FR2575160A1 - Composes ionophores carboxyliques monovalents - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE DES COMPOSES IONOPHORES CARBOXYLIQUES CONTENANT UN GROUPE THIOL, EVENTUELLEMENT ACETYLE, INTRODUIT ARTIFICIELLEMENT PAR ACTION DE L'ANHYDRIDE S-ACETYL-MERCAPTOSUCCINIQUE SUR LEDIT IONOPHORE ET ELIMINATION EVENTUELLE DU GROUPE ACETYLE PAR L'HYDROXYLAMINE. APPLICATION : OBTENTION D'AGENTS POTENTIALISATEURS DES IMMUNOTOXINES.

Description

Composés ionophores carboxyliques monovalents.

La présente invention concerne des composés ionophores carboxyliques monovalents utiles pour l'obtention de nouveaux conjugués associant par liaison covalente sur ionophore carboxylique monovalent et une macromolécule, lesdits conjugués convenant à titre de potentialisateurs des immunotoxines.

Dans sa demande de brevet français nO 82-02 091, la Demanderesse a mentionné la capacité que présentent les ionophores carboxyliques de potentialiser les immunotoxines.

Par immunotoxines, on désigne des substances anticancéreuses obtenues par couplage, par liaison covalente, d'une protéine cytotoxique (par exemple la chaîne A de la ricine) avec des anticorps ou fragments d'anticorps dirigés contre un antigene porté par une cellule à détruire.

De telles immunotoxines ont notamment été décri tes par la Demanderesse dans le brevet français nO 78/27838 et son addition n" 79/24655 et dans les demandes françaises nO 81/07596 et nO 81121836. Les propriétés potentialisatrices des ionophores ont pu être utilisées avantageusement dans certains types de situations. En particulier, ils donnent des résultats favorables à chaque fois qu'une immunotoxine est utilisée en tant qu'agent cytotoxique sélectif in vitro pour détruire les cellules-cibles. C'est notamment le cas lorsque l'immunotoxine est utilisée comme agent cytotoxique dans le traitement de la moelle osseuse de patients leucémiques à qui la moelle osseuse ainsi traitée sera ultérieurement transplantée.C'est également le cas lorsque l'immunotoxine est utilisée pour réduire la population de cellules T d'un greffon en vue d'applications de greffe allogénique de moelle osseuse dans le but de prévenir les désordres liés à la réaction du greffon contre l'hSte.

Par contre, lorsque l'immunotoxine est utilisée in vivo en tant qu'agent thérapeutique chez l'homme, l'emploi in vivo d'un ionophore afin de bénéficier de l'effet potentialisateur connaît certaines limitations inhérentes
- à la toxicité propre des ionophores;
- à leur faible solubilité dans les solvants
appropriés aux administrations parentérales;
- à leur élimination tres rapide du plasma sanguin.

Selon la présente invention, il a été trouvé que, d'une façon surprenante, ces limitations pouvaient être éliminées en remplaçant les ionophores carboxyliques par des conjugués associant par liaison covalente un ionophore carboxylique monovalent et une macromolécule, telle qu'un anticorps, un fragment d'anticorps, une protéine, un peptide, etc.

Selon un premier aspect, ia présente invention a donc pour objet, en tant que produits nouveaux, des conjugués (molécules artificielles mixtes) construits par liaison covalente d'un ionophore carboxylique monovalent avec des macromolécules (tels des anticorps, des protéines, des ligands peptidiques). Dans la suite de cette demande, de tels conjugués seront désignés sous le nom de "conjugués ionophores.

Les ionophores utilisés sont des molécules connues : ce sont notamment des substances naturelles isolées à partir de souches de champignons Streptomycetes qui comportent un squelette hydrocarbone dans lequel sont inclus des hétérocycles oxygénés. A une extrémité de la chaîne, il existe toujours une fonction acide carboxylique tandis qutà l'autre extrémité se trouvent une ou plusieurs fonctions alcool (B.C. Pressman, Annual
Review of Biochemistry, 45, 501-530, 1976).

Ces substances naturelles, ainsi que certains composés hémisynthétiques qui en dérivent, possedent en commun une activité ionophore, c'est-à-dire la capacité de permettre le transfert d'ions métalliques (et notamment d'ions monovalents) d'une phase hydrophile à une phase lipophile non miscibles.

