FR2775295A1 - Fragment d'adn specifique de streptococcus agalactiae et molecules d'acides nucleiques apparentees - Google Patents
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Abstract
On décrit ici une séquence d'ADN nouvellement identifiée provenant de Streptococcus agalactiae ("GBS "), appelée GBS3. 1. On décrit aussi des procédés, sondes oligonucléotidiques, amorces d'amplification, et trousses pour la détection à spécificité d'espèce de S. agalactiae. De préférence, S. agalactiae est détecté par amplification des acides nucléiques de S. agalactiae au moyen des amorces d'amplification décrites, et ensuite détection des acides nucléiques amplifiés. Dans un mode de réalisation davantage préféré, les acides nucléiques de S. agalactiae sont amplifiés et détectés par amplification par déplacement de brin thermophile (ADBt).
Description
i La présente invention concerne des procédés pour identifier des
micro-organismes, en particulier des procédés et des séquences d'acides nucléiques pour identifier Streptococcus agalactiae par amplification d'acides nucléiques et hybridation d'acides nucléiques. Streptococcus agalactiae, également connu sous le nom de Streptococcus du Groupe B ("GBS"), a longtemps été associé à la mastite chez les animaux laitiers. Plus récemment, le GBS a été reconnu comme un agent pathogène grave chez l'homme; le GBS est un agent responsable des
méningites, bactériémies, endocardites, broncho-
pneumonies, arthrites, péritonites, infections des plaies, et infections des voies urinaires chez l'adulte. En outre, le GBS est l'une des causes principales de la morbidité et de la mortalité néonatales et maternelles. Comme il y a une identité pratiquement complète des sérotypes de GBS isolés chez des mères et leurs nouveau-nés infectés, il s'avère que le GBS est transmis par les voies génitales maternelles au nouveau-né lorsqu'il passe dans la filière pelvi-génitale. Ceci est une source significative d'infection pathogène des nouveau-nés; on estime que 5 à % des femmes enceintes sont infectées par le GBS. Le taux de mortalité chez les nouveau-nés affectés par le GBS est de 20 à 25 %, avec 30 % des nouveau-nés infectés qui développent une méningite. Baker, N. Engl. J. Med. 314, 1702 (1986). De plus, le GBS rentre en jeu dans environ
% des cas d'endométriose post-partum. Id.
Les procédés conventionnels d'identification du GBS comprennent le marquage Gram, l'hémolyse, la classification sérologique sur la base des antigènes du groupe B, l'hydrolyse d'hippurate, le test CAMP, et la réaction à des disques de bacitracine et de sulfaméthoxazole/triméthoprime. Daly et al., J. Clin. Microbiology 29, 80 (1991). Tous ces procédés souffrent d'une faible sensibilité, d'une précision variable, et d'un long temps d'exécution. Une identification rapide du GBS est souhaitable, en particulier au moment de l'accouchement, de façon que tant la mère que l'enfant puissent recevoir un traitement prophylactique, empêchant ainsi le déclenchement d'une maladie maternelle ou néonatale. Les dosages diagnostiques basés sur des acides nucléiques, tels que l'hybridation Southern, offrent des moyens rapides d'identification de micro- organismes, habituellement en moins d'une journée. Les procédés se basant sur une amplification en chaîne par polymérase (ACP) sont encore plus sensibles et peuvent parfois donner des résultats en quelques heures. Toutefois, les méthodologies basées sur des acides nucléiques sont souvent pleines d'inconvénients. La plupart de ces procédés sont coûteux, ne sont disponibles que pour quelques espèces de micro-organismes, et ne peuvent séparer qu'une espèce par échantillon testé. De plus, les dosages basés sur des acides nucléiques nécessitent le développement de sondes ou amorces oligonucléotidiques qui
sont spécifiques du micro-organisme auquel on s'intéresse.
Pour parer aux problèmes attenants à un diagnostic conventionnel de GBS, on a tenté de développer des procédés diagnostiques se basant sur des acides nucléiques
pour identifier le GBS.
Baseggio et al., Mol. Cell Probes 11, 349 (1997) propose un procédé pour classer des souches de GBS isolées chez des vaches laitières souffrant de mastite. L'ADN génomique isolé à partir d'isolats de GBS provenant d'animaux infectés est soumis à une digestion par restriction suivie d'une électrophorèse sur gel à champ pulsé. Les profils électrophorétiques des produits de la digestion par restriction sont caractéristiques de différentes souches de GBS et offrent une base de diagnostic. Daly et al., J. Clin. Microbiology 29, 80 (1992), décrit l'utilisation d'une sonde oligonucléotidique marquée par chimioluminescence (ACCUPROBE , Gen- Probe, Inc.) pour identifier le GBS. La sonde d'ADN est ciblée sur une région de l'ARNr de GBS. La détermination implique l'hybridation de la sonde à l'ARN cible par une hybridation en solution, et ensuite la mesure de la chimioluminescence. Cette détermination souffre d'une faible sensibilité parce que les acides nucléiques cibles ne sont pas amplifiés avant hybridation. Il faut mettre en culture les micro-organismes infectieux pour produire des colonies isolées afin d'obtenir l'ARNr cible adéquat pour
l'analyse.
Chatellier et al., J. Clin. Microbiology 35, 2573 (1997), traite d'un procédé pour identifier des souches de GBS dans des échantillons de liquide céphalo-rachidien par une détermination d'ADN polymorphe à amplification aléatoire (RAPD). L'ADN cible est amplifié par ACP au moyen d'amorces uniques ayant une séquence - d'oligonucléotide aléatoire. Les produits d'amplification ACP sont séparés par électrophorèse, et les motifs en
bande de gel résultants sont caractéristiques de souches25 particulières de GBS et sont utilisés pour le diagnostic.
Le brevet des Etats-Unis N 5 620 847 de Greisen et al. enseigne aussi un procédé basé sur une ACP pour identifier le GBS dans le liquide céphalo-rachidien. Dans la première étape, on utilise une amorce bactérienne universelle pour amplifier une région cible dans l'ARNr de 16S. Puis les acides nucléiques amplifiés sont analysés avec une série de sondes, dont l'une distingue le GBS des autres espèces bactériennes se trouvant dans le liquide céphalo-rachidien. Malgré les recherches décrites ci-dessus, on a encore besoin, dans la technique, de procédés rapides, précis et
sensibles pour l'identification de GBS.
La présente invention propose une région nouvellement identifiée du génome de Streptococcus agalactiae ("GBS") que l'on peut utiliser pour détecter des acides nucléiques de S. agalactiae par des tests d'hybridation ou d'amplification. On a développé des amorces d'amplification et des sondes d'acides nucléiques qui conduisent à une identification à spécificité d'espèce de S. agalactiae sans réactivité croisée détectable avec des
espèces non GBS.
Dans un premier aspect, la présente invention propose un procédé pour la détection à spécificité d'espèce d'acides nucléiques de Streptococcus agalactiae, comprenant les étapes consistant à: (a) hybrider une sonde oligonucléotidique à des acides nucléiques de Streptococcus agalactiae, la sonde étant constituée d'au moins 10 nucléotides consécutifs d'une séquence de Streptococcus agalactiae GBS3.1; et ensuite (b) détecter l'hybridation entre la sonde oligonucléotidique et les
acides nucléiques de Streptococcus agalactiae.
Dans un deuxième aspect, la présente invention propose un procédé pour la détection à spécificité d'espèce d'acides nucléiques de Streptococcus agalactiae, comprenant les étapes consistant à: (a) hybrider à des acides nucléiques de Streptococcus agalactiae au moins une amorce d'amplification comprenant une séquence de fixation cible, la séquence de fixation cible étant constituée d'au moins 10 nucléotides consécutifs d'une séquence de Streptococcus agalactiae GBS3.1; et (b) amplifier les acides nucléiques de Streptococcus agalactiae; et ensuite (c) détecter les acides nucléiques de Streptococcus agalactiae amplifiés. Dans des modes de réalisation préférés, l'amorce d'amplification contient des séquences pour l'amplification des acides nucléiques cibles. Dans des modes de réalisation davantage préférés, les acides nucléiques cibles sont amplifiés par amplification par
déplacement de brin thermophile (ADBt).
Dans un troisième aspect, la présente invention propose un procédé pour la détection à spécificité d'espèce d'acides nucléiques de Streptococcus agalactiae, comprenant les étapes consistant à: (a) hybrider à des acides nucléiques de Streptococcus agalactiae une première et une deuxième amorces d'amplification, la séquence de fixation cible de chaque amorce d'amplification étant constituée d'au moins 10 nucléotides consécutifs d'une séquence de Streptococcus agalactiae GBS3.1, o les première et deuxième amorces d'amplification sont choisies de telle sorte que les première et deuxième amorces d'amplification soient adjacentes et puissent être ligaturées lorsqu'elles sont hybridées aux acides nucléiques de Streptococcus agalactiae; et (b) ligaturer les première et deuxième amorces d'amplification hybridées pour produire un produit d'amplification; et ensuite (c)
détecter le produit d'amplification.
Dans un quatrième aspect, la présente invention décrit un ADN isolé constitué d'une séquence de Streptococcus agalactiae GBS3.1. Dans des modes de réalisation préférés, la séquence de GBS3.1 est choisie dans l'ensemble constitué par la SEQ ID N :3, la SEQ ID N :6, la SEQ ID N :7, la SEQ ID N :8 et la SEQ ID N :9. On décrit en outre des sondes oligonucléotidiques et des amorces d'amplification comprenant une séquence de fixation cible constituée d'au moins 10 nucléotides consécutifs d'une séquence de GBS3.1. De préférence, l'oligonucléotide a une séquence choisie dans l'ensemble constitué par la SEQ ID N :4, la SEQ ID N :5, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :10, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :11, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :12, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :13, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :14, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :15, la SEQ ID N :16, la SEQ ID N :17, la SEQ ID N :18, la SEQ ID N :19, et la SEQ ID N :20. Dans d'autres modes de réalisation préférés, l'oligonucléotide comprend en outre une séquence pour l'amplification d'un acide nucléique cible, et, mieux encore, l'oligonucléotide est choisi dans l'ensemble constitué par la SEQ ID N :10, la SEQ ID N :1l, la SEQ ID N :12, la SEQ ID N :14, et la SEQ
ID N :15.
Dans un cinquième aspect, la présente invention propose un ensemble d'amorces pour l'amplification à spécificité d'espèce d'acides nucléiques de Streptococcus agalactiae, comprenant une première amorce d'amplification comprenant une séquence de fixation cible constituée d'au moins 10 nucléotides consécutifs d'une séquence de GBS3.1 isolée. De préférence, la première amorce d'amplification est choisie dans l'ensemble constitué par la SEQ ID N :4, la SEQ ID N :5, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :10, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :11, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :12, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :13, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :14, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :15, la SEQ ID N :16, la SEQ ID N :17, la SEQ ID N :18, la SEQ ID N :19, et la SEQ ID N :20. Dans d'autres modes de réalisation, la première amorce d'amplification comprend en outre une séquence pour l'amplification des acides nucléiques cibles. Selon ce mode de réalisation, la première amorce d'amplification est de préférence choisie dans l'ensemble constitué par la SEQ ID N :10, la SEQ ID N :11, la SEQ ID N :12, la SEQ ID N :13, la SEQ ID N :14 et la SEQ ID N :15. Sont en outre décrites des trousses pour la détection à spécificité d'espèce d'acides nucléiques de Streptococcus agalactiae, comprenant les amorces et sondes oligonucléotidiques de l'invention. Dans un sixième aspect, la présente invention propose un ensemble d'amorces pour l'amplification à spécificité d'espèce d'acides nucléiques de Streptococcus agalactiae comprenant une première amorce d'amplification constituée de la SEQ ID N :10, une deuxième amorce d'amplification
constituée de la SEQ ID N :13, une première amorce "pare-
chocs" ou "bumper", constituée de la SEQ ID N :16, et une
deuxième amorce bumper constituée de la SEQ ID N :17.
