FR2610632A1 - Peptides caracteristiques des retrovirus d'immunodeficience humaine (virus hiv) leurs applications au diagnostic des infections dues a certains de ces virus et, le cas echeant, a la vaccination contre le sida - Google Patents

Peptides caracteristiques des retrovirus d'immunodeficience humaine (virus hiv) leurs applications au diagnostic des infections dues a certains de ces virus et, le cas echeant, a la vaccination contre le sida Download PDF

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Abstract

PEPTIDES AYANT DES PROPRIETES IMMUNOLOGIQUES EN COMMUN AVEC L'OSSATURE PEPTIDIQUE DE LA GLYCOPROTEINE D'ENVELOPPE DES VIRUS DE LA CLASSE HIV-2, CES PEPTIDES CONTENANT UN NOMBRE DE RESIDUS D'ACIDES AMINES N'EXCEDANT PAS 40. APPLICATIONS AU DIAGNOSTIC ET AU VACCIN.

Description

PEPTIDES CARACTERISTIQUES DES RETROVIRUS
D'IMMUNODEFICIENCE HUMAINE (VIRUS HIV)
LEURS APPLICATIONS AU DIAGNOSTIC DES INFECTIONS DUES
A CERTAINS DE CES VIRUS ET, LE CAS ECHEANT,
A LA VACCINATION CONTRE LE SIDA
La présente invention est relative â des peptides ayant des propriétés d'immunologiques, le cas échéant immunogènes, en commun avec des antigènes susceptibles d'être obtenus sous une forme purifiée, à partir de virus capables de provoquer des lymphadénopathies susceptibles d'être relayées ensuite par le symdrome d'immunodéficience acquise (SIDA) chez l'homme.
L'invention concerne en particulier des peptides antigéniques susceptibles d'être reconnus par des anticorps induits chez l'homme par des virus désignés par l'abréviation HIV, selon la nomenclature définie dans NATURE. Elle concerne également des peptides ayant des propriétés immunogènes ou susceptibles d'être rendus immunogènes in vivo, cette immunogénicité étant susceptible de se manifester par l'induction in vivo d'anticorps reconnaissant des antigènes caractéristiques des virus HIV-2 et même, au moins en ce qui concerne certains de ces peptides, des antigènes issus de H 1V-I.
L'invention concerne en outre des applications de ces peptides à la fabrication de compositions pour le diagnostic in vitro chez l'homme de potentialité de certaines formes du SIDA et, en ce qui concerne certains d'entre eux, à la production de compositions immunogènes et de compositions vaccinantes contre les rétrovirus HIV
De même l'invention concerne les applications aux mêmes fins des anticorps susceptibles d'être induits vivo par les peptides immunogènes ou rendus immunogènes et, pour certains de ces anticorps, leurs applications à la production de principes actifs de médicaments contre ces SIDAS humains.
L'invention concerne également la mise en oeuvre de certains de ces peptides dans des procédés pour le diagnostic in vitro chez l'homme de certaines formes du SIDA, ainsi que leur application à la constitution de trousses ou "kits" de diagnostic.
Un premier rétrovirus dénommé LAV-1 ou HIV-1 a été isolé et décrit dans la demande de brevet
GB.83/24.800 et une demande EP.84/401.834 du 14/09/84.
Ce virus a également été décrit par F.Barre Sinoussi et al. dans Science, 220 n 45-99, 20 pages 868-871.
Des variants de ce virus HIV-1 désignés par
LAV ELI et LAV MAL, ont également été isolés, caractérisés et décrits dans la demande de brevet EP.84/ 401.834.
Les virus HIV-1 et leurs variants possèdent les propriétés suivantes
- ils ont pour cibles préférencielles les cellules Leu3 (ou lymphocytes T4) humaines et leurs cellules dérivées "immortalisées".
- ils ont une activité transcriptase inverse nécessitant la présence d'ions Mg2+ et présentent une forte activité pour le poly(adenylate-oligo-deoxythymidylase) poly(A)-oligo(dT)12-18)
- ils ont une densité de 1,16 à 1,17 sur gradient de sucrose,
- ils ont un diamètre moyen de 139 nanomètres et un noyau de diamètre moyen de 41 nanomètres,
- les lysats de ces virus contiennent une protéine p25 (protéine du noyau) qui ne croise pas immunologiquement avec la protéine p24 de HIV-1,
- ils contiennent une protéine p42 appartenant à leur enveloppe,
- ils contiennent également une glycoprotéine d'enveloppe gap110 d'un poids moléculaire de 110.000.
L'isolement et la caractérisation de rétrovirus appartenant à une classe distincte et n'ayant qu'une parenté immunologique réduite avec les précédents, ont été décrits dans la demande de brevet européen n 87/400.151.4. Ces rétrovirus qui ont été regroupés sous la désignation HIV-21 ont été isolés chez plusieurs malades africains présentant des symptômes d'une lymphadénopathie ou d'un SIDA.
Les rétrovirus du type HIV-2 comme les rétrovirus du type HIV-1, se caractérisent par un tropisme pour les lymphocytes T4 humains et par un effet cytopathogène à l'égard de ces lymphocytes, lorsqu'ils s'y multiplient, pour alors causer soit des poly-adénopathies généralisées et persistantes, soit un SIDA.
Plus généralement les rétrovirus purifiés par H=V-2 possèdent en général les propriétés suivantes - la cible préférentielle des rétrovirus HIV-2 est constituée par les cellules Leu3 (ou lymphocytes T4) humaines et pour des cellules "immortalisées" dérivées de ces lymphocytes T4 - ils sont cytotoxiques pour les lymphocytes T4 humains - ils ont une activité de transcriptase inverse nécessitant la présence d'ions Mg2+ et présentant une forte activité pour le poly(adénylate-oligodéoxyth ylase) (poly(A)-oligo(dT) 12-18) - ils ont une densité de 1,16 dans un gradient de sucrase - ils ont un diamètre moyen de 140 nanomètres et un noyau ayant un diamètre moyen de 41 nanomètres - ils peuvent être cultivés dans des lignées permanentes du type HUT ou exprimant la protéine T4 - ils ne sont pas infectieux pour les lymphocytes T8 - les lysats de ces virus contiennent une protéine p26 qui ne croise pas immunologiquement avec la protéine p24 du virus HTLV-I ou du virus HTLV-II - ces lysats contiennent en outre une protéine p16 qui n'est pas reconnue immunologiquement par la protéine p19 de HTLV-I ou de HTLV-II dans des essais de radioimmunoprécipitation - ils contiennent en outre une glycoprotéine d'enveloppe ayant un poids moléculaire de l'ordre de 130.000-140.000 qui ne croise pas immunologiquement avec la gap110 des
HIV-1, mais qui en revanche croise immunologiquement avec la glycoprotéine d'enveloppe gp140 de STLV-II= (virus isolé chez le singe) - ces lysats contiennent encore des antigènes marquables par la 35S-cystéine, dont les poids moléculaires s'éta- gent entre 32.000 et 42.000-45.000 : ils comprennent notamment un antigène ayant un poids moléculaire de l'or- dre de 36.000 et un antigène ayant un poids moléculaire de l'ordre de 42.000, l'un de ces antigènes (p36 et p42) constituant vraisemblablement une glycoprotéine transmembranaire du virus HIV-2 - l'ARN génomique des HIV-2 n'hybride pas avec l'ARN génomique de HIV-1 dans des conditions stringentes - dans des conditions non stringentes, l'ARN génomique de HIV-2 n'hybride, ni avec le gène env et le LTR qui le jouxte, de HIV-1, ni avec des séquences de la région Pol du génome de HIV-1 - dans des conditions non stringentes, il hybride faiblement avec des séquences de nucléotides de la région de HIV-1.
La poursuite de l'étude des rétrovirus HIV-2 a également conduit à l'obtention de séquences d'ADN complémentaires (ADNc) des ARNs de leurs génomes. La séquence nucléotidique complète de l'ADNc d'un rétrovirus représentatif de la classe HIV-2 (HIV-2 ROD déposé le 21/02/1986 à la CNCM sous le n I-522, sous le nom de référence LAV-II ROD).
Cette séquence nucléotidique et les phases de lecture ouverte qu'elle contient sont indiqués ci-après.
EiV2 .ROD
Figure img00050001
GTGTGCTCCCATCTCTCCTAGTCGCCGCCTGGTCATTCGGTGTTCACCTGAGTAACAAGA
. 200 . . . .
CCCTGGTCTGTTAGGACCCTTCTTGCTTTGGGAAACCGAGGCAGGAAAATCCCTAGCAGG
. . . . . 300
TTGGCGCCTGAACAGGGACTTGAAGAAGACTGAGAAGTCTTGGAACACGGCTGAGTGAAG
. . . . . .
GCAGTAAGGGCGGCAGGAACAAACCACGACGGAGTGCTCCTAGAAAGGCGCGGGCCGAGG
. . . 400 . .
TACCAAAGGCAGCGTGTGGAGCGGGAGGAGAAGAGGCCTCCGGGTGAAGGTAAGTACCTA
. . . . . .
CACCAAAAACTGTAGCCGAAAGGGCTTGCTATCCTACCTTTAGACAGGTAGAAGATTGTG
. 500 . . . .
MetGlyAlaArgAsnSerVarLeuArgGluLysLysAlaAspGluLeuGluArgIle
GGAGATGGGCGCGAGAAACTCCGTCTTGAGAGGGAAAAAAGCAGATGAATTAGAAAGAAT
. . . . . 600
ArgLeuArgProGlyGlyLysLysLysTyrArgLeuLysHisIleValTrpAlaAlaAsn
CAGGTTACGGCCCGGCGGAAAGAAAAAGTACAGGCTAAAACATATTGTGTGGGCACCGAA
. . . . . .
LysLeuAspArgPheGlyLeuAlsGluSerLeuLeuGluSerLysGluGlyCysGlnLys
TAAATTGGACAGATTCGGATTAGCAGAGAGCCTGTTGGAGTCAAAAGAGGGTTGTCAAAA
. . . 700 . .
IleLeuThrValLeuAspProMetValProThrGlySerGluAsnLeuLysSerLeuPhe
AATTCTTACAGTTTTAGATCCAATGGTACCGACAGGTTCAGAAAATTTAAAAAGTCTTTT
. . . . . .

AsnThrValCysValIleTrpCysIleHisAlaGluGluLysValLysAspThrGluGly
TAATACTGTCTGGGTCATTTGGTGCATACACGCAGAAGAGAAAGTGAAAGATACTGAAGG
. 800 . . . .
AlaLysGlnIleValArgArgHisLeuValAlaGluThrGlyThrAlaGluLysHetPro
AGCAAAACAAATACTGCGGAGACATCTAGTGGCAGAAACAGGAACTGCAGAGAAAATGCC
SerThrSerArgProThrAlaProSerSerGluLysGlyGlyAsnTyrProValGluHis
AAGCACAAGTAGACCAACAGCACCATCTAGCGAGAAGGGAGGAAATTACCCAGTGCAACA
. . . . . .
ValGlyGlyAsnTyrThrHisIleProLeuSerProArgThrLeuAsnAlaTrpValLys
TGTAGGCGGGAAGTACACCCATATACCGCTGAGTCCCCGAACCCTAAATGCGTGGGTAAA
. . . 1000 . .
LeuValGluGluLysLysPheGlyAlaGluValValProGlyPheGlnAlaLeuSerGlu
ATTAGTAGAGGAAAAAAAGTTCGGGGCAGAAGTAGTGCCAGGATTTCAGGCACTCTCAGA
. . . . . .
GlyCysThrProTyrAspIleAsnGlnMetLeuAsnCysValGlyAspHisGlnAlaAla
AGGCTGCACGCCCTATGATATCAACCAAATGCTTAATTGTGTGGGCGACCATGAAGCAGC
. 1100 . . . .
MetGlnIleIleArgGluIleIleAsnGluGluAlaAlaGluTrpAsnValGlnHisPro
CATGCAGATAATCAGGGAGATTATCAATGAGGAAGCAGGAGAATGGGATGTGCAACATCC
. . . . . 1200
IleProGlyProLeuProAlaGlyGlnLeuArgGluProArgGlySerAspIleAlaGly
AATACCAGGCCCCTTACCAGCGGGGCAGCTTAGAGAGCCAAGGGGATCTGACATAGCAGG
. . . . . .
