FR2762011A1 - Procede de preparation de ribitol par voie fermentaire et souche de microorganismes mise en oeuvre dans ce procede - Google Patents
Procede de preparation de ribitol par voie fermentaire et souche de microorganismes mise en oeuvre dans ce procede Download PDFInfo
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Abstract
La présente invention concerne un procédé de préparation de ribitol dans lequel on cultive sur un milieu de fermentation contenant une source carbonée directement assimilable, une souche de microorganismes capable de générer du ribulose et possédant une ribulose- réductase NADH-spécifique, dans laquelle l'activité enzymatique de la ribulose réductase NADPH-spécifique a été éliminée ou sensiblement réduite, et que l'on récupère le ribitol ainsi obtenu.Elle concerne également une souche de microorganismes capable de produire du ribitol pour culture sur un milieu contenant une source carbonée directement assimilable, ladite souche étant capable de générer du ribulose et possédant une ribulose réductase NADH-spécifique, dans laquelle l'activité enzymatique de la ribulose réductase NADPH-spécifique a été éliminée ou sensiblement réduite.
Description
PROCEDE DE PREPARATION DE RIBITOL PAR VOIE FERMENTAIRE
ET SOUCHE DE MICROORGANISMES MISE EN OUVRE DANS CE PROCEDE
La présente invention concerne un procédé de préparation de ribitol par voie fermentaire. L'invention concerne également une souche de microorganisme dont la mise en culture sur un milieu contenant une source carbonée directement assimilable permet la préparation de ribitol.
ET SOUCHE DE MICROORGANISMES MISE EN OUVRE DANS CE PROCEDE
La présente invention concerne un procédé de préparation de ribitol par voie fermentaire. L'invention concerne également une souche de microorganisme dont la mise en culture sur un milieu contenant une source carbonée directement assimilable permet la préparation de ribitol.
Dans la présente description, on entend par source carbonée directement assimilable", une source carbonée qui une fois assimilée par le microorganisme conduira à la production d'arabitol. Des exemples de telles sources sont au moins un élément choisi dans le groupe constitué par le glucose, le D-galactose, le Lsorbose, le D-ribose, le D-xylose, le D-arabinose, le Larabinose, le D-ribulose, le D-xylulose, le saccharose, le glycérol, le xylitol, le D-arabitol, le L-arabitol, le Dsorbitol, le D-mannitol, le galactitol, le myo-inositol, l'éthanol, l'amidon, le D-gluconate, le lactate, le succinate, le citrate et le fructose.
De préférence, de telles sources sont au moins un élément choisi dans le groupe constitué par le glucose, le
D-galactose, le L-sorbose, le saccharose, le glycérol, l'amidon et le fructose.
D-galactose, le L-sorbose, le saccharose, le glycérol, l'amidon et le fructose.
Le ribitol fait partie du groupe des alcools polyhydriques communément appelés "polyols". Le ribitol est un pentitol. C'est un isomère de position de l'arabitol.
Les polyols peuvent être préparés par voie chimique. Ainsi, peut-on procéder à la synthèse des polyols à partir de leurs sucres correspondants par hydrogénation, en utilisant des catalyseurs métalliques comme le Nickel de Raney. Cependant, les voies chimiques présentent l'inconvénient d'être complexes et onéreuses.
On a donc exploré les méthodes de production des polyols par voie de fermentation, par les levures notamment. Les méthodes fermentaires présentent le grand avantage d'être relativement simples. De plus, la matière première utilisée en tant que substrat carboné est souvent très accessible et bon marché.
De nombreuses levures sont déjà connues comme ayant une capacité productrice de polyols. Ainsi, l'art antérieur fait état de microorganismes dont la mise en culture, dans des conditions spécifiques, permet la production de divers polyols tels que le glycérol, l'arabitol, le sorbitol, l'érythritol, le xylitol ou encore le mannitol.
La formation de ces polyols est souvent associée aux voies métaboliques normales des levures, mais elle peut être influencée par les conditions de croissance.
