FR2573080A1 - Inositol-triphosphate - Google Patents

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Abstract

INOSITOL-TRIPHOSPHATE (IP) CHOISI PARMI LE GROUPE FORME PAR LE D-MYO-INOSITOL-1,2,6-TRIPHOSPHATE, LE D-MYO-INOSITOL-1,2,5-TRIPHOSPHATE, LE L-MYO-INOSITOL-1,3,4-TRIPHOSPHATE ET LE MYO-INOSITOL-1,2,3-TRIPHOSPHATE, PROCEDE POUR LE PRODUIRE, ET COMPOSITION EN COMPRENANT.

Description

2S73080
INOSITOL-TRIPHOSPHATE
La présente invention concerne un inositol-
triphosphate spécial (IP3), un procédé de sa production, et
une composition le contenant.
Déjà en 1900, différents chercheurs avaient décrit la découverte de l'acide phytinique, composé organique
phosphaté, c'est-à-dire le 1,2,3,4,5,6-hexakis (dihydrogéno-
phosphate) myo-inositol (qu'on appelle encore parfois l'acide inositohexaphosphorique) dans les plantes. La teneur des
différentes plantes en acide phytinique varie considérable-
ment. La teneur des grains est habituellement d'environ 0,5-2 %, avec quelques exceptions. Le riz glacé a une teneur de seulement 0,1 %, tandis que le riz sauvage contient 2,2 % d'acide phytinique. Les haricots en contiennent environ 0,4-2 %, les plantes oléagineuses environ de 2-5 %, et le pollen, de 0,3-2 %. La teneur en acide phytinique de la plante varie durant le temps de croissance. La teneur est
aussi influencée par le climat, entre autres.
Il y a dans la littérature des rapports sur la
présence de l'inositol-pentaphosphate (IP5) et de l'inositol-
tétraphosphate (IP4) dans quelques plantes. On sait de plus que les dérivés phosphatés inférieurs à IP6 se forment à la germination des graines. Par exemple, les produits finaux à la germination sont l'inositol et le phosphate. L'emploi
de IP6 a été décrit dans plusieurs publications scientifi-
ques. La majorité des auteurs de ces articles ont observé plusieurs effets négatifs chez les humains et les animaux,
liés à la consommation de IP6 ou de substances contenant IP6.
Alimenter des chiens avec une nourriture contenant trop de IP6 cause par exemple du rachitisme. Chez les humains, on a observé un manque de zinc, et en conséquence une croissance
plus lente des enfants. On a observé une anémie, principale-
ment chez les femmes. A cause des effets négatifs mentionnés
ci-dessus sur le bilan minéral chez les humains et les ani-
maux, on a tenté jusqu'à présent de réduire au minimum la
prise de IP6 et de ses dérivés.
En outre, on sait, par exemple par Bull. Sté.
Chim. Biol. 36,9 (1956) p. 85, hydrolyser l'acide phytinique S avec de l'acide chlorhydrique dilué à une température élevée pour obtenir un mélange d'inositol-phosphates inférieurs, c'est-à-dire de IPS, IP4, IP3, IP2 (inositol-diphosphate) et
de IP1 (inositol-monophosphate). Chacun de ces inositol-
phosphates peut exister sous la forme de nombreux isomères.
On peut attendre jusqu'à 20 isomères pour IP3.
Un isomère spécifique de IP3, le D-myo-inositol-
1,4,5-triphosphate, a été décrit dans Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, 2 (1984), page 481. Ce composé est connu comme agent de mobilisation intracellulaire du calcium dans le corps humain, et on peut facilement l'isoler à partir des
membranes cellulaires.
On ne sait rien des propriétés de n'importe quel
autre des isomères spécifiques des différents inositol-
triphosphates sous forme pure. Ainsi, il est assez difficile de séparer le grand nombre d'isomères de IP3 les uns des autres, et par suite d'identifier et de définir la formule structurale de chaque isomère et ses propriétés. Jusqu'à
présent, on ne connaît aucun procédé de production ou d'ob-
tention d'un quelconque isomère isolé de IP3 autre que le susdit D-myoinositol-1,4,5-triphosphate. De plus, dans un
procédé de production de IP3 qui implique un système d'hydro-
lyse, un ré-arrangement des isomères et/ou une déphospho-
rylation plus poussée en IP2, IP1 ou l'inositol doivent être
considérés comme des problèmes particuliers.
A cause des difficultés mentionnées ci-dessus, il n'y a pas de données sur les isomères spécifiques de IP3
sous forme pratiquement pure autre que le susdit D-myo-
inositol-1,4,5-triphosphate. Selon la présente invention, et de façon tout à
fait inattendue, on a pu résoudre le problème mentionné ci-
dessus de la séparation de certains isomères différents de
IP3 les uns des autres, et de les produire sous forme prati-
quement pure. Les isomères de IP3 peuvent être obtenus sous
la forme d'un sel ou d'un acide. La forme de sel est préfé-
rée, puisqu'elle est plus facile à produire sous forme
concentrée et pure que celle d'acide.
Selon la présente invention, un inositol-
triphosphate (IP3), choisi parmi le groupe constitué par le
D-myo-inositol-1,2,6-triphosphate, le D-myo-inositol-1,2,5-
triphosphate, le L-myo-inositol-1,3,4-triphosphate et le myo-inositol-1,2, 3-triphosphate, sous forme d'acide ou de
sel, est produit et isolé sous forme pratiquement pure.
Comme mentionné ci-dessus, les isomères IP3 indi-
vidualisés peuvent être obtenus sous forme de sel ou d'acide.
Sous ces deux formes, ils peuvent, pour la première fois,
être obtenus sous forme pratiquement pure.
Le IP3 sous forme acide est généralement fourni sous la forme d'une solution aqueuse. Dans un tel cas, la concentration de l'acide peut être de 10 à 45, de préférence de 15 à 45, et encore mieux de 20 à 45 % en poids du poids
total de la solution.
On peut facilement obtenir la forme du sel de l'isomère IP3 à partir de la forme acide en utilisant des modes opératoires standard. Ainsi, on peut préparer des sels tels que les sels de métaux alcalins et les sels de métaux alcalino-terreux, par exemple de lithium, de sodium, de potassium, de calcium ou de magnésium. Cependant, les sels d'aluminium, de zinc et de fer, sont eux aussi très utiles, ainsi que les sels d'ammonium et d'amine organique. De plus, des sels mixtes contenant différents cations peuvent être utilisés. Des exemples d'amines sont la triéthanolamine,
la diéthanolamine, la triisopropanolamine, le N;N-diméthyl-
2-amino-2-méthyl-1-propanol, la N,N-diméthyl-éthanolamine, la tétrabutylamine et la cyclohexylamine. D'autres sels peuvent aussi 8tre utiles. Sont spécialement préférés les
sels qui sont physiologiquement acceptables.
