FR2804971A1 - Adn codant une acetohydroxyacide synthase, bacterie le contenant et procede de production de l-valine par culture de cette bacterie - Google Patents

Adn codant une acetohydroxyacide synthase, bacterie le contenant et procede de production de l-valine par culture de cette bacterie Download PDF

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Abstract

L'invention concerne un ADN codant une enzyme comportant une mutation par laquelle un résidu sérine (Ser) au niveau de l'acide aminé numéro 17 est remplacé par un autre résidu d'acide aminé (Phe), cet ADN codant l'isoenzyme III de l'acétohydroxyacide synthase issue de Escherichia coli qui est dépourvue d'inhibition par la L-valine et qui est active pour catalyser les réactions pour produire de la L-valine, une bactérie contenant cet ADN dans son ADN chromosomique ou dans un plasmide et qui est capable de produire de la L-valine et un procédé de production de L-valine par culture de cette bactérie.

Description

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La présente invention concerne un ADN codant l'isoenzyme III de l'acétohydroxyacide synthase dépourvue de rétroinhibition par la L-valine, une bactérie contenant cet ADN et un procédé de production de L-valine au moyen de cette bactérie.
Dans le passé, la L-valine a été produite par un procédé de fermentation utilisant principalement un micro-organisme appartenant au genre Brevibacterium, Corynebacterium ou Serratia, ou un mutant de celui-ci, qui produit de la L-valine ou de la L-leucine (Amino acid fermentation, JAPAN SCIENTIFIC SOCIETY'S PRESS, pages 397-422, 1986). Bien que de tels procédés conventionnels aient considérablement amélioré le rendement en ces acides aminés, le développement d'une technique plus efficace et plus rentable est nécessaire pour répondre à la demande croissante concernant la L-valine et la L-leucine.
Mises à part les bactéries mentionnées ci-dessus, il existe une autre bactérie productrice de L-valine qui appartient au genre Escherichia et qui nécessite de l'acide lipoïque pour la croissance ou qui est déficiente en activité de H-ATPase, et une bactérie appartenant au genre Escherichia qui présente les caractéristiques précédentes dans laquelle a été introduit un opéron ilvGMEDA exprimant les gènes ilvG, ilvM, ilvE et ilvD et n'exprimant pas la thréonine désaminase (W095/06926).
L'étape finale de la biosynthèse de la L-valine est réalisée par un groupe d'enzymes codées par l'opéron ilvGMEDA. L'opéron ilvGMEDA comprend les gènes ilvG, ilvM, ilvE, ilvD et ilvA, qui codent respectivement une grande sous-unité et une petite sous-unité de l'isoenzyme II de l'acétohydroxyacide synthase, de la transaminase, de la dihydroxyacide déshydratase et de la thréonine désaminase. Parmi ces enzymes, l'acétohydroxyacide synthase, la transaminase et la dihydroxyacide déshydratase catalysent les voies de synthèse allant de l'acide pyruvique à la L-valine et de l'acide 2-cétobutyrique à la L-isoleucine, et la thréonine désaminase catalyse la désamination de la L-thréonine en acide 2-cétobutyrique, ce qui constitue une étape limitant la vitesse de la biosynthèse de la L-isoleucine. L'expression de l'opéron ilvGMEDA est soumise à un contrôle (atténuation) de la part de la L-valine et/ou de la L-isoleucine et/ou de la L-leucine.
Concernant la biosynthèse de la L-valine, comme isoenzymes de l'acétohydroxyacide synthase, on connaît non seulement l'isoenzyme II (appelée dans la suite AHAS il) mais encore l'isoenzyme III (appelée dans la suite AHAS
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III). AHAS III est codée par l'opéron ilvIH qui consiste en le gène ilvI codant une grande sous-unité (sous-unité catalytique) et le gène ilvH codant une petite sous-unité (sous-unité de contrôle). AHAS III est soumise à une rétroinhibition par la L-valine.
Il a été décrit un gène ilvH mutant cloné par un mutant de Escherichia coli résistant à la L-valine qui comportait une substitution de l'acide aminé 14Gly par Asp (Vyazmensky, M. et al., Biochemistry, 35,10339-10346 (1996)).
Par ailleurs, on connaît le mutant ilvH612 de AHAS III (De Felice et al., J.
Bacteriol., 120, 1058-1067 (1974)). Le gène ilvH de l'opéron ilvIH de Escherichia coli MI262 (Guardiola et al., J. Bacteriol., 120, 536-538 (1974)) ; De Felice et al., J. Bacteriol., 120, 1068-1077 (1974)) contient le double mutant ilvH612 dans lequel 29Asn est remplacé par Lys et 92GIn est remplacé par un codon stop (TAG).
Comme on l'a indiqué ci-dessus, un ADN codant AHAS II a été utilisé pour cultiver un micro-organisme producteur de L-valine, mais l'utilisation d'un ADN codant AHAS III n'a pas été décrite.
C'est pourquoi, la présente invention a pour but de fournir un ADN codant AHAS III qui est dépourvu de rétroinhibition par la L-valine, un microorganisme contenant cet ADN et un procédé de production de L-valine au moyen de ce micro-organisme.
On a constaté que le rendement en L-valine est augmenté quand un ADN codant AHAS III résistant à la valine isolé d'un mutant résistant à la L-valine est introduit dans Escherichia coli.
Plus précisément, la présente invention concerne un ADN codant une petite sous-unité de l'isoenzyme III de l'acétohydroxyacide synthase issue de Escherichia coli qui comporte une mutation par laquelle un résidu d'acide aminé correspondant à un résidu sérine au niveau de l'acide aminé numéro 17 est remplacé par un autre résidu d'acide aminé dans SEQ ID NO: 2 présentée dans la suite, ou une mutation par laquelle un résidu d'acide aminé correspondant à un résidu sérine au niveau de l'acide aminé numéro 17 est remplacé par un autre résidu d'acide aminé et une mutation par laquelle un résidu d'acide aminé correspondant à un résidu glycine au niveau de l'acide aminé numéro 14 est remplacé par une autre résidu acide aminé dans SEQ ID NO: 2.
