FR2807757A1 - Nouvelle proteine ulip/crmp humaine et son utilisation dans le diagnostic et la therapie des cancers et des syndromes neurologiques et paraneoplastiques - Google Patents

Abstract

L'invention a pour objet un polypeptide purifié, désigné ULIP6, comprenant une séquence d'acide aminé SEQ ID ndegre 2, l'acide nucléique codant pour ce polypeptide, une séquence non codante en 3' de cette séquence codante et leur utilisation dans le diagnostic et la thérapie des cancers et des syndromes neurologiques paranéoplasiques.

Description

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L'invention concerne une nouvelle protéine ULIP/CRMP humaine et son utilisation dans le diagnostic et la thérapie des cancers et des syndromes neurologiques paranéoplasiques.

Les syndromes neurologiques paranéoplasiques (SNP) surviennent à l'occasion d'un cancer, souvent avant sa découverte et ne sont liés ,ni à la prolifération tumorale elle-même (envahissement direct, métastases) ni à la thérapie. Leur fréquence est globalement estimée à environ 1 % des cancers. Plusieurs tableaux cliniques ont été depuis longtemps individualisés (encéphalomyélite, neuropathie sensitive de Denny Brown, atrophie cérébelleuse, encéphalite limbique, opsoclonus, ...) correspondant en fait à l'atteinte soit élective soit préférentielle de certains groupes de neurones. La fréquence des cellules inflammatoires au voisinage des lésions avait fait évoquer depuis de nombreuses années la possibilité d'un processus auto-immun ou viral. La mise en évidence, plus récente, d'autoanticorps dans le sérum et le liquide céphalo-rachidien (LCR) de patients souffrant de SNP, spécifiques du type de tumeur et du type de neurones qui dégénèrent, a relancé l'hypothèse d'une participation de l'auto-immunité dans la génèse de cette pathologie (Graus et al., 1985 ; Greenlee et al., 1983).

Outre la présence d'un titre élevé de ces anticorps dans le sang et le LCR des patients, il existe plusieurs arguments suggérant que les SNP relèvent de mécanismes auto-immuns. Ainsi, les antigènes reconnus dans le système nerveux central sont aussi présents dans les tumeurs des patients (Anderson et al., 1987). Au sein du tissu tumoral, on retrouve des anticorps spécifiquement dirigés contre ces antigènes ainsi que des lymphocytes B et T (Hetzel et al., 1990).

Ces données suggèrent que le processus auto-immun serait déclenché par l'expression d'antigènes tumoraux. Un processus d'immunité croisée provoquerait les lésions du système nerveux central. D'autres arguments indiquent en outre que les lésions cérébrales résultent de la réponse auto-immune. Ainsi, dans le cerveau des patients, le titre des anticorps spécifiques est supérieur à celui du sérum et du LCR (Dalmau et al., 1991). De plus, dans le cas des encéphalomyélites associées aux anticorps anti-Hu, il existe une réaction lymphocytaire intense, composée de cellules B et

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T, située à proximité de neurones en voie de destruction (Dalmau et al., 1991 ; Graus et al., 1990).

Plusieurs types d'auto-anticorps permettant des regroupements syndromiques précis en fonction de critères immunologiques, neurologiques et carcinologiques ont été décrits.

Ainsi, les anticorps anti-Yo sont retrouvés dans le sérum et le LCR de femmes présentant une atrophie cérébelleuse paranéoplasique et un cancer gynécologique (ovaire, sein ou utérus) (Greenlee et al., 1983 ; Jaeckle et al., 1985).

Ces anticorps reconnaissent deux protéines cytoplasmiques de 34 et 62 kDa spécifiques des cellules de Purkinje du cervelet.

Les anticorps anti-Ri sont retrouvés dans le sérum et le LCR de patients (principalement des femmes) présentant un opso-myoclonus, un syndrome cérébelleux et un cancer du sein. Ces anticorps reconnaissent deux protéines de 50 et 80 kDa spécifiques des neurones du système nerveux central (Luque et al., 1991).

Les anticorps anti-Hu sont les plus fréquemment rencontrés au cours des SNP. Ils sont retrouvés dans le sérum et le LCR de patients présentant un syndrome de Denny-Brown ou une encéphalomyélonévrite et un cancer du poumon à petites cellules (Graus et al., 1985 ; Dalmau et al., 1992).

Ces auto-anticorps reconnaissent plusieurs protéines de 37 à 45 kDa exprimées spécifiquement par l'ensemble des neurones du système nerveux.

Un autre type d'auto-anticorps a été identifié chez des patients présentant un SNP : les anticorps anti-CV2 (Antoine et al., 1993 ; Honnorat et al., 1996). Ces derniers sont atypiques, en ce sens que la cible antigénique reconnue à l'âge adulte est essentiellement non neuronale, alors que l'analyse du cerveau post-mortem de quatre patients permet d'objectiver une perte neuronale, une gliose et un processus inflammatoire caractéristique des SNP.

