FR2808883A1 - Procede et dispositif pour l'injection d'un echantillon dans un capillaire d'electrophorese - Google Patents

Abstract

Procédé pour l'injection d'un échantillon dans un capillaire d'électrophorèse selon lequel on plonge le capillaire (1) dans l'échantillon et on applique entre les extrémités du capillaire (1) un champ électrique pour faire migrer l'échantillon dans le capillaire (1), caractérisé en ce qu'on introduit préalablement l'échantillon dans une pièce (3) présentant un canal (4) dont les dimensions, perpendiculairement à la direction selon laquelle ledit canal (4) s'étend, sont inférieures à environ quatre fois le diamètre extérieur du capillaire (1), et en ce que pour plonger le capillaire (1) dans l'échantillon, on introduit ledit capillaire (1) dans ledit canal (4).

Description

PROCEDE ET DISPOSITIF POUR L'INJECTION D'UN ECHANTILLON DANS UN CAPILLAIRE D'ELECTROPHORESE La présente invention est relative à l'injection d'un échantillon dans un capillaire d'électrophorèse.

L'électrophorèse par capillaire(s) a l'avantage de permettre un plus grand débit et une automatisation plus élevée que les techniques d'électrophorèse antérieures.

Toutefois, cette technique s'avère très coûteuse en particulier quant à la preparation des échantillons.

Les techniques d'injection principalement utilisées à ce jour nécessitent en effet des préparations de grandes quantités volume d'échantillons (10 à 20 pl d'échantillon d'ADN par exemple), dont elles n'utilisent qu'une faible partie.

Un but de l'invention est de pallier cet inconvénient.

Un autre but de l'invention est de proposer une technique qui permette de réaliser, dans un capillaire ou un ensemble de capillaires, une injection électrocinétique reproductible et efficace.

On connaît principalement deux méthodes différentes pour injecter un échantillon, tel que par exemple un échantillon d'ADN dans un capillaire : l'injection hydrodynamique, et l'injection électrocinétique.

L'injection hydrodynamique consiste à utiliser une différence de pression pour faire entrer une certaine quantité d'échantillon dans un capillaire. Cette technique est souvent peu satisfaisante, dans la mesure où elle necessite des zones d'introduction d'échantillons larges et ne permet par conséquent pas une bonne résolution, où elle ne peut être utilisée que pour des matrices de séparation peu visqueuses et où elle difficile à mettre en oeuvre en parallèle sur une pluralité de capillaires.

C'est pourquoi on privilégie le plus souvent l'injection électrocinétique, qui consiste à appliquer, pendant une courte durée, une différence de potentiel entre les extrémités des capillaires pour faire migrer les molécules à l'intérieur de ceux-ci. La quantité d'échantillon introduite par cette méthode peut être augmentée, soit en accentuant la différence de potentiel, soit en allongeant le temps de chargement, sans pour autant maîtriser totalement la quantité injectée. En général, la résolution est meilleure que pour l'injection hydrodynamique.

L'invention propose quant à elle un procédé pour l'injection d'un echantillon dans un capillaire d'électrophorèse selon lequel on plonge le capillaire dans l'échantillon et on applique entre les extrémités capillaire champ électrique pour faire migrer l'échantillon dans capillaire, caractérisé en ce qu'on introduit préalablement l'échantillon dans une pièce présentant un canal dont les dimensions, perpendiculairement à la direction selon laquelle ledit canal s'étend, sont inférieures à environ quatre fois le diamètre extérieur du capillaire, et en ce que pour plonger le capillaire dans l'échantillon, on introduit ledit capillaire dans ledit canal.

Elle propose également un dispositif pour l'injection d'un échantillon dans un capillaire d'électrophorèse comportant une pièce creuse dans laquelle l'échantillon est reçu et dans laquelle le capillaire est destiné à être plongé, ainsi que des moyens pour appliquer entre les extremités du capillaire un champ électrique destiné à faire migrer l'échantillon dans le capillaire, caractérisé en ce que ladite pièce creuse est pièce présentant un canal dont les dimensions, perpendiculairement à la direction selon laquelle ledit canal s'étend, sont inférieures à environ quatre fois le diamètre extérieur du capillaire et qui est apte à recevoir un capillaire et en ce qu'il comporte en outre des moyens pour introduire l'échantillon dans ledit canal.

Avec un tel procédé ou un tel dispositif, on restreint considérablement le volume d'échantillon qu'il est nécessaire de préparer: il suffit en effet d'un volume d'échantillon permettant de remplir le canal sur quelques millimètres ; l'ensemble de l'échantillon préparé est alors utilisé.

