JPH0827196A - ヒト由来のチトクロムｐ４５０２ｃ９を認識する抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９を発現す
る形質転換体である酵母から抽出および精製されたヒト
由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９を抗原として免疫感作
化した哺乳動物から血液を採取し、該血液から分離・精
製して得られうる、他のヒト由来のチトクロムＰ４５０
分子種に対して交差反応性を実質的に示さないことを特
徴とするヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９を認識す
る抗体。 【効果】本発明は、ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子
種を認識しかつ目的とする特定なチトクロムＰ４５０分
子種のみを特異的に認識する抗体を提供する。そして本
発明抗体を用いることによって生体内のチトクロムＰ４
５０分子種を正確にしかも簡便に定量することが可能と
なった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒト由来のチトクロムＰ
４５０２Ｃ９を認識する抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術】チトクロムＰ４５０は生体が取り込んだ
薬物、異物、環境汚染物質などの酸化的代謝（解毒およ
び代謝活性化）、生体内生理活性物質の生合成など極め
て多彩な反応に関与する要因の１つとして、チトクロム
Ｐ４５０が互いに重複した基質特異性を有する多数の分
子種から構成されることが挙げられる。そして、生体に
薬物を投与すると、特定のチトクロムＰ４５０分子種が
誘導されることがよく知られている。一方、新規薬物の
開発においては、ヒトにおける薬物の代謝、効果、毒性
を早期に予測、評価することが極めて重要な課題であ
る。そのためにはヒト生体内のチトクロムＰ４５０分子
種の分布および存在量を知る必要がある。そして近年、
チトクロムＰ４５０には動物種差や人種差があることが
明らかになってきており、たとえば特定の薬物を代謝す
るチトクロムＰ４５０分子種を遺伝的に欠損する人種の
場合、薬物の効果が強く、さらには副作用を生じること
などの症例が報告されるようになってきた。また、生体
内のチトクロムＰ４５０分子種の量は高血圧や糖尿病な
どの病態により変動することも知られるようになった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】こうした状況から、ヒ
トにおける薬物の代謝、効果、毒性等の早期予測、評価
をより正確に行うために生体内のチトクロムＰ４５０分
子種を正確にしかも簡便に定量する方法が望まれてい
る。こうした課題を解決するために、ラット、ウサギな
どの実験動物のチトクロムＰ４５０分子種を認識する抗
体を用いることも考えられるが、チトクロムＰ４５０に
は動物種間による相違があることおよび必ずしも目的の
チトクロムＰ４５０分子種のみを特異的に認識する能力
がないことから、必ずしも正確な評価とはなり得ない。
従って、ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種の定量を
正確に行うためにヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種
を認識しかつ目的とする特定なチトクロムＰ４５０分子
種のみを特異的に認識する抗体が必要であった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、こうした
状況を鑑み、ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種を認
識しかつ目的とする特定なチトクロムＰ４５０分子種の
みを特異的に認識する抗体を作製するために、組換えＤ
ＮＡ技術を用いることによって所望の抗体を得ることに
成功し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、ヒト
由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９を発現する形質転換体
である酵母から抽出および精製されたヒト由来のチトク
ロムＰ４５０２Ｃ９を抗原として免疫感作化した哺乳動
物から血液を採取し、該血液から分離・精製して得られ
うる、他のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種に対し
て交差反応性を実質的に示さないことを特徴とするヒト
由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９を認識する抗体（以
下、本発明抗体と記す。）を提供するものである。

【０００５】以下、さらに詳細に本発明を説明する。本
発明でいう「ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９を認
識する抗体」とは、ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ
９以外の他のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種に対
して交差反応性を実質的に示さないものであればいかな
る方法によって得てもよいが、哺乳動物を免疫感作する
ために用いられる抗原は、ヒト由来のチトクロムＰ４５
０２Ｃ９以外の他のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子
種を実質的に混入しないヒト由来のチトクロムＰ４５０
２Ｃ９を用いる必要がある。ここで、ヒト由来のチトク
ロムＰ４５０２Ｃ９はヒトの肝臓からも精製することは
できるが、得られるチトクロムＰ４５０はどうしても類
似のチトクロムＰ４５０分子種が若干混在してしまい、
単一な状態にまで精製することはきわめて難しい。特に
含量が少ないにもかかわらず、重要な薬物の代謝に関与
するチトクロムＰ４５０分子種の場合、単一な状態にま
で精製は不可能である。このような試料を抗原として用
いれば、ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９以外の他
のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種に対して交差反
応性を実質的に示さない抗体を製造することはできな
い。また仮にきわめて単一な状態にまで精製できたとし
ても得られる量がきわめて少量なために哺乳動物を充分
に免疫感作することができない、もしくはきわめて低い
抗体価のものしか得られない等の問題が生じる。また、
そもそもヒトの肝臓を大量に入手することは倫理的、技
術的に不可能に近く、現実的ではない。これに対して、
本発明で用いた方法は、組換えＤＮＡ技術によって特定
のチトクロムＰ４５０分子種のみを発現する形質転換体
である酵母から哺乳動物を免疫感作するために用いられ
る抗原を抽出および精製する方法であって、これによっ
てヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９以外の他のヒト
由来のチトクロムＰ４５０分子種を実質的に混入しない
ような高い純度のヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９
を大量に、しかも容易に得ることができる。

【０００６】具体的には、（１）ヒト由来のチトクロム
Ｐ４５０２Ｃ９をコードする遺伝子をクローニングし、
（２）クローニングした遺伝子を酵母で発現させるため
の発現プラスミドを構築し、（３）構築した酵母発現プ
ラスミドを酵母に導入し、ヒト由来のチトクロムＰ４５
０２Ｃ９を発現する組換え体酵母を作製し、（４）作製
した組換え体酵母を培養し、これを破砕後、酵母ミクロ
ソーム画分を調製し、（５）該画分を界面活性剤等を用
いて可溶化後、得られる可溶化上清をオクチルアミノセ
ファロースカラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カ
ラムクロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトカラ
ムクロマトグラフィー等の各種カラムクロマトグラフィ
ーによって精製し、（６）精製したヒト由来のチトクロ
ムＰ４５０２Ｃ９を抗原として哺乳動物を免疫感作化
し、（７）該哺乳動物から血液を採取し、採取した血液
から本発明抗体を分離・精製する、方法があげられる。

【０００７】上記の「ヒト由来のチトクロムＰ４５０２
Ｃ９をコードする遺伝子」の塩基配列は配列表中の配列
番号５で示されており、ヒト由来のチトクロムＰ４５０
２Ｃ９をコードする遺伝子は市販のヒト肝細胞由来のｃ
ＤＮＡライブラリーからＰＣＲなど通常の方法を用いて
単離することができる。

【０００８】ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９をコ
ードする遺伝子を酵母で発現させるためのプロモーター
としては、通常の酵母発現系において用いられるプロモ
ーターであれば特に制限されるものではないが、例えば
酵母アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（以
下、ＡＤＨプロモーターと記す）、グリセルアルデヒド
ー３リン酸脱水素酵素遺伝子のプロモ−タ−（以下、Ｇ
ＡＰＤＨプロモーターと記す）、フォスフォグリセリン
酸キナーゼ遺伝子のプロモ−タ−（以下、ＰＧＫプロモ
ーターと記す）等をあげることができる。なお、ＡＤＨ
プロモーターは、例えば酵母ＡＤＨ１プロモーターおよ
び同ターミネーターを保持する酵母発現ベクターｐＡＡ
Ｈ５（Washington Research Foundationから入手可能、
Ammerer ら、Methods in Enzymology, 101 (p.192-20
1)）から通常の遺伝子操作方法により調製することがで
きる。酵母ＡＤＨ１プロモーターは、Washington Resea
rch Foundation の米国特許第299,733 に含まれてお
り、米国において、工業的、商業的目的で使用する場合
は権利者からの権利許諾を必要とする。上記の酵母内で
発現させるためのプロモーターおよび前記のヒト由来の
Ｐ４５０分子種をコードする塩基配列を有する遺伝子を
含む酵母内発現プラスミドは通常の遺伝子組換え方法を
用いて構築することができる。例えば、ヒト由来のＰ４
５０分子種をコードするcDNAを特開平2-211880等に記載
されるＡＤＨプロモーターとターミネーターを保有する
酵母発現ベクターｐＡＡＨ５ＮのＨｉｎｄＩＩＩ部位に
挿入することにより構築する方法等をあげることができ
る。

