FR2473713A1 - Procede et produits pour la suppression des troubles - Google Patents
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Abstract
Pour l'élimination de troubles dans des mélanges réactionnels troublés par des échantillons en particulier pour une mesure photométrique, on ajoute au mélange réactionnel : a. un ou plusieurs composés organiques à bas poids moléculaire, tels que des alcools aromatiques ou des amines, qui portent des substituants électro-négatifs, par exemple des phénols ou des naphtols, qui sont substitués par un ou plusieurs atomes d'halogène et/ou par des groupes hydroxyles, et également b. un ou plusieurs détergents solubles ne donnant pas de troubles qui forment par addition de a un complexe moins soluble, tels que des adducts de polyéthylène oxyde non ioniques ou des détergents cationiques, en particulier des éthers alkyle, aralkyle ou alkylthio ou des esters alkyle ou aralkyle de polyéthlèneoxyde glycols, avec 8 à 22 atomes de carbone dans les groupes alkyles et 5 à 25 unités oxyde d'éthylène ou des composés chlorure d'alkyldiméthylbenzylammonium avec 8 à 22 atomes de carbone dans le groupe alkyle, en une quantité suffisante pour engendrer une précipitation du complexe et finalement on ajoute un autre détergent jusqu'à ce que le complexe précipité soit de nouveau dissous.
Description
Procédé et Produits pour la suppression des troubles.
L'invention concerne un procédé et un réactif
pour la suppression des troubles dans les mélanges réaction-
nels troublés par les matières soumises aux essais, de pré-
férence la matière d'essai biologique, par exemple le sérum ou le plasma. Ces mélanges sont entre autres utilisés pour l'analyse clinico-chimique, pour l'analyse chimique des produits alimentaires ainsi que pour l'analyse de l'eau et des eaux usées. Pour obtenir une spécificité plus élevée
on utilise souvent dans ces cas des enzymes.
Un problème connu de l'analyse photométrique est l'influence des troubles du liquide d'essai tel que le sérum ou le plasma, sur le résultat de l'analyselorsque la mesure est effectuée sans valeur d'essai à blanc. On aspire à éviter une mesure à blanc pour diminuer la consommation
du réactif, pour simplifier le processus de mesure et d'in-
terprétation et pour réduire la quantité d'échantillons
utilisée. Lorsqu'on utilise des réactifs uniques qui con-
tiennent tous les composants réactifs mélangés, la déter-
mination d'une valeur d'essai à blanc est même en principe impossible. De tels troubles sont provoqués par différentes
causes, souvent par une teneur élevée en triglycérides.
Un trouble conduit à une extinction spécifi-
que accrue dans le mélange échantillon-réactif. Comme l'ex-
tinction globale est composée de la participation de cou-
leur qui est directement proportionnelle à la concentration du substrat à doser, et d'une participation du trouble, on
obtient alors nécessairement des résultats faux.
On sait éclaircir de tels troubles par addi-
tion de détergents dans une mesure telle que la participa-
tion du trouble à l'extinction globale peut être négligée
(DE-AS 2 327 894).
Un inconvénient important de ce procédé rési-
de dans le fait qu'on utilise des quantités très élevées de détergent. Les concentrations élevées nécessaires sont préjudiciables car alors souvent l'activité de l'enzyme utilisée est diminuée et en outre de telles quantités ne -2- se laissent plus loger dans les mélanges de solides qui doivent être secs et capables de s'écouler facilement. Ceci a de l'importance en particulier dans le cas de réactifs uniques. L'invention a pour but de supprimer les inconvénients mentionnés plus haut et de mettre au point un
procédé et un réactif, qui permettent de supprimer les trou-
bles commentés ci-dessus. Par suppression on entend égale-
ment ici 'dans le cadre de l'invention l'empêchement ou la
diminution de tels troubles.
