に対して行われる場合に形成され、得られたポリ
ペプチドはＣ末端に遊離カルボキシル基を有する。或い
は、ベンズヒドリルアミン樹脂またはｐ−メチルベンズ
ヒドリルアミン樹脂を用いる場合、アミド結合が形成さ
れ、得られたポリペプチドはＣ末端にカルボキサミド基
を有する。これらの樹脂は商業的に入手可能であり、そ
れらの製法は、ステュワート（Stewart）ら、「固相ペ
プチド合成法（Solid Phase Peptide Synthesis）」
（第２版）ピアス・ケミカル・カンパニー（Pierce Che
mical Co.）、イリノイ州、ロックフォード、1984に記
載された。

必要な場合に側鎖が、そしてα−アミノ基が保護された
Ｃ末端アミノ酸を、種々の活性化剤、例えば、ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド（DCC）、N,N′−ジイソプロピ
ルカルボジイミドおよびカルボニルジイミダゾールを用
いてベンズヒドリルアミン樹脂に結合させる。樹脂支持
体に対して結合させた後、トリフルオロ酢酸（TFA）ま
たはジオキサン中HClを０℃〜25℃の温度で用いてα−
アミノ保護基を除去する。ジメチルスルフィドをメチオ
ニン（Met）の導入後にTFAに加えて、可能なＳアルキル
化を抑制する。α−アミノ保護基を除去後、残存する保
護されたアミノ酸を、所望の配列を得るのに必要な順序
で段階的に結合させる。

種々の活性化剤をカップリング反応に用いることがで
き、例えば、DCC、N,N′−ジイソプロピルカルボジイミ
ド、ベンゾトリアゾル−１−イル−オキシ−トリス−
（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホス
フェート（BOP）およびDCC−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール（HOBt）がある。それぞれの保護されたアミノ酸を
過剰に（＞2.0当量）用い、そしてカップリングは、通
常、Ｎ−メチルピロリドン（NMP）中またはDMF、CH₂Cl₂
若しくはそれらの混合物中で行う。カップリング反応の
完了の程度は、各段階で、例えば、カイザー（Kaiser）
らによるAnal.Biochem.34： 595（1970）に記載されたようなニンヒドリン反応によ
って監視される。不完全なカップリングが見出される場
合は、カップリング反応を繰り返す。カップリング反応
は、商業的な入手可能な機器を用いて自動的に行うこと
ができる。

所望のポリペプチドの完全なアッセンブリー後、ポリペ
プチド樹脂を、液体HFなどの試薬を用いて０℃で１〜２
時間開裂させ、ポリペプチドを樹脂から開裂させ且つ側
鎖保護基全部を除去する。通常、アニソールなどの掃去
剤を液体HFと一緒に用いて、開裂の際に生成した陽イオ
ンがポリペプチド中に存在するアミノ酸残基をアルキル
化しないようにする。ポリペプチド−樹脂は、所望なら
ば、開裂する前にTFA/ジチオエタンを用いて脱保護して
よい。

固体支持体上の側鎖対側鎖の環化は、酸性アミノ酸（例
えば、Asp）および塩基性アミノ酸（例えば、Lys）の側
鎖機能の選択的開裂を可能にする直交保護スキームを用
いることを必要とする。Aspの側鎖のための９−フルオ
レニルメチル（Fm）保護基およびLysの側鎖のための９
−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）保護基
は、この目的に用いることができる。これらの場合、Bo
cに保護されたポリペプチド樹脂の側鎖保護基は、DMF中
のピペリジンによって選択的に除去される。環化は、DC
C、DCC/HOBtまたはBOPなどの種々の活性化剤を用いて固
体支持体上で達成される。HF反応は、前記に記載したよ
うに、環化されたポリペプチド樹脂上で行われる。

更に、組換えDNA方法論を用いてポリペプチドを製造す
ることができる。所望ならば、ある与えられた宿主生物
での更に有効な発現に好ましい既知のコドンによって製
造された既知の遺伝暗号を用いて、所望のアミノ酸配列
をコードするオリゴヌクレオチドを合成することができ
る。マシューシ（Matteucci）ら［J.Am.Chem.Soc.103:3
185（1981）］のホスホルアミダイト固体支持体法また
は他の既知の方法をこのような合成に用いることができ
る。得られたオリゴヌクレオチドは、適当なベクター中
に挿入し且つ適合した宿主生物で発現させることができ
る本発明のポリペプチドは、高速液体クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過、イオン交換および分配クロマトグラフィ
ー、向流分配または他の周知の方法を用いて精製するこ
とができる。

抗体は、標準法を用いて本発明のポリペプチドに対して
製造することができる。本明細書中で用いる「抗体」と
いう用語は、多クローン性抗体および単クローン性抗体
双方を意味する。更に、それには全免疫グロブリンおよ
びそれらの抗原結合性断片が含まれる。

多クローン性抗体は、宿主動物、例えば、ウサギ、ラッ
ト、ヤギ、ヒツジ、マウス等に１種類のポリペプチドで
免疫することによって生じることができる。好ましく
は、１回以上のブースター注射を最初の注射後に行っ
て、抗体力価を増大させる。次に、血液を動物から採取
し、血清を標準法、例えば、ポリペプチドを抗原として
用いるエンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ
（エライザ）によって調製し且つ選別する。

