FR2809734A1

FR2809734A1 - Proteine tetraspane humaine et son utilisation

Info

Publication number: FR2809734A1
Application number: FR0007006A
Authority: FR
Inventors: Giovanni Magistrelli; Yves Delneste; Pascale Jeannin
Original assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 2000-05-31
Filing date: 2000-05-31
Publication date: 2001-12-07

Abstract

La présente invention a pour objet une protéine tétraspane humaine et ses fragments, notamment son domaine extracellulaire EC2, les acides nucléiques correspondants, les vecteurs contenant lesdits acides nucléiques, les anticorps dirigés contre ladite tétraspane ou ses fragments ainsi que les compositions pharmaceutiques comprenant ces précédents objets. La présente invention concerne encore l'utilisation de ladite tétraspane ou d'un agoniste de cette dernière notamment pour diminuer la migration des cellules tumorales.

Description

La superfamille des tétraspanes (abréviation TM4SF) regroupe des glycoprotéines présentant des homologies structurales et de séquences. Ces tétraspanes présentent quatre domaines hydrophobes TM1 à TM4 (TM pour transmembrane) pouvant constituer des domaines transmembranaires permettant la formation de deux boucles extérieures, une de petite taille appelée EC1(EC pour extracellular) située à l'extrémité N-terminale et une de plus grande taille appelée EC2 située à l'extrémité Cterminale) (Maecker et al., 1997). Les plus fortes homologies entre les différents membres de la superfamille des tétraspanes sont confinées aux domaines transmembranaires. La plus grande diversité de séquence est trouvée au niveau des boucles extracellulaires et en particulier EC2. Cependant, quatre résidus cystéines sont conservés au niveau de EC2 : motif CCG localisé à environ 50 acides aminés après le domaine TM3, un résidu cystéine à environ 11acides aminés en amont de TM4, et un résidu cystéine fréquemment trouvé dans un motif PXSC (X pouvant être n'importe lequel des acides aminés) qui est placé indifféremment dans le domaine EC2.

La superfamille des tétraspanes contient une vingtaine de membres dont certains sont ubiquitaires (comme par exemple les molécules CD9, CD63, CD81 et CD82) (Oren et al., 1990 ; Boucheix et al., 1991 ; Metzelaar et al., 1991 ; Gil et al., 1992) ou d'expression plus restreinte (comme par exemple la molécule CD37 sur les lymphocytes B matures, la molécule CD53 sur les cellules lymphoïdes et méloïdes ou la neurospanine sur les cellules nerveuses) (Classon et al., 1989 ; Amiot, 1990 ; et Bixby, 1999). Les molécules de la superfamille des tétraspanes agiraient comme facilitateurs dans les interactions des molécules membranaires (Maecker et al., 1997).

De nombreuses molécules de la superfamille des tétraspanes ont été initialement identifiées comme des antigènes tumoraux comme les molécules TAPA-1/CD63 (Oren et al., 1990), Motility related protein-l/CD9 (Boucheix et al., 1991), L6 (Marken et al.,

1992), Sarcoma Amplified Sequence (SAS) (Jankowski étal, 1994), TI-1 (Kallin et al., 1991) ou CO-029 (Szala et al., 1990). De manière remarquable, il apparaît que la diminution d'expression de certaines molécules de la superfamille des tétraspanes est associée à une augmentation des propriétés de migration des cellules tumorales (processus d'invasion tumorale ou métastase). Ce phénomène a été largement rapporté dans la littérature pour les molécules CD9 (Miyake et al., 1991), CD63 (Hotta et al., 1988 ; Azorsa et al., 1991), et CD82 (Adachi et al., 1996 ; White et al., 1998). De la même manière, la transfection de cellules tumorales avec les ADNc codant pour les molécules CD9 (Ikeyama et al., 1993), CD63 (Hotta et al., 1991 ; Kondoh et al., 1993 ; Radford et al., 1995 ; Radford et al., 1996) ou CD82 (Dong et al., 1995) induit une diminution de la mobilité et donc de l'agressivité de la tumeur.

Les molécules de la superfamille des tétraspanes jouent un rôle de corécepteur en formant des complexes oligomériques dont le rôle reste obscur. Parmi ces structures multimériques, citons l'interaction de la molécule CD19 avec les tétraspanes CD9/CD81/CD82 (Horvath et al., 1998). Les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II forment des complexes oligomériques avec les tétraspanes CD37/CD53/CD81/CD82 (Angelisova et al., 1994) ou CD9/CD63/CD81/CD82 (Rubinstein et al., 1996). La molécule CD2 interagit avec la tétraspane CD53 et la molécule CD5 interagit avec la tétraspane CD9 (Toyo-oka et al., 1999). Les molécules CD81 et CD82 s'associent aux domaines intracellulaires des molécules CD4 et CD8 (Imai & Yoshie, 1993 ; Imai et al., 1995).

Les molécules de la superfamille des tétraspanes interagissent également avec les intégrines, principalement celles de la famille ss1 comme par exemple l'interaction de la molécule CD63 avec les intégrines [alpha]3ss1 (VLA-3) et [alpha]6ss1 (VLA-6), de la molécule CD9 avec les intégrines [alpha]4ss1 (VLA-4) et VLA-6, de la molécule CD 151 avec l'intégrine [alpha]5ss1 (Berdichevski et al., 1996 ; Rubinstein et al., 1994 ; Rubinstein et al., 1996 ; Mannion et al., 1996 ; Radford et al., 1996 ; Sincock et al., 1997) ou de la molécule NAG-2 avec [alpha]3ss1 et [alpha]6ss1 (Tachibana et al., 1997). Les molécules CD9 et CD63 ont également la propriété d'interagir avec la molécule LFA-1 ([alpha]1ss2). Le rôle des intégrines dans les mécanismes d'adhésion et de migration cellulaire ainsi que la capacité des molécules de la superfamille des tétraspanes à former des complexes

oligomériques avec les intégrines permettent de souligner le rôle de ces dernières dans les processus d'invasion tumorale.

L'association des molécules de la superfamille des tétraspanes avec des molécules de costimulation exprimées par les cellules du système immunitaire a permis de mettre en évidence leur participation dans l'activation de certaines cellules immunes.

Une activation des molécules CD9 et CD82 à l'aide d'anticorps monoclonaux fournit un signal de costimulation aux lymphocytes T stimulés avec un anticorps anti-CD3 (Lebelbinay et al., 1995 ; Tai et al., 1996). Des anticorps anti-CD151 et anti-CD9 induisent une agrégation et une activation plaquettaire, respectivement (Slupsky et al., 1989 ; Griffith et al., 1991). L'activation cellulaire médiée par les molécules de la superfamille des tétraspanes est associée à la génération de seconds signaux impliqués dans la transduction du signal. Un anticorps anti-CD53 fournit un signal de costimulation à des lymphocytes B activés via le récepteur aux immunoglobulines (Rasmussen et al., 1994) ; ce signal d'activation est médié en partie par la protéine kinase C (Bosca & Lazo, 1994). Un anticorps anti-CD9 active la kinase p72syk (Ozaki et al., 1995) et la signalisation intracellulaire est associée à une GTP-binding protein (Seehafer & Shaw, 1991). Des expériences d'immunoprécipitation des molécules CD63 et CD53 montrent qu'elles sont associées à des phosphatases non identifiées (Carmo & Wright, 1995).

La molécule CD81a été identifiée comme un récepteur pour la molécule E2 du virus à l'hépatite C (Pileri et al., 1998 ; Flint et al., 1999). Des souris n'exprimant pas la molécule CD9 (CD9 knock-out) présentent une fertilité réduite consécutive à une altération des interactions spermatozoïde-ovule (Kaji étal, 2000).

