FR2762013A1 - Systemes de detection d'hybridation d'acides nucleiques, leur procede de preparation et leurs utilisations - Google Patents
Systemes de detection d'hybridation d'acides nucleiques, leur procede de preparation et leurs utilisations Download PDFInfo
- Publication number
- FR2762013A1 FR2762013A1 FR9704328A FR9704328A FR2762013A1 FR 2762013 A1 FR2762013 A1 FR 2762013A1 FR 9704328 A FR9704328 A FR 9704328A FR 9704328 A FR9704328 A FR 9704328A FR 2762013 A1 FR2762013 A1 FR 2762013A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- domain
- primer
- hybridization
- sequence
- hybridization detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
- Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
- Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
L'Invention est relative à des systèmes de détection d'hybridation d'acides nucléiques, constitués par : - un domaine de fixation A constitué par un polynucléotide simple-brin ; - un domaine intermédiaire B, constitué par au moins un synthon d'arrêt ; et- un domaine de visualisation C, constitué par un polynucléotide double-brin, dans lequel est incorporé au moins un nucléotide marqué constituant un moyen de détection.Ces systèmes permettent l'amplification du signal d'hybridation de sondes d'acides nucléiques sur des séquences cibles.
Description
SYSTEMES DE DETECTION D'HYBRIDATION D'ACIDES NUCLEIQUES,
LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET LEURS UTILISATIONS.
LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET LEURS UTILISATIONS.
La présente Invention est relative à des moyens de détection de l'hybridation d'acides nucléiques, utilisables en particulier pour le diagnostic.
Les techniques d'identification de séquences d'ARN ou d'ADN (séquences cibles) dans un échantillon mettent en oeuvre l'hybridation de la séquence cible avec une sonde marquée, et la détection du duplex formé, après élimination de la sonde non-hybridée.
Ces techniques sont couramment utilisées en particulier pour le diagnostic de pathologies virales ou infectieuses, pour la recherche médicale ou génétique, l'identification de clones, l'analyse de gènes transcrits, etc.
Deux types de sondes sont utilisées, les sondes dites longues (généralement de taille supérieure à 100 bases) et les sondes courtes, de taille variant entre 10 et 30 bases de long. Les sondes les plus couramment utilisées en diagnostic médical sont des oligonucléotides de synthèse conjugués à un marqueur, soit par attachement direct à ce marqueur, soit par conjugaison à un ligand dans ce dernier cas, la détection s'effectue par l'intermédiaire d'un marqueur fixé sur ce ligand.
On peut utiliser des marqueurs radioactifs ou froids.
De nombreuses techniques de marquage sont décrites par exemple par SAMBROOK et al., [Molecular
Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]. Ces méthodes incluent par exemple, dans le cas de marqueurs radioactifs, le marquage en 5' d'oligonucléotides de synthèse par l'enzyme polynucléotide kinase avec du i2p
ATP, ou encore l'incorporation de dCTP ou dATP radioactif lors du marquage par translation de coupure (nicktranslation).
Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]. Ces méthodes incluent par exemple, dans le cas de marqueurs radioactifs, le marquage en 5' d'oligonucléotides de synthèse par l'enzyme polynucléotide kinase avec du i2p
ATP, ou encore l'incorporation de dCTP ou dATP radioactif lors du marquage par translation de coupure (nicktranslation).
A titre d'exemple de marqueurs nonradioactifs, pouvant être incorporés par voie chimique dans des oligonucléotides de synthèse (Demande PCT WO 89/12462), on citera en particulier la biotine ; Des analogues biotinylés de l'UTP peuvent également être incorporés par translation de coupure dans des ADN double-brin.
La biotine est généralement mise en évidence par l'intermédiaire de sa liaison à l'avidine, qui sert elle-même de support d'attachement pour des molécules fluorescentes, des enzymes ou d'autres composés détectables.
Dans d'autres systèmes de marquage nonradioactif, des haptènes (groupe dinitrophényle, digoxigénine) remplacent la biotine, et des anticorps spécifiques marqués servent de révélateurs au système.
La sensibilité des essais d'hybridation moléculaire est un facteur important qui est souvent limitant dans l'application des tests de diagnostic en biologie moléculaire.
La sensibilité d'un essai dépend directement du marquage servant à révéler la sonde hybridée. Un des moyens d'améliorer la sensibilité d'un essai est d'amplifier le signal en augmentant le nombre de marqueurs incorporés dans la sonde, afin d'obtenir des sondes dites polymarquées .
Dans ce but, il a par exemple été proposé d'utiliser l'enzyme terminal-transférase, qui est capable d'allonger une chaîne ADN simple-brin par addition à son extrémité 3' d'analogues de nucléotides, par exemple de nucléotides biotinylés. L'inconvénient principal de cette méthode réside dans le fait que le nombre de nucléotides ajoutés par l'enzyme à l'extrémité de la chaîne ADN simple-brin est aléatoire. Il en résulte un mélange de produits de différentes longueurs, ce qui rend le marquage difficilement reproductible, et produit des sondes hétérogènes, difficiles à standardiser et donc non-adaptées au diagnostic médical.
COLLINS (Demande EP 204 510) propose une variante dans laquelle la sonde est allongée par une queue homopolymérique (poly A) en utilisant l'enzyme terminal-transférase. Le marqueur est alors constitué d'un homopolymère (poly T) dans lequel sont incorporées des molécules détectables. Ce système ne permet toutefois pas d'éliminer complètement les inconvénients résultant de l'impossibilité de contrôler l'action de l'enzyme.
Il a également été proposé d'amplifier le signal en d'utilisant des sondes oligonucléotidiques polymarquées ramifiées, ou bien reliées entre elles par des "ponts" polynucléotidiques s'hybridant à leurs extrémités, comme décrit respectivement dans les Demandes
EP 292 128 et EP 450 594, au nom de SEGEV.
EP 292 128 et EP 450 594, au nom de SEGEV.
Le Brevet US 4,882,269 décrit un système dans lequel des sondes secondaires polymarquées s'hybrident sur plusieurs sites d'une sonde primaire.
La Demande EP 0317 077 ainsi que la Demande
PCT WO 92/02526 décrivent un système dans lequel les sondes secondaires sont constituées par des constructions polynucléotidiques polymarquées en forme de peigne. Ces systèmes présentent l'inconvénient de nécessiter la synthèse de nombreux oligonucléotides différents, ainsi que la mise en oeuvre d'étapes d'hybridation et/ou de ligation pour former les constructions finales. En outre, il est difficile d'obtenir des produits finaux homogènes dans leurs caractéristiques, et leur purification est délicate.
PCT WO 92/02526 décrivent un système dans lequel les sondes secondaires sont constituées par des constructions polynucléotidiques polymarquées en forme de peigne. Ces systèmes présentent l'inconvénient de nécessiter la synthèse de nombreux oligonucléotides différents, ainsi que la mise en oeuvre d'étapes d'hybridation et/ou de ligation pour former les constructions finales. En outre, il est difficile d'obtenir des produits finaux homogènes dans leurs caractéristiques, et leur purification est délicate.
La présente Invention a pour but de proposer un système permettant l'amplification du signal d'hybridation, dépourvu des inconvénients mentionnés cidessus, et simple à obtenir, à purifier et à utiliser.
La présente invention a pour objet un système de détection d'hybridation d'acides nucléiques permettant la détection d'une séquence cible, caractérisé en ce qu'il est constitué par
- un domaine de fixation A, constitué par un polynucléotide simple-brin
- un domaine intermédiaire B, constitué par au moins un synthon d'arrêt ; et
- un domaine de visualisation C, constitué par un polynucléotide double-brin, dans lequel est incorporé au moins un nucléotide marqué constituant un moyen de détection.