C'est ainsi qu'une large variété de microorganismes produisent des polyols en réponse à de hautes pressions osmotiques, ou lorsqu'elles sont cultivées sur des sources carbonées particulières.
On peut à ce titre citer Candida lîpolytica qui produit du mannitol à partir de n-alcanes, et Candida boidinîl qui produit du sorbitol à partir de fructose. Les microorganismes du genre Monîliella, Trigonoprîs ou Torulopsis permettent l'obtention de l'érythritol à partir du sucrose ou du glucose. Les microorganismes tels que
Yamadazyma (Pîchia miso, Pîchia ohmeri), Debaromyces,
Hansenula, Zygosaccharomyces ou Saccharomyces cerevisîae produisent de l'arabitol à partir de glucose.
Yamadazyma (Pîchia miso, Pîchia ohmeri), Debaromyces,
Hansenula, Zygosaccharomyces ou Saccharomyces cerevisîae produisent de l'arabitol à partir de glucose.
Les domaines d'application des polyols sont extrêmement nombreux. Ils sont utilisés notamment pour la stabilisation des enzymes, en améliorant leur thermostabilité et leur stabilité dans les solvants aqueux ou organiques, pour la conservation par lyophilisation ou la cryoprotection, et pour l'encapsulation. Les polyols trouvent également des applications dans le domaine agroalimentaire compte tenu de leurs propriétés acariogènes et de leur moindre caloricité. Ils sont aussi utilisés en cosmétologie ou en pharmacie, notamment en ce qui concerne les soins cutanés, compte tenu de leur haut pouvoir émollient et grâce à leurs propriétés inhibitrices de croissance dues au fait qu'ils constituent des sources carbonées difficilement assimilables.
L'utilisation du ribitol a déjà été décrite dans certaines de ces applications, telles la stabilisation des enzymes comme l'alpha-amylase et la pullulanase. Son pouvoir acariogène a également été mentionné dans le brevet JP 4370095 au nom de KAO CORP.
Le procédé le plus couramment utilisé pour la production de ribitol est la biotransformation du ribose en ribitol par Candida polymorpha (Onishi et Suzuki, 1966, Agr. Biol. Chem., 30, 11, 1139-1144). Cependant, l'approvisionnement en ribose est difficile et son coût est élevé. Il serait donc souhaitable de disposer d'un procédé de production de ribitol à partir d'une matière première quantitativement et économiquement plus accessible.
Or, la Société Demanderesse a eu le mérite de mettre au point un procédé original de préparation de ribitol par voie directe, à partir d'une source carbonée facilement assimilable, par culture d'une souche de microorganismes génétiquement modifiée. Ce procédé permet l'obtention de ribitol à partir d'une source carbonée facilement assimilable avec un bon rendement.
Conformément au procédé selon l'invention, on utilise une voie de synthèse conduisant au ribulose, qui est lui-même transformé en ribitol. Or, dans un grand nombre de microorganismes, le ribulose est converti presque exclusivement en arabitol, le ribitol n'étant obtenu qu'en quantités minimes.
La Société Demanderesse a néanmoins réussi à mettre au point un procédé de préparation de ribitol dans lequel la voie métabolique de conversion du ribulose est essentiellement dirigée vers le ribitol. Ceci est obtenu, conformément à l'invention, en éliminant l'activité enzymatique de la ribulose réductase NADPH-spécifique. En conséquence, la conversion du ribulose en ribitol peut être favorisée, soit par l'activité ribulose réductase
NADH-spécifique homologue à la souche considérée, soit par transfert de l'activité ribulose réductase NADH-spécifique d'une souche la possédant, telles les levures du genre Yamadazyma. Dans ce dernier cas, la ribulose-réductase
NADH-spécifique est donc de nature exogène.
NADH-spécifique homologue à la souche considérée, soit par transfert de l'activité ribulose réductase NADH-spécifique d'une souche la possédant, telles les levures du genre Yamadazyma. Dans ce dernier cas, la ribulose-réductase
NADH-spécifique est donc de nature exogène.