De préférence, dans l'ADN ci-dessus, la mutation du résidu d'acide aminé correspondant à un résidu sérine au niveau de l'acide aminé numéro 17 consiste dans le remplacement du résidu sérine par un résidu phénylalanine et la mutation du résidu d'acide aminé correspondant à un résidu glycine au niveau de
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l'acide aminé numéro 14 consiste dans le remplacement du résidu glycine par un résidu acide aspartique.
La présente invention concerne également un ADN codant l'isoenzyme III de l'acétohydroxyacide synthase issue de Escherichia coli qui est dépourvue d'inhibition par la L-valine et qui est active pour catalyser deux réactions pour produire de l'a-acétolactate à partir de pyruvate et de l'a-acéto-a-hydroxybutyrate à partir d'a-cétobutyrate et de pyruvate.
De préférence, cet ADN code une grande sous-unité et une petite sousunité de l'isoenzyme III de l'acétohydroxyacide synthase, la petite sous-unité ayant une mutation par laquelle un résidu d'acide aminé correspondant à un résidu sérine au niveau de l'acide aminé numéro 17 est remplacé par un autre résidu d'acide aminé, ou une mutation par laquelle un résidu d'acide aminé correspondant à un résidu asparagine au niveau de l'acide aminé numéro 29 est remplacé par un autre résidu d'acide aminé, ou une mutation par laquelle la région C-terminale est délétée à partir de l'acide aminé numéro 91, dans SEQ ID NO: 2, ou une combinaison de deux ou plusieurs mutations choisies dans le groupe consistant en les mutations mentionnées précédemment et une mutation par laquelle un résidu d'acide aminé correspondant à un résidu glycine au niveau de l'acide aminé numéro 14 est remplacé par un autre résidu d'acide aminé dans SEQ ID NO: 2.
De préférence encore, dans l'ADN ci-dessus, la mutation du résidu d'acide aminé correspondant à un résidu sérine au niveau de l'acide aminé numéro 17 consiste dans le remplacement du résidu sérine par un résidu phénylalanine, la mutation du résidu d'acide aminé correspondant à un résidu asparagine au niveau de l'acide aminé numéro 29 consiste dans le remplacement du résidu asparagine par un résidu lysine ou un résidu tyrosine, et la mutation du résidu d'acide aminé correspondant à un résidu glycine au niveau de l'acide aminé numéro 14 consiste dans le remplacement du résidu glycine par un résidu d'acide aspartique.
La présente invention concerne également une bactérie qui contient l'un des ADN décrits ci-dessus dans son ADN chromosomique ou dans un plasmide et qui est capable de produire la L-valine.
De préférence, dans la bactérie ci-dessus, l'expression de l'ADN est augmentée et, de préférence encore, l'expression de l'ADN est augmentée par le fait que l'ADN est sous le contrôle d'un promoteur fort ou que le nombre de copies de l'ADN est amplifié.
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Enfin, la présente invention concerne également un procédé de production de L-valine comprenant les étapes de culture de la bactérie précédente dans un milieu de culture, de production et d'accumulation de la L-valine dans le milieu de culture et de récupération de la L-valine à partir du milieu de culture.
Le premier ADN selon la présente invention, mentionné ci-dessus, est un ADN codant une petite sous-unité de AHAS III qui présente une activité d'acétohydroxyacide synthase sans être soumise à une rétroinhibition par L-valine, de même qu'une grande sous-unité. L'activité d'acétohydroxyacide synthase désigne l'activité catalysant deux réactions pour produire de l'a-acétolactate à partir de pyruvate et de l'a-acéto-a-hydroxybutyrate à partir d'a-cétobutyrate et de pyruvate. La petite sous-unité de AHAS III de Escherichia coli a la séquence d'acides aminés représentée dans SEQ ID NO: 2 dans la liste de séquences annexée.
La mutation mentionnée précédemment est choisie parmi une mutation par laquelle un résidu d'acide aminé correspondant à un résidu sérine au niveau de l'acide aminé numéro 17 est remplacé par un autre résidu d'acide aminé dans SEQ ID NO: 2, ou une mutation par laquelle un résidu d'acide aminé correspondant à un résidu sérine au niveau de l'acide aminé numéro 17 est remplacé par un autre résidu d'acide aminé et une mutation par laquelle un résidu d'acide aminé correspondant à un résidu glycine au niveau de l'acide aminé numéro 14 est remplacé par un autre résidu d'acide aminé dans SEQ ID NO: 2.
La mutation au niveau de l'acide aminé numéro 17 est de préférence le remplacement du résidu sérine par un résidu phénylalanine, et la mutation au niveau de l'acide aminé numéro 14 est de préférence un remplacement du résidu glycine par un résidu d'acide aspartique.
Le second ADN selon la présente invention est un ADN codant AHAS III qui est dépourvue d'inhibition par la L-valine et qui est active pour catalyser deux réactions pour produire de l'a-acétolactate à partir de pyruvate et de l'a- acéto-a-hydroxybutyrate à partir d'a-cétobutyrate et de pyruvate. Cet ADN code simultanément la grande sous-unité et la petite sous-unité de AHAS III.