La superfamille des tétraspanes s'est récemment développée par l'identification de sept nouveaux ADNc codant pour des molécules présentant les caractéristiques structurales de cette famille (Serru et al., 2000) ainsi que par le clonage chez le poulet d'une nouvelle molécule, appelée neurospanine (Perron et Bixby, 2000).

Ainsi, il reste aujourd'hui un grand besoin d'isoler et d'identifier de nouvelles tétraspanes. De telles tétraspanes seraient en effet susceptibles d'avoir un rôle important pour moduler les interactions des molécules membranaires mais aussi dans le processus d'invasion tumorale. Il existe donc un besoin de nouvelles compositions pharmaceutiques utiles dans le traitement des maladies liées à l'altération de l'expression

des molécules de la superfamille des tétraspanes tout comme de nouveaux diagnostiques permettant de déceler ces maladies. Ceci est justement l'objet de la présente invention.

La présente invention a ainsi pour objet une nouvelle protéine tétraspane humaine isolée de séquence SEQ ID No. 2, l'un de ses fragments d'au moins 5 acides aminés ou l'une de ses protéines dérivées.

Cette nouvelle tétraspane selon l'invention a été isolée de façon surprenante en se basant notamment sur une étiquette de séquence exprimée EST (EST pour Expressed Sequence Tag ) choisie parmi 1856102 EST de la banque db EST, disponible à l'adresse internet "www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/".

De plus, comme il est démontré dans l'exemple 2 ci-après, l'expression de cette tétraspane n'est pas limitée aux neurones. Ainsi, il a été démontré que cette nouvelle tétéraspane était également exprimée notamment au niveau des cellules endothéliales et des lymphocytes T.

Par protéine , on entend désigner également les termes de peptide ou polypeptide, ces 3 termes étant utilisés indifféremment dans la présente description.

Dans la présente description, en particulier dans les revendications, sauf mention particulière, on entendra désigner par tétraspane humaine la tétraspane humaine isolée de séquence SEQ ID No. 2.

Par fragment de la tétraspane humaine de séquence SEQ ID No. 2, on entend désigner dans la présente description tout fragment dont la séquence comprend au moins 5 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID No. 2, de préférence 8,10, 15,20, 25,50 et 100 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID No. 2.

Par protéine dérivé de la tétraspane humaine de séquence SEQ ID No. 2 , on entend désigner dans la présente description les protéines comprenant une séquence présentant un pourcentage d'identité après alignement optimal d'au moins 90 %, de préférence 95 %, et 99 % avec la séquence SEQ ID No. 2.

Parmi lesdits fragments et lesdites protéines dérivées de la protéine de séquence SEQ ID No. 2, on préfère ceux capables d'exercer au moins partiellement une des activités des protéines tétraspanes telles que mentionnées ci-avant, ou de moduler au moins partiellement une des activités des protéines tétraspanes mentionnées ci-avant.

Parmi lesdits fragments et lesdites protéines dérivées de la protéine de séquence SEQ ID No. 2, on préfère de manière particulière ceux capables d'inhiber ou

d'augmenter au moins partiellement une des activités des protéines tétraspanes telles que mentionnées ci-avant, lesdits fragments et lesdites protéines dérivées pouvant ainsi être utilisés pour moduler, en particulier diminuer, l'activité biologique de la tétraspane.

Ainsi, lesdites protéines dérivées pourront comprendre une ou plusieurs substitutions, de préférence conservatrices, délétions ou insertions, comparées à la protéine sauvage de séquence SEQ ID No. 2.

Par substitution conservatrice, on entend désigner toute substitution d'acide aminé n'induisant que peu ou pas d'effet sur la charge totale, la polarité ou l'hydrophobicité de la protéine de référence, ladite substitution permettant d'accroître ou de diminuer l'activité recherchée de la tétraspane. Cette activité recherchée pouvant être soit une activité agoniste ou soit antagoniste de la tétraspane.

Par pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par fenêtre de comparaison pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2 :482], moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. Mol. Biol.

48 :443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :2444], moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ou encore par les logiciels de comparaison BLAST N ou BLAST P).

Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par fenêtre de comparaison dans laquelle la région de la séquence d'acide nucléique ou

d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.

Par exemple, on pourra utiliser le programme BLAST, BLAST 2 séquences , disponible sur le site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/, les paramètres utilisés étant ceux donnés par défaut (en particulier pour les paramètres open gap penaltie : 5, et extension gap penaltie : 2 ; la matrice choisie étant par exemple la matrice BLOSUM 62 proposée par le programme), le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer étant calculé directement par le programme.

Parmi lesdits fragments de la protéine de séquence SEQ ID No. 2 selon l'invention, on préfère la protéine isolée de séquence SEQ ID No. 4 correspondant au domaine extracellulaire EC2 de la tétraspane humaine, ou une de ses protéines dérivées.

Parmi lesdits fragments de la protéine de séquence SEQ ID No. 2 selon l'invention, on préfère également la protéine isolée de séquence SEQ ID No. 6 correspondant au domaine extracellulaire EC2 de la tétraspane humaine flanqué de ses deux domaines transmembranaires TM3 et TM4, ou une de ses protéines dérivées.

Par protéine dérivée de la protéine de séquence SEQ ID No. 4 ou de séquence SEQ ID No. 6, on entend désigner respectivement une protéine dont la séquence présente un pourcentage d'identité après alignement optimal d'au moins 90 %, de préférence 95 %, et 99 % avec la séquence SEQ ID No. 4 ou SEQ ID No. 6.

De préférence, lesdites protéines dérivées de la protéine de séquence SEQ ID No. 4 et de séquence SEQ ID No. 6 sont capables d'exercer respectivement au moins partiellement une des activités des fragments de séquences SEQ ID No. 4 et SEQ ID No. 6 de la protéine tétraspane ou de moduler au moins partiellement une desdites activités, comme ci-avant mentionnées pour les fragments et protéines dérivées de la séquences SEQ ID No. 2.

Sous un autre aspect, l'invention comprend les acides nucléiques isolés dont la séquence code pour une protéine selon la présente invention, leur acide nucléique de séquence complémentaire ou la séquence de leur ARN correspondant.

Par acide nucléique, séquence nucléique, séquence polynucléotidique ou polynucléotide, on entend un fragment d'ADN, mono brin ou double brins, ou d'ARN naturel, recombinant, ou de synthèse, comportant ou non des nucléotides non naturels, désignant un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment, un segment ou une région.

L'invention comprend en particulier un acide nucléique selon l'invention, dont la séquence code pour la protéine de séquence SEQ ID No. 2 ou pour une de ses protéines dérivées. Un tel acide nucléique est par exemple et préférentiellement un acide nucléique de séquence SEQ ID No. 1.

L'invention comprend en particulier un acide nucléique selon l'invention, dont la séquence code pour la protéine de séquence SEQ ID No. 4 ou pour une de ses protéines dérivées. Un tel un acide nucléique est par exemple et préférentiellement un acide nucléique de séquence SEQ ID No. 3.

L'invention comprend en particulier un acide nucléique selon l'invention, dont la séquence code pour la protéine de séquence SEQ ID No. 6 ou pour une de ses protéines dérivées. Un tel un acide nucléique est par exemple et préférentiellement un acide nucléique de séquence SEQ ID No. 5.

L'invention est aussi relative aux acides nucléiques capables de s'hybrider avec l'une des séquences d'acides nucléiques selon la présente invention.

Par acide nucléique capable de s'hybrider spécifiquement avec l'un des acides nucléiques selon l'invention, on entend désigner les acides nucléiques d'au moins 15 nucléotides, de préférence 18,20, 25 et 50 nucléotides capables de s'hybrider dans des conditions stringentes d'hybridation avec l'un desdits acides nucléiques selon l'invention, ces conditions étant bien connues de l'homme de l'art, telles que les conditions décrites notamment par Sambrook et al. (Molecular cloning, A laboratory Manual, Sec. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pages 11. 50 et 11.51, 1989).

