FR2531714A1 - Procede de purification de s-adenosyl-l-methionine - Google Patents
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Abstract
L'INVENTION CONCERNE UN PROCEDE DE PURIFICATION DE S-ADENOSYL-L-METHIONINE. LEDIT PROCEDE CONSISTE A SOUMETTRE UN LIQUIDE CONTENANT LA S-ADENOSYL-L-METHIONINE BRUTE A UN PROCESSUS DE PURIFICATION EN SERIE COMPRENANT, DANS UN ORDRE DESIRE QUELCONQUE, A. AU MOINS UNE ETAPE DE TRAITEMENT DUDIT LIQUIDE AVEC UNE RESINE D'ECHANGE DE CATIONS FAIBLEMENT ACIDE DU TYPE H ET B. AU MOINS UNE ETAPE DE TRAITEMENT DUDIT LIQUIDE AVEC UNE RESINE SYNTHETIQUE POREUSE ADSORBANTE. APPLICATION A LA PRODUCTION DE PRODUITS A USAGE PHARMACEUTIQUE.
Description
La présente invention concerne un procédé de puri fication de S-adénosyl-L-méthionine (qu'on désignera ci-après de façon abrégée.par SAM), et plus particulièrement, un procédé pour isoler efficacement une SAM de grande pureté. d'un liquide contenant SAM brute.
SAM est une substance importante qui participe, in vivo au métabolisme des graisses, des protéines et des glucides. Récemment, on a trouvé que SAM avait un effetthéra- peutique sur l'adipose jecur, la lipémie, l'artériosclérose, la dépression et l'insomnie, et il est souhaitable de produire SAM en grandes quantités.
De nombreux procédés étaient connus jusqu'à-pré- sent pour la purification de SAM. Des exemples particuliers comprennent : (1) un procédé consistant à combiner une étape de traitement d'un liquide contenant SAM avec une résine d'échange de cations fortement acide et une étape de traitement de ce liquide avec du carbone activé (brevet japonais publié sous le N" 13680/1971)-, (2) un procédé qui consiste à traiter un liquide contenant SAM brut avec une résine d'échange de cations faiblement acide (Enzymologia, Vol. 29, page 283), (3) un procédé consistant à combiner une étape de traitement d'un liquide contenant SAM brut avec une résine d'échange de cations faiblement acide du type H+ et une étape de traitement de ce liquide avec du carbone activé (demande de brevet japonais mise à l'inspection Publique N" 14299/1981), (4) un procédé qui consiste à traiter un liquide contenant SAM brut avec une résine du type chélate (brevet japonais publié sous le N" 20998/1978), et (5) un procédé passant par un sel de SAM avec l'acide picrique ou l'acide picrolonique (brevets -des Etats-Unis d'Amérigue N" 3 707 536 et N" 3 954 726).
Le procédé (2) est plus simple du point de vue des étapes de traitement et plus économique que le procédé tel), (4) ou (5), mais il présente comme inconvénient une séparation incomplète de SAM des impuretés et matières étrangères et il ne permet pas d'obtenir SAM avec une pureté suffisam ment grande pour une utilisation comme médicament. En ce qui concerne le procédé (3), qui est une amélioration du procédé (1), la pureté de SAM est accrue mais1 étant donné que l'adsorption de SAM sur le carbone activé est forte, le pourcentage de récupération en SAM est réduit. Si l'on cherche à accroître le pourcentage de récupération en aug-mentant la quantité de solvant organique dans un éluant, il en résulte malheureusement une séparation insuffisante de SAM des impuretés et des matières étrangères.
La présente invention se propose donc de fournir un procédé grâce auquel on peut isoler efficacepent SAM à un degré de pureté élevé.
La Demanderesse a effectué des recherches intensives pour atteindre cet objectif, et elle a constaté que
SAM pouvait être isolé et purifié efficacement à partir d'un liquide'contenant SAM brut en combinant une étape de traitement de ce liquide avec une résine d'échange de cations faiblement acide-du type H+ avec une étape de traitement de ce liquide avec une résine synthétique poreuse adsorbante.
SAM pouvait être isolé et purifié efficacement à partir d'un liquide'contenant SAM brut en combinant une étape de traitement de ce liquide avec une résine d'échange de cations faiblement acide-du type H+ avec une étape de traitement de ce liquide avec une résine synthétique poreuse adsorbante.
Ainsi, selon la présente invention, on dispose d'un procédé pour purifier SAM qui consiste à soumettre un liquide contenant SAM brut à un procédé de purification en serie qui comprend, dans un ordre désiré quelconque, (A) au moins une étape de traitement du liquide contenant SAM brut avec une résine d'échange de cations faiblement acide du type H+ et (B) au moins une étape de traitement de ce liquide avec une résine synthétique poreuse adsorbante.
