FR2833012A1

FR2833012A1 - Peptides agonistes de l'hormone de croissance et leurs applications

Info

Publication number: FR2833012A1
Application number: FR0115641A
Authority: FR
Inventors: Claude Carelli
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2001-12-04
Filing date: 2001-12-04
Publication date: 2003-06-06
Anticipated expiration: 2021-12-04
Also published as: AU2002364314A8; WO2003048206A2; AU2002364314A1; FR2833012B1; WO2003048206A3

Abstract

L'Invention se rapporte à des peptides agonistes de l'hormone de croissance ainsi qu'à leurs applications en tant que médicaments, compléments alimentaires, et agents pour stimuler in vitro la prolifération cellulaire.

Description

La présente Invention se rapporte à des peptides agonistes de l'hormone de croissance ainsi qu'aux applications de ces peptides.

L'hormone de croissance (Growth hormone, GH) est une hormone naturellement sécrétée par les cellules somatotropes de l'antéhypophyse des vertébrés sous le contrôle de deux peptides d'origine hypothalamique : la GH-RH (Growth Hormone Releasing Hormone) et la somatostatine.

Elle exerce de multiples actions dont la principale est la stimulation de la croissance du squelette et des tissus mous, notamment des tissus musculaires.

Chez l'homme, elle est actuellement utilisée médicalement dans le traitement à long terme des retards structuraux de l'enfant liés soit à un déficit somatotrope (c'est-à-dire une insuffisance de sécrétion de GH par l'antéhypophyse), soit à un syndrome de TURNER (anomalie génétique correspondant à l'absence d'un chromosome X), soit à une insuffisance rénale chronique, soit encore à une anomalie du développement foetoplacentaire (retard de croissance intra-utérin), ainsi que pour pallier chez l'adulte un déficit en hormone de croissance consécutif à une tumeur de l'hypophyse ou de l'hypothalamus.

Les nombreux travaux de recherches accomplis ces dernières années sur l'action de l'hormone de croissance, en particulier sur son impact sur le métabolisme, laissent à penser que ses indications médicales pourraient être élargies à l'avenir notamment au traitement des grands brûlés, des états cachectiques (personnes en situation de grave dénutrition, malades du SIDA, cancéreux,.....), de celles qui souffrent d'ostéoporose et des personnes âgées.

L'hormone de croissance est également utilisée par les sportifs, et notamment par les sportifs de haut niveau, pour augmenter leur masse musculaire et, partant, leurs performances à l'effort.

Enfin, elle est utilisée dans l'élevage des animaux de ferme et, en particulier dans l'élevage bovin, pour augmenter la production de viande et la production de lait.

Chez l'homme, l'hormone de croissance a été initialement prescrite sous la forme d'extraits hypophysaires obtenus à partir de cadavres humains. Cependant, il s'est avéré que des enfants traités par ces extraits ont développé au stade adulte la maladie de CREUTZFELDT-JACOB suite à la transmission de prions présents dans les cadavres, ce qui a amené les Autorités sanitaires à en interdire l'usage.

Ce n'est qu'en 1987 que l'hormone de croissance extractive a été remplacée en totalité par une hormone synthétique obtenue par recombinaison génétique et connue sous le nom de somatotropine.

Si l'efficacité de cette dernière a été pleinement démontrée, en tout cas chez les enfants souffrant de retards de croissance, son coût extrêmement élevé et son mode d'administration (injections sous-cutanées quotidiennes ou quasi-quotidiennes) ont amené de nombreux auteurs à rechercher d'autres voies pharmacologiques.

Notamment, deux voies majeures ont été à ce jour proposées pour potentialiser l'activité biologique de l'hormone de croissance endogène.

Il s'agit, en premier lieu, de l'utilisation d'anticorps spécifiquement dirigés contre des séquences particulières de l'hormone de croissance et dont la particularité serait, selon les diverses hypothèses avancées, de : - prolonger la demi-vie de l'hormone endogène en la protégeant de l'action protéolytique des enzymes sériques (ASTON et al., Mol. Immunol., 1991,28 : 41- 50), - induire un changement de sa conformation de sorte à prolonger sa liaison à une ou plusieurs classes de récepteurs associés à une haute activité somatogène (THOMAS et al., J Endocrinol., 1990,124 : 469-474), - induire l'inhibition de l'intemalisation du complexe honnone/récepteur et/ou de la dégradation lysosomiale de ce complexe (BATES et al., J Endocrinol., 1992,132 : 369-375), - induire la libération retardée du complexe anticorps/hormone du site d'injection et/ou une modification de la biodistribution de ce complexe (WANG et al., Mol.

Immunol., 1992,29 : 313-317), - augmenter les récepteurs lactogènes hépatiques bien que ceux-ci n'apparaissent pas être directement impliqués dans la croissance (THOMAS et al., ibid), ou encore - obtenir un effet comparable à celui observé par l'administration de doses élevées de la protéine de liaison de l'hormone de croissance (Growth Hormone Binding Protein, GH-BP) (WELLS et al., J Endocrinol., 1994,140 (suppl. ) : 76).

On sait depuis de nombreuses années provoquer la production de tels anticorps in situ par l'administration de peptides correspondant à de petites séquences de

l'hormone de croissance, préalablement liés de manière covalente à une autre molécule ayant pour vocation d'en augmenter l'immunogénicité.

Ainsi, par exemple, la Demande de Brevet Européen n 0 284 406 décrit des compositions immunogènes destinées à être administrées chez des vertébrés en vue de potentialiser les effets de l'hormone de croissance endogène et qui renferment un peptide ayant une homologie structurelle avec la séquence 35-53 de l'hormone de croissance bovine, associé à un adjuvant (adjuvant de Freund complet ou incomplet, hydroxyde d'aluminium, dipeptide muramyle,...) ou conjugué à un transporteur (épitope de cellules T auxiliaire, sérum albumine, myoglobine,...) ou à un autre immunogène de manière à obtenir un effet double. Notamment, cette Demande de Brevet Européen propose de lier le peptide à une molécule de somatostatine (cette dernière consistant elle-même en un petit peptide de 14 acides aminés, de conformation cyclique de par la présence d'un pont disulfure entre deux résidus cystéine situés en positions 3 et 14) pour neutraliser parallèlement la somatostatine et, partant, libérer l'activité de l'hormone de croissance des effets inhibiteurs de cette hormone.

Les résultats expérimentaux rapportés dans ce document montrent que les moutons immunisés au moyen d'un tel conjugué produisent effectivement des anticorps dont certains se lient à l'hormone de croissance et d'autres à la somatostatine, mais ils ne démontrent pas que cette production d'anticorps se traduit réellement par une potentialisation de l'activité biologique de l'hormone de croissance.