Les macromolécules utilisées peuvent être des anticorps (ou des fragments d'anticorps), des protéines (telles des hormones peptidiques ou des protéines humaines, par exemple la sérum-albumine humaine), des ligands peptidiques (tels des polypeptides naturels ou synthétiques et en particulier la polylysine).

Dans le cas où l'on utilise un anticorps, celui-- ci peut être soit de caractere polyclonal s'il résulte d'une immunisation classique conduite chez l'animal, soit de caractère monoclonal sil est produit par un ~ clone de cellules hybrides obtenues par fusion entre lymphocytes et cellules de myélome. Cet anticorps pourra être utilise soit sous la forme de molécules entières d'immunoglobuline comportant la capacité à reconnaître l'antigene choisi, soit sous la forme de tout fragment de ces molécules d'immunoglobuline ayant conservé la capacité à reconnattre l'antigene choisi, et en parti culier les fragments connus sous les appellations de F(ab')2, Fab et Fab'.

Le couplage chimique entre les macromolécules et l'ionophore peut être réalise par diverses méthodes sous réserve que la méthode choisie - préserve les activités biologiques respectives des
composants du conjugué; - assure une reproductibilité satisfaisante et un bon
rendement de couplage;.

- permette de maîtriser la valeur du rapport
ionophore/macromolécule dans le conjugué obtenu; - conduise a un produit stable et soluble dans liteau.

Parmi toutes les méthodes de couplage chimique répondant à ces caractéristiques, on peut choisir celles qui mettent en oeuvre une ou plusieurs fonctions thiol pour l'établissement de la liaison. Dans ce cas, on peut utiliser un groupement thiol artificiellement introduit sur l'un des composés à coupler, et introduire sur l'autre composé une- ou plusieurs fonctions susceptibles de réagir avec les fonctions thiol, et ceci en milieu aqueux de pE compris entre 5 et 9, à une température ne dépassant pas 300C, pour fournir une liaison stable, covalente et définie.

Par exemple, on peut introduire artificiellement un thiol sur les ionophores par action de l'anhydride S acétyl-mercapto-succinique qui sera capable d'acyler une des fonctions alcool de l'ionophore. On pourra ensuite libérer cette fonction thiol par élimination du radical acetyl protecteur par action de lthydroxylamine ainsi que cela a déjà été décrit (Archives of Biochemistry and Biophysics, 119, 41-49, 1967). le couplage sera alors réalisé avec la macromolécule sur laquelle on aura introduit une ou plusieurs fonctions susceptibles d'établir une liaison covalente avec le thiol. Cette liaison covalente pourra être soit une liaison disulfure, soit une liaison thioether.

Cas de la Liaison disulfure
Dans ce cas, la préparation du conjugué peut etre représentée par le schéma
ISH + P-R-S-S-X --t I-S-S-R-P + XSH dans lequel
I représente Itionophore à coupler,
P la macromolécule à modifier, -S-S-X désigne un groupement disulfure mixte activé
dont X est le radical activateur.

La macromolécule substituée par un atome de soufre activé est obtenue à partir de la macromolécule elle-même, par substitution à l'aide d'un réactif luimême porteur d'un atome de soufre activé selon le schéma
P + Y-R-S-S-X 'r P-R-S-S-X dans lequel
P est la macromolécule à modifier,
Y représente une fonction permettant la fixation co
valente du réactif sur la protéine,
R désigne un groupement pouvant porter simultanément
les substituants Y et -S-S-X,
X désigne le radical activateur.

Le groupement fonctionnel Y est une fonction capable de se lier de façon covalente avec l'une quelconque des fonctions portées par les chaînes latérales des aminoacîdes constitutifs de la protéine à substituer.