La petite sous-unité contient une mutation par laquelle un résidu d'acide aminé correspondant à un résidu sérine au niveau de l'acide aminé numéro 17 est remplacé par un autre résidu d'acide aminé, ou une mutation par laquelle un résidu d'acide aminé correspondant à un résidu asparagine au niveau de l'acide aminé numéro 29 est remplacé par un autre résidu d'acide aminé, ou une mutation par laquelle la région C-terminale est délétée à partir du résidu d'acide aminé
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numéro 91, dans SEQ ID NO: 2, ou une combinaison de deux ou plusieurs mutations choisies dans le groupe consistant en les mutations mentionnées précédemment et une mutation par laquelle un résidu d'acide aminé correspondant à un résidu glycine au niveau de l'acide aminé numéro 14 est remplacé par un autre résidu d'acide aminé dans SEQ ID NO: 2. Les petites sous-unités de AHAS III qui comportent une mutation seront appelées dans la suite petites sous-unités mutantes de AHAS III. De préférence, la mutation du résidu d'acide aminé correspondant à un résidu sérine au niveau de l'acide aminé numéro 17 consiste dans le remplacement du résidu sérine par un résidu phénylalanine, et la mutation du résidu d'acide aminé correspondant à un résidu asparagine au niveau du résidu acide aminé numéro 29 consiste dans le remplacement du résidu asparagine par un résidu de lysine ou de tyrosine, et la mutation du résidu d'acide aminé correspondant à un résidu glycine au niveau de l'acide aminé numéro 14 consiste dans le remplacement du résidu glycine par un résidu d'acide aspartique.
L'ADN selon la présente invention a été obtenu à partir d'un mutant résistant à la L-valine de Escherichia coli. Toutefois, il est possible de l'obtenir en induisant la ou les mutations ci-dessus dans un ADN codant la AHAS III de type sauvage par mutagenèse dirigée. La AHAS III est codée par l'opéron ilvIH. Cet opéron peut être obtenu par exemple par amplification du fragment d'ADN allant de la région promotrice à l'extrémité 3' du gène ilvH par PCR (amplification en chaîne par polymérase) au moyen d'amorces ayant les séquences représentées dans SEQ ID NO: 3 et 4 et d'une matrice constituée par l'ADN génomique de Escherichia coli. La séquence nucléotidique de l'opéron ilvIH est connue (Genbank/EMBL/DDBJ accession X55034). La séquence nucléotidique de la région codante de ilvH est représentée dans SEQ ID NO: 1.
La petite sous-unité mutante de AHAS III codée par l'ADN selon la présente invention peut avoir une séquence d'acides aminés qui inclut une substitution, une délétion, une insertion, une addition ou une inversion d'un ou plusieurs acides aminés ainsi que les mutations mentionnées précédemment, à condition que la petite sous-unité mutante présente une activité d'acétohydroxyacide synthase sans subir de rétroinhibition par la L-valine, ainsi que la grande sous-unité.
Un ADN qui code sensiblement la même protéine que la petite sousunité mutante décrite ci-dessus est obtenu par exemple en modifiant la séquence nucléotidique, par exemple par mutagenèse dirigée, de manière qu'un ou plusieurs résidus d'acides aminés à des sites spécifiés comprennent une substitution,
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une délétion, une insertion, une addition ou une inversion. Un ADN ainsi modifié peut être obtenu par un traitement mutagène connu, par exemple par un procédé pour traiter l'ADN codant la petite sous-unité in vitro, par exemple avec l'hydroxylamine, un procédé pour traiter une bactérie appartenant au genre Escherichia contenant l'ADN codant la petite sous-unité avec des rayons ultraviolets ou avec un agent mutagène comme la N-méthyl-N'-nitro-Nnitrosoguanidine (NTG) et l'acide nitreux utilisé habituellement pour un tel traitement mutagène.
L'ADN qui code sensiblement la même protéine que la petite sousunité mutante de AHAS III est obtenu par expression d'un ADN comportant une mutation décrite ci-dessus en copies multiples dans une cellule appropriée, examen de la résistance à la L-valine et sélection de l'ADN dont la résistance est accrue. En outre, on sait que la séquence d'acides aminés d'une protéine et la séquence nucléotidique qui la code peuvent varier légèrement parmi les souches, les mutants ou les variants, de sorte que l'ADN qui code sensiblement la même protéine peut être obtenu à partir d'espèces, de souches, de mutants et de variants résistant à la L-valine appartenant au genre Escherichia.
Spécifiquement, l'ADN qui code sensiblement la même protéine que la petite sous-unité mutante peut être obtenu en isolant un ADN qui s'hybride avec un ADN ayant par exemple la séquence nucléotidique représentée dans SEQ ID NO: 1 dans la liste de séquences dans des conditions stringentes et qui code une protéine ayant une activité d'acétohydroxyacide synthase, à partir d'une bactérie appartenant au genre Escherichia qui est soumise à un traitement mutagène, ou d'un mutant spontané ou variant d'une bactérie appartenant au genre Escherichia. Le terme "conditions stringentes" désigne des conditions expérimentales d'hybridation plus ou moins exigeantes concernant notamment la température et la force ionique et qui permettent la formation d'un hybride spécifique sans qu'un hybride non spécifique se forme. Il est délicat d'exprimer de telles conditions par des valeurs numériques mais, par exemple, les conditions stringentes comprennent des conditions dans lesquelles des ADN ayant une grande homologie, par exemple, des ADN ayant une homologie d'au moins 70 % s'hybrident tandis que des ADN ayant une homologie plus faible ne s'hybrident pas.
La bactérie selon la présente invention contient le premier ADN ou le second ADN selon la présente invention et présente une activité de production de L-valine. Cette bactérie n'est pas limitée particulièrement à condition qu'elle
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présente une voie de biosynthèse de la L-valine avec l'acétohydroxyacide synthase. Ce peut être par exemple une bactérie appartenant au genre Escherichia, une corynébactérie ou une bactérie appartenant au genre Serratia, mais il s'agit de préférence d'une bactérie appartenant au genre Escherichia, par exemple une bactérie Escherichia coli.
L'ADN selon la présente invention peut être introduit dans une bactérie par exemple par un procédé dans lequel la bactérie est transformée avec un plasmide contenant l'ADN ou par un procédé dans lequel l'ADN est intégré dans l'ADN chromosomique d'une bactérie par recombinaison homologue.