Des compositions immunogènes du même type, mais renfermant un peptide présentant une homologie structurelle avec les séquences 1-18,55-72, 97-110 et 122-138 de l'hormone de croissance humaine sont également décrites dans la Demande de Brevet Européen n 0 303 488, également au nom de COOPERS ANIMAL HEALTH Ltd.

Plus récemment, des études basées sur la réactivité, vis-à-vis de l'hormone de croissance, d'anticorps monoclonaux montrant une aptitude particulièrement marquée à potentialiser in vivo son activité, ont permis à PORTETELLE et RENAVILLE d'identifier la séquence 104-113 de l'hormone de croissance bovine, qui est située dans l'hélice a n 3 de cette hormone, comme étant l'un de ses épitopes.

Ces Auteurs ont donc proposé, dans la Demande Internationale PCT WO 97/27298, d'utiliser des peptides correspondant à tout ou partie de cette séquence, liés de manière covalente à un adjuvant ou à un autre peptide servant de transporteur, pour

potentialiser l'activité biologique de l'hormone de croissance endogène. Ils indiquent que Z >

de tels peptides induisent, lorsqu'ils sont injectés chez des rats hypophysectomisés (et donc, incapables de secréter de la GH), une augmentation du poids corporel de ces rats et du taux circulant d'IGF-1 (Insulin-like Growth Factor 1)-qui est l'un des médiateurs de l'hormone de croissance-supérieure à celle obtenue par injection d'hormone de croissance native. Ils précisent, par ailleurs, que leurs études expérimentales montrent qu'il existe une corrélation entre le taux plasmatique d'anticorps aptes à reconnaître et à se lier à la GH native produits par les rats et leur prise de poids, et que les peptides liés à de l'ovalbumine ou au dipeptide muramyle (MDP) ont une activité nettement supérieure à celle des peptides liés à la somatostatine, même lorsque cette dernière est elle-même liée au dipeptide muramyle.

La deuxième voie qui a été proposée pour potentialiser l'activité biologique de l'hormone de croissance endogène fait appel à l'utilisation de molécules que l'on désigne sous le nom de sécrétagogues et qui sont capables de stimuler la sécrétion de l'hormone de croissance endogène par liaison à des récepteurs spécifiques localisés dans l'hypophyse et l'hypothalamus (Growth Hormone Secretagogue Receptor, GHS-R).

Les sécrétagogues semblent, en effet, pouvoir agir soit au niveau de l'hypophyse en stimulant directement la sécrétion de GH par cette dernière, soit au niveau de l'hypothalamus en induisant la synthèse de la GH-RH qui induit, à son tour, la sécrétion de GH par l'hypophyse.

En particulier, certains peptides comme la GH-RP-6 et ses superagonistes, la GH-RP-2 (MEACHAM et al., Metabolism, 1999,48 : 585-589),

l'hexalerin (ARVAT et AT et Endocrinol. Invest., 1998, 21 : 673-679), et des molécules mimétiques non-peptidiques comme le L-692 (KINEMAN et al., Endocrinology, 1999, 140 : 3581-3586), le 429 et le MK-0677 (McKEE et al., Mol. Endocrinol., 1997, Il : 415- 423) stimulent la production de l'hormone de croissance endogène par l'activation de récepteurs distincts.

Des travaux récents semblent montrer qu'in vivo, les sécrétagogues ne pourraient agir et, donc, stimuler la sécrétion de l'hormone de croissance qu'à la condition que la GH-RH soit disponible au niveau hypothalamique. Les GHS-R ont été caractérisés et clonés. Ils appartiennent à la famille des récepteurs protéiques membranaires à 7 traversées. Le clonage de l'un de ces récepteurs présent chez l'homme et le porc au niveau hypophysaire (SKINNER et al., J Clin. Endocrinol. Metab., 1998,83 : 4314-4320) a permis de mettre en évidence un autre type de récepteurs qui apparaissent, eux, appartenir

à la famille des récepteurs couplés à la protéine G et dont l'activité serait liée au relargage de l'hormone de croissance. Ainsi, l'activation des GHS-R pourrait être elle-même sous le contrôle d'une hormone non encore identifiée.

Or, dans le cadre de ses travaux, l'Inventeur a constaté que, de manière surprenante, des peptides qui comprennent la séquence 104-113 de l'hormone de croissance bovine ou la séquence qui lui correspond chez les autres espèces animales (par exemple, la séquence 164-174 chez l'homme), liée de façon covalente à son extrémité C-terminale à une séquence linéaire dérivée de celle de la somatostatine (laquelle est constante d'une espèce animale à l'autre) par substitution de l'un au moins des deux résidus cystéine que comporte cette dernière, sont capables de potentialiser l'activité biologique de l'hormone de croissance endogène lorsqu'ils sont administrés à des animaux secrétant cette hormone, ou de mimer ses effets lorsqu'ils sont administrés à des animaux hypophysectomisés et ce, par un mécanisme d'action qui serait différente à la fois de celui des peptides immunogènes de l'état de la technique-puisque, contrairement à ces derniers, ils n'induisent pas la production d'anticorps dirigés contre eux-mêmes ou contre l'hormone de croissance-et de celui des sécrétagogues.

Sur la base de cette constatation, l'Inventeur a cherché à définir les caractéristiques de structure devant être présentées par des peptides pour avoir de telles propriétés, ce qui l'a conduit à identifier toute une famille de peptides agonistes de l'hormone de croissance et ce sont ces peptides qui font l'objet de l'Invention.