Parmi celles-ci, les fonctions aminées terminales des radicaux lysyle contenues dans la protéine sont particulièrement indiquées. Dans ce cas, Y pourra notamment représenter - un groupe carboxylique qui pourra se lier aux fonc
tions aminées de la protéine en présence d1un agent
de couplage tel qu'un carbodiimide et notamment un
dérivé soluble dans l'eau comme l'éthyl-1 (diéthyl
amino-3 propyl)-3-carbodiimide, - un chlorure d'acide carboxylique qui est susceptible
de réagir directement avec les fonctions aminées pour
les acyler, - un ester dit "activé" tel qu'un ester d'ortho- ou
para-, nitro- ou dinitro-phényle, ou encore un ester
de N-hydroxysuccinimide qui réagit directement avec
les fonctions aminées pour les acyler, - un anhydride interne d'un diacide carboxylique tel,
par exemple, l'anhydride succinique qui réagit spon
tanément avec les fonctions amines pour créer des
liaisons amides, - un groupement imidoester

ou R1 est un groupe alkyle réagissant avec les groupes aminés de la macromolécule selon la réaction

Le radical -S-S-X désigne un disulfure mixte activé capable de réagir avec un radical thiol libre.

En particulier, dans le disulfure mixte, X pourra désigner un groupe pyridyl-2 ou pyridyl-4 éventuellement substitué par un ou des radicaux alkyle, halogène, carboxylique. X peut aussi désigner un groupe phényle, de préférence substitué par un ou des groupes nitro- ou carboxylique. X peut encore représenter un groupe alcoxycarbonyle, tel que le groupe méthoxycarbonyle.

Le radical R désigne tout radical capable de porter simultanément les substituants Y et S-S-X. Il devra être choisi de façon à ne pas comporter de fonctions susceptibles d'interférer au cours des réactions ultérieures avec les réactifs utilisés et les produits synthétisés. En particulier, le groupe R peut être un groupe -(CH2)n avec n compris entre 1 et 10, ou encore un groupe

dans lequel R4 désigne l'hydrogène ou un groupe alkyle ayant de 1 à 8 atomes de carbone, et R3 désigne un substituant inerte vis-à-vis des réactifs utilisés ultérieurement, tel qu'un groupe carbamate

ou
R5 désigne un groupe alkyle droit ou ramifié ayant de 1 à 5 atomes de carbone et notamment le groupe tertiobutyle.

La réaction du composé Y-R-S-S-X avec la macromolécule P est effectuée en phase liquide homogène, le plus souvent dans l'eau ou une solution tampon. Lorsque la solubilité des réactifs l'exige, il est possible d'ajouter au milieu réactionnel jusqu'a 30% en volume d'un solvant organique miscible à l'eau tel qu'un alcool et notamment le butanol tertiaire. La réaction est effectuée à température ambiante pendant un temps variant de quelques minutes à 24 heures. Après quoi, une dialyse permet d'éliminer les produits de faible masse molécu laire, et en particulier les excès de réactif. Ce procédé permet d'introduire -un nombre de substituants par mole de macromolécule habituellement compris entre 1 et 50.

En utilisant de tels composés, le couplage de la macromolécule et de l'ionophore est réalisé par mise en présence en solution aqueuse des deux composés a une température ne dépassant pas 30 C pendant un temps variant de quelques minutes à 1 jour. la solution aqueuse obtenue est dialysée pour éliminer les produits de faible masse moléculaire.

Cas de ta liaison thioéther
La préparation du conjugué consiste alors à faire réagir I-SH avec la protéine P, sur laquelle aura préalablement été introduit un radical maléimide. La réaction est alors représentée par le schéma

dans lequel
Z représente une structure d'espacement, aliphatique
ou aromatique comportant de 1 à 10 atomes de carbone.

La protéine P substituée par le maléimide est obtenue à partir de la protéine P elle-même, par substitution de fonctions aminées de la protéine à l'aide d'un réactif lui-mEme porteur du groupement maléimide, selon le schéma

dans lequel Y1 représente :: - soit un groupe carboxylique, la réaction étant alors
effectuée après activation de la fonction carboxylique
en présence d'un agent de couplage, tel qu'un carbo
diimide et notamment un dérivé soluble dans liteau,
tel que l'ethyl-1 (diéthylamino-3 propyl)-3-carbo
diimide, - soit un ester dit "activé" tel qu'un ester d'ortho- ou
para-, nitro- ou dinitrophényle,ou encore un ester de
N-hydroxysuccinimi-de qui réagit directement avec les
fonctions aminées pour les acyler.