好ましくは、ポリペプチドの免疫原性は、アジュバント
との組合せによっておよび／または免疫する前に更に高
分子に変換することによって増大される。

動物のワクチン注射に適当なアジュバントとしては、制
限されないが、アジュバント65（ピーナッツ油、マンニ
ドモノオレエートおよびモノステアリン酸アルミニウム
を含む）；完全または不完全フロイントアジュバント；
ミネラルゲル、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸ア
ルミニウムおよびミョウバン；界面活性剤、例えば、ヘ
キサデシルアミン、オクタデシルアミン、リゾレシチ
ン、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、N,N−
ジオクタデシル−Ｎ′,N′−ビス（２−ヒドロキシメチ
ル）プロパンジアミン、メトキシヘキサデシルグリセロ
ールおよびプルロニックポリオール；ポリアニオン、例
えば、ピラン、硫酸デキストラン、ポリIC,ポリアクリ
ル酸およびカルボポル：ペプチド、例えば、ムラミルジ
ペプチド、ジメチルグリシンおよびタフトシン；並びに
油エマルジョンがある。ポリペプチドは、更に、リポソ
ームまたは他の微粒子担体中に混入後に投与することが
できる。

ポリペプチドの免疫原性は、更に、免疫原性担体分子
（すなわち、宿主動物において免疫学的反応を独立して
誘発する性質を有する巨大分子であって、本発明のポリ
ペプチドが共有結合によって結合することができるも
の）に対する架橋によってまたはカップリングによって
増大させることができる。低分子のポリペプチドはハプ
テン（抗体に対して特異的に結合することができるが、
抗体産生を誘発することができない分子、すなわち、そ
れらは免疫原性ではない）として作用することが多いの
で、担体分子に対する架橋または共役が必要であること
がある。免疫原性担体分子に対するこのようなポリペプ
チドの共役は、「担体効果」として一般的に知られてい
ることによって断片を免疫原性にする。

適当な担体分子としては、例えば、タンパク質および天
然のまたは合成の高分子化合物、例えば、ポリペプチ
ド、多糖、リポ多糖等がある。有用な担体は、モレイン
（Morein）らによって、Nature 308:457（1984）に記載
されたキル（Quil）Ａと称されるグリコシドである。タ
ンパク質担体分子が特に好適であり、制限されないが、
カサガイのヘモシアニンおよび哺乳動物血清タンパク
質、例えば、ヒト若しくはウシのガンマグロブリン、ヒ
ト、ウシ若しくはウサギの血清アルブミン、またはこの
ようなタンパク質のメチル化誘導体若しくは他の誘導体
が挙げられる。他のタンパク質担体は当業者に明らかで
ある。好ましくは、不可欠ではないが、タンパク質担体
は、ポリペプチドに対する抗体を誘発する宿主動物とは
無関係である。

担体分子に対する共有結合カップリングは、当該技術分
野で周知の方法を用いて行うことができ、その厳密な選
択は、用いられる担体分子の性質によって指示される。
免疫原性担体分子がタンパク質である場合、本発明のポ
リペプチドは、例えば、水溶性カルボジイミド、例え
ば、ジシクロヘキシルカルボジイミドまたはグルタルア
ルテヒドを用いて結合させることができる。

これらのようなカップリング剤を用いて、ポリペプチド
をそれらだけで、別個の担体分子を用いることなく架橋
することができる。凝集体にするこのような架橋は、免
疫原性を更に増大させることができる。

このような免疫された動物から生じた血清は、そのまま
用いることができる。或いは、IgG画分を、プラズマフ
ォレシスまたは固定化タンパク質ＡなどのIgG特異的吸
収剤を用いる吸着クロマトグラフィーのような標準法を
用いて血清から分離することができる。

単クローン性抗体は、例えば、コーラー（Kohler）ら
［Nature,256:495（1975）；Eur.j.Immunol.6:511（197
6）］によって記載されたように、標準法を用いて製造
することができる。本質的には、動物を前記に記載した
ように免疫して抗体分泌体細胞を生じさせる。次に、こ
れらの細胞を、ミエローマ細胞に融合させるために免疫
した動物から取り出す。

抗体を生じる可能性を有する体細胞、特に、Ｂ細胞は、
ミエローマ細胞系と融合するのに適している。これらの
体細胞は、感作動物のリンパ節、脾臓および末梢血液か
ら誘導することができる。本発明の代表的な実施態様で
はマウスの脾臓細胞を用い、その理由は、一つには、こ
れらの細胞がマウスミエローマ細胞との安定な融合を比
較的高い百分率で生じるからである。しかしながら、ラ
ット、ウサギ、カエルまたは他の代りの細胞を用いるこ
とも可能であろう。

特殊化されたミエローマ細胞系は、ハイブリドーマ産生
融合法［コーラーおよびミルスタイン（Milstein）、Eu
r.J.Immunol.6:511（1976）；シュルマン（Shulman）
ら、Nature 276:269（1978）；フォルク（Volk）ら、J.
Virol.42:220（1982）］で用いるために、リンパ球腫瘍
から生じさせた。これらの細胞系は少なくとも三つの理
由で生じた。第一は、融合ハイブリドーマを、非融合で
且つ同様に無制限に自己増殖性のミエローマ細胞から選
択するのが容易であることによる。一般的には、これ
は、ハイブリドーマの増殖を支持するある種の選択培地
中でミエローマを増殖させることができないように酵素
が欠失したミエローマを用いて達成される。第二の理由
は、リンパ球腫瘍細胞がそれら自身の抗体を産生する固
有の能力によるものである。単クローンの技術を用いる
目的は、ハイブリドーマの体細胞成分の遺伝子制御下で
所望の単一抗体を生じる無制限の寿命を有する融合ハイ
ブリッド細胞系を得ることである。ハイブリドーマによ
る腫瘍細胞抗体の産生を排除するために、免疫グロブリ
ンＬ鎖およびＨ鎖を生じることができないかまたは抗体
分泌機構を欠失したミエローマ細胞系を用いる。これら
の細胞系を選択する第三の理由は、融合に対するそれら
の適合性および効率のためである。