Ce but a été atteint selon l'invention au-mo-
yen d'un procédé pour la suppression des troubles dans les mélanges réactionnels troublés par la matière d'essai, en particulier pour la mesure photométrique, par addition de détergents, lequel est caractérisé en ce que l'on ajoute au mélange réactionnel, en une quantité suffisante pour provoquer une précipitation du complexe,
- a) un ou plusieurs composés organiques à faible poids mo-
léculaire et - b) un ou plusieurs détergents en soi solubles de façon limpide qui forment avec l'additif a) un complexe moins soluble, et en ce qu'ensuite on ajoute encore du détergent jusqu'à
ce que le complexe précipité soit de nouveau dissous.
L'invention repose sur la constatation sur-
prenante du fait que les composés organiques mentionnés qui en eux-mêmes seuls dans une solution aqueuse limpide ne présentent aucune ou seulement une très faible activité
éclaircissante sur les troubles décrits plus haut, renfor-
cent considérablement de façon synergétique l'activité
éclaircissante déjà connue en soi des détergents. Ceci con-
duit à ce que, dans la plupart des cas, non seulement un éclaircissement est rendu possible, mais encore le trouble peut être complètement supprimé, la quantité de détergent
nécessaire pour cela pouvant aussi en même temps être consi-
dérablement diminuée. Des exemples de composés utilisables sous a) sont: a) des alcools et des amines aromatiques (condensés et - 3 - non condensés), de préférence ceux qui sont substitués de façon fortement électronégative (de préférence les substituants électronégatifs sont des halogènes), donc par exemple l'alcool benzylique, le phénol, les mono-, di- et trichlorophénols, les dibromo- et tribromophénols,
les crésols, les naphtols, les dihydroxynaphtols, l'ani-
line et la chloraniline, la méthylaniline; - b) les esters d'acides aryliques et alcoyliques, donc par exemple le p-hydroxybenzoate d'éthyle, l'acétate d'éthyle,
l'acétate de butyle, le propionate d'éthyle, le trichlo-
roacétate d'éthyle et analogues; - c) des alcools rectilignes et cycliques et aliphatiques ramifiés avec plus de trois atomes de carbone, donc par exemple l'alcool amylique, l'octanol, le dodécanol, le cyclohexanol et analogues; - d) des composés aliphatiques halogénés à courte chalne, donc par exemple le dichloroéthane, le trichloroéthylène,
le tétrachlorométhane, le dichlorobutène, le tétrachloro-
difluoroéthane et analogues;
- e) des cétones aliphatiques, donc par exemple la butanone-
(2), la cyclohexanone et analogues; - f) des aldéhydes, comme par exemple l'aldéhyde cinnamique ou le benzaldéhyde;
- g) des acides carboxyliques, par exemple l'acide octanoi-
que; - h) des éthers, comme par exemple le 2-méthoxyphénol;
- i) le benzene.
La quantité respective d'un tel composé (appe-
lé dans ce qui suit adjuvant) pour un cas particulier peut etre déterminée par des essais préalables. En général, on a trouvé que des concentrations comprises entre 0,5 et 300 mM,
de préférence entre 2 et 10 mM apportent de bons résultats.
Parmi les détergents formant avec les adJu-
vants mentionnés ci-dessus des complexes peu solubles, dé-
tergents qui par ailleurs seuls dans le mélange réactionnel
sont solubles de façon limpide, se trouvent des représen-
tants des détergents non iono-qgnes, ionogènes, et des amphotères. Les
adducts d'oxydes de polyéthylène non ionogènes sont préférés.
-4- Des résultats particulièrement bons sont obtenus avec les
éthers d'alcoyles et d'aralcoyles et avec les alcoylthio-
éthers ainsi qu'avec les esters alcoyliques et aralcoyli-
ques des glycols d'oxydes de polyéthylène. Dans ces déter-
gents les groupes alcoyle présentent en général 8 à 22 ato- mes de carbone, le groupe aryle est de préférence un radical
phényle. Dans le radical glycol de ces détergents se trou-
vent en général 3 à 25 unités oxyde d'éthylène sous forme
condensée. Des exemples typiques pour ce groupe particu-
1O lièrement préféré de détergents sont le Thésit, le Génapol, le Tergitol, le Triton X 100, le Lensodel et le Brij 35. En outre on peut aussi utiliser des détergents ioniques, en particulier des chlorures d'alcoyldiméthylbenzyl-ammonium Pour le groupe alcoyle ce qui a été dit plus haut dans le cas des adducts d'oxydes de polyéthylène est valable. Des sulfates d'alcoyle secondaires dont les groupes alcoyle correspondent à la définition ci-dessus se sont également révélés utilisables. Parmi les détergents amphotères, le N-lauryldiéthanolamide s'est révélé approprié Dans le cadre de l'invention, comme il a déjà
été indiqué, la quantité de détergent nécessaire est extra-
ordinairement abaissée par rapport à l'état de la technique.