La préparation de tels réactifs est notamment décrite dans Helvetica Chimica Acta, 58, 531-541 (1975).

D'autres réactifs de la même classe sont commercialement disponibles.

La réaction du composé

est effectuée en phase liquide homogène, le plus souvent dans l'eau ou une solution tampon. Lorsque la solubilité des réactifs l'exige, il est possible d'ajouter au milieu réactionnel jusqu'à 20% en volume d'un solvant organique miscible à l'eau, tel qu'un alcool et notamment le butanol tertiaire.

La réaction est effectuée à température ambiante pendant un temps variant de quelques heures à 24 heures.

Après quoi, une dialyse permet d'éliminer les produits de faible masse moléculaire et, en particulier, les excès de réactifs. Ce procédé permet d'introduire un nombre de groupements substituants par mole de protéine habituellement compris entre 1 et 50.

En utilisant de tels composés, le couplage de la macromolécule avec ltîonophore est réalisé par mise en présence en solution aqueuse des deux composés à une température ne depassant pas 300C pendant un temps -va- riant de quelques heures à un jour. La solution obtenue est dialysée pour éliminer les produits de faible masse moléculaire, puis le conjugué peut être purifié par diverses méthodes connues.

Selon un second aspect, l'invention concerne l'utilisation des conjugués ionophores comme potentialisateurs des immunotoxines.

Les études effectuées sur les conjugués ionophores ont montré que lteffet potentialisateur des ionophores est préservé
après couplage avec la macromolécule.

La liaison de l'ionophore à la-macromolécule apporte
à celui-ci une grande solubilité en milieu aqueux
favorable à l'administration in vivo du produit; - la liaison de l'ionophore à la macromolécule allonge
considérablement le temps de demi-vie plasmatique de
l'ionophore, ce qui est essentiel au maintien de
l'effet potentialisateur in vivo; - la toxicité du conjugué est plus faible que 'celle de 1 'ionophore lui-méme.

Ainsi pour chaque patient, on dirigera vers les cellules-cibles au moins deux substances effectrices indispensables au résultat - d'une part, une protéine cytotoxique (telle que par
exemple la chaîne A de ricine) qui sera l'effeceeur
cytotoxique inclus dans le conjugué dit immunotoxine; - d'autre part, l'ionophore (tel que par exemple la
monensine) qui est le constituant du système poten
tialisateur inclus dans le conjugué dit conjugué
ionophore.

Dans le cas où l'ionophore est couplé à une macromolécule possédant un récepteur à la surface des cellules-cibles (par exemple lorsque la macromolécule sera un anticorps ou un fragment d'anticorps reconnaissant un antigène spécifique de la population cellulaire à détruire différent de celui reconnu par l'immunotoxine) ou bien si l'ionophore est couplé à une hormone peptidique possédant un récepteur à-la surface -des cellules à détruire, la probabilité pour que les deux cibles choisies soient présentes ensemble à la surface des cellules non cibles devient très faible et l'on dispose ainsi d'un moyen extremement puissant pour augmenter encore le caractère spécifique de la cytotoxicite.des immunotoxines.

La présente invention concerne donc également l'association médicamenteuse d'au moins une immunotoxine et d1au moins un conjugué ionophore selon l'invention.

Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.

EXEMPLE 1
Conjugué ionophore obtenu par réaction entre l'anticorps T 29-33 substitué par un groupement disulfure activé et la monensine sur laquelle on a introduit un thiol.

a) Anticorps T 29-33
Cet anticorps est un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène T 200 des leucocytes humains. Cet anticorps est décrit dans J. Exp. Met., 1980, 152, 842.

Il est commercialement disponible auprès d'Hybritech
Inc., San Diego - California - USA.

b) Anticorps T 29-33 activé
A 2 ml d'une solution d'anticorps T 29-33 à 10 mg/ml (soit 0,133 micromole d'anticorps) est ajoutée une solution aqueuse contenant 3 mg d'acide (pyridyl2-disulfanyl)-3-propionique préalablement dissous dans le butanol tertiaire et 1,8 mg d'éthyl-l-diméthyamino-3propyl-3-carbodiimide. Le mélange est agité 15 minutes à 300C puis dialysé en continu contre du tampon phosphate 125 mM pH 7 (40 heures à 500 ml/h). Après dialyse, la solution protéique est centrifugée et l'on obtient 2,5 ml d'une solution à 6*6 mg d'anticorps modifie par ml. Par dosage spectrophotométrique à 343 nm de la pyridine thione-2 libérée par échange avec le mercapto-2 éthanol, on constate que l'on a obtenu un anticorps portant 7,2 groupements activateurs par mol-e d'anticorps.

c) Monensine activée
La monensine utilisée est un produit commercial.

