WO1994004187A1 - Procede pour ameliorer la croissance et la qualite des carcasses des animaux domestiques producteurs de viande, ensemble de vaccination et vaccins - Google Patents

Procede pour ameliorer la croissance et la qualite des carcasses des animaux domestiques producteurs de viande, ensemble de vaccination et vaccins Download PDF

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WO1994004187A1
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Raymond Dufour
Claude Roulet
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Boehringer Ingelheim Animal Health France SAS
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Rhone Merieux SA
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6081—Albumin; Keyhole limpet haemocyanin [KLH]

Definitions

  • the present invention relates to a process for improving the growth and quality of carcasses of domestic pigs and ruminants intended for meat production, by which the protein anabolism, particularly that of muscle tissue, is substantially increased and lipogenesis, by increasing the anabolic actions of endogenous growth hormone. It also relates to a set of vaccinations and vaccines.
  • the zootechnical interest of this hormone in its applications to the increase of the production of meat or milk, is due to its properties of coordination of the tissue, muscular, mammary, adipose metabolisms, which act in support of physiological processes or dominant growths, which define homeorhesis and which implement the direct distribution of nutrients (Bauman DE et al., Federation Proc, 1982, 41, 2538-2544). Additional studies have shown that growth depends on a variety of factors such as the protein composition of the ration, the amount of hormone administered, and possibly specific environmental conditions.
  • immunological methods attempt to replace this exogenous supply, either by seeking to increase the activity of endogenous GH, by the action of antibodies directed against certain peptide sequences of GH, either by seeking to increase the secretion of endogenous GH by the action of antibodies directed against certain peptide sequences of GRF (Growth Hormone Releasing Factor) or by the immunoneutral isation of somatostatin (SRIF: Somatotropin Release Inhibiting Factor).
  • GRF Crowth Hormone Releasing Factor
  • SRIF Somatotropin Release Inhibiting Factor
  • application EP-AO 137 234 describes the 7 kDa fragment of the part C-terminal of human growth hormone
  • application EP-AO 284 406 relates to the fragment 35-53 of growth hormone of different species
  • application WO 89/00166 relates to passive and active immunization against -vis peptide fragments of the sequence 112-159 of GH of different species, in particular ovine, bovine and porcine
  • application EP-AO 429 788 relates to the passive and active immunization of the fragments 98-110, 110-118 and 155-163 of porcine growth hormone and equivalent antigenic peptides. These fragments are compared to peptides 35-52, 36-44, 46-53 and 35-43 which are derived from those described in application EP-A-O 284 406.
  • EP-A-O 284 406 relates to the fragment
  • Trout WE and Schanbacher (1990 cited) do not observe any effect on GH, on the increase in weight and on the composition of the carcass.
  • IGF.1 insulin-1 ike growth factor 1
  • the mechanisms of action of growth hormone or somatotropin are still poorly defined and can involve either a direct action of GH on the metabolism of tissue proteins, or an action dependent on insulin-1 ike growth factor 1 (IGF.1).
  • IGF.1 insulin-1 ike growth factor 1
  • the latter would involve the endocrine and / or autocrine-paracrine activities of IGF.1 to account for the presence of GH receptors, particularly on the liver and muscle.
  • the endocrine activity of IGF.1 has been the subject of numerous demonstrations. Administration of IGF.1 to hypophysectomized rats stimulates their growth (Schoenle E. et al., Nature 1982, 296, 252-253). GH would increase the secretion of IGF. 1 Hepatigue which would act on the anabolism of proteins in muscle tissue.
  • mice lacking GH receiving IGF.1 and / or GH from Pell JM and Bâtes PE (Endocrinology 1992, 130, 1942-1950)].
  • the first model showed that the expression of IGF.1 in the absence of GH stimulates weight and longitudinal growth normally and that, moreover, GH and IGF.1 appear to act respectively on the growth of the liver and the brain.
  • the second mouse model lacking GH made it possible to study the respective roles of GH and IGF.1 on protein metabolism liver, muscle and heart tissue. IGF.1 and GH have specific effects on tissue protein metabolism in this model.
  • GH has greater anabolic activity than IGF.1 on the protein metabolism of muscle and cardiac tissues and acts alone and directly on that of liver tissue.
  • the object of the present invention is to provide a process which makes it possible to obtain, in all growing ruminants and pigs, intended for the production of meat, an increase in weight growth, an increased efficiency of the food ration and an improvement in composition. of the carcass, obtained by the increase in protein anabolism, particularly that of muscle tissue, and the decrease in lipogenesis, by the increase in the anabolic actions of endogenous growth hormone (GH).
  • GH endogenous growth hormone
  • this objective can be achieved by means of multiple active immunization involving at least two distinct valences leading to an increase in the basal and pulsed secretion of the growth hormone GH and preferably in addition to a potent ial immunomodulation of this hormone, these two valences having a synergistic effect making it possible to achieve the desired result even in rapidly growing animals.
  • the present invention therefore relates to a process for improving the growth and quality of the carcasses of domestic pigs and ruminants intended for meat production, by which anabolism is substantially increased protein, particularly that of muscle tissue, and lipogenesis is reduced, by increasing the anabolic actions of endogenous growth hormone, characterized in that the animal is administered a valence designed to induce an increase in basal and pulsed secretion of GH growth hormone and at least one other valence chosen from valences designed to induce this effect or a potentiating immunomodulation of GH.
  • the latter is preferably obtained by active immunization directed against one or more fragments of GH so as to increase its activity.
  • the immunizing modulation potentiating the GH or the anti isomatostatic immunization with the immunizing modulation potentializing the GRF which also leads to an increase in the basal and pulsed secretion of the GH, by active immunization. against one or more fragments of GRF so as to increase the activity of this hormone.
  • Active somatostatin immunoneutralization is preferably obtained using somatostat ine 14 and / or at least one of its peptide fragments capable of inducing neutralizing antibodies.
  • the active potentiating immunomodulation of GRF is preferably obtained using at least one of the peptide sequences described in international patent application WO 90/15073, the sequence 28-44 or any of the sequences partial of this region and in particular the sequences 31-44 and 35-44.
  • GH is preferably obtained using at least one of the peptide sequences described on the one hand for pST
  • EP-A-0 303 488 for the sequences 122-138, 119-131, 130-143,
  • the invention also covers the use of fragments of these sequences retaining the activity of the sequence from which they originate and of fragments or sequences antigenically and immunologically equivalent to the fragments and sequences thus defined, which also covers sequences incorporating them.
  • peptides can be obtained by chemical or biochemical synthesis or by expression of a recombinant DNA in an appropriate host. They are in all cases associated with a carrier molecule responsible for immunogenicity, in the form of a conjugate in which the sequence is covalently linked to the immunogenic carrier molecule or also in the form of an immunogenic fusion protein obtained directly by expression of recombinant DNA.
  • the valences according to the invention preferably comprise an adjuvant of immunity and are advantageously in the form of an emulsion.
  • valences in particular in water-in-oil or oil-in-water emulsion, designed to obtain immunization leading to marked and long-lasting activation of GH after one or two administrations.
  • the method according to the invention preferably comprises an early administration of valences in young animals, in particular in the first weeks following birth, preferably at weaning in piglets and between 3 and 4 weeks for lambs and calves.
  • a second administration can be carried out later, preferably then at least approximately 4 weeks after the first, at the earliest approximately 3 months and later approximately 1 month before the slaughter of the animal, to obtain an immunization leading to an activation (global activation resulting from the increase in the secretion of GH and possibly from the potentiation of its activity) marked and of long duration of the GH.
  • the so-called early administration also includes, according to the invention, the single administration of the valences in a form ensuring their delayed, continuous or pulsed release, capable of maintaining a high level of antibodies.
  • the subject of the invention is also a vaccination assembly containing a valence determining an increase in the basal and pulsed secretion of the hormone GH and at least one valence chosen from valences determining this same effect or a potential immunomodulation which is hormone growth hormone, for simultaneous, separate or spread over time to increase the anabolic actions of GH growth hormone.
  • the valent potent ial i sant the growth hormone can be a vaccine comprising as active ingredient at least one peptide sequence of GH and able to induce antibodies directed against the corresponding sequence of endogenous GH to potential ial activity of the latter.
  • the determining valences on the secretion of GH can be a vaccine comprising as active ingredient somatostatin and / or at least one of its fragments capable of inducing neutralizing antibodies, to induce antibodies against isomatostatin, and / or a vaccine comprising at least one GRF peptide sequence for inducing antibodies against the corresponding endogenous GRF sequence to potentiate its action.
  • GH and GRF peptide sequences can be chosen from those mentioned above.
  • the peptide sequences and somatostatin or its fragments are associated with carrier molecules as seen above.
  • simultaneous use means the use of a mixture, extemporaneous or not, of the different valences.
  • separate use is meant the separate administration of unmixed valences within a short period of time.
  • use spread over time is meant the separate administration of the valencies over time or the simultaneous or separate administration in the above sense of the valences but repeatedly.
  • a preferred vaccination set comprises a mixture of valences, made or to be made extemporaneously, preferably in water-in-oil emulsion or in oil-in-water emulsion, which, after a first administration, generally induces a response. immune system with no significant effect on the activity of growth hormone and which, after a second administration, induces immunization leading to marked and long-lasting activation of GH.
  • a subject of the invention is also muitivalent vaccines containing a valence designed to induce an increase in the basal and pulsed secretion of growth hormone GH and at least one valence chosen from valences designed to induce this same effect or a potentiating immunomodulation.
  • GH growth hormone The.
  • valences are especially chosen from: a valence comprising as active ingredient the somatostatin and / or at least one of its fragments capable of inducing neutralizing antibodies associated with an immunogenic carrier molecule; a valency comprising as active principle at least one peptide sequence of GH associated with an immunoqene carrier molecule, capable of inducing antibodies potentiating the activity of GH; a valence comprising as active principle a peptide sequence of GRF associated with an immunogenic carrier molecule, capable of inducing antibodies potentiating the activity of GRF.
  • the vaccines are adjuvanted to obtain an immunization leading to a marked and long-lasting activation of GH after one or more, in particular two, administrations.