- un domaine de fixation A, constitué par un polynucléotide simple-brin
- un domaine intermédiaire B, constitué par au moins un synthon d'arrêt ; et
- un domaine de visualisation C, constitué par un polynucléotide double-brin, dans lequel est incorporé au moins un nucléotide marqué constituant un moyen de détection.
Des systèmes de détection d'hybridation conformes à l'invention sont schématisés sur la Figure 1.
La taille du domaine de fixation A est avantageusement comprise entre 8 et 40 nucléotides de long, préférentiellement 15 à 25 nucléotides. Ce domaine
A se fixe à la séquence cible à détecter, soit par hybridation directe, soit par l'intermédiaire d'au moins un adaptateur ; on entend par adaptateur une molécule d'acide nucléique comprenant au moins une séquence simple-brin complémentaire de la séquence cible à détecter et au moins une séquence simple-brin en partie complémentaire du domaine A.
A se fixe à la séquence cible à détecter, soit par hybridation directe, soit par l'intermédiaire d'au moins un adaptateur ; on entend par adaptateur une molécule d'acide nucléique comprenant au moins une séquence simple-brin complémentaire de la séquence cible à détecter et au moins une séquence simple-brin en partie complémentaire du domaine A.
On entend par synthon une molécule (analogue de nucléotide ou autre) possédant la capacité d'être incorporée dans un polynucléotide de synthèse.
Le synthon d'arrêt du domaine B utilisé dans le cadre de la présente invention, est un synthon qui possède en outre la propriété de provoquer un arrêt de la polymérase lorsqu'il est rencontré sur le brin matrice lors d'une réaction de copie ou d'élongation d'un polynucléotide. Ceci permet l'obtention de systèmes de détection d'hybridation conformes à l'invention, par le procédé qui sera décrit plus loin.
Des synthons utilisables comme synthons d'arrêt sont par exemple choisis parmi les alcanes diol, ou tout autre composé tels que ceux décrits par exemple par WILK et al. [Nucleic Acids Res., 18, pp. 2065-2068, (1990)], par KUBAREVA et al. [Nucleic Acids Res., 20, pp.
4533-4538, (1992)], par NEWTON et al. [Nucleic Acids
Res., 21, pp. 1155-1162, (1993)], ainsi que dans la
Demande EP 416 817 au nom de IMPERIAL CHEMICAL INDUSTRIES
PLC.
Res., 21, pp. 1155-1162, (1993)], ainsi que dans la
Demande EP 416 817 au nom de IMPERIAL CHEMICAL INDUSTRIES
PLC.
Les moyens de détection incorporés dans le domaine C constituent un amplificateur de signal permettant la visualisation du système de détection d'hybridation. Des moyens de détection utilisables dans le cadre de la présente invention sont, de manière générale les marqueurs, connus en eux-mêmes, classiquement utilisés pour marquer les sondes d'acide nucléique en vue de permettre leur visualisation. Il s'agit en particulier de nucléotides ou d'analogues de nucléotides, pouvant être incorporés par une polymérase dans une chaîne oligonucléotidique, et pouvant être marqués de manière à être détectés soit directement, par exemple dans le cas d'un marquage radioactif ou par une molécule fluorescente, soit indirectement, par exemple dans le cas de ligands, (tels que la biotine ou un haptène), révélés par l'intermédiaire de la fixation de molécules marquées (telles que lavidine ou un anticorps). Ils peuvent également être introduits dans la chaîne polynucléotidique sous forme de précurseurs de marquage destinés à être modifiés ultérieurement afin de produire la molécule émettant le signal de visualisation.
Avantageusement, au moins 1/50, de préférence au moins 1/10, et de manière tout à fait préférée au moins 1/5, des monomères constitutifs du domaine doublebrin C des systèmes de détection d'hybridation conformes à l'invention, sont des nucléotides ou analogues de nucléotides marqués, tels que définis ci-dessus. Ces monomères marqués peuvent être incorporés dans un seul des brins du domaine C ; pour obtenir un marquage plus important et un signal plus élevé, on préférera généralement les incorporer dans chacun des deux brins.
Le niveau du signal généré par le système de détection d'hybridation dépend également de la taille du domaine double-brin C ; avantageusement , celle-ci est comprise entre 0,1 et 50 kb, et préférentiellement entre 1 et 10 kb.
En revanche, la séquence du domaine doublebrin C n'est pas primordiale, dans la mesure où ce polynucléotide a pour seule fonction de permettre la visualisation du système de détection d'hybridation, grâce aux nucléotides marqués qui y sont incorporés.
Préférentiellement, les systèmes de détection d'hybridation conformes à l'invention sont obtenus en incorporant au moins un nucléotide ou analogue de nucléotide marqué, tel que défini ci-dessus, par extension enzymatique d'au moins une amorce contenant au moins un synthon d'arrêt tel que défini ci-dessus.
L'invention englobe également un procédé d'obtention des systèmes de détection d'hybridation conformes à l'invention, dans lequel l'on effectue la synthèse d'au moins l'un des brins du domaine C à laide d'une polymérase dans un mélange réactionnel approprié, caractérisé en ce que tout ou partie d'au moins l'un des nucléotides triphosphate dudit mélange réactionnel est remplacé par l'un de ses dérivés marqués, et en ce qu'il comprend au moins une étape a) au cours de laquelle on effectue l'élongation par polymérase, en présence d'un brin matrice, d'une amorce P' comprenant, de 5' en 3', un domaine A et un domaine B tels que définis ci-dessus, et un domaine X constitué par une séquence capable de s'hybrider audit brin matrice pour amorcer la polymérisation.
L'amorce P' est schématisée sur la Figure 2.
Dans ces conditions, les dérivés marqués de nucléotides sont incorporés par la polymérase dans le produit d'élongation d'amorce néo-synthétisé, à la place de tout ou partie des nucléotides correspondants.
On peut ainsi obtenir un marquage important du domaine C. Par exemple, dans le cas théorique d'un fragment de 10 kb, (c'est-à-dire 20 000 nucléotides si le fragment est double brin), si l'on remplace 1/3 des thymidines triphosphates par un analogue marqué, et en considérant que l'on dispose d'une séquence à amplifier dans laquelle les 4 bases se trouvent en proportions égales, on obtient un fragment dans lequel sont incorporés plus de 800 monomères marqués/brin.
La matrice à partir de laquelle on obtient le domaine C peut avoir une séquence quelconque, dénommée ci-après séquence neutre , du fait qu'elle est en particulier totalement indépendante des séquences cibles que l'on envisage de détecter à l'aide des systèmes de détection d'hybridation conformes à l'invention. Pour améliorer le rendement de la réaction, en particulier dans le cas où l'on met en oeuvre une réaction d'amplification en chaîne par polymérase, on choisira de préférence, une séquence riche en bases A et T, ce type de séquence s'amplifiant généralement mieux que les séquences riches en G et C.
Le domaine A en 5' de l'amorce P' doit être choisi de façon à ne pas interférer dans l'élongation de la séquence neutre ; en particulier, il ne doit pas s'hybrider de façon stable avec celle-ci (ce qui peut être vérifié au préalable grâce à des logiciels d'analyse d'homologie de séquence). Ce domaine ne doit pas non plus présenter de complémentarité de séquence avec le domaine
X de la même amorce P', ou avec une quelconque région de l'amorce P".
X de la même amorce P', ou avec une quelconque région de l'amorce P".
Selon un mode de mise en oeuvre préféré, le procédé conforme à l'invention comprend en outre une étape b) au cours de laquelle on effectue l'élongation par polymérase, en présence d'un brin matrice constitué par le produit d'élongation de l'amorce P', d'une seconde amorce P" comprenant une séquence capable de s'hybrider audit brin matrice pour amorcer la polymérisation.
