FR2619123A1 - Acide desoxyribonucleique portant l'information genetique de la creatinase - Google Patents

Abstract

On décrit un acide polydésoxyribonucléique possédant une séquence de bases codant pour une séquence d'acides aminés d'un polypeptide qui est une créatinase, provenant d'un microorganisme producteur de créatinase appartenant au genre Bacillus. La séquence de bases de l'ADN du gène de la créatinase et la séquence d'acides aminés de la créatinase ont été élucidées. On décrit également le transformant possédant cet acide polydésoxyribonucléique, ainsi qu'un procédé de préparation de la créatinase, avec une productivité élevée, par l'application d'une technique de génie génétique.

Description

ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE PORTANT L'INFORMATION GENETIQUE DE

LA CREATINASE

La présente invention concerne un nouvel acide polydésoxyribonucléique portant l'information génétique de la créatinase. L'invention concerne également un transformant comprenant ledit acide polydésoxyribonucléique, et la créatinase, ainsi qu'un procédé de préparation de cette dernière, par l'expression par le transformant de

l'information génétique dudit acide polydésoxyribonucléique.

La créatinase est une enzyme qui catalyse la réaction de la créatine et de l'eau pour produire l'urée et la sarcosine. On sait que cette substance existe dans des microorganismes appartenant aux genres Pseudomonas [Journal of General Microbiologv, 14. 351, (1956)], Artherob6ctor [Molecular & Cellular Biochemistry, 3, 9, (1974)], Alkaligenes, Penicillum (Publication du Brevet Japonais n' 7674/1981), Flavobacterium Micrococcus, Colinebacterium (Publication du Brevet Japonais n; 8395/1977>, Bacillus (Publication du Brevet Japonais n' 17465/1986), Actinobacillus (Demande de Brevet Japonais Mise à la Disposition du Public n' 67484/1981), et Acinetobactor (Demande de Brevet Japonais Mise & la Disposition du Public n' 67485/1981>. Egalement, on a décrit de la créatinase provenant de Pseudomonas putida par l'utilisation d'une

technologie du génie génétique.

Etant donné que la créatinase est une hydrogénase ayant la créatine comme substrat, elle peut être utilisée pour le titrage de la créatine existant dans un fluide corporel, tel que le sérum. Elle peut être également utilisée, par la mesure de la quantité de créatine produite

dans le système producteur de créatine créatinine-

créatinase, pour le titrage de diverses substances, qui sont les substrats d'enzymes affectant le système producteur de créatine, ainsi que pour la détermination des activités enzymatiques mises en Jeu dans le système producteur de créatine. De ce fait, la créatinase est un réactif très important pour l'utilisation non seulement dans les expériences au laboratoire, mais également dans le

diagnostic clinique.

Les microorganismes producteurs de créatinase décrits Jusqu'à présent, qui sont utilisés sans recours à une technique de génie génétique, ne fournissent qu'un rendement médiocre de production de la créatinase, si bien que l'utilisation d'une substance inductrice d'enzyme, telle que la créatine ou similaire, qui peut aider à produire de la créatinase, a été indispensable. Ceci rend élevé le coût de production de la créatinase. De plus, conformément à cette méthode, la séparation d'autres types d'enzymes, tels que la créatininase ou similaire, qui peuvent être présentes conjointement avec la créatinase, est très difficile. Le coût de la purification pour obtenir une créatinase de pureté élevée rend le coût de la production d'ensemble encore plus élevé. De ce fait, l'utilisation de ces microorganismes producteurs de créatinase n'a pas toujours été une voie efficace et commode pour fournir de la créatinase comme réactif pour une large utilisation dans les

expériences au laboratoire ou dans le diagnostic clinique.

La créatinase provenant de microorganismes producteurs de créatinase appartenant au genre Bacillus nécessite également l'addition d'une substance inductrice d'enzyme, qui est coûteuse, au cours de sa préparation. De plus, il n'y a pas eu de publication sur la structure

chimique détaillée du polypeptide constituant cette enzyme.

Les présents inventeurs-ont entrepris des études approfondies afin d'améliorer la productivité de cette créatinase, et ils ont réussi à obtenir le gène de cette créatinase et en outre à élucider l'analyse de sa structure primaire. En outre, les inventeurs ont mis au point un procédé pour préparer la créatinase, avec une productivité élevée, par l'application d'une technique de génie génétique. De plus, par l'analyse de la séquence d'ADN du gène de la créatinase induit par les microorganismes producteurs de créatinase appartenant au genre Bacillus, les inventeurs ont découvert que l'enzyme possédait des structures de séquence d'acides aminés et de séquence de bases qui sont tout à fait différentes de celles de la créatinase produite par une technique de génie génétique connue d'une manière classique. Les inventeurs ont également découvert que les protéines obtenues présentaient d'excellentes activités de créatinase tout à fait inattendues. Ces découvertes ont conduit à la réalisation

de cette invention.

Le nouveau procédé de préparation de la créatinase conforme à cette invention ne nécessite pas l'utilisation d'une substance inductrice d'enzyme qui est coûteuse, telle que la créatine, au cours de la production de créatinase, et il constitue, de ce fait, un procédé industriellement avantageux. En conséquence, la présente invention a pour but de proposer un acide polydésoxyribonucléique ayant une séquence de bases codant pour une séquence d'acides aminés d'un polypeptide qui est la créatinase provenant d'un microorganisme producteur de créatinase appartenant au genre Bacillus, ou d'un polypeptide ayant ladite créatinase comme

constituant.

Cette invention a pour autre but de proposer un

transformant comprenant cet acide polydésoxyribonucléique.

Encore un autre but est de proposer un polypeptide comprenant une cratinase ayant une séquence d'acides aminés qui est représentée, partant de l'extrémité N terminale, par la formule suivante, ou un polypeptide ayant une telle créatinase comme constituant: A-GIn Gin Ile Thr Asp Leu Glu Arg Thr Lys Ile Leu Gin Asn Gly Gly Glu Lys Val

20

Lys Pro Thr Phe Ser Lys Glu Glu Met Thr Arg Arg Asn Thr Arg Leu Ar8 Glu Tyr Met Ala Lys Ala Gly Ile Asp Ala Val Met Phe

-50

Thr Ser Tyr His Asn lie Asn Tyr Tyr Ser Asp Phe Leu Tyr Thr Ser Phe Asn Arg Ser Tyr Ala Leu Val Val Thr Gin Asp Lys Bis

80

Val Thr Val Ser Ala Asn lie Asp Ala Gly Met Pro Trp Arg Arg Ser Phe Asp Glu Asn lle Val Tyr Thr Asp Trp Lys Arg Asp Asn

110

Phe Leu Tyr Ala Val Lys Lys Val Leu Asn Glu Gly Gly Phe Ser Ser Gly Arg Leu Gly Val Glu Asn Asp Bis Met Thr Leu Asp Leu

140

Arg Arg Gln Val Gln Asp Ala Leu Pro Asn Thr Glu Leu Val Asp Val Ser Gln Ala Val Met Gly His Arg Met Phe Lys Ser Asp Glu

170

Glu lie Asp Leu Ile Lys Asn Gly Ala Arg lie Ala Asp lie Gly Gly Ala Ala Val Val Glu Ala lie Arg Glu Gly Val Pro Glu Tyr

200

Glu Val Ala Leu His Gly Thr Glu Ala Met Val Arg Glu lie Ala Arg Thr Tyr Pro His Ala Glu Leu Arg Asp Thr Trp Ile Trp Phe Gin Ser Gly Ile Asn Thr Asp Gly Ala Ris Asn Trp Ala Thr Ser Arg Lys Leu Gln Arg Gly Asp lie Leu Ser Leu Asn Cys Phe Pro Met Ile Ala Gly Tyr Tyr Thr Ala Leu Glu Arg Thr Leu Phe Leu Glu Glu Val Ser Asp Arg Bis Leu Glu Leu Trp Glu Ile Asn Cys Lys Val His Arg Arg Gly Leu Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Arg Cys Met Asp Ile Ala Ala Glu Leu Asn Glu Ile Tyr Arg Glu Bis Asp Leu Leu Ala Asn Arg Thr Phe Gly Tyr l Gly Bis Ser Phe Gly Val Leu Ser Ris Tyr Tyr Gly Arg Glu Ala Gly Leu Glu Leu Arg Glu Asp lie Glu Thr Val Leu Glu Pro Gly Met Val Val Ser Met Glu Pro Met Ile Met Ile Pro Glu Gly Glu Pro Gly Ala Gly Gly Tyr Arg Glu Bis Asp Ile Leu Val Ile Ser Glu Asn Gly Thr Glu Asn Ile Thr Lys Phe

400

Pro Phe Gly Pro Glu Bis Asn Ile:Ile Lys Lys -B ( I) ou - A représente un reste d'acide aminé, un groupe acétyle, ou un atome d'hydrogène;-et

- B représente un reste d'acide aminé ou -OH ou NH2.