Parmi lesdites conditions stringentes, on préfère les conditions telles qu'elles assurent aux acides nucléiques qui s'hybrident spécifiquement avec l'un des acides

nucléiques selon l'invention, une séquence présentant au moins 90 %, de préférence, 95 % et 99 % d'identité après alignement avec la séquence complémentaire de l'un desdits acides nucléiques selon l'invention.

Sous un autre aspect, l'invention comprend l'utilisation des acides nucléiques selon l'invention comme amorce, notamment pour l'amplification d'acide nucléique par une technique de polymérisation en chaîne à la polymérase (PCR ou méthode apparentée à la PCR) ou en tant que sonde pour la mise en évidence ou l'identification d'acide nucléique.

La présente invention concerne l'ensemble des sondes qui peuvent être déduites des acides nucléiques de l'invention, notamment des séquences capables d'hybrider avec elles, et qui peuvent permettre de mettre en évidence lesdits acides nucléiques de l'invention, en particulier de discriminer les séquences normales des séquences mutées.

L'ensemble des sondes et amorces selon l'invention pourront être marquées par des méthodes bien connues de l'homme du métier, afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable.

L'invention comprend en outre l'utilisation des acides nucléiques selon l'invention, comme oligonucléotides sens ou antisens.

Les acides nucléiques antisens pourront notamment être utilisés dans des traitements thérapeutiques dits antisens connus de l'homme du métier. Ils consistent principalement à combiner une séquence d'ARN naturellement produite avec une polynucléotide antisens qui s'hybride à cette dernière de façon à former un duplex. Ce duplex bloque ensuite le reste de la transcription ou interdit la traduction.

On peut également citer les oligonucléotides sens qui, par interaction avec des protéines impliquées dans la régulation de l'expression du produit correspondant, induiront soit une inhibition, soit une activation de cette expression, et être ainsi utilisés dans d'autres traitements thérapeutiques nécessitant la modulation de cette expression.

Un autre objet de l'invention est un vecteur, de clonage et/ou d'expression, qui contient un acide nucléique selon l'invention, notamment un acide nucléique choisi parmi :

- un acide nucléique codant pour une tétraspane de séquence SEQ ID No. 2 ou pour une protéine dont la séquence présente un pourcentage d'identité après alignement optimal d'au moins 90 %, de préférence 95 %, et 99 % avec la séquence SEQ ID No. 2 ; - un acide nucléique de séquence SEQ ID No. 1 ; - un acide nucléique qui codant pour le domaine extracellulaire EC2 de séquence SEQ ID No. 4, ou pour une protéine dont la séquence présente un pourcentage d'identité après alignement optimal d'au moins 90 %, de préférence 95 %, et 99 % avec la séquence SEQ ID No. 4 ; - un acide nucléique de séquence SEQ ID No. 3 ; - un acide nucléique codant pour le domaine extracellulaire EC2 de la tétraspane humaine flanqué de ses deux domaines transmembranaires TM3 et TM4 de séquence SEQ ID No. 6, ou pour une protéine dont la séquence présente un pourcentage d'identité après alignement optimal d'au moins 90 %, de préférence 95 %, et 99 % avec la séquence SEQ ID No. 6 ; - un acide nucléique de séquence SEQ ID No. 5.

Parmi les vecteurs selon l'invention, on préfère les vecteurs caractérisés en ce qu'ils comportent les éléments permettant l'expression desdites séquences dans une cellule hôte et éventuellement la sécrétion desdites séquences hors de la cellule hôte. Par vecteur d'expression , on entend aussi bien des vecteurs d'expression à réplication autonome du type plasmide que des systèmes destinés à assurer l'intégration dans les cellules, mais ces vecteurs d'expression pourront être également des vecteurs d'expression de type viral ou bien même, lorsque l'on souhaite réaliser par exemple de la thérapie génique, de l'ADN nu. Parmi les vecteurs viraux, on préfère ceux dérivés de l'adénovirus, du virus associé à l'adénovirus (AAV), de rétrovirus, des lentivirus, et de préférence les dérivés de HIV, des poxvirus, du virus de l'herpès pour l'expression en système eucaryote. Parmi les vecteurs non viraux, on préfère les polynucléotides nus tels que l'ADN nu ou l'ARN nu selon la technique développée par la société VICAL, les chromosomes artificiels de levure (YAC, yeast artificial chromosome) pour l'expression dans la levure, les chromosomes artificiels de souris (MAC, mouse artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules murines et de manière préférée les chromosomes artificiels d'homme (HAC, human artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules humaines.

Une cellule qui contient un vecteur selon l'invention est aussi un objet de la présente invention. Ladite cellule est préférentiellement une cellule eucaryote ou procaryote et plus préférentiellement une cellule de mammifère.

La cellule peut ainsi être choisie parmi les cellules bactériennes mais également parmi les cellules de levure, de même que parmi les cellules végétales et animales ; de préférence, l'hôte cellulaire est une cellule de mammifères, mais également une cellule d'insectes dans laquelle on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre des baculovirus par exemple. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes d'acide nucléique inséré dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant l'expression de l'acide nucléique transfecté.

L'invention concerne encore un procédé de préparation d'une tétraspane, d'un de ses fragments ou d'une de ses protéines dérivées selon l'invention, qui comprend les étapes suivantes : a) la culture d'une cellule selon l'invention, notamment une cellule contenant une séquence d'ADN codant pour la tétraspane de séquence SEQ ID No. 2 ou pour son domaine extracellulaire de séquence SEQ ID No. 4 ou SEQ ID No. 6, dans un milieu de culture approprié à ladite cellule ; et b) la récupération de ladite tétraspane, dudit fragment ou de ladite protéine dérivée, notamment la tétraspane de séquence SEQ ID No. 2 ou son domaine extracellulaire de séquence SEQ ID No. 4 ou SEQ ID No. 6, à partir du milieu de culture et/ou de lysat desdites cellules cultivées.

Pour la mise en #uvre de ce procédé ladite cellule à l'étape a) est préférentiellement une cellule selon l'invention telle que définie ci-dessus.

La tétraspane recombinante, ses fragments ou ses protéines dérivées selon l'invention, notamment la tétraspane humaine de séquence SEQ ID No. 2, son domaine extracellulaire de séquence SEQ ID No. 4 ou la protéine SEQ ID No. 6 sont susceptibles d'être obtenus selon le procédé de préparation de l'invention et selon les techniques de production de protéines recombinantes connues de l'homme du métier. La présente invention concerne donc aussi la tétraspane, ses fragments ou ses protéines dérivées susceptibles d'être obtenus par la méthode ci-dessus présentée. Dans ce cas, l'acide nucléique utilisé est placé sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un

hôte cellulaire. Un système efficace de production de protéine recombinante nécessite de disposer d'un vecteur, par exemple d'origine plasmidique ou virale, et d'une cellule hôte compatible. Le vecteur doit comporter un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Il doit pouvoir être maintenu de façon stable dans la cellule et peut éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion des protéines traduites. Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les acides nucléiques codant pour la tétraspane, ses fragments ou ses protéines dérivées peuvent être insérés dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standards telles par exemple la transfection par précipitation au phosphate de calcium, la lipofection, l'électroporation, le choc thermique.

La tétraspane, ses fragments ou ses protéines dérivées selon l'invention obtenus comme indiqué ci-dessus, peuvent aussi bien se présenter sous forme glycosylée que non glycosylée et peuvent présenter ou non la structure tertiaire naturelle.

La tétraspane, ses fragments ou ses protéines dérivées selon l'invention peuvent être obtenus par synthèse chimique et peuvent ainsi comporter des acides aminés non naturels. De telles protéines sont également comprises dans l'invention.