De préférence, l'expression de l'ADN selon la présente invention est augmentée, par le fait que l'ADN est sous le contrôle d'un promoteur fort ou que le nombre de copies de l'ADN est amplifié. Comme promoteurs forts, on connaît par exemple le promoteur lac, le promoteur trp, le promoteur trc, le promoteur tac, le promoteur PR, le promoteur PL du phage lambda, le promoteur tet, le promoteur amyE et le promoteur spac. En outre, il est possible d'augmenter le nombre de copies de l'ADN selon la présente invention en maintenant l'ADN sur un vecteur à copies multiples ou en introduisant des copies multiples de l'ADN dans l'ADN chromosomique. Le vecteur à copies multiples peut être par exemple pBR322, pTWV228, pMW 119 ou pUC 19.
Pour introduire le vecteur contenant l'ADN selon la présente invention dans une bactérie hôte, il est possible d'employer un procédé de transformation connu quelconque. Par exemple, il est possible d'employer un procédé consistant à traiter les cellules receveuses avec le chlorure de calcium pour augmenter la perméabilité à l'ADN, procédé qui a été décrit pour Escherichia coli K-12 [voir Mandel ; M. et Higa, A., J. Mol. Biol., 53,159 (1970) ], et un procédé consistant à préparer des cellules compétentes à partir de cellules qui sont dans la phase de croissance et à introduire l'ADN dans ces cellules, procédé qui a été décrit pour Bacillus subtilis [voir Duncan, C.H., Wilson, G.A. et Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977) ]. En outre, il est possible aussi d'employer un procédé consistant à préparer, à partir de cellules receveuses d'ADN, des protoplastes ou des sphéroplastes qui peuvent aisément absorber des ADN recombinés puis à introduire l'ADN recombiné dans les cellules, ce procédé étant applicable à Bacillus subtilis, aux actinomycètes et aux levures [voir Chang, S. et Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979) ;Bibb, M. J., Ward, J.M. et Hopwood, O.A., Nature, 274,398 (1978) ; Hinnen, A., Hicks, J.B. et Fink, G.R., Proc. Natl. Sci., USA, 75,1929 (1978)], ou un procédé de transformation par impulsions
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électriques (voir la demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 2-207791).
Les procédés pour introduire l'ADN selon la présente invention dans l'ADN chromosomique bactérien comprennent un procédé utilisant un ADN linéarisé et un procédé utilisant un plasmide contenant une origine de réplication sensible à la température. Ou bien encore, l'ADN selon la présente invention peut être introduit dans une bactérie par transduction à partir d'une bactérie contenant l'ADN selon la présente invention dans son ADN chromosomique.
Pour introduire des copies multiples de l'ADN selon la présente invention dans l'ADN chromosomique d'une bactérie, on réalise une recombinaison homologue au moyen d'une séquence dont il existe des copies multiples dans l'ADN chromosomique à titre de cibles. Comme séquences dont il existe des copies multiples dans l'ADN chromosomique, il est possible d'utiliser les répétitions inversées qui existent aux extrémités d'un élément transposable.
Par ailleurs, comme l'indique la demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 2-109985, il est possible d'incorporer l'ADN selon la présente invention dans un transposon et de le transférer pour introduire des copies multiples de l'ADN dans l'ADN chromosomique.
La bactérie dans laquelle est introduit l'ADN selon la présente invention peut être une bactérie ayant acquis une productivité de L-valine par introduction de l'ADN selon la présente invention, ou bien une bactérie ayant de manière inhérente une productivité de L-valine.
La bactérie ayant une productivité de L-valine peut être par exemple Escherichia coli VL1970 (brevet US n 5 658 766). De plus, il est possible d'utiliser les bactéries décrites dans W096/06926 comme bactéries productrices de L-valine appartenant au genre Escherichia qui nécessitent de l'acide lipoïque pour leur croissance et/ou qui sont déficientes en activité de H±ATPase, ou une bactérie appartenant au genre Escherichia dans laquelle est introduit un opéron ilvGMEDA exprimant au moins les gènes ilvG, ilvM, ilvE et ilvD. Comme l'expression de l'opéron ilvGMEDA est soumise à un contrôle (atténuation) par la L-valine et/ou la L-isoleucine et/ou la L-leucine, il est préférable que la région qui est essentielle pour l'atténuation de l'expression soit délétée ou mutée pour désactiver la répression de l'expression par la L-valine produite. Une autre approche suggère l'introduction des mutations (ileS ou vaIS) affectant des aminoacyl-ARNt synthases ayant une affinité diminuée (Km augmenté) pour les
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acides aminés correspondants. De plus, on utilise de préférence un opéron qui n'exprime pas une thréonine désaminase active.
Escherichia coli VL1970 contenant la mutation DeS17 par laquelle l'atténuation est désactivée comme décrit ci-dessus a été déposé auprès de la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) Depositary, GNIIgenetika, (1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moscou, Russie) sous le numéro de dépôt VKPM B-4411.
Les procédés pour réaliser par exemple l'hybridation, la PCR, la préparation d'ADN plasmidique, la digestion et la ligature d'ADN et la transformation sont décrits par Sambrook, J., Fritsche, E. F., Maniatis, T. dans Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21 (1989).
Il est possible de réaliser la production de L-valine en cultivant les bactéries ayant une productivité de L-valine dans un milieu pour permettre la production et l'accumulation de L-valine dans le milieu, et en récupérant la L-valine à partir du milieu.