L'originalité de la découverte de ces auto-anticorps réside, d'une part, dans leur mise en évidence. Ces derniers avaient échappé à l'ensemble des investigations habituelles qui consistaient à révéler les antigènes reconnus par immunohistochimie sur du cerveau post-mortem. L'antigène reconnu est en effet soluble et disparaît du cerveau post-mortem dans la plupart des

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conditions de fixation. Seule une fixation du tissu post-mortem humain par immersion dans le paraformaldéhyde ou in situ par perfusion de paraformaldéhyde chez l'animal, a permis de révéler la présence de ces anticorps dans le LCR ou le sérum des patients atteints de SNP (Antoine et al., 1993 ; Honnorat et al., 1996).

Les auto-anticorps anti-CV2 présents dans les sérums de patients atteints de syndrome neurologique paranéoplasique (SNP) ont été définis par leur capacité à reconnaître, par immunohistochimie indirecte, un antigène cytoplasmique exprimé spécifiquement, dans le cerveau de rat adulte, par une sous-population d'oligodendrocytes du tronc cérébral, de la moelle et du cervelet.

L'originalité de ces auto-anticorps réside, d'autre part, dans leur intérêt diagnostique. Leur présence dans le sérum ou le LCR de patients a valeur diagnostique puisqu'elle permet de préciser l'origine paranéoplasique d'un syndrome neurologique. La découverte de ces anticorps lorsqu'elle précède celle du cancer, oriente la recherche de celui-ci et permet sa découverte. Tel a été le cas pour six patients sur 19 présentant des anticorps anti-CV2. Les troubles cliniques étaient différents suivant les patients, certains présentaient un tableau d'encéphalite limbique, d'autres une encéphalomyélonévrite et d'autres un syndrome de Lambert-Eaton.

Néanmoins, dans plus de 60 % des cas, le syndrome cérébelleux était prédominant. La tumeur la plus fréquemment associée était le cancer du poumon à petites cellules (60 % des cas).

Des expériences sur des cerveaux de rats nouveaux-nés ont montré que ces anticorps anti-CV2 réagissaient avec une protéine de 66 kDa (Honnorat et al., 1996).

Cet antigène se situe dans le cerveau adulte dans une souspopulation d'oligodendrocytes ou dans des cellules qui gardent des capacités de différenciation dans le cerveau adulte (bulbe olfactif, gyrus denté).

L'antigène reconnu jouerait un rôle dans la survie neuronale, via des interactions Neurone/Oligodendrocyte, comme le suggère la perte des neurones observée dans le cerveau post-mortem de patients atteints de SNP.

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Son expression très restreinte à l'âge adulte contraste avec une expression très forte et transitoire dans le système nerveux central et périphérique en développement, suggérant le rôle probable de cet antigène dans le développement du système nerveux.

Dans la demande WO 98/37192 et l'article de Honnorat et al de 1999, l'antigène cible des auto-anticorps anti-CV2, correspondant à une protéine désignée par POP-66 pour paraneoplastic oligodendrocyte protein 66 kDa , a été identifiée comme étant la forme humaine de la protéine ULIP-4. Les protéines ULIP (pour "Unc-33 like phosphoprotein") sont impliquées dans le contrôle du développement neuronal et le transport axonal (Byk et al, 1996). Quatre membres de cette famille avaient été identifiés par trois équipes différentes (Byk et al, 1998, Wang et Strittmatter, 1996; et Hamajima et al, 1996). La recherche extensive d'éventuels autres membres de cette famille n'avait pas abouti.

Les auteurs de la présente invention ont alors été confrontés à de nouveaux résultats, qui n'étaient pas cohérents avec l'identification établie par la demande WO 98/37192 : que tous les sérums anti-CV2 testés sur des cellules Hela reconnaissaient indiscutablement la protéine recombinante ULIP 4 en immunohistochimie, seuls 20% de ces sérums reconnaissaient la protéine ULIP 4 par Western Blot sur ces mêmes extraits de cellules. Or tous les sérums anti-CV2 testés reconnaissaient par ailleurs par Western Blot la même protéine de 66 kDa après immunoprécipitation, sur des extraits de cerveaux.

En outre, l'ARNm d'ULIP4 n'était que très faiblement exprimé dans les oligodendrocytes en hybridation in situ. A partir de ces données, les auteurs de la présente invention ont supposé qu'il pouvait exister un nouveau membre de la famille des ULIP non identifié à ce jour, fortement exprimé par les oligodendrocytes et reconnu en Western Blot par tous les sérums anti-CV2.

Les auteurs de la présente invention ont maintenant mis en évidence que, contrairement à ce que proposait la demande WO 96/37192, POP-66, l'antigène majeur cible des auto-anticorps anti-CV2, n'était pas la protéine ULIP 4 mais une autre protéine. Ils sont parvenus à caractériser celle-

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ci. Il s'agit d'une nouvelle protéine humaine de la famille des ULIP, désignée ULIP6.

ULIP 6 comprend dans sa partie C-terminale un épitope majeur reconnu en Western Blot par les anticorps anti-CV2.