Le procédé de préparation du ribitol selon l'invention est donc caractérisé par le fait que l'on cultive sur un milieu de fermentation contenant une source carbonée directement assimilable, une souche de microorganismes capable de générer du ribulose et possédant une ribulose réductase NADH-spécifique, soit homologue, soit de nature exogène, dans laquelle l'activité enzymatique de la ribulose réductase NADPHspécifique a été éliminée ou sensiblement réduite, et que l'on récupère le ribitol ainsi obtenu.
On entend par "sensiblement réduite", une expression d'une activité enzymatique non totalement réprimée, ce qui peut être effectué dans le cadre de la stratégie ARN antisens, par le contrôle de l'expression de ces antimessagers, par exemple, par l'utilisation d'un promoteur inductible.
Conformément au procédé de préparation de ribitol selon l'invention, la souche cultivée est capable de générer le ribulose à partir du ribulose-5-phosphate.
Ceci est notamment le cas pour la souche
Yamadazyma ohmeri (auparavant appelée Pi chia ohmeri). Les voies métaboliques qui conduisent à la production du ribitol dans cette souche ont été élaborées par la Société
Demanderesse et sont présentées à la Figure 1.
Yamadazyma ohmeri (auparavant appelée Pi chia ohmeri). Les voies métaboliques qui conduisent à la production du ribitol dans cette souche ont été élaborées par la Société
Demanderesse et sont présentées à la Figure 1.
La Société Demanderesse a montré qu'il existe deux autres voies qui consomment le ribulose-5-phosphate celle qui conduit à la production du ribose-5-phosphate, précurseur des acides nucléiques par la D-ribose-5phosphate isomérase (nO 4, Fig. 1), et celle qui génère le
D-xylulose-5-phosphate par la D-ribulose-5-phosphate-3épimérase (n" 5, Fig. 1).
D-xylulose-5-phosphate par la D-ribulose-5-phosphate-3épimérase (n" 5, Fig. 1).
Conformément au procédé selon l'invention, ces autres voies d'assimilation du ribulose-5-phosphate sont sensiblement réduites, favorisant ainsi la conversion du ribulose-5-phosphate essentiellement en ribulose qui est lui-même transformé en ribitol. Cela peut être réalisé, par exemple en réduisant sensiblement l'activité de la Dribose-5-phosphate-isomérase (n" 4, Fig. 1), la D ribulose-5-phosphate-3-épimérase (n" 5, Fig. 1), la transcétolase (n" 10, fig. 1) et/ou la kinase (n" 9, Fig.
1)
Selon un mode de réalisation du procédé selon l'invention, donc, ces autres voies d'assimilation du ribulose-5-phosphate sont sensiblement réduites.
Selon un mode de réalisation du procédé selon l'invention, donc, ces autres voies d'assimilation du ribulose-5-phosphate sont sensiblement réduites.
Conformément au procédé selon l'invention, la souche cultivée est choisie parmi les souches de levures osmotolérantes. De préférence, elle est choisie parmi les souches de microorganismes du genre Yamadazyma,
Debaromyces, Hansenula, Zygosaccharomyces et Saccharomyces. Plus préférentiellement encore, on utilise une souche de Yamadazyma ohmeri.
Debaromyces, Hansenula, Zygosaccharomyces et Saccharomyces. Plus préférentiellement encore, on utilise une souche de Yamadazyma ohmeri.
Le procédé selon l'invention est mis en oeuvre à une température comprise entre environ 25 et environ 400C, et de préférence entre environ 30 et environ 38"C.
Le pH utilisé dans le procédé selon l'invention est compris entre environ 3 et environ 7, et de préférence entre environ 5 et environ 6.
La teneur en source carbonée directement assimilable dans le milieu de fermentation est généralement comprise entre environ 100 et environ 600 g/l, et de préférence entre environ 150 et environ 400 g/l.
Bien entendu, la température, le pH et le milieu de fermentation sont choisis en fonction de la souche mise en oeuvre.
