FR2748812A1 - Trousse de diagnostic et procede pour determiner la concentration d'un cytochrome p450 - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne une trousse de diagnostic pour les maladies hépatiques telles que l'hépatite C et la cirrhose alcoolique qui est destinée à être utilisée avec un échantillon de sérum humain et qui contient un anticorps capable de reconnaître un cytochrome P450 humain, et un procédé pour déterminer la concentration d'un cytochrome P450 (par exemple sous-famille 1A2) dans le sérum d'un patient humain pour le diagnostic de l'hépatite C et de la cirrhose alcoolique (patient 1: cirrhose alcoolique, patient 2: hépatite C, patient 3: cirrhose non alcoolique, patient 4: cirrhose biliaire primitive).
Description
La présente invention concerne une trousse de diagnostic pour l'hépatite C
et la cirrhose alcoolique et un procédé pour déterminer la concentration d'un cytochrome P450 dans le sérum humain pour le diagnostic de l'hépatite C et de
la cirrhose alcoolique.
Dans certaines trousses diagnostics, les activités d'enzymes telles que
la glutamate-oxaloacétate-transam i nase (GOT), la glutamate-pyruvate-
transaminase (GPT), la y-glutamyle-transpeptidase (y-GTP), entres autres, sont
mesurées comme marqueurs biologiques de symptômes hépatiques humains.
Toutefois, ces activités enzymatiques ne sont pas toujours satis-
faisantes pour caractériser une maladie car elles ne font pas la distinction entre les maladies hépatiques telles que les hépatites virales que sont l'hépatite A, l'hépatite B, l'hépatite non-A non-B, les lésions hépatiques provoquées par l'alcool et les
lésions hépatiques provoquées par des drogues.
Ainsi, l'on recherche un autre marqueur pour caractériser certaines
maladies hépatiques ainsi qu'une trousse correspondante.
On a constaté que la concentration d'un cytochrome P45 humain, une enzyme spécifique qui, habituellement, n'est pas présente dans le sang humain, augmente beaucoup dans le sérum d'un patient atteint d'une maladie hépatique telle
que l'hépatite C ou la cirrhose alcoolique et qu'une trousse pour déterminer la con-
centration de cette enzyme permet le diagnostic de ces maladies hépatiques.
La présente invention concerne donc une trousse de diagnostic pour
l'hépatite C et la cirrhose alcoolique qui est destinée à être utilisée avec un échan-
tillon de sérum humain et qui comprend un anticorps capable de reconnaître un cytochrome P45o humain, une trousse de diagnostic pour l'hépatite C et la cirrhose alcoolique destinée à être utilisée avec un échantillon de sérum humain, et qui comprend (a) un support solide auquel est lié un anticorps capable de reconnaitre un cytochrome P4o humain, et (b) un réactif contenant un anticorps marqué capable de reconnaître un cytochrome P45o humain, ainsi qu'un procédé pour déterminer la concentration d'un cytochrome P450 humain dans le sérum humain pour le diagnostic dc l'hépatite C et de la cirrhose alcoolique qui comprend (a) la conduite d'une réaction antigène- anticorps par addition d'un échantillon de sérum humain à un support solide auquel est lié un anticorps capable de reconnaître un cytochrome P450 humain, puis le retrait par lavage de l'excès de cytochrome P4o humain et des substances qui n'ont pas réagi, (b) la conduite d'une réaction antigène-anticorps par addition au produit de la réaction d'un anticorps marqué capable de reconnaître un cytochrome P450o humain, puis le retrait par lavage de l'excès d'anticorps marqué capable de reconnaître un cytochrome P45o humain, et (c) la détection dudit cytochrome P45o au moyen du marqueur sur ledit anticorps
marqué, dans le produit de la réaction.
L'invention va être décrite de manière plus précise dans la suite en se référant aux dessins annexés, dans lesquels:
les figures 1A à 1D représentent des courbes d'étalonnage de la con-
centration de cytochrome P45, obtenues en utilisant comme échantillons des solu-
tions standards de cytochrome P45 humain et la trousse de diagnostic de la présente invention; les figures 2A à 2D représentent les résultats d'une détermination de la concentration de cytochrome P45o dans des échantillons de sérum de patients atteints de différentes maladies hépatiques au moyen de la trousse de diagnostic de la présente invention, le patient 1 étant atteint de cirrhose alcoolique, le patient 2 d'hépatite C, le patient 3 de cirrhose non alcoolique et le patient 4 de cirrhose
biliaire primitive.
Les figures 1A à 1D montrent que des anticorps capables de recon-
naître les sous-familles 1A2, 2C8, 2E1 et 3A4 de P4o, respectivement, ont réagi
avec les sous-familles correspondantes et ont permis la détermination de la con-
centration de cytochrome P450 de manière quantitative et en présentant une spé-
cificité vis-à-vis de chacune des sous-familles. D'autre part, les figures 2A à 2D révèlent que la concentration de cytochrome P45o dans le sérum de patients atteints de maladies hépatiques telles que l'hépatite C et la cirrhose alcoolique augmente beaucoup. On va tout d'abord décrire une trousse de diagnostic pour l'hépatite C et la cirrhose alcoolique selon la présente invention, qui est destinée à être utilisée avec un échantillon de sérum humain et qui comprend un anticorps capable de
reconnaître un cytochrome P450 humain.
Les anticorps qui peuvent reconnaître P450 humain et qui peuvent être utilisés dans la présente invention comprennent par exemple des anticorps capables de reconnaître les sous-familles dc P., telles que lA1, 1A2, 2B6, 2C8, 2C9, 2C18,
2C19, 2D6, ZE1 ou 3A4.
Les anticorps que l'on préfère sont ceux qui ne présentant sensiblement pas de réactivité croisée avec d'autres sous-familles de cytochrome P4_o humain qu'une sous-famille de cytochrome P,450 humain spécifique. En d'autres termes, de tels anticorps présentent une spécificité de réaction stricte vis-à-vis de 1A1/2, 2C8/9/18, 2E1 ou 3A4, ou bien sont capables de distinguer sensiblement 1A1/2,
2C8/9/18, 2E1 ou 3A4, respectivement.