Ces aspects de la présente invention, ainsi que d'autres aspects, sont décrits plus en détail dans la
description de l'invention présentée ci-dessous, prise en
relation avec les dessins joints, dans lesquels: la Figure 1 représente un brin de la séquence d'ADN de GBS3.1 (SEQ ID N :3) provenant du GBS de type III; la Figure 2 représente l'alignement des séquences de GBS3.1 provenant de 15 souches de GBS. Seules quatre séquences distinctes (SEQ ID N :3 et SEQ ID N :7, SEQ ID N :8, SEQ ID N :9) sont représentées par les 15 souches de GBS. La séquence consensus de GBS3.1 (SEQ ID N :6) est indiquée en haut de l'alignement; la Figure 3 montre les amorces de ADBt, les bumpers et les détecteurs du système ADBt de GBS3.1 et leurs cibles dans la séquence de GBS3.1; la Figure 3A représente les séquences des amorces d'amplification par ADBt de GBS3.1 (SEQ ID N :10, SEQ ID
N :11, SEQ ID N :12, SEQ ID N :13, SEQ ID N :14, SEQ ID
N :15), les bumpers (SEQ ID N :16 et SEQ ID N :17) et les détecteurs (SEQ ID N :18, SEQ ID N :19, SEQ ID N :20). Les séquences de fixation cibles et les sites BsoBI des amorces d'amplification sont indiquées respectivement par des caractères soulignés et italiques; et la Figure 3B montre le système de ADBt de GBS3.1 choisi pour une étude ultérieure. Cet ensemble d'amorces et de bumpers cible une région allant des nucléotides 1 à 103 de la séquence de GBS3.1 et conduit à un produit
d'amplification de 61 pb.
Les séquences de nucléotides sont présentées ici par un simple brin uniquement dans la direction 5' -+ 3', de gauche à droite. Les nucléotides sont représentés ici de la manière recommandée par la IUPAC- IUB Biochemical Nomenclature Commission, conformément au 37 C.F.R. 1. 822
et à l'usage établi.
La production et l'utilisation des gènes clones, ADN recombinés, vecteurs, cellules hôtes transformées, marqueurs identifiables, protéines, et fragments de protéines, par génie génétique, sont bien connues de l'homme du métier. Voir par exemple le brevet US N 4 761 371 de Bell et al., colonne 6, ligne 3 à colonne 9, ligne 65; le brevet US N 4 877 729 de Clark et al., colonne 4, ligne 38 à colonne 7, ligne 6; le brevet US N 4 912 038 de Schilling, colonne 3, ligne 26 à colonne 14, ligne 12; et le brevet US N 4 879 224 de
Wallner, colonne 6, ligne 8 à colonne 8, ligne 59.
On décrit ici une région nouvellement identifiée de l'ADN génomique de S. agalactiae ("GBS"), qui a été appelée "GBS3.1". La séquence de GBS3.1 présente un degré d'homologie élevé parmi les souches de GBS. Les séquences de GBS3.1 décrites ici sont utiles dans des procédés pour détecter et diagnostiquer le GBS. Par exemple, ces séquences sont utilisables pour concevoir des sondes d'hybridation à utiliser dans des hybridations Southern ou sur tache conventionnelles, ou pour concevoir des amorces d'amplification à utiliser dans des protocoles d'amplification d'acides nucléiques, tels que l'amplification en chaîne par polymérase (ACP), l'amplification en chaîne par ligase (ACL), l'amplification par déplacement de brin (ADB) ou l'amplification par déplacement de brin thermophile (ADBt). On décrit également ici des oligonucléotides, des procédés et des trousses pour la détection, de préférence
la détection à spécificité d'espèce, du GBS.
Les séquences de GBS3.1 décrites ici comprennent les séquences indiquées sous les dénominations SEQ ID N :3, SEQ ID N :7, SEQ ID N :8, et SEQ ID N :9, et leurs séquences complémentaires. Telle qu'utilisée ici, l'expression "séquences de GBS3.1" englobe aussi les séquences de GBS3.1 provenant de souches de GBS autres que celles spécifiquement décrites ici. En d'autres termes, les séquences de GBS3.1 de la présente invention comprennent les produits d'amplification (c'est-à-dire les amplicons) résultant de l'amplification d'acides nucléiques de GBS avec des amorces d'amplification spécifiques de GBS3.1, comme la SEQ ID N :4 et la SEQ ID N :5. Les séquences de GBS3.1 provenant de souches de GBS autres que celles spécifiquement décrites ici seront généralement homologues à au moins 75 % (et mieux encore homologues à 80 %, 85 %,90 % ou même 95 %) d'un segment continu d'ADN se trouvant à l'intérieur des séquences de GBS3.1 indiquées ici sous les désignations SEQ ID N :3, SEQ ID N :7, SEQ ID N :8, et SEQ ID N :9, et seront capables de s'hybrider aux acides nucléiques de GBS dans
des conditions fortement stringentes, comme défini ci-
dessous. Les séquences de GBS3.1 de la présente invention comprennent des séquences qui s'hybrident dans des conditions fortement stringentes à des acides nucléiques de GBS et sont pratiquement homologues aux séquences de GBS3.1 spécifiquement décrites ici, et en particulier les séquences de GBS3.1 décrites ici sous les désignations SEQ ID N :3, SEQ ID N :7, SEQ ID N :8 et SEQ ID N :9. Cette définition est destinée à englober les variations naturelles alléliques dans la séquence de GBS3.1. Telles qu'utilisées ici, les séquences de nucléotides qui sont "pratiquement homologues" le sont à au moins 75 %, et
mieux encore sont homologues à 80 %, 90 % ou même 95 %.
Des conditions d'hybridation fortement stringentes qui vont permettre à des séquences d'ADN homologues de s'hybrider à une séquence d'ADN comme indiqué ici sont bien connues dans la technique. Par exemple, l'hybridation de telles séquences à l'ADN décrit ici peut être réalisée dans 25 % de formamide, 5 x SSC, 5 x solution de Denhardt, avec 100 pg/ml d'ADN simple brin, et 5 % de sulfate de dextrane à 42 C, avec des conditions de lavage de 25 % de formamide, 5 x SSC, 0,1 % de SDS à 42 C pendant minutes, pour permettre l'hybridation de séquences ayant une homologie d'environ 60 %. Des conditions plus stringentes sont représentées par un lavage stringent avec NaCl 0,3 M, citrate de sodium 0,03 M, 0,1 % de SDS à 60 C, ou même 70 C. Voir Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (2ème édition, 1989), incorporé ici à titre de référence dans sa totalité. En général, les séquences de GBS3.1 qui s'hybrident aux séquences de GBS3. 1 décrites ici seront homologues à au moins 75 %, %, 85 %, 90 % ou même 95 % des séquences de GBS3.1
décrites ici.
Les sondes d'hybridation oligonucléotidiques
constituent aussi des aspects de la présente invention.
Tel qu'utilisé ici, le terme "sonde" indique un oligonucléotide qui s'hybride à une séquence cible, typiquement pour faciliter sa détection. Telle qu'utilisée ici, une "séquence cible" se réfère à une séquence d'acide
nucléique à laquelle la sonde se fixe spécifiquement.
Contrairement à une amorce, une sonde n'est pas étendue par une polymérase. La sonde est souvent liée (directement ou indirectement) à un marqueur détectable pour faciliter la détection ou la capture lorsqu'elle est hybridée à la
séquence cible.
Les sondes décrites ici s'hybrident aux acides nucléiques de GBS3.1. De façon caractéristique, les sondes de la présente invention vont s'hybrider à des nucléotides consécutifs des séquences de GBS3.1 décrites ici dans des conditions stringentes, comme défini ci- dessus. En d'autres termes, les sondes de la présente invention vont être homologues à au moins 75 %, 80 %, 85 %, 90 % ou même 95 % de nucléotides consécutifs à l'intérieur des séquences de GBS3.1 décrites ici, en particulier la SEQ ID
N :3, la SEQ ID N :7, la SEQ ID N :8 et la SEQ ID N :9.
Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, les sondes ont des séquences de nucléotides telles qu'indiquées ici sous les désignations SEQ ID N :4, SEQ ID N :5, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :10, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :11, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :12, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :13, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :14, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :15, la SEQ ID N :16, la SEQ ID N :17, la SEQ ID N :18, la SEQ ID N :19, et la SEQ ID N :20, ainsi que
leurs séquences complémentaires.
Comme les acides nucléiques ne nécessitent pas une homologie complète pour s'hybrider, il apparaîtra de façon évidente à l'homme du métier que les séquences sondes spécifiquement décrites ici peuvent être modifiées de façon à être pratiquement homologues aux séquences cibles décrites ici sans perte d'utilité en tant que sondes de GBS. Il est bien connu dans la technique que l'hybridation de séquences d'acides nucléiques homologues et partiellement homologues peut être accomplie par ajustement des conditions d'hybridation pour augmenter ou diminuer la stringence (c'est-à-dire ajustement de la température d'hybridation ou de la teneur en sels du tampon). Les sondes d'hybridation peuvent avoir n'importe quelle longueur convenable. Il n'y a pas de limite inférieure ou supérieure particulière à la longueur de la sonde, du moment que la sonde s'hybride aux acides nucléiques cibles de GBS3.1 et fonctionne efficacement comme une sonde (par exemple facilite la détection). Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la sonde comprend au moins 10 nucléotides consécutifs d'une séquence de GBS3.1, comme défini ci-dessus. Les sondes de la présente invention peuvent être aussi courtes que 60,
, 30, 20, 15 ou 10 nucléotides, ou encore plus courtes.
De la même façon, les sondes peuvent être aussi longues que 20, 40, 50, 60, 75, 100 ou 200 nucléotides, ou même plus longues. La longueur maximale de la sonde est la longueur de la séquence de GBS3.1 particulière sélectionnée. Par exemple, une sonde dérivant de la séquence de GBS de type III (voir Figure 1: SEQ ID N :3)
peut être aussi longue que 336 nucléotides.
Dans un mode de réalisation préféré, la sonde est à spécificité d'espèce, ce qui signifie que dans des conditions stringentes (telles que définies ci-dessus, par exemple un lavage stringent avec NaCl 0,3 M, citrate de sodium 0,03 M, 0,1 % de SDS à 60 C), elle s'hybride uniquement à des acides nucléiques provenant de GBS et ne s'hybride pas à des acides nucléiques provenant de quelconques espèces non GBS, ou le fait dans une mesure négligeable, si bien qu'il n'y a qu'une hybridation ou détection insignifiante d'acides nucléiques non GBS. En d'autres termes, une sonde spécifique de GBS ne s'hybride pas à des acides nucléiques non GBS ou ne les détecte pas (ou ne le fait que dans une mesure insignifiante) dans les mêmes conditions que celles dans lesquelles la sonde
s'hybride aux acides nucléiques de GBS et les détecte.