多数のミエローマ細胞系を融合細胞ハイブリッド産生用
に用いることができ、例えば、P3X60−Ag8、P3/NS1−Ag
4−１（NS−１）、Sp2/0−Ag14およびS194/5.XXO.Bu.1
が挙げられる。P3X60−Ag8およびNS−１細胞系は、コー
ラーおよびミルスタインによって記載された［Eur.J.Im
munol.6:511（1976）］。シュルマンら［Nature,276:26
9（1978）］は、Sp2/0−Ag14ミエローマ細胞系を開発し
た。S194/5.XXO.Bu.1系は、トローブリッジ（Trowbridg
e）によって報告された［J.Exp.Med.148:313（197
9）］。

抗体を産生する脾臓またはリンパ節の細胞およびミエロ
ーマ細胞のハイブリッドを生じるための方法は、通常、
体細胞とミエローマ細胞とを10:1の比率で（しかしなが
ら、その比率は約20:1〜約1:1に変化することができ
る）、それぞれ、細胞膜の融合を促進する１種類または
複数種類の（化学的、ウイルス性または電気的）物質の
存在下で混合することを行う。融合法は、コーラーおよ
びミルスタイン、上記、ジェフター（Gefter）ら［Soma
tic Cell Genet.3:231（1977）］およびフォルクら［J.
Virol.42:220（1982）］に記載された。これらの研究者
によって用いられた融合促進剤は、センダイ（Sendai）
ウイルスおよびポリエチレングリコール（PEG）であっ
た。本発明の実施例の融合法ではPEGを用いる。

融合法は、生長し得るハイブリッドを極めて低頻度で生
じる（例えば、脾臓を体細胞源として用いる場合、約１
×10⁵個の脾臓細胞毎に１個のハイブリッドだけが得ら
れる）ので、融合細胞ハイブリッドを残存する非融合細
胞、特に、非融合ミエローマ細胞から選択する手段を有
することが不可欠である。更に、所望の抗体産生ハイブ
リドーマを他の得られた融合細胞ハイブリッドから検出
する手段が必要である。

概して、融合細胞ハイブリッドの選択は、ハイブリドー
マの増殖を支持するが、非融合ミエローマ細胞の増殖を
妨げ、一般的には、不明確に分割を続けると考えられる
培地中で細胞を培養することによって達成される。融合
で用いられる体細胞は、インビトロの培養では長期間生
存率を維持しないので、問題は起こらない。本発明の実
施例では、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェ
ラーゼを欠いている（HPRT−陰性）ミエローマ細胞を用
いた。これらの細胞に対する選択は、融合細胞ハイブリ
ッドが脾臓細胞のHPRT−陽性遺伝子型のために生存して
いる培地である。ヒポキサンチン／アミノペテリン／チ
ミジン（HAT）培地中で行われる。更に、遺伝子型によ
るコンピテントハイブリッドの増殖を支持する培地に対
抗して選択することができる遺伝子欠失（薬剤感受性
等）の異なるミエローマ細胞を用いることは可能であ
る。

融合細胞ハイブリッドを選択的に培養するのには数週間
を要する。この期間の最初に、所望の抗体を産生するこ
れらのハイブリッドを確認する必要があるので、それら
を引き続きクローン化し且つ増殖させてよい、概して、
得られたハイブリッドの約10％が所望の抗体を産生する
が、約１〜約30％の範囲では顕著ではない。抗体産生ハ
イブリッドの検出はいくつかの標準検定法の内のいずれ
か一つで達成することができ、文献に記載されたエンザ
イムリンクドイムノアッセイおよびラジオイムノアッセ
イが挙げられる［例えば、ケネット（Kennet）ら（監
修）、Monoclonal Antibodies and Hybridomoas:A New
Dimension in Biological Analyses,376〜384頁，プレ
ナム・プレス（Prenum Press），ニューヨーク（1980）
を参照されたい］。

所望の融合細胞ハイブリッドが選択され且つ個々の抗体
産生細胞系にクローン化されたならば、各細胞系を２種
類の標準法のいずれかで増殖させることができる。ハイ
ブリドーマ細胞の懸濁液は、組織適合性動物に注射する
ことができる。次に、注射された動物では、融合細胞ハ
イブリッドによって生じた特異的単クローン性抗体を分
泌する腫瘍が発生する。動物の体液は、例えば、血清ま
たは腹水液を取り、高濃度の単クローン性抗体を提供す
ることができる。或いは、個々の細胞系をインビトロの
実験室の培養容器中で増殖させてもよい。単一の特異的
単クローン性抗体を高濃度で含んでいる培地を、傾瀉、
濾過または遠心分離によって採取することができる。

前記に記載したように製造された抗ポリペプチド抗体が
本発明で用いるのに適当であるか否かということは、
（ａ）免疫化ポリペプチドおよびヒトIL−４を抗原とし
て用いるエライザ分析および（ｂ）細胞レセプターに対
する¹²⁵Ｉ−IL−４の特異的結合の阻害を測定する放射
リガンドレセプター結合分析を含む二部分スクリーニン
グ法によって決定される。

このような検定で用いるための組換え体ヒトIL−４は、
例えば、ジェンザイム・コーポレーション（Genzyme Co
rporation）、マサチューセッツ州、ボストンから入手
可能な商品である。或いは、それは、IL−４遺伝子の既
知のヌクレオチド配列［ヨコト（Yokoto）ら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 83:5894（1986）］および標準組換えDN
A法［例えば、国際特許出願第WO87/02990号明細書；キ
メネイド（Kimmenade）ら、Eur,L.Biochem.173:109（19
88）を参照されたい］を用いて製造することができる。