On dispose de différents procédés pour obtenir un tel anticorps, mais habituellement on utilise comme antigène pour immuniser un mammifère un cytochrome P45, humain qui n'est sensiblement pas contaminé par d'autres sous-
familles de cytochrome P4so humain.
Bien qu'un cytochrome P45o humain puisse être purifié à partir d'un foie humain, le cytochrome P4so humain ainsi obtenu n'est pas toujours dépourvu d'une légère contamination par des sous-familles de cytochrome P45o similaires et ne
peut pas être purifié sans grande difficulté pour obtenir un composant unique.
En particulier, dans le cas d'une sous-famille de cytochrome P4so qui contribue au métabolisme d'une molécule pharmacologique importante en dépit de sa faible teneur, il est sensiblement impossible d'obtenir le cytochrome P4,so à l'état
de composant unique par purification.
Lorsqu'un tel produit est utilisé comme antigène, il n'est pas possible de préparer un anticorps sensiblement dépourvu de réactivité croisée visà-vis de
sous-familles de cytochrome P45 humain autres que la sous-famille de cyto-
chrome P4so humain spécifique.
Par ailleurs, s'il était malgré tout possible d'obtenir un cytochrome P4, humain à l'état de composant unique, le rendement serait trop faible pour immuniser de manière suffisante un mammifère ou encore on ne pourrait obtenir qu'un très faible titre d'anticorps. De plus, il est sensiblement impossible d'obtenir
un grand nombre de foies humains pour des raisons éthiques et techniques.
De ce fait, il est préférable de préparer l'antigène pour l'immunisation d'un mammifère au moyen d'un procédé qui fait intervenir une extraction et une purification à partir d'une levure transformante obtenue par la technologie de recombinaison d'ADN et qui exprime seulement une sous-famille de cytochrome
P450 spécifique.
Plus précisément, le procédé pour produire l'antigène comprend (1) le clonage d'un gène codant une sous-famille de cytochrome P45o humain, (2) la construction d'un plasmide d'expression pour exprimer le gène cloné dans une levure, (3) l'introduction du plasmide d'expression de levure construit dans une levure pour produire une levure recombinée exprimant la sous-famille de cytochrome P4o humain, (4) la culture dc la levure rccombinée obtenue, la lyse de cette levure et la préparation d'une fraction microsomiale de levure, (5) la dissolution de ladite fraction au moyen d'un tensioactif par exemple, la purification du surnageant dissous obtenu par une chromatographie sur colonne appropriée, telle qu'une chromatographie sur colonne d'octylaminosépharose, une chromatographie sur colonne d'échange d'anions, une chromatographie sur colonne d'hydroxyapatite,
(6) l'immunisation d'un mammifère avec l'antigène constitué par la sous-
famille de cytochrome P4sO humain purifié, et
(7) le prélèvement du sang du mammifère puis l'isolement et la purifica-
tion de l'anticorps à partir du sang prélevé.
La séquence nucléotidique du gène codant une sous-famille de cyto-
chrome P4so humain est décrite dans la littérature et ce gène peut être isolé à partir d'une banque d'ADNc du commerce dérivée de cellules hépatiques humaines au moyen d'un procédé conventionnel qui fait intervenir par exemple l'amplification
en chaîne par polymérase (ACP ou PCR).
Le promoteur pour l'expression du gène codant une sous-famille de cytochrome P450 humain dans la levure peut être tout promoteur utilisé dans un
système d'expression de levure conventionnel et comprend par exemple le promo-
teur du gène de l'alcool-déshydrogénase de levure (dans la suite en abrégé pro-
moteur ADH), le promoteur du gène de la glycéraldéhyde-triphosphate-
déshydrogénase (abrégé dans la suite en promoteur GAPDH), le promoteur du
gène de la phosphoglycérate-kinase (abrégé dans la suite en promoteur PGK).
Le promoteur ADH peut être préparé par exemple à partir du vecteur d'expression de levure pAAH5 (disponible auprès de Washington Research Foundation; voir Ammerer et al., Method in Enzymology, 101 (p. 192-201)) qui porte un promoteur ADH1 de levure et un terminateur, au moyen d'un procédé de génie génétique courant. Le promoteur ADH1 de levure fait l'objet du brevet US
n0 299 733 au nom de Washington Research Foundation.
Le promoteur pour l'expression dans la levure qui est décrit ci-dessus ct le plasmide d'expression de levure qui porte le gène contenant une séquence nucléotidique codant la sous-famille de cytochrome P450 humain peuvent être
construits par un procédé de génie génétique courant.
Ce procédé peut comprendre par exemple un procédé dans lequel un ADNc codant la sous-famille de cytochrome P450 humain est inséré dans un site Hind III du vecteur d'expression de levure pAAH5N décrit dans JP-A-2 211 880,
qui porte le promoteur ADH et un terminateur.
La levure recombinée qui exprime la sous-famille de cytochrome P4, humain peut être obtenue par introduction du plasmide d'expression de levure dans une levure par un procédé conventionnel, par exemple le procédé aux protoplastes. Les souches de levure dcstinées à être utilisées dans la présente invention comprennent par exemple Saccharomyces cerevisiae. La souche que l'on
préfère est Saccharomyces cerevisiae AH 22 (ATCC 38626).
L'extraction et la purification de la sous-famille de cytochrome P4o à partir de la levure recombinée peuvent être réalisées par un procédé habituel tel que celui qui est décrit par exemple dans le document J. Biochem., vol. 98, n0 1,
p. 167-175 (1985).
Plus précisément, la levure recombinée obtenue est cultivée et la masse de levure est soumise à une sonication après avoir été convertie en sphéroplastes
par lyse enzymatique, par exemple.
Une fraction microsomiale de levure est préparée par centrifugation et, après dissolution de ladite fraction avec un tensioactif et le cholate de sodium ou analogue (et précipitation par le sulfate d'ammonium, le polyéthylèneglycol ou analogue, si nécessaire), le surnageant dissous obtenu est purifié par un type quelconque de chromatographie sur colonne tel que chromatographie sur colonne
d'octylaminosépharose, chromatographie sur colonne d'échange d'anions, chroma-
tographie sur colonne d'hydroxyapatite, par exemple. La chromatographie liquide à
hautes performances est un procédé d'isolement et de purification que l'on préfère.
