FR2851773A1

FR2851773A1 - Polypeptides impliques dans la biosynthese des spiramycines, sequences nucleotidiques codant ces polypeptides et leurs applications

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Publication number: FR2851773A1
Application number: FR0302439A
Authority: FR
Inventors: Rouault Marie Helene Blondelet; Helene Dominguez; Rongere Emmanuelle Darbon; Claude Gerbaud; Anne Gondran; Fatma Karray; Patricia Lacroix; Mermet Bouvier Nat Oestreicher; Jean Luc Pernodet; Karine Tuphile
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Aventis Pharma SA
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Aventis Pharma SA
Priority date: 2003-02-27
Filing date: 2003-02-27
Publication date: 2004-09-03

Abstract

La présente invention concerne l'isolement et l'identification de nouveaux gènes de la voie de biosynthèse des spiramycines et de nouveaux polypeptides impliqués dans cette biosynthèse. L'invention est également relative à un procédé de production de ces polypeptides. Elle est également relative à l'utilisation de ces gènes dans le but d'augmenter les taux de production et la pureté de la spiramycine produite. L'invention concerne notamment un microorganisme produisant de la spiramycine I mais ne produisant pas de spiramycine II et III et l'utilisation d'un tel micoorganisme. L'invention a également trait à l'utilisation des gènes de la voie de biosynthèse des spiramycines pour la construction de mutants pouvant conduire à la synthèse de nouveaux antibiotiques ou à des formes dérivées de spiramycines. L'invention concerne encore les molécules produites grâce à l'expression de ces gènes et des compositions pharmacologiquement actives d'une molécule produite grâce à l'expression de tels gènes.

Description

POLYPEPTIDES IMPLIQUES DANS LA BIOSYNTHESE DES SPIRAMYCINES. SEQUENCES NUCLEOTIDIOUES CODANT CES POLYPEPTIDES ET LEURS APPLICATIONS
La présente invention concerne l'isolement et l'identification de nouveaux gènes de la voie de biosynthèse des spiramycines et de nouveaux polypeptides impliqués dans cette biosynthèse. Elle est également relative à l'utilisation de ces gènes dans le but d'augmenter les taux de production et la pureté de la spiramycine produite.

L'invention a également trait à l'utilisation de ces gènes pour la construction de mutants pouvant conduire à la synthèse de nouveaux antibiotiques ou à des formes dérivées de spiramycines. L'invention concerne encore les molécules produites grâce à l'expression de ces gènes et enfin des compositions pharmacologiquement actives d'une molécule produite grâce à l'expression de tels gènes.

Les Streptomyces sont des bactéries filamenteuses Gram positif du sol. Elles jouent un rôle important dans la décomposition et la minéralisation des matières organiques grâce à la grande diversité des enzymes dégradatives qu'elles sécrètent. Elles présentent des phénomènes de différenciations morphologiques uniques chez les procaryotes s'accompagnant d'une différenciation métabolique caractérisée par la production de métabolites secondaires présentant une extraordinaire diversité de structures chimiques et d'activités biologiques. Parmi ces métabolites, on retrouve les spiramycines produites à l'état naturel par la bactérie Streptomyces ambofaciens.

La spiramycine est un antibiotique de la famille des macrolides utile aussi bien en médecine vétérinaire qu'en médecine humaine. Les macrolides sont caractérisés par la présence d'un cycle lactone sur lequel sont greffés un ou plusieurs sucres. Streptomyces ambofaciens produit à l'état naturel la spiramycine I, II et III (cf. Figure 1), cependant l'activité antibiotique de la spiramycine 1 est nettement supérieure à celle des

spiramycines II et III (Liu et al., 1999). La molécule de spiramycine 1 est constituée d'un macro-cycle lactonique, appelle platénolide et de trois sucres : la forosamine, le mycaminose et le mycarose (cf. Figure 1). L'activité antibiotique des spiramycines est due à une inhibition de la synthèse protéique chez les procaryotes par un mécanisme impliquant la liaison de l'antibiotique au ribosome bactérien.

Certains composés membres de la famille des macrolides et possédant également un cycle lactone ont donné lieu à des utilisations hors du domaine des antibiotiques.

Ainsi le produit FK506 a des effets immunosuppresseurs et offre des perspectives d'application thérapeutique dans le domaine de la transplantation d'organe, de l'arthrite rhumatoïde et plus généralement dans des pathologies liées à des réactions autoimmunes. D'autres macrolides comme l'avermectine ont des activités insecticides et anti-helminthiques.

