JPS5971682A - ユ−グレナの培養法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はユーグレナを培養する方法に関する・ユーグレ
ナは光合成を営む原生ｗＪ物であって、その細胞膜がタ
ンパク性であるため高等動物ＶＬよって消化されや丁ぐ
、また、細胞タンパク質は高い栄養価紮有することが本
発明者によって報告されている〔日本農芸化学会誌、第
５１巻、第８号（昭和５２年〕〕。この生物は。

また、多くの生理活性物質を含む可能性がちり。

生物座業上の新しい素材として多様な利用を期待しりる
ものであ◇。

ユーグレナを独立栄養的に培養することもできるが、細
胞収量や照明および二酸化炭素の費用の点から、工業的
な大振培養ＶＬは適当でない。

ユーグレナを従属栄養的に生育せしめるためにこれまで
多ぐの研究があり、炭素源としては。

エタノール、＝ｘｅ、ｙルコース、グルタミン酸などが
用いられてきたが、これらはいずれも高価である。した
がって、ユークレナを工業的に利用するためには安価な
炭素源を用いて収率よ〈大鑑培養できる方法の確立か必
要となる〇本発明は、フルクトースを含む糖資源１％に
廃穂密などの精糖工場から副生ずる安価な楯資源を有効
に利用丁０ことのできるユーグレナの培養法を提供する
ことを目的とする・ すなわち１本発明のユーグレナの培養法は。

糖類の中でフルクトースｋ　ｉｔＺもよく資化するユー
グレナを、フルクトース含有楯資源を炭素源として培養
することを特徴と丁’Ｓ。

本発明者の研究によれば、ユーグレナは、インベルター
ゼを含め、多糖、少１４　ｅ細胞外で加水分解して取込
む酵素系を欠除しており２これら糖類２資化すＱことが
できない。また、単糖類の中でも、グルコースに比べと
ぐにフルクトースを良く資化するユーグレナ株のあるこ
とを見出した。したがって、この株を分離、馴致すれば
フルクトースを炭素源として効果的にユーグレナを培養
することができ、この結果、フノトクトースを含む糖質
源を有効に利用してユーグレナの大量培養が可能となる
。

本発明で用いるユーグレナの株は、フルクトースを主た
る炭素源とする培地でユーグレナ株會培養して細胞数を
計測し、一方、クルコースを主たる炭素源とする他は同
様にして上記と同じユーグレナ株を培養して細胞数を計
測し１両者を比較してフルクトース？主たる炭素源でよ
り生育するユーグレナ株を選択することにより得ること
かできる。勿論、この培養に先立って。

ユーグナレ葡フルクトースを主たる炭素源とする培地で
培養して馴化することもできる。さらＩＱ、選択したフ
ルクトース資化能にすぐれたユーグレナを、さらにフル
クトースを主体とする培地で培養音線り返すことにより
馴化して、フルクトース資化能？増太芒せることができ
る。

次にこの具体側を示す。

本発明者の保存株および野外よりの採取味。

合計４６株を、フルクトースを主たる炭素源とする次の
培地■で５〜１０回培養し２て馴致した・培地■ フルクトース　　　　　　　　　　１２り／ノグルタε
ンθ　　　　　　　　　　　４り／ノ了ルギニン酸塩酸
塩　　　　　　ｏ３７／ノアスパラギン酸　　　　　　
　　０．３９７ノグリシン　　　　　　　　　　　０．
３９／ノヒスチジン塩・−水化物　　　Ｏ，ＯＳノ／ｉ
リンゴ酸　　　　　　　　　　　　６．５９７ノクエン
酸三カリ塩　　　　　　　０．５ｊＪ／ノコハク酸ナト
リウム六水化物　　　　　　　０．１９７ノ硫酸アンモ
ニウム　　　　　　　０．２５９７１厘炭酸アンモニウ
ム　　　　　　０．２５９／ノリン酸−カリウム　　　
　　　　１．２５ｊＥ／ノ炭酸マグネシウム　　　　　
　　　０．６ノ／ノ炭酸カルシウム　　　　　　　　０
．１２９／ｉ亜硫酸丁ンモニウムＯ六水化物５０１ｊ＋
９／ｉ硫酸マンガン　　　　　　　　　１８η／ｉ硫酸
亜鉛・上水化物　　　　　　２５１ｎＦＩ／Ｉｔモリブ
デン厳アンモニワム・四水化物　　　　４１ｎ９／ノ硫
酸銅　　　　　　　　　　　　　１．２　ｎｆ！／ノパ
ナジウム酸アンモニウム　　　０．５　ｍ９／　Ｊｌ硫
酸コバル１會七水化物　　　　０．５ｍ９／ｉホウ酸　
　　　　　　　　　　　　０．６１ｎｇ／ノ硫酸ニツク
ル・大水化物　　　　Ｉ）、　５　ｍｆｌ　／ノビタミ
ンＢ、　＠塩酸塩　　　　　　　１ｍｙｉｉヒタＳ　７
　Ｂ１２　　　　　　　　　０．００５ｍ９／ノついで
、この株を培地工と、フルクトースの代ｔ）にグリコ−
スケ用いた他は培地工と＋ｉｔ−の培地Ｉ′とで、それ
ぞれ、初発ｐＨ３，３，培養温度２７℃で暗所で振盪培
養し２定常期に達せしめたのち細胞数を計測した。