Un autre aspect de la présente invention est un procédé pour détecter le GBS par utilisation d'une sonde de GBS3.1, telle que définie ci-dessus. Selon ce mode de réalisation de l'invention, une sonde d'acides nucléiques s'hybride à des acides nucléiques de GBS, et l'hybridation entre la sonde et les acides nucléiques de GBS est ensuite détectée. Un mode de réalisation préféré de l'invention est un procédé à spécificité d'espèce (telle que définie ci-dessus) de détection de GBS utilisant une sonde d'hybridation. L'hybridation peut être réalisée selon n'importe quelle technique convenable connue. De façon caractéristique, les hybridations seront réalisées dans des conditions très stringentes. Il apparaîtra de façon évidente à l'homme du métier que les conditions d'hybridation peuvent être modifiées pour augmenter ou diminuer le degré d'hybridation, le niveau de spécificité de l'hybridation, et le niveau d'arrière-plan de la fixation non spécifique (c'est-à-dire par modification de l'hybridation ou des concentrations de sels ou des
températures du lavage).
De façon similaire, la détection de l'hybridation entre la sonde et les acides nucléiques de GBS peut être réalisée par n'importe quel procédé connu dans la technique. La sonde peut contenir un marqueur détectable qui va indiquer l'hybridation entre la sonde marquée et les acides nucléiques de GBS. Le marqueur détectable de la sonde est un fragment qui peut être détecté directement ou indirectement. Pour la détection directe du marqueur, les sondes peuvent être étiquetées avec un radio- isotope et détectées par autoradiographie. En variante, la sonde peut être étiquetée avec un fragment fluorescent et détectée par fluorescence, comme on le sait dans la technique. En variante encore, la sonde peut être indirectement détectée par étiquetage avec un marqueur qui nécessite des réactifs additionnels pour devenir détectable. Des procédés illustrant le marquage indirect comprennent ceux utilisant des agents de chimioluminescence, des enzymes qui produisent des produits réactionnels visibles, et des ligands (par exemple haptènes, anticorps ou antigènes) qui peuvent être détectés par fixation à des partenaires de fixation spécifiques marqués (par exemple fixation d'un haptène à un anticorps marqué). Les marqueurs ligands sont également utiles pour la capture en phase solide de la sonde oligonucléotidiques (c'est-à-dire des sondes de capture). Des exemples de marqueurs comprennent la biotine (détectable par fixation à de l'avidine ou de la streptavidine marquée) et des enzymes, telles que la peroxydase de raifort ou la phosphatase alcaline (détectables par addition de substrats enzymatiques pour produire un produit réactionnel coloré). Les procédés de marquage d'oligonucléotides sont bien connus dans la
technique.
Les amorces d'amplification de GBS3.1 font également partie de la présente invention. Une amorce d'amplification est un oligonucléotide utile pour l'amplification d'une séquence cible par extension de l'oligonucléotide après hybridation à la séquence cible, ou par ligature d'oligonucléotides multiples qui sont
adjacents lorsqu'ils sont hybridés à la séquence cible.
Les amorces oligonucléotidiques de la présente invention sont de préférence utilisées pour détecter le GBS par amplification de séquences cibles d'acides nucléiques de
GBS3.1.
Les copies de la séquence cibles qui sont générées durant la réaction d'amplification sont appelées "produits d'amplification", "amplimères" ou "amplicons". Un produit d'extension se réfère à la copie d'une séquence cible produite par hybridation d'une amorce et extension de l'amorce par une polymérase qui utilise la séquence cible
en tant que matrice.
Telle qu'utilisée ici, la "séquence cible" d'une amorce d'amplification se réfère à une séquence d'acides nucléiques à laquelle l'amorce d'amplification se fixe de façon spécifique et s'amplifie. Elles comprennent la séquence d'acides nucléiques originale à amplifier et son deuxième brin complémentaire ainsi que l'un ou l'autre brin d'une copie de la séquence cible originale générée durant la réaction d'amplification. La partie de l'amorce qui s'hybride à la séquence cible (c'est-à-dire la séquence de fixation cible ou la région d'annellation) peut aussi être utilisée à titre de sonde d'hybridation pour la détection d'acides nucléiques cibles de GBS dans divers procédés d'hybridation d'acides nucléiques, comme
décrit plus en détail ci-dessus.
Ainsi, il apparaîtra de façon évidente à l'homme du métier que les amorces et sondes de la présente invention sont structurellement similaires ou identiques dans de nombreux cas. Les termes "amorce" et "sonde" se réfèrent à la fonction de l'oligonucléotide. Un oligonucléotide peut agir comme une sonde s'il est hybridé à une séquence cible pour capturer ou détecter la séquence cible. En variante, le même oligonucléotide peut agir comme une amorce s'il
est utilisé pour amplifier la cible, comme décrit ci-
dessous. Des bases convenables pour préparer les sondes oligonucléotidiques ou les amorces d'amplification de la présente invention peuvent être choisies parmi les bases nucléotidiques naturelles telles que l'adénine, la cytosine, la guanine, l'uracile, et la thymine; et les bases nucléotidiques non naturelles ou "synthétiques"
telles que la 8-oxoguanine, la 6-mercaptoguanine, la 4- acétylcytidine, la 5-(carboxyhydroxyéthyl)uridine, la 2'-
O-méthylcytidine, la 5-carboxyméthylaminométhyl-2-
thiouridine, la 5-carboxyméthylaminométhyluridine, la
dihydrouridine, la 2'-O-méthylpseudouridine, la p-D-
galactosylquéosine, la 2'-O-méthylguanosine, l'inosine, la
N6-isopentényladénosine, la 1-méthyladénosine, la 1-
méthylpseudouridine, la 1-méthylguanosine, la 1-
méthylinosine, la 2,2-diméthylguanosine, la 2-
méthyladénosine, la 2-méthylguanosine, la 3- méthylcytidine, la 5-méthylcytidine, la N6-méthyladénosine, la 7- méthylguanosine, la 6-méthylaminométhyluridine, la 5- méthoxyaminométhyl-2-thiouridine, la 0,D-mannosylquéosine, la 5- méthoxycarbonylméthyluridine, la 5-méthoxyuridine, la
2-méthylthio-N6-isopentényladénosine, la N-((9-0-D-
ribofuranosyl-2-méthylthiopurine-6-yl)carbamoyl)thréonine,
la N-((9-3-D-ribofuranosylpyridine-6-yl)-N-
méthylcarbamoyl)thréonine, l'ester méthylique de l'acide uridine-5oxyacétique, l'acide uridine-5-oxyacétique, la
wybutoxosine, la pseudouridine, la quéosine, la 2-
thiocytidine, la 5-méthyl-2-thiouridine, la 2-thiouridine,
la 2-thiouridine, la 5-méthyluridine, la N-((9-p-D-
ribofuranosylpurine-6-yl)carbamoyl)thréonine, la 2'-O-
méthyl-5-méthyluridine, la 2'-O-méthyluridine, la
wybutosine, et la 3-(3-amino-3-carboxypropyl)uridine.
De même, on peut aussi employer des analogues chimiques d'oligonucléotides (par exemple des oligonucléotides dans lesquels les liaisons phosphodiester ont été modifiées, par exemple en méthylphosphonate, phosphotriester, phosphorothioate, phosphorodithioate, ou phosphoramidate). On peut obtenir une protection contre la dégradation en utilisant une stratégie de "coiffage à l'extrémité 3'" par laquelle des liaisons résistantes aux nucléases remplacent les liaisons phosphodiester à l'extrémité 3' de l'oligonucléotide. Voir Tidd et Warenius, Br. J. Cancer 60, 343 (1989); Shaw et al. , Nucleic Acids Res. 19, 747 (1991). Les liaisons phosphoramidate, phosphorothioate et méthylphosphonate fonctionnent toute de façon adéquate de cette manière. Une modification plus importante de la charpente phosphodiester s'est avérée conférer une certaine stabilité et peut aussi permettre une meilleure affinité
et une perméation cellulaire accrue des oligonucléotides.
Voir Milligan, et al., J. Med. Chem. 36, 1923 (1993). De nombreuses stratégies chimiques différentes ont été employées pour remplacer la totalité de la charpente phosphodiester par de nouvelles liaisons. Id. Des analogues de charpente comprennent les liaisons phosphorothioate, phosphorodithioate, méthylphosphonate, phosphoramidate, boranophosphate, phosphotriester,
formacétal, 3'-thioformacétal, 5'-thioformacétal, 5'-
thioéther, carbonate, 5'-N-carbamate, sulfate, sulfonate, sulfamate, sulfonamide, sulfone, sulfite, sulfoxyde, sulfure, hydroxylamine, méthylène(méthylimino) (MMI) ou méthylène-oxy(méthylimino) (MOMI). On préfère en particulier les oligonucléotides à modification phosphorothioate et méthylphosphonate du fait de leur disponibilité par une synthèse d'oligonucléotides automatisée. Id. L'oligonucléotide peut être un "acide nucléique peptidique", tel que décrit dans Nielsen et al., Science 254, 1497 (1991). La seule exigence est que la sonde oligonucléotidique possède une séquence dont au moins une partie est capable de se fixer à une partie de
la séquence d'une molécule d'ADN cible.
Les amorces d'amplification décrites ici s'hybrident à des acides nucléiques de GBS3.1 et les amplifient. Quand un ensemble de deux ou plus de deux amorces d'amplification est utilisé pour amplifier des acides nucléiques GBS3.1, on préfère que l'ensemble d'amorces d'amplification soit contenu dans une solution aqueuse commune. De façon caractéristique, les amorces d'amplification vont s'hybrider à des nucléotides consécutifs des séquences de GBS3.1 décrites ici dans des conditions stringentes telles que définies plus haut. En d'autres termes, les amorces de la présente invention vont être homologues à au moins 75 %, 80 %, 85 %, 90 % ou même 95 % de nucléotides consécutifs à l'intérieur des séquences de GBS3.1 décrites ici, en particulier la SEQ ID
N :3, la SEQ ID N :7, la SEQ ID N :8, et la SEQ ID N :9.
Les amorces d'amplification peuvent avoir une quelconque longueur souhaitable. Il n'y a pas de limite inférieure ou supérieure particulière à la longueur de l'amorce, du moment que l'amorce s'hybride à l'ADN de GBS3.1 cible e-t agit efficacement comme une amorce d'amplification. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les amorces comprennent au moins 10 nucléotides consécutifs d'une séquence de GBS3.1, comme défini ci-dessus. Les amorces peuvent être aussi courtes que 50, 40, 30, 20, 15 ou 10 nucléotides, ou même plus courtes. De la même façon, les amorces peuvent être aussi longues que 20, 40, 50, 60, 75, 100 ou 200 nucléotides, ou
même plus longues.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'amorce d'amplification est à spécificité d'espèce, ce qui signifie que dans des conditions stringentes (telles que définies ci-dessus), l'amorce d'amplification s'hybride à, amplifie et détecte uniquement des acides nucléiques de GBS, et ne s'hybride pas à, n'amplifie pas et ne détecte pas les acides nucléiques de n'importe quelle autre espèce non GBS, ou bien le fait dans une mesure négligeable, si bien qu'il n'y a qu'une hybridation, une amplification et une détection insignifiantes d'acides nucléiques non GBS. En d'autres termes, une amorce d'amplification spécifique de GBS ne s'hybride pas à, n'amplifie pas et ne détecte pas des acides nucléiques non GBS (ou ne le fait que dans une mesure insignifiante) dans les mêmes conditions que celles dans lesquelles l'amorce d'amplification s'hybride à,
amplifie et détecte des acides nucléiques de GBS.