Dans ce cas, l'élongation de l'amorce P" se poursuit jusqu'à ce que la polymérase rencontre un synthon d'arrêt présent dans le produit d'élongation de l'amorce P' ; l'hybridation des produits d'élongation ainsi obtenus génère un système de détection d'hybridation conforme à l'Invention, possédant les domaines A, B, et C tels que définis ci-dessus.
La position de l'amorce P" et de la partie X de l'amorce P sur leurs matrices respectives conditionne la taille du domaine C. Celle-ci peut être très importante. En effet, différentes techniques connues de l'homme du métier permettent d'obtenir facilement et avec de bons rendements, des fragments d'élongation de plusieurs dizaines de kilobases [BARNES, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 91, p. 2216-2220 (1994); CHENG et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, p. 5695-5699, (1994)].
L'amorce P" comprend au moins la séquence capable de s'hybrider audit brin matrice pour amorcer la polymérisation; toutefois, elle peut comprendre en outre, un domaine A et un domaine B tels que définis ci-dessus, et donc avoir la même structure que l'amorce P'. Dans ce cas, les domaines A et B des amorces P et P" peuvent être identiques ou différents.
Avantageusement, le procédé conforme à l'invention comprend en outre une étape c) au cours de laquelle on effectue l'élongation par polymérase de l'amorce P', en présence d'un brin matrice constitué par le produit d'élongation de l'amorce P".
Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, les étapes b) et c) sont répétées jusqu'à obtention de la quantité souhaitée de systèmes de détection d'hybridation conformes à l'invention. Dans ce but, le procédé conforme à l'invention pourra être mis en oeuvre dans les conditions usuelles des méthodes connues d'amplification en chaîne par polymérase (PCR).
La publication de NEWTON et al., et la Demande
EP 416 817, citées ci-dessus, décrivent l'utilisation de synthons d'arrêt dans des amorces de PCR. Ces amorces comprennent une séquence nucléotidique capable de s'hybrider à une séquence cible, et une queue polynucléotidique, séparées par un synthon d'arrêt.
EP 416 817, citées ci-dessus, décrivent l'utilisation de synthons d'arrêt dans des amorces de PCR. Ces amorces comprennent une séquence nucléotidique capable de s'hybrider à une séquence cible, et une queue polynucléotidique, séparées par un synthon d'arrêt.
Lorsqu'une amorce de ce type est utilisée pour l'amplification d'une séquence cible dans une réaction d'amplification en chaîne par polymérase, la queue polynucléotidique n'est pas copiée, et le produit d'amplification final se présente donc sous forme d'une copie double-brin de la séquence cible, pourvue d'une queue polynucléotidique simple-brin. Cette queue polynucléotidique peut être utilisée pour fixer la séquence cible amplifiée sur un support solide, ou pour la visualiser, par l'intermédiaire d'une sonde marquée complémentaire de ladite queue.
Cependant, le procédé décrit dans ces documents, qui a pour but l'amplification d'une séquence cible spécifique, tout en la dotant de moyens de capture sur un support solide, et/ou de moyens permettant son hybridation avec une sonde par l'intermédiaire de laquelle on pourra la détecter, aboutit à des produits qui sont très différents par leur destination, et de ce fait par leur constitution, des systèmes de détection d'hybridation conformes à l'invention. En particulier, il n'est pas envisagé, dans ces documents, d'incorporer des moyens de détection, tels que des oligonucléotides marqués, dans la portion double-brin résultant de l'amplification.
Dans le cadre de la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, les problèmes de fidélité des ADN polymérases ne se posent pas, dans la mesure où le degré d'homologie entre le domaine C et la séquence neutre utilisée comme matrice initiale ne joue aucun rôle, et où seuls importent la longueur du domaine C et le nombre de marqueurs qui peuvent y être incorporés.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré, on peut utiliser dans le procédé conforme à l'invention plusieurs types d'amorces P' différant entre elles par la séquence du domaine A, et identiques entre elles en ce qui concerne la séquence du domaine X.
La présente invention a également pour objet un nécessaire pour la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une amorce P' telle que définie ci-dessus, un polynucléotide utilisable comme matrice pour l'élongation de ladite amorce, et un nucléotide triphosphate marqué.
Avantageusement ledit nécessaire comprend en outre une amorce P".
Pour purifier les systèmes de détection d'hybridation conformes à l'invention à l'issue de la réaction enzymatique ayant permis leur obtention, de nombreuses méthodes de purification connues en ellesmêmes sont utilisables. Ces méthodes permettent l'élimination des nucléotides triphosphates et des amorces non incorporés et de l'enzyme résiduelle. Les fragments recherchés sont récupérés avec de bons rendements. Ces méthodes sont applicables directement sur le produit de la réaction enzymatique, ou bien après son isolation après migration sur gel d'électrophorèse.
La qualité des fragments d'amplification obtenus est facilement contrôlable par électrophorèse sur gel d'agarose. Si de bonnes conditions d'amplification sont sélectionnées, une seule bande est observée sur gel.
Le produit purifié est quantifiable par spectrométrie W ou bien par dosage du marqueur incorporé.
La mise en oeuvre du procédé conforme à l'Invention permet d'obtenir de façon simple et reproductible, des systèmes de détection d'hybridation marqués ayant des caractéristiques homogènes, qui sont faciles à quantifier et à purifier par des méthodes classiques, et qui ont une très haute activité spécifique, supérieure à celle des sondes marquées obtenues habituellement par translation de coupure.
En outre, les systèmes de détection d'hybridation conformes à l'invention présentent les avantages suivants
- ils possèdent une cinétique d'hybridation très rapide, correspondant à peu près à la cinétique d'hybridation des oligonucléotides ; comme dans le cas des oligonucléotides, cette cinétique est essentiellement liée à leur concentration dans le milieu et par rapport à la séquence cible ; ceci permet de définir facilement les conditions d'hybridation et de lavage nécessaires à la spécificité d'hybridation des systèmes de détection d'hybridation conformes à l'invention.
- ils possèdent une cinétique d'hybridation très rapide, correspondant à peu près à la cinétique d'hybridation des oligonucléotides ; comme dans le cas des oligonucléotides, cette cinétique est essentiellement liée à leur concentration dans le milieu et par rapport à la séquence cible ; ceci permet de définir facilement les conditions d'hybridation et de lavage nécessaires à la spécificité d'hybridation des systèmes de détection d'hybridation conformes à l'invention.
- le domaine de reconnaissance C étant sous forme double-brin, il ne présente pas de risques d'hybridation croisée avec la séquence cible et donc, il n'y a pas de problème de bruit de fond.
- les molécules incorporées dans ce domaine de reconnaissance et servant à la révélation sont suffisamment espacées pour qu'il n'y ait pas d'encombrement stérique gênant éventuellement leur liaison avec un ligand.
Les systèmes de détection d'hybridation conformes à l'invention peuvent être utilisés pour la détection d'une ou plusieurs séquences cibles dans un échantillon biologique.
Pour détecter simultanément plusieurs séquences cibles, on peut utiliser simultanément plusieurs systèmes de détection d'hybridation, différant entre eux par la séquence du domaine A. On peut également utiliser des systèmes de détection d'hybridation différant aussi entre eux par la séquence du domaine C et/ou par la nature des nucléotides marqués incorporés dans ledit domaine.
La ou les séquence(s) cible(s) à détecter peuvent être fixées sur un support solide.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ledit support solide comprend au moins une électrode. La ou les séquence(s) cible(s) peuvent être fixées sur cette électrode en utilisant par exemple les méthodes décrites dans la Demande PCT
WO/94/22889. Avantageusement, ledit support solide est constitué par une pluralité d'électrodes, qui sont de préférence des microélectrodes, et dont au moins 2 portent chacune une séquence cible différente.
WO/94/22889. Avantageusement, ledit support solide est constitué par une pluralité d'électrodes, qui sont de préférence des microélectrodes, et dont au moins 2 portent chacune une séquence cible différente.