Pour produire le ou les isomères de IP3 selon l'invention, on peut utiliser comme matériaux de départ un ou plus des composés IP6, IP5 ou IP4, ou bien un produit naturel contenant au moins l'un de ces composés. Dans les cas o le matériau de départ est un produit naturel, on en choisit de préférence un qui contient
au moins 0,3 %, de préférence au moins 1 %, d'inositol-
phosphate (IP6 + IP5 + IP4).
Des produits particulièrement convenables sont
les graines, en particulier le son, les pollens, les hari-
cots et les plantes oléagineuses. Ces produits contiennent
tous du IP6.
On croit théoriquement que les isomères de IP3 peuvent être produits par les techniques suivantes, par
exemple:
1) dégradation enzymatique à partir de IP4, IP5 et/ou IP6.
2) hydrolyse chimique à partir de IP4, IP5 et/ou IP6.
3) synthèse chimique à partir de, par exemple, l'inositol,
IP1, IP2 et de phosphate.
4) synthèse enzymatique à partir de, par exemple, l'inositol,
IP1, IP2 et un phosphate.
) production microbiologique (comprenant également les
techniques de ADN hybride).
6) migration chimique ou enzymatique de l'inositol-phosphate ou hydrolyse chimique ou enzymatique d'inositol-phosphate substitué. Une combinaison de deux ou plus des procédés mentionnés ci-dessus peut aussi être possible. Cependant, beaucoup de ces procédés ne produisent que des mélanges d'un certain nombre d'isomères qui sont au mieux extrêmement
difficiles à séparer en isomères individualisés, si toute-
fois on peut les séparer.
Selon l'invention, on préfère un procédé dans lequel on utilise un matériau contenant IP6, comme on l'a
mentionné auparavant. Puis IP6 est dégradé par voie enzyma-
tique en IP3, à l'aide de l'enzyme phytase. L'enzyme phytase est normalement présente dans toutes les plantes et graines contenant de l'inositol-phosphate. C'est pourquoi, selon l'invention, il n'est habituellement pas nécessaire d'ajouter d'enzyme si on utilise un produit naturel comme matériau de départ. Dans les cas o le produit naturel a une activité
enzymatique trop basse ou bien quand on utilise comme maté-
riau de départ IP6, IP5, ou IP4, ou bien un mélange de ceux-
ci, on ajoute une enzyme phytase provenant du son, par
exemple.
L'enzyme phytase provenant de plantes, de graines, et de micro-organismes, a l'effet surprenant de rendre possible, selon l'invention, la production des isomères IP3 spécifiques mentionnés ci-dessus en forte concentration et
sous forme pratiquement pure.
Le IP6 peut être fourni soit sous forme de maté-
riau pur, soit sous forme d'un produit source contenant du IP6. Une manière convenable de traiter un matériau de départ
naturel contenant IP6, par exemple le son, est de le pré-
traiter, par exemple par dégradation ou élimination de la membrane extérieure, et élimination des constituants non désirés. Ensuite, on trempe le matériau dans l'eau afin de rendre l'inositol-phosphate disponible pour la dégradation et d'activer l'enzyme. Quand de l'enzyme supplémentaire est nécessaire, elle peut être ajoutée à cette étape ou à une étape ultérieure. On laisse ensuite agir l'enzyme pendant aussi longtemps que nécessaire pour que soit atteint le degré
désiré d'hydrolyse.
L'hydrolyse a lieu à une température convenable, habituellement de 2070 C, de préférence de 30-60 C, et à un pH de 4 à 8. Afin d'arrêter l'hydrolyse au niveau désiré, l'enzyme peut être détruite ou inactivée, par exemple par un rapide chauffage du matériau de départ hydrolysé. Afin de donner au matériau une forme stable au stockage, on peut
convenablement le lyophiliser.
L'invention concerne spécialement un procédé de production d'un inositoltriphosphate (IP3) choisi parmi le groupe constitué par le D-myo-inositol1,2,6-triphosphate,
le D-myo-inositol-1,2,5-triphosphate, le L-myo-inositol-
1,3,4-triphosphate et le myo-inositol-1,2,3-triphosphate,
sous forme d'acide ou de sel, dans lequel un matériau conte-
nant IP6 est mis à l'incubateur à une température comprise entre 20 et 70 C, de préférence comprise entre 30 et 50 C, et à un pH de 4 à 8, avec de la phytase jusqu'à ce que soit accomplie la libération d'environ 30-60 %, habituellement environ 50 %, du phosphore total de l'ester. Audit stade, une forte proportion de l'isomère IP3 ou des isomères IP3
désirés s'est formée par hydrolyse du matériau contenant IP6.
On peut ensuite séparer le mélange d'inositol-
phosphates obtenu par chromatographie sur colonne afin d'isoler la fraction contenant IP3. En cas de séparation chromatographique, ladite fraction est ensuite éventuellement
soumise à une autre séparation chromatographique, de préfé-
rence dans une colonne. Une telle séparation peut présenter
des avantages si la fraction contient plus d'un isomère IP3.
Le ou les isomères IP3 sont ensuite de préférence isolés sous forme acide. En ajoutant une base à l'acide, on peut
obtenir, si on le désire, IP3 sous forme de sel.
Parmi les nombreuses sources de phytase utile selon l'invention, on préfère la levure, et encore plus la
levure de boulanger. La levure de boulanger suédoise, pro-
duite par Jâstbolaget, en Suède, ainsi que la levure de boulanger produite par Rajamâki, en Finlande, et par Hefefabriken AG, en Suisse, ont par exemple été utilisées selon la présente invention. On a établi que, de façon très surprenante, quand on utilise une telle levure, on
n'obtient pratiquement qu'un seul isomère, le D-myo-inositol-
1,2,6-triphosphate. Bien sûr, l'utilisation de levure est un procédé très intéressant quand seul ledit isomère est désiré. Dans l'état actuel des connaissances, aucune autre méthode ne fournit un produit constitué d'un seul isomère. On obtient habituellement un mélange d'un grand
nombre d'isomères.
Le procédé mentionné ci-dessus, avec les modifi-
cations appropriées, peut aussi être utilisé quand on utilise comme matériau de départ un ou plusieurs des composés IP6,
IP5 ou IP4 eux-mêmes.
Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne également une composition d'inositol-phosphate, constituée de D-myo-inositol-1,2,6triphosphate, et d'au
moins l'un des D-myo-inositol-1,2,5-triphosphate, L-myo-
inositol-1,3,4-triphosphate et myo-inositol-1,2,3-triphos-
phate, sous forme d'acide ou de sel. La composition contient habituellement 20-99,5, de préférence 30-99,5 % en
poids dudit IP3. La teneur en D-myo-inositol-1,2,6-triphos-
phate se trouve dans le domaine allant de 50-100 % en poids,
sur la base de la teneur totale en lesdits inositol-
triphosphates, le reste comprenant les inositol-phosphates
autres que IP3.
Quelquefois, il peut être préférable que dans la
composition, le IP3 consiste essentiellement en du D-myo-
inositol-1,2,6-triphosphate seul.
En plus de IP3, le reste de la composition
d'inositol-phosphate peut contenir également des inositol-
tétraphosphates (IP4) et des inositol-diphosphates (IP2).
La composition peut comprendre 20-99,5 %, de préférence plus de 60 %, en poids de IP3,et 80-0,5 %,
de préférence moins de 40 %, en poids d'autres inositol-
phosphates. 40-85 %, de préférence 50-85 %, en poids desdits autres inositol-phosphates doivent ensuite être constitués de IP2 et de IP4. Il peut 8tre préférable que
IP3 soit constitué essentiellement par du D-myo-inositol-
1,2,6-triphosphate. La composition contient quelquefois des quantités mineures, par exemple moins de 10 %, de préférence 1-8 %, en poids de un ou plusieurs IP1 et IP6, calculés sur la base
de la teneur totale en inositol-phosphates de la composition.
On peut préparer de tels types de compositions
en enrichissant le produit d'inositol-phosphate de fermenta-
tion initiale par addition du D-myo-inositol-1,2,6-triphos-
phate jusqu'à obtenir la concentration finale désirée dudit isomère dans la composition. De telles méthodes sont bien connues dans le domaine et consistent par exemple en un
simple mélange mécanique. D'une autre façon, cette composi-
tion peut être produite directement par fermentation en uti-
lisant de la levure, spécialement de la levure de boulanger, comme source de phytase. Comme on l'a précédemment indiqué, l'emploi de levure de boulanger a pour résultat la production presque exclusive de D-myoinositol-1,2,6-triphosphate,
c'est-à-dire que presque toute la fraction de IP3 est cons-
tituée de D-myo-inositol-1,2,6-triphosphate.
L'inositol-triphosphate sous forme d'acide ou de sel selon l'invention peut être employé comme médicament ou
comme produit alimentaire, éventuellement sous forme d'adju-
vant ou comme stabilisant pour divers produits. En outre, IP3 peut exercer un effet protecteur sur les semences. On peut aussi l'employer comme adjuvant pour une pâte dentifrice, comme agent inhibiteur de corrosion dans les peintures, les laques, les huiles lubrifiantes, et en traitement de surface des métaux, comme composant dans un agent d'assainissement, comme agent ignifuge, pour des applications lithographiques, pour l'inhibition de la production par exemple d'aflatoxine dans les micro-organismes, et pour une modification ou une augmentation de l'activité enzymatique de l'amylase, par
exemple.
La composition d'inositol-phosphate, produite soit directement par fermentation, soit par enrichissement,
comme décrit précédemment, est utile dans toutes les appli-
cations mentionnées ci-dessus.
Les isomères de IP3 mentionnés ci-dessus ont les formules suivantes: le Dmyo-inositol-1,2,6-triphosphate de formule njn. X + o X est l'hydrogène, au moins un cation univalent, divalent ou multivalent, ou un mélange de ceux-ci, n est le nombre d'ions, et z est la charge des ions respectifs;
le D-myo-inositol-1,2,5-triphosphate de formule.
uP3 o X, n et z ont les significations mentionnées ci-dessus; le myoinositol-1,2,3-triphosphate de formule a2a- upu3- n.Xz o X, n et z ont les significations mentionnées ci-dessus; et le L-myo-inositol-1,3,4triphosphate de formule
OH ( OPO 2- OH
OH 3 n3 OH 2 o X, n et z ont les significations mentionnées ci-dessus; Dans chacune des formules ci-dessus, n est compris entre 6 et 1 inclusivement, et z est compris entre 1 et 6 inclusivement. De préférence, n est compris entre 3 et 6
inclusivement et z est 3, 2 ou 1.
Les.nouveaux isomères de IP3 de la présente invention sont particulièrement efficaces dans l'utilisation thérapeutique citée cidessus, et ils sont pratiquement dénués de tous effets secondaires indésirables dans cet emploi. En particulier, le D-myo-inositol-1,2,6triphosphate est particulièrement efficace, et il présente un degré
d'activité supérieur par comparaison avec les autres iso-
mères, spécialement le D-myo-inositol-1,4,5-triphosphate.
Les complexes formés par le D-myo-inositol-1,2,6-triphosphate avec le cadmium sont considérablement plus stables que les
complexes du cadmium formés par, par exemple, le D-myo-
inositol-1,4,5-triphosphate. Dans une moindre mesure, le
D-myo-inositol-1,2,5-triphosphate, le L-myo-inositol-1,3,4-
triphosphate et le myo-inositol-1,2,3-triphosphate, sont aussi plus souhaitables pour l'emploi thérapeutique que le D-myo-inositol-1,4,5triphosphate pour un grand nombre des
mêmes raisons.
L'invention sera expliquée de façon plus appro-
fondie en liaison avec les exemples de réalisation ci-dessous et les figures et tableaux joints. Les exemples 1 et 2 montrent une hydrolysedu phytate de sodium avec la phytase
de blé et le fractionnement d'un mélange d'inositol-phos-
phates. Les exemples 3 et 4 concernent la détermination de la structure des isomères de IP3. L'exemple 5 illustre la détermination des valeurs de pKa de IP3. L'exemple 6 montre la détermination des constantes relatives de liaison pour IP3 avec Ca, Zn, et Cd, respectivement. Les exemples 7-10 concernent des modes opératoires de traitement des sels de calcium des isomères de IP3 de l'invention. L'exemple 11
illustre le spectre infrarouge du sel de calcium du D-myo-
inositol-1,2,6-triphosphates. Les exemples 12 et 13 montrent une hydrolyse du phytate de sodium avec du son de blé, et le fractionnement d'un mélange des inositol-phosphates
obtenus. L'exemple 14 concerne un mode opératoire de traite-
ment du sel de zinc du D-myo-inositol-1,2,6-triphosphate.
