FR2828210A1 - Acide nucleique regulateur permettant l'expression d'un polynucleotide d'interet specifiquement dans l'endothelium d'une graine de plante, et ses applications - Google Patents
Acide nucleique regulateur permettant l'expression d'un polynucleotide d'interet specifiquement dans l'endothelium d'une graine de plante, et ses applications Download PDFInfo
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Abstract
Un objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant des signaux de régulation permettant l'expression d'un polynucléotide d'intérêt, spécifiquement dans l'endothélium et / ou l'albumen d'une graine de plante, lorsque ce polynudéotide d'intérêt est placé sous le contrôle de ces signaux de régulation, ledit acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence SEQ ID Ndegre1, ou avec un fragment d'au moins 200 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID Ndegre1.
Description
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Domaine de l'invention L'invention se rapporte au domaine de l'amélioration contrôlée de qualité agronomique de plantes variées, incluant les plantes à fruits et les céréales de grande culture. Elle est relative à l'expression ciblée de polynucléotides et/ou de polypeptides d'intérêt spécifiquement dans certains tissus de la plante, et plus spécifiquement dans l'endothélium et/ou l'albumen d'une graine de plante.
Etat de la technique La testa, aussi désignée téguments de la graine est un tissu essentiel pour le développement et la viabilité de la graine. Lorsque la graine est entièrement mature, la testa constitue une couche protectrice des parties internes de celle-ci. Pendant le développement de la graine, la testa est un tissu d'importation de substances nutritives vitales pour le développement de l'embryon. La graine se comporte comme un parasite vis-à-vis de la plante mère, en ce qui concerne sa nutrition. Tous les matériaux nutritifs bruts nécessaires à la croissance de la graine doivent être importés de la plante mère. Dans les graines des plantes dicotylédones, le tissu vasculaire entre dans la graine par le funiculus, puis s'anastomose dans le tissu de la testa de la graine. Il n'existe aucune connexion de tissu vasculaire entre la testa de la graine et l'embryon. Ainsi, toutes les substances nutritives libérées dans la graine en développement doivent être tout d'abord importées à l'intérieur de la testa, avant d'être libérées par diffusion dans l'embryon.
Il existe un besoin dans l'état de la technique de faire exprimer des gènes d'intérêt spécifiquement dans la testa, en vue d'en modifier la composition, par exemple pour modifier la composition en tannins et en fibres ou encore modifier l'équilibre hormonal.
Contextes agronomique et industriel : D'un point de vue agronomique, les téguments (testa) interviennent dans de nombreux aspects déterminant la qualité de la graine, dont les plus importants sont : - la nutrition de l'embryon (Weber et al., 1996)
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- la taille de la graine (Léon-Kloosterziel et al., 1994 ; Weber et al., 1996 ; Alonso-Blanco et al., 1999) - le contrôle de la dormance, de la germination (obstacle physique à la sortie de la radicule, imperméabilité à l'eau et à l'oxygène) (Werker, 1980 ; Kelly et ai., 1992 ; Debeaujon et aL, 2000 ; Debeaujon et Koornneef, 2000) et de la qualité de la plantule (Kantar et al., 1996) - la longévité de la graine, par limitation du stress oxydant dû à l'oxygène de l'air et protection contre les pathogènes et les UV (Mohamed-Yasseen et al., 1994).
L'influence de la testa sur la dormance 1 germination et sur la protection de l'embryon est principalement due à la présence de grandes quantités de flavonoïdes (majoritairement tannins et flavonols) localisés dans l'endothélium, qui est la couche cellulaire la plus interne de la testa (Scalbert, 1991 ; Shirley et al., 1995 ; Winkel-Shirley, 1998 ; Debeaujon et al., 2000).
Mais il est probable que des composés comme la lignine et la cellulose jouent un rôle non négligeable dans la rigidité de ce tissu. Moduler qualitativement et quantitativement la composition de la testa en ces différents composés pourrait présenter un intérêt dans la modification des caractéristiques métaboliques et structurales de ce tissu. Une approche compémentaire consisterait à moduler au niveau de la testa les équilibres des différentes hormones intervenant dans le développement de la graine (gibbérellines ou GAs ; acide abscissique ou ABA, éthylène ; auxines ; cytokinines ; brassinostéroïdes ; jasmonates, comme montré pour l'acide abscissique dans l'embryon (Phillips et al., 1997). On peut également envisager de faire synthétiser au niveau de la testa des substances qui n'y sont pas naturellement présentes mais qui conféreraient à la graines une protection supplémentaire, en particulier contre les pathogènes.
D'un point de vue nutritionel (animaux) et industriel, le contrôle de la composition de la testa représente également un atout majeur. Si l'on prend l'exemple des flavonofdes, l'obtention de variétés de colza à graines jaunes (sans tannins) permettrait une meilleure valorisation des tourteaux tirés de la graine après extraction de l'huile ; ces variétés produisent également plus d'huile et moins de fibres que les variétés à graines noires ou brunes. Ces dernières variétés, riches en tannins, conduisent à des tourteaux plus
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pauvres en protéines et à digestibilité réduite (Stringam et al., 1974 ; Theander et al., 1977 ; Mitaru et al., 1982 ; Shirzadegan et Röbbelen, 1985 ; Simbaya et al., 1995 ; Jonsson, 1997 ; Baetzel et al., 1999). Des variétés d'orge sans tannins sont recherchées pour la fabrication de la bière, car ces flavonoïdes causent la précipitation des protéines et donc l'opacification du produit fini (Jende-Strid, 1993). Une seconde alternative à l'absence totale de flavonoïdes est de remplacer les tannins par des anthocyanes et/ou surexprimer les gènes de biosynthèse de flavonols, qui sont deux autres catégories de flavonoïdes, permettrait de bénéficier des propriétés protectrices de flavonoïdes (Rice-Evans et al., 1997) et de s'affranchir des inconvénients des tannins. Finalement, enrichir la testa en anthocyanes permettrait d'augmenter la richesse du produit en antioxydants et ainsi améliorer sa capacité nutritionnelle.
L'intérêt de pouvoir moduler la composition en flavonoïdes (type de produit final) ainsi que leur quantité (augmentation ou réduction) apparaît clairement à travers ces exemples. La même approche peut être envisagée pour d'autres composants comme la lignine, la cellulose ou les équilibres hormonaux. Dans ce contexte, un promoteur spécifique de la testa permettrait de modifier exclusivement cet organe, sans affecter les caractéristiques végétatives de la plante, ce qui est primordial vu le rôle protecteur des flavonoïdes.
Enfin, étant donné le rôle important de la testa dans le développment de la graine, on peut penser que sa modification, par exemple par la surexpression de gènes impliqués dans la biosynthèse d'hormones, la production d'une toxine ou controllant la division cellulaire, dans ce tissu d'origine maternelle (Varoquaux et al., 2000) pourrait conduire à une réduction de la taille 1 nombre voire à une disparition des graines qui est recherchée pour des fruits de type raisin, tomate, concombre, pastèque, melon etc.
La testa étant un organe de protection de l'embryon de la graine, il peut être désirable d'affecter son développement dans le but d'obtenir des plantes ne possédant pas de graines fertiles ou encore de plantes dépourvues ou pratiquement dépourvues de graines. L'obtention de plantes incapables de produire des graines revêt un intérêt considérable dans le
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domaine des plantes à fruits. En effet, des fruits dépourvus de graines possèdent des qualités gustatives supérieures à celles observées pour des fruits identiques dans lesquels les graines sont présentes. De plus, les graines sont souvent dures et ont un goût amer. Dans certains cas, comme pour le raisin, la consommation des graines peut entraîner des troubles digestifs. En outre, en l'absence de graines, les cavités naturelles dans lesquelles elles sont normalement présentes sont remplacées par le tissu comestible du fruit, qui rend un fruit dépourvu de graines beaucoup plus attractif pour le consommateur.
Enfin, il a été observé qu'un fruit dépourvu de graines se conserve plus longtemps, du fait que les graines produisent des hormones provoquant la sénescence. Cet effet a pu être observé chez le melon d'eau, dans lequel les graines sont à l'origine de la détérioration du fruit.
Selon un autre aspect, l'obtention de plantes ou de fruits dépourvus de graines possède un intérêt supplémentaire dans la culture de plantes transgéniques, car dans ce cas, on évite toute dissémination de graines génétiquement modifiées dans l'environnement.
A la connaissance du demandeur, un seul promoteur capable de diriger l'expression d'un gène d'intérêt spécifiquement dans la testa a été isolé à ce jour. Au cours de travaux de sélection à grande échelle de séquences à activité de promoteur dans le génome du tabac, FOBERT et al.
(1994) ont isolé et caractérisé un fragment d'ADN d'environ 3 kb capable d'induire l'expression d'un gène rapporteur dans la testa de la graine, dont l'activité maximale a été rapportée à 10 jours après l'anthèse (floraison).
Toutefois, selon ces auteurs, ce promoteur originaire du tabac serait un promoteur cryptique, puisque la région génomique dans laquelle il a été localisé ne comporte aucun cadre de lecture ouvert à proximité de celui-ci. Mais surtout, le promoteur décrit par FOBERT et al. n'est pas spécifique de l'endothélium.
De même, le promoteur du gène FBP7 isolé à partir du génome du pétunia a été utilisé pour contrôler l'expression du gène de la barnase dans les ovules et dans les graines en développement (Colombo et al., 1997). En plaçant un gène marqueur sous le contrôle du promoteur de FBP7, ces auteurs ont observé une expression du gène rapporteur dans la testa de la graine en développement à l'exception de la couche cellulaire externe, ainsi
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que dans l'épiderme du placenta. Le promoteur du gène FBP7 n'est pas spécifique de la testa, puisqu'il est actif aussi dans l'épiderme du placenta.
Le demandeur s'est attaché à la caractérisation de nouvelles séquences promotrices fonctionnelles dans une plante et capables de diriger l'expression d'une ou plusieurs séquences d'intérêt placées sous le contrôle, spécifiquement dans la testa de la graine.
SOMMAIRE DE L'INVENTION
Un premier objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant des signaux de régulation permettant l'expression d'un polynucléotide d'intérêt, spécifiquement dans l'endothélium et 1 ou l'albumen d'une graine de plante, lorsque ce polynucléotide d'intérêt est placé sous le contrôle de ces signaux de régulation, ledit acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence SEQ ID N'l, ou avec
un fragment d'au moins 200 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N'l.
Un premier objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant des signaux de régulation permettant l'expression d'un polynucléotide d'intérêt, spécifiquement dans l'endothélium et 1 ou l'albumen d'une graine de plante, lorsque ce polynucléotide d'intérêt est placé sous le contrôle de ces signaux de régulation, ledit acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence SEQ ID N'l, ou avec
un fragment d'au moins 200 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N'l.
L'invention est également relative à une cassette d'expression comprenant un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus, le polynucléotide d'intérêt étant choisi parmi un polynucléotide codant pour un polypeptide et un polynucléotide sens ou antisens.
L'invention est également relative à un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression comprenant un acide nucléique ou une cassette d'expression telle que définie ci-dessus, ainsi qu'à une cellule hôte transformée par cet acide nucléique ou cette cassette d'expression.
L'invention a encore pour objet l'utilisation d'un acide nucléique, d'une cassette d'expression, d'un vecteur recombinant ou d'une cellule hôte recombinante telle que définie ci-dessus pour l'obtention d'une plante transformée.
L'invention a aussi trait à des procédés d'obtention d'une plante transformée par un acide nucléique, une cassette d'expression, un vecteur recombinant ou une cellule hôte transformée telle que définie ci-dessus, ainsi qu'à des plantes transformées obtenues selon ces procédés et à des parties de ces plantes transformées, notamment les fruits et les semences.
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DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Il est fourni selon l'invention un acide nucléique comprenant des signaux de régulation permettant l'expression d'un polynucléotide d'intérêt, spécifiquement dans l'endothélium et/ou l'albumen d'une graine de plante, lorsque ce polynucléotide d'intérêt est placé sous le contrôle de ces signaux de régulation, ledit acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence SEQ ID N01, ou avec un fragment d'au moins 200 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N01.
Il est fourni selon l'invention un acide nucléique comprenant des signaux de régulation permettant l'expression d'un polynucléotide d'intérêt, spécifiquement dans l'endothélium et/ou l'albumen d'une graine de plante, lorsque ce polynucléotide d'intérêt est placé sous le contrôle de ces signaux de régulation, ledit acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence SEQ ID N01, ou avec un fragment d'au moins 200 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N01.
L'invention concerne aussi un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique tel que défini ci-dessus.
Selon l'invention, toute technique classique de biologie moléculaire, de microbiologie et d'ADN recombinant connue de l'homme du métier peut être utilisée. De telles techniques sont décrites par exemple par Sambrook et al. (1989), Glover et al. (1985), Gait (1984), Hames et Higgins (1985) et Ausubel et al. (1994).
Un acide nucléique selon l'invention se présente préférentiellement sous une forme isolée ou purifiée.
Le terme" isolé" au sens de la présente invention désigne un matériel biologique qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement). Par exemple, un polynucléotide présent à l'état naturel dans une plante n'est pas isolé. Le même polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de la plante est isolé.
Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel.
Le terme"purifié"ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative.
Un polynucléotide ou un polypeptide est à l'état purifié après purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre
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de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement quatre ou cinq ordres de grandeur.
Aux fins de la présente description, l'expression" séquence nucléotidique"peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression"séquence nucléotidique"englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
Les termes"acide nudéique","po ! ynudéotide","otigonudéotide" ou encore"séquence nudéotidique"englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple brin ou sous la forme de duplex.
Le terme"nucléotide"désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (i) un analogue d'une purine, (ii) un analogue d'une pyrimidine, ou (iii) un sucre analogue, de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N WO 95/04064.
Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant "complémentaire" d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée. Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), et C et G.
Selon l'invention, un premier acide nucléique ayant au moins 80% d'identité avec un second acide nucléique de référence, possédera au moins 80%, de préférence au moins 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 99,5% d'identité en nucléotides avec ce second polynucléotide de référence, le pourcentage d'identité entre deux séquences étant déterminé comme décrit ci-dessous.
Le"pourcentage d'identité"entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence nucléotidique ou polypeptidique dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des"gaps") par rapport à la séquence de référence
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(qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences.
Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique ou un résidu d'aminoacide identique est observé pour les deux séquences (nucléique ou peptidique) comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus.
De manière préférée, le pourcentage d'identité de séquences est déterminé à l'aide du logiciel BLAST (version BLAST 2.06 de Septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut.
Un acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique selon l'invention englobe es"variants" d'un acide nucléique selon l'invention.
Par"variant"d'un acide nucléique selon l'invention, on entend un acide nucléique qui diffère de l'acide nucléique de référence par une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions d'un nucléotide, par rapport à l'acide nucléique de référence. Un variant d'un acide nucléique selon l'invention peut être d'origine naturelle, tel qu'un variant allélique qui existe naturellement. Un tel acide nucléique variant peut être également un acide nucléique non naturel obtenu, par exemple, par des techniques de mutagenèse.
En général, les différences entre l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique" variant" sont réduites de telle sorte que l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique variant ont des séquences nucléotidiques très similaires et, dans de nombreuses régions, identiques.
Un"Variant"d'un acide nucléique régulateur selon l'invention conserve sa capacité à diriger l'expression d'un polynucléotide d'intérêt spécifiquement dans l'endothélium et/ou l'albumen d'une graine de plante, le cas échéant lorsque ce variant est associé à une séquence régulatrice à fonction de promoteur. Pour vérifier le caractère fonctionnel d'un"variant" d'un acide nucléique selon l'invention, y compris d'un acide nucléique
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possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence SEQ ID N01 ou avec un fragment d'au moins 200 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N'l, l'homme du métier peut mettre en oeuvre) les tests d'expression spécifique d'un gène rapporteur ou marqueur décrits dans les exemples.
Par"fragment"d'un acide nucléique selon l'invention, on entend une séquence nucléotidique d'une longueur réduite par rapport à l'acide nucléique de référence, le fragment d'acide nucléique possédant une séquence nucléotidique identique à la séquence nucléotidique de l'acide nucléique de référence sur la partie commune. De tels fragments d'un acide nucléique selon l'invention possèdent au moins 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 ou 2300 nucléotides consécutifs de l'acide nucléique de référence, la longueur maximale en nucléotides d'un fragment d'un acide nucléique selon l'invention étant bien entendu limitée par la longueur maximale en nucléotides de l'acide nucléique de référence.
Préférentiellement, un"fragment"d'un acide nucléique régulateur selon l'invention comprend le polynucléotide défini par la séquence allant du nucléotide en position 2054 jusqu'au nucléotide en position 2335 de la séquence SEQ ID N01.
De manière tout à fait préférée, un tel" fragment" comprend le polynucléotide défini par la séquence allant du nucléotide en position 2223 jusqu'au nucléotide en position 2228, de la séquence SEQ ID N'l, qui correspond au motif CANNTG .
Les "variants " et les" fragments" d'un acide nucléique régulateur selon l'invention sont biologiquement actifs", du fait qu'ils conservent leur capacité à diriger (s'ils comprennent une séquence promotrice) ou à moduler (par exemple moduler l'activité d'une séquence promotrice placée à proximité), l'expression d'un polynucléotide d'intérêt, spécifiquement dans l'endothélium, ou à la fois dans l'endothélium et la couche cellulaire à aleurone d'une graine de plante, comme cela peut être vérifié par l'homme du métier mettant en oeuvre les techniques décrites dans les exemples.
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Par acides nucléique comprenant des signaux de régulation au sens de l'invention, on entend un acide nucléique capable d'influencer les caractéristiques d'expression d'un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle de cet acide nucléique régulateur, en l'occurrence un acide nucléique dont la séquence permet de conférer une expression spécifique de tissu, et plus particulièrement capable de conférer une expression spécifique du polynucléotide d'intérêt dans l'endothélium et/ou l'albumen d'une graine de plante. Un tel acide nucléique peut comprendre, en plus des signaux de régulation permettant l'expression d'un polynucléotide d'intérêt, spécifiquement dans l'endothélium et/ou l'albumen d'une graine de plante, également une séquence à fonction de promoteur.
Aux fins de la présente description, un acide nucléique à fonction de promoteur aussi désigné promoteur ou encore séquence promotrice , consiste en un acide nucléique qui possède les motifs de reconnaissance de l'ARN polymérase, et plus spécifiquement d'une boîte TATA et d'une boîte CAAT , dont la structure est bien connue de l'homme du métier.
Il a été montré selon l'invention que l'acide nucléique de séquence SEQ ID N01 comprend les signaux de régulation nécessaires à l'expression d'un polynucléotide d'intérêt, spécifiquement dans l'endothélium d'une graine de plante, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N01 comprenant également une séquence promotrice capable d'initier la transcription d'un polynucléotide d'intérêt placé sous son contrôle.
A la connaissance du demandeur, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N01 est le premier acide nucléique régulateur capable de diriger l'expression d'un polynucléotide d'intérêt spécifiquement dans l'endothélium d'une graine de plante. Une telle spécificité d'expression n'avait pas été observée avec les séquences régulatrices décrites par Fobert et al. (1994) ou par Colombo et al. (1997) dont l'expression n'était pas limitée à l'endothélium mais s'étendait plusieurs types cellulaires présents dans la testa de la graine.
Il a aussi été montré selon l'invention que l'acide nucléique de séquence SEQ ID N"1, ou encore un fragment d'au moins 250 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID Nol, est capable de diriger l'expression d'un polynucléotide d'intérêt, par exemple le gène rapporteur GUS, de
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manière optimale dès la formation de l'ovule En conséquence, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N01 ou un fragment d'au moins 200 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N01 telle que définie cidessus, outre son activité spécifique de l'endothélium permet aussi une expression précoce, dès les derniers stades du développement de l'ovule, d'un polynucléotide d'intérêt placé sous son contrôle. Cette caractéristique d'activité temporelle précoce de l'acide nucléique régulateur selon l'invention rend possible l'expression du polynucléotide d'intérêt dès les premiers stades de formation de la graine, par exemple pour en modifier la composition ou encore pour altérer très précocement son développement, ce qui ne pouvait pas être envisagé avec les séquences promotrices décrites dans l'état de la technique.
Grâce à la réalisation de constructions d'ADN comprenant la totalité ou des parties de plus en plus restreintes de la séquence SEQ ID N"I, placées en aval d'un polynucléotide d'intérêt, le gène rapporteur GUS, est montré selon l'invention que les signaux de régulation permettant de diriger spécifiquement l'expression d'un polynucléotide d'intérêt dans l'endothélium de la graine, et le cas échéant également dans la couche à aleurone de l'albumen, étaient localisés du côté 3'de la séquence SEQ ID N01.
L'acide nucléique de séquence SEQ ID N01 selon l'invention a une longueur de 2376 nucléotides.
Acides nucléiques comportant les signaux de régulation spécifiques de tissus.
Différentes constructions d'ADN ont été réalisées, chacune de ces constructions d'ADN comprenant un fragment de l'acide nucléique allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 2335 de la séquence SEQ ID N'l. Les constructions d'ADN comprennent également un acide nucléique à fonction de promoteur.
Il a été réalisé des cassettes d'expression comprenant un polynucléotide d'intérêt codant pour un gène rapporteur, le gène GUS, qui a été placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur tel que défini cidessus, comprenant à la fois les signaux de régulation spécifiques de tissu et un acide nucléique à fonction de promoteur.
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Ces cassettes d'expression ont été utilisées pour transformer des plantes, plus spécifiquement des plantes de l'espèce Arabidopsis thaliana, après quoi l'expression du gène rapporteur a été suivie dans les différents tissus de la plante au cours du temps.
Les résultats des exemples montrent que les signaux de régulation nécessaires à l'activité de transcription tissu-spécifique dans la graine de plante sont compris dans l'acide nucléique allant du nucléotide en position 2054 jusqu'au nucléotide en position 2335 de la séquence SEQ ID N'l, ce qui correspond à l'expression du gène rapporteur obtenu avec la construction désignée pBAN6.
Il a été montré selon l'invention que l'acide nucléique régulateur présent dans la construction pBAN6 contenait un motif CANNTG localisé du nucléotide en position 2223 jusqu'au nucléotide en position 2228 de la séquence SEQ ID N'l. Le motif CANNTG constitue un site potentiel de liaison à des facteurs de transcription du type MYC, ainsi qu'il résulte de l'étude structurale de l'acide nucléique régulateur de séquence SEQ ID N01 à l'aide d'un ordinateur exploitant les informations de la base de données PLACE (Plant cis-acting Regulator Elements data base ; HIGO et al., 1999).
Sans vouloir être liés par une quelconque théorie, les inventeurs pensent que le motif CANNTG localisé du nucléotide en position 2223 jusqu'au nucléotide en position 2228 de la séquence SEQ ID N01 constitue une caractéristique structurelle importante de l'acide nucléique régulateur tissu-spécifique de l'invention.
De plus, des résultats préliminaires indiquent la présence d'un motif de liaison d'un facteur de transcription réprimant l'expression dans l'albumen, ce motif étant localisé dans une région nucléotidique allant du nucléotide en position 1919 jusqu'au nucléotide en position 2054 de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N01.
Description de l'acide nucléique à fonction de promoteur contenu dans la séquence SEQ ID N01
L'acide nucléique à fonction de promoteur contenu dans l'acide nucléique de séquence SEQ ID N01 est entièrement contenu dans la séquence allant du nucléotide en position 2054 jusqu'au nucléotide en
L'acide nucléique à fonction de promoteur contenu dans l'acide nucléique de séquence SEQ ID N01 est entièrement contenu dans la séquence allant du nucléotide en position 2054 jusqu'au nucléotide en
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position 2335 de la séquence SEQ ID ? 1. Cette séquence contient une boîte TATA localisée du nucléotide en position 2306 jusqu'au nucléotide en position 2312 de la séquence SEQ ID N'l. Cette séquence promotrice contient également une boîte CAAT localisée du nucléotide en position 2172 jusqu'au nucléotide en position 2180 de la séquence SEQ ID N'l. La boîte TATA constitue l'élément promoteur proprement dit, qui est localisé en général à une distance d'environ 30 bases du site d'initiation de la transcription. La boîte CAAT est un élément agissant en cis qui est retrouvée communément dans la région promotrice et activatrice ( enhancer ).
L'acide nucléique à fonction de promoteur allant du nucléotide en position 2172 jusqu'au nucléotide en position 2312 de la séquence SEQ ID Nol, ainsi que tout fragment biologiquement actif de cet acide nucléique promoteur et contenant les boîtes CAAT et TATA définies ci-dessus constitue un autre objet de la présente invention.
Acides nucléiques régulateurs selon l'invention
Il s'agit en premier lieu d'un acide nucléique comprenant des signaux de régulation permettant l'expression d'un polynucléotide d'intérêt, spécifiquement dans l'endothélium et/ou l'albumen d'une graine de plante, lorsque ce polynucléotide d'intérêt est placé sous le contrôle de ces signaux de régulation, ledit acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence SEQ ID N'l, ou avec un fragment d'au moins 250 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N01.
Il s'agit en premier lieu d'un acide nucléique comprenant des signaux de régulation permettant l'expression d'un polynucléotide d'intérêt, spécifiquement dans l'endothélium et/ou l'albumen d'une graine de plante, lorsque ce polynucléotide d'intérêt est placé sous le contrôle de ces signaux de régulation, ledit acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence SEQ ID N'l, ou avec un fragment d'au moins 250 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N01.
Comme déjà précisé, un tel acide nucléique régulateur comprendra préférentiellement le motif CANNTG allant du nucléotide en position 2223 jusqu'au nucléotide en position 2228 de la séquence SEQ ID N01.
Selon un premier aspect, un tel acide nucléique est caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence allant du nucléotide en position 2273 jusqu'au nucléotide en position 2335 de la séquence SEQ ID ? 1. Un tel acide nucléique régulateur est compris notamment dans la construction pBAN8 des exemples.
Selon un second aspect, l'acide nucléique régulateur est caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité
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en nucléotides avec la séquence allant du nucléotide en position 2141 jusqu'au nucléotide en position 2335 de la séquence SEQ ID N01. Un tel acide nucléique régulateur est compris notamment dans la construction désignée pBAN7 décrite dans les exemples.
Selon un troisième aspect, l'acide nucléique régulateur est caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence allant du nucléotide en position 2054 jusqu'au nucléotide en position 2335 de la séquence SEQ ID N01. Un tel acide nucléique régulateur est notamment compris dans la construction pBAN6 décrite dans les exemples.
Selon un quatrième aspect, l'acide nucléique régulateur est caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence allant du nucléotide en position 1919 jusqu'au nucléotide en position 2335 de la séquence SEQ ID N'l. Un tel acide nucléique régulateur est compris notamment dans la construction pBAN5 décrite dans les exemples.
Selon un cinquième aspect, l'acide nucléique régulateur est caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence allant du nucléotide en position 1510 jusqu'au nucléotide en position 2335 de la séquence SEQ ID N01. Un tel acide nucléique régulateur est notamment compris dans la construction pBAN4 décrite dans les exemples.
Selon un sixième aspect, l'acide nucléique régulateur est caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence allant du nucléotide en position 1011 jusqu'au nucléotide en position 2335 de la séquence SEQ ID ? 1. Un tel acide nucléique régulateur est compris dans la construction désignée pBAN3 décrite dans les exemples.
Selon un septième aspect, l'acide nucléique régulateur est caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence allant du nucléotide en position 509 jusqu'au nucléotide en position 2335 de la séquence SEQ ID N01. Un tel acide nucléique régulateur est notamment compris dans la construction pBAN2 décrite dans les exemples.
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Selon un huitième aspect, l'acide nucléique régulateur est caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 2335 de la séquence SEQ ID N'l. Un tel acide nucléique régulateur est compris dans la construction désignée pBAN 1 décrite dans les exemples.
Chacun des acides nucléiques ci-dessus peut aussi comprendre la séquence allant du nucléotide en position 2336 jusqu'au nucléotide en position 2376 de la séquence SEQ ID N'l.
Pour obtenir l'expression d'un polynucléotide d'intérêt uniquement dans l'endothélium de la testa de la graine, on utilisera un acide nucléique régulateur comprenant au moins la séquence allant du nucléotide en position 1919 jusqu'au nucléotide en position 2335 de la séquence SEQ ID N'l.