Elle a été modifiée comme suit : 693 mg de monensine sont dissous dans le chloroforme puis mis en réaction avec 350 mg d'anhydride S-acétyl mercaptosuccinique (SAMSA). On laisse la réaction évoluer une demi-heure à température ambiante. Le milieu réactionnel est ensuite évaporé à sec sous vide puis repris dans l'acétate d'éthyle et lavé extensivement à l'eau. La phase organique est ensuite séchée et tirée à sec sous vide. Le produit est obtenu cristallisé après séchage sous vide.

Il est identifié par son spectre RMN et son spectre de masse.

d) Préparation du conjugué ionophore
8 mg- (soit 9 micromoles) de monensine activée sont dissous dans le minimum de terbutanol et ajoutés à 2,5 ml de la solution d'anticorps activé à 6,6 mg/ml (soit O,11 micromole) dans le tampon phosphate 125 mM pH 7.

L'incubation dure 2 heures à 250C puis le milieu réactionnel est purifié par dialyse de I'excès de réactifs contre du tampon PBS (phosphate 10 mM, chlorure de sodium 140 m pH 7,4).

Apres dialyse et centrifugation, on a obtenu 2,8 ml d'une solution d'IgG T 29-33 à 5,6 mg/ml portant en moyenne 7 monensines par mole d'anticorps.

EXEMPLE 2 Potentiatisation de L'immunotoxine anti-T65.

Le conjugué selon l'invention, obtenu comme indiqué précédemment, a été étudié en ce qui concerne ses propriétés biologiques et plus spécialement sa capacité à potentialiser l'activité de l'immunotoxine anti-T65 dans un modèle cellulaire approprié.

Ce modele -est constitué par des cellules de la lignée lymphoblastoide humaine CEM qui portent naturellement les antigènes T65 et T2OO. L'antigene T65- contre lequel est dirigée l'immunotoxine utilisée constitue le premier antigène-cible du modèle. Cette immunotoxine est celle qui a été décrite dans une précédente demande de brevet de la Demanderesse déposée en France sous le numéro 81/21836. L'antigène T200 contre lequel est dirigé le conjugué ionophore sera le deuxième antigènecible du modèle.

La proprieté fondamentale des immunotoxines étant d'inhiber la synthèse protéique es cellulescibles, le test utilisé consiste a mesurer l'effet des substances étudiées sur l'incorporation de 14C-leucine dans les cellules cancéreuses en culture. Cette mesure est effectuée selon une technique adaptée de celle décrite dans Journal of Biological Chemistrp, 1974, 249 (11), 3557-3562, utilisant le traceur 14C-leucine pour la détermination du taux de synthèse protéique. La détermination de la radioactivité incorporée est effectuée ici sur les cellules entieres isolées par filtration.

A partir de ces déterminations, on peut tracer les courbes effets/doses présentant en abscisses la concentration molaire en chaîne A des substances étudiées et en ordonnées l'incorporation de 14C-leucine exprimée en pourcentage de l'incorporation des cellules témoins en l'absence de toute substance affectant la~synthèse protéique.

On peut ainsi déterminer pour chaque substance étudiée la concentration qui inhibe 50 Z de l'incorporation de 14C-leucine ou "concentration inhibitrice 50" (CI 50).