La présente invention a donc pour objet un polypeptide purifié ULIP 6, comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID n 2.

Est en outre compris dans la présente invention un fragment épitopique du polypeptide mentionné ci-dessus, comprenant la séquence SEQ ID n 4. Plus particulièrement l'invention a pour objet le peptide purifié de séquence SEQ ID n 4.

La présente invention a également pour objet un acide nucléique isolé codant pour le polypeptide ULIP6 tel que défini ci-dessus, de préférence comprenant la-séquence nucléotidique SEQ ID n 1. La séquence SEQ ID n 1 présente une région 5' non codante (nucléotides 1 à 162), un cadre de lecture ouvert (nucléotides 163 à 1854) et une région 3' non codante (nucléotides 1855 à 3074).

La présente invention a en outre pour objet un acide nucléique isolé comprenant la séquence nucléotidique SEQ ID n 3, qui correspond à la région non codante en 3' de la séquence codante humaine SEQ ID n 1. Cette séquence non codante de même que la partie 5' non codante (nucléotides 1 à 162 à SEQ ID n 1) peuvent notamment servir à la préparation de sondes spécifiques.

Le polypeptide de la présente invention peut être synthétisé par toutes les méthodes bien connues de l'homme du métier. Le polypeptide de l'invention peut par exemple être synthétisé par les techniques de la chimie de synthèse, telles que la synthèse de type Merrifield qui est avantageuse pour des raisons de pureté, de spécificité antigénique, d'absence de produits secondaires non désirés et pour sa facilité de production.

Une protéine ULIP6 recombinante peut également être produite par un procédé, dans lequel un vecteur contenant un acide nucléique

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comprenant la séquence SEQ ID n 1 est transféré dans une cellule hôte qui est mise en culture dans des conditions permettant l'expression du polypeptide correspondant.

La protéine produite peut ensuite être récupérée et purifiée.

Les procédés de purification utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant obtenu peut être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps mono- ou polyclonaux spécifiques, etc.

La séquence d'acide nucléique d'intérêt, codant pour le polypeptide ULIP6, peut être insérée dans un vecteur d'expression, dans lequel elle est liée de manière opérante à des éléments permettant la régulation de son expression, tels que notamment des promoteurs, activateurs et/ou terminatéurs de transcription.

Les signaux contrôlant l'expression des séquences nucléotidiques (promoteurs, activateurs, séquences de terminaison...) sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple l'électroporation ou la précipitation au phosphate de calcium.

Les vecteurs de clonage et/ou d'expression tels que décrits cidessus, contenant une séquence nucléotidique définie selon l'invention font également partie de la présente invention.

L'invention vise en outre les cellules hôtes transfectées, de manière transitoire ou stable, par ces vecteurs d'expression. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis

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la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée.

L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes, comme les bactéries, ou eucaryotes, comme par exemple les levures, cellules d'insectes, CHO (cellules d'ovaires de hamster chinois) ou tout autre système avantageusement disponible. Un hôte cellulaire préféré pour l'expression des protéines de l'invention est constitué par la bactérie E. coli.

Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences d'ADN ou d'ARN, obtenues par criblage de banques de séquences au moyen de sondes élaborées sur la base de la séquence SEQ ID n 1 ou 3. De telles banques peuvent être préparées par des techniques classiques de biologie moléculaire, connues de l'homme de l'art.

Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent également être préparées par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage des banques.

Cet acide nucléique permet la réalisation de sondes nucléotidiques, capables de s'hybrider fortement et spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique, d'un ADN génomique ou d'un ARN messager, codant pour un polypeptide selon l'invention ou un fragment biologiquement actif de celui-ci. Les conditions d'hybridation appropriées correspondent aux conditions de température et de force ionique usuellement utilisées par l'homme du métier (Sambrook et al., 1989), de préférence à des conditions de température comprises entre (Tm moins 5 C) et (Tm moins 30 C) et de préférence encore, à des conditions de température comprises entre (Tm moins 5 C) et (Tm moins 10 C) (forte stringence), Tm étant la température théorique de fusion, définie comme étant la température à laquelle 50 % des brins appariés se séparent. De telles sondes font également partie de l'invention. Elles peuvent être utilisées comme outil de diagnostic in vitro pour la détection, par des expériences d'hybridation, de transcrits spécifiques des polypeptides de l'invention dans des échantillons biologiques ou pour la mise en évidence de synthèses aberrantes ou d'anomalies génétiques résultant d'un polymorphisme,

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de mutations ou d'un mauvais épissage.

Les sondes de l'invention comportent au minimum 10 nucléotides, et au maximum comportent la totalité d'une séquence nucléotidique SEQ ID n 1 ou 3, ou de son brin complémentaire.

L'acide nucléique de l'invention peut également être utilisé pour réaliser des amorces oligonucléotidiques , qui hybrident dans des conditions de forte stringence à la séquence SEQ ID n 1 ou 3.

Ces amorces oligonucléotidiques sens et/ou antisens peuvent être utiles pour des réactions de séquençage ou d'amplification spécifique selon la technique dite de PCR (réaction de polymérisation en chaîne) ou toute autre variante de celle-ci.