Lorsque l'on recherchera l'expression du polynucléotide d'intérêt à la fois dans l'endothélium de la testa de la graine et dans la couche de cellules à aleurone de l'albumen, on utilisera préférentiellement un acide nucléique régulateur plus court, par exemple un acide nucléique régulateur comprenant une séquence allant du nucléotide en position 2054 jusqu'au nucléotide en position 2335 de la séquence SEQ ID N"1, dépourvu de tout ou partie de la séquence 1918-2053 de la séquence SEQ ID N'l.
La présente invention est également relative à un acide nucléique dont la séquence est complémentaire à la séquence de l'un quelconque des acides nucléiques tels que définis ci-dessus.
Un acide nucléique régulateur tel que défini ci-dessus peut comprendre uniquement les signaux de régulation permettant de moduler l'expression d'un polynucléotide d'intérêt, spécifiquement dans l'endothélium et/ou l'albumen d'une graine de plante, sans inclure d'acide nucléique à fonction de promoteur.
Dans ce cas, les caractéristiques fonctionnelles d'activité tissuspécifique d'un acide régulateur selon l'invention sont exploitées par l'introduction, dans cet acide nucléique régulateur, également d'un acide nucléique à fonction de promoteur, plus spécifiquement d'un polynucléotide à fonction de promoteur qui est fonctionnel dans une cellule de plante.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier d'un acide régulateur selon l'invention, cet acide nucléique régulateur est caractérisé en ce qu'il
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comprend de plus un polynucléotide à fonction de promoteur qui est fonctionnel dans une cellule de plante.
Dans un mode de réalisation particulier, le polynucléotide à fonction de promoteur est la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 2172, premier nucléotide de la boîte CAAT, jusqu'au nucléotide en position 2312, dernier nucléotide de la boîte TATA de la séquence SEQ ID N01 ou encore un variant ou un fragment biologiquement actif de cette séquence.
Un variant de l'acide nucléique à fonction de promoteur défini cidessus comprend une séquence nucléotidique ayant au moins 80% d'identité avec la séquence allant du nucléotide en position 2172 jusqu'au nucléotide en position 2312 de la séquence SEQ ID N01 et est capable de diriger l'expression d'un polynucléotide d'intérêt dans une cellule de plante. De manière tout à fait préférée, un tel variant comprend les boîtes CAAT et TATA définies précédemment dans la présente description. Un tel fragment d'acide nucléique peut aussi comprendre la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 2313 jusqu'au nucléotide en position 2376 de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N'l.
Comme cela a déjà été précisé, l'un des objectifs poursuivis par la présente invention est l'obtention d'une expression contrôlée d'un polynucléotide d'intérêt, spécifiquement dans l'endothélium et/ou la couche cellulaire à aleurone de l'albumen d'une graine de plante, par exemple dans les situations où l'on cherche à : - modifier la composition ou l'équilibre hormonal de la testa de la graine ; - obtenir des plantes avec des graines de taille réduite ou encore avec un nombre réduit de graines, voire une absence pratiquement totale ou totale de graines, et plus spécifiquement de graines matures ou de graines fertiles.
L'invention a donc encore pour objet un acide nucléique comprenant un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur tel que défini ci-dessus. Un tel acide nucléique est aussi désigné cassette d'expression aux fins de la présente description.
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L'invention a donc encore pour objet une cassette d'expression comprenant un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur tel que défini précédemment.
CASSETTES D'EXPRESSION SELON L'INVENTION
Selon un premier mode de réalisation, une cassette d'expression selon l'invention est caractérisée en ce que le polynucléotide d'intérêt code pour un polypeptide.
Selon un premier mode de réalisation, une cassette d'expression selon l'invention est caractérisée en ce que le polynucléotide d'intérêt code pour un polypeptide.
Préférentiellement, le polynucléotide d'intérêt code pour un polypeptide impliqué dans la régulation du contenu en tannins ou en fibres de la graine ou encore pour un polypeptide régulant l'équilibre hormonal dans la testa de la graine.
Au vu des exemples cités ci-dessus, on peut envisager d'augmenter (surexpression) ou de supprimer par cosuppression, antisens (Vaucheret et Fagard, 2001), ARN interférence (Smith et al., 2000) ou immunomodulation (Phillips et al., 1997) l'expression de divers gènes du métabolisme placés sous le contrôle du promoteur pBAN.
La modulation du métabolisme des composés phénoliques peut se concevoir en utilisant un gène codant pour des facteurs de transcription, par exemple de type Myc (Damiani et aL, 1999 ; Nesi et al., 2000) ou de type Myb (Grotewold et al., 1998 ; Borevitz et al., 2000), ainsi que des gènes de structure codant pour des enzymes de la voie de biosynthèse ou pour des transporteurs (Debeaujon et al., 2001). La protéine BAN (probablement une leucocyanidine réductase selon Devic et al., 1999) est une enzyme clé conduisant à la formation des tannins. Il est probable que sa suppression ou sa surexpression conduisent à l'absence et à l'augmentation de tannins respectivement, cela sans affecter les niveaux des autres flavonoïdes ; la suppression de la CHS (chacone synthase) conduit à l'absence de flavonoïdes ; quant à la LDOX (leucocyanidine déoxygenase) et la FLS (flavonol synthase) (Pelletier et al., 1997), leur modulation devrait conduire à augmenter ou supprimer les anthocyanes et les flavonols, respectivement. L'utilisation de gènes du métabolisme des lignines tels que ceux codant pour les enzymes F5H (ferulate-5-hydroxylase ; Meyer et al., 1998 ; Franke et al.,
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2000), cinnamyl-alcool dehydrogenase et cinnamoyl-CoA reductase (Ralph et al., 1998) sont des candidats pour la modification de ces composés.
Des gènes codant pour des enzymes de la voie de biosynthèse de la cellulose (Fagard et al., 2000) peuvent être envisagés pour modifier ce composé.
Les gènes codant pour des invertases de la testa (Weber et al., 1996) sont des cibles potentielles pour modifier les modalités de nutrition de l'embryon.
La manipulation de gènes de biosynthèse d'hormones pour modifier les caractéristiques structurales de la testa peut également se concevoir, en particulier pour les gibbérellines avec G (Sun et Kamiya, 1994), et le gène de la GA-20-oxidase (Coles et al., 1999 ; Kang et aL, 1999), pour l'acide abscissique avec ABA2 codant pour la zéaxanthine epoxidase (Marin et aL, 1996), pour l'éthylène avec l'enzyme ACC synthase (Gray et al., 1992), pour les brassinostéroïdes avec DET2 codant pour une stéroïde 5-alpha- réductase (Noguchi et al., 1999), pour les auxines avec iaaM (Rotino et al., 1997), pour les cytokinines avec ipt (Barry et al., 1984) ; voir la revue de Hedden et Philips (2000) pour plus de détails.
Dans la situation où l'on cherche à obtenir une plante pour laquelle le développement d'une graine mature est affecté, on préférera un polynucléotide d'intérêt dont l'expression est toxique pour la cellule de plante, par exemple un polynucléotide codant pour un polypeptide toxique pour la cellule de plante, ou encore un polynucléotide capable d'inhiber ou de bloquer spécifiquement la fonction d'un ou plusieurs gènes impliqués dans le développement de la graine.
De manière préférée, lorsque le polynucléotide d'intérêt code pour un polypeptide toxique pour la cellule de plante, les séquences codant pour les polypeptides suivants seront choisies de préférence : - la Barnase (Paddon et Hartley, 1987 ; Hartley, 1989) - la toxine diphtérique (YAMAIZUMI et ai., 1987) ;
Il peut ainsi s'agir des gènes dont on sait qu'ils s'expriment chez les plantes, en se référant à la revue de Day et Irish (1997) : - barnase de Bacillus amyloliquefaciens (Paddon et Hartley, 1987 ; Hartley, 1989)
Il peut ainsi s'agir des gènes dont on sait qu'ils s'expriment chez les plantes, en se référant à la revue de Day et Irish (1997) : - barnase de Bacillus amyloliquefaciens (Paddon et Hartley, 1987 ; Hartley, 1989)
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- toxine diphtérique chaine A de Corynebacterium diphteria (Yamaizumi et al., 1978 ; Czaco et al., 1992).
- RNase T1 de Aspergillus oryzae (Mariani et al., 1990) - exotoxine A de Pseudomonas aeruginosa (Koning et al., 1992)
On peut aussi faire exprimer des gènes conférant de nouvelles propriétés à la testa comme des inhibiteurs de protéases pour la protection contre les insectes (Jouanin et al., 2000), ou des toxines cellulaires telles que la barnase (Colombo et al., 1997 ; Varoquaux et aL, 2000) ou la toxine A diphtérique (Czaco et al., 1992) pour réduire la taille de la graine (Koltunow et Brennan, 1998 ; Koltunow et ai., 1998) ou pour effectuer l'ablation génétique de la graine et donc l'obtention de fruits sans graines. Pour cette dernière approche, l'utilisation d'un système inductible comme ceux décrits par Aoyama et Chua (1997) ainsi que Zuo et al. (2000) peut être envisagée.
On peut aussi faire exprimer des gènes conférant de nouvelles propriétés à la testa comme des inhibiteurs de protéases pour la protection contre les insectes (Jouanin et al., 2000), ou des toxines cellulaires telles que la barnase (Colombo et al., 1997 ; Varoquaux et aL, 2000) ou la toxine A diphtérique (Czaco et al., 1992) pour réduire la taille de la graine (Koltunow et Brennan, 1998 ; Koltunow et ai., 1998) ou pour effectuer l'ablation génétique de la graine et donc l'obtention de fruits sans graines. Pour cette dernière approche, l'utilisation d'un système inductible comme ceux décrits par Aoyama et Chua (1997) ainsi que Zuo et al. (2000) peut être envisagée.
Tirer profit du système barnase/barstar, comme décrit par Mariani et al.
(1990,1992) est une deuxième possibilité.
L'ablation génétique de la graine peut aussi être atteinte en utilisant des antisens de gènes du cycle cellulaire comme CDC2 (Ferreira et al., 1991 ; Hemerly et al., 1992). On peut penser aussi à des gènes tels que AINTEGUMENTA dont le mutant est embryon-léthal (Elliot et al., 1996 ; Klucher et al., 1996). Des gènes intervenant dans le métabolisme d'hormones telles que les gibbérellines et les auxines sont des candidats potentiels pour l'obtention d'une parthénocarpie (Vivian-Smith et Koltunow, 1999 ; Varoquaux et al., 2000).
Selon un autre aspect, le polynucléotide d'intérêt dont l'expression est toxique pour la cellule de plante peut être un polynucléotide sens ou antisens capable d'inhiber ou de bloquer respectivement la transcription ou la traduction d'un gène requis pour le développement normal de la graine, et de manière préférée d'un gène requis pour le développement normal de la testa de la graine, tout particulièrement la testa.
1) Pour modifier les produits finaux de voies biochimiques, comme celle des flavonoïdes, des lignines ou de la cellulose - gènes de biosynthèses de flavonoïdes, particulièrement BAN (pour suppression des tannins) - gènes du métabolisme des lignines - gènes de biosynthèse de la cellulose
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- Gènes du métabolisme hormonal de la graine
2) Pour réduire la taille de la graine voire conduire à sa disparition : - gènes du cycle cellulaire - gènes de développement de la testa (Schneitz, 1999), particulièrement AINTEGUMENTA (Krizek, 1999) - gènes du métabolisme hormonal
De préférence, un polynucléotide antisens selon l'invention hybride, au sein de la cellule, spécifiquement avec une région du gène cible comprenant le site d'initiation de la transcription et/ou avec une séquence importante pour l'épissage correct de l'ARN messager.
2) Pour réduire la taille de la graine voire conduire à sa disparition : - gènes du cycle cellulaire - gènes de développement de la testa (Schneitz, 1999), particulièrement AINTEGUMENTA (Krizek, 1999) - gènes du métabolisme hormonal
De préférence, un polynucléotide antisens selon l'invention hybride, au sein de la cellule, spécifiquement avec une région du gène cible comprenant le site d'initiation de la transcription et/ou avec une séquence importante pour l'épissage correct de l'ARN messager.
De préférence, un polynucléotide antisens selon l'invention est un acide nucléique complémentaire de l'ARN messager constituant le produit de transcription du gène cible et comprenant le site d'initiation de la traduction.
Un tel polynucléotide antisens peut être l'ADN complémentaire de l'ARN messager du gène visé.
Selon encore un autre mode de réalisation, le polynucléotide d'intérêt, qui est placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, code pour un polypeptide constitué d'une protéine de fusion entre un récepteur aux glucocorticoïdes et la protéine GAL-4.
VECTEURS RECOMBINANT SELON L'INVENTION
L'invention concerne aussi des vecteurs recombinants de clonage et/ou d'expression comprenant un acide nucléique régulateur ou une cassette d'expression telle que définis ci-dessus.
L'invention concerne aussi des vecteurs recombinants de clonage et/ou d'expression comprenant un acide nucléique régulateur ou une cassette d'expression telle que définis ci-dessus.
Un autre objet de l'invention consiste donc en des vecteurs recombinants dans lequel a été inséré un acide nucléique régulateur selon l'invention, comprenant des signaux de régulation permettant l'expression d'un polynucléotide d'intérêt, spécifiquement dans l'endothélium et/ou l'albumen d'une graine de plante, lorsque ce polynucléotide d'intérêt est placé sous son contrôle, ledit acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence SEQ ID N"1, ou avec un fragment d'au moins 250 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N01.
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Avantageusement, un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression selon l'invention comprend une cassette d'expression comprenant un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur tel que défini ci-dessus.
Font ainsi partie de l'invention des vecteurs recombinants pour l'expression d'un polynucléotide d'intérêt dans l'endothélium et/ou l'albumen d'une graine de plante, comprenant : a) un acide nucléique régulateur tel que défini dans la présente description ; et b) un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle de l'acide nucléique régulateur défini en a).
Le polynucléotide d'intérêt peut consister en un polynucléotide codant pour un polypeptide détectable, ou polypeptide marqueur tel que par exemple un polypeptide codant pour la protéine GUS ou encore pour une protéine fluorescente, telle que la protéine GFP (Green fluorescent protein) ou YFP (Yellow fluorescent protein).