2 6 1 9 1 23

La présente invention e encore pour but ce proposer un procédé de préparation de créatinase, comprenant: - l'insertion d'un acide polydésoxyribonucléique qui est un gène de la créatinase, provenant d'un microorganisme producteur de créatinase appartenant au genre Bacillus, ou d'un acide polydésoxyribonucléique possédant ledit gène de la créatinase comme constituant, dans un vecteur d'expression, afin d'obtenir un ADN recombinant; - la production d'un tansfoamant par introduction dudit ADN recombinant dans un microorganisme hôte, et la culture dudit transformant, pour amener le transformant à manifester l'information génétique dudit acide polydésoxyribonucléique; et *'- la collecte du polypeptide de ladite créatinase oudu

polypeptide ayant ladite créatinase comme constituant.

D'autres buts, caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront plus aisément ci-après à la

lecture de la description suivante.

: - La Figure 1 est une représentation schématique montrant la configuration du vecteur pCRi, indiquant les sites de coupure du vecteur pCRi avec l'utilisaticn

d'endonucléases de restriction EcoR I, Hind III.

Ban II. Bgl II, Pst I, Sph I, et CIa I; 2-- - les Figures 2-1 et 2-2 représentent la séquence ae bases de l'ADN du gène de la créatinase %de 5' vers 3'); et - les Figures 3-1 et 3-2 représentent la séquence d'acides aminés du produit de translation obtenuh -artir O celui-ci. Dans le polypeptide de formule (I), le reste d'acide aminé représenté par A peut être un ou plusieurs restes d'acides aminés. Des exemples préférés de A sont un

atome d'hydrogène, la méthionine, ou un polypeptide signal.

Le groupe représenté par B peut être un amide d'acide ou un

ou plusieurs restes d'acides aminés.

Un acide polydésoxyribonucléique qui code pour le gène de la créatinase agissant comme catalyseur dans la réaction de la créatine et de l'eau pour produire de l'urée et de la sarcosine, ou un acide polydésoxyribonucléique ayant ledit gène comme constituant, peut être tout acide polydésoxyribonucléique pour autant qu'il contienne ledit gène de la créatinase lui-même. Sont donnés comme exemples dudit gène de la créatinase lui-même, la créatine représentée par la formule (II) suivante, partant de l'extrémité N terminale: Gin Gin Ile Thr Asp Leu Glu Arg Thr Lys Ile Leu Gin Asn Gly Gly Glu Lys Val 51 Lys Pro Thr Phe Ser Lys Glu Glu Met Thr Arg Arg Asn Thr Arg Leu Arg Glu Tyr Met Ala Lys Ala Gly Ile Asp Ala Val Met Phe 2! Thr Ser Tyr His Asn lie Asn Tyr Tyr Ser Asp Phe Leu Tyr Thr Ser Phe Asn Arg Ser Tyr Ala Leu Val Val Thr GIn-Asp Lys His ::- Val Thr Val Ser Ala Asn le Asp Ala GIy Met Pro Trp Arg Arg Ser Phe Asp Glu Asn Ile Val Tyr Thr Asp Trp Lys Arg Asp Asn 3so Phe Leu Tyr Ala Val Lys Lys Val Leu Asn Glu Gly Gly Phe Ser Ser Gly Arg Leu Gly Val Glu Asn Asp His Met Thr Leu Asp Leu Arg Arg Gin Val Gln Asp Ala Leu Pro Asn Thr Glu Leu Val Asp Val Ser Gin Ala Val Met Gly Ris Arg Met Phe Lys Ser Asp Glu Glu Ile Asp Leu Ile Lys Asn Gly Ala Arg Ile Ala Asp Ile Gly Gly Ala Ala Val Val Glu Ala lie Arg Glu Gly Val Pro Glu Tyr Glu Val Ala Leu Ris Gly Thr Glu Ala Met Val Arg Glu Ile Ala Arg Thr Tyr Pro Ris Ala Glu Leu Arg Asp Thr Trp lie Trp Phe Gin Ser Gly Ile Asn Thr Asp Gly Ala His Asn Trp Ala Thr Ser Arg Lys Leu Gin Arg Gly Asp lie Leu Ser Leu Asn Cys Phe Pro Met Ile Ala Gly Tyr Tyr Thr Ala Leu Glu Arg Thr Leu Phe Leu Glu Glu Val Ser Asp Arg His Leu Glu Leu Trp Glu Ile Asn Cys Lys Val Bis Arg Arg Gly Leu Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Arg Cys Met Asp Ile Ala Ala Glu Leu Asn Glu Ile Tyr Arg Glu His Asp Leu Leu Ala Asn Arg Thr Phe Gly Tyr Gly Ris Ser Phe Gly Val Leu Ser Bis Tyr Tyr Gly Arg Glu Ala Gly Leu Glu Leu. Arg Glu Asp Ile Glu Thr Val Leu Glu Pro Gly

:3 5 360

Met Val Val Ser Met Glu Pro Met Ile Met Ile Pro Glu Gly Glu Pro Gly Ala Gly Gly Tyr Arg Glu His Asp lie Leu Val lie Ser Glu Asn Gly Thr Glu Asn Ile Thr Lys Phe Pro Phe Gly Pro Glu His Asa Ile lie Lys Lys () ainsi que des acides polydésoxyribonucléiques ayant une séquence de bases codant pour une séquence d'acides aminés d'un polypeptide comprenant de la créatinase qui catalyse la réaction de la créatine et de l'eau pour produire de l'urée et de la sarcosine. L'acide polydésoxyribonucléique peut être tout acide polydésoxyribonucléique pour autant que celui-ci possède n'importe lequel parmi plusieurs codons correspondant à chacun des acides aminés constituant la séquences d'acides aminés de formule (Ii) du poiypeptiae

créatinase. Ii peut être également un acide polydésoxy-

ribonucléique possédant, à son extrémité 5' terminale, un ou plusieurs codons autres qu'un cocon non-sens et/ou à son extrémité 3' terminale, un ou plusieurs codons. Un exemple typique d'un tel acide polydésoxyribonucléqiue est celui possédant une séquence de bases. représentée. partant de l'extrémité 5' terminale, par la formule cIII!:

X- CAA CAA ATC ACA GAT CTT GAA AGA ACA

AAG ATT TTA CAA AAC GGC GGG GAG AAA GTA

AAG CCC ACT TTT TCA AAA GAG GAA ATG ACA

90

CGC CGC AAT ACC CGT TTA CGC GAG TAT ATG

GCG AAG GCC GGA ATC GAT GCT GTT ATG TTC

ACT TCT TAC CAT AAT ATC AAC TAT TAC AGC

180

GAC TTT TTA TAT ACA TCA TTC AAC AGA TCG

TAT GCG CTC GTC GTC ACT CAG GAC AAG CAT

GTG ACT GTA AGC GCA AAC ATT GAT GCC GGC

270

ATG CCG TGG AGA CGC AGC TTT GAC GAG AAT

ATT GTT TAC ACA GAC TGG AAA AGA GAC AAC

TTT CTT TAT GCC GTG AAA AAG GTA TTA AAT

o10 360

GAG GGA GGC TTC TCC AGC GGC CGT CTC GGT

GTA GAA AAT GAT CAT ATG ACG CTG GAT TTA

CGG CGC CAA GTG CAG GAT GCC CTG CCA AAC

i5 - $450

ACA GAG CTT GTG GAC GTT TCC CAG GCG GTG

ATG GGG CAT CGG ATG TTT AAG TCT GAC GAG

GAA ATT GAT TTG ATT AAA AAT GGA GCC CGT

2' 540

ATT GCA GAT ATC GGC GGA GCG GCC GTT GTC

GAA GCG ATT CGC GAA GGC GTA CCG GAA TAC

GAA GTG GCG CTG CAT GGG ACA GAA GCA ATG

GTA CGC GAA ATT GCC CGT ACG TAC CCG CAC

GCT GAA CTT CGG GAC ACG TGG ATT TGG TTT

CAA TCC GGC ATT AAT ACG GAC GGC GCT CAC

AAC TGG GCG ACT TCC CGC AAG CTG CAG CGA

GGA GAT ATT TTG AGC CTA AAC TGC TTC CCG

ATG ATC GCT GGT TAC TAT ACG GCA CTT GAG

CGC ACG TTG TTC TTG GAA GAA GTG TCT GAC

CGC CAT CTT GAA CTG TGG GAA ATC AAC TGT

il 1 1

AAA GTG CAT AGA CGC GGC CTT GAA CTG ATC

AAG CCA GGG GCT AGA TGT ATG GAT ATC GCC

GCT GAA TTA AAT GAG ATC TAC CGC GAG CAC

GAC TTG TTG GCG AAC CGG ACG TTC GGT TAC

lo GGA CAC TCA TTC GGC GTA CTG AGC CAC TAT

TAC GGA CGT GAG GCT GGA CTG GAG CTG CGG

GAA GAT ATC GAA ACA GTG TTG GAG CCG GGC

*. ATG GTT GTG TCC ATG GAA CCA ATG ATC ATG

ATT CCA GAG GGA GAG CCG GGA GCG GGC GGT

TAC CGT GAG CAC GAC ATC CTC GTT ATT AGC

2,., GAG AAC GGG ACA GAG AAT ATC ACT AAG TTC

CCA TTC GGT CCG GAG CAT AAC ATT ATT AAA

AAG -Y ()

o: _5 - X représente un codon autre que TAA, TAG et TGA, ou un atome d'hydrogène; et

- Y désigne un codon ou un atome d'nydrogène.