Préférentiellement, les sondes ou amorces de l'invention sont marquées, préalablement à leur utilisation. Pour cela, plusieurs techniques sont à la porfée de l'homme du métier comme par exemple le marquage fluorescent, radioactif, chimioluminescent ou enzymatique.

Les méthodes de diagnostic in vitro dans lesquelles' ces sondes nucléotidiques sont mises en oeuvre pour la détection de synthèses aberrantes ou d'anomalies génétiques, telles que la perte d'hétérozygotie et le réarrangement génétique, au niveau des séquences nucléiques codant pour un polypeptide ULIP6 selon l'invention sont incluses dans la présente invention. Un tel type de méthode comprend : - la mise en contact d'une sonde nucléotidique de l'invention avec un échantillon biologique dans des conditions permettant la formation d'un complexe d'hybridation entre ladite sonde et la susdite séquence nucléotidique, éventuellement après une étape préalable d'amplification de la susdite séquence nucléotidique - la détection du complexe d'hybridation éventuellement formé ; - éventuellement le séquençage de la séquence nucléotidique formant le complexe d'hybridation avec la sonde de l'invention.

Les sondes de l'invention sont en outre avantageusement utilisables pour la détection d'anomalies chromosomiques.

Les séquences nucléotidiques selon l'invention ont par ailleurs des utilisations dans le domaine thérapeutique, pour la réalisation de séquences

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antisens, capables de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique, y compris un ARN messager, utilisables en thérapie génique.

L'invention a ainsi pour objet des séquences antisens capables d'inhiber, au moins partiellement, la production d'un polypeptide selon l'invention, tel que défini précédemment.

Elles sont plus particulièrement utiles dans le traitement des désordres du système nerveux central et périphérique et de la vision, notamment dans le traitement des syndromes neurologiques paranéoplasiques, ainsi que dans le traitement anticancéreux, notamment des tumeurs associées à des syndromes neurologiques paranéoplasiques.

L'exploitation des protéines ULIP, et en particulier ULIP6, ainsi que des anticorps dirigés contre ces protéines, est prometteuse dans divers domaines.

Ainsi, la détection de l'auto-anticorps anti-CV2 par immunofluorescence sur cerveau animal fixé est utilisée actuellement comme test diagnostic.

La production de protéine recombinante ULIP6 selon l'invention permet la fabrication d'un test (de type Elisa ou Western Blot) rapide et fiable, pour détecter les anticorps anti-CV2.

De tels tests existent déjà pour les anticorps anti-Hu, anti-Yo et anti-Ri. Le test pour détecter les anti-CV2 dans le sérum des patients pourrait être prescrit en cas de suspicion de syndrome neurologique paranéoplasique et inclurait par conséquent les anticorps anti-CV2 au même titre que les autres anticorps identifiés dans les SNP tels que précédemment cités.

L'invention vise donc également une méthode pour le diagnostic des syndromes neurologiques paranéoplasiques et/ou pour le diagnostic précoce de la formation de tumeurs d'origine cancéreuse, caractérisée en ce que l'on met en évidence dans un échantillon biologique (tel que sang, sérum, LCR, etc) prélevé chez un individu des auto-anticorps dirigés contre une protéine ULIP6 par - la mise en contact un échantillon biologique prélevé chez un individu avec un polypeptide purifié ULIP6 éventuellement fixé sur un support

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dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques spécifiques entre ledit polypeptide et les auto-anticorps éventuellement présent dans l'échantillon biologique, et - la détection des complexes immunologiques spécifiques éventuellement formés.

L'invention a donc pour objet une composition utile pour le diagnostic des syndromes neurologiques paranéoplasiques et/ou pour le diagnostic précoce de la formation des tumeurs, caractérisée en ce qu'elle comprend un polypeptide ULIP6 ou un fragment épitopique dudit polypeptide.

De manière avantageuse, on peut utiliser à la place du polypeptide complet la partie C-terminale comprenant l'épitope dominant (par exemple le fragment allant de l'acide aminé n 475 à l'acide aminé 564). On peut en particulier utiliser un fragment épitopique du polypeptide ULIP 6, comprenant la séquence SEQ ID n 4. Le peptide de séquence SEQ ID n 4 a ainsi permis la production d'anticorps très spécifiques d'ULIP6.

L'invention a également pour objet un kit pour le diagnostic des syndromes neurologiques paranéoplasiques et pour le diagnostic précoce de la formation des tumeurs à partir d'un prélèvement biologique comprenant : - au moins un polypeptide purifié ULIP6, éventuellement fixé sur un support, - des moyens de révélation de la formation de complexes antigène/anticorps spécifiques entre un auto-anticorps anti-ULIP6 et ledit polypeptide purifié ULIP6, dérivé ou fragment polypeptidique et/ou des moyens de quantification de ces complexes.