Selon la présente invention, la culture, la récupération et la purification de la L-valine à partir du milieu peuvent être réalisées d'une manière similaire au procédé de fermentation conventionnel où un acide aminé est produit au moyen d'un micro-organisme. Le milieu utilisé pour la culture peut être un milieu synthétique ou un milieu naturel à condition qu'il contienne une source de carbone et une source d'azote et des minéraux, et, si nécessaire, des quantités appropriées de nutriments qui sont nécessaires pour la croissance des microorganismes. La source de carbone peut inclure différents glucides comme le glucose et le saccharose, et différents acides organiques. Selon le mode d'assimilation des micro-organismes utilisés, il est possible d'utiliser un alcool comme l'éthanol ou le glycérol. Comme source d'azote, on peut utiliser différents sels d'ammonium comme le sulfate d'ammonium, l'ammoniac ou des composés azotés comme les amines, une source d'azote naturelle comme la peptone, un hydrolysat de soja et des micro-organismes de fermentation digérés. Comme minéraux, on peut utiliser par exemple le monophosphate de potassium, le sulfate de magnésium, le chlorure de sodium, le sulfate ferreux, le sulfate de manganèse, le carbonate de calcium.
La culture est de préférence réalisée dans des conditions aérobies sous forme de culture secouée ou de culture agitée à une température de 20 à 40 C, de préférence de 30 à 38 C. Habituellement, le pH de la culture est de 5 à 9, de préférence de 6,5 à 7,2. Il est possible d'ajuster ce pH avec l'ammoniac,
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le carbonate de calcium, différents acides, différentes bases et différents tampons.
Habituellement, une culture de 1 à 3 jours conduit à l'accumulation de la L-valine cible dans le milieu de culture.
Après la culture, les solides tels que les cellules peuvent être retirés du milieu liquide par centrifugation et filtration sur membrane, après quoi la L-valine cible peut être récupérée et purifiée par échange d'ions, concentration et cristallisation.
La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples non limitatifs suivants et des dessins annexés, dans lesquels : la figure 1 représente une amorce de PCR pour obtenir le gène ilvH mutant contenant une seule mutation : 14Gly en Asp ; etla figure 2 représente une amorce de PCR pour obtenir le gène ilvH mutant contenant une seule mutation : 17Ser en Phe.
1. Souches de E. coli W3350 résistantes à la L-valine
Un mutant résistant à la L-valine a été sélectionné sur un milieu minimal contenant 0,1 mg/ml de L-valine à partir de la souche de E. coli de type sauvage W3350. Le mutant W3350 Valo,lR ainsi obtenu résiste à des concentrations de L-valine inférieures ou égales à 1 mg/ml.
Puis l'opéron leucine (leuABCD) dans lequel le transposon Tn 10 était inséré (leu::TnlO) a été introduit dans W3350 Val0,1R par transduction avec le phage P1. A partir du transductant W3350 Val0,1R Leu::TnlO, une souche doublement mutante a été induite qui se développait sur du milieu minimal contenant 20 mg/ml de L-valine et 0,05 mg/ml de L-leucine.
2. Culture de la souche productrice de L-valine VL1991
Dans E. coli VL1970 (VKPM B-4411, brevet US n 5 658 766) a été introduit un gène participant à la résistance à de grandes concentrations de thréonine (>40 mg/ml) ou d'homosérine (>5 mg/ml) qui a été isolé à partir d'une souche B3996 ayant une mutation (rhtA23) participant à la résistance (brevet US n 5 705 371). La souche VL1971 a ainsi été obtenue.
Puis, les gènes d'utilisation du saccharose de E. coli VL478 ont été introduits dans VL1971 par transduction avec le phage PI pour obtenir VL1972 à partir duquel a été induit un mutant spontané VL1991 qui se développait plus rapidement que la souche parentale.
<Desc/Clms Page number 11>
3. Introduction de la résistance à la L-valine dans VL1991
La mutation qui était contenue dans le double mutant mentionné ci-dessus a été introduite dans VL1991 par transduction avec le phage P1.
Un mutant spontané qui était Leu+ a été sélectionné à partir des transductants.
Ce mutant a été appelé VL1997. Puis, un gène ilvD dans lequel le transposon TnlO avait été inséré (ilvD::Tn10) était introduit dans VL1997 par transduction avec le phage P1 pour obtenir VL1997 ilvD::TnlO qui a ensuite été transduit avec l'opéron ilvGMEDA issu de la souche B de E. coli. A partir de VL1998 ainsi obtenu a été sélectionné un mutant spontané VL1999 qui se développait plus rapidement que la souche parentale.
4. Souche productrice de L-valine VL1999/pVL715.
La souche VL1999 a été transformée avec le plasmide pVL715 pour obtenir la souche productrice de valine recombinée VL1999/pVL715. Le plasmide pVL715 a été construit de la manière suivante. Le fragment d'ADN BamHI-XmaIII contenant les gènes ilv (ilvGMEDAYC) a été excisé du plasmide pVR12 (Gavrilova et al., Biotechnology (en russe), 4, n 5,600-608 (1988)) qui contient les gènes, puis inséré dans pAYC32, un dérivé de RSF1010 (Chistoserdov et Tsygankov, Plasmid, 1986, v.16, pages 161-167) pour remplacer le fragment d'ADN BamHI-XmaIII de pAYC32, pour former le plasmide pVS712. Puis, le plasmide pVL715 a été dérivé à partir de pVS712, ce qui supprime la mutation valS91 affectant la valyl-ARNt synthétase (brevet US n 5 658 766) de la manière suivante. pVS712 a été introduit dans le mutant valS91. La souche résultante, valS91/pVS712, présentait une auxotrophie à l'égard de la valine comme souche receveuse. Ensuite, les "révertants" capables de se développer dans du milieu minimal ne contenant pas de valine ont été sélectionnés. Cette propriété a été conférée à certains d'entre eux par une mutation dans les gènes ilvGMEDAYC contenus dans le plasmide pVS712. Le plasmide pVL715 a été isolé à partir de l'un des révertants. L'activité de AHAS était augmentée dans les souches de E. coli contenant pVL715 par rapport à celles contenant pVL712.