Par ailleurs, un tel canal permet de parfaitement contrôler la position du capillaire et en particulier de le positionner avec une grande précision par rapport à l'électrode et créer ainsi d'une manière reproductible un champ électrique destiné à faire migrer l'échantillon. outre, il permet une grande homogénéité sur le champ en entrée du capillaire, et donc une même vitesse de migration sur l'ensemble molécules dans le canal.

améliore ainsi la reproductibilité et l'efficacité de l'injection.

Le dispositif d'injection proposé par l'invention est avantageusement complété par les différentes caractéristiques suivantes prises seules selon toutes leurs combinaisons possibles, qui contribuent également à atteindre buts de l'invention - l'élément formant puits et la pièce qui présente le canal sont aptes à s'emboîter l'un dans l'autre, l'échantillon montant par capillarité différence pression dans le canal lorsque la pièce qui présente le canal est introduite dans la pièce formant puits ; - l'élément formant puits présente une forme évasée facilitant le guidage la pièce présente un canal ; - le canal se prolonge par une ouverture évasée qui facilite l'introduction du capillaire ; - cette ouverture est sensiblement de forme conique; - le dispositif comporte une plaque qui présente une pluralité d'éléments formant puits destinés à coopérer avec une pluralité de pièces complémentaires présentant chacune un canal ; - le dispositif comporte au moins un réceptacle apte à recevoir une telle plaque des moyens aptes à transporter automatiquement ledit réceptacle d'une station de travail à une autre ; - le dispositif comporte en outre un couvercle apte à fermer le réceptacle lorsqu'une telle plaque est en place dans celui-ci ; - le dispositif comporte des moyens formant joint assurant l'étanchéité entre le réceptacle et le couvercle ; - les pieces complémentaires présentant chacune un canal sont portées par une plaque et le dispositif comporte des moyens pour positionner automatiquement l'une par rapport à l'autre ladite plaque et la plaque qui présente une pluralité d'éléments formant puits.

L'invention porte également sur un dispositif d'électrophorèse comportant un tel dispositif d'injection. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront encore de la description qui suit qui est purement illustrative et non limitative et qui doit être lue en regard des dessins annexés sur lesquels - la figure 1 est une représentation schématique en coupe d'un dispositif conforme à un mode de réalisation possible de l'invention , - la figure 2 est une représentation schématique en perspective éclatée d'une palette de manipulation d'un dispositif conforme à un mode de réalisation de l'invention ; la figure 3 est une représentation schématique en perspective d'une enceinte de stockage d'un dispositif conforme à un mode de réalisation possible de l'invention et de moyens de manipulation automatiques.

a représenté sur la figure 1 un système permettant l'injection d'échantillons dans un capillaire 1.

Ce système comporte un puits 2 dont le fond est forme sensiblement conique et reçoit une gouttelette d'un échantillon a injecter dans le capillaire. II comporte en outre une pièce 3 destinée à être introduite dans ce puits 2 et qui est d'une forme lui permettant de s'emboîter dans celui-ci.

Cette pièce 3 présente un canal 4, en l'occurrence tubulaire, qui s'étend axialement sur toute sa longueur et dans lequel le capillaire 1 est reçu.

Plus exactement, ce canal 4 est défini par un tube 5 en verre ou en un matériau analogue qui est de très faible diamètre intérieur et dans lequel le capillaire 1 est reçu.

La pièce 3 porte, à son extrémité par laquelle l'échantillon est destiné à s'introduire dans le tube 5, puis dans le capillaire 1, une électrode 6.

L'alimentation de cette électrode 6 est réalisée au moyen d'un fil métallique 7 qui s'étend dans la hauteur de la pièce 3 entre ladite électrode 6 et une plaque métallique 8 qui est elle-même reliée à un générateur Haute Tension. La pièce 3 est fixée dans un orifice 9 qui traverse la plaque 8, par exemple par vissage.

Cette pièce 3 se termine au niveau dudit orifice 9 par une portion 3a métallique (conducteur électrique), qui est traversée une ouverture axiale 3b de forme conique qui permet de guider le capillaire pour le placer dans le tube 5 (les parois de cette ouverture sont par exemple en Téflon).

Le capillaire 1 est quant à lui porté par une plaque 10 formant support.

Une injection au moyen du dispositif qui vient d'être décrit s'effectue de la façon suivante.