【０００９】ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９を発
現する組換え体酵母は、構築された酵母発現プラスミド
を、例えばプロトプラスト法等の通常の方法によって酵
母に導入することで得ることができる。本発明システム
において用いられる酵母菌株としては、例えばサッカロ
ミセス・セレビジェー(Saccharomyces cerevisiae)等を
あげることができる。好ましくはサッカロミセス・セレ
ビジェーＡＨ２２株（ＡＴＣＣ３８６２６）があげられ
る。

【００１０】組換え体酵母からのチトクロムＰ４５０分
子種の抽出および精製は、例えば、J.Biochem., Vol 9
8. No.1. p167-175 (1985) 等に記載された通常の方法
に従い行うことができる。具体的には、作製した組換え
体酵母を培養し、得られた酵母を溶菌酵素等によるスフ
ェロプラスト化後、超音波破砕する。遠心分離によって
酵母ミクロソーム画分を調製し、該画分を界面活性剤お
よびコール酸ナトリウム等を用いて可溶化後（必要に応
じて硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコール等
による沈殿を行う）、得られる可溶化上清をオクチルア
ミノセファロースカラムクロマトグラフィー、陰イオン
交換カラムクロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイ
トカラムクロマトグラフィー等の各種カラムクロマトグ
ラフィーによって精製する。なお高速液体クロマトグラ
フィー装置で分離・精製することが適している。

【００１１】本発明抗体の作製は、このようにして精製
したヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９を抗原として
哺乳動物を免疫感作化し、該哺乳動物から血液を採取
し、採取した血液から本発明抗体を分離・精製すること
により行うことができる。例えばマウス、ハムスター、
モルモット、ニワトリ、ラット、ウサギ、イヌ等の哺乳
動物を免疫するには、例えばJ.ASSOC.OFF.ANAL.CHEM 70
(6) 1025-1027 (1987)等に記載されるW.H.Newsome等の
通常の免疫感作の方法を用いて、例えば抗原の１回また
はそれ以上の投与により行われる。例えば、７ないし３
０日、特に１２ないし１６日間隔で２または３回の投与
等が好ましい。投与量は１回につき、例えば抗原約０．
０５から２ｍｇ程度を目安とする。投与経路は、皮下投
与、皮内投与、腹膜腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与
等を選択することができるが、静脈内、腹膜腔内もしく
は皮下に行われうる注射が好ましい投与形態である。さ
らに皮下注射と腹腔内注射の組み合わせが特に好まし
い。なおこの場合、抗原は適当な緩衝液、例えば完全フ
ロイントアジュバント（Aracel A.Bayol F 結核死菌を
混合したもの）、ＲＡＳ〔MPL(Monophosphoryl Lipid
A)+TDM(Synthetic Trehalose Dicorynomycolate)+CWS(C
ell Wall Skeleton) アジュバントシステム] 、水酸化
アルミニウム等の通常用いられるアジュバントの１種を
含有するナトリウム系リン酸緩衝液、生理食塩水等に溶
解して用いられるが、投与経路や条件等によっては、上
記のようなアジュバントを使用しないこともある。ここ
でアジュバントとは抗原とともに投与したとき、非特異
的にその抗原に対する免疫反応を増強する物質を意味す
る。そして、上記の哺乳動物を０．５ないし４ケ月間処
置せずに放置した後、該哺乳動物の血清を耳静脈等から
少量サンプリングし、抗体価を測定する。抗体価が上昇
してきたら、状況に応じて抗原の投与を適当回数実施す
る。例えば１００μｇないし１０００μｇ、特に５０μ
ｇないし５００μｇの抗原の投与量でもう１回の投与が
行われる。最後の投与の１ないし２ケ月間後に免疫感作
した哺乳動物から通常の方法により血液を採取して、該
血液を、例えば遠心分離、硫酸アンモニウムまたはポリ
エチレングリコールを用いることによる沈澱、ゲルろ過
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
アフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィ
ー等の通常の方法によって分離・精製することにより、
ポリクローナル抗血清として本発明抗体を得ることがで
きる。なお血清は、たとえば、５６℃で３０分間処理す
ることによって補体系の不活性化を実施してもよい。

【００１２】また、上記の免疫感作した哺乳動物から免
疫適格Ｂ細胞が単離され、該免疫適格Ｂ細胞が連続的に
細胞分裂し得る腫瘍細胞と融合され、生成する融合物が
単離され、そして選択の後、所望の抗体を産生するハイ
ブリドーマ細胞がクローン化され、そしてモノクローナ
ル抗体を製造するために該ハイブリドーマ細胞が試験管
内または生体内で培養されることにより、ヒト由来のチ
トクロムＰ４５０２Ｃ９以外の他のヒト由来のチトクロ
ムＰ４５０分子種に対して交差反応性を実質的に示さな
い高度の特異性および親和性を有する本発明抗体も製造
することができる。

【００１３】本発明抗体は、ヒト由来のチトクロムＰ４
５０２Ｃ９以外の他のヒト由来のチトクロム分子種に対
して交差反応性を実質的に示さないことを特徴とする新
規な抗体である。ここで「ヒト由来のチトクロムＰ４５
０２Ｃ９以外の他のヒト由来のチトクロム分子種に対し
て交差反応性を実質的に示さない」とは、目的とするヒ
ト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９と異なる分子種のヒ
ト由来のチトクロムＰ４５０に対して、交差反応性が約
１／４未満、好ましくは約１／２０未満、そしてより好
ましくは１／１００未満であるような選択的認識が実質
的に可能であることを意味する。ここで、交差反応性の
程度は、例えばヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９を
後述するイムノブロット法によって検出することができ
る基質蛋白質濃度を１とした時に他のヒト由来のチトク
ロム分子種が同方法によって検出されてくる濃度をＣと
すれば、１／Ｃのように決定される。また、ヒト由来の
チトクロムＰ４５０２Ｃ９を発現する形質転換体である
酵母から抽出および精製されたヒト由来のチトクロムＰ
４５０２Ｃ９を抗原として免疫感作化した哺乳動物から
血液を採取し、該血液から分離・精製して得られる血清
の希釈率が１０^{- 4} においてもヒト由来のチトクロムＰ
４５０分子種を認識する能力を有する。

【００１４】本発明抗体の利用としては、ヒト由来のチ
トクロムＰ４５０２Ｃ９に作用させた本発明抗体または
該抗体に対する抗体を、それら抗体が有する標識によっ
て検出することによってヒト由来のチトクロムＰ４５０
２Ｃ９を免疫学的に検出する方法をあげることができ
る。具体的には、例えば、イムノブロット法、免疫沈降
による分離法、間接競合阻害法（ELISA 法）、細胞また
は組織の免疫学的染色法等によってヒト由来のチトクロ
ムＰ４５０２Ｃ９を分析する方法をあげることができ
る。該分析方法は、簡便でかつ迅速に処理できる精度の
高い分析方法である。例えば、以下の方法によって行う
ことができる。