Les procédés de purification de protéines recombinantes ou naturelles, telles que la tétraspane, ses fragments ou ses protéines dérivées selon la présente invention, sont connus de l'homme du métier. La tétraspane, ses fragments ou ses protéines dérivées selon l'invention, notamment recombinants, peuvent être purifiés à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immuno-affinité à l'aide d'anticorps mono- ou polyclonaux spécifiques, etc.. Une variante préférée consiste à produire une protéine recombinante fusionnée à une protéine porteuse (protéine chimère). L'avantage de ce système est qu'il permet une stabilisation et une diminution de la protéolyse du produit recombinant, une augmentation de la solubilité au cours de la renaturation in

vitro et/ou une simplification de la purification lorsque le partenaire de fusion possède une affinité pour un ligand spécifique.

Sous un autre aspect, la présente invention comprend les anticorps monoclonaux, polyclonaux, ou un de leurs fragments, dirigés spécifiquement contre la tétraspane, l'un de ses fragments ou l'une de ses protéines dérivées selon l'invention, notamment dirigés contre la tétraspane humaine de séquence SEQ ID No. 2, son domaine extracellulaire de séquence SEQ ID No. 4 ou la protéine de SEQ ID No. 6.

De préférence, l'anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments, est caractérisé en ce qu'il est capable de se fixer spécifiquement sur un des épitopes ou déterminant de la tétraspane humaine de séquence SEQ ID No. 2, notamment un épitope porté par un de ses domaines extracellulaires, tel que le domaine extracellulaire de séquence SEQ ID No. 4, ou porté par la protéine de séquence SEQ ID No. 6. Les déterminants épitopiques consistent habituellement en des groupes de molécules présentant des surfaces chimiquement actives telles que des acides aminés ou des chaînes latérales de sucres et ayant une structure tridimensionnelle spécifique et/ou une charge spécifique caractéristique.

Les anticorps monoclonaux pourront avantageusement être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite, par exemple, par Kohler et Milstein en 1975 (Kôhler et Milstein. Nature, 256 : 1975).

Les anticorps polyclonaux pourront être préparés, par exemple par immunisation d'un animal, en particulier une souris ou un lapin, avec la tétraspane, l'un de ses fragments ou l'une de ses protéines dérivées selon l'invention, notamment tétraspane humaine de séquence SEQ ID No. 2, son domaine extracellulaire de séquence SEQ ID No. 4 ou la protéine de SEQ ID No. 6, associé à un adjuvant de la réponse immunitaire, puis purification des anticorps spécifiques contenus dans le sérum des animaux immunisés sur une colonne d'affinité sur laquelle a préalablement été fixée la tétraspane, l'un de ses fragments ou l'une de ses protéines dérivées selon l'invention, ayant servi d'antigène.

Les anticorps de l'invention, ou leurs fragments pourront également être marqués par un marquage de type enzymatique, fluorescent ou radioactif.

Un tel anticorps pourrait non seulement être utile pour étudier et ainsi mieux connaître le rôle joué par la tétraspane humaine selon l'invention, en particulier au

niveau des interactions des molécules membranaires ; mais également pour d'autres applications comme les applications thérapeutiques ou diagnostics, ou pour le ciblage de composés capables de moduler l'activité biologique de la tétraspane humaine de l'invention.

Les fragments d'anticorps monoclonal ou polyclonal selon l'invention comprennent tout fragment dudit anticorps monoclonal capable de se fixer sur un épitope de la tétraspane, l'un de ses fragments ou l'une de ses protéines dérivées selon l'invention sur lequel se fixe l'anticorps monoclonal ou polyclonal dont ledit fragment est issu. Des exemples de tels fragments incluent en particulier des anticorps monoclonaux simple chaîne ou des fragments monovalents Fab ou Fab' et des fragments divalents tels que F (ab')2, possèdent la même spécificité de fixation que l'anticorps monoclonal ou polyclonal dont ils sont issus. Un fragment selon l'invention pourra également être un fragment Fv simple chaîne produit par des méthodes connues de l'homme de l'art et telles que décrites par exemple par Skerra et al. (Skerra et al. Science, 240 : 1988) et King et al. (King, et al. Biochemical J., 290 : 723- 729, 1991).

Selon la présente invention, des fragments d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux de l'invention peuvent être obtenus à partir des anticorps monoclonaux ou polyclonaux tels que décrits précédemment par des méthodes telles que la digestion par des enzymes, comme la pepsine ou la papaïne et/ou par clivage des ponts disulfures par réduction chimique. D'une autre manière, les fragments d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux compris dans la présente invention peuvent être synthétisés par des synthétiseurs automatiques de peptides tels que ceux fournis par la société Applied Biosystems, etc., ou peuvent être préparés manuellement en utilisant des techniques connues de l'homme de l'art et telles que décrites par exemple par Geysen et al.

(Geysen, et al. J. Immunol. Methods, 102 : 1978).

En général, pour la préparation d'anticorps monoclonaux, polyclonaux ou leurs fragments, on pourra se référer aux techniques qui sont en particulier décrites dans le manuel Antibodies (Harlow et al., Antibodies : Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications pp. 726,1988) ou à la technique de préparation à partir d'hybridomes décrite par Kohler et Milstein en 1975.

Les anticorps monoclonaux ou polyclonaux selon l'invention pourront par exemple être purifiés sur une colonne d'affinité sur laquelle a préalablement été immobilisée la tétraspane humaine, un domaine extracellulaire de ladite tétraspane, ou l'un de ses fragments comportant l'épitope reconnu spécifiquement par lesdits anticorps monoclonaux ou polyclonaux selon l'invention.

L'invention comprend en outre un anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les anticorps humanisés, chimériques ou anti-idiotypes.

Les anticorps monoclonaux humanisés selon l'invention ou leurs fragments peuvent être préparés par des techniques connues de l'homme de l'art (Carter et al., PNAS 89 : 4285-4289,1992 ; Mountain, et al. Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10 :
1992).

De tels anticorps monoclonaux humanisés selon l'invention sont préférés pour leur utilisation dans des méthodes thérapeutiques.

Les anticorps monoclonaux ou leurs fragments de type chimérique selon l'invention peuvent être réalisés en utilisant les techniques de recombinaison génétique.

L'invention comprend également un anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est marqué.

Les anticorps monoclonaux ou polyclonaux selon l'invention ou leurs fragments peuvent également, selon l'invention, se présenter sous forme d'anticorps marqués afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable.

Les anticorps monoclonaux marqués selon l'invention ou leurs fragments incluent par exemple des anticorps dits immunoconjugués qui peuvent être conjugués par exemple avec des enzymes telles que la peroxydase, la phosphatase alkaline, la ss-Dgalactosidase, la glucose oxydase, la glucose amylase, l'anhydrase carbonique, l'acétylcholinestérase, le lysozyme, la malate déhydrogénase ou la glucose-6 phosphate déhydrogénase ou par une molécule comme la biotine, la digoxigénine ou la 5-bromodésoxyuridine. Des marqueurs fluorescents peuvent être également conjugués aux anticorps monoclonaux ou leurs fragments de l'invention et incluent notamment la fluorescéine et ses dérivés, la rhodamine et ses dérivés, la GFP (GFP pour Green Fluorescent Protéine), le dansyl, l'umbelliférone etc.. Dans de tels conjugués, les anticorps monoclonaux de l'invention ou leurs fragments peuvent être préparés par des

méthodes connues de l'homme de l'art. Ils peuvent être couplés aux enzymes ou aux marqueurs fluorescents directement ou par l'intermédiaire d'un groupe espaceur ou d'un groupe de liaisons tel qu'un polyaldéhyde, comme le glutaraldéhyde, l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), l'acide diéthylènetriaminepentaacétique (DPTA), ou en présence d'agents de couplage tels que le périodate etc.. Les conjugués comportant des marqueurs de type fluorescéine peuvent être préparés par réaction avec un isothiocyanate.