Les différents essais ont été conduits comme suit; les résultats expérimentaux correspondants sont présentés sur la figure nO I.

a) Des cellules CEM sont incubées 18 heures en présence
de concentrations connues d'immunotoxine anti-T65
utilisée à titre de référence, puis les cellules
sont soumises à l'étape d'incorporation du traceur
radioactif. La CI 50 obtenue est de 2,8.10 11 M
(courbe 1), ce qui montre que les cellules sont
normalement sensibles à l'effet de l'immunotoxine.

b) Les cellules CEM sont incubées 18 heures à 37"C en
présence d'un mélange de concentrations connues
d'immunotoxine anti-T65 et respectivement
1. soit de monensine libre à la concentration de
50 nu (courbe 2);
2. soit de conjugué ionophore anti-T200 préalablement décrit, à la concentration de 10 N M (soit 70 nM
en monensine) (courbe 3).

Il a été préalablement vérifié que la mone-nsine et le conjugué ionophore ne sont pas cytotoxiques pour les cellules employées aux concentrations indiquées.

Les CI 50 obtenues sont respectivement:
2,4.10-14 M pour la monensine 50 nM
1,4.10 M pour le conjugué ionophore 10-8 M.

Ces résultats montrent des effets potentialisateurs remarquables, d'un facteur de 1000 fois pour la monensine 50 nM et de 2000 fois pour le conjugué iono phore à la concentration de 10 H M (soit 70 nM en monensine).

EXEMPLE 3
Conjugué ionophore obtenu par réaction entre L'anticorps 3E10 substitué par un groupement disulfure activé et la monensine sur laquelle on a introduit un thiol.

a) Anticorps 3E10
Cet anticorps est un anticorps monoclonal dirigé contre un antigène membranaire humain. Il a été obtenu lors d'une fusion lymphocytaire anti-cellules de melanome humaines SK MEL 28. L'hybridome a été cloné et multiplié; l'anticorps a été produit en ascite puis purifié sur pro téine A Sepharose.

b) Anticorps anti-3E10 activé
Cet anticorps est obtenu à partir de l'anticorps ci-dessus selon une technique décrite à exemple 1. On a ainsi obtenu 195- mg d'ànticorps 3E10 possédant 8 groupements activateurs par mole d'anticorps.

c) Monensine activée
La monensine est activée -selon la méthode décrite à l'exemple 1.

d) Préparation du conjugué ionophore
91 mg de monensine activée (soit 104 micromoles) sont dissous dans le minimum de terbutanol et ajoutés à 50 ml de la solution d'anticorps activé à 3,9 mg/ml (soit 1,3 micromole) dans le tampon phosphate 125 mM ph 7.

L'incubation dure 2 heures à 25 C, puis le milieu réactionnel est purifié de l'excès de réactif par dialyse contre du tampon PBS (phosphate 10 mM, chlorure de sodium 140 mM, pH 7,4). Après dialyse et centrifugation, on a obtenu 2,8 ml d'une solution d'IgG à 3,7 mg/ml portant en moyenne 8 monensines par IgG.

EXEMPLE 4
Toxicité du conjugué 3E10-monensine.

Le conjugué 3E10-monensine a été étudié en ce qui concerne ses propriétés biologiques in vivo. Plus specialerilent, sa toxicite et sa pharmacocinétique ont été comparées à celles de la monensine libre.

La toxicité de la monensine libre a été déterminée chers la souris. La dose létale 50 % après injection I.V. est de 4 mg/kg9 soit 80 microgrammes/souris.

La toxicité du conjugué a été testée sur souris en administration unique également par voie I.V. Pour les souris de chaque lot, le produit a été injecté par voie intraveineuse aux doses suivantes : 3,7 mg, 1,85 mg > 0,952 mg, 0,496 m2 de conjugué soit respectivement l'équivalent de 163 g, 81,5 pg, 40,75 g, 20,4 iig de aonensine. Aucune mortalité n'a été observée dans aueun des lots de souris.

EXEMPLE 5
Pharmacocinétique du conjugué -3E10-monensine.

La pharmacocinétique a été étudiée chez la souris nude femelle à l'aide du conjugué ionophore décrit à l'exemple 3.

On injecte aux souris - soit 1 ml de conjugué ionophore à 3,7 mg/ml (soit
163 g de monensine couplée), - soit 163 ug de monensine libre (lot témoin).

Pour chaque temps, les plasmas de deux souris sont prélevé. La monensine active est dosee dans les plasmas par dilution de ceux-ci et cpmparaison avec une courbe-étalon de monensine libre dans le test d'inhibi- tion de la synthèse protéique décrit à l'exemple 1.