Selon un autre aspect, le polynucléotide d'intérêt code pour un polypeptide impliqué dans la régulation du contenu en tannins ou en fibres de la graine, ou pour un polypeptide régulant l'équilibre hormonal dans la testa du grain. Le polynucléotide d'intérêt peut être aussi un polynucléotide dont l'expression est toxique pour la cellule de plante, tel qu'il est défini précédemment dans la présente description.
Un vecteur recombinant selon l'invention répondant à la définition ci-dessus est le vecteur pBAN1 : : GUS/pBIB-Hyg contenu dans la souche de
E. coli déposée à la CNCM le 17 juillet 2001 sous le numéro d'accès 1-2703.
E. coli déposée à la CNCM le 17 juillet 2001 sous le numéro d'accès 1-2703.
D'autres vecteurs répondant à la définition générale d'un vecteur recombinant selon l'invention sont respectivement les vecteurs pBAN2 : : GUS, pBAN3 : : GUS, pBAN4 : : GUS, pBAN5 : : GUS, pBAN6 : GUS pBAN7 : GUS et PBAN8 : GUS illustrés dans les exemples.
Le vecteur pBAN1 : : GUS comprend la totalité de l'acide nucléique régulateur de séquence SEQ ID N01.
Le vecteur pBAN2 : : GUS comprend l'acide nucléique régulateur allant du nucléotide en position 509 jusqu'au nucléotide en position 2376 de la séquence SEQ ID N'l, c'est-à-dire l'acide nucléique SEQ ID ? 14.
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Le vecteur pBAN3 : : GUS comprend la séquence allant du nucléotide en position 1011 jusqu'au nucléotide en position 2376 de la séquence SEQ ID D N 1 c'est-à-dire l'acide nucléique SEQ ID N013.
Le vecteur pBAN4 : : GUS comprend l'acide nucléique régulateur allant du nucléotide en position 1510 jusqu'au nucléotide en position 2376 de la séquence SEQ ID N 1 c'est-à-dire l'acide nucléique SEQ ID ? 12.
Le vecteur pBAN5 : : GUS comprend un acide nucléique régulateur allant du nucléotide en position 1919 jusqu'au nucléotide en position 2376 de la séquence SEQ ID N 1 c'est-à-dire l'acide nucléique SEQ ID N 11.
Le vecteur pBAN6 : : GUS comprend un acide nucléique régulateur allant du nucléotide en position 2054 jusqu'au nucléotide en position 2376 de la séquence SEQ ID N"1, c'est-à-dire l'acide nucléique SEQ D ? 10.
Le vecteur pBAN7 : : GUS comprend un acide nucléique régulateur allant du nucléotide en position 2141 jusqu'au nucléotide en position 2376 de la séquence SEQ ID n01, c'est-à-dire l'acide nucléique SEQ ID n"9.
Le vecteur pBAN8 : : GUS comprend un acide nucléique régulateur allant du nucléotide en position 2273 jusqu'au nucléotide en position 2376 de la séquence SEQ ID n01, c'est-à-dire l'acide nucléique SEQ ID n 8.
L'acide nucléique de séquence SEQ ID N 1 peut être amplifié à l'aide des amorces de séquences SEQ ID N015 et SEQ ID ? 23.
L'acide nucléique de séquence SEQ ID ? 14 peut être amplifié à l'aide des amorces de séquences SEQ ID N016 et SEQ ID ? 23.
L'acide nucléique de séquence SEQ ID N013 peut être amplifié à l'aide des amorces de séquences SEQ ID N 17 et SEQ ID N 23.
L'acide nucléique de séquence SEQ ID N 12 peut être amplifié à l'aide des amorces de séquences SEQ ID ? 18 et SEQ ID ? 23.
L'acide nucléique de séquence SEQ ID N 11 peut être amplifié à l'aide des amorces de séquences SEQ D ? 19 et SEQ ID N 23.
L'acide nucléique de séquence SEQ ID N 10 peut être amplifié à l'aide des amorces de séquences SEQ ID ? 20 et SEQ ID N023.
L'acide nucléique de séquence SEQ ID N09 peut être amplifié à l'aide des amorces de séquences SEQ ID N021 et SEQ ID N023.
L'acide nucléique de séquence SEQ ID N08 peut être amplifié à l'aide des amorces de séquences SEQ ID N 22 et SEQ ID N23.
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Caractéristiques générales des vecteurs recombinants selon l'invention.
Par"vecteur"au sens de la présente invention, on entendra une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme simple brin ou double brin.
Un vecteur recombinant selon l'invention est indifféremment un vecteur de clonage, un vecteur d'expression, ou plus spécifiquement un vecteur d'insertion, un vecteur de transformation ou un vecteur d'intégration.
Il peut s'agir d'un vecteur d'origine bactérienne ou virale.
Selon un premier mode de réalisation, un vecteur recombinant selon l'invention est utilisé afin d'amplifier l'acide nucléique qui y est inséré après transformation ou transfection de l'hôte cellulaire désiré.
Selon le mode de réalisation préféré, un vecteur recombinant selon l'invention est utilisé pour exprimer un polynucléotide d'intérêt, spécifiquement dans l'endothélium et/ou l'albumen d'une graine de plante, et dans ce cas spécifiquement dans la couche cellulaire à aleurone de l'albumen de la graine de plante.
Un vecteur recombinant selon l'invention comprend avantageusement aussi des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription appropriée.
En outre, les vecteurs recombinants selon l'invention pourront inclure une ou plusieurs origines de réplication fonctionnelle chez les hôtes cellulaires dans lesquels leur amplification ou leur expression est recherchée, ainsi que des séquences nucléotidiques marqueurs de sélection.
Selon un aspect avantageux, un vecteur recombinant selon l'invention est un vecteur intégratif permettant l'insertion de multiples copies de la séquence d'ADN insérée dans ce vecteur dans le génome d'une plante, dont la transformation par un acide nucléique selon l'invention est recherchée.
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De manière avantageuse, le vecteur recombinant, ou dans d'autres cas la cassette d'expression contenue dans ce vecteur, peut aussi contenir des séquences 5'non traduites dites"leaders". De telles séquences peuvent augmenter la traduction. Parmi celles connues de l'homme du métier, on peut citer : - le leader EMCV (EncephaloMyoCarditis VIRUS 5'non coding region) (ELROY-STEIN et al., 1989) ; - le leader TEV (Tobacco Etch Virus) (CARRINGTON AND FREED, 1990) ; -le leader du gène BiP codant pour la protéine de liaison à la chaîne lourde de l'immunoglobuline humaine (MACEJACK et al., 1991) ; - le leader AMV RNA 4 provenant de l'ARNm de la protéine du virus de la mosaïque de la luzerne (JOBLING et Gehrky, 1987) ; - le leader du virus de la mosaïque du tabac (GALLIE et al., 1989).
Les vecteurs selon l'invention peuvent aussi comprendre des séquences dites"terminateurs".
Parmi les terminateurs utilisables dans les constructions de l'invention, on peut citer notamment : - le polyA 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV), décrit dans l'article de FRANCK et al. (1980) ; - le terminateur correspondant à la région 3'non-codante du gène de la opaline synthase du plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens (DEPICKER et al., 1982), - le terminateur du gène histone (EP 0 633 317).
Le vecteur d'expression peut aussi comprendre des séquences de type peptides signaux vacuolaire ou apoplastique lorsqu'elles ne sont pas déjà présentes dans la séquence du gène d'intérêt, pour amener la protéine codée par le gène hétérologue dans des compartiments particuliers des cellules de plante, en particulier celles comprenant la zone de transfert de l'albumen.
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Les vecteurs bactériens préférés selon l'invention sont par exemple les vecteurs pBR322 (ATCC n 37 017) ou encore les vecteurs tels que pAA223-3 (Pharmacia, Uppsala, Suède) et pGEM 1 (Promega Biotech, Madison, Wt, Etats-Unis).
On peut encore citer d'autres vecteurs commercialisés tels que les vecteurs pQE70, pQE60, pQE9 (Quiagen), psi174, pBluescript SA, pNH8A, pMH16A, pMH18A, pMH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI et pSG (Stratagene).
Il peut s'agir également de vecteurs du type Baculovirus tel que le vecteur pVL1392/1393 (Pharmingen) utilisé pour transfecter les cellules de la lignée Sf9 (ATCC N CRL 1711) dérivée de Spodoptera frugiperda.
Préférentiellement, on aura recours à des vecteurs spécialement adaptés pour l'expression de séquence d'intérêt dans des cellules de plantes, tels que les vecteurs suivants : - vecteur pBluescript SK+ commercialisé par la Société Stratagène ; - vecteur pRTL2-GUS décrit par Carrington et al. (1990) ; - vecteur pAVA 393, illustré dans les exemples et qui dérive du vecteur pAVA321 décrit par Von Arnhim et al. (1998) ; - les vecteurs pBIB-HYG et pBIB-KAN décrits par Becker et al. (1990) ; - vecteur pBIN19 (BEVAN et al. 1984), commercialisé par la Société CLONTECH (Palo Alto, Californie, USA) ; - vecteur pB1 101 (JEFFERSON, 1987), commercialisé par la Société CLONTECH ; - vecteur pBI121 (JEFFERSON, 1987), commercialisé par la Société CLONTECH ; - vecteur pEGFP ; Yang et al. (1996a et 1996b), commercialisé par la Société CLONTECH ; - vecteur pCAMBIA 1302 (HAJDUKIIEWICZ et al., 1994) CELLULES HOTES TRANSFORMEES SELON L'INVENTION
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Pour permettre l'expression d'un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, les acides nucléiques régulateurs, les cassettes d'expression ou encore les vecteurs recombinants définis dans la présente description doivent être introduits dans une cellule hôte. L'introduction des polynucléotides selon l'invention dans une cellule hôte peut être réalisée in vitro, selon les techniques bien connues de l'homme du métier pour transformer ou transfecter des cellules, soit en culture primaire, soit sous la forme de lignées cellulaires.
L'invention a en outre pour objet une cellule hôte transformée par un acide nucléique régulateur, par une cassette d'expression ou encore par un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus.
Une telle cellule hôte transformée est préférentiellement d'origine bactérienne, fongique ou végétale.
Ainsi, peuvent être notamment utilisées des cellules bactériennes de différentes souches de Escherichia coli ou encore d'Agrobacterium
tumefaciens.
tumefaciens.
De manière préférée, la cellule hôte transformée est une cellule de plante ou encore un protoplaste de plante.
De manière tout à fait préférée, la solution hôte transformée est d'origine végétale et est choisie parmi les cellules des espèces végétales
telles que Solanacea, Cactaceae, Cucurbitacea, Papillionacea, Actinidiaceae, Cucurbitaceae, Rubiaceae, Moraceae, Passifloraceae, Composite, Caricaceae, Ericaceae, Gramineae, Cruciferae, Cariofillaceae, Amarylidiaceae, Iridaceae, Leguminosae, Liliaceae, Oleaceae, Paeoniaceae, Papaveraceae, Primulaceae, Rosaceae, Scrophulariaceae, Violaceae, Vitaceae, Malvaceae.
telles que Solanacea, Cactaceae, Cucurbitacea, Papillionacea, Actinidiaceae, Cucurbitaceae, Rubiaceae, Moraceae, Passifloraceae, Composite, Caricaceae, Ericaceae, Gramineae, Cruciferae, Cariofillaceae, Amarylidiaceae, Iridaceae, Leguminosae, Liliaceae, Oleaceae, Paeoniaceae, Papaveraceae, Primulaceae, Rosaceae, Scrophulariaceae, Violaceae, Vitaceae, Malvaceae.
On préfère tout particulièrement les plantes dérivées de l'aubergine, de la tomate, du melon ou du melon d'eau, du concombre, des espèces du type citrus, du poivre, des fraises, du raisin, de la pomme, de la poire, de la cerise, l'olive, du colza, du choux ou du poivron.
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Il peut s'agir indifféremment d'une cellule végétale originaire d'une plante dicotylédone ou monocotylédone.
Une cellule hôte transformée selon l'invention est la souche de Escherichia coli contenant le plasmide pBAN1 : : GUS/pBIB-Hyg déposé à la CNCM le 17 juillet 2001 sous le numéro d'accès 1-2703.
D'autres cellules hôtes transformées préférées selon l'invention sont respectivement des cellules hôtes transformées avec les vecteurs pBAN2 : : GUS, PBAN3 : : GUS, pBAN4 : : GUS, pBAN5 : : GUS, pBAN6 : : GUS pBAN7 : GUS et pBAN8 : GUS illustrés dans les exemples.
PLANTES TRANSFORMEES SELON L'INVENTION L'invention concerne aussi un organisme multicellulaire végétal transformé, caractérisé en ce qu'il comprend une cellule hôte transformée ou une pluralité de cellules hôtes transformées par un acide nucléique, une cassette d'expression ou encore par un vecteur recombinant tel que défini cidessus.
L'invention a encore pour objet une plante transgénique comprenant, sous une forme intégrée dans son génome, un acide nucléique ou une cassette d'expression telle que définie dans la présente description.
De manière générale, l'invention est aussi relative à l'utilisation d'un acide nucléique régulateur, d'une cassette d'expression, d'un vecteur recombinant ou encore d'une cellule hôte telle que définie ci-dessus pour l'obtention d'une plante transformée.
Dans un mode de réalisation particulier de l'utilisation ci-dessus, dans lequel l'expression du polynucléotide régulateur placé sous le contrôle d'un acide nucléique selon l'invention est toxique pour la cellule, la plante transformée ne produit pas de graines matures, ou bien produit des graines de taille réduite, ou bien produit un nombre réduit de grains ou se caractérise par l'absence totale de graines, particulièrement l'absence totale de graines matures et/ou fertiles.
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Un premier objectif poursuivi selon la présente invention est l'obtention de plantes transgéniques ou transformées dont la graine mature possède des caractéristiques améliorées, notamment du point de vue de la qualité ou de la quantité en tannins ou en fibres ou encore des équilibres hormonaux.
Un second objectif poursuivi selon l'invention est l'obtention de plantes transgéniques ou transformées affectées dans le développement de la testa de la graine.