【００１５】Ｉ．イムノブロット法 固体支持材に結合される試料に存在するヒト由来のチト
クロムＰ４５０２Ｃ９を本発明抗体（第１抗体）によっ
て認識させ、その抗体を検出する方法である。試料を結
合させる固体支持材としては、膜、シート、フィルター
等の形状にされたニトロセルロースが一般的に使用され
るが、試料の吸着がよくかつその試料に存在するヒト由
来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９の抗原性を消失させない
ものであれば特に制限はない。ニトロセルロースを使用
する場合、試料のニトロセルロースへの結合は、例えば
リン酸緩衝生理食塩水等の適当な緩衝液に試料を溶解し
て得られた溶液をニトロセルロース上にスポットする。
なお、定量化のためのスポット量は、抗原であるヒト由
来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９に対する本発明抗体（第
１抗体）の量が過剰になるような量が望ましく、１μｌ
／３ｍｍ角程度がよい。このようにしてスポットされた
ニトロセルロースを約１分間から約２４時間、適当な湿
度条件下でインキュベートする。インキュベート後、ス
ポットした部位以外への非特異的な吸着を防止するため
に、試料を結合させた固体支持材を本発明抗体（第１抗
体）によって認識されない高分子量担体分子、すなわ
ち、本発明抗体（第１抗体）の製造において用いられな
い高分子量担体分子（ヤギ、ウシ等の別種の動物の血清
アルブミンやスキムミルク）を含む溶液と約２０分間か
ら約２４時間、室温下でインキュベートすることによっ
て該高分子量担体分子で固体支持材の表面を覆う。イン
キュベート後、得られた固体支持材をよく洗浄して遊離
状態にある上記の高分子量担体分子を除去する。このよ
うに調製された固体支持材を本発明抗体（第１抗体）を
含む調製液と混合した後、約１０分間から約３時間、振
とうしながらインキュベートする。なお本発明抗体（第
１抗体）を含む調製液とは、本発明抗体（第１抗体）を
遊離の状態で、蒸留水、緩衝液、生理食塩水等の溶液中
に存在しうる調製液をいう。このようにして、試料に存
在するヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９を本発明抗
体（第１抗体）によって認識させる。つぎに、その抗体
を検出する方法について説明する。本発明抗体（第１抗
体）が、例えばペルオキシダーゼ、アルカリホスファタ
ーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダ
ーゼ、グルコアミラーゼ、炭酸アンヒドラーゼ、アセチ
ルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロ
ゲナーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナ
ーゼ等の酵素等で標識されている場合には、インキュベ
ート後、遊離の状態にある本発明抗体（第１抗体）を洗
浄によって除去してから、上記の標識酵素の基質を作用
させて、発色等で反応を測定することによって本発明抗
体（第１抗体）を検出することができる。例えば、 ペ
ルオキシダーゼで標識される場合には、基質として過酸
化水素、発色試薬としてジアミノベンジジンまたはＯ−
フェニレンジアミンと組み合わさって褐色または黄色を
生じる。グルコースオキシダーゼで標識される場合に
は、基質として、たとえば２，２'−アシド−ジ−（３
−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴ
Ｓ）等を用いる。また、本発明抗体（第１抗体）を認識
しかつ結合する酵素あるいはラジオアイソトープ等で標
識された第２抗体を使用する場合には、インキュベート
後、遊離の状態にある本発明抗体（第１抗体）を洗浄に
よって除去してから、第２抗体とインキュベートする。
この酵素等で標識された第２抗体としては、例えばペル
オキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラ
ーゼ、炭酸アンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラー
ゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼ、グルコー
ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ等の酵素を結合
した第１抗体（本発明抗体）に対する抗体をあげること
ができる。具体的な例としては、第１抗体（本発明抗
体）としてウサギ抗血清を使用する場合、第２抗体とし
ては、アルカリホスファターゼを結合した抗ウサギ免疫
グロブリン（ＩｇＧ）ヤギ免疫グロブリン（ＩｇＧ）を
好ましくあげることができる。なお、該ウサギＩｇＧヤ
ギＩｇＧは市販されており、容易に入手可能である。第
２抗体の検出としては、上記の標識された本発明抗体
（第１抗体）の場合と同様な方法をあげることができ
る。

【００１６】ＩＩ．免疫沈降による分離法 試料に存在するヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９を
本発明抗体（第１抗体）によって認識させ、その抗体と
ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９からなる免疫複合
体を精製することによって試料からヒト由来のチトクロ
ムＰ４５０２Ｃ９のみを分離し、分離したヒト由来のチ
トクロムＰ４５０２Ｃ９をゲル電気泳動法、酵素活性測
定、イムノブロット法等の方法によってヒト由来のチト
クロムＰ４５０２Ｃ９の検出に利用する。まず、試料と
ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９に対する本発明抗
体（第１抗体）を、たとえば、約１時間から約２４時
間、４℃で撹拌しながら混合することによって免疫複合
体を形成させる。この際の試料と本発明抗体（第１抗
体）との混合比としては、例えば１：８程度をあげるこ
とができるが、試料に存在するヒト由来のチトクロムＰ
４５０２Ｃ９によって適宜増減される。つぎに形成され
た免疫複合体に、抗体に特異的に結合しかつ抗体および
抗体と結合しているヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ
９を溶液中から分離することができる２次試薬を添加
し、この混合物をインキュベートすることによって、免
疫複合体と２次試薬からなる複合体を形成させ、これを
回収する。ここで２次試薬としては、たとえば、プロテ
インＡ，プロテインＧ等の抗体と結合する細菌細胞壁蛋
白質または抗免疫グロブリン抗体があげられる。なお、
これら２次試薬は不溶性の支持材に結合されたものを用
いると免疫複合体と２次試薬からなる複合体の回収（遠
心分離、洗浄等）がきわめて容易である。不溶性の支持
材は、非常に広範囲のデザインを有し、そして使用に際
して意図された特定の目的に応じて非常に異なる形状を
有することができる。たとえば、ビーズ、皿、球、プレ
ート、小型ロッド、セル、小型ボトル、小型チューブ、
ファイバー、ネット等をあげることができる。具体的な
例としては、アガロース等の多糖体（たとえば、セファ
ロース、バイオゲル等）からなるビーズや透明プラスチ
ック材料、たとえばポリ塩化ビニルまたはポリスチレン
からなるミクロタイタープレート、ポリスチレンおよび
ポリスチレンラテックスからなる小球、チューブまたは
ロッド等が使用可能である。つぎに回収された複合体を
加熱処理等の操作によってヒト由来のチトクロムＰ４５
０２Ｃ９を遊離させる。そして遊離の状態にあるヒト由
来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９をゲル電気泳動法、酵素
活性測定、イムノブロット法等の方法によって検出すれ
ばよい。