La présente Invention a donc pour objet des peptides qui sont caractérisés en ce qu'ils comprennent la séquence d'acides aminés (I) ci-après : X,-Tyr-X2-Leu-X3-Ala-Gly-X4-Lys-Asn-Phe-Phe-Xs (I) dans laquelle : - Xl est absent ou représente, lorsqu'il est présent, un résidu valine ou une séquence choisie parmi les séquences suivantes :
Z,-Val
Asp-ZI-Val Ser-Asp-Zt-Val Z2-Ser-Asp-Zr- Val, et Gly-Z2-Ser-Asp-Zl- V al

dans lesquelles Zl représente soit un résidu arginine, auquel cas Z2 représente un résidu thréonine, soit la séquence Ser-Asp, auquel cas Z2 représente un résidu alanine ; - X2 représente une séquence choisie parmi les séquences Glu-Lys, Glu-Ser et AspLeu ; - X3 est absent ou représente, lorsqu'il est présent, un résidu lysine ou une séquence choisie parmi les séquences suivantes :
Lys-Asp
Lys-Asp-Leu
Lys-Asp-Leu-Glu
Lys-Asp-Leu-Glu-Glu Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Gly
Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Gly-Ile

Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Gly-Ile-Gln Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Gly-Ile-Gln-Z3, et
Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Gly-Ile-Gln-Z3-Leu dans lesquelles Z3 représente un résidu alanine ou thréonine ; - X4 représente un résidu choisi parmi les résidus cystéine, sérine, tyrosine, phénylalanine, acide aspartique, acide glutamique, alanine et glycine ; tandis que - Xs est absent ou représente, lorsqu'il est présent, un résidu tryptophane ou une séquence choisie parmi les séquences suivantes :
Trp-Lys
Trp-Lys-Thr
Trp-Lys-Thr-Phe Trp-Lys-Thr-Phe-Thr Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser
Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-X6, et
Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-X6-Lys-Gln-Ala dans lesquelles X6 représente un résidu choisi parmi les résidus cystéine, sérine, tyrosine, phénylalanine, acide aspartique, acide glutamique, alanine et glycine ; avec la double condition que, quand Xl est absent, alors Xs représente la séquence Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-X6-Lys-Gln-Ala, et que X4 et X6 ne soient pas conjointement des résidus cystéine.

Selon un mode de réalisation préféré de l'Invention, dans la séquence (I), X représente la séquence GIy-Z2-Ser-Asp-Z-Val dans laquelle ZI et Z2 ont la même signification que précédemment, X3 est absent, X2 et X4 ont la même signification que précédemment, tandis que Xs représente la séquence Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-X6 dans laquelle X6 a la même signification que précédemment.

Selon une première variante de ce mode de réalisation préféré, dans la séquence (1), XI représente la séquence Gly-Thr-Ser-Asp-Arg-Val, X2 représente la séquence Glu-Lys, tandis que X4 et X6 représentent tous deux un résidu sérine, ce qui conduit à un peptide comprenant la séquence d'acides aminés (II) ci-après : Gly-Thr-Ser-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Ala-Gly-Ser-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-
1 5 10 15 Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Ser (II)
20
Cette séquence est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID N0 : 1.

Le peptide ainsi constitué comprend la séquence 104-113 de l'hormone de croissance bovine (que l'on retrouve à l'identique chez de très nombreuses espèces animales comme le porc, le rat, la souris, le chien, le chat, le hamster, le loup,...), liée à son extrémité C-terminale à une séquence linéaire dérivée de celle de la somatostatine par substitution des deux résidus cystéine que comporte cette dernière, par des résidus sérine.

Selon une autre variante de ce mode de réalisation préféré, dans la séquence (1), XI représente la séquence Gly-Ala-Ser-Asp-Ser-Asp-Val, X2 représente la séquence Asp-Leu, tandis que X4 et X6 représentent tous deux un résidu sérine, ce qui conduit à un peptide comprenant la séquence d'acides aminés (III) ci-après : Gly-Ala-Ser-Asp-Ser-Asp-Val-Tyr-Asp-Leu-Leu-Ala-Gly-Ser-Lys-Asn-Phe-Phe-
1 5 10 15 Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Ser (III)
20
Cette séquence est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID N0 : 2.

Le peptide ainsi constitué comprend la séquence 164-174 de l'hormone de croissance humaine, liée à son extrémité C-terminale à une séquence linéaire dérivée de

celle de la somatostatine par substitution des deux résidus cystéine que comporte cette dernière, par des résidus sérine.

La présente Invention englobe également les peptides dérivés des séquences (1), (II) et (III) par substitution d'un ou plusieurs acides aminés, pour autant que, d'une part, ces substitutions n'aboutissent pas à la présence de deux résidus cystéine dans ces peptides, ce qui provoquerait leur cyclisation, et, d'autre part, que les peptides ainsi dérivés présentent une homologie d'au moins 80% avec lesdites séquences.

Peuvent notamment être substitués : - les résidus sérine, à l'exception du résidu sérine qui est situé en position 1,2 ou 3 dans la séquence (I), lorsque Xl est présent et représente l'une des séquences Ser-Asp-ZI-Val, Zz-Ser-Asp-Zj-Val ou Gly-Z2-Ser-Asp-ZI-Val, - et qui est donc situé en position 3 dans les séquences (II) et (III)-par des résidus acide aspartique, acide glutamique, alanine, glycine et cystéine, - les résidus acide aspartique, acide glutamique, alanine et glycine par des résidus sérine, - les résidus leucine par des résidus méthionine, - les résidus lysine par des résidus arginine et inversement, - les résidus phénylalanine par des résidus tyrosine, tryptophane et cystéine, - le résidu valine par un résidu isoleucine, et - le résidu asparagine par un résidu histidine.

Conformément à l'Invention, tous les résidus acide aminé des peptides peuvent appartenir à la série L. Toutefois, il est également possible de prévoir que certains de ces résidus, comme les résidus thréonine, alanine, tryptophane et phénylalanine, et en particulier les deux résidus phénylalanine consécutifs que comportent les peptideslesquels sont situés en positions 20 et 22 dans les séquences (II) et (III)-appartiennent à la série D, de manière à conférer aux peptides une meilleure résistance à l'action des peptidases.

Par ailleurs, l'Invention prévoit également la possibilité de fixer sur le résidu tryptophane que comportent les peptides, lorsque X5 est présent dans la séquence (I),-et qui est donc situé en position 18 dans les séquences (II) et (III)-un groupe alkyle en Cl-C3 (méthyle, éthyle, propyle, isopropyle) pour conférer aux peptides une résistance à l'oxydation.

Avantageusement, les peptides conformes à l'invention sont liés de façon covalente, au niveau de leur extrémité C-terminale ou d'un résidu lysine, à une molécule d'un poly (éthylène glycol), et notamment d'un PEG de PM 1500 ou 4000, propre à diminuer leur clearance urinaire. Cette liaison peut être réalisée comme décrit par ABUCHOWSKI et al. (J. Biol. Chem., 1977, 252 : 3582-3586).

Les peptides conformes à l'Invention peuvent être préparés par toutes les techniques classiques de synthèse peptidique, soit par condensation successive des résidus d'acides aminés dans l'ordre requis, soit par condensation des résidus sur un fragment préalablement formé et contenant déjà plusieurs acides aminés dans l'ordre approprié, ou encore par condensation de plusieurs fragments préalablement préparés, en prenant soin de protéger, au préalable, toutes les fonctions réactives portées par les résidus d'acides aminés, excepté les fonctions amine et carboxyle engagées dans la liaison peptidique lors de la e condensation, et notamment par la technique de synthèse en phase solide de MERRIFIELD.

