JPS60244286A - 蓚酸オキシダ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、蓚酸オキシダーゼの製造法に関する。

従来、蓚酸オキシダーゼとしては、例えば、カビ（ｍｏ
ｌｄ）（ジェイ、ホウゲット　アンドエイ。

メイヤー（Ｊ、Ｈｏｕｇｅｔ　ａｎｄ　Ａ、Ｍａｙｅｒ
　）、　：！　７プト。

レンド、　（Ｃｏｍｐｔ、Ｒｅｎｄ、）　、　／　（Ｓ
’　ｊ　、　３　ｏ４ＬＪｊ（／り２７年）、ワイ、ス
ズキアンドジェイ、ディー、ミー　ス−（ｙ、　５ｕｚ
ｕｋｉ　ａｎｄ　Ｊ、１１．Ｍｅｅｓｕｅ　）　、プラ
ントセル　フィシオル、（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ、）　、乙。

２ｌ頁（／り乙ｊ年）〕、大麦苗〔ジェイ、チリポガ（
Ｊ、Ｃｈｉｒｉｂｏｇａ　）　、　７チ、バイオケム、
ハイオフイズ、　（Ａｒｃｈ、ＢｉｏＣｈｅｍ、　Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ、）、　／　／乙。

６１７、頁（／りｚ６年）〕、ホウレンソウビート〔エ
イ、イー、リークアンド　ブイ、ニス、バット（Ａ、Ｅ
、Ｌｅｅｋ　ａｎｄ　Ｖ、Ｓ、　Ｂｕｔｔ）　、　ブロ
ク、バイオケム、ジエイ、（Ｐｒｏｃ、　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、　Ｊ、）　、　／　、ＩＩ　。

！ｒ７頁（／’１７３年）〕、カビ（ｆｕｎｇｉ）（イ
ー　、　ヒー。

バイセイ　アンド　ブイ、エイチ、チェルデリン（Ｅ。

Ｂ、　Ｖａｉｓｅｙ　ａｎｄ　Ｖ　、　Ｈ、Ｃｈｅｌｄ
ｅｌｉｎｅ　）　、　７チ、バイオケム、バイオフイズ
、（Ａｒｃｈ、ＢｉＯＣｈｅｍ　、　Ｂｉｏ　−ｐｈｙ
ｓ　、　、りｔ、ｇｇ頁（１５ｉ’ｇ／年）〕等由来の
ものが知られているに過ぎない。

そこで本発明者等は、上記とは別に、広く自然界より蓚
酸オキシダーゼを生産し得る微生物の検索を行った結果
、土壌中よシ新たに分離したシュードモナス（Ｐｅｅｕ
ｄｏｍｏｎ、ａｓ）属に属する／菌株が、該酵素を菌体
内に効率よく生産すること等の知見を得、本発明を完成
した。

すなわち、本発明は、シュードモナス属に属し、蓚酸オ
キシダーゼ生産能を有する微生物を培地に培養し、−培
養物よシ該酵素を採取することを特徴とする蓚酸オキシ
ダーゼの製造法である。

以下、本発明を具体的に説明する。

先ず、本発明に使用する菌としては、シュードモナス（
Ｐｓθｕａｏｍｏｎａｓ　）属に属し、蓚酸オキシダー
ゼを生産する微生物であれば、如何なる菌でも良く、ま
た、これらの菌の変種もｐ〈は変異株でも良い。

そして、その微生物の具体例としては、シュードモナス
、マルトフイリア（Ｐｓｅｕｄｏｎｎｏｎａｓ　ｍａｌ
ｔｏ−ｐｈｉｌｉａ）　ＯＸ　−ｊ　４１等が挙げられ
る。

上記シュードモナス・マルトフィリアｏｘ−！ｒ≠は、
土壌中より新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質
は、以下に示すとおシである。