En général des quantités comprises entre 0,05 et 1% suffi-
sent. De préférence les adjonctions de détergents sont com-
prises entre 0,2 et 0,8%. On peut naturellement également
utiliser des concentrations plus élevées, mais alors le dan-
ger d'une influence négative sur l'enzyme utilisée augmente.
Par contre, selon la DE-AS indiquée plus haut, on utilise
% en volume de.détergent pour l'éclaircissement.
Des concentrations particulièrement faibles en détergent peuvent être utilisées lorsque la dissolution du complexe de détergent et d'adjuvant est effectuée par
addition d'un détergent qui est différent du détergent con-
tenu dans le complexe. En d'autres termes, on utilise, selon ce mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, au moins deux détergents différents. On peut alors utiliser comme
deuxième détergent également un détergent, qui avec l'adju-
vant.ne rende possible la formation d'aucun complexe diffi-
-5-
cilement soluble qui peut être identifié par un trouble.
Un autre objet de l'invention est un produit d'éclaircissement pour les mélanges réactionnels troublés par la matière d'essai, destinés aux procédés d'analyses, en particulier pour le mesure photométrique, avec une teneur
en détergent, lequel est caractérisé en ce qu'il est cons-
titué - a) d'un ou de plusieurs composés organiques à bas poids moléculaire et
- b) d'un ou de plusieurs détergents également en soi solu-
bles de façon limpide qui, avec le constituant a) forment un complexe moins soluble et éventuellement - c) d'un ou de plusieurs autres détergents différents de b) qui n'ont pas besoin de former avec a) un complexe peu soluble,
ou bien contient ces constituants.
Les indications précédentes relatives à la na-
ture et aux quantités des détergents et adjuvants utilisés
sont valables dans le cas de cet agent d'éclaircissement.
Le procédé est utilisable en relation avec toutes les sortes de mesures dans lesquelles les troubles qui apparaissent peuvent conduire à une altération ou une perturbation de la mesure. Il s'agit en particulier ici de
mélanges réactionnels qui sont destinés à la mesure photo-
métrique. De tels mélanges réactionnels sont connus de façon générale de l'homme du métier et sont par exemple décrits, pour beaucoup de substances à déterminer, dans "Methoden der enzymatischen Analyse", de H. U. Bergmeyer, Verlag Chemie, Weinheim/Bergstrasse. Il n'est par conséquent pas nécessaire
de donner ici une description plus complète de tels mélanges
réactionnels. Exemples 1 à 36 Système éclaircissant de trouble Les combinaisons suivantes selon l'invention
produisent, en l'espace d'une minute à deux heures au maxi-
mum, une élimination du trouble dans le système.
2 ml de mélange à l'essai + 2 il de lait de table avec une teneur en graisses de 3,5%, - 6 -
Epaisseur de couche 1 cm, 546 nm, 25 C.