【００１７】ＩＩＩ．間接競合阻害法（ELISA 法） 基本的には、固体支持材に結合される抗原であるヒト由
来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９と試料中に含まれるヒト
由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９との競合、例えば固体
支持材に結合される抗原であるヒト由来のチトクロムＰ
４５０２Ｃ９と標識が施されている第２抗体によって認
識される第１抗体の遊離抗原であるヒト由来のチトクロ
ムＰ４５０２Ｃ９との競合に基づいている。これに関連
して、固体支持材への抗原の結合は直接、あるいはスペ
ーサーおよび／または第１抗体（すなわち、本発明抗
体）によって認識されない高分子量担体分子を介して起
こり得る。ここで、第１抗体（すなわち、本発明抗体）
によって認識されない高分子量担体分子とは、第１抗体
の製造において用いられない高分子量担体分子のことで
ある。これは本発明抗体がポリクローナルである場合に
重要である。抗原の直接または間接的な結合に用いられ
る固体支持材としては、たとえばミクロタイタープレー
トまたは試験管のプラスチック表面、ポリスチレン、ポ
リプロピレン、ポリ塩化ビニル、ガラスまたはプラスチ
ック等からなるビーズ表面、ろ紙、デキストラン、セル
ロースもしくはニトロセルロースまたはその他の類似の
材料の細片の表面等をあげることができる。これらの固
体支持材に、抗原であるヒト由来のチトクロムＰ４５０
２Ｃ９を直接、あるいはスペーサーおよび／または第１
抗体（本発明抗体）によって認識されない高分子量担体
分子を介して間接的に結合する（以下、コーティングと
記す。）には、例えば、あらかじめ、グルタルアルデヒ
ドまたは臭化シアン等を用いる通常の方法によって固体
支持材の活性化を行う。用いられるコーティング液とし
ては、例えば１４０ｍＭの塩化ナトリウムを含む約１０
ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ=7.4）等をあげることができ
る。コーティングの条件として、例えば抗原であるヒト
由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９のコーティング液内の
濃度は、約０．０５μｇ／mlから約１μｇ／ml等を好ま
しくあげることができる。またコーティング時間として
は、例えば約６時間ないし２４時間をあげることができ
る。なお、上記の具体的な例としては、例えば固体支持
材としてポリスチレン製の９６穴ミクロタイタープレー
トを使用することができる。このようにして得られる固
体支持材に直接または間接的に結合するヒト由来のチト
クロムＰ４５０２Ｃ９は次に、試料中に含まれる検出す
べき抗原であるヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９お
よび第１抗体（本発明抗体）を含有する試験溶液と混合
され、該混合物はインキュベートされる。なお、試料中
に含まれる検出すべき抗原であるヒト由来のチトクロム
Ｐ４５０２Ｃ９は、この際に遊離の形態で、水溶液、生
理食塩水、緩衝液または生体試料等の成分として存在し
得る。約１０分間ないし約２時間のインキュベート後
に、混合物は第１抗体（本発明抗体）を認識し、そして
結合する酵素等で標識された第２抗体とインキュベート
される。この酵素等で標識された第２抗体としては、例
えばペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グル
コアミラーゼ、炭酸アンヒドラーゼ、アセチルコリンエ
ステラーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼ、
グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ等の酵
素を結合した第１抗体（本発明抗体）に対する抗体をあ
げることができる。具体的な例としては、第１抗体（本
発明抗体）としてウサギ抗血清を使用する場合、第２抗
体としては、ペルオキシダーゼを結合した抗ウサギ免疫
グロブリン（ＩｇＧ）ヤギ免疫グロブリン（ＩｇＧ）を
好ましくあげることができる。なお、該ウサギＩｇＧヤ
ギＩｇＧは市販されており、容易に入手可能である。ペ
ルオキシダーゼで標識される場合には、基質として過酸
化水素、発色試薬としてジアミノベンジジンまたはＯ−
フェニレンジアミンと組み合わさって褐色または黄色を
生じる。グルコースオキシダーゼで標識される場合に
は、基質として、たとえば２，2'−アシド−ジ−（３−
エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）
等を用いる。また本発明は、ヒト由来のチトクロムＰ４
５０２Ｃ９の免疫学的検出・分析用キットを包含する。
上記の試験キットは、たとえば次の構成成分を含有し得
る：(1) ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９を直接、
あるいはスペーサーおよび／または第１抗体（本発明抗
体）によって認識されない高分子量担体分子を介して間
接的に結合する固体支持材、(2) 本発明抗体を含有する
試薬、(3) 本発明抗体に対する標識された抗体を含有す
る試薬、すなわち第１抗体（本発明抗体）を認識し、そ
して結合する酵素等で標識された第２抗体を含有する試
薬。さらに補助的に、(4) ヒト由来のチトクロムＰ４５
０２Ｃ９の標準化溶液、(5) 緩衝液、(6) 非特異的吸着
および凝集体の形成を防止するポリペプチド、界面活性
剤等の添加剤、および(7)ピペット、反応容器、計算曲
線等を含めるとよい。上記の固体支持材は、非常に広範
囲のデザインを有し、そして使用に際して意図された特
定の目的に応じて非常に異なる形状を有することができ
る。例えば、皿、球、プレート、小型ロッド、セル、小
型ボトル、小型チューブ、ファイバー、ネット等をあげ
ることができる。具体的な例としては、透明プラスチッ
ク材料、たとえばポリ塩化ビニルまたはポリスチレンか
らなるミクロタイタープレート、ポリスチレンおよびポ
リスチレンラテックスからなる小球、チューブまたはロ
ッド等が使用可能である。

【００１８】ＩＶ． 細胞または組織の免疫学的染色法 固定された細胞または組織標本中に存在するヒト由来の
チトクロムＰ４５０２Ｃ９を本発明抗体（第１抗体）に
よって認識させ、その抗体を検出する方法であり、細胞
または組織中の存在量、局在状態を調べるのに役立つ。
調べたい細胞または組織を固定し、光学顕微鏡または電
子顕微鏡等の観察が可能な標本を作製する。細胞または
組織の固定に使用する試薬は、顕微鏡下での観察に適し
たもので、かつ抗原であるヒト由来のチトクロムＰ４５
０２Ｃ９を認識する本発明抗体の能力を消失させないも
のであれば特に制限はないが、好ましくは３．７％ホル
マリン液、１００％メタノール、１００％エタノール、
４％パラホルムアルデヒド溶液、１％グルタールアルデ
ヒド溶液等があげられる。そして固定された細胞または
組織標本を約３０分間から約２４時間、４℃でインキュ
ベートすることによって、固定された細胞または組織標
本中に存在するヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９を
本発明抗体（第１抗体）によって認識させる。つぎに、
その抗体を検出する方法について説明する。本発明抗体
（第１抗体）が、たとえばペルオキシダーゼ、アルカリ
ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、炭酸アンヒドラー
ゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレー
トデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼ等の酵素等で標識されている場合には、
インキュベート後、遊離の状態にある本発明抗体（第１
抗体）を洗浄によって除去してから、上記の標識酵素の
基質を作用させて、発色等で反応を測定することによっ
て本発明抗体（第１抗体）を検出することができる。例
えば、 ペルオキシダーゼで標識される場合には、基質
として過酸化水素、発色試薬としてジアミノベンジジン
またはＯ−フェニレンジアミンと組み合わさって褐色ま
たは黄色を生じる。グルコースオキシダーゼで標識され
る場合には、基質として、例えば２，2'−アシド−ジ−
（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢ
ＴＳ）等を用いる。また、本発明抗体（第１抗体）を認
識しかつ結合する酵素等で標識された第２抗体を使用す
る場合には、インキュベート後、遊離の状態にある本発
明抗体（第１抗体）を洗浄によって除去してから、第２
抗体とインキュベートする。この酵素等で標識された第
２抗体としては、例えばペルオキシダーゼ、アルカリホ
スファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコース
オキシダーゼ、グルコアミラーゼ、炭酸アンヒドラー
ゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレー
トデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼ等の酵素を結合した第１抗体（本発明抗
体）に対する抗体をあげることができる。具体的な例と
しては、第１抗体（本発明抗体）としてウサギ抗血清を
使用する場合、第２抗体としては、ペルオキシダーゼを
結合した抗ウサギ免疫グロブリン（ＩｇＧ）ヤギ免疫グ
ロブリン（ＩｇＧ）を好ましくあげることができる。な
お、該ウサギＩｇＧヤギＩｇＧは市販されており、容易
に入手可能である。第２抗体の検出としては、上記の標
識された本発明抗体（第１抗体）の場合と同様な方法を
あげることができる。以下、実施例を挙げて本発明を説
明するが、本発明は下記の実施例にのみ限定されないこ
とは言うまでもない。