ThrThrSerThrValGluGluGlnIleGlnTrpMetPheArgProGlnAsnProValPro
GACAACAAGCACAGTAGAAGAACAGATCCAGTGGATGTTTAGCCCACAAAATCCTGTACC
. . . 1300 . .
ValGlyAsnIleTyrArgArgTrpIleGlnIleGlyLeuGlnLysCysValArgMetTyr
AGTAGGAAACATCTATAGAAGATGGATCCAGATAGGATTGCAGAAGTGTGTCAGGATGTA
. . . . . .
AsnProThrAsnIleLeuAspIleLysGlnGlyProLysGluProPheGlnSerTyrVal
CAACCCGACCAACATCCTAGACATAAAACAGGGACCAAAGGAGCCGTTCCAAAGCTATGT
. 1400 . . . .
AspArgPheTyrLysSerLeuArgAlaGluGlnThrAspProAlaValLysAsnTrpMet
AGATAGATTCTACAAAAGCTTGAGGGCAGAACAAACAGATCCAGCAGTGAAGAATTGGAT
. . . . . 1500
ThrGlnThrLeuLeuValGlnAsnAlaAsnProAspCysLysLeuValLeuLysGlyLeu
GACCCAAACACTGCTAGTACAAAATGCCAACCCAGACTGTAAATTAGTGCTAAAAGGACT
. . . . . .
GlyMetAsnProThrLeuGluGluMetLeuThrAlaCysGlnGlyValGlyGlyProGly
AGGGATGAACCCTACCTTAGAAGAGATGCTGACCGCCTGTCAGGGGGTAGGTGGGCCAGG
. . . . 1600 .
GlnLysAlaArgLeuMetAlaGluAlaLeuLysGluValIleGlyPrc aProIlePro
CCAGAAAGCTAGATTAATGGCAGAGGCCCTGAAAGAGGTCATAGGACCT@@CCCTATCCC
. . . . . .
PheAlaAlaAlaGlnGlnArgLysAlaPheLysCysTrpAsnCysGlyLysGluGlyHis
ATTCGCAGCAGCCCAGCAGAGAAAGGCATTTAAATGCTGGAACTGTGGAAAGGAAGGGCA
. 1700 . . . .
SerAlaArgGlnCysArgAlaProArgArgGlnGlyCysTrpLysCysGlyLysProGly
CTCGGCAAGACAATGCCGAGCACCTAGAAGGCAGGGCTGCTGGAAGTGTGGTAAGCCAGG
. . . . . 1800
ThrGlyArgPhePheArgThrGlyProLeuGly
HisIleMetThrAsnCysProAspArgGlnAlaGlyPheLeuGlyLeuGlyProTrpGly
ACACATCATGACAAACTGCCCAGATAGACAGGCAGGTTTTTTAGGACTGGGCCCTTGGGG
. . . . . .
LysGluAlaProGlnLeuProArgGlyProSerSerAlaGlyAlaAspThrAsnSerThr
LysLysProArgAsnPheProValAlaGlnValProGlnGlyLeuThrProThrAlaPro
AAAGAAGCCCCGCAACTTCCCCGTGGCCCAAGTTCCGCAGGGGCTGACACCAACAGCACC
. . . 1900 . .
ProSerGlySerSerSerGlySerThrGlyGluIleTyrAlaAlaArgGluLysThrGlu
ProValAspProAlaValAspLeuLeuGluLysTyrMetGlnGlnGlyLysArgGlnArg
CCCAGTGGATCCAGCAGTGGATCTACTGGAGAAATATATGCAGCAAGGGAAAAGACAGAG
. . . . . .

ArgAlaGluArgGluThrIleGlnGlySerAspArgGlyLeuThrAlsProArgAlaGly
GluGlnArgGluArgProTyrLysGluValThrGluAspLeuLeuHisLeuGluGlnGly
AGAGCAGAGAGAGAGACCATACAAGGAAGTGACAGAGGACTTAGTGCACCTCGAGCAGGG
GlyAspThrIleGlnGlyAlaThrAsnArgGlyLeuAlaAlaProGlnPheSerLeuTrp
GluThrProTyrArgGluProProThrGluAspLeuLeuHisLeuAsnSerLeuPheGly
GGAGACACCATACAGGGAGCCACCAACAGAGGACTTGCTGCACCTCAATTCTCTCTTTGG
. . . . . 2100
LysArgProValValThrAlaTyrIleGluGlyGlnProValGluValLeuLeuAspThr
LysAspGln
AAAAGACCAGTAGTCACAGCATACATTGAGGGTCAGCCAGTAGAAGTCTTGTTAGACACA
. . . . . .
GlyAlaAspAspSerIleValAlaGlyIleGluLeuGlyAsnAsnTyrSerProLysIle
GGGGCTGACGACTCAATAGTAGCAGGAATAGAGTTAGGGAACAATTATAGCCCAAAAATA
. . . 2200 . .
ValGlyGlyIleGlyGlyPheIlaAsnThrLysGluTyrLysAsnValGluIleGluVal
GTAGGGGGAATAGGGGGATTCATAAATACCAAGGAATATAAAAATGTAGAAATAGAAGTT
. . . . . .
LeuAsnLysLysValArgAlaThrIleMetThrGlyAspThrProIleAsnIlePheGly
CTAAATAAAAAGGTACGGGCCACCATAATGACAGGCGACACCCCAATCAACATTTTTGGC
. 2300 . . . .
ArgAsnIleLeuThrAlaLeuGlyMetSerLeuAsnLeuProValAlaLysValGluPro
AGAAATATTCTGACAGCCTTAGGCATGTCATTAAATCTACCAGTCGCCAAAGTAGAGCCA
. . . . . 2400
IleLysIleMetLeuLysProGlyLysAspGlyProLysLeuArgGlnTrpProLeuThr
ATAAAAATAATGCTAAAGCCAGGGAAAGATGGACCAAAACTGAGACAATGGCCCTTAACA
. . . . . .
LysGluLysIleGluAlaLeuLysGluIleCysGluLysMetGluLysGluGlyGlnLeu
AAAGAAAAAATAGAAGCACTAAAAGAAATCTGTGAAAAAATGGAAAAAGAAGGCCAGCTA
. . . 2500 . .
GluGluAlaProProThrAsnProTyrAsnThrProThrPheAlaIleLysLysLysAsp
GAGGAAGCACCTCCAACTAATCCTTATAATACCCCCACATTTGCAATCAAGAAAAAGGAC
. . . . . .
LysAsnLysTrpArgMetLeuIleAspPheArgGluLeuAsnLysValThrGlnAspPhe
AAAAACAAATGGAGGATGCTAATAGATTTCAGAGAACTAAACAAGGTAACTGAAGATTTC
. 2600 . . . .
ThrGluIleGlnLeuGlyIleProHisProAlaGlyLeuAlaLysLysArgArgIleThr
ACAGAAATTCAGTTAGGAATTCCACACCCAGCAGGGTTGGCCAAGAAGAGAAGAATTACT
. . . . . 2700
ValLeuAspValGlyAspAlaTyrPheSerIleProLeuHisGluAspPheArgProTyr
GTACTAGATGTAGGGGATGCTTACTTTTCCATACCACTACATGAGGACTTTAGACCATAT
. . . . . .
ThrAlaPheThrLeuProSerValAsnAsnAlaGluProGlyLysArgTyrIleTyrLys
ACTGCATTTACTCTACCATCAGTGAACAATGCAGAACCAGGAAAAAGATACATATATAAA
. . . 2800 . .
ValLeuProGlnGlyTrpLysGlySerProAlaIlePheGlnHisThrMetArgGlnVal
GTCTTGCCACAGGGATGGAAGGGATCACCAGCAATTTTTCAACACACAATGAGACAGGTA
. . . . . .
LeuGluProPheArgLysAlaAsnLysAspValIleIleIleGlnTyrMetAspAspIle
TTAGAACCATTCAGAAAAGCAAACAAGGATGTCATTATCATTGAGTACATGGATGATATC
. 2900 . . . .
LeuIleAlaSerAspArgThrAspLeuGluHisAspArgValValLeuGlnLeuLysGlu
TTAATAGCTAGTGACAGGACAGATTTAGAACATGATAGGGTAGTCCTGCAGCTCAAGGAA
. . . . . 3000
LeuLeuAsnGlyLeuGlyPheSerThrProAspGluLysPheGlnLysAspProProTyr
CTTCTAAATGGCCTAGGATTTTCTACCCCAGATGAGAAGTTCCAAAAAGACCCTCCATAC
. . . . . .
HisTrpMetGlyTyrGluLeuTrpProThrLysTrpLysLeuGlnLysIleGlnLeuPro
CACTGGATGGGCTATGAACTATGGCCAACTAAATGGAAGTTGCAGAAAATACAGTTGCCC
. . . 3100 . .
GlnLysGluIleTrpThrValAsnAspIleGlnLysLeuValGlyValLeuAsnTrpAla
CAAAAAGAAATATGGACAGTCAATGACATCCAGAAGCTAGTGGGTGTCCTAAATTGGGCA
. . . . . .
AlaGlnLeuTyrProGlyIleLysThrLysHisLeuCysArgLeuIleArgGlyLysMet
GCACAACTCTACCCAGGGATAAAGACCAAACACTTATGTAGGTTAATCAGAGGAAAAATG
. 3200 . . . .
ThrLeuThrGluGluValGlnTrpThrGluLeuAlaGluAlaGluLeuGluGluAsnArg
ACACTCACAGAAGAAGTACAGTGGACAGAATTAGCAGAAGCAGAGCTAGAAGAAAACAGA
. . . . . 3300
IleIleLeuSerGlnGluGlnGluGlyHisTyrTyrGlnGluGluLysGluLeuGluAla
ATTATCCTAAGCCAGGAACAAGAGGGACACTATTACCAAGAAGAAAAAGAGCTAGAAGCA T@rValClnLysAspGluGluAsnGluTrpThrTyrLysIleHisGlnGluGluLysIle
AGAGTCCAAAAGGATCAAGAGAATGAGTGGACATATAAAATACACCAGGAAGAAAAAATT
LeuLysValGlyLysTyrAlaLysValLysAsnThrHisThrAsnGlyIleArgLeuLeu
CTAAAAGTAGGAAAATATGCAAAGGTGAAAAACACCCATACCAATGGAATCAGATTGTTA
. . . . . .
AlaGlnValValGlnLysIleGlyLysGluAlaLeuValIleTrpGlyArgIleProLys
GCACAGGTAGTTCAGAAAATAGGAAAAGAAGGACTAGTCATTTGGGGACGAATACCAAAA
. 3500 . . . .
PheHisLeuProValGluArgGluIleTrpGluGlnTrpTrpAspAspTyrTrpGlnVal
TTTCACCTACCAGTAGAGAGAGAAATCTGGGAGCAGTGGTGGGATAACTACTGGCAAGTG
. . . . . 3600
ThrTrpIleProAspTrpAspPheValSerThrProProLeuValArgLeuAlaPheAsn
ACATGGATCCCAGACTGGGACTTCGTGTCTACCCCACCACTGGTCAGGTTAGCGTTTAAC
. . . . . .
LeuValGlyAspProIleProGlyAlsGluThrPheTyrThrAspGlySerCysAsnArg
CTGGTAGGGGATCCTATACCAGGTGCAGAGACCTTCTACACAGATCGATCCTGCAATAGG
. . . . 3700 .
GlnSerLysGluGlyLysAlaGlyTyrValThrAspArgGlyLysAspLysValLysLys
CAATCAAAAGAAGGAAAAGCAGGATATGTAACAGATAGAGGGAAAGACAAGGTAAAGAAA
. . . . . .
LeuGluGlnThrThrAsnGlnGlnAlaGluLeuGluAlaPheAlaMetAlaLeuThrAsp
CTAGAGCAAACTACCAATCAGGAAGCAGAACTAGAAGCCTTTGCGATGGCACTAACAGAC
. 3800 . . . .
SerGlyProLysValAsnIleIleValAspSerGlnTyrValMetGlyIleSerAlaSer
TCGGGTCCAAAAGTTAATATTATAGTAGACTCACAGTATGTAATGGGGATCAGTGCAAGC
. . . . . 3900
GlnProThrGluSerGluSerLysIleValAsnGlnIleIleGluGluMetIleLysLys
CAACCAACAGAGTCAGAAAGTAAAATAGTGAACCAGATCATAGAAGAAATGATAAAAAAG . @@. . . . .