  • the adjuvants used are preferably an oil-in-water or water-in-oil emulsion.
  • the peptide sequences can in particular be chosen from those mentioned above.
  • An advantageous vaccine according to the invention can be prepared according to any known technique in a form ensuring delayed, continuous or pulsed release of valences and thus maintaining a high level of antibodies.
  • the emulsions according to the invention preferably consist of a mixture of highly purified mineral oils and non-ionic surfactants.
  • the different peptides indicated for the implementation Work of the invention cannot by themselves trigger an immune response and lead to the appearance of antibodies.
  • carrier molecules which are generally proteins (albumin, ovalbumin, tetanus toxoid, alpha-globulin, thyroglobulin, hemocyanin for example) by covalent bonds or be expressed in an appropriate host from recombinant DNA in the form of an immunogenic fusion protein, for example a protein from the periplasm (MalE) or the outer membrane (TraTp) of E. coli or any other protein with similar properties.
  • the conjugation of a peptide on a protein involves the creation of a covalent bond between the peptide and the protein. This bond is made on the reactive groups of the amino acid residues of the carrier protein (aspartic acid, glutamic acid, histidine, tyrosine, cysteine and especially lysine) or on oligosaccharides after periodic oxidation (for glycoproteins).
  • the binding can also take place on the amino acid residues, on the NH 2 and COOH ends (when they are free); an additional amino acid can be added such as tyrosine (which also allows labeling with radioactive iodine) and especially cysteine which can react quantitatively with certain groups.
  • conjugation agents have been proposed. They can be classified into 3 main classes: homobifunctional agents, heterobifunctional agents and condensing agents.
  • Homobi functional agents essentially consist of an aliphatic and / or aromatic hydrocarbon chain, having at its ends two identical groups capable of reacting with good yield with the amino acid residues carried by the peptide and the carrier molecule .
  • Many groups have been proposed: methyl bisimidates, N-hydroxysuccinimide diesters, bis isothiocyanates, dialdehydes, all of which react on the amine functions, bisdiazotized benzidine, which copulate on the residues of tyros i ne, bi smal eimides, which is' addi t on thiols.
  • the most widely used homobi functional agent is glutaraldehyde.
  • the homobi functional agents lead, in addition to the peptide-carrier protein bond sought, to dimerization of the peptide and of the carrier protein and, if the protein or the peptide has several reactive groups, to crosslinking of the conjugate rendering its Difficult reproduc ibility and characterizat ion.
  • heterobi functional agents consist of a hydrocarbon chain having at its ends two different reactive groups. The coupling is done in 3 stages:
  • one of the reactive groups is an ester of N-hydroxysuccinimide (or N-hydroxysul fosuccinimide, more soluble in water) which reacts initially in an aqueous medium on amine residues to give an amide bond with the coupling agent.
  • the other group is generally either a group capable of releasing thiols [S-acet ⁇ l thioglycolate from SATA, hydrolyzable by hydroxyamine or dilute bases, (pyr idy 1 -2) di thio from SPDP, reduced by di thiothreitol ], or on the contrary a group capable of reacting with thiols (maleimide of MBS, SMPB, SMCC or GMBS), (2-pyridyl) di thio of SPDP, iodoacetyl of SIAB.
  • thiols maleimide of MBS, SMPB, SMCC or GMBS
  • condensation reagents there is no ligand between the carrier molecule and the peptide.
  • the carbodi imides and the periodic oxidation of ol igosaccharides in sugars.
  • the carbodi imides allow the formation of an amide bond between the amino and carboxylic acid groups carried by the two molecules, peptide and carrier protein.
  • the reaction is carried out by activating the carboxylic acid function (O-acyl isourea) on which the amino groups react. It has been proposed to catalyze the reaction with N-hydroxysuccinimide, the reactive species is al ⁇ rs an ester of N-hydroxysuccinimide, whose half-life is longer than that of isourea O-acyl.
  • the vaccines of the invention intended for domestic ruminants and pigs consist in particular of two or three immunogens associated with immunity adjuvants, forming the valences of the vaccines. These valences can be constituted as follows: - mixing of the respective conjugates or fusion proteins with somatostatin and a GH peptide sequence,
  • the adjuvanting substances of immunity, or adjuvants are of very varied chemical nature and have a mode of action still little known.
  • the adjuvants most widely used in animal vaccine preparations can be classified into three groups: aluminum gels, saponins and emulsions.
  • Aluminum hydroxides are either prepared in situ, by adding alum to the antigen solution, or separately, before being added to the antigen. These apparently amorphous gels, however, contain boehmite microcrystals (AlOOH) (Shirodkar S. et al., Pharm. Res., 1990, 7, 1282-1288).
  • Saponins are substances extracted from plants belonging to various families (Caryophyllaceae, Rosaceae, Araliaceae ...); their essential property is to lower the surface tension and many of them are hemolytic.
  • saponins are very complex mixtures of heterosides of triterpenes or sterols, chemically very similar.
  • the bark of Panama wood has provided under the name Quil A a purified fraction, but which is still a complex mixture of tri terpene heteroids some of which are adjuvants and whose complete chemical structure is known only for a very small number of them.
  • the saponin Quil A forms with certain proteins (generally amphiphilic) complexes called is ⁇ oms (immunost imulat ing complex) which are very powerful adjuvants.
  • the emulsions are macroscopically homogeneous dispersions of a liquid in another immiscible liquid.
  • One of the liquids being generally water, the other oil or an oil miscible substance, we will speak of water-in-oil emulsion (W / O) and oil emulsion -in-water (O / W) depending on whether the dispersed phase is water or oil respectively.
  • W / O water-in-oil emulsion
  • O / W oil emulsion -in-water
  • the emulsion is made stable by a third component, which is the surfactant.
  • oils used until now are mineral oils (hydrocarbons) obtained by refining petroleum. Their exact chemical composition is not precisely known. These oils are characterized by various parameters (viscosity, density, refractive index) that i are linked to the average molar mass and to the type of hydrocarbon: isoparaffinic or cycloparaffic (naphthenic); linear hydrocarbons and aromatics having been eliminated during refining. Currently hydrocarbons obtained by "oligomerization" of alkenes, chemically much better defined than mineral oils, are available.
  • Vegetable oils which are biodegradable, are possible, but have not yet led to the industrial production of emulsion vaccines.
  • Surfactants are substances having a hydrophilic part, and a lipophilic part. These substances, alone or mixed together, are put at the water-oil interface and, depending on the relative importance of the hydrophilic and lipophilic parts (hydrophi le-1 ipophi le or HLB balance of the Anglo-Saxon authors), lead to oil emulsions -in-water or water-in-oil, whose properties are different, both physically (viscosity, behavior towards containers %) and biologically
  • hydrophilic groups An important point, in particular for the emulsions intended to be injected, is the chemical nature of the surfactants, in particular hydrophilic groups.
  • the hydrophilic groups will preferably be nonionic.
  • lipophilic surfactants with very low HLB such as Span ® 85 (sorbitan trioleate) or Pluronic ® L121 (ethylene oxide-co-propylene oxide) is that they are themselves adjuvants (Woodward LF, Lab. Anim. Sci. 1989, 39, 222-225). This is to be linked to the adjuvant power of vegetable oils (weaker, however, than that of hydrocarbons) which can be considered as very low HLB surfactants.
  • the emulsions may contain bacterial bodies used either as immunogens or as an adjuvant.
  • the use of killed mycobacteria, in the complete Freund's adjuvant in particular, is possible in the laboratory, but is impossible for farm animals.
  • the search for the adjuvant substance present in mycobacteria and the smallest chemical structure which has this property has led to the isolation, and the characterization of muramy ldipept ide (MDP), then to its synthesis.
  • MDP muramy ldipept ide
  • the conjugate with somatostat ine can be constituted from the naturally occurring hormone, somatostat ine 14 (or somatostat i ne 15-28), or fragments thereof capable of inducing neutralizing antibodies. It is obtained by one or other of the conjugation methods described above.
  • the somatostat ine is a tetradecapept ide. Its formula is as follows:
  • conjugates can be produced by a coupling between a polymer (Lys-Ala) and the somatostat ine by carbodiimide in the presence of N-hydroxysulfosuccinimide, by a coupling between the tetanus toxoid and the somatostat ine by glutaraldehyde, by a coupling between thyroglobul i ne and the somatostat ine by carbodiimide or by the coupling between alpha-globulin ine and the somatostat ine by glutaraldehyde.
  • the conjugate is obtained by adding 50 mg of somatostat ine and 200 mg of human alpha globulin dissolved in 40 ml of 0.1 M ammonium acetate, 26 ml of 20 mM glutaraldehyde solution (0 , 2%) over a period of 1 hour. The mixture is left overnight at ambient temperature, then is dialyzed several times at 4 ° C. against 0.15 M NaCl buffer 0.01 M phosphate, pH 7.5.
  • the conjugate which forms an ocher suspension, is concentrated by ultrafiltration on an Amicon ultrafiltrating membrane with a cutoff threshold of 10 kDa, until a final volume of 25 ml is obtained.
  • the antigen is emulsified using an industrially used formulation, into which enter highly purified mineral oil and nonionic surfactants, one lipophilic, the other hydrophilic; the final product is an oil-in-water emulsion.
  • the conjugate is obtained by adding, to 12 mg of thyroglobulin and 4 mg of somatostatin dissolved in 2 ml of water, 2.3 mg of N-ethyl-N '- (3-diethylamino propyl) carbodiimide and 0, 83 mg of N-hydroxysul fosuccinimide dissolved in water. The pH is adjusted around 6-7. The mixture is left overnight at room temperature. The solution is then centrifuged, desalted by ⁇ hromatographi e on Sephadex G-50 in 0.05 M NH 4 HCO 3 buffer, then lyophi 1 ised.
  • the antigens are taken up in 2.5 ml of 150 mM NaCl buffer - 10 mM phosphate pH 7.5, then are emulsified in an oily phase used industrially to obtain a water-in-oil emulsion.
