FR2582001A2 - Nouveaux derives de l'a1-antitrypsine humaine, composition et reactif biologique les contenant - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE ADDITION CONCERNE DES DERIVES DE L'A-ANTITRYPSINE OU DES ANALOGUES DE L'A-ANTITRYPSINE SELON L'UNE DES REVENDICATIONS 1 A 3 DU BREVET PRINCIPAL, CARACTERISES EN CE QUE LA SEQUENCE DE L'A-ANTITRYPSINE OU DE SES ANALOGUES A ETE TRONQUEE DE SES 5 AMINO-ACIDES N-TERMINAUX. CES DERIVES SONT UTILES, NOTAMMENT COMME MEDICAMENTS A ACTIVITE ANTI-ELASTASE AINSI QUE COMME REACTIFS BIOLOGIQUES.
Description
La présente addition concerne de nouveaux dérivés de l'al-antitrypsine ou des analogues tels qu'ils ont été décrits dans la demande de brevet principal, lesquels présentent des propriétés sensiblement équivalentes.
Des études récentes ont mis en évidence que l'a1-antitrypsine ( 1-AT) plasmatique normale est présente sous deux formes, une forme qui a été décrite dans le brevet principal et une autre forme qui comporte une délétion N-terminale de 5 amino-acides.
C'est pourquoi, la présente addition concerne des dérivés de l'a1-AT ou des analogues de l'a1-AT selon l'une des revendications 1 à 3 du brevet principal, caractérisés en ce que la séquence de l'a1-AT ou de ses analogues a été tronquée de ses 5 amino-acides
N-terminaux.
N-terminaux.
D'après les études en cours, il semble que la forme tronquée provienne d'un remaniement de la molécule native dans le plasma. La forme tronquée est présente à une concentration environ 10 fois plus faible que la forme native.
Les essais effectués sur ces variants tronqués montrent qu'ils sont des inhibiteurs efficaces de l'élastase comme la protéine native.
Ces dérivés tronqués peuvent être préparés par des techniques identiques à celles qui ont été décrites dans le brevet principal,en utilisant en lieu et place du gène codant pour les analogues de l'a1-AT, un gène tronqué de 15 bases à l'extrémité 5'.
Les exemples ci-après sont destinés à illustrer plus particulièrement la préparation des nouveaux dérivés selon la présente addition, ainsi que la préparation d'autres variants.
EXEMPLE 1
Préparation du variant / Gly358 / de l'a1 AT
Ce variant est construit par mutagénèse directe du site, à l'aide d'un oligonucléotide synthétique, comme cela a été décrit dans l'exemple 1 du brevet principal.
Préparation du variant / Gly358 / de l'a1 AT
Ce variant est construit par mutagénèse directe du site, à l'aide d'un oligonucléotide synthétique, comme cela a été décrit dans l'exemple 1 du brevet principal.
Dans ce cas-ci, l'oligonucléotide utilisé portant la mutation désirée est le suivant
5' GATAGAACCGGGTATGGC 3'
Ceci conduit à la mutation ATG
5' GATAGAACCGGGTATGGC 3'
Ceci conduit à la mutation ATG
GGT (Met
Gly).
Gly).
Comme cela est décrit dans l'exemple 1 du brevet principal, la mutagénèse est effectuée sur le gène de l'a1-AT sous cloné dans M13mp701. Après la mutation, le fragment BglII-PstI comprenant le gène variant est transféré dans le plasmide d'expression pTG983 décrit dans le brevet principal.
Par transformation de E. coli avec ce plasmide, comme décrit dans le brevet principal, on obtient l'expression du variant g Gly358 / de l'a1-AT.
EXEMPLE 2 - 358 - - 358 -
Préparation des variants [Leu358], [Ala358], [Ile358] et [Phe358] de l'α1-AT
Les différents variants mentionnés précédemment sont préparés par remplacement d'un fragment approprié d'ADN dans le gène de l'a1-AT.
Préparation des variants [Leu358], [Ala358], [Ile358] et [Phe358] de l'α1-AT
Les différents variants mentionnés précédemment sont préparés par remplacement d'un fragment approprié d'ADN dans le gène de l'a1-AT.
Le principe de la technique est décrit dans la figure 1 ci-annexée.
Les variants sont construits en remplacant un petit segment d'ADN au niveau de la région codant pour l'acide aminé 358 par un fragment synthétique double-brin contenant la mutation appropriée
Le petit fragment est clivé à partir du gène en utilisant les enzymes de restriction NdeI et AvaI qui coupent de chaque côté de la région codant pour le site actif de l'a1-AT.
Le petit fragment est clivé à partir du gène en utilisant les enzymes de restriction NdeI et AvaI qui coupent de chaque côté de la région codant pour le site actif de l'a1-AT.
Le site AvaI existe déjà dans le gène d'origine, mais un nouveau site NdeI doit être créé pour-la mise en oeuvre du procédé ; ceci est effectué par une mutation dirigée du site par un oligonucléotide synthétique (voir exemple 1 de la présente addition).