I1 n'y a pas de limitations particulières en ce qui concerne le procédé de production du liquide contenant
SAM brut utilisé dans la présente invention. Par exemple, ce liquide est produit par la culture d'un microorganisme appartenant au genre Saccharomyces, Candida 'ou Mucor capable de produire SAM, dans un milieu de culture contenant de la méthionine pour produire et accumuler SAM à l'intérieur et/ ou à l'extérieur des cellules microbiennes, et à extraire le bouillon de culture avec un agent d'extraction tel que l'acide perchlorique, l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique ou l'acide formique ; ou par réaction, par voie enzymatique, d'adénosine-triphosphate et de méthionine en présence de méthionine-adénosyl-transférase.
SAM brut utilisé dans la présente invention. Par exemple, ce liquide est produit par la culture d'un microorganisme appartenant au genre Saccharomyces, Candida 'ou Mucor capable de produire SAM, dans un milieu de culture contenant de la méthionine pour produire et accumuler SAM à l'intérieur et/ ou à l'extérieur des cellules microbiennes, et à extraire le bouillon de culture avec un agent d'extraction tel que l'acide perchlorique, l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique ou l'acide formique ; ou par réaction, par voie enzymatique, d'adénosine-triphosphate et de méthionine en présence de méthionine-adénosyl-transférase.
L'essentiel du procédé de la présente invention consiste à purifier un tel liquide contenant SAM brut en le soumettant à un procédé de purification en série qui comprend, dans un ordre désiré quelconque, (A) au moins une étape de traitement du liquide contenant SAM brut avec une résine d'échange de cations faiblement acide du type H et (B) au moins une étape de traitement de ce liquide avec une résine synthétique poreuse adsorbante.
L'étape de traitement (A) est conduite de la maniere suivante.
Tout d'abord, le pH du liquide contenant SAM brut est ajusté en général à 3, 5--6 , 5, de préférence à 4-6,5.
Lorsque le pH du liquide contenant SAN brut est trop bas,
SAM est difficilement adsorbé sur la résine d'échange d'ions.
SAM est difficilement adsorbé sur la résine d'échange d'ions.
S'il est trop élevé, SAM est susceptible d'une décomposition.
Le procédé d'ajuStement du -pH n'est pas particulièrement limité. De préférence, l'ajustement du pH s'effectue en utilisant une combinaison d'un acide et d'une substance alcaline capable de former un précipité diffilement soluble ou insoluble dans l'eau, ou une résine d'échange d'anions (du type OH ).
Par mise en contact du liquide contenant SAM brut, dont le pH a été ajusté de la manière susmentionnée, avec la résine d'échange de cations faiblemen-t acide du type H+
SAM de charge positive est sélectivement adsorbé sur la résine d'échange de cations. Les impuretés ayant des charges neutres et négatives dans liquide ne sont pas adsorbes sur la résine.
SAM de charge positive est sélectivement adsorbé sur la résine d'échange de cations. Les impuretés ayant des charges neutres et négatives dans liquide ne sont pas adsorbes sur la résine.
La résine d'échange de cations faiblement acide utilisée peut être toute résine d'échange de cations comportant des groupes acide carboxylique comme groupes d'échange d'ions. Des exemples particuliers en sont Amberlite IRC-50 et IRC-80 (des produits de Rohm & Haas Co.) et Diaion WK20 (un produit de Mitsubishi-Chemical Co., Ltd.). La mise en contact peut s'effectuer par un procédé discontinu ou un procédé à colonne. Ce dernier procédé est préféré en raison de son fonctionnement satisfaisant et de sa facilité d'élimination des impuretés.
SAM adsorbé sur la résine d'échange d'ions est ensuite séparé par élution fractionnée de la résine avec une solution aqueuse d'un acide inorganique ou organique ayant un pH ne dépassant généralement pas 3,0, de préférence compris entre 0,2 et 2,0. L'acide 'utilisé n'est pas particulièrement limité et l'on peut utiliser, par exemple, l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide acétique et l'acide p-toluànesulfonique. Si nécessairev avant l'élution fractionnée de SAM, on peut laver la résine d'échange d'ions à l'eau ou avec une solution aqueuse diluée d'un acide (par exemple à un pH de 3,5 ou plus) pour éliminér les traces, d'impuretés présentes.
L'étape de traitement (B) s'effectue de la maniere suivante.