  • This oily phase contains highly purified mineral oil and non-ionic, lipophilic and hydrophilic surfactants.
  • PEPTIDE SEQUENCES OF GH AND GRF
  • the peptide sequences of the GRF and GH hormones indicated in the patent applications or in the aforementioned articles, can be used at a rate of one per type of hormone for the preparation of conjugates or fusion proteins.
  • peptide sequences of GH which can be used are in particular the following:
  • bovine 122-138 Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gl ⁇ -Leu-Leu-Ser - sequences 122-138, 119-131, 130-143, 123-137 and 133-146 (bovine, ovine hormones, swine). bovine 122-138:
  • GRF peptide sequences which can be used are in particular the following:
  • sequences 28-44 porcine, bovine (or ovine or caprine) and more particularly the sequences 31-44 or 35-44
  • GRF peptide 28-414
  • KLH Megathura crenulata
  • 50 mg of GRF peptide (28-44) and 36 mg of lyophilized hemocyanin from Megathura crenulata (KLH) are successively dissolved in an opaque bottle containing 11.5 ml of 0.1 M NaHCO 3 .
  • 475 ⁇ l of 68.5 mM glutaraldehyde are added over a total period of 5 hours (i.e. 50 ⁇ l every 30 minutes).
  • the solution is immediately dialyzed at + 4oC against an isotonic buffer (0.15 M NaCl 0.01 M phosphate - pH 7.5).
  • a vaccine comprising, in a water-in-oil or oil-in-water emulsion, an immunogenic conjugate of one of the above GRF sequences and / or GH and an immunogenic conjugate of somatostatin 14.
  • the first administration of the vaccine induces an immune response with no significant effect on the activity of the growth hormone.
  • the second administration of the vaccine is necessary so that the immunization and its effects on the potential GH immunizing immunity become marked and prolonged.
  • the emulsions are stable and made from a mixture of highly purified mineral oils and non-ionic surfactants.
  • the vaccination schedule is as follows:
  • second vaccine at least 4 weeks after the first, at the earliest 3 months and at the latest 1 month before slaughter.
  • the mode of administration of these formulations is preferably transcutaneous, in particular using a needle-free injection apparatus by pressure jet, in particular according to patent application FR-A-2 652 257.
  • the effectiveness of active immunization is measured by the immune responses and the effects on weight growth and the water, protein and fat composition of muscle tissue.
  • the antibody titers are determined by radioimmunoassay up to the time of slaughter and relate to the anti isomatostatic antibodies and anti-peptide sequences of the GRF and GH hormones.

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Abstract

Procédé pour améliorer la croissance et la qualité des carcasses des porcins et ruminants domestiques destinés à la production de viande, par lequel on augmente sensiblement l'anabolisme protéique, particulièrement celui du tissu musculaire, et l'on diminue la lipogénèse, par l'augmentation des actions anabolisantes de l'hormone de croissance endogène, caractérisé en ce qu'on administre à l'animal une valence conçue pour induire une augmentation de la sécrétion basale et pulsée de l'hormone de croissance GH et au moins une autre valence choisie parmi des valences conçues pour induire cet effet ou une immunomodulation potentialisatrice de la GH.

Description

Procédé pour améliorer la croissance et la qualité des carcasses des animaux domestiques producteurs de viande, ensemble de vaccination et vaccins.
La présente invention est relative à un procédé pour améliorer la croissance et la qualité des carcasses des porcins et ruminants domestiques destinés à la production de viande, par lequel on auqmente sensiblement l'anabolisme protéique, particulièrement ceiui du tissu musculaire, et l'on diminue la lipogénèse, par l'augmentation des actions anabolisantes de l'hormone de croissance endogène. Elle concerne également un ensemble de vaccination et des vaccins.
L'administration continue et prolongée de l'hormone de croissance homologue, extraite des hypophyses ou produite par l'expression d'un ADN recombinant dans un hôte approprié, aux ruminants et porcins en croissance destinés à la production de viande, entraîne une augmentation de la croissance pondérale, une amélioration de la composition de la carcasse par l'augmentation de la masse protéique par rapport à celle des graisses et une amélioration de l'efficacité alimentaire.
L'intérêt zootechnique de cette hormone, dans ses applications à l'augmentation de la production de viande ou de lait, est dû à ses propriétés de coordination des métabolismes tissulaires, musculaires, mammaires, adipeux, qui agissent en support des processus physiologiques ou de croissance dominants, qui définissent l'homéorhèse et qui mettent en oeuvre la répartition directe des nutriments (Bauman D.E. et al., Fédération Proc, 1982, 41, 2538-2544). Des études complémentaires ont mis en évidence que la croissance dépend de facteurs variés tels que la composition en protéines de la ration, la quantité d'hormone administrée et peut-être des conditions particulières de l'environnement.
Chez le porc, les travaux de Machlin (J. Anim. Sci., 1972, 35, 794-800), Chunq C.S. et al (J. Anim. Sci., 1985, 60, 118-130), Etherto T.D. et al. (J. Anim. Sci., 1987, 64, 433-443), Evock CM. et al (J. Anim. Sci., 1988, 66, 1928-1941), Campbell R.G. et al (J. Anim. Sci. 1989, 67, 177-186), Smith V.G. et Kasson (J. Anim. Sci., 1990, 68, 4109-4116) et Grant A.L. et al.(J. Endocrinol., 1991, 130, 331-338 ; 1991, 69, 571-577) ont montré que l'hormone de croissance porcine administrée pendant plusieurs semaines ne développait nettement ses effets anaboliques sur la croissance musculaire et sur l'efficacité alimentaire que sur les animaux recevant une alimentation riche en protéines. Chez les ruminants, les mêmes conclusions ont été apportées par les travaux de Pell J.M. et al. (British Journal of Nutrition 1990, 63, 431-445) et Mac Rae J.C. (J. Endocrinol., 1991, 130, 53-61) sur les moutons, et ceux de Eisemann et al. (J. Nutrition 1986, 116, 2504-2515 et J. Nutrition 1989, 67, 105-115) et de Breir B.H. et al. (J. Endocrinol., 1988, 116, 169-177) pour les génisses et bouvillons. Les derniers ont montré en particulier que le gain de poids était corrélé avec le développement des récepteurs hépatiques de grande affinité pour la GH, lesquels dépendaient également de la richesse en protéines de la ration.
Pour pallier les difficultés ou les- contraintes liées à l'administration exogène de l'hormone de croissance, les méthodes immunologiques tentent de remplacer cet apport exogène, soit en cherchant à augmenter l'activité de la GH endogène, par l'action d'anticorps dirigés contre certaines séquences peptidiques de la GH, soit en cherchant à augmenter la sécrétion de la GH endogène par l'action d'anticorps dirigés contre certaines séquences peptidiques de GRF (Growth Hormone Releasing Factor) ou par l'immunoneutral isation de la somatostatine (SRIF : Somatotropin Release Inhibiting Factor).
L'augmentation de l'activité de la GH d'origine externe sur la croissance de rats hypophysectomi ses ou de souris dépourvues de GH a été obtenue par son administration sous la forme de complexes avec certains anticorps monoclonaux vis-à-vis de certains épitopes de GH par Holder A. T. et al (J. Endocrinol., 1986, 107, R9-R12), Aston R. et al. (J. Endocrinol., 1986, 110, 381-388), Aston R. et al. (Mol. Immunol. 1987, 24, 143-150), Wallis R. et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 149, 187-193), Aston R. et al. (Mol. Immunol., 1989, 25, 435-446), la demande de brevet EP-A-O 458 072 (American Cyanamid Company), concernant l'anticorps monoclonal PS 7.6 associé à la pST, et par Bâtes P.C. et al. (J. Endocrinol., 1992, 132, 369-371). Cette augmentation de l'activité de GH est également observée avec certains sérums préparés à l'aide de séquences particulières de la GH ovine par Bomford R. et Aston R. (J. Endocrinol., 1990, 125, 31-38) ou de la GH porcine par Wang B.S. et al. (J. Endocrinol., 1990, 127, 482-485).
Les propriétés que possèdent les anticorps développés contre certaines séquences peptidiques de l'hormone de croissance peuvent être mises en oeuvre directement vis-à-vis de l'hormone endogène des animaux en croissance à l'aide de l'immunisation active dirigée contre ces séquences. Ces possibilités sont mentionnées dans les demandes de brevet EP-A-O 137 234 (Wellcome), EP-A-O 303 488 (Coopers Animal Health Limited), EP-A-O 284 406 (Coopers Animal Health Limited), EP-A-O 429 788 (American Cyanamid Company) et WO 89/00166 (Peptide Technology LTD).
Une application particulière est décrite par Pell J.M. et Aston R. (J. Endocrinol., 1991, 131, R1-R4) à l'aide de la séquence 134-154 de la pST utilisée sous forme d'un conjugué immunogène chez l'agneau. L'augmentation de la croissance pondérale et du poids de la carcasse et l'amélioration de la composition de la carcasse en protéines, sans que celle-ci entraîne de diminution significative de la quantité de graisse, sont corrélées avec l'immunisation contre ce peptide. Les activités métabol igues dues à l'immunomodulation de la GH endogène dans cette étude seraient différentes de celles qui sont apportées par l'administration de GH et n'entraîneraient pas de différences significatives des concentrations plasmatiques de la GH, de l'IGF.I ( insul ine- 1 ike growth factor I) et de l'insuline.
Des séquences peptidiques de l'hormone de croissance entraînant la formation d'anticorps potent ial isant l'activité anabolique de la GH sont décrites dans les demandes de brevet précitées : la demande EP-A-O 137 234 décrit le fragment de 7 kDa de la partie C-terminale de l'hormone de croissance humaine, la demande EP-A-O 284 406 concerne le fragment 35-53 de l'hormone de croissance de différentes espèces, la demande WO 89/00166 concerne l'immunisation passive et active vis-à-vis de fragments peptidigues de la séquence 112-159 de la GH de différentes espèces, en particulier ovine, bovine et porcine, la demande EP-A-O 429 788 concerne l'immunisation passive et active des fragments 98-110, 110-118 et 155-163 de l'hormone de croissance porcine et les peptides antigénigues équivalents. Ces fragments sont comparés aux peptides 35-52, 36-44, 46-53 et 35-43 gui sont dérivés de ceux décrits dans la demande EP-A-O 284 406.