Après traitement par les enzymes de restriction, le plasmide délété de la région codant pour le site actif est séparé par électrophorèse préparative sur gel et traité avec de la phosphatase d'intestin de veau, puis cette préparation est liée, en utilisant la ligase T4, avec un petit fragment d'ADN synthétique contenant la mutation désirée ainsi que des séquences formant des extensions 5' mono-brin correspondant à celles du gène coupé par NdeI et AvaI.
Cette méthodologie conduit à des constructions identiques à celle de pTG983, à la seule différence des mutations au niveau du site actif.
Chacun des variants est produit dans E. coli avec des niveaux qui sont voisins de ceux obtenus pour pTG983 décrit dans le brevet principal, comme cela ressort d'essais d'immunodiffusion radiale, c 'est-à-dire à des taux d'environ 1 % des protéines cellulaires totales de
E. coli.
E. coli.
Les extraits, soniqués et clarifiés, sont testés pour la présence de l'activité inhibitrice de l'élastase neutrophile humaine ou de la cathepsine G.
Les résultats obtenus sont rassemblés dans les figures 2 et 3 annexées, l'inhibition de l'élastase étant mesurée comme cela est décrit dans l'exemple 2 du brevet principal et l'activité cathepsine G étant mesurée en utilisant un substrat chromogénique, le N-succinyleala-ala-pro-phe-p-nitroanilide.
Les variants [Leu358], [Ala358] et [Ile358] inhibent l'activité élastase comme les variants j Met358] et [Val358] décrits en détail au brevet principal, tandis que les variants [Gly358] et [Arg358] ne le font pas.
De tous les variants testés, seuls les variants [Leu358] et Met358 / inhibent la cathepsine G.
Le traitement avec 10 mM N-chlorosuccinimide (CNS) dont les résultats sont représentés à la figure 4 montre que dans des conditions où le variant [Met358] (figure 4a) est complètement inactivé par oxydation, les variants [Leu358] (figure 4b), [Ala358] (figure 4c), [Ile358] (figure 4d) et / Val358] (figure 4e) demeurent pleinement actifs contre l'élastase neutrophile.
EXEMPLE 3
Production des variants tronqués de l'α1-AT
Ces variants sont préparés de la façon suivante, illustrée par la figure 5
On part du plasmide pTG983 qui est muté à l'aide d'un oligonucléotide synthétique de façon à créer un site unique ApaI autour du codon 8 en remplaçant les deux nucléotides CT du codon 7 par les nucléotides GG.
Production des variants tronqués de l'α1-AT
Ces variants sont préparés de la façon suivante, illustrée par la figure 5
On part du plasmide pTG983 qui est muté à l'aide d'un oligonucléotide synthétique de façon à créer un site unique ApaI autour du codon 8 en remplaçant les deux nucléotides CT du codon 7 par les nucléotides GG.
Ensuite, on effectue une nouvelle mutation du plasmide pour créer un site NdeI au niveau du codon d'initiation de la traduction.
Le plasmide résultant est traité par les enzymes Apal et NdeI de façon à déléter la partie correspondant aux amino-acides que l'on souhaite tronquer.
Ce fragment délété est remplacé par un oligonucléotide synthétique qui permet d'assurer la fusion du 6ème codon de l1a1-AT au codon d'initiation.
Afin d'améliorer le niveau d'expression des protéines tronquées, le site de fixation des ribosomes présent sur pTG983 a été remplacé par un site de fixation des ribosomes synthétiques nommé R1 qui présente la structure représentée sur la figure 5 et qui se trouve inséré entre les sites de restriction ClaI et NdeI.
Par transformation de E. coli à l'aide du plasmide obtenu, nommé pTG1904R1T2, on obtient une a1-AT dépourvue des 5 premiers amino-acides de l'extrémité
N-terminale ; son taux d'expression est de l'ordre de 15 z des protéines cellulaires totales de E. coli.
N-terminale ; son taux d'expression est de l'ordre de 15 z des protéines cellulaires totales de E. coli.
Cette expression est mesurée par lecture densitométrique d'un gel d'électrophorèse coloré au bleu de Coomassie.
Les surnageants soniqués et clarifiés des cellules induites contiennent l'a1-AT tronquée ; celle-ci inhibe efficacement l'élastase neutrophile humaine.
On observe une bonne corrélation entre le dosage par immunodiffusion radiale et l'activité anti-élastase.
Compte tenu de la mise en évidence de cette activité desdits dérivés tronqués, la présente addition s'étend également aux compositions pharmaceutiques et aux réactifs biologiques les contenant, notamment aux réactifs utiles au dosage de l'élastase neutrophile et de la thrombine.
Claims (4)
1) Dérivés de l' 1-antitrypsine ou des analogues de l'a1-antitrypsine selon l'une des revendications 1 à 3 du brevet principal, caractérisés en ce que la séquence de l'α1-antitrypsine ou de ses analogues a été tronquée de ses 5 amino-acides N-terminaux.
Gly5] α-AT.
2) / AGlu1
3) Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comporte un composé selon l'une des revendications 1 et 2.
4) Réactif biologique caractérisé en ce qu'il comporte un composé selon l'une des revendications 1 et 2, utile, notamment, au dosage de l'élastase neutrophile et de la thrombine.
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2582001B2 (fr) | 1988-04-29 |
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