De nombreuses voies de biosynthèse, concernant des antibiotiques appartenant à des classes variées ainsi que d'autres métabolites secondaires (pour une revue, Chater K.

1990), ont à ce jour déjà été étudiées chez les Streptomycètes. Cependant, la connaissance des voies de biosynthèse des spiramycines n'est que très partielle à cejour.

La biosynthèse des spiramycines est un processus complexe comportant de nombreuses étapes et impliquant de nombreuses enzymes (Omura et al., 1979a, Omura et al., 1979b). Les spiramycines appartiennent à la large classe des polyketides qui regroupe des molécules complexes particulièrement abondantes dans les microorganismes du sol. Ces molécules sont regroupées non pas par analogie de structure mais par une certaine similarité au niveau d'étapes de leur voie de biosynthèse.

En effet, les polyketides sont produits par une série complexe de réactions mais possèdent en commun d'avoir dans leur voie de biosynthèse une série de réactions catalysées par une ou des enzymes appelées polyketides synthases (PKS). Chez Streptomyces ambofaciens, la biosynthèse du macro-cycle lactonique des spiramycines (platénolide) est réalisée par une série de huit modules codés par cinq gènes PKS différents (Kuhstoss S., 1996, brevet US 5,945,320). Les spiramycines sont obtenues à partir de ce cycle lactone. Cependant, les diverses étapes et enzymes impliquées dans la

synthèse des sucres, ainsi que leur liaison au cycle lactone et la modification de ce cycle pour l'obtention des spiramycines restent encore inconnues à cejour.

Le brevet US 5,514,544 décrit le clonage d'une séquence appelée srmR chez Streptomyces ambofaciens. Il est fait l'hypothèse dans ce brevet que le gène srmR code une protéine régulatrice de la transcription des gènes impliqués dans la biosynthèse des macrolides.

En 1987, Richardson et collaborateurs (Richardson et al., 1987) ont montré que la résistance à la spiramycine de S. ambofaciens est conférée par au moins trois gènes, ces derniers ont été appelés srmA, srmB et srmC. Le brevet US 4,886,757 décrit plus particulièrement la caractérisation d'un fragment d'ADN de S. ambofaciens contenant le gène srmC. Cependant la séquence de ce gène n'a pas été divulguée. En 1990, Richardson et collaborateurs (Richardson et al., 1990) ont posé l'hypothèse de l'existence de trois gènes de biosynthèse de la spiramycine proche de srmB. Le brevet US 5,098,837 rapporte le clonage de cinq gènes potentiellement impliqués dans la biosynthèse de la spiramycine. Ces gènes ont été baptisés srmD, srmE, srmF, srmG et srmH.

Une des difficultés majeures dans la production de composés tels que les spiramycines réside dans le fait que de très grands volumes de fermentation sont nécessaires à la production d'une quantité relativement faible de produit. Il est donc souhaitable de pouvoir augmenter l'efficacité de production de telles molécules afin d'en diminuer les coûts de production.

La voie de biosynthèse des spiramycines est un processus complexe et il serait souhaitable d'identifier et de supprimer les réactions parasites qui pourraient exister au cours de ce processus. Le but d'une telle manipulation est d'obtenir un antibiotique plus pur et/ou une amélioration de la productivité. A ce sujet, Streptomyces ambofaciens produit à l'état naturel la spiramycine I, II et III (cf. Figure 1), cependant l'activité antibiotique de la spiramycine 1 est nettement supérieure à celle des spiramycines II et

III (Liu et al., 1999). Il serait donc souhaitable de pouvoir disposer de souches ne produisant que de la spiramycine I.

En raison de l'intérêt commercial des antibiotiques macrolides, l'obtention de nouveaux dérivés, notamment d'analogues de spiramycines ayant des propriétés avantageuses est intensivement recherchée. Il serait souhaitable de pouvoir générer en quantité suffisante les intermédiaires de biosynthèse de la voie de biosynthèse des spiramycines ou des dérivés des spiramycines notamment dans le but de fabriquer des antibiotiques hybrides dérivés des spiramycines.

Description générale de l'invention
La présente invention résulte du clonage de gènes dont le produit intervient dans la biosynthèse des spiramycines. L'invention concerne tout d'abord de nouveaux gènes de la voie de biosynthèse des spiramycines et de nouveaux polypeptides impliqués dans cette biosynthèse.