Concernant ia séquence de bases de formule UIII>, le codon représenté par X peut être tout codon pour autant que celui-ci code pour un acide aminé. De plus, X peut posséder & son extrémité 5' terminale, un ou plusieurs codons codant pour des acides aminés. Des exemples préférés de X sont ATG ou un acide polydésoxyribonucléique

correspondant à un peptide signal.

Le codon représenté par Y peut être tout cocon choisi parmi les codons de terminaison de translation et les codons codant pour un acide aminé. Y peut posséder, à son extrémité 3' terminale, un ou plusieurs codons codant pour des acides aminés, et dans ce cas, il est souhaitable qu'un codon de terminaison de translation soit prévu à 1 extrémité 3' terminale

de ces codons.

Un acide polydésoxyribonucléique ayant un gène de

la créatinase comme constituant, un acide polydésoxy-

ribonucléique qui est un gène ayant une séquence de bases codant pour la séquence d'acides aminés de formule (II), ou un acide polydésoxyribonucléique représenté par la formule (III), peuvent être préparés par le procédé comprenant les étapes suivantes. Un ADN d'un microorganisme producteur de créatinase, qui est un donneur d'un gène de créatinase, est tout d'abord sépare et purifié, et l'on fait suivre par un traitement par ultrasons ou par une endonucléase de restriction. Cet ADN et un ADN vecteur d'expression linéaire digéré sont réunis avec ies extrémités apointées ou cohésives d'ADN ligase des deux ADN, pour former un cercle fermé. Le vecteur d'ADN recombinant ainsi obtenu est introduit dans un microoorganisme hôte reproductible. On cultive des microorganismes possédant ledit vecteur d'ADN recombinant recueilli au moyen d'un criblage, à l'aide d'un marqueur au vecteur et de l'activité créatinase en tant qu'indicateurs. Ledit vecteur d'ADN recombinant est ensuite séparé des microorganismes cultivés et il est purifié, & partir duquel on recueille

l'acide polydésoxyribonucléique du gène de la créatinase.

Tout microorganisme producteur de créatinase peut être utilisé comme microorganisme donneur du gène de la créatinase aux fins de cette invention. Un exemple est la souche Bacillus SP B-0618 (FERM BP-0750> décrite dans la

Publication du Brevet Japonais n0 17465/1986.

26191Z3

Des microorganismes transformés, provenant du genre Bacillus, auxquels l'aptitude & la producticon de créatinase a été conféréepar l'utilisation d'une tecnnique de génie génétique, peuvent également être employés comme

microorganismes donneurs du gène de la créatlnase.

La méthode pour recueillir un ADN induit par le microorganisme donneur du gène est maintenant illustrée à titre d'exemple. On cultive tout d'abord n'importe lequel

parmi les microorganismes donneurs du gène mentionnés ci-

dessus, dans un milieu de culture liquide, sous aération, pendant 1 à 3 jours. Le bouillon ainsi cultivé est soumis à une centrifugation pour recueillir le microorganisme, lequel est ensuite lysé pour produire une bactériolyse contenant le gène de la créatinase. Le traitement par une enzyme lysant

la paroi cellulaire, telle que le lysozyme ou la h-

glucanase. est utilisé pour la cactério;yse, en combinaison, si nécessaire, avec une autre enzyme, telle qu'une protéase ou un agent tensio-actif, tel que le laurylsulfate de sodium. De plus, la digestion physique des parois cellulaires au moyen de la congélation-décongélation ou de la presse de French. par exemple, peut être employée

conjointement avec la bactériolyse.

Des méthodes classiques de purification, comprenant, par exemple, l'extraction au phénol, le traitement par protéase, le traitement par ribonucléase, la précipitation par un alcool, et la centrifugation, peuvent être appliquées, soit indépendamment de, soit en combinaison, avec la séparation et la purification de l'ADN

à partir de la bactériolyse.

La digestion de l'ADN du microorganisme ainsi séparé et purifié peut être affectuée à l'aide d'un traitement par ultrasons ou par une endonucléase de restriction par exemple. Cependant, afin d'assurer une jonction aisée des fragments d'ADN et de l'ADN vecteur, l'utilisation d'une endonucléase de restriction est préférable, en particulier, celles présentant une activité

2 6 1 9 1 2 3

sur les séquences nucléotidiques spécifiques, telles que

EcoR I, Hind III, BamH I, ou BamH II.

Des vecteurs souhaitables employés sont ceux restructurés pour être utilisés comme ADN recombinant génétique par un traitement artificiel d'un phage ou d'ADN plasmide qui est capable de se développer de façon autonome

dans des cellules bactériennes hôtes.

Dans le cas o Escherichia coli est utilisé comme microorganisme hôte, par exemple, Xgt. XC, Xgt. XB, ou

similaires, sont utilisés comme phages.

Comme plasmides, pBR322, pBR325, pACYC184, pUC12, pUC13, pUC18, pUC19, ou similaires, sont utilisés lorsque Escherichia coli est le microorganisme hôte, pUB110, pC194, ou similaires, sont utilisés lorsque Eaciilus subtillisest : le microorganisme hote, et YRp7, pYC1, YEp13, $JDB, YIpl, ou similaires, sont utilisés lorsque Saccharomve cereisiEae est le microorganisme note. De plus. ces vecteur - navettes peuvent etre employés, qui peuvent se développer de facon autonome dans des cellules bactériennes hotes de microorganismes gram-positifs ou des micrqorganismes gram-négatifs, ou des deux, par exemple, aans úscherichia coli ou Saccharcmyces cerevisiae ou les ceux. ses vecteurs sont, de façon souhaitable, digérés en fragments de vecteurs à l'aide de la même endonucléase de restriction que celle utilisée dans la rupture de l'ADN du microorganisme. donneur

de gène de la créatinase mentionné ci-dessus.

Une méthode classique d'utilisation de l'ADN ligase peut être employée pour relier l'ADN bactérien et le fragment de vecteur. Par exemple, l'extrémité cohésive de l'ADN bactérien et celle du fragment de vecteur sont tout d'abord mises sous forme bicaténaire, puis un ADN recombinant de 1'ADN bactérien et le fragment de vecteur peuvent être préparés par l'action d'une ADN ligase appropriée. Si nécessaire, l'ADN bactérien fragment de vecteur sous forme bicaténaire est introduit dans le microorganisme hôte pour produire

l'ADN recombinant à l'aide d'ADN ligase in vivo.

Tous microorganismes peuvent être utilisés comme bactéries hôtes, qui permettent une croissance autonome et stable de l'ADN recombinant et qui sont capables ce manifester le caractère de l'ADN étranger. Des exemples de ces microorganismes comprennent Escherichia coli DH1, Escherichia coli HB101, Escherichia coli W3110, Escherichia coli C600, et similaires, lorsque Escherichia coli est utilisé comme bactérie hôte, Bacillus subtillis 207-25 [Gene, 34, 1 - 8, <1985)], Bacillus subtillis 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 - 93, <1984)], Bacillus subtillis BDI70 [Nature, 293, 481 - 483, <1981)], Bacillus subtillis M (ATCC 6051>, et similaires, lorsque Bacillus subtillis est utilisé comme bactérie hôte, Saccharomyces cerevisiae AH-22 [Gene, 39, 117 - 120, <1985)1, i Saccharomyces cerevisiae BWG1-7A [Molecular & Cellular Biology, 6, 355 367, (1986)!, et similaires, lorsque

Saccharomyces cerevisiae est utilisé comme bactérie hôte.

L'introduction de l'ADN recombinant dans le microorganisme hôte peut être effectuée en présence de l'ion 2,: calcium, lorsque le microorganisme hôte est une bactérie appartenant au genre Escherichia. Lorsqu' une bactérie appartenant au genre Baci1us est utilisée comme microorganisme hôte, on peut utiliser soit la méthode des cellules compétentes, la méthode des protoplastes, soit la méthode par micro-injection. Pour la bactérie hôte appartenant au genre Saccharomyces, on peut employer la méthode des protoplastes ou la méthode à l'acétate de lithium. On a découvert que la bactérie transformante ainsi obtenue, lorsqu'elle est cultivée dans un milieu nutritif, produit de façon stable une quantité importante de créatinase. L'introduction de l'ADN, qui remplit la fonction recherchée dans le microorganisme hôte peut être retrouvée au moyen de la détection du microorganisme qui peut 3_6 manifester un marqueur de résistance aux médicaments du vecteur sur lequel l'ADN recombinant qui remplit la fonction recherchée est maintenu, ainsi que la créatinase en même temps. Par exemple, on peut choisir des bactéries qui se développent dans un milieu de culture sélectif du marqueur de résistance

aux médicaments et qui produisent de la créatinase.