La préparation de l'anticorps destiné à être utilisé dans la présente invention peut être réalisée par exemple par immunisation d'un mammifère avec un antigène constitué par la sous-famille de cytochrome P4so humain purifiée de cette manière, prélèvement du sang du mammifère puis isolement et purification
de l'anticorps à partir du sang obtenu.
L'immunisation de mammifères tels que des souris, des hamsters, des cobayes, des poulets, des rats, des lapins ou des chiens est accomplie par exemple par une ou plusieurs administrations de l'antigène selon le procédé général
d'immunisation proposé par W. H. Newsome et al. dans J. Assoc. Off. Anal.
Chem., 70(6), 1 025-1 027 (1987).
De préférence, l'administration a lieu deux ou trois fois à des inter-
valles de 7 à 30 j, en particulier de 12 à 16 j.
Une quantité standard pour l'administration est par exemple d'environ 0, 05 à environ 2 mg d'antigène par administration. La voie d'administration peut
être choisie parmi les voies sous-cutanée, intracutanée, intrapéritonéale, intra-
veineuse, intramusculaire. On préfère l'administration par injection qui peut être intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée. On préfère encore une combinaison d'injection sous-cutanée et d'injection intrapéritonéale. Dans ce cas, l'antigène est utilisé sous forme d'une solution dans un tampon approprié, par exemple un tampon phosphate de sodium, du sérum physiologique ou analogue, qui contient l'un des adjuvants courants tels que l'adjuvant complet de Freund (mélange d'émulsifiant Aracel A, d'huile Bayol F et de bacille tuberculeux tué), le système d'adjuvant RAS ("Rabi Adjuvant System") [MPL (monophosphoryllipide A) + TDM (dicorynomycolate de tréhalose synthétique) + CWS (squelette de paroi cellulaire)], l'hydroxyde d'aluminium, bien que l'adjuvant ci-dessus puisse ne pas être utilisé selon la voie
d'administration et les conditions.
L'adjuvant destiné à être utilisé désigne une substance qui amplifie de manière non spécifique la réaction d'immunisation d'un antigène lorsqu'il est
administré avec cet antigène.
- Après 0,5 à 4 mois d'élevage du mammifère ci-dessus sans traitement, une petite quantité de sérum de l'animal est prélevée par une veine auriculaire et
son titre d'anticorps est déterminé.
Lorsque le titre d'anticorps augmente, l'administration de l'antigène est répétée un nombre de fois approprié en fonction des circonstances. Par exemple, une administration supplémentaire est faite à une dose d'antigène de 100,ug à
1 000,ug, en particulier de 50,ug à 500,ug.
Un à deux mois après la dernière administration, du sang est prélevé sur le mammifère immunisé selon le procédé habituel, et l'anticorps de la présente invention est obtenu sous forme d'un antisérum polyclonal par traitement dudit
sérum par des moyens conventionnels, par exemple la centrifugation, la précipi-
tation avec le sulfate d'ammonium ou le polyéthylèneglycol, la chromatographie telle que chromatographie par filtration sur gel, chromatographie d'échange d'ions, chromatographie d'affinité. Le sérum pcut être traité par exemple à 56 C pendant
min pour inactiver le complément.
Un anticorps qui ne présente sensiblement pas de réactivité croisée avec d'autres sous-familles de cytochrome P450 humain qu'une sous- famille de cytochrome P4s0 humain spécifique et qui a une spécificité et une affinité élevées peut être préparé par isolement de cellule B immunocompétentes à partir du mammifère immunisé ci-dessus, fusion des cellules B immunocompétentes avec des cellules malignes qui sont capables de se diviser de manière permanente, isolement des cellules fusionnées résultantes, sélection et clonage de cellules d'hybridome capables de produire l'anticorps voulu et culture desdites cellules
d'hybridome in vitro ou in vivo pour produire l'anticorps monoclonal.
Telle qu'elle est utilisée ici, l'expression "absence de réactivité croisée avec d'autres sous-familles de cytochrome P4so humain qu'une sous-famille de cytochrome P4so humain spécifique" signifie qu'une reconnaissance sélective dans laquelle la réactivité croisée avec d'autres sous-familles de cytochrome P4so humain qu'une sous-famille de cytochrome P4so humain spécifique est inférieure à environ 1/4, de préférence inférieure à environ 1/20, et de préférence encore
inférieure à 1/100, est possible.
Le degré de réactivité croisée est donné par 1/C, o la concentration de protéines du substrat à laquelle une sous-famille de cytochrome P4s humain spécifique peut être détectée par le procédé d'immunotransfert se voit attribuer la valeur 1 et la concentration d'autres sous-familles de cytochrome humain détectées par le même procédé est égale à C. On va maintenant décrire la trousse de diagnostic pour l'hépatite C et la cirrhose alcoolique selon la présente invention qui comprend (a) un support solide auquel est lié un anticorps (le premier anticorps) qui est capable de reconnaître un cytochrome P4so humain, et (b) un réactif contenant un anticorps marqué (le second
anticorps) capable de reconnaître un cytochrome P4so humain.
Le premier anticorps n'est pas spécifiquement limité et il est possible
d'utiliser un anticorps capable de reconnaître un cytochrome P4so humain.
De tels anticorps comprennent par exemple des anticorps capables de reconnaître des sous-familles de cytochrome P450 choisies dans un groupe
consistant en lA1, 1A2, 2B6, 2C8, 2C9, 2C18, 2C19, 2D6, 2E1 et 3A4.
Les anticorps que l'on préfère sont ceux qui ne présentent sensiblement pas de réactivité croisée avec d'autres sous-familles de cytochrome P4so humain
qu'une sous-famille de cytochrome P4so5 humain spécifique, comme décrit ci-
dessus. La trousse selon la présente invention peut comprendre en outre (c) une solution standard de cytochrome P45o humain, (d) un tampon, (e) un polypeptide
pour inhiber l'adsorption non spécifique et la formation d'agrégats, et éventuelle-
ment un additif tel qu'un tensioactif et (f) une pipette, un récipient réactionnel et
une courbe d'étalonnage, notamment.