L'invention a également pour objet les anticorps mono- ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugués, obtenus à partir d'un peptide ou polypeptide purifié ULIP comprenant une séquence d'acides aminés SEQ ID n 2 ou n 4 et leur utilisation, pour la purification ou la détection d'une protéine ULIP dans un échantillon biologique.

Des anticorps polyclonaux peuvent être obtenus à partir du sérum d'un animal immunisé contre la protéine, produite par exemple par recombinaison génétique suivant la méthode décrite ci-dessus, selon les modes opératoires usuels.

Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes décrite par Kôhler et Milstein.

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Les anticorps peuvent être des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab et F(ab')2. Ils peuvent également se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués.

L'invention porte également sur l'utilisation d'anticorps dirigés contre la protéine ULIP6 pour la mise en évidence d'une protéine ULIP6 dans des néoplasmes, et des syndromes neurologiques paranéoplasiques à des fins de diagnostic.

De manière préférentielle, l'invention porte sur l'utilisation d'anticorps monoclonaux obtenus à partir du sérum polyclonal anti-CV2 de patients par immortalisation de lymphocytes, selon les techniques usuelles connues de l'homme du métier.

Ainsi, les anticorps dirigés contre une protéine de la famille ULIP sont utiles pour détecter une expression anormale de protéine ULIP chez des patients présentant des syndromes neurologiques, chez qui aucun cancer n'a été diagnostiqué par les méthodes classiques. Cette expression anormale de protéine ULIP6 pourra être corrélée à l'existence d'un cancer qui n'avait pas été repéré. Ainsi, les anticorps dirigés contre la protéine ULIP6, sont utiles pour le diagnostic précoce d'un cancer.

Des anticorps humains ou non, obtenus chez des patients, ou après immunisation avec l'ensemble ou une partie de Ja protéine ULIP6 tels que définis précédemment, peuvent également être marqués de manière détectable par exemple par association à un élément radioactif, et être injectés à un individu. Par des procédés d'imagerie bien connus de l'homme du métier, ils peuvent permettre de détecter ou diagnostiquer un tumeur cancéreuse après réaction antigénique de ces anticorps avec les cellules de la tumeur.

L'invention a donc également pour objet une méthode de détection ou de diagnostic d'une tumeur cancéreuse comprenant l'administration à un patient d'un anticorps tel que défini précédemment marqué de manière détectable et la visualisation par imagerie du site de fixation de cet anticorps.

L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant au moins un agent thérapeutique choisi parmi

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une protéine purifiée ULIP6, ou un acide nucléique codant pour ladite protéine, une séquence anti-sens capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence nucléotidique SEQ ID n 1 ou n 3, ou un anticorps dirigé contre ladite protéine, associée à un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

L'invention comprend de manière préférentielle des compositions pharmaceutiques comprenant comme principe actif un polypeptide ULIP6 purifié, préférentiellement sous forme soluble, associé à un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

De telles compositions offrent une nouvelle approche pour traiter les désordres du système nerveux central et périphérique et de la vision, et notamment les syndromes neurologiques paranéoplasiques. Par ailleurs, elles sont utiles pour traiter les désordres neurologiques liés à une perte neuronale et/ou une sous-expression de la protéine ULIP6 dans le système nerveux.

Ainsi, ULIP6 révèle aussi un intérêt dans des pathologies neurodégénératives telles que les atrophies multisystémiques qui sont des affections similaires à celles des SNP et pour lesquelles une anomalie d'une sous-population oligodendrocytaire a été détectée (Papp et al., 1992).

Les compositions selon l'invention sont par ailleurs utiles en thérapie anticancéreuse.

Les anticorps dirigés contre la protéine ULIP6 peuvent être associés à des agents antinéoplasiques, permettant ainsi le ciblage des médicaments vers les cellules tumorales.

Ils peuvent en outre être associés à un groupe chimique hydrophile choisi de manière à passer ou non la barrière hématoencéphalique, selon le type de tumeur.

La protéine ULIP6 ainsi que les séquences nucléotidiques décrites plus haut, et les séquences ou oligonucléotides anti-sens, peuvent être utiles dans la thérapie de tout type de cancer dans lequel un gène codant pour la protéine ULIP6 est impliqué. Parmi des exemples de cancers, on peut citer les tumeurs périphériques, telles que le cancer du poumon à petites cellules, le thymome, le cancer du sein et de l'ovaire, ainsi que les tumeurs cérébrales, de préférence les tumeurs cérébrales primitives d'origine gliale.

L'expression d'ULIP6 dans les cellules non prolifératives du cerveau normal,

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son absence dans des tissus normaux tels que poumon ou thymus par exemple, sa réexpression différentielle lors de la tumorigénèse de ces tissus et la modulation de son expression dans une lignée tumorale au cours de la différenciation suggèrent à cet égard que ULIP 6 pourrait être un gène suppresseur de tumeur.

Préférentiellement, les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être administrées par voie systémique, de préférence par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique ou par voie orale.

Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement thérapeutique adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés, etc.