Dans des modes de réalisation particuliers de la présente invention, l'amorce d'amplification ou sa séquence de fixation cible a une séquence telle que donnée par la SEQ ID N :4, la SEQ ID N :5, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :10, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :11, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :12, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :13, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :14, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :15, la SEQ ID N :15, la SEQ ID N :16, la SEQ ID N :17, la SEQ ID N :18, la SEQ ID N :19 ou la SEQ ID N :20. D'une autre façon, l'amorce d'amplification a une séquence telle que donnée par la SEQ ID N :10, la SEQ ID N :11, la SEQ ID N :12, la SEQ ID N :13, la SEQ ID N :14, ou la SEQ ID N :15. De préférence, l'amorce d'amplification a une séquence telle que donnée par la SEQ ID N :4, la SEQ ID N :5, la SEQ ID N :10, la SEQ ID N :11, la SEQ ID N :12, la SEQ ID N :13, la SEQ ID N :14, la SEQ ID N :15, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :10, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :11, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :12, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :13, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :14, ou la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :15. Mieux encore l'amorce d'amplification a une séquence telle que donnée par la SEQ ID N :4, la SEQ ID N :5, la SEQ ID N :10 ou la SEQ ID N :13. Comme les acides nucléiques ne nécessitent pas une homologie complète pour s'hybrider, il apparaîtra de façon évidente à l'homme du métier que les séquences amorces spécifiquement décrites ici peuvent être modifiées de façon à être pratiquement homologues des séquences amorces décrites ici sans perte d'utilité en tant qu'amorces d'amplification de GBS. Il est bien connu dans la technique que l'hybridation de séquences d'acides nucléiques homologues et partiellement homologues peut être accomplie par ajustement des conditions d'hybridation pour augmenter ou diminuer la stringence (c'est- à-dire ajustement de la température d'hybridation ou de la teneur
en sels du tampon).
Les amorces d'amplification de l'invention décrites ici peuvent être utilisées dans n'importe quel procédé d'amplification d'acides nucléiques connu dans la technique. Ces procédés comprennent, mais sans s'y limiter, l'amplification en chaîne par polymérase (ACP; décrite dans les brevets US N 4 683 195, 4 683 202, 4 800 159, 4 965 188), l'amplification par déplacement de brin (ADB; décrite par Walker et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89, 392 (1992), incorporé ici à titre de
référence dans sa totalité; Walker et al., Nucl. Acids.
Res. 20, 1691 (1992), incorporé ici à titre de référence dans sa totalité; brevet US N 5 270 184), l'amplification par déplacement de brin thermophile (ADBt; brevet US N 5 648 211 et demande de brevet européen N EP 0 684 315 de Frasier et al. ), la
réplication de séquence auto-entretenue (3SR; J.C.
Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874 (1990)), l'amplification basée sur des séquences d'acides nucléiques (NASBA; brevet US N 5 130 238 de Cangene), le système à réplicase Qp (P. Lizardi et ai., BioTechnology 6, 1197 (1988)), ou l'amplification basée sur une transcription (D.Y. Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173 (1989)). De préférence, les amorces d'amplification de la présente invention sont utilisées pour réaliser une ADB ou une ADBt, et mieux encore une
ADBt.
Pour une amplification par ADBt (ou ADB), les amorces oligonucléotidiques sont de préférence choisies de telle sorte que la teneur en GC soit faible, de préférence inférieure à 70 % de la composition en nucléotides totale de la sonde. De façon similaire, pour une ADBt, la séquence cible a de préférence une faible teneur en GC pour minimiser les structures secondaires. Une amorce d'amplification à utiliser en ADBt comprend une séquence de fixation cible, un site de reconnaissance pour une endonucléase de restriction, et une queue. La séquence de fixation cible se trouve à l'extrémité 3' de l'amorce d'amplification par ADBt. Elle s'hybride à l'extrémité 3' de la séquence cible. La séquence de fixation cible confère une spécificité d'hybridation sur l'amorce d'amplification. Un site de reconnaissance pour une endonucléase de restriction se trouve en 5' de la séquence de fixation cible. L'endonucléase de restriction est une endonucléase qui va couper un brin d'un complexe d'ADN quand le site de reconnaissance est hémimodifié, comme décrit par Walker et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89, 392 (1992); Nucl. Acids. Res. 20, 1691 (1992); ces deux publications sont incorporées ici à titre de référence dans leur totalité. La queue de l'amorce d'amplification est constituée des nucléotides 5' du site de reconnaissance par l'endonucléase de restriction. La longueur et la séquence de la queue ne sont généralement pas déterminantes. La queue a la fonction d'un site de réamorçage par une polymérase quand le reste de l'amorce d'amplification est coupé et déplacé durant la ADBt. Telle qu'utilisée ici, une "amorce bumper" ou "amorce externe" est une amorce utilisée pour déplacer des produits d'extension d'amorce. L'amorce bumper s'hybride à une séquence cible en amont de la séquence de fixation cible d'amorce d'amplification de telle sorte que l'extension de l'amorce bumper déplace l'amorce d'amplification en aval et son produit d'extension. En général, il ne sera pas nécessaire que les amorces bumper utilisées dans des réactions d'ADB et d'ADBt soient spécifiques de GBS. Les amorces bumper ne sont nécessaires que pour s'hybrider à leurs cibles en amont des amorces d'amplification, si bien que lorsque les amorces bumper sont étendues, elles vont déplacer l'amorce d'amplification et son produit d'extension. La séquence des amorces bumper n'est par conséquent en général pas déterminante, et elle peut dériver de n'importe quelle séquence cible en amont qui -est suffisamment proche du site de fixation de l'amorce d'amplification pour permettre le déplacement du produit d'extension d'amorce d'amplification après extension de l'amorce bumper. Des mésappariements occasionnels avec la cible dans la séquence d'amorce bumper ou une certaine hybridation croisée avec des séquences non cibles n'ont généralement pas un effet négatif sur l'efficacité de l'amplification, du moment que l'amorce bumper s'hybride toujours à la séquence cible spécifique. L'extension d'amorces bumper constitue un procédé pour déplacer les produits d'extension d'amorces d'amplification, mais un chauffage convient également. Dans un mode de réalisation de l'invention, les amorces bumper comprennent au moins 10 nucléotides consécutifs d'une séquence de GBS3.1, telle que définie cidessus. Dans des modes de réalisation préférés, une ou plusieurs des amorces bumper ont des séquences telles que données ici par la SEQ ID N :16 et la SEQ ID N :17. On peut aussi utiliser des amorces bumper en tant que séquence de fixation cible d'une amorce d'amplification ou en tant que sonde d'hybridation,
chacune telle que définie ci-dessus.
Pour des procédés d'amplification qui ne nécessitent pas de séquences spécialisées aux extrémités de la cible (par exemple ACP et ACL), l'amorce d'amplification est, de façon caractéristique, constituée essentiellement seulement de la séquence de fixation cible. Dans le cas de procédés d'amplification qui nécessitent des amorces contenant des séquences spécialisées en plus de la séquence de fixation cible, la séquence spécialisée peut être liée à la séquence de fixation cible par utilisation de procédés de routine pour la préparation d'oligonucléotides sans modification de la spécificité d'hybridation de la séquence de fixation cible. Des exemples illustratifs de procédés d'amplification nécessitant des séquences amorces spécialisées pour l'amplification comprennent les suivants: ADB et ADBt, 3SR, NASBA, et l'amplification basée sur une transcription. Ces séquences spécialisées ne s'hybrident pas aux acides nucléiques cibles, mais, à la place, réalisent une fonction séparée, qui est nécessaire pour l'amplification (par exemple le site d'enzyme de restriction et la queue d'amorce dans des amorces pour ADB
et ADBt).
Un autre aspect de la présente invention est un procédé de détection de GBS par hybridation d'au moins une amorce d'amplification comprenant une séquence de fixation cible à des acides nucléiques de GBS, amplification des acides nucléiques de GBS, et ensuite détection des acides nucléiques de GBS amplifiés. On préfère les procédés à spécificité d'espèce (telle que définie ci-dessus) de détection de GBS utilisant une ou plusieurs amorces d'amplification. La ou les amorces d'amplification s'hybrident aux acides nucléiques provenant de la séquence de GBS3.1, les amplifient et les détectent. De façon caractéristique, la séquence cible de l'amorce d'amplification sera un ADN double brin de la séquence de
GBS3.1 du génome de GBS.
De préférence, les procédés de l'invention décrits ici emploient un ensemble de deux ou plus de deux amorces d'amplification pour amplifier les séquences cibles de GBS. En variante, on peut utiliser une amorce d'amplification unique pour réaliser la présente invention. Un "ensemble d'amorces" comprend deux ou plus de deux amorces qui sont conçues ou adaptées pour agir ensemble afin d'amplifier la séquence cible. Un ensemble d'amorces peut ne comprendre que des amorces d'amplification ou il peut comprendre des amorces bumper (par exemple pour des réactions par ADB et ADBt). De préférence, l'ensemble d'amorces comprend deux amorces d'amplification pour une ACP ou deux amorces d'amplification et deux amorces bumper pour une ADB/ADBt. A titre d'autre alternative, l'ensemble d'amorces peut contenir une ou plusieurs amorces additionnelles ou
substituées pour réaliser les procédés de l'invention. Les amorces d'amplification à utiliser dans la mise en oeuvre30 des procédés décrits ici sont telles qu'indiquées ci-
dessus. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les amorces d'amplification sont hybridées aux acides nucléiques de GBS et étendues. Des procédés d'amplification impliquant des réactions d'extension comprennent, mais sans s'y limiter, les ADB et ADBt. On peut utiliser n'importe quel protocole d'amplification reposant sur une hybridation cyclique spécifique d'amorces5 à l'acide nucléique cible, tel que ACP, ADB, ADBt, 3SR, le système à réplicase QP, ou un système basé sur une transcription. On préfère une amplification par ADB et
ADBt, et mieux encore par ADBt.
Les réactions d'ADBt peuvent être réalisées comme décrit dans le brevet US N 5 648 211 et la demande de brevet européen N EP 0 684 315 de Frasier et al. En bref, une amplification par ADBt se base sur 1) l'aptitude d'une endonucléase de restriction à couper le brin non modifié d'une forme hémiphosphorothioate de son site de reconnaissance double brin, et 2) l'aptitude de certaines polymérases à amorcer la réplication au niveau de la coupure et à déplacer le brin non matrice en aval. Dans des réactions d'ADBt, l'extension d'amorces, la coupure d'un site de reconnaissance par une endonucléase de restriction hémimodifié, le déplacement de produits d'extension simple brin, l'annellation d'amorces aux produits d'extension et l'extension subséquente des amorces se produisent en même temps dans le mélange réactionnel. Ceci est contraire à l'ACP, dans laquelle les étapes de la réaction se déroulent en phases ou cycles individuels en résultat des caractéristiques de cyclage de
température de la réaction.
