FR2809106A1

FR2809106A1 - Polypeptide ro/ssa-like et ses fragments et polynucleotides codant lesdits polypeptides et applications therapeutiques

Info

Publication number: FR2809106A1
Application number: FR0006315A
Authority: FR
Inventors: Georges Bahr; Cecile Cocude; Andre Capron
Original assignee: ISTAC
Current assignee: ISTAC
Priority date: 2000-05-17
Filing date: 2000-05-17
Publication date: 2001-11-23
Also published as: JP2003533230A; AU2001239378A1; EP1283882A1; WO2001088128A1; US20030186269A1; CA2409414A1

Abstract

La présente invention concerne un nouveau polypeptide Ro/ SSA-like et ses fragments, le clonage de l'ADNc et les polynucléotides codant lesdits polypeptides, des vecteurs de clonage et/ ou d'expression incluant lesdits polynucléotides, des cellules transformées par lesdits vecteurs et des anticorps spécifiques dirigés contre lesdits polypeptides. L'invention concerne également des procédés de détection et/ ou de dosage desdits polypeptides et polynucléotides, les trousses de diagnostic correspondantes, un procédé de criblage de ligands, un procédé de détection d'auto-anticorps anti-Ro/ SSA-like, un procédé de purification d'un fluide biologique humain susceptible de contenir des auto-anticorps anti-Ro/ SSA-like, ainsi que des composés utilisables à titre de médicament pour la prévention et/ ou le traitement de pathologies virales telles le SIDA et de maladies auto-immunes, notamment du lupus systémique érythémateux (SLE) et du syndrome de Sjögren.

Description

La présente invention concerne un nouveau polypeptide Ro/SSA-like et ses fragments, le clonage de l'ADNc et les polynucléotides codant lesdits polypeptides, des vecteurs de clonage et/ou d'expression incluant lesdits polynucléotides, des cellules transformées par lesdits vecteurs et des anticorps spécifiques dirigés contre lesdits polypeptides. L'invention concerne également des procédés de détection et/ou de dosage desdits polypeptides et polynucléotides, les trousses de diagnostic correspondantes, un procédé de criblage de ligands, un procédé de détection d'autoanticorps anti-Ro/SSA-like, un procédé de purification d'un fluide biologique humain susceptible de contenir des auto-anticorps antiRo/SSA-like, ainsi que des composés utilisables à titre de médicament pour la prévention et/ou le traitement de maladies virales telles le SIDA et de maladies auto-immunes, notamment du lupus systémique érythémateux (SLE) et du syndrome de Sjôgren.

Les muramylpeptides sont, parmi les immunomodulateurs de synthèse, ceux qui ont montré un grand nombre d'effets immunopharmacologiques sur les cellules de la lignée monocytaire /macrophagique potentialisant leur résistance non spécifique à l'infection, augmentant l'activité tumoricidale des macrophages, et aussi agissant comme adjuvants de vaccins. Le Murabutide (MB), analogue du muramyldipeptide (MDP) a été sélectionné pour son profil biologique particulièrement prometteur et sa bonne tolérance chez l'animal et chez l'homme. En effet, contrairement au MDP et à de nombreux autres analogues, il est démontré que le MB n'est pas pyrogène, n'induit pas de réactions inflammatoires et n'a pas montré de toxicité sévère lors des études cliniques chez des volontaires sains et de patients atteints de cancer.

De part ses capacités biologiques, le MB est un agent antiviral prometteur dans le domaine du SIDA (Syndrome d'Immunodéficience acquise). En effet, le MB inhibe la réplication du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) dans les macrophages et

les cellules dendritiques mais également dans les cellules mononuclées du sang périphérique (Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMC) de patients infectés. Ainsi, compte tenu de ces caractéristiques biologiques l'immunomodulateur MB a fait l'objet d'un brevet français délivré N FR 2 724 845 et intitulé Compositions de Muramyl peptides capables d'inhiber jusqu'à 100% la réplication d'un virus de l'immunodéficience acquise tel que le VIH . De plus, les essais cliniques de phase 1 et de phase IIa menés à terme sur des patients VIH+ ont démontré une bonne tolérance clinique du MB.

Les inventeurs ont démontré que le MB exerce une forte inhibition de la réplication virale dans les PBMCs de patients déplétées en lymphocytes CD8, activées par la phytohémagglutinine (PHA) et mises en culture avec de l'interleukine 2 (IL-2). En effet, le MB inhibe de 70 à 100% le taux de protéine virale p24 du VIH dans les surnageants de culture. Cet effet est corrélé au taux d'expression des ARN messagers viraux (non épissés et simple épissés). De plus, l'analyse du profil de cytokines et chimiokines sécrétées a démontré que le MB induisait la production de chimiokines connues comme inhibitrices de la réplication du VIH. Toutefois, cette induction ne semble pas être corrélée en totalité avec l'effet inhibiteur du MB.

L'inhibition de la réplication du VIH par le MB ne passe pas seulement par l'induction de la production de p-chimiokines puisque le MB intervient aussi au niveau de l'ADN proviral et de la transcription virale. L'absence de toxicité du MB dans ces mêmes cultures cellulaires a été vérifié par les inventeurs qui ont constaté que non seulement le nombre de cellules vivantes reste inchangé en début de culture mais semble, de plus, augmenter en fin de culture.

Les résultats obtenus par les inventeurs suggèrent donc que le MB induit la production de cytokines ou d'autres facteurs non identifiés à ce jour, et qui possèdent une activité suppressive de la réplication du VIH.

Afin d'identifier ces nouveaux facteurs impliqués dans la régulation de la réplication virale, les inventeurs ont utilisé la méthodologie du Differential Display-RT-PCR (DD-RT-PCR) qui repose sur 2 étapes essentielles. Une première étape de reverse transcription (RT) de l'ARN total cellulaire afin d'obtenir des ADN complémentaires de tous les ARN qui possède une queue poly A.

Ensuite, une deuxième étape d'amplification par Polymerase Chain Reaction (PCR) à partir des ADNc servant de matrice et de différents couples d'amorces en présence d'un nucléotide radio-marqué. Les produits de PCR sont ensuite séparés sur gel par électrophorèse. Les fragments différentiellement amplifiés sont coupés du gel, réamplifiés puis clonés et séquences.

La DD-RT-PCR, réalisée à partir de PBMCs d'un patient VIH+, a permis aux inventeurs de sélectionner plus de 130 fragments d'ADNc différentiellement exprimés après traitement au MB. Ces fragments ont été sous-clonés dans le vecteur pCR2.1 (Invitrogen), puis séquences par séquençage automatique (ABI Prism 377, Perkin-Elmer). Les séquences ont été analysées pour les recherches d'homologies en utilisant les banques de données et le serveur Basic Local Alignment Search Tool (Blast 2) du NCBI.

En utilisant la technologie DD-RT-PCR, les inventeurs ont isolé une nouvelle protéine nommée Ro/SSA-like qui présente une identité relative de séquence avec la protéine Ro/SSA.

Il existe deux familles peptidiques comprenant quatre formes moléculaires différentes Ro/SSA 60 kDa lymphocytaires et érythrocytaires, Ro/SSA 52 kDa lymphocytaires et Ro/SSA 54 kDa érythrocytaires (pour revue voir Sibilia, (1998)). Les polypeptides Ro/SSA de 60 et 52 kDa s'associent directement ou indirectement à une molécule d'ARN monocaténaire (hYRNA) pour former un complexe ribonucléoprotéique. Dans ce complexe, une autre protéine, appelée la La/SSB, est présente. L'isoforme Ro/SSA de 60 kDa possède un motif Zinc-finger unique possédant des résidus

cystéines capables de lier l'ADN et l'ARN et un motif consensus de liaison de ribonucléoprotéine (RNP) (Lopez-Luna et al.(1995)). Ainsi, la Ro/SSA de 60 kDa est capable de lier directement les hyRNA (Human Cytoplasmic RNA). L'isoforme Ro/SSA de 52 kDa possède deux motifs Zinc-finger ainsi qu'une séquence leucine-Zipper qui lie l'ADN et qui permet des interactions protéine-protéine qui conduisent à une dimérisation intramoléculaire. Cet isoforme ne possède pas de motif consensus de liaison au ribonucléoprotéine (RNP) et est ainsi incapable de lier le hyARN. Sa liaison au complexe se ferait par la calréticuline. L'isoforme Ro/SSA de 54 kDa érythrocytaire isolée par Rader et al. (1989) présente différents épitopes communs à Ro/SSA 52 kDa. Cette dernière isoforme n'a pas été séquencée à ce jour. Le complexe ribonucléprotéique Ro/SSA est présent dans la plupart des tissus de cellules (globules rouges, plaquettes) mais sa structure et sa quantité varient selon les tissus, les espèces et le stade de développement embryonnaire. Sa fonction est méconnue mais sa structure qui lui permet de fixer des acides nucléiques, notamment l'ARN, et l'existence d'homologies avec certaines protéines de régulation génomique suggèrent qu'il participe aux mécanismes de transcription de l'ADN. Des sérums de patients atteints de maladies auto-immunes telles le lupus érythémateux systémique (SLE) et néonatal et du syndrome de Sjôgren présentent souvent des anticorps dirigés contre les protéines cellulaires Ro/SSA normales.

Les maladies auto-immunes sont des maladies du système immunitaires caractérisées par la production d'anticorps (appelé auto-anticorps) qui réagissent avec des antigènes (appelé autoantigène) provenant des tissus du propre patient (pour revue voir Schwartz et al (1984)). Les maladies auto-immunes de la présente invention comprennent, de manière non exhaustive les maladies suivantes : l'uvéite, la maladie de Bechet, la sarcoidose, le syndrome de Sjôgren, la polyarthrite rhumatoïde, la polyarthrite juvénile, le

syndrome de Fiessinger-Leroy-Reiter, la goutte, l'ostéoarthrose, le lupus systémique érythémateux, le lupus érythémateux aigu disséminé, la polymyosite, la myocardite, la cirrhose biliaire primitive, la maladie de Crohn, la colite ulcéreuse, la sclérose en plaques et autres maladies démyélinisantes, l'anémie aplasique, le purpura thrombocytopénique essentiel, le myélome multiple et le lymphome à lymphocytes B, le panhypopituitarisme de Simmonds, la maladie de Basedow-Graves et l'ophtalmopathie de Graves, la thyroïdite subaiguë et la maladie de Hashimoto, la maladie d'Addison, le diabète sucré insulino-dépendant (type 1). Plus particulièrement, les maladies auto-immunes de l'invention correspondent à la SLE ou au syndrome de Sjôgren ou aux maladies virales chroniques présentant des manifestations cliniques semblables aux maladies auto-immunes, telles que le SIDA, et l'hépatite C. Ces maladies peuvent être subdivisées en maladies organe-spécifiques et en maladies systémiques. Les maladies organe-spécifiques n'affectent qu'un seul organe, tel que la glande thyroïde, ou qu'un système physiologique tel que le système neuromusculaire. Les autoantigènes impliqués dans des maladies organe-spécifique sont d'abord des antigènes spécifiques d'un organe et peuvent être impliqués dans la pathologie de la maladie.

Par exemple les auto-anticorps dirigés contre la thyroglobuline sont observés dans la thyroïdite auto-immune et la thyroglobuline semble être impliquée dans la pathologie de la maladie. Les maladies autoimmunes systémiques, à l'inverse, affectent de multiples systèmes physiologiques. Les auto-anticorps impliqués dans des maladies auto-immunes systémiques sont généralement réactifs avec des auto-antigènes plus ubiquitaires, qui incluent un groupe d'antigènes présents dans le noyau des cellules. Ce dernier groupe inclut l'ADN, les histones, et un large nombre de ribonucléoprotéines. Les maladies auto-immunes présentent une large variété de symptômes et de signes cliniques, néanmoins, la production d'auto-anticorps

circulants dirigés contre des ribonucléoprotéines (RNP) semblent être une caractéristique commune aux maladies auto-immunes rhumatismales. Les auto-antigènes les plus fréquents dans le lupus érythémateux systémiques (SLE) et aux maladies voisines associées sont les ribonucléoprotéines Ro/SSA, La/SSB, nRNP et Sm.

C'est un des objets de la présente invention de fournir la protéine Ro/SSA-like, sur laquelle est susceptible de se lier des anticorps sériques produits par certains patients atteints de maladies auto-immunes.

La présente invention a donc pour objet un polypeptide isolé dénommé Ro/SSA-like de séquence d'acides aminés SEQ ID N 2.

Cette séquence comprend des domaines consensus conservés qui sont aisément identifiables par l'homme du métier. Parmi ces domaines consensus conservés, il convient de citer la séquence d'acides aminés 16 à 54 de la séquence SEQ ID N 2 qui comprend le motif Zinc-finger , la séquence d'acides aminés 91à 123 de la séquence SEQ ID N 2 qui comprend une région riche en cystéine et histidine appelée "Boîte B" ("B. Box"), la séquence d'acides aminés 190 à 245 de la séquence SEQ ID N 2 qui comprend le motif leucine-Zipper .