L'ADN recombinant possédant le gène de la créatinase, une fois choisi de cette manière, peut être facilement extrait du microrganisme transformant pour être introduit dans une autre bactérie hôte. En variante, un ADN de gène de la créatinase peut être digéré à l'aide d'une endonucléase de restriction ou similaire, à partir d'un ADN recombinant possédant un gène de la créatinase, et il est

réuni au fragment de vecteur obtenu d'une manière similaire.

L'ADN-fragment de vecteur a l'état réuni est ensuite introduit dans

le microorganisme hôte.

È- Une créatinase mutéine. qui est un mutant produit par une technique de génie génétique, à partir d'un gène de la créatinase de la présente invention, possédant une activité créatinase substantielle, peut être préparée par ammplification de ce mutant, à l'aide de diverses méthodes, 2,' production de l'ADN recombinant par insertion du mutant dans un vecteur, et introduction de cet ADN recombinant dans le

microorganisme hôte.

La séquence de bases du gène de la créatinase préparé par le procédé décrit ci-dessus a été décodée par la méthode désoxy [Science, 214. 1205 1210 (1981;1. La séquence d'acides aminés de la créatinase a été déterminée à

partir de la séquence de bases.

La méthode employée pour la détermination de la séquence d'acides aminés de la fraction constituant l'extrémité N terminale du peptide créatinase va maintenant être discutée. Les microorganismes donneurs du gène de la créatinase, capables de produire la créatinase, ont tout d'abord été cultivés dans un milieu nutritif, afin de

produire et accumuler de la créatinase oans les bactéries.

Les bactéries cultivées ont été recueillies à partir du bouillon, par filtration, centrifugation, ou moyens similaires. Les bactéries recueillies ont ensuite été digérées, soit par des moyens mécaniques, soit par des moyens enzymatiques, à l'aide de lysczyme ou similaires, et, aux bactéries digérées, on a ajouté de l'EDTA et/ou un agent tensio-actif approprié, si nécessaire, pour solubiliser la créatinase, qui a été ensuite séparée en tant que solution aqueuse. Cette solution aqueuse de créatinase a été condensée ou soumise à un fractionnement au sulfate d'ammonium, une filtration sur gel, une chromatographie d'adsorption, ou une chromatographie d'lchanae d'ions, afin d'obtenir une créatinase de pureté élevée. La séquence d'acides aminés de la fraction constituant l'extrémité N terminale du peptide créatinase a été déterminée sur cette créatinase de pureté élevée, à l'aide a'un séquenceur de protéines en phase liquiae (Beckman System 890ME, fabriqué par Beckman. Inc.). De cette manière, il a été confirmé que la séquence d'acides aminés de ladite fraction est identique à la séquence d'acides aminés de l'extrémité N terminale de

la créatinase obtenue par une technique de génie génétique.

La culture du microorganisme hote transformant est conduite dans les conditions déterminées, en prenant en considération les caractéristiques physiologiques_ milieu nutritif du microorganisme hôte. Dans la plupart des cas, on emploie une culture liquide. Cependant. dans une production à l'échelle industrielle, la culture aérobie sous forte agitation est plus avantageuse. Une grande variété de milieux nutritifs habituellement utilisés pour la culture des bactéries peut être utilisée pour cultiver le microorganisme hôte. D'une manière spécifique, tous composés carbonés nutritifs peuvent être utilisés comme sources de carbone, comprenant, par exemple, le glucose, le sucrose, le lactose, le maltose, le fructose, les mélasses et similaires. Comme sources d'azote, tous composés azotés disponibles peuvent être employés, y compris les peptones, les extraits de viande, les extraits de levure, les hydrolysats de caséine et similaires. D'autres ingrédients, y compris des sels, tels que phosphates, carbonates et sulfates, de même que les sels de magnésium, de calcium, de potassium, de fer, de manganèse, de zinc, et similaires, et certains types d'acides aminés ou de vitamines, peuvent être

utilisés s'ils conviennent.

On peut faire varier la température de la culture dans une plage dans laquelle les bactéries peuvent se développer et produire de la créatinase. La plage des températures que l'on préfère est 20 - 42'C pour Escherichia coli, 30 - 37 C pour Bacillus subtiliis, et 25 - 35'C pour accharomvces cerevisîae. On peut faire varier le temps de la culture daseueoertaLoemrre dépendant des conditions de la culture. En principe, la culture est terminée au moment o le rendement en créatinase atteint un maximum. Dansla pratique habituelle, cela prend environ 12 - 48 heures lorsque la bactérie hôte est Escherichia col1, 18 - 42 heures lorsque la bactérie h6te est Bacillus subtillis, et 24 - 48 heures lorsque la bactérie h6te est Saccharomvces cerevisiae, Il est possible de faire varier le pH des milieux de culture à l'intérieur de la plage dans laquelle les bactéries peuvent se développer et produire la créatinase. La plage des pH particulièrement préférée est 6 - 8 pour Escherichia colu, environ 7 pour Bacillus subtillis, et 5 - 7 pour Saccharomyces cerevisiae, La créatinase peut être présentée en vue de l'utilisation sous la forme de bouillon de culture comme il contient des bactéries, Cependant, la créatinase contenue dans le bouillon de culture est généralement utilisée après que l'on en ait séparé les bactéries par filtration, centrifugation, ou moyens analogues. Au cas o de la créatinase soit contenue dans la pâte bac-triene, les bactéries sont tout d'abord séparées par filtration ou par centrifugation. Les bactéries recueillies sont ensuite digérées, soit par des moyens mécaniques, soit par des moyens enzymatiques, à l'aide de lysozyme ou similaires, et aux bactéries digérées, on ajoute un agent chélatant, tel que EDTA et/ou un agent tensio-actif approprié, si nécessaire, pour solubiliser la créatinase, ce qui permet ainsi de recueillir la créatinase en tant que solution aqueuse. Les solutions contenant la créatinase ainsi obtenues sont ensuite condensées par évaporation sous vide ou par l'utilisation d'un filtre, et elles sont soumises à un traitement de relargage par du sulfate d'ammonium, du sulfate de sodium, ou similaires, ou à une précipitation fractionnée à l'aide d'un solvant organique hydrophile, tel que le méthanol, l'éthanol, l'acétone, ou similaires. Le précipité est dissous dans l'eau, et la solution est dialysée à travers une membrane semi-permeable, afin d'éliminer les impuretés de faible masse moléculaire. En variante, le précipité est purifié par filtration sur gel, chromatographie d'adsorption, chromatographie d'échange d'ions, ou similaires, à l'aide d'un adsorbant ou d'un agent de filtration sur gel. La créatinase purifiée est produite à partir de la solution contenant la créatinase obtenue par l'utilisation de ces divers moyens par évaporation sous

vide, lyophilisation, ou similaires.

Dans la description de ce mémoire, les acides

aminés, peptides, acides nucléiques, et composés apparentés aux acides nucléiques sont indiqués de manière abrégée selon la nomenclature en vigueur dans la technique. Quelques

exemples d'abréviations sont énumérés ci-dessous.

Egalement, toutes désignations d'acides aminés se rapportent aux isomères L. ADN: Acide désoxyribonucléique ARN: Acide ribonucléique A: Adénine T: Thymine G: Guanine C: Cytosine Ala: Alanine Arg: Arginine Asn Asparagi.ne Asp: Aspartate Cys: Cystéine Gln: Glutamine Glu: Glutamate Gly: Glycine His: Histidine Ile: Isoleucine Leu: Leucine Lys: Lysine Met: Méthionine Phe: Phénylalanine Pro: Proline Ser: Sérine Thr: Thréonine Trp: Tryptophane Tyr: Tyrosine Val: Valine D'autres caractéristiques de la présente invention

ressortiront au cours de la description suivante des modes

de réalisation qui sont donnés à titre d'exemples pour illustrer l'invention et qui ne sont pas destinés à en

limiter la portée.