Les réactions d'amplification employant les amorces de la présente invention peuvent incorporer de la thymine, comme décrit par Walker et al. (Proc. Nat'1 Acad. Sci. USA 89, 392 (1992); Nucl. Acids Res. 20, 1691 (1992); ces deux publications sont incorporées ici à titre de référence dans leur totalité), ou bien elles peuvent
remplacer partiellement ou totalement le TPP par du 5'-
triphosphate de 2'-désoxyuridine dans la réaction pour réduire la contamination croisée avec des produits d'amplification transportés à partir de réactions d'amplifications antérieures avec les réactifs, dispositifs de pipetage et surfaces de laboratoire, par exemple, comme enseigné dans le brevet européen N 0 624 643. La désoxyuridine (dU) est incorporée dans les produits d'amplification et peut être excisée par traitement à l'ADN uracile- glycolase (UDG). Ces sites abasiques empêchent l'amplification de quelconques produits d'amplification contaminants dans des réactions d'amplification subséquentes. L'UDG peut être inactivée par un inhibiteur d'UDG avant réalisation de l'amplification subséquente pour empêcher une excision de la dU dans les produits d'amplification nouvellement formés. Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, l'amplification est réalisée par hybridation de deux ou plus de deux amorces d'amplification aux acides nucléiques de GBS, de telle sorte que les amorces soient adjacentes entre elles lorsqu'elles sont hybridées à leurs séquences cibles respectives, et ensuite ligature des amorces d'amplification hybridées pour produire un produit
d'amplification plus long.
La présence de GBS ou d'acides nucléiques de GBS est détectée par détermination de la présence des acides nucléiques de GBS amplifiés. Les produits d'amplification peuvent être détectés par hybridation à une sonde marquée, comme décrit ci-dessus. Quand on utilise une sonde pour détecter l'amplification, la sonde est typiquement choisie pour s'hybrider à une séquence qui se trouve entre les amorces d'amplification (c'est-à-dire une sonde interne). Quand l'amplification est réalisée par ACL, on peut utiliser une sonde qui recouvre les deux amorces et ne détecte pas les amorces non ligaturées. D'une autre façon, les produits d'amplification peuvent être détectés par leur taille caractéristique, par exemple par électrophorèse suivie d'une coloration au bromure d'éthidium pour visualiser les types d'acides nucléiques. Ceci constitue le procédé préféré pour détecter les produits d'amplification dans des procédés par ACL. Dans une autre variante, on utilise une amorce d'amplification marquée. Dans encore une autre variante, une sonde d'amplification/sonde interne marquée est étendue sur la séquence cible (amorce de détection) pour la détection de produits d'amplification, comme décrit par Walker et al.,
Proc. Nat'1 Acad. Sci. USA 89, 392 (1992); Nucl. Acids.
Res. 20, 1691 (1992); ces deux publications sont
incorporées ici à titre de référence dans leur totalité.
Des exemples de procédés de détection spécifiques utilisables pour détecter des produits d'amplification comprennent un procédé chimioluminescent dans lequel on détecte des produits amplifiés en utilisant une sonde de capture biotinylée et une sonde de détection conjuguée à
une enzyme, comme décrit dans le brevet US N 5 470 723.
-Après hybridation de ces deux sondes à des sites différents de la région de détermination de la séquence cible (c'est-à-dire entre les sites de fixation des deux amorces d'amplification), le complexe est capturé sur une plaque de microtitrage revêtue de streptavidine, et le signal chimioluminescent est développé et lu sur un luminomètre. A titre d'autre variante, une amorce de signal, telle que décrite dans le brevet européen N 0 678 582, est incorporée dans la réaction d'amplification pour faciliter la détection du produit d'amplification. Selon ce mode de réalisation, des produits d'amplification secondaire marqués sont générés durant l'amplification d'une manière dépendante de l'amplification de la cible et peuvent être détectés à titre d'indication de l'amplification de cible au moyen du
marqueur associé.
La présente invention propose aussi des trousses pour détecter des acides nucléiques de GBS, comprenant une sonde d'acide nucléique, une amorce d'amplification, de préférence une paire d'amorces d'amplification ou un ensemble d'amorces, chacune comme décrit ci- dessus. On préfère que les procédés, sondes, amorces d'amplification, et ensembles d'amorces pour détecter le GBS, tels que décrits ci-dessus, soient à spécificité d'espèce. La trousse peut éventuellement contenir des moyens pour détecter les acides nucléiques de GBS, utilisant un acide nucléique oligonucléotidique ou une amorce d'amplification, comme décrit ci-dessus. De préférence, la sonde oligonucléotidique ou l'amorce d'amplification comprend au moins 10 nucléotides consécutifs d'une séquence de GBS3.1. Dans un autre mode de réalisation, l'amorce d'amplification contient une séquence pour l'amplification d'un acide nucléique cible en plus d'une
séquence de fixation cible, chacune telle que décrite ci-
dessus. La trousse peut en outre comprendre d'autres composants et réactifs pour réaliser le procédé d'hybridation ou d'amplification (par exemple hybridation Southern, hybridation sur tache, ACP, ADB, etc, et analogues). A titre d'exemple illustratif, une telle trousse peut contenir au moins une amorce d'amplification selon la présente invention. Pour la détection par hybridation, elle peut aussi comprendre une solution d'hybridation, par exemple à 25 % de formamide, 5 x SSC, x solution de Denhardt, 100 pg/ml d'ADN simple brin, et % de sulfate de dextrane, ou d'autres réactifs que l'on sait être utiles pour l'hybridation de sonde. Voir Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (2ème édition, 1989), incorporé ici à titre de référence dans sa totalité. D'une autre façon, des réactifs utilisables avec l'un des procédés d'amplification d'acides nucléiques connus peuvent être incorporés avec des amorces d'amplification de GBS3.1. Les composants de la trousse sont conditionnés ensemble dans un récipient commun, comprenant, de façon caractéristique, des instructions écrites pour réaliser des modes de réalisation spécifiques sélectionnés des procédés décrits ici. Des composants pour les procédés de détection, tels que décrits ci-dessus, peuvent éventuellement être incorporés dans la trousse, comme par exemple une deuxième sonde, et/ou des réactifs et moyens pour réaliser une détection de marqueur (par exemple radiomarqueur,
substrats enzymatiques, anticorps, etc, et analogues).
Les procédés, sondes, amorces d'amplification, et trousses, décrits ici, sont utilisables pour détecter le GBS dans un quelconque échantillon suspecté de contenir du GBS. Les échantillons peuvent comprendre des acides nucléiques isolés, des micro-organismes isolés, ou il peut s'agir d'échantillons cliniques. De façon caractéristique, ces échantillons cliniques sont sous la forme d'un fluide ou tissu biologique (par exemple lait, expectoration, lavages bronchiques, lavages gastriques, sang, lait,
lymphe, peau, liquide céphalo-rachidien et tissus mous).
Les échantillons peuvent aussi être obtenus par des écouvillons, par exemple des écouvillons vaginaux ou rectaux. Comme le GBS infecte tant l'homme que les autres espèces animales, la présente invention est applicable à des protocoles diagnostiques tant humains que vétérinaire et l'échantillon peut être obtenu à partir de l'une ou
l'autre source.
Les exemples suivants sont proposés pour illustrer la présente invention et ne devraient pas être compris comme
la limitant.
Exemple 1
Identification d'un fragment d'ADN spécifique de GBS
(GBS3.1)
On utilise une amplification en chaîne par polymérase à amorce arbitraire (ACP-AA) pour créer un affichage différentiel de produits d'amplifications à partir d'ADN génomique provenant de 5 espèces de GBS et de 9 espèces non GBS (Tableau 1). Les amorces pour 1'ACP-AA sont les suivantes: Amorce #27: 5' CCGGAACATCAGCAGCGA 3' (SEQ ID N :1) Amorce #54: 5' CAGTGTACTGGATGCTCT 3' (SEQ ID N :2) Les conditions des réactions d'amplification sont
indiquées ci-dessous.
Conditions réactionnelles pour ACP (50 vil) Tris-HCl 10 mM, pH 8,3 (à 25 C) KC1 50 mM MgCl2 1,5 mM 0,001 % (p/v) de gélatine dNTPs 0,2 mM Amorce #27 marquée au 32p 0,2 jiM Amorce #54 marquée au 32p 0,2 pM ng d'ADN génomique provenant de chaque souche et servant de matrice 2,5 U d'ADN polymérase de Taq Gold (Perkin-Elmer) On marque les amorces en 5' avec un marqueur radioactif (32p) conformément aux instructions du fabricant
(Random Primed DNA Labeling Kit, Boehringer Mannheim).
On réalise 1'ACP-AA dans un dispositif à thermocycle Perkin-Elmer Cetus (modèle 480) en utilisant
l'amplification suivante ci-dessous.
Profil d'ACP C 3 minutes Puis passer à: 94 C 1 minute 37 C 1 minute 72 C 2 minutes cycles Puis passer à 4 C jusqu'au lendemain On isole les produits d'amplification et on les visualise par électrophorèse sur un gel d'acrylamide dénaturant à 8 % (100 W) pendant 5 heures, suivie d'une autoradiographie (exposition jusqu'au lendemain avec un
film médical pour rayons X Fuji).
On identifie une bande unique qui est présente dans toutes les souches de GBS, mais qui est absente dans toutes les espèces non GBS testées. Cette bande est
appelée "GBS3.1".
Tableau 1
Organismes cibles pour amplification en chaîne par polymérase à amorce arbitraire Cibles ID# GBS Ia ATCC 12400 GBS Ib ATCC 12401 GBS Ic ATCC 25941
GBS II ATCC 12973
GBS III ATCC 12403
Strep. Groupe A ATCC 49399 Strep. Groupe C ATCC 12388 Strep. Groupe D ATCC 29212 Strep. Groupe F ATCC 12390 Strep. Groupe G ATCC 9106 Strep. Pneumoniae ATCC 27336 Haemophilus influenza ATCC 33533 Neisseria gonorrhoeae ATCC 23970 Neisseria meningitidis ATCC 13090
Exemple 2
Réamplification du fragment d'ADN de GBS3.1 par amplification en chaînepar polymérase à amorce arbitraire
(ACP-AA)
On excise du gel la bande de GBS3.1, et on extrait l'ADN en faisant bouillir la tranche de gel d'acrylamide dans 100 pl d'eau distillée stérile pendant 15 minutes, puis en précipitant à l'éthanol en utilisant du glycogène en tant que support. On utilise 5 pl de l'ADN extrait pour réamplifier la bande de GBS3.1 par ACP-AA en utilisant les amorces de l'Exemple 1 (SEQ ID N :l et SEQ ID N :2). Les conditions réactionnelles de l'ACP-AA sont telles que décrites dans l'Exemple 1, avec utilisation de 5 pl de l'ADN extrait à la plage des 5 ng d'ADN génomique de
matrice. Le profil d'amplification est tel qu'indiqué ci-
dessous. Profil d'ACP C 2 minutes Puis passer à: 94 C 1 minute 58 C 1 minute 72 C 2 minutes 35 cycles Puis passer à 4 C jusqu'au lendemain On isole et visualise les produits d'amplification de la façon décrite dans l'Exemple 1. Un produit d'ACP d'environ 350 pb (comme prévu) est visible, qui représente
le fragment de GBS3.1.