5. Identification des mutations conférant une résistance à la L-valine
Les gènes ilvIH ont été clones et séquences à partir de W3350 Val0,1R et de VL1997. Le clonage des gènes ilvIH a été réalisé par amplification des fragments d'ADN qui s'étendaient de la région promotrice à l'extrémité 3' du gène ilvH par PCR au moyen d'amorces ayant les séquences représentées dans SEQ ID
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NO: 3 et 4. La PCR a été réalisée dans les conditions de 30 cycles de 94 C pendant 60 s, 48 C pendant 30 s, 72 C pendant 90 s. Les gènes ilvIH amplifiés ont été traités avec le fragment de Klenow et clones dans le site HincII du vecteur pUC19 pour donner pILVIHl et pILVIH1,2. De la même manière, un opéron ilvIH de type sauvage issu de la souche W3350 a été cloné dans pUC19 pour obtenir pIL VIH.
L'analyse comparative des séquences a révélé que l'opéron ilvIH mutant de W3350 Val0,1R contient une substitution de C en T au niveau du nucléotide n 50 et que VL1997 contient deux substitutions : une substitution de C en T au niveau du nucléotide n 50 et une substitution de G en A au niveau du nucléotide n 41 dans SEQ ID NO: 1. Ces mutations ont entraîné des substitutions d'acides aminés de 17Ser à Phe et 14Gly à Asp qui seront appelées mutation ilvHl et ilvH2, respectivement. Les gènes ilvH contenant l'une ou l'autre de ces mutations ou ces deux mutations ont été appelés ilvHl, ilvH2 et ilvHl,2, respectivement.
6. Séparation de la mutation ilvHl et de la mutation ilvH2 du gène mutant ilvHl,2
Pour élucider l'effet de chaque mutation de ilvHI,2, ces mutations ont été séparées par mutagenèse dirigée au moyen de la PCR.
Pour obtenir le gène mutant ilvH contenant seulement la mutation 14Gly en Asp, on a utilisé le fait que cette mutation crée un site MluI unique (figure 1). Ainsi, deux amorces ayant les séquences représentées dans SEQ ID NO: 5 et 6 ont été synthétisées.
Au moyen des amorces ci-dessus, un plasmide pILVIH1,2 dans lequel le gène ilvHl,2 a été cloné a été amplifié par PCR. Ainsi, un fragment d'ADN linéarisé d'environ 5 kb qui était flanqué par des sites MluI a été produit. Ce fragment PCR a été coupé avec MluI puis ligaturé pour former le plasmide circulaire pILVIH2 contenant seulement la mutation cible. Ceci a été prouvé également par analyse de la séquence.
Pour obtenir un gène mutant ilvH contenant la seule mutation 17Ser en Phe, deux amorces ayant les séquences représentées dans SEQ ID NO: 7 et 8 ont été synthétisées (figure 2).
Avec ces amorces, un plasmide pILVIH contenant l'opéron ilvIH de type sauvage a été amplifié. Le fragment PCR produit était flanqué par des sites StuI créés par remplacement du codon adéquat ATT par le codon ATA (codant De). Le fragment a été coupé avec StuI et ligaturé pour donner le plasmide
<Desc/Clms Page number 13>
circulaire pIL VIH1' contenant la mutation ponctuelle 17Ser en Phe nouvellement introduite. Ceci a été prouvé par séquençage du gène ilvHl du plasmide.
7. Identification d'autres mutations conférant une résistance à la L-valine
Les gènes ilvH ont été clones et séquences à partir de deux mutants résistant à la L-valine dérivés de E. coli W3350 qui ont été obtenus de la manière décrite ci-dessus. Il est alors apparu que la substitution de T en A au niveau du nucléotide n 85 dans SEQ ID NO: 1 s'était produite dans un mutant et que la substitution de A en C au niveau du nucléotide n 87 dans SEQ ID NO: 1 était apparue dans l'autre mutant. Du fait de ces mutations,29Asn était remplacé par Tyr ou Lys, respectivement. La mutation de 29Asn en Tyr et la mutation de 29Asn en Lys seront appelées ilvH3 et ilvH4, respectivement. Les opérons ilvIH de ces mutants ont été clones dans pUC19 pour obtenir pILVIH3 et pILVIH4, respectivement.
De la même manière, l'opéron ilvIH a été clone dans pUC 19 à partir de
Figure img00130001

E. coli MI262 (Dvr, IIvB-, IIvG-), obtenu auprès du E. coli Genetic Stock Center, qui comporte une mutation connue de AHAS III, ilvH612 (Guardiolae et al., J. Bacteriol., 120,536-538 (1974) ; De Felice et al., J. Bacteriol., 120, 1068-1077 (1974)) pour obtenir pILVIH262. Dans pILVIH262, le gène ilvH dans l'opéron comporte des mutations (ilvH612) : C en A au niveau du nucléotide n 87 dans SEQ ID NO: 1 et C en T au niveau du nucléotide n 274 dans SEQ ID NO: 1.
Du fait de ces mutations, 29Asn est remplacé par Lys et 92Gln est remplacé par un codon stop (TAG). Le gène ilvI de l'opéron ilvIH de M1262 comporte une mutation (ilvI614) par laquelle le produit d'expression du gène ilvl ne présente pas d'activité enzymatique. Le fragment BamHI de pILVIH262 contenant le gène ilvI muté a été remplacé par un fragment BamHI contenant le gène ilvl de type sauvage de pILVIH pour obtenir pILVIH612.
8. Introduction du gène ilvHl dans une souche de type sauvage de E. coli
Le gène ilvHl mutant a été introduit dans le chromosome de la souche W3350 de E. coli au moyen d'un procédé décrit antérieurement (Parker et Marinus, 1988, Gene, v. 73, pages 531-535). La souche W3350 ilvHI a ainsi été obtenue. II est apparu que cette souche était résistante à des concentrations de L-valine atteignant 1 mg/ml, c'est-à-dire qu'elle présentait le même niveau de résistance que la souche W3350 Val0,1R.