【００１９】

【実施例】

製造例１ ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９をコー
ドする塩基配列を有する遺伝子の取得 市販のヒト肝臓由来のｃＤＮＡライブラリー（Clontech
社）から配列番号１〜４記載のヒト由来のチトクロムＰ
４５０２Ｃ９遺伝子クローニング用プライマーを用いた
ＰＣＲ法を用いることによりヒト由来のチトクロムＰ４
５０２Ｃ９をコードするｃＤＮＡを得た。得られたｃＤ
ＮＡの塩基配列および検定アミノ酸配列を配列番号５に
記載した。

【００２０】製造例２ 酵母発現プラスミドの構築：ｐ
２Ｃ９ 図１にヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９の酵母内発
現プラスミドの構築方法を示す。配列番号１〜４で示す
プライマーを用いて、ＰＣＲ法により、ヒト由来のチト
クロムＰ４５０２Ｃ９遺伝子のタンパク質コーディング
領域を約０.９ｋｂと約０.６ｋｂの２つの断片に分けて
増幅した。得られた約０.９ｋｂ断片はＰｓｔＩで切断
してｐＵＣＢベクター（pUC19 が有するEcoRI 部位をHi
ndIII部位に改変し、形成されたHindIII とHindIII 部
位の間のクローニングサイトを下記のクローニングサイ
ト（化１）：

【化１】 に交換することにより作製されたサブクローン用のプラ
スミド）にサブクローン化し、さらに約０.６ｋｂ断片
をＸｂａＩ、ＰｓｔＩ部位に組み込んで、２つの断片を
連結させた。このプラスミドのＫｐｎＩ部位を平滑化
し、ＸｂａＩリンカーを挿入したものからコーディング
領域を含むＸｂａＩ断片を切り出し、ｐＵＣベクター中
にＡＤＨプロモーター、ターミネーター領域を持つｐＵ
ＣＡＮベクター（市販されるpUC19 ベクターが有するEc
oRI 部位とＨindIII部位をそれぞれNotI部位に改変し、
形成されたNotI部位とNotI部位の間にpAAH5Nから調製し
たNotI断片を組み込んで得たベクター）のＨｉｎｄ III
部位を平滑化、ＸｂａＩリンカーを導入したｐＵＣＡＮ
Ｘに挿入した。これをＮｏｔＩで切り出し、同様にＮｏ
ｔＩ処理したｐＡＡＨ５Ｎに挿入し、ヒト由来のチトク
ロムＰ４５０２Ｃ９の酵母発現プラスミドｐ２Ｃ９を構
築した。

【００２１】製造例３ 形質転換酵母菌体の作製 ＹＰＤ培地（１％酵母エキス，２％ポリペプトン、２％
グルコース）１.０mlにサッカロミセス・セレビシェー
ＡＨ２２株を植菌し、３０℃で１８時間振盪した後、遠
心分離（5000Xg、10分間) により集菌した。得られた菌
体を１.０mlの０.２Ｍ ＬｉＣ１溶液に懸濁した後、再
度遠心分離（5000Xg、10分間) し、得られたペレットに
２０μｌの１Ｍ ＬｉＣ１溶液、３０μｌの７０％ポリ
エチレングリコール4000溶液、約１.０μｇのヒトＰ４
５０酵母内発現プラスミドｐ２Ｃ９を含む１０μｌの溶
液を添加した。これを十分に混合した後、３０℃で１時
間インキュベートし、さらに１４０μｌの滅菌水を加え
て撹拌した。この溶液をＳＤ合成培地プレート（2.0％
グルコース、0.67％窒素源アミノ酸不含（Nitrogen bas
e w/o amino acids, Difco製）、20μｇ／mlヒスチジ
ン、2.0％寒天）上に蒔き、３０℃で３日間インキュベ
ートし、上記の酵母内発現プラスミドを保有する形質転
換酵母菌体を選抜した。このようにして、酵母内でヒト
由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９を発現させる形質転換
酵母菌体を作製した。

【００２２】製造例４ 酵母内で発現したヒト由来のチ
トクロムＰ４５０２Ｃ９の定量 製造例３によって作製されたヒト由来のチトクロムＰ４
５０２Ｃ９を発現させる形質転換酵母菌体の培養液（Ｓ
Ｄ合成培地、菌体濃度約1.５×１０⁷ 菌体／ml）２００
mlを集菌し、該菌体を１０mlの１００ｍＭリン酸カリウ
ム緩衝液（pH7.0）を懸濁した後、遠心分離（5000×
ｇ、１０分間）した。得られたペレットを新たに２.０m
lの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）に懸濁
し、２本のキュベットに１.０mlずつ分注した。サンプ
ル側のキュベットに一酸化炭素を吹き込んだ後、両キュ
ベット内にジチオナイト５−１０mgを添加し、撹拌した
のち４００−５００ｎｍの差スペクトルを測定し、酵母
内に存在するヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９濃度
を算出した。形質転換酵母菌体におけるヒト由来のチト
クロムＰ４５０２Ｃ９の発現量は約１０⁵ −約１０⁶ 分
子／菌体のレベルであった。

【００２３】製造例５ 形質転換酵母菌体からのミクロ
ソーム画分の調製 製造例３によって作製されたヒト由来のチトクロムＰ４
５０２Ｃ９を発現させる各種の形質転換酵母菌体の培養
液（ＳＤ合成培地、菌体濃度約１.０×１０8菌体／ml）
３.８ｌを集菌し、得られた菌体を４００mlの緩衝液Ａ
（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5），２Ｍ ソルビ
トール，０.１ｍＭ ＤＴＴ，０.２ｍＭ ＥＤＴＡ）に
懸濁し、１６０mg ザイモリエイス 100,000（zymolyas
e100T 和光純薬社製）を加え、３０℃で６０分間イン
キュベートした。遠心分離（5000×ｇ、１０分間）して
得られたスフェロプラストを１００mlの緩衝液Ａに懸濁
した後、遠心分離（5000×ｇ、１０分間）した。同じ遠
心分離操作をもう一度繰り返してスフェロプラストの洗
浄を行った後、スフェロプラストを２００mlの緩衝液
（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5），0.65Ｍ ソ
ルビトール，0.1ｍＭ ＤＴＴ）に懸濁し超音波破砕
（５０Ｗ，５分間）した。該破砕物を遠心分離（9000×
ｇ、２０分間）して、上清画分を得た。また、これをさ
らに遠心分離（125000×ｇ、７０分間）して沈澱を集
め、０.１Ｍリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）１０mlに再
懸濁することによりミクロソーム画分を得た。