Les systèmes de détection d'hybridation conformes à l'invention peuvent être employés directement pour la reconnaissance d'une séquence cible ; dans ce cas, le domaine A sera choisi de manière à ce que sa séquence soit complémentaire de la séquence cible à détecter.
Avantageusement, ou pourra utiliser également un adaptateur intermédiaire d'hybridation, tel que défini ci-dessus. Cet adaptateur est constitué par au moins un oligonucléotide de longueur comprise entre 15 et 50 bases, qui peut aisément être synthétisé automatiquement sur synthétiseur d'ADN.
Dans ce cas, on peut utiliser pour détecter différentes séquences cibles, le même système de détection d'hybridation, qui peut être préparé en grande quantité et stockée à -200C sans perte de ses propriétés.
La présente Invention sera mieux comprise à laide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention et d'utilisation de systèmes de détection d'hybridation conformes à l'Invention.
I1 doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : Obtention de systèmes de détection d'hybridation conformes à l'invention.
A) Obtention d'un système de détection d'hybridation à partir d'un fragment de 1010 paires de bases d'ADN humain.
- Amorce P' J15 (stop) 2H12170: 5' ACC ATC GCT TCC AGA (STOP)2 GCA AGG CAG GAG CTG CAG GA 3' - Amorce P"
H13180: 5' GAT TGC CCT AGA GTG CAG TG 3'
Les conditions d'amplification ont d'abord été mises au point avec des amorces non modifiées, c'est-àdire ne comportant pas les domaines A et B.
H13180: 5' GAT TGC CCT AGA GTG CAG TG 3'
Les conditions d'amplification ont d'abord été mises au point avec des amorces non modifiées, c'est-àdire ne comportant pas les domaines A et B.
L'amplification a ensuite été reproduite avec l'amorce P' modifiée comportant les trois domaines A, B et C.
L'amplification est réalisée sur 0,1 g d'ADN génomique humain (CLONTECH), en présence de 10 pmoles de chacune des amorces, 2,5 unités de Taq polymérase (CIS
BIO INTERNATIONAL), 5 l de tampon 10 X (Tris/HC1 100 mM, pH 9 ; KC1 500 mM ; MgC12 15 mM ; Triton X100 1 %, BSA 2 mg/ml) CIS BIO INTERNATIONAL), 0,75 > 1 de chacun des nucléotides triphosphate (solutions à 20 mM, BOEHRINGER MANNHEIM). Après une première dénaturation à 940C, 5 minutes, on effectue 35 cycles des séquences suivantes 940C 1 min. 30", 600C 1 min. 30", 700C 1 min. 30", et une dernière élongation 5 min. à 700C. Le résultat est visualisé après migration sur gel NUSIEVE/AGAROSE (2%/1%).
BIO INTERNATIONAL), 5 l de tampon 10 X (Tris/HC1 100 mM, pH 9 ; KC1 500 mM ; MgC12 15 mM ; Triton X100 1 %, BSA 2 mg/ml) CIS BIO INTERNATIONAL), 0,75 > 1 de chacun des nucléotides triphosphate (solutions à 20 mM, BOEHRINGER MANNHEIM). Après une première dénaturation à 940C, 5 minutes, on effectue 35 cycles des séquences suivantes 940C 1 min. 30", 600C 1 min. 30", 700C 1 min. 30", et une dernière élongation 5 min. à 700C. Le résultat est visualisé après migration sur gel NUSIEVE/AGAROSE (2%/1%).
Une seule bande, de la longueur attendue, est obtenue.
Le rendement et la spécificité de la réaction avec l'amorce modifiée et l'amorce non modifiée sont équivalents.
B) Obtention d'un système de détection d'hybridation à partir de fragments de 6023 et 10709 paires de bases d'ADN du phage k.
- Amorce P' - J15(stop)2#1 : 5' ACC ATC GCT TCC AGA(STOP)2 GCT GAA GTG GTG GAA ACC GC 3' - Amorce P : - x6528 5' CTG CCT GCA TCT CTT CGA CC 3' ou bien - 11215: 5' CAG CGA CCT IGT CCA CCT CC 3'
L'amorce Jl5(stop)2Bl permet d'amplifier un fragment de 6023 pb lorsqu'elle est utilisée avec l'amorce #6528, et un fragment 10709 pb lorsqu'elle est utilisée avec l'amorce 11214-
On utilise le kit XL PCR (PERKIN ELMER) en suivant le protocole préconisé par le fabricant et la technique du démarrage à haute température (hot-start).
L'amorce Jl5(stop)2Bl permet d'amplifier un fragment de 6023 pb lorsqu'elle est utilisée avec l'amorce #6528, et un fragment 10709 pb lorsqu'elle est utilisée avec l'amorce 11214-
On utilise le kit XL PCR (PERKIN ELMER) en suivant le protocole préconisé par le fabricant et la technique du démarrage à haute température (hot-start).
La phase inférieure du milieu réactionnel est préparée dans des tubes de 500 1 à paroi mince (PERKIN
ELMER) selon les instructions du fabricant. On utilise 40 pmoles d'amorces et 1,1 mM final en Mg(OAc)2. La phase inférieure est recouverte de cire (PERKIN-ELMER) ; la phase supérieure est ensuite rajoutée. L'amplification est réalisée à partir de 1 ng d'ADN de phage k.
ELMER) selon les instructions du fabricant. On utilise 40 pmoles d'amorces et 1,1 mM final en Mg(OAc)2. La phase inférieure est recouverte de cire (PERKIN-ELMER) ; la phase supérieure est ensuite rajoutée. L'amplification est réalisée à partir de 1 ng d'ADN de phage k.
L'amplification se déroule selon île protocole suivant
- 940C, 1 minute
- 10 cycles : 940C 15 sec./680C 5 minutes
- 20 cycles : 940C 15 sec./680C 5 minutes avec des incréments de 15 secondes à chaque cycle
- une dernière élongation 10 minutes à 720C.
- 940C, 1 minute
- 10 cycles : 940C 15 sec./680C 5 minutes
- 20 cycles : 940C 15 sec./680C 5 minutes avec des incréments de 15 secondes à chaque cycle
- une dernière élongation 10 minutes à 720C.
Les produits d'amplification sont contrôlés après électrophorèse sur gel d'agarose 0,8% et coloration au bromure d'éthidium. On n'observe qu'une seule bande de la longueur attendue.
C) Obtention d'un système de détection d'hybridation à partir d'un fragment de 20874 paires de bases d'ADN du phage #.
- Amorce P' - K20(stoP) 2x1 5' CAC GTG GCT ACC ATG CCA T'iT(stop)2 GCT GAA GTG GTG GAA ACC GC - Amorce P" 5' GCC TCG CAT ATC AGG AAG CAC
L'amplification est réalisée avec les amorces 2 et K20(stop) 2X1 sur 1 ng d'ADN de phage k. Les réactifs sont les mêmes qu'en B, ci-dessus. Les conditions d'amplification sont les suivantes
- 940C 1 min.
L'amplification est réalisée avec les amorces 2 et K20(stop) 2X1 sur 1 ng d'ADN de phage k. Les réactifs sont les mêmes qu'en B, ci-dessus. Les conditions d'amplification sont les suivantes
- 940C 1 min.
- 18 cycles 940C 1 min/680C 10 min.
- 15 cycles 940C 1 min./680C 10 min. avec incréments de 15 sec à chaque cycle
- 10 min. à 720C.
- 10 min. à 720C.
L'amplification est contrôlée après électrophorèse sur gel d'agarose 0,6%.
On observe une seule bande de la taille attendue.