シュードモナス・マルトフイリアｏｘ　、５−弘の菌学
的性質 （ａ）形態顕微鏡的観察（肉汁寒天斜面培地で３０℃、
／６時間培養） ■細胞の形及び大きさニー ０．５μｍ）＜７〜２μｍの短桿菌である。

■細胞の多形性の有無；認められない。

■運動性の有無二／〜′数本の極鞭毛を有し、運動性を
有する。

■胞子の有無：形成せず。

■ダラム染色性：陰性。

■抗酸性：陰性。

（ｂ）各培地における生育状態 ■肉汁寒天平板培養：温度３０℃、≠ｇ待時間静置培養
により、黄色のコロニー。拡散性色素は生産しない。

■肉汁寒天斜面培養：■肉汁寒天平板培養の記載に同じ
。

■肉汁液体培養：生育良好。

■肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチンは、液化されない。

■リドマスミルク：変化は、認められない。

（Ｃ）生理的性質 ■硝酸塩の還元：還元しない。

■脱窒反応：陰性。

■ＭＲテスト：陰性。

■ｖｐテスト：陰性。

■インドールの生成：陰性。

■硫化水素の生成：陰性。

■デンプンの加水分解：陰性。

■クエン酸の利用：クリステンセン（Ｃｈｒｉｓ　−ｔ
ｅｎｅｅｎ）培地では、利用するが、コーザー（Ｋｏｓ
θｒ）培地では、生育不良のため利用性は、不明である
。

■無機窒素の利用：アンモニア及び硝酸塩は、共に僅か
に利用する。

［相］色素の生成：陰性。

■ウレアーゼ：陰性。

■オキシダーゼ：陰性。

０カタラーゼ：陽性。“ ■生育の範囲： 至適温度：、２０〜３７℃ 至適ｐＨ：ｊ〜り ［相］酸素に対する態度：好気性。

［株］Ｏ−Ｆテスト：酸化性。

Ｏ糖類から酸及びガスの生成 酸の生成ガスの生成 （ＩＩＬ−アラビノース　＋　− （２）Ｄ−キシロース　＋　− （３）Ｄ−グルコース　十　− （４）　Ｄ−マンノース　十　− （５）Ｄ−フラクトース　十　− （６）Ｄ−ガラクトース　＋　− （７）麦芽糖　十　− （８）シ　ヨ　糖　十　− （９）乳　糖　−− （１０）トレハロース　＋　− （１１）Ｄ−ソルビット　−　− （１２Ｄ−マンニット　＋　− （１３１イノジツト　−　− α４グリセリン　十　− （１９デンプン　−− （ｄ）その他の性質 ■リパーゼ：陰性。

■栄養要求性：メチオニン。

上記シュードモナス・マルトフィリアｏｘ−ｊｌｌの菌
類学的諸性質をパージエイズ・マニュアル・オプ・デイ
ターミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’
ｓ　Ｍａｎｕａｌ　Ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ
　Ｂａｃｔｅｒｉｏ　−１ｏｇｙ　）第ｒ版（／り７≠
年）記載の分類と対比すると、本菌は、ダラム染色が陰
性、好気性の無胞子桿菌で鞭毛を有して運動性があシ、
かつカタラーゼ陽性等であることよシ、シュードモナス
属に属するものと認められ、また、コロニーが黄色に着
色すること、生育因子としてメチオニンを要求すること
及びオキシダーゼ陰性等であることよりシュードモナス
・マルトフイリイアに属するものと分類された。

しかしながら、その分離源及びゼラチンの氷解能等にお
いて、従来のシュードモナス・マルトフイラに属する菌
株とは異なシ、シュードモナス・マルトフイラに属する
新菌株であると判断され、本新菌株を、シュードモナス
・マルトフイリアＯＸ−よ≠と命名した。

なお、上記シュードモナス・マルトフイリアＯｘ−よ≠
は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第７
６Ｏ１号（°ＦＥＲＭ　Ｐ−７ｔＯ／）として寄託され
ている。