GluAlsIleTyrValAlaTrpValProAlaHisLysGlyIleGlyGlyAsnGlnGluVal
GAAGCAATCTATGTTGCATGGGTCCCAGCCCACAAAGGCATAGGGGGAAACCAGGAAGTA
. . . 4000 . .
AspHisLeuValSerGlnGlyIleArgGlnValLeuPheLeuGluLysIleGluProAla
GATCATTTAGTGAGTCAGGGTATCAGACAAGTGTTGTTCGTGGAAAAAATAGAGCCCGCT
. . . . . .
GlnGluGluHisGluLysTyrHisSerAsnValLysGluLeuSerHisLysPheGlyIle
CAGGAAGAACATGAAAAATATCATAGCAATGTAAAAGAACTGTCTCATAAATTTGGAATA
. 4100 . . . .
ProAsnLeuValAlaArgGlnIleValAsnSerCysAlsGlnCysGlnGlnLysGlyGlu
CCCAATTTAGTGGCAAGGCAAATAGTAAACTCATGTGCCCAATGTCAACAGAAAGGGGAA
. . . . . 4200
AlaIleHisGlyGlnValAsnAlaGluLeuGlyThrTrpGlnMetAspCysThrHisLeu
GCTATACATGGGCAAGTAAATGCAGAACTAGGCAGTTGGCAAATGGACTGCACACATTTA
. . . . . .
GluGlyLysIleIleIleValAlaValHisValAlaSerGlyPheIleGluAlaGluVal
GAAGGAAAGATCATTATAGTAGCAGTACATGTTGCAAGTGGATTTATAGAAGCAGAAGTC
. . . 4300 . .
IleProGlnGluSerGlyArgGlnThrAlaLeuPheLeuLeuLysLeuAlaSerArgTrp
ATCCCACAGGAATCAGGAAGACAAACAGCACTCTTCCTATTGAAACTGGCAAGTAGGTGG
ProIleThrHisLeuHisThrAspAsnGlyAlaAsnPheThrSerGlnGluValCysMet
CCAATAACACACTTGGATACAGATAATGGTGCCAACTTCACTTCACAGGAGGTGAAGATG
. 4400 . . . .
ValAlaTrpTrpIleGlyIleGluGlnSerPheGlyValProTyrAsnProGlnSerGln
GTAGCATGGTGGATAGGTATAGAACAATCGTTTGGAGTACCTTACAATCCACAGAGCCAA
. . . . . 4500
GlyValValGluAlaMetAsnHisHisLeuLysAsnGlnIle@erGluThrIleValLeu
GGAGTAGTAGAAGCAATGAATCACCATCTAAAAAACCAAATAAGTGAAACAATAGTACTA
. . . . . .
MetAlaIleHiscysMetAsnPheLysArgArgGlyGlyIleGlyAspMetThrProSer
ATGGCAATTCATTGCATGAATTTTAAAAGAAGGGGGGGAATAGGGGATATGACTCCATCA
. . . 4600 . .
GluArgLeuIleAsnMetIleThrThrGluGlnGluIleGlnPheLeuGlnAlaLysAen
GAAAGATTAATCAATATGATCACCACAGAACAAGAGATACAATTCCTCCAAGCCAAAAAT
. . . . . .
SerLysLeuLysAspPheArgValTyrPheArgGluGlyArgAspGlnLeuTrpLysGly
TCAAAATTAAAAGATTTTCGGGTCTATTTCAGAGAAGGCAGAGATCAGTTGTGGAAAGGA
. 4700 . . . .
ProGlyGluLeuLeuTrpLysGlyGluGlyAlaValLeuValLysValGlyThrAspIle
CCTGGGGAACTACTGTGGAAAGGAGAAGGAGCAGTCCTAGTCAAGGTAGGAACAGACATA
. . . . . 4800
LysIleIleProArgArgLysAlaLysIleIleArgAspTyrGlyGlyArgGlnGluMet
MetGluGluAspLysArgTrp
AAAATAATACCAAGAAGGAAAGCCAAGATCATCAGAGACTATGGAGGAAGACAAGAGATG
. . . . . .
AspSerGlySerHisLeuGluGlyAlaArgGluAspGlyGluMetAla
IleValValProThrTrpArgValProGlyArgMetGluLysTrpHisSerLeuValLys
GATAGTGGTTCCCACCTGGAGGGTGCCAGGGAGGATGGAGAAATGGCATAGCCTTGTCAA
. . . 4900 . .
TyrLeuLysTyrLysThrLysAspLeuGluLysValCysTyrValProHisHisLysVal
GTATCTAAAATACAAAACAAAGGATCTAGAAAAGGTGTGCTATGTTCCCCACCATAAGGT
. . . . . .
GlyTrpAlaTrpTrpThrCysSerArgValIlePheProLeuLysGlyAsnSerHisLeu GGGATGGGCATGGTGGACTTGCAGGAGGGTAATATTCCCATTAAAA@ CAGTCATCT
. 5000 . . .
GluIleGlnAlaTyrTrpAsnLeuThrProGluLysGlyTrpLeu TyrSerVal
AGAGATACAGGCATATTGGAACTTAAGACCAGAAAAAGGATGGCTC TTATTCAGT
. . . . . 5100
ArgIleThrTrpTyrThrGluLysPheTrpThrAspValThrProAspCysAlaAspVal
AAGAATAACTTGGTACACAGAAAAGTTCTGGACAGATGTTACCCCAGACTGTGCAGATGT
. . . . . .
LeuIleHisSerThrTyrPheProCysPheThrAlaGlyGluValArgArgAlaIleArg
CCTAATACATAGCACTTATTTCCCTTGCTTTACAGCAGGTGAAGTAAGAAGAGCCATCAG
. . . 5200 . .
GlyGluLysLeuLeuSerCysCysAsnTyrProArgAlaHisArgAlaGlnValProSer
AGGGGAAAAGTTATTGTCCTGCTGCAATTATCCCCGAGCTGATAGAGCCCAGGTACCGTC
. . . . . .
LeuGlnPheLeuAlaLeuValValValGlnGlnAsnAspArgProGlnArgAspSerThr
MetThrAspProArgGluThrValPro
ACTTCAATTTCTGGCCTTAGTGGTAGTGCAACAAAATGACAGACCCCAGAGAGACAGTAC
. 5300 . . . .
ThrArgLysGlnArgArgArgAspTyrArgArgGlyLeuArgLeuAlaLysGlnAspSer
ProGlyAsnSerGlyGluGluThrIleGlyGluAlaPheAlaTrpLeuAsnArgThrVal
CACCAGGAAACAGCGGCGAAGAGACTATCGGAGAGGCCTTCGCCTGGCTAAACAGGACAG
. . . . . 5400
ArgSerHisLysGlnArgSerSerGluSerProThrProArgThrTyrPheProGlyVal
GluAlaIleAsnArgGluAlsValAsnHisLeuProArgGluLeuIlePheGlnValTrp
TAGAAGCCATAAACAGAGAAGCAGTGAATCACCTACCCCGAGAACTTATTTTCCAGGTGT
AlaGluValLeuGluIleLeuAla
GlnArgSerTrpArgTyrTrpHisAspGluGlnGlyMetSerGluSerTyrThrLysTyr
GGCAGAGGTCCTGGAGATACTGGCATGATGAACAAGGGATGTCAGAAAGTTACACAAAGT
. . . 5500 . .
ArgTyrLeuCysIleIleGlnLysAlsValTyrMetHisValArgLysGlyCysThrCys
ATAGATATTTGTGCATAATACAGAAAGCAGTGTACATGCATGTTAGGAAAGGGTGTACTT
. . . . . .
LeuGlyArgGlyHisGlyProGlyGlyTrpArgProGlyProProProProProProPro
GCCTGGGGAGGGGACATGGGCCAGGAGGGTGGAGACCAGGGCCTCCTCCTCCTCCCCCTC
. 5600 . . . .
MetAlaGluAlaProThrGluLeuProProValAspGlyThrProLeu
GlyLeuVal***
CAGGTCTGGTCTAATGGCTGAAGCACCAACAGAGCTCCCCCCGGTGGATGGGACCCCACT
ArgGluProGlyAspGluTrpIleIleGluIleLeuArgGluIleLysGluGluAlsLeu
GAGGGAGCCAGGGGATGAGTGGATAATAGAAATCTTGAGAGAAATAAAAGAAGAAGCTTT
. . . . . .
LysHisPheAspProArgLeuLeuIleAlaLeuGlyLysTyrIleTyrThrArgHisGly
MetGlu
AAAGCATTTTGACCCTCGCTTTGCAATTGCTCTTGGCAAATATATCTATACTAGACATGG
. . . 5800 . .
AspThrLeuGluGlyAlaArgGluLeuIleLysValLeuGlnArgAlaLeuPheThrHis
ThrProLeuLysAlaProGluSerSerLeuLysSerCysAsnGluProPheSerArgThr
AGACACCCTTGAAGGCGGGAGAGAGCTCATTAAAGTCCTGCAAGGAGCCCTTTTCACGCA
. . . . . .
PheArgAlaGlyCysGlyHisSerArgIleGlyGlnThrArgGlyGlyAsnProLeuSer
SerGluGlnAspValAlaThrGlnGluLeuAlaArgGlnGlyGluGluIleLeuSerGln
CTTCAGAGCAGGATGTGGCCACTCAAGAATTGGCCAGACAAGGGGAGGAAATCCTCTCTC
. 5900 . . . .
AlaIleProThrProArgAsnMetGln
LeuTyrArgProLeuGluThrCysAsnAsnSerCysTyrCysLysArgCysCysTyrHis
AGCTATACCGACCCCTAGAAACATGCAATAACTCATGCTATTGTAAGCGATGCTGCTACC
. . . . . 5000
MetAsnGluArgAlaAsp
CysGlnMetCysPheLeuAsnLysGlyLeuGlyIleCysTyrGluArgLysGlyArgArg
ATTGTCAGATGTGTTTTGTAAAGAAGGGGCTCGGGATATGTTATGAACGAAAGGGGAGAC
. . . . . .
GluGluGlyLeuGlnArgLysLeuArgLeuIleArgLeuLeuHisGlnThrSerGluTyr
Met
ArgArgThrProLysLysThrLysThrHisProSerProThrProAspLys
GAAGAAGGACTCCAAAGAAAACTAAGACTCATCCGTCTCCTACACCAGACAAGTGAGTAT
. . . 6100 . .
AspGluSerAlaAlaTyrCysHisPheIleSer
MetAsnGlnLeuLeuIleAlaIleLeuLeuAlsSerAlaCysLeuValTyrCysThrGln
GATGAATCAGCTGCTTATTGCCATTTTATTAGCTAGTGCTTGCTTAGTATATTGCACCCA
. . . . . .
TyrValThrValPheTyrGlyValProThrTrpLysAsnAlaThrIleProLeuPheCys
ATATGTAACTGTTTTCTATGGCGTACCCACGTGGAAAAATGCAACCATTCCCCTCTTTTG
. 6200 . . . .
AlaThrArgAsnArgAspThrTrpGlyThrIleGlnCysLeuProAspAsnAspAspTyr
TGCAACCAGAAATAGGGATACTTGGGGAACCATACAGTGCTTGCCTGACAATGATGATTA
. . . . . 6300
GlnGluIleThrLeuAsnValThrGluAlaPheAspAlaTrpAsnAsnThrValThrGlu
TCAGGAAATAACTTTGAATGTAACAGAGGCTTTTGATGCATGGAATAATACAGTAACAGA
. . . . . .
GlnAlaIlegluAspValTrpHisLeuPheGluThrSerIleLysProCysValLysLeu
ACAAGCAATAGAAGATGTCTGGGATCTATTCGAGACATCAATAAAACCATGTGTCAAACT
. . . 6400 . .
ThrProLeuCysValAlaMetLysCysSerSerThrGluSerSerThrGlyAsnAsnThr
AACACCTTTATGTGTAGCAATGAAATGCAGCAGCACAGAGAGCAGCACAGGGAACAACAC
ThrSerLysSerThrSerThrThrThrThrThrProThrAspGlnGluGlnGluIleSer
AACCTCAAAGAGCACAAGCACAACCACAACCACACCCACAGACCAGGAGCAAGAGATAAG
. 6500 . . . .