Tout d'abord, le liquide contenant SAM brut est ajusté à pH 6,5 ou moins, puis amené au contact de la résine synthétique poreuse adsorbante. L'ajustement du pH et la mise en contact peuvent s'effectuer de la même manière que dans l'étape de traitement (A). La mise en contact avec l'adsorbant a pour résultat une adsorption sélective des amines, de la méthylthioadénosine (le produit de décomposition de SAM) et des matières colorées qui sont les matières étrangères contenues dans le liquide. Par un choix des con disions F comme décrit ci-dessus, SAN et les matières étrangères peuvent être adsorbées ensemble sur l'adsorbant. Dans ce cas, SAM peut être séparé sélectivement par une élution fractionnée de l'adsorbant avec une solution aqueuse d'un acide inorganique ou organique ayant un pH ne dépassant pas 3,5, de préférence compris entre 0,2 et 2,0.
Les acides inorganiques et organiques que l'on peut utiliser peuvent être tous ceux entrant dans la caté gorie.utilisée dans l'étape de traitement (A). On peut utiliser un solvant organique conjointement à l'acide inorganique ou organique à condition que sa proportion puisse assurer une solutionniforne. Des exemples de solvant organique sont le méthanol, méthanol; le n-propanol, l'iso propanol, l'acétone, la méthyl-éthyl-cétone, le formiate de méthyle, l'acétate d'éthyle, le dioxanne et le toluène.
Si on le désire, de la même manière que dans l'étape de traitement (A), l'adsorbant peut être lavé à l'eau ou avec une solution aqueuse diluée d'un acide avant l'élution fractionnée afin d'éliminer les traces d'impuretés présentes.
La résine synthétique poreuse adsorbante utilisée dans la présente invention est insoluble dans l'eau et pré- sente une structure de réseau géant. Des exemples particuliers comprennent les adsorbants non polaires à base d'un copolymère styrène/divinylbenzène en tant que matrice tel que Amberlite XAD-2 et XAD-4 (produits de Rohm & Haas Co.) et Diaion HP-10, HP-20, HP-30, HP-40 et HP-50 (produits de
Mitsubishi Chemical Co., Ltd.), et des adsorbants moyennement polaires à base d'un polymère d'un ester d'acide acrylique et/ou d'un ester d'acide méthacrylique ou d'un copolymère d'un tel monomère avec un monomère non polaire tel que le styrène et le divinylbenzène comme matrice, par exemple Amberlite XAD-7 et XAD-8 (produits de Rohm & Haas
Co.) et Diaion HP-ZMG (produit de Mitsubishi Chemical Co.,
Ltd.). Si on le désire, ces adsorbants peuvent être utìli- sés en combinaisons.
Mitsubishi Chemical Co., Ltd.), et des adsorbants moyennement polaires à base d'un polymère d'un ester d'acide acrylique et/ou d'un ester d'acide méthacrylique ou d'un copolymère d'un tel monomère avec un monomère non polaire tel que le styrène et le divinylbenzène comme matrice, par exemple Amberlite XAD-7 et XAD-8 (produits de Rohm & Haas
Co.) et Diaion HP-ZMG (produit de Mitsubishi Chemical Co.,
Ltd.). Si on le désire, ces adsorbants peuvent être utìli- sés en combinaisons.
Ces adsorbants présentent en commun une adsorption sélective des matières étrangères présentes dans le liquide contenant SAM brut, par exemple des amines et des matières colorées. Ils présentent cependant une adsorbabilité sélective vis-à-vis de SAM selon leur type.. En particulier, les adsorbants non polaires adsorbent les matières étrangères mais non SAM, et les adsorbants moyennement polaires adsorbent SAM ainsi que les matières étrangères dans des donditions d'acidité relativement faible, mais adsorbent uniquement les matières étrangères et non SAM dans des conditions d'acidité relativement forte.
Dans le procédé de la présente invention, le traitement de 11étape (Aj et le traitement de l'étape (B) sont conduits chacun au moins une fois. La séquence des étapes de traitement est facultative. Des exemples préférés de séquence sont (1) (A) puis (B) ; (2) (B) puis (A) ; (3) (A), (B) puis (A) ; et (4) (B), (A) puis (B). Selon les besoins, l'étape de traitement (A) et/ou l'étape de traitement (B) peuvent être encore enchaînées à ces exemples. A mesure que le nombre des étapes de traitement augmente, les frais entraînés par le procédé de purification sont naturellement légèrement augmentés.
Lorsque l'étape de traitement (B) doit être conduite avant l'étape de traitement (A), il est plus opérationnel de se placer dans des conditions dans lesquelles seules les impuretés sont sélectivement adsorbées sur la résine synthétique adsorbante sans adsorption de SAM. Une technique particulière permettant d'établir de telles conditions consiste par exemple à utiliser un adsorbant non polaire ou un adsorbant modérément polaire et à le mettre en contact dans des conditions acides à un pH ne dépassant pas 3,5, de préférence de 0,2 à 3,0.