Les gènes de la voie de biosynthèse et les séquences codantes associées ont été clonés et la séquence d'ADN de chacun a été déterminée. Les séquences codantes

clonées seront désignées par la suite o/7*c, orf2*c, orf3 *c, orf4*c, or/3* or/6*, orf7*c, or/8*, or/9*, orflO*, or/7, or/2, or/3, orf4, orf5, or/6, orf7, or/8, orj9c, or/10, orf11c, or/12, orfl3c, orfl4, orf15c, or/16, or/17, or/18, or/19, or/20, or/2 le, orf22c, orj23c,

or/24c, orj25c, or/26, or/27, orj28c, or/29, orf30c, or/31 et orj32c. La fonction des protéines codées par ces séquences dans la voie de biosynthèse des spiramycines est développée dans la discussion ci-après qui est illustrée par les figures 4, 5, 6 et 8.

1) Un premier objet de l'invention concerne un polynucléotide codant un polypeptide impliqué dans la biosynthèse des spiramycines caractérisé en ce que la séquence dudit polynucléotide est :

(a) l'une des séquences SEQ ID N 3,5, 7,9, 11, 13,15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113,115, 118, et 120, (b) l'une des séquences constituées par les variants des séquences (a), (c) l'une des séquences dérivées des séquences (a) et (b) en raison de la dégénérescence du code génétique.

2) La présente invention a également pour objet un polynucléotide s'hybridant dans des conditions d'hybridation de forte stringence à au moins l'un des polynucléotides selon le paragraphe 1) ci-dessus.

3) L'invention concerne également un polynucléotide présentant au moins 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% d'identité en nucléotides avec un polynucléotide comprenant au moins 10,12, 15, 18, 20 à 25, 30, 40, 50,60, 70,80, 90,100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300,1350, 1400,1450, 1500,1550, 1600,1650, 1700, 1750, 1800,1850 ou 1900 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide selon le paragraphe 1) ci dessus.

4) L'invention concerne également un polynucléotide selon le pragraphe 2) ou 3) ci-dessus caractérisé en ce qu'il est isolé à partir d'une bactérie du genre Streptomyces.

5) L'invention concerne également un polynucléotide selon le pragraphe 2), 3) ou 4) ci-dessus caractérisé en ce qu'il code une protéine impliquée dans la biosynthèse d'un macrolide.

6) L'invention concerne également un polynucléotide selon le pragraphe 2), 3) ou 4) ci-dessus caractérisé en ce qu'il code une protéine ayant une activité similaire à la protéine codée par le polynucléotide avec lequel il s'hybride ou il présente l'identité.

7) L'invention concerne également un polypeptide résultant de l'expression d'un polynucléotide selon le pragraphe 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) ci-dessus.

8) Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide impliqué dans la biosynthèse des spiramycines caractérisée en ce que la séquence dudit polypeptide est : (a) l'une des séquences SEQ ID N 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29,31,32,33,35,37,38,39,41,42,44,46,48,50,51,52,54,55,56,57,58,59,61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77,-79, 81, 83, 85, 108, 110, 112, 114, 116, 117, 119 et 121, (b) l'une des séquences telles que définies en (a) excepté que tout au long de ladite séquence un ou plusieurs acides aminés ont été substitués, insérés ou délétés sans en affecter les propriétés fonctionnelles, (c) l'une des séquences constituées par les variants des séquences (a) et (b).

9) Un autre objet de l'invention concerne un polypeptide présentant au moins 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% d'identité en acides aminés avec un polypeptide comprenant au moins 10,15, 20,30 à 40,50, 60,70, 80,90,100, 120,140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480,500, 520, 540,560, 580,600, 620 ou 640 acides aminés consécutifs d'un polypeptide selon le paragraphe 8) ci-dessus.

10) Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide selon le paragraphe 9) ci-dessus caractérisé en ce qu'il est isolé à partir d'une bactérie du genre Streptomyces.

11) Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide selon le paragraphe 9) ou 10) ci-dessus caractérisé en ce qu'il code une protéine impliquée dans la biosynthèse d'un macrolide.

12) Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide selon le pragraphe 9), 10) ou 11) ci-dessus caractérisé en ce qu'il a une activité similaire à celle du polypeptide avec lequel il partage l'identité.

13) Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant caractérisé en ce qu'il comprend au moins un polynucléotide selon l'un des paragraphes 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) ci-dessus.

14) Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant selon le pragraphe 13) ci-dessus caractérisé en ce que le dit ADN recombinant est compris dans un vecteur.

15) Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant selon le paragraphe 14) ci-dessus caractérisé en ce que ledit vecteur est choisi parmi les bactériophages, les plasmides, les phagemides, les vecteurs intégratifs, les fosmides, les cosmides, les vecteurs navettes, les BAC ou les PAC.

16) Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant selon le pragraphe 15) ci-dessus caractérisé en ce qu'il est choisi parmi pOS49.1, pOS49.11, pOSC49. 12, pOS49. 14, pOS49. 16, pOS49. 28, pOS44. 1, pOS44. 2, pOS44. 4, pSPM5, pSPM7, pOS49. 67, pOS49. 88, pOS49. 106, pOS49. 120, pOS49. 107, pOS49.32, pOS49. 43, pOS49. 44, pOS49. 50, pOS49. 99, pSPM17, pSPM21, pSPM502, pSPM504, pSPM507, pSPM508, pSPM509, pSPMl, pBXLllll, pBXL1112, pBXL1113, pSPM520, pSPM521, pSPM522, pSPM523, pSPM524, pSPM525, pSPM527, pSPM528, pSPM34, pSPM35, pSPM36, pSPM37, pSPM38, pSPM39, pSPM40, pSPM41, pSPM42, pSPM43, pSPM44, pSPM45, pSPM47, pSPM48, pSPM50, pSPM51, pSPM52, pSPM53, pSPM55, pSPM56, pSPM58, pSPM72, pSPM73, pSPM515, pSPM519, pSPM74 et pSPM75.

17) Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence d'acide nucléique codant un polypeptide selon le pragraphe 7), 8), 9), 10), 11) ou 12) ci-dessus.

18) L'invention est également relative à un système d'expression comprenant un vecteur d'expression approprié et une cellule hôte permettant l'expression d'un ou plusieurs polypeptides selon le paragraphe 7), 8), 9), 10), 11) ou 12) ci-dessus.

19) L'invention est également relative à un système d'expression selon le paragraphe 18 ci-dessus caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les systèmes d'expression procaryotes ou les systèmes d'expression eucaryotes.

20) L'invention est également relative à un système d'expression selon le paragraphe 19) ci-dessus caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les systèmes d'expression chez la bactérie E. coli, les sytèmes d'expression baculovirus permettant une expression dans des cellules d'insectes, les sytèmes d'expression permettant une expression dans des cellules de levures, les sytèmes d'expression permettant une expression dans des cellules de mammifères.

21) L'invention est également relative à une cellule hôte dans laquelle a été introduit au moins un polynucléotide et/ou au moins un ADN recombinant et/ou au moins un vecteur d'expression selon l'un des pragraphes 1), 2), 3), 4), 5), 6), 13), 14), 15), 16) ou 17) ci-dessus.

22) L'invention est également relative à un procédé de production d'un polypeptide selon le paragraphe 7), 8), 9), 10), 11) ou 12) ci-dessus caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes: a) insérer au moins un acide nucléique codant ledit polypeptide dans un vecteur approprié ; b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, une cellule hôte préalablement transformée ou transfectée avec le vecteur de l'étape a) ; c) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire; d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape c), ledit polypeptide ; e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.

23) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme bloqué dans une étape de la voie de biosynthèse d'au moins un macrolide.

24) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 23) ci-dessus caractérisé en ce qu'il est obtenu en inactivant la fonction d'au moins une protéine impliquée dans la biosynthèse de ce ou de ces macrolides dans un microorganisme producteur de ce ou de ces macrolide.

25) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 24) ci-dessus caractérisé en ce que l'inactivation de cette ou de ces protéines est effectuée par mutagénèse dans le ou les gènes codant ladite ou lesdites protéines ou par expression d'un ou de plusieurs ARN anti-sens complémentaires de l'ARN ou des ARN messagers codant ladite ou lesdites protéines.

26) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 25) ci-dessus caractérisé en ce que l'inactivation de cette ou de ces protéines est effectuée par mutagénèse par irradiation, par action d'agent chimique mutagène, par mutagénèse dirigée ou par remplacement de gène.

27) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 25) ou 26) ci-dessus caractérisé en ce que la ou les mutagénèses sont effectuées in vitro ou in situ, par suppression, substitution, délétion et/ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés ou par inactivation génique.

28) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 23), 24), 25), 26) ou 27) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorganisme est une bactérie du genre Streptomyces.

29) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 23), 24), 25), 26), 27) ou 28) ci-dessus caractérisé en ce que le macrolide est la spiramycine.

30) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 23), 24), 25), 26), 27), 28) ou 29) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorganisme est une souche de S. ambofaciens.

31) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 23), 24), 25), 26), 27), 28), 29) ou 30) ci-dessus caractérisé en ce que la mutagénèse est effectuée dans au moins un gène comprenant une séquence selon l'un des paragraphes 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) ci-dessus.

32) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 25), 26), 27), 28), 29), 30) ou 31) ci-dessus caractérisé en ce que la mutagénèse est effectuée dans un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N 3, 5, 7,9, 11, 13,15, 17,19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68,70, 72,74, 76,78, 80, 82, 84, 107,109, 111, 113, 115,118, et 120.

33) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 25), 26), 27), 28), 29), 30), 31) ou 32) ci-dessus caractérisé en ce que la mutagénèse consiste en l'inactivation génique d'un gène comprenant une séquence correspondant à la séquence SEQ ID N 13.

34) Un autre aspect de l'invention concerne une souche de Streptomyces ambofaciens caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche choisie parmi : - l'une des souches déposées auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2909, 1- 2911,1-2912,1-2913,1-2914,1-2915,1-2916 ou 1-2917 - la souche SPM510.

35) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation d'un intermédiaire de biosynthèse de macrolide caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme selon l'un des paragraphes 23), 24), 25), 26), 27), 28), 29), 30), 31), 32), 33) ou 34) ci dessus, b) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, c) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape b), ledit intermédiaire de biosynthèse.

36) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation d'une molécule dérivée d'un macrolide caractérisé en ce que l'on prépare un intermédiaire de biosynthèse selon le procédé du paragraphe 35) ci-dessus et que l'on modifie l'intermédiaire ainsi produit.

37) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation selon le paragraphe 36) ci-dessus caractérisé en ce que l'on modifie ledit intermédiaire par voie chimique, biochimique, enzymatique et/ou microbiologique.

38) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation selon le paragraphe 36) ou 37) ci-dessus caractérisé en ce que l'on introduit dans ledit microorganisme un ou plusieurs gènes codant des protéines susceptibles de modifier l'intermédiaire en s'en servant comme substrat.

39) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation selon le paragraphe 36), 37) ou 38) ci-dessus caractérisé en ce que le macrolide est la spiramycine.

40) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation selon le paragraphe 36), 37), 38) ou 39) ci-dessus caractérisé en ce que le microorganisme utilisé est une souche de S. ambofaciens.

41) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme produisant de la spiramycine I mais ne produisant pas de spiramycine II et III
42) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 41) ci-dessus caractérisé en ce qu'il comprend l'ensemble des gènes nécessaires à la biosynthèse de la spiramycine 1 mais que le gène comprenant la séquence SEQ ID N 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID N 14 ou l'un de ses variants n'est pas exprimé ou a été rendu inactif.

43) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 42) ci-dessus caractérisé en ce que la dite inactivation est réalisée par mutagénèse dans le gène codant ladite protéine ou par l'expression d'un ARN anti-sens complémentaire de l'ARN messager codant ladite protéine.

44) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 43) ci-dessus caractérisé en ce que la dite mutagénèse est effectuée dans le promoteur de ce gène, dans la séquence codante ou dans une séquence non codante de manière à rendre inactive la protéine codée ou à en empêcher son expression ou sa traduction.

45) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon la revendication 43) ou 44) ci-dessus caractérisé en ce que la mutagénèse est effectuée par irradiation, par action d'agent chimique mutagène, par mutagénèse dirigée ou par remplacement de gène.

46) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 43), 44) ou 45) ci-dessus caractérisé en ce que la mutagénèse est effectuée in vitro ou in situ, par suppression, substitution, délétion et/ou addition d'une ou plusieurs bases dans le gène considéré ou par inactivation génique.

47) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 41) ou 42) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorganisme est obtenu en exprimant les gènes de la voie de biosynthèse de la spiramycine sans que ceux-ci ne comprennent le gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID N 14 ou l'un de ses variants.

48) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 41), 42), 43), 44), 45), 46) ou 47) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorganisme est une bactérie du genre Streptomyces.

49) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47) ou 48) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorganisme est obtenu à partir d'une souche de départ produisant les spiramycines I, II et III.

50) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47), 48) ou 49) ci-dessus caractérisé en ce qu'il est obtenu par mutagénèse dans un gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID N 14 ou l'un de ses variants ayant la même fonction.

51) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47), 48), 49) ou 50) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorganisme est obtenu à partir d'une souche de S. ambofaciens produisant les spiramycines I, II et III, dans laquelle est effectuée une inactivation génique du gène comprenant la séquences correspondant à SEQ ID N 13 ou l'une des séquences dérivées de celle-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.