2 6 19 1 2 3

EXEMPLES

Exemple 1 [Préparation d'un ADN chromosomique' On a préparé un ADN chromosomique à partir d'une souche de Bacillus sp B-0618 (FERM BP-0750> par la méthode suivante. On a cultivé la souche ave- secousses dans 150 ml d'un milieu de bouillon normal, contenant 0,5% de thiosulfate de sodium, à 37 C, pendant toute une nuit. Le bouillon cultivé a été centrifugé à 3 000 tpm pendant 10 minutes, afin de recueillir les cellules bactériennes, qui ont été mises en suspension dans 5 ml d'une solution contenant 10 de sucrose, 59 nfl de Tris aci'e chlorhydrique (pH Q,0) et 50 m'l d'EDTA. A la suspension, on a ajouté 1 ml de solution de lysozyme (10 mg/ml>, et on a fait incuber le mélange, à 37'G, pendant 15 minutes, en faisant suivre par l'addition de I mi de SDS à 10% <oaécyvisulfeate de sodium>. A la suspension ainsi obtenue, on a ajoute un volume égal d'un solvant mixte de chloroforme et de phénol (1: 1), et on a agité le méliange et on l'a centrifugé à 10 000 tpm pendant 3 minutes, pour séparer l'eau et les couches de solvant. A la couche d'eau séparée, on a ajouté doucement 2 fois son volume d'éthanoi, et on a agité lentement le mélange avec une tige de verre. afin d'amener l'ADN à s'enrouler autour de la tige. L'ADN séparé de cette manière a été dissous dans 10 ml d'une solution contenant mM de Tris acide chlorhydrique (pH 8, 0) et 1 mM d'EDTA (cette solution étant désignée ci-après par l'abréviation "TE")>. Cette solution a été traitée par un volume égal de solvant mixte chloroforme-phénol, et elle a été à nouveau centrifugée pour séparer la couche d'eau. A cette solution, on a encore ajouté 2 fois son volume d'éthanol, et l'ADN a été à nouveau séparé du mélange de la même manière que celle décrite ci-dessus. L'ADN finalement obtenu a été dissous

dans 2 ml de TE.

Exemple 2 [Préparation d'un ADN plasnid pACYC 184' Escherichia coli pMl91 portant intérieurement pACYC 184 [J. Bacteriol., 134, 1141 <1981); ATCC 37033] a été cultivé avec secousses dans 1 litre de milieu BHI (produit par Difco Co.). Lorsque la turbidité du bouillon a atteint D0660 = 1,0, on lui a ajouté de la septinomycine à une concentration finale de 300 ig/ml. Les secousses du bouillon à 37 C ont été poursuivies pendant au moins 16 heures. Après achèvement de la culture avec secousses, le bouillon a été centrifugé à 3 000 tpm pendant 10 minutes pour recueillir les bactéries, à partir desquelles l'ADN de plasmide a été préparé conformément à la méthode au lysozyme-SDS et à la méthode au chlorure de césium-bromure d'éthidium [Maniatis et al, Molecular Cloning. 86 - 94, Cold

Spring Harbor (1982)].

Exemple 3 [Construction du Plasmide pCRi possédant le gène de la Créatinase (CR)1 (1) Deux (2> 1l (environ 0,5 igi ce i'ADN chromosomique de Bacillus sp préparé à l'Exemple 1, 1 pl de tampon de - digestion de Hind III 10 fois concentré [Tris acide chlorhydrique 100 mM (pH 7,5>, MgCl2 70 mM, NaCl 600 mM, mercapto éthanol 70 mM], 1 i1 de Hind III 2-3 t(10 unités/ul; produit par Takara Shuzo Co., Ltd.)>,; et 6 il d'eau ont été mélangés et incubés à 37'C pendant 1 heure en vue d'une digestion. L'ADN de plasmide pACYC 184 (environ 0,3.g) a été digéré de façon séparée à l'aide de Hind III selon une méthode analogue. A celui-ci, on a ajouté 0,6 unité de phosphatase alcaline (produite par Takara Shuzo Co., Ltd.; ci-après désignée par l'abréviation "BAP") et le mélange a été incubé à 65 C pendant 1 heure. Les deux solutions d'ADN ainsi préparées ont été mélangées ensemble, et, à cette solution d'ADN mixte, on a ajouté 0, 1 volume d'acétate de sodium 3M. Ensuite, la solution a été traitée par un volume égal d'un solvant mixte chloroforme-phénol et centrifugé pour séparer la phase aqueuse. A celle-ci on a ajouté une quantité double d'étha-ol, et on a fait précipiter l'ADN par centrifugation et on l'a séché sous vide. L'ADN séché a été dissous dans 89 1l d'eau, et à celuici, 10 il de Tampon Leigation 10 /ois cencentré [Tris acide chlorhydrique 0,5 M (pH 7,6), MgC12 O,1M, dithiothréitol O, 1M, spermidine 10 mM, ATP 10 mM) et 1 gl de ligase d'ADN T4 (175 unités; produit par Takara Shuzo Co., Ltd.) ont été ajoutés et mélangés, et on a laissé reposer le mélange à 4"C pendant toute une nuit. Cette solution d'ADN a été traitée par un mélange chloroforme-phénol, et l'ADN a été précipité par l'éthanol, séché sous vide, et dissous dans 10 l

de TE.

(2> On a cultivé Escherichia col( DH 1 (Stock n ME8569; fourni par National Gene Research Institute; dans 100 ml de milieu BHI (Infusion de Cervelle et de Coeur, produite par Difco Co.), recueilli à la phase de croissance logarithmique par centrifugation (10 000 tpm, 2 minutes, et mis en suspension dans 40 ml d'une solution refroidie par de la glace contenant 30 mM d'acétate de potassium. 100 mM de RbCl, 10 mM de CaCl!, 50 mrM de MnC12, et de la glycérine à 15% (pH 5,8).Après avoir laissé reposer la suspension à O C pendant 5 minutes, celle-ci a été centrifugée pour éliminer le surnageant. Les cellules ont été mises en suspension dans 4 ml d'une solution refroidie par de la glace contenant 10 mM de tampon MOPS (produit par Dotite Co.), 75 mM de CaCl2, 10 mM de RbCl, et de la glycérine à 15% (pH 6,5), et on a laissé la suspension à O C pendant 5 minutes afin d'obtenir des

cellules compétentes.

(3) A 200 l de la suspension de celluies, on a ajouté pl de la solution d'ADN préparée au point.12 ci-dessus. Après avoir laissé reposer le mélange à 0'C pendant 30 minutes, on v a ajoutée 1 ml de milieu BHI, et on l'a maintenu à 37 C pendant 90 minutes. Une fraction aliquote du mélange %0,. ml) a été étalée sur une plaque d'agar BHI, contenant 25 ig/ml de chloramphénicol, et cultivée pendant toute une nuit à 37 C, pour produire un transformant. Ce transformant a été répliqué sur une plaque de milieu de créatinase (composition: - peptone............. 5 g - extrait de viande.... 2 g - extrait de levure.... 5 g - NaCi..............

. 1 g..DTD: - K2HPC4............... 1

- MgS04..,,, 0,5 g - peroxydase........... 500 UI - sarcosine oxydase.... 500 UI _- dianisidine.......... i,1 g - créatine............. 11,5 g agar.................15 g - eau distillée........ 1 litre; pH 7,0J, et il a été cultivé encore pendant toute une

nuit à 37'C.

La périphérie de 3 colonies parmi environ 3 000 transformants a été colorée dans le charbon actif. L'une des trois souches a été nommée Escherichia coli DHI pCR1 (Déposée auprès de l'Institut de Recherche de Fermentation, Agence des Sciences Industrielles et de la Technologie; numéro de dépôt n 9495, FERM P-9495). Cette souche a été cultivée après purification dans un milieu BHI, pendant toute une nuit, à 37'C, afin de déterminer son rendement en créatinase selon la méthode de mesure de l'activité créatinase décrite ci-dessous. Comme résultat, on a trouvé que l'activité créatinase était égale à

0,5 u/ml.

Le plasmide contenu dans la souche Escherichia coli DHI pGR1 a été séparé conformément à la méthode décrite à l'Exemple 2, et le plasmide contenant le gène

de la créatinase et le gène pACYCi 184 a été nommé pCR1.

[Mesure de l'Activité Créatinase] L'activité créatinase a été déterminée par la

méthode suivante dans cette invention.

On a d'abord préparé trois solutions: Première solution: Tampon phosphate 0,2 M (pH 7,5)............. 0,5 mi Solution aqeuse de créatine 50 mM......

... 4,5 ml Seconde solution: Tampon Tris acide chlorhydrique 0,2 M (pH 8,0)................................... 0,5 mi Solution aqueuse d'amino-4 antipyrine 15 mM. 0,5 ml Phénol à 0,2,............................. 0,5 ml Peroxydase (50 u/ml)....................... 0,5 ml Sarcosine oxydase (30 u/ml).................. 1,0 ml Benzène p-chloromercurique 0,5 mi........DTD: ... 2,0 ml L Trosième solution: Benzène p-chloromercurique 0,.5 mN Un demi ml de la première solution a été introduit à la pipette dans un tube à essai et équilibré à 37'C pendant 3 minutes. On lui a ajouté 10 gl d'une solution d'enzyme et on l'a maintenu à 37 C pendant 5 minutes précises. Au mélange, on a ajouté 0,5 ml de la troisième solution puis 0, 5 ml de la seconde solution. Après avoir maintenu ce mélange à 37'C pendant 20 minutes encore, on a aJouté 1,5 ml d'eau distillée et on a mesuré l'absorbance à une longueur d'onde de 500 nm. Une unité de l'enzyme a été..DTD: 2619 1 2 3

définie comme étant la quantité pour produire 1 jpmole de

peroxyde d'hydrogène par minute.