Lorsque l'étape finale du procédé de purification en série est l'étape (B), il est possible d'utiliser un procédé consistant à adsorber tout d'abord SAM sur la résine synthétique adsorbante, puis à le séparer, ou un procédé qui consiste à faire passer SAM à travers la résine synthétique adsorbante sans adsorption.
La solution é-luée de SAM provenant de l'étape de purification en série décrite ci-dessus est concentrée sous pression réduite, selon les besoins. Ensuite, elle est amenée au contact d'un solvant organique tel que le méthanol, l'éthanol, le n-pr-opanol, I'isopropanol, le n-butanol, l'isobutanol, le méthoxyéthanol, acétone, la méthyl-éthylcétone, le formiate de méthyle, le formiate d'éthyle, l'acétate de méthyle, l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle et le dioxanne. On peut ainsi obtenir un précipité d'un sel formé entre SAM et un acide inorganique ou organique.
En variante, sans mise en contact de la solution de SAM avec un solvant organique, on peut obtenir une poudre d'un sel formé entre SAM et un acide inorganique ou organique en éliminant l'excès d'acide de la solution de SAM en utilisant une résine d'échange d'anions (du type OH) ou une substance alcaline capable de former un sel insoluble dans l'eau par réaction avec l'acide utilisédans l'élut ion fractionnée de SAM, puis évaporation du solvant de la solution sous pression réduite jusqu siccités
La résine d'échange d'ions faiblement acide du type H+ est régénérée à un stade où SB en a été éiué. Il n'est donc pas toujours néces-saire de la soumettre à un traitement de régénération particulier.On peut l'utiliser de façon répétée après seulement un lavage à l'eau Par ailleurs, la résine synthétique adsorbante peut être faci-lement régénérée, par exemple par lavage avec une solution aqueuse à 50 % de méthanol, puis à l'eau.
La résine d'échange d'ions faiblement acide du type H+ est régénérée à un stade où SB en a été éiué. Il n'est donc pas toujours néces-saire de la soumettre à un traitement de régénération particulier.On peut l'utiliser de façon répétée après seulement un lavage à l'eau Par ailleurs, la résine synthétique adsorbante peut être faci-lement régénérée, par exemple par lavage avec une solution aqueuse à 50 % de méthanol, puis à l'eau.
Ainsi, selon la présente invention on peut obtenir efficacement SAM d'un très haut degré de pureté par des opérations simples en utilisant des substances faciles à régénérer.
Les exemples suivants illustrent la présente invention plus en détail.
EXEMPLE 1
On cultive Saccharomyces cerevisiae (IFO 204) dans le milieu de culture de F. Schlenk et coll. Journal of Biological Chemistry, Vol. 229, page 1037 (1957)] pour former des cellules microbiennes dans lesquelles est accumulé SAM. On met en suspension- 210 g des cellules résultantes dans 1000 ml d'acide perchlorique 1,5N et on les extrait par agitation à la température ambiante pendant 1 heure. Ensuite, on élimine les résidus cellulaires en les séparant par centrifugation, On ajoute de l'hydrogénocarbonate de potassium à l'extrait pour ajuster son pH à 5,0.
On cultive Saccharomyces cerevisiae (IFO 204) dans le milieu de culture de F. Schlenk et coll. Journal of Biological Chemistry, Vol. 229, page 1037 (1957)] pour former des cellules microbiennes dans lesquelles est accumulé SAM. On met en suspension- 210 g des cellules résultantes dans 1000 ml d'acide perchlorique 1,5N et on les extrait par agitation à la température ambiante pendant 1 heure. Ensuite, on élimine les résidus cellulaires en les séparant par centrifugation, On ajoute de l'hydrogénocarbonate de potassium à l'extrait pour ajuster son pH à 5,0.
On élimine en filtrant par aspiration à la trompe le précipité résultant de perchlorate de potassium pour obtenir 1080 ml d'un extrait contenant 1,15 g de SAM.
On fait passer l'extrait à travers une colonne garnie de 200 ml de résine d'échange de cations faiblement acide, Amberlite IRC-50 (type H+) (marque de fabrique d'un produit de Rohm & Haas Co.) pour adsorber SAM. On lave la colonne avec 400 ml d'acide acétique 0,0001N et la soumet à une élution fractionnée avec de l'acide sulfurique 0,1N pour obtenir 630 ml d'une solution de SAM.
On ajuste le pH de la solution de SAM résultante à 4,5 avec une résine d'échange d'anions faiblement basique,
Amberlite IRA-45 (type OH ) (marque de fabrique d'un produit de Rohm & Haas Co.), puis on la fait passer à travers une colonne garnie de 1,5 litre de Amberlite XAD-7 (marque de fabrique d'une résine synthétique adsorbante du type acrylate fabriquée par Rohm & Haas Co.) pour adsorber SAM.
