FR2836145A1 - Precurseurs de phosphoramidites, phosphoramidites obtenus et leur utilisation dans la preparation d'oligonucleotides renfermant des lesions photochimiques - Google Patents
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Abstract
Dérivé répondant à la formule (1)dans laquelle A et B représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un substituant choisi dans le groupe constitué par la cytosine, l'uracile et la thymine, R1 représente un groupe méthyle, 2-cyanoéthyle, 2-silyléthyle ou allyle, et Lev représente un groupe lévulinyle.
Description
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La présente invention a pour objet des précurseurs de phosphoramidites, leur procédé de préparation, les phosphoramidites obtenus et leur utilisation dans la synthèse d'oligonucléotides renfermant spécifiquement des lésions photochimiques en position définie.
L'exposition de l'ADN cellulaire aux ultraviolets provoque des lésions qui se forment au niveau de deux pyrimidine adjacentes et qui se traduisent à l'échelle moléculaire par l'obtention de dimères cyclobutaniques et d'adduits de type pyrimidine (6-4 pyrimidinone) qui peuvent s'isomériser en adduits de type Dewar.
En absence de réparation et lors de la réplication de l'ADN endommagé, ces lésions peuvent entraîner des erreurs de lecture des polymérases et donc être mutagènes.
Elles peuvent également induire une réponse immunosuppressive qui joue un rôle important dans le développement du processus de carcinogénèse. Ces lésions sont responsables chez l'homme de la plupart des cancers de la peau. Ceci représente dans le monde actuel un problème majeur de santé publique.
Exacerbée par la diminution de la couche d'ozone, on peut s'attendre à ce que l'augmentation du rayonnement UVB capable de traverser l'atmosphère entraîne également sur d'autres organismes vivants des répercussions incontrôlables qui pourraient modifier dramatiquement l'équilibre de nombreux écosystèmes.
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C'est pourquoi les inventeurs se sont intéressés à des composés synthétiques contenant spécifiquement ce type de lésions en position définie et qui permettent d'étudier ces dommages.
Actuellement, il existe trois voies de synthèse de phosphoramidites qui permettent d'obtenir, sur un support solide, des oligo-nucléotides renfermant spécifiquement et en position définie l'adduit cyclobutanique cis-syn de thymine (Taylor J. S, Brockie I. R., O'Day C. L.,"A building block for the sequence-specific introduction of cis-syn thymine divers into oligonucleotides", Solidphase synthesis of TpT [c, s] pTpT. J. Am. Chem. Soc.
(1987), 109,6735-6742 ; Murata T., Iwai S, Ohtsuka E, "Synthesis and characterization of a substrate for T4 endonuclease V containing a phosphorodithioate linkage at the thymine dimer site", Nucleic Acids Res. (1990), 18, 7279-7286 ; Kosmoski J. V., Smerdon M. J.,"Synthesis and nucleosome structure of DNA containing a UV photoproduct at a specific site", Biochemistry (1999), 38,9485-9494 ; Tommasi S., Swiderski P. M., Tu Y, Kaplan B. E., Pfeifer G. P.,"Inhibition of transcription factor binding by ultraviolet-induced pyrimidine divers", Biochemistry (1996), 35,15693-15703).
Les synthèses conduisant à ces phopshoramidites suivent toutes la stratégie développée initialement par Taylor J. S et repose sur l'emploi, avant l'étape photochimique, d'un dinucléotide dont les fonctions phosphodiester et hydroxyle en 3'sont protégées.
Les différences entre ces synthèses portent sur le choix des groupements protecteurs, le groupement
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protecteur de la fonction phosphate pouvant être un méthyle ou un cyanoéthyle, la fonction hydroxyle en 3' étant protégée soit sous forme d'éther de silyle, soit sous forme d'ester d'acide lévulinique.
Le schéma 1 de ces synthèses est le suivant :
Schéma 1
La photolyse de 8 conduit au dimère de thymine CisSyn 9 avec un rendement de 41% pour 9a et de 42% pour 9b. La fonction hydroxyle en 5'du composé 9 est protégée par le groupement diméthoxytrityle (étape i ; rendement : 60% et 76%), puis la fonction hydroxyle en 3'est déprotégée (étape ii ; rendement : 73% et 78%) puis fonctionnalisée en phosphoramidite (étape iii ; rendement : 53% et 54%).
La photolyse de 8 conduit au dimère de thymine CisSyn 9 avec un rendement de 41% pour 9a et de 42% pour 9b. La fonction hydroxyle en 5'du composé 9 est protégée par le groupement diméthoxytrityle (étape i ; rendement : 60% et 76%), puis la fonction hydroxyle en 3'est déprotégée (étape ii ; rendement : 73% et 78%) puis fonctionnalisée en phosphoramidite (étape iii ; rendement : 53% et 54%).