Le polypeptide selon l'invention est caractérisé en ce qu'il est capable de se lier à une séquence d'acide nucléique et en ce qu'il est comporte au moins un domaine de fixation à un acide nucléique sélectionné dans le groupe composé d'un domaine doigt de zinc (zinc-finger) et d'un domaine leucine zipper .

On entend désigner par liaison à une séquence d'ADN, une interaction spécifique entre le polypeptide de l'invention et une séquence d'ADN au moyen d'une série de liaisons faibles contractées entre les acides aminés de la protéine et les bases. Le polypeptide selon l'invention possède au moins un domaine de liaison à l'ADN qui contient au moins un des motifs protéiques connus susceptibles d'interagir avec l'ADN, c'est-à-dire la structure en doigt de gant à

laquelle est associée un atome de zinc ( zinc-finger ), la structure hélice-tour-hélice, la structure hélice-boucle-hélice et la fermeture éclair à leucines ( leucine-zipper ).

Par motif en doigt de gant ( zinc-finger ), on entend désigner une séquence d'une vingtaine d'acides aminés ayant dans l'espace une forme de doigt de gant. Il en existe deux types : ceux qui contiennent quatre cystéines (C4) et ceux qui contiennent deux cystéines et deux histidines (C2H2). Ces acides aminés définissent la nature du doigt de gant et sont situés à sa base et un ion Zn++ est situé au centre du carré formé par ces quatre acides aminés.

Par motif de type leucine zipper , on entend désigner des motifs appartenant de préférence à des facteurs de transcription dimérique qui sont soit des homodimères, soit des hétérodimères. Le monomère est constitué d'une séquence à caractère basique qui interagit de manière spécifique avec l'acide nucléique, de préférence avec l'ADN et d'un domaine hydrophobe en hélice a qui interagit avec le domaine homologue de l'autre chaîne. Dans ce domaine se trouve une leucine tous les 7 aminoacides, c'est-à-dire à chaque tour d'hélice. Toutes ces leucines sont alignées et l'interaction se fait à leur niveau entre les deux monomères. Le polypeptide selon l'invention possède un motif de type leucine zipper .

Le polypeptide isolé se caractérise en ce qu'il comprend un polypeptide choisi parmi : a) un polypeptide de séquence SEQ ID N 2 ; b) un polypeptide variant de polypeptide de séquences d'acides aminés défini en a) ; c) un polypeptide homologue au polypeptide défini en a) ou b) et comportant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, 87 %, 90 %, 95 % , 97 % 98 %, 99 % d'identité avec ledit polypeptide de a) ; d) un fragment d'au moins 15 acides aminés consécutifs, de préférence d'au moins 17,20, 23,25, 30,40, 50,100

amino-acides consécutifs d'un polypeptide défini en a), b) ou c) à l'exception du fragment de séquence SEQ ID N 4 ; e) un fragment biologiquement actif d'un polypeptide défini en a), b) ou c) à l'exception du fragment de séquence SEQ ID
N 4
Dans la présente description, on utilisera le terme polypeptide pour désigner également une protéine ou un peptide.

On entendra par polypeptide variant l'ensemble des polypeptides mutés pouvant exister naturellement, en particulier chez l'être humain, et qui correspondent notamment à des troncatures, substitutions, délétions et/ou additions de résidus d'amino-acides.

Par polypeptide homologue, on entendra désigner les polypeptides présentant, par rapport au polypeptide naturel Ro/SSAlike, certaines modifications comme en particulier une délétion, addition ou substitution d'au moins un acide aminé, une troncature, un allongement et/ou une fusion chimérique. Parmi les polypeptides homologues, on préfère ceux dont la séquence d'acides aminés présente au moins 80 % d'identité, de préférence d'au moins 85 %, 87 %, 90 %, 93%, 95%, 97 %, 98 %, 99 % d'identité avec les séquences d'acides aminés des polypeptides selon l'invention. Dans le cas d'une substitution, un ou plusieurs acides aminés consécutifs ou non consécutifs, peuvent être remplacés par des acides aminés équivalents . L'expression acide aminé équivalent vise ici à désigner tout acide aminé susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la structure de base sans cependant modifier les caractéristiques ou propriétés fonctionnelles essentielles, comme leurs activités biologiques, des polypeptides correspondants telles que l'induction in vivo d'anticorps capables de reconnaître le polypeptide dont la séquence d'acides aminés est comprise dans la séquence d'acides aminés SEQ ID N 2, ou l'un de ses fragments. Ces acides aminés équivalents peuvent être déterminés soit en s'appuyant sur

leur homologie de structure avec les acides aminés auxquels ils se substituent, soit sur les résultats des essais d'activité biologique croisée auxquels les différents polypeptides sont susceptibles de donner lieu. A titre d'exemple, on mentionnera les possibilités de substitutions susceptibles d'être effectuées sans qu'il en résulte une modification approfondie des activités biologiques des polypeptides modifiés correspondants, les remplacements, par exemple, de la leucine par la valine ou l'isoleucine, de l'acide aspartique par l'acide glutamique, de la glutamine par l'asparagine, de l'arginine par la lysine etc., les substitutions inverses étant naturellement envisageables dans les mêmes conditions.

Par fragment biologiquement actif, on entendra désigner en particulier un fragment de séquence d'acides aminés de polypeptide selon l'invention présentant au moins une des caractéristiques structurelles du polypeptide de l'invention c'est-à-dire un domaine conservé de type Zinc-finger et/ou leucine Zipper et/ou B Box, ou des propriétés fonctionnelles du polypeptide de l'invention, notamment en ce qu'il comporte une activité de liaison à un acide nucléique ADN et/ou ARN. Le polypeptide variant, le polypeptide homologue ou le fragment de polypeptide selon l'invention possède au moins 10 %, de préférence au moins 20 % , 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % de l'activité de liaison à un acide nucléique. Différents protocoles ont été décrits et sont accessibles à l'homme du métier pour mettre en évidence l'aptitude de polypeptides à lier des acides nucléiques. Les exemples ci-après proposent des fonctions biologiques pour la protéine Ro/SSA-like en fonction des domaines peptidiques de cette protéine et permettent ainsi à l'homme du métier d'identifier les fragments biologiquement actifs.

Par fragment de polypeptide, on entend désigner un polypeptide comportant au minimun 15 acides aminés consécutifs, de préférence au moins 17, 20,23, 25,30, 40,50, 100 amino-acides consécutifs. Les fragments de polypeptide selon l'invention obtenus

par clivage dudit polypeptide par une enzyme protéolytique, par un réactif chimique, ou encore en plaçant ledit polypeptide dans un environnement très acide font également partie de l'invention.

De préférence un polypeptide selon l'invention est un polypeptide constitué de la séquence SEQ ID N 2 ou d'une séquence possédant au moins 80 % d'identité, de préférence au moins 85 %, 90 %, 95 %, 98 % et 99 % d'identité avec la SEQ ID N 2 après alignement optimal. Par polypeptide dont la séquence d'acides aminés présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 85 %, 90 %, 95 %, 98 % et 99 % après alignement optimal avec une séquence de référence, on entend désigner les polypeptides présentant certaines modifications par rapport au polypeptide de référence, comme en particulier une ou plusieurs délétions, troncations, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une ou plusieurs substitutions.

Parmi les polypeptides dont la séquence d'acides aminés présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 85 %, 90 %, 95 %, 98 % et 99 % après alignement optimal avec les séquences SEQ ID N 2 ou avec l'un de leurs fragments selon l'invention, on préfère les polypeptides variants codés par les séquences peptidiques variantes telles que précédemment définies, en particulier les polypeptides dont la séquence d'acides aminés présente au moins une mutation correspondant notamment à une troncation, délétion, substitution et/ou addition d'au moins un résidu d'acide aminé par rapport aux séquences SEQ ID N 2 ou avec l'un de leurs fragments, de manière plus préférée les polypeptides variants présentant une mutation liée à une pathologie.

L'invention concerne également un polynucléotide purifié ou isolé caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide de séquence SEQ ID N 2 tel que défini précédemment. De manière préférée, le

polynucléotide selon l'invention possède la séquence SEQ ID N 1 à l'exception de la séquence SEQ ID N 3.

Le polynucléotide purifié ou isolé selon l'invention se caractérise en ce qu'il comprend un polynucléotide choisi parmi : a) SEQ ID N 1 ; b) la séquence d'un fragment d'au moins 15 nucléotides consécutifs, de préférence d'au moins 18,21, 24,27,
30,35, 40,50, 75,100 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N 1à l'exception de la séquence SEQ
ID N 3. c) une séquence nucléique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 85 %, de préférence d'au moins 90 %, 95 %, 98 % et 99 % après alignement optimal avec une séquence définie en a) ou b) ; d) la séquence complémentaire ou la séquence d'ARN correspondant à une séquence telle que définie en a), b) ou c).

Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui seront employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADN, et/ou un fragment d'ARN.

Il doit être compris que la présente invention ne concerne pas les séquences nucléotidiques dans leur environnement chromosomique naturel, c'est-à-dire à l'état naturel. Il s'agit de séquences qui ont été isolées et/ou purifiées, c'est-à-dire qu'elles ont été prélevées directement ou indirectement, par exemple par copie, leur environnement ayant été au moins partiellement modifié. On

entend ainsi également désigner les acides nucléiques obtenus par synthèse chimique.

Par polynucléotide de séquence complémentaire, on entend désigner tout ADN dont les nucléotides sont complémentaires de ceux de la SEQ ID N 1 ou d'une partie de la SEQ ID N 1et dont l'orientation est inversée.

Par pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. On entend désigner par "meilleur alignement" ou "alignement optimal", l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci-après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par fenêtre de comparaison pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). Afin d'obtenir l'alignement optimal, on utilise de préférence le programme BLAST, avec la matrice BLOSUM 62. On peut également utiliser les matrices PAM ou PAM250.

Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale, la séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés à comparer pouvant comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.

Par séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 85 %, de préférence d'au moins 90 %, 95 %, 98 % et 99 % après alignement optimal avec une séquence de référence, on entend désigner les séquences nucléiques présentant, par rapport à la séquence nucléique de référence, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une substitution, notamment ponctuelle, et dont la séquence nucléique présente au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, 95 %, 98 % et 99 % d'identité après alignement optimal avec la séquence nucléique de référence. Il s'agit de préférence de séquences dont les séquences complémentaires sont susceptibles de s'hybrider spécifiquement avec les séquences SEQ ID N 1 de l'invention. De préférence, les conditions d'hybridation spécifiques ou de forte stringence seront telles qu'elles assurent au moins 85 %, de préférence d'au moins 90 %, 95 %, 98 % et 99 % d'identité après alignement optimal entre l'une des deux séquences et la séquence complémentaire de l'autre.

Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de

l'hybridation entre deux fragments d'ADN complémentaires. A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les fragments polynucléotidiques décrits cidessus, sont avantageusement les suivantes.

L'hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes : (1) préhybridation à 42 C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 x SSC (1x SSC correspond à une solution 0,15 M NaCl + 0,015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5 % de dextran sulfate et 1 % d'ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (i.e. : 42 C, pour une sonde de taille > 100 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20 C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20 C en 0,1x SSC + 0,1% SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0,1x SSC + 0,1% SDS pendant 30 minutes à 60 C pour une sonde de taille > 100 nucléotides. Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-dessus pour un polynucléotide de taille définie, peuvent être adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al., 1989.

Parmi les séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 85 %, de préférence d'au moins 90 %, 95 %, 98 % et 99 % après alignement optimal avec la séquence selon l'invention, on préfère également les séquences nucléiques variantes de SEQ ID N 1, ou de leurs fragments, c'est-à-dire l'ensemble des séquences nucléiques correspondant à des variants alléliques, c'est- à-dire des variations individuelles des séquences SEQ ID N 1. Ces séquences mutées naturelles correspondent à des polymorphismes présents chez les mammifères, en particulier chez l'être humain et, notamment, à des polymorphismes pouvant conduire à la survenue d'une pathologie.

On entend également désigner par séquence nucléique variante tout ARN ou ADNc résultant d'une mutation et/ou variation d'un site d'épissage de la séquence nucléique génomique dont l'ADNc a pour séquence SEQ ID N 1.

Plus particulièrement, l'invention concerne un acide nucléique purifié ou isolé selon la présente invention, caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué de l'une des séquences SEQ ID N 1, de leurs séquences complémentaires ou des séquences de l'ARN correspondant à SEQ ID N 1. Les amorces ou sondes, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence d'un acide nucléique selon l'invention, font également partie de l'invention. Ainsi, la présente invention pour la détection, l'identification, le dosage ou l'amplification de séquence d'acide nucléique concerne également les amorces ou les sondes selon l'invention qui peuvent permettre en particulier de mettre en évidence ou de discriminer les séquences nucléiques variantes, ou d'identifier la séquence génomique des gènes dont l'ADNc est représenté par SEQ ID N 1, en utilisant notamment une méthode d'amplification telle que la méthode PCR, ou une méthode apparentée. Selon l'invention, les polynucléotides pouvant être utilisés comme sonde ou comme amorce dans des procédés de détection, d'identification, de dosage ou d'amplification de séquence nucléique, présentent une taille minimale de 15 bases, de préférence d'au moins 18,20, 25,30, 40,50 bases.