試験した４６株のうち、グルコースよりもフルクトース
をよく資化する株は次の６株であった口 第　　　　１　　　　表 ＦＫ−２１１０８ ＺＫ−０８１１（Ｉ ＺＫ−１４］２（＋ ＡＭ７０２　　　　　　　　　　　　　１０６Ｓｏ−３
３１０８ ＨＢ−１０１０５ ＺＫ−１４株はとぐニ、グルコースよりもフルクトース
に対して資化能奮示しく良く生育し）。

この株をフルクト−スケ単−炭素蒜とする培地■で２０
ケ月に亘って継代培養したどころ、同条件でグルコース
を単一炭素源とした培地での生育度（細胞数）に比べ、
１．２４培の生頁朋を示した。

培地■ フルクトース　　　　　　　　　　　１２り／ｉミリン
了ンモニウム　　　　　　　　５９／ノ硫赦マグネシウ
ム・上水化物　　　　　　　　　０．５グ／ノ亜硫酸ア
ンモニウム・大水化物　　　　　　　　５０ｍ９７ノ硫
酸マンカン　　　　　　　　　　１８■／Ｉｔ硫酸亜鉛
・上水化物　　　　　　　２５１１Ｉｇ／ノモリブデン
酢アンモニウム・四水化物　　　　　　４ｍ９７ノ硫酸
銅　　　　　　　　　　　　　　１．２ＭＦｌ／ｉバナ
ジウム酸アンモニウム　　　　　　　０．５π９／Ｊｌ
硫蔽コバルト・上水化物　　　　　０．５　ｍｆｌ／ノ
ホウ酸　　　　　　　　　　　　　　０．６ｍｋｌ／ノ
硫酸ニッケルの大水化物　　　　　０．５ｍ９／ノビタ
ミンＢ１番塩酸塩　　　　　　　　１Ｍ９／ｉビタｉ　
ｙ　Ｂ、２　　　　　　　　　０．００５’Ｒ９／１２
ＺＫ−１４株はユーグレナ・グラシリス（Ｅｕ、５ｒｉ
ｅｎａ　、Ｆｒａｃｌ）ｉｓＪ　　２株の近縁株で形態
的には通常の２株と顕微鏡下で差異は認められない。

本発明では、グルコースを炭素源とした場合よりもフル
クトースを炭素源とした場合に良く育つユーグレナ、言
い換えれば５グルコースよりもフルクトースに対して資
化能を有する株が用いられる。そして、ＺＫ−１４株以
外の亮１表に示した株、あるいは第１表に示さなかった
株の多くも長期間に亘。馴致によりフルクトースに対す
る親和性が増大し、その資化能を増大させることができ
Ｑ（Ｉしたかつて、これらの株も必要に応じて本発明に
用いることができる。′また、ＺＫ−１４株などのユー
グレナはストレプトマイシン処理。

紫外線照射、高熱処理などの公知の方法によって葉緑体
欠損株ｒ与えるが、これらの株もＺＫ−１４株と同様に
、フルクトースを主たる炭素源とすＱ培地で能率よく大
板培養によってユーグレナ虻与える。

培地としてはフルクトースを主たる炭素源として含むも
のが用いられ、さらに、窒素源、無機成分を含み、ビタ
ミンＢ８．ビタミンＢ＋２に含むことが好ましく、この
代表例として培地■が挙げられる。

培地■（水として水道水を便用フ フルクトース　　　　　　　　　　１２ｙ／ノリン酸ア
ンモニウム　　　　　　　５ｙ／〕硫酸マグネシウム・
上水化物　　　　０．５９／ｉ炭酸カルシウム　　　　
　　　　０．１．り／ノ硫酸第−鉄・上水−化′＠１ｍ
９／Ｉ。