Le support solide peut revêtir différents agencements et différentes formes en fonction de l'utilisation spécifique qui est envisagée. Par exemple, il peut être sous forme d'une capsule ou cuvette, d'une sphère, d'une plaque, d'une
baguette, d'une cellule, d'un petit flacon, d'un petit tube, de fibres ou d'un réseau.
Les exemples spécifiques d'un tel support comprennent une micro-
plaque de titrage constituée par une matière plastique transparente telle que le poly(chlorure de vinyle) ou le polystyrène, une petite sphère, un tube, ou une
baguette en polystyrène ou en latex au polystyrène.
Pour lier un anticorps (le premier anticorps) capable de reconnaître un cytochrome P45o humain à un tel support solide, ce dernier est habituellement
activé au préalable par un procédé conventionnel qui fait intervenir du glutaral-
déhyde ou du bromure de cyanogène, par exemple.
Une solution de liaison d'anticorps qui peut être utilisée comprend par exemple un tampon phosphate environ 10 mM (pH 7,4) contenant du chlorure de
sodium 140 mM. La solution de liaison d'anticorps contient par exemple un anti-
corps à une concentration d'environ 0,05,ug/ml à environ 1,ug/ml.
La durée de traitement peut être par exemple d'environ 6 h à environ 24 h. Dans un exemple spécifique, on peut utiliser une microplaque de titrage à
96 puits en polystyrène.
L'anticorps (premier anticorps) capable de reconnaître un cytochrome
P4,s0 humain peut être lié directement ou indirectement à un tel support solide.
Lorsqu'un anticorps (premier anticorps) capable de reconnaître un
cytochrome P4so humain est lié indirectement à un tel support solide, il est préfé-
rable de lier l'anticorps au support par l'intermédiaire d'une molécule espaceur et/ou d'une molécule porteuse de masse moléculaire élevée qui n'est pas reconnue
par l'anticorps. Cette molécule porteuse de masse moléculaire élevée est une molé-
cule qui n'est pas utilisée dans la préparation de l'anticorps. Une telle molécule est
utilisée habituellement lorsque le premier anticorps est polyclonal.
L'anticorps marqué (second anticorps) capable de reconnaître un cyto-
chrome P4so humain peut être obtenu par marquage du premier anticorps avec une
enzyme telle que peroxydase, phosphatase alcaline, 0-D-galactosidase, glucose-
oxydase, glucoamylase, anhydrase carbonique, acétylcholine-estérase, lysozyme,
maléate-déshydrogénase, glucose-6-phosphate-déshydrogénase, par exemple.
Dans ce cas, après incubation et retrait du second anticorps à l'état libre par lavage, le second anticorps peut être détecté par une mesure de la coloration qui accompagne la réaction de ladite enzyme de marquage avec un substrat de
cette enzyme.
Par exemple, lorsque la peroxydase est utilisée comme marqueur, une couleur jaune apparaît lorsque le peroxyde d'hydrogène en tant que substrat est combiné avec la diaminobenzidine ou la o-phénylènediamine en tant que réactif
de développement.
Lorsque la glucose oxydase est utilisée comme marqueur, le substrat peut être par exemple le 2,2'-azino-di-(3-éthylbenzothiazoline-6- sulfonate)
(ABTS).
L'anticorps (premier anticorps) capable de reconnaître un cytochrome
P4o humain peut aussi être marqué avec la biotine, par exemple à l'aide du "sys-
tème de biotinylation de protéine" fabriqué par la société Amersham. Dans ce cas, après incubation et retrait du second anticorps à l'état libre par lavage, ce second
anticorps peut être détecté avec une sensibilité élevée par une mesure de la colora-
tion qui accompagne la réaction lors du traitement du second anticorps avec une
enzyme, par exemple la peroxydase, la phosphatase alcaline, la I-D-
galactosidase, la glucose oxydase, la glucoamylase, l'anhydrase carbonique,
l'acétylcholine estérase, le lysozyme, la maléate déshydrogénase, la glucose-6-
phosphate-déshydrogénase, qui est marquée avec une substance (streptavidine) qui
se lie spécifiquement à la biotine.
Le procédé pour déterminer la concentration d'un cytochrome P4,o dans le sérum humain pour le diagnostic de l'hépatite C et de la cirrhose alcoolique
selon la présente invention va être décrit de manière plus détaillée dans la suite.
L'anticorps (premier anticorps) capable de reconnaître un cytochrome P45o humain purifié comme décrit ci-dessus est placé dans une microplaque de titrage à 96 puits telle qu'une microplaque Nunc-Immuno Plate MaxiSorp (marque déposée) de la société Nunc, de manière que la quantité de protéine soit de 50 ng à 500 ng, de préférence de 200 ng à 400 ng/puits et il est laissé au repos à environ 4 C à la température ambiante pendant environ 2 h à environ 20 h. Ensuite, les puits sont lavés deux à cinq fois avec environ 100,ul à environ 500,ul de tampon phosphate environ 10 mM (pH 7,4) contenant environ mM de chlorure de sodium et environ 0,1 % de Tween 20. De plus, environ 100,ul à environ 500,ul de tampon phosphate environ 10 mM (pH 7,4) contenant environ 140 mM de chlorure de sodium et environ 1 % de sérumalbumine bovine sont ajoutés aux puits pour le blocage et sont laissés au repos à une température d'environ 4 C à la température ambiante pendant environ 30 min à 60 min. Ensuite, les puits sont lavés deux à cinq fois avec environ 100,ul à environ 500,ul de tampon phosphate environ 10 mM (pH 7, 4) contenant environ 140 mM de chlorure de sodium et environ 0,1 % de Tween 20. A un support solide traité de cette manière est ajouté un échantillon de sérum humain préparé par dilution d'un sérum avec de l'eau distillée, un tampon, du sérum physiologique ou analogue, si nécessaire (le sérum étant obtenu par
exemple sous forme de surnageant formé par centrifugation d'environ 1 ml à envi-
ron 10 ml de sang prélevé, à environ 4 C et 2 000 g pendant 15 min pour retirer le précipité) en une quantité d'environ 50,ui à environ 200 pul par puits et l'ensemble est laissé au repos à la température ambiante pendant 1 à 2 h pour réaliser la
réaction antigène-anticorps.