Les polynucléotides selon l'invention peuvent ainsi être utilisés comme amorce et/ou sonde dans des procédés mettant en oeuvre notamment la technique de PCR (amplification en chaîne par polymérase) (Rolfs et al., 1991). Cette technique nécessite le choix de paires d'amorces oligonucléotidiques encadrant le fragment qui doit être amplifié. On peut, par exemple, se référer à la technique décrite dans le brevet américain U.S. N 4,683,202. Les fragments amplifiés peuvent être identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une technique

chromatographique comme la filtration sur gel ou la chromatographie échangeuse d'ions, puis séquences. La spécificité de l'amplification peut être contrôlée en utilisant comme amorces les séquences nucléotidiques de polynucléotides de l'invention et comme matrices, des plasmides contenant ces séquences ou encore les produits d'amplification dérivés. Les fragments nucléotidiques amplifiés peuvent être utilisés comme réactifs dans des réactions d'hybridation afin de mettre en évidence la présence, dans un échantillon biologique, d'un acide nucléique cible de séquence complémentaire à celle desdits fragments nucléotidiques amplifiés.

L'invention vise également les acides nucléiques susceptibles d'être obtenus par amplification à l'aide d'amorces selon l'invention.

D'autres techniques d'amplification de l'acide nucléique cible peuvent être avantageusement employées comme alternative à la PCR (PCR-like) à l'aide de couple d'amorces de séquences nucléotidiques selon l'invention. Par PCR-like on entend désigner toutes les méthodes mettant en #uvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acides nucléiques, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés, ces techniques sont bien entendu connues. En général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase ; l'échantillon d'origine est un ARN il convient préalablement d'effectuer une transcription reverse. Il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, comme par exemple la technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique d'amplification à déplacement de brin (Walker et al., 1992), la technique TAS (Transcription-based Amplification System) décrite par Kwoh et al. (1989), la technique 3SR (Self-Sustained Sequence Replication) décrite par Guatelli et al. (1990), la technique NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) décrite par Kievitis et al. (1991), la technique TMA (Transcription Mediated Amplification), la technique LCR (Ligase Chain Reaction) décrite par Landegren et

al. (1988), la technique de RCR (Repair Chain Reaction) décrite par Segev (1992), la technique CPR (Cycling Probe Reaction) décrite par Duck et al. (1990), la technique d'amplification à la Q-béta-réplicase décrite par Miele et al. (1983). Certaines de ces techniques ont depuis été perfectionnées.

Dans le cas où le polynucléotide cible à détecter est un ARNm, on utilise avantageusement, préalablement à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification à l'aide des amorces selon l'invention ou à la mise en #uvre d'un procédé de détection à l'aide des sondes de l'invention, une enzyme de type transcriptase inverse afin d'obtenir un ADNc à partir de l'ARNm contenu dans l'échantillon biologique. L'ADNc obtenu servira alors de cible pour les amorces ou les sondes mises en oeuvre dans le procédé d'amplification ou de détection selon l'invention.

La technique d'hybridation de sondes peut être réalisée de manières diverses (Matthews et al., 1988). La méthode la plus générale consiste à immobiliser l'acide nucléique extrait des cellules de différents tissus ou de cellules en culture sur un support (tels que la nitrocellulose, le nylon, le polystyrène) pour réaliser par exemple des puces à ADN, puis à incuber, dans des conditions bien définies, l'acide nucléique cible immobilisé avec la sonde. Après l'hybridation, l'excès de sonde est éliminé et les molécules hybrides formées sont détectées par la méthode appropriée (mesure de la radioactivité, de la fluorescence ou de l'activité enzymatique liée à la sonde).

Selon un autre mode de mise en #uvre des sondes nucléiques selon l'invention, ces dernières peuvent être utilisées comme sondes de capture. Dans ce cas, une sonde, dite sonde de capture , est immobilisée sur un support et sert à capturer par hybridation spécifique l'acide nucléique cible obtenu à partir de l'échantillon biologique à tester et l'acide nucléique cible est ensuite détecté grâce

à une seconde sonde, dite sonde de détection , marquée par un élément facilement détectable.

Parmi les fragments d'acides nucléiques intéressants, il convient par ailleurs de citer en particulier les oligonucléotides antisens, c'est-à-dire dont la structure assure, par hybridation avec la séquence cible, une inhibition de l'expression du produit correspondant. Il faut également citer les oligonucléotides sens qui, par interaction avec des protéines impliquées dans la régulation de l'expression du produit correspondant, induiront soit une inhibition, soit une activation de cette expression. Les oligonucléotides selon l'invention présente une taille minimale de 9 bases, de préférence d'au moins 10,12, 15,17, 20,25, 30,40, 50 bases.

Les sondes, amorces et oligonucléotides selon l'invention peuvent être marqués directement ou indirectement par un composé radioactif ou non radioactif, par des méthodes bien connues de l'homme du métier, afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable. Les séquences de polynucléotides selon l'invention non marquées peuvent être utilisées directement comme sonde ou amorce.

Les séquences sont généralement marquées pour obtenir des séquences utilisables pour de nombreuses applications. Le marquage des amorces ou des sondes selon l'invention est réalisé par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives.

Parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le 32P, le 33P, le 35S, le 3H ou le 125I. Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels la biotine, l'avidine, la streptavidine, la dioxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémoluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents.

La présente invention concerne également les vecteurs de clonage et/ou d'expression comprenant un acide nucléique ou codant pour un polypeptide selon l'invention. Un tel vecteur peut

également contenir les éléments nécessaires à l'expression et éventuellement à la sécretion du polypeptide dans une cellule hôte.

Une telle cellule hôte est également un objet de l'invention.

Selon un autre aspect, l'invention concerne un vecteur d'expression antisens. Un tel vecteur d'expression contient une séquence de polynucléotide selon l'invention, insérée en orientation inverse dans le vecteur d'expression. Ainsi, l'homme du métier reconnaît aisément qu'un ARNm correspondant à l'ADN dans le vecteur antisens hybride avec un ARNm correspondant à de l'ADN dans le vecteur sens. Un vecteur d'expression antisens est un vecteur qui exprime un ARN antisens d'intérêt dans une cellule hôte appropriée, soit de manière constitutive soit après induction. Le terme antisens se réfère à toute composition contenant une séquence d'acide nucléique spécifique. Les molécules antisens peuvent être produites par des méthodes telles que la synthèse ou la transcription. Lorsque de telles molécules sont introduites dans la cellule, les nucléotides complémentaires se combinent avec les séquences naturelles produites par la cellule pour former des duplexes et ainsi bloquer soit la transcription ou la traduction du polypeptide selon l'invention. Il entre également dans l'étendue de l'invention, de réaliser des molécules antisens susceptibles de s'apparier avec la molécule d'ARN avec laquelle la protéine Ro/SSA like est susceptible de s'associer pour former une ribonucléoprotéine.

Lesdits vecteurs comportent de préférence un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Ils doivent pouvoir être maintenus de façon stable dans la cellule et peuvent éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion de la protéine traduite. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le promoteur peut être le promoteur

naturellement présent en amont du gène codant pour Ro/SSA-like humaine de l'invention.

Les différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences d'acide nucléique selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi.

Parmi les systèmes à réplication autonome, on utilise de préférence en fonction de la cellule hôte, des systèmes de type plasmide , cosmide ou mini-chromosome ou des systèmes de type viral, les vecteurs viraux pouvant notamment être des adénovirus (Perricaudet et al., 1992), des rétrovirus, des lentivirus, des poxvirus ou des virus herpétiques (Epstein et al., 1992).

L'homme du métier connaît les technologies utilisables pour chacun de ces systèmes.

Lorsque l'on souhaite l'intégration de la séquence dans les chromosomes de la cellule hôte, on peut utiliser par exemple des systèmes de type plasmidique ou viral ; de tels virus sont, par exemple, les rétrovirus (Temin, 1986), ou les AAV (Carter, 1993).

Parmi les vecteurs non viraux, on préfère les polynucléotides nus tels que l'ADN nu ou l'ARN nu selon la technique développée par la société VICAL, les chromosomes artificiels de bactérie (BAC, bacterial artificial chromosome), les chromosomes artificiels de levure (YAC, yeast artificial chromosome) pour l'expression dans la levure, les chromosomes artificiels de souris (MAC, mouse artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules murines et de manière préférée les chromosomes artificiels d'homme (HAC, human artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules humaines.

De tels vecteurs sont préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple la lipofection,

l'électroporation, le choc thermique, la transformation après perméabilisation chimique de la membrane, la fusion cellulaire.

L'invention comprend en outre les cellules hôtes, notamment les cellules eucaryotes et procaryotes, transformées par les vecteurs selon l'invention. Parmi les cellules utilisables aux sens de la présente invention, on peut citer les cellules bactériennes (Olins et Lee, 1993), mais aussi les cellules de levure (Buckholz, 1993), de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifères (Edwards et Aruffo, 1993), et notamment les cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO). On peut citer également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant par exemple en #uvre des baculovirus (Luckow, 1993). Un hôte cellulaire préféré pour l'expression des protéines de l'invention est constitué par les cellules Cos et les cellules Hela. Selon un mode préféré de réalisation, la cellule hôte est transformée par un vecteur d'expression qui permet l'expression et/ou éventuellement la sécérétion du polypeptide selon l'invention.

L'invention comprend également les animaux transgéniques, de préférence les mammifères, excepté l'Homme, comprenant une desdites cellules transformées selon l'invention. Ces animaux peuvent être utilisés en temps que modèles, pour l'étude de l'étiologie de pathologie liée à une altération de l'homologue animal de la protéine Ro/SSA-like naturelle humaine ou pour l'étude des effets d'une infection virale provoquée par un virus à ARN, tel le VIH, sur l'expression de la protéine Ro/SSA-like en présence ou non d'un traitement anti-viral, tel que le murabutide.

Parmi les mammifères selon l'invention, on préfère des animaux tels que les rongeurs, en particulier les souris, les rats ou les lapins, exprimant un polypeptide selon l'invention.

Les animaux transgéniques selon l'invention peuvent surexprimer le gène codant pour la protéine selon l'invention, ou leur gène homologue, ou exprimer ledit gène dans lequel est

introduite une mutation. Ces animaux transgéniques, en particulier des souris, sont obtenus par exemple par transfection de copie de ce gène sous contrôle d'un promoteur fort de nature ubiquitaire, ou sélectif d'un type de tissu, ou après transcription virale.

Alternativement, les animaux transgéniques selon l'invention peuvent être rendus déficients pour le gène codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID N 2, ou leurs gènes homologues, par inactivation ciblée par recombinaison homologue en utilisant ou non le système LOX-P/CRE recombinase (Rohlmann et al., 1996) ou par tout autre système d'inactivation de l'expression de ce gène. Ces animaux transgéniques sont obtenus par exemple par recombinaison homologue sur cellules souches embryonnaires, transfert de ces cellules souches à des embryons, sélection des chimères affectées au niveau des lignées reproductrices, et croissance desdites chimères.

Les cellules ou mammifères transformés tels que décrits précédemment peuvent aussi être utilisés à titre de modèles afin d'étudier les interactions entre les polypeptides selon l'invention, et les composés chimiques ou protéiques, impliqués directement ou indirectement dans les activités des polypeptides selon l'invention, ceci afin d'étudier les différents mécanismes et interactions mis en jeu. Ils peuvent en particulier être utilisés pour la sélection de produits interagissant avec les polypeptides selon l'invention, notamment la protéine de séquence SEQ ID N 2 ou leurs variants selon l'invention, à titre de cofacteur, ou d'inhibiteur, notamment compétitif, ou encore ayant une activité agoniste ou antagoniste de l'activité des polypeptides selon l'invention. De préférence, on utilise lesdites cellules transformées ou animaux transgéniques à titre de modèle notamment pour la sélection de produits permettant de lutter contre les pathologies liées à une expression anormale de ce gène.

En plus de leur utilité à titre de modèle d'analyse, les cellules et mammifères selon l'invention sont utilisables dans une méthode de production d'un polypeptide selon l'invention, comme décrit cidessous.

La méthode de production d'un polypeptide de l'invention sous forme recombinante, elle-même comprise dans la présente invention, se caractérise en ce que l'on cultive les cellules transformées, notamment les cellules de la présente invention, dans des conditions permettant l'expression et éventuellement la sécrétion d'un polypeptide recombinant codé par une séquence d'acide nucléique selon l'invention, et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant.

Les polypeptides recombinants susceptibles d'être obtenus par cette méthode de production font également partie de l'invention. Ils peuvent se présenter sous forme glycosylée ou non glycosylée et peuvent présenter ou non la structure tertiaire de la protéine naturelle.

Les séquences des polypeptides recombinants peuvent être également modifiées afin d'améliorer leur solubilité, en particulier dans les solvants aqueux. De telles modifications sont connues de l'homme du métier comme par exemple la délétion de domaines hydrophobes ou la substitution d'acides aminés hydrophobes par des acides aminés hydrophiles.