ビタミンＢｌ−＠酸塩　　　　　　　　　　　２．５Ｔ
ＪＩｇ／ｉビタミンＢＩ２　　　　　　　　　　　５μ
ｙ／ノ本発明では他の糖も含むフルクトース含有糊資源
も用いることができるが、ユーグレナは。

インベルターゼなどのカルボヒドラーゼヲ含有しないの
で、ショ糖などの三糖類および他の少糖類、多糖類はそ
のままでは利用できない。そこで、予め鹸または適当な
酵素を用いてこレラの配糖体結合を切断し、遊離フルク
トース斌ヲ増加せしめることが望ましい。廃糖蜜などの
シヨ糖含有糊資源では、たとえば加熱滅菌に際して培地
１ｐＨ１，０〜３．５程度の酸性にし、滅菌後に培養に
適したｐＨ値に再調節することにより、簡便にほぼ目的
を達成しうる。さらに丁寧に加水分解を行なうには希酸
を用い、３０〜８０℃の温度″Ｔ：３０分〜１２分間１
２時間すればよい。また、それぞれの少糖および多糖に
特異性ケもつ酵素を用い、それぞれの酵素作用に適した
反応条件を与え２緩和に処理することもできＱｈたとえ
ば、シヨ糖含有糊資源については、酵母よＶ得られたイ
ンベルターゼを用い。

酢酸緩＠液中、ｐＨ５，４，温度３０℃で、あるいはＮ
ｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ　　、Ｊ：　’ｆ）
のインベルターゼを用い、酢酸緩衝液中、ｐＨ７，５，
温度３８℃で２遊離フルクトース量が最大ＩＬＬ　ｆｒ
　’ｒｗまで酵素反応を行なえばよい。また、イヌリン
のようなフルクタンを糖質源として用いるときは、イヌ
リナーゼによればよく、たとえば、酢酸緩衝液中、ｐＨ
５，０，温度２５゛″Ｃで処理する。

糖類は主たる炭素源として用いられＱものであり、遊離
フルクトースおよび共存す０クルコースの義嵐かユーグ
レナの生育に最適にｆＸＱように培地中ＶＬ＠解または
鴇釈することが望筐しぐ、この濃度が１．０〜３．Ｏｗ
ｔ係になるように希釈丁０ことが好ましい、希釈は微泣
金編の補給も考慮してＸ適７Ｋまたは井戸Ｘヶ用いるこ
とが適当である。

炭素源以外の培地成分中、窒素源としてはアンモニウム
塩まｋはグルタミン酸などのアミノ酸またはコーンステ
ープリカーを加える。アンモニウム塩としては、硫帳塩
２　リン醒塩、塩酸塩などいずれもが用いうるが、窒素
分消費後のアニオン残分が問題になる場合は、炭酸塩ケ
用いるか、またにアン七ニア水ｒ用すると良好な結果が
得られ。。ユーグレナは硝酸、亜硝酸。

尿素？利用できないので、これらを有効窒素源として加
えても効果がない、廃糖蜜などの糖質源を用いる場合で
この糖質源中に含まれる有効蟹素成分が不足するときは
、Ｃ／Ｎ比がユーグレナの生育条件の合致するように前
記の窒素源を加えＱ。

窒素分以外の無機質については、転化糖、フルクタン加
水分解物などを用いのときは前出のフルクトース培地に
準じて培地を調製すればよい。廃密糖の場合は、成分が
原料糖質、原産地。

製造方法などによって太きく異なるが、一般にはユーグ
レナ培養のために必要な無機成分は概ね含有されており
、特に添加の必要のない場合が多い。しかし、マグネシ
ウム塩、リン酸は不足する場合も多く、この場合は補充
する。また。

他の成分についても不足する場合は補給する。

ビタξン類はいずれの場合も補給することが好ましぐ、
上記のようにビタミンＢ１とビタミンＢ１□を添加する
。

廃密糖をはじめ複雑な組成ヶもつ糖質源ではユーグレナ
の生育阻害物質葡含む可能性があるが１本発明者がこれ
まで試験した範囲ではこのような弊害はみられず、普通
の製品では安心して利用しうるものと思われ。。

以上のように本発明では培地における炭素源として釉々
の糖資弁を利用しり／ｌ）が１本発明のユーグレナはフ
ルクトースの資化能ｆＬ特に優れており、フルクトース
に富んだ糖質源、たとえば、フルクトース、廃糖蜜、廃
糖密加水分解物フルクタン加水分解物などが特に好まし
め。