Le dosage est effectué sur des cellules CEM en présence de l'immunotoxine anti-T65.

Les résultats sont présentés A la figure 2 sur laquelle on a porté en abscisses le temps en heures et en ordonnées la concentration en monensine en g/ml.

Ces résultats montrent 1) que la monensine libre ne peut pas être mise en évi
dence dans les plasmas (sauf au temps zéro ou l'on
retrouve une concentration plasmatique de 5.10 7 M,
soit environ 0,5 llg/ml, soit dans la masse sanguine
totale de la souris une quantité égale à 0,007 Z de
la dose injectée).

2) Dans le cas du conjugué, on observe que le conjugué
peut être mis en évidence pendant au moins 8 heures
à une concentration de l'ordre de 10 g/ml soit en viron 1 x 10 5 M. Au bout de 24 heures, la concen-
tration retrouvée n'est plus que voisine de 1,5 g/ml.

Cette concentration est cependant 100 fois supérieure
à celle nécessaire à l'activation maximale dans les
conditions des essais in vitro.

EXEMPLE 6
Conjugué ionophore obtenu par réaction entre La sérumalbumine humaine (SA) substituée paon groupement disulfure activé et la monensine sur laquelle on a introduit un thioL.

a) Sérum-albumine humaine activée
La SA a été obtenue A partir de la SA ci-dessus selon une technique analogue à celle décrite pour les anticorps dans les exemples précédents. On a ainsi obtenu 220 mg de SA possédant 16 groupements activateurs par mole d'albumine.

b) Monensine activée
La monensine est activée selon la méthode décrite à l'exemple 1.

c) Preparation du conjugué ionophore
228 mg de monensine activée, soit 268 micromoles, sont dissous dans le minimum de terbutanol et ajoutés à 23 ml de la solution de SA activée à 9,4 mg/ml (soit 52,7 micromoles) dans le tampon phosphate 125 mM pH 7.

L'incubation dure 1 heure à 250C, puis le milieu réactionnel est dialysé contre du tampon PBS (phosphate 10 mbI, chlorure de sodium 140 mH > pH 7,4).

Après dialyse et centrifugation, on a obtenu 28 ml d'une solution de SA modifiée à 8,7 mg/ml portant en moyenne 16 monensines par mole d'albumine.

EXEMPLE 7
Pharmacocinétique du conjugué SA-Monensine.

La pharmacocinétique a été etudiée chez la souris nude mâle à l'aide du conjugué ionophore décrit à l'exemple 6.

Le protocole expérimental utilisé est le même que celui décrit à l'exemple 5.

Les résultats sont présentés à la figure 3 sur laquelle on a porté en abscisses le temps en heures et en ordonnées la concentration en monensine en pg/ml.

Ils montrent que 1) Comme dans le cas de l'exemple 5, la-monensine libre
ne peut pas être mise en évidence dans les plasmas.

2) Le conjugué peut être mis en évidence pendant au
moins 4 heures à une concentration de l'ordre de
30 g/ml. Au bout de 8 heures, la concentration
retrouvée n'est plus que de-l'ordre de 6 pg/ml.

Cette concentration est cependant 400 fois supérieure
à celle nécessaire à l'activation maximale dans les
conditions des essais in vitre.

Claims (5)

REVENDICATIONS

1. A titre de nouveaux produits, les composés ionophores carboxyliques contenant un groupe thiol, éventuellement acétylé, introduit artificiellement par action de l'anhydride

S-acétylmercaptosuccinique sur ledit ionophore et élimination éventuelle du groupe acétyle par l'hydroxylamine.

2. Composé ionophore selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il provient de la monensine.

3. Composé ionophore obtenu par réaction entre la monensine et l'anhydride S-acétylmercapto succinique dans un solvant organique et à la température ambiante.

4. Procédé pour l'obtention d'un composé ionophore selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on traite un composé ionophore avec l'anhydride S-acétyl-mercaptosuccinique dans un solvant organique et à la température ambiante et on libère ensuite la fonction thiol par action de l'hydroxylamine.

5. Procédé selon la revendication 4, caracterisé en ce que le composé ionophore est la monensine.