GluAspThrProCysAlaArgAlaAspAsnCysSerGlyLeuGlyGluGluGluThrIle
TGACCATACTCCATGCGCACGCGCAGACAACTGCTCAGGATTGGGAGAGGAAGAAACGAT
. . . . . 6600
AsnCysGlnPheAsnMetThrGlyLeuGluArgAspLysLysLysGlnTyrAsnGluThr
CAATTGCCAGTTCAATATGACAGGATTAGAAAGAGATAAGAAAAAACAGTATAATGAAAC
. . . . . .
TrpTyrSerLysAspValValCysGluThrAsnAsnSerThrAsnGlnThrGlnCysTyr
ATGGTACTCAAAAGATGTGGTTTGTGAGACAAATAATAGCACAAATCAGACCCAGTGTTA
. . . 6700 . .
MetAsnHisCysAsnThrSerValIleThrGluSerCysAspLysHisTyrTrpAspAla
CATGAACCATTGCAACACATCAGTCATCACAGAATCATGTGACAAGCACTATTGGGATGC
. . . . . .
IleArgPheArgTyrCysAlaProProGlyTyrAlaLeuLeuArgCysAsnAspThrAsn
TATAAGGTTTAGATACTGTGCACCACCGGGTTATGCCCTATTAAGATGTAATGATACCAA
. 6800 . . . .
TyrSerGlyPheAlaProAsnCysSerLysValValAlaSerThrCysThrArgMetMet
TTATTCAGGCTTTGCACCCAACTGTTCTAAAGTAGTAGCTTCTACATGCACCAGGATGAT
. . . . . 6900
GluThrGlnThrSerThrTrpPheGlyPheAsnGlyThrArgAlaGluAsnArgThrTyr
GGAAACGCAAACTTCCACATGGTTTGGCTTTAATGGCACTAGAGCAGAGAATAGAACATA
. . . . . .
IleTyrTrpHisGlyArgAspAsnArgThrIleIleSerLeuAsnLysTyrTyrAsnLeu
TATCTATTGGCATGGCAGAGATAATAGAACTATCATCAGCTTAAACAAATATTATAATCT
. . . 7000 . .
SerLeuHisCysLysArgProGlyAsnLysThrValLysGlnIleMetLeuMetSerGly
CAGTTTGCATTGTAAGAGGCCAGGGAATAAGACAGTGAAACAAATAATGCTTATGTCAGG
. . . . . .
HisValPheHisSerHisTyrGlnProIleAsnLysArgProArgGlnAlaTrpCysTrp
ACATGTGTTTCACTCCCACTACCAGCCGATCAATAAAAGACCCAGACAAGCATGGTGCTG
. 7100 . . . .
PheLysGlyLysTrpLysAspAlaMetGlnGluValLysGluThrLeuAlaLysHisPro
GTTCAAAGGCAAATGGAAAGACGCCATGCAGGAGGTGAAGGAAACCCTTGCAAAACATCC
. . . . . 7200
ArgTyrArgGlyThrAsnAspThrArgAsnIleSerPheAlaAlaProGlyLysGlySer
CAGGTATAGAGGAACCAATGACACAAGGAATATTAGCTTTGCAGCGCCAGGAAAAGGCTC
. . . . . .
AspProGluValAlaTyrMetTrpThrAsnCysArgGlyGluPheLeuTyrCysAsnNet
AGACCCAGAAGTAGCATACATGTGGACTAACTGCAGAGGAGAGTTTCTCTACTGCAACAT
. . . 7300 . .
ThrTrpPheLeuAsnTrpIleGluAsnLysThrHisArgAsnTyrAlaProCysHisIle
GACTTGGTTCCTCAATTGGATAGAGAATAAGACACACCGCAATTATGCACCGTGCCATAT
. . . . . .
LysGluIleIleAsnThrTrpHisLysValGlyArgAsnValTyrLeuProProArgGlu
AAAGCAAATAATTAACACATGGCATAAGGTAGGGAGAAATGTATATTTGCGTCCCAGGGA
. 7400 . . . .
GlyGluLeuSerCysAsnSerThrValThrSerIleIleAlaAsnIleAspTrpGlnAsn
AGGGGAGCTGTCCTGCAACTCAACAGTAACCAGCATAATTGCTAACATTGACTGGCAAAA
. . . . . 7500
AsnAsnGlnThrAsnIleThrPheSerAlaGluValAlaGluLeuTyrArgLeuGluLeu
CAATAATCAGACAAACATTACCTTTAGTGCAGAGGTGGCAGAACTATACAGATTGGAGTT
. . . . . .
GlyAspTyrLysLeuValGluIleThrProIleGlyPheAlaProThrLysGluLysArg
GGGAGATTATAAATTGGTAGAAATAACACCAATTGGCTTCGCACCTACAAAAGAAAAAAG
. . . 7600 . .
TyrSerSeralaHisGlyArgHisThrArgGlyValPheValLeuGlyPheLeuGlyPhe
ATACTCCTCTGCTCACGGGAGACATACAAGAGGTGTGTTCGTGCTAGGGTTCTTGGGTTT
. . . . . .
LeuAlaThrAlaGlySerAlaMetGlyAlaAlaSerLeuThrValSerAlaGlnSerArg
TCTCGCAACAGCAGGTTCTGCAATGGGCGCGGCGTCCCTGACCGTGTCGGCTCAGTCCCG
. 7700 . . . .
ThrLeuLeuAlaGlyIleValGlnGlnGlnGlnGlnLeuLeuAspValValLysArgGln
GACTTTACTGGCCGGGATAGTGCAGCAACAGCAACAGCTGTTGGACGTGGTCAAGAGACA
. . . . . 7800
GlnGluLeuLeuArgLeuThrValTrpGlyThrLysAsnLeuGlnAlaArgValThrAla
ACAAGAACTGTTGCGACTGACCGTCTGGGGAACGAAAAACCTCCAGGCAAGAGTGACTGC
. . . . . .
IleGluLysTyrLeuGlnAspGlnAlaArgLeuAsnSerTrpGlyCysAlaPheArgGln
TATAGAGAAGTACCTACAGGACCAGGCGCGGCTAAATTCATGGGGATGTGCGTTTAGACA
. . . 7900 . .
ValCysHisThrThrValProTrpValAsnAspSerLeuAlsProAspTrpAspAsnMet
AGTCTGCCACACTACTGTACCATGGGTTAATGATTCCTTAGCACCTGACTGGGACAATAT
. . . . . .
ThrTrpGlnGluTrpGluLysGlnValArgTyrLeuGluAlaAsnIleSerLysSerLeu
GACGTGGCAGGAATGGGAAAAACAAGTCCGCTACCTGGAGGCAAATATCAGTAAAAGTTT
. 8000 . . . .
GluGlnAlsGlnIleGlnGlnGluLysAsnHetTyrGluLeuGlnLysLeuAsnSerTrp
AGAACAGGCACAAATTCAGCAAGAGAAAAATATGTATGAACTACAAAAATTAAATAGCTG
. . . . . 8100
AspIlePheGlyAsnTrpPheAspLeuThrSerTrpValLysTyrIleGlnTyrGlyVal
GGATATTTTTGGCAATTGGTTTGACTTAACCTCCTGGGTCAAGTATATTCAATATGGAGT
. . . . . .
LeuIleIleValAlaValIleAlaLeuArgIleValIleTyrValValGlnMetLeuSer
Val
GCTTATAATAGTAGCAGTAATAGCTTTAAGAATAGTGATATATGTAGTACAAATGTTAAG
. . . 8200 . .
AlaCysPheLeuPheProProArgLeuTyrProThrAsp
ArgLeuArgLysGlyTyrArgProValPheSerSerProProGlyTyrIleGlnGlnIle
GlyLeuGluArgAlaIleGlyLeuPheSerLeuProProProValIleSerAsnArgSer
TAGGCTTAGAAAGGGCTATAGGCCTGTTTTCTCTTCCCCCCCCGGTTA CCAACAGAT
. . . . . .
ProTyrProGlnGlyProGlyThrAlaSerGlnArgArgAsnArgArgArgArgTrpLys
HisIleHisLysAspArgGlyGlnProAlaAsnGluGluThrGluGluAspGlyGlySer
IleSerThrArgThrGlyAspSerGlnProThrLysLysGlnLysLysThrValGluAla
CCATATCCACAAGGACCGGGGACAGCCAGCCAACGAAGAAACAGAAGAAGACGGTGGAAG
. 8300 . . . .
GlnArgTrpArgGlnIleLeuAlaLeuAlaAspSerIleTyrThrPheProAspProPro
AsnGlyGlyAspArgTyrTrpProTrpProIleAlaTyrIleHisPheLeuIleArgGln
ThrValGluThrAspThrGlyProGlyArg
CAACGGTGGAGACAGATACTGGCCCTGGCCGATAGCATATATACATTTCCTGATCCGCCA
. . . . . 8400
AlaAspSerProLeuAspGlnThrIleGlnHisLeuGlnGlyLeuThrIleGlnGluLeu
LeIleArgLeuLeuThrArgLeuTyrSerIleCysArgAspLeuLeuSerArgSerPhe
GCTGATTCGCCTCTTGACGAGACTATACAGCATCTGCAGGGACTTACTATCCAGGAGCTT
. . . . . .
ProAspProProThrHisLeuProGluSerGlnArgLeuAlaGluThr
LeuThrLeuGlnLeuIleTyrGlnAsnLeuArgAspTrpLeuArgLeuArgThrAlaPhe
CCTGACCCTCCAACTCATCTAGCAGAATCTCAGAGACTGGCTGAGACTTAGAACAGCCTT
. . . 8500 . .
LeuGlnTyrGlyCysGluTrpIleGlnGluAlaPheGlnAlaAlaAlaArgAlaThrArg
MetGlyAlaSerGlySerLysLysHisSerArgProProArgGlyLeuGlnGlu
CTTGCAATATGGGTGCGAGTGGATCCAAGAAGCATTCCAGGCCGCCGCGAGGGCTAGAAG
. . . . . .
GluThrLeuAlaGlyAlaCysArgGlyLeuTrpArgValLeuGluArgIleGlyArgGly
ArgLeuLeuArgAlaArgAlaGlyAlaCysGlyGlyTyrTrpAsnGluSerGlyGlyGlu
AGAGACTCTTGCGGGCGCGTGCAGGGGCTTGTGGAGGGTATTGGAACGAATCGGGAGGGG
. 8600 . . . .
IleLeuAlaValProArgArgIleArgGlnGlyAlsGluIleAlaLeuLeu
TyrSerArgPheGlnGluGlySerAspArgGluGlnLysSerProSerCysGluGlyArg
AATACTCGCGGTTCCAAGAAGGATCAGACAGGGAGCAGAAATGGCCCTCCTGTGAGGGAC
. . . . . 8700
GlnTyrGlnGlnGlyAspPheMetAsnThrProTrpLysAspProAlaAlaGluArgGlu
GGCAGTATCAGCAGGGAGACTTTATGAATACTCCATGGAAGGACCCAGCAGCAGAAAGGG
. . . . . .
LysAsnLeuTyrArgGlnGlnAsnMetAspAspValAspSerAspAspAspAspGlnVal
AGAAAAATTTGTACAGGCAACAAAATATGGATGATGTAGATTCAGATGATGATGACCAAG
. . . 8800 . .
ArgValSerValThrProLysValProLeuArgProMetThrHisArgLeuAlaIleAsp
TAAGAGTTTCTGTCACACCAAAAGTACCACTAAGACCAATGACACATAGATTGGCAATAG
. . . . . .
MetSerHisLeuIleLysThrArgGlyGlyLeuGluGlyMetPheTyrSerGluArgArg
ATATGTCACATTTAATAAAAACAAGGGGGGGACTGGAAGGGATGTTTTACAGTGAAAGAA
. 8900 . . . .
HisLysIleLeuAsnIleTyrLeuGluLysGluGluGlyIleIleAlaAspTrpGlnAsn
GACATAAAATCTTAAATATATACTTAGAAAAGGAAGAAGGGATAATTGCAGATTGGCAGA
. . . . . 9000
TyrThrHisGlyProGlyValArgTyrProMetPhePheGlyTrpLeuTrpLysLeuVal
ACTACACTCATGGGCCAGGAGTAAGATACCCAATGTTCTTTGGGTGGCTATGGAAGCTAG
. . . . . .