【００２４】製造例６ ミクロソーム画分からのヒト由
来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９の精製 製造例５で取得したヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ
９を含むミクロソーム画分（約３００mg）を１ｍＭＤＴ
Ｔ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．２５ｍＭＰＭＳＦ、２０％グ
リセロールを含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（pH7.
2、緩衝液Ｂ）で３mg/mlに希釈し、コール酸ナトリウム
を最終濃度０．６％になるように滴下し、４℃ ３０分
放置し、ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９を可溶化
した。可溶化液を遠心分離（２０００００ｘｇ、３０
分）した後、上清を０．５％コール酸ナトリウムを含む
緩衝液Ｂで平衡化したオクチルアミノセファロース４Ｂ
（ファルマシア社製）１５mlを充填したカラムに通し、
ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９を担体に吸着させ
た。緩衝液Ｂでカラムを充分に洗浄し、非吸着分を除去
した後、緩衝液Ｂに０．２％ポリオキシエチレンノニル
フェニルエーテル（花王社製、商品名エマルゲン９１
１）を添加した緩衝液にてヒト由来のチトクロムＰ４５
０２Ｃ９を溶出させた。活性画分を集め、２０％グリセ
ロールを含む０．０２Ｍトリス−酢酸緩衝液（pH7.2、
緩衝液Ｃ）に対して１晩透析した。その後、０．４％ポ
リオキシエチレンノニルフェニルエーテル（花王社製、
商品名エマルゲン９１１）を添加した緩衝液Ｃで平衡化
したＤＥＡＥ−５ＰＷ（トーソー社製）ＨＰＬＣカラム
に供したところヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９は
非吸着画分に溶出された。続いて、０．２％ポリオキシ
エチレンノニルフェニルエーテル（花王社製、商品名エ
マルゲン９１１）、０．２％コール酸ナトリウム、２０
％グリセロールを含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液（pH7.2緩衝液Ｄ）で平衡化したハイドロキシアパタ
イト（高研社製）ＨＰＬＣカラムに供し、緩衝液Ｄでカ
ラムを充分に洗浄し、非吸着部分を除去した後、リン酸
ナトリウム直線濃度勾配法にてヒト由来のチトクロムＰ
４５０２Ｃ９を溶出した。続いて、活性画分を集め、２
０％グリセロールを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（pH7.
2、緩衝液Ｅ）で平衡化したハイドロキシアパタイト
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）ＨＰＬＣカラムに供し、緩衝液
Ｅにて充分に洗浄し、０．０５％コール酸ナトリウム、
２０％グリセロールを含む０．３５Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液でヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９を溶出さ
せ、活性画分を集め、精製ヒト由来のチトクロムＰ４５
０２Ｃ９を得た。

【００２５】製造例７ 哺乳動物の免疫感作化工程およ
び本発明抗体取得工程 製造例６によって得られた精製ヒト由来のチトクロムＰ
４５０２Ｃ９を１mg／mlの濃度になるように生理食塩水
に溶解した。この水溶液２mlにあらかじめ４２℃から４
３℃にインキュベートされたＲＡＳ〔MPL(Monophosphor
yl Lipid A)+TDM(Synthetic Trehalose Dicorynomycola
te)+CWS(Cell Wall Skeleton) アジュバントシステム〕
（Sigma 社製）４０μｌを加え、よく混合した。得られ
た混合物をニュージーランドホワイト種ウサギ（雌、１
４週齢、平均２．４kg）一羽あたり１mlの液量投与し
た。その内訳は、１００μｌずつ背部１０ケ所に皮下投
与であった。その後、３週間後、５週間後に再度初回の
１／２量を同様に投与をした。この間ウサギの耳静脈か
ら少量の血液をサンプリングし、抗体価を測定した。２
回目の投与後に抗体価が上昇したため、２回目投与の約
２週間後に免疫感作した供試ウサギの頸動脈から全採血
し、得られた血液をセパラピットチューブ（積水化学社
製）に入れ、３７℃で２時間インキュベートした後、遠
心分離（3000rpm 、20min 、室温）して上清を回収する
ことにより、抗血清を得た。さらに得られた抗血清を５
６℃で３０分間処理し、補体系の不活性化を行った。こ
れを（第１）抗体として下記の試験に用いた。

【００２６】試験例１ 本発明抗体を用いたイムノブロ
ット法によるヒト由来のチトクロム２Ｃ９の分析 製造例１から６によって得られてヒト由来のチトクロム
２Ｃ９および同様な方法に準じて得られた他のヒト由来
のチトクロムＰ４５０分子種９種類（チトクロムＰ４５
０１Ａ１、１Ａ２、２Ａ６、２Ｂ６、２Ｃ８、２Ｃ１
８、２Ｄ６、２Ｅ１および３Ａ４）に対し、製造例７で
得た本発明抗体を用いてイムノブロッティングを行っ
た。ヒト由来のチトクロムＰ４５０１Ａ１、１Ａ２、２
Ａ６、２Ｂ６、２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１８、２Ｄ６、２
Ｅ１および３Ａ４をそれぞれ0.5 から1pmol をＳＤＳポ
リアクリルアミドゲルで電気泳動（40mA、1 時間）し
た。このゲルにニトロセルロース膜を重ね、転写用緩衝
液（25mM Tris 、192mM グリシン、20% メタノール）中
に浸した状態で、BIO-RAD 社製のブロッティング装置に
より、4 ℃、20mA、15時間処理し、泳動したタンパク質
をニトロセルロース膜へと移動させた。得られたニトロ
セルロース膜は、TBS ＋Tween20 溶液（50mM Tris-HCl
(pH7.5)、200mM NaCl、0.05% Tween20 ）で洗浄した
後、3%のゼラチンを含むTBS ＋Tween20 溶液中で、37
℃、40分間インキュベートし、その後、1%ゼラチンを含
むTBS ＋Tween20 溶液で1000倍希釈した本発明抗体と、
37℃、1 時間反応させた。反応後、TBS ＋Tween20 溶液
で4 回洗浄後、3%のゼラチンを含むTBS ＋Tween20 溶液
中で、37℃、20分間インキュベートし、その後、1%ゼラ
チンを含むTBS ＋Tween20 溶液で、2500倍希釈した^{1
2 5} I 標識したProteinA（アマシャム社製）と、37℃、
1 時間反応させた。反応後、TBS ＋Tween20 で4 回洗浄
後、風乾し、富士フィルム社製のイメージングプレート
にて15時間露光し、富士フィルム社製のBAS2000 システ
ムにて検出した。本発明抗体は、上記10種のヒト由来の
チトクロムＰ４５０のうち、２Ｃ９と特異的に強く反応
したが、２Ｃ８にもわずか反応した（表１および図２参
照）。なお、この交差反応性は約１／２０未満であっ
た。

【００２７】比較例１ 比較例抗体を用いたイムノブロ
ット法によるヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種の分
析 市販品であるラット由来のチトクロムＰ４５０分子種を
認識する抗体（比較例抗体）を用いた場合は、上記の試
験例１と同様な方法に準じて行った。上記のようにして
得られたニトロセルロース膜を、4%ブロックエース（雪
印乳業社製）溶液中で、室温、1 時間インキュベート
し、その後、0.4%ブロックエース溶液で500 倍希釈した
ラット由来のチトクロムＰ４５０を認識する抗体それぞ
れと、室温、1 時間反応させた。反応後、0.1% Tween2
0、0.4%ブロックエース溶液で3 回洗浄後、0.4%ブロッ
クエース溶液で5000倍希釈したアルカリフォスファター
ゼ標識抗ヤギIgG ウサギ血清と、室温、1 時間反応させ
た。反応後、0.1% Tween20、0.4% ブロックエース溶液
で3 回洗浄、さらにAP溶液（10mM Tris-HCl(pH9.6)、0.
1M NaCl 、5mM MgCl2 ）で1 回洗浄し、その後同溶液に
NBT （シグマ社製）、BCIP（シグマ社製）を加えた基質
溶液中に入れて発色させた。ラット由来のチトクロムＰ
４５０分子種をを認識する抗体それぞれとの反応交差性
を表１を示す。ラット由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ１
を認識する抗体は、10種のヒト由来のチトクロムＰ４５
０のうち、２Ａ６、２Ｃ８の２分子種と強く反応し、２
Ｂ６、２Ｃ９、２Ｄ６の３分子種とも反応した。ラット
由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ６を認識する抗体は、２
Ｃ８、２Ｃ９の２分子種と強く反応し、２Ａ６、２Ｃ１
８、２Ｅ１の３分子種とも反応した。ラット由来のチト
クロムＰ４５０２Ｃ１１を認識する抗体は、２Ａ６、２
Ｃ８、２Ｃ９の３分子種と反応した。ラット由来のチト
クロムＰ４５０２Ｃ１３を認識する抗体は、２Ｃ８、２
Ｃ９の２分子種と強く反応し、２Ａ６、２Ｃ１８、２Ｅ
１の３分子種とも反応した。ラット由来のチトクロムＰ
４５０２Ｅ１を認識する抗体は、２Ｅ１と強く反応し、
２Ａ６とも反応した。ラット由来のチトクロムＰ４５０
３Ａ２を認識する抗体は、３Ａ４と強く反応した。以
上、異なる動物種由来のチトクロムＰ４５０分子種を認
識する抗体では、特定のヒト由来のチトクロムＰ４５０
分子種のみと特異的に反応しなかった。