L'invention comprend également l'utilisation d'une protéine purifiée ULIP6, un acide nucléique codant pour ladite protéine ou appartenant aux régions non codantes du gène de l'ULIP6, une séquence anti-sens capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence nucléotidique SEQ ID n 1 ou n 3, ou un anticorps dirigé contre ladite protéine, associée à un véhicule pharmaceutiquement acceptable, pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter les maladies neurodégénératives et les néoplasmes.

L'invention a enfin pour objet une méthode de traitement des maladies neurodégénératives et des néoplasmes comprenant l'administration à un sujet nécessitant un tel traitement d'une quantité thérapeutiquement efficace d'une composition pharmaceutique telle que définie précédemment.

Les exemples et les figures dont les légendes sont présentées ciaprès sont donnés à titre illustratif.

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LEGENDE DES FIGURES - La figure 1 représente un Western Blot réalisé à partir d'extraits protéiques d'E. coli exprimant la protéine de fusion GST-ULIP6 C-term. Ces extraits ont été séparés par SDS-PAGE 12,5 %, transférés sur membrane de PVDF et incubés avec des sérums humains. Pistes 1 à 14 : sérumsanti-CV2 ; pistes 15 à 17 : sérumscontrôles.

- La figure 2 représente un Western Blot réalisé à partir de protéines de fusion GST-ULIP6 C-term après purification sur billes d'agarose- glutathione. La protéine est reconnue par deux sérums anti-CV2, (piste 1 : sérum 94-822, piste 2 : sérum 95-590) mais pas par un sérum contrôle (ligne 3).

Exemple 1 : Identification de la cible des anticorps anti-CV2
Après expression des protéines recombinantes de la famille Ulip dans des cellules HeLa, les auteurs de l'invention ont pu montrer que les sérums anti-CV2 alors en leur possession reconnaissaient tous Ulip4 en immunohistochimie. Ce résultat suggérait que Ulip4 pouvait être l'antigène majeur reconnu par les sérums anti-CV2 (Honnorat et al, 1999). Par contre, lorsque une cohorte plus importante de sérums a été testée en Western blot sur la protéine Ulip4 exprimée dans E. coli, ils se sont aperçus que si plusieurs sérums anti-CV2 reconnaissaient indiscutablement la protéine recombinante Ulip4, certains ne la reconnaissaient pas, alors que tous les sérums anti-CV2 reconnaissent par Western blot une même protéine de 66kDa après immunoprécipitation d'extraits protéiques de cerveaux (Honnorat et al, 1996). De plus, par hybridation in situ, les oligodendrocytes n'exprimaient pas l'ARN messager de Ulip4. Les auteurs de l'invention ont alors émis l'hypothèse de l'existence d'une autre protéine homologue aux protéines Ulip, non encore décrite et exprimée par les oligodendrocytes.

Pour rechercher cette protéine, un sérum anti-CV2, ne reconnaissant pas Ulip4 recombinante par Western blot a été utilisé pour cribler une banque d'expression. Une banque d'ADNc de moëlle épinière

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humaine, lieu d'expression maximale de l'antigène CV2 chez l'adulte, clonés dans le phage lambda gt11a été choisie (Clontech, Palo Alto, USA). Les phages ont été criblés à une densité de 2x104 pfu par boites de 150 mm de diamètres. Après incubation 3 heures 30 à 42 C, les boites étaient recouverte d'une membrane de nitrocellulose incubée dans l'IPTG (10 mmolaires) et réincubées 3 heures à 37 C. Les membranes étaient ensuite saturées dans du PBS-Tween-lait écrémé, puis incubées une nuit avec le sérum dilué au 1/100. Les membranes étaient ensuite lavées en PBS-Tween puis incubées avec un anti-sérum anti-immunoglobuline humaine marqué à la peroxidase.

Après lavage, les membranes étaient révélées par la méthode de diaminobenzidine. Les clones donnant un signal positif ont été purifiés par repiquages successifs jusqu'a obtenir 100% de clones positifs. Quatre ADNc de 1400 à 1700 paires de bases et codant pour la partie C-terminale d'une même protéine ont été identifiés. Le clone présentant la plus grande séquence codante (clone 97) contenait 1490 paires de bases (nucléotides 1585 à 3074 de la séquence ID n 1) avec un cadre ouvert de lecture de 270 nucléotides codant pour un polypeptide de 90 acides aminés (acides aminés 475 à 564 de la séquence ID n 2). Après recherche d'homologie dans des banques de données, il a été constaté que ce polypeptide (nommé dans la suite de l'étude Ulip6 C-Term) présentait une homologie de 35% avec la partie C-terminale de chacun des membres déjà connu de la famille Ulip et qu'il n'existait aucune homologie avec d'autres familles de protéines.