- a) Variation de l'adjuvant Dans 0,1 m de tampon tris/HC1 avec 2% de MgS04.7H20 Produit 2,4-dichlorophénol 2,3-dichlorophénol 2,4dibromophénol phénol
2,4,6-trichloro-
phénol
1,7-dihydroxy-
naphtol
2,7-dihydroxy-
naphtol
1,5-dihydroxy-
naphtol Hydroquinone Aniline 2-chloraniline o-toluidine Pentanol-(1) Chloroforme Benzène Guaiacol Benzaldéhyde
Aldéhyde cinna-
mique Cyclohexanone avec 6,0 % de K2SO4 dans 0,5m de tampon sel de sodium de l'acide octanoique
Concentra-
tration 8; 6; 4 mM 8; 6; 4 mM 8; 4 mM
1%; 0,5%
24; 12; 8 mM 8; 4 mM 8; 4 mM 8; 6; 4 mM 2% 2;1,5; 1% en vol. 0,8 % en vol. 1; 0,5% en vol. 2% en vol. 0,4% en vol. 0,75% en vol. 1% en vol. 1% en vol. 0,5 % en vol. 3%en vol. et 2,5 %0 de au phosphate 1 %O Conc. du détergent il ,6 %0
2,8 %0
7,3 %0O
3,3 % 7 %O
4,5 %0
3,5 %0
,5 %0 %0 %0 17 %0 16 %0 9 %0 4 %0 %0 7 %0
1,4 %O
%0
1,2 %0
Génapol pH 8,0 8,0 8,0 8,0 7,1 8,0 8,0 8,0 8,0 8,0 8,0 8,0 8,0 8,0 8,0 8, 0 8,0 8,0 8,0 Ox-80) de potassium
2,5 %0 5,0
(1) Hydroxypolyéthoxydodécane (Thésit).
Exem- ple N I
-- 7 --
- b) Variation des détergents
Dans 0,1 m de tampon tris/HCl (pH 8,0) avec 2% de MgSO4.
7H20 et 8 mM/1 de 2,4-dichlorophénol comme additif, on a, avec les systèmes suivants, obtenu un bon éclaircissement: Détergent I Thésit 2) Tergitol NPX Triton X100 ' Pégosperse 5) Thésit Thésit Thésit Teepol 710 6) Lensodel AB6 Thésit Tween 20 8) Brij 35 9) Génapol Ox80 (En présence Tween 20 Génapol Génapol Ox80 OxlOC Détergent II 3) 4) Brij 35 Tween 20 Chlorure de benzalconium Brij 35 7) Brij 35 Bromure de
cétyltriméthyl-
ammonium
acide laurique-
bis-(2-hydroxy-
éthyl)-amine
Acide laurique-
bis-(2-hydroxy-
éthyl)-amine ) Sel de Na du sulfate de dodécyle d'ions K+) Bromure de
cétyltriméthyl-
ammonium Tween 20 11) Sel de Na du sulfate de dodécyle Conc. ,6 %o %o 17 %o %o 2 %o/2 %o 2 %o/1 %o 3,5 %o/ 0,8 %o %o/7 %o %o/12 %o 4 %o/1 %o 8 %o/2 %o %o/2 %o 3 %o/16 %o 7,5 %o/1 %o 1 %o/3,5 %o 6 %o/3 %o Exempli N 33* 36* - a - - 8 - 2) 3) 4) ) 6) 7) 8) 9) ) 11) Voir 1) Tergitol NPX = 10,5 éthoxy-nonylphénol Triton X100 = 9-10 éthoxy-octylphénol Pégosperse = laurylate de polyéthylèneglycol Teepol 710) sulfates d'alcoyles sec. mélangés Lensodel AB6 (avec C à C18)
8 18
Tween 20 = 20 monolaurate d'éthoxy-sorbitanne Brij 35 = éther de polyéthylene et de lauryle Génapol Ox80) Ethers d'alcools gras et de polyglycols Génapol X100) (à chalne rectiligne avec C12 a C15)
Exemple 37
Réactif pour la détermination de l'acide
urique dans le sérum.
Composition: 0,05 mole/l de K4P207 % en volume d'éthanol amené à pH 8,5 par HCl 1 mg/ml de NADP
1 U/ml d'alcooldéhydrogénase EC 1.2.1.5.
1000 U/ml de catalase EC 1.11.1.6.
0,05 mole/l d'oxalate de Na2 0,05 mole/l de pyrazole Les longueurs d'onde de mesure prédéterminées et la quantité relativement élevée d'échantillon nécessaire font que, dans
le cas de matière d'essais troublée lipémiquement, la mesu-
re est rendue plus difficile ou respectivement impossible.