培地はｐＨ２，５〜８．０で行なうのが適当であり、典
型的にはｐ）１３．３〜３．５である。培養温度は１０
〜３（１’ｃρＩ適当であり、典型的には２７℃程度、
ｆｃとえば２６〜２８℃である。

培養中における照明は０〜ｉｏ、ｏｏｏルックスの範囲
で用い０のが一般的である。照明の程度によって得らｆ
ＬＯ細胞の生理活性物質の含量に差か生じＱので、ユー
グレナ細胞の利用目的に応じて照明ケ適宜調節すること
か望せしい。

ユーグレナをたん白泥として利用する場合は照明を特に
必要としないが、ビタミンＣ，Ｅなどのビタミン知、不
飽和脂質１葉緑素、カロチノイドなどの生理活性物質の
生ａを望む場合は。

５００〜２０．０００ルツクスの光、一般的ｔｌＬは、
白色光を照射す０必賃がある。また、生成物を特定のも
のに枚って培養するときは、青色光るるいは赤色光を照
射す０方が効果的なこともある。

培養に際しては通気盆石なうのが適当であり。

たとえば、ｉｏ）培地であれば毎分２〜５ノの空気を通
気する。培地のスケールが犬きぐなれば２これに準じて
迎気址ヲ増加さぜる。グリコール酸なとの特定の生成物
を得る目的ＶＬは酸素ガスを通気することが望ましい。

攪拌は、攪拌器またはスターラーにより毎分３０〜２５
０回転程度施すのが好ましい。これは培養中のａ胞が沈
降せぬ程度であり・激しい攪拌ｉｒ、細胞の破壊を招き
好ましくない。

培養は通常２〜６日で細胞分裂が足常期に達し、細胞数
が最大になった時点で完了丁Ｑ０ユーグレナ細胞は遠心
分離によって収集し、凍結乾燥、噴霧乾燥、熱風乾燥な
どの方法て゛乾燥して粉末状の製品を得Ｑことかできる
。製品は培地組成と照明の再熱によって８調が異なり、
帯黄色、黄褐色２緑褐色、淡褐色などｔ示す。細胞収ル
、は、弔地組成が適切′″′ｒ：をノリ培養条件を選べ
ば、培養液ｊ！当すｌＯ〜２５ノであり、対糖収量は０
．８〜２％［及ぶ。

得られるユーグレナーの化学成分は培地組成と培養条件
によって若干異な。か、暗黒下および照射下で、転化糖
を炭素源２　リン酸アンモニウムヲ鴛素源として培養し
た場合について、代表例として第２表に示す。

第　　２　　表　　（乾９勿中の係） 成　　分　　　　暗黒下　　照明下 粗タンノぞり質　　　　４８．４　　　５５．０粗脂肪
　　１２．０　１５．２ パラミロン　　　　　３０．６　　　１７．６灰　　　
　　分　　　　　　　　　２．５　　　　　４．２その
他　　６．５　８．９ 実Ｍｉｆｉｌｌ 廃糖蜜（フィリツビン産せ蔗糖密）　　　　　　２５０
ノリン酸アンモニウム　　　　　　　　５０ｙ硫酸マグ
ネシウム　　　　　　　　　　２ノビタミンＢ、　　　
　　　　　　　　　　０．２５ＥビタばンＢ１２　　　
　　　　　　　　、　５０μｙＸ　道　Ｘ　　　　　　
　　　　　　　　１０ノにするからなる培地を硫酸でｐ
Ｈ２，２に調節シ１１通常通りにオートクレーブによる
滅菌２行なった。

冷却後、水酸化ナトＩＪウムを用いてｐＨ１３，５に調
節し、毎分１００回転の攪拌器′？Ｉ：備えた１５ノの
培養槽中２８℃で、ＺＫ−１４株の培養を行なった。通
気は空気を用いて毎分２ノとし、とぐＶＣ照明？与えす
７内視窓よりのわずかな明０さで、はは暗黒に近い状態
で３日間培養上行なったところｐｉは３．５に没化し、
細胞和はｌ尻ｌ当たり］　０７となった。

培養を止め、　　１，０００　ｒｐｒｎで細胞を遠心分
離して集め、凍結乾燥した。細胞は卵黄色粉末として得
られ、乾燥物中の含量は次の通りであったＯ 粗タンパク質　　　　　　５０％ パラεロン　　　　　　　　３０％ 粗脂肪　　　１２％ 灰　　　　　分　　　　　　　　　　　　　６　係ビタ
ミンＣＯ，０５係 ビタミンＥ　　　　　　　　０．０５係また。タンパク
質中の必須アミノ酸含量は次の通りであった（窒累１６
グラム当りのグラム数　）　。