Exemple 4 [Cartographie de pCR1 et Détermination de la Séquence de Bases du Gène de la Créatinase] On a préparé l'ADN de plasrmide pCR1 à partir de la souche Escherichie coli DH1 pCR1 de la même manière que celle décrite pour la préparation de pACYC 184. Une carte de clivage de l'ADN pCR1 a été préparée à l'aide des endonucléases de restriction CIa I, EcoR I, Hind III, Bgl II, Pst I, Sph I (tous produits par Takara Shuzo Co. Ltd. ), et Ban II (produit par Toyobo Co., Ltd. >. Les résultats sont présentés sur la Figure 1. La séquence ce bases de l'ADN contenant le gène de la créatinase a été déterminée selon la méthode Didésoxy à l'aide du pnage Mi3 [Science. 214, 1205 - 1210 (i9i>!. La Figure 2 représente la séquence de bases et la séquence d'acides anne du gène

de la créatinase.

Exemple 5 [Préparation de la créatinasel On a cultivé Escherichia ccli DH! pCRi dans litres de milieu BhI (produit par Difco Go.) sous aérationagitation à 37'C, pendant 16 heures, à i'aide d'un fermenteur vibrant de 30 litres. Les bactéries cultivées ont été recueillies par centrifugation à 5 000 tpm pendant 10 minutes. Le rendement en créatinase obtenu était de 5,0 u/ml. Les bactéries ont été lavées avec 2 litres de sérum physiologique et mises en suspension dans 2 litres de

tampon phosphate 10 mM (pH 7,0).

A la suspension ainsi préparée, on a ajouté 1 mg/ml de chlorure de lysozyme et EDTA-2Na (pour fournir une concentration 2 mM>. Après incubation à 37'C pendant minutes avec agitation, le mélange a été centrifugé à 15 000 tpm pendant 10 minutes et on a recueilli 1,7 litre du surnageant résultant, Au surnageant, on a ajouté lentement 680 g oe

sulfate d'ammonium pour relarguer un précipité de protéines.

Le précipité a été dissous dans 200 ml de tampon phosphate mM (pH 7,0) et ii a été ensuite traité dans une colonne Séphadex 0-25 pour le dessalage. Ensuite, la solution dessalée a été soumise a une chromatographie d'échange d'ions sur DEAE-Cephallose CL-6B, pour recueillir la fraction active. Cette fraction a été dessalée et lyophilisée pour donner 4,08 g d'un produit pulvérulent. Le rendement obtenu était de 42%, l'activité spécifique du

produit étant de 10,3 u/mg.

Cette invention a élucidé la structure du gène de la créatinase provenant de microorganismes producteurs de créatinase appartenant au genre Bacillus et la séquence des acides aminés de la créatinase. De plus, cette invention a fourni un procédé nouveau et efficace pour la préparation de la créatinase utilisant le gène de la créatinase et basé sur

diverses techniques de génie génétique.

Il va de soi que de nombreuses modifications et variantes de la présente invention sont possibles à la lumière des enseignements ci-dessus. TI doit par conséquent être entendu que le domaine de protection ne acit en aucune manière être limité aux modes de réalisation décrits ici d'une manière spécifique, et que l'invention peut être mise en oeuvre autrement que dans ces modes de réalisation

spécifiquement décrits..

Claims (12)

REVENDICATIONS'

1 - Acide polydésoxyribonucléique, caractérisé par le fait qu'il a une séquence de bases codant pour une séquence d'acides aminés d'un polypeptiae qui est une créatinase provenant d'un microorganisme producteur de créatinase appartenant au genre Bacilus, ou d'un

polypeptida ayant ladite créatinase-comme constituant.

2 - Acide polydésoxyribonucléique selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il a une séquence de-bases codant pour une séquence d'acides aminés d'un polypeptide qui est une créatinase, ou d'un polypeptide ayant ladite créatinase comme constituant, ladite séquence d'acides aminés, partant de l'extrémité N terminale, étant représentée par la formule: i5 A -Gln Gln lie Thr Asp Leu Glu Arg Thr Lys Ile Leu Gln Asn Gly GI.y Glu Lys Val Lys Pro Thr Phe Ser Lys Glu Glu Met Thr Arg Arg Asn Thr Arg Leu Arg Glu Tyr Met Ala Lys Ala Gly Ile Asp Ala Val Met Phe Thr Ser Tyr Ris Asn Ile Asn Tyr Tyr Ser 2 5 Asp Phe Leu Tyr Thr Ser Phe Asn Arg Ser Tyr Ala Leu Val Val Thr Gln Asp Lys Ris Val Thr Val Ser Ala Asn lle Asp Ala Gly Met Pro Trp Arg Arg Ser Phe Asp Glu Asa Ile Val Tyr Thr Asp Trp Lys Ars Asp Asn Phe Leu Tyr Ala Val Lys Lys Val Leu Asn Glu Gly Gly Phe Ser Ser Gly Arg Leu Gly Val Glu Asn Asp Ris Met Thr Leu Asp Leu Arg Arg Gln Val Gln Asp Ala Leu Pro Asn Thr Glu Leu Val Asp Val Ser Gln Ala Val Met Gly Ris Arg Met Phe Lys Ser Asp Glu Glu Ile Asp Leu Ile Lys Asn Gly Ala Arg lie Ala Asp Ile Gly Gly Ala Ala Val Val Glu Ala Ile Arg Glu Gly Val Pro Glu Tyr Glu Val Ala Leu Bis Gly Thr Glu Ala Met Val Arg Glu lie Ala Arg Thr Tyr Pro His Ala Glu Leu Arg Asp Thr Trp Ile Trp Phe Gln Ser Gly lie Asn- Thr Asp Gly Ala Bis Asn Trp Ala Thr Ser Arg Lys Leu Gin Arg Gly Asp Ile Leu Ser Leu Asn Cys Phe Pro Met Ile Ala Gly Tyr Tyr Thr Ala Leu Glu Arg Thr Leu Phe Leu Glu Glu Val Ser Asp Arg Ris Leu Glu Leu Trp Glu Ile Asn Cys Lys Val Ris Arg Arg GIy Leu Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Arg Cys Met Asp Ile Ala Ala Glu Leu Asn Glu Ile Tyr Arg Glu Ris Asp Leu Leu Ala Asn Ar Thr Phe Gly Tyr Asp Leu Leu Ala Ans Arg Thr Phie Gly Tyr Gly His Ser Phe Gly Val Leu Ser Ris Tyr Tyr Gly Arg Glu Ala Gly Leu Glu Leu Arg Glu Asp Ile Glu Thr Val Leu Glu Pro Gly Met Val Val Ser Met Glu Pro Met Ile Met lie Pro Glu Gly Glu Pro Gly Ala Gly Gly Tyr Arg Glu His Asp Ile Leu Val Ile Ser Glu Asn Gly Thr Glu Asn le Thr Lys Phe Pro Phe Gly Pro Glu Ris Asn Ile Ile Lys Lys - B o - A reDrésente un reste d'acide aminé ou un atome d'hydrogène; et

- B représente un reste d'acide aminé ou -OH.

3 - Acide polycésoxyribonucléique selon la revendication 1. caractérisé par le fait qu'il a une séquence de bases coaant pour une séquence c'acides aminés d'un polypeptide qui est une créatinase, ou d'un polypeptide ayant ladite crétinase comme constituant, ladite séquence de bases, partant de l'extrémité 5' terminale, étant représentée par la formule:

X - CAA CAA ATC ACA GAT CTT GAA AGA ACA

AAG ATT TTA CAA AAC GGC GGG GAG AAA GTA

AAG CCC ACT TTT TCA AAA GAG GAA ATG ACA

CGC CGC AAT ACC CGT TTA CGC GAG TAT ATG

GCG AAG GCC GGA ATC GAT GCT GTT ATG TTC

ACT TCT TAC CAT AAT ATC AAC TAT TAC AGC

GAC TTT TTA TAT ACA TCA TTC AAC AGA TCG

TAT GCG CTC GTC GTC ACT CAG GAC AAG CAT

GTG ACT GTA AGC GCA AAC ATT GAT GCC GGC

ATG CCG TGG AGA CGC AGC TTT GAC GAG AAT

ATT GTT TAC ACA GAC TGG AAA AGA GAC AAC

TTT CTT TAT GCC GTG AAA AAG GTA TTA AAT

GAG GGA GGC TTC TCC AGC GGC CGT CTC GGT

GTA GAA AAT GAT CAT ATG ACG CTG GAT TTA

CGG CGC CAA GTG CAG GAT GCC CTG CCA AAC

ACA GAG CTT GTG GAC GTT TCC CAG GCG GTG

ATG GGG CAT CGG ATG TTT AAG TCT GAC GAG

GAA ATT GAT TTG ATT AAA AAT GGA GCC CGT

ATT GCA GAT ATC GGC GGA GCG GCC GTT GTC

GAA GCG ATT CGC GAA GGC GTA CCG GAA TAC

GAA GTG GCG CTG CAT GGG ACA GAA GCA ATG

GTA CGC GAA ATT GCC CGT ACG TAC CCG CAC

GCT GAA CTT CGG GAC ACG TGG ATT TGG TTT

CAA TCC GGC ATT AAT ACG GAC GGC GCT CAC

AAC TGG GCG ACT TCC CGC AAG CTG CAG CGA

GGA GAT ATT TTG AGC CTA AAC TGC TTC CCG

ATG ATC GCT GGT TAC TAT ACG GCA CTT GAG

CGC ACG TTG TTC TTG GAA GAA GTG TCT GAC

CGC CAT CTT GAA CTG TGG GAA ATC AAC TGT

AAA GTG CAT AGA CGC GGC CTT GAA CTG ATC

AAG CCA GGG GCT AGA TGT ATG GAT ATC GCC

GCT GAA TTA AAT GAG ATC TAC CGC GAG CAC

GAC TTG TTG GCG AAC CGG ACG TTC GGT TAC

GGA CAC TCA TTC GGC GTA CTG AGC CAC TAT

TAC GGA CGT GAG GCT GGA CTG GAG CTG CGG

GAA GAT ATC GAA ACA GTG TTG GAG CCG GGC

2O

ATG GTT GTG TCC ATG GAA CCA ATG ATC ATG

ATT CCA GAG GGA GAG CCG GGA GCG GGC GGT

TAC CGT GAG CAC GAC ATC CTC GTT ATT AGC

GAG AAC GGG ACA GAG AAT ATC ACT AAG TTC

CCA TTC GGT CCG GAG CAT AAC ATT ATT AAA

AAG - Y

o - X représente un codon autre que TAA, TAG ou TGA, ou un atome d'hydrogène; et

- Y représente un codon ou un atome d'hydrogène.

4 - Transformant, caractérisé par le fait qu'il comprend un microorganisme hôte portant un acide polydésoxyribonucléique étranger par rapport audit hôte et ayant une séquence de bases codant pour une séquence d'acides aminés d'un polypeptide comprenant une créatinase provenant d'un microorganisme producteur de créatinase appartenant au genre Bacillus, ou d'un polypeptide ayant:

ladite créatinase comme constituant.

- Transformant selon la revendication 4, caractérisé par le fait que le microorganisme hôte a une séquence de bases codant pour une séquence d'acides aminés d'un polypeptide qui est une créatinase, ou d'un polypeptide ayant ladite créatinase comme constituant, ladite séquence d'acides aminés, partant de l'extrémité N terminale, étant représentée par la formule: A-Gln Gln Ile Thr Asp Leu Glu Arg Thr Lys Ile Leu Gin Asn Gly Gly Glu Lys Val <i Lys Pro Thr Phe Ser Lys Glu Glu Met Thr Arg Arg Asn Thr Arg Leu Arg Glu Tyr Met Ala Lys Ala Gly Ile Asp Ala Val Met Phe _^ Thr Ser Tyr His Asn lie Asn Tyr Tyr Ser Asp Phe Leu Tyr Thr Ser Phe Asn Arg Ser Tyr Ala Leu Val Val Thr Gin Asp Lys Ris Val Thr Val Ser Ala Asn Ile Asp Ala Gly Met Pro Trp Arg Arg Ser Phe Asp Glu Asn 34- Ile Val Tyr Thr Asp Trp Lys Arg Asp Asn Phe Leu Tyr Ala Val Lys Lys Val Leu Asn 54% Glu Gly Gly Phe Ser Ser Gly Arg Leu Gly Val. Glu Asa Asp His Met Thr Leu Asp Leu Arg Arg Gln Val Gln Asp Ala Leu Pro Asn io Thr Glu Leu Val Asp Val Ser Gin Ala Val Met Gly lis Arg Met Phe Lys Ser Asp Glu Glu Ile Asp Leu Ile Lys Asn Gly Ala Arg Ile Ala Asp Ile Gly Gly Ala Ala Val Val Glu Ala lie Arg Glu Gly Val Pro Glu Tyr Glu Val Ala Leu His Gly Thr Glu Ala Met Val Arg Glu Ile Ala Arg Thr Tyr Pro Ris Ala Glu Leu Arg Asp Thr Trp Ile Trp Phe GIln Ser Gly Ile Asn Thr Asp Gly Ala His Asn Trp Ala Thr Ser Arg Lys Leu Gin Arg Gly Asp Ile Leu Ser Leu Asn Cys Phe Pro Met Ile Ala Gly Tyr Tyr Thr Ala Leu Glu Arg Thr Leu Phe Leu Glu Glu Val Ser Asp Arg His Leu Glu Leu Trp Glu lie Asn Cys Lys Val Ris Arg Arg Gly Leu Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Arg Cys Met Asp Ile Ala Ala Glu Leu Asn Glu lie Tyr Arg Glu Ris Asp Leu Leu Ala Asn Arg Thr Phe Gly Tyr Gly His Ser Phe Gly Val Leu Ser His Tyr Tyr Gly Arg Glu Ala Gly Leu Glu Leu Arg Glu Asp lie Glu Thr Val Leu Glu Pro Gly Met Val Val Ser Met Glu Pro Met Ile Met Ile Pro Glu Gly Glu Pro Gly Ala Gly Gly Tyr Arg Glu Ris Asp Ile Leu Val Ile Ser Glu Asn Gly Thr Glu Ash Ile Thr Lys Phe Pro Phe Gly Pro Glu His Asn Ile Ile Lys Lys - B o: - A représente un reste d'acide aminé ou un atome d'hydrogène; et

- B représente un reste d'acide aminé ou -COH.

6 - Transformant selon ia revendication 4, caractérisé par ie fait que le microorganisme nôte a une séquence ae bases codant une séquence d'acides aminés d'un polypeptide qui est une créatinase ou d'un polypeptiae ayant ladite créatinase comme constituant, ladite séquence d'acides aminés, partant de l'extrémité 5' terminale, étant représentée par la formule:

X-CAA CAA ATC ACA GAT CTT G-AA AGA ACA

AAG ATT TTA CAA AAC GGC GGG GAG AAA GTA

AAG CCC ACT TTT TCA AAA GAG GAA ATG ACA

Ili D51 liV D1 DOYV 3VS 953 113 VVYS 135 DV3 sDo DVl DOYV 153 3Dos IV VV 3S3 VlD 51V VDs VV9S VV 599 IV3 D3 I3I 9DsS VVs DVi VVD 533 VIS Des VVM 3D5 l1V Dos VVY D315 Is 33S 39 DoS S DD IV IVyS VYOD IV 1D3 0D VMS IVV VVV SIV 91i lYD IIV VVs

sVS 3VD 131 9VV Ili 51V 953 iV3 9D DIV --

9S DS 5V3 3i1 1i 3VD5 DZs 113 SYVD VDV

DVV VM3 913 3D9 IVD 5V3 515 VV3 D3D 553

Vil IVs 513 DoV D1V iV3 IVs IVV VVO VI (

1559 D13 153 OD9 DV Do1 DIl D99 Vs 9S9-

VV VIl VI sVV VVV M99 3509 IVI 113 111 OVV OVs V5V VVV DU1 DV9 VoV DVI 115 IIV

IVV DVS VD III DV D53 VOV 551 D533 51DV

359 039 IV9 IIV DVV VOD D3V VIS I3YV 19

iV3 9VV DYV9 DV I3V 31 319 313 939 IVI 931 VYV YVV Di1 Vo1 V3V IVI VIl Ii DVYD 3SV oVï IVI DVV DIV lVy iV3 DVI 131 I3V D11 9iV 115 12 IV9 DIV V95 D339 DVV 935 91V IVI MVS 3D3 Vil 93 3V VV 3093 3D3

úZL6L9Z

CAA TCC GGC ATT AAT ACG GAC GGC GCT CAC

AAC TGG GCG ACT TCC CGC AAG CTG CAG CGA

GGA GAT ATT TTG AGC CTA AAC TGC TTC CCG

ATG ATC GCT GGT TAC TAT ACG GCA CTT GAG

CGC ACG TTG TTC TTG GAA GAA GTG TCT GAC

o10 CGC CAT CTT GAA CTG TGG GAA ATC AAC TGT

AAA GTG CAT AGA CGC GGC CTT GAA CTG ATC

AAG CCA GGG GCT AGA TGT ATG GAT ATC GCC

GCT GAA TTA AAT GAG ATC TAC CGC GAG CAC

GAC TTG TTG GCG AAC CGG ACG TTC GGT TAC

GGA CAC TCA TTC GGC GTA CTG AGC CAC TAT

TAC GGA CGT GAG GCT GGA CTG GAG CTG CGG

-'-J

GAA GAT ATC GAA ACA GTG TTG GAG CCG GGC

ATG GTT GTG TCC ATG GAA CCA ATG ATC ATG

ATT CCA GAG GGA GAG CCG GGA GCG GGC GGT

TAC CGT GAG CAC GAC ATC CTC GTT ATT AGC

GAG AAC GGG ACA GAG AAT ATC ACT AAG TTC

CCA TTC GGT CCG GAG CAT AAC ATT ATT AAA

3O o

AAG --

oQ : - X représente un codon autre que TAA,- TAG ou TGA, ou un atome d'hydrogène; et

3 - Y représente un codon ou un atome d'hydrogène.