La demande EP-A-O 284 406 concerne le fragment
35-53 de l'hormone de croissance porcine (pGH), ovine ou bovine (oGH/bGH), les peptides bGH 26-43, bGH 35-43, bGH 37-48, bGH 39-46, bGH 43-54, bGH 43-61 et leurs analogues humains, aviaires, porcins et de poissons. Leur conjugaison à différents peptides, à des épitopes de la cellule T et à la somatostat ine est envisagée de manière théorigue. Ces conjugués sont proposés pour une immunisation active destinée en particulier à l'augmentation de la somatogénèse et de la lactogénèse. La demande WO 89/00166, pour les mêmes espèces, concerne la séquence 112-159 de la GH, plus particulièrement les séquences 130-150 de la GH bovine, 134-154 et 120-140 de la GH porcine.
L'augmentation de la sécrétion endogène de GH par l'augmentation de l'activité de GRF par certains anticorps anti-GRF a fait l'objet de la demande de brevet WO 90/15073 (Coopers Animal Health Limited) qui propose l'emploi des anticorps dirigés contre des séquences peptidiques situées dans la région 28-44 du GRF et en particulier les séquences peptidiques 31-44 et 35-44 pour l'amélioration de la croissance de la lactation ou de la composition de la carcasse, que ces anticorps soient d'origine passive ou active. Cette même demande propose de façon théorique la conjugaison de ces séquences avec tout ou partie de la somatostatine ou de l'hormone de croissance.
L'immunoneutralisation active de la somatostatine visant à l'augmentation de la croissance et de l'indice de consommation et à l'amélioration des caractéristiques de la carcasse a été décrite dans ses applications aux espèces domestiques.
Chez les bovins, l'immunisation active de bouvi lions est rapportée par Trout W.E. et Schanbacher B.D. (J. Endocrinol., 1990, 125, 123-129) et Lawrence M.E. et al. (J. Anim. Sci., 1987, 215, Suppl. 1 résumé 135) chez la génisse laitière par Petitclerc G. et al. (J. Anim. Sci., 1988, 66, Suppl. 1 389) et chez le veau par Vicini J.L. et al. (Dom. Anim. Endocrinol. 1988, 5, 35). Les effets de l'immunisatich ant isosmatostatine ne sont pas concordants : l'augmentation de la sécrétion basale de GH n'est observée que par Petitclerc et al. (1988 cité) et l'augmentation de la croissance sur les génisses laitières n'est observée que par Lawrence et al. sur les bouvi lions (1987 cité). Trout W.E. et Schanbacher (1990 cité) n'observent aucun effet sur la GH, sur l'augmentation pondérale et sur la composition de la carcasse.
Chez les moutons, les travaux sur l'immunisation ant i somatostatine ont conduit également à des résultats discordants. L'augmentation de la sécrétion de GH, mesurée par la sécrétion basale et puisée est observée sur des agneaux recevant une immunisation active à partir de l'âge de 5 mois (Varnes M. A. et al., Endocrinology 1980, 106, 1027-1032) ; par contre le gain de poids de ces animaux est inférieur à celui des témoins.
Ces résultats ne sont pas confirmés sur des agneaux soumis à l'immunisation active ant isomatostat ine au même âge (4-5 mois) et placés dans des conditions d'alimentation riche ou non (Bass J.J. et al., J. Endocrinol., 1987, 112, 27-31). Dans ces conditions, aucune augmentation de GH n'est observée et une légère augmentation du taux de croissance est mesurée à la limite de la signification chez les animaux recevant la ration la plus riche.
Ces deux essais ont montré le peu d'efficacité de l'immunisation active ant i somatostat ine des agneaux âgés sur la croissance et le rôle non négligeable de l'alimentation sur le taux de croissance. Tous les travaux qui sont ensuite rapportés ont été effectués sur des agneaux plus jeunes, âgés de 3 à 4 semaines, soumis à l'immunisation active contre la somatostatine. Ils montrent une augmentation du taux de croissance sans modification de la composition de la carcasse et de la sécrétion basale ou puisée de GH . C'est ainsi que Spencer G. S. G. et al. (Anim. Prod. 1981, 32, 376) observent une augmentation de la croissance de 76 % ; les essais suivants ont confirmé une augmentation du taux de σroissance des agneaux immunisés de l'ordre de 15 à 20 % (Spencer G. S. G. et al., Livest. Prod. Sci, 1983, 10, 25-37 et 469-477 ; Chaplin R.K. et al., Can. J. Anim. Sci., 1984, 64, Suppl. 1, 312-313). Cependant, cet effet d'accroissement serait moins important chez les races à développement rapide et ne serait observé chez celles-ci gue sur les femelles (Spencer G. S. G. et al., Livest. Prod. Sci. 1985, 13, 43-52). Cette réserve sur la moindre efficacité de l'immunisation sur les races à développement rapide est infirmée dans un essai plus récent (Laarveld B. et al., Can. J. Anim. Sci., 1986, 66, 77-83).
Chez le porc, les premiers essais d'immunisation active ant i somatostat ine ont été effectués par Spencer G. S. G., 1984 (cité par Spencer G. S. G., Reprod. Nutr. Develop., 1987, 27 (23), 581-589). De leur côté, Dubreuil P. et al. (Endocrinology 1989, 125, 1378-1384) ont soumis des porcs à une immunisation active ant i somatostat ine pour étudier la sécrétion de GH avant et après administration externe de GRF sur les animaux alimentés ou soumis au jeûne. Ils ne décrivent pas dans ce rapport les effets sur la croissance et la composition de la carcasse. Ils mettent en évidence, chez les immunisés, l'élévation de la sécrétion basale de GH et l'augmentât ion de l'amplitude de la réponse de GH aux injections rapprochées de GRF. Cette étude montre que l'immunisation active ant i somatostat ine lève une inhibition constante qui serait due à la somatostatine sur le niveau de la sécrétion basale et augmente l'amplitude des pics de sécrétion spontanée ou provoquée par le GRF endogène ou exogène. Elle conduit également à montrer que l'intervalle séparant deux sécrétions pulsées est dû à un état réfractaire qui serait en partie sous le contrôle de SRIF. L'immunisation active ant i somatostat ine supprimant la part de cet état due à la somatostatine révélerait un autre état réfractaire aux stimulations puisées plus rapprochées qui serait dû à une désensibilisation des cellules secrétrices de la GH à l'action du GRF. Une observation identiique fut effectuée sur le rat soumis à une immunisation passive anti-SRIF (Van Arsenigevic D, et al. Endocrinology, 1987, 121, 1487).
L'application de l'immunisation passive anti-somatostatine fait l'objet du brevet US-A-4 599 229 (International Minerais and Chemical).
Les mécanismes d'action de l'hormone de croissance ou somatotropine sont encore mal défini s et peuvent faire intervenir soit une action directe de la GH sur le métabolisme des protéines des tissus, soit une action dépendant de l'insuline-1 ike growth factor 1 (IGF.1). Cette dernière ferait intervenir des activités endocrines et/ou autocrine-paracrine de l'IGF.1 pour rendre compte de la présence de récepteurs à la GH particulièrement sur le foie et le muscle. L'activité endocrine de l'IGF.1 a fait l'objet de nombreuses démonstrations. L'administration d'IGF.1 à des rats hypophysectomi sés stimule leur croissance (Schoenle E. et al., Nature 1982, 296, 252-253). La GH entraînerait l'augmentation de la sécrétion d'IGF.1 hépatigue gui agirait sur l'anabolisme des protéines du tissu musculaire. Ce mode d'action est la conclusion de l'étude de Grant A.L. et al. (J. Endocrinol., 1991, 130, 331-338) qui observent, après administration de GH à des porcs pendant 1 mois, une augmentation de la concentration plasmatique d'IGF.1 associée à une augmentation d'ARNm d'IGF.1 du tissu hépatique et à une diminution d'ARNm d'IGF.1 du tissu musculaire. Plus indirectement, Chung S. et al. (Endocrinology 1986, 119, 780-786) ont montré chez le porc recevant un apport de GH pendant 35 jours, une corrélation positive entre l'augmentation de la liaison des récepteurs hépatiques à la GH, la concentration sérique d'IGF.1 et l'augmentation de poids. Pell J.M. et al. (British Journal of Nutrition 1990, 63, 431-445) envisagent également une action endocrine d'IGF.1. Ils observent également chez l'agneau recevant un apport de GH une corrélation positive entre l'augmentation de la capacité des sites de liaison de forte affinité de la GH du tissu hépatique, la concentration plasmatique de l'IGF.1 et de l'insuline et les gains en croissance observés, mais n'écartent pas une action périphérique de la GH sur le tissu musculaire. Mac Rae J.C. et al. (J. Endocrinol., 1991, 130, 53-61) décrivent également l'augmentation simultanée d'IGF.1, d'insuline et de glucose pendant l'administration continue de GH : ils observent que les niveaux de base et les augmentations d'IGF.1 sont plus élevés avec une alimentation riche en protéines. Bien que la corrélation entre l'anabolisme des protéines et l'augmentation d'IGF.1 n'est significative gue chez les animaux recevant davantage de protéines et disparaît chez les animaux recevant l'alimentation pauvre en protéines, les auteurs n'éliminent pas l'hypothèse de l'activité endocrine d'IGF.1 et envisagent une désensibilisation ou une "down-regulat ion" de ses récepteurs en cas d'apport protéique insuffisant.