Ces polypeptides peuvent être produits à partir des séquences d'acide nucléique définies ci-dessus, selon les techniques de production de polypeptides recombinants connues de l'homme du métier. Dans ce cas, la séquence d'acide nucléique utilisée est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire.

Un système efficace de production d'un polypeptide recombinant nécessite de disposer d'un vecteur et d'une cellule hôte selon l'invention. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes d'une séquence nucléotidique

insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée.

Les procédés utilisés pour la purification d'un polypeptide recombinant sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant peut être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux spécifiques.

Une variante préférée consiste à produire un polypeptide recombinant fusionné à une protéine porteuse (protéine chimère).

L'avantage de ce système est qu'il permet une stabilisation et une diminution de la protéolyse du produit recombinant, une augmentation de la solubilité au cours de la renaturation in vitro et/ou une simplification de la purification lorsque le partenaire de fusion possède une affinité pour un ligand spécifique.

Les polypeptides selon la présente invention peuvent aussi être obtenus par synthèse chimique en utilisant l'une des nombreuses synthèses peptidiques connues, par exemple les techniques mettant en #uvre des phases solides (voir notamment Stewart et al., 1984) ou des techniques utilisant des phases solides partielles, par condensation de fragments ou par une synthèse en solution classique. Les polypeptides obtenus par synthèse chimique et pouvant comporter des acides aminés non naturels correspondants sont également compris dans l'invention.

L'invention concerne également un anticorps monoclonal ou polyclonal et ses fragments, caractérisés en ce qu'ils lient sélectivement et/ou spécifiquement un polypeptide selon l'invention.

Les anticorps chimériques, les anticorps humanisés et les anticorps

simple chaîne font également partie de l'invention. Les fragments d'anticorps selon l'invention sont de préférence des fragments Fab, F(ab')2, ou Fv.

Les polypeptides selon l'invention permettent de préparer des anticorps monoclonaux ou polyclonaux. Les anticorps monoclonaux pourront avantageusement être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par Kohler et Milstein en 1975.

Les anticorps polyclonaux pourront être préparés, par exemple par immunisation d'un animal, en particulier une souris, avec un polypeptide selon l'invention associé à un adjuvant de la réponse immunitaire, puis purification des anticorps spécifiques contenus dans le sérum des animaux immunisés sur une colonne d'affinité sur laquelle a préalablement été fixé le polypeptide ayant servi d'antigène. Les anticorps polyclonaux selon l'invention peuvent aussi être préparés par purification sur une colonne d'affinité, sur laquelle a préalablement été immobilisé un polypeptide selon l'invention.

Les antisera polyclonaux et/ou des anticorps monoclonaux de l'invention ainsi que les auto-anticorps de patients atteints de maladies auto-immunes et dirigés contre la protéine Ro/SSA-like peuvent être utilisés pour analyser la structure et la fonction de la protéine Ro/SSA-like et ses fragments. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'anticorps monoclonal ou polyclonal ou l'auto-anticorps est capable d'inhiber l'interaction entre les polypeptides Ro/SSA-like de l'invention et la séquence d'acide nucléique, sur laquelle ceux-ci se lient, afin d'altérer la fonction physiologique desdits polypeptides selon l'invention.

Des idiotypes communs à différents auto-anticorps de patients ou un idiotype de l'anticorps de l'invention peuvent être utilisés pour générer des anticorps anti-idiotypes et leur fragments. En effet, la structure idiotypique (de liaison à l'antigène) de l'anticorps est antigénique et peut donc permettre de produire des anticorps

spécifiques dirigés contre la structure idiotypique. De tels anticorps anti-idiotypique sont également un des objets de la présente invention. L'anticorps anti-idiotype selon l'invention peut être capable de remplacer l'antigène original pour une partie ou toutes les fonctions, l'utilisation et les propriétés du polypeptide original de l'invention ; il peut être notamment utile pour bloquer la liaison des anticorps anti-Ro/SSA-like à la protéine native Ro/SSA-like in vivo, ou pour remplacer les polypeptides anti-Ro/SSA-like de l'invention dans les méthodes décrites ci-après qui impliquent la plasmaphérèse et l'immunoabsorption extra-corporelle.

L'invention concerne également des méthodes pour la détection et/ou la purification d'un polypeptide selon l'invention, caractérisées en ce qu'elles mettent en oeuvre un anticorps selon l'invention. L'invention comprend en outre des polypeptides purifiés, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par une méthode selon l'invention.

Par ailleurs, outre leur utilisation pour la purification des polypeptides, les anticorps de l'invention, en particulier les anticorps monoclonaux, peuvent également être utilisés pour la détection de ces polypeptides dans un échantillon biologique. Pour ces différentes utilisations, les anticorps de l'invention pourront également être marqués de la même manière que décrit précédemment pour les sondes nucléiques de l'invention et de manière préférée avec un marquage de type enzymatique, fluorescent ou radioactif.

Les anticorps de l'invention constituent également un moyen d'analyse de l'expression de polypeptide selon l'invention, par exemple par immunofluorescence, marquage à l'or, immunoconjugués enzymatiques. Plus généralement, les anticorps de l'invention peuvent être avantageusement mis en oeuvre dans toute situation où l'expression d'un polypeptide selon l'invention doit être observée, et plus particulièrement en immunocytochimie, en immunohistochimie ou dans des expériences de western blotting .

Ils peuvent permettre notamment de mettre en évidence une expression anormale de ces polypeptides dans les tissus ou prélèvements biologiques.

Plus généralement, les anticorps de l'invention peuvent être avantageusement mis en #uvre dans toute situation où l'expression d'un polypeptide selon l'invention, normal ou muté, doit être observée. Ainsi, un procédé de détection et/ou de dosage d'un polypeptide selon l'invention dans un échantillon biologique, comprenant les étapes de mise en contact de l'échantillon biologique avec un anticorps selon l'invention et de mise en évidence du complexe antigène-anticorps formé est également un objet de l'invention.

Entre également dans le cadre de l'invention, une trousse de réactif pour la détection et/ou le dosage d'un polypeptide selon l'invention dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : (i) un anticorps monoclonal ou polyclonal tel que décrit précédemment ; (ii) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique ; (iii) le cas échéant, les réactifs permettant la détection des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique. Cette trousse est notamment utile à la réalisation d'expériences de Western Blotting ; celles-ci permettent d'étudier la régulation de l'expression du polypeptide selon l'invention à partir de tissus ou de cellules. Cette trousse est également utile aux expériences d'immunoprécipitation pour mettre en évidence notamment les protéines interagissant avec le polypeptide selon l'invention. Cette trousse est également utile pour réaliser la détection et/ou le dosage d'un polypeptide selon l'invention en utilisant une méthode qui met en jeu la technique ELISA, l'immunofluorescence, la radio-immunologie (technique RIA) ou une technique équivalente.

L'invention comprend également une méthode de détection et/ou de dosage d'un polynucléotide selon l'invention, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : (i) d'isolement de l'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon biologique ; (ii) d'amplification spécifique de l'ADN codant pour le polypeptide selon l'invention à l'aide d'amorces ; (iii) d'analyse des produits d'amplification. C'est également un objet de l'invention de fournir une trousse pour la détection et/ou le dosage d'un acide nucléique selon l'invention, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : (i) un couple d'amorces nucléiques selon l'invention, (ii) les réactifs nécessaires pour effectuer une réaction d'amplification d'ADN, et éventuellement (iii) un composant permettant de vérifier la séquence du fragment amplifié, plus particulièrement une sonde selon l'invention.

L'invention comprend aussi une méthode de détection et/ou de dosage d'acide nucléique selon l'invention, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : (i) de mise en contact d'un polynucléotide selon l'invention avec un échantillon biologique ; (ii) de détection et/ou de dosage de l'hybride formé entre ledit polynucléotide et l'acide nucléique de l'échantillon biologique.

Ainsi, la séquence polynucléotidique appropriée peut être utilisée dans des réactions d'hybridation in situ pour détecter le taux d'expression de gènes codant pour l'antigène Ro/SSA-like contre lequel sont dirigés les auto-anticorps du patient, dans des tissus spécifiques ou dans des PBMCs. Le taux d'expression génique peut ainsi être quantifié chez les patients et comparé à des contrôles sains, ou peuvent être comparés entre différents tissus.

C'est donc un objet de l'invention de fournir une trousse pour la détection et/ou le dosage d'acide nucléique selon l'invention, dans

un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : (i) une sonde selon l'invention, (ii) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation, et/ou le cas échéant, (iii) un couple d'amorces selon l'invention, ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN.

Font également partie de l'invention, les méthodes de détermination d'une variabilité allélique, d'une mutation, d'une délétion, d'une perte d'hétérozygotie ou de toute anomalie génétique du gène codant le polypeptide selon l'invention, caractérisées en ce qu'elles mettent en oeuvre une séquence d'acide nucléique, un polypeptide ou un anticorps selon l'invention.

On peut détecter ces mutations directement par analyse de l'acide nucléique et des séquences selon l'invention (ARN ou ADNc), mais également par l'intermédiaire des polypeptides selon l'invention. En particulier, l'utilisation d'un anticorps selon l'invention qui reconnaît un épitope portant une mutation permet de discriminer entre une protéine saine et une protéine associée à une pathologie .

Cette méthode de diagnostic et/ou d'évaluation pronostique peut être utilisée de façon préventive, ou afin de servir à l'établissement et/ou la confirmation d'un état clinique chez un patient. L'analyse peut être effectuée par séquençage de tout ou partie du gène (i.e. les exons), ou par d'autres méthodes connues de l'homme du métier. On peut en particulier utiliser des méthodes basées sur la PCR, par exemple la PCR-SSCP qui permet de détecter des mutations ponctuelles. On peut également effectuer l'analyse par fixation d'une sonde selon l'invention sur une puce à ADN contenant au moins un polynucléotide selon l'invention et l'hybridation sur ces microplaques. Une puce à ADN contenant une séquence selon l'invention est également un des objets de l'invention.

De même, une puce à protéines contenant une séquence d'acides aminés selon l'invention est aussi un objet de l'invention.

Une telle puce à protéines permet l'étude des interactions entre les polypeptides selon l'invention et d'autres protéines ou des composés chimiques, et peut ainsi être utile pour le criblage de composés interagissant avec les polypeptides selon l'invention. On peut également utiliser les puces à protéines selon l'invention pour détecter la présence d'anticorps dirigés contre les polypetides selon l'invention dans le sérum de patients. On peut aussi mettre en oeuvre une puce à protéines contenant un anticorps monoclonal ou polyclonal, ou un anticorps anti-idiotypique, ou leurs fragments selon l'invention.

L'invention concerne également une méthode de criblage de ligands susceptibles d'affecter la transcription in vitro et/ou in vivo du gène codant naturellement pour le polypeptide de l'invention et qui comporte les étapes suivantes : (i) mise en contact d'une cellule choisie parmi la cellule hôte de l'invention et les cellules eucaryotes de préférence humaine, exprimant le polypeptide de l'invention et d'un ou plusieurs ligands potentiels, en présence de réactifs nécessaires à la mise en #uvre d'une réaction de transcription et (ii) détection et/ou de mesure de l'activité transcriptionnelle. Le gène codant pour le polypeptide selon l'invention qui est présent dans la cellule hôte ou dans une cellule eucaryote, de préférence humaine, correspond au moins à une séquence polynucléotidique codant pour le polypeptide de l'invention de préférence sous la forme d'ADN génomique ou d'ADNc, lié de manière opérationnelle à la séquence promotrice du gène Ro/SSA-like humaine ou du gène homologue d'une espèce animale telle la souris. La technologie de DD-RT-PCR constitue également une méthode de criblage de ligands selon l'invention susceptible d'affecter la transcription du gène codant pour le polypeptide Ro/SSA-like selon l'invention.

Par ligand susceptible d'affecter la transcription in vitro et/ou in vivo du gène codant naturellement pour le polypeptide de l'invention, on entend définir tous les composés susceptibles d'interagir avec les séquences polynucléotidiques régulatrices (promoteur, séquence amont, enhancer , silencer , insulator , etc...) du gène codant naturellement pour le polypeptide selon l'invention ou les composés susceptibles d'interagir avec des facteurs de transcription (facteurs de transcription généraux ou facteurs tissu-spécifiques) impliqués dans la régulation de la transcription du gène codant pour le polypeptide selon l'invention, pour former un complexe susceptible d'affecter la transcription du gène codant Ro/SSA-like de l'invention, c'est-à-dire d'augmenter, de diminuer, de moduler ou d'annuler la transcription dudit gène. Les ligands identifiés incluent les protéines, les acides nucléiques, les carbohydrates, les lipides et toutes les molécules chimiques susceptibles d'affecter la transcription in vitro et/ou in vivo du gène codant naturellement pour le polypeptide de l'invention.