Les exemples 15-17 montrent l'hydrolyse du phytate de-sodium avec de la levure de boulanger, le fractionnement du mélange d'inositol-phosphates obtenu, et la détermination de l'isomère
isolé de IP3 obtenu.
L'exemple 18 illustre un mode opératoire de trai-
tement du sel de sodium du D-myo-inositol-1,2,6-triphosphate.
L'exemple 19 montre une hydrolyse chimique du phytate de sodium avec l'acide chlorhydrique, et le fractionnement du mélange d'inositol9phosphates obtenu. L'exemple 21 concerne la synthèse chimique d'inositol-phosphates, à partir d'acide polyphosphorique et de myoinositol, et la détermination structurale de IP3 par RMN-H. L'exemple 21 montre l'hydrolyse de l'acide phytique dans le son de riz, l'extraction et l'analyse des inositol-phosphates obtenus. L'exemple 22
concerne la caractérisation de différents sels de D-myo-
S inositol-1,2,6-triphosphate. L'exemple 23 montre que IP3 prévient l'augmentation de l'agrégation des plaquettes dans les humains provoquée par le fait de fumer. Dans l'exemple 24, on montre qu'une glycémie accrue chez les souris, provoquée
par des radicaux libres, peut être contrecarrée par l'injec-
tion de IP3.
Exemplet
Hydrolyse du phytate de sodium avec la phytase
de blé, et fractionnement d'un mélange d'inositol-phosphates.
Une quantité de 1,6 g de phytate de sodium (provenant de mais, Sigma Chemical Co) est dissoute dans 650 ml de tampon d'acétate de sodium, à pH 5,2. On y ajoute 2,7 g de phytase de blé (EC 3.1.3.26, 0,015 U/mg, Sigma
Chemical Co), et le mélange est mis à l'incubateur à 38 C.
La déphosphorylation est suivie de la détermination du phosphore inorganique libéré. Après 3 heures, quand 50 % du phosphore inorganique est libéré, on arrête l'hydrolyse en ajoutant 30 ml d'ammoniac à pH 12. On obtient un mélange
liquide contenant les inositol-phosphates.
- On fait passer 350 ml du mélange sur une colonne échangeuse d'ions (Dowex 1, forme chlorure, 25 mm x 250 mm), et on élue avec un gradient linéaire d'acide chlorhydrique
(0-0,7 N HCl). On hydrolyse complètement des parties ali-
quotes des fractions éluées afin de déterminer les teneurs
en phosphore et en inositol. La figure 1 montre les varia-
tions de la quantité de phosphore en fonction du volume élué. Les pics correspondent à différents inositol-phosphates, c'est-à-dire qu'un pic présentant un rapport du phosphore
à l'inositol de trois à un correspond à l'inositol-triphos-
phate, etc. On obtient deux fractions présentant. un rapport
du phosphore à l'inositol de trois à un.
Exemple 2
Fractionnement des inositol-triphosphates.
On neutralise 100 ml de la première fraction obtenue dans l'exemple 18 présentant un rapport phosphore/ inositol de trois/un et on précipite à l'état de sel de baryum, après addition, en excès de 10 %, d'une solution d'acétate de baryum 0,1 M. On dissout 600 mg du sel précipité dans 50 ml d'acide chlorhydrique dilué. On sépare la solution sur une colonne échangeuse d'ions (Dowex 1, forme chlorure, 25 mm x 2500 mm) avec de l'acide chlorhydrique dilué comme éluant. On analyse des parties aliquotes des fractions éluées pour en déterminer la teneur en phosphore. La figure 2
indique les variations de la quantité de phosphore en fonc-
tion du volume élué. On peut voir sur la figure trois pics
constitués par les inositol-triphosphates isomères.
E3xemple 3
Détermination de la structure des inositol-
triphosphates isomères par RMN-H.
Les trois pics obtenus dans l'exemple 2 sont analysés par RMN-H. Les spectres sont représentés sur la figure 3 a, b et c. Les données montrent que les pics sont constitués par le myo-inositol-1,2,6-triphosphate, le
myo-inositol-1,2,3-triphosphate et le myo-inositol-1,3,4-
triphosphate, respectivement.
La seconde fraction obtenue dans l'exemple 1 et présentant un rapport phosphore/inositol de trois/un est
analysée par RMN-H. Le spectre est représenté sur la figure 4.
Les données montrent que cette fraction est constituée par du myoinositol-1,2,5-triphosphate. Dans cet exemple de réalisation, ainsi que dans tous les exemples suivants o
l'on utilise la RMN-H, l'appareil de RMN-H est un spectro-
mètre Nicolet 360 WB. Le standard interne est du tétra-
méthylsilane.
Exemple_4
Détermination des isomères optiques des inositol-
triphosphates. mg des composés déterminés par RMN-H selon l'exemple 3 comme étant le myo-inositol-1,2,6-triphosphate
et le myo-inositol-1,3,4-triphosphate sont encore chromato-
graphiés sur une colonne chirale à base de cellulose acétylée (20 mm x 300 mm, Merck), avec un mélange d'éthanol et d'eau
comme éluant. On analyse les fractions avec un polarimètre.
Comme on peut le voir sur la figure 5, chaque composé con-
siste en un isomère optique, le D-myo-inositol-1,2,6-tri-
phosphate et le L-myo-inositol-1,3,4-triphosphate, respec-
tivement. Exm]ple 5
Détermination des valeurs de pKa pour des inositol-
triphosphates. Une quantité de 10 ml de la première fraction obtenue dans l'exemple 1 présentant un rapport phosphore/ inositol de trois/un est dosée avec NaOH O,O1 M. On mesure avec une électrode le pH au cours du dosage. La figure 6 représente les variations de pH en fonction du volume de NaOH. On obtient les-valeurs suivantes de pKa: pKal = 4,7
pKa2 = 7,5.
Exemple 6
Détermination des constantes relatives de forma-
tion de complexes entre les inositol-triphosphates et le
calcium, le zinc et le cadmium, respectivement.