Bien que les observations précédentes montrent dans la plupart des cas le rôle endocrine de l'IGF.1, la propriété d'IGF.1 à reproduire l'activité de la GH a été mise en doute par les études de croissance pondérale et longitudinale montrant gue la GH est environ 20 fois plus active que l'IGF.1 sur une base molaire (cité par Behringer R. et al., Endocrinology, 1990, 127, 1033-1040). La séparation des actions de la GH et de l'IGF.1 est difficile à réaliser et ne peut être envisagée que sur des petits animaux de laboratoire [souris transgéniques (Tg) n'exprimant que l'IGF.1 et dépourvus de GH et souris Tg surexprimant la GH de Behringer R. et al. (Endocrinology 1990, 127, 1033-1040) ou souris dépourvues de GH recevant IGF.1 et/ou GH, de Pell J.M. et Bâtes P.E. (Endocrinology 1992, 130, 1942-1950)]. Le premier modèle a montré que l'expression d'IGF.1 en l'absence de GH stimule les croissances pondérale et longitudinale normalement et que, de plus, GH et IGF.1 apparaissent agir respectivement sur la croissance du foie et du cerveau. Le second modèle de souris dépourvues de GH (Pell J.M.) a permis d'étudier les rôles respectifs de GH et d'IGF.1 sur le métabolisme des protéines des tissus hépatique, musculaire et cardiaque. IGF.1 et GH ont dans ce modèle des effets spécifiques sur le métabolisme protéique des tissus. La GH présente une plus grande activité anaboligue qu'IGF.1 sur le métabolisme protéique des tissus musculaire et cardiaque et agirait seule et directement sur celui du tissu hépatique. Ces résultats, associés à l'observation de la synthèse tissulaire d'IGF, montrent que l'activité anabolique de la GH ne peut être limitée à la seule activité endocrine d'IGF.1.
L'immunomodulation de la GH par immunisation active chez l'agneau en croissance par la séquence 134-154 de la pST par Pell J.M. et Aston R. (J. Endocrinol., 1991, 131, R1-R4) semble confirmer l'observation précédente faite par Pell J.M. sur la souris. L'immunisation contre ce peptide entraîne des effets comparables à ceux d'un apport exogène de GH mais ne s'accompagne d'aucune modification du taux plasmatique d'IGF.1. Les effets de cette immunisation impliquent une action directe de la GH sur le tissu musculaire et cette action semble dépendre de l'interaction de certaines régions de l'hormone avec différents sous-types de récepteurs.
Les travaux décrits précédemment ont montré que les immunisations actives, neutralisante pour la somatostatine, potentialisatrice par la modulation des activités de l'hormone de libération de l'hormone de croissance (GHRH ou GRF) ou de celles de l'hormone de croissance (GH) à l'aide des séquences peptidiques particulières de ces deux hormones, pouvaient avoir un intérêt zootechnique. Ces mêmes travaux ont cependant montré que des incertitudes demeurent quant au niveau d'intervention et à l'efficacité véritable de ces méthodes. On a ainsi vu que l'immunomodulat ion de la GH endogène n'entraîne pas une diminution significative de la quantité de graisse. De son côté, l'immunoneutralisation active de la somatostatine révèle des résultats fort contradictoires gue ce soit notamment chez les bovins et les ovins et plus particulièrement chez les animaux à croissance rapide.
La présente invention a pour objectif de fournir un procédé permettant d'obtenir chez tous les ruminants et porcins en croissance, destinés à la production de viande, une augmentation de la croissance pondérale, une efficacité accrue de la ration alimentaire et une amélioration de la composition de la carcasse, obtenues par l'augmentation de l'anabolisme protéique, particulièrement celui du tissu musculaire, et la diminution de la lipogénèse, par l'augmentation des actions anabolisantes de l'hormone de croissance (GH) endogène.
La demanderesse a trouvé que cet objectif pouvait être atteint à l'aide d'une immunisation active multiple faisant intervenir au moins deux valences distinctes conduisant à une augmentation de la sécrétion basale et puisée de l'hormone de croissance GH et de préférence en outre à une immunomodulation potent ial isatrice de cette hormone, ces deux valences ayant un effet de synergie permettant d'aboutir au résultat recherché même chez les animaux à croissance rapide.
La présente invention a donc pour objet un procédé pour améliorer la croissance et la qualité des carcasses des porcins et ruminants domestiques destinés à la production de viande, par lequel on auqmente sensiblement l'anabolisme protéique, particulièrement celui du tissu musculaire, et l'on diminue la lipogénèse, par l'augmentation des actions anabolisantes de l'hormone de croissance endogène, caractérisé en ce qu'on administre à l'animal une valence conçue pour induire une augmentation de la sécrétion basale et puisée de l'hormone de croissance GH et au moins une autre valence choisie parmi des valences conçues pour induire cet effet ou une immunomodulation potentialisatrice de la GH.
Malgré les données contradictoires de l'état de la technique au sujet de l'immunisation active antisomatostat ine (supra), la demanderesse a en outre trouvé qu'il était préférable d'assurer l'augmentation de la sécrétion basale et puisée de la GH par cette technigue, en la potential isant par son association avec l'immunomodulation potentialisatrice de la GH.
Cette dernière est de préférence obtenue par immunisation active dirigée contre un ou plusieurs fragments de la GH de façon à augmenter l'activité de celle-ci.
Selon l'invention, on peut encore associer l'immunomodulation potentialisatrice de la GH ou l'immunisation ant isomatostat ine à l'immunomodulation potential isatrice du GRF qui conduit aussi à une augmentation de la sécrétion basale et puisée de la GH, par immunisation active contre un ou plusieurs fragments du GRF de façon à augmenter l'activité de cette hormone.
Enfin, dans un mode de réalisation intéressant de l'invention, on peut associer ces trois types d'immunisation active.
L'immunoneutralisation active de la somatostatine est de préférence obtenue à l'aide de la somatostat ine 14 et/ou l'un au moins de ses fragments peptidiques aptes à induire des anticorps neutralisants.
L'immunomodulat ion potentialisatrice active du GRF est de préférence obtenue à l'aide d'au moins l'une des séquences peptidiques décrites dans la demande de brevet internationale WO 90/15073, la séquence 28-44 ou l'une quelconque des séquences partielles de cette région et en particulier les séquences 31-44 et 35-44.
L'immunomodulat ion potent ial isatr ice active de la
GH est de préférence obtenue à l'aide de l'une au moins des séquences peptidiques décrites d'un part pour la pST
(somatotropine ou GH porcine) dans les demandes de brevet EP-A-O 284 406 pour la séquence 35-53, WO 89/00166 pour la séquence 112-159 ou des fragments de la séquence 112-159 notamment les séquences 133-159 et 128-147, EP-A-O 429 788 pour les séquences 98-110, 110-118 et 155-163, EP-A-O 303
488 pour les séquences 112-138, 119-131, 130-143, 123-137,
133-146 et dans la publication de Aston R. et al. (Molecular Immunology, 1991, 28, 41-50) pour les séquences 53-73,
134-154 et 174-191, d'autre part pour la bST ou oST
(somatotropine ou GH bovine ou ovine) dans les demandes de brevet EP-A-O 284 406 pour les séquences 35-53, WO 89/00166 pour la séquence 112-159 ou l'une quelconque des séquences partielles de cette région (notamment 133-159 et 128-147),
EP-A-0 303 488 pour les séquences 122-138, 119-131, 130-143,
123-137, 133-146, et pour la publication d'Aston R. et al.
(Molecular Immunology, 1991, 28, 41-50) pour les séquences
32-46, 80-100, 95-115, 120-140, 130-150, 167-191.
Bien entendu, l'invention couvre aussi l'utilisation de fragments de ces séquences conservant l'activité de la séquence dont ils sont issus et des fragments ou séquences ant igéniquement et immuno logiquement équivalents aux fragments et séquences ainsi définis, ce qui recouvre aussi des séquences les incorporant.
Ces peptides peuvent être obtenus par synthèse chimique ou biochimique ou par expression d'un ADN recombinant dans un hôte approprié. Ils sont dans tous les cas associés à une molécule porteuse responsable de l'immunogénicité, sous forme d'un conjugué dans lequel la séquence est liée par covalence à la molécule porteuse immunogène ou encore sous forme d'une protéine de fusion immunogène obtenue directement par expression d'un ADN recombinant .
Les valences selon l'invention comprennent de préférence un adjuvant de l'immunité et se présentent avantageusement sous forme d'une émulsion.
Il s'agit de préférence de valences, notamment en émulsion eau-dans-l'huile ou huile-dans-l'eau, conçues pour obtenir une immunisation conduisant à l'activation marquée et de longue durée de la GH après une ou deux administrations. Le procédé selon l'invention comprend de préférence une administration précoce des valences chez le jeune animal, notamment dans les premières semaines qui suivent la naissance, de préférence au sevrage chez les porcelets et entre 3 et 4 semaines pour les agneaux et veaux.
Une deuxième administration peut être réalisée ultérieurement, de préférence alors au moins 4 semaines environ après la première, au plus tôt 3 mois environ et au plus tard 1 mois environ avant l'abattage de l'animal, pour obtenir une immunisation conduisant à une activation (activation globale résultant de l'augmentation de la sécrétion de GH et éventuellement de la potentialisation de son activité) marquée et de longue durée de la GH.
L'administration dite précoce inclut aussi selon l'invention l'administration unique des valences sous une forme assurant leur libération retardée, continue ou puisée, apte à maintenir un taux élevé en anticorps.
L'invention a encore pour objet un ensemble de vaccination contenant une valence déterminant une augmentation de la sécrétion basale et puisée de l'hormone GH et au moins une valence choisie parmi des valences déterminant ce même effet ou une immunomodulation potential isatrice de l'hormone de croissance GH, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en vue d'augmenter les actions anabolisantes de l'hormone de croissance GH.
La valence potent ial i sant l'hormone de croissance peut être un vaccin comprenant à titre de principe actif au moins une séquence peptidique de la GH et apte à induire des anticorps dirigés contre la séquence correspondante de la GH endogène pour potent ial iser l'activité de cette dernière.
Les valences déterminantes sur la sécrétion de GH peuvent être un vaccin comprenant à titre de principe actif la somatostatine et/ou l'un au moins de ses fragments aptes à induire des anticorps neutralisants, pour induire des anticorps ant isomatostatine, et/ou un vaccin comprenant au moins une séquence peptidique de GRF pour induire des anticorps contre la séquence correspondante de GRF endogène pour potentialiser son action.