<Desc/Clms Page number 14>
Ainsi, la mutation ponctuelle 17Ser en Phe, qui confère aux cellules un faible degré de résistance à la L-valine, a été confirmée par l'analyse de la séquence du gène ilvHl et par la mutation ilvHl qui a été séparée de la mutation ilvH2 du mutant ilvHl,2 par mutagenèse dirigée.
9. Effet des différentes mutations ilvH sur la résistance de AHAS III à l'inhibition par la L-valine
Les mutations ilvHl (17Ser en Phe), ilvH2 (14Gly en Asp), ilvH3 (29Asn en Lys), ilvH4 (29Asn en Tyr) et ilvH612 (29Asn en Lys et 92Gln en un codon stop, TAG), conféraient à l'enzyme AHAS III une résistance à l'inhibition par la L-valine de la manière suivante. Après introduction des plasmides ayant différents gènes ilvIH, la souche de E. coli MI262 déficiente en activité de AHAS présentait une activité enzymatique avec différents niveaux de résistance à la Lvaline, comme le montre le tableau 1 ci-dessous sur lequel on peut voir aussi que la AHAS provenant des souches contenant les plasmides pILVIH2 ou pILVIH612 présente le plus haut niveau de résistance à la L-valine.
Tableau 1. Effet des différentes mutations ilvH sur la résistance de AHAS à l'inhibition par la L-valine
Figure img00140001
<tb>
<tb> Plasmide <SEP> Inhibition <SEP> de <SEP> AHAS <SEP> par <SEP> la <SEP> valine, <SEP> %
<tb> 1 <SEP> mM <SEP> 10 <SEP> mM <SEP>
<tb> pILVIH <SEP> 70 <SEP> >99,9
<tb> pILVIH1 <SEP> 50 <SEP> 70
<tb> pILVIH2 <SEP> 0 <SEP> 10
<tb> pILVIH3 <SEP> 10 <SEP> 20
<tb> pILVIH4 <SEP> 8 <SEP> 12
<tb> pILVIH612 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
10. Effet de différentes mutations ilvH sur la production de L-valine
L'effet de différentes mutations ilvH sur la production de L-valine a été examiné. Ces mutations ont été introduites dans le chromosome des souches VL1970 et VL1999/pVL715. La souche parentale W3350 des souches VL1970 et VL1999 n'exprime pas d'acétohydroxyacide synthase II (AHAS II) active, car cette souche comporte une mutation dans le gène ilvG avec changement du cadre de
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lecture. D'autre part, les souches VL1970 et VL1999 expriment une AHAS II active.
Après introduction de différentes mutations ilvH dans la souche VL1970, les nouvelles souches VL1970 ilvHl, VL1970 ilvHl,2, VL1970 ilvH3, VL1970 ilvH4, VL1970 ilvH612 ont été obtenues. En outre, après introduction de différentes mutations ilvH dans la souche VLI999/pVL715, les nouvelles souches VL1999 ilvHl,2/pVL715, VL1999 ilvH3/pVL715, VL1999 ilvH612/pVL715 ont été obtenues. Ces souches et les souches parentales respectives ont été cultivées à 37 C pendant 18 h dans un milieu nutritif, et 0,3 ml de la culture obtenue a été inoculé dans 3 ml d'un milieu de fermentation ayant la composition indiquée dans la suite dans un tube à essai de 20 x 200 mm, puis une culture a été réalisée à 37 C pendant 72 h au moyen d'une secoueuse rotative (250 tr/min). Après la culture, la quantité de valine accumulée dans le milieu et l'absorbance à 560 nm du milieu ont été déterminées par des procédés connus.
Les résultats sont présentés dans le tableau 2 et le tableau 3 ci-dessous.
Dans ces tableaux, ilvH+ désigne le gène ilvH de type sauvage.
Composition du milieu de fermentation (g/L) :
Glucose 80 (NH4)2SO4 22
K2HP04 2
NaCI 0,8 MgS04, 7H20 0,8 FeS04, 7H20 0,02
MnSO4, 5H2O 0,02
Chlorhydrate de Thiamine 0,2
Extrait de levure (Sigma) 1,0
CaC03 30 (CaC03 a été stérilisé séparément)
<Desc/Clms Page number 16>
Tableau 2. Effet des différentes mutations ilvH sur la production de L-valine par les souches VL1970
Figure img00160001
<tb>
<tb> Souche <SEP> D056o <SEP> L-valine <SEP> (g/L)
<tb> VL1970 <SEP> 19,4 <SEP> 10,2
<tb> VL1970ilvHl <SEP> 20,1 <SEP> 11,4
<tb> VL1970ilvHl,2 <SEP> 19,5 <SEP> 12,6
<tb> VL1970ilvH3 <SEP> 18,2 <SEP> 12,62
<tb> VL1970ilvH4 <SEP> 17,2 <SEP> 11,7
<tb> VL1970ilvH612 <SEP> 18,4 <SEP> 12,8
<tb>
Tableau 3. Production de L-valine par la souche VL1990/pVL715 contenant différentes mutations dans le gène ilvH
Figure img00160002
<tb>
<tb> Souche <SEP> DO560 <SEP> L-valine <SEP> (g/L)
<tb> VL1999 <SEP> ilvH+/pVL715 <SEP> 17,6 <SEP> 18,7
<tb> VL1999 <SEP> ilvHl,2/pVL715 <SEP> 18,9 <SEP> 23,4
<tb> VL1999 <SEP> ilvH3/pVL715 <SEP> 19,4 <SEP> 20,6
<tb>
Figure img00160003

VL1999 i1vH612/pVL715 17,7 20,2
On peut voir d'après les tableaux 2 et 3 que l'introduction des mutations ilvH décrites ci-dessus améliorait le rendement en valine des souches productrices de valine respectives. On peut voir également que la combinaison des mutations ilvHI et ilvH2 peut donner de meilleurs résultats.