Exemple 3
Clonage du fragment de GBS3.1 On clone le fragment de GBS3.1 réamplifié obtenu dans l'Exemple 2 dans le vecteur PCR TA II (Invitrogen; Carlsbad, CA) en suivant les instructions du fabricant. On transforme des cellules bactériennes avec le vecteur pTA II - GBS3.1. La région de clonage multiple du vecteur pTA II a deux sites EcoRI flanquant l'insérat, et la présence du fragment de GBS3.1 dans les colonies bactériennes transformées est confirmée par digestion par EcoRI. La digestion par restriction libère un fragment d'ADN ayant une longueur d'environ 350 paires de bases, correspondant
au fragment de GBS3.1.
Exemple 4
Séquençage du fragment de GBS3.1 On réalise le séquençage du fragment d'ADN de GBS3.1 cloné dans le vecteur pTA II en utilisant des amorces conçues pour les régions promoteurs M13+ et SP6 du vecteur. On utilise la trousse de séquençage cyclique ABI PRISM Terminator (Perkin-Elmer) pour cycler la séquence GBS3.1 dans un dispositif Perkin-Elmer Cetus Thermocycler (modèle 480) en suivant les protocoles du fabricant. On purifie les produits amplifiés et on les fait passer dans un dispositif de séquençage d'ADN Applied Biosystems 373 DNA Sequencer. La séquence de GBS3.1 provenant de la souche de GBS de type III est présentée sur la Figure 1 (SEQ ID N :3). On ne trouve pas de séquence d'ADN similaire sur les 800 séquences entrées dans la génothèque
GenBank pour l'espèce Streptococcus.
Exemple 5
Criblage initial de GBS3.1 pour la spécificité d'espèce En se basant sur l'information de séquence obtenue dans l'Exemple 4, on conçoit des amorces pour ACP spécifiques de GBS3.1, comme indiqué ci-dessous: Séquences d'amorces pour ACP Amorce GBS3.1-5' 5' AAGCAATTCAGATCATTTTTCA 3' (SEQ ID N :4) Amorce GBS3.1-3' 5' GAGATTAATTTTTGTTTATGAG 3' (SEQ ID N :5) En utilisant les amorces de GBS3.1, on amplifie l'ADN
génomique de 5 souches de GBS et de 10 espèces non GBS.
Les conditions de la réaction d'ACP sont les mêmes que celles décrites dans l'Exemple 1, sauf qu'on utilise 50 ng d'ADN génomique en tant que matrice. Les résultats sont présentés ci-dessous dans le Tableau 2. Toutes les souches de GBS sont amplifiées avec succès par 1'ACP utilisant les amorces spécifiques. de GBS3.1, tandis qu'aucune des espèces non GBS ne présente de quelconques produits d'amplification détectables. Ces résultats initiaux indiquent que les amorces de GBS3.1 affichent une
spécificité complète pour GBS.
Tableau 2
Amplification d'ADN génomique de GBS avec les amorces pour ACP spécifiques de GBS3.1 Souches amplifiées ID# Amplification GBS Ia ATCC 12400 + GBS Ib ATCC 12401 + GBS Ic ATCC 25941 +
GBS II ATCC 12973 +
GBS III ATCC 12403 +
Strep. Groupe A ATCC 49399 -
Strep. Groupe C ATCC 12388 -
Strep. Groupe D ATCC 29212 -
Strep. Groupe F ATCC 12390 -
Strep. Groupe G ATCC 9106 -
Strep. Pneumoniae ATCC 27336 -
Strep. Pneumoniae ATCC 6303 -
Haemophilus influenza ATCC 33533 -
Neisseria gonorrhoeae ATCC 23970 -
Neisseria meningitidis ATCC 13090 Neisseria meningitidlis ATCC 13090
Exemple 6
Spécificité et réactivité croisée des amorces pour ACP de
GBS3.1
On utilise les amorces pour ACP de l'Exemple 5 pour étudier davantage la spécificité d'espèce du fragment de GBS3.1. On amplifie de l'ADN génomique provenant de 22 souches de GBS et de 40 espèces non GBS en utilisant les amorces pour ACP de GBS3.1. Les conditions réactionnelles pour l'ACP sont telles que décrites dans l'Exemple 1, sauf qu'on amplifie dans chaque réaction 50 ng d'ADN génomique de matrice. La séquence d'amplification par ACP est telle
qu'indiquée ci-dessous.
Profil d'ACP C 8 minutes Puis passer à: 94 C 1 minute 58 C 1 minute 72 C 1 minute cycles Puis passer à 4 C jusqu'au lendemain On isole et visualise les produits d'amplification par ACP par électrophorèse et autoradiographie de la façon
décrite dans l'Exemple 1. Les résultats sont présentés ci-
dessous dans le Tableau 3. Toutes les souches de GBS sont amplifiées par les amorces de GBS3.1, tandis qu'aucune des espèces non GBS évaluées n'est amplifiée. Ces résultats indiquent que les amorces de GBS3.1 vont identifier toutes les souches de GBS, mais ne vont pas réagir de façon
croisée avec l'ADN provenant d'espèces non GBS.
Tableau 3
Spécificité et réactivité croisée des amorces pour ACP spécifiques de GBS3.1 Souches amplifiées ID# Amplification par ACP GBS Ia ATCC 12400 + GBS Ib ATCC 12401 + GBS Ic ATCC 25941 +
GBS II ATCC 12973 +
GBS III ATCC 12403 +
GBS 13813 +
GBS 747 +
GBS T-1964 +
GBS T-33 +
GBS T-35 +
GBS T-3282 +
*GBS T-32 +
GBS T-31 +
GBS T-2887 +
GBS T-1952 +
GBS T-3863 +
GBS T-37 +
GBS 12040 +
GBS AAAII +
GBS 4768 +
GBS 6638 +
GBS 11586 +
Tableau 3 - Suite Spécificité et réactivité croisée des amorces pour ACP spécifiques de GBS3.1 Espèces non GBS ID# Amplification par ACP Strep. Groupe A ATCC 49399 Strep. Groupe C ATCC 12388
Strep. Groupe C 152 -
Strep. Groupe D ATCC 29212 Strep. Groupe F ATCC 12390 Strep. Groupe G ATCC 9106
Strep. Anginosus ATCC 27335 -
Strep. Bovis ATCC 33317 -
Strep. Pneumoniae ATCC 6303 -
Strep. Pneumoniae ATCC 27336 -
Espèces non GBS testées dans 8 groupes
Actinobacter lwoffi ATCC 19901 -
Branhamella catarrhlis ATCC 25240 -
Candida albicans ATCC 44808 -
Ch20amydia trachomais LGV-2 Chlamydia trachomatis LGV-2J Chlamydia trachomatis J Chlamydia trachomatis
Gardnerella vaginalis ATCC 14018 -
Haemophilus influenza ATCC 33533 Kingella kingae ATCC 23330
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 -
Moraxella lacunata ATCC 17967 -
Mycoplasma orale ATCC 23714 -
Neisseria cinerea ATCC 14685 -
Neisseria elongata ATCC 25295 -
Neisseria flavescens ATCC 13120 -
Tableau 3 - Suite Spécificité et réactivité croisée des amorces pour ACP spécifiques de GBS3.1 Non GBS/Réunies ID# Amplification par ACP Neisseria gonorrhoeae ATCC 19424 Neisseria gonorrhoeae ATCC 35541 Neisseria gonorrhoeae BDMS 2900 Neisseria gonorrhoeae BDMS 1632 Neisseria lactamica ATCC 44418
Neisseria lactamica ATCC 49142 -
Neisseria méningitidis ATCC 13077 -
Neisseria méningitidis ATCC 13090 -
Neisseria mucosa ATCC 19696 -
Neisseria sicca ATCC 29193 -
Neisseria subflava ATCC 14799 -
Proteus mirabolis ATCC 29906 -
Staph. aureus ATCC 12598 -
Salmonella minnesota ATCC 9700 -
Tricomonas vaginalis ATCC 30001 -
Exemple 7
Séquençage du fragment de GBS3.1 provenant de quinze souches de GBS Pour déterminer le degré d'homologie de séquence dans la séquence de GBS3.1 parmi les souches de GBS, on utilise les amorces spécifiques de GBS3.1 pour amplifier et cycler la séquence du fragment de GBS3.1 provenant de quinze des souches de GBS étudiées dans l'Exemple 6. Les 15 souches de GBS utilisées pour le séquençage sont présentées dans le Tableau 4. On purifie les produits d'amplification par ACP obtenus dans l'Exemple 6 en utilisant le système Qiagen Qiaex II conformément aux instructions du fabricant. On utilise chaque fragment d'ADN amplifié purifié en tant que matrice pour le séquençage cyclique, comme décrit dans l'Exemple 4. On réalise le séquencage des fragments d'ADN en utilisant les amorces spécifiques de GBS3.1 (GBS3.1- 5' et GBS3.1-3'), comme indiqué dans
l'Exemple 5.
Les séquences de GBS3.1 provenant des 15 souches de GBS sont présentées sur la Figure 2. Les séquences sont alignées et une séquence de GBS3.1 consensus (SEQ ID N :6) est déterminée, comme le montre la Figure 2. Les 15 souches de GBS représentent quatre séquences de GBS3.1 différentes (SEQ ID N :3, SEQ ID N :7, SEQ ID N :8, et SEQ ID N :9). On n'identifie que 3 variants de bases parmi les séquences sur une longueur totale de 336 paires de bases,
ce qui indique une homologie supérieure à 99 %.
Tableau 4
Souches de GBS pour séquençage de GBS3.1 Souches de GBS ID# GBS Ia ATCC 12400 GBS Ib ATCC 12401 GBS Ic ATCC 25941
GBS II ATCC 12973
GBS III ATCC 12403
GBS 13813
GBS 747
GBS T-1964
GBS T-33
GBS T-35
GBS T-3282
GBS T-32
GBS T-31
GBS T-2887
GBS AAAII
Exemple 8
Protocole d'amplification par déplacement de brin thermophile (ADBt) On réalise les réactions par ADBt pratiquement comme décrit antérieurement dans le brevet US N 5 648 211 et la demande de brevet européen N E0 0 684 315 de Frasier et al., en remplaçant TTP par dUTP afin de permettre l'inactivation (décontamination) des amplicons transportés
dans des réactions subséquentes utilisant l'ADN uracile-
glycosylase (UDG).
Pour chaque réaction par ADBt, on ajoute l'ADN cible dans un tube contenant de l'ADN placentaire humain, du DMSO, du glycérol, et du phosphate de potassium. On fait bouillir le mélange réactionnel pendant 2 minutes pour dénaturer l'ADN puis on le transfère dans un dispositif Thermal-lok réglé à 45 C. Puis on ajoute le mélange de décontamination contenant du phosphate de potassium, du dGTP, du dATP, du thio-dCTP, des amorces, des bumpers, de la SAB, du DTT, du tréhalose, de l'UDG et de l'acétate de magnésium et on incube le mélange pendant 30 minutes à C. Après l'incubation, on ajoute le mélange d'amplification contenant du phosphate de potassium, du dUTP, de la SAB, du DTT, du tréhalose, de l'UDI, du bsoBI, de la Bst-polymérase, et de l'acétate de magnésium, et on incube le tube à la température d'amplification pendant 30 minutes. On arrête la réaction d'amplification en faisant bouillir le tube réactionnel pendant 5 minutes. On utilise ce protocole dans toutes les expériences. Mélange réactionnel final pour ADBt (50 pl):30 phosphate de potassium 45 mM pg/ml de sérumalbumine bovine acétylée thio-dCTP 1,4 mM, dUTP 0,5 mM, dGTP 0,2 mM, et dATP 0,2 mM acétate de magnésium 6 mM Amorces et bumpers pour ADBt respectivement 0,5 iM et
0,05 AM
650 ng d'ADN placentaire humain par réaction 7 % de glycérol 7 % de DMSO 9 unités de Bst-polymérase unités de BsoBI 1 unité d'uracile-N- glycosylase unités d'inhibiteur d'uracile-N-glycosylase
Température: 52 C.