エライザ分析は、クレティアンら［J.Immunol/Meth.11
7:67（1989）］の方法などの標準法によって、微量滴定
プレートに吸着させたポリペプチドまたはIL−４を用い
て行われる。固定化ポリペプチドまたはタンパク質に結
合した抗体の存在は、標識された抗IgG第二抗体によっ
て検出される。このような第二抗体は、好ましくは、ペ
ルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ｂ−ガラク
トシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼなどの酵素
で標識される。ホースラディッシュペルオキシダーゼ
は、ピロガロール、ｏ−フェニレンジアミンまたは2,
2′−アジノ−ビス（３−エチル−ベンズチアゾリン−
６−スルホン酸）などの基質に対するその活性について
の吸光分光分析によって検出することができる。

免疫化ポリペプチドおよびIL−４双方に特異的に結合す
ることが見出された抗体は、更に、適当な標的細胞上の
レセプターに対する標識IL−４の特異的結合を阻害する
能力について評価される。本発明の抗ポリペプチド抗体
は、このような結合を少なくとも60％阻害する能力を特
徴とする。

IL−４レセプターを有する任意の細胞、例えば、ジジョ
イ（Jijoye）、Ｕ−937、CCRF−CEMおよびCEM−CM3細胞
を用いて、結合検定を行うことができるが、ダウディ細
胞は便利で且つ容易に入手可能である。ダウディ細胞
は、バーキットリンパ腫患者由来の十分に特徴化された
Ｂリンパ芽球細胞系であり、アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション（American Type Culture Collec
tion）から寄託番号ATCC CCL 213として購入することが
できる。検定で用いるための¹²⁵Ｉ−IL−４は、例え
ば、ラクトペルオキシダーゼ法［デビッド（David）
ら、Biochemistry 13:1014（1974）］またはボルトン
（Bolton）ら［Biochem.J.133:529（1973）］の方法を
用いてIL−４をヨウ素−125で標識することによって製
造することができる。グリコシル化組換え体ヒトIL−４
は、例えば、ジェンザイム・コーポレーション、マサチ
ューセッツ州、ボストンから購入可能な商品である。

本明細書の抗イディオタイプ抗体は、本発明のポリペプ
チド中に存在するIL−４抗原決定基に特異的な抗体に対
して向けられている。このような抗イディオタイプ抗体
は、元の抗原決定基のように擬態し且つ作用する［例え
ば、リーガン（Reagan）らの米国特許第4,731,237号明
細書を参照されたい］。IL−４それ自体と同様に、これ
らの抗体は、IL−４レセプターに対して特異的に且つ直
接結合すると考えられる。しかしながら、抗イディオタ
イプ抗体はIL−４の生物活性を有していない。

このような抗イディオタイプ抗体は、本発明のポリペプ
チドに対する抗体（多クローン性または単クローン性）
を動物にワクチン注射することによって製造される。そ
れらは、前記に記載したように、全多クローン性抗血清
として若しくはそれらのIgG画分としてまたはクローン
化したハイブリドーマによって生じた単クローン性抗体
として回収することができる。

本明細書の１種類以上の抗体の有効量および生理的に許
容し得る担体を含む薬剤組成物を製造することができ
る。この種の担体は当業者に周知である。抗体は、アレ
ルギーまたはIL−４によって媒介された他の症状を治療
するために、ヒトの患者に対して直接または組成物の形
態で投与することができる。薬剤組成物は、生理的に許
容し得る担体と有効量の１種類以上の抗体とを混合する
ことによって製造される。

特定の状況に対する本発明の抗体の適当な用量の決定
は、当該技術分野の技術の範囲内である。一般的には、
最適よりも少ない一層少量の投与量で治療を開始する。
したがって、投与量は、条件下で最適の効果に達するま
で、小さい増加量で増加される。便宜上、全日用量を分
割してよいし、所望ならば、一日の間に少量ずつ投与し
てもよい。

本明細書の抗体の投与量および投与頻度は、担当医師の
判断にしたがって調節され、患者の年齢、状態および体
格並びに治療される１種類または複数種類の症状の苛酷
さなどの要因が考慮される。

実施例特に断らない限り、固体混合物中固体、液体中液体およ
び液体中固体について下記に与えられた百分率は、それ
ぞれ、重量／重量、容量／容量および重量／容量に基づ
く。

タンパク質の決定は、ローリィ（Lowry）ら［J.Biol.Ch
em.193:265（1951）］の方法によって、ウシ血清アルブ
ミンを標準として用いて行った。IL−４の生物検定は、
モスマン（Mossman）［J.Immunol.Methods,65:55（198
3）］に記載されたように行って、PHAに刺激されたヒト
末梢血液リンパ球でのMTT（３−［4,5−ジメチルチアゾ
ル−２−イル］−2,5−ジフェニルテトラゾリウム臭化
物）の取込みとして細胞増殖の刺激を測定した。１単位
のIL−４活性は、検定において２×10⁵個の細胞で最大
刺激の２分の１を引き起こすIL−４の量である。１マイ
クログラムの純粋なヒトIL−４の検定での活性は、約2
0,000単位である。

ポリペプチド合成多数のポリペプチドを合成し、そのアミノ酸配列は、全
体的には、完全な成熟ヒトIL−４タンパク質のアミノ酸
配列に対応した。

ポリペプチドは、メリフィールドの固相法［J.Am.Chem.
Soc.85:2149（1963）］およびアプライド・バイオシス
テムズ（Applied Biosystems）430A型合成機を用いて合
成した。ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ保護基およ
び対称性無水物を用いた。保護基を除去した後、ポリペ
プチドをフッ化水素によって樹脂から開裂させた。