Pour vérifier que le domaine A est bien sous forme simple-brin après amplification, on utilise loligonucléotide complémentaire du domaine A de l'amorce K20(stop) 2k1, de séquence 5' TGG CAT GGT AGC CAC GTG 3 cet oligonucléotide est marqué en 5' par la polynucléotide kinase, en présence de Y 32P ATP. I1 est hybridé en solution 10 minutes à 370C avec 5 Fl du produit d'amplification, dans un tampon PBS 1 X, NaCl 0,25 M. Le produit d'hybridation est séparé par électrophorèse sur gel d'agarose 0,6%. Le gel est séché puis autoradiographié pendant 1 nuit. L'autoradiographie montre que la radioactivité est localisée en haut du gel au niveau de la bande d'amplification, ainsi qu'en bas du gel, au niveau de l'oligonucléotide marqué non hybridé.
La présence de la radioactivité au niveau de la bande de 20,8 kb montre que l'on a bien une hybridation de l'oligonucléotide marqué sur un fragment complémentaire simple brin.
Ces exemples démontrent que l'on peut obtenir facilement des fragments très longs (jusqu'à 20000 pb) en utilisant des amorces de type P' et que la portion simple brin demeure sous cette forme après la réaction d'amplification.
EXEMPLE 2 : Détection d'un acide nucléique cible ; mise en évidence de 1'amplification de signal
Cible
La cible est un ARN de 30 bases de long obtenu par transcription in vitro et dont la séquence est la suivante 5' UuG CCU GGU CGU CCG GW CCU UUC WG GUG 3'.
Cible
La cible est un ARN de 30 bases de long obtenu par transcription in vitro et dont la séquence est la suivante 5' UuG CCU GGU CGU CCG GW CCU UUC WG GUG 3'.
On prépare des solutions diluées de 10 en 10.
La solution non diluée est considérée comme étant la solution 1.
Méthode
La détection de la cible se fait par hybridation sandwich en utilisant une sonde de capture fixée sur un microsupport et une sonde de détection qui est mise en évidence à l'aide d'un système de détection d'hybridation conforme à l'invention, soit à titre de comparaison, marquée avec une biotine.
La détection de la cible se fait par hybridation sandwich en utilisant une sonde de capture fixée sur un microsupport et une sonde de détection qui est mise en évidence à l'aide d'un système de détection d'hybridation conforme à l'invention, soit à titre de comparaison, marquée avec une biotine.
La sonde de détection G4 (séquence 5' GGT CGT CCT GGC AAT 3') est marquée par une biotine à son extrémité 5' selon le procédé décrit dans la Demande
PCT WO/89/12462, ou bien additionnée d'une séquence supplémentaire (séquence I15) à son extrémité 3'. La séquence I15 (5' ATC CGT TCT ACA GCC 3') s'hybride spécifiquement à un oligonucléotide (cIl5cJl5) dont une partie est complémentaire de I15 et une partie est complémentaire de la séquence J15 L'ensemble
G4 I15 + cI15cJ15 joue le rôle d'un adaptateur qui permet indirectement la liaison spécifique entre la sonde de détection et le système amplificateur.
PCT WO/89/12462, ou bien additionnée d'une séquence supplémentaire (séquence I15) à son extrémité 3'. La séquence I15 (5' ATC CGT TCT ACA GCC 3') s'hybride spécifiquement à un oligonucléotide (cIl5cJl5) dont une partie est complémentaire de I15 et une partie est complémentaire de la séquence J15 L'ensemble
G4 I15 + cI15cJ15 joue le rôle d'un adaptateur qui permet indirectement la liaison spécifique entre la sonde de détection et le système amplificateur.
Système de détection d'hybridation
Le système de détection d'hybridation est obtenu par amplification PCR d'un fragment d'ADN humain avec les amorces J15 ( stop)2Hl2l70 et H13180 (voir exemple 1).
Le système de détection d'hybridation est obtenu par amplification PCR d'un fragment d'ADN humain avec les amorces J15 ( stop)2Hl2l70 et H13180 (voir exemple 1).
Le milieu réactionnel contient 0,1 Fg d'ADN humain dans du tampon Taq 1X (CIS BIO INTERNATIONAL), avec 2,5 U de
Taq DNA polymérase (CIS BIO INTERNATIONAL) et 6 pmoles de chacune des amorces. Les nucléotides triphosphates sont à 300 nM sauf le dTTP qui est à 240 nM. Le milieu d'amplification contient en outre 60 nM de bio-16-dUTP (BOEHRINGER-MANNHEIM, France). Les conditions d'amplification sont les suivantes : 940C 5 min., puis 35 cycles, 940C 1 min., 600C 1 min. 30 et 700C 1 min. 30 et une dernière élongation 5 min. à 700C. On obtient ainsi un fragment double brin de 1010 paires de bases dans lequel environ 1/5ème des thymidines sont remplacées par des uridines biotinylées.
Taq DNA polymérase (CIS BIO INTERNATIONAL) et 6 pmoles de chacune des amorces. Les nucléotides triphosphates sont à 300 nM sauf le dTTP qui est à 240 nM. Le milieu d'amplification contient en outre 60 nM de bio-16-dUTP (BOEHRINGER-MANNHEIM, France). Les conditions d'amplification sont les suivantes : 940C 5 min., puis 35 cycles, 940C 1 min., 600C 1 min. 30 et 700C 1 min. 30 et une dernière élongation 5 min. à 700C. On obtient ainsi un fragment double brin de 1010 paires de bases dans lequel environ 1/5ème des thymidines sont remplacées par des uridines biotinylées.
L'amplification est contrôlée sur gel d'agarose 1%. On obtient une seule bande de taille attendue. Le fragment est purifié sur colonne SEPHACRYLQHR (MICROSPINTMS400, PHARMACIA).
Hybridation sur puce
La puce comporte 48 électrodes carrées de 50 Rm de côté. Différents oligonucléotides, parmi lesquels la sonde de capture Gc. La sonde de capture Gc (séquence : 5' CTC CAA GAA AGG ACC C 3'), sont fixés chacun sur une électrode par leur extrémité 5', par copolymérisation avec du pyrrole, selon le procédé décrit dans la Demande PCT WO/94/22889.
La puce comporte 48 électrodes carrées de 50 Rm de côté. Différents oligonucléotides, parmi lesquels la sonde de capture Gc. La sonde de capture Gc (séquence : 5' CTC CAA GAA AGG ACC C 3'), sont fixés chacun sur une électrode par leur extrémité 5', par copolymérisation avec du pyrrole, selon le procédé décrit dans la Demande PCT WO/94/22889.
Les hybridations se déroulent en 1 heure à 450C dans un tampon PBS 1 X, NaCl 0,5 M, EDTA 10 mM,
DENHARDT 2,5 X contenant 100 Fg/ml d'ADN de sperme de hareng soniqué. Les solutions d'hybridation sont chauffées 3 min. à 80 OC dans des microtubes en présence de l'ARN à doser, puis transférées dans un sac d'hybridation dans lequel est placée la puce.
DENHARDT 2,5 X contenant 100 Fg/ml d'ADN de sperme de hareng soniqué. Les solutions d'hybridation sont chauffées 3 min. à 80 OC dans des microtubes en présence de l'ARN à doser, puis transférées dans un sac d'hybridation dans lequel est placée la puce.
Détection avec la sonde biotinylée
L'hybridation de 1'ARN cible sur la puce est effectuée dans 20 Al de tampon 1 X contenant 1 Al de la solution d'ARN à tester et 15 pmoles de sonde G4 marquée à la biotine. On effectue ensuite 3 rinçages dans un tampon PBS 1 X, contenant 0,5 M NaCl et 0,05% de Tween 20. La puce est ensuite incubée 10 minutes dans une solution de streptavidine-phycoérythrine à 5 ng/l dans
PBS/NaCl/Tween, puis rincée dans le tampon de lavage.