Ensuite, les puits sont lavés deux à cinq fois avec environ 100,ul à environ 500,ul de tampon phosphate environ 10 mM (pH 7,4) contenant environ
mM de chlorure de sodium et environ 0,1 % de Tween 20.
Puis, le produit réactionnel est traité par exemple avec environ 50,ul à environ 200,ul, de préférence environ 100,ul, d'une solution d'un anticorps marqué
préparée par dilution environ 250 à 2 000 fois, de préférence 500 fois, d'un anti-
corps marqué à la biotine (second anticorps) capable de reconnaître un cytochrome P450 humain, avec un tampon phosphate environ 10 mM (pH 7,4) (environ 5 mM à environ 50 mM) contenant environ 140 mM de chlorure de sodium et environ 0,1% de Tween 20 et il est laissé au repos à la température ambiante pendant 1 à
2 h pour réaliser la réaction antigène-anticorps.
Ensuite, les puits sont lavés deux à cinq fois avec environ 100,ul à environ 500,ul de tampon phosphate environ 10 mM (pH 7,4) contenant environ mM de chlorure de sodium et environ 0,1 % de Tween 20 pour retirer l'excès d'anticorps marqué (second anticorps) capable de reconnaître un cytochrome P4, humain. Ensuite, le produit réactionnel est traité avec environ 50,uPl à environ
,ul, de préférence environ 100,ul, de peroxydase de raifort marquée à la strep-
tavidine (HRP, disponible par exemple auprès de la société Amersham), laissé au repos à une tcmpérature d'environ 4 C à la température ambiante pendant environ min à 60 min, lavé de la même manière que ci- dessus, traité avec une solution de substrat (par exemple o- phénylenediamine 4 mM, peroxyde d'hydrogène
0,004 %, citrate 0,02 M, NaHPO4 0,05 M/pH 5,0) et laissé au repos à la tempé-
rature ambiante pendant environ 10 min à environ 60 min pour le développement d'une couleur brune fonction de la quantité d'antigène (c'est-à-dire cytochrome
P45o humain).
Pour le diagnostic de l'hépatite C et de la cirrhose alcoolique, la con-
centration de cytochrome P450 dans le sérum humain peut être déterminée par une mesure de l'absorbance du puits à une longueur d'onde spécifique du substrat (par exemple 492 nm pour la o-phénylènediamine) avec un spectrophotomètre tel
qu'un lecteur de microplaques pour microplaques de titrage à 96 puits ou analogue.
Pour la détermination de la concentration, il est commode de préparer au préalable une courbe d'étalonnage à l'aide de solutions standards de cytochrome
P450 humain.
Pour la trousse de diagnostic de la présente invention, il est possible d'utiliser d'autres principes que celui décrit ci-dessus, par exemple le procédé d'immunotransfert et le procédé ELISA (voir: "Current Protocols in Molecular
Biology", Wiley Interscience (1991)).
Les exemples non limitatifs suivants illustrent la présente invention de
manière plus détaillée.
Exemples
Exemple de référence l: Obtention d'un gène ayant une séquence nucléoti-
dique codant un cytochrome P4,0 humain Un ADNc codant un cytochromne P450 humain a été obtenu à partir
d'une banque d'ADNc dérivée de foie humain du commerce (Clontech) par un pro-
cessus d'ACP (PCR) utilisant une amorce de clonage conçue sur la base de la
séquence nucléotidique connue du gène de cytochrome P45o humain. Exemple de référence 2: Construction d'un plasmide d'expression de levure
Une région de codage de protéine d'un gène de cytochrome P4o humain a été amplifiée par un processus d'ACP (PCR) à l'aide d'une amorce de clonage. Le fragment obtenu a été inséré dans un vecteur pUCA (plasmide de sous-clonage) préparé par transformation du site Eco RI du site de clonage multiple de pUC19 en site Hind III, coupure du site de clonage multiple résultant
avec Hind III pour former un fragment de vecteur ayant des sites Hind III et inser-
tion dans ces sites du fragment ayant les sites de clonage suivants: Hind 11I EcoRI Sphl Sall Saml Sall Xbal Spel Pstl BamHI Kpnl Hind 111
pour construire un plasmide d'expression de levure pour cytochrome P45o humain.
Exemple de référence 3: Préparation de cellules de levure transformées Sacchromyces cerevisiae AH 22 a été inoculé dans du milieu YPD (1 % d'extrait de levure, 2 % de polypeptone et 2 % de glucose) et la culture a été secouée à 30 C pendant 18 h. Puis, les cellules ont été récoltées par centrifugation
(5 000 x g, 10 min).
Les cellules obtenues ont été mises en suspension dans une solution de
LiCl 0,2 M et la suspension a été centrifugée (500 x g, 10 min) de nouveau.
Le culot obtenu a été ajouté à 20 ul de solution de LiCI 1 M, 30,u1 de solution de polyéthylèneglycol 4 000 à 70 % et 10,ul d'une solution contenant
environ 1,0 ug de plasmide d'expression de levure pour cytochrome P4so humain.
L'ensemble a été mélangé suffisamment, incubé à 30 C pendant 1 h et mélangé avec 140,ul d'eau stérile sous agitation. La solution obtenue a été étalée sur une boîte de milieu synthétique SD (2,0 % de glucose, 0, 67 % de source d'azote exempte d'acides aminés ("Nitrogen base w/o amino acids", fabriqué par la société Difco), 20,ug/ml d'histidine et 2,0 % de gélose) et incubée à 30 C pendant 3 j pour sélectionner les cellules de levure transformées portant le plasmide d'expression de
levure décrit ci-dessus.
Exemple de référence 4: Mesure du cytochrome P,45 humain exprimé dans la levure
Des cellules ont été récoltées à partir de 200 ml de la solution de cul-
ture (milieu synthétique SD, densité cellulaire: environ 1,5 x 107 cellules/ml) con-
tenant les cellules de levure transformées capables d'exprimer le cytochrome P4so
humain dans la levure préparées dans l'exemple de référence 3.