ProValAspValProGlnGluGlyGluAspThrGluThrHisCysLeuValHisProAla
TACCAGTAGATGTCCCACAAGAAGGGGAGGACACTGAGACTCACTGCTTAGTACATCCAG
. . . 9100 . .
GlnThrSerLysPheAspAspProHisGlyGluThrLeuValTrpGluPheAspProLeu
CACAAACAAGCAAGTTTGATGACCCGCATGGGGAGAGACTAGTCTGGGAGTTTGATCCCT
. . . . . .
LeuAlaTyrSerTyrGluAlaPheIleArgTyrProGluGluPheGlyHisLysSerGly
TGCTGGCTTATAGTTACGAGGCTTTTATTCGGTACCCAGAGGAATTTGGGCACAAGTCAG
. 9200 . . . .
LeuProGluGluGluTrpLysAlaArgLeuLysAlaArgGlyIleProPheSer
GCCTGCCAGAGGAAGAGTGGAAGGCGAGACTGAAAGCAAGAGGAATACCATTTAGTTAAA
. . . . . 9300
GACAGGAACAGCTATACTTGGTCAGGGCAGGAAGTAACTAAGAGAAACAGCTGAGACTGC
. . . . . .
AGGGACTTTCCAGAAGGGGCTGTAACCAAGGGAGGGACATGGGAGGAGCTGGTGGGGAAC
. . . 9400 . .
GCCCTCATATTCTCTGTATAAATATACCCGCTAGCTTGCATTGTACTTCGGTCGCTCTGC
. . . . . .
GGAGAGGCTGGCAGATTGAGCCCTGGGAGGTTCTCTCCAGCAGTAGCAGGTAGAGCCTGG
. 9500 . . . .
GTGTTCCCTGCTAGACTCTCACCAGCACTTGGCCGGTGCTGGGCAGACGGCCCCACGCTT
. . . . . 9600
GCTTGCTTAAAAACCTCCTTAATAAAGCTGCCAGTTAGAAGCA
. . . .
Les résultats des études comparatives entre les protéines de noyau (core), ci-après dénommées "protéines qgq" et les protéines d'enveloppes, ci-après dénommées "protéines env" ont également été rapportés dans la demande de brevet européen n- 87/400.151.4, déjà citée. Ils montrent que les protéines du noyau (protéines aaa) dans HIV-2 présentent des différences moins accentuées par rapport à celles des virus HIV-1, que les protéines d'enveloppe (protéines env). Globalement les protéines env dans HIV-2 se sont révélées présenter des parentés immunologiques extrêmement faibles, sinon inexistentes, avec les protéines env correspondantes des virus HIV-1.
Des études plus poussées ont conduit les inventeurs à reconnaître une première classe de peptides ayant des séquences d'aminoacides soit identiques, soit proches de séquences contenues à l'intérieur des structures des protéines aaa et env de HIV-2, voire de HIV1. Ces peptides sont notamment applicables au diagnostic d'une infection par le virus HIV-2 ou de l'un de ses variants.
A cet égard la présente invention concerne également des procédés et des compositions de diagnostic pour la détection in vitro d'anticorps dirigés contre un virus HIV-2 ou de leurs variants, plus particulièrement dans des échantillons biologiques, notamment des sérums de patients ayant subi une infection par le virus HIV-2, certains de ces peptides permettant une discrimination particulièrement poussée entre les infections dues à des virus HIV-2 et à des virus HIV-1.
Ces études poussées ont également conduit à la possibilité de synthétiser des peptides immunogènes ou susceptibles d'être rendus immunogènes, présentant des caractéristiques de structures leur permettant d'induire in vivo la production d'anticorps susceptibles de reconnaître des protéines env à la fois des HIV-1 et des
HIV-2 et, au moins pour certains de ces peptides, de se fixer tant sur des virus HIV-1 que sur des virus HIV-2, plus particulièrement aux fins de les neutraliser.
L'utilisation de ces derniers types de peptides est donc particulièrement indiquée pour la production de principes actifs de vaccins contre les virus HIVr donc contre le SIDA.
Pour désigner ci-après les résidus d'aminoacides entrant dans la constitution des peptides selon l'invention, on aura recours, pour ceux des acides aminés ayant une signification univoque à la nomenclature internationale désignant chaque acide aminé naturel par une lettre unique (lettre majuscule) selon le tableau des correspondances qui suit
M Méthionine
L Leucine
I Isoleucine
V Valine
F Phenylalanine
S Sérine
P Proline
T Thréonine
A Alanine
Y Tyrosine
H Histidine
Q Glutamine
N Asparagine
K Lysine
D Acide Aspartique
E Acide glutaminique
C Cystéine
W Tryptophane
R Arginine
G Glycine
Lorsqu'un acide aminé pourra, en raison de sa position au sein de la chaine d'aminoacides caractéristique d'un peptide déterminé, prendre plusieurs significations, il pourra soit être désigné par un tiret "-", si sa signification peut être quelconque, soit par une lettre minuscule lorsque cet aminoacide pourra présenter un nombre limité de significations préférées, ce nombre étant cependant toujours supérieur à 1. Dans ce dernier cas, les significations possibles de cette lettre minuscule seront toujours précisées en rapport avec le peptide auquel il appartient.
Afin de faciliter la lecture, ces peptides seront désignés par une abréviation env ou qaq suivie d'un indice numérique, par référence à des séquences d'aminoacides contenues, selon le cas, soit dans les protéines env soit dans les protéines qêq de certains
HIV-1 ou HIV-2. Il y sera encore fait référence dans ce qui suit.
Enfin dans les définitions qui suivent - les groupes X représentent soit un groupe NH2 libre ou amidé, notamment par un ou deux groupes alcoyle comprenant de 1 à 5 atomes de carbone, soit un groupe peptidique comprenant de 1 à 5 aminoacides, dont l'aminoacide N-terminal présente lui-même un groupe NH2 libre ou amidé comme précédemment indiqué, et - les groupes Z représentent, soit un groupe -OH libre ou alcoxyle et contenant alors un groupe alcoyle comprenant de 1 à 5 atomes de carbone, soit un groupe peptidique comprenant de 1 à 5 aminoacides, dont l'aminoacide C- terminal présente lui-méme un groupe -OH libre ou alcoxyle, comme précédemment indiqué, les groupes de 1 à 5 acides aminés le cas échéant contenus dans X ou Z ou dans les deux à la fois étant tels, que leur présence n'est pas incompatible avec la préservation pour l'essentiel des propriétés immunologiques, le cas échéant immunogènes, des peptides qui en sont dépourvus.
Les peptides selon l'invention, qui ont en commun des propriétés immunologiques avec des antigènes de HIV-2 et, pour certains d'entre eux également avec des antigènes de HIV-1 ou de ses variants, comprennent normalement au plus 40 résidus d'acides aminés.
Des peptides préférés sont les suivants env XE--A-E-D-YL-KQ--L--WGC-----CZ env2
X---E--Q-QQEKN--EL--L-Z env3 XEL--YK-v-I-P-G-APTK-KR-----Z env4
X----VTV-YGVP-WK-AT--LFCA-Z env5
X---QE--L-NVTE-F--W-NZ env6
X-L---S-KPCVKLTPLCV--Z env7
X----N-S-IT--C-K----Z env8
X-I---YC-P-G-A-L-C-N--TZ env9
X------A-C------W--Z env10
X-G-DPE------NC-GEF-YCN-----NZ env11
X-----C-IKQ-I------G---YZ
Des peptides préférés correspondent aux précédents et présentent les formules qui suivent env 1
XRVTAIEKYLQDQARLNSWGCAFRWVCZ, env2
XSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWZ, env3
XELGDYKLVEITPIGFAPTKEKRYSSAHZ, env4 XabcdVTVeYGVPfWKgAThiLFCAj Z, dans lesquels les lettres de a à j peuvent avoir les significations suivantes a est C, E ou D b est T, K, D ou N c est Q ou L d est Y ou W e est F ou Y f est T ou V g est N ou E h est I ou T i est P ou T j est T ou S env5
XabcQEdeLfNVTEgFhiWjNZ, dans lequel les lettres de a à j peuvent avoir les significations suivantes a est D ou P b est D ou N c est Y ou P d est I, V ou I e est T, V, E ou A f est V, G ou E ou g est A, N ou G h est D ou N i est A ou M j est N ou K env6
XLabcSdKPCVKLTPLCVefKZ, dans lequel les lettres de a à f peuvent avoir les significations suivantes a est F ou W b est E ou D c est T ou Q d est I ou L e est A, S ou T f est M ou L env7
XabcNxSyITcdCeKfghiZ, dans lequel les lettres de a à i et x et y peuvent avoir les significations suivantes a est N ou T ou I b est H ou S ou N c est E ou Q d est S ou A e est D ou P f est H ou V g est Y ou S h est W ou F i est D ou E x est T ou R y est V ou A env8
XaIbcdYCxPeGfAgLhCiNjkTZ, dans lequel les lettres de a à k et x peuvent avoir les significations suivantes a est A ou P b est R ou P c est F ou I d est R ou H e est P ou A f est Y ou F h est L ou I i est R ou K j est - ou N k est D ou K x est A ou T envq
XwabcxyAdCefghizWjkZ, dans lequel les lettres de a à k et x à z peuvent avoir les significations suivantes a est K ou b est R ou c est P ou M ou I d est W ou H ou Y c est W ou N ou T f est F ou I g est K ou S ou N h est G ou R ou E i est - ou A ou T j est K ou N ou D ou S k est D ou A ou N ou K w est N, D ou I x est R ou G y est Q ou K ou R z est K ou E ou Q envl0 XaGbDPEcdefghNCiGEFjYCNkxlmnNZ, dans lequel les lettres de a à n et x peuvent avoir les significations suivantes a est K ou b est S ou G c est V ou I d est A ou V ou T e est Y ou T ou M f est M ou H g est W ou S h est T ou F i est R ou G j est L ou F k est M ou S.
1 est W ou Q ou K ou G m est F ou L n est L ou F x est T ou S env11
XabcdwCeIKQfIxgyhizGjklYZ, dans lequel les lettres de a à 1 et w à z peuvent avoir les significations suivantes a est R ou T ou S ou N b est N ou I c est Y ou T d est A ou L e est H ou R f est I ou F g est T ou M h est H ou Q ou A i est K ou E j est R ou K k est N ou A 1 est V ou M w est P ou Q x est N ou K y est W ou V z est V ou T ou K
La structure du peptide antigénique codé par le gène aaa et désigné par aaq1 est également représentée ci-après
XNCKLVLKGLGMNPTLEEMLTAZ
Il sera remarqué que, d'une façon générale, les aminoacides ayant une signification univoque (donc représentés par une lettre majuscule correspondant à la nomenclature internationale) qui interviennent dans les définitions qui précédent des peptides selon l'invention, se trouvent être la correspondance avec des aminoacides identiques placés dans le même ordre dans les séquences env ou gag correspondantes de la protéine env ou gqg d'au moins l'un des HIV.
Les positions de ces séquences sont soulignées et repérées au sein des séquences d'aminoacides des protéines env respectivement de HIV-2 ROD (CNCM n-
I-532) et HIV-1 BRU (CNCM n I-232). Les traits pleins qui apparaissent en certaines localisations de ces séquences visent à souligner que certains aminoacides contenus dans ces séquences ont été volontairement délétés au plan de la présentation, afin de permettre la mise en alignement d'aminoacides respectivement identiques (alors marqués d'un astérique) sur une même ligne verticale dans les séquences des protéines correspondantes de
HIV-1 et de HIV-2.
Figure img00230001
Figure img00240001
760 770 780 790 800
HIV2------ LRIVIYVVQM LSRLRKGYRP V-FSSPPGYI QQIHIHKDRG QPANEETEED
**** * * * ** * * ** * t*
HIV1----- LRIVFAVLSI VNRVRQGYSP LSFQT----- ---HLPTPRG PDRPEGIEEE
.......... .......... ......... .......... .......... ..........
810 820 830 840 850
HIV2------ GGSNGGDRYW PWPIAYIHFL IRQLIRLLT- -----LYSIC RDLLSRSFLT
** ** * * * ****
HIV1------ GGERDRDRSI RLVNGSLA-L IWDDLRSLCL FSYHRL---- RDLLLIVTRI
.......... .......... ......... .......... .......... ..........