Lesdites séquences peptidiques de GH et de GRF peuvent être choisies parmi celles citées précédemment. Les séquences peptidiques et la somatostatine ou ses fragments sont associées à des molécules porteuses comme vu ci-dessus.
Par utilisation simultanée, on entend l'utilisation d'un mélange, extemporané ou non, des différentes valences. Par utilisation séparée, on entend l'administration séparée des valences non mélangées dans un court intervalle de temps. Enfin, par utilisation étalée dans le temps, on entend l'administration séparée des valences au cours du temps ou l'administration simultanée ou séparée dans le sens ci-dessus des valences mais à plusieurs reprises.
Un ensemble de vaccination préféré comprend un mélange des valences, fait ou à faire extemporanément, de préférence en émulsion eau-dans-l'huile ou hui le-dans-l'eau, gui, après une première administration, induit en général une réponse immunitaire sans effet notable sur l'activité de l'hormone de croissance et qui, après une deuxième administration, induit une immunisation conduisant à une activation marquée et de longue durée de la GH.
L'invention a également pour objet des vaccins muitivalents contenant une valence conçue pour induire une augmentation de la sécrétion basale et puisée de l'hormone de croissance GH et au moins une valence choisie parmi des valences conçues pour induire ce même effet ou une immunomodulation potentialisatrice de l'hormone de croissance GH. Les. valences sont notamment choisies parmi : une valence comprenant à titre de principe actif la somatostatine et/ou l'un au moins de ses fraqments aptes à induire des anticorps neutralisants associés à une molécule porteuse immunogène ; une valence comprenant à titre de principe actif au moins une séquence peptidique de la GH associée à une molécule porteuse immunoqène, apte à induire des anticorps potentialisateurs de l'activité de la GH ; une valence comprenant à titre de principe actif une séquence peptidique du GRF associée à une molécule porteuse immunogène, apte à induire des anticorps potentialisateurs de l'activité du GRF. Les vaccins sont adjuvés pour obtenir une immunisation conduisant à une activation marquée et de longue durée de la GH après une ou plusieurs, notamment deux, administrâtions. Les adjuvants utilisés sont de préférence une émulsion huile-dans-l'eau ou eau-dans-l'huile. Les séquences peptidiques peuvent être notamment choisies parmi celles citées plus haut.
Un vaccin avantageux selon l'invention, nécessitant une seule admini stration, peut être préparé selon toute technique connue sous une forme assurant une libération retardée, continue ou puisée, des valences et maintenant ainsi un niveau élevé d'anticorps.
Les émulsions selon l'invention sont de préférence constituées d'un mélange d'huiles minérales hautement purifiées et de tensioactifs non ionigues.
L'invention va être maintenant décrite plus en détail par l'exposé de méthodes de préparation de vaccins et de modes de réalisation du procédé conformes à l'invention.
NECESSITE D'UNE MOLECULE PORTEUSE IMMUNOGENE
Les différents peptides indiqués pour la mise en oeuvre de l'invention, qu'ils soient obtenus par synthèse chimique ou biochimique ou par expression d'un ADN recombinant dans un hôte approprié, ne peuvent pas par eux-mêmes déclencher une réponse immunitaire et entraîner l'apparition d'anticorps. Pour être immunoqènes, ils doivent être couplés à des molécules porteuses qui sont généralement des protéines (albumine, ovalbumine, anatoxine tétanique, alpha-globuline, thyroglobuline, hémocyanine par ex.) par des liaisons covalentes ou être exprimés dans une hôte approprié à partir d'un ADN recombinant, sous forme de protéine de fusion immunogène, entre par exemple une protéine du périplasme (MalE) ou de la membrane externe (TraTp) d'E. coli ou toute autre protéine ayant des propriétés analogues.
La conjugaison d'un peptide sur une protéine (ou une glycoprotéine) impligue la création d'une liaison covalente entre le peptide et la protéine. Cette liaison se fait sur les groupements réactifs des résidus des acides aminés de la protéine porteuse (acide aspartique, acide glutamique, histidine, tyrosine, cystéine et surtout lysine) ou sur les ol igosacchar ides après oxydation périodique (pour les glycoprotéines). Pour le peptide, la liaison peut se faire aussi sur les résidus des acides aminés, sur les extrémités NH2 et COOH (quand elles sont libres) ; un acide aminé supplémentaire peut être ajouté tel que la tyrosine (qui permet aussi le marquage par l'iode radioactif) et surtout la cystéine qui peut réagir quantitativement avec certains groupements.
De nombreux agents de conjugaison ont été proposés. On peut les classer en 3 grandes classes : les agents homobifonctionnels, les agents hétérobifonctionnels et les agents de condensation.
Les agents homobi fonct ionnel s sont formés essentiellement d'une chaîne hydrocarbonée, aliphatigue et/ou aromatigue, possédant à ses extrémités deux groupements identiques susceptibles de réagir avec un bon rendement avec les résidus d'acides aminés portés par le peptide et la molécule porteuse. De nombreux groupements ont été proposés : bisimidates de méthyle, diesters du N-hydroxysuccinimide, bis isothiocyanates, dialdéhydes, qui tous réagissent sur les fonctions amines, benzidine bisdiazotée, qui copulent sur l es rés i dus tyros i ne , bi smal éimides , qu i s ' addi t ionnent sur les thiols. L'agent homobi fonctionnel le plus largement employé est le glutaraldéhyde. Les agents homobi fonct ionnel s conduisent, en plus de la liaison pept ide-protéine porteuse recherchée, à une dimérisation du peptide et de la protéine porteuse et, si la protéine ou le peptide possède plusieurs groupements réactifs, à une réticulation du conjugué rendant sa reproduct ibilité et sa caractéri sat ion difficiles.
Pour pallier ces inconvénients, des auteurs ont proposé l'emploi des agents hétérobi fonct ionnels. Ceux-ci sont constitués d'une chaîne hydrocarbonée ayant à ses extrémités deux groupements réactifs différents. Le couplage se fait en 3 temps :
(1) : addition de l'agent hétérobi fonct ionnel sur la molécule porteuse (ou le peptide), par un seul des deux groupements réactifs,
(2) : (pour certains agents seulement) : déblocage de l'autre groupement réactif, (3) : addition du peptide (ou de la molécule porteuse) qui réagit avec le groupement libéré précédemment.
Pratiquement, dans la plupart des aqents hétérobi fonct ionnels, l'un des groupements réactifs est un ester du N-hydroxysuccinimide (ou du N-hydroxysul fosuccinimide, plus soluble dans l'eau) qui réagit dans un premier temps en milieu aqueux sur les résidus amine pour donner une liaison amide avec l'agent de couplage. L'autre groupement est généralement soit un groupement susceptible de libérer des thiols [S-acétγl thioglycolate du SATA, hydrolysable par l'hydroxy lamine ou les bases diluées, (pyr idy 1 -2 )di thio du SPDP, réduit par le di thiothréitol], soit au contraire un groupement susceptible de réagir avec les thiols (maléimide du MBS, SMPB, SMCC ou du GMBS), (pyridyl-2)di thio du SPDP, iodoacétyl du SIAB. Dans la catégorie des agents hétérobifonctionnels, on peut ajouter l'iminothiolane.
Dans la plupart des cas, il est possible de doser simplement la guantité de réactif fixé, et de déterminer le niveau de substitution moyen du conjugué.
Enfin, dans les réactifs de condensation, il n'y a pas de ligand entre la molécule porteuse et le peptide. A cette catégorie appartiennent les carbodi imides et l'oxydation périodique des ol igosaccharides des sucres.
Les carbodi imides permettent la formation d'une liaison amide entre les groupements aminé et acide carboxylique portés par les deux molécules, peptide et protéine porteuse. La réaction se fait par activation de la fonction acide carboxylique (O-acyl isourée) sur laquelle réagissent les groupements aminé. Il a été proposé de catalyser la réaction par le N-hydroxysuccinimide, l'espèce réactive est alόrs un ester de N-hydroxysuccinimide, dont la demi-vie est plus longue que celle de l'O-acyl isourée. Quoique la réaction soit très employée pour la préparation des conjugués avec en particulier le N-éthyl-N'-(diméthylamino-3 propyl) carbodiimide (EDCI), avec ou sans N-hydroxysuccinimide, cette méthode souffre des mêmes inconvénients que celles utilisant les agents homobifonctionnels : dimérisation possible du peptide, réticulation de la protéine porteuse, mélange final complexe. De plus il a été montré que le carbodiimide peut s'additionner pour donner un groupement N-acyl urée stable et de plus antigénique. Quant au couplage sur les glycoprotéines par les ol igosaccharides, il est employé surtout pour la préparation des conjugués avec les immunoglobul ines et certaines enzymes, comme la peroxydase. Après avoir bloqué les groupements aminé, la glycoprotéine est oxydée par l'acide périodique, puis purifiée. Ensuite l'autre protéine réagit par ses fonctions aminé sur les groupements aldéhyde et enfin le conjugué formé est réduit par le borohydrure. Récemment, il a été proposé d'effectuer le couplage sur les aldéhydes provenant de l'oxydation périodique des sucres par des hydrazines ou des semicarbazides portés par l'autre molécule. Les vaccins de l'invention destinés aux ruminants et porcins domestiques sont constitués notamment de deux ou trois immunogènes associés à des adjuvants de l'immunité, formant les valences des vaccins. Ces valences peuvent être constituées comme suit : - mélange des conjugués ou des protéines de fusion respectifs à la somatostatine et à une séquence peptidique de GH,
- mélange des conjugués ou des protéines de fusion respectifs à la somatostatine et à une séquence de GRF, - mélange des conjugués ou des protéines de fusion respectifs à une séquence de GRF et à une séquence de GH ,- mélange des conjugués ou des protéines de fusion respectifs à la somatostatine, à une séquence de GRF et à une séquence de GH .
ADJUVANTS
Les substances adjuvantes de l'immunité, ou adjuvants, sont de nature chimique très variée et ont un mode d'action encore mal connu. Les adjuvants les plus largement employés dans les préparations vaccinales destinées aux animaux peuvent être classés dans trois groupes : les gels d'aluminium, les saponines et les émulsions.
a) Gels d'aluminium
I I s'agit des adjuvants à base d'aluminium, hydroxyde ou phosphate.