D'autres conjugués peuvent inclure également des marqueurs chimioluminescents tels que le luminol et les dioxétanes ou des marqueurs bioluminescents tels que la luciférase et la luciférine.

Parmi les marqueurs pouvant être fixés sur l'anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention, on préfère également les marqueurs radioactifs tels que 14C, 36Cl, 57Co, 58Co, 51Cr, 152 Eu, 59Fe,3H, 125I, 131I, 32P, 35S, 75SE et 99mTc qui peuvent être détectés par des moyens connus tels que par exemple le compteur gamma ou à scintillations ou par autoradiographie.

L'invention a aussi pour objet un agoniste ou un antagoniste permettant respectivement d'augmenter ou de diminuer l'activité de la tétraspane, d'un de ses fragments ou d'une de ses protéines dérivées selon l'invention, notamment de la tétraspane humaine de séquence SEQ ID No. 2, de son domaine extracellulaire de séquence SEQ ID No. 4 ou de la protéine de SEQ ID No. 6.

L'invention concerne encore l'utilisation d'une tétraspane, l'un de ses fragments ou l'une de ses protéines dérivées selon l'invention, notamment tétraspane humaine de séquence SEQ ID No. 2, son domaine extracellulaire de séquence SEQ ID No. 4 ou la protéine de SEQ ID No. 6, d'un anticorps selon l'invention, d'un agoniste selon l'invention ou d'un antagoniste selon l'invention pour, ou pour la préparation d'une composition destinée à, moduler les interactions des molécules membranaires et/ou pour réguler la réponse immunitaire.

En effet, l'exemple 2 ci-après démontre une expression spécifique (par rapport aux autres cellules immunes) de cette nouvelle molécule au niveau des lymphocytes T.

Une utilisation particulièrement préférée est l'utilisation d'une protéine tétraspane, l'un de ses fragments ou l'une de ses protéines dérivées selon l'invention, notamment tétraspane humaine de séquence SEQ ID No. 2, son domaine extracellulaire

de séquence SEQ ID No. 4 ou la protéine de SEQ ID No. 6, ou d'un agoniste selon l'invention pour, ou pour la préparation d'une composition destinée à, diminuer, voire supprimer, la survie, la migration, la croissance ou la prolifération de cellules tumorales.

En effet, il a été constaté que la protéine tétraspane selon la présente invention était exprimée au niveau des cellules endothéliales, qui sont impliquées dans le processus d'angiogénèse et particulièrement dans la néovascularisation tumorale.

Un autre objet essentiel de l'invention est une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé choisi parmi les composés suivants : a) une protéine tétraspane, l'un de ses fragments ou l'une de ses protéines dérivées selon l'invention, notamment la tétraspane humaine de séquence SEQ ID No.

2, son domaine extracellulaire de séquence SEQ ID No. 4 ou la protéine de SEQ ID No.

6; b) un acide nucléique selon l'invention ; c) un anticorps selon l'invention ; d) un agoniste selon l'invention ; e) un antagoniste selon l'invention ; f) un vecteur selon l'invention ; et g) une cellule selon l'invention.

Cette composition pharmaceutique peut notamment être utilisée pour la prévention ou le traitement de maladies neurodégénératives, pour la régulation du système immunitaire, pour la régulation de l'angiogénèse ou pour la réparation ou la régénération du tissu nerveux.

Préférentiellement, elle est utilisée pour la prévention ou le traitement du cancer.

Les compositions pharmaceutiques comprenant un vecteur selon l'invention pourront en particulier être utilisées pour le transfert d'acide nucléique codant pour une protéine tétraspane, l'un de ses fragments ou l'une de ses protéines dérivées selon l'invention, notamment la tétraspane humaine de séquence SEQ ID No. 2, son domaine extracellulaire de séquence SEQ ID No. 4 ou la protéine de SEQ ID No. 6, dans une cellule donnée in vivo dans le cadre d'un traitement d'une maladie neurodégénérative par thérapie génique. Cette nouvelle technologie dont le champ d'application est vaste, permet d'envisager le traitement de maladies neurodégénératives pour lesquelles les

alternatives thérapeutiques classiques sont peu efficaces voire inexistantes et concerne aussi bien les maladies génétiques qu'acquises. L'approche la plus pratiquée consiste à utiliser un véhicule viral pour introduire l'acide nucléique thérapeutique dans la cellule à traiter et, en particulier, rétroviral et adénoviral. En effet, les virus ont développé des mécanismes sophistiqués pour traverser les membranes cellulaires, échapper à la dégradation au niveau des lysosomes et faire pénétrer leur génome dans les noyaux afin d'assurer l'expression du gène thérapeutique.

De plus en plus de méthodes de transfert de gènes font appel à des vecteurs non viraux. D'autres méthodes de transfert de gènes peuvent être employées comme par exemple la délivrance de l'acide nucléique thérapeutique au moyen de vecteurs synthétiques, tels que les lipides cationiques qui interagissent spontanément avec l'acide nucléique pour former des complexes chargés positivement capables de fusionner avec les membranes cellulaires anioniques et faire pénétrer l'acide nucléique qu'ils transportent (voir par exemple Behr, Bioconjugate Chemistry (1994) 5:382). Enfin, une approche encore plus simple peut également être envisagée par administration directe d'ADN nu codant pour une protéine tétraspane, l'un de ses fragments ou l'une de ses protéines dérivées selon l'invention, notamment la tétraspane humaine de séquence SEQ ID No. 2, son domaine extracellulaire de séquence SEQ ID No. 4 ou la protéine de SEQ ID No. 6.

De telles compositions pharmaceutiques comprenant un vecteur ou système de vecteurs, selon l'invention pourront également être utilisées pour le transfert d'acide nucléique codant pour une protéine tétraspane, l'un de ses fragments ou l'une de ses protéines dérivées selon l'invention, notamment la tétraspane humaine de séquence SEQ ID No. 2, son domaine extracellulaire de séquence SEQ ID No. 4 ou la protéine de SEQ ID No. 6, dans une cellule donnée ex vivo dans le cadre d'un traitement de maladie neurodégénérative, en particulier pour la réparation ou la régénération de neurones ou tissu neuronal, qui seront ensuite implantés ou réimplantés dans le patient à traiter (xénogreffe ou allogreffe).

Une forme de réalisation préférée selon l'invention est une composition pharmaceutique pour la prévention ou le traitement des métastases, qui comprend au moins un composé choisi parmi les composés suivants :

a) une protéine tétraspane, l'un de ses fragments ou l'une de ses protéines dérivées selon l'invention, notamment la tétraspane humaine de séquence SEQ ID No.

6; b) un acide nucléique selon l'invention ; c) un agoniste selon l'invention ; d) un vecteur selon l'invention ; et e) une cellule selon l'invention.

La quantité de composés comprise dans les compositions pharmaceutiques selon la présente invention et nécessaire pour une thérapie efficace dépendra de différents facteurs tels que le mode d'administration, la partie du corps ciblée, l'état physiologique du patient, de l'administration d'autres médicaments, des éventuels effets secondaires, etc.. Le dosage pour de telles préventions ou traitements thérapeutiques devra être réalisé de manière à optimiser sa sécurité et son efficacité. En général, des modèles animaux peuvent être utilisés pour déterminer les quantités efficaces des composés entrant dans les compositions pharmaceutiques selon la présente invention pour le traitement ou la prévention des pathologies particulières. Ces méthodes sont en particulier discutées dans les ouvrages tels que Gilman et al. (Goodman and Gilman's : The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed. Pergamon Press, 1990) et Remington's Pharmaceutical Sciences (17th ed., 1990) pour des méthodes d'administration telles que les méthodes par voie orale, intraveineuse, intrapéritonale, intramusculaire ou transdermique. Les excipients pharmaceutiquement acceptables incluent notamment l'eau, les solutions salines, les tampons ou tout autre composé décrit par exemple dans l'Index de Merck.