次に、本発明に於ける蓚酸オキシダーゼ生産に使用され
る培地としては、窒素源、炭素源、無機物、ビタミン等
よシ選択されたものを適量含有する培地であれば、合成
もしくは天然培地等如何なるものでも使用可能である。

上記窒素源としては、例えば、酵母エキス、ペプトン、
肉エキス、大豆、アミノ酸、硫酸アンモニウム、硝酸カ
リウム等のものが挙げられ、炭素源としては、例えば、
グルコース、ショ糖、キシロース等の糖質、蓚酸等の有
機酸等が挙げられる。

また、無機物としては、例えば、リン酸カリウム、リン
酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄、塩化ナ
トリウム等が用いられる。

本発明に用いられる菌の培養は、固体培養法でもよいが
、通常液体培養法を採用するのが有利であシ、具体的に
は、振盪培養、攪拌培養、通気培養等により好気的に培
養を行なう。

培養温度は、例えば、通常、２タル３６℃、好ましくは
３０℃で、培養時のｐＨは！−♂、好ましくはｐＨよ！
である。

このような培養条件下に、培養時間は、培養形態によっ
ても異なるが、例えば、２≠〜り乙時間程度培養するこ
とにより培養物中に本酵素が生成蓄積する。

培養終了後、培養物よシ蓚酸オキシダーゼを採取するに
は、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。

しかし、本酵素は、菌体内に存在する酵素であるため、
培養終了後培養物に例えば、トリトンＸ−７００等の界
面活性剤もしくはトルエン等を添加し、例えば、２≠時
間程度振盪もしくは放置し、自己消化を行なわせること
により蓚酸オキシダーゼを菌体外に排出させることが出
来る。

また、培養物よシ、例えば、濾過遠心分離等の操作によ
シ菌体を分離したのち、菌体より本酵素を採取するのが
好ましく、−この場合、菌体をそのま＼用いることもで
きるが、超音波破壊機、フレンチプレス、ダイノミル等
の種々の破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチ
ームの如き細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解す
る方法、摩耗剤を用いて菌体をすりつぶす方法あるいは
浸透圧ショックを適用する方法を用いる。

このようにして上記菌体もしくはこれを破壊したもの、
あるいは細胞壁を溶解したものより、例えば、濾過、遠
心分離等の適当な処理操作によシ固形物を除去して菌体
抽出液を得るか、又は水、緩衝液もしくは適当な溶剤で
抽出し、これをそのま＼粗酵素として得るか、あるいは
また該抽出液に必要によシプロタミン硫酸、ポリエチレ
ンイミン等を添加して除核酸を行なうか、更に凍結乾燥
法、アルコール沈澱法、アセトン沈澱法等を適宜選択し
て実施す、ることによシ粗酵素粉末を得る。

上記粗酵素液もしくは粗酵素粉末よシ更に精製酵素標品
を得るには、例えば、セファデックスＧ−２００等を用
いるゲル濾過法、イオン交換体、ハイドロキシアパタイ
ト等を用いる吸着溶出法、ショ糖密度勾配遠心法等の沈
降法、アフイニテイクロマト法、分子ふるい膜もしくは
中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、組み合わせ
て実施することにより、精製された本酵素標品を得るこ
とができる。

また、長時間の培養を行って自己消化させた場合の培養
濾液についても、同様に処理することによシ本酵素を得
ることが出来る。

以上の如くして得られた本酵素の理化学的性質を示すと
、以下のとおりである。

（１）作　用 酸素の存在下で、蓚酸を酸化し、２分子の二酸化炭素と
７分子の過酸化水素を生成する。

本酵素 ↓ （Ｃ００Ｈ）２＋　０２　→２　ＣＯ２４−Ｈｚ　０２
（２）基質特異性 蓚酸に対しては、基質特異性が極めて高く、”またグリ
オキシル酸に僅かに作用する。

（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ 第１図に示すとお９．、’Ｑ、／Ｍクエン酸緩衝液中で
の至適ｐＨは、蓚酸ではよ０であった。