Les dérivés de pUC19 comportant des opérons ilvIH contenant différents gènes ilvH mutants ont été introduits dans la souche W3350. Cette souche n'exprime pas de AHAS II active car elle comporte une mutation dans le gène ilvG avec changement du cadre de lecture. On peut voir d'après le tableau 4 ci-dessous que les transformants obtenus produisaient de la L-valine, et que la souche contenant le plasmide pIL VIH1,2 était la plus productrice.
<Desc/Clms Page number 17>
Tableau 4. Production de L-valine par la souche W3350 contenant des plasmides ayant différents gènes ilvH mutants
Figure img00170001
<tb>
<tb> Souche <SEP> D0560 <SEP> L-valine <SEP> (g/L)
<tb> W3350 <SEP> 21,4 <SEP> 0
<tb> W3350/pIL <SEP> VIH1 <SEP> 13,8 <SEP> 2,3
<tb> W3350/pILVIH1,2 <SEP> 10,5 <SEP> 8,2
<tb> W3350/pILVIH3 <SEP> 11,7 <SEP> 5,9
<tb> W3350/pILVIH4 <SEP> 16,4 <SEP> 5,5
<tb>
La présente demanderesse a observé antérieurement qu'au cours de la production de L-valine par fermentation, l'activité de AHAS (principalement AHAS II) dans les cellules productrices diminuait progressivement. On a montré que la demi-vie de AHAS III à 45 C était de 144 min tandis que celle de AHAS II était de 44 min (Alexander-Caudle et al., J. Bacteriol. 172,3060-3065 (1990)). On peut suggérer que cette thermostabilité accrue de AHAS III reflète la stabilité générale accrue de l'enzyme. De ce fait, on estime que AHAS III résistante à la L-valine a un effet positif sur la production de la L-valine du fait de cette stabilité accrue par rapport à AHAS II.

Claims (9)

  1. REVENDICATIONS 1. ADN codant une petite sous-unité de l'isoenzyme III de l'acétohydroxyacide synthase issue de Escherichia coli, caractérisé en ce qu'il comporte une mutation par laquelle un résidu d'acide aminé correspondant à un résidu sérine au niveau de l'acide aminé numéro 17 est remplacé par un autre résidu d'acide aminé dans SEQ ID NO: 2 ou une mutation par laquelle un résidu d'acide aminé correspondant à un résidu sérine au niveau de l'acide aminé numéro 17 est remplacé par un autre résidu d'acide aminé et une mutation par laquelle un résidu d'acide aminé correspondant à un résidu glycine au niveau de l'acide aminé numéro 14 est remplacé par un autre résidu d'acide aminé dans SEQ ID NO: 2.
  2. 2. ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce que la mutation du résidu d'acide aminé correspondant à un résidu sérine au niveau de l'acide aminé numéro 17 consiste dans le remplacement du résidu sérine par un résidu phénylalanine et la mutation du résidu d'acide aminé correspondant à un résidu glycine au niveau de l'acide aminé numéro 14 consiste dans le remplacement du résidu glycine par un résidu d'acide aspartique.
  3. 3. ADN caractérisé en ce qu'il code l'isoenzyme III de l'acétohydroxyacide synthase issue de Escherichia coli qui est exempte d'inhibition par la L-valine et qui est active pour catalyser deux réactions pour produire de l'a-acétolactate à partir de pyruvate et de l'a-acéto-a-hydroxybutyrate à partir d'a-cétobutyrate et de pyruvate.
  4. 4. ADN selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il code une grande sous-unité et une petite sous-unité de l'isoenzyme III de l'acétohydroxyacide synthase, la petite sous-unité ayant une mutation par laquelle un résidu d'acide aminé correspondant à un résidu sérine au niveau de l'acide aminé numéro 17 est remplacé par un autre résidu d'acide aminé ou une mutation par laquelle un résidu d'acide aminé correspondant à un résidu asparagine au niveau de l'acide aminé numéro 29 est remplacé par un autre résidu d'acide aminé, ou une mutation par laquelle la région C-terminale est délétée à partir de l'acide aminé numéro 91, dans SEQ ID NO: 2, ou une combinaison de deux ou plusieurs mutations choisies dans le groupe consistant en les mutations mentionnées précédemment et une mutation par laquelle un résidu d'acide aminé correspondant à un résidu glycine au niveau de l'acide aminé numéro 14 est remplacé par un autre résidu d'acide aminé dans SEQ ID NO: 2.
    <Desc/Clms Page number 19>
  5. 5. ADN selon la revendication 4, caractérisé en ce que la mutation du résidu d'acide aminé correspondant à un résidu sérine au niveau de l'acide aminé numéro 17 consiste dans le remplacement du résidu sérine par un résidu phénylalanine, la mutation du résidu d'acide aminé correspondant à un résidu asparagine au niveau de l'acide aminé numéro 29 consiste dans le remplacement du résidu asparagine par un résidu lysine ou un résidu tyrosine, et la mutation du résidu d'acide aminé correspondant à un résidu glycine au niveau de l'acide aminé numéro 14 consiste dans le remplacement du résidu glycine par un résidu d'acide aspartique.
  6. 6. Bactérie caractérisée en ce qu'elle contient un ADN selon l'une quelconque des revendications précédentes dans son ADN chromosomique ou dans un plasmide et en ce qu'elle est capable de produire de la L-valine.
  7. 7. Bactérie selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'expression dudit ADN est augmentée.
  8. 8. Bactérie selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite expression est augmentée par le fait que ledit ADN est placé sous le contrôle d'un promoteur fort ou par le fait que le nombre de copies dudit ADN est amplifié.
  9. 9. Procédé de production de L-valine, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de culture d'une bactérie selon l'une quelconque des revendications 6 à 8 dans un milieu de culture, de production et d'accumulation de L-valine dans le milieu de culture et de récupération de la L-valine à partir du milieu de culture.
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