Une quantité de 10 ml de la première fraction obtenue dans l'exemple 1 présentant un rapport phosphore/ inositol de trois/un, est dosée avec NaOH 0,01 M en présence de 0,2 mM d'ions calcium, d'ions zinc et d'ions cadmium, respectivement. Une tendance plus grande à la formation d'un complexe entre le métal et l'inositol-triphosphate a pour résultat l'abaissement de la valeur de pH pour un certain volume de NaOH ajouté. Comme on peut le voir sur la figure 7, les constantes de formation de complexes entre un métal et IP3 augmentent dans l'ordre suivant: Ca < Zn < Cd
Exemple_7
Procédé de préparation du sel de calcium du D-myo-inositol-1,2,6triphosphate.
ml de la fraction contenant le D-myo-inositol-
* 1,2,6-triphosphate obtenu dans l'exemple 2 sont neutralisés
à un pH d'environ 7 avec une solution aqueuse de Ca(OH)2.
Le sel de calcium est précipité par addition de 100 ml d'éthanol. Le précipité est centrifugé, recristallisé, et
séché sous vide.
La structure du sel de calcium purifié du D-myo-
inositol-1,2,6-triphosphate obtenu est confirmée par analyse
par RMN-H.
Le sel de calcium du D-myo-inositol-1,2,6-tri-
phosphate recristallisé ci-dessus est aussi analysé chimi-
quement pour déterminer la teneur en carbone, en phosphore,
en oxygène, et en calcium. Le tableau i indique les résul-
tats. La formule du sel est Ca3IP3.
Exemple-8-
Procédé de préparation du sel de calcium du L-myo-inositol-1,3,4triphosphate.
ml de la fraction contenant le L-myo-inositol-
30.1,3,4-triphosphate obtenu dans l'exemple 2 sont neutralisés
à un pH d'environ 7 avec une solution aqueuse de Ca(OH)2.
Le sel de calcium est précipité par addition de 100 ml d'éthanol. Le précipité est centrifugé, recristallisé, et
séché sous vide.
La structure du sel de calcium purifié du L-myo-
inositol-1,3,4-triphosphate obtenu est confirmée par analyse par RMN-H.
Le sel de calcium du L-myo-inositol-1,3,4-tri-
phosphate recristallisé ci-dessus est aussi analysé chimi-
quement pour déterminer la teneur en carbone, en phosphore,
en oxygène, et en calcium. Le tableau 1 indique les résul-
tats. La formule du sel est Ca3IP3.
Exemple 9
Procédé de préparation du sel de calcium du myo-inositol-1,2,3triphosphate.
ml de la fraction contenant le myo-inositol-
1,2,3-triphosphate obtenu dans l'exemple 2 sont neutralisés
à un pH d'environ 7 avec une solution aqueuse de Ca(OH)2.
Le sel de calcium est précipité par addition de 100 ml d'éthanol. Le précipité est centrifugé, recristallisé, et
séché sous vide.
La structure du sel de calcium purifié du myo-
inositol-1,2,3-triphosphate obtenu est confirmée par analyse
par RMN-H.
Le sel de calcium du myo-inositol-1,2,3-tri-
phosphate recristallisé ci-dessus est aussi analysé chimi-
quement pour déterminer la teneur en carbone, en phosphore,
en oxygène, et en calcium. Le tableau 1 indique les résul-
tats. La formule du sel est Ca3IP3.
Exemple 10
Procédé de préparation du sel de calcium duD-myo-inositol-1,2,5-triphosphate.
ml de la fraction contenant le D-myo-inositol-
1,2,5-triphosphate obtenu dans l'exemple 2 sont neutralisés
à un pH d'environ 7 avec une solution aqueuse de Ca(OH)2.
Le sel de calcium est précipité par addition de 100 ml d'éthanol. Le précipité est centrifugé, recristallisé, et
séché sous vide.
La structure de sel de calcium purifié du D-myo-
inositol-1,2,5-triphosphate obtenu est confirmée par analyse
par RMN-H.
Le sel de calcium du D-myo-inositol-1,2,5-tri-
phosphate recristallisé ci-dessus est aussi analysé chimi-
quement pour déterminer la teneur en carbone, en phosphore,
en oxygène, et en calcium. Le tableau 1 indique les résul-
tats. La formule du sel est Ca3IP3.
Exemp le 11 Spectre infrarouge (IR) du sel de calcium du D-myo-inositol-1, 2,6-triphosphate.
Le sel de calcium purifié du D-myo-inositol-1,2,6-
triphosphate obtenu dans l'exemple 7 est analysé par IR.
Les bandes caractéristiques sont: 3500 cm 1 - OH 2900 cm 1 - CH 1600 cm 1 _ OH 1100 cm - C-O et -P 1000 cm1 - C-O et -P 800 cm - C-C Exemle 1212 Hydrolyse du phytate de sodium avec du son de blé,
et fractionnement d'un mélange d'inositol-phosphates.
Une quantité de 10 g de phytate de sodium (prove-
nant de mais, Sigma Chemical Co) est dissoute dans 500 ml d'une solution tampon d'acétate de sodium à pH 5,0. Tout en augmentant la température à 37 C, on ajoute du son de blé (10 g) sous agitation. L'incubation commence et continue à 37 C. La déphosphorylation est suivie du dosage du phosphore inorganique libéré. L'hydrolyse est arrêtée par addition de 100 ml d'ammoniac après 2 heures, quand 50 % du phosphore inorganique a été libéré. La suspension obtenue
est centrifugée, et le surnageant est recueilli.
On fait passer 300 ml du surnageant à travers une colonne échangeuse d'ions (Dowex 1, forme chlorure, 25 mm x 250 mm) et on élue avec un gradient linéaire d'acide chlorhydrique (0-0,7 N HCl). On hydrolyse complètement des parties aliquotes des fractions éluées afin de déterminer les teneurs en phosphore et en inositol. On recueille deux fractions présentant un rapport phosphore/inositol de
trois/un (IP3).
Fractionnement des inositol-triphosphates.
On utilise la même méthode que celle décrite dans l'exemple 2, excepté que la première fraction recueillie dans l'exemple 12 est chromatographiée. On obtient trois
- pics, et on analyse les produits correspondants par RMN-H.
Les produits sont le myo-inositol-1,2,6-triphosphate, le
myo-inositol-1,2,3-triphosphate et le myo-inositol-1,3,4-
triphosphate, respectivement.
Exemple 14
Procédé de préparation du sel de zinc du D-myo-
inositol-1,2,6-triphosphate.
ml de la fraction contenant le D-myo-inositol-
1,2,6-triphosphate obtenu dans l'exemple 13 sont neutralisés, à une valeur de pH d'environ 7, avec une solution aqueuse de ZnO. Le sel de zinc est précipité par addition de 100 ml d'éthanol. Le précipité est centrifugé, recristallisé, et séché sous vide. Le sel de zinc recristallisé ci-dessus du D-myo-inositol-1,2,6-triphosphate est aussi chimiquement analysé afin d'en déterminer la teneur en carbone, en phosphore, en oxygène, et en zinc. Le tableau 1 reproduit
les résultats. La formule du sel est Zn3IP3.