L'invention concerne encore une trousse de diagnostic comprenant au moins : - un anticorps monoclonal, polyclonal selon l'invention ou un de leurs fragments ; ou - un acide nucléique selon l'invention permettant de réaliser une PCR afin de déterminer quantitativement et/ou qualitativement la présence ou non de la tétraspane.

Ainsi, entre également dans le cadre de l'invention, une trousse ou nécessaire de diagnostic comprenant un anticorps selon l'invention, notamment pour le dosage (dont la détection) ou l'identification de la tétraspane, l'un de ses fragments ou l'une de ses

protéines dérivées selon l'invention, notamment la tétraspane humaine de séquence SEQ ID No. 2, son domaine extracellulaire de séquence SEQ ID No. 4 ou la protéine de SEQ ID No. 6, dans un échantillon biologique, de préférence in vitro.

En particulier, une trousse de diagnostic caractérisée en ce qu'elle comprend les éléments suivants : - un anticorps polyclonal, monoclonal ou un de leurs fragments selon l'invention, le cas échéant marqué ; - le cas échéant, un réactif pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la réaction immunologique ; - le cas échéant, un réactif permettant la détection des complexes antigèneanticorps produits par la réaction immunologique, ce réactif pouvant également porter un marqueur, ou être susceptible d'être reconnu à son tour par un réactif marqué, plus particulièrement dans le cas où ledit anticorps monoclonal, polyclonal ou un de leurs fragments n'est pas marqué.

L'utilisation d'un anticorps monoclonal, polyclonal, ou un de leurs fragments pour le dosage ou l'identification in vitro d'une tétraspane, l'un de ses fragments ou l'une de ses protéines dérivées selon l'invention, notamment la tétraspane humaine de séquence SEQ ID No. 2, son domaine extracellulaire de séquence SEQ ID No. 4 ou la protéine de SEQ ID No. 6, dans un échantillon biologique est un autre objet de l'invention.

Les anticorps monoclonaux, polyclonaux ou leurs fragments selon l'invention, peuvent ainsi être utilisés pour l'identification ou la localisation, notamment tissulaire ou cellulaire, et/ou le dosage de tétraspane, l'un de ses fragments ou l'une de ses protéines dérivées selon l'invention, notamment la tétraspane humaine de séquence SEQ ID No. 2, son domaine extracellulaire de séquence SEQ ID No. 4 ou la protéine de SEQ ID No. 6, ladite utilisation étant comprise dans l'invention.

Les anticorps monoclonaux, polyclonaux ou leurs fragments selon l'invention constituent également un moyen d'analyse de l'expression de la tétraspane, l'un de ses fragments ou l'une de ses protéines dérivées selon l'invention, dans des échantillons biologiques (fluides ou sur des coupes de tissus spécifiques), par exemple par immunofluorescence, par marquage enzymatique, radioactif ou à l'or. Ils permettent notamment de mettre en évidence et de quantifier la présence spécifique normale ou

anormale de protéine tétraspane selon l'invention dans les tissus ou prélèvements biologiques, ce qui les rend utiles pour l'identification et la localisation de protéine tétraspane selon l'invention, pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de protéine tétraspane selon l'invention mais également pour le suivi de l'évolution de méthodes de prévention ou de traitement de pathologie nécessitant ladite détection ou ledit dosage.

Plus généralement, les anticorps monoclonaux, polyclonaux ou leurs fragments selon l'invention peuvent être avantageusement mis en oeuvre dans toute situation où l'expression de tétraspane, l'un de ses fragments ou l'une de ses protéines dérivées selon l'invention, notamment la tétraspane humaine de séquence SEQ ID No. 2, son domaine extracellulaire de séquence SEQ ID No. 4 ou la protéine de SEQ ID No. 6, doit être observée de manière qualitative et/ou quantitative.

De préférence, l'échantillon biologique est constitué par un fluide biologique, tel que le sérum, le sang total, des cellules, un échantillon de tissu ou des biopsies d'origine humaine.

Toute procédure ou test classique peut être mise en oeuvre pour réaliser une telle détection et/ou dosage. Ledit test peut être un test par compétition ou par sandwich, ou tout test connu de l'homme de l'art dépendant de la formation d'un complexe immun anticorps-antigène. Suivant les applications selon l'invention, l'anticorps monoclonal, polyclonal ou un de leurs fragments peut être immobilisé ou marqué. Cette immobilisation peut être réalisée sur de nombreux supports connus de l'homme de l'art.

Ces supports peuvent notamment inclure le verre, le polystyrène, le polypropylène, le polyéthylène, le dextran, le nylon, ou des celluloses naturelles ou modifiées. Ces supports peuvent être soit solubles ou insolubles.

A titre d'exemple, une méthode préférée met en jeu des processus immunoenzymatiques selon la technique ELISA, par immunofluorescence, ou radioimmunologique (RIA) ou équivalent.

Ainsi, l'invention comprend également un procédé pour la détection et/ou le dosage de la tétraspane ou d'un domaine extracellulaire de la tétraspane selon l'invention dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :

a) mise en contact de l'échantillon biologique (tissu ou fluide biologique) avec un anticorps monoclonal, polyclonal ou un de leurs fragments selon l'invention (dans des conditions permettant une réaction immunologique entre lesdits anticorps et ladite tétraspane, l'un de ses fragments ou l'une de ses protéines dérivées selon l'invention, notamment la tétraspane humaine de séquence SEQ ID No. 2, son domaine extracellulaire de séquence SEQ ID No. 4 ou la protéine de SEQ ID No. 6 ; b) mise en évidence du complexe antigène-anticorps éventuellement formé.

L'invention comprend également l'utilisation d'un acide nucléique selon l'invention capable de s'hybrider avec une séquence d'ADN, et/ou d'ARN correspondant, du gène codant pour la tétraspane, l'un de ses fragments ou l'une de ses protéines dérivées selon l'invention, notamment la tétraspane humaine de séquence SEQ ID No. 2, son domaine extracellulaire de séquence SEQ ID No. 4 ou la protéine de SEQ ID No. 6, pour le dosage ou l'identification in vitro d'une telle séquence d'ADN, et/ou d'ARN correspondant, dans un échantillon biologique est aussi un mode de réalisation de l'invention.

Ces différentes utilisations pourront notamment permettre de pronostiquer la sévérité d'une tumeur.

Un objet de l'invention concerne encore un mammifère, excepté l'homme, notamment en tant que modèle animal, comprenant un acide nucléique ou une cellule transformée selon l'invention, notamment caractérisé en ce que l'un au moins des allèles du gène correspondant à l'homologue du gène codant pour la tétraspane humaine de séquence SEQ ID No. 2 dudit animal n'est pas fonctionnel ou est surexprimé.

Parmi les mammifères selon l'invention, on préférera des animaux tels que les souris, les rats ou les lapins, dont le gène correspondant à l'homologue du gène codant pour la tétraspane humaine de séquence SEQ ID No. 2 porté par l'un au moins des deux allèles dudit animal est muté de telle sorte que la protéine codée par un tel gène n'est pas exprimée ou n'est pas fonctionnelle.