52) Un autre aspect de l'invention concerne une souche de S. ambofaciens caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2910.

53) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de production de spiramycine I, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (a) cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme selon l'un des paragraphes 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47), 48), 49), 50), 51) ou 52) ci-dessus, (b) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, (c) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape b), la spiramycine I.

54) Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation d'un polynucléotide selon l'un des paragraphes 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) ci-dessus pour améliorer la production en macrolides d'un microorganisme.

55) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant producteur de macrolide caractérisé en ce qu'il possède une modification génétique dans au moins un gène comprenant une séquence selon l'un des paragraphes 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) ci-dessus et/ou qu'il surexprime au moins un gène comprenant une séquence selon l'un des paragraphes 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) ci-dessus.

56) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55) ci-dessus caractérisé en ce que la modification génétique consiste en une suppression, une substitution, une délétion et/ou une addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés dans le but d'exprimer une ou des protéines ayant une activité supérieure ou d'exprimer un niveau plus élevé de cette ou de ces protéines.

57) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55) ci-dessus caractérisé en ce que la surexpression du gène considéré est obtenue en augmentant le nombre de copie de ce gène et/ou en plaçant un promoteur plus actif que le promoteur sauvage.

58) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55) ou 57) ci-dessus caractérisé en ce que la surexpression du gène considéré est obtenue en transformant un microorganisme producteur de macrolide par une construction d'ADN recombinant selon le paragraphe 13,14 ou 17 ci-dessus, permettant la surexpression de ce gène.

59) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55), 56), 57) ou 58) ci-dessus caractérisé en ce que la modification génétique est effectuée dans un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N 3,5, 7,9, 11,13, 15,17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70,72, 74,76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, et 120, ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.

60) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55), 56), 57), 58) ou 59) ci-dessus caractérisé le microorganisme surexprime un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N 3,5, 7,9, 11, 13,15, 17, 19, 21, 23, 25, 28,30, 34,36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, et 120, ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.

61) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55), 56), 57), 58), 59) ou 60) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorganisme est une bactéries du genre Streptomyces.

62) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55), 56), 57), 58), 59), 60) ou 61) ci-dessus caractérisé en ce que le macrolide est la spiramycine.

63) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55), 56), 57), 58), 59), 60), 61) ou 62) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorganisme est une souches de S. ambofaciens.

64) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de production de macrolides, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (a) cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme selon l'un des paragraphes 55), 56), 57), 58), 59), 60), 61), 62), 63) ou 64) ci-dessus, (b) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, (c) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape b), le ou lesdits macrolides produits.

65) Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation d'une séquence et/ou d'un ADN recombinant et/ou d'un vecteur selon l'un des paragraphes 1), 2), 3), 4), 5), 6), 7), 8), 9), 10), 11), 12), 13), 14), 15), 16) ou 17) ci-dessus pour la préparation d'antibiotiques hybrides.

66) Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation d'au moins un polynucléotide et/ou au moins un ADN recombinant et/ou au moins un vecteur d'expression et/ou au moins un polypeptide et/ou au moins une cellule hôte selon l'un des paragraphes 1), 2), 3), 4), 5), 6), 7), 8), 9), 10), 11), 12), 13), 14), 15), 16), 17) ou 21) ci-dessus pour réaliser une ou plusieurs bioconversions.

67) Un autre aspect de l'invention concerne un polynucléotide caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polynucléotide complémentaire de l'un des polynucléotides selon le paragraphe 1), 2), 3), 4), 5), ou 6) ci-dessus.

68) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme producteur d'au moins une spiramycine caractérisé en ce qu'il surexprime : - un gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymérase (PCR) en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N 138) et 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens, - ou un gène dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.

69) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 68 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une bactérie du genre Streptomyces.

70) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 68 ou 69 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une bactérie de l'espèce Streptomyces ambofaciens.

71) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 68,69 ou 70 caractérisé en ce que la surexpression dudit gène est obtenue par transformation dudit microorganisme par un vecteur d'expression.

72) Un autre aspect de l'invention concerne une souche de Streptomyces ambofaciens caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche OSC2/pSPM75(l) ou de la souche OSC2/pSPM75(2).

73) Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant caractérisé en ce qu'il comprend : - un polynucléotide susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymérase en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N 138) et 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens, - ou un fragment d'au moins 10,12, 15,18, 20 à 25, 30, 40, 50,60, 70,80, 90,100, 150,200, 250,300, 350,400, 450,500, 550,600, 650,700, 750,800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1460, 1470, 1480, 1490 ou 1500 nucléotides consécutifs de ce polynucléotide.

74) Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant selon le paragraphe 73 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur.

75) Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant selon le paragraphe 73 ou 74 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur d'expression.

76) Un autre aspect de l'invention concerne une cellule hôte dans laquelle a été introduit au moins un ADN recombinant selon l'un des paragraphes 73,74 ou 75.

77) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de production d'un polypeptide caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes: a) transformer une cellule hôte par au moins un vecteur d'expression selon le paragraphe 75; b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, ladite cellule hôte; c) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire;

d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape c), ledit polypeptide ; e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.

78) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 51 caractérisé en ce que l'inactivation génique est effectuée par délétion en phase du gène ou d'une partie du gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N 13 ou l'une des séquences dérivées de celle-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.

79) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon l'un des paragraphes 41,42, 43,44, 45,46, 47,48, 49,50, 51 ou 78 caractérisé en ce en ce qu'il surexprime en outre : - un gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymérase en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N 138) et 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens.

- ou un gène dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.

80) Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur d'expression caractérisé en ce que le polynucléotide de séquence SEQ ID N 47 ou un polynucléotide dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique est placé sous le contrôle d'un promoteur permettant l'expression de la protéine codée par le dit polynucléotide chez Streptomyces ambofaciens.

81) Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur d'expression selon le paragraphe 80 caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pSPM524 ou pSPM525.

82) Un autre aspect de l'invention concerne une souche de Streptomyces ambofaciens transformée par un vecteur selon le paragraphe 80 ou 81.

83) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon l'un des paragraphes 41,42, 43,44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,78 ou 79 caractérisé en ce qu'il surexprime en outre le gène de séquence codante SEQ ID N 47 ou d'une séquence codante dérivée de celle-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.

84) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 83 caractérisé en ce qu'il s'agit de la souche SPM502 pSPM525 déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 26 février 2003 sous le numéro d'enregistrement 1-2977.

85) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de production de spiramycine(s), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (a) cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme selon l'un des paragraphes 68, 69, 70,71, 72,78, 79,82, 83 ou 84, (b) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, (c) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape b), les spiramycines.

86) Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide caractérisé en ce que sa séquence comprend la séquence SEQ ID N 112.

87) Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide caractérisé en ce que sa séquence correspond à la séquence traduite de la séquence codante : - d'un gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymérase (PCR) en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N 138) et 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens, -ou d'un gène dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.

88) Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur d'expression permettant l'expression d'un polypeptide selon le paragraphe 86 ou 87 chez Streptomyces ambofaciens.

89) Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur d'expression selon le paragraphe 88 caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pSPM75.

Définitions générales
Le terme " isolé " au sens de la présente invention désigne un matériel biologique (acide nucléique ou protéine) qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement).

Par exemple un polynucléotide présent à l'état naturel dans une plante ou un animal n'est pas isolé. Le même polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de la plante ou l'animal est considéré comme " isolé ".

Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel.

Le terme " purifié " ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative.

Un polynucléotide est à l'état " purifié " après purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement 4 ou 5 ordres de grandeur.

Aux fins de la présente invention le terme ORF ( Open Reading Frame , c'est à dire cadre ouvert de lecture) a été employé pour désigner en particulier la séquence codante d'un gène.

Aux fins de la présente description, l'expression " séquence nucléotidique " peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique.

L'expression " séquence nucléotidique " englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.

Les termes " acide nucléique ", " polynucléotide ", " oligonucléotide " ou encore séquence nucléotidique " englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple chaîne ou sous la forme de duplex.

Le terme " nucléotide " désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (1) un analogue d'une purine, (2) un analogue d'une pyrimidine, ou (3) un sucre analogue, des exemples de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N WO 95/04 064.

Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant " complémentaire " d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier polynucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée. Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), ou C et G.

Le terme gènes de la voie de biosynthèse des spiramycines comprend également les gènes régulateurs et les gènes conférant la résistance aux microorganismes producteurs.

On entendra par " fragment " d'un acide nucléique de référence selon l'invention, une séquence nucléotidique de longueur réduite par rapport à l'acide nucléique de référence et comprenant, sur la partie commune, une séquence en nucléotides identique à l'acide nucléique de référence.

Un tel " fragment " d'acide nucléique selon l'invention peut être le cas échéant, compris dans un polynucléotide plus grand duquel il est constitutif.