Exemple 2 : Production de la protéine recombinante GSTULIP6 C-Term
Pour confirmer que ce polypeptide était bien l'antigène reconnu par les sérums anti-CV2, la phase codante du clone 97 a été clonée dans un vecteur d'expression bactérien, pGex 2T (Pharmacia Amersham Biotech, Suède). Ce vecteur permet l'expression, chez E.coli, de la protéine d'intérêt en fusion avec la glutathione-S-transferase (GST, 26kDa). Par Western-blot, 16 des 18 sérums anti-CV2 testés reconnaissaient la protéine de fusion GST-

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Ulip6-CTerm dans un extrait protéique bactérien, soit 89 % de positifs (Figure 1). Il est à noter que le polypeptide Ulip6 C-Term a un poids moléculaire de 10 kDa ce qui représente environ 15 % d'une protéine de 66 kDa. Aucun de ces sérums ne reconnaissait la GST seule. 100 sérums contrôles ont également été testés. Aucun ne présentait de réactivité vis à vis de la protéine de fusion GST-Ulip6 C-Term. Dans le but de disposer du test le plus spécifique possible, les auteurs de l'invention ont également testé les sérums anti-CV2 sur la protéine de fusion GST-Ulip6 C-Term purifiée sur billes d'agaroseglutathione. La figure 2 montre un exemple des résultats obtenus en Western blot.

Exemple 3 : Northern-blot sur ARN de moelle épinière humaine
Pour déterminer la taille du transcript du gène Ulip6, une analyse par Northern blot a été réalisée sur des ARN polyA+ purifiés extraits de moelle épinière humaine (Clontech, Palo Alto, USA). La sonde correspondait à la totalité du clone 97 marqué au dCTP alpha 32P. Les ARN ont été séparés sur gel d'électrophorèse agarose 1,2% formaldéhyde et transférés sur membrane de nylon. Après préhybridation avec la solution d'hybridation rapide (Clontech, Palo Alto, USA) la membrane était incubée une heure avec la sonde. Après lavage, la membrane était exposée sur un film pendant une nuit à -80 C. Une seule bande correspondant à un transcrit de 5 kb a été révélée.

Exemple 4 : Hybridation in situ sur moelle épinière
Pour vérifier la présence de l'ARN messager de Ulip6 dans les oligodendrocytes, une analyse par hybridation in situ a été réalisée sur coupe frontale de moelle. La sonde utilisée était une sonde ARN froide obtenue par transcription du clone 97 sous cloné dans pBluescript SK (Stratagène) et marquée à la digoxigénine. Une sonde sens était utilisée comme contrôle négatif. Un marquage spécifique des oligodendrocytes a pu être observé.

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Exemple 5 : Production d'un anticorps de lapin anti-Ulip6
Des anticorps polyclonaux ont été produits par immunisation de lapins contre un peptide spécifique de la protéine Ulip6 (peptide Pep Ulip6="KEMGTPLADTPTRPVTRHGG" de séquence SEQ ID n 4 , correspondant au fragment d'acides aminés 505 à 524 sur SEQ ID n 2). Le peptide a été synthétisé sur un appareil de synthèse peptidique (432A Peptide Synthesizer SYNERGY, Applied Biosystems), par la société COVALAB (Lyon, France). La pureté des échantillons a été contrôlée par HPLC et spectrométrie de masse. Un milligramme de peptide couplé à l'hémocyanine et à de l'adjuvant complet de Freund a été injecté aux lapins (COVALAB, Lyon, France). Toutes les 3 semaines, une nouvelle injection de 0,5 mg a été réalisée. La production d'anticorps et leur spécificité ont été analysées par western-blots et immunohistochimie, en utilisant comme contrôle les sérums pré-immuns.

Les anticorps obtenus reconnaissaient la protéine GST-Ulip6 CTerm par western-blot, une protéine de 66 kDa sur extraits de cerveau et marquaient spécifiquement des oligodendrocytes par immunohistochimie sur coupes de moelle de rats.

Exemple 6 :Recherche de la séquence complète Ulip6
Pour obtenir un ADNc complet de Ulip6, la banque d'ADNc de moëlle épinière humaine, clonés dans le phage lambda gt11(Clontech, Palo Alto, USA) a été criblée avec une sonde radioactive. Cette sonde obtenue par PCR était marquée au dCTP alpha 32P, et correspondait aux nucléotides 1585 à 1854 de la séquence ID N 1. Les phages ont été criblés à une densité de 2x104 pfu par boites de 150 mm de diamètres. Après incubation 6 heures à 37 C, une réplique était obtenue sur une membrane de nylon. Cette membrane était traitée pour dénaturation des phages, puis l'ADN était fixé une nuit à 42 C. Après préhybridation avec la solution d'hybridation rapide

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(Clontech, Palo Alto, USA) la membrane était incubée une heure avec la sonde radioactive. Après lavage, la membrane était exposée sur un film pendant une nuit à -80 C. des clones donnant un signal positif ont été purifiés par repiquages successifs jusqu'a obtenir 100% de clones positifs. Le plus grand ADNc obtenu comprenait 3074 nucléotides (SEQ ID n 1) et comprenait un cadre ouvert de lecture de 1692 nucléotides (nucléotides n 163 à 1854 de la SEQ ID n 1). Il codait pour une protéine de 564 acides aminés (SEQ ID n 2), dont la partie C-terminale était strictement identique au polypeptide ULIP6 C-term (acides aminés 475 à 564 sur SEQ ID n 2). Après alignement de la protéine obtenue avec les quatre protéines ULIP/CRMP humaines connues, une homologie de 50 % était observée.