D'une manière quasi-générale, la souche mise en oeuvre dans le procédé conforme à l'invention produit du ribulose, dont de petites quantités ne seront pas converties en ribitol. Ce ribulose résiduel peut être facilement hydrogéné catalytiquement en un mélange équimoléculaire de ribitol et d'arabitol, ce qui permet d'augmenter le rendement en ribitol obtenu directement par fermentation.
L'hydrogénation d'un tel sucre s'effectue conformément aux règles de l'art qui conduisent par exemple à la production de sorbitol à partir du glucose.
On peut utiliser pour cette étape aussi bien des catalyseurs à base de ruthénium que des catalyseurs au
Nickel de Raney.
Nickel de Raney.
On préfère cependant utiliser des catalyseurs au
Nickel de Raney qui sont moins onéreux.
Nickel de Raney qui sont moins onéreux.
Dans la pratique, on utilise de 1 à 10 % en poids de catalyseur par rapport à la matière sèche de sucre soumis à l'hydrogénation. L'hydrogénation s'effectue de préférence sur des sirops dont la matière sèche est comprise entre 15 et 50 %, dans la pratique voisine de 30 à 45 %, sous une pression d'hydrogène comprise entre 20 et 200 bars. Elle peut être effectuée de manière continue ou discontinue.
Lorsque l'on opère de manière discontinue, la pression d'hydrogène utilisée est généralement comprise entre 30 et 60 bars et la température à laquelle se déroule l'hydrogénation est comprise entre 100 et 150 0C.
On veille aussi à maintenir le pH du milieu d'hydrogénation par l'addition de soude ou de carbonate de soude par exemple, mais sans dépasser un pH de 9,0. Cette manière de faire permet d'éviter l'apparition de produits de cracking ou d'isomérisation.
On arrête la réaction lorsque la teneur du milieu réactionnel en sucres réducteurs est devenue inférieure à 1 %, de préférence encore inférieure à 0,5 % et plus particulièrement inférieure à 0,1 %.
Après refroidissement du milieu réactionnel, on élimine le catalyseur par filtration et on déminéralise le sirop ainsi obtenu sur des résines cationiques et anioniques.
La récupération du ribitol à partir de ce mélange ribitol/arabitol est effectuée de manière connue en soi, soit par cristallisation fractionnée, soit par fractionnement chromatographique.
Conformément à un mode préférentiel du procédé selon l'invention, on procède à une hydrogénation catalytique du milieu de fermentation.
L'invention a également pour objet une souche de microorganismes capable de produire du ribitol par culture sur un milieu contenant une source carbonée directement assimilable. Cette souche est caractérisée par le fait qu'elle est capable de générer du ribulose, qu'elle possède une activité ribulose réductase NADH-spécifique, et que l'activité enzymatique de la ribulose réductase
NADPH-spécifique a été éliminée, ou sensiblement réduite, dans cette souche.
NADPH-spécifique a été éliminée, ou sensiblement réduite, dans cette souche.
La ribulose réductase NADH-spécifique dans la souche est soit homologue, soit de nature exogène.
Selon une variante de la souche selon l'invention, la souche est capable de générer le ribulose à partir du ribulose-5-phosphate.
De préférence, les voies d'assimilation du ribulose-5-phosphate autres que celle qui conduit au ribulose sont sensiblement réduites dans cette souche.
La souche de microorganismes productrice de ribitol conforme à l'invention est choisie parmi les souches de levures osmotolérantes. De préférence, cette souche peut être choisie parmi les souches de microorganismes du genre Yamadazyma, Debaromyces,
Hansenula, Zygosaccharomyces et Saccharomyces.
Hansenula, Zygosaccharomyces et Saccharomyces.
Plus préférentiellement encore, la souche conforme à l'invention est Yamadazyma ohmeri. Yamadazyma ohmeri (auparavant appelée Pi chia ohmeri, déposée auprès de l'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC 20209) est une levure osmotolérante dont le seuil de tolérance au glucose se situe à 500 g/l. En présence notamment de glucose, et quelle que soit la concentration,
Y. ohmeri produit du D-arabitol. La voie de biosynthèse du D-arabitol chez Y. ohmeri (décrite à la Figure 1) est similaire à celle de Zygosaccharomyces mellis et
Zygosaccharomyces rouxii. Le D-arabitol est produit par la réduction du D-ribulose par une ribulose réductase NADPHspécifique. Le D-ribulose provient de la déphosphorylation du ribulose-5-phosphate dont la richesse intracellulaire conditionne la production d'arabitol.