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L'ordre des étapes de protection en 5'et déprotection en 3'peut être inversé (étape iv et i).
Le composé 8 est obtenu selon les voies illustrées par le schéma 2. Par la voie des phosphoramidites (8a-b) dans le sens 3'- > 5', on condense un dérivé diméthoxytritylé en 5'et phosphoramidite en 3'de la thymidine (10a-b) et un dérivé protégé en 3'de la thymidine (lla décrit par Taylor J. S ; llb décrit par Murata T. ) ; par la voie des chlorophosphites (8a) dans le sens 5'- > 3', on condense le dérivé tritylé en 5'de la thymidine (10c) avec le dérivé chlorophosphite en 5'de la thymidine protégée en 3' (llc décrit par Kosmoski J. V. ). Le phosphite triester est ensuite oxydé en phosphate triester et la fonction hydroxyle en 5' détritylée pour conduire à 8a.
Schéma 2
L'inconvénient majeur de cette voie générale de synthèse, lié au fait que le groupement diméthoxytrityle
L'inconvénient majeur de cette voie générale de synthèse, lié au fait que le groupement diméthoxytrityle
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n'est pas compatible avec l'étape d'irradiation photochimique, est de déprotéger la fonction hydroxyle en 5'du précurseur de 8 (Schéma 2, étape iii et il) puis de reprotéger cette fonction au niveau de 9 pour obtenir le phosphoramidite 7 (Schéma 1, étape i). Ces différentes étapes entraînent une perte de rendement d'au moins 44%. De plus, l'adduit photochimique 9 doit être déprotégé en 3'pour obtenir le phosphoramidite 7, ce qui représente une perte supplémentaire d'au moins 22% du photoproduit.
La demande de brevet EP 0 787 740 décrit un procédé de préparation d'un photoproduit (6-4) à partir d'un dimère de thymidine de formule (II)
dans laquelle Rs représente un groupe méthyle ou cyanoéthyle et R7 représente un groupe lévulinyle, ou tert-butyldiméthylsilyle.
dans laquelle Rs représente un groupe méthyle ou cyanoéthyle et R7 représente un groupe lévulinyle, ou tert-butyldiméthylsilyle.
Ce procédé de préparation comprend :
une étape d'irradiation du composé de formule II, une étape de protection du groupe 5'OH, - une étape de déprotection du groupe 3'OH, puis - la réaction du produit obtenu avec, par exemple, un dérivé phosphochloré, pour obtenir le phosphoramidite attendu de formule (I)
une étape d'irradiation du composé de formule II, une étape de protection du groupe 5'OH, - une étape de déprotection du groupe 3'OH, puis - la réaction du produit obtenu avec, par exemple, un dérivé phosphochloré, pour obtenir le phosphoramidite attendu de formule (I)
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Bien que ce procédé pallie les inconvénients des procédés connus de l'état antérieur de la technique, il comprend encore quatre étapes, dont plusieurs étapes de protection et de déprotection successives qui nuisent au bon rendement du procédé.
Or, les inventeurs ont découvert que, si l'on protégeait l'hydroxyle en position 5'par un groupe lévulinyle, il n'était pas nécessaire de supprimer ce groupe avant l'étape d'irradiation photochimique. Ce groupe s'est avéré à la fois stable aux conditions d'irradiation et compatible avec les conditions de synthèse sur support solide.
La présente invention a en conséquence pour objet des dérivés répondant à la formule (1)
dans laquelle
dans laquelle
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A et B représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un substituant choisi dans le groupe constitué par la cytosine, l'uracile et la thymine,
Ri représente un groupe méthyle, 2-cyanoéthyle,
2-silyléthyle ou allyle, et
Lev représente un groupe lévulinyle.
Ri représente un groupe méthyle, 2-cyanoéthyle,
2-silyléthyle ou allyle, et
Lev représente un groupe lévulinyle.
Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, A et B représentent chacun une thymine et le dérivé
correspond au O-cyanoéthyle phosphate de la 5'-0lévulinylthymidilyl (3'-5') thymidine.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation des composés de formule (2)
dans laquelle - C représente un substituant choisi parmi
et
correspond au O-cyanoéthyle phosphate de la 5'-0lévulinylthymidilyl (3'-5') thymidine.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation des composés de formule (2)
dans laquelle - C représente un substituant choisi parmi
et
<Desc/Clms Page number 8>
dans lesquelles Xi, Xs Rs et R6 sont définis comme illustrés au tableau suivant :
<tb>
<tb> X1 <SEP> X2 <SEP> R5 <SEP> R6
<tb> O <SEP> O <SEP> H <SEP> H
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> CH3 <SEP> H
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> H <SEP> CH3
<tb> O <SEP> NH <SEP> H <SEP> H
<tb> NH <SEP> 0 <SEP> H <SEP> H
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> CH3 <SEP> CH3
<tb> 0 <SEP> NH <SEP> CH3 <SEP> H
<tb> NH <SEP> 0 <SEP> H <SEP> CH3
<tb> NH <SEP> NH <SEP> H <SEP> H
<tb>
<tb> X1 <SEP> X2 <SEP> R5 <SEP> R6
<tb> O <SEP> O <SEP> H <SEP> H
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> CH3 <SEP> H
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> H <SEP> CH3
<tb> O <SEP> NH <SEP> H <SEP> H
<tb> NH <SEP> 0 <SEP> H <SEP> H
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> CH3 <SEP> CH3
<tb> 0 <SEP> NH <SEP> CH3 <SEP> H
<tb> NH <SEP> 0 <SEP> H <SEP> CH3
<tb> NH <SEP> NH <SEP> H <SEP> H
<tb>
Ri représente un groupe méthyle, 2-cyanoéthyle,
2-silyléthyle ou allyle, et
Lev représente un groupe lévulinyle, par irradiation d'un composé de formule (1).
2-silyléthyle ou allyle, et
Lev représente un groupe lévulinyle, par irradiation d'un composé de formule (1).
Les composés de formule (2a), dans laquelle - C représente un substituant (a) tel que défini précédemment,
Ri représente un groupe méthyle, 2-cyanoéthyle,
2-silyléthyle ou allyle, et
Lev représente un groupe lévulinyle ; et les composés de formule (2b) dans laquelle - C représente un substituant (b) tel que défini précédemment,
Ri représente un groupe méthyle, 2-cyanoéthyle,
2-silyléthyle ou allyle, et
Lev représente un groupe lévulinyle, font également partie de l'invention.
Ri représente un groupe méthyle, 2-cyanoéthyle,
2-silyléthyle ou allyle, et
Lev représente un groupe lévulinyle ; et les composés de formule (2b) dans laquelle - C représente un substituant (b) tel que défini précédemment,
Ri représente un groupe méthyle, 2-cyanoéthyle,
2-silyléthyle ou allyle, et
Lev représente un groupe lévulinyle, font également partie de l'invention.
Les composés de formule (2b) peuvent se présenter sous forme cis-syn, trans-syn 1 ou trans-syn 2.
Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, C représente un substituant (bl)
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La présente invention a également pour objet des composés de formule (3)
dans laquelle - C représente un substituant choisi parmi (a) et (b) tels que définis précédemment, Ri représente un groupe méthyle, 2-cyanoéthyle,
2-silyléthyle ou allyle, et - R2 représente un groupe (X3) ou (X4)'
où R3 représente un groupe méthyle, 2-cyanoéthyle, 2-silyléthyle ou allyle, et R4 représente un substituant
choisi parmi les groupes-NR'R, morpholino, N-pyrrolidinyle et 2, 2, 6, 6, -tétraméthyl-N-pipéridyle, R' et R" étant chacun un groupe (CI-C4) alkyle, et
Lev représente un groupe lévulinyle, notamment le composé de formule
dans laquelle - C représente un substituant choisi parmi (a) et (b) tels que définis précédemment, Ri représente un groupe méthyle, 2-cyanoéthyle,
2-silyléthyle ou allyle, et - R2 représente un groupe (X3) ou (X4)'
où R3 représente un groupe méthyle, 2-cyanoéthyle, 2-silyléthyle ou allyle, et R4 représente un substituant
choisi parmi les groupes-NR'R, morpholino, N-pyrrolidinyle et 2, 2, 6, 6, -tétraméthyl-N-pipéridyle, R' et R" étant chacun un groupe (CI-C4) alkyle, et
Lev représente un groupe lévulinyle, notamment le composé de formule
<Desc/Clms Page number 10>
Les composés de formule (3) peuvent être préparés par un procédé comprenant les étapes suivantes : - irradiation du composé de formule (1) pour obtenir un composé de formule (2), - réaction du composé de formule (2) avec un composé de formule (4)
dans laquelle - R3 représente un groupe méthyle, 2-cyanoéthyle,
2-silyléthyle ou allyle, et - R4 représente un groupe choisi parmi les groupes
- NR'R", morpholino, N-pyrrolidinyle et 2, 2, 6, 6,-tétraméthyl-N-pipéridyle, R'et R"étant chacun un groupe (CI-C4) alkyle pour obtenir le composé de formule (3).
dans laquelle - R3 représente un groupe méthyle, 2-cyanoéthyle,
2-silyléthyle ou allyle, et - R4 représente un groupe choisi parmi les groupes
- NR'R", morpholino, N-pyrrolidinyle et 2, 2, 6, 6,-tétraméthyl-N-pipéridyle, R'et R"étant chacun un groupe (CI-C4) alkyle pour obtenir le composé de formule (3).