860 870 880 890 900
HIV2------ LQLIYQNLRD WLRLRTA--F LQYGCEWIQE AFQ----AAA RATRETL--
* * * * *** *** * *
HIV1------ VELLG--RRG WEALKYWWNL LQYWSQELKN SAVSLLNATA IAVAEGTDRV
.......... .......... .......... .......... .......... ..........
910 920 930 938
HIV2------ ----AGACRG LWRVLERIGR GILAVPRRIR QGAEIALL
** ***** ** * ***
HIV1------ IEVVQGACRA ---------- -IRHIPRRIR QGLERILL
Outre les peptides précités l'invention concerne également les peptides modifiés par insertion et/ou délétion et/ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, pour autant que les propriétés antigéniques ou immunogènes desdits peptides ne sont pas modifiées.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention concerne des peptides ayant des propriétés immunologiques en commun avec l'ossature peptidique de la glycoprotéine d'enveloppe des virus de la classe HIV-2, ces peptides contenant un nombre de résidus d'acides aminés n' excédant pas 40.
Ces peptides préférés selon l'invention ont les séquences suivantes env 1
RVTAI EKYLQDQARLNSWGCAFRQVC
AI EKYLQDQ env2 SLEQAQIQQEKNMYELOKLWSW
QIQQEKN env3
ELGDYKLVEITPIGFAPTKEKRYSSAH
YKLVEITPIGFAPTKEK env4
CTQYVTVFYGVPTWKNATIPLFCAT
VTVFYGVPTWKNAT
EKLWVTVYYGVPVWKEATTTLFCAS
VTVYYGVPVWKEAT
EDLWVTVYYGVPVWKEATTTLFCAS
VTVYYGVPVWKEAT
DNLWVTVYYGVPVWKEATTTLFCAS
VTVYYGVPVWKEAT env5
DDYQEITL-NVTEAFDAWNN
L-NVTEAF PNPQEVVLVNVTENFNMWKN
LVNVTENF
PNPQEIELENVTEGFNMWKN
LENVTEGF PNPQEIALENVTENFNMWKN
LENVTENF env6
ETSIKPCVKLTPLCVAMK
DQSLKPCVKLTPLCVSLK
DQSLKPCVKLTPLCVTLN PCVRLTPLCV env7
NHCNTSVITESCD
NTSVIT
TSCNTSVITQACP
NTSVIT
INCNTSVITQACP
NTSVIT
INCNTSAITQACP
NTSAIT env8
YCAPPGYALLRC-NDT
YCAPAGFAILKCNNKT
YCAPAGFAILKCNDKK YCAPAGFAILKCRDKK env9
NKRPRQAWCWFKG-KWKT
N--MRQAHCNISRAKWNA
D--IRRAYCTINETEWDK I--IGQAHCNISRAQWSK env10
KGSDPEVAYMWTNCRGEFLYCNMTWFLN
NCRGEFLYCN -GGDPEIVTHSFNCGGEFFYCNSTQLFN
NCGGEFFYCN -GGDPEITTHSFNCRGEFFYCNTSKLFN
NCRGEFFYCN -GGDPEITTHSFNCGGEFFYCNTSGLFN
NCGGEFFYCN envi 1
RNYAPCHIKQ.INTWHKVGRNVY
CHIKQII
TlTLPCRIKQFINMWQEVGKAMY
CRIKQFI
SlTtPCRIKQIINMWQKTCKAMY
CRIKQII NITLQCRIKQIIKMVAGR-KAIY
CRIKQII gag1
NCXLVLKGLGMNPTLEEMLTA
Les peptides selon l'invention peuvent encore avantageusement être préparés par les techniques classiques, dans le domaine de la synthèse des peptides.
Cette synthèse peut entre réalisée en solution homogène ou en phase solide.
Par exemple, on aura recours à la technique de synthèse en solution homogène décrit par HOUBENWEYL dans l'ouvrage intitulé "Méthode der Organischen Chemie" (Méthode de la Chimie Organique) édité par E. Wunsch, vol. 15-I et II., THIEME, Stuttgart 1974.
Cette méthode de synthèse consiste à condenser successivement deux-à-deux les aminoacyles successifs dans l'ordre requis, ou à condenser des aminoacyles et des fragments préalablement formés et contenant déjà plusieurs aminoacyles dans l'ordre approprié, ou encore plusieurs fragments préalablement ainsi préparés, étant entendu que l'on aura eu soin de protéger au préalable toutes les fonctions réactives portées par ces aminoacyles ou fragments, à l'exception des fonctions amines de l'un et carboxyles de l'autre ou vice-versa, qui doivent normalement intervenir dans la formation des liaisons peptidiques, notamment après activation de la fonction carboxyle, selon les méthodes bien connues dans la synthèse des peptides.En variante, on pourra avoir recours à des réactions de couplage mettant en jeu des réactifs de couplage -classique, du type carbodiimide, tels eue par exemple la 1-éthyl-3-(3-diméthvl-amino- propyl)-carbodiimide. Lorsque l'aminoacyle mis e oeuvre possède une fonction acide supplémentaire (notamment dans le cas de l'acide glutamique), ces fonctions seront par exemple protégées, par des groupes t-bustylester.
Dans le cas de la synthèse progressive, acide aminé par acide aminé, la synthèse débute de préférence par la condensation de 1 'amino-acide C-terminal avec l'aminoacide qui correspond à l'aminoacyle voisin dans la séquence désirée et ainsi de suite, de proche en proche, jusqu'à l'acide aminé N-terminal. Selon une autre technique préférée de l'invention, on a recours à celle décrite par R.D. MERRIFIELD dans l'article intitulé "Solid phase peptide synthesis" (J. Am. Soc., 45, 2149-2154).
Pour fabriquer une chaîne peptidique selon le procédé de MERRIFIELD, on a recours à une résine polymère très poreuse, sur laquelle on fixe le premier acide aminé C-terminal de la chaîne. Cet acide aminé est fixé sur la résine par l'intermédiaire de son groupe carboxylique et sa fonction amine est protégée, par exemple par le groupe t-butyloxycarbonyle.
Lorsque le premier acide aminé C-terminal est ainsi fixé sur la résine, on enlève le groupe protecteur de la fonction amine en lavant la résine avec un acide.
Dans le cas où le groupe protecteur de la fonction amine est le groupe t-butyloxycarbonyle, il peut être éliminé par traitement de la résine à l'aide d'acide trifluoroacétique.
On couple ensuite le deuxième acide aminé qui fournit le second amino-acyle de la séquence recherché, à partir du résidu amino-acyle C-terminal sur la fonction amine déprotégée du premier acide aminé C-terminal fixé sur la chaîne. De péférence, la fonction carboxyle de ce deuxième acide aminé est activée, par exemple par la dicyclohexylcarbodiimide, et la fonction amine esr protégée, par exemple par le t-butyloxycarbonyle.
On obtient ainsi la première partie de la chaine peptidique recherchée, qui comporte deux acide aminés, et dont la fonction amine terminale est protégée. Comme précédemment, on déprotège la fonction amine et on peut ensuite procéder à la fixation du troisième aminoacyle, dans les conditions analogues à celles de l'addition du deuxième acide aminé C-terminal.
On fixe ainsi, les uns après les autres, les acides aminés qui vont constituer la chaîne peptidique sur le groupe amine chaque fois déprotégé au préalable de la portion de la chaîne peptidique déjà formée, et qui est rattachée à la résine.
Lorsque la totalité de la chaîne peptidique désirée est formée, on élimine les groupes F -ecteurs des différents acide aminés constituant la chaine peptidique et on détache le peptide de la résine par exemple à l'aide d'acide fluorydrique.
L'invention concerne également les oligomères hydrosolubles des peptides monomères sus-indiqués.
L'oligomérisation peut provoquer un accroissement de l'immunogénicité des peptides monomères selon l'invention. Sans qu'une telle indication chiffrée puise être considérée comme limitative, on mentionnera néanmoins que ces oligomères peuvent, par exemple, contenir de 2 à 10 unités monomères.
Les unités monomères entrant dans cet oligomère sont soit toutes constituées par le polypeptide de séquence 1 ou par le polypeptide de séquence 2, soit par l'un et l'autre de ces polypeptides.
On peut avoir recours, pour réaliser l'oligo- mérisation, à toute technique de polymérisation couramment utilisée dans le domaine des peptides, cette polymérisation étant conduite jusqu'à l'obtention d'un oligomère ou polymère contenant le nombre de motifs monomères requis pour l'acquisition de l'immunogénicité désirée.
Une méthode d'oligomérisation ou de polymé risatlon du monomère consiste dans la réaction de cel;-ci avec un agent de réticulation tel que le glutaraldéhyde.
On peut également avoir recours à d'autres mé thcies d'oligomérisation ou de couplage, par exemple à celle mettant en jeu des couplages successifs d'unités monomères, par l'intermédiaire de leurs fonctions terminales carboxyle et amine en présence d'agents de couplage homo- ou hétéro- bifonctionnels.
On peut également pour la production de molécules comportant un ou plusieurs motifs de 17 acides aminés tels que définis ci-dessus, avoir recours à des techniques du génie génétique mettant en oeuvre des micro-organismes transformés par un acide nucléique déterminé comprenant des séquences nucléotidiques appropriées correspondantes.
L'invention concerne enfin également les acides nucléiques contenant une ou plusieurs séquences issues de la séquence de l'ADNc du virus HIV-2 ROD. Ces séquences repérées par la numérotation figurant sur la séquence précédemment décrite, codent pour certains peptides intéressants de l'invention.
Séquence codant pour envî nucléotides 7850 à 7927
env2 " 8030 à 8095
env3 " 7601 à 7636
env4 " 6170 à 6247
env5 " 6294 à 6349
env6 " 6392 à 6445
env7 " 6724 à 6763
env8 ' 6794 à 6838
env9 " 7112 à 7162
env,C " 7253 à 7336
envil " 7358 à 7426
gag1 " 1535 à 1597
Il va de soi que l'invention concerne les acides nucléiques correspondant à des séquences placées en des régions analogues des ADNc dérivés de variants de
HIV-2 ROD, ainsi que tous les acides nucléiques dont les modifications vis à vis des précédents résulteraient de la mise à profit de la dégenerescence du code génétique.
L'invention concerne encore les conjugués obtenus par couplage covalent des peptides selon l'invention (ou des susdits oligomères) à des molécules porteuses (naturelles ou synthétiques), physiologiquement acceptables et non toxiques, par l'intermédiaire de groupements réactifs complémentaires respectivement portés par la molécule porteuse et le peptide. Des exemples de groupements appropriés sont illustrés dans ce qui suit
A titre d'exemple de molécules porteuses ou supports macromoléculaires entrant dans la constitution des conjugués selon l'invention, on mentionnera des protéines naturelles, telles que l'anatoxine tétanique, l'ovalbulmine, des sérums albumines, des hémocyamines, etc...
A titre de support macromoléculaires synthétiques, on mentionnera par exemple des polylysines ou des poly(D-L-alanine)-poly(L-lysine).
La littérature mentionne d'autres types de supports macromoléculaires susceptibles d'être utilisés, lesquels présentent en général un poids moléculaire supérieur à 20 000.
Pour synthétiser les conjugués selon l'invention, on peut avoir recours à des procédés connus en soi, tels que celui décrit par FRANTZ et ROBERTSON dans Infect. and Immunity, 33, 193-198 (1981), ou celui décrit dans Applied and Environmental Microbiology, (ozuoDre 1981), vol. 42, n' 4, 611-614 par P.E. KAUFFMAN en utilisant le peptide et la molécule porteuse appro prie.
Dans la pratique, on utilisera avanta- geusement comme agent de couplage les composés suivants, cités à titre non limitatif : aldéhyde glutarique, chloroformiate d'éthyle, carbodiimides hydrosolubles [N-éthyl-N' (3-diméthylamino-propyl) carbodiimide, HCl, diisocyanates, bis-diazobenzidine, di- et trichloro-striazines, bromures de cyanogène, ainsi que les agents de couplage mentionnés dans Scand. J. Immunol., (1978), vol. 8, p. 7-23 (AVRAMEAS, TERNYNCK, GUESDON).
On peut avoir recours à tout procédé de couplage faisant intervenir d'une part une ou sieurs fonctions réactives du peptide et d'autre p one ou plusieurs fonctions réactives de molécule ports.