Confoemément à un troisième objectif, on cherche à obtenir des plantes transgéniques ou transformées dont les graines comprennent des teneurs réduites en tannins ou en anthocyanes par rapport à la normale. Un tel objectif sera poursuivi plus particulièrement concernant l'obtention de plantes transgéniques ou transformées de colza ou de maïs ayant les caractéristiques ci-dessus, et dont les graines sont d'une couleur jaune plus intense que la normale.
Selon le premier objectif ci-dessus, le polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention sera choisi de telle manière à ce qu'il modifie la qualité nutritionnelle et/ou hormonale de la testa de la graine.
Selon un second objectif ci-dessus, le polynucléotide d'intérêt sera choisi de telle manière à ce que son expression soit toxique pour la cellule de l'endothélium dans laquelle il est exprimé.
Les acides nucléiques régulateurs et les cassettes d'expression sont ceux décrits précédemment dans la description.
Lorsqu'une expression du polynucléotide d'intérêt sera recherchée exclusivement dans l'endothélium de la testa, on choisira de préférence un acide nucléique régulateur comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence allant du nucléotide en position 1919 jusqu'au nucléotide en position 2335 de la séquence SEQ ID N'l, comme c'est le cas par exemple pour les acides nucléiques
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régulateurs contenus dans les vecteurs pBAN1 : : GUS, pBAN2 : : GUS, pBAN3 : : GUS, pBAN4 : : GUS et pBAN5 : : GUS.
Lorsqu'au contraire on cherchera à obtenir une expression du polynucléotide d'intérêt également dans la couche à aleurone de l'albumen, on choisira alors de préférence un acide nucléique régulateur comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence allant du nucléotide en position 2054 jusqu'au nucléotide en position 2335 de la séquence SEQ ID Nol, comme c'est le cas de l'acide nucléique régulateur contenu dans le vecteur pBAN6 : : GUS.
L'invention a également trait à toute partie d'une plante transformée telle que définie dans la présente description, y compris ses graines et ses fruits.
Les plantes transformées selon l'invention appartiennent préférentiellement aux espèces qui ont déjà été listées ci-dessus concernant l'origine des cellules hôtes végétales transformées de l'invention.
De manière tout à fait préférée, les plantes transformées selon l'invention sont choisies parmi l'aubergine, la tomate, le melon ou le melon d'eau, le concombre, les espèces du type citrus, le poivre, les fraises, les raisins, les pommes, les poires, les cerises, le colza, le choux, le poivron ou encore les olives.
Les plantes peuvent être indifféremment des dicotylédones ou des monocotylédones.
L'invention a encore pour objet un procédé d'obtention de plantes transformées caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) obtention d'une cellule hôte recombinante végétale selon l'invention ; b) régénération d'une plante entière à partir de la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) ; c) sélection des plantes obtenues à l'étape b) ayant intégré un acide nucléique ou une cassette d'expression telle que définie dans la présente description.
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L'invention a encore pour objet un procédé d'obtention d'une plante transformée caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) obtention d'une cellule hôte recombinante de Agrobacterium tumefaciens selon l'invention ; b) transformation d'une plante d'intérêt par infection avec les cellules hôtes recombinantes de Agrobacterium tumefaciens obtenues à l'étape a) ; c) sélection des plantes ayant intégré dans leur génome un acide nucléique ou une cassette d'expression telle que définie dans la présente description.
L'invention a encore pour objet un procédé d'obtention d'une plante transformée caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) transfecter au moins une cellule de plante avec un acide nucléique, avec une cassette d'expression ou avec un vecteur recombinant selon l'invention ; b) régénérer une plante entière à partir de la cellule de plante recombinante obtenue à l'étape a) ; c) sélectionner les plantes ayant intégré dans leur génome un acide nucléique ou une cassette d'expression selon l'invention.
L'un quelconque des procédés d'obtention d'une plante transformée décrit ci-dessus peut en outre comporter les étapes additionnelles suivantes : d) croisement entre elles de deux plantes transformées telles qu'obtenues à l'étape c) avec une plante de la même espèce ; e) sélection des plantes homozygotes pour le transgène.
Dans un second mode de réalisation particulier, l'un quelconque des procédés d'obtention d'une plante transgénique décrit ci-dessus peut en outre comporter les étapes additionnelles suivantes : f) croisement d'une plante transformée obtenue à l'étape c) avec une plante de la même espèce ; g) sélection des plantes issues du croisement de l'étape f) ayant conservé le transgène.
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Un autre objet de l'invention consiste en une plante transformée ou transgénique telle qu'obtenue selon l'un quelconque des procédés d'obtention d'une plante définie ci-avant.
L'invention a également pour objet une plante transformée, susceptible d'être obtenue par l'un quelconque des procédés décrits cidessus.
Elle est également relative à une semence ou un fruit d'une plante transformée susceptible d'être obtenue par l'un quelconque des procédés cidessus.
Elle est également relative à toute partie, notamment, tige, feuille, fleur, fruit d'une plante transformée susceptible d'être obtenue par l'un quelconques des procédés ci-dessus.
La transformation de cellules végétales peut être réalisée par les techniques connues de l'homme du métier.
On peut citer notamment les méthodes de transfert direct de gènes telles que la microinjection directe dans des embryoïdes de plante (NEUHAUS et al., 1987), l'infiltration sous vide (BECHTOLD et al., 1993) ou l'électro po ration (CHUPEAU et al., 1989) ou encore la précipitation directe au moyen de PEG (SCHOCHER et ai., 1986) ou le bombardement par canon de particules recouvertes de l'ADN plasmidique d'intérêt (FROMM et al. 1990).
On peut également infecter la plante par une souche bactérienne notamment d'Agrobacterium. Selon un mode de réalisation du procédé de l'invention, les cellules végétales sont transformées par un vecteur selon l'invention, ledit hôte cellulaire étant susceptible d'infecter lesdites cellules végétales en permettant l'intégration dans le génome de ces dernières, des séquences nucléotidiques d'intérêt initialement contenues dans l'ADN du vecteur susmentionné. Avantageusement, l'hôte cellulaire susmentionné utilisé est Agrobacterium tumefaciens, notamment selon la méthode décrite dans l'article de Ha and AN (1989), ou encore Agrobacterium rhizogenes, notamment selon la méthode décrite dans l'article de GUERCHE et al., (1987) ou encore dans la demande PCT N WO 00 22.148.
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Par exemple, la transformation des cellules végétales peut être réalisée par le transfert de la région T du plasmide circulaire extrachromosomique inducteur de tumeurs Ti d'Agrobacterium tumefaciens, en utilisant un système binaire (WATSON et al. 1994). Pour ce faire, deux vecteurs sont construits. Dans l'un de ces vecteurs, la région T a été éliminée par délétion, à l'exception des bordures droite et gauche, un gène marqueur étant inséré entre eux pour permettre la sélection dans les cellules de plantes. L'autre partenaire du système binaire est un plasmide Ti auxiliaire, plasmide modifié qui n'a plus de région T mais contient toujours les gènes de virulence vir, nécessaires à la transformation de la cellule végétale.
Selon un mode préféré, on peut utiliser la méthode décrite par ISHIDA et al. (1996) pour la transformation des Monocotylédones.
Selon un autre protocole, la transformation est réalisée selon la méthode décrite par FINER et al. (1992) utilisant le canon à particules de tungstène ou d'or.
L'homme du métier est capable de mettre en oeuvre de nombreux procédés de l'état de la technique afin d'obtenir des plantes transformées par un acide nucléique régulateur ou une cassette d'expression selon l'invention.
L'homme du métier pourra se référer avantageusement à la technique décrite par BECHTOLD et ai. (1993) afin de transformer une plante à l'aide de la bactérie Agrobacterium tumefaciens. Des techniques utilisant d'autres types de vecteurs peuvent également être utilisées, telles que les techniques décrites par BOUCHEZ et al. (1993) ou encore par HORSCH et al. (1994).
A titre illustratif, une plante transgénique selon l'invention peut être obtenue par des techniques de biolistique telles que celles décrites par FINER et al. (1992) ou encore celles décrites par VAIN et al. (1993).
D'autres techniques préférées de transformation d'une plante conformément à l'invention par Agrobacterium tumefaciens sont celles décrites par ISHIDA et al. (1996) ou encore dans la demande PCT publiée sous le n WO 95/06 722 au nom de JAPAN TOBACCO.
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L'invention a encore pour objet une semence de plante dont les cellules constitutives comprennent un acide nucléique régulateur ou une cassette d'expression selon l'invention, qui a été artificiellement inséré dans son génome.
L'invention a encore pour objet une semence d'une plante transgénique telle que définie ci-avant ou encore un fruit d'une telle plante transgénique.
Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation d'un acide nucléique régulateur tel que défini dans la présente description pour l'expression in vitro ou in vivo, de préférence in planta, d'un polynucléotide d'intérêt, préférentiellement un polynucléotide dont l'expression est toxique pour la cellule végétale.
L'invention a encore pour objet une plante transformée affectée dans le développement de ces graines, susceptible d'être obtenue par l'un quelconque des procédés ci-dessus, ainsi que toute partie de cette plante transformée, y compris ces fruits.
L'invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples suivants.
Description des figures
La figure 1 représente un schéma des différentes constructions nucléotidiques ou cassettes d'expression contenant respectivement tout ou partie de l'acide nucléique régulateur de séquence SEQ ID Nl et un gène rapporteur placé en aval de l'acide nucléique régulateur, le gène rapporteur GUS. Schéma des constructions contenant le gène rapporteur GUS placé sous le contrôle de différentes délétions réalisées en 5'de la région promotrice du gène BAN. + 1 et ATG représentent les sites d'initiation de la traduction respectivement ; RNT, région non traduite ; Myc et Myb, boîte cis reconnues par des facteurs de transcription de type Myc (bHLH) et de type Myb, respectivement ; les chiffres représentent des paires de bases.
La figure 1 représente un schéma des différentes constructions nucléotidiques ou cassettes d'expression contenant respectivement tout ou partie de l'acide nucléique régulateur de séquence SEQ ID Nl et un gène rapporteur placé en aval de l'acide nucléique régulateur, le gène rapporteur GUS. Schéma des constructions contenant le gène rapporteur GUS placé sous le contrôle de différentes délétions réalisées en 5'de la région promotrice du gène BAN. + 1 et ATG représentent les sites d'initiation de la traduction respectivement ; RNT, région non traduite ; Myc et Myb, boîte cis reconnues par des facteurs de transcription de type Myc (bHLH) et de type Myb, respectivement ; les chiffres représentent des paires de bases.
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La figure 2 illustre le principe de détermination des oligonucléotides utilisés pour l'amplification des délétions, la figure 2 illustrant plus particulièrement la construction du vecteur pBAN1 : : GUS.
En haut : Addition d'un site de restriction SAII à l'extrémité 5'gta GTCGAC ATTTAGGCCAAGATTTTAGGAG.
En bas : Modification de la région ATG pour créer un site de restriction Ncol.
La figure 3 illustre le profil d'expression temporelle du gène BAN (RT-PCR et expression GUS), comparée à l'activité du gène GUS placé sous le contrôle de p BAN1.
La figure 4 illustre la construction du vecteur pBAN : : GUS
La figure 5 illustre le protocole de construction du vecteur pBan : : Gus/pBIB-HYG.
La figure 5 illustre le protocole de construction du vecteur pBan : : Gus/pBIB-HYG.
La Figure 6 illustre le profil d'expression du gène rapporteur GUS placé sous le contrôle du promoteur pBAN1.
A, bouton floral ; B, fleur non pollinisée ; C, silique de 3 jours après pollinisation Uap) ; D, gros plan de graines immatures dans une silique de 3 JAP. E, Nomarski de graine immature d'une plante sauvage (sans GUS, montrant la structure de la testa, particulièrement la localisation de l'endothélium ; F, coupe transversale dans une graine ; G, Nomarski de graine immature (3 jap). H, fragment de feuille de rosette ; 1, fragments de tiges ; J. germination de 4 jours. Les flèches des figures D ? E, F et G désignent l'endothélium ; en, endothélium ; t, testa ; emb, embryon ; alb, albumen.
La Figure 7 illustre la construction du vecteur pBAN1 : : barnasebarstar
La Figure 8 illustre la construction du vecteur pBAN1 : : barnase- barstar/pBIB-HYG
La Figure 9 illustre l'ablation génétique de l'endothélium par le gène barnase placé sous le contrôle du promoteur pBAN1. A, Nomarski de graine immature d'un transformant pBAN1 : : Barnase révélant l'absence d'endothélium (comparer avec la situation chez des graines sauvages, à la figure 6E) ; B, détection de tannins au niveau de l'endothélium chez une
La Figure 8 illustre la construction du vecteur pBAN1 : : barnase- barstar/pBIB-HYG
La Figure 9 illustre l'ablation génétique de l'endothélium par le gène barnase placé sous le contrôle du promoteur pBAN1. A, Nomarski de graine immature d'un transformant pBAN1 : : Barnase révélant l'absence d'endothélium (comparer avec la situation chez des graines sauvages, à la figure 6E) ; B, détection de tannins au niveau de l'endothélium chez une
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plante sauvage, par le test vanilline colorant les tannins en rouge sombre (flèche) ; C, test vanilline sur graines immatures d'un transformant pBAN1 : : Barnase révélant l'absence de tannins ; D et E, graines matures de plantes sauvages (graines brunes) et de graines de transformant pBAN1 : : Barnase (graines brunes) et de graines de transformant p BAN1 : : Barnase (graines jaunes) ; le, localisation de l'endothélium chez le sauvage.
EXEMPLES MATERIE ET METHODES GENERAUX UTILISES DANS LES EXEMPLES. a) Matériel végétal
Les essais ont été réalisés exclusivement sur Arabidopsis thaliana (L. ) Heynh. génotype Wassilevskija-2 (Ws-2), qui est également utilisé pour générer la collection de transformants à ADN-T de l'INRA de Versailles (BECHTOLD et al., 1993). b) Souches bactériennes
Pour les clonages moléculaires : Escherichia coli DH12S (GibcoBRL).
Les essais ont été réalisés exclusivement sur Arabidopsis thaliana (L. ) Heynh. génotype Wassilevskija-2 (Ws-2), qui est également utilisé pour générer la collection de transformants à ADN-T de l'INRA de Versailles (BECHTOLD et al., 1993). b) Souches bactériennes
Pour les clonages moléculaires : Escherichia coli DH12S (GibcoBRL).