Pour obtenir un composé de formule (2a), on peut réaliser l'irradiation du composé de formule (1) par un
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rayonnement UV à 254 nm dans une solution aqueuse d'acétonitrile, à une température comprise entre 0 et 20 C.
Pour la préparation des composés de formule (2b), on peut réaliser l'irradiation dans des conditions classiques connues de l'homme du métier, notamment à une longueur d'onde supérieure à 290 nm dans une solution aqueuse d'acétonitrile en présence d'acétone.
La préparation des composés de formule (3) à partir des composés de formule (2) et de formule (4) est réalisée par des méthodes connues de l'homme du métier.
Les composés de formule (3) peuvent être utilisés pour la préparation d'ADN contenant des lésions photochimiques de formule (a) et (b) en utilisant un synthétiseur d'ADN selon des méthodes classiques connues de l'homme du métier.
Les exemples qui suivent illustrent l'invention.
Exemple 1 : Synthèse du O-cyanoéthyle phosphate 5'-0- lévulinyl-P- (2-cyanoéthyl)-T (cis-syn) T-3'- (2-cyanoéthyl) - N, N-diisopropylphosphoramidite : 1.1. Synthèse du O-cyanoéthyle phosphate de la 5'-0- lévulinylthymidilyl (3'-5') thymidine.
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A une solution de 3'-0- (4, 4'diméthoxytrityl) thymidine préparée selon la méthode décrite par Wagner T. et coll., Nucleosides and Nucleotides (1997), 16,1657-1660 (168 mg ; 0,31 mmole) dans l'acétonitrile anhydre (20 ml) sont additionnées par canulation, une solution de tétrazole (71 mg ; 1,023 mmole ; 3,3 eq) dans l'acétonitrile anhydre (10 ml) puis une solution de 5'-0-lévulinylthymidine-3'- (2- cyanoéthyl)-N, N-diisopropylphosphoramidite (ChemGenes Corp., Ashland, MA, USA) (250 mg ; 0,46 mmole ; 1,5 eq) dans l'acétonitrile anhydre (20 ml). Le mélange réactionnel, placé sous atmosphère d'argon, est agité à température ambiante pendant 30 minutes. Une solution d'iode 0,36 M (2,5 ml) dans le mélange tétrahydrofurane/eau/lutidine (50/25/25) est ensuite ajoutée. Après 20 minutes d'agitation, la solution est concentrée sous vide à température ambiante et reprise par du dichlorométhane puis une solution saturée de sodium thiosulfate est ajoutée goutte à goutte jusqu'à décoloration de la phase organique. Après addition d'eau jusqu'à égalisation des deux phases, la phase organique
<Desc/Clms Page number 13>
est lavée puis séchée sur sulfate de sodium anhydre et concentrée à sec. Le résidu obtenu est repris par 2,5 ml d'une solution à 3% d'acide trifluoroacétique dans le dichlorométhane anhydre et la solution est agitée pendant 10 minutes. Après trois coévaporations successives avec du méthanol, le résidu est purifié par chromatographie sur gel de silice. L'élution est effectuée par un gradient croissant de méthanol (0-10 %) dans le dichlorométhane. Le composé attendu est obtenu sous forme d'une mousse blanche avec un rendement global de 87 % (194 mg ; 0,27 mmole).
RMN IH (0, ppm ; J, Hz) (CD30D, 300 MHz) 7, 53 et 7, 51 (1H, sl, H6 Tpa) ; 7, 47 (1H, s, H6 pTa) ; 6, 26 (1H, t, J=6, 8, Hl'pT) ; 6, 23 (1H, t, J=7, 0, Hl'Tp) ; 5, 12 (1H, m, H3'Tp) ; 4, 49-4, 25 (8H, m, H3'pT, H4'Tpb, H5'H5"pT, H5'H5"Tp, OCH2 CH2CN) ; 4, 08 (1H, s, H4'pTb) ; 2, 93 (2H, m, OCH2CH2CN) ; 2, 82 (2H, m, OCOCHsCHsCOMe) ; 2, 70-2, 80 (3H, m, OCOCH2CH2COMe, H2'pTc) ; 2, 47 (1H, m, H2" Top') ; 2, 29 (2H, m, H2'H2"pT) ; 2,16 (3H, s, OCOCH2CH2COMe) ; 1,89 (3H, s, Me pTd) ; 1.88 (3H, s, Me Tpd). RMN 13C (#, ppm) (CD30D, 75 MHz)
209, 6 (OCOCH2CH2COMe) ; 174, 3 (OCOCHCOMe) ; 166, 4 (C4 Tp, C4 pT) ; 152, 4 (C2 Tpa) ; 152, 3 (C2 pTa) 138, 0 (C6 Tpb) ; 137, 6 (C6 pTb) ; 118, 0 (CN) ; 112, 2 (C5 Tp, C5 pT) ; 86, 7 (C1'Tp, C1'pT) ; 86, 1 (C4'pTc) ; 84, 2 (C4'Tpc) ; 80,1 (C3'Tp) ; 71,8 (C3'pT) ; 69,5 (C5'pT) ; 64,7 (C5'Tp, OCH2CH2CN) ; 40,5 (C2'pT) ; 39,1 (C2'Tp) ; 38,8 (COCH2CH2COMe) ; 29,9 (OCOCH2CH2COMe) 28,9 (OCOCH2CH2COMe) ; 20,4 (OCH2CH2CN) ; 12,7 (CH3 pT, CH3 Tp).