Les techniques de détection et/ou de mesure de l'activité transcriptionnelle sont connues de l'homme du métier. Il convient notamment de citer les technologies de Northern Blotting et de RTPCR qui peuvent être mises en oeuvre avec les polynucléotides de l'invention utilisés respectivement comme sonde ou comme amorce.

De préférence, l'échantillon biologique selon l'invention dans lequel sont réalisés la détection, le dosage, le criblage est constitué par un fluide corporel, par exemple un sérum humain ou animal, du sang, de l'urine ou par des biopsies.

C'est également un des objets de l'invention de fournir des ligands qui affectent la transcription in vitro et/ou in vivo du gène codant naturellement pour le polypeptide de l'invention et qui sont susceptibles d'être obtenus par la méthode de criblage précédente.

Les immunomodulateurs de synthèse, tels les composés de la famille

des muramyldipeptides, et plus particulièrement le Murabutide (MB) constituent des ligands selon l'invention.

La présente invention concerne également un agent de diagnostic de maladies auto-immunes humaines caractérisé en ce que ledit agent de diagnostic est sélectionné parmi un polypeptide selon l'invention, un anticorps anti-idiotypique selon l'invention, et une cellule hôte selon l'invention qui est transformée par un vecteur d'expression susceptible d'exprimer efficacement un polypeptide de l'invention. Selon un mode particulier de réalisation l'agent de diagnostic selon l'invention est caractérisé en ce que ledit polypeptide, ledit anticorps anti-idiotypique, lesdits fragments d'anticorps anti-idiotypique sont couplés à un support solide directement ou indirectement par l'intermédiaire d'un bras d'espacement et sont éventuellement marqués directement ou indirectement par un marqueur générateur de signal ; marqueur est sélectionné parmi les isotopes radioactifs et les entités non isotopiques. Les entités non isotopiques sont sélectionnées parmi les enzymes, les colorants, les haptènes, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémiluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents, les ligands tels que la biotine, l'avidine, la streptavidine, la digoxygénine.

L'invention porte également sur une trousse de diagnostic caractérisée en ce qu'elle contient un agent de diagnostic tel que précédemment défini.

La détection et la mesure des auto-anticorps sont utilisées pour diagnostiquer et suivre l'évolution des maladies auto-immunes ou maladies virales chroniques présentant des manifestations cliniques semblables aux maladies auto-immunes, telles que le SIDA et l'hépatite C. Dans les laboratoires cliniques le test dirigé contre les anticorps anti-nucléaires permet de mesurer la présence d'autoanticorps réactifs aux auto-antigènes nucléaires. Ce test est largement utilisé pour détecter les auto-anticorps dirigés contre des

antigènes nucléaires, et est utilisé pour le diagnostic de nombreuses maladies systémiques auto-immunes. La présente invention se propose donc de fournir un procédé de détection d'auto-anticorps anti-Ro/SSA-like dans un fluide biologique humain pour la réalisation d'un nouveau test diagnostic de nombreuses maladies auto-immunes. Le procédé de détection d'auto-anticorps antiRo/SSA-like dans un fluide biologique humain comprend les étapes (i) de mise en contact dudit fluide biologique avec un agent de diagnostic selon l'invention caractérisé en ce que lesdits autoanticorps réagissent avec ledit agent de diagnostic ; et (ii) de mise en évidence du complexe auto-anticorps/polypeptide ou du complexe auto-anticorps/anticorps anti-idiotype formé. Les auto-anticorps détectés par ce procédé sont de préférence associés aux maladies auto-immunes sélectionnées de préférence dans le groupe du lupus systémique érythémateux (SLE) et du syndrome de Sjôgren, dans le groupe des pathologies chroniques présentant des manifestations auto-immunes telles le SIDA ou les hépatites B et C, et dans le groupe des pathologies virales et de préférence celles causées par une infection par un virus à ARN. Les auto-anticorps détectés par ce procédé peuvent également être présents dans le liquide biologique de patients dont les cellules ont subi un stress. Par stress on entend désigner un agent physique, chimique ou biologique provoquant une réaction de la cellule. Parmi les agents physiques, il convient de citer en autres les rayons béta, les rayons gamma, les rayons X, les ultraviolets, les infra-rouges, la lumière visible. Egalement, des conditions de culture, aérobie ou anaérobie, le pH du milieu de culture, acide, basique ou neutre, la concentration en agent oxydatif (radicaux libres, etc...) ou d'un autre élément dans le milieu cellulaire et/ou extracellulaire est susceptible de constituer des facteurs de stress de nature physique. Par agent chimique, on entend désigner tout composé chimique susceptible d'interagir avec la cellule ou un des composants cellulaires membranaires ou

intracellulaires ; par exemple, les agents intercalants tels le bromure d'éthidium, l'iodure de propidium constituent des composés chimiques selon l'invention. Les composés biologiques de l'invention correspondent à tous les composés susceptibles de provoquer une réaction biologique cellulaire. On peut citer de manière non exhaustive toutes les molécules interagissant avec un récepteur membranaire tels par exemple les molécules de la communication intercellulaire, les hormones, les cytokines, les lymphokines, les interleukines, les anticorps. Les virus constituent également des agents biologiques selon l'invention.

L'invention porte également sur la trousse permettant la mise en #uvre du procédé de détection d'auto-anticorps anti-Ro/SSA-like précédent ; cette trousse contient au moins un agent de diagnostic selon l'invention.

Une des applications thérapeutiques des polypeptides de l'invention consiste à utiliser le polypeptide de l'invention exprimé pour absorber les auto-anticorps circulants du patient. Ainsi, le polypeptide selon l'invention ou l'anticorps anti-idiotypique selon l'invention ou l'un de ses fragments, peut être lié à des particules de phase solide qui sont mises en contact avec le liquide biologique du patient lors par exemple d'une plasmaphérèse, ou d'une immunoabsorption extra-corporelle, afin de réduire le taux circulant d'auto-anticorps anti-Ro/SSA-like chez le patient. L'invention fournit un procédé de purification d'un fluide biologique humain susceptible de contenir des auto-anticorps anti-Ro/SSA-like et comprenant les étapes : (i) de mise en contact dudit fluide biologique avec un polypeptide selon l'invention ou un anticorps anti-idiotypique selon l'invention ou l'un de ses fragments, dans des conditions permettant la formation d'un complexe auto-anticorps/polypeptide ou d'un complexe auto-anticorps/anticorps anti-idiotype formé ; (ii) séparation du fluide biologique et du complexe formé à l'étape (i) ; et de (iii) récupération du fluide biologique obtenu à l'étape (ii). Le

fluide biologique humain ainsi purifié et susceptible d'être obtenu par le procédé précédent peut être utilisé pour la préparation d'une composition destinée au traitement thérapeutique de patients atteints de maladies auto-immunes, de préférence sélectionnées dans le groupe du lupus systémique érythémateux (SLE) et du syndrome de Sjôgren.

Le fluide biologique humain purifié et susceptible d'être obtenu par le procédé précédent peut également être utilisé pour la préparation d'une composition destinée au traitement thérapeutique de patients dont les cellules ont subi un stress, et de préférence une irradiation aux ultra-violets. Le fluide biologique humain purifié susceptible d'être obtenu par le procédé précédent peut également être utilisé pour la préparation d'une composition destinée au traitement thérapeutique de patients atteints de maladies infectieuses chroniques ayant des manifestations auto-immunes de préférence sélectionnées parmi le SIDA, l'hépatite B, l'hépatite C.

Selon un autre aspect, l'invention concerne un composé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi un anticorps, un anticorps anti-idiotype, un polypeptide, un polynucléotide, un polynucléotide antisens, un oligonucléotide, un vecteur, un vecteur antisens, une cellule, un ligand selon l'invention à titre de médicament et notamment en tant que principes actifs de médicament ; ces composés seront préférentiellement sous forme soluble, associés à un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Par véhicule pharmaceutiquement acceptable, on entend désigner tout type de véhicule employé habituellement dans la préparation de compositions injectables, c'est-à-dire un diluant, un agent de suspension tel une solution saline isotonique ou tamponnée. De préférence, ces composés seront administrés par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique ou par voie orale. Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés

selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés, etc. Quand l'agent est un polypeptide, un antagoniste, un ligand, un polynucléotide, par exemple une composition anti-sens, un vecteur, par exemple un vecteur antisens, on peut l'introduire dans des tissus ou des cellules hôtes par un certain nombre de façons, incluant l'infection virale, la micro-injection ou la fusion de vésicules. On peut également utiliser l'injection par jet pour une administration intramusculaire comme décrit par Furth et al . (1992). On peut déposer le polynucléotide sur des microparticules d'or, et le délivrer par voie intradermique à l'aide d'un dispositif de bombardement de particules, ou un pistolet à gène comme décrit dans la littérature (voir par exemple Tang et al.

(1992) où les microprojectiles d'or sont revêtues avec le polynucléotide de l'invention, de préférence le polynucléotide antisens de l'invention, puis bombardée dans les cellules de peau.

Plus particulièrement, le composé à titre de médicament de l'invention est destiné à la prévention et/ou au traitement de maladies auto-immunes sélectionnées de préférence dans le groupe composé du lupus systémique érythémateux et du syndrome de Sjôgren. L'invention vise également à fournir une composition pharmaceutique pour le traitement préventif et curatif du lupus systémique érythémateux et/ou du syndrome de Sjôgren caractérisée en ce qu'elle contient une quantité thérapeutiquement efficace d'un composé selon l'invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Cette composition pharmaceutique pourra contenir plus particulièrement toute séquence antisens ou vecteur comportant une telle séquence ou tout inhibiteur tel que le Murabutide.

Le facteur Ro/SSA-like de l'invention est une protéine cellulaire qui est susceptible d'interagir avec les éléments agissant en CIS (CIS-

acting element) des virus à ARN. En effet, aux extrémités 5' et 3' des génomes viraux se trouvent fréquemment des séquences importantes pour la réplication virale. Parmi celles-ci, il convient de citer les séquences impliquées dans la traduction et/ou dans la transcription du génome viral ; ces séquences ont en général l'aptitude à former une structure en boucle (stem loop) avec laquelle la protéine Ro/SSA-like de l'invention est susceptible d'interagir. De telles interactions sont aisément mises en évidence par l'homme du métier par des expériences de retard sur gel à ARN et/ou par des expériences de couplage aux U.V.. Le polypeptide de l'invention est donc susceptible d'interagir avec les éléments agissant en CIS des virus à ARN et ainsi d'intervenir dans le processus de réplication des virus à ARN. C'est donc un des objets de la présente invention de fournir des composés à titre de médicament susceptible d'inhiber, d'altérer, d'empêcher les interactions du polypeptide de l'invention avec des séquences du génome de virus à ARN ayant infecté des cellules de patients. Parmi ces composés, il convient de citer plus particulièrement, les anticorps anti-Ro/SSA-like, les inhibiteurs et les antagonistes de Ro/SSA-like. Il est également dans l'étendue de l'invention d'utiliser les ligands susceptibles d'être obtenus par le procédé de criblage de l'invention tel le murabutide pour inhibiber, altérer, annihiler la transcription du gène codant naturellement pour le polypeptide de l'invention ainsi que des polynucléotides ou des vecteurs antisens pour inhiber, altérer, empêcher directement ou indirectement les interactions du polypeptide de l'invention avec des séquences du génome de virus à ARN ayant infecté des cellules de patients. Parmi les virus à ARN dont la réplication est susceptible d'être affectée par des ligands ou composé de l'invention, il convient de citer de manière non exhaustive (a) les virus de la famille des Togaviridae, et plus particulièrement les alphavirus tels le virus Sinbis, les flavivirus, tels le virus de la fièvre jaune, les rubivirus, tel le virus de la rubéole, les pestivirus ; les Coronaviridae ; (c) les

Rétroviridae tels les oncoviridae, les spumaviridae et les lentivirus, et plus particulièrement le virus du syndrome d'immunodéficience acquise de l'homme (VIH) ; (d) les Paramyxoviridae tels que le virus para-inflenza, le virus Sendai, le virus de la maladie de Newcastle, le virus de la rougeole, le virus des oreillons ; (e) les Orthomyxoviridae, tels que les virus des grippes humaines (A, B, C) ; (il les Rhabdoviridae, tels que le virus rabique ; (g) les Bunyaviridae, tels que les virus des encéphalites humaines ; (h) les Arenaviridae, tels que les virus responsables des fièvres hémorragiques chez l'homme tels que le virus Ebola, le virus de la fièvre de Lassa, le virus du complexe Tacaribe-Pichinde ; (g) les Picornaviridae, tels que les poliovirus humains, les rhinovirus (virus du rhume), les cardiovirus (virus de l'encéphalomyocardite, virus Mengo), le virus de l'hépatite A. L'invention concerne donc un composé selon l'invention destiné à la prévention et/ou au traitement de maladie sélectionnée parmi les pathologies causées par une infection par un virus à ARN ainsi que la composition pharmaceutique pour le traitement préventif et/ou curatif de pathologie virale sélectionnée parmi les pathologies causées par une infection par un virus à ARN, caractérisée en ce qu'elle contient une quantité thérapeutiquement efficace d'un composé selon l'invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Parmi les composés à titre de médicament de l'invention, les composés antagonistes du polypeptide Ro/SSA-like sont particulièrement préféré pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies virales ; parmi ces composés antagonistes, il convient de citer plus particulièrement les polynucléotides antisens et/ou les vecteurs antisens.