Pour l'élimination de ce trouble on a pré-
paré les additifs suivants: 1) 2 % d'acétate de butyle 1,5 % de Thesit 2) 0,5 % de dichloroéthane 0,5 % d'hexanol
5 %o de Génapol X-80 (éther d'isotridécanol et de poly-
glycol) 9 %o de Génapol X-100 (éther d'isotridécanol et de -9- polyglycol) 6 %o de Thésit
Mélange soumis à l'essai: 2 ml de réactif (avec les addi-
tifs 1) ou 2) 0,1 ml d'échantillon
démarrage avec 0,6 U d'uricase EC 1.7.33.3.
Mesure à 340 nm et 25 C au point final. Les additifs sus-
mentionnés font que les extinctions de départ fortement augmentées par la matière d'essais troublée lipémiquement
sont supprimées dans le temps le plus court.
Un trouble d'extinction voisine de 2,0 est, en l'espace d'environ 10 minutes, diminué, par rapport à la
valeur à blanc du réactif, jusqu'à un niveau stable d'ex-
tinction d'environ 0,2. Grâce à cela, il est possible
d'égaliser pour démarrer alors la réaction.
Exemple 38
Réactif pour la détermination du cholestérol dans le sérum: Composition: 2,54 g/l de KH2PO 4 31,60 g/1 de K2HP04 8 g/l de Na2SO4 mg/1 de 4aminoantipyrine 282 mg/1 de phénol pH 7,90
3 U/ml de peroxydase EC 1.11.1.7.
0,3 U/ml de cholestérol-estérase EC 3.1.1.13.
0,3 U/ml de cholestérol-oxydase EC 1.1.3.6.
Ce réactif est conçu comme un mélange unique et doit par
conséquent être utilisable sans la mesure d'une valeur d'es-
sai à blanc. Cette exigence a été satisfaite grâce aux ad-
ditifs suivants, également dans le cas de matièresd'essai fortement troublées lipémiquement: additifs éclaircissants du trouble: 1) X815 mg/1 de 3,4-dichlorophénol 4 g/1 de Génapol Ox-100
- 10 -
3 g/1 de désoxycholate de sodium 2) 2 g/1 d'heptanol 8 g/1 de Thésit 3) 1 g/1 d'acétate d'éthyle 7 g/1 de Thésit 4) à pH 7,0 et 80 mM de tampon au phosphate de K /Na 1,5 g/1 de parahydroxy-benzoate d'éthyle 4 g/1 de Thésit ' ) *à pH 7,50 dans 0,2 m de tampon au phosphate de potas- sium en plus des 3 nmmoles/l de phénol utilisées pour former la couleur, encore mmoles/1 de phénol 1,5 g/l de Génapol Ox-100 1,5 g/1 de Tween 20
1,0 g/l de cholate de sodium.
mélange: 2 ml de réactif + 20 pl d'échantillon, 546 nm, oC. Les troubles produits par la matière d'essais d'extinction a 1,5 sont décomposés totalement ou jusqu'à une mesure
négligeable pendant tout le temps nécessaire à la mesure.
Exemple 39
Réactif pour la détermination du glucose dans le sérum: Composition: 14,9 g/1 de Na2HPO4 13,2 g/1 de KH2PO4 8,0 g/1 de Na2S04
U/ml de glucoseoxydase EC 1.1.3.4.
1,8 U/ml de peroxydase EC 1.11.1.7.
0,2 U/ml d'estérase EC 3.1.1.13 470 mg/1 de phénol 156 mg/1 de 4aminoantipyrine à pH 7,0 Additifs éclaircissants du trouble: 1) Y814 mg/l de 3,4-dichlorophénol 3,6 g/l de Génapol Ox-100 3,0 g/1 d'acide tauroglyco-cholique
- 11 -
2) * 814 mg/1 de 3,4-dichlorophénol 2,5 g/1 de Thésit 3,9 g/1 d'acide tauroglyco-cholique 3) * dans 0,2 m de tampon au phosphate de potassium, pH 7,0 en plus 1,35 g/1 de phénol 489 mg/1 de 3,4-dichlorophénol 3,0 g/1 de Génapol Ox-100 2,8 g/l de cholate de sodium La mesure est ici effectuée à 578 nm. Comme déjà indiqué dans l'exemple 38, les additifs ont ici également pour effet que les troubles provoqués par la matière d'essais dans le
mélange testé sont décomposés dans le temps le plus court.