Pour la transformation de plantes : Agrobacterium tumefaciens C58CI souche GV3101 contenant le plasmide pMP90 (KONCZ et al., 1984). c) Plasmides - pBluescript SK + abrégé pBS (Stratagène)
Ce vecteur de clonage contient un gène de résistance à l'ampicilline et un site multiple de clonage situé dans le gène LacZ, permettant une sélection blanc/bleu des colonies transformées/non transformées.
Ce vecteur de clonage contient un gène de résistance à l'ampicilline et un site multiple de clonage situé dans le gène LacZ, permettant une sélection blanc/bleu des colonies transformées/non transformées.
- pRTL2-GUS
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Ce vecteur de clonage a été construit par James Carrington (Washington State University, Pullman, USA). Il dérive du vecteur pRTL2 (Carrington et al., 1990) auquel a été ajoutée la cassette suivante : le gène rapporteur GUS (JEFFERSON et al., 1987) précédé d'une courte séquence activatrice de traduction (TL) et placé entre un double promoteur 35S et le terminateur 35S (TOPFER et al., 1987). Un site N col créé à l'ATG du gène GUS permet la réalisation de fusions traductionnelles.
- pWP146
Ce vecteur comporte le gène de la barnase sous le contrôle du promoteur AG du maïs ainsi que le gène codant pour la Barstar placé sous le contrôle d'un promotur bactérien pour permettre la croissance des bactéries.
Ce vecteur comporte le gène de la barnase sous le contrôle du promoteur AG du maïs ainsi que le gène codant pour la Barstar placé sous le contrôle d'un promotur bactérien pour permettre la croissance des bactéries.
- pBIB-HYG
Ce vecteur binaire comporte, outre un site de multiclonage, un gène de résistance à l'hygromycine (HYG) à expression in planta (BECKER, 1990).
Ce vecteur binaire comporte, outre un site de multiclonage, un gène de résistance à l'hygromycine (HYG) à expression in planta (BECKER, 1990).
B) METHODES
B. 1) Culture de plantes.
B. 1) Culture de plantes.
- En serre climatisée :
Les plantules provenant soit d'un semi préalable sur papier filtre humide, soit de culture in vitro sont repiquées en pots individuels (multiplication de génotypes) ou en barquettes (transformations, à raison de 30 plantules/barquette), sur terreau (Stender, Allemagne). La croissance des plantes est soutenue par un arrosage régulier avec une solution nutritive (Coïc et Lessaint, 1971). La température est maintenue aux environs de
25 C le jour et 20 C la nuit. D'autre part, un éclairage d'appoint à l'aide de lampes à vapeur de mercure assure quotidiennement 16h de jour tout au long de l'année. Dans ces conditions, il faut compter environ 3 mois entre la
Les plantules provenant soit d'un semi préalable sur papier filtre humide, soit de culture in vitro sont repiquées en pots individuels (multiplication de génotypes) ou en barquettes (transformations, à raison de 30 plantules/barquette), sur terreau (Stender, Allemagne). La croissance des plantes est soutenue par un arrosage régulier avec une solution nutritive (Coïc et Lessaint, 1971). La température est maintenue aux environs de
25 C le jour et 20 C la nuit. D'autre part, un éclairage d'appoint à l'aide de lampes à vapeur de mercure assure quotidiennement 16h de jour tout au long de l'année. Dans ces conditions, il faut compter environ 3 mois entre la
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plantation et la récolte de graines matures. Le battage des transformants s'effectue en serre, où les eaux usagées sont filtrées puis traitées à l'eau de JAVEL. Equipées d'un sas d'entrée et d'un filtre de mailles inférieures à 1 mm au niveau des aérations, les serres sont conformes aux normes de sécurité concernant la manipulation d'organismes génétiquement modifiés.
- En culture in vitro (conditions axéniques)
Les graines sont préalablement désinfectées par trempage 30 min dans une solution alcoolique à 1 % de chlore actif suivi de 3 rinçages successifs dans l'alcool 96%. Le semi s'effectue alors en boîtes de Pétri sur milieu minéral de GAMBORG et al. (1968) additionné de 1% de saccharose et de 0,8% d'agar (Bio Mérieux). Un antibiotique variant selon la résistance in planta portée par le vecteur binaire (kanamycin ou hygromycin à une concentration de 50 mg. 1-1) est ajouté pour la sélection de transformants.
Les graines sont préalablement désinfectées par trempage 30 min dans une solution alcoolique à 1 % de chlore actif suivi de 3 rinçages successifs dans l'alcool 96%. Le semi s'effectue alors en boîtes de Pétri sur milieu minéral de GAMBORG et al. (1968) additionné de 1% de saccharose et de 0,8% d'agar (Bio Mérieux). Un antibiotique variant selon la résistance in planta portée par le vecteur binaire (kanamycin ou hygromycin à une concentration de 50 mg. 1-1) est ajouté pour la sélection de transformants.
Les graines sont soumises à un traitement au froid (3 jours à 4 C) pour lever la dormance et homogénéiser la levée avant d'être incubées en chambre de culture climatisée (60% d'humidité relative, 16 h de lumière à 20 C/8 h d'obscurité à 15 C, intensité lumineuse 200-250u E. m's au niveau des boîtes).
B. 2. Extractions d'acides nucléiques - ADN plasmidique
Les minipréparations pour vérification rapide des clones bactériens sont réalisées suivant la méthode de lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979).
Les minipréparations pour vérification rapide des clones bactériens sont réalisées suivant la méthode de lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979).
Les maxipréparations de plasmides et de BACs pour clonages sont effectuées à l'aide du kit Plasmid Purification (Qiagen), suivant les recommandations du fournisseur.
- ADN végétât
Le protocole adopté est celui préconisé par KUBO et al. (1999).
Le protocole adopté est celui préconisé par KUBO et al. (1999).
L'ADN est isolé à partir de feuilles de rosettes âgées de 3 semaines.
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- ARNs totaux végétaux
L'ARN a été isolé à partir de tissus pour la plupart récoltés sur plantes sauvages Ws cultivées en serre. Seules les racines et les germinations de 4 jours ont été obtenues in vitro. Les stades de développement des siliques immatures ont été numérotés de 1 à 10 du sommet à la base des hampes florales, chaque stade incluant 4 siliques successives. Le stade moyen de développement de l'embryon a été déterminé pour chaque catégorie de siliques par observation d'un échantillon de graines sous microscope après incubation dans une solution d'hydrate de chloral (cf g) NOMARSKI).
L'ARN a été isolé à partir de tissus pour la plupart récoltés sur plantes sauvages Ws cultivées en serre. Seules les racines et les germinations de 4 jours ont été obtenues in vitro. Les stades de développement des siliques immatures ont été numérotés de 1 à 10 du sommet à la base des hampes florales, chaque stade incluant 4 siliques successives. Le stade moyen de développement de l'embryon a été déterminé pour chaque catégorie de siliques par observation d'un échantillon de graines sous microscope après incubation dans une solution d'hydrate de chloral (cf g) NOMARSKI).
L'extraction d'ARNs totaux a été réalisée à l'aide du RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) complété par un traitement à la Dnase suivant le protocole du kit RNase-Free Dnase Set (Qiagen).
B. 3 Clonages moléculaires : - Amplification des promoteurs par PCR
Les délétions en 5'du promoteur de BAN ont été obtenues par PCR à partir de l'ADN du BAC T13M11 (Accession AC005882).
Les délétions en 5'du promoteur de BAN ont été obtenues par PCR à partir de l'ADN du BAC T13M11 (Accession AC005882).
Approximativement 150 ng d'ADN ont servi de matrice pour l'amplification,
en présence de 10 1. tampon Pfu 10X, 2pi dNTPs 5 mM, 2 1. de chacun des oligos spécifiques à 10 picoM (Tableau 2), 0, 8u1 (2 unités) d'ADN polymérase Pfu TURBO (Stratagène) et de l'eau bidistillée stérile, q. s. p. 40 1. 11. Après une dénaturation préalable de 3 min à 94 C, 35 cycles d'amplification sont réalisés, 1 cycle comprenant 30 sec à 94 C, 30 sec à 60 C et 2 min 30 sec à 72 C ; la PCR se termine par 10 min à 72 C. Les PCRs sont réalisées à l'aide d'un thermocycleur PTC-100 (programmable Thermal Controller, MJ Research, INC.).
en présence de 10 1. tampon Pfu 10X, 2pi dNTPs 5 mM, 2 1. de chacun des oligos spécifiques à 10 picoM (Tableau 2), 0, 8u1 (2 unités) d'ADN polymérase Pfu TURBO (Stratagène) et de l'eau bidistillée stérile, q. s. p. 40 1. 11. Après une dénaturation préalable de 3 min à 94 C, 35 cycles d'amplification sont réalisés, 1 cycle comprenant 30 sec à 94 C, 30 sec à 60 C et 2 min 30 sec à 72 C ; la PCR se termine par 10 min à 72 C. Les PCRs sont réalisées à l'aide d'un thermocycleur PTC-100 (programmable Thermal Controller, MJ Research, INC.).
- Vérification des construits
Elle est effectuée par analyse de restriction et par séquençage à l'aide d'oligo situés au niveau des jonctions vecteur/insert en utilisant des oligos universels de pBS (M13 et reverse) ou d'oligos spécifiques.
Elle est effectuée par analyse de restriction et par séquençage à l'aide d'oligo situés au niveau des jonctions vecteur/insert en utilisant des oligos universels de pBS (M13 et reverse) ou d'oligos spécifiques.
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- Digestions et ligatures
Elles sont réalisées en suivant les conditions préconisées par le' fournisseur des enzymes de restriction (GIBCOBRL) et de la T4 ADN ligase (GIBCOBRL).
Elles sont réalisées en suivant les conditions préconisées par le' fournisseur des enzymes de restriction (GIBCOBRL) et de la T4 ADN ligase (GIBCOBRL).
- Séquençage d'ADN
Le séquençage a été réalisé par la méthode de JANGER à l'aide d'un appareil séquenceur ABI Société Applied BIOSYSTEMS, Inc.
Le séquençage a été réalisé par la méthode de JANGER à l'aide d'un appareil séquenceur ABI Société Applied BIOSYSTEMS, Inc.
- Transformation de bactéries
Des bactéries électrocompétentes (Sambrook et al., 1989) sont électroporées en présence de 10u ! de produit de ligation. Ce dernier est préalablement dessalé par diafiltration sur membrane de 0, 025 um (SCHLEICHER et SCHUELL). L'électroporation est réalisée sous une tension de 1,25 kV appliquée pendant une durée qui est fonction de la
résistance et de la capacité (200 Q et 25 uF, respectivement du circuit de l'électroporateur du type Gene Pulser Il System, commercialisé par la Société Bio-Rad)..
Des bactéries électrocompétentes (Sambrook et al., 1989) sont électroporées en présence de 10u ! de produit de ligation. Ce dernier est préalablement dessalé par diafiltration sur membrane de 0, 025 um (SCHLEICHER et SCHUELL). L'électroporation est réalisée sous une tension de 1,25 kV appliquée pendant une durée qui est fonction de la
résistance et de la capacité (200 Q et 25 uF, respectivement du circuit de l'électroporateur du type Gene Pulser Il System, commercialisé par la Société Bio-Rad)..
B. 4. Production de plantes transgéniques
La transformation est réalisée par incubation de plantes en début de floraison pendant 5 min dans un milieu d'infiltration contenant Agrobacterium (voir BECHTOLD et al., 1993, pour les détails de la procédure) ainsi que de l'agent mouillant Silwet (WILCO, Belgique) à 15u !/250 ml, selon la méthode de Clough and Bent (1998).
La transformation est réalisée par incubation de plantes en début de floraison pendant 5 min dans un milieu d'infiltration contenant Agrobacterium (voir BECHTOLD et al., 1993, pour les détails de la procédure) ainsi que de l'agent mouillant Silwet (WILCO, Belgique) à 15u !/250 ml, selon la méthode de Clough and Bent (1998).
B. 5. RT-PCR SEMI-QUANTITATIVE
Les ADNcs simples brins sont synthétisés à partir de 1 ug d'ARNs totaux dans un volume de 20 pI contenant 20 mM Tris-HCI (pH 8 ; 4), 50 mM Kcl, 2.5 mM MgCI2, 10 mM DTT, 1 mM dNTPs, 500 ng oligos (dT) 12-18 (GibcoBRL), 25 unités de Rnase Out (GibcoBRL) et 200 unités de transcriptase réverse MMLV SuperScript Il (GibcoBRL) pendant 50 min. à 42 C.
Les ADNcs simples brins sont synthétisés à partir de 1 ug d'ARNs totaux dans un volume de 20 pI contenant 20 mM Tris-HCI (pH 8 ; 4), 50 mM Kcl, 2.5 mM MgCI2, 10 mM DTT, 1 mM dNTPs, 500 ng oligos (dT) 12-18 (GibcoBRL), 25 unités de Rnase Out (GibcoBRL) et 200 unités de transcriptase réverse MMLV SuperScript Il (GibcoBRL) pendant 50 min. à 42 C.