Avantageusement, il s'agit des fonctions carboxyle et amine, lesquelles peuvent donner lieu à une réaction de couplage en présence d'un agent de couplage du genre de ceux utilisés dans la synthèse des protéines, par exemple, le 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide, le N-hydroxybenzotriazole, etc... On peut encore avoir recours à la glutaraldéhyde, notamment lorsqu'il s'agit de relier entre eux des groupes aminés respectivement portés par le peptide et la molécule support.
Les peptides selon l'invention possèdent des propriétés antigéniques. Ils peuvent donc être utilisés dans des procédés de diagnostic pour la détection d'une infection par le virus HIV-2.
Comme on l'a déjà mentionné, des études ont permis de distinguer deux groupes de peptides pouvant être mis en oeuvre dans des procédés de détection d'anticorps contre le virus HIV-2 dans un fluide biologique humain, notamment un sérum ou un liquide céphalo-rachidien.
Un premier groupe (I) comprend les peptides Ces Ces Ces peptides reconnaissent des anticorps anti
HIV-2 et sont donc capables de détecter une infection par HIV-2. Ils reconnaissent également dans une certaine mesure des anticorps anti-HIV-1.
Un second groupe (II) comprend des peptides qui correspondent plus particulièrement à ceux qui sont situés dans la partie transmembranaire et dans la fin de la partie externe de la protéine d'enveloppe. Ces peptides sont ceux précédemment désignés par env1, env2 et env3. Ils permettent la reconnaissance spécifique de la présence d'anticorps contre HIV-2 et permettent donc de discriminer chez une personne les infections passées ou présentes dues à un HIV, plus particulièrement entre celles qui ont été provoquées par un HIV-2 et celles qui l'ont été par un HIV-1.
L'invention concerne également une composition contenant au moins l'un des susdits peptides ou au moins un oligomère de ce peptide caractérisée en ce qu'elle a la capacité d'être reconnue par des sérums d'origine humaine contenant des anticorps contre le virus HIV-2.
L'invention concerne un procédé de diagnostic in vitro un ou des peptides selon l'invention pour la détection d'anticorps contre HIV-2 dans des fluides biologiques, en particulier dans des sérums humains.
D'une façon générale le procédé de diagnostic 111 vitro ci-dessus comprend les étapes suivantes
- la mise en contact de ce liquide biologique avec lesdits peptides,
- la détection de la présence éventuelle d'un complexe peptide-anticorps par des méthodes physiques ou chimiques, dans ledit liquide biologique.
Dans un mode de réalisation préféré de l'in- vention, la détection du complexe antigène-anticorps est réalisée grâce à des tests immunoenzymatiques (du type EtSA), immunofluorescents (du type IFA), radioimmunologiques (du type RIA) ou des tests de radioimmunoprécipi- tatou (du type RIPA).
Ainsi l'invention concerne également tout peptide selon l'invention marqué à l'aide d'un marqueur adéquat du type enzymatique, fluorescent, radioactif, etc...
De telles méthodes comprennent par exemple les tapes suivantes
- dépôt de quantités déterminées d'une composition peptidique selon l'invention dans les puits d'une microplaque de titration,
- introduction dans lesdits puits de dilutions croissantes du sérum devant être diagnostiqué,
- incubation de la microplaque,
- rinçages répétés de la microplaque,
- introduction dans les puits de la microplaque d'anticorps marqués contre des immunoglobulines du sang, le marquage de ces anticorps ayant été réalisé à l'aide d'une enzyme sélectionnée parmi celles qui sont capables d'hydrolyser un substrat en modifiant l'absor- ption des radiations de ce dernier, au moins à une longueur d'onde déterminée,
- détection, en comparaison avec un témoin de contrôle, de la quantité de substrat hydrolysé.
L'invention concerne également des coffrets ou kits pour le diagnostic in vitro de la présence d'anticorps contre virus HIV-2 et, dans certains cas, HIV dans un milieu biologique qui comprennent
- une composition peptidique selon l'invention,
- les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la réaction immunologique,
- les réactifs permettant la détection du complexe antigènes-anticorps produit par la réaction immunologique. De tels réactifs peuvent également porter un marqueur, ou être susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué. Plus particulièrement dans le cas où la composition polypeptidique sus-mentionnée n'est pas marquée.
- un tissu fluide biologique de référence dépourvu d'anticorps reconnus par la composition polypeptidique sus-mentionnée,
L'invention concerne les anticorps eux-mêmes formés contre les peptides de l'invention.
Il va de soi que cette production n'est pas limitée aux anticorps polyclonaux.
Elle s'applique encore à tout anticorps monoclonal produit par tout hybridome susceptible d'être formé, par des méthodes classiques, à parti. es cellules spléniques d'un animal, notamment de souris ou de rat, immunisés contre l'un des peptide de l'invention, d'une part et des cellules d'une lignée de cellule myélome approprié d'autre part, et d'être sélectionné, par sa capacité à produire des anticorps monoclonaux reconnaissant le peptide initialement mis en oeuvre pour l'immunisation des animaux.
L'invention concerne également des compositions immunogènes pour la production de vaccins dont le principe actif est constitué par au moins un peptide selon l'invention, ou un oligomère de ce peptide, ou un peptide sous forme conjuguée avec une molécule porteuse, caractérisées en ce qu'elles induisent la production d'anticorps contre les susdits peptides en quantité suffisante pour aussi inhiber les protéines du rétrovirus HLV-2, voire même le rétrovirus HIV-2 entrant en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Les compositions immunogènes pour la production de vaccins comprennent de façon avantageuse plus paticulièrement au moins l'un des peptides précédemment désignés par env4, env5, env6, env7, env8, env9, env10, envol voir des mélanges de ceux-ci.
Parmi ces peptides aptes à constituer des principes actifs de vaccins certains sont particulièrement préférés car ils possèdent une structure de base en acides aminés correspondant à des régions des glycoprotéines d'enveloppe qui présentent un important degré de conservation, non seulement dans les HIV-2, mais également dans les HIV-1. Ces peptides particulièrement préférés sont les peptides désignés par env4, certains peptides env5, env6 et env10.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention les peptides immunogènes (ou fragments de ces peptides) aptes à constituer des principes actifs de vaccins sont choisis parmi ceux dont les formules correspondent à des séquences qui, dans les glycoprotéines d'enveloppe de HIV-2 et HIV-1 présentant une homologie en acides aminés supérieure à 50, qui appartiennent à la partie externe de l'enveloppe du virus, qui sont dépourvus ou presque de délétions, et qui renferment des résidus de cystéine favorables à la stabilisation des liaisons et à la constitution de boucles d'ancrage.
Les peptides suivants appartiennent à cette catégorie de peptides préférés.
env4
XVTV-YGVP-WK-ATZ env5 Xt-NVTE-FZ env6
XKPCVKLTPLCVZ env7
XN-S-ITZ env10
XNC-GEF-YNCZ env11
XC-IKQ-IZ
Des compositions pharmaceutiques avantageuses sont constituées par des solutions, suspensions ou liposomes injectables contenant une dose efficace d'au moins un produit selon l'invention. De préference, ces solutions, suspensions ou liposomes sont réalisés dans une phase aqueuse stérilisée isotonique, de préférence saline ou glucosée.
L'invention concerne plus particulièrement de telles suspensions, solutions ou forme liposome qui sont aptes à être administrées par injections intradermiques, intramusculaires ou sous-cutanées, ou encore par scarifications.
Elle concerne également des compositions pharmaceutiques administrables par d'autres voies, notamment par voie orale.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention, utilisables en tant que vaccins pour être efficaces dans la production d'anticorps contre le virus
HIV-2, peuvent à titre d'exemple être administrées à des doses situées entre 10 et 500 pg/kg, de peptides selon l'invention, de préférence de 50 à 100 pg/kg.
Ces doses sont citées à titre d'exemple et ne possèdent en aucun cas un caractère limitatif.
Comme on l'a'déjà indiqué plus haut les différents peptides qui ont été définis peuvent comprendre des modifications qui n'ont pas pour effet de modifier de façon fondamentale leurs propriétés immunologiques.
Les peptides équivalents qui en résultent entrent dans le champ des revendications qui suivent. A titre d'exemples de peptides équivalents on mentionnera ceux dont les structures en correspondance avec des régions des
ADNc d'autres variants de HIV-2 ou de HIV-1, lorsque ces régions ont été mises en alignement dans des conditions semblables à celles qui ont été évoquées ci-dessus, à propos de HIV-2 ROD et HIV-1 BRU.A titre d'autres de ces peptides, on mentionnera ceux dont les structures sont en correspondance avec de telles régions dans les
ADNc qui ont fait l'objet de dépôts à la CNCM, notamment sous les numéros I-502, I-642 (HIV-2 IRMO), I-643 (HIV-2
EHO) ainsi que, dans les cas appropriés, des variants de
HIV-1 qui ont fait l'objet de dépôts à la CNCM sous les numéros I-232, I-240, I-241, I-550, I-551.
Les peptides selon l'invention peuvent encore être définis par les formules suivantes (dans lesquels
X, Z et les tirets "-" ont les significations sus-indiquées)
XR--A-E-D-YL-DQ--L--WGC-----CZ
XA-E-D-YL-DZ
X--E--Q-QQEKN--EL--L---Z
XQ-QQEKNZ
XEL--YK-V-I-P-G-APTK-KR-----Z
XYK-V-I-P-G-APTK-KRZ
X----VTV-YGVP-WK-AT-LFCA-Z
XVTV-YGVP-WK-ATZ
X---QE--L-NVTE-F--W-NZ
XL-NVTE-FZ
XL---S-KPCVKLTPLCV--KZ
XKPCVKLTPLCVZ
XS-KPCVKLTPLCVZ
X---N-S-IT--C-Z
XN-S-ITZ
XYC-P-G-A-L-C-N-TZ
X------A-C-------W--Z
NKRPRQAWCWFKG-KWKD
X-G-DPE------NC-GEF-YCN-----NZ
X-----C-IKQ-I------G----YZ

Claims (7)

    REVENDICATIONS 1/ Peptide ayant des propriétés immunologiques en commun avec l'ossature peptidique de la glycoprotéine d'enveloppe des virus de la classe HIV-2, ce peptides contenant un nombre de résidus d'acides aminés r. excédant pas 40.