209, 6 (OCOCH2CH2COMe) ; 174, 3 (OCOCHCOMe) ; 166, 4 (C4 Tp, C4 pT) ; 152, 4 (C2 Tpa) ; 152, 3 (C2 pTa) 138, 0 (C6 Tpb) ; 137, 6 (C6 pTb) ; 118, 0 (CN) ; 112, 2 (C5 Tp, C5 pT) ; 86, 7 (C1'Tp, C1'pT) ; 86, 1 (C4'pTc) ; 84, 2 (C4'Tpc) ; 80,1 (C3'Tp) ; 71,8 (C3'pT) ; 69,5 (C5'pT) ; 64,7 (C5'Tp, OCH2CH2CN) ; 40,5 (C2'pT) ; 39,1 (C2'Tp) ; 38,8 (COCH2CH2COMe) ; 29,9 (OCOCH2CH2COMe) 28,9 (OCOCH2CH2COMe) ; 20,4 (OCH2CH2CN) ; 12,7 (CH3 pT, CH3 Tp).
RMN 31p (0, ppm) :-1, 65 (CD30D, 121 MHz)
<Desc/Clms Page number 14>
SM HR (FAB) : (M+H) + calculé pour C2sH37014NsP 698,2074, trouvé 698,2092.
1.2. Synthèse de
Une solution 0,7 mM du composé obtenu à l'étape précédente (400 ml) dans un mélange eau/acétonitrile (70 : 30) est placée dans réacteur en pyrex de contenance 500 ml. Après bullage d'argon pendant 30 minutes, 20 ml d'acétone sont ajoutés. L'irradiation ultraviolette est réalisée à l'aide d'une lampe à mercure haute pression (Hanau Q81 ; 80 watts) munie d'une enveloppe réfrigérée en pyrex, et positionnée à l'intérieur du réacteur. La durée de l'irradiation est de 4 heures. Le photolysat est ensuite concentré puis purifié par chromatographie liquide haute performance (CLHP) en phase inverse.
- Colonne préparative : Waters Preppak Cartrige, bondapak
C18, 125 (15-20 pm), 47x300 mm.
C18, 125 (15-20 pm), 47x300 mm.
- Conditions : Détection : 230 nm, Débit : 50 ml/minutes
<Desc/Clms Page number 15>
Table du gradient
<tb>
<tb> Éluant
<tb> Temps <SEP> H2O/CH3CN <SEP> H2O/CH3CN
<tb> (minutes) <SEP> 90 <SEP> : <SEP> 10 <SEP> 50 <SEP> : <SEP> 50
<tb> Initial <SEP> 100 <SEP> 0
<tb> 65 <SEP> 87 <SEP> 13
<tb> 90 <SEP> 0 <SEP> 100
<tb>
<tb> Éluant
<tb> Temps <SEP> H2O/CH3CN <SEP> H2O/CH3CN
<tb> (minutes) <SEP> 90 <SEP> : <SEP> 10 <SEP> 50 <SEP> : <SEP> 50
<tb> Initial <SEP> 100 <SEP> 0
<tb> 65 <SEP> 87 <SEP> 13
<tb> 90 <SEP> 0 <SEP> 100
<tb>
La fraction de temps de rétention 54 minutes, obtenue avec un rendement de 30%, correspond au composé attendu. Elle est constituée d'un mélange équimoléculaire des deux diastéréoisomères de l'isomère Cis-Syn.
RMN 1H (0, ppm ; J, Hz) (D20, 400 MHz) 6,25 (0,5H, t, J=6,5, Hl'pT) ; 6,06 (0,5H, m, Hl'pT) ; 5,74 (0,5H, dd, J = 10, 4 ; 4,2 Hl'Tp) ; 5,38 (0,5H, dd, J = 10,2 ; 4,2, Hl'Tp), 5, 11 ; 5,07 (1H, sl, H3'Tp) ; 1,61 (3H, s, CH3 Tp*) ; 1, 54 (3H, s, CH3 pT*).
RMN 31p (8, ppm) : -4, 02 ;-4, 52 (D2O, 243 MHz) SM HR (FAB) : (M+H) + calculé pour C28H37014NsP 698,2074, trouvé 698, 2076.