Amberlite IRA-45 (type OH ) (marque de fabrique d'un produit de Rohm & Haas Co.), puis on la fait passer à travers une colonne garnie de 1,5 litre de Amberlite XAD-7 (marque de fabrique d'une résine synthétique adsorbante du type acrylate fabriquée par Rohm & Haas Co.) pour adsorber SAM.
On lave la colonne avec 2 litres d'acide acétique 0,0001N -puis on la soumet à une élution fractionnée avec de l'acide sulfurique 0,1N pour obtenir 1440 ml d'une solution de SAM.
On concentre la solution de SAM sous pression réduite jusqu'à ce que son volume total soit de 200 ml.
On ajoute ensuite 800 ml d'acétone pour obtenir un précipité de sulfate de SAM. On recueille le précipité par séparation par centrifugation, on le dissout dans une petite quantité d'eau puis on le lyophilise pour obtenir 1,74 g de sulfate de SAM sous forme d'une poudre blanche. Ce produit présente une seule tache dans la chromatographie sur papier et la chromatographie en couche mince sur gel de silice.
Le rendement en SAM et son degré de pureté sont indiqués sur le Tableau 1.
EXEMPLE 2
On fait passer un extrait contenant 1,06 g de SAM, obtenu de la même manière que dans liExemple 1, à travers une colonne garnie de 200 ml de Amberlite IRC-84 (type H+) (marque de fabrique d'une résine d'échange de cations faiblement acide fabriquée par Rohm & Haas Co.) pour adsorber
SAM. On lave la colonne avec 400 ml d'acide chlorhydrique 0,0001N puis on la soumet à une élution fractionnée avec de l'acide chlorhydrique pour obtenir 640 ml d'une solution de SAM.
On fait passer un extrait contenant 1,06 g de SAM, obtenu de la même manière que dans liExemple 1, à travers une colonne garnie de 200 ml de Amberlite IRC-84 (type H+) (marque de fabrique d'une résine d'échange de cations faiblement acide fabriquée par Rohm & Haas Co.) pour adsorber
SAM. On lave la colonne avec 400 ml d'acide chlorhydrique 0,0001N puis on la soumet à une élution fractionnée avec de l'acide chlorhydrique pour obtenir 640 ml d'une solution de SAM.
La solution de SAM est ajustée à pH 4,8 avec
Amberlite IRA-45 (typeçOH ), une résine d'échange dlanions faiblement basique, puis on la fait passer à travers une colonne garnie de 1,5 litre de Amberlite XAD-7 (marque de fabrique d-'une résine synthétique adsorbante fabriquée par
Rohm & Haas Co.) pour adsorber SAM. On lave la colonne avec 2 litres d'acide acétique 0,0001N puis on la soumet à une élution fractionnée en faisant passer un solvant mixte composé d'acide chlorhydrique 0,1N et-d'acétone (à un rapport en volume de 1:0.,1) pour obtenir 1120 ml d'une solution de SAM.
Amberlite IRA-45 (typeçOH ), une résine d'échange dlanions faiblement basique, puis on la fait passer à travers une colonne garnie de 1,5 litre de Amberlite XAD-7 (marque de fabrique d-'une résine synthétique adsorbante fabriquée par
Rohm & Haas Co.) pour adsorber SAM. On lave la colonne avec 2 litres d'acide acétique 0,0001N puis on la soumet à une élution fractionnée en faisant passer un solvant mixte composé d'acide chlorhydrique 0,1N et-d'acétone (à un rapport en volume de 1:0.,1) pour obtenir 1120 ml d'une solution de SAM.
La so-lution de SAM est concentrée sous pression réduite jusqu'à ce que son volume total soit de 200 ml, puis on ajoute Amberlite IRA-45 (type OH ), une résine d'échange d'anions faiblement basique, pour ajuster le pH de la solution à 2,0. On sépare la résine par filtration par aspiration, et on concentre le filtrat sous pression réduite.
On lyophilise le concentré pour obtenir 1,19 g de chlorhydrate de SAM sous forme d'une poudre blanche. Ce produit présente une seule tache dans la chromatographie sur papier et la chromatographie en couche mince sur gel de silice.
Le rendement en SAM et son degré de-pureté sont indiqués sur le Tableau 1.
EXEMPLE 3
On fait passer un extrait contenant 0,98 g de SAM, obtenu de la même manière que dans l'Exemple 1, à travers une colonne garnie de 200 ml de Amberlite XAD-2 (marque de fabrique d'un adsorbant du type styrène/divinylbenzène fabrique par Rohm & Haas Co.) pour adsorber les matières étrangères. On ajoute de l'hydrogénocarbonate de potassium à la solution de SAM de laquelle les matières étrangères ont été éliminées comme ci-dessus, pour ajuster son- pH à 5,0.