ポリペプチドの精製は、レイニン・ダイナマクス（Rain
in Dynamax）Ｃ−８カラムを0.1％トリフルオロ酢酸
中のアセトニトリルの勾配によって展開させて用いる逆
相高速液体クロマトグラフィーによって行った。溶出液
は、214nmでの紫外線吸光度によって監視された。精製
ポリペプチドの同一性は、標準法を用いて、アミノ酸配
列順序および質量スペクトル分析によって確認された。

生じたポリペプチド、それらのアミノ酸配列およびその
ポリペプチド配列が対応する成熟ヒトIL4の残基を表１
に示す。

ホップ（Hopp）ら［Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:3824（1
981）］によって行われたヒトIL−４の親水性分析によ
り、第７番のポリペプチドに対応する領域は、IL−４の
α−ヘリックス領域をおそらく形成する二次構造モデル
によって指示される親水性残基および疎水性残基双方を
含むことが示される。

抗ポリペプチド抗体の製造および特徴化ヒトIL−４の残基61〜82に対応する第７番のポリペプチ
ド（表１）2mgを、0.5モルのトリス−HCl、pH6.8が0.4m
lおよび百日咳ワクチン（源、18334菌株、加熱殺菌、20
単位/ml、チメルサール稀釈度1/10,000）0.1ml中に溶解
させた。完全フロイントアジュバント（0.5ml）を加
え、試料をシリンジ中で均一化した。ニュー・ジーラン
ドシロウサギにそれぞれ、0.1ml（ポリペプチド200μ
ｇ）の皮内注射によって試料1mlを用いて免疫した。

約４か月の期間の後、続いて周期的に、ブースター注射
を前記のように行った。血液を、ウサギの耳または大腿
静脈から周期的に取り且つ凝固させた。

IgG画分は、１種類のウサギの血清から、1.5モルグリシ
ン緩衝液、pH8.9で平衡させたプロテインＡ−セファロ
ースカラム［ファーマシア（Pharmacia）、ニュージ
ャージー州、ピスカタウェイ］上に同一種類を吸着させ
ることによって単離された。クロマトグラフィーは、フ
ォートン・バイオケム・カンパニー（Forton Biochem.C
o.）による標準法を用いて行った。精製された物質は、
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動［レムリ（Laemml
i）、Nature,227:680（1970）］によって約98％純度のI
gGであると判断された。この物質は抗血清343−6IgG画
分を示した。

同様の方法を用いて、表１に示した他のポリペプチドに
対する抗血清のIgG画分を更に製造した。

エライザは、単離されたIgG画分について、96ウェル微
量滴定プレート［ベクトン・ディキンソン（Becton−Di
ckinson）］に、トリス緩衝食塩水（TBS;50ミリモルト
リス、0.15モルNaCl、pH7.0）50μｌ中の各種ポリペプ
チドの１種類約0.25μｇを用いて室温で１時間コーティ
ングすることによって行った。このインキュベーション
後、ウェルを、0.1％のトゥウィーン（Tween）20（ポリ
オキシエチレンソルビタンモノラウレート）を含むTBS
で５回洗浄した。

洗浄したウェルを、TBS中１％ウシ血清アルブミン（BS
A）を用いて室温で１時間ブロックし、TBSで５回洗浄
し、TBS中0.1％非特異的IgGを用いて室温で２時間ブロ
ックし、そして前記に記載したように５回洗浄した。次
に、IgG画分のTBS中各種稀釈度の一部分50μｌをウェル
に加え、そのプレートを室温で１時間インキュベートし
た後、前と同様に洗浄した。

各ウェルに対して、ホースラディッシュペルオキシダー
ゼで標識したヤギ抗ウサギIgG2.5ngを含むTBS50μｇを
加え、そのプレートを室温で１時間インキュベートし
た。上記のように洗浄した後、ウェルを、過酸化水素お
よび2,2−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリ
ンスルホネート）で展開させた。

３種類の検定成分（すなわち、抗原、抗体または標識第
二抗体）の一つを欠いた対照ウェルも展開させた。試料
は、ダイナテク（Dynatech）650型分光光度計で読み取
られた。

第７番のポリペプチド（表１）およびヒトIL−４を抗原
として用いて抗血清343−6IgG画分について行ったこの
ような分析の結果を図２に示す。抗原結合性の尺度とし
ての414nmでの吸光度が、ウェル当りのポリペプチドま
たはIL−４の量の関数として示される場合、抗体が双方
の抗原に結合したことが分かる。これらの結果を生じる
ために、抗血清343−6IgG画分を1:200に稀釈した後、一
部分50μｌをウェルにコーティングした。

抗ポリペプチドIgH画分の抗体が、ヒトIL−４に対して
特異的に結合することによって、細胞レセプターに対す
るIL−４の結合を阻害することができるか否かを決定す
るために、放射リガンド結合分析を行った。

CHO細胞で発現された精製組換え体ヒトIL−４［レー（L
e）ら、J.Biol.Chem.263:10817（1988）］を、ボルトン
ら［Biochem.J.133:529（1973）］の方法の変法によっ
て、デュポン（Dupont）−NEN、マサチューセッツ州、
ボストンからのボルトン・ハンター（Bolton−Hunter）
試薬を用いてヨウ素−125で標識した。簡潔には、ボル
トン・ハンター試薬2mCiを、50ミリモルのリン酸ナトリ
ウム緩衝液、pH8.0の100μｌ中、精製IL−４の5.0μｇ
と22℃で２時間反応させた。反応を、1.0モルグリシン
を等量加えることによって１時間急冷した。