Parmi les modèles animaux plus particulièrement intéressants ici, on trouve notamment : - les animaux transgéniques présentant un déficit de la protéine homologue à la tétraspane humaine de séquence SEQ ID No. 2 d'un des composants du LSR. Ils sont obtenus par exemple par recombinaison homologue sur cellules souches embryonnaires,

transfert de ces cellules souches à des embryons, sélection des chimères affectées au niveau des lignées reproductrices, et croissance desdites chimères ; - les souris transgéniques surexprimant ledit gène homologue. Les souris sont obtenues par transfection de copies multiples dudit gène sous contrôle d'un promoteur puissant de nature ubiquitaire, ou sélectifd'un type de tissu ; - les animaux (de préférence souris) transgéniques rendus déficients pour un desdits gènes portés par les deux allèles, par inactivation à l'aide du système LOXP/CRE recombinase ou de tout autre système d'inactivation de l'expression d'un gène à un âge précis de l'animal.

Ainsi, un tel modèle animal pourra notamment servir à cribler des molécules pour la prévention ou le traitement de maladies neurodégénératives, pour la réparation ou la régénération du tissu nerveux, pour la prévention ou le traitement du cancer et préférentiellement pour la prévention ou le traitement des métastases.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et la figure dont la légende est donnée ci-après.

Légende de la figure Figure : Expression de la tétraspane au niveau des cellules endothéliales et des lymphocytes T
Electrophorèse en gel d'agarose à 1 % mettant en évidende l'expression de l'ARNm codant pour la neurospanine dans différents types de cellules humaines.

L'expression de l'ARNm codant pour la neurospanine a été analysée par RTPCR dans les lymphocytes T, les cellules LAK, les cellules endothéliales, les cellules B, les monocytes et les neutrophiles. Le contrôle d'intégrité et de qualité de l'ADNc utilisé dans les expériences a été évaluée en analysant l'expression de l'ARNm codant pour la GAPDH.

Exemple 1 : Clonage de l'ADNc codant pour la nouvelle tétraspane humaine
Dans le but d'identifier de nouvelles molécules exprimées sélectivement à la surface des cellules humaines, des séquences pouvant contenir un motif transmembranaire ont été recherchées dans les banques de données EST (Expressed

Sequence Tag) humaines et particulièrement dans la banque db EST, disponible à l'adresse internet "www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/". Cette banque contient 1856102 différents EST.

L'identification de séquences ESTs humaines codant pour des motifs transmembranaires potentiels a été réalisée à l'aide du logiciel TopPred 2 (logiciel de prédiction de protéines membranaires) qui est disponible sur internet (http://www.biokemi.su.se/TopPred2).

Parmi les 3000 séquences obtenues présentant le plus haut score, l'EST #AA411274 a été sélectionné. La séquence nucléotidique disponible (http: //www.ncbi.nih.nlm.gov) présente un cadre de lecture ouvert de 109 acides aminés avant un codon stop. Son produit de traduction présente un motif transmembranaire (position 69-91). La séquence peptidique présente 50 % d'idendité avec une protéine appelée neurospanine dont la séquence a été clonée chez le poulet. La neurospanine est une molécule appartenant à la superfamille des tétraspanes. La séquence nucléotidique codante de l'EST #AA411274 présente 85 % d'identité avec la séquence de la neurospanine. Basé sur les caractéristiques structurales des tétraspanes, il apparaît que le domaine protéique 69-91 correspond au 4ème domaine transmembranaire (EC4) des tétraspanes.

Des homologues de la séquence #AA411274 ont ensuite été recherchés dans la banque de données EST humaines. Huit nouvelles séquences nucléotidiques ont ainsi été sélectionnées sur la base d'une homologie avec la séquence #AA411274 (clones #AA132131, AA132070, T85007, AA031888, R60397. 1, AA031808, AA329968 et AA324463). Les clones ont été obtenus auprès de Research Genetics (New York, NY).

Les clones bactériens ont été sélectionnés à l'aide de l'antibiotique approprié. L'ADN plasmidique a été purifié à l'aide d'un kit commercial (Midiprep DNA extraction kit, Qiagen, Germany) et séquence en utilisant le kit ABI Prism BigDye Terminator DNA kit (Perkin Elmer Applied Biosystems, Warrington, UK) en suivant les recommandations du fournisseur. La séquence a été analysée avec un séquenceur automatique ABI Prism 377 (Perkin Elmer Applied Biosystems). Les séquences ont été analysées grâce au logiciel d'analyse de séquence Sequencher (Genecodes, Ann Arbor, MI). Après alignement des différentes séquences, un fragment d'ADN de 1345 paires de bases présentant un cadre ouvert de lecture de 747 nucléotides contenant un codon

d'initiation et un codon stop a été défini. Ce fragment a été amplifié par PCR à l'aide d'amorces spécifiques correspondant aux extrémités 5' et 3' de la séquence alignée. La séquence d'ADNc complète a été obtenue par une série de cycles d'amplification par PCR de l'extrémité 5' (5'RACE) l'aide de kits commerciaux. Les matrices d'ADN étaient de l'ADNc préparé à partir de moelle osseuse humaine (Marathon-Ready cDNA ; Clontech). La prédiction d'un peptide signal a été définie à l'aide d'un logiciel disponible sur le Web (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignaIP).

Résultats
Par analyse des banques de données EST humaines disponibles, un clone d'ADNc (#AA411274) codant pour une molécule présentant un motif transmembranaire a été sélectionné. La séquence d'ADNc obtenue est longue de 1345 paires de bases, voir séquence SEQ No 1. La séquence protéique prédite contient 248 acides aminés et présente un poids moléculaire de 27,5 kDa et un point isoélectrique de 4. 4. présente 85 % d'homologie avec la neurospanine de poulet (appartenant à la superfamille des tétraspanes). Le codon d'initiation est à la position nt 281 et le codon stop est localisé au nucléotide nt 1015. Le produit de traduction présente : - 4 domaines transmembranaires prédits (TM1-4) localisés aux positions aal3- 36, aa50-73, aa83-107 et aa218-243 de la séquence SEQ ID No. 2 ; - 2 domaines extracellulaires prédits (EC1 et EC2) localisés aux positions aa37- 49 et aal08-217 de la séquence SEQ ID No. 2.

La plus grande diversité est contenue dans la boucle externe EC2 (62 % d'identité).

Le peptide signal est en position aal-32 de la séquence SEQ ID No. 2.

Exemple 2 : Mise en évidence de l'expression de la tétraspane au niveau des cellules endothéliales et des lymphocytes T.

L'expression de l'ARNm codant pour la neurospanine a été évaluée par RT-PCR dans les types cellulaires suivants : lymphocytes B, lymphocytes T, monocytes, neutrophiles, cellules T activées par de l'IL-2 (LAK ou Lymphokine Activcated Killer cells) et cellules endothéliales. Brièvement, les culots cellulaires sont repris dans un tampon d'extraction contenant de l'isothiocyanate de guanidium (Trizol ; Life

technologies) à raison de 1 ml pour 10 x 106 cellules. Après deux extractions au phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25/24/1), les ARNs totaux sont précipités par ajout d'un volume égal d'isopropanol (18 heures à -20 C) puis collectés par centrifugation (13. 000 rpm, 30 min, 4 C). Le culot est rincé avec de l'éthanol 70 %.