Y. ohmeri produit du D-arabitol. La voie de biosynthèse du D-arabitol chez Y. ohmeri (décrite à la Figure 1) est similaire à celle de Zygosaccharomyces mellis et
Zygosaccharomyces rouxii. Le D-arabitol est produit par la réduction du D-ribulose par une ribulose réductase NADPHspécifique. Le D-ribulose provient de la déphosphorylation du ribulose-5-phosphate dont la richesse intracellulaire conditionne la production d'arabitol.
Pour la mise en oeuvre du procédé de préparation de ribitol selon l'invention on prépare une souche modifiée.
Les modifications peuvent être réalisées par toute méthode connue en soi. Ainsi, on peut procéder à une modification génétique telle que la mutagénèse à l'aide d'ondes UV, ou à des ciblages génétiques par clonage des gènes directement impliqués dans les voies métaboliques.
Dans les exemples qui suivent, on procède tout d'abord au clonage de la ribulose réductase NADPHspécifique, puis à l'élimination de cette ribulose réductase du génome de Yamadazyma ohmeri et enfin à la mise en culture de la souche modifiée ainsi obtenue.
Les souches selon l'invention peuvent être mises en culture notamment dans des milieux contenant en plus d'une source carbonée directement assimilable, des facteurs nutritifs tels que l'extrait de levure, la liqueur de Corn Steep et des apports minéraux tels que le phosphate de potassium acide et le sulfate de magnésium.
L invention pourra être mieux comprise à l'aide des exemples non-limitatifs décrits ci-dessous.
Exemple 1: Clonage de la ribulose réductase NADPHspécifique
Une banque d'expression de Y. ohmeri a été réalisée dans le phage Xgt 11. Les plages de lyses obtenues ont été testées avec des anticorps contre la ribulose réductase NADPH-spécifique. Les inserts des clones positifs ont été isolés puis clonés dans des vecteurs Bluescript-SKs de la société Stratagene, afin de permettre leur séquençage.
Une banque d'expression de Y. ohmeri a été réalisée dans le phage Xgt 11. Les plages de lyses obtenues ont été testées avec des anticorps contre la ribulose réductase NADPH-spécifique. Les inserts des clones positifs ont été isolés puis clonés dans des vecteurs Bluescript-SKs de la société Stratagene, afin de permettre leur séquençage.
Des amorces ont été générées à partir des séquences nucléotidiques des ADN complémentaires obtenues, et ont été utilisées en réaction de PCR (réaction de polymérisation en chaine) sur l'ADN de la banque génomique obtenue, par la méthode décrite dans Current Protocols in
Molecular Biology, première édition, 1987, Wiley
Interscience.
Molecular Biology, première édition, 1987, Wiley
Interscience.
Deux clones positifs ont été isolés. Le séquençage des inserts a permis de définir une phase ouverte de lecture de 277 acides aminés dont les 20 premiers déduits de la séquence nucléotidique sont identiques à ceux déterminés par séquençage protéique de l'extrémité NH2terminale de l'enzyme purifiée. Ceci confirme que le gène isolé code bien pour la ribulose réductase NADPHspécifique.
Exemple 2: Elimination de la ribulose réductase NADPHspécifique
La méthode suivie pour l'élimination du gène codant pour l'activité ribulose réductase NADPH-spécifique est inspirée de Piredda et Gaillardin, 1994 Yeast 10: 1601 - 1612 et consiste en la méthode de "remplacement d'allèle" qui s'effectue en deux temps
- dans la souche de Yamadazyma ohmeri auxotrophe
pour la leucine (souche obtenue par mutagénèse
UV), intégration au locus chromosomique par
recombinaison homologue d'un plasmide portant le
gène de la ribulose réductase NADPH-spécifique
délété (par insertion dans la partie codante du
gène leu2)et le gène ura3,
- excision de ce plasmide par étalement des
transformants sur un milieu de culture
renfermant de l'acide 5-fluoro-orotique (crible
de sélection mis au point par Boeke et al.