1 9
Exemple_ 15
Hydrolyse de phytate de sodium avec de la levure
de boulanger et fractionnement d'un mélange d'inositol-
phosphates. On dissout une quantité de 0,7 g de phytate de sodium (provenant de mals, Sigma Chemical Co) dans 600 ml d'un tampon d'acétate de sodium à pH 4,6. On ajoute, tout en agitant, 50 g de levure de boulanger provenant de Jâstbolaget, Suède (substances sèches: 28 %, teneur en azote: 2 %; teneur en phosphore:O,4%).On commence et on continue l'incubation à C. La déphosphorylation est suivie du dosage du phosphore inorganique libéré. Après 7 heures, quand 50 % du phosphore organique est libéré, on arrête l'hydrolyse en ajoutant 30 ml d'ammoniac à pH 12. On centrifuge la suspension, et on
recueille le surnageant.
On fait passer 400 ml du surnageant sur une colonne échangeuse d'ions (Dowex 1, forme chlorure, 25 mm x 250 mm) et on élue avec un gradient linéaire d'acide chlorhydrique
(0-0,7 N HCl).
On hydrolyse complètement des parties aliquotes des fractions éluées afin de déterminer leur teneur en phosphore et en inositol. La figure 8 représente la variation de la quantité de phosphore en fonction du volume élué. Les
pics correspondent à différents inositol-phosphates, c'est-
à-dire qu'un pic avec un rapport du phosphore à l'inositol de trois à un correspond aux inositol-triphosphates, etc.
Exemple 16
Détermination de la structure des inositol-
triphosphates isomères.
La fraction obtenue dans l'exemple 15 présentant un rapport phosphore/inositol de trois/un est neutralisée et évaporée avant une analyse par RMN-H. Le spectre s'avère identique à celui indiqué dans la figure 3a. Les données
montrent que le pic consiste en du myo-inositol-1,2,6-tri-
phosphate.
Ex emp le 17
Détermination des isomères optiques du myo-
inositol-triphosphate. On a utilisé la même méthode que celle décrite 5. dans l'exemple 4, à la différence que 10 mg du composé déterminé par RMN selon l'exemple 16 sont analysés. Comme on peut le voir sur la figure 9, le composé est constitué d'un
seul isomère optique, le D-myo-inositol-1,2,6-triphosphate.
Ledit isomère peut se ré-arranger en L-myo-inositol-1,3,4-
triphosphate, par traitement avec un acide tel que l'acide chlorhydrique. Exeple 18
Procédé de préparation du sel de sodium du D-myo-
inositol-1,2,6-triphosphate.
100 ml de la fraction contenant le D-myo-inositol-
1,2,6-triphosphate obtenu dans l'exemple 15 sont neutralisés
à un pH d'environ 7, avec une solution aqueuse de NaOH.
Après addition de 100 ml d'éthanol, le volume de la solution
est réduit par évaporation, et le sel de sodium est préci-
pité, centrifugé, recristallisé, et séché sous vide. La
structure du sel de sodium purifié du D-myo-inositol-1,Z,6-
triphosphate obtenu est confirmée par analyse en RMN-H.
On a aussi analysé chimiquement le sel de sodium recristallisé du D-myoinositol-1,2,6-triphosphate, afin d'en déterminer les teneurs en carbone, phosphore, oxygène, et sodium. Le tableau 1 reproduit les résultats. La formule
du sel est Na6IP3.
Exmple 19 Hydrolyse chimique du phytate de sodium, et
fractionnement d'un mélange d'inositol-phosphates.
Une quantité de 1,0 g de phytate de sodium (pro-
venant de mais, Sigma Chemical Co) est dissoute dans 15 ml de HCl 6 N. L'échantillon est chauffé sous vide dans un tube scellé, dans un four (105 C) pendant 5 heures. Après ce
laps de temps, 34 % du phosphore inorganique a été libéré.
On neutralise 5 ml du mélange liquide à pH 7 avec une solution aqueuse de NaOH, et on le fait passer sur une colonne échangeuse d'ions (Dowex 1, forme chlorure 10 mm x 150 mm) et on élue avec un gradient linéaire d'acide
chlorhydrique (HC1 0-0,7 N). Des parties aliquotes des frac-
tions éluées sont complètement hydrolysées afin d'en déter-
miner les teneurs en phosphore et en inositol. La figure 10 représente la variation de la quantité de phosphore en fonction du volume élué. La fraction présentant un rapport phosphore/inositol de trois/un est recueillie.Le spectre de
RMN-H indique un nombre substantiel de produits isomères.
Exemple 20
Synthèse chimique d'inositol-phosphates.
On introduit de l'acide polyphosphorique (80 % P205, 3,5 g) dans un flacon à bouchon de verre, et on chauffe à 150 C. On ajoute 0,2 g de myoinositol, et on maintient le mélange à ladite température pendant 2 heures, jusqu'à ce
qu'on le neutralise à pH 7 avec une solution aqueuse de NaOH.
On précipite la composition obtenue sous forme d'un sel de baryum après addition d'un excès de 10 % d'une solution d'acétate de baryum 0,1 M. On transforme 20 mg du sel de baryum en la forme acide par addition d'acide chlorhydrique dilué, et on analyse
par HPLC. L'appareil d'analyse est étalonné avec des inositol-
phosphates connus. La figure 11 représente les chromatogrammes.
On recueille la fraction déterminée comme étant l'inositol-
triphosphate. Le spectre RMN-H indique un nombre substantiel
de produits isomères.
Exemple 21
On met en suspension 1,0 kg de son de riz, contenant environ 1 % d'inositol-hexaphosphate (IP6) dans 1 d'une solution tampon d'acétate de sodium à pH 5 à 25 C. Après 4 heures, après libération de 50 % du phosphore inorganique, on enlève la boue et on ajoute un litre de HCl 2 M. On secoue la suspension pendant 1 heure, et on la centrifuge ensuite. On neutralise le surnageant à pH 7 avec une solution aqueuse de Ca(OH)2. On obtient un précipité en ajoutant 5 1 d'éthanol. Le sel de calcium, constitué par un mélange de différents inositol-phosphates, est centrifugé,
séché, et recristallisé. 20 mg du sel de calcium recristal-
lisé sont transformés en la forme acide, par addition d'acide chlorhydrique dilué, et sont analysés par HPLC. Le mélange est constitué de 40 % d'inositol-triphosphate, dont 70 % de D-myo-inositol-1,2,6triphosphate. Le reste est constitué
d'autres inositol-phosphates.