L'hybridation de 1'ARN cible sur la puce est effectuée dans 20 Al de tampon 1 X contenant 1 Al de la solution d'ARN à tester et 15 pmoles de sonde G4 marquée à la biotine. On effectue ensuite 3 rinçages dans un tampon PBS 1 X, contenant 0,5 M NaCl et 0,05% de Tween 20. La puce est ensuite incubée 10 minutes dans une solution de streptavidine-phycoérythrine à 5 ng/l dans
PBS/NaCl/Tween, puis rincée dans le tampon de lavage.
La puce est montée sur lame et sous lamelle dans une goutte de tampon PBS/NaCl/Tween. Le signal est enregistré, après irradiation à 500-550 nm pendant 1 seconde, par un microscope couplé à une caméra CCD.
Le signal sur chaque électrode est quantifié en unités arbitraires de fluorescence (UAFs) ; la gamme de signal est linéaire de 0 à 250 UAFs. Les résultats, exprimés en UAFs, sont illustrés par le Tableau I ciaprès.
Détection avec le système de détection d'hybridation conforme à l'invention
Elle se déroule en 2 étapes.
Elle se déroule en 2 étapes.
a) hybridation avec l'adaptateur
L'ARN à tester (1 pl) est d'abord hybridé sur la puce avec 25 pmoles de l'oligonucléotide I15G4 et 25 pmoles de l'oligonucléotide cI15cJ15. La puce est traitée 2 x 5 minutes dans une solution NaOH 0,1 N et rincée à l'eau distillée.
L'ARN à tester (1 pl) est d'abord hybridé sur la puce avec 25 pmoles de l'oligonucléotide I15G4 et 25 pmoles de l'oligonucléotide cI15cJ15. La puce est traitée 2 x 5 minutes dans une solution NaOH 0,1 N et rincée à l'eau distillée.
b) hybridation avec le système de détection d'hybridation :
Après un rapide rinçage dans le tampon
PBS/NaCl/Tween, la puce est transférée dans un deuxième sac d'hybridation contenant 10 Fl du système de détection d'hybridation purifié marqué à la biotine et 10 1 de tampon d'hybridation 2 X. Les rinçages, la révélation à la streptavidine-phycoérythrine, et l'enregistrement du signal sont effectués comme décrit ci-dessus.
Après un rapide rinçage dans le tampon
PBS/NaCl/Tween, la puce est transférée dans un deuxième sac d'hybridation contenant 10 Fl du système de détection d'hybridation purifié marqué à la biotine et 10 1 de tampon d'hybridation 2 X. Les rinçages, la révélation à la streptavidine-phycoérythrine, et l'enregistrement du signal sont effectués comme décrit ci-dessus.
Les signaux sont enregistrés après une irradiation de 1 seconde. Les résultats, exprimés en pixels, sont illustrés par le Tableau I ci-après.
TABLEAU I
<tb> <SEP> Dilution
<tb> <SEP> O <SEP> (témoin
<tb> <SEP> d'ARN <SEP> 'ARN <SEP> 1 <SEP> 1/10 <SEP> 1/100 <SEP> 0 <SEP> (témoin
<tb> <SEP> sans <SEP> ARN)
<tb> Marquage
<tb> <SEP> o
<tb> Biotine <SEP> 80 <SEP> 37 <SEP> 18 <SEP> 10
<tb> Système <SEP> de <SEP> 250 <SEP> 250 <SEP> 220 <SEP> 10
<tb> détection
<tb>
Les électrodes comportant des sondes autres que G4 donnent des signaux entre 4 et 10 UAFs. Un signal de 250 UAFs correspond, dans les conditions utilisées, à une saturation du système de lecture.
<tb> <SEP> O <SEP> (témoin
<tb> <SEP> d'ARN <SEP> 'ARN <SEP> 1 <SEP> 1/10 <SEP> 1/100 <SEP> 0 <SEP> (témoin
<tb> <SEP> sans <SEP> ARN)
<tb> Marquage
<tb> <SEP> o
<tb> Biotine <SEP> 80 <SEP> 37 <SEP> 18 <SEP> 10
<tb> Système <SEP> de <SEP> 250 <SEP> 250 <SEP> 220 <SEP> 10
<tb> détection
<tb>
Les électrodes comportant des sondes autres que G4 donnent des signaux entre 4 et 10 UAFs. Un signal de 250 UAFs correspond, dans les conditions utilisées, à une saturation du système de lecture.
On voit que le signal obtenu avec la sonde marquée par une seule biotine décroît très vite lorsque la dilution augmente, alors que l'utilisation du système de détection d'hybridation conforme à l'invention permet l'obtention d'un signal plus élevé, et en outre augmente nettement la sensibilité du test. Le bruit de fond en présence du système de détection d'hybridation ou de la sonde biotinylée est le même.
EXEMPLE 5 : Utilisation du système de détection d'hybridation conforme à 1'invention pour la révélation sur microplaque.
Le système amplificateur est constitué du fragment de 1010 bp marqué à la digoxigénine. Le protocole utilisé est le même que dans l'exemple 1. La digoxigénine est incorporée pendant la synthèse enzymatique du système amplificateur en remplaçant 1/5 des dTTP par de la digoxigénine-ll-2'-deoxy-uridine-5'- triphosphate (BOEHRINGER-MANNHEIM).
Les résultats obtenus avec le système amplificateur sont comparés aux résultats obtenu après hybridation avec la sonde G4 marquée à la digoxigénine (oligonucléotide G4 marqué chimiquement à son extrémité 5 et purifié par HPLC, PHARMACIA). La cible est fixée sur une microplaque recouverte de streptavidine (LABSYSTEM) par l'intermédiaire de la sonde de capture Gc marquée à la biotine.
La cible est constituée d'ARN comme dans l'exemple précédent. On effectue des dilutions de la cible de 10 en 10.
Hybridation avec G4 DIG
1'ARN cible est incubé dans 50 1 de tampon
PBS/NaCl contenant 30 pmoles de sonde G4 DIG et 40 pmoles de sonde de capture Gc marquée à la biotine. Les solutions sont chauffées 3 minutes à 800C puis transférées dans les puits. On incube 1 heure à 42 OC.
1'ARN cible est incubé dans 50 1 de tampon
PBS/NaCl contenant 30 pmoles de sonde G4 DIG et 40 pmoles de sonde de capture Gc marquée à la biotine. Les solutions sont chauffées 3 minutes à 800C puis transférées dans les puits. On incube 1 heure à 42 OC.
Après 3 lavages avec le tampon PBS/NaCl/Tween, on incube pendant 1 heure à 370C avec l'anticorps anti-DIG marqué à la peroxydase (solution mère à 75 U/ml, BOEHRINGER
MANNHEIM, diluée au 1/2000 dans du PBS/NaCl contenant 3% de BSA).
MANNHEIM, diluée au 1/2000 dans du PBS/NaCl contenant 3% de BSA).
Hybridation avec le système de détection d'hybridation conforme à l'invention
Elle se déroule en 2 étapes
a) hybridation avec l'adaptateur
L'ARN à tester est d'abord hybridé dans 50 Rl de tampon PBS/NaCl/Tween contenant 40 pmoles de sonde Gcbiotine, 40 pmoles de I15G4, et 40 pmoles de cI15cJ15. Les solutions sont dénaturées 3 minutes à 800C puis transférées dans les puits de la microplaque.
Elle se déroule en 2 étapes
a) hybridation avec l'adaptateur
L'ARN à tester est d'abord hybridé dans 50 Rl de tampon PBS/NaCl/Tween contenant 40 pmoles de sonde Gcbiotine, 40 pmoles de I15G4, et 40 pmoles de cI15cJ15. Les solutions sont dénaturées 3 minutes à 800C puis transférées dans les puits de la microplaque.