L'ARN total est resuspendu dans de l'eau contenant un inhibiteur de Rnase (RNAsin ; Promega, Madison, WI), dénaturé par chauffage (5 min à 65 C) puis quantifié par spectrophotométrie (#=260 nm). Les ADNs complémentaires (ADNc) sont synthétisés à l'aide d'un kit commercial (First strand cDNA synthesis, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suède) sont rétrotranscrits. La transcription réverse (2 g d'ARN total) est réalisée dans le tampon Tris-HCl 10 mM pH 8,3 contenant 300 ug/ml d'amorce oligodT (5'-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAA(T)i8-3' : SEQ ID No. 7), 10 M de dithiothréitol (DTT), 5 mM des 4 nucléotides et 1 U/ml de réverse transcriptase recombinante. Le mélange réactionnel est incubé pendant 1 heure à 37 C et la réaction est stoppée par chauffage à 65 C pendant 5 minutes. Le mélange réactionnel pour la RT-PCR est le suivant : 1 l d'ADNc (correspondant à 25 ng d'ARN total), 25 pmoles d'amorce (5'-CGGGGCCTGCCTGCTGGCCATCGGCATC-3' : SEQ ID No. 8 et 5'CCCTGGTAGTGCTTGGTGAGCTCC-3' : SEQ ID No. 9), dNTP 200 M, MgCl2 1,5 mM, Tris-HCl 10 mM pH 8,3, KCI 50 mM et 0,4 unité de Taq polymérase (Perkin Elmer). Les conditions de PCR sont : 5 min à 95 C, 30 cycles : 1 min à 94 C, 1 min à 55 C et 1 min à 72 C, une extension finale de 5 min à 72 C. Les échantillons sont repris dans le tampon d'échantillon (bleu de bromophénol 0,25 %, sucrose 40 %) et analysés par électrophorèse en gel d'agarose 1 % contenant du bromure d'éthidium. Après migration, les échantillons sont visualisés par illumination du gel aux UV. L'intégrité de l'ARN est analysée en évaluant l'expression de l'ADNc codant pour la molécule actine p à l'aide des amorces suivantes : 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' : SEQ ID No.

10 et 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' : SEQID No. 11.

La figure montre que la neurospanine est exprimée dans les types cellulaires suivants : lymphocytes T, cellules T activées par de l'IL-2 (LAK ou Lymphokine Activated Killer cells) et cellules endothéliales.

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Claims

REVENDICATIONS

1. Protéine tétraspane humaine isolée de séquence SEQ ID No. 2, l'un de ses fragments d'au moins 5 acides aminés ou l'une de ses protéines dérivées.

2. Protéine selon la revendication 1 de séquence SEQ ID No. 4, ou une de ses protéines dérivées.

3. Protéine selon la revendication 1 de séquence SEQ ID No. 6, ou une de ses protéines dérivées.

4. Acide nucléique isolé dont la séquence code pour une protéine selon l'une des revendications 1 à 3 ou son acide nucléique de séquence complémentaire.

5. Acide nucléique selon la revendication 4 dont la séquence est choisie parmi les séquences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, leur séquence complémentaire et la séquence de leur ARN correspondant.

6. Acide nucléique d'au moins 15 nucléotides capable de s'hybrider avec un acide nucléique selon l'une des revendications 4 et 5.

7. Utilisation in vitro d'un acide nucléique selon l'une des revendications 4 à 6 comme amorce ou sonde.

8. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 4 à 6 comme oligonucléotide sens ou antisens pour la préparation d'une composition pharmaceutique.

9. Vecteur caractérisé en ce que ledit vecteur contient un acide nucléique selon l'une des revendications 4 à 6.

10. Vecteur selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit vecteur contient un acide nucléique choisi parmi : a) un acide nucléique codant pour une protéine de séquence SEQ ID No. 2 ou pour une protéine dont la séquence présente un pourcentage d'identité après alignement optimal d'au moins 90 % avec la séquence SEQ ID No. 2 ; b) un acide nucléique de séquence SEQ ID No. 1 ; c) un acide nucléique codant pour une protéine de séquence SEQ ID No. 4, ou pour une protéine dont la séquence présente un pourcentage d'identité après alignement optimal d'au moins 90 % avec la séquence SEQ ID No. 4 ; d) un acide nucléique de séquence SEQ ID No. 3 ;

e) un acide nucléique codant pour une protéine de séquence SEQ ID No. 6, ou pour une protéine dont la séquence présente un pourcentage d'identité après alignement optimal d'au moins 90 % avec la séquence SEQ ID No. 6 ; et f) un acide nucléique de séquence SEQ ID No. 5.

11. Cellule, caractérisée en ce qu'elle contient un vecteur selon la revendication 9 ou 10.

12. Cellule selon la revendication 11, caractérisée en ce que ladite cellule est une cellule eucaryote ou procaryote.

13. Cellule selon la revendication 12, caractérisée en ce que ladite cellule est une cellule de mammifère.

14. Procédé de préparation d'une protéine selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la culture d'une cellule selon l'une des revendications 11à 13, dans un milieu de culture approprié à ladite cellule ; b) la récupération de ladite protéine à partir du milieu de culture et/ou de lysat desdites cellules cultivées.

15. Anticorps monoclonaux, polyclonaux, ou un de leurs fragments, dirigés spécifiquement contre une protéine selon l'une des revendications 1 à 3.

16. Agoniste permettant d'augmenter l'activité d'une protéine selon l'une des revendications 1 à 3.

17. Antagoniste permettant de diminuer l'activité d'une protéine selon l'une des revendications 1 à 3.

18. Utilisation d'une protéine selon l'une des revendications 1 à 3, d'un anticorps tel que défini dans la revendication 15, d'un agoniste tel que défini dans la revendication 16 ou d'un antagoniste tel que défini dans la revendication 17 pour la préparation d'une composition destinée à moduler les interactions des molécules membranaires et/ou pour réguler la réponse immunitaire.

19. Utilisation d'une protéine selon l'une des revendications 1 à 3 ou d'un agoniste tel que défini dans la revendication 16 pour la préparation d'une composition destininée à diminuer, supprimer la survie, la migration, la croissance ou la prolifération de cellules tumorales.

20. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé choisi parmi les composés suivants : a) une protéine selon l'une des revendications 1 à 3 ; b) un acide nucléique selon l'une des revendications 4 à 6 ; c) un anticorps selon la revendication 15 ; d) un agoniste selon la revendication 16 ; e) un antagoniste selon la revendication 17 ; f) un vecteur selon l'une des revendications 9 et 10 ; g) une cellule selon l'une des revendications 11 à 13.

21. Composition pharmaceutique selon la revendication 20, pour la prévention ou le traitement de maladies neurodégénératives, à la régulation du système immunitaire, à la régulation de l'angiogénèse ou à la réparation ou la régénération du tissu nerveux.

22. Composition pharmaceutique selon la revendication 20, pour la prévention ou le traitement du cancer.

23. Composition pharmaceutique pour la prévention ou le traitement des métastases caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé choisi parmi les composés suivants : a) une protéine selon l'une des revendications 1 à 3 ; b) un acide nucléique selon l'une des revendications 4 à 6 ; c) un agoniste selon la revendication 16 ; d) un antagoniste selon la revendication 17 ; e) un vecteur selon l'une des revendications 9 et 10 ; et f) une cellule selon l'une des revendications 11 à 13.

24. Trousse de diagnostic comprenant au moins : - un anticorps monoclonal, polyclonal, ou un de leurs fragments selon la revendication 15 ; ou - un acide nucléique selon l'une des revendications 4 à 6.

25. Utilisation d'un anticorps monoclonal, polyclonal, ou un de leurs fragments selon la revendication 15 pour le dosage ou l'identification in vitro d'une protéine selon l'une des revendications 1 à 3 dans un échantillon biologique.

26. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 4 à 6 pour le dosage ou l'identification in vitro d'une séquence du gène codant pour une protéine selon l'une des revendications 1 à 3 dans un échantillon biologique.

27. Utilisation selon la revendication 25 ou 26 pour pronostiquer la sévérité d'une tumeur.

28. Mammifère, excepté l'homme, caractérisé en ce qu'il contient une cellule selon l'une des revendications 11à 13.

29. Mammifère selon la revendication 28, caractérisé en ce que le gène correspondant à l'homologue du gène codant pour la tétraspane humaine de séquence SEQ ID No. 2 porté par l'un au moins des deux allèles dudit animal est muté ou inactivé de telle sorte que la protéine codée par un tel gène n'est pas exprimée ou n'est pas fonctionnelle.

30. Mammifère en tant que modèle animal selon la revendication 28 ou 29, caractérisé en ce que ledit mammifère est une souris.