In vivo, les peptides conformes à l'Invention stimulent la croissance et favorisent la production d'IGF-1 et ce, aussi bien lorsqu'ils sont administrés à des animaux qui secrètent de l'hormone de croissance qu'à des animaux privés d'hypophyse et, donc, d'hormone de croissance endogène.

Administrés à des animaux secrétant de l'hormone de croissance, ils ont des effets stimulants sur la croissance (objectivés par une prise de poids corporel) au moins équivalents et, le plus souvent, supérieurs à ceux des peptides immunogènes de l'état de la technique, et toujours plus importants que ceux induits par l'administration d'hormone de croissance native. Par ailleurs, ils génèrent une augmentation de la production d'IGF-1 notablement plus élevée et plus durable que celle induite par les peptides immunogènes de l'état de la technique et par l'hormone de croissance native.

Administrés à des animaux hypophysectomisés, ils sont plus performants que les peptides immunogènes de l'état de la technique et ce, aussi bien en termes de croissance que de production d'IGF-1.

Par contre, même dans le cas où ils sont administrés de manière itérative, ils n'induisent pas la production d'anticorps dirigés contre eux-mêmes, ni celle d'anticorps 1 dirigés contre l'hormone de croissance endogène, contrairement aux peptides immunogènes de l'état de la technique et à l'hormone de croissance native. Or, il paraît de plus en plus

certain que la production d'anticorps anti-GH provoquerait à plus ou moins long terme une neutralisation de l'hormone de croissance endogène et, partant, de son activité biologique.

Enfin, les peptides conformes à l'Invention, apparaissent être dénués d'effet toxique.

Le mécanisme d'action des peptides conformes à l'Invention n'est pas encore élucidé à ce jour. Toutefois, le fait qu'ils n'induisent pas la production d'anticorps anti-GH permet d'écarter l'hypothèse d'une action par potentialisation de l'activité de l'hormone de croissance endogène via la production d'anticorps dirigés contre cette hormone. Par ailleurs, dans la mesure où leur activité est indépendante de la présence de l'hypophyse-et donc, comme on peut le supposer, de l'hypothalamus-, leur mécanisme d'action ne se calque pas non plus sur celui de l'hormone de croissance, ni sur celui des sécrétagogues.

Compte tenu de leurs propriétés remarquables, les peptides conformes à l'Invention sont susceptibles de trouver de nombreuses applications, notamment en médecine humaine, en médecine vétérinaire, en diététique humaine ou dans l'alimentation animale.

La présente Invention a, donc, également pour objet un peptide tel que 1 précédemment défini pour l'utilisation en tant que médicament, ainsi qu'une composition pharmaceutique comprenant au moins un tel peptide en tant que principe actif, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement acceptables.

Une telle composition est susceptible d'être utilisée, en médecine humaine et vétérinaire, dans toutes les indications thérapeutiques liées à un déficit complet ou partiel, congénital ou acquis, de l'hormone de croissance endogène, et notamment dans ID le traitement des retards structuraux, dans les affections dans lesquelles une augmentation de la masse musculaire peut être recherchée comme les états cachectiques liés au sida ou au cancer, ainsi que pour stimuler ou restaurer les défenses immunitaires, en particulier chez les sujets âgés ou immunodéprimés.

La présente Invention a, aussi, pour objet un complément alimentaire comprenant au moins un peptide tel que précédemment défini en tant que substance active, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement acceptables.

Un tel complément alimentaire est susceptible d'être utilisé en tant que traitement d'appoint d'un traitement thérapeutique ou d'une rééducation fonctionnelle, ou par des. sportifs souhaitant augmenter leur masse musculaire et, partant, leurs performances

à l'effort, ou encore dans l'alimentation animale pour augmenter la production de viande ou de lait.

La présente invention a, encore, pour objet l'utilisation d'un peptide tel que précédemment défini pour stimuler in vitro la prolifération cellulaire, par exemple dans le cadre de cultures de kératocytes ou d'hépatocytes.

La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui suit et qui se réfère à des exemples de mise en évidence de l'activité biologique d'un peptide conforme à l'Invention.

Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustrations de l'objet de l'Invention et n'en constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLE 1 : ACTIVITE VACCINALE D'UN PEPTIDE CONFORME A L'INVENTION
L'activité vaccinale d'un peptide conforme à l'Invention, désigné peptide PI dans ce qui suit, a été mise en évidence par des tests visant à administrer ce peptide à des rats femelles adultes normaux d'une part, et hypophysectomisés d'autre part, selon un protocole vaccinal et à apprécier les effets de cette administration sur le poids corporel de ces rats, leur taux plasmatique en anticorps dirigés contre ce peptide ainsi que sur leur taux plasmatique en IGF-1.

Les résultats obtenus ont été comparés à ceux observés suite à l'administration, en utilisant le même protocole vaccinal, de 3 peptides ayant une partie de leur séquence commune avec celle du peptide PI (ci-après peptides P4, P6 et P7) et, dans le cas des rats normaux, de GH native porcine.

1) Séquences des peptides PI. P4. P6 et P7 :
La séquence du peptide PI correspond à la séquence (II) précédemment définie, tandis que les séquences des peptides P4, P6 et P7 sont indiquées ci-après.

Peptide P4

Ac-Gly-Thr-Ser-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Ile-Ser-Gln-Gln-Val-His-Ala-Ala- His-Ala-Glu-Ile-Asn-Glu-Ala-Gly-Arg
Peptide P6 Ac-Ala-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile-Gln-Asn-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe- Ala-Gly-Ser-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Ser

Peptide P7 Ac-Gly-Thr-Ser-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Ser-Leu-Ile-Ser-Gln-Gln-Val-His-Ala-Ala-
His-Ala-Glu-Ile-Asn-Glu-Ala-Gly-Lys-MDP
Ces trois dernières séquences sont représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID N0 : 3 à SEQ ID N0 : 5.

Concrètement, le peptide P4 comprend la séquence 104-113 de la GH bovine, liée à son extrémité C-terminale à la séquence 323-339 de l'ovalbumine, et correspond au peptide dénommé 104-113-OVA décrit dans la Demande Internationale PCT WO 97/27298 et présenté dans cette dernière comme ayant un effet potentialisateur de l'activité biologique de l'hormone de croissance particulièrement prononcé.