On fait passer un extrait contenant 0,98 g de SAM, obtenu de la même manière que dans l'Exemple 1, à travers une colonne garnie de 200 ml de Amberlite XAD-2 (marque de fabrique d'un adsorbant du type styrène/divinylbenzène fabrique par Rohm & Haas Co.) pour adsorber les matières étrangères. On ajoute de l'hydrogénocarbonate de potassium à la solution de SAM de laquelle les matières étrangères ont été éliminées comme ci-dessus, pour ajuster son- pH à 5,0.
On sépare le précipité résultant de perchlorate de potassium en filtrant par aspiration.
On fait ensuite passer la solution de SAM à travers une colonne garnie de 200 ml de Amberlite RC-50 (type
H+), une résine d'échange de cations faiblement acide, pour adsorber SAM. On lave la colonne avec 400 ml d'acide acétique 0,0001N et la soumet à une élution fractionnée avec de l'acide sulfurique 0,1N pour obtenir 630 ml d'une solution de SAM.
H+), une résine d'échange de cations faiblement acide, pour adsorber SAM. On lave la colonne avec 400 ml d'acide acétique 0,0001N et la soumet à une élution fractionnée avec de l'acide sulfurique 0,1N pour obtenir 630 ml d'une solution de SAM.
On concentre la solution de SAM résultante sous pression réduite jusqu'à ce que son volume total soit de 200 ml, puis on ajoute 800 ml d'acétone pour obtenir un précipité de sulfate de SAM. off recueille le précipité en, le séparant par centrifugation, on le dissout dans une petite quantité d'eau, et on le lyophilise pour obtenir 1,50 g de sulfate de SAM sous forme d'une poudre blanche.
Ce produit présente une seule tache dans la chromatographie sur papier et la chromatographie en couche mince sur gel de silice.
Le rendement en SAM et son degré de pureté sont indiqués sur le Tableau 1.
EXEMPLE 4
On produit des cellules microbiennes contenant
SAM accumulé de la même manière que dans l'Exemple 1. On met en suspension 200 g des cellules microbiennes dans 1000 ml d'acide formique 0,1N. On chauffe la suspension à 60"C pendant 10 minutes, puis on la refroidit immediatement. On se- pare les cellules par centrifugation pour obtenir 1020 ml d'un extrait contenant 0,91 g de SAM.
On produit des cellules microbiennes contenant
SAM accumulé de la même manière que dans l'Exemple 1. On met en suspension 200 g des cellules microbiennes dans 1000 ml d'acide formique 0,1N. On chauffe la suspension à 60"C pendant 10 minutes, puis on la refroidit immediatement. On se- pare les cellules par centrifugation pour obtenir 1020 ml d'un extrait contenant 0,91 g de SAM.
On fait passer l'extrait à travers une colonne garnie de 200 ml de Amberlite XAD-8 (marque de fabrique d'un acrylate adsorbant fabriqué par Rohm & Haas Co.) pour adsorber les matières étrangères.
La solution de SAM débarrassée des matières étrangères comme ci-dessus est ajustée à pu .5,0 avec Amberlite
IRA-45 (type OH-), une résine d'échange d'anions faiblement basique, puis on la fait passer à travers une colonne garnie de 200 ml de Amberlite IRC-84 (type H+)9 une résine d'échange de cations faiblement acide, pour adsorber SAM.
IRA-45 (type OH-), une résine d'échange d'anions faiblement basique, puis on la fait passer à travers une colonne garnie de 200 ml de Amberlite IRC-84 (type H+)9 une résine d'échange de cations faiblement acide, pour adsorber SAM.
On lave la colonne avec 400 ml d'acide chlorhydrique 0,0001N, puis on la soumet à une élution fractionnée avec de l'acide chlorhydrique 0,2N pour obtenir 710 ml d'une solution de-SAM.
On ajoute Amberlite IRA-45 (type OH )v-une résine d'échange d'anions faiblement basique, à la solution de SAM pour ajuster son pH à 2,0. On sépare la résine par filtration par aspiration, et on concentre le filtrat sous pres- sion réduite, et on le lyophilise pour obtenir 1,01 g de chlorhydrate de SAM sous forme d'une poudre -blanche. Ce produit présente une seule tache dans la chromatograph e sur papier et la chromatographie en couche mince sur gel de silice.
Le rendement en SAM et son degré de pureté sont indiqués sur le Tableau 1.
EXEMPLE 5
On fait passer 630 ml d'une solution de SAM, obtenue par traitement avec l'adsorbant styrène/divinylbenzène et la résine d'échange de cations faiblement acide de type H de la même manière que dans l'Exemple 3,a travers une colonne garnie de 200 ml dgun adsorbant du type acrylate, Amberlite XAD-7, pour adsorber les matières étrangères.