Exemple 22
Caractérisation des différents sels de D-myo-
inositol-1,2,6-triphosphate.
On partage en 7 portions 70 ml de la fraction présentant un rapport phosphore/inositol de trois/un obtenu dans l'exemple 15. Après avoir ajusté le pH avec NaOH 0,1 M, on ajoute différents cations sous forme de chlorure, un ion à chaque portion. Les sels utilisés sont FeCl3, MgCl2, AlCl3,
KC1, NH4Cl, (CH3CH2CH2CH2)4N Cl et C6H13NH3Cl, respecti-
vement. Après addition de 10 ml d'éthanol, des précipités se forment. On recristallise les sels, et on les analyse
pour en déterminer les teneurs en phosphore, carbone, oxy-
gène, et métal, après recristallisation. Le tableau 1 ci-
dessous indique la composition des sels purifiés.
Exemnple 23
On étudie l'effet de IP3 sur l'agrégation des pla-
quettes après inhalation de fumée de tabac chez les humains.
2-3 On administre en deux occasions, à ouatre jeunes mâles non-fumeurs en bonne santé, une capsule contenant 50 mg de IP3 ou SO mg d'un placebo. Le IP3 utilisé est le sel de calcium du D-myo-inositol-1,2,6-triphosphate. Ni le sujet ni l'expérimentateur ne connaissent quels sujets reçoivent IP3
ou le placebo.
Deux heures après l'ingestion de la capsule, on prélève un échantillon de sang. Les sujets fument ensuite deux cigarettes d'affilée. On prélève un second échantillon de sang apras qu'ils aient fuméo On détermine les réponses d'agrégation des plaquettes à ADP et au collagène dans les
deux échantillons, en utilisant pratiquement la même procé-
dure que dans l'exemple 1o. Les résultats sont exprimés sous la forme des variations dans l'agrégation de l'échantillon avant à l'échantillon après l'inhalation de fumée. Un signe plus indique que l'agrégation est plus importante après
inhalation de fumée.
Agent Concentration de Différence entre d'agrégation l'agent d'agré- IP3 Placebo IP3 et rlacebo 20..gation ADP O Dsmol - 1o5 + 7,25 5,85 -"- 1 mmol - 1,5 + O025 1,75 -"- 2,5 mmol - 1,5 0 1,5 Y"- 5 mmol - 2,5 - 0,75 1, 75 Collagène 0,5 mg 5,15 +12,25 6,5 -"-_ 1 mg - 8,25 + 1,75 10,0 -"-_ 2,5 mg - 3,75 0 3,75 -"- 5 mg - 1,5 - 0,25 1,25 Dans le groupe ayant recu le placebo, l'inhalation de fumée cause une augmentation de l'agrégation, qui est la plus marquée pour des concentrations faibles des agents d'agrégation. Dans tous les cas, cet effet est contrecarré par IP3. Ainsi, IP3 prévient l'augmentation de l'agrégation
des plaquettes causée par l'inhalation de fumée.
On injecte par voie intrapéritonéale à des souris
(10 dans chaque groupe) du IP3 (sel de sodium du D-myo-ino-
sitol-1,2,6-triphosphate) à trois doses différentes, ou bien de l'eau physiologique. 30 minutes après cette injection, toutes les souris excepté un groupe de contrôle reçoivent une injection intraveineuse d'alloxane, SO mg/kg, dans de l'eau physiologique. Les animaux sont mis à la diète pendant 12 heures
avant l'injection d'alloxane, et pendant une heure après.
72 heures après l'injection d'alloxane, on analyse un échan-
tillon de sang des souris pour déterminer leur glycémie. Les résultats sont les suivants: Dose de IP3 Dose d'alloxane Glycémie mg/kg mg/kg o 0 2 16
0 50 864
800 50 857
1600 50 677
L'alloxane provoque un diabète et augmente la glycémie en favorisant les réactions de radicaux libres dans les cellules produisant l'insuline. Avec IP3, la glycémie décroit en fonction de la dose, et la dose la nlus élevée
protège quelque peu l'alloxane.
Tableau 1: Formules chimiques des différents sels de IP3
_________________________________________________________
Composé - -- Analyse élémentaire Formule__ Me% C% 0% P% N% Sel de calcium de 1,2,6-IP3 Ca: 22,0 14,1 44,2 17,1 -- Ca3IP3 Sel de calcium de 1,3,4IP3 Ca: 21,4 13,8 42,9 16,3 -- Ca3IP3 Sel de calcium de 1,2,3-IP3 Ca: 22, 7 12,9 45,6 18,2 -- Ca3IP3 Sel de calcium de 1,2,5-IP3 Ca: 23,2 13,3 44,7 16,9 -- Ca3IP3 Sel de zinc de 1,2,6-IP3 Zn: 31,5 12,1 38,2 14,7 -- Zn3IP3 Sel de sodium 1,2,6-IP3 Na: 23,1 12,8 44,6 15,8 -- Na6IP3 Sel de fer de 1, 2,6-IP3 Fe: 21,5 13,1 43,4 18,2 -- Fe2IP3 Sel de potassium et de magnésium K: 27,5 11,3 38,7 14,1 -- K4MgIP3 de 1,2,6-IP3 Mg: 3,8 Sel de magnésium de 1,2,6-IP3 Mg: 15,8 16,0 50,8 18,9 -- Mg3IP3 Sel d'aluminium de 1,2,6-IP3 Al: 12,6 15,8 53,3 21,2 -- Al2IP3 Sel d'anmmonium de 1,2,6- IP3 -- 13,1 47,8 16,9 15,6 (NH4)6IP3
Sel de tétrabutyl-
ammonium de
1,2,6-IP3 -- 57,0 20,1 7,8 3,5 [CH3(CH2)3)4N]3H3IP3
X Sel de cyclohexyl-
amnonium de
1,2,6-IP3 -- 39,5 35,1 12,6 6,2 [C6H3NH3]3H3IP3
%!P ZuotuoiZne 'oaed/qd -sO qdil-9'Z'L-Il ls ui-o X-g S Z 9dI no (aoidsoqd) s!xoexq r IOZ!SOU!-OXM j!p zuomoilne IOzlSou!-oXm(ogeqdsogdou'oM -oIpXy!p)-s!xog3-9'S'bú'Z't 9(HO) 9H9D!10!Sou!-oMH
=oplo awjoo rl ua saaoglldm!s zuos snossop-!D soilunDnins -