ヨウ素化タンパク質は、50ミリモルリン酸ナトリウム、
pH7.4中0.2％ゼラチンで平衡させたPD−１カラム（ファ
ーマシア、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）中の
ゲル濾過によって単離された。カラムから空隙率で溶離
する放射性物質を集め且つ分析した。標識IL−４の特異
的放射能は、カルボ（Calvo）ら、Biochem.J.212:259
（1983）］の自己置換法によって決定されたように1500
Ci/ミリモルであり、モル取込み比率はタンパク質１モ
ル当りヨウ素0.68モルであった。

各種抗ポリペプチドIgG画分の結合培地［10％ウシ胎児
血清（FCS）含有RPMI1640］中連続稀釈の10分の１ミリ
リットル容量を、結合培地1.0ml中の一定量の¹²⁵Ｉ−IL
−４（約２×10⁵cpm）と一緒に、1.5ml試験管中、４℃
で18時間インキュベートした後、結合検定を実施した。
このプレインキュベーションの後、試験管の内容物を２
×10⁶個のダウディ細胞と混合し、その混合物を４℃で
２時間インキュベートした。

インキュベーション後、細胞を800または12,000×ｇで
の遠心分離を４℃で30秒間行うことによってペレットに
し、上澄みを捨てた。細胞を、標識IL−４含まない新し
い結合培地0.1ml中に４℃で再懸濁し、上記のようにペ
レットにし、検定培地100μｌに再懸濁し、そしてフタ
ル酸ジブチルおよびフタル酸ジオクチル（1:1）100μｌ
の上に置いた。細胞を、13,000×ｇで２分間ペレットに
し、液体窒素中で冷凍した後、ガンマカウンターで計数
した。非特異的結合は、非標識ヒトIL−４を1.0mg含む
試料で平行して決定された。

前述の分析の結果を表２に示す。

表２のデータは、ヒトIL−４の残基52〜65（第６番ポリ
ペプチド）、61〜82（第７番ポリペプチド）および104
〜129（第11番ポリペプチド）に対応するポリペプチド
に対して生じた抗体が、ダウディ細胞に対する¹²⁵Ｉ−I
L−４の結合の強力な阻害剤であったことを示してい
る。これらの抗体は免疫化ポリペプチドおよびIL−４の
双方に対して結合したが、予備免疫血清はどちらにも結
合しなかったし、レセプター結合に対する作用もなかっ
た。

表２に更に示したように、ポリペプチド６および７に対
する抗体は、標識IL−４の結合を阻害するのに同等に強
力である。表１は、これらのポリペプチドが共通のアミ
ノ酸部分配列KDTRCを共有していることを示している。
このように組み合わせた根拠により、この部分配列は重
要なエピトープを構成し且つ５個程度の少ないアミノ酸
残基を含んでいるらしい本発明のポリペプチドを支持す
ることができるということが示唆される。

第６番のポリペプチドに対する多クローン性抗体によっ
て生じた結合阻害は特に興味深い。前述のように、クレ
ティアンらは、同ポリペプチドに対して生じた単クロー
ン性抗体がIL−４の生物活性を中和しないことを発見し
た。しかしながら、以下に記載した引き続きのエピトー
プ分析では、その抗体は、おそらく、ポリペプチドのア
ミノ末端方向の残基に対して向けられていて、カルボキ
シル末端の部分配列Lys−Asp−Thr−Arg−Cysに対する
のではないことが示された。おそらくは、この実施例の
多クローン性抗血清がIL−４を阻害したのは、その若干
の抗体がこの特異的部分配列を含むエピトープに対して
向けられていたことによるものである。

第７番のポリペプチドに対する抗血清343−6IgG画分に
ついて得られた結果を図３のグラフで示し、２×10⁶個
のダウディ細胞を、50ピコモルの¹²⁵Ｉ−IL−４および
指示した抗体濃度について４℃で２時間インキュベート
したものである。抗体不在での特異的結合は3,347cpmで
あった。観察された強力な結合阻害と、抗体が第７番の
ポリペプチドおよびIL−４に対して特異的に結合したと
いう事実を組合わせることにより、抗体が向けられてい
るアミノ酸残基はIL−４の表面上に晒されているらしい
ことが示唆される。

単クローン性抗ポリペプチド抗体単クローン性抗体を、本質的にはコーラーおよびミルス
タイン［Nature,256:495（1975）］によって記載された
ように製造した。インキュベーションは全て、５％CO₂
インキュベーター中37℃で行った。

Balb/cマウス［チャールズ・リバー（Charles Rive
r）］に、2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン［プリ
スタン（Pristane）］500μｌを腹腔内に（i.p.）投与
することによって免疫学的に感作した。約４日後に、第
７番のポリペプチド（表1;ヒトIL−４の残基61〜82に対
応する）250μｇをリン酸緩衝溶液（PBS）250μｌ容量
に溶解させ、完全フロイントアジュバントの一部分250
μｌを加え、そして混合物を均一化し且つ各マウスに腹
腔内投与した。約１か月後に、不完全フロイントアジュ
バントで1:1に稀釈したポリペプチド125μｇを含むブー
スター注射を腹腔内に投与した。

３または４週間後に、PBS中の第７番のポリペプチド250
μｇの最終腹腔内注射を投与した。免疫化の進行中、周
期的に、尾静脈から試験採血を行い且つ前記に記載した
ようにエライザによって分析した。最後の免疫化の４日
後に、被験動物を屠殺し且つそれらの脾臓を取り出し
た。

脾臓は、２枚のスライドの間でストレプトマイシン100
μg/m.およびペニシリン100単位/mlを含む新しいRPMI16
40培地（RPMIpen/strep培地）中に浸軟させた後、大型
試験管に移した。破片を１分間沈降させた後、試験管上
層の細胞を5ml試験管に移した。RPMIpen/strep培地5ml
を加え、細胞を懸濁させた後、約300×ｇで８分間遠心
分離することによって沈降させた。