La méthode suivie pour l'élimination du gène codant pour l'activité ribulose réductase NADPH-spécifique est inspirée de Piredda et Gaillardin, 1994 Yeast 10: 1601 - 1612 et consiste en la méthode de "remplacement d'allèle" qui s'effectue en deux temps
- dans la souche de Yamadazyma ohmeri auxotrophe
pour la leucine (souche obtenue par mutagénèse
UV), intégration au locus chromosomique par
recombinaison homologue d'un plasmide portant le
gène de la ribulose réductase NADPH-spécifique
délété (par insertion dans la partie codante du
gène leu2)et le gène ura3,
- excision de ce plasmide par étalement des
transformants sur un milieu de culture
renfermant de l'acide 5-fluoro-orotique (crible
de sélection mis au point par Boeke et al.
1984).
Les transformants obtenus ont été analysés par la technique de Southern en utilisant des sondes ADN spécifiques. L'ADN génomique des clones transformants, extrait et digéré par des enzymes de restriction adéquates, a été analysé avec une sonde ADN spécifique du gène de la ribulose réductase NADPH-spécifique. Neuf des dix clones testés ont montré le profil attendu, caractéristique de l'intégration du plasmide au site chromosomique. Sur les clones résultant du passage en acide 5-fluoro-orotique, ceux présentant en hybridation moléculaire une bande caractéristique de la présence du gène leu 2 dans la copie tronquée du gène de la ribulose réductase NADPH-spécifique, ont été isolés et analysés.
Les conditions de révélation par la technique de
Southern sont décrites ci-dessous.
Southern sont décrites ci-dessous.
Le transfert d'ADN sur membrane Hybond N+ à partir d'un gel d'agarose est effectué sous vide en utilisant un appareil Vacugène.
La dépurination de l'ADN est réalisée en plaçant le gel pendant 20 minutes dans une solution d'acide chlorhydrique (250mM) . Le gel est ensuite immergé dans une solution de 1M NaOH, 1.5M NaCl pendant 15 minutes afin de dénaturer l'ADN. La neutralisation est ensuite effectuée par immersion du gel pendant 15 minutes dans une solution 1M Tris-HCl pH 7.2, 1.5M NaCl.
Le transfert est effectué sous vide pendant 45 minutes en présence de tampon 20xSSC (3M Nazi, 0.3M trisodium citrate).
L'ADN est fixé sur la membrane par une irradiation aux rayons ultraviolets pendant 10 minutes suivie d'une cuisson sous vide de 2 heures à 80"C.
Les membranes sont ensuite préhybridées pendant 3 heures à 42"C dans une solution de 25 % formamide, 5xSSC,SxDenhardt (une solution 100xDenhardt est 2 % (p/v)
BSA, 2 % (p/v) Ficoll, 2 % (p/v) polyvinylpyrrolidone, 0.5 (p/v) SDS), 50mM tampon phosphate pH6, 150 pg/ml d'ADN de sperme de hareng soniqué et 0.3 % SDS.
BSA, 2 % (p/v) Ficoll, 2 % (p/v) polyvinylpyrrolidone, 0.5 (p/v) SDS), 50mM tampon phosphate pH6, 150 pg/ml d'ADN de sperme de hareng soniqué et 0.3 % SDS.
L'hybridation avec la sonde ADN préalablement marquée (technique de marquage "random labelling" avec de l'ATP-cxP32) est effectuée pendant une nuit à 420C dans la solution de préhybridation.
Les membranes sont ensuite rincées pendant 10 minutes à 42"C dans une solution 2xSSC, 0.1 % SDS, puis pendant 10 minutes à 52"C dans la même solution, et enfin pendant 30 minutes à 62"C dans une solution 0.1xSSC, 0.1 %
SDS. Elles sont ensuite mises en autoradiographie à -80"C.