Le peptide P6 comprend, lui, la séquence 35-52 de la GH bovine, liée à son extrémité C-terminale à une séquence dérivée de celle de la somatostatine par substitution de ses deux résidus cystéine par des résidus sérine. Il est donc structurellement proche, sans être toutefois identique, au conjugué 35-53-somatostatine décrit dans la Demande Européenne n00 284 406.

Quant au peptide P7, il résulte de la liaison, au niveau de son extrémité C-terminale, du peptide P4 avec une molécule de dipeptide muramyle (N-acétyl muramylL-alanyl-D-isoglutamine ou MDP-SIGMA). Pour les besoins de cette liaison, le résidu arginine situé en position 339 de l'ovalbumine a été remplacé par un résidu lysine, tandis que le résidu lysine situé en position 112 dans la séquence de la GH a été, lui, remplacé par un résidu sérine, de manière à éviter que le MDP n'aille se fixer au niveau de cette séquence.

Tous ces peptides sont acétylés à leur extrémité N-terminale.

Les peptides ont été synthétisés en phase solide selon la technique de MERRIFIELD en utilisant une stratégie Fmoc et, pour ce qui concerne le peptide P7, la liaison covalente avec le dipeptide muramyle a été effectuée selon la méthode décrite par CARELLI et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., 1982,79 : 5392-5393).

La GH native porcine, obtenue par recombinaison génétique, a été gracieusement fournie par RENAVILLE et PORTETELLE (Université de GEMBLOUX,

Belgique).

1

2) Protocole vaccinal : a) Rats normaux :
Des rats Wistar femelles adultes pesant 180 g ont été répartis en 6 groupes de 4 rats chacun, respectivement affectés des numéros 1n à 6n.

Les rats du groupe In n'ont subi aucun traitement, ce groupe étant destiné à servir de contrôle.

Les rats des groupes 2n, 3n, 4n et 5n ont reçu à 11 et à J21, par injection sous-cutanée, 0,2 ml d'une émulsion huile (SEPPIC Iso 25) dans l'eau (tampon PBS 0, 1M de pH 6,9) (75 : 25, v : v) contenant 50 jj. g de peptide P4 (groupe 2n), de peptide P7 (groupe 3,,), due peptide P6 (groupe 4n) ou de peptide P1 (groupe 5n).

Les rats du groupe 6n ont reçu à JI, J3 et J5, par injection sous-cutanée, 0,2 ml d'une solution de tampon PBS contenant 5 u. g de GH native, les injections ayant été renouvelées pendant les 5 semaines suivantes (semaines 2 à 6) à raison de deux injections par semaine.

Des prélèvements sanguins ont été effectués chez tous les rats, par ponction au niveau du sinus rétro-orbital, au cours de la semaine précédant la première injection (semaine-1) et des semaines 3,7 et 17. b) Rats hypophysectomisés :
Des rats Wistar femelles adultes, préalablement hypophysectomisés et pesant 180 g, ont été répartis en 5 groupes de 4 rats chacun, respectivement affectés des numéros l à 5h.

Comme précédemment, les rats du groupe 1h n'ont reçu aucun traitement, tandis que les rats des groupes 2h, 3h, 4h et 5h ont reçu, par injection sous-cutanée, 0,2 ml d'une émulsion huile (SEPPIC Iso 25) dans l'eau (tampon PBS 0, lM de pH 6,9) (75 : 25, v : v) contenant 50 Lg de peptide P4 (groupe 2h), de peptide P7 (groupe 3h), de peptide P6 (groupe 4h) ou de peptide P1 (groupe 5h).

Des prélèvements sanguins ont été effectués chez tous les rats, par ponction au niveau du sinus rétro-orbital, au cours de la semaine précédant la première injection (semaine-1) et des semaines 4,7, 13 et 17.

3) Dosages des anticorps plasmatiques dirigés contre les peptides administrés ou contre la GH native :
Les dosages des anticorps susceptibles d'avoir été produits par les rats à

l'encontre du peptide (groupes 2n à 5n et 2h à 5h) ou de la GH native (groupe 6n) qui leur a été administré, ont été réalisés par des immunotests de type ELISA.

Pour ce faire, après centrifugation des échantillons sanguins prélevés, les sérums recueillis ont été dilués dans du tampon PBS dans des rapports de : - 1 : 6 400 pour la recherche d'anticorps anti-peptide dans les sérums des rats des groupes 2n à 5n (rats normaux), - 1 : 800 pour la recherche d'anticorps anti-GH native dans les sérums des rats du groupe 6n (rats normaux), et - 1 : 1600 pour la recherche d'anticorps anti-peptide dans les sérums des rats des groupes 2h à 5h (rats hypophysectomisés).

Dans tous les cas, les parois de puits de microplaques Microsorp (NUNC) de 96 puits ont été traitées pendant toute une nuit à température ambiante avec 100 III d'un tampon carbonate de sodium 0,1 M de pH 9,0 et contenant 5 g/ml du peptide correspondant aux anticorps recherchés ou de GH native. Après deux lavages par un mélange de tampon PBS et de Tweene 20 (MERCK) à 0,1%, les parois des puits ont été

mises à incuber avec une solution à 2% de caséine pendant 1 heure à 37 C. A l'issue de quoi, les parois ont été lavées 3 fois avec du mélange tampon PBS/Tween&commat; 20 à 0, 1%, puis mises à incuber avec 100 ul des sérums dilués à tester pendant 2 heures à température ambiante. Après un lavage abondant des parois par du mélange tampon PBS/Tween"20 à 1 0,1%, celles-ci ont été de nouveau mises à incuber avec une solution d'anticorps anti-Ig de rat marqués par de la peroxydase (NORDIC IMMUNOLOGY) pendant 1 heure à température ambiante avant addition d'un substrat ABTS (sel diammonium de 2,2'-azino- di[3-éthylbenzothiazolin-sulfonate - BOEHRINGER). Après 30 minutes d'incubation en présence de ce substrat, la densité optique des milieux d'incubation a été lue à 405 nm.

Par ailleurs, les sérums des rats des groupes 2n à 5n et 2h à 5h ont été soumis à des immunotests ELISA complémentaires pour vérifier si les anticorps antipeptide susceptibles d'avoir été produits par ces rats sont capables de reconnaître et de se lier à la GH native. Ces immunotests ont été réalisés selon un protocole identique à celui qui vient d'être décrit sur des sérums préalablement dilués dans du tampon PBS dans des

rapports de 1 : 800 pour les rats des groupes 2n à 5n et de 1 : 400 pour les rats des groupes 2h à 5h, et dans des puits dont les parois ont été préalablement traitées pendant toute une nuit à température ambiante avec 100 fil d'un tampon carbonate de sodium 0,1 M de pH 9,0 et contenant 5 jg/ml de GH native.