L'incubation se déroule 1 heure à 420C. On effectue 3 lavages au PBS/NaCl/Tween puis on procède à l'incubation avec le système de détection d'hybridation
b) hybridation avec le système de détection d'hybridation
On distribue dans chaque puits, 50 Fl de
PBS/NaCl contenant 5 Rl de la solution purifiée de système de détection d'hybridation marqué à la digoxigénine, et 3% de BSA. Les microplaques sont incubées 1 heure à 42 OC. Après 3 lavages, on procède à l'incubation pendant 1 heure à 370C, avec l'anticorps anti-DIG dilué au 1/4000.
b) hybridation avec le système de détection d'hybridation
On distribue dans chaque puits, 50 Fl de
PBS/NaCl contenant 5 Rl de la solution purifiée de système de détection d'hybridation marqué à la digoxigénine, et 3% de BSA. Les microplaques sont incubées 1 heure à 42 OC. Après 3 lavages, on procède à l'incubation pendant 1 heure à 370C, avec l'anticorps anti-DIG dilué au 1/4000.
Révélation
Après 3 lavages, les puits sont incubés à l'obscurité, en présence de 50 Fl de substrat de la peroxydase (O-phénylènediamine, dans un tampon citratephosphate, pH 5,5, contenant 0,02% H202). La réaction est arrêtée au bout de 10 minutes pour le système amplificateur et de 30 minutes pour les témoins, par 50 pl d'acide oxalique 1 M. La densité optique est lue à 492 nm.
Après 3 lavages, les puits sont incubés à l'obscurité, en présence de 50 Fl de substrat de la peroxydase (O-phénylènediamine, dans un tampon citratephosphate, pH 5,5, contenant 0,02% H202). La réaction est arrêtée au bout de 10 minutes pour le système amplificateur et de 30 minutes pour les témoins, par 50 pl d'acide oxalique 1 M. La densité optique est lue à 492 nm.
Les résultats, exprimés en unités de densité optique, sont rassemblés dans le Tableau II ci-dessous.
TABLEAU II
<tb> dilution <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 101 <SEP> 10' <SEP> 10-3 <SEP> 10-4 <SEP> 10-5 <SEP> <SEP> 10-6 <SEP> 0
<tb> <SEP> 5 <SEP> Rl <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Témoin <SEP> 0,21 <SEP> 0,09 <SEP> 0,06 <SEP> 0,06 <SEP> 0,06 <SEP> 0,06 <SEP> 0,05 <SEP> 0,06 <SEP> 0,05
<tb> Système <SEP> de
<tb> détection <SEP> NT <SEP> 1,59 <SEP> 1,71 <SEP> 1,74 <SEP> 0,87 <SEP> 0,44 <SEP> 0,38 <SEP> 0,40 <SEP> 0,41
<tb> d'hybridation
<tb>
NT : non testé
On observe comme dans l'exemple précédent une très nette augmentation du signal et une très nette augmentation de la sensibilité du test après soustraction du bruit de fond.
<tb> <SEP> 5 <SEP> Rl <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Témoin <SEP> 0,21 <SEP> 0,09 <SEP> 0,06 <SEP> 0,06 <SEP> 0,06 <SEP> 0,06 <SEP> 0,05 <SEP> 0,06 <SEP> 0,05
<tb> Système <SEP> de
<tb> détection <SEP> NT <SEP> 1,59 <SEP> 1,71 <SEP> 1,74 <SEP> 0,87 <SEP> 0,44 <SEP> 0,38 <SEP> 0,40 <SEP> 0,41
<tb> d'hybridation
<tb>
NT : non testé
On observe comme dans l'exemple précédent une très nette augmentation du signal et une très nette augmentation de la sensibilité du test après soustraction du bruit de fond.
Claims (18)
1) Système de détection d'hybridation d'acides nucléiques, caractérisé en ce qu'il est constitué par
- un domaine de fixation A, constitué par un polynucléotide simple-brin
- un domaine intermédiaire B, constitué par au moins un synthon d'arrêt ; et
- un domaine de visualisation C, constitué par un polynucléotide double-brin, dans lequel est incorporé au moins un nucléotide marqué constituant un moyen de détection.
2) Système de détection d'hybridation selon la revendication 1 caractérisé en ce la taille du domaine A est comprise entre 8 et 40 nucléotides de long.
3) Système de détection d'hybridation selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que au moins 1/50 des nucléotides constitutifs du domaine C sont des nucléotides marqués.
4) Système de détection d'hybridation selon une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la taille du domaine C est comprise entre 0,1 et 50 kb.
5) Procédé de préparation d'un système de détection d'hybridation selon une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel l'on effectue la synthèse d'au moins l'un des brins du domaine C à l'aide d'une polymérase dans un mélange réactionnel approprié, lequel procédé est caractérisé en ce que tout ou partie d'au moins l'un des nucléotides triphosphate dudit mélange réactionnel est remplacé par l'un de ses dérivés marqués, et en ce qu'il comprend au moins une étape a) au cours de laquelle on effectue l'élongation par polymérase, en présence d'un brin matrice, d'une amorce P comprenant, de 5' en 3', un domaine A et un domaine B tels que définis dans la revendication 1, et un domaine X constitué par une séquence capable de s'hybrider audit brin matrice pour amorcer la polymérisation.
6) Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape b) au cours de laquelle on effectue l'élongation par polymérase, en présence d'un brin matrice constitué par le produit d'élongation de l'amorce P', d'une seconde amorce P" comprenant une séquence capable de s'hybrider audit brin matrice pour amorcer la polymérisation.
7) Procédé selon une quelconque des revendications 5 ou 6, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape c) au cours de laquelle on effectue l'élongation par polymérase de l'amorce P', en présence d'un brin matrice constitué par le produit d'élongation de l'amorce P"
8) Procédé selon une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisée en ce que les étapes b) et c) sont répétées jusqu'à obtention de la quantité souhaitée du système de détection d'hybridation.
9) Procédé selon une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que le mélange réactionnel comprend plusieurs types d'amorces P' différant entre elles par la séquence du domaine A, et identiques entre elles en ce qui concerne la séquence du domaine X.
10) Nécessaire pour la mise en oeuvre d'un procédé selon une quelconque des revendications 5 à 10, comprenant au moins une amorce P' telle que définie dans la revendication 5, un polynucléotide utilisable comme matrice pour l'élongation de ladite amorce, et un nucléotide triphosphate marqué.
11) Nécessaire selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins une amorce P".
12) Utilisation d'au moins un système de détection d'hybridation selon la revendication 1 pour la détection d'une séquence cible d'acide nucléique.
13) Utilisation selon la revendication 12 caractérisée en ce que pour détecter simultanément plusieurs séquences cibles, on utilise simultanément plusieurs systèmes de détection d'hybridation selon la revendication 1, différant entre eux par la séquence du domaine A.
14) Utilisation selon la revendication 13 caractérisée en ce que lesdits systèmes de détection d'hybridation diffèrent également entre eux par la séquence du domaine C et/ou par la nature des nucléotides marqués incorporés dans ledit domaine.
15) Utilisation selon une quelconque des revendications 12 à 14 caractérisée en ce que ladite séquence cible est fixée sur un support solide.
16) Utilisation selon la revendication 15 caractérisé en ce que ledit support solide comprend au moins une électrode.
17) Utilisation selon la revendication 16 caractérisée en ce que ledit support solide est constitué par une pluralité d'électrodes, dont au moins 2 portent chacune une séquence cible différente.