SDS. Elles sont ensuite mises en autoradiographie à -80"C.
Une des souches recombinées, dont le profil était conforme, a été appelée RR-. Aucune activité ribuloseréductase NADPH-dépendante n'a été détectée dans les extraits acellulaires de la souche RR-.
Le dosage des activités enzymatiques est réalisé par incubation des extraits bruts acellulaires en présence de ribulose et de cofacteur NADPH. Le suivi de la consommation du cofacteur réduit (variation de l'absorbance à 340 nm) donne une preuve indirecte de la présence ou de l'absence de ladite activité. En complément d'analyse, la nature des métabolites produits dans le surnageant de culture en cours et à la fin de la fermentation est déterminée par chromatographie en phase gazeuse.
Exemple 3: Production de ribitol par la mise en culture de la souche RR
La souche recombinée obtenue à l'exemple 2 a été mise en culture sur un milieu contenant du glucose (100 g/l), de l'extrait de levure (3 g/l), KH2PO4 (2 g/l) et
MgSO4 (1 g/l).
La souche recombinée obtenue à l'exemple 2 a été mise en culture sur un milieu contenant du glucose (100 g/l), de l'extrait de levure (3 g/l), KH2PO4 (2 g/l) et
MgSO4 (1 g/l).
Les productions ont été réalisées en erlenmeyers et fermenteurs de 2 litres.
La production de ribitol s'est élevée à 30 g/l, soit un rendement de 30 % en poids par rapport à la quantité de glucose consommée.
Le seul coproduit est le ribulose, dans une proportion de 8 %.
En fin de fermentation le moût a été filtré, déminéralisé, concentré à 40 % de matière sèche, puis hydrogéné en présence de 5 % de Nickel de Raney à une pression de 50 bars et à une température de 50"C durant 3 heures.
Le sirop hydrogéné obtenu contenait 89 % de ribitol et 10 % d'arabitol.
Exemple 4 : Production de ribitol par la mise en culture de la souche RR
La souche obtenue dans l'exemple 2 a été mise en culture sur un milieu contenant du glucose (200 g/l), de la liqueur de Corn Steep (40 g/l) et MgSO4 (2 g/l).
La souche obtenue dans l'exemple 2 a été mise en culture sur un milieu contenant du glucose (200 g/l), de la liqueur de Corn Steep (40 g/l) et MgSO4 (2 g/l).
Le ribitol a été obtenu avec un rendement de 28% en poids par rapport à la quantité de glucose consommée.
Le seul coproduit est le ribulose dans une proportion de 4 à 5 %.
Exemple 5: Modification génétique de la souche RR pour obtenir la souche RR-lig3.5
La méthode de déletion de l'activité ribulose réductase NADPH-spécifique par remplacement d'allèles conduit obligatoirement à une souche auxotrophe pour l'uracile, condition sine qua non de la survie sur milieu enrichi en acide 5-fluoro-orotique.
La méthode de déletion de l'activité ribulose réductase NADPH-spécifique par remplacement d'allèles conduit obligatoirement à une souche auxotrophe pour l'uracile, condition sine qua non de la survie sur milieu enrichi en acide 5-fluoro-orotique.
Dans le cas le plus préférentiel, la souche
Yamadazyma ohmeri délétée pour ces deux activités (ribulose réductase NADPH-spécifique et URA 3) peut présenter un avantage en croissance et stabilité si on lui réattribue le gène ura 3 qu'elle a perdu.
Yamadazyma ohmeri délétée pour ces deux activités (ribulose réductase NADPH-spécifique et URA 3) peut présenter un avantage en croissance et stabilité si on lui réattribue le gène ura 3 qu'elle a perdu.
Il a été montré que l'apport dudit gène par un vecteur plasmidique réplicatif (lig3.5) peut suffire.
Toute autre méthode de complémentation génique telle que décrite dans l'art peut également être utilisée.
La souche résultante RR-lig3.5 portera donc le gène URA 3 mais non pas celui codant pour la ribulose réductase
NADPH-spécifique.