4) Dosage de l'IGF-1 plasmatique :
Pour la détermination des taux plasmatiques en IGF-1, l'IGF-1 sérique présent dans les échantillons sanguins a été extrait selon la méthode décrite par BREIER et al. (J Endocrinol., 1991,128 : 3,347-352). Brièvement, cette méthode consiste à faire précipiter à température ambiante les protéines de liaison de l'IGF-1 en mélangeant 1 volume de plasma avec 7 volumes d'une solution éthanolique contenant de l'acide chlorhydrique 2N. Après centrifugation, les surnageant sont neutralisés par addition de tampon Tris-HCl 0, 8 M de pH 8,0 et conservés à une température de-20 C pendant 1 heure. Ils sont soumis à une centrifugation complémentaire avant d'être utilisés.

L'IGF-1 sérique ainsi extrait a été dosé par des immunotests ELISA par

compétition. Pour ce faire, les parois de puits de microplaques Microsorp de 96 puits ont été traitées pendant toute une nuit à température ambiante avec 100). t1 d'un tampon carbonate de sodium 0,1 M de pH 9,0 et contenant 5). tg/ml d'IGF-l (PEPRO-TECH Inc.).

Après deux lavages par du mélange tampon PBS/Tweeno 20 à 0,1%, les parois des puits ont été mises à incuber avec une solution à 2% de caséine pendant 1 heure à 37 C. A l'issue de quoi, les parois ont été lavées 3 fois avec du mélange tampon PBS/Tween 20 à 0,1%, puis mises à incuber, pendant 2 heures et à température ambiante, avec 100 p. I d'un mélange comprenant l'un des extraits d'IGF-1 à tester et un anticorps polyclonal de chèvre anti-IGF-1 (SANTA CRUZ Biotechnology), ce mélange ayant été lui-même incubé préalablement pendant 1 heure à température ambiante. Après un lavage abondant des parois par du mélange tampon PBS/Tweeno 20 à 0, 1%, ces dernières ont été mises à incuber avec un anticorps anti-IgG de chèvre marqué par de la peroxydase (BIOSYS) pendant encore 1 heure avant addition d'ABTS.

Après 30 minutes d'incubation en présence de ce substrat, la densité optique des milieux d'incubation a été lue à 405 nm et leur teneur en IGF-1 a été déterminée par référence à la courbe standard montrée sur la Figure 1 et élaborée à partir de solutions de tampon PBS renfermant des concentrations croissantes en IGF-1.

5) Résultats : a) Rats normaux :
Les résultats obtenus chez les rats normaux sont illustrés sur les Figures 2A à 2D.

La Figure 2A représente l'augmentation du poids corporel des rats des groupes In (-), 2n tj), 3n (Q), 4n (A), 5n () et 6n (.) en fonction du temps, exprimée en pourcentages par rapport à leur poids initial.

La Figure 2B représente les valeurs de densité optique obtenues à 405 nm lors des immunotests réalisés sur les sérums correspondant aux prélèvements sanguins effectués chez les rats des groupes 2n à 6n au cours des semaines 7 CD et 17 (1ITi) pour vérifier si ces rats ont produit des anticorps dirigés contre le peptide ou la GH qui leur a été administré.

La Figure 2C représente les valeurs de densité optique obtenues à 405 nm lors des immunotests réalisés sur les sérums correspondant aux prélèvements sanguins effectués chez les rats des groupes 2n à 5n au cours des semaines 7 (E].) et 17 GID pour vérifier l'aptitude des anticorps anti-peptide éventuellement produits par ces rats à reconnaître et à se lier à la GH native. Sont également indiquées sur cette Figure, les valeurs de densité optique obtenues sur les sérums des rats du groupe 1n, qui illustrent le bruit de fond lié à la technique utilisée pour réaliser les immunotests.

La Figure 2D représente les taux plasmatiques d'IGF-1 présentés par les rats des groupes In à 6n au cours des semaines 7 (E) et 17 (a).

Ces résultats montrent que, chez les rats normaux : - Seuls les peptides PI, P6 et P7 induisent une augmentation du poids corporel significativement plus élevée que celle observée chez les rats du groupe In n'ayant reçu aucun traitement. Le peptide P4 apparaît, lui, n'avoir aucun effet significatif, tandis que la GH native freine la prise de poids corporel dès la semaine 5, ce qui devient particulièrement marqué à partir de la semaine 8.

- Des peptides P1, P6 et P7, le peptide P7 est celui qui induit l'augmentation de poids la plus prononcée, les peptides PI et P6 induisant une augmentation de poids sensiblement identique, mais néanmoins moins importante que celle observée pour le peptide P7.

- Les peptides P4, P6 et P7 induisent tous les trois la production d'anticorps dirigés contre eux-mêmes et le taux d'anticorps le plus élevé est observé pour le

peptide P7. Par contre, le peptide Pl n'induit pas d'anticorps dirigé contre lui-même. Quant à la GH native, le très faible taux d'anticorps anti-GH observé à la semaine 7 devient nul à la semaine 17.

- Les peptides P4, P6 et P7 induisent la production d'anticorps qui reconnaissent et se lient à la GH native, ce qui n'est pas le cas du peptide P1, comme en témoignent les valeurs de densité optique indiquées sur la Figure 2C pour les rats du groupe 5n qui sont du même ordre que celles observées pour les rats du groupe In.

- Tous les peptides et la GH native induisent une augmentation de la production d'IGF-1 plasmatique. Toutefois, cette augmentation est, à la semaine 17, sensiblement 7 fois plus élevée chez les rats ayant reçu le peptide PI que celle observée chez les rats ayant reçu le peptide P7 (groupe 3n) ou la GH native (groupe 6n), et sensiblement 10 fois plus élevée que celle observée chez les rats du groupe In n'ayant reçu aucun traitement. b) Rats hypophysectomisés :
Les résultats obtenus chez les rats hypophysectomisés sont illustrés sur les Figures 3A à 3D.

La Figure 3A représente l'augmentation du poids corporel des rats des groupes li (-), 2h (M), 3h (CI), 4h (") et 5h (e) en fonction du temps, exprimée en pourcentages par rapport à leur poids initial.

La Figure 3B représente les valeurs de densité optique obtenues à 405 nm lors des immunotests réalisés sur les sérums correspondant aux prélèvements sanguins

effectués chez les rats des groupes 2h (ex), 31 i (M), 4h (S) et 5h (8) au cours des semaines 4,7, 13 et 17 pour vérifier si ces rats ont produit des anticorps dirigés contre le peptide qui leur a été administré.