2 6 1 9 123

7 - Transformant selon la revendication 4, caractérisé par le fait que le microorganisme hOte est un

microorganisme appartenant au genre Escherichia.

8 - Transformant selon la revendication 7, caractérisé par le fait que le microorganisme hôte appartenant au genre Escherichia est un microorganisme

appartenant & l'espèce Escherichiae coli.

9 - Polypeptide qui est une créatinase ayant une séquence d'acides aminés qui. en partant de l'extrémité N terminale, est représentée par la formule suivante, ou polypeptide ayant une telle créatinase comme constituant: A-Gin Gin lie Thr Asp Leu Glu Arg Thr Lys lie Leu Gin Asn Gly Gly Glu Lys Val Lys Pro Thr Phe Ser Lys Glu Glu Met Thr Arg Arg Asn Thr Arg Leu Arg Glu Tyr Met Ala Lys Ala Gly lie Asp Ala Val Met Phe Thr Ser Tyr His Asn-Ile Asn Tyr Tyr Ser Asp Phe Leu Tyr Thr Ser Phe Asn Arg Ser Tyr Ala Leu Val Val Thr Gin Asp Lys Bis Val Thr Val Ser Ala Asn Ile Asp Ala Gly Met Pro Trp Arg Arg Ser Phe Asp Glu Asn Ile Val Tyr Thr Asp Trp Lys Arg Asp Asn Phe Leu Tyr Ala Val Lys Lys Val Leu Asn Glu Gly Gly Phe Ser Ser Gly Arg Leu Gly Val Glu Asn Asp Ris Net Thr Leu Asp Leu Ars Arg Gln Val Gin Asp Ala Leu Pro Asn Thr Glu Leu Val Asp Val Ser Gin Ala Val Met Gly Lis Arg Met Phe Lys Ser Asp Glu Glu Ile Asp Leu Ile Lys Asn Gly Ala Arg Ile Ala Asp Ile Gly Gly Ala Ala Val Val Glu Ala Ile Arg Glu Gly Val Pro Glu Tyr Glu Val Ala Leu His Gly Thr Glu Ala Met Val Arg Glu Ile Ala Arg Thr Tyr Pro His Ala Glu Leu Arg Asp Thr Trp Ile Trp Phe Gln Ser Gly Ile Asn Thr Asp Gly Ala Bis Asn Trp Ala Thr Ser Arg Lys Leu Gln Arg Gly Asp Ile Leu Ser Leu Asn Cys Phe Pro Met Ile Ala Gly Tyr Tyr Thr Ala Leu Glu Arg Thr Leu Phe Leu Glu Glu Val Ser Asp Arg His Leu Glu Leu Trp Glu lie Asn Cys Lys Val His Arg Arg Gly Leu Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Arg Cys Met Asp Ile Ala Ala Glu Leu Asn Glu Ile Tyr Arg Glu Bis Asp Leu Leu Ala Asn Arg Thr Phe Gly Tyr Gly Ris Ser Phe Gly Val Leu Ser His Tyr Tyr Gly Arg Glu Ala Gly Leu Glu Leu Arg Glu Asp Ile Glu Thr Val Leu Glu Pro Gly Met Val Val Ser Met Glu Pro Met Ile Met Ile.Pro Glu Gly Glu Pro Gly Ala Gly Gly Tyr Arg Glu His Asp Ile Leu Val Ile Ser Glu Asn Gly Thr Glu Asn Ile Thr Lys Phe Pro Phe Gly Pro Glu Bis Asa I'le lie Lys Lys - B o - A représente un reste d'acide aminé, un groupe acétyle, ou un atome d'hydrogène;et

- B représente un reste d'acide aminé, -OH ou NH2.

- Procédé de préparation de la créatinase, caractérisé par le fait qu'il comprend: - l'insertiond" 'aid polydésoxyribonuciéiaue qui est un gène de la créatinase, provenant d'un microorganisme producteur de créatinase appartenant au genre Bacillus, ou d'un acide polydésoxyribonucléique possédant ledit gène de la créatinase comme constituant, dans un vecteur d'expression, afin d'obtenir un ADN recombinant; - la production d'un transfnat par introduction dudit ADN recombinant dans un microorganisme hôte, et la culture dudit transformant, pour amener le transformant à manifester l'information génétique dudit acide polydésoxyribonucléique; et - la collecte du polypeptide de ladite créatinase ou du

polypeptide ayant ladite créatinase comme constituant.

11 - Procédé selon la revendication 10, caractérisé par le fait que l'acide poiydésoxyribonucléique qui est un gène de ia créatinase provenant d'un microorganisme producteur de créatinase appartenant au genre Bacillus, ou que l'acide polydésoxyribonucléique présentant ledit gène de la créatinase comme constituant est un acide polydésoxyribonucléique ayant une séquence de bases codant pour une séquence d'acides aminés d'un polypeptide qui est une créatinase, ou d'un polypeptide ayant ladite créatinase comme constituant, ladite séquence d'acides aminés, partant de l'extrémité N terminale, étant représentée par la formule suivante: A-Gln Gin Ile Thr Asp Leu Glu Arg Thr Lys lie Leu Gin Asn Gly Gly Glu Lys Val Lys Pro Thr Phe Ser Lys Glu Glu Met Thr Arg Arg Asn Thr Arg Leu Arg Glu Tyr Met Ala Lys Ala Gly Ile Asp Ala Val Met Phe Thr Ser Tyr Ris Asn Ile Asn Tyr Tyr Ser Asp Phe Leu Tyr Thr Ser Phe Asn Arg Ser Tyr Ala Leu Val Val Thr Gln Asp Lys Ris Val Thr Val Ser Ala Asn Ile Asp Ala Gly Met Pro Trp Arg Arg Ser Phe Asp Glu Asn Ile Val Tyr Thr Asp Trp Lys Arg Asp Asn Phe Leu Tyr Ala Val Lys Lys Val Leu Asn Glu Gly Gly Phe Ser Ser Gly Arg Leu Gly Val Glu Asn Asp Ris Met Thr Leu Asp Leu Arg Arg Gin Val Gln Asp Ala Leu Pro Asn Thr Glu Leu Val Asp Val Ser Gln Ala Val Met Gly His Arg Met Phe Lys Ser Asp Glu o10 Glu Ile Asp Leu Ile Lys Asn Gly Ala Arg le Ala Asp Ile Gly Gly Ala Ala Val Val Glu Ala Ile Arg Glu Gly Val Pro Glu Tyr Glu Val Ala Leu His Gly Thr Glu Ala Met Val Arg Glu-Ile Ala Arg Thr Tyr Pro Lis Ala Glu Leu Arg Asp Thr Trp Ile Trp Phe GIln Ser Gly Ile Asn Thr Asp Gly Ala His Asn Trp Ala Thr Ser Arg Lys Leu Gln Arg Gly Asp lie Leu Ser Leu Asn Cys Phe Pro Met Ile Ala Gly Tyr Tyr Thr Ala Leu Glu Arg Thr Leu Phe Leu Glu Glu Val Ser Asp Arg His Leu Glu Leu Trp Glu Ile Asn-Cys Lys Val His Arg Arg Gly Leu Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Arg Cys Met Asp Ile Ala Ala Glu Leu Asn Glu Ile Tyr Arg Glu His Asp Leu Leu Ala Asn Arg Thr Phe Gly Tyr Gly is Ser Pe Gly Va Leu Ser Ris Tyr

Gly His Ser Phe Gly Val Leu Ser Ris Tyr-

Tyr Gly Arg Glu Ala Gly Leu Glu Leu Arg Glu Asp lie Glu Thr Val Leu Glu Pro Gly Met Val Val Ser Met Glu Pro Met Ile Met Ile Pro Glu Gly Glu Pro Gly Ala Gly Gly Tyr Arg Glu Ris Asp lie Leu Val Ile Ser Glu Asn Gly Thr Glu Asn Ile Thr Lys Phe Pro Phe Gly Pro Glu Bis Asn Ile lie Lys Lys - B o: - A représente un reste d'acide aminé ou un atome d'hydrogène; et

- B représente un reste d'acide aminé ou -OH.

12 - Procédé selon la revendication 10, caractérisé par le fait que le microorganisme hôte est un

microorganisme appartenant au genre Escherichia.

13 - Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que le microorganisme hôte appartenant au genre Escherichia est un microorganisme

appartenant à l'espèce Escherichia coli.