【００２８】

【表１】 １）＋＋＋を１００％とした時、＋＋は２５％程度、＋は５％程度、無印は１％ 程度未満の反応を示すことを表す。 ２）N.D は未試験。

【００２９】試験例２ 間接競合阻害法によるヒト由来
のチトクロムＰ４５０２Ｃ９の分析 ポリスチレン製の９６穴ミクロタイタープレートに、製
造例６によって得られたヒト由来のチトクロムＰ４５０
２Ｃ９を１０μｇ／mlの濃度で含むコーティング液（塩
化ナトリウムを１４０mg／ｌの濃度で含む１０mMのリン
酸緩衝液（ＮａＨ2 ＰＯ4 −Ｎａ2 ＨＰＯ4 、pH7.4)）
を 0.1ml／ウェルの割合で添加した後、４℃で一晩イン
キュベートした。そしてコーティング液を除去した後、
ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９によってコーティ
ングされたミクロタイタープレートを１０mMのリン酸緩
衝液（ＮａＨ2 ＰＯ4 −Ｎａ2 ＨＰＯ4 、pH7.4)中に浸
すことにより３回洗浄し、該ミクロタイタープレートの
上面を下にしてペーパータオル上で軽く打ちつけること
によりプレート内の水分を除去した。次に、該ミクロタ
イタープレートにブロッキング液（ブロックエース、雪
印乳業社製）を 0.1ml／ウェルの割合で添加した後、室
温で４時間インキュベートした。そして再びミクロタイ
タープレートを0.05％(w/v) の Tween20を含む１０mMの
リン酸緩衝液（ＮａＨ2 ＰＯ4 −Ｎａ2 ＨＰＯ4 、pH7.
4)を用いて３回洗浄した。次に、製造例７によって得ら
れた抗体（第１抗体）をブロッキング液で１０ないし１
０⁸ 倍希釈し、上記のミクロタイタープレートに 0.1ml
／ウェルの割合で添加した後、室温で１時間インキュベ
ートした。そして第１抗体調製液を除去した後、0.05％
(w/v) の Tween20を含む１０mMのリン酸緩衝液（ＮａＨ
2 ＰＯ4 −Ｎａ2 ＨＰＯ4 、pH7.4)を用いて３回洗浄し
た。次に、市販のアルカリフォスファターゼを結合した
抗ウサギ免疫グロブリン（ＩｇＧ）ヤギ免疫グロブリン
（ＩｇＧ）（生化学工業社製）を、 0.5mg／mlの濃度で
ブロッキング液で４０００倍に希釈した第２抗体調製液
を上記のミクロタイタープレートに、 0.1ml／ウェルの
割合で添加した後、室温で１時間インキュベートした。
そして第２抗体調製液を除去した後、0.05％(w/v) の T
ween２０を含む１０mMのリン酸緩衝液（ＮａＨ2 ＰＯ4
−Ｎａ2 ＨＰＯ4 、ｐＨ7.4)を用いて３回洗浄し、該ミ
クロタイタープレートの上面を下にしてペーパータオル
上で軽く打ちつけることによりプレート内の水分を除去
した。次に、アルカリホスファＢ−テストワコーキット
（和光純薬社製）を用いて、該試薬（p-ニトロフェニルリン 酸二
ナトリウム ）および0.1 Ｍの炭酸塩緩衝液（pH9.8 ）を上記
のミクロタイタープレートに各々、 0.1ml／ウェルの割
合で添加した後、該ミクロタイタープレートを室温で３
０分間インキュベートした。そして0.2 Ｎの水酸化ナト
リウム溶液0.1ml を加えることにより、酵素反応を停止
し、ミクロタイタープレート内の発色をマルチスキャニ
ングスペクトロフォトメーター（大日本製薬社製）を用
いて、４０５nmでの吸光度を測定した。その結果、図３
に示す曲線が得られた。

【００３０】

【発明の効果】本発明は、ヒト由来のチトクロムＰ４５
０分子種を認識しかつ目的とする特定なチトクロムＰ４
５０分子種のみを特異的に認識する抗体を提供する。そ
して本発明抗体を用いることによって生体内のチトクロ
ムＰ４５０分子種を正確にしかも簡便に定量することが
可能となった。

【配列表】

【００３１】配列番号１ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列 1 AGTCTAGAATGGATTCTATTGTGTCCCTTGTGCTC 35

【００３２】配列番号２ 配列の長さ：33 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列 1 CTCCAAACAAGTCAACTGCAGTGTTTTCCAAGC 33

【００３３】配列番号３ 配列の長さ：33 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列 1 GCTTGGAAAACACTGCAGTTGACTTGTTTGGAG 33

【００３４】配列番号４ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列 1 ACTGAGCAGCAGCCAGGCCATCTGCTCTTC 30