La Figure 3C représente les valeurs de densité optique obtenues à 405 nm lors des immunotests réalisés sur les sérums correspondant aux prélèvements sanguins

effectués chez les rats des groupes 2h (J]), 3h (Q), 411 (Ii !) et 5h (.) au cours des semaines 4,7, 13 et 17 pour vérifier si les anticorps anti-peptide éventuellement produits par ces rats sont capables de reconnaître et de se lier à la GH native.

La Figure 3D représente les taux plasmatiques d'IGF-1 présentés par les rats des groupes 2h à 5h au cours des semaines 4 (0) et 17 (a).

Ces résultats montrent que, chez les rats hypophysectomisés :

- Les peptides P4, P6 et P7, dont il a été précédemment montré qu'ils sont immunogènes, n'induisent pas d'augmentation du poids corporel significativement plus élevée par rapport à celle observée chez les rats du groupe lh n'ayant reçu aucun traitement. La Figure 3A montre que les peptides P6 et P7 ont même plutôt pour effet de freiner la prise de poids. Par contre, le peptide P1 induit une augmentation du poids corporel supérieure de plus de 10% à celle observée chez les rats du groupe lh et supérieure de 18% à celle induite par le peptide P6.

- Le peptide PI n'induit pas la production d'anticorps dirigés contre luimême, contrairement aux peptides P4, P6 et P7 pour lesquels un taux significatif d'anticorps est observé dès la semaine 4. Ce taux devient particulièrement significatif pour le peptide P6 aux semaines 13 et 17.

- Les peptides P6 et P7 induisent, avec une cinétique d'apparition différente, la production d'anticorps qui réagissent avec la GH native. Ce n'est pas le cas du peptide P4. Ce n'est pas le cas non plus du peptide P1.

- Tous les peptides induisent une augmentation de la production d'IGF- 1 plasmatique. Toutefois, cette augmentation est, à la semaine 17, sensiblement 2, 5 fois plus élevée chez les rats immunisés par le peptide PI que celle observée chez les rats ayant reçu les autres peptides et sensiblement 8 fois plus élevée que celle observée chez les rats du groupe 1 il n'ayant reçu aucun traitement.

EXEMPLE 2 : ACTIVITE HORMONALE D'UN PEPTIDE CONFORME A L'INVENTION L'activité hormonale du peptide PI a été mise en évidence par des tests visant à administrer, de façon régulière et prolongée (2 injections sous-cutanées par semaine pour un total de 13 injections), des doses relativement importantes (100 jj. g par injection) de peptide PI en solution physiologique à des rats femelles adultes normaux et à comparer les effets de cette administration sur le poids corporel de ces rats, leur taux plasmatique en anticorps dirigés contre ce peptide ainsi que sur leur taux plasmatique en IGF-1, avec ceux observés suite à l'administration de GH native porcine : - d'une part, en solution physiologique et selon un schéma posologique identique à celui utilisé pour le peptide PI, et, - d'autre part, en émulsion huile dans l'eau, à raison de deux injections sous-cutanées effectuées à 30 jours d'intervalle, d'une dose deux fois moins élevée (50 g/injection).

1) Protocole opératoire :
Des rats Wistar femelles adultes pesant 180 g ont été répartis en 4 groupes de 4 rats chacun, respectivement affectés des numéros 1 à 4.

Les rats du groupe 1 n'ont subi aucun traitement, ce groupe étant destiné à servir de contrôle.

Les rats du groupe 2 ont reçu à JI et J30, par injection sous-cutanée, 0,2 ml d'une émulsion huile (SEPPIC Iso 25) dans l'eau (tampon PBS 0, 1M de pH 6,9) (75 : 25, v : v) contenant 50 flg de GH native.

Les rats des groupes 3 et 4 ont reçu, par injection sous-cutanée, 0,2 ml d'une solution de tampon PBS contenant 100 J. g de GH native (groupe 3) ou de peptide P1 (groupe 4) à raison de deux injections par semaine et pour un total de 13 injections.

Des prélèvements sanguins ont été effectués chez tous les rats, par ponction au niveau du sinus rétro-orbital, au cours de la semaine précédant la première injection (semaine-1) et chaque mois jusqu'au terme de l'expérimentation correspondant à la semaine 19.

Les dosages des anticorps susceptibles d'avoir été produits par les rats des groupes 2 et 3 à l'encontre de la GH native, et par les rats du groupe 4 à l'encontre du peptide PI, ainsi que les immunotests visant à apprécier l'aptitude des anticorps éventuellement induits par le peptide PI à reconnaître et à se lier à la GH native ont été réalisés selon des protocoles identiques à ceux décrits à l'exemple 1.

Il en est de même des immunotests visant à déterminer le taux plasmatique d'IGF-1 des rats.

2) Résultats :
Les résultats obtenus sont illustrés sur les Figures 4A à 4E.

La Figure 4A représente l'augmentation du poids corporel des rats des groupes 1 (-), 2 (A), 3 (0) et 4 () entre les semaines 8 et 19, exprimée en pourcentages par rapport à leur poids initial.

La Figure 4B représente les valeurs de densité optique obtenues à 405 nm lors des immunotests réalisés sur les sérums correspondant aux prélèvements sanguins effectués chez les rats du groupe 4 (jjjjj) au cours de la semaine 19 pour vérifier si ces rats ont produit des anticorps dirigés contre le peptide P1, après dilution de ces sérums au 1 : 200,1 : 400,1 : 800 et 1 : 1600. Sont également indiquées sur cette Figure, les valeurs de

densité optique obtenues sur les sérums des rats du groupe 1 qui illustrent le bruit de fond lié à la technique utilisée pour réaliser les immunotests.

La Figure 4C représente les valeurs de densité optique obtenues à 405 nm lors des immunotests réalisés sur les sérums correspondant aux prélèvements sanguins effectués chez les rats des groupes 1 (ja), 2 (go), 3 (0) et 4 (8) au cours de la semaine 19 pour vérifier si les anticorps anti-peptide éventuellement produits par ces rats sont capables de reconnaître et de se lier à la GH native, après dilution de ces sérums au 1 : 200, 1 : 400,
1 : 800,1 : 1600,1 : 3200,1 : 6400 et 1 : 12800.

La Figure 4D représente les taux plasmatiques d'IGF-1 présentés par les rats des groupes 1 OEl), 2 (go), 3 (0) et 4 (jot) au cours des semaines 13 et 19.