On fait passer 630 ml d'une solution de SAM, obtenue par traitement avec l'adsorbant styrène/divinylbenzène et la résine d'échange de cations faiblement acide de type H de la même manière que dans l'Exemple 3,a travers une colonne garnie de 200 ml dgun adsorbant du type acrylate, Amberlite XAD-7, pour adsorber les matières étrangères.
La solution de SAM dont les matières étrangères ont été éliminées comme ci-dessus est concentrée sous pression réduite jusqu'à ce que son volume total soit de 200m1.
On ajoute ensuite 800 ml d'acétone pour former un précipité de sulfate de SAM. On recueille le précipité en le. séparant par centrifugation, on le dissout dans une petite quantité d'eau, et le lyophilise pour obtenir 1,46 g de sulfate de
SAM sous forme d'une poudre blanche. Ce produit présente une seule tache dans la chromatographie sur papier et la chromatographie en couche mince sur gel de silice.
SAM sous forme d'une poudre blanche. Ce produit présente une seule tache dans la chromatographie sur papier et la chromatographie en couche mince sur gel de silice.
Le rendement en SAM et son degré de pureté sont indiqués sur le Tableau 1.
Exemple Comparatif 1
On ajuste à 5,0 le pH de 950 g d'un extrait contenant Q;98 g de SAM, obtenu de la même manière que dans l'Exemple 1, avec de l'hydrogénocarbonate de potassium.
On ajuste à 5,0 le pH de 950 g d'un extrait contenant Q;98 g de SAM, obtenu de la même manière que dans l'Exemple 1, avec de l'hydrogénocarbonate de potassium.
On sépare le précipité résultant de perchlorate de potassium par filtration par aspiration pour obtenir un liquide contenant SAM.
On fait passer le liquide contenant SAM à travers une colonne garnie de 200 ml de Amberlite IRC-50 (type H) une résine d'échange de cations faiblement acide, pour adsorber SAM. On lave la colonne avec 400 mî d'acide acétique 0,0001N, puis on la soumet à une élution fractionnée avec de l'acide sulfurique 0,1N pour obtenir 610 ml d'une solution de SAM.
On fait passer la solution de S M à travers une colonne garnie de 200 ml de carbone actif chromatographique.
On lave lacolonne avec 600 ml d'acide sulfurique 0,2N, puis on la soumet à une élution fractionnée avec un solvant mixte se composant d'acide sulfurique 1,GN et de méthanol (1:1 en volume) pour obtenir une solution de SAN.
On concentre la solution de SAM sous pression réduite jusqu'à ce que son volume total -soit de 200 ml.
On ajoute 800 ml d'acétone pour obtenir un précipité de sulfate de SAM. On recueille le précipité par séparation par centrifugation, on le dissout dans une petite quantité d'eau, et le lyophilise pour obtenir 1,28 g de sulfate de
SAM sous forme d'une poudre blanche. Ce produit présente une seule tache dans la chromatographie sur papier et la chromatographie en couche mince sur gel de silice.
SAM sous forme d'une poudre blanche. Ce produit présente une seule tache dans la chromatographie sur papier et la chromatographie en couche mince sur gel de silice.
Le rendement en SAM et son degré de pureté sont indiqués sur le Tableau 1.
Exemple Comparatif 2
On répète Exemple 1 à la-différence qu'on n'effectue que le traitement avec Amberlite IRC-50 (type H+) comme traitement de purification.
On répète Exemple 1 à la-différence qu'on n'effectue que le traitement avec Amberlite IRC-50 (type H+) comme traitement de purification.
Les résultats sont indiqués sur le Tableau 1.
Tableau 1
Pureté Réaction Quantité de Rendement
de SAM à la mé.thylthio- en SAM
(7) ninhydrine adénosine (%)
(*1) avec des (%) (*3)
matières
autres que
SAM (*2)
Ex. 1 98,1 - 0,08 89
Ex. 2 98,0 . - 0,1 90
Ex. 3 98,0 - 0,1 90
Ex. 4 98,1 - 0,08 90
Ex. 5 98,5 - å 0,05 88
à 0,05
Ex. Comp. 1 97,6 - 0,4 77
Ex. Comp. 2 56,7 ++ 1,8 90
"Ex." signifie Exemple, et "Ex. Comp." signifie
Exemple Comparatif.