L'invention concerne également un composé selon l'invention destiné à la prévention et/ou au traitement de pathologies infectieuses chroniques ayant des manifestations auto-immunes telles que le SIDA, les hépatites B et C. En effet, il a été démontré que certains patients VIH+ étaient susceptibles de développer des

taux élevés d'immunoglobulines G (IgG) réagissant avec de l'ADN double brin, avec des peptides synthétiques dérivés de l'histone H2A présentant des résidus ubiquitine, avec l'antigène Sm-D, avec l'antigène RNP Ul-A ou avec l'antigène Ro/SSA de 60 kD (Muller et al.., 1992). L'invention porte en outre sur une composition pharmaceutique pour le traitement préventif et curatif d'une maladie infectieuse chronique ayant des manifestations auto-immunes sélectionnée de préférence dans le groupe composé du SIDA, de l'hépatite B, de l'hépatite C caractérisée en ce qu'elle contient une quantité thérapeutiquement efficace d'un composé selon l'invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Selon un autre mode de réalisation, il est également dans l'étendue de l'invention de fournir une méthode de traitement thérapeutique ou prophylactique de maladie associée à une augmentation de l'expression ou de l'activité du polypeptide Ro/SSA-like selon l'invention. Cette méthode comprend d'administrer à un patient qui nécessite un tel traitement, une quantité thérapeutiquement efficace d'un antagoniste du polypeptide de l'invention.

De manière plus générale, la présente invention concerne l'utilisation d'un composé selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné à neutraliser les auto-anticorps anti-Ro/SSAlike présents dans le fluide biologique de patient. L'invention concerne également l'utilisation de polynucléotide antisens et/ou de vecteur antisens selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné à diminuer l'expression du polypeptide Ro/SSAlike de l'invention. L'invention porte en outre sur l'utilisation d'un composé selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des infections par les virus à ARN.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples représentés ci-après. Dans ces exemples on se référera aux figures suivantes.

Figure 1 : Stratégie utilisée pour l'obtention de l'ADNc correspondant pour la protéine Ro/SSA Like. Le fragment initial de 152 pb obtenu par DD-RT-PCR correspond au trait supérieur. La région 3' de l'ADNc a été obtenue après un 3' RACE (Rapid Amplification of cDNA ends), le fragment obtenu d'environ 2800 pb correspond au trait inférieur ; celui-ci présente un cadre ouvert de lecture long de 256 amino-acides.

Une réaction de PCR (5' RACE) à partir de l'oligonucléotide 96F3 a permis aux inventeurs d'identifier la queue poly A+ du cDNA ; celle-ci est située en 3' du fragment initialement obtenu par DD-RT-PCR.

Figure 2 : de séquence du cadre de lecture ouvert de 256 amino-acides avec la protéine Ro/SSA-humaine de 52 kDa. La ligne supérieure représente la séquence de 256 amino-acides du cadre ouvert de lecture. La ligne inférieure correspond à la séquence de la protéine humaine Ro/SSA-like de 52 kDa. La ligne intermédiaire indique les amino-acides homologues ou équivalents.

Figure 3 : utilisée afin d'obtenir la région 5' de l'ADNc grâce à une approche 5' RACE à partir des amorces 96R4 (SEQ ID N 11) et 96R5 (SEQ ID N 12). Cette approche a permis d'obtenir un fragment d'environ 1000 pb (trait inférieur) contenant un codon START (ATG) potentiel appelé ATG 1.

Figure 4: Alignement de séquences en acides aminés de la protéine Ro/SSA-like (485 aa) avec la protéine Ro/SSA de 52

kDa (475 aa). La protéine Ro/SSA 52kDa comporte plusieurs domaines caractéristiques; la région 16 - 54 porte le motif Zinc finger, la région 91-123 est une région riche en Cystéine et en Histidine (Cyst/His rich) appelée B Box, le domaine 190-245 porte le motif leucine zipper.

Figure 5 : Analyse par Northern blot de l'expression de l'ARNm codant pour la Ro/SSA-like. (1) Rate, (2) ganglion lymphatique, (3) thymus, (4) PBMCs, (5) moelle osseuse, (6) foie fétal. L'ARNm de la ssactine est utilisé comme contrôle interne.

Figure 6 : par RT-PCR semi-quantitative de l'expression différentielle de l'ARNm codant pour la protéine Ro/SSA like dans des PBMCs de patients VIH+ . L'étude est réalisée en présence ( murabutide ) et en absence ( medium Il) de murabutide dans le milieu de culture. Les quantités différentes d'ARN matrice ont été utilisées. L'expression du GAPDH est utilisé comme contrôle interne.

EXEMPLES Exemple 1 : Stratégie de clonage de la nouvelle séquence polynucléotidique codant pour Ro/SSA-like Les expériences de Differential-Display-RT-PCR (DD-RT-PCR) ont été réalisées à partir de PBMCs d'un patient VIH+. Les inventeurs ont sélectionné plus de 130 fragments d'ADNc différentiellement exprimés après traitement des PBMC de patient VIH+ au murabutide (MB). Ces fragments ont été sous-clonés dans le vecteur Pcr2.1 (Invitrogen), puis séquences par séquençage automatique (ABI Prism 377, Perkin-Elmer). Les séquences ont été analysées pour les recherches d'homologie en utilisant les banques de données et le serveur Basic Local Alignment Search Tool (Blast 2) du NCBI.

A partir d'un fragment long de 152pb (SEQ ID N 5) obtenu par du DD-RT-PCR, les inventeurs ont synthétisé deux amorces spécifiques dont 96 R : 5' TGC GTT TAT TTC TCC AGT TTG GCC TAT TTT AAC 3' (SEQ ID N 6) afin de réaliser une première amplification par le 5' et 3' RACE (pour Rapid Amplification of cDNA Ends). Les inventeurs ont ainsi pu obtenir un fragment d'environ 2800pb (SEQ ID N 7) grâce à l'amplification à partir de 96 R. Ce fragment a été séquence en plusieurs étapes grâce aux amorces internes 396 : GTG AGA AGT TTC AGA CCC AAA TAT 3'(SEQ ID N 9), 395 : 5' CCA GCC GAT TAC TAG TAG AGA AAA AGC 3' (SEQ ID N 10), 421 : 5' GCA TCT CGT CAG GCC GGC ACT ACT 3' (SEQ ID N 11), 420 : 5' CTT GCT CCC TTA AGG CCA TTT CAG 3' (SEQ ID N 12). La séquence de 2800 pb (SEQ ID N 7) présente un cadre de lecture ouvert (ORF) de 256 amino-acides jusqu'à un codon Stop potentiel.

Les inventeurs ont comparé cet ORF avec des séquences présentes dans les banques de données, et ont ainsi identifié des

protéines homologues présentant une homologie relative avec cet ORF. Ils en outre identifié la présence d'un domaine de type Leucin Zipper constitué d'une séquence riche en Leucine de type (L-(X)6-L- (X)6-L-(X)6). Plus particulièrement, les inventeurs ont observé que cet ORF présente 46% d'identité avec la protéine Ro/SSA de 52kDa humain ; cette ribonucléoprotéine dont la fonction demeure inconnue et qui composée d'un polypeptide simple et d'une molécule d'ARN, est localisée dans le cytoplasme ou dans le noyau et dans de nombreuses cellules de mammifères. Il existe au moins deux isoformes rencontrées dans des types cellulaires et dans des tissus différents. La particularité de cette protéine est sa capacité à lier une molécule d'ARN. Des serums de patients atteints de lupus erythémateux systhémique et du syndrome de Sjogren présente souvent des anticorps dirigé contre la protéine cellulaire normale. Il est à noter l'absence de domaine Zinc finger dans cet ORF alors que celui-ci est présent dans la protéine Ro/SSA.

Afin d'obtenir la partie 3' de l'ADNc, les inventeurs ont synthétisé l'amorce 96 F3 : CCT GTC TGA GGC ATA GAG GCA GGC AAG CCG 3') (SEQ ID N 13) qui a permis d'obtenir un fragment d'environ 500pb qui a permis de confirmer la présence de la queue poly A+ en 3' du fragment initialement obtenu par DD-RT-PCR.

La figure 1 présente schématiquement la stratégie utilisée ; la figure 2 présente les homologies de séquences du cadre de lecture ouvert de 256 amino-acides du fragment d'environ 2800 pb avec la protéine Ro/SSA humaine de 52 kDa.

La séquence d'environ 2800 pb (SEQ ID N 7) ne correspondant pas à celle obtenue après Northern blotting. Les inventeurs ont donc synthétisé à partir de cette séquence deux amorces nucléotidiques afin de réaliser de nouvelles réactions de 5' RACE. Pour cela une nouvelle matrice a été synthétisée et amplifiée à partir d'ARN total de PBMCs patients VIH+ non stimulées par le MB. Les PCR réalisées à partir des amorces 96

R4 (5'- CCT GGC TCT GCT GGA TGA GCT CGC TAT-3')(SEQ ID N 14) et 96 R5 (5'-TCA ACT CTG CAA TCA TCC TCC ACA GGA- 3')(SEQ ID N 15), ont révélé la présence d'un fragment d'environ 1000pb qui a été cloné et séquence (SEQ ID N 16). La séquence montre que les deux codons Stop initialement obtenu ne sont pas retrouvés, de plus, le cadre de lecture reste ouvert et la séquence en acides aminés est encore homologue à la protéine Ro/SSA de 52kDa. Ce dernier fragment présente un ATG potentiel précédé par un codon STOP. Le cadre de lecture est maintenant de 485 aa. La stratégie utilisée afin d'obtenir la région 5' de l'ADNc grâce à une approche de 5' RACE à partir d'amorces 96 R4 et R5 est présentée dans la figure 3.

Une réaction de 5' RACE a été effectuée à partir d'une nouvelle amorce 96R6 (5'- TCA CCC TTC AGC CCC ATT CCT GGA TGT-3') (SEQ ID N 17) afin de confirmer la présence de l'ATGi et du codon Stop avant celui-ci (figure 3). La PCR a permis d'amplifier un fragment d'environ 550pb, celui-ci fut cloné et séquence. Il a permis de confirmer la présence de l'ATG. L'alignement de séquence en acides aminés du nouveau cadre de lecture de 485 amino-acides avec la protéine Ro/SSA de 52kDa est présentée dans la figure 4.

Une PCR a été réalisée à partir d'amorces spécifiques contenant le codon START1 et le codon STOP sur une RT (Reverse Transcrits d'ARN totaux) de PBMCs afin d'amplifier la copie de l'ADNc codant pour la protéine Ro/SSA-like. Les inventeurs ont obtenu un fragment de taille attendue, celui-ci a été cloné et séquence. La séquence en acides nucléiques complète correspond à la séquence SEQ ID N 1. Le cadre de lecture ouvert est de 485 aa (SEQ ID N 2).

La séquence en acides nucléiques (SEQ ID N 1) a été comparée à différentes banques de données, celle-ci est partiellement homologue au clone NT2RM2001575 (Homo

sapiens cDNA FJ 10369 fis) portant le numéro d'accession aux banques de données DDBJ/EMBL/GenBank AK001231 (SEQ ID N 3). Aucune étude de l'activité biologique de la protéine correspondante n'a été réalisée ; la séquence en acides aminés déduite (SEQ ID N 4) correspond partiellement à la séquence SEQ ID N 2.

Exemple 2 : de l'expression de l'ARNm correspondant 2.1. Etude par Northern blotting de l'expression de l'ARNm dans différents tissus
Le fragment correspondant au cadre de lecture ouvert de 256 amino-acides a été utilisé comme sonde et a été marquée au 32P (Megaprime, Amersham). L'hybridation d'une membrane contenant 2 g d'ARN poly A+ (Clontech) provenant de rate (1), de ganglion lymphatique (2), de thymus (3), de PBMCs (4), de moelle osseuse (5), de foie fétal (6). a révélé le résultat présenté en figure 5.

On note la faible représentativité de l'expression de l'ARNm correspondant dans les PBMCs par rapport à d'autres tissus lymphoïdes.

2. 2. Etude par RT-PCR semi-quantitative de l'expression de l'ARNm dans des PBMCs de patients VIH+ ou de contrôles sains 2.2.1 Isolement et Traitement des PBMCs:
Des PBMC de patients (P) infectés par le VIH ou de donneurs sains contrôles (C) sont isolées, déplétées en CD8+ (Dynabeads, Dynal) et stimulées par la PHA (5 g/ml) pendant 3 jours. Puis, les cellules sont traitées ou non par le Murabutide (10 g/ml) en présence d'interleukine 2 (IL2) (lOU/ml) dans du milieu RPMI

supplémenté en sérum de veau fétal (SVF) à 10% pendant 6 heures ou 24 heures à raison de 5.10 cellules minimum par condition.