La fraction de temps de rétention 54 minutes est traitée par une solution aqueuse ammoniacale à 32% pendant une nuit à température ambiante. L'analyse du spectre de RMN H du brut réactionnel montre la présence d'un seul composé. Celui-ci est identifié au dimère cyclobutanique Cis-Syn du dinucléotide de thymine de formule
<Desc/Clms Page number 16>
par comparaison avec les données de RMN du proton de la littérature ( (a) Kemmink J., Boelens R., Kaptein R., "Eur. Biophys. J" (1987), 14,293-299. (b) Koning T. M. G., Van Soest J. J. G., Kaptein R.,"Eur. J. Biochem." (1991), 195,29-40). Le composé obtenu correspond effectivement au mélange diastéréoisomérique de l'isomère Cis-Syn.
RMN IH (8, ppm ; J, Hz) (D20, 300 MHz) 5,98 (1H, dd, J=5,7 et 8,8, Hl'pT) ; 5,66 (1H, dd, J = 5,3 ; 8,6, H1'Tp) ; 4,65 (1H, m, H3'Tp) ; 4,33 (2H, m, H6 pT, H3'pT) ; 4,25 (1H, d, J=5,9, H6 Tp) ; 4,19-3, 89 (4H, m, H4'Tp, H4'pT, H5'H5"pT) ; 3, 70 (2H, m, H5'H5"Tp) ; 2,61 (1H, ddd, J=13,8 ; 8, 6 ; 5,3, H2'Tp) ; 2,43-2, 25 (2H, m, H2"Tp, H2'pT) ; 2,09 (1H, ddd, J=13, 6 ; 5, 7 ; 3,5 H2"
1. 3. Synthèse de 5'-O-lévulinyl-P- (2-cyanoéthyl) -T (cissyn) T-3'- (2-cyanoéthyl) -N, N-diisopropylphosphoramidite.
1. 3. Synthèse de 5'-O-lévulinyl-P- (2-cyanoéthyl) -T (cissyn) T-3'- (2-cyanoéthyl) -N, N-diisopropylphosphoramidite.
Le photoproduit obtenu à l'étape précédente (100 mg, 0,14 mmol), séché pendant une nuit sous vide dans un dessicateur contenant du pentoxyde de phosphore, est repris dans un mélange de tétrahydrofurane/acétonitrile (1/1) anhydre (2ml). Après avoir ajouté la
<Desc/Clms Page number 17>
diisopropyléthylamine (100 gl, 0,57 mmol, 4 éq), la réaction est agitée 30 minutes à température ambiante, sous atmosphère d'argon. Le chloro- (2-cyanoéthyl)-bis- N, N'-diisopropylphosphoramidite (64 gl, 0.28 mmol, 2 éq) est additionné et la réaction agitée pendant 10 minutes.
Le mélange réactionnel est ensuite concentré puis repris par du dichlorométhane et une solution saturée de bicarbonate de sodium. Après lavage, la phase organique est séchée sur sulfate de sodium anhydre puis évaporée.
Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur gel de silice (granulométrie 6-35 microns) avec un gradient d'acétone dans l'acétate d'éthyle (0-40%). Le composé attendu est obtenu sous forme d'une laque translucide avec un rendement de 58 % (75 mg).
RMN 31p (8, ppm) : 149,78 ; 149,63 ;-4, 06 (CD3CN, 243 MHz) Exemple 2 : Synthèse d'oligonucléotides 10 et 32 mères renfermant l'adduit cis-syn cyclobutanique de thymine
Le composé de l'exemple 1 (cs) a été employé pour synthétiser deux oligonucléotides 10 et 32 mères de séquence :
10 mère : CGCAT [cs] TACGC
32 mère : GATCTCGGCGACATCGGT [cs] TCCGTCCTAACTCG 2.1. Synthèse sur support solide.
Le composé de l'exemple 1 (cs) a été employé pour synthétiser deux oligonucléotides 10 et 32 mères de séquence :
10 mère : CGCAT [cs] TACGC
32 mère : GATCTCGGCGACATCGGT [cs] TCCGTCCTAACTCG 2.1. Synthèse sur support solide.
Les synthèses ont été réalisées sur un synthétiseur d'ADN Applied Biosystems, 392 DNA/RNA Synthesizer à l'échelle micromolaire.
Les phosphoramidites standards ont été employés.
<Desc/Clms Page number 18>
Le phosphoramidite de l'exemple 1 est utilisé à une concentration de 0,1 M dans un mélange tétrahydrofurane/acétonitrile (1/3).