On détecte les produits d'amplification avec une sonde de détection radiomarquée à spécificité d'amplicon
dans une réaction d'extension d'amorce comme décrit ci-
dessous dans l'Exemple 9. D'une autre façon, on peut détecter les produits d'amplification par un immunodosage sur latex, dans lequel une sonde de détection est
biotinylée et la deuxième est conjuguée à un antigène.
Exemple 9
Réactions d'extension de radiomarquage On marque les sondes de détection en 5' au 32p en utilisant de la polykinase de T4 pour faciliter la détection du produit d'amplification. Les conditions de radiomarquage sont les suivants: oligonucléotide de sonde de détection 1 mM, 30 unités d'ADN polynucléotide kinase de T4, 60 pCi de y-32P-ATP, et tampon 1 x PNK (tampon 10 x
PNK disponible auprès de United States Biochemical, Inc.).
On laisse les réactions se dérouler à 37 C pendant 45 minutes, et on les arrête en chauffant les échantillons à C pendant 10 minutes. On conserve à -20 C la sonde de
détection marquée et on l'utilise dans la semaine.
On réalise les réactions d'extension de radiomarquage en mélangeant 5 p1 de l'échantillon ADBt avec 5 pl du mélange de détection contenant la sonde de détection
radiomarquée (mélange de détection = KPO4 50 mM, a-thio-
dATP, dCTP et dGTP 0,2 mM chaque, dUTP 0,5 mM, et 1 pl de sonde de détection radiomarquée). On fait bouillir les échantillons pendant 2 minutes, puis on les équilibre pendant au moins 2 minutes dans un bain d'eau à 37 C. On ajoute 1 pl de mélange enzymatique à chaque mélange réactionnel de détection et on incube à 37 C pendant minutes (mélange enzymatique = 2 unités de fragment de Klenow exogène et tampon 1 x React 1 (tampon 10 x React 1 disponible auprès de BRL Life Technologies Inc.). On arrête les réactions en ajoutant 10 il de tampon d'arrêt (disponible auprès de USB; 3 x = 95 % de formamide, EDTA mM, 0,05 % de bleu de bromophénol, 0,05 % de xylènecyanol), puis on fait bouillir les échantillons pendant 2 minutes. On détecte les produits d'extension radiomarqués en séparant les produits réactionnels sur un gel de polyacrylamide à 8 % puis en réalisant une autoradiographie et une quantification avec un dispositif Molecular Dynamics 455SI Phosphoimager et un logiciel
ImageQuant version 1.1.
Exemple 10
Amplification de GBS3.1 par amplification par déplacement de brin thermophile (ADBt) On conçoit des amorces d'amplification, des bumpers, et des sondes de détection, spécifiques de GBS3.1, pour une amplification par déplacement de brin thermophile (ADBt) de GBS3.1, comme représenté sur la Figure 3A. Les amorces d'ADBt sont dirigées vers une sous-région à la moitié 5' du fragment de GBS3.1. Le site de restriction par BsoBI est indiqué en italique et le site de fixation spécifique est souligné. On crible toutes les combinaisons d'amorces d'amplification (3 amorces à gauche x 3 amorces à droite). On observe une amplification positive avec toutes les 9 combinaisons d'amorces. On observe les meilleurs résultats avec la combinaison d'amorces GBS3.1AL48 (SEQ ID N :10) et GBS3.1AR46 (SEQ ID N :13), que l'on sélectionne pour des études plus poussées. Les bumpers sont GBS3. 1BL44 (SEQ ID N :6) et GBS3.1BR44 (SEQ ID N :17) et les détecteurs sont GBS3.1D40 (SEQ ID N :18), GBS3.1DR46 (SEQ ID N :19) et GBS.1C42 (SEQ ID N :20), comme le montre la Figure 3A. Le système d'ADBt de GBS3. A sélectionné est décrit sur la Figure 3B. Le produit
d'amplification a une longueur de 61 pb.
Exemple 11
Sensibilité du système d'ADBt de GBS3.1 On réalise une courbe de titration de génome pour déterminer le nombre minimal de copies de génome que l'on peut amplifier et détecter par le système d'ADBt de GBS3. 1. On isole de l'ADN génomique de GBS et on le dilue dans 10 ng d'ADN placentaire humain. On réalise les réactions d'ADBt de la façon décrite dans l'Exemple 8 en utilisant 0 104, 1 03, 102, 101 et 0 copies de génome par réaction. On obtient une sensibilité de 10 copies de
génome avec tous les systèmes de détection.
Exemple 12
Spécificité et réactivité croisée du système d'ADBt de
GBS3.1
On réalise une expérience pour évaluer la spécificité et la réactivité croisée du système d'ADBt de GBS3.1. On teste la spécificité avec de l'ADN génomique (préparations tant en lysat que pures) à partir de 33 souches de GBS avec le système d'ADBt de FBS3.1 (Tableau 4). On teste la réactivité croisée avec des échantillons réunis provenant de 67 espèces non GBS (Tableau 5). On pipette dans un tube de l'ADN génomique réuni provenant de trois à cinq espèces non GBS, chacune avec une valeur génomique de 107, et on l'amplifie en utilisant le système d'ADBt de GBS3.1 provenant de l'Exemple 9. Les amorces d'amplification, bumpers et détecteur sont les suivants: Ensemble amorce/bumper: GBS3.1AL48, GBS3. 1AR46,
GBS3.1BL44, GBSBR44
Détecteur: GBS3.1DR46 Pour empêcher l'apparition de résultats négatifs faux dus à une inhibition de l'amplification, on incorpore un échantillon témoin qui contient le groupe pour réaction croisée avec addition de 2 x 104 copies de génome de matrice de GBS. On teste seize tels groupes ainsi que leurs témoins apparentés (pointes). Toutes les 33 souches de GBS sont positives, et tous les groupes contenant les 67 espèces non GBS sont négatifs (sauf dans les groupes
témoins contenant des pointes de GBS).
Tableau 5
Souches de GBS présentant une amplification positive par le système d'ADBt de GBS3.1 Type ID# Ia 265 Ia 694 Ia 836 Ia 926 Ia 781 Ib 848 Ib 861 Ib 883 Ib 900 Ib 1088 Ic 575 Ic 580 Ic 597 Ic 598 Ic 607
II 235
II 800
II 910
II 934
II 1004
III 749
III 771
III 775
III 843
III 879
IV 3139
V 721
V 753
V 874
V 940
V 950
VI SS1214
VII PT7274
Tableau 6
Amplification d'espèces non GBS (dans 16 groupes) par le système d'ADBt de GBS3.1 Groupe Espèce non GBS Groupe A Strep. Groupe A 12901, Strep. Groupe A 12902, Strep. Groupe A 18, Strep. Groupe A 195J, Strep. Groupe A 400 Groupe C+D Strep. Groupe C 163, Strep. Groupe C 2164, Strep. Groupe C 12388, Strep. Groupe D 29212 Groupe F Strep. Groupe F 12393, Strep. Groupe F 77, Strep. Groupe F 110, Strep. Groupe F 114 Groupe G Strep. Groupe G R582336, Strep. Groupe G 165, Strep. Groupe G 12394 Groupe 1 Strep. Pneumoniae 12, Strep. Pneumoniae 184J, Strep. Pneumoniae 628, Strep. Pneumoniae III, Strep. Pneumoniae SPA18 Groupe 2 Strep. Uberis 19436, Strep. Equinis 9812, Strep. Parasanguis 15909 Groupe 3 Strep. Constellatus 3483, Strep. Gallinarum
35539, Strep. Intermedius 8850, Strep.
Salivarlus 461 Groupe 4 Salmonella minnesota 9700, Salmonella typhimurium 13311, E. coli 11775, Klebsiella pneumoniae 13883 Groupe 5 Actinobacter lwoffi 19901, Haemophilus influenza 33533, Moraxella lacunata 17967, Proteus mirabilis 29906 Groupe 6 Candida albicans 44808, Gardnerella vaginalis 14018, Mycoplasma orale 23714, Tricomonas vaginalis 30001 Groupe 7 Staph. aureus 12598, VSH-1, VSH-2, Peptostreptococcus productus 27340 Groupe 8 Neisseria cinerea 14685, Neisseria elongata 25292, Neisseria flavescens 13120, Neisseria sicca 29193, Neisseria lactamica 44418 Groupe 9 Branhamella catarrhlis 25240, Kingella kingae 23330, Neisseria musoca 19696, Neisseria subflava 14799 Groupe 10 Neisseria meningitidis 13077, Neisseria meningitidis 13102, Neisseria meningitidis 13113, Neisseria meningitidis 14632, Neisseria meningitidis 35559 Groupe 11 Neisseria gonorrhoeae 19424, Neisseria gonorrhoeae 35541, Neisseria gonorrhoeae BDMS 2900, Neisseria gonorrhoeae BDMS 1632 Groupe 12 Chlamydia trachomatis LGV-2, Chlamydia trachomatis J, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci
Exemple 13
Résumé du fragment de GBS3.1 1. Le fragment de GBS3.1 a une longueur d'environ
336 pb.
2. Les 15 souches de GBS séquencées partagent une
homologie supérieur à 99 % de la séquence de GBS3.1.
3. Aucun site de restriction par BsoBI n'est trouvé dans le fragment. 4. Aucune séquence d'ADN similaire n'est trouvée parmi 800 entrées de séquences de la génothèque GenBank de
l'espèce Streptococcus.
5. Les tests de spécificité par ACP de 22 souches de GBS
sont positifs à 100 %.
6. Les tests de réactivité croisée par ACP de 43 espèces
non GBS sont négatifs à 100 %.
7. Les tests de spécificité par ADBt de 33 souches de GBS (y compris les types I à VII) sont positifs à
100 %.
8. Les tests de réactivité croisée par ADBt de 67
espèces non GBS sont négatifs à 100 %.
9. La sensibilité du système d'ADBt de GBS3.1 est de 10 génomes. Tous les brevets et publications de brevets sont incorporés ici à titre de référence dans leur totalité, comme si chaque brevet ou publication de brevet individuel était spécifiquement et individuellement indiqué comme
étant incorporé à titre de référence.
Bien que l'invention ci-dessus ait été décrite en certains détails à titre d'illustration et d'exemple dans un but de clarté et de compréhension, il apparaîtra de façon évidente que certains changements et modifications peuvent être mis en pratique dans le cadre des
revendications annexées.