2. 2.2 RT-PCR:
Après traitement, l'ARN des cellules est extrait (RNAplus, Quantum-bioprobe) puis traité à la DNase (Boerhinger) et rétrotranscrit (RT) à l'aide d'un oligo(dT) en présence de la reverse transcriptase Mu-MLV (Superscript II, Gibco).

La qualité des RT est vérifiée par PCR (25 cycles) à l'aide d'amorces spécifiques de la GAPDH (5'GCC ATC AAT GAC CCC TTC ATT GAC 3') (SEQ ID N 18) et (5' TGA CGA ACA TGG GGG CAT CAG CAG 3')(SEQ ID N 19) à partir de 20,100 et 500 ng d'ARN total.

Puis, les inventeurs ont réalisé les RT-PCR (35cycles) à l'aide d'amorces spécifiques de l'ARNm codant pour la Ro/SSA-like. (5' GAA AGA GAG GTC GCA GAG GCC TGT 3') (SEQ ID N 20) et (5' TGA TAA GGC TGA GGA AGG GAA ATG 3')(SEQ ID N 21). Le nombre de cycles d'amplification a été mis au point au préalable (35 cycles). Les fragments amplifiés sont visualisés sur gel d'agarose (1%) en présence de bromure d'éthidium, puis quantifiés grâce au programme Imager master (Pharmacia).

2.2.3 Evaluation de l'expression différentielle:
Pour chaque dilution, la valeur donnée pour le gène étudié est rapportée à celle de la GAPDH (Rapport = R). Pour chaque patient et chaque temps (6h ou 24h), le R des cellules traitées au Murabutide est rapporté à celui des cellules non traitées. Les résultats sont alors exprimés en % d'augmentation ou d'inhibition de l'expression du gène par rapport au cellules non traitées. Il est à noter que, pour chaque dilution testée, le R peut varier faiblement, la moyenne des R a été effectuée en prenant soin d'être toujours dans la phase linéaire d'amplification.

2.2.4 Résultats:
Les inventeurs ont testé l'expression différentielle de l'ARNm codant pour la protéine Ro/SSA-like sur 10 patients VIH+ et 8 contrôles sains. Les résultats ont révélé une inhibition significative de l'expression de l'ARNm dans les PBMCs de patients VIH+ après stimulation au Murabutide (7 patients / 10 montrent une inhibition de plus de 40%), tandis que dans les PBMCs de contrôles sains, l'inhibition est plus faible et n'a été observé que dans 3 cas sur 8. La figure 6 illustre l'inhibition observée chez un patient.

Exemple 3 : Expression de protéines recombinantes en système bactérien E. coli (pQE) 3.1. Expression d'une protéine recombinante partielle correspondant au cadre de lecture de 256 aa.

Une PCR a été réalisée sur de l'ADNc de PBMCs à partir d'amorces nucléotidiques correspondant à l'ATGa (5'-GCA GCC CGG GCC ATG CAG AAA CTG GAG TTG-3') (SEQ ID 22) et au STOP (5'-GGT GGT CTG CAG CTT AGT CCT CCC CAT CCA-3') (SEQ ID 23). Ces amorces présentent respectivement les sites de restriction correspondant aux enzymes de restriction Sma 1 et Pst I. Le fragment obtenu a été cloné dans le vecteur pCR2.1(Invitrogen).

L'insert présent dans le vecteur pCR2.1(Invitrogen) a été excisé du vecteur avec l'enzyme Sac I (site situé à 11 aa de l'ATG2) et Pst I (Stop) puis insérer dans le vecteur pQE30 (Sac I/PstI).

Après transformation de bactéries M 15, l'expression de la protéine recombinante a été induite par l'IPTG pendant 5 heures puis purifiée sur billes de nickel. Cette purification, réalisée dans des conditions

dénaturantes, a permis d'obtenir une protéine Ro/SSA-like recombinante resolubilisée en présence de SDS 0.1%.

3. 2. Obtention d'un antiserum dirigé contre la protéine recombinante
Deux lots de 5 souris ont été immunisés avec 50 g ou 100 g de protéine resolubilisée, en présence d'ajuvant complet de Freund, une seconde immunisation a eu lieu trois semaines plus tard en présence d'ajuvant incomplet.

Les souris ont été saignées trois semaines après la première immunisation (SI) et une semaine après la deuxième immunisation (S2). Les sérums ont été testés en ELISA sur la protéine recombinante purifiée. Les sérums donnant des titres élevés ont été utilisés dans des expériences pour détecter la présence sur des membrane obtenue par Western blotting de la protéine recombinante ainsi que la protéine native présente dans des extraits d'antigènes totaux de PBMCs de patients VIH+. Trois sérums ont été testés sur des extraits d'antigènes de PBMCs de deux patients différents.

3. 3 Expression de la protéine recombinante totale correspondant au cadre de lecture ouvert de 485aa
Une PCR a été réalisée sur de l'ADNc de PBMCs à partir d'amorces nucléotidiques correspondant à l'ATGi (5'- TGA GAA GCA TGC ATG GAT CCC ACA GCC TTG-3' ) (SEQ ID N 24) et au STOP (5'GTG GTA CCC GGG TTA GTC CTC CCC ATC CAG -3') (SEQ ID N 25). Le fragment a été cloné dans le vecteur pCR2. 1 puis séquence.

Le fragment a été digéré par les enzymes Sph 1 et Sma 1 puis inséré dans le vecteurs pQ80. La purification a été réalisée selon les

points décrits dans le ≈3.1. Les inventeurs ont obtenu la protéine recombinante à la taille attendue de 58 kDa ainsi que deux produits de dégradation aux tailles 51et 34 kDa.

La protéine ainsi exprimée a été utilisée pour l'immunisation de souris selon les conditions décrites dans le paragraphe 3.2.

3. 4. Expression de la protéine native dans des extraits protéiques de PBMCs
L'antisérum dirigé contre la protéine recombinante partielle a permis d'étudier l'expression de la protéine native correspondante dans des extraits protéiques de PBMCs. Ainsi, l'antisérum reconnaît une protéine native de 54 kDa sur de extraits de PBMCs.

Exemple 4 : de la protéine recombinante en système eucaryote
La protéine Ro/SSA homologue étant exprimée dans le cytoplasme ou dans le noyau de cellules de mammifères les inventeurs ont développé une stratégie de surexpression de la protéine recombinante dans des cellules eucaryotes afin d'apprécier son rôle dans la régulation du VIH.

Pour cela la copie complète de l'ADNc a été amplifiée à partir des amorces 96 GFP Xho 1 (5'-GTG TGA CTC GAG ACC ATG GAT CCC ACA GCC-3') (SEQ ID N 26) et 96 GFP Eco RI (5'- CCG GAA TTC CGT CCT CCC CAT CCA GGG A-3') (SEQ ID N 27), celle-ci fut cloné dans le vecteur pEGFP digéré par Xho I/Eco RI puis séquence.

Le cDNA codant pour la GFP est en 3' de l'insert cloné.

D'autre part, la copie complète de l'ADNc a été amplifiée à partir des amorces 96 His RI (5'-CCG GAA TTC ACC ATG GAT CCC ACA GCC-3')(SEQ ID N 28) et 96 His Xho 1 (5'-GCT TTC CTC GAG GTC CTC CCC ATC CAG GGA-3') (SEQ ID N 29), celle-ci fut clonée dans

le vecteur pcDNA6 digéré par Eco Ri/Xho I. Dans ce système la protéine est fusionnée à 6 Histidines et à une protéine V5.

Exemple 5 : Mise en évidence d'auto-anticorps anti-RoSSA-like dans les sérums de patients atteints du syndrome de Sjôrgren.

Afin d'analyser si la nouvelle protéine Ro/SSA-like peut être une cible pour les autoanticorps présents dans certaines maladies autoimmunes comme le syndrome de Sjôgren, les inventeurs ont testé les sérums de 6 patients pour étudier la présence des anticorps dirigés contre la protéine Ro/SSA-like de l'invention. Les inventeurs ont également analysé les sérums de 5 donneurs sains n'ayant aucun symptôme de la maladie.

Les patients ont été analysés dans le laboratoire de l'hôpital comme possédant ou non les anticorps anti-SSA ou anti-SSB ou anti-SSA et anti-SSB. Les analyses ont été faites par ELISA ; pour ce faire, les puits ds microplaques de 96 puits sont recouverts de la protéine Ro/SSA-like de l'invention, les sérums sont incubés à différentes dilutions et la présence des anticorps est révélée par un anticorps anti-IgG humain conjugué à péroxidase. L'activité enzymatique est révélée par le substrat de la péroxidase (0phénylène diamine) et les valeurs de l'absorbance pour chaque puits sont obtenues après lecture sur un spectrophotomètre de plaque ELISA. Les résultats sont montrés dans le tableau suivant :

<tb>
<tb> Sujet <SEP> testé <SEP> Présence <SEP> Niveau <SEP> d'autoanticorps <SEP> anti
<tb> d'anticorps <SEP> Ro/SSA-like <SEP> mesuré <SEP> en <SEP> valeur
<tb> anti <SEP> SSA/SSB <SEP> d'absorbance <SEP> dans <SEP> les <SEP> sérums
<tb> dilués
<tb> 1/500 <SEP> 1/100
<tb> Donneurs <SEP> sains
<tb> 1- <SEP> 0. <SEP> 12 <SEP> 0. <SEP> 22 <SEP> (-)
<tb> 2- <SEP> 0. <SEP> 10 <SEP> 0. <SEP> 17 <SEP> (-)
<tb> 3- <SEP> 0. <SEP> 10 <SEP> 0. <SEP> 19 <SEP> (-)
<tb> 4- <SEP> 0. <SEP> 19 <SEP> 0. <SEP> 30 <SEP> (-)
<tb> 5- <SEP> 0. <SEP> 18 <SEP> 0. <SEP> 30 <SEP> (-)
<tb> Syndrome <SEP> de
<tb> Sjogren
<tb> 1 <SEP> SSA-/SSB- <SEP> 0. <SEP> 14 <SEP> 0. <SEP> 23 <SEP> (-)
<tb> 2 <SEP> SSA-/SSB- <SEP> 0. <SEP> 51 <SEP> 1. <SEP> 00 <SEP> (+)
<tb> 3 <SEP> SSA+/SSB- <SEP> 0. <SEP> 11 <SEP> 0. <SEP> 17 <SEP> (-)
<tb> 4 <SEP> SSA+/SSB- <SEP> 0. <SEP> 21 <SEP> 0. <SEP> 38 <SEP> (+)
<tb> 5 <SEP> SSA-/SSB+ <SEP> 0. <SEP> 41 <SEP> 0. <SEP> 51 <SEP> (+)
<tb> 6 <SEP> SSA+/SSB+ <SEP> 0. <SEP> 37 <SEP> 0. <SEP> 63 <SEP> (+)
<tb>

Ces résultats montrent clairement la présence d'autoanticorps contre la protéine Ro/SSA-like dans les sérums de patients atteints du syndrome de Sjôgren (4 sur 6 patients). Le plus intéressant est que le patient 2 qui ne possède pas d'anticorps anti-SSA et anti-SSB est le plus positif contre la nouvelle protéine Ro/SSA-like de l'invention. Ceci suggère que la nouvelle protéine peut être d'une valeur importante pour confirmer le diagnostique de la maladie et confirme la découverte d'un nouveau membre de la famille des SS antigènes.

REFERENCES Buckholz, (1993), Curr. Op. Biotechnology 4,538.

Carter, (1993) Curr. Op. Biotechnology 3, 533.

Duck et al. (1990), Biotechniques, 9, 142.

Edwards et Aruffo (1993), Curr. Op. Biotechnology, 4,558.

Epstein (1992) Médecine/ Sciences, 8,902.

Furth et al . (1992) Anal. Biochem. 205 :365.

Gorbalenya et al. 1988 Nature 333 : Guatelli et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : Kievitis et al. (1991), J. Virol. Methods, 35, 273.

Kôhler et Milstein. (1975) Nature 256,495.

Kwoh, et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86,1173.

Landegren et al. (1988) Science 241,1077.

Linder et al. 1989, Nature 337 : 121-122Lopez-Luna et al.( 1995) Scand. J. Rhumatol. 24 : Luckow (1993), Curr. Op. Biotechnology 4,564.

Luking. et al. (1998) 33 : 259-296 Matthews et al. (1988), Anal. Biochem., 169,1-25.

Miele et al. (1983), J. Mol. Biol., 171, 281.

Muller et al. (1992) Aids 6 : 933.Neddleman et Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48 : 443 Olins et Lee (1993), Curr. Op. Biotechnology 4 : 520.

Pause and Sonenbery, 1992, EMBO J. 11 : 2643-2654 Pearson et Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 2444 Perricaudet et al. (1992), La Recherche 23 : 471.

Rader et al. (1989), J. Clim. Invest. 83 : 1293-1298.

Rohlmann et al. (1996) Nature Biotech. 14 : 1562.

Rolfs, A. et al. (1991), Berlin : Springer-Verlag.

Schartw et al. Fundamental Immunology, Second Edition, Paul W.E.

Edition Raven Press, New York (1984) pp 816-866).