Ces cellules ont été mises en suspension dans 10 ml de tampon phos-
phate de potassium 100 mM (pH 7,0) et la suspension a été centrifugée (5 000 x g, min). Le culot obtenu a été mis en suspension dans 2,0 ml de tampon phosphate de potassium 100 mM (pH 7,0) frais et la suspension a été divisée en portions de 1,0ml dans deux cuvettes. Du monoxyde de carbone a été insufflé dans une
cuvette constituant un échantillon et 5-10 mg de dithionite ont été ajoutés.
Après agitation, les spectres différentiels à 400-500 nm ont été
mesurés et la concentration du cytochrome P45o humain dans la levure a été cal-
culée. La quantité de cytochromne P450 humain exprimé dans les cellules de levure
transformées atteignait un niveau d'environ 105-106 molécules/cellule.
Exemple de référence 5: Préparation d'une fraction microsomiale à partir des cellules de levure transformées Des cellules ont été récoltées à partir de 3,8 1 de la solution de culture (milieu synthétique SD, densité cellulaire: environ 1,0 x 108 cellules/ml) contenant les cellules de levure transformées capables d'exprimer le cytochrome P45o humain dans la levure préparées dans l'exemple de référence 3. Ces cellules ont été mises en suspension dans 400 ml de tampon A (tris-HCI 10 mM (pH 7,5), sorbitol 2 M, DTT 0,1 mM et EDTA 0, 2 mM). A la suspension ont été ajoutés 160 mg d'enzyme zymolyase (Zymolyase 100T, fabriquée par la société Wako Pure Chemical Ind.) et le mélange a été incubé à 30 C pendant 60 min. Les sphéroplastes obtenus par centrifugation (5 000 x g, 10 min) ont été mis en suspension dans du tampon A et centrifugés (5 000 x g, 10 min) de nouveau. La même centrifugation ayant été répétée une fois encore pour le lavage, les sphéroplastes ont été mis en suspension dans 200 ml d'un tampon (tris- HCI
mM (pH 7,5), sorbitol 0,65 M et DTT 0,1 mM) et ont été soumis à une soni-
cation (50 W, 5 min). Le produit lysé a été centrifugé (9 000 x g, 20 min) pour recueillir un surnageant qui a été centrifugé encore (125 000 x g, 70 min) pour recueillir un précipité. Le précipité recueilli a été remis en suspension dans 10 ml de tampon phosphate de potassium 0,1 mM (pH 7,4) pour donner une fraction microsomiale. Exemple de référence 6: Purification du cytochrome P45o humain à partir de la fraction microsomiale La fraction microsomiale (environ 300 mg) contenant le cytochrome P45o humain obtenue dans l'exemple de référence 5 a été diluée avec du tampon phosphate de potassium 0,1 M (pH 7,22, tampon B) contenant 1 mM de DTT, 1 mM de EDTA, 0,25 mM de PMSF (fluorure de phénylméthanesulfonyle) et 20 % de glycérol à 3 mg/ml. Du cholate de sodium a été ajouté goutte à goutte à la dilution jusqu'à une concentration finale de 0,6 % et l'ensemble a été laissé au repos à 4 C pendant 30 min pour la dissolution du cytochrome P45o humain. Après centrifugation (200 000 x g, 30 min) dc la solution, le surnageant a été appliqué à une colonne garnie de 15 ml d'octylaminosépharose 4B (Pharmacia) équilibrée avec du tampon B contenant 0,5 % de cholate de sodium pour lier le cytochrome P45o humain au support. La colonne a été lavée suffisamment avec du tampon B pour retirer les produits non liés et le cytochrome P450o humain a été élué avec un tampon préparé par addition de 0,2 % de nonylphényléther de polyoxyéthylène (fabriqué par la société Kao Corp., marque déposée: Emulgen 911) au tampon B. Les fractions actives ont été recueillics et dialysées pendant une nuit contre du tampon tris-acétate 0,02 M (pH 7,2, tampon C) contenant 20 % de glycérol. Puis, les fractions ont été appliquées à une colonne de CLHP DEAE-5PW (fabriquée par la société Toso) équilibrée avec un tampon préparé par addition de 0,4 % de nonylphényléther de polyoxyéthylène (fabriqué par la société Kao Corp., marque déposée: Emulgen 911) au tampon C, et le cytochrome P4so humain a été élué dans les fractions non liées. Ensuite, les fractions ont été appliquées à une colonne d'hydroxyapatite (fabriquée par la société Koken) pour CLHP équilibrée avec du tampon phosphate de sodium 0,01 M (pH 7,2, tampon D) contenant 0, 2 % de nonylphényléther de polyoxyéthylène (fabriqué par la société Kao Corp., marque déposée: Emulgen 911), 0,2 % de cholate de sodium et 20 % de glycérol. La colonne a été lavée suffisamment avec du tampon D pour retirer les produits non liés et le cytochrome P4o humain a été élué avec un gradient linéaire de phosphate
de sodium.
Ensuite, les fractions actives ont été recueillies et appliquées à une colonne d'hydroxyapatite (fabriquée par la société Biorad) pour CLHP équilibrée
avec du tampon phosphate 0,01 M (pH 7,2, tampon E) contenant 20 % de glycérol.
La colonne a été lavée suffisamment avec du tampon E et le cytochrome P4so humain a été élué avec du phosphate dc sodium 0,35 M contenant 0,05 % de cholate de sodium et 20 % de glycérol. Les fractions actives ont été recueillies pour
donner du cytochrome P45o humain purifié.
Exemple de préparation 1: Préparation d'un anticorps (premier anticorps) capable de reconnaître un cytochrome P45o humain
Le cytochrome P45o humain purifié obtenu dans l'exemple de réfé-
rcnce 6 a été dissous dans du sérum physiologique à une conentration de 1 mg/ml.