また、安定ｐＨの範囲は、４’ｌ−〜７であった。

なお、該範囲は、各ｐＨ・の緩衝液（ｐＨ２，０〜ｂ、
。

では、０．／’Ｍクエン酸緩衝液、また、ｐＨ６，θ〜
９．５においては、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液を夫
々使用。）中、温度２ｊ℃で２日間保存したのち酵素活
性を測定してめたものである。

（４）力価の測定法 Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨｊ：Ｏ）　０．３ｒｔｔ
ｌ、Ｍ蓚酸カリウムｏ、ｉ罰、ｏ、ｏｏｚｃｓのｔ−ア
ミノアンチピリン、０．０２％のフェノール又はＮ、Ｎ
−ジメチルアニリン、パーオキシダーゼ≠単位及び本酵
素液！Ｏμｔ（適当量に希釈もしくは濃縮する。）を添
加し総量を３−としたものを、温度３７℃で２０分間反
応させたのち、生成する色素の可視部吸収（ｊＪ−［ｎ
ｍ）を測定し、予め測定した既知過酸化水素量の吸光度
値よシ過酸化水素の生成量を算出し、酵素単位を得た。

その他酸素電極を用いて酸素の吸収を測定する方法も必
要によシ使用した。

なお、酵素活性／単位は、温度３７℃で７分間に／マイ
クロモルの過酸化水素を生成する酵素量である。

（５）作用適温の範囲 第２図に示すとおシ、作用適温の範囲は、３！〜ｊＯ℃
であシ、該温度範囲は、各温度の蓚酸を基質とした反応
液に本酵素を添加し、１０分間作用させた際の酵素活性
を測定してめたものである。

（６）　１）　Ｈ、温度などによる失活の条件第３図に
示すとおり、温度乙Ｏ℃から失活していき、温度７０℃
ではほとんど失活する。

なお、該条件は、各温度の０．　／　Ｍ　リン酸カリウ
ム緩衝液ＣｐＨ７０）中において、本酵素を７０分間処
理した際の残存する酵素活性を測定してめた嘱のである
。

’ｐａｌＡｓよシ酸性側では失活し、一方、ｐＨ’７０
よジアルカリ性側でも失活する。

（７）阻害、活性化及び安定化 夫々／ｍＭのＨｇ　、Ｐｂ　１ＣＨａＣＯＯ−及びＣ１
−の含有溶液Ｃ０，０！；Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ左Ｏ
）中温度３０℃で／θ分間反応したのちの酵素活性は、
無処理を／　０．０としたとき夫々り、２３．２り及び
≠／であった。

（８）精製方法 本酵素の分離、精製は、常法によシ行なうことができ、
例えば、硫安による分画沈澱、ＤＥＡＦｉ−セルロース
による吸着溶出、バイオゲルＡ　−ＱＪｍによるゲル濾
過等の精製手段を適宜組み合わせて用いることができる
。

（９）分子量 ０．７％ＳＤＳを含有する！チポリアクリルアミド電気
泳動によシ測定した結果、３７０００であった。

（ＸＯ）アクリルアミドディスクゲル電気泳動第４図に
示すとおシ、ポアサイズ７ｊ％のアクリルアミドゲル（
ｐＩ！４ｔ）を用いて常法によジアクリルアミドディス
クゲル電気泳動を行なった結果、単一なバンドであるこ
とが確認された。

Ｕυ等電点 ディスクゲル焦点電気泳動法にょシ測定した結果、ｌＡ
７であった。

以上の如く本発明によれば、従来シュードモナス属の細
菌としては、生産することが未公知で、かつまた、従来
蓚酸オキシダーゼの存在の知られているカビ、大麦苗等
に比較して、極めて短時間のうちに効率よく本酵素を得
ることが出来るので、本発明は、産業上極めて有意義で
ある。