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Deux l de la solution d'ADNcs simples brins préalablement diluée 10 fois a été utilisée pour la réaction de PCR réalisée dans un volume total de 50 1-11 en présence de 20 mM Tris-HCI (pH 8.4), 50 mM Kcl, 1.5 mM MgCiz, 0.2 mM dNTPs, 0.2 uM de chaque oligo gène-spécifique et 1 unité de Taq DNA polymérase (GibcoBRL). Les oligos gène-spécifique ban-sens (5'- AACAACTAAATCTCTATCTCTGTA-3'SEO ID N 2) et ban-antisens (5'GAATGAGACCAAAGACTCATATAC-3' SEQ I ID ? 3) (Dévie et al., 1999) permettent d'amplifier une bande de 1,2 kb dans l'ADNc de BAN et de 1,5 kb dans l'ADN génomique. Les oligos gène-spécifique GBGe306-sens (5'ACCAGGAGGTTTTCAAAGAC-3' SEQ I ID N 4) et GBGe306-antisens (5'- CAACATAACTTGCTCTGTTC-3'SEO ID Nos) amplifient une bande de 0,9 kg dans l'ADNc de GBGe306, et de 1,1 kb dans l'ADN génomique. Le gène EF1 A4 codant pour un facteur d'élongation (GenBankX16432 ; Liboz et al., 1990) a été utilisé comme contrôle positif. Les oligos gène-spécifique EF-sens (5'ATGCCCCAGGACATCGTGATTTCAT-3' SEQ ID N 6) et EF-antisens (5'TTGGCGGCACCCTTAGCTGGATCA-3'SEO ID N 7) amplifient une bande de 0,7 kb dans l'ADNc de EF1 A4, et de 0,9 kb dans l'ADN génomique. Pour s'assurer de la linéarité de l'amplification des PCRs comportant 18,21 et 24 cycles ont été réalisées. Chaque cycle comprend 30 sec à 94 C, 30 sec à 60"C et 2 min 30 sec à 72 C. Les trois séries ont satisfait les exigences de linéarité d'amplification, mais seulement la série à 21 cycles est présentée. Les échantillons amplifiés sont séparés sur gel d'agarose à 1% (p/v) en tampon TAE puis sont transférés sur membrane de nylon GeneScreen Plus (NEN, USA) chargée positivement selon la méthode préconisée par Sambrook et al. (1989). Après préhybridation dans un tampon à 7% SDS, 2 mM EDTA et 0,25 M Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,4 durant 1 heure à 65 C, la membrane est hybridée à 650C durant une nuit dans le même tampon auquel est ajoutée la sonde cDNA ad hoc obtenue en utilisant les oligos présentés ci-dessus et marquée au (P)-dCTP à l'aide du kit Prime-a-Gene Labeling System (Promega). La membrane est ensuite lavée durant 15 minutes à 650C dans le tampon LAVI (2 X SSC, 0,5% sarkosyl, 0,2% NaO, 10 H2O) séchée et enveloppées dans un film alimentaire (Saran) puis placée à-80 C au contact d'un film photographique (Hyperfilm MP0, Amersham, GB) sous écran amplificateur (Amersham).
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* B. 6 Test GUS
Le protocole de coloration GUS (Jefferson et al., 1987) consiste à incuber des fragments de plantes dans un tampon stérile contenant 100 mM
de tampon phosphate pH 7, 2 (Sambrook et al., 1989), 10 mM Na2-EDTA, 0, 1% Triton X-100, 2 mM X-Gluc (Duchefa) et 2, 5 mM de ferricyanide et de ferrocyanide. L'incubation a lieu à l'obscurité à 37 C pendant une nuit.
Le protocole de coloration GUS (Jefferson et al., 1987) consiste à incuber des fragments de plantes dans un tampon stérile contenant 100 mM
de tampon phosphate pH 7, 2 (Sambrook et al., 1989), 10 mM Na2-EDTA, 0, 1% Triton X-100, 2 mM X-Gluc (Duchefa) et 2, 5 mM de ferricyanide et de ferrocyanide. L'incubation a lieu à l'obscurité à 37 C pendant une nuit.
B. 7 Microscopie
Les organes végétaux sont incubés pendant quelques minutes dans une solution d'éclaircissement de cellules, composée d'hydrate de chloral/glycérol/eau (8/1/2, p/v/v) sur lame de microscopie, avant d'être observés sous lamelle à l'aide d'un microscope équipé d'optiques à contraste d'interférence différentielle de type Nomarski. Le test vanilline pour la détection des tannins dans les tissus est réalisé selon la méthode de Aastrup et al. (1984).
Les organes végétaux sont incubés pendant quelques minutes dans une solution d'éclaircissement de cellules, composée d'hydrate de chloral/glycérol/eau (8/1/2, p/v/v) sur lame de microscopie, avant d'être observés sous lamelle à l'aide d'un microscope équipé d'optiques à contraste d'interférence différentielle de type Nomarski. Le test vanilline pour la détection des tannins dans les tissus est réalisé selon la méthode de Aastrup et al. (1984).
EXEMPLE 1 : Construction de plusieurs cassettes d'expression comprenant un polynucléotide codant pour le polypeptide GUS. placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention.
1. a) Plan des délétions de la partie 5'du gène BAN
Des délétions sur une région de 2.4 kb en amont du site d'initiation de la traduction ont été réalisées. Ces délétions sont illustrées sur la figure 1.
Des délétions sur une région de 2.4 kb en amont du site d'initiation de la traduction ont été réalisées. Ces délétions sont illustrées sur la figure 1.
Un découpage en trois zones majeures a été effectué.
- la zone 1 (415 pb) comprend la région 5'transcrite non traduite du gène BAN et le promoteur sensu stricto de BAN, ainsi que la région 3' transcrite non traduite de GBGe306 ; - la zone Il (908 pb) correspond à la région génomique couverte par le transcrit de GBGe306 ; - la zone tt) (1323 pb) comprend la région 5'transcrite non traduite de GBGe306, le promoteur sensu stricto de ce gène ainsi qu'une zone intergénique indéfinie.
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Ce prédécoupage a pour but d'analyser la contribution de la région en amont du promoteur sensu stricto sur l'expression d'un polynucléotide d'intérêt, plus spécifiquement le polynucléotide codant pour le polypeptide GUS.
Chaque zone est également subdivisée en 4 (zone 1) ou 2 parties (zones)) et i) f). L'objectif de cette subdivision est de faciliter la détection de motifs fonctionnels gouvernant les spécificités d'expression développementales (tissulaire et temporelle) ainsi que la réponse à des stimuli environnementaux comme la lumière, la température etc.
1. b) Sous-clonage des délétions
Chaque délétion est amplifiée par PCR à partir du vecteur BAC
T13M11 contenant un insert d'ADN génomique de Arabidopsis thaliana, écotype Columbia. L'ADN polymérase employée et la Pfu, pour son activité d'autocorrection.
Chaque délétion est amplifiée par PCR à partir du vecteur BAC
T13M11 contenant un insert d'ADN génomique de Arabidopsis thaliana, écotype Columbia. L'ADN polymérase employée et la Pfu, pour son activité d'autocorrection.
L'amplification est effectuée à l'aide d'oligonucléotides déterminés de la manière suivante, illustrée sur la figure 2 : - oligo 5' : ils sont spécifiques de la délétion et sont modifiés par l'addition d'un site de restriction Salil précédé de 3 bases de sécurité.
- oligo 3' : il est commun à toutes les délétions. La création d'un site Ncol par modification de la séquence d'origine permet la mise en fusion traductionnelle de la délétion et du gène rapporteur.
Les produits d'amplification ont ensuite été clonés bords francs dans le vecteur pBS-SK aux sites Smal ou EcorV pour être séquencés intégralement.
1. c) Gène rapporteur.
La mise en fusion traductionnelle nécessite la présence d'un site Ncol à l'ATG du gène rapporteur. Le clonage des promoteurs s'effectue dans un vecteur de sous-clonage présentant une cassette rapporteur : : terminateur. Ensuite la cassette promoteur : : rapporteur : : terminateur est transférée dans un vecteur binaire.
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Le choix du rapporteur s'est porté sur le gène GUS dont le produit est très stable et peut s'accumuler dans les tissus, permettant de détecter des activités très faibles avec le temps.
L'intérêt du gène GUS provenant du plasmide pRTL2 (fig. 4) construit par James Carrington (Washington State University, Pullman, USA) est qu'il présente au niveau de son codon d'initiation de la traduction (ATG) un site de restriction NeOI qui permet sa mise en fusion traductionnelle avec les promoteurs.
1. d) Introduction des promoteurs BAN dans les vecteurs de sous-clonage.
La cassette TL : : GUS : : terminateur 35S a été transférée dans le plasmide pBS-SK pour construire le plasmide pBS-GUS. Ce plasmide intermédiaire est plus adéquat que pRTL2 pour le clonage ultérieur des promoteurs. La construction des plasmides pBAN : : GUS est illustrée sur la figure 4.
Les promoteurs, excisés de pBS par digestion avec Sali et Ncol, sont ligaturés dans pBS-GUS préalablement digéré par Xhol (compatible Sali) et Ncol pour construire les plasmides pBAN : : GUS (voir figure 3). l. e) Transfert des cassettes d'expression pBAN : : rapporteur : : terminateur 35S dans un vecteur binaire.
Le vecteur binaire pBIB-HYG (Becker, 1990) comportant une résistance à l'hygromycine a été utilisé. La carte du vecteur pBIB-HYG est représentée sur la figure 5.
- Construction du vecteur binaire pBAN : GUS
La cassette pBAN : : GUS : : term35S, sortie du vecteur pBAN-GUS par digestion Kpnl/Smal est ligaturée dans le vecteur pBIB-HYG digéré par Kpnl/Smal, pour former le vecteur pBAN-GUS/pBIB-HYG. Le protocole de construction des vecteurs pBAN : : GUS pBIB-HYG est représenté sur la figure 5.
La cassette pBAN : : GUS : : term35S, sortie du vecteur pBAN-GUS par digestion Kpnl/Smal est ligaturée dans le vecteur pBIB-HYG digéré par Kpnl/Smal, pour former le vecteur pBAN-GUS/pBIB-HYG. Le protocole de construction des vecteurs pBAN : : GUS pBIB-HYG est représenté sur la figure 5.
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- Construction du vecteur binaire pBAN : GFP5
La cassette pBAN : : GFP5 : : term35S, sortie du vecteur pBAN-GFP5 par digestion Kpnl/Smal est ligaturée dans le vecteur pBIB-HYG digéré par Kpnl/Smal, pour former le vecteur pBAN-GUS/pBIB-HYG. Le protocole de construction du vecteur pBAN1-GFP5/pBIB-HYG est représenté sur la figure
6.
La cassette pBAN : : GFP5 : : term35S, sortie du vecteur pBAN-GFP5 par digestion Kpnl/Smal est ligaturée dans le vecteur pBIB-HYG digéré par Kpnl/Smal, pour former le vecteur pBAN-GUS/pBIB-HYG. Le protocole de construction du vecteur pBAN1-GFP5/pBIB-HYG est représenté sur la figure
6.
1. f) Construction du vecteur pBAN1 : : Barnase-Barstar (BN-BS) lpBIB- HYG
Le promoteur pBAN1 excisé de pBS par une digestion Sall/Ncol est ligaturé dans le vecteur pWP146 préalablement digéré par Sail et Ncol (Figure 7).
Le promoteur pBAN1 excisé de pBS par une digestion Sall/Ncol est ligaturé dans le vecteur pWP146 préalablement digéré par Sail et Ncol (Figure 7).
La cassette d'expression pBAN1 : : BN-BS : : tCaMV est excisée de pBAN1 : : BN-BS par digestion Xhol et ligaturée dans pBIB-HYG préalablement digéré par Sali, qui est compatible avec Xhol (Figure 8).
EXEMPLE 2- Transformation in planta.
Les cassettes d'expression en vecteurs binaires sont introduites dans des plantes d'Arabidopsis écotype Ws (T,, plante infiltrée) par la méthode d'infiltration au Silwet mise au point par Clough and Bent (1998). Le Silwet est un agent mouillant très puissant introduit dans la solution d'Agrobacterium juste avant trempage des plantes.
Les graines des plantes transformées sont récoltées en bulk, stérilisées et semées sur milieu nutritif avec hygromycine. L'obtention de plantules T1 (transformants primaires) avec siliques nécessite en moyenne 3,5 à 4 mois.
EXEMPLE 3 : Transformation de plantes avec diverses cassettes d'expression contenant un acide nucléique régulateur dérivé de la séquence SEQ ID N01 selon l'invention.
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Les observations de coloration GUS détaillées ci-après concernent des transformants d'Arabidopsis exprimant les constructions pBAN1 : : GUS, pBAN2 : : GUS, pBAN3 : : GUS, pBAN5 : : GUS et pBAN6 : : GUS. Cinq transformants indépendants ont été étudiés par construit. Les transformants contenant les constructions pBAN4 : : GUS, pBAN7 : : GUS et pBAN8 : : GUS ont également été réalisés.
D'une façon générale, dans la majorité des transformants considérés, l'expression GUS est observée dans l'endothélium de graines immatures sans différence mesurable dans la force d'expression entre les différentes cassettes d'expression expérimentées. Cependant, une variabilité quantitative est observée entre transformants indépendants pour une même cassette d'expression, ce qui est probablement à mettre en corrélation avec le nombre de transgènes exprimés par plante, ou avec des effets de position d'insertion du T-DNA dans le génome.
Quelle que soit la cassette d'expression utilisée, il existe des transformants montrant également une expression durant la germination localisée dans l'albumen, parfois à la jonction hypocotyle-racine ou bien dans la pointe racinaire. Quelques profils d'expression ont également été obtenus pour un transformant particulier (ex expression GUS dans la totalité de l'hypocotyle et de la racine pour un des transformants pBAN5 ou expression dans les feuilles pour l'un des transformants pBAN6). Le profil d'expression obtenu peut donc toujours varier en fonction de l'événement de transformation considéré. Donc, quel que soit le construit considéré, il est nécessaire de tester plusieurs transformants indépendants pour obtenir le profil d'expression spécifique souhaité.
L'observation des colorations GUS effectuées sur les plantes exprimant la cassette d'expression pBAN5 montre que l'utilisation d'un promoteur de 457 (415 + 42) paires de base en amont du site d'initiation de la traduction permet d'obtenir une expression forte et endothélium spécifique.
Cependant, l'observation des plantes exprimant la cassette d'expression pBAN6 montre qu'un promoteur plus petit, de 322 (280 + 42) paires de base en amont du site d'initiation de la traduction, confère toujours une forte expression graine spécifique, dans l'endothélium, mais également dans la couche à aleurone.
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En conséquence, la région promotrice située entre-457 et-322 paires de base en amont du site d'initiation de la traduction contient le (s) motif (s) nécessaire (s) et suffisant (s) pour réprimer une expression dans la couche à aleurone.
CONCLUSION :
Bien que les différents promoteurs testés soient fonctionnels, les promoteurs de type pBAN5 et pBAN6 seront utilisés préférentiellement, selon les besoins, pour conférer une expression spécifique dans l'endothélium (pBAN5) ou dans l'endothélium et l'albumen (pBAN6).