Les hydroxydes d'aluminium sont soit préparés in situ, par addition d'alun à la solution d'antigène, soit séparément, avant d'être additionnés à l'antigène. Ces gels apparemment amorphes contiennent cependant des microcristaux de boehmite (AlOOH) (Shirodkar S. et al., Pharm. Res., 1990, 7, 1282-1288).
b) Saponines
Les saponines sont des substances extraites de végétaux appartenant à diverses familles (Caryophyllacées, Rosacées, Araliacées ...) ; leur propriété essentielle est d'abaisser la tension superficielle et beaucoup d'entre elles sont hémolytiques. Au niveau chimique, les saponines sont des mélanges très complexes d'hétérosides de triterpènes ou de stérols, chimiquement très proches. L'ecorce de bois de Panama a fourni sous le nom de Quil A une fraction purifiée, mais qui est encore un mélange complexe d'hétéros ides tri terpéniques dont certains sont adjuvants et dont la structure chimique complète n'est connue que pour un très petit nombre d'entre eux.
La saponine Quil A forme avec certaines protéines (généralement amphiphiles) des complexes appelés isσoms ( immunost imulat ing complex) gui sont des adjuvants très puissants.
c) Emulsions
Les emulsions sont des dispersions, macroscopiguement homogènes, d'un liguide dans un autre liguide non miscible. L'un des liguides étant généralement de l'eau, l'autre de l'huile ou une substance miscible à l'huile, on parlera d'émulsion eau-dans-l'huile (E/H) et d'émulsion huile-dans-l'eau (H/E) selon que la phase dispersée est l'eau ou l'huile respectivement. L'émulsion est rendue stable par un troisième composant, qui est le tensioaσtif.
Les huiles utilisées jusqu'à présent sont des huiles minérales (hydrocarbures) obtenues par raffinage du pétrole. Leur composition chimique exacte n'est pas connue avec précision. Ces huiles se caractérisent par divers paramètres (viscosité, densité, indice de réfraction) qu i sont liés à la masse molaire moyenne et au type d'hydrocarbure : isoparaff inique ou cycloparaff in ique (naphténique) ; les hydrocarbures linéaires et les aromatiques ayant été éliminés lors du raffinage. Actuellement des hydrocarbures obtenus par "oligomérisation" d'alcènes, chimiquement beaucoup mieux définis que les huiles minérales, sont disponibles.
Les huiles végétales, qui sont biodégradables, sont envisageables, mais n'ont pas encore conduit à la production industrielle de vaccins en émulsion.
Les tensioactifs sont des substances possédant une partie hydrophile, et une partie lipophile. Ces substances seules ou mélangées entre elles se mettent à l'interface eau-huile et, selon l'importance relative des parties hydrophile et lipophile (balance hydrophi le-1 ipophi le ou HLB des auteurs anglo-saxons), conduisent à des émulsions huile-dans-l'eau ou eau-dans-l'huile, dont les propriétés sont différentes, tant au niveau physigue (viscosité, comportement vis-à-vis des contenants...) que biologigue
(pouvoir adjuvant, tolérance).
Un point important, en particulier pour les emulsions destinées à être injectées, est la nature chimigue des tensioactifs, en particulier des groupements hydrophiles. D'une manière générale, pour des raisons d'innocuité (absence d'irritation en particulier) les groupements hydrophiles seront de préférence non ioniques.
Une propriété intéressante des tensioactifs lipophiles à très faible HLB tels que le Span 85® (trioléate de sorbitan) ou le Pluronic L121® (copolymère d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène) est qu'ils sont eux-mêmes adjuvants (Woodward L.F., Lab. Anim. Sci. 1989, 39, 222-225). Cela est à relier au pouvoir adjuvant des huiles végétales (plus faible cependant que celui des hydrocarbures) qui peuvent être considérées comme des tensioactifs de très faible HLB.
Il faut ajouter que les emulsions peuvent contenir des corps bactériens utilisés soit comme immunogènes, soit comme adjuvant. L'emploi de mycobactér ies tuées, dans l'adjuvant de Freund complet en particulier, est possible au laboratoire, mais est impossible pour les animaux de rente. La recherche de la substance adjuvante présente dans les mycobactér ies et de la plus petite structure chimique qui possède cette propriété a conduit à l'isolement, et à la caractérisation du muramy ldipept ide (MDP), puis à sa synthèse.
PREPARATION DE CONJUGUES-SOMATOSTATINE
Le conjugué avec la somatostat ine peut être σonstitué à partir de l'hormone de forme naturelle, la somatostat ine 14 (ou somatostat i ne 15-28), ou de fragments de celle-ci aptes à induire des anticorps neutralisants. Il est obtenu par l'une ou l'autre des méthodes de conjugaison décrites ci-dessus.
La somatostat ine est un tétradécapept ide . Sa formule est la suivante :
Figure imgf000029_0001
A titre d'exemple, les conjugués peuven t être réalisés par un couplage entre un polymère (Lys-Ala) et la somatostat ine par le carbodiimide en présence de N-hydroxysulfosuccinimide, par un couplage entre l'anatoxine tétanique et la somatostat ine par le glutaraldéhyde, par un couplage entre la thyroglobul i ne et la somatostat ine par le carbodiimide ou encore par le couplage entre l' alpha-globul ine et la somatostat ine par le glutaraldéhyde.
EXEMPLES DE PREPARATION DE VACCINS ANTISOMATOSTATINE :
1) Le conjugué est obtenu en additionnant, à 50 mg de somatostat ine et 200 mg d'alpha-globul ine humaine dissous dans 40 ml d'acétate d'ammonium 0,1 M, 26 ml de solution de glutaraldéhyde 20 mM (0,2 %) sur une durée de 1 heure. Le mélange est laissé une nuit à température ambiante, puis est dialyse plusieurs fois à 4°C contre du tampon NaCl 0,15 M -phosphate 0,01 M, pH 7,5.
Le conjugué, qui forme une suspension ocre, est concentré par ultrafiltration sur membrane ultrafiltrante Amicon de seuil de coupure 10 kDa, jusqu'à l'obtention d'un volume final de 25 ml.
L'antigène est mis en émulsion à l'aide d'une formulation employée industriellement, dans laquelle entrent de l'huile minérale hautement purifiée et des tensioactifs non ioniques, l'un lipophile, l'autre hydrophile ; le produit final est une émulsion huile-dans-l'eau.
2 ) Le conjugué est obtenu en additionnant, à 12 mg de thyroglobul ine et 4 mg de somatostatine dissous dans 2 ml d'eau, 2,3 mg de N-éthyl-N'-(diéthylamino-3 propyl) carbodiimide et 0,83 mg de N-hydroxysul fosuccinimide dissous dans l'eau. Le pH est ajusté autour de 6-7. Le mélange est laissé une nuit à température ambiante. La solution est ensuite centrifugée, dessalée par σhromatographi e sur Séphadex G-50 en tampon NH4HCO3 0,05 M, puis est lyophi 1 isée.
Les antigènes sont repris dans 2,5 ml de tampon NaCl 150 mM - phosphate 10 mM pH 7,5, puis sont émulsionnés dans une phase huileuse utilisée industriellement pour obtenir une émulsion eau-dans-l'huile. Cette phase huileuse contient de l'huile minérale hautement purifiée et des tensioactifs non ionigues, lipophiles et hydrophiles.
SEQUENCES PEPTIDIQUES DE GH ET DE GRF
Les séquences peptidiques des hormones GRF et GH indiquées dans les demandes de brevet ou dans les articles précités, peuvent être utilisées à raison d'une par type d'hormone pour la préparation de conjugués ou protéines de fusion.
Les séquences peptidigues de GH pouvant être utilisées sont notamment les suivantes :
- de l'hormone GH bovine ou ovine 35-53
NH2-Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile-Gln-Asn-Thr-Gln-Val-AlG-Phe-Cys-COOH
- de l'hormone GH porcine 35-53
Ala-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile-Gln-Asn-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe-Cys - de l'hormone GH porcine
98-110 Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-Thr-Ser-Asp-Arg-Val-Tyr
110-118 Tyr-G 1 u-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-G lu-Glu
155-163 Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gl γ-Leu-Leu-Ser - les séquences 122-138, 119-131, 130-143, 123-137 et 133-146 (des hormones bovine, ovine, porcine). bovine 122-138 :
Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-Asp-Gly-Thr-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu Ovine 122-138 :
même séquence que la GH bovine, excepté en 130 où Gly est remplacé par Val
Porcine 122-138 :
même séquence que la GH bovine, excepté en 131 où Thr est remplacé par Ser
Bovine 130-143 :
Gly-Thr-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-Thr-Tyr-Asp
Ovine 130-143 :
le 130 Gly est remplacé par Val Porcine 130-143 :
Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-Thr-Tyr-Asp Bovine, ovine ou porcine 133-146 :
Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-Thr-Tyr-Asp-Lys-Phe-Asp
Fragments de la séquence 112-159 ;
en part i cu l i er l es o l i gopep t i des des régions 133-159 et 128-147 comprenant de 6 à 7 peptides au minimum et 20 au maximum.
Certains ont fait l'objet de descriptions par Aston et al. cité ci-dessus.
- de l'hormone porcine
53-73
Cys-Phe-Ser-Glu-Thr-Ile-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Glu-Ala-Gln-Gln-Arg-Ser-Asp-Val
134-154
Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-Thr-Tyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Leu-Arg-Ser-Asp-Asp-Ala
174-191
Thr-Tyr-Leu-Arg-Val-Met-Lys-Cys-Arg-Arg-Phe-Val-Glu-Ser-Ser-
Cys-Ala-Phe
- de l'hormone bovine ou ovine
32-46
Phe-Glu-Arg-Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile-Gln
80- 100
Leu-Leu-Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Leu-Gln-Phe-Leu-Ser- Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser 95-115
Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-Thr-Ser-Asp-Arg-Val¬
Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp
120-140
Ile-Gln-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-Asp-Gly-Ser-Pro-Arg-AlaGly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln
130-150
Gly-Thr-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-Thr-Tyr-Asp-Lys¬
Phe-Asp-Thr-Asn-Met-Arg 167-191
Lys-Asp-Leu-His-Lys-Thr-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg-Val-Met-Lys-CysArg-Arg-Phe-Gly-Glu-Ala-Ser-Cys-Ala-Phe
Préparation d'un conjugué avec une séguence de GH : exemple de conjugaison avec la fraction GH (134-154).