Ces résultats montrent que : - Jusqu'à la semaine 15, le peptide PI induit une augmentation du poids corporel selon un rythme similaire à celui de l'augmentation de poids observée chez les rats du groupe 1 n'ayant reçu aucun traitement. Toutefois, l'augmentation de poids des rats du groupe 4 est constamment supérieure de 7% à celle des rats du groupe 1. A partir de la semaine 15, la différence de prise de poids entre les 2 groupes s'amoindrit, mais elle reste significativement plus élevée (+3%) chez les rats du groupe 4.

- En ce qui concerne l'administration de l'hormone native, celle-ci induit, aussi bien chez le groupe 2 que chez le groupe 3, une augmentation du poids corporel qui est, dans un premier temps, supérieure à celle observée chez les rats du groupe 1, puis qui devient similaire à celle observée chez les rats du groupe 1 (de la semaine 11 à la semaine 16) et, enfin, inférieure à celle observée chez les rats du groupe 1 (à partir de la semaine 16), et ce, de façon très significative (-5% pour les rats du groupe 2,-10% pour les rats du groupe 3).

- Là également, le peptide P1 se révèle ne pas induire la production d'anticorps dirigés contre lui-même, ni contre la GH native.

- Par contre, la GH native, lorsqu'elle est administrée de façon itérative (groupe 3), induit l'apparition d'un taux plasmatique très élevé en anticorps dirigés contre elle-même, qui induisent une neutralisation de ses effets, ce qui explique que les rats du groupe 3 aient une prise de poids plus faible que celle des rats du groupe 1.

- Le peptide PI et la GH native induisent tous deux une augmentation de la production d'IGF-1 plasmatique. Toutefois, outre le fait que la production d'IGF-1 est notablement plus élevée chez les rats du groupe 4 que celle observée chez les rats des

groupes 2 et 3, elle est aussi la seule à se maintenir dans le temps puisque, à la semaine 19, les taux plasmatiques d'IGF-1 des rats du groupe 4 sont encore 4 fois plus élevés que ceux des rats du groupe 1, alors que les taux plasmatiques d'IGF-1 des rats du groupe 2 sont inférieurs à ceux du groupe 1 et ceux du groupe 3 sont du même ordre que ces derniers.

Claims

REVENDICATIONS

1. Peptide, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acides aminés (I) ci-après : Xt-Tyr-X2-Leu-X3-Ala-Gly-X4-Lys-Asn-Phe-Phe-X5 (I) dans laquelle : - Xl est absent ou représente, lorsqu'il est présent, un résidu valine ou une séquence choisie parmi les séquences suivantes :

Z t-Val

Asp-Z,-Val

Ser-Asp-ZI-Val Z2-Ser-Asp-Zi-Val, et Gly-Z2-Ser-Asp-Zi-VaI dans lesquelles Zt représente soit un résidu arginine, auquel cas Z2 représente un résidu thréonine, soit la séquence Ser-Asp, auquel cas Z2 représente un résidu alanine ; - X représente une séquence choisie parmi les séquences Glu-Lys, Glu-Ser et AspLeu ; - X3 est absent ou représente, lorsqu'il est présent, un résidu lysine ou une séquence choisie parmi les séquences suivantes :

Lys-Asp

Lys-Asp-Leu

Lys-Asp-Leu-Glu

Lys-Asp-Leu-Glu-Glu Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Gly

Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Gly-Ile Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Gly-Ile-Gln

Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Gly-Ile-Gln-Z3, et

Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Gly-Ile-Gln-Z3-Leu dans lesquelles Z3 représente un résidu alanine ou thréonine ; - X4 représente un résidu choisi parmi les résidus cystéine, sérine, tyrosine, phénylalanine, acide aspartique, acide glutamique, alanine et glycine ; tandis que

Trp-Lys- Thr-Phe- Thr-Ser-X6, et Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Xs-Lys-GIn-Ala dans lesquelles X6 représente un résidu choisi parmi les résidus cystéine, sérine, tyrosine, phénylalanine, acide aspartique, acide glutamique, alanine et glycine ; avec la double condition que, quand XI est absent, alors Xs représente la séquence Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Xë-Lys-GIn-Ala, et que X4 et X6 ne soient pas conjointement des résidus cystéine.

Trp-Lys-Thr-Phe Trp-Lys-Thr-Phe-Thr Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser

Trp-Lys-Thr

Trp-Lys

- X$ est absent ou représente, lorsqu'il est présent, un résidu tryptophane ou une séquence choisie parmi les séquences suivantes :

2. Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que, dans la

séquence (I), XI représente la séquence Gly-ZrSer-Asp-Zt-val dans laquelle Z) et Z2 ont la même signification que précédemment, X3 est absent, X2 et X4 ont la même signification que précédemment, tandis que X$ représente la séquence Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Ser.

3. Peptide selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acides aminés (II) ci-après (SEQ ID N0 : 1) : Gly-Thr-Ser-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Ala-Gly-Ser-Lys-Asn-Phe-Phe-TrpLys-Thr-Phe-Thr-Ser-Ser (II)

4. Peptide selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acides aminés (III) ci-après (SEQ ID N0 : 2) : Gly-Ala-Ser-Asp-Ser-Asp-Val-Tyr-Asp-Leu-Leu-Ala-Gly-Ser-Lys-Asn-Phe-Phe-

Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Ser (III)

5. Peptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que un ou plusieurs des résidus thréonine, alanine, tryptophane et phénylalanine qu'il comprend, appartiennent à la série D.

6. Peptide selon la revendication 5, caractérisé en ce que les deux résidus phénylalanine consécutifs qu'il comprend, appartiennent à la série D.

7. Peptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'un groupe alkyle en CI-C3 est fixé sur le résidu tryptophane qu'il comprend, lorsque X$ est présent dans la séquence (1).

8. Peptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est lié de façon covalente, au niveau de son extrémité C-terminale ou d'un résidu lysine, à une molécule d'un poly (éthylène glycol).

9. Peptide selon l'une quelconque des revendications pour l'utilisation en tant que médicament.

10. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 en tant que principe actif, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement acceptables

11. Utilisation d'au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 pour la préparation d'un médicament destiné à pallier un déficit en hormone de croissance endogène.

12. Utilisation d'au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 pour la préparation d'un médicament destiné à augmenter la masse musculaire.

13. Utilisation d'au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 pour la préparation d'un médicament destiné à stimuler ou restaurer les défenses immunitaires.

14. Complément alimentaire, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 en tant que substance active, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement acceptables.

15. Utilisation d'au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 pour la préparation d'un complément alimentaire destiné à augmenter la production de viande ou de lait.

16. Utilisation d'au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 pour stimuler in vitro la prolifération cellulaire.