Un cycle modifié a été utilisé lors du couplage de ce phosphoramidite. Les modifications par rapport au cycle standard comprennent : un temps de couplage rallongé à 20 minutes, un double coiffage (double capping), et un rinçage supplémentaire, - une suppression de l'étape de détritylation remplacée par une déprotection du groupement lévulinyle avec une solution de monohydrate d'hydrazine 0,5 M dans un mélange pyridine/acide acétique (3/2, v/v) en deux passages de 5 minutes suivie de cinq lavages de 30 secondes à l'acétonitrile.
Les rendements de couplages du phosphoramidite de l'exemple 1 ont été évalués par la mesure conductimétrique du cation Dmt+ libéré pour des couplages suivants par rapport à des couplages précédants l'incorporation dudit phosphoramidite. Dans le cas du 10 mère, le rendement de couplage pour le phosphoramidite utilisé (position 5) et le suivant (A6) par rapport à celui précédent le phosphoramidite modifié (A4) est de l'ordre de 87%. Dans le cas du 32 mère, le rendement de couplage pour le phosphoramidite utilisé (position 14), le précedent (C13) et les deux suivants (G15 et G16) par rapport à C12 est de l'ordre de 91%.
2.2. Déprotection et purification.
2.2. 1. Déprotection des bases nucléiques, du phosphate triester et décrochage du support
<Desc/Clms Page number 19>
Les oligonucléotides sont déprotégés et"décrochés" du support par action d'une solution aqueuse ammoniacale à 32% pendant 24 h à température ambiante, à l'abri de la lumière. Après évaporation à sec, les oligonucléotides tritylés sont purifiés par CLHP en polarité de phase inverse.
Colonne semipréparative : Waters Prepak Delta-Pak C18 25 x 100 mm (15 pm, 300 ).
Conditions : Détection à 260 nm, Débit 3 ml/minutes
Table de gradient
Table de gradient
<tb>
<tb> Eluant
<tb> Temps <SEP> Acétate <SEP> de <SEP> TEA <SEP> CH3CN
<tb> (minutes) <SEP> 0,1 <SEP> M <SEP> pH <SEP> 7
<tb> Initial <SEP> 95 <SEP> 5
<tb> 55 <SEP> 60 <SEP> 40
<tb>
Temps de rétention au lU mère : 41. minutes.
<tb> Eluant
<tb> Temps <SEP> Acétate <SEP> de <SEP> TEA <SEP> CH3CN
<tb> (minutes) <SEP> 0,1 <SEP> M <SEP> pH <SEP> 7
<tb> Initial <SEP> 95 <SEP> 5
<tb> 55 <SEP> 60 <SEP> 40
<tb>
Temps de rétention au lU mère : 41. minutes.
Temps de rétention du 32 mère : 41 minutes.
2.2. 2. Détritylation des oligonucléotides.
Les oligonucléotides tritylés sont détritylés par traitement par une solution aqueuse d'acide acétique 40% pendant 2 heures puis purifiés par CLHP en polarité de phase inverse.
Colonne analytique : Waters Delta-Pak C18 3,9 x 150 mm (5Mm, 300 À).
Conditions : Détection à 260 nm, Débit 1 ml/minute
Table de gradient
Table de gradient
<tb>
<tb> Eluant
<tb> Temps <SEP> Acétate <SEP> de <SEP> TEA <SEP> CH3CN
<tb> (minutes) <SEP> 0,1 <SEP> M <SEP> pH <SEP> 7
<tb> Initial <SEP> 95 <SEP> 5
<tb> 30 <SEP> 60 <SEP> 40
<tb>
Temps de rétention du 10 mère : 12,8 minutes. Temps de rétention du 32 mère : 11,9 minutes.
<tb> Eluant
<tb> Temps <SEP> Acétate <SEP> de <SEP> TEA <SEP> CH3CN
<tb> (minutes) <SEP> 0,1 <SEP> M <SEP> pH <SEP> 7
<tb> Initial <SEP> 95 <SEP> 5
<tb> 30 <SEP> 60 <SEP> 40
<tb>
Temps de rétention du 10 mère : 12,8 minutes. Temps de rétention du 32 mère : 11,9 minutes.
<Desc/Clms Page number 20>
2. 2. 3. Caractérisation.
L'analyse en spectrométrie de masse MALDI (mode positif) des oligonucléotides 10 et 32 mères est la suivante :
10 mère Masse (M+H) + calculée 2988.005, mesurée 2988.7 +/-0, 5u
32 mère Masse (M+H) + calculée 9767.371, mesurée
9764.3 +/-5u.
10 mère Masse (M+H) + calculée 2988.005, mesurée 2988.7 +/-0, 5u
32 mère Masse (M+H) + calculée 9767.371, mesurée
9764.3 +/-5u.
Ainsi, l'utilisation de dérivés de formule (1) selon l'invention permet d'obtenir de manière rapide et économique des adduits de formule (3) qui peuvent être incorporés dans des oligonucléotides aptes à être utilisés par des biophysiciens et des physicochimistes pour des études structurales, par des biochimistes et des biologistes pour des études dans le domaine de la réparation de l'ADN, de la transcription et de son contrôle, dans le domaine immunitaire et dans le domaine de la transduction de signaux consécutifs à l'exposition cellulaire du rayonnement UV.