Dans un flacon opaque sont dissous successivement
42 mg de peptide GH (134-154) et 60 mg d'hémocyanine pure de Megathura crenulata (KHL). Puis 0,8 ml de solution de glutaraldéhyde 68,5 mM est ajouté très lentement, sur une durée totale de 5 heures, à raison de 40 μl toutes les 15 minutes. La solution est ensuite dialysee à 4ºC contre un tampon isotonigue (NaCl 0,15 M - phosphate 0,01 - pH 7,5) puis est conservée à - 20°C jusgu'à son utilisation.
Les séquences peptidiques de GRF pouvant être utilisées sont notamment les suivantes :
Les séquences 28-44 porcine, bovine (ou ovine ou caprine) et plus particulièrement les séquences 31-44 ou 35-44
28-44 porcin
Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Val- Arg-Leu 28-44 bovin, ovin, caprin
Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu
et les séquences 31-44 et 35-44 des GRF des différentes espèces ou peptides équivalents du point de vue antigénique et immuno logique.
Préparation d'un conjugué avec une séquence de GRF : exemple de conjugaison avec la fraction GRF (28-44).
Dans un flacon opaque contenant 11,5 ml de NaHCO3 0,1 M sont dissous successivement 50 mg de peptide GRF (28-44) et 36 mg d'hémocyanine de Megathura crenulata (KLH) lyophilisée. Puis 475 μl de glutaraldéhyde 68,5 mM sont additionnés sur une durée totale de 5 heures (soit 50 μl toutes les 30 minutes). Puis la solution est immédiatement dialysee à + 4ºC contre un tampon isotonique (NaCl 0,15 M -phosphate 0,01 M - pH 7,5).
Préparation de vaccins plurivalentε
En tenant compte de l'animal dest inataire, on prépare un vaccin comprenant, dans une émulsion eau-dans-l'huile ou huile-dans-l'eau, un conjugué immunogène de l'une des susdites séquences GRF et/ou de GH et un conjugué immunogène de la somatostatine 14. La première administration du vaccin induit une réponse immunitaire sans effet notable sur l'activité de l'hormone de croissanσe. La deuxième administration du vaccin est nécessaire pour que l'immunisation et ses effets sur l' immunomodulat ion potent ial isatrice de la GH deviennent marqués et prolongés. Les emulsions sont stables et faites d'un mélange d'huiles minérales hautement purifiées et de tensioactifs non ionigues.
Le calendrier de vaccination est le suivant :
- porc : premier vaccin au sevrage des porcelets ;
- bovins, ovins : premier vaccin administré aux veaux et agneaux entre 3 et 4 semaines ;
- pour tous, deuxième vaccin au moins 4 semaines après le premier, au plus tôt 3 mois et au plus tard 1 mois avant l'abattage.
Le mode d'administration de ces formulations est de préférence transcutané, notamment à l'aide d'un appareil d'injection sans aiguille par jet sous pression, notamment selon la demande de brevet FR-A-2 652 257.
L'efficacité de l'immunisation active est mesurée par les réponses immunitaires et les effets sur la croissance pondérale et la composition en eau, en protéines et en graisses du tissu musculaire. Les titres en anticorps sont déterminés par radio- immuno-essai jusqu'au moment de l'abattage et concernent les anticorps ant isomatostat ine et anti-séquences peptidiques des hormones GRF et GH.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour améliorer la croissance et la qualité des carcasses des porcins et ruminants domestigues destinés à la production de viande, par lequel on augmente sensiblement l'anabolisme protéique, particulièrement celui du tissu musculaire, et l'on diminue la lipogénèse, par l'augmentation des actions anabolisantés de l'hormone de croissance endogène, caractérisé en ce qu'on administre à l'animal une valence conçue pour induire une augmentation de la sécrétion basale et puisée de l'hormone de croissance GH et au moins une autre valence choisie parmi des valences conçues pour induire cet effet ou une immunomodulation potential isatrice de la GH.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'augmentation de la sécrétion basale et puisée de la GH est obtenue par immunisation active antisomatostatine et/ou par immunomodulation potent ial isatrice de l'hormone de libération de l'hormone de croissance (GRF).
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'immunomodulat ion potential isatrice de la GH et/ou de GRF est obtenue par immunisation active dirigée contre un ou plusieurs fragments peptidiques de l'hormone correspondante de façon à augmenter l'activité de celle-ci.
4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce gue la valence conçue pour induire une augmentation basale et puisée de la GH comprend la somatostatine 14 et/ou l'un au moins de ses fragments peptidiques, associés à une molécule porteuse immunogène.
5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la valence conçue pour induire une immunomodulation potentialisatrice de la GH comprend l'une au moins des séquence de GH qui suivent :
séquences de la GH porcine 35-53, 112-159, 133-159, 128-147, 98-110, 110-118, 155-163, 122-138, 119-131, 130-143, 123-137, 133-146, 53-73, 134-154, 174-191 ;
séquences de la GH bovine ou ovine 35-53, 112-159, 133-159, 128-147, 122-138, 119-131, 130-143, 123-137, 133-146, 32-46, 80-100, 95-115, 120-140, 130-150, 167-191 ; - fragments de ces séquences conservant l'activité de la séquence dont ils sont issus et fragments ou séquences ant igéniguement et immuno logiquement équivalents, les fragments ou séquences étant associés à une molécule porteuse immunogène.
6. Procédé selon la revendication 3 ou 5, caractérisé en ce que l'immunisation active dirigée contre GRF est obtenue par une valence comprenant l'une au moins des séquences 28-44, 31-44, 35-44 ou fragments de ces séquences conservant l'activité de la séquence dont ils sont issus et fragments ou séquences ant igéniquement et immunologiquement équivalents, les fragments ou séquences étant associés à une molécule porteuse immunogène.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendicat ions 1 à 6, caractérisé en ce que les valences comprennent un adjuvant de l'immunité.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les valences sont conçues pour obtenir une immunisation conduisant à l'activation marquée et de lonque durée de la GH après une ou deux administrations.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que les valences soni: en émulsion eau-dans-l'huile ou hui le-dans-l'eau.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendicat ions 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend une administration précoce des valences chez le jeune animal, notamment dans les premières semaines qui suivent la naissance.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que cette administration précoce a lieu au sevrage chez le porcelet et entre 3 et 4 semaines chez les agneaux et veaux.
12. Procédé selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce que les valences sont sous une forme leur assurant une libération retardée, continue ou puisée.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisé en ce que l'on effectue une deuxième admini strat ion 4 semaines environ après l'administration précoce, au plus tôt 3 mois environ et au plus tard 1 mois environ avant l'abattage de l'animal.
14. Ensemble de vaccination contenant une valence déterminant une augmentation de la sécrétion basale et puisée de l'hormone de croissance GH et au moins une autre valence déterminant ce même effet ou une immunodulat ion potent ial isatrice de l'hormone de croissance GH, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en vue d'augmenter les actions anabolisantes de l'hormone de croissance GH.
15. Ensemble de vaccination selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comporte une valence constituée par un vaccin comprenant à titre de principe actif au moins une séquence peptidique de la GH et apte à induire des anticorps dirigés contre la séquence correspondante de la GH endogène pour potentialiser l'activité de cette dernière.
16. Ensemble de vaccination selon la revendication 14 ou 15, caractérisé en ce qu'il comporte une valence constituée par un vaccin comprenant à titre de principe actif la somatostatine pour induire des anticorps ant isomatostat ine .
17. Ensemble de vaccination selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisé en ce qu'il comporte une valence constituée par un vaccin comprenant à titre de principe actif au moins une séquence peptidique de la GRF pour induire des anticorps contre la séquence correspondante de la GRF endogène pour potentialiser son action.
18. Ensemble de vaccination selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend un mélange, fait ou à faire extemporanément, des valences selon les revendications 14 à 16 destiné à induire une immunisation conduisant à l'activation marguée et de longue durée de la GH après une ou deux administrations.
19. Vaccin multivalent contenant une valence conçue pour induire une augmentation basale et puisée de l'hormone de croissance GH et au moins une autre valence choisie parmi des valences conçues pour induire cet effet ou une immunomodulation potentialisatrice de l'hormone de croissance GH.
20. Vaccin selon la revendication 19, caractérisé en ce que les valences sont choisies parmi les valences comprenant à titre de principe actif la somatostatine et/ou l'un au moins de ses fraqments peptidiques, associés à une molécule porteuse immunogène, au moins une séquence peptidique de la GH associée à une molécule porteuse immunogène, apte à induire des anticorps potential isateurs de l'activité de la GH, et au moins une séquence peptidique du GRF associée à une molécule porteuse immunogène, apte à induire des anticorps potentialisateurs de l'activité du GRF ; le vaccin étant adjuvé pour induire une immunisation conduisant à l'activation marquée et de longue durée de la GH après une ou plusieurs administrations.
21. Vaccin selon la revendication 19 ou 20, caractérisé en ce gu'il se présente sous une forme assurant une libération retardée, continue ou puisée, des valences.
22. Ensemble de vaccination ou vaccin selon la revendication 15 ou 20, caractérisé en ce que la ou les séquences peptidiques de la GH sont choisies parmi les séquences ou fragments définis à la revendication 5.
23. Ensemble de vaccination selon la revendication 17, caractérisé en ce gue la ou les séquences peptidiques de GRF sont choisies parmi les séquences ou fragments définis à la revendication 6.
24. Vaccin selon la revendication 20, caractérisé en ce gue la ou les séquences peptidiques de GRF sont choisies parmi les séquences ou fragments définis à la revendication 6.
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