salnuao sol 'Z uo!z!sod op oaounu el sinofnoz apQssod aloIxt uo!lisoa ua anbiioidsoqd ap!Du,p aosai un u ail:so inb auoqiuD op amoqv,l 'selqlg snld sel uolsod op soaGmnu sel auuop Inb suas al uueAins sasl!Zn Zuos Zo 'lu@moA!zDodsoi ceim!iuoD suas el suep z@ aizuom aun,p sllln'!e sap suas O[ al suep uo!zeuoeauinu aun zua@uosGidai a za 1 'alqlssod anb saAoGI nad issnu uozlsod op solamnu sep lueuuop uoizqoi -omnu el 'Io:lsoui,p neXou el ans onb!ioidsoRd ap!De,p saosao sel sgnzls quos no loipua,l op uoiDuog ua sapmou zuos lOz!Soui-oAm np sino!zogui sozuqdsoild-slzosa sel ZdI oa dI 'SdI '9dI inod saauuop Issne zuos silnuioj sel 'uo!uoAu!,l op CdI Op saodom -os! sol ZuEuoasgadai 'snossap-!D seouuop zuos salnwioj sol uo!uOAu!,o op uo!suapazdwo3 ainollIOm aun inod 9Z
D-myo-inositol-1,2,5-tri-
phosphate, autrement dit
P. D-1,2,5-IP3
myo-inositol-1,2,3-tri-
phosphate, autrement dit
1,2,3-IP3
P
P = O-PO3H2
OH (P là L-myo-inositol-1,3,4-tri-
OHqg t phosphate, autrement dit Pw L-1,3,4-IP3
*.P S L-myo-inositol-1,2-diphos-
0..'(7) _ phate autrement dit
L-1,2-IP2
P é e C-myo-inositol-1,2,5,6-
tetra-phosphate ou-D-1,2,5, 6-IP4
L-myo-inositol-1,2,3,4,5-
penta-nhosnhate ou
L-1,2,3,4,5-1P5
P = -0-Po3H2

Claims (18)

REVENDICATIONS
1. Inositol-triphosphate (IP3), caractérisé en ce
qu'il est choisi parmi le groupe constitué par le D-myo-
inositol-1,2,6-triphosphate, le D-myo-inositol-1,2,5-tri-
phosphate, le L-myo-inositol-1,3,4-triphosphate et le myo-
inositol-1,2,3-triphosphate, sous forme d'acide ou de sel.
2. IP3 selon la revendication 1, caractérisé en ce
qu'il consiste en du D-myo-inositol-1,2,6-triphosphate.
3. IP3 selon la revendication 1, caractérisé en ce
qu'il consiste en du myo-inositol-1,2,3-triphosphate.
4. IP3 selon la revendication 1, caractérisé en ce
qu'il se trouve sous forme pratiquement pure.
5. IP3 sous forme acide selon la revendication 1,
caractérisé en ce qu'il se trouve sous la forme d'une solu-
tion aqueuse.
6. IP3 sous forme acide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il se trouve sous forme d'une solution aqueuse dans laquelle la concentration de l'acide est comprise entre 10-45 % en poids, sur la base du poids total
de la solution.
7. IP3 sous forme de sel selon la revendication 1, caractérisé en ce que ses cations sont choisis parmi le groupe constitué par les métaux alcalins et les métaux alcalino-terreux.
8. Sel selon la revendication 7, caractérisé en ce que les cations sont choisis parmi le groupe constitué par le lithium, le sodium, le potassium, le calcium, et le magnésium.
9. IP3 sous forme de sel selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cations sont choisis parmi le
groupe constitué de l'aluminium, du zinc, et du fer.
10. IP3 sous forme de sel selon la revendication 1, caractérisé en ce que le sel est un sel d'ammonium ou un
sel d'amine organique.
11. Procédé de production d'un inositol-triphosphate (IP3), choisi parmi le groupe constitué par le D-myo-inositol- 1,2,6-triphosphate, le D-myoinositol-1,2,5-triphosphate, le
L-myo-inositol-1,3,4-triphosphate et le myo-inositol-1,2,3-
triphosphate, sous forme d'acide ou de sel, caractérisé en ce que un matériau contenant de l'inositol-hexaphosphate est mis à l'incubateur à une température comprise entre 20 et 70 C, à un pH de 4 à 8, avec de la phytase, jusqu'à ce
que soit accomplie la libération d'environ 30-60 % du phos-
phore total de l'ester, on sépare ensuite par chromatographie le mélange obtenu pour isoler la fraction contenant IP3, on
soumet éventuellement ladite fraction à une séparation chro-
matographique ultérieure, et on isole des formes spécifiques
isomères de IP3 sous forme d'acide ou de sel en solution.
12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en
ce que la phytase est une phytase de levure.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en
ce que la levure est une levure de boulanger.
14. Procédé de production du D-myo-inositol-1,2,6-tri-
phosphate sous forme d'acide ou de sel, caractérisé en ce
que l'on met à l'incubateur un matériau contenant de l'ino-
sitol-hexaphosphate, à une température comprise entre 20 et C, avec de la phytase de levure jusqu'à ce que soit accomplie la libération d'environ 30-60 % du phosphore total de l'ester, on sépare ensuite par chromatographie le mélange obtenu pour isoler la fraction contenant IP3, et on isole le D-myo-inositol-1,2,6-triphosphate sous forme d'acide ou
de sel en solution.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en
ce que la levure est une levure de boulanger.
16. Composition d'inositol phosphate, comprenant du D-myo-inositol-1,2,6triphosphate, et au moins l'un des
composés D-myo-inositol-1,2,5-triphosphate, L-myo-inositol-
1,3,4-triphosphate, et myo-inositol-1,2,3-triphosphate, sous forme d'acide ou de sel, caractérisée en ce qu'elle contient
-99,5 % en poids dudit 1P3, et que la teneur en D-myo-
inositol-1,2,6-triphosphate se trouve comprise entre 50-100%
en poids, sur la base de la teneur totale desdits inositol-
triphosphates, le reste comprenant les inositol-phosphates
autres que IP3.
17. Composition selon la revendication 16, caractérisée en ce que la fraction de IP3 est présente à raison de
-99,5 % en poids.
18. Composition selon la revendication 16, caractérisée
en ce que le IP3 est essentiellement le D-myo-inositol-
1,2,6-triphosphate.
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