On dispose au fond du puits 2 une goutte G d'echantillon (c'est à dire quelques NI, par exemple de 1 à 5), puis on introduit la pièce 3 dans le puits 2.

La goutte G monte alors par capillarité ou pression dans le tube 5. Une goutte de quelques micro- litres d'échantillon suffit pour créer ainsi dans le tube 5 une colonne de plusieurs mm d'échantillon.

On introduit alors le capillaire 1 dans la pièce 3 en rapportant la plaque 10 formant support sur la plaque 8.

Le capillaire 1 baigne alors dans l'échantillon, en étant situé à une distance bien déterminée et reproductible de l'électrode 6.

L'application d'un champ électrique entre l'électrode 6 et une autre électrode - non représentée - à l'extrémité du capillaire 1 la plus éloignée de l'électrode 6 permet de faire migrer les molécules dans le capillaire 1.

Le capillaire 1 est par exemple d'une longueur 35 cm, d'un diamètre interne de 75 #tm et d'un diamètre externe de 200 La pièce 3 et la plaque 10 sont par exemple en Plexiglas.

Le puits 2, la pièce 3 et le tube 5 sont par exemple d'une hauteur de 20 à 25 mm.

plaque 8 est par exemple en Inox.

tube 5 présente par exemple un diamètre interne de 650 #im et un diametre externe de 1600 gym. Le diamètre interne du trou conique que présente la portion 3 en Téflon varie de 1000 #im à 400 pm.

L'électrode 6 est par exemple en Platine et se présente sous la forme d'un disque d'un diamètre interne de 400 #tm et d'un diamètre externe de 700 gym, rapporté sur la tranche d'extrémité de la pièce Bien entendu, d'autres dispositions d'électrodes pourraient être envisagées.

Notamment, l'électrode 6 pourrait être portée par fond du puits 2. Elle pourrait être constituée par un fil par exemple en Platine qui descend de la plaque jusqu'au fond du puits. Le tube 5 peut être en Platine et jouer le rôle d'électrode.

En variante encore, la pièce 2 pourrait être une pièce métallique constituant l'electrode 6.

Dans tous les cas, il est avantageux de donner à l'électrode une géométrie permettant un champ électrique aussi homogène que possible dans le canal 4.

Le puits 2 est avantageusement porté par une plaque 11, avec une pluralité d'autres puits d'injection.

A titre d'exemple, la plaque 11 peut porter 96 puits répartis selon une matrice * 12.

Ainsi que l'illustre la figure 2, cette plaque 11 et les puits 2 qu'elle porte sont avantageusement reçus dans un réceptacle 12.

Ce receptacle 12 permet de manipuler lesdites plaques 11 et en particulier les transporter d'une station de travail à une autre.

II comporte des moyens de détrompage (picots 17) imposant une seule position possible pour une plaque 11 dans ledit réceptacle 12. couvercle 13 est rapporté sur ledit réceptacle 12 pour éviter l'évaporation et l'exposition à la lumière des échantillons.

Des moyens formant joint sont prévus entre ledit couvercle 13 et ledit réceptacle 12 pour réduire au minimum l'évaporation. Les palettes 14 ainsi constituées par un réceptacle 12 fermé par un couvercle 13 et renfermant une plaque 11 permettent à un automate manipuler les plaques 11 de la façon suivante.

Les puits 2 de la plaque 11 ayant été initialement remplis, l'automate ou un opérateur positionne un couvercle 13 sur le réceptacle dans lequel ladite plaque 11 est disposée de façon à fermer le réceptacle 12.

Puis, la palette 14 ainsi constituée est transportée jusqu'à une enceinte 15 (figure 3), dans laquelle il est possible de stocker un grand nombre de ces palettes 14.

L'armoire 15 comporte par exemple un compartiment réfrigéré maintenu en permanence à 4 C ou en dessous, ce qui permet de minimiser la dégradation échantillons stockés.

Le dispositif peut par ailleurs également comporter un compartiment de chauffage permettant de dénaturer les échantillons, par exemple en les chauffant à , avant de les refroidir rapidement à 4 C ou en dessous l'automate déplaçant les palettes 14 d'un compartiment à un autre.

Le compartiment de chauffage peut être intégré à l'armoire 15, être constitue par une station de travail indépendante.

Lorsqu'une électrophorèse doit être mise en oeuvre sur une plaquell, l'automate va chercher dans le compartiment réfrigéré de l'armoire 15 palette qui correspond à cette plaque 11, au moyen d'un bras de manipulation 16.