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BIBLIOGRAPHIE - Anderson et al., CRC Crit. Rev. Neurobiol., 1987, vol. 3, pp 245- 99 - Antoine J. C. et al., Journal of the Neurological Sciences, 1993, vol. 117, pp 215-223 - Byk et al., Journal of Neuroscience, 1996, vol. 16 (2), pp 688- 701 - Byk T, Ozon S, Sobel A (1998). EurJ. Biochem, 254 :14-24 - Dalmau et al., Neurology, 1991, vol. 41, pp 1757-64 - Graus et al., Neurology, 1985, vol. 35, pp 538-543 - Greenlee et al., Ann. Neurol., 1983, vol. 14, pp 609-13 - Hamajima N, Matsuda K, Sakata S, Tamaki M, Nonaka M (1996). Gene,180:157-163.

- Hetzel et al., Mayo Clin. Proc., 1990, vol. 65, pp 1558-63 - Honnorat J. et al., Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry, 1996, vol. 61, pp 270-278 - Jaeckle et al., Ann. Neurol., 1985, vol. 18, pp 592-600 - Kôhler et Milstein, Nature, 1975, vol. 256, pp 495-497 - Levy N., Mattei MG., 1995, Geneprobs II, a practical approch.

BD Hames and SJ Higgins, Oxford University Press, pp 211-243

<Desc/Clms Page number 20>

- Luque et al., Ann. Neurol., 1991, vol. 29, pp 241-51 - Sambrook et al., Molecular Cloning, a laboratory Manual, 1989, 9. 47-9.62 - Wang LH and Strittmatter SM (1996). J Neurosci,16:6197-6207.

Claims (14)

REVENDICATIONS

1. Polypeptide purifié désigné ULIP6, comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID n 2 ou fragment épitopique dudit polypeptide, comprenant la séquence SEQ ID n 4.

2. Acide nucléique isolé comprenant une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide ou un fragment épitopique dudit polypeptide tel que défini dans la revendication 1.

3. Acide nucléique selon la revendication 2, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID n 1.

4. Acide nucléique isolé comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID n 3 ou la séquence allant du nucléotide 1 au nucléotide 162 de SEQ ID n 1.

5. Vecteur de clonage et/ou d'expression contenant une séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications 2 à 4.

6. Cellule hôte transfectée par un vecteur selon la revendication 5.

7. Anticorps mono- ou polyclonaux obtenus à partir d'un polypeptide selon la revendication 1 ainsi que les fragments, les anticorps chimériques ou les immunoconjugués desdits anticorps mono- ou polyclonaux.

8. Composition utile pour le diagnostic des syndromes neurologiques paranéoplasiques et/ou pour le diagnostic précoce de la formation des tumeurs, caractérisée en ce qu'elle comprend un polypeptide ou un fragment épitopique dudit polypeptide tel que défini dans la revendication 1.

9. Utilisation d'un polypeptide selon la revendication 1 pour détecter la présence d'anticorps anti-CV2 dans un échantillon biologique.

10. Utilisation d'anticorps mono- ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugués selon la revendication 7, pour la purification ou la détection d'une protéine ULIP6 selon la revendication 1, dans un échantillon biologique.

11. Méthode pour le diagnostic des syndromes neurologiques paranéoplasiques et/ou pour le diagnostic précoce de la formation des tumeurs cancéreuses, dans lequel on met en évidence dans un échantillon biologique

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prélevé chez un individu des auto-anticorps dirigés contre une protéine ULIP 6 par - la mise en contact d'un échantillon biologique prélevé chez un individu avec un polypeptide selon la revendication 1, éventuellement fixé sur un support dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques spécifiques entre ledit polypeptide et les auto-anticorps éventuellement présents dans l'échantillon biologique, et - la détection des complexes immunologiques spécifiques éventuellement formés.

12. Kit pour le diagnostic des syndromes neurologiques paranéoplasiques et pour le diagnostic précoce de la formation des tumeurs à partir d'un prélèvement biologique comprenant : - au moins un polypeptide ULIP6, selon la revendication 1, éventuellement fixé sur un support, des moyens de révélation de la formation de complexes antigène/anticorps spécifiques entre un auto-anticorps anti-ULIP6 et ledit polypeptide ULIP6 et/ou des moyens de quantification de ces complexes.

13. Composition pharmaceutique comprenant au moins un agent thérapeutique choisi parmi un polypeptide selon la revendication 1, un acide nucléique selon la revendication 2 à 4 ou un acide nucléique comprenant une séquence anti-sens capable de s'hybrider spécifiquement avec un acide nucléique selon la revendication 2 à 4, ou un anticorps spécifiquement dirigé contre le polypeptide selon la revendication 7, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

14. Utilisation d'un agent thérapeutique tel que défini dans la revendication. 13 pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter les maladies neurodégénératives et les néoplasmes.