5:1の比率の脾臓細胞対NS−１マウスミエローマ細胞（A
TCC TIB18）を調製し、RPMIpen/strep培地で１回洗浄し
た。前記のように細胞をペレットにした後、培地を捨
て、分子量が約1500ダルトンのPEG（75ミリモルHEPES緩
衝液中、2g/リットル）0.5mlを、20秒毎に静かに撹拌し
ながら37℃で１分間にわたって滴加した。PEGの添加
は、PEG溶液を最初に0.5ml、次に1.0mlで繰り返した。

融合の後、細胞を沈降させ、そしてRPMIpen/strep培地
0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0および32.0mlを用いて
１分間周期で洗浄した。融合細胞を前記のように沈降さ
せ、培地を捨てた後、無経験マウスからの約１×10⁵個
の脾臓細胞を支持（feeder）細胞として、グルタミン0.
2933mg/mlおよび10％ウシ胎児血清（FCS）を含むRPMIpe
n/strep培地に加え、そして細胞を混合した後、前記の
ように沈降させた。マウスから単離後、その前日に、支
持脾臓細胞は、グルタミンおよびFCSを含むRPMIpen/str
ep培地中、37℃で一晩中インキュベートされた。

融合細胞および支持細胞を、グルタミン0.2933mg/ml、1
0％FCS、１×10^-2モルのヒポキサンチン、４×10^-5モル
のアミノプテリンおよび1.6×10^-3モルのチミジンを含
むRPMIpen/strep培地（HAT培地）中、150μl/ウェルの9
6ウェル平底微量滴定プレート（COSTAR）で７日間一緒
に増殖させた。このインキュベーション期間の後、各ウ
ェル中の培地をHT培地（アミノプテリンを欠いたHAT培
地）で置き換え、インキュベーションを続けた。

数日後、エライザを、標識抗マウスIgG抗体を用いるこ
とを除き、前記に記載したようにハイブリドーマ上澄み
について行った。試験で陽性のウェルのハイブリドーマ
をHT培地で限界稀釈することによってクローン化した。

クローン化したハイブリドーマ382全部をこの方法で製
造し、その全部が単クローン性抗体を生じた。これらの
ハイブリドーマを、抗原として第７番のポリペプチドを
用いるエライザによってスクリーニングした後、12種類
の陽性細胞系を同定した。これらの内10種類は、IL−４
に対するエライザスクリーニングによって陽性であるこ
とが分かった。

寒天中の８種類の陽性クローンについてのオークターロ
ニースクリーニングを、免疫グロブリン特異的抗血清を
用いる標準法によって行い、６種類のクローンがIgGI抗
体を生じ、１種類がIgG2a抗体を生じ、そして１種類がI
gM抗体を生じることが示された。

抗イディオタイプ抗体の製造抗イディオタイプ抗体を製造するために、リン酸緩衝溶
液0.5ml中の前記に記載した抗血清343−6ILgG画分1.5mg
を、完全フロイントアジュバント0.5mlに加え、完全に
混合してエマルジョンを生成した。試料をヒツジ［ドー
セット（Dorset）交配種］に皮下注射した。以後、ブー
スターワクチン注射を、不完全フロイントアジュバント
を用いることを除き、同一の方法で数週間間隔で投与し
た。

免疫化の進行中に採取された不定期の血液試料につい
て、免疫グロブリンによるブロッキングを省略し且つホ
ースラディッシュペルオキシダーゼで標識したロバ抗ヒ
ツジIgG5.0ngを第二抗体として用いることを除き、前記
に記載したように抗原として抗血清343−6IgG画分を用
いてエライザ分析を行った。このようにして得られたヒ
ツジ抗血清（抗血清1448で示された）は、ウサギ抗血清
343−6IgG画分に対して特異的に結合するが、IL−４ま
たは第７番のポリペプチドに対して結合しないことが分
かった。

ヒツジ抗血清が抗イディオタイプ抗体を実際に含んでい
なかったかどうかを決定するために、抗血清の連続稀釈
について、前記に記載したように、¹²⁵Ｉ−IL−４およ
びダウディ細胞を用いて放射リガンドレセプター結合分
析を行って、その結果を図４に示した。検定での各試料
は２×10⁶個の細胞および50ピコモルの¹²⁵Ｉ−IL−４
（２×10⁵cpm）を含んでいた。抗血清不在での特異的結
合は5,931cpmであった。

図４で示したように、ヒツジ抗血清1448は、細胞に対す
る標識IL−４の結合の強力な拮抗阻害剤であり、一層低
い稀釈度での80％を上回る特異的結合を無効にした。対
照的に、ヒツジ予備免疫血清は、IL−４の結合に対して
作用しなかった。

エピトープ分析第６番および第７番のポリペプチドのアミノ酸残基が、
細胞レセプターに対するIL−４の結合を阻害することが
できる抗体の産生に対して臨界的であったことを決定す
るために、エピトープ分析を、本質的には、ガイセン
（Geysen）ら［Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998（198
4）］によって記載されたように行った。

ガイセンらの方法は、エライザを行うのに十分な純度お
よび十分な量の多数の低分子ポリペプチドの固体支持体
上での急速な同時合成を可能にし、ポリペプチドは、そ
れらを合成した固体支持体になお結合している。原則と
して、エライザは、このようなポリペプチドについて、
低分子ポリペプチドの配列を含むアミノ酸配列を有する
一層高分子のポリペプチドまたはタンパク質に対して製
造された抗体を用いて行われる。抗体が一層高分子の免
疫原内のエピトープに特異的である場合、すなわち、低
分子の合成ポリペプチドに包含される場合、その抗体は
ポリペプチドに結合し且つエライザによって検出するこ
とができる。