Bien que les différents promoteurs testés soient fonctionnels, les promoteurs de type pBAN5 et pBAN6 seront utilisés préférentiellement, selon les besoins, pour conférer une expression spécifique dans l'endothélium (pBAN5) ou dans l'endothélium et l'albumen (pBAN6).
Enfin, une analyse in silico de la séquence du promoteur pBAN6 (confrontation à la base de données PLACE à l'aide du serveur Web Signal Scan ; http ://www. dna. affrc. go. jp/htdocs/PLACE/signatscan. htmi) a permis de dresser une carte de motifs de régulation putatifs présents sur ce promoteur. Une importante information est la localisation d'un site de fixation de facteur de transcription de type MYB, à proximité de celui d'un facteur de type MYC, au début de pBAN7. Or NESI et al. (2000) ont montré que le gène BAN est régulé positivement par les gènes TT2 (spécifique graine, facteur de typeMYB, séquence non publiée) et TT8 (codant pour un facteur MYC). Ces résultats suggèrent que ces boîtes seraient à l'origine de l'activité endothélium spécifique du promoteur.
EXEMPLE 4 : Construction d'une cassette d'expression contenant un polynucléotide dont l'expression est toxique pour la cellule, placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention.
La faisabilité de l'utilisation de la barnase placée sous le contrôle du promoteur pBAN1 pour l'ablation génétique de l'endothélium a été étudiée sur les deux premiers transformants indépendants. L'effet recherché pour une application biotechnologique est la réduction de taille de la graine pouvant aller jusqu'à l'ablation totale, ainsi que la suppression des flavonoïdes de l'endothélium conduisant à l'obtention de graines jaunes.
Le promoteur pBAN1 a été placé devant la cassette barnase : : barstar : : terminateur du vecteur pWP146 (barnase-barstar) fourni
<Desc/Clms Page number 47>
par Pascual Perez (Biogemma). La cassette pBAN1 : : barnase : : bastar : term a ensuite été transférée dans pBIB-HYG et le vecteur obtenu utilisé pour transformer des plantes sauvages d'Arabidopsis.
Des observations histologiques (Nomarski) ont révélé une absence totale d'endothélium chez les graines produites par les deux transformants obtenus (Figure 9A). D'autre part, aucun tannin n'a été détecté dans ces graines à l'aide du test vanilline (Figures 9B et 9C), ce qui conduit à la production de graines matures jaunes (Figure 9D), contrairement aux graines sauvages dont la couleur brune est due à la présence de tannins dans l'endothélium (Figure 9). Les graines des transformants sont d'autre part plus petites que celles de plante sauvage et présentent parfois une forme de coeur. Leur capacité à germer n'est pas affectée. Ces résultats préliminaires observés sur deux transformants indépendants confirment l'intérêt de l'approche d'ablation génétique de l'endothélium pour l'obtention de graines viables jaunes et de plus petite taille. Ils démontrent également que la suppression de l'endothélium seul n'est pas suffisante pour conduire à l'avortement de la graine. L'utilisation de pBAN6, qui permettrait d'affecter également l'albumen, est une possibilité à tester. Parallèlement on peut penser à modifier le présent système d'expression en ajoutant une séquence d'adressage de la toxine à l'extérieur de l'endothélium pour détruire l'albumen et l'embryon, la préservation de l'endothélium permettant la production d'une plus grande quantité de toxine (Martine Devic, communication personnelle).
EXEMPLE 5 : Construction d'un système d'expression inductible d'un polynucléotide toxique pour la cellule sous le contrôle d'un acide régulateur dérivé de la séquence SEQ ID N01 selon l'invention.
Un tel système d'expression inductible comprend : - une première cassette d'expression contenant un polynucléotide codant pour une protéine de fusion entre un récepteur aux glucocorticoïdes et le facteur de transcription GAL4, ce polynucléotide étant placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur dérivé de la séquence SEQ ID N01 selon l'invention ; et
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- une seconde cassette d'expression contenant un polynucléotide dont l'expression est toxique pour une cellule de plante, ce polynucléotide étant placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur susceptible d'être activé par le facteur de transcription GAL4.
Lorsqu'une plante est transformée par le système d'expression inductible ci-dessus, la protéine de fusion entre le récepteur aux glucocorticoïdes et le facteur de transcription GAL4 est produite de manière constitutive, spécifiquement dans l'endothélium, ou spécifiquement dans l'endothélium et l'albumen des graines de cette plante, grâce à la première cassette d'expression.
Lorsque la plante ainsi transformée est mise en contact avec un glucocorticoïde, le glucocorticoïde se fixe spécifiquement sur la partie récepteur de la protéine de fusion ci-dessus et entraîne la fixation de la partie GAL4 de la protéine de fusion sur l'acide nucléique régulateur contenu dans la seconde cassette d'expression. L'acide nucléique régulateur de la seconde cassette d'expression est activé et va induire l'expression du polynucléotide toxique pour la cellule, spécifiquement dans l'endothélium, ou spécifiquement dans l'endothélium et l'albumen des graines de la plante transformée, empêchant ainsi la formation de graines matures et fertiles.
Le système d'expression inductible défini de manière générale cidessus permet l'obtention contrôlée d'une descendance viable des plantes transformées ou au contraire l'obtention contrôlée d'événements d'avortement précoce des graines.
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TABLEAU 1 : SEQUENCES
<tb>
<tb> SEQ <SEP> ! <SEP> D <SEP> ? <SEP> Désignation
<tb> 1 <SEP> Insert <SEP> d'ADN <SEP> de <SEP> Pban1
<tb> 2 <SEP> Amorce <SEP> ban-sens
<tb> 3 <SEP> Amorce <SEP> ban-antisens
<tb> 4 <SEP> Amorce <SEP> GBGe <SEP> 306 <SEP> sens
<tb> 5 <SEP> Amorce <SEP> GBGe <SEP> 306 <SEP> antisens
<tb> 6 <SEP> Amorce <SEP> EF-sens
<tb> 7 <SEP> Amorce <SEP> EF-antisens
<tb> 8 <SEP> Insert <SEP> d'ADN <SEP> de <SEP> pBAN8
<tb> 9 <SEP> Insert <SEP> d'ADN <SEP> de <SEP> pBAN7
<tb> 10 <SEP> Insert <SEP> d'ADN <SEP> de <SEP> pBAN6
<tb> 11 <SEP> Insert <SEP> d'ADN <SEP> de <SEP>pBAN5
<tb> 12 <SEP> Insert <SEP> d'ADN <SEP> de <SEP> pBAN4
<tb> 13 <SEP> Insert <SEP> d'ADN <SEP> de <SEP> pBAN3
<tb> 14 <SEP> Insert <SEP> d'ADN <SEP> de <SEP> pBAN2
<tb> 15 <SEP> Amorce <SEP> pBAN <SEP> 1-5'
<tb> 16 <SEP> Amorce <SEP> pBAN2-5'
<tb> 17 <SEP> Amorce <SEP> pBAN3-5'
<tb> 18 <SEP> Amorce <SEP> pBAN4-5'
<tb> 19 <SEP> Amorce <SEP> pBAN5-5'
<tb> 20 <SEP> Amorce <SEP> pBAN6-5'
<tb> 21 <SEP> Amorce <SEP> pBAN7-5
<tb> 22 <SEP> Amorce <SEP> pBAN8-5'
<tb> 23 <SEP> Amorce <SEP> pBAN-3'
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<tb> 23 <SEP> Amorce <SEP> pBAN-3'
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.
Claims (34)
- Revendications 1. Acide nucléique comprenant des signaux de régulation permettant l'expression d'un polynucléotide d'intérêt, spécifiquement dans l'endothélium et/ou l'albumen d'une graine de plante, lorsque ce polynucléotide d'intérêt est placé sous le contrôle de ces signaux de régulation, ledit acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence SEQ ID N'l, ou avec un fragment d'au moins 200 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N'l.
- 2. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide possédant au moins 80 % d'identité en nucléotides avec la séquence allant du nucléotide en position 2273 jusqu'au nucléotide en position 2335 de la séquence SEQ ID N01.
- 3. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide possédant au moins 80 % d'identité en nucléotides avec la séquence allant du nucléotide en position 2141 jusqu'au nucléotide en position 2335 de la séquence SEQ ID N01.
- 4. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide possédant au moins 80 % d'identité en nucléotides avec la séquence allant du nucléotide en position 2 054 jusqu'au nucléotide en position 2335 de la séquence SEQ ID N'l.
- 5. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide possédant au moins 80 % d'identité en nucléotides avec la<Desc/Clms Page number 61>séquence allant du nucléotide en position 1919 jusqu'au nucléotide en position 2335 de la séquence SEQ ID N'l.
- 6. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide possédant au moins 80 % d'identité en nucléotides avec la séquence allant du nucléotide en position 1510 jusqu'au nucléotide en position 2335 de la séquence SEQ ID N'l.
- 7. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide possédant au moins 80 % d'identité en nucléotides avec la séquence allant du nucléotide en position 1011 jusqu'au nucléotide en position 2335 de la séquence SEQ ID ? 1.
- 8. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence allant du nucléotide en position 509 jusqu'au nucléotide en position 2335 de la séquence SEQ ID N'l.
- 9. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 2335 de la séquence SEQ ID N'l.
- 10. Acide nucléique de séquence complémentaire à un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9.
- 11. Cassette d'expression comprenant un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9.
- 12. Cassette d'expression selon la revendication 11, caractérisée en ce que le polynucléotide d'intérêt code pour un polypeptide.<Desc/Clms Page number 62>
- 13. Cassette d'expression selon la revendication 12, caractérisé en ce que le polynucléotide d'intérêt code pour un polypeptide impliqué dans la régulation du contenu en tannins ou en fibres de la graine ou pour un polypeptide régulant l'équilibre hormonal dans la testa de la graine.
- 14. Cassette d'expression selon la revendication 13, caractérisée en ce que le polynucléotide d'intérêt code pour un polypeptide choisi parmi les protéines suivantes : - une protéine de fusion entre un récepteur aux glucocorticoïdes et la protéine GAL4 ; - la toxine diphtérique ; et - la barnase.
- 15. Cassette d'expression selon la revendication 11, caractérisée en ce que le polynucléotide d'intérêt est un polynucléotide sens ou antisens.
- 16. Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9 ou une cassette d'expression selon l'une des revendications 11 à 15..
- 17. Vecteur recombinant selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur pBAN1 : : GUS contenu dans la souche de E. coli déposée à la CNCM le 17 Juillet 2001 sous le numéro d'accès 1-2703.
- 18. Cellule hôte transformée par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9 par une cassette d'expression selon l'une des revendications 11 à 15 ou par un vecteur recombinant selon l'une des revendications 16 et 17.<Desc/Clms Page number 63>
- 19. Cellule hôte selon la revendication 18, caractérisée en ce qu'il s'agit de la la souche de E. coli déposée à la CNCM le 27 Juillet 2001 sous le numéro d'accès 1-2703..
- 20 Cellule hôte selon la revendication 18, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule de Agrobacterium tumefaciens.
- 21. Cellule hôte selon la revendication 18, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule de plante, ou d'un protoplaste de plante.
- 22. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9, d'une cassette d'expression selon l'une des revendications 11 à 15, d'un vecteur recombinant selon l'une des revendications 16 et 17 ou d'une cellule hôte selon l'une des revendications 18,20 ou 21 pour l'obtention d'une plante transformée
- 23. Utilisation selon la revendication 22, caractérisée en ce que la plante transformée produit des graines affectées dans le développement de la testa de la graine..
- 24. Plante transformée par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9, par une cassette d'expression selon l'une des revendications 11 à 15 ou par un vecteur recombinant selon l'une des revendications 16 et 17.
- 25. Plante transformée selon la revendication 24, caractérisée en ce qu'elle produit des graines affectées dans le développement de la testa de la graine.
- 26. Partie d'une plante transformée selon l'une des revendications 24 ou 25.<Desc/Clms Page number 64>
- 27. Procédé d'obtention d'une plante transformée caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivante : a) obtention d'une cellule hôte recombinante végétale selon la revendication 21 ; b) Régénération d'une plante entière à partir de la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) ; c) Sélection des plantes obtenues à l'étape b) ayant intégré un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9 ou une cassette d'expression selon l'une des revendications 11 à 15.
- 28. Procédé d'obtention d'une plante transformée caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) Obtention d'une cellule hôte recombinante de Agrobacterium tumefaciens selon la revendication 20 ; b) Transformation d'une plante d'intérêt par infection avec la cellule hôte
recombinante de Agrobacterium tumefaciens obtenue à l'étape a) ; c) Sélection des plantes ayant intégré dans leur génome un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9 ou une cassette d'expression selon l'une des revendications 11 à 15. - 29. Procédé d'obtention d'une plante transformée caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) Transfecter au moins une cellule de plante avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9, avec une cassette d'expression selon l'une des revendications 14 à 15 ou avec un vecteur recombiant selon l'une des revendications 16 et 17 ; b) régénérer une plante entière à partir de la cellule de plante recombinante obtenue à l'étape a) ; c) Sélectionner les plantes ayant intégré dans leur génome un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9 ou une cassette d'expression selon l'une des revendications 11 à 15.<Desc/Clms Page number 65>
- 30. Procédé d'obtention d'une plante transformée selon l'une des revendications 27 à 29, caractérisé en ce qu'il comporte en outre les étapes suivantes : d) croisement entre elles de deux plantes transformées telles qu'obtenues à l'étape c) avec une plante de la même espèce ; e) sélection des plantes homozygotes pour le transgène.
- 31. Procédé d'obtention d'une plante transformée selon l'une des revendications 27 à 29, caractérisé en ce qu'il comporte en outre les étapes suivantes : f) croisement d'une plante transformée obtenue à l'étape c) avec une plante de la même espèce ; g) sélection des plantes issues du croisement de l'étape f) ayant conservé le transgène.
- 32. Plante transformée, telle qu'obtenue par le procédé selon l'une des revendications 27 à 31.
- 33. Semence ou fruit d'une plante transformée selon la revendications 32.
- 34. Partie d'une plante transformée selon la revendication 32.
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| FR0110365A FR2828210B1 (fr) | 2001-08-01 | 2001-08-01 | Acide nucleique regulateur permettant l'expression d'un polynucleotide d'interet specifiquement dans l'endothelium d'une graine de plante, et ses applications |
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