NADPH-spécifique.
Dans ce cas, la fermentation de la souche RR- lig3.5 conduit à une productivité en ribitol meilleure que celle décrite dans les exemples 3 et 4.
Claims (16)
1. Procédé de préparation de ribitol, caractérisé par le fait que l'on cultive sur un milieu de fermentation contenant une source de carbone directement assimilable, une souche de microorganismes capable de générer du ribulose et possédant une ribulose réductase NADHspécifique, dans laquelle l'activité enzymatique de la ribulose réductase NADPH-spécifique a été éliminée ou sensiblement réduite, et que l'on récupère le ribitol ainsi obtenu.
2. Procédé de préparation de ribitol selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la ribulose réductase NADH-spécifique est de nature exogène.
3. Procédé de préparation de ribitol selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que la souche génère le ribulose à partir du ribulose-5-phosphate.
4. Procédé de préparation de ribitol selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que dans la souche les voies d' assimilation du ribulose-5-phosphate sont sensiblement réduites.
5. Procédé de préparation de ribitol selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que la souche est choisie parmi les souches de levures osmotolérantes.
6. Procédé de préparation de ribitol selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que la souche est choisie parmi les souches de microorganismes du genre Yamadazyma, Debaromyces,
Hansenula, Zygosaccharomyces et Saccharomyces.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que la souche est une souche de Yamadazyma ohmeri.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que l'on met en oeuvre le procédé à une température comprise entre environ 25 et environ 400C, et de préférence entre environ 30 et environ 38"C, à un pH compris entre environ 3 et environ 7, et de préférence entre environ 5 et environ 6, et à une teneur en source carbonée directement assimilable dans le milieu de fermentation comprise entre environ 100 et environ 600 g/l, et de préférence entre environ 150 et environ 400 g/l.
9. Procédé de préparation de ribitol selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé par le fait que le milieu de fermentation est soumis à une hydrogénation catalytique.
10. Souche de microorganismes capable de produire du ribitol par culture sur un milieu contenant une source carbonée directement assimilable, caractérisée par le fait qu'elle est constituée d'une souche capable de générer du ribulose et possédant une activité ribulose réductase NADH-spécifique, dans laquelle l'activité enzymatique de la ribulose réductase NADPH-spécifique a été éliminée ou sensiblement réduite.
11. Souche de microorganismes capable de produire du ribitol par culture sur un milieu contenant une source carbonée directement assimilable selon la revendication 10, caractérisée par le fait que dans la souche la ribulose réductase NADH-spécifique est de nature exogène.
12. Souche de microorganismes capable de produire du ribitol par culture sur un milieu contenant une source carbonée directement assimilable, selon l'une ou l'autre des revendications 10 et 11, caractérisée par le fait qu'elle génère le ribulose à partir du ribulose-5phosphate.
13. Souche de microorganismes capable de produire du ribitol par culture sur un milieu contenant une source carbonée directement assimilable selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisée par le fait que dans la souche les voies d'assimilation du ribulose-5-phosphate sont sensiblement réduites.
14. Souche de microorganismes capable de produire du ribitol par culture sur un milieu contenant une source carbonée directement assimilable, selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisée par le fait que ladite souche est choisie parmi les souches de levures osmotolérantes.
15. Souche de microorganismes capable de produire du ribitol par culture sur un milieu contenant une source carbonée directement assimilable selon l'une quelconque des revendications 10 à 14, caractérisée par le fait que ladite souche est choisie parmi les souches de microorganismes du genre Yamadazyma, Debaromyces,
Hansenula, Zygosaccharomyces et Saccharomyces.
16. Souche de microorganismes capable de produire du ribitol par culture sur un milieu contenant une source carbonée directement assimilable selon l'une quelconque des revendications 10 à 15, caractérisée par le fait que ladite souche est une souche de Yamadazyma ohmeri.
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| US7226761B2 (en) | 1992-11-05 | 2007-06-05 | Danisco Sweeteners Oy | Manufacture of five-carbon sugars and sugar alcohols |
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Effective date: 20091231 |