そしてまた、本酵素は、体液、飲食物等蓚酸含有物中の
蓚酸の定量用酵素として極めて有用なものである。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。

実施例 リン酸／カリウム０．　／％、リン酸２カリウム０．／
チ、硫酸マグネシウム０．２／％、硫酸第１鉄０．００
　／チ、酵母エキス／チ及びシヨ糖／チを夫々含有する
溶液１０ｍ１（ｐＨｊ：ｊ）を三角フラスコ（容量：／
　ｊ　０ｒｔｔｌ　）に分注したのち、これを、常法に
よ多温度／２０℃で５分間加熱滅菌して培地を得、該培
地にシュードモナス・マルトフイリア○Ｘ−Ｊ−≠（Ｆ
ＫＲＭＰ−７乙Ｏ／）を接種し、温度３０℃で２２時間
振盪培養して培養物を得た。

次いで、上記培地組成の他に、更に、蓚酸カリウム０．
２　ｊ　％及びグリシン０．３％を添加した溶液２ｔｆ
ミニジヤーフアーメンタ−（容量：２ｔ）に分注したの
ち、これを常法によ多温度／２θ℃で７０分間加熱滅菌
して培地を得、これに、上述の如くして得た培養物〆Ｏ
ｍｌを接種し、温度３０℃で７２時間回転攪拌培養して
培養物を得た。

このようにして得た培養物に、トリトンｘ−ｉｏ。

（和光紬薬■製）を０．２％となる如く添加したものを
、温度２！℃で２０時、間装置したのち、更にこれに、
１０％ポリエチレンイミン溶液（ｐＨ７Ｏ）ｌｊｒｒｔ
ｌ及び硫酸アンモニウム！≠１添加し、不溶物を濾別し
て粗酵素液を得た。

次いで、該粗酵素液を、０．０／Ｍ’）ン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７０）で３倍に希釈したものを、該リン酸緩衝液（’
ｐＨ’７：Ｏ）で平衡化したーＤＥＡＥ−セルロースカ
ラム（３，ｊ　ｒ、ｍ　Ｘ　３０　ｃｒｎ　）に入れ、
酵素を吸着させたのち、０．０７Ｍリン酸緩衝液ＣｐＨ
７，０）Ｃ０，２ｔＭ硫酸アンモニウム含有。）を使用
して、吸着された酵素を溶出し、活性画分を得た。

そして、該活性画分を、硫酸アンモニウム！θ〜ｚＯ％
飽和で分画し、０．０／Ｍ’）ン酸緩衝液（ｐＨ７０’
）を用いて３倍に希釈した液を、０．０／）Ａ’）ン酸
緩衝液（１）Ｈ７（１））で平衡化したＤＥＡＥ−セフ
ァロースＣＬ、、４Ｂカラムに通し、酵素を吸着させた
のち、０．０／Ｍリン酸緩衝液（０，／　４　Ｍ硫酸ア
ンモニウム含有。）を用い、吸着された酵素を溶出し、
得られた活性区分をコロジオンバックを用いて濃縮した
のち、更に、バイオゲルＡ　、　Ｑ、　ｊ　ｍ（２，ｊ
ｃｒｎ×／　ｊ　Ｏｃｍ）を使用してゲル濾過を行ない
、精製された蓚酸オキシダーゼ標品ｙｓｒｒｑ（収率／
３．２％、比活性ｌＡ♂単位／■蛋白質）を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本酵素の至適ｐＨ１第２図は、作用°適温の
範囲、第３図は、温度による失活の条件、第４図は、ア
クリルアミドディスクゲル電気泳動を夫々示す図である
。 特許出願人　財団法人野田産業科学研究所輩１回 Ｈ 笈力図 温　）ｆ、Ｃ°Ｃノ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）シュードモナス属に属し、蓚酸オキシダーゼ生産
   能を有する微生物を培地に培養し、培養物よシ該酵素を
   採取することを特徴とする蓚酸オキシダーゼの製造法。