A 2 ml de la solution ont été ajoutés 40,ul de RAS [système d'adjuvant MPL (lipide monophosphorylé A) + TDM (dicorynomycolate de tréhalose synthétique) + CWS (squelette de paroi cellulaire)] (fabriqué par la société Sigma)
préalablement incubé à 42-43 C, puis l'ensemble a été mélangé suffisamment.
Le mélange obtenu a été administré à des lapins albinos New Zealand
(femelles, de 14 semaines, poids corporel moyen 2,4 kg) à raison de 1 ml par lapin.
Plus précisément, le mélange a été administré par voie sous-cutanée au niveau de
sites dorsaux à une dose de 100,ul.
Après 3 semaines et 5 semaines, la moitié de la quantité a été admi-
nistrée. Pendant cette période, des échantillons de sang ont été recueillis par les veines auriculaires et le titre d'anticorps a été déterminé. Comme le titre d'anticorps augmentait après le second rappcl, les lapins immunisés ont été saignés à mort au niveau des artères carotides. Le sang obtenu a été placé dans un tube Separapit (fabriqué par la société Sekisui Chemical), incubé à 37 C pendant 2 h, centrifugé (3 000 tr/min, 20 min, température ambiante), et le surnageant a été recueilli pour donner un antisérum. L'antisérum obtenu a été traité à 56 C pendant 30 min pour
inactiver le complément.
Puis, après addition de tampon phosphate 10 mM (pH 7,4) contenant
mM de chlorure de sodium et 0,1 % de Tween 20 et 1 ml de sulfate d'ammo-
nium saturé à 1 ml de l'antisérum, le mélange a été agité pendant 30 min et centri-
fugé à 4 C et 10 000 tr/min pendant 10 min pour séparer un précipité. Au précipité obtenu ont été ajoutés 1 ml de PBS (solution salée tamponnée au phosphate) et
1 ml de sulfate d'ammonium saturé. Le mélange a été agité pendant 30 min et cen-
trifugé de nouveau à 4 C et 10 000 tr/min pendant 10 min pour séparer un préci-
pité. Le précipité obtenu a été dissous dans 1 ml de tampon phosphate 10 mM (pH 7,4) contenant 140 mM de chlorure de sodium et 0,1 % de Tween 20 et 1 ml de sulfate d'ammonium saturé et la solution obtenue a été dialysée pendant une nuit contre 1 1 de PBS pour retirer le sulfate d'ammonium et donner une fraction de
* IgG qui a été utilisée comme premier anticorps dans le test suivant.
Exemple de préparation 2: Préparation d'un anticorps marqué (second anticorps) capable de reconnaître un cytochrome P450 humain Un anticorps marqué (second anticorps) capable de reconnaître un
cytochrome P450 humain a été obtenu par marquage à la biotine du premier anti-
corps obtenu dans l'exemple de préparation 1 au moyen d'un système de biotinyla-
tion de protéine disponible auprès de la société Amersham.
Exemple de préparation 3: Préparation d'un support solide auquel est lié un anticorps capable de reconnaître un cytochrome P4so humain L'anticorps (premier anticorps) capable de reconnaître un cytochrome
P45so humain préparé dans l'exemple de préparation 1 a été placé dans une micro-
plaque de titrage à 96 puits [Nunc-Immuno Plate MaxiSorp (marque déposée), fabriquée par la société Nunc] de manière que la quantité de protéine soit de 250 ng/puits et la microplaque a été laissée au repos à 4 C pendant 16 h.
Ensuite, les puits ont été lavés trois fois avec 200/ul de tampon phos-
phate 10 mM (pH 7,4) contenant 140 mM de chlorure de sodium et 0,1% de Tween 20. Dc plus, 150,1ul de tampon phosphate 10 mM (pH 7,4) contenant mM de chlorure de sodium et 1% de sérumalbumine bovine ont été ajoutés aux puits pour le blocage et l'ensemble a été laissé au repos à la température ambiante pendant 60 min.
Lcs puits ont ensuite été lavés trois fois avec 200,ul de tampon phos-
phate environ 10 mM (pH 7,4) contenant 140 mM de chlorure de sodium et 0, 1 %
de Tween 20 pour obtenir le support solide voulu.
Exemple de test 1: Détermination de la concentration d'un cytochrome P450 dans un sérum humain pour le diagnostic de l'hépatite C et de la cirrhose alcoolique (partie 1) Au support solide obtenu dans l'exemple de préparation 3 ont été ajoutés 100,ul par puits de solutions de cytochrome P4a humain standardisées (ajustées à 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125 et 0,16 pmol de P4so/ml) et l'ensemble a été laissé au repos à la température ambiante pendant 1 h pour le déroulement de la
réaction antigène-anticorps.
Ensuite, le produit de la réaction a été traité avec 100,ul d'une solution dc l'anticorps marqué préparé dans l'exemple de préparation 2 obtenue par dilution dc l'anticorps marqué à la biotine (second anticorps) capable de reconnaître un cytochrome PKso humain 500 fois avec du tampon phosphate 10 mM (pH 7,4) contenant 140 mM de chlorure de sodium et 0,1 % de Tween 20, et l'ensemble a été laissé au repos à la température ambiantc pendant 1 h pour le déroulement de la
réaction antigène-anticorps.
Lcs puits ont ensuite été lavés trois fois avec environ 200,ul de tampon phosphate 10 mM (pH 7,4) contenant 140 mM de chlorure de sodium et 0,1 % de Tween 20 pour retirer l'excès d'anticorps marqué (second anticorps) capable de
reconnaître un cytochrome P450 humain.
Ensuite, le produit de la réaction a été traité avec 100,ul de peroxydase de raifort marquée à la streptavidine (HRP disponible dans le commerce, par exemple auprès de la société Amersham), laissé au repos à la température ambiante pendant 30 min, lavé d'une manière semblable à celle décrite ci-dessus, traité avec une solution de substrat (ophénylènediamine 4 mM, peroxyde d'hydrogène
0,004 %, citrate 0,02 M, NaHPO4 0,05 M/pH 5,0) et laissé au repos à la tempéra-
ture ambiante pendant 30 min pour développer une couleur brune indiquant la
quantité d'antigène (c'est-à-dire de cytochrome P45o humain).