Segev, (1992), Kessler C. Springer Verlag, Berlin, New-York, 197-205.

Sibilia, (1998), Rev. Rhum. 65 : 45-57

Smith et Waterman (1981) Ad. App. Math. 2 : Stewart et Yound (1984), Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford.

Tang et al. (1992) Nature 356 :152.

Temin, (1986) Retrovirus vectors for gene transfer. In Kucherlapati R., ed. Gene Transfer.

Walker et al. 1982, EMBO J. 1 :

Claims

REVENDICATIONS 1. Polypeptide isolé dénommé Ro/SSA-like de séquence d'acides aminés SEQ ID N 2.
2. Polypeptide isolé caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide choisi parmi : a) un polypeptide de séquence SEQ ID N 2 ; b) un polypeptide variant de polypeptide de séquences d'acides aminés défini en a) ; c) un polypeptide homologue au polypeptide défini en a) ou b) et comportant au moins 80 % d'identité avec ledit polypeptide de a) ; d) un fragment d'au moins 15 acides aminés consécutifs d'un polypeptide défini en a), b) ou c) à l'exception du fragment de séquence SEQ ID N 4 ; e) un fragment biologiquement actif d'un polypeptide défini en a), b) ou c) à l'exception du fragment de séquence SEQ ID

N 4
3. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 2 caractérisé en ce qu'il est comporte au moins un domaine conservé de fixation à un acide nucléique sélectionné dans le groupe composé d'un domaine doigt de zinc et d'un domaine leucine-zipper .
4. Polynucléotide purifié ou isolé caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide selon la revendication 1.
5. Polynucléotide selon la revendication 4 de séquence SEQ ID N 1à l'exception de la séquence SEQ ID N 3.
6. Polynucléotide isolé caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide choisi parmi :

<Desc/Clms Page number 56>

a) SEQ ID N 1 ; b) la séquence d'un fragment d'au moins 15 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N 1à l'exception de la séquence SEQ ID N 3. c) une séquence nucléique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 85 %, après alignement optimal avec une séquence définie en a) ou b) ; d) la séquence complémentaire ou la séquence d'ARN correspondant à une séquence telle que définie en a), b) ou c).
7. Utilisation d'un polynucléotide selon la revendication 6 en tant qu'amorce pour l'amplification ou la polymérisation de séquences nucléiques.
8. Utilisation in vitro d'un polynucléotide selon la revendication 6 en tant que sonde pour la détection de séquences nucléiques.
9. Utilisation in vitro d'un polynucléotide selon la revendication 6 en tant que séquence d'acide nucléique sens ou antisens pour contrôler l'expression du produit protéique correspondant.
10. Utilisation d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 7,8, 9 caractérisé en ce que ledit polynucléotide est marqué directement ou indirectement par un composé radioactif ou un composé non radioactif.
11. Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression comprenant un polynucléotide selon l'une des revendications 4 à 6 ou codant pour un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.

<Desc/Clms Page number 57>
12. Vecteur recombinant d'expression antisens comprenant un polynucléotide selon l'une des revendications 4 à 6 caractérisé en ce que ledit polynucléotide est inséré en orientation inverse dans ledit vecteur.
13. Cellule hôte, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur selon l'une des revendications 11 et 12.
14. Animal, excepté l'homme, caractérisé en ce qu'il comprend une cellule selon la revendication 13.
15. Procédé de préparation d'un polypeptide recombinant caractérisé en ce que l'on cultive une cellule hôte selon la revendication 13 dans des conditions permettant l'expression et éventuellement la sécrétion dudit polypeptide recombinant et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant.
16. Polypeptide recombinant obtenu par un procédé selon la revendication 15.
17. Anticorps monoclonal ou polyclonal isolé et ses fragments caractérisé en ce qu'il lie sélectivement un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3 ou 16.
18. Anticorps anti-idiotypique et ses fragments caractérisé en ce qu'il est dirigé contre l'anticorps selon la revendication 17.
19. Procédé de détection et/ou de dosage d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3 ou 16, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact de l'échantillon biologique avec un anticorps selon la revendication 17;

<Desc/Clms Page number 58>

b) mise en évidence du complexe antigène-anticorps formé.
20. Trousse de réactifs pour la mise en #uvre d'un procédé selon la revendication 19 dans un échantillon biologique par réaction immunologique, caractérisé en ce qu'elle comprend les éléments suivants : a) un anticorps monoclonal ou polyclonal selon la revendication 17; b) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique ; c) le cas échéant, les réactifs permettant la détection du complexe antigène-anticorps produit lors la réaction immunologique.
21. Procédé de détection et/ou de dosage d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 4 à 6 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) isolement de l'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon biologique ; b) amplification spécifique de l'ADN à l'aide de polynucléotide selon la revendication 7 utilisé comme amorce; c) analyse des produits d'amplification.
22. Procédé de détection et/ou de dosage d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 4 à 6 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) Mise en contact d'un polynucléotide selon l'une des revendications 4 à 6 avec un échantillon biologique ; b) Détection et/ou dosage de l'hybride formé entre ledit polynucléotide et l'acide nucléique de l'échantillon biologique.

<Desc/Clms Page number 59>
23. Trousse de réactifs pour la mise en #uvre d'un procédé selon la revendication 21 ou 22 caractérisé en ce qu'elle comprend au moins un polynucléotide selon l'une des revendications 4 à 6.
24. Puce à ADN caractérisée en ce qu'elle contient un polynucléotide selon l'une des revendications 4 à 6.
25. Puce à protéines caractérisée en ce qu'elle contient un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3 ou 16, ou un anticorps selon la revendication 17 ou un anticorps anti-idiotypique selon la revendication 18.
26. Procédé de criblage de ligands qui affectent la transcription in vitro et/ou in vivo du gène codant naturellement pour le polypeptide selon les revendications 1 à 3, et qui comporte les étapes suivantes : a) mise en contact d'une cellule choisie parmi la cellule hôte de la revendication 13 et une cellule eucaryote, de préférence humaine, exprimant le polypeptide selon la revendication 1 à

3, et d'un ou plusieurs ligands potentiels en présence de réactifs nécessaires à la mise en #uvre d'une réaction de transcription ; b) détection et/ou mesure de l'activité transcriptionnelle.
27. Ligand obtenu par le procédé selon la revendication 26.
28. Ligand selon la revendication 27 caractérisé en ce qu'il s'agit du Murabutide.
29. Agent de diagnostic de maladies auto-immunes humaines caractérisé en ce que ledit agent de diagnostic est sélectionné parmi :

<Desc/Clms Page number 60>

a) un polypeptide selon les revendications 1 à 3 ; b) un anticorps anti-idiotypique selon la revendication 18 ; c) une cellule selon la revendication 13 transformée par un vecteur d'expression selon la revendication 11 susceptible d'exprimer efficacement ledit polypeptide selon les revendications 1 à 3.
30. Agent de diagnostic selon la revendication 29 caractérisé en ce que ledit polypeptide, ledit anticorps anti-idiotypique, lesdits fragments d'anticorps anti-idiotypique sont couplés à un support solide directement ou indirectement par l'intermédiaire d'un bras d'espacement.
31. Agent de diagnostic selon les revendications 29 et 30 caractérisé en ce que ledit polypeptide, ledit anticorps anti-idiotypique, lesdits fragments d'anticorps anti-idiotypique sont marqués directement ou indirectement par un marqueur générateur de signal.
32. Procédé in vitro de détection d'auto-anticorps anti-Ro/SSA-like dans un fluide biologique humain comprenant les étapes de : a) mise en contact dudit fluide biologique avec un agent de diagnostic selon les revendications 29 à 31 caractérisé en ce que lesdits auto-anticorps réagissent avec ledit agent de diagnostic ; b) mise en évidence du complexe auto-anticorps/polypeptide ou du complexe auto-anticorps/anticorps anti-idiotype formé.
33. Procédé selon la revendication 32 caractérisé en ce que lesdits auto-anticorps sont présents dans le fluide biologique de patient atteint de pathologies sélectionnées dans le groupe composé des

<Desc/Clms Page number 61>

maladies auto-immunes, des pathologies infectieuses chroniques ayant des manifestations auto-immunes, des pathologies virales.
34. Procédé selon la revendication 33 caractérisé en ce que lesdites maladies auto-immunes sont de préférence choisies parmi dans le lupus systémique érythémateux (SLE) et le syndrome de Sjôgren.
35. Procédé selon la revendication 33 caractérisé en ce que lesdites pathologies infectieuses chroniques ayant des manifestations autoimmunes sont de préférence choisies parmi dans le SIDA, l'hépatite B, l'hépatite C.
36. Procédé selon la revendication 33 caractérisé en ce que lesdites pathologies virales sont de préférence choisies parmi celles causées par une infection par un virus à ARN.
37. Procédé selon la revendication 32 caractérisé en ce que lesdits auto-anticorps sont présents dans le fluide biologique de patient dont les cellules ont subi un stress, de préférence une irradiation aux ultra-violets.
38. Trousse de diagnostic caractérisé en ce qu'elle contient un agent de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 29 à 31.
39. Procédé in vitro de purification d'un fluide biologique humain susceptible de contenir des auto-anticorps anti-Ro/SSA-like et comprenant les étapes de : a) mise en contact dudit fluide biologique avec un polypeptide selon les revendications 1 à 3, ou un anticorps anti- idiotypique ou l'un de ses fragments, selon la revendication

18, dans des conditions permettant la formation d'un

<Desc/Clms Page number 62>

complexe auto-anticorps/ polypeptide ou d'un complexe auto-anticorps/anticorps anti-idiotype formé ; b) séparation du fluide biologique et du complexe formé à l'étape a) c) récupération du fluide biologique obtenu à l'étape b).
40. Utilisation d'un fluide biologique humain purifié obtenu par le procédé selon la revendication 39 pour la préparation d'une composition destinée au traitement thérapeutique de patients atteints de maladies auto-immunes, de préférence sélectionnées dans le groupe du lupus systémique érythémateux (SLE) et du syndrome de Sjôgren.
41. Utilisation d'un fluide biologique humain purifié obtenu par le procédé selon la revendication 39 pour la préparation d'une composition destinée au traitement thérapeutique de patients dont les cellules ont subi un stress.
42. Utilisation d'un fluide biologique humain purifié obtenu par le procédé selon la revendication 39 pour la préparation d'une composition destinée au traitement thérapeutique de patients atteints de maladies infectieuses chroniques ayant des manifestations auto-immunes de préférence sélectionnées parmi le SIDA, l'hépatite B, l'hépatite C.
43. Composé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : a) un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3 ou 16; b) un polynucléotide selon l'une des revendications 4 à 6 ; c) un polynucléotide selon l'une des revendications 4 à

6 utilisé en tant que séquence d'acide nucléique antisens ; d) un vecteur selon la revendication 11ou 12 ; e) une cellule selon la revendication 13 ;

<Desc/Clms Page number 63>

f) un anticorps selon la revendication 17 ; g) un anticorps anti-idiotypique selon la revendication 18; h) un ligand selon les revendications 27 et 28. à titre de médicament.
44. Composé selon la revendication 43 à titre de médicament destiné à la prévention et/ou au traitement de maladies sélectionnées dans le groupe composé des maladies auto-immunes, des pathologies infectieuses chroniques ayant des manifestations auto-immunes, des pathologies virales.
45. Composé selon la revendication 44 caractérisé en ce que ladite maladie auto-immune est sélectionnée dans le groupe composé du lupus systémique érythémateux et du syndrome de Sjôgren.
46. Composition pharmaceutique pour le traitement préventif et/ou curatif du lupus systémique érythémateux et/ou du syndrome de Sjôgren caractérisée en ce qu'elle contient une quantité thérapeutiquement efficace d'un composé selon la revendication 45 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
47. Composé selon la revendication 44 caractérisé en ce que ladite pathologie virale est sélectionnée parmi les pathologies causées par une infection par un virus à ARN.
48. Composition pharmaceutique pour le traitement préventif et/ou curatif de pathologie virale sélectionnée de préférence parmi les pathologies causées par une infection par un virus à ARN, caractérisée en ce qu'elle contient une quantité thérapeutiquement efficace d'un composé selon la revendication 47 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

<Desc/Clms Page number 64>
49. Composé selon la revendication 44 caractérisé en ce que ladite pathologie infectieuse chronique ayant des manifestations auto-immunes est sélectionnée dans le groupe composé du SIDA, de l'hépatite B, de l'hépatite C.
50. Composition pharmaceutique pour le traitement préventif et curatif d'une maladie infectieuse chronique ayant des manifestations auto-immunes sélectionnée de préférence dans le groupe composé du SIDA, de l'hépatite B, de l'hépatite C caractérisée en ce qu'elle contient une quantité thérapeutiquement efficace d'un composé selon la revendication 49 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
51. Utilisation d'un composé selon la revendication 43 pour la préparation d'un médicament destiné à neutraliser les autoanticorps anti-Ro/SSA-like dans un fluide biologique.
52. Utilisation d'un composé selon la revendication 43 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des infections par les virus à ARN.