  1. 2/ Peptide selon la revendication 1 caractérisé par l'une des formules
    XR--A-E-D-YL-DQ--L--WGC-----CZ
    XA-E-D-YL-DZ dans laquelle X et Z sont des groupements OH ou NH2 ou, dans la mesure où les propriétés immunologiques du peptide dépourvu de ces groupes ne s'en trouvent pas essentiellement modifiées, des groupes comportant de 1 à 5 résidus d'acides aminés, et chacun des tirets correspond à un résidu aminoacyle choisi parmi ceux qui permettent de conserver au peptide sus-défini les propriétés immunologiques de l'une des séquences suivantes ::
    RVTAIEKYLQDQARLNSWGCAFRQVC AI EKYLQDQ 3/ Peptide selon la revendication 1 caractérisé par l'une des formules
    X--E--Q-QQEKN--EL--L---Z
    XQ-QQEKNZ dans laquelle X et Z sont des groupements OH-ou NH2 ou, dans la mesure où les propriétés immunologiques du peptide dépourvu de ces groupes ne s'en trouvent pas essentiellement modifiées, des groupes comportant de 1 à 5 résidus d'acides aminés, et chacun des tirets correspond à un résidu aminoacyle choisi parmi ceux qui permettent de conserver au peptide sus-défini les propriétés immunologiques de l'une des séquences suivantes
    SLEQAQIQQEKNMYELOKLNSW
    QIQQEKN 4/ Peptide selon la revendication 1 caractérisé par l'une des formules
    XEL--YK-V-I-P-G-APTK-KR-----Z
    XYK-V-I-P- & APTK-KRZ dans laquelle X et Z sont des groupements OH ou NH ou, dans la mesure où les propriétés immunologiques du peptide dépourvu de ces groupes ne s'en trouvent pas essentiellement modifiées, des groupes comportant de 1 à 5 résidus d'acides aminés, et chacun des tirets correspond à un résidu aminoacyle choisi parmi ceux qui permettent de conserver au peptide sus-défini les propriétés immunologiques de l'une des séquences suivantes
    ELGDYKLVEITPIGFAPTKEKRYSSAH
    YKLVEITPIGFAPTKEK 5/ Peptide selon la revendication 1 caractérisé par l'une des formules
    X----VTV-YGVP-WK-AT--LFCA-Z
    XVTV-YGVP-WK-ATZ dans laquelle X et Z sont des groupements OH ou NN ou, dans -la mesure où les propriétés immunologiques du peptide dépourvu de ces groupes ne s'en trouvent pas essentiellement modifiées, des groupes comportant e 1 à 5 résidus d'acides aminés, et chacun des tirets correspond à un résidu aminoacyle choisi parmi ceux qui permettent de conserver au peptide sus-défini les propriétés immu biologiques de l'une des séquences suivantes CTQYVTVFYGVPTWKNAT I PLFCAT
    VTVFYGVPTWKNAT
    EKLWVTVYYGVPVWKEATTTLFCAS
    VTVYYGVPVWKEAT 6/ Peptide selon la revendication 5 caractérisé par l'une des formules
    CTQYVTVFYGVPTWKNATIPLFCAT
    VTVFYGVPTWKNAT
    EKLWVTVYYGVPVWKEATTTLFCAS
    VTVYYGVPVWKEAT
    EDLWVTVYYGVPVWKEATTTLFCAS
    VTVYYGVPVWKEAT
    DNLWVTVYYGVPVWKEATTTLFCAS
    VTVYYGVPVWKEAT 7/ Peptide selon la revendication 1 caractérisé par l'une des formules
    X---QE--L-NVTE-F--W-NZ
    XL-NVTE-FZ dans laquelle X et Z sont des groupements OH ou NH ou, dans la mesure où les propriétés immunologiques du peptide dépourvu de ces groupes ne s'en trouvent pas essentiellement modifiées, des groupes comportant de 1 à 5 résidus d'acides aminés, et chacun des tirets correspond à un résidu aminoacyle choisi parmi ceux qui permettent de conserver au peptide sus-défini les propriétés immu biologiques de l'une des séquences suivantes
    DDYQEITL-NVTEAFDAWNN
    L-NVTE
    PNPQEVVLVNVTENFNMWKN
    LVNVTE 8/ Peptide selon la revendication 7 caractérisé par l'une des formules DDYQEITL-NVTEAFDAWNN
    L-NVTEAF PNPQEVVLVNVTENFNMWKN
    LVNVTENF
    PNPQEIELENVTEGFNMWKN
    LENVTEGF
    PNPQEIALENVTENFNMWKN
    LENVTENF 9/ Peptide selon la revendication 1 caractérisé par l'une des formules XL---S-KPCVKLTPLcV- -KZ
    XKPCVKLTPLCVZ
    XS-KPCVKLTPLCVZ dans laquelle X et Z sont des groupements OH ou NH2 ou, dans la mesure où les propriétés immunologiques du peptide dépourvu de ces groupes ne s'en trouvent pas essentiellement modifiées, des groupes comportant de 1 à 5 résidus d'acides aminés, et chacun des tirets correspond à un résidu aminoacyle choisi parmi ceux qui permettent de conserver au peptide sus-défini les propriétés immunologiques de l'une des séquences suivantes
    ETSIKPCVKLTPLCVAMK
    DQSLKPCVKLTPLCVSLK
    KPCVKLTPLCV
    SLKPCVKLTPLCV 10/ Peptide selon la revendication 9 caractérisé par l'une des structures suivantes
    ETSIKPCVKLTPLCVAMK
    DQSLKPCVKLTPLCVSLK
    DQSLKPCVKLTPLCVTLN
    PCVKLTPLCV 11/ Peptide caractérisé en ce qu'il contient la structure de base
    X---N-S-IT--C-Z
    XN-S-ITZ dans laquelle X et Z sont des groupements OH ou NH2 ou, dans la mesure où les propriétés immunologiques du peptide dépourvu de ces groupes ne s'en trouvent pas essentiellement modifiées, des groupes comportant de 1 à 5 résidus d'acides aminés, et chacun des tirets correspond à un résidu aminoacyle choisi parmi ceux qui permettent de conserver au peptide sus-défini les propriétés immunologiques de l'une des séquences suivantes
    NHCNTSVITESCD
    NTSVIT
    TSCNTSVITQACP
    NTSVIT 12/ Peptide selon la revendication 11 caractérisé par l'une des formules suivantes
    NHCNTSVITESCD
    NTSVIT
    TSCNTSVITQACP
    NTSVIT
    INCNTSVITQACP
    NTSVIT
    INCNTSAITQACP
    NTSAIT 13/ Peptide selon la revendication 1 caractérisé par l'une des formules suivantes
    XYC-P-G-A-L-C-N-TZ dans laquelle X et Z sont des groupements OH ou NH2 ou, dans la mesure où les propriétés immunologiques du peptide dépourvu de ces groupes ne s'en trouvent pas essentiellement modifiées, des groupes comportant de 1 à 5 résidus d'acides aminés, et chacun des tirets correspond à un résidu aminoacyle choisi parmi ceux qui permettent de conserver au peptide sus-défini les propriétés immunologiques de l'une des séquences suivantes
    YCAPPGYALLRC-NDT
    YCAPAGFAILKCNNKT 14/ Peptide selon la revendication 13 caractérisé par l'une des formules
    YCAPPGYALLRC-NDT
    YCAPAGFAILKCNNKT
    YCAPAGFAILKCNDKK YCAPAGFAI LKCRDKK 15/ Peptide selon la revendication 1 caractérisé par la formule
    X------A-C------W--Z dans laquelle X et Z sont des groupements OH ou NH2 ou, dans la mesure où les propriétés immunologiques du peptide dépourvu de ces groupes ne s'en trouvent pas essentiellement modifiées, des groupes comportant de 1 à 5 résidus d'acides aminés, et chacun des tirets correspond à un résidu aminoacyle choisi parmi ceux qui permettent de conserver au peptide sus-défini les propriétés immunologiques de l'une des séquences suivantes
    NKRPRQAWCWFKG-KWKD
    N--MRQAHCNISRAKWNA 16/ Peptide selon la revendication 15 caractérisé par la formule suivante
    NKRPRQAWCWFKG-KWKT
    N--MRQAHCNISRAKWNA
    D--IRRAYCTINETEWDK
    I--IGQAHCNISRAQWSK 17/ Peptide selon la revendication 1 caractérisé par la formule suivantes
    X-G-DPE------NC-GEF-YCN-----NZ
    XNC-GEF-YCNZ dans laquelle X et Z sont des groupements OH ou NH ou, dans la mesure où les propriétés immunologiques du peptide dépourvu de ces croupes ne s'en trouvent pas essentiellement modifiées, des groupes comportant de 1 à 5 résidus d'acides aminés, et chacun des tirets correspond à un résidu aminoacyle choisi parmi ceux qui permettent de conserver au peptide sus-défini les propriétés immunologiques de l'une des séquences suivantes
    KGSDPEVAYMWTNCRGEFLYCNMTWFLN
    NCRGEFLYCN -GGDPEIVTHSFNCGGEFFYCNSTQLFN
    NCGGEFFYCN 18/ Peptide selon la revendication 17 caractérisé par l'une des structures suivantes
    KGSDPEVAYMWTNCRGEFLYCNMTWFLN
    NCRGEFLYCN -GGDPEIVTHSFNCGGEFFYCNSTQLFN
    NCGGEFFYCN -GGDPEITTHSFNCRGEFFYCNTSKLFN
    NCRGEFFYCN -GGDPEITTHSFNCGGEFFYCNTSGLFN
    NCGGEFFYCN 19/ Peptide selon la revendication 1 caractérisé par l'une des formules suivantes X-----C-IKQ-I------G---YZ
    XC-IKQ-IZ dans laquelle X et Z sont des groupements OH ou NH2 ou, dans la mesure où les propriétés immunologiques du peptide dépourvu de ces groupes ne s'en trouvent pas essentiellement modifiées, des groupes comportant de 1 à 5 résidus d'acides aminés, et chacun des tirets correspond à un résidu aminoacyle choisi parmi ceux qui permettent de conserver au peptide sus-défini les propriétés immunologiques de l'une des séquences suivantes RNYAPCHIKQI INTWHKVGRNVY
    CHIKQII
    TITLPCRIKQFINMWQEVGKAMY
    CRIKQFI 20/ Peptide selon la revendication 19 caractérisé par l'une des structures suivantes RNYAPCHIKQI INTWHKVGRNVY
    CHIKQII
    TITLPCRIKQFINMWQEVGKAMY
    CRIKQFI
    SITLPCRIKQI INMWQKTCKAMY
    cRIQrI
    NITLQCRIKQIIKMVAGR-KAIY
    CRIKQII 21/ Peptide antigénique aaa1, caractérisé en ce qu'il a la structure de base
    XNCKLVLKGLGMNPTLEEMLTA dans laquelle X et Z sont des groupements OH ou NH2 ou, dans la mesure où les propriétés immunologiques du peptide dépourvu de ces groupes ne s'en trouvent pas essentiellement modifiées, des groupes comportant de 1 à 5 résidus d'acides aminés, et chacun des tirets correspond å un résidu aminoacyle choisi parmi ceux qui permettent de conserver au peptide sus-défini les propriétés immunologiques de l'une de la séquence suivante NCKLVLKGLGMNPTLEEMLTA 22/ Composition antigénique contenant au moins un peptide aaal selon la revendication 21 ou au moins un oligomère de ce peptide, caractérisée en ce qu'elle a la capacité d'être reconnue par des fluides biologiques d'origine humaine, notamment des sérums contenant des anticorps anti-HIV-2 et dans une certaine mesure des anticorps anti-HIV-1.
  2. 23/ Composition antigénique contenant au moins un peptide selon les revendications 2, 3 et 4 ou au moins un oligomère de ce peptide, caractérisée en ce qu'elle reconnaissent spécifiquement la présence d'anticorps contre HIV-2.
  3. 24/ Composition immunogène contenant au moins un peptide ou au moins un oligomère de ce pept ou ce peptide sous forme conjuguée avec une molécule porteuse, selon les revendications 5 à 20, en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable pour la production de vaccins, caractérisée en ce qu'elle induit la production d'anticorps contre les susdits peptides en quantité suffisante pour inhiber efficacement les protéines du rétrovirus HIV-2, voire même le rétrovirus HIV-2 entier.
  4. 25/ Composition immunogène selon la revendication 24 caractérisée en ce qu'elle contient les peptides dont les formules correspondent å des séquences qui, dans les glycoprotéines d'enveloppe de HIV-2 et HIV-1 présentent une homologie en acides aminés supérieure à 50.
  5. 26/ Composition immunogène selon l'une des revendications 24 ou 25, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un peptide ou au moins un oligomère de ce peptide ou ce peptide sous forme conjuguée avec une molécule porteuse choisi parmi env4, env5, env6 et envl0.
    27/ Procédé de diagnostic in vitro de l'infection par HIV-2 dans un liquide biologique comprenant
    - la mise en contact de ce liquide biologique avec au moins un peptide selon l'une des revendications 1, 2, 3, 4, 21 ou un conjugué de ces peptides avec une molécule porteuse,
    - la détection de la présence éventuelle d'un complexe antigène-anticorps par des méthodes physiques ou chimiques, dans ledit liquide biologique.
  6. 28/ Procédé de diagnostic in vitro de l'infection par HIV-2 dans un liquide biologique selon la revendication 27, caractérisé en ce que la détection du complexe antigène-anticorps éventuellement formé est réalisée grâce à des tests immunoenzymatiques (du type
    ELISA) immunofluorescents (du type IFA) radioimmunologiques (du type RIA) ou des tests de radioimmunoprécipitation (du type RIPA).
  7. 29/ Kit pour le diagnostic in vitro de l'infection par HIV-2 dans un liquide biologique caractérisé en ce qu'il comprend - une composition peptidique contenant un peptide selon l'une des revendications 1 à 4 ou 21, ou un mélange de ces peptides, ou un conjugué de ces peptides avec une molécule porteuse, - un réactif pour la constitution du milieu propice à la réalisation d'une réaction immunologique, - un ou plusieurs réactifs éventuellement marqué pour la détection du complexe antigène-anticorps formé par la réaction immunologique, - un liquide biologique de référence dépourvu d'anticorps reconnus par la susdite composition peptidique.
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