La concentration du cytochrome P45o pour le diagnostic de l'hépatite C et de la cirrhose alcoolique a été déterminée par une mesure de l'absorbance du
puits à une longueur d'onde spécifique du substrat (492 nm) au moyen d'un spec-
trophotomètre tel qu'un lecteur de microplaques pour microplaques de titrage à
96 puits, par exemple.
Les résultats sont présentés sur la figure 1.
Exemple de test 2: Détermination de la concentration d'un cytochrome P4s0 dans du sérum humain pour le diagnostic de l'hépatite C et de la cirrhose alcoolique (partie 2) Au support solide obtenu dans l'exemple de préparation 3 ont été ajoutés 100,ul par puits d'un sérum humain à titre d'échantillon (obtenu sous forme de surnageant formé par centrifugation de 1 ml d'un échantillon constitué par du sang prélevé, à 4 C et 2 000 x g pendant 15 min pour retirer le précipité) et l'ensemble a été laissé au repos pendant 1 h à la température ambiante pour le
déroulement de la réaction antigène-anticorps.
Ensuite, le produit de la réaction a été traité avec 100,ul d'une solution de l'anticorps marqué préparé dans l'exemple de préparation 2 obtenue par dilution de l'anticorps marqué à la biotine (second anticorps) capable de reconnaître un cytochrome P450 humain 500 fois avec du tampon phosphate 10 mM (pH 7,4) contenant 140 mM de chlorure de sodium et 0,1 % de Tween 20, et l'ensemble a été laissé au repos à la température ambiante pendant 1 h pour le déroulement de la
réaction antigène-anticorps.
Les puits ont ensuite été lavés trois fois avec environ 200,ul de tampon phosphate 10 mM (pH 7,4) contenant 140 mM de chlorure de sodium et 0,1% de Tween 20 pour retirer l'excès d'anticorps marqué (second anticorps) capable de
reconnaître un cytochrome P450 humain.
Puis, le produit de la réaction a été traité avec 100,ul de peroxydase de raifort marquée à la streptavidine (HRP disponible dans le commerce, par exemple auprès de la société Amersham), laissé au repos à la température ambiante pendant min, lavé d'une manière semblable à celle décrite ci-dessus, traité avec une solution de substrat (o- phénylènediamine 4 mM, peroxyde d'hydrogène 0,004 %, citrate 0,02 M, NaJHPO4 0,05 M/pH 5,0) et laissé au repos à la température ambiante pendant 30 min pour développcr une couleur brune indiquant la quantité
d'antigène (c'est-à-dire de cytochrome P45o humain).
La concentration du cytochrome P450 dans le sérum humain pour le diagnostic de l'hépatite C et de la cirrhose alcoolique a été déterminée par une mesure de l'absorbance du puits à une longueur d'onde spécifique du substrat (492 nm) au moyen d'un spectrophotomètre tel qu'un lecteur de microplaques pour microplaques de titrage à 96 puits, par exemple. Les résultats sont représentés sur
la figure 2.
Claims (9)
1. Trousse de diagnostic pour l'hépatite C et la cirrhose alcoolique destinée à être utilisée avec un échantillon de sérum humain, caractérisée en ce qu'elle comprend un anticorps capable dc reconnaître un cytochrome P45o humain.
2. Trousse de diagnostic selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'anticorps capable de reconnaître un cytochrome P4_o humain est un anticorps capable de reconnaître une sous-famille de cytochrome P45o choisie parmi les
sous-familles de cytochrome P450 humain 1A1/2, 2C8/9/18, 2E1 et 3A4.
3. Trousse de diagnostic selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que l'anticorps est capable de reconnaître une sousfamille de cytochrome P45o humain et ne présente sensiblement pas de réactivité croisée avec
d'autres sous-familles de cytochrome P450 humain.
4. Trousse de diagnostic pour l'hépatite C et la cirrhose alcoolique destinée à être utilisée avec un échantillon de sérum humain, caractérisée en ce qu'elle comprend (a) un support solide auquel est lié un anticorps capable de reconnaître un cytochrome P45o humain, et (b) un réactif contenant un anticorps
marqué capable de reconnaître un cytochrome P45o humain.
5. Trousse de diagnostic selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'anticorps capable de reconnaître un cytochrome P45O humain est un anticorps capable de reconnaître une sous-famille de cytochrome P4o choisie parmi les
sous-familles de cytochrome P45o humain 1A1/2, 2C8/9/18, 2E1 et 3A4.
6. Trousse de diagnostic selon la revendication 4 ou la revendication 5, caractérisée en ce que l'anticorps est capable de reconnaître une sousfamille de cytochrome P45o humain et ne présente sensiblement pas de réactivité croisée avec
d'autres sous-familles de cytochrome P45o humain.
7. Procédé pour détcrminer la concentration d'un cytochrome P45o dans du sérum humain pour le diagnostic dc l'hépatite C et de la cirrhose alcoolique,
caractérisé en ce qu'il comprend (a) la mise en oeuvre d'une réaction antigène-
anticorps par addition d'un échantillon dc sérum humain à un support solide auquel est lié un anticorps capable de reconnaître un cytochrome P4o humain puis le retrait du cytochrome P45o humain Cenl excès et des produits qui n'ont pas réagi par lavage, (b) la mise en oeuvre d'une réaction antigène-anticorps par addition au produit de la réaction d'un anticorps marqué capable de reconnaître un cytochrome P4. humain puis le retrait de l'excès d'anticorps marqué capable de reconnaître un cytochrome P450 humain par lavage, et (c) la détection dudit cytochrome P4o dans
le produit de la réaction au moyen du marqueur présent sur ledit anticorps marqué.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'anticorps est un anticorps capable de reconnaître une sous-famille de cytochrome P450 choisie parmi les sous-familles de cytochrome P450 humain 1A1/2, 2C8/9/18, 2E1 et 3A4.
9. Procédé selon la revendication 7 ou la revendication 8, caractérisé en ce que l'anticorps est capable de reconnaître une sous-famille de cytochrome P45o
humain et ne présente sensiblement pas de réactivité croisée avec d'autres sous-
familles de cytochrome P450 humain.
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