II lui retire son couvercle 13 et le remplace par un couvercle constitué par une plaque du type de la plaque 8, porteuse d'une pluralité pièces 3 supports d'électrodes, ces pièces 3 étant réparties sur ladite pièce 8 de façon à correspondre aux différents puits 2 de la plaque 11.

Les échantillons montent alors par capillarité dans les tubes 5 pièces 3.

Lorsque les échantillons sont ainsi en place dans les tubes 5, la nouvelle palette - constituée par un réceptacle 12, une plaque 11 et un couvercle 8 porteur d'une pluralité de pièces 3 supports d'électrodes - est transportée par l'automate dans le séquenceur. Elle est insérée selon un mouvement parallèle à l'axe des capillaires, lesquels s'introduisent dans les tubes 5 des pièces 3 en étant guidés par ouvertures coniques des portions 3a.

Tous capillaires se trouvent alors positionnés de la même façon par rapport aux électrodes 6 et ce positionnement est reproductible d'une plaque 11 à une autre.

Claims (11)

<U>REVENDICATIONS</U>

1. Procédé pour l'injection d'un échantillon dans un capillaire d'electrophorèse selon lequel on plonge le capillaire (1) dans l'echantillon et applique entre les extrémités du capillaire (1) un champ électrique pour faire migrer l'échantillon dans le capillaire (1), caractérisé ce qu'on introduit préalablement l'échantillon dans une pièce (3) présentant un canal (4) dont les dimensions, perpendiculairement à la direction selon laquelle ledit canal (4) s'étend, sont inférieures à environ quatre fois le diamètre extérieur du capillaire (1), et en ce que pour plonger le capillaire (1) dans l'échantillon, on introduit ledit capillaire (1) dans ledit canal (4).

2. Dispositif pour l'injection d'un échantillon dans un capillaire (1) d'electrophorèse comportant une pièce (3) creuse dans laquelle l'échantillon reçu et dans laquelle le capillaire (1) est destiné à être plongé, ainsi que des moyens pour appliquer entre les extrémités du capillaire (1) un champ électrique destiné à faire migrer l'échantillon dans le capillaire (1), caractérisé en ce que ladite pièce (3) creuse est une pièce présentant un canal (4) dont les dimensions, perpendiculairement à la direction selon laquelle ledit canal (4) s'étend, sont inférieures à environ quatre fois le diamètre extrérieur du capillaire (1) et qui est apte à recevoir un capillaire (1) et en ce qu'il comporte en outre des moyens pour introduire l'échantillon dans ledit canal (4).

3. Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que les moyens pour introduire un échantillon dans le canal (4) comportent un élément formant puits qui est apte à recevoir la pièce(3) qui présente le canal (4) et dont le fond est destiné à recevoir une goutte d'échantillon.

4. Dispositif selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'élément formant puits et la pièce (3) qui présente le canal sont aptes à s'emboîter l'un dans l'autre, l'échantillon montant par capillarité ou différence de pression dans le canal (4) lorsque la pièce (3) qui présente le canal (4) est introduite dans la pièce formant puits.

5. Dispositif selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'élément formant puits présente une forme évasée facilitant le guidage de la pièce (3) qui présente un canal (4).

6. Dispositif selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que le canal se prolonge par une ouverture évasée qui facilite l'introduction du capillaire.

7. Dispositif selon la revendication 6, caractérisé en que cette ouverture est sensiblement de forme conique.

8. Dispositif selon la revendication 3, prise seule ou en combinaison avec l'une des revendications 4 à 7, caractérisé en ce qu'il comporte une plaque qui présente une pluralité d'éléments formant puits destinés à coopérer avec une pluralité de pièces complémentaires présentant chacune un canal.

9. Dispositif selon la revendication 8, caractérisé en ce comporte au moins un réceptacle apte à recevoir une telle plaque des moyens aptes à transporter automatiquement ledit réceptacle d'une station de travail à une autre.

10. Dispositif selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comporte en outre un couvercle apte à fermer le réceptacle lorsqu'une telle plaque est en place dans celui-ci.

11. Dispositif selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens formant joint assurant l'étanchéité entre le réceptacle et le couvercle. Dispositif selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que pièces complémentaires présentant chacune un canal sont portées par plaque et en ce qu'il comporte des moyens pour positionner automatiquement l'une par rapport à l'autre ladite plaque et la plaque qui présente une pluralité d'éléments formant puits. 13. Dispositif d'électrophorèse caractérisé en ce qu'il comporte un dispositif d'injection selon l'une des revendications 2 à 12.