Les exemples mis en oeuvre sont du type de ceux pour les-
quels sont utilisés:
a) un ou plusieurs détergents en soi solu-
bles de façon limpide qui peuvent former avec l'additif un complexe moins soluble et ceux pour lesquels, b) en addition à a) au moins un détergent qui
n'est pas en mesure de former avec l'additif, dans les condi-
tions qui règnent dans le mélange réactionnel, un complexe
moins soluble (marqué de *).
- 12 -
Claims (11)
1. Procédé pour la suppression des troubles dans les mélanges réactionnels troublés par les matières
soumises aux essais, en particulier pour la mesure photomé-
trique, par addition de détergents, caractérisé en ce que l'on ajoute au mélange réactionnel en une quantité suffisante pour provoquer une précipitation du complexe,
a) un ou plusieurs composés organiques à fai-
ble poids moléculaire et b) un ou plusieurs détergents en soi solubles de façon limpide qui forment avec l'additif a) un complexe moins soluble,
et en ce qu'ensuite on ajoute encore du déter-
gent jusqu'à ce que le complexe précipité soit de nouveau dissous.
2. Procédé selon la revendication 1, caracté-
risé en ce que l'on utilise des alcools ou amines aromati-
ques qui portent des substituants électronégatifs en tant
que composant a).
3. Procédé selon la revendication 2, carac-
térisé en ce que l'on utilise des phénols ou des naphtols qui sont substitués par un ou plusieurs atomes d'halogènes
et/ou groupes hydroxy.
4. Procédé selon la revendication 3, carac-
térisé en ce que l'on utilise un di- ou trihalogénophénol
ou un dihydroxynaphtol.
5. Procédé selon l'une des revendications
1 à 4, caractérisé en ce que l'on utilise comme détergents des adducts d'oxyde de polyéthylène non ionogènes ou des
détergents cationiques.
6. Procédé selon la revendication 5, caracté-
risé en ce que l'on utilise des éthers d'alcoyle, d'aralcoyle
ou alcoylthio ou des esters d'alcoyle ou d'aralcoyle de gly-
cols d'oxydes de polyéthylène avec 8 à 22 atomes de carbone
dans les groupes alcoyle et 5 à 25 unités oxyde d'éthylène.
7. Procédé selon la revendication 5, carac-
térisé en ce que l'on utilise des composés chlorures d'al-
coyldiméthylammonium avec 8 à 22 atomes de C dans le groupe
- 13 -
alcoyle.
8. Procédé selon l'une des revendications
précédentes, caractérisé en ce que, pour dissoudre le com-
plexe formé, on ajoute un détergent qui est différent du détergent contenu dans le complexe précipité.
9. Produit d'éclaircissement pour les mélan-
ges réactionnels troublés par la matière d'essai, destinés
aux procédés d'analyses, en particulier pour la mesure pho-
tométrique, avec une teneur en détergent, lequel est carac-
térisé en ce qu'il est constitué a) d'un ou de plusieurs composés organiques à bas poids moléculaire et b) d'un ou de plusieurs détergents également en soi solubles de façon limpide qui, avec le constituant a) forment un complexe moins soluble et éventuellement c) d'un ou de plusieurs autres détergents différents de b) qui n'ont pas besoin de former avec a) un complexe peu soluble,
ou bien contient ces constituants.
10. Produit selon la revendication 9, carac-
térisé en ce qu'il contient des alcools ou amines aromatiques qui portent des substituants électronégatifs, ou des mélanges
de ceux-ci.
11. Produit selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce qu'il contient en tant que détergent un
éther d'alcoyle, d'aralcoyle ou alcoylthio ou un ester d'al-
coyle ou d'aralcoyle d'un glycol d'oxyde de polyéthylène ou/et un chlorure d'alcoyldiméthylbenzyl-ammonium ou des
mélanges de ceux-ci.
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