Pureté Réaction Quantité de Rendement
de SAM à la mé.thylthio- en SAM
(7) ninhydrine adénosine (%)
(*1) avec des (%) (*3)
matières
autres que
SAM (*2)
Ex. 1 98,1 - 0,08 89
Ex. 2 98,0 . - 0,1 90
Ex. 3 98,0 - 0,1 90
Ex. 4 98,1 - 0,08 90
Ex. 5 98,5 - å 0,05 88
à 0,05
Ex. Comp. 1 97,6 - 0,4 77
Ex. Comp. 2 56,7 ++ 1,8 90
"Ex." signifie Exemple, et "Ex. Comp." signifie
Exemple Comparatif.
(*1) : La pureté de SAM est mesurée par chromatographie bidimensionnelle sur papier.
(*2) : La réaction à la ninhydrine avec des matières autres que SAM est déterminée de la façon suivante
Un échantillon est développé par chromatographie bidimensionnelle en couche mince de cellulose, et la présence de taches autres qu'une tache de SAM qui sont détectées par la formation de couleur à La ninhydrine est mesurée et estimée d'après la méthode suivante à trois graduations.
Un échantillon est développé par chromatographie bidimensionnelle en couche mince de cellulose, et la présence de taches autres qu'une tache de SAM qui sont détectées par la formation de couleur à La ninhydrine est mesurée et estimée d'après la méthode suivante à trois graduations.
- : Néant
+ : Présence légère
++: Présence considérable
(*3) : La quantité de méthylthioadénosine est mesurée par chromatographie bidimensionnelle sur papier.
+ : Présence légère
++: Présence considérable
(*3) : La quantité de méthylthioadénosine est mesurée par chromatographie bidimensionnelle sur papier.
Les résultats ci-dessus montrent clairement que grâce au procédé de la présente invention, on peut obtenir
SAM de plus grande pureté en un rendement plus élevé que dans les procédés connus.
SAM de plus grande pureté en un rendement plus élevé que dans les procédés connus.
Claims (10)
1. Procédé de purification de S-adénosyl-L-méthionine caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre un liquide contenant la S-adénosyl-L-méthionine brute à un processus de purification, ce processus étant un processus de purification en série comprenant, dans un- ordre désiré quelconque, (A) au moins une étape de traitement dudit liquide avec une résine d'échange de cations faiblement acide du type H+ et (B) au moins une étape de traitement dudit liquide avec une résine synthétique pareuse adsorbante
2.Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape (A) comprend la mise en contact du liquide contenant la S-adénosyl-L méthionine brute et ayant un pH de 3,5 à 6,5 avec ladite tésine d'échange de cations pour adsorber sur la résine la S-adénosy1-L-méthionine que contient le liquide, puis à soumettre la S-adénosyl-
L-méthionine à une élution fractionnée pour la séparer de ladite résine d'échange de cations en utilisant une solution aqueuse d'un acide 'ayant un pH ne dépassant pas 3,0.
3. Procédé selon la revendication 18 caractérisé en ce que l'étape (B) comprend la mise en contact du liquide contenant. la S-adénosyl-L-méthionine brute et ayant un pH ne dépassant pas 6,5, avec ladite résine synthétique adsorbante de manière à adsorber les matières étrangères contenues dans le liquide sur l'adsorbant.,
4.Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape (B) comprend la mise en contact du liquide contenant la S-adénosyl-L-méthionine brute et ayant un pH ne dépassant pas 6,5 avec ladite résine synthétique- adsor- bante de manière à faire adsorber à la fois la S-adénosyl
L-méthionine et les matières étrangères du liquide sur laadsorbant, puis à soumettre à une élution fractionnée la S-adénosyl-L-methionine pour la séparer de la résine synthétique adsorbante en utilisant une solution aqueuse d'un acide ayant un pH ne dépassant pas 3,5.
5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le processus de purification comprend l'étape (A > et l'étape (B), dans cet ordre.
6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le processus de purification comprend l'étape (A), l'étape (B) et l'étape (A), dans cet ordre.
7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le processus de purification comprend l'étape (B) et l'étape (A), dans cet ordre.
8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le processus de purification comprend l'étape (B),- l'étape (A) et l'étape (B)1 dans cet ordre.
9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'étape (B) comprend la mise en contact du liquide contenant la S-adénosyl-L-méthionine brute et ayant un pH ne dépassant pas 6,5 avec la résine synthétique adsorbante de manière à n'adsorber que les matières étrangères du liquide sur l'adsorbant.
10 Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la premiere étape (B) comprend la mise en contact du liquide contenant la S-adénosyl-L-méthionine brute et ayant un rH ne dépassant pas 6,5 avec la résine synthétique adsorbante de manière à ne faire adsorber sur l'adsorbant que les matières étrangères contenues dans le liquide.
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| JP57139948A JPS5929700A (ja) | 1982-08-13 | 1982-08-13 | Ｓ−アデノシル−ｌ−メチオニンの精製法 |
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