Claims (2)
- A et B représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un substituant choisi dans le groupe constitué par la cytosine, l'uracile et la thymine, - Ri représente un groupe méthyle, 2-cyanoéthyle,dans laquelle
REVENDICATIONS 1. Dérivé répondant à la formule (1)Lev représente un groupe lévulinyle.2-silyléthyle ou allyle, et2. Dérivé selon la revendication 1, pour lequel A et B représentent chacun une thymine et qui correspond au 0cyanoéthyle phosphate de la 5'-0-lévulinylthymidilyl (3'- 5') thymidine.dans laquelle C représente un substituant choisi parmi
3. Procédé de préparation des composés de formule (2)<Desc/Clms Page number 22>
dans lesquelles Xi, Xs, Rs et R6 sont définis comme illustrés au tableau suivant :
<tb><tb> NH <SEP> NH <SEP> H <SEP> H<tb> NH <SEP> 0 <SEP> H <SEP> CH3<tb> 0 <SEP> NH <SEP> CH3 <SEP> H<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> CH3 <SEP> CH3<tb> NH <SEP> 0 <SEP> H <SEP> H<tb> 0 <SEP> NH <SEP> H <SEP> H<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> H <SEP> CH3<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> CH3 <SEP> H<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> H <SEP> H<tb> Xi <SEP> X2 <SEP> Rs <SEP> R6<tb>Ri représente un groupe méthyle, 2-cyanoéthyle, 2-silyléthyle ou allyle, et Lev représente un groupe lévulinyle par irradiation d'un composé de formule (1) selon l'une quelconque des revendications 1 et 2.
4. Composés de formule (2a) dans laquelle - C représente un substituant (a) tel que défini à la revendication 3, Ri représente un groupe méthyle, 2-cyanoéthyle, 2-silyléthyle ou allyle, et Lev représente un groupe lévulinyle.5. Composés de formule (2b) dans laquelle<Desc/Clms Page number 23>- C représente un substituant (b) tel que défini à la revendication 3, Ri représente un groupe méthyle, 2-cyanoéthyleLev représente un groupe lévulinyle sous forme cis-syn, trans-syn 1 ou trans-syn 2.2-silyléthyle ou allyle, etRi représente un groupe méthyle, 2-cyanoéthyle,dans laquelle - C représente un substituant choisi parmi (a) et (b) tels que définis à la revendication 3,
7. Composés de formule (3)
6. Composés selon la revendication 5 dans laquelle C représente un substituant (bl) - 2-silyléthyle ou allyle, et - ruz représente un groupe (X3) ou (X4)
<Desc/Clms Page number 24>où R3 représente un groupe méthyle, 2-cyanoéthyle, 2silyléthyle ou allyle, et R4 représente un substituant choisi parmi les groupes-NR'R', morpholino, Npyrrolidinyle et 2, 2, 6, 6, -tétraméthyl-N-pipéridyle, R'et R', étant chacun un groupe (Ci-C4) alkyle, et Lev représente un groupe lévulinyle.
9. Procédé de préparation des composés selon l'une quelconque des revendications 7 et 8, comprenant les étapes suivantes : irradiation du composé de formule (1) pour obtenir un composé de formule (2), et - réaction du composé de formule (2) avec un composé de formule (4)
8. Composés selon la revendication 7 répondant à la formule<Desc/Clms Page number 25>un groupe choisi parmi les groupes-NR'R', morpholino, N-pyrrolidinyle et 2, 2, 6, 6, -tétraméthyl-N-pipéridyle, R' et R" étant chacun un groupe (Cl-C4) alkyle pour obtenir le composé de formule (3).
(4a) (4b) dans laquelle R3 représente un groupe méthyle, 2-cyanoéthyle, 2-silyléthyle ou allyle, et R4 représente10. Utilisation des composés de formule (3) selon l'une quelconque des revendications 7 et 8 pour la préparation d'oligonucléotides.
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| EP0787740A2 (fr) * | 1996-01-31 | 1997-08-06 | Biomolecular Engineering Research Institute | Produit photo (6-4) utilisable comme élément de couplage, procédé pour sa préparation, procédé pour la préparation d'oligonucléotides contenant le produit photo (6-4) et procédé pour la préparation d'ADN contenant le produit photo (6-4) |
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2002
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Patent Citations (1)
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| VAN DER MAREL, G. A. ET AL: "Phosphotriester synthesis of DNA fragments on cellulose and polystyrene solid supports", RECL.: J. R. NETH. CHEM. SOC. (1982), 101(7-8), 234-41, XP008010066 * |
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