LISTAGE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: BECTON DICKINSON AND COMPANY
(B) RUE: 1, rue Becton (C) VILLE: Francklin lakes (E) PAYS: New Jersey. Etats-Unis d'Amérique
(F) CODE POSTAL: 07417-6800
(ii) TITRE DE L' INVENTION: FRAGMENT D'ADN SPECIFIQUE DE
STREPTOCOCCUS AGALACTIAE ET MOLECULES D'ACIDES NUCLEIQUES
APPARENTEES
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 20 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO:1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 18 paires de base (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: acide nucléique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:1:
CCGGAACATC AGCAGCGA 18
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO:2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 18 paires de base (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: acide nucléique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:2:
CAGTGTACTG GATGCTCT 18
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO:3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 336 paires de base (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (vi) SOURCE D'ORIGINE:
(A) ORGANISME: GBS
(B) SOUCHES: GBSIa, GBSIII et GBS9
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:3:
AAGCAATTCA GATCATTTTT CAGTAACGGT GGAACGTTTA CCTAGAACCC ATTATACTGC 60
TAGCCTTGAA GGGACTAGTG ACGGAAAAGA GATTAAACTC AAAAAAGATT ATGATGGTAA 120
AAACCAAACT ATTGATTTAT CGGTCGCTTT TAAATCTTTT ACAGTAACAA GTAATCTTAT 180
GGATGGTAAT CTTTATTTTG GTGATAATCG TATTGCTAAA TTAAAAGATG GTAGCTATTC 240
CGTAGAGAAT TATCCAGTGA CTGATGGTTC AAAAGCTTAT ATCAAAAAAG TTTTTAATGA 300
TGGTGAGATA ACCTCTCATA AACAAAAATT AATCTC 336
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO:4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 22 paires de base (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: acide nucléique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:4:
AAGCAATTCA GATCATTTTT CA 22
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO:5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 22 paires de base (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: acide nucléique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:5:
GAGATTAATT TTTGTTTATG AG 22
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO:6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 336 paires de base (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (vi) SOURCE D'ORIGINE:
(A) ORGANISME: GBS
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:6:
AAGCAATTCA GATCATTTTT CAGTAACGGT GGAACGTTTA CCTAGAACCY ATTATACTGC 60
TAGCCTTGAA GGGACTAGTG ACGGAAAAGA GATTAAACTC AAAAAAGATT ATGATGGTAA 120
AAACCAAACT ATTGATTTAT CGGTCGCTTT TAAATCTTTT ACAGTAACAA GTAATCTTAT 180
GGATGGTAAT CTTTATTTTG GTGATAATCG TATTGCTAAA TTAAAAGATG GTAGCYATTC 240
CGTAGAGAAT TATCCAGTGA CTGATGGTTC AAAAGCTTAT ATCAAAAARG TTTTTAATGA 300
TGGTGAGATA ACCTCTCATA AACAAAAATT AATCTC 336
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO:7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 336 paires de base (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (vi) SOURCE D'ORIGINE:
(A) ORGANISME: GBS
(B) SOUCHES: GBSIb, GBSIc, GBS1, GBS4, et GBS5
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:7:
AAGCAATTCA GATCATTTTT CAGTAACGGT GGAACGTTTA CCTAGAACCC ATTATACTGC 60
TAGCCTTGAA GGGACTAGTG ACGGAAAAGA GATTAAACTC AAAAAAGATT ATGATGGTAA 120
AAACCAAACT ATTGATTTAT CGGTCGCTTT TAAATCTTTT ACAGTAACAA GTAATCTTAT 180
GGATGGTAAT CTTTATTTTG GTGATAATCG TATTGCTAAA TTAAAAGATG GTAGCTATTC 240
CGTAGAGAAT TATCCAGTGA CTGATGGTTC AAAAGCTTAT ATCAAAAAGG TTTTTAATGA 300
TGGTGAGATA ACCTCTCATA AACAAAAATT AATCTC 336
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO:8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 336 paires de base (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) - (vi) SOURCE D'ORIGINE:
(A) ORGANISME: GBS
(B) SOUCHES: GBSII
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:8:
AAGCAATTCA GATCATTTTT CAGTAACGGT GGAACGTTTA CCTAGAACCT ATTATACTGC 60
TAGCCTTGAA GGGACTAGTG ACGGAAAAGA GATTAAACTC AAAAAAGATT ATGATGGTAA 120
AAACCAAACT ATTGATTTAT CGGTCGCTTT TAAATCTTTT ACAGTAACAA GTAATCTTAT 180
GGATGGTAAT CTTTATTTTG GTGATAATCG TATTGCTAAA TTAAAAGATG GTAGCTATTC 240
CGTAGAGAAT TATCCAGTGA CTGATGGTTC AAAAGCTTAT ATCAAAAAGG TTTTTAATGA 300
TGGTGAGATA ACCTCTCATA AACAAAAATT AATCTC 336
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO:9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 336 paires de base (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (vi) SOURCE D'ORIGINE:
(A) ORGANISME: GBS
(B) SOUCHES: GBS3, GBS6, GBS7, GBS8, GBS14
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:9:
AAGCAATTCA GATCATTTTT CAGTAACGGT GGAACGTTTA CCTAGAACCC ATTATACTGC 60
TAGCCTTGAA GGGACTAGTG ACGGAAAAGA GATTAAACTC AAAAAAGATT ATGATGGTAA 120
AAACCAAACT ATTGATTTAT CGGTCGCTTT TAAATCTTTT ACAGTAACAA GTAATCTTAT 180
GGATGGTAAT CTTTATTTTG GTGATAATCG TATTGCTAAA TTAAAAGATG GTAGCCATTC 240
CGTAGAGAAT TATCCAGTGA CTGATGGTTC AAAAGCTTAT ATCAAAAAAG TTTTTAATGA 300
TGGTGAGATA ACCTCTCATA AACAAAAATT AATCTC 336
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO:10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 40 paires de base (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: acide nucléique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:10:
CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGAGTAAC GGTGGAACGT 40
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO:11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 39 paires de base (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: acide nucléique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:11:
CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGAGTAAC GGTGGAACG 39
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO:12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 38 paires de base (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: acide nucléique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:12:
CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGAGTAAC GGTGGAAC 38
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO:13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 40 paires de base (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii)-TYPE DE MOLECULE: acide nucléique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:13:
ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGGTCACT AGTCCCTTCA 40
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO:14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 39 paires de base (B)TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: acide nucléique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:14:
ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGGTCACT AGTCCCTTC 39
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO:15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 39 paires de base (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: acide nucléique
* (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:15:
ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGTCACTA GTCCCTTCA 39
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO:16:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 17 paires de base (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: acide nucléique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:16:
AAGCAATTCA GATCATT 17
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO:17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 18 paires de base (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: acide nucléique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:17:
TTTGAGTTTA ATCTCTTT 18
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO:18:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 14 paires de base (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: acide nucléique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:18:
GTTTACCTAG AACC 14
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO:19:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 16 paires de base (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: acide nucléique
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:19:
TGGGTTCTAG GTAAAC 16
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO:20:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 15 paires de base (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: acide nucléique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:20:
TTATACTGCT AGCCT 15
Claims (11)
1. Procédé pour la détection à spécificité d'espèce d'acides nucléiques de Streptococcus agalactiae, comprenant les étapes consistant à: (a) hybrider une sonde oligonucléotidique à des acides nucléiques de Streptococcus agalactiae, la sonde étant constituée d'au moins 10 nucléotides consécutifs d'une séquence de Streptococcus agalactiae GBS3.1; et ensuite (b) détecter l'hybridation entre la sonde oligonucléotidique et les acides nucléiques de
Streptococcus agalactiae.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence de Streptococcus agalactiae GBS3.1 est choisie dans l'ensemble constitué par la SEQ ID N :3, la SEQ ID N :6, la SEQ ID N :7, la SEQ ID N :8 et la SEQ ID N :9.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la sonde oligonucléotidique est choisie dans l'ensemble constitué par la SEQ ID N :4, la SEQ ID N :5, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :10, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :11, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :12, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :13, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :14, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :15, la SEQ ID N :16, la SEQ ID N :17, la SEQ
ID N :18, la SEQ ID N :19, et la SEQ ID N :20.
4. Procédé pour la détection à spécificité d'espèce d'acides nucléiques de Streptococcus agalactiae, comprenant les étapes consistant à: (a) hybrider à des acides nucléiques de Streptococcus agalactiae au moins une amorce d'amplification comprenant une séquence de fixation cible, la séquence de fixation cible étant constituée d'au moins 10 nucléotides consécutifs d'une séquence de Streptococcus agalactiae GBS3.1; et (b) amplifier les acides nucléiques de Streptococcus agalactiae; et ensuite (c) détecter les acides nucléiques de Streptococcus
agalactiae amplifiés.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la séquence de Streptococcus agalactiae GBS3.1 est choisie dans l'ensemble constitué par la SEQ ID N :3, la SEQ ID N :6, la SEQ ID N :7, la SEQ ID N :8 et la SEQ ID N :9.
6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la séquence de fixation cible de l'amorce d'amplification au nombre d'au moins une est choisie dans l'ensemble constitué par la SEQ ID N :4, la SEQ ID N :5, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :10, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :11, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :12, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :13, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :14, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :15, la SEQ ID N :16, la SEQ ID N :17, la SEQ
ID N :18, la SEQ ID N :19, et la SEQ ID N :20.
7. ADN isolé, caractérisé en ce qu'il est constitué
d'une séquence de Streptococcus agalactiae GBS3.1.
8. ADN isolé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la séquence de Streptococcus agalactiae GBS3.1 est choisie dans l'ensemble constitué par la SEQ ID N :3, la SEQ ID N :6, la SEQ ID N :7, la SEQ ID N :8 et la SEQ ID
N :9.
9. Oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence de fixation cible constitué d'au moins 10 nucléotides consécutifs de l'ADN isolé de la
revendication 7.
10. Oligonucléotide selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit oligonucléotide est choisi dans l'ensemble constitué par la SEQ ID N :4, la SEQ ID N :5, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :10, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :11, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :12, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :13, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :14, la séquence de fixation cible de la SEQ ID N :15 la SEQ ID N :16, la SEQ ID N :17, la SEQ ID N :18, la SEQ
ID N :19, et la SEQ ID N :20.
11. Trousse pour la détection à spécificité d'espèce d'acides nucléiques de Streptococcus agalactiae, comprenant: (a) un oligonucléotide selon la revendication 9; et (b) des moyens pour détecter lesdits acides
nucléiques de Streptococcus agalactiae.
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|---|---|---|---|
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| US (1) | US6004754A (fr) |
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| EP0510902A1 (fr) * | 1991-04-25 | 1992-10-28 | National Research Council Of Canada | Essai d'immunologique pour détecter de streptocoque de groupe-B |
| WO1993003186A1 (fr) * | 1991-07-31 | 1993-02-18 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Procedes et reactifs pour la detection et la presence de bacteries dans le liquide cephalo-rachidien |
| WO1996000298A1 (fr) * | 1994-06-24 | 1996-01-04 | Innogenetics N.V. | Detection, identification et differentiation simultanees de taxa d'eubacteriales a l'aide d'une technique d'hybridation |
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1998
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-
1999
- 1999-01-19 DE DE19901827A patent/DE19901827A1/de not_active Withdrawn
- 1999-01-19 FR FR9900666A patent/FR2775295B1/fr not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BENTLEY RW ET AL., "DEVELOPMENT OF PCR-BASED HYBRIDIZATION PROTOCOL FOR IDENTIFICATION OF STREPTOCOCCAL SPECIES", JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, vol. 3, no. 5, May 1995 (1995-05-01), pages 1296 - 1301, XP002140532 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE19901827A1 (de) | 1999-07-29 |
| FR2775295B1 (fr) | 2001-08-24 |
| US6004754A (en) | 1999-12-21 |
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|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |
Effective date: 20120928 |