【００３５】配列番号：５ 配列の長さ：１４７３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 1 ATG GAT TCT ATT GTG TCC CTT GTG CTC TGT CTC TCA TGT TTG CTT 45 1 Met Asp Ser Ile Val Ser Leu Val Leu Cys Leu Ser Cys Leu Leu 15 46 CTC CTT TCA CTC TGG AGA CAG AGC TCT GGG AGA GGA AAA CTC CCT 90 16 Leu Leu Ser Leu Trp Arg Gln Ser Ser Gly Arg Gly Lys Leu Pro 30 91 CCT GGC CCC ACT CCT CTC CCA GTG ATT GGA AAT ATC CTA CAG ATA 135 31 Pro Gly Pro Thr Pro Leu Pro Val Ile Gly Asn Ile Leu Gln Ile 45 136 GGT ATT AAG GAC ATC AGC AAA TCC TTA ACC AAT CTC TCA AAG GTC 180 46 Gly Ile Lys Asp Ile Ser Lys Ser Leu Thr Asn Leu Ser Lys Val 60 181 TAT GGC CCT GTG TTC ACT CTG TAT TTT GGC CTG AAA CCC ATA GTG 225 61 Tyr Gly Pro Val Phe Thr Leu Tyr Phe Gly Leu Lys Pro Ile Val 75 226 GTG CTG CAT GGA TAT GAA GCA GTG AAG GAA GCC CTG ATT GAT CTT 270 76 Val Leu His Gly Tyr Glu Ala Val Lys Glu Ala Leu Ile Asp Leu 90 271 GGA GAG GAG TTT TCT GGA AGA GGC ATT TTC CCA CTG GCT GAA AGA 315 91 Gly Glu Glu Phe Ser Gly Arg Gly Ile Phe Pro Leu Ala Glu Arg 105 316 GCT AAC AGA GGA TTT GGA ATT GTT TTC AGC AAT GGA AAG AAA TGG 360 106 Ala Asn Arg Gly Phe Gly Ile Val Phe Ser Asn Gly Lys Lys Trp 120 361 AAG GAG ATC CGG CGT TTC TCC CTC ATG ACG CTG CGG AAT TTT GGG 405 121 Lys Glu Ile Arg Arg Phe Ser Leu Met Thr Leu Arg Asn Phe Gly 135 406 ATG GGG AAG AGG AGC ATT GAG GAC CGT GTT CAA GAG GAA GCC CGC 450 136 Met Gly Lys Arg Ser Ile Glu Asp Arg Val Gln Glu Glu Ala Arg 150 451 TGC CTT GTG GAG GAG TTG AGA AAA ACC AAG GCC TCA CCC TGT GAT 495 151 Cys Leu Val Glu Glu Leu Arg Lys Thr Lys Ala Ser Pro Cys Asp 165 496 CCC ACT TTC ATC CTG GGC TGT GCT CCC TGC AAT GTG ATC TGC TCC 540 166 Pro Thr Phe Ile Leu Gly Cys Ala Pro Cys Asn Val Ile Cys Ser 180 541 ATT ATT TTC CAT AAA CGT TTT GAT TAT AAA GAT CAG CAA TTT CTT 585 181 Ile Ile Phe His Lys Arg Phe Asp Tyr Lys Asp Gln Gln Phe Leu 195 586 AAC TTA ATG GAA AAG TTG AAT GAA AAC ATC AAG ATT TTG AGC AGC 630 196 Asn Leu Met Glu Lys Leu Asn Glu Asn Ile Lys Ile Leu Ser Ser 210 631 CCC TGG ATC CAG ATC TGC AAT AAT TTT TCT CCT ATC ATT GAT TAC 675 211 Pro Trp Ile Gln Ile Cys Asn Asn Phe Ser Pro Ile Ile Asp Tyr 225 676 TTC CCG GGA ACT CAC AAC AAA TTA CTT AAA AAC GTT GCT TTT ATG 720 226 Phe Pro Gly Thr His Asn Lys Leu Leu Lys Asn Val Ala Phe Met 240 721 AAA AGT TAT ATT TTG GAA AAA GTA AAA GAA CAC CAA GAA TCA ATG 765 241 Lys Ser Tyr Ile Leu Glu Lys Val Lys Glu His Gln Glu Ser Met 255 766 GAC ATG AAC AAC CCT CAG GAC TTT ATT GAT TGC TTC CTG ATG AAA 810 256 Asp Met Asn Asn Pro Gln Asp Phe Ile Asp Cys Phe Leu Met Lys 270 811 ATG GAG AAG GAA AAG CAC AAC CAA CCA TCT GAA TTT ACT ATT GAA 855 271 Met Glu Lys Glu Lys His Asn Gln Pro Ser Glu Phe Thr Ile Glu 285 856 AGC TTG GAA AAC ACT GCA GTT GAC TTG TTT GGA GCT GGG ACA GAG 900 286 Ser Leu Glu Asn Thr Ala Val Asp Leu Phe Gly Ala Gly Thr Glu 300 901 ACG ACA AGC ACA ACC CTG AGA TAT GCT CTC CTT CTC CTG CTG AAG 945 301 Thr Thr Ser Thr Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Leu Leu Leu Lys 315 946 CAC CCA GAG GTC ACA GCT AAA GTC CAG GAA GAG ATT GAA CGT GTG 990 316 His Pro Glu Val Thr Ala Lys Val Gln Glu Glu Ile Glu Arg Val 330 991 ATT GGC AGA AAC CGG AGC CCC TGC ATG CAA GAC AGG AGC CAC ATG 1035 331 Ile Gly Arg Asn Arg Ser Pro Cys Met Gln Asp Arg Ser His Met 345 1036 CCC TAC ACA GAT GCT GTG GTG CAC GAG GTC CAG AGA TAC ATT GAC 1080 346 Pro Tyr Thr Asp Ala Val Val His Glu Val Gln Arg Tyr Ile Asp 360 1081 CTT CTC CCC ACC AGC CTG CCC CAT GCA GTG ACC TGT GAC ATT AAA 1125 361 Leu Leu Pro Thr Ser Leu Pro His Ala Val Thr Cys Asp Ile Lys 375 1126 TTC AGA AAC TAT CTC ATT CCC AAG GGC ACA ACC ATA TTA ATT TCC 1170 376 Phe Arg Asn Tyr Leu Ile Pro Lys Gly Thr Thr Ile Leu Ile Ser 390 1171 CTG ACT TCT GTG CTA CAT GAC AAC AAA GAA TTT CCC AAC CCA GAG 1215 391 Leu Thr Ser Val Leu His Asp Asn Lys Glu Phe Pro Asn Pro Glu 405 1216 ATG TTT GAC CCT CAT CAC TTT CTG GAT GAA GGT GGC AAT TTT AAG 1260 406 Met Phe Asp Pro His His Phe Leu Asp Glu Gly Gly Asn Phe Lys 420 1261 AAA AGT AAA TAC TTC ATG CCT TTC TCA GCA GGA AAA CGG ATT TGT 1305 421 Lys Ser Lys Tyr Phe Met Pro Phe Ser Ala Gly Lys Arg Ile Cys 435 1306 GTG GGA GAA GCC CTG GCC GGC ATG GAG CTG TTT TTA TTC CTG ACC 1350 436 Val Gly Glu Ala Leu Ala Gly Met Glu Leu Phe Leu Phe Leu Thr 450 1351 TCC ATT TTA CAG AAC TTT AAC CTG AAA TCT CTG GTT GAC CCA AAG 1395 451 Ser Ile Leu Gln Asn Phe Asn Leu Lys Ser Leu Val Asp Pro Lys 465 1396 AAC CTT GAC ACC ACT CCA GTT GTC AAT GGA TTT GCC TCT GTG CCG 1440 466 Asn Leu Asp Thr Thr Pro Val Val Asn Gly Phe Ala Ser Val Pro 480 1441 CCC TTC TAC CAG CTG TGC TTC ATT CCT GTC TGA 1473 481 Pro Phe Tyr Gln Leu Cys Phe Ile Pro Val *** 491

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９遺伝子を
含む酵母発現プラスミド（ｐ２Ｃ９）の構築方法を示す
図である。

【図２】本発明抗体のヒト由来のチトクロムＰ４５０分
子種に対する交差反応性を示す図である。矢印がヒト由
来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９との反応を示すバンドで
ある。なお、他のバンドは電気泳動のための試料作製
（ＳＤＳ処理）時に生じるヒト由来のチトクロムＰ４５
０２Ｃ９の分解物との反応を示すバンドとわずかな交差
反応性（約１／２０未満）によるヒト由来のチトクロム
Ｐ４５０２Ｃ８との反応を示すバンドである。

【図３】ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９を認識す
る本発明抗体の抗体価を示す図である。図から、ヒト由
来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９を発現する形質転換体で
ある酵母から抽出および精製されたヒト由来のチトクロ
ムＰ４５０２Ｃ９を抗原として免疫感作化した哺乳動物
から血液を採取し、該血液から分離・精製して得られる
血清の希釈率が１０^{- 4} においてもヒト由来のチトクロ
ムＰ４５０分子種を認識する能力を充分に有することが
明らかであり、本発明抗体が高い抗体価であることがわ
かる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 1/19 8828−4Ｂ 9/02 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 林 浩司 兵庫県宝塚市高司４丁目２番１号 住友化 学工業株式会社内 (72)発明者 藪崎 義康 兵庫県宝塚市高司４丁目２番１号 住友化 学工業株式会社内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９を発
   現する形質転換体である酵母から抽出および精製された
   ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９を抗原として免疫
   感作化した哺乳動物から血液を採取し、該血液から分離
   ・精製して得られうる、他のヒト由来のチトクロムＰ４
   ５０分子種に対して交差反応性を実質的に示さないこと
   を特徴とするヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９を認
   識する抗体。
2. 【請求項２】ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９を発
   現する形質転換体である酵母から抽出および精製された
   ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ９を抗原として免疫
   感作化した哺乳動物から血液を採取し、該血液から分離
   ・精製して得られる血清の希釈率が１０^{- 4} においても
   ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種を認識する能力を
   有することを特徴とする請求項１記載のヒト由来のチト
   クロムＰ４５０２Ｃ９を認識する抗体。