ガイセンらの上記の方法を用いて、一連の15種類のオク
タペプチドをポリエチレンピン［ケンブリッジ・リサー
チ・バイオケミカルズ・インコーポレーテッド（Cambri
dge Research Biochemicals,Inc.）ニューヨーク州、バ
リー・ストリーム］上で合成し、その凝集体でのアミノ
酸配列は、第７番のポリペプチド（成熟ヒトIL−４の残
基61〜82に対応する）の残基全部を補った。これらのオ
クタペプチドの配列を表３に示す。

同様に、成熟ヒトIL−４の残基47〜70に対応する残基全
部を互いに補った一連の17ピン固定化オクタペプチドを
製造した。これらのオクタペプチドのアミノ酸配列を表
４に示す。

第７番のポリペプチドについてのエピトープ分析を行う
ために、前記に記載したようにポリペプチドで免疫した
ウサギからの129−88で示される抗血清について、表３
に示したポリエチレンピン固定化オクタペプチドを抗原
として用いてエライザを行った。この抗血清は、前記に
記載したように行った検定において、ダウディ細胞に対
する¹²⁵Ｉ−IL−４の結合を強力に阻害することが分か
った。エライザは、96ウェル微量滴定プレート中で、ウ
ェル上に遊離抗原をコーティングする代わりにウェル中
でピンを用いることを除き、本質的には前記に記載した
ように、抗血清129−88について行った。タイターテク
（Titertec）MCC340エライザプレートリーダーを用いて
色の展開を読み取る前に、ピンを壁から除去した。

この分析結果を図５に示し、414nmでの吸光度を各オク
タペプチドについて示している。図５に示したオクタペ
プチドの番号は、表３の番号に対応する。オクタペプチ
ド５〜12に対する抗体の強力な結合は図５から分かる。
表３を参照することにより、これらのオクタペプチドの
およその中心は、成熟ヒトIL−４の残基69〜76に対応す
ることが分かる。これらのデータと、抗血清129−88が
細胞レセプターに対する標識IL−４の結合を阻害したと
いう事実とを組み合わせることにより、成熟ヒトIL−４
の残基69〜76は、１種類または複数種類のエピトープを
含み、それに対する抗体は、細胞レセプターに対するヒ
トIL−４の結合を阻害するということが示唆される。

同様に、表４に示した固定化オクタペプチドを用いて、
第６番のポリペプチドに対して生じたウサギ抗血清を分
析した。342−６で示したこの抗血清は、ダウディ細胞
に対する¹²⁵Ｉ−IL−４の結合を阻害する能力について
２回評価された。免疫化進行中の初期に調製された血清
試料（初期抗血清343−６）は、標識IL−４を阻害しな
かったが；後期に調製された試料（後期抗血清342−
６）は強力に阻害した。これらの分析の結果を、初期お
よび後期抗血清について、それぞれ図6AおよびＢに示
す。図６で示したオクタペプチドの番号は表４の番号に
対応する。

図6Aで示したように、第６番のポリペプチドに対する非
阻害初期抗血清342−６は、オクタペプチド３〜７およ
び９〜13と反応性の抗体を含んでいた。表４を参照する
ことにより、これらのオクタペプチドの中心は、成熟ヒ
トIL−４の残基53〜57および59〜63それぞれにほぼ対応
することが分かる。

後期の阻害抗血清342−６は、それが、オクタペプチド1
1〜16に対して更に強力に結合することを示した抗体を
更に含んでいたことを除き、同様の結合パターンを生じ
（図6B）、その中心はヒトIL−４の残基61〜66に対応し
た。図６のパネルＡおよびＢのデータを総合することに
より、成熟ヒトIL−４の残基61〜66はエピトープを含
み、それに対する抗体は細胞レセプターに対するヒトIL
−４の結合を阻害することが示唆される。

この示唆は、前記に記載したように、第６番および第７
番のポリペプチド並びに第７番のポリペプチドに対する
単クローン性抗体の１種類を用いて行ったエライザの研
究によって強調される。この抗体は双方のポリペプチド
に対して強力に結合した。更に、それは、ダウディ細胞
に対する¹²⁵Ｉ−IL−４の結合を強力に阻害した。ポリ
ペプチド中の唯一の共通の部分配列はKDTRCであり、成
熟ヒトIL−４の残基61〜65に対応している。当然の結果
として、阻害単クローン性抗体はこの部分配列に対して
向けられていなければならないし、そして部分配列は重
要なエピトープを含んでいなければならないということ
になる。

本発明の多くの修正および変更は、当業者に明らかにな
るように、その精神および範囲から逸脱することなく行
うことができる。本明細書中に記載した具体的な実施態
様は例としてのみ与えられ、発明は添付の請求の範囲の
条項によってのみ制限されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者トロッタ，ポール・ピーアメリカ合衆国ニュージャージー州07094, セコーカス，ハーマン・コーブ・タワーズ 2429 (56)参考文献Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ 117（１），67−82（1989) Ｐｒｏｃ．Ｎａｃｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．78，3824−3828（1981)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アミノ酸配列： Lys−Asp−Thr−Arg−Cys−Leu−Gly−Ala−Thr−Ala−
Gln−Gln−Phe−His−Arg−His−Lys−Gln−Leu−Ile−
Arg−Phe またはその部分配列からなる５−22のアミノ酸残基を有
するポリペプチド。
【請求項２】アミノ酸配列： Lys−Asp−Thr−Arg−Cys−Leu−Gly−Ala−Thr−Ala−
Gln−Gln−Phe−His−Arg−His−Lys−Gln−Leu−Ile−
Arg−Phe を有する請求項１のポリペプチド。