イソロイシン　　　　　　３，３ ０イシン　　　　　　　　　６．５ リジン　　　　　　５．８ 含量アミノ酸　　　　　　　４．４ 芳香族アはノ級　　　　　７．２ トレオニン　　　　　　　４・４ トリプトファン　　　　　１．０ パ　　　リ　　　ン　　　　　　　　　　　　　　５．
３実施例２ 廃糖蜜（北海道産甜菜糖密）　　　　　　　　２２０９
グルタミン酸　　　　　　　　　　３０ｆ−炭酸アンモ
ニウム　　　　　　　　２０１リン酸マグネシウム　　
　　　　　１０５Ｅ炭師カルシウム　　　　　　　　　
　５ｙビタミンＢ１０．１ｙ ビタミンＢ、□　　　　　　　　　　　５０μノ水　道
　水　　　　　　　　　　　　８ｉにするからなる培地
を一夜硫酸でｐＨ２，０にし、４０℃にて一夜放置し、
ついで１本酸化す）　ＩＪウム水溶液でｐＨ３，３に調
節したのち２通常通り滅菌した０ ＺＫ−１４株のユーグレナを予めストレプトマイシン菌
で処理して得たＺ　Ｋ　−１４株の葉緑体欠損変異株を
、上記の培地ヶ用いて、１０ｉのカラス製ジャーを使用
し、外表面で８０００ルツクスになるように螢光灯に、
１：０照射を与え。

２９℃で培養した。６０時間の培養ののち細胞を集め、
熱風乾燥法により乾燥した。細胞収址は２００ｙであっ
た。製品は淡黄褐緑色であり。

乾燥物中の含量は以下の通！ｌ）であった。

粗タンパク質　　　　　　　５２％ パラミロン　　　　　　　２８係 粗脂肪　　　１１％ 灰　　　　　分　　　　　　　　　　　　　５％ビタミ
ンＣＯ，１４係 ビタミンＥ　　　　　　　　Ｏ１３％ タンパク質中の必須アミノ酸組成は実施例１と大差がな
かった。

実施例３ 転化糖（乾物として全糖獅り　　　　　　　１２０ノリ
ン酸アンモニウム　　　　　　　５０り硫酸マグネシウ
ム・７水化物　　　　　　５り炭酸カルシウム　　　　
　　　　　１ｙ硫酸第１鉄・７Ｘ化物　　　　　０．０
１９ビタεンＢｌ＠塩酸塩　　　　　０．０２５ｙビタ
ミンＢＩ２　　　　　　　　　　　５０μノ水　道　水
　　　　　　　　　　　１０ノにするからなる培地を用
いた。なお、この培地成分のうち、リン酸アンモニウム
は最初に培地中に２０！含有せしめ、培養の進行に伴な
って細胞の消費に合わせて追加施与し２合計５０ｙとし
たものである。この培地’１ｐＨ３，５に調整し。

とぐに予め加水分解操作を施すことなく加熱滅菌し、ユ
ーグレナＺＫ−１４株を接種し、薄明中、２８℃で３日
間培養した。乾燥細胞収量は１６０ｙであった。製品は
黄已粉末であった。

粗タンパク質　　　　　　５３％ パラミロン　　　　　　　２６係 粗　　脂　　肪　　　　　　　　　１４％灰　　　　　
　分　　　　　　　　　　　２ｑｂビタミンＣＯ，０７
係 ビタばンＥ　　　　　　　　Ｏ，１３％この製品？唯一
のタンパク質素とする次のような組成の飼料を作り、３
透口のＳＤ系雄白ネメミ葡用い飼育試験葡行なった・ 乾燥ユーグレナ細胞　　　　　６７％ ビタミン混合物　　　　　　　　１％ 塩類混合物　　　　　　　　　４係 粉末繊維素　　　　　　　　　　３％ コリン埴酸塩　　　　　　　　０．３係太豆油　　　　
　５％ コーンスターチ　　　　　　１９．７係また。比較例と
して乾燥ユーグレナ細胞の代りにカゼインを用いて同様
に飼有試験を行なった０ 飼育試験は４週間行なったが、ユーグレナ全タンパク源
とした場合と、カゼインケタンパク源とした場合では生
育に差異は認められず、また内臓の検査でも差異はなか
った。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 工、　糖類の中でフルクトースを最もよく資化するユー
   グレナｔ、フルクトース含有糖資源を炭素源として培養
   することを特徴とするユーグレナの培養法。