18) Utilisation selon une quelconque des revendications 12 à 17, caractérisée en ce que l'on met en oeuvre au moins un adaptateur intermédiaire d'hybridation, constitué par une molécule d'acide nucléique dont une partie peut s'hybrider spécifiquement avec le domaine A du système de détection d'hybridation, et une partie peut s'hybrider spécifiquement avec la séquence cible.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9704328A FR2762013B1 (fr) | 1997-04-09 | 1997-04-09 | Systemes de detection d'hybridation d'acides nucleiques, leur procede de preparation et leurs utilisations |
| US09/402,764 US6210932B1 (en) | 1997-04-09 | 1998-04-09 | System for detecting nucleic acid hybridization, preparation method and application thereof |
| JP54246798A JP2001518787A (ja) | 1997-04-09 | 1998-04-09 | 核酸ハイブリッド形成検知システムおよびその調製法と応用 |
| EP98920600A EP0973947A1 (fr) | 1997-04-09 | 1998-04-09 | Systemes de detection d'hybridation d'acides nucleiques, leur procede de preparation et leurs utilisations |
| PCT/FR1998/000722 WO1998045475A1 (fr) | 1997-04-09 | 1998-04-09 | Systemes de detection d'hybridation d'acides nucleiques, leur procede de preparation et leurs utilisations |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9704328A FR2762013B1 (fr) | 1997-04-09 | 1997-04-09 | Systemes de detection d'hybridation d'acides nucleiques, leur procede de preparation et leurs utilisations |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2762013A1 true FR2762013A1 (fr) | 1998-10-16 |
| FR2762013B1 FR2762013B1 (fr) | 1999-06-04 |
Family
ID=9505675
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9704328A Expired - Fee Related FR2762013B1 (fr) | 1997-04-09 | 1997-04-09 | Systemes de detection d'hybridation d'acides nucleiques, leur procede de preparation et leurs utilisations |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6210932B1 (fr) |
| EP (1) | EP0973947A1 (fr) |
| JP (1) | JP2001518787A (fr) |
| FR (1) | FR2762013B1 (fr) |
| WO (1) | WO1998045475A1 (fr) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2809417B1 (fr) * | 2000-05-24 | 2004-07-30 | Commissariat Energie Atomique | Detection et caracterisation de l'activite de proteines impliquees dans la reparation de lesions de l'adn |
| WO2003016574A1 (fr) * | 2001-08-16 | 2003-02-27 | Zhifeng Shao | Analyse de profils d'expression genique utilisant l'hybridation sequentielle |
| AU2008256851A1 (en) * | 2007-05-23 | 2008-12-04 | Oregon Health & Science University | Microarray systems and methods for identifying DNA-binding proteins |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6463398A (en) * | 1987-05-02 | 1989-03-09 | Wakunaga Pharma Co Ltd | Probe for detecting polynucleotide |
| EP0416817A2 (fr) * | 1989-09-06 | 1991-03-13 | Zeneca Limited | Procédé d'amplification |
| EP0501356A1 (fr) * | 1991-02-28 | 1992-09-02 | Roche Diagnostics GmbH | Détection de bactéries avec amplification d'acides nucléiques |
| WO1996006946A1 (fr) * | 1994-08-26 | 1996-03-07 | Igen, Inc. | Biocapteur et procede destines a la detection par luminescence electrophotochimique d'acides nucleiques adsorbes sur une surface solide |
-
1997
- 1997-04-09 FR FR9704328A patent/FR2762013B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-04-09 EP EP98920600A patent/EP0973947A1/fr not_active Withdrawn
- 1998-04-09 WO PCT/FR1998/000722 patent/WO1998045475A1/fr not_active Ceased
- 1998-04-09 JP JP54246798A patent/JP2001518787A/ja active Pending
- 1998-04-09 US US09/402,764 patent/US6210932B1/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6463398A (en) * | 1987-05-02 | 1989-03-09 | Wakunaga Pharma Co Ltd | Probe for detecting polynucleotide |
| EP0416817A2 (fr) * | 1989-09-06 | 1991-03-13 | Zeneca Limited | Procédé d'amplification |
| EP0501356A1 (fr) * | 1991-02-28 | 1992-09-02 | Roche Diagnostics GmbH | Détection de bactéries avec amplification d'acides nucléiques |
| WO1996006946A1 (fr) * | 1994-08-26 | 1996-03-07 | Igen, Inc. | Biocapteur et procede destines a la detection par luminescence electrophotochimique d'acides nucleiques adsorbes sur une surface solide |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| NEWTON C. R. ET AL.,: "The production of PCR products with 5' single-stranded tails using primers that incorporate novel phosphoramidite intermediates", NUCLEIC ACID RESEARCH, vol. 21, no. 5, - 1993, pages 1155 - 1162, XP002052476 * |
| PATENT ABSTRACTS OF JAPAN vol. 013, no. 262 (C - 608) 16 June 1989 (1989-06-16) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1998045475A1 (fr) | 1998-10-15 |
| US6210932B1 (en) | 2001-04-03 |
| JP2001518787A (ja) | 2001-10-16 |
| EP0973947A1 (fr) | 2000-01-26 |
| FR2762013B1 (fr) | 1999-06-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR950013953B1 (ko) | 리가제 연쇄 반응에 적용가능한 표적 핵산의 증폭 방법 | |
| US9447457B2 (en) | Detection of target nucleic acid sequences by cyclic exonucleolytic reactions | |
| EP0787209B1 (fr) | Procede d'amplification de sequences d'acide nucleique par deplacement, a l'aide d'amorces chimeres | |
| EP1300466A2 (fr) | Réaction d'amplification en cascade d'acide nucléique | |
| CA2585164A1 (fr) | Sequences nucleotidiques issues du genome des retrovirus du type hiv-1, hiv-2 et siv, et leurs applications notamment pour l'amplification des genomes de ces retrovirus et pour lediagnostic in vitro des infections dues a ces virus | |
| JPH11504517A (ja) | オリゴヌクレオチドの化学結合による核酸検出及び増幅 | |
| KR20010012175A (ko) | 폴리뉴클레오티드의 2단계 혼성화 및 포획법 | |
| CA2582809A1 (fr) | Amplification par replique de reseaux d'acides nucleiques | |
| JPH11510709A (ja) | 最適蛍光オリゴヌクレオチド | |
| KR102843262B1 (ko) | 자가-발광을 기초로 하는 단일-채널 시퀀싱 방법 | |
| HUE032212T2 (en) | Polymer chain reaction detection system using oligonucleotides containing phosphorothioate group | |
| RU2729983C2 (ru) | Способ амплификации днк на основе внедрения в цепь | |
| CA2069096A1 (fr) | Synthese enzymatique d'oligonucleotides | |
| AU2015287576A1 (en) | DNA amplification technology | |
| JP2002531106A (ja) | 不連続プライマ−伸長による核酸反復配列の長さ決定 | |
| JPH0923899A (ja) | 塩基配列増幅方法 | |
| FR2949120A1 (fr) | Procede de detection d'un adn circularise et utilisation de ce procede pour la detection de mutations | |
| US20050176014A1 (en) | Fluorescent hybridization probes with reduced background | |
| FR2762013A1 (fr) | Systemes de detection d'hybridation d'acides nucleiques, leur procede de preparation et leurs utilisations | |
| EP1283911B1 (fr) | Detection et caracterisation de l'activite de proteines impliquees dans la reparation de lesions de l'adn | |
| FR2722799A1 (fr) | Procede d'amplification d'acide nucleique a l'aide d'un nucleoside modifie, et detection du produit d'amplification a l'aide d'anticorps | |
| EP0775217B1 (fr) | Méthode d'amplification et/ou de détection d'une séquence d'acide nucléique, réactif de détection et leurs applications | |
| US9074248B1 (en) | Primers for helicase dependent amplification and their methods of use | |
| FR2809105A1 (fr) | Amorces d'amplification modifiees et leurs utilisations | |
| BE1011052A3 (fr) | Procede et trousse de diagnostic et/ou de quantification par hybridation de type sandwich de sequences d'acides nucleiques sur support solide. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TP | Transmission of property | ||
| ST | Notification of lapse |