De tels fragments comprennent ou alternativement consistent en, des polynucléotides de longueur allant de 8,10, 12,15, 18, 20 à 25, 30, 40, 50,60, 70,80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950,1000, 1050,1100, 1150,1200, 1250, 1300, 1350,1400, 1450,1500, 1550,1600, 1650,1700, 1750,1800, 1850 ou 1900 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention.

Par " fragment " d'un polypeptide selon l'invention, on entendra un polypeptide dont la séquence d'acides aminés est plus courte que celle du polypeptide de référence et qui comprend sur toute la partie commune avec ces polypeptides de référence, une séquence en acides aminés identique.

De tels fragments peuvent, le cas échéant, être compris au sein d'un polypeptide plus grand duquel ils font partie.

De tels fragments d'un polypeptide selon l'invention peuvent avoir une longueur de 10, 15,20, 30 à 40,50, 60,70, 80,90,100, 120,140, 160,180, 200,220, 240,260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620 ou 640 acides aminés.

Par " conditions d'hybridation de forte stringence " au sens de la présente invention, on entendra des conditions d'hybridation défavorisant l'hybridation de brins d'acides nucléiques non homologues. Des conditions d'hybridations de forte stringence peuvent être par exemple décrites comme des conditions d'hybridation dans le tampon décrit par Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984) à une température comprise entre 55 C et 65 C, de manière préférée la température d'hyridation est de 55 C, de manière encore plus préférée la températue d'hybridation est de 60 C et de manière tout à fait ' préférée la température d'hybridation est de 65 C, suivi d'un ou plusieurs lavages effectué en tampon 2X SSC (le tampon IX SSC correspond à une solution aqueuse

0,15M NaCl, 15 mM de citrate de sodium) à une température comprise entre 55 C et 65 C, de manière préférée cette température est de 55 C, de manière encore plus préférée cette températue est de 60 C et de manière tout à fait préférée cette température est de 65 C, suivi d'un ou plusieurs lavages en tampon 0.5X SSC à une température comprise entre 55 C et 65 C, de manière préférée cette température est de 55 C, de manière encore plus préférée cette températue est de 60 C et de manière tout à fait préférée cette température est de 65 C.

Il va sans dire que les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon des techniques connues de l'homme du métier. Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'ouvrage de F. Ausubel et al (2002).

Par " variant " d'un acide nucléique selon l'invention, on entendra un acide nucléique qui diffère d'une ou plusieurs bases par rapport au polynucléotide de référence. Un acide nucléique variant peut être d'origine naturelle, tel qu'un variant allélique retrouvé naturellement, ou peut être aussi un variant non naturel obtenu par exemple par des techniques de mutagénèse.

En général, les différences entre l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique variant sont réduites de telle sorte que les séquences nucléotidiques de l'acide nucléique de référence et de l'acide nucléique variant sont très proches et, dans de nombreuses régions, identiques. Les modifications de nucléotides présentes dans un acide nucléique variant peuvent être silencieuses, ce qui signifie qu'elles n'altèrent pas les séquences d'aminoacides codées par ledit acide nucléique variant.

Cependant, les changements de nucléotides dans un acide nucléique variant peuvent aussi résulter de substitutions, additions, délétions dans le polypeptide codé par l'acide nucléique variant par rapport aux peptides codés par l'acide nucléique de référence. En outre, des modifications de nucléotides dans les régions codantes peuvent

produire des substitutions, conservatives ou non conservatives dans la séquence d'aminoacides.

De préférence, les acides nucléiques variants selon l'invention codent des polypeptides qui conservent sensiblement la même fonction ou activité biologique que le polypeptide de l'acide nucléique de référence ou encore la capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides codés par l'acide nucléique initial.

Certains acides nucléiques variants coderont ainsi des formes mutées des polypeptides dont l'étude systématique permettra de déduire des relations structure activité des protéines en question.

Par " variant " d'un polypeptide selon l'invention, on entendra principalement un polypeptide dont la séquence d'acides aminés contient une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions d'au moins un résidu d'acide aminé, par rapport à la séquence d'acides aminés du polypeptide de référence, étant entendu que les substitutions d'aminoacides peuvent être indifféremment conservatives ou non conservatives.

De préférence, les polypeptides variants selon l'invention conservent sensiblement la même fonction ou activité biologique que le polypeptide de référence ou encore la capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides initiaux.

Par polypeptide ayant " une activité similaire " à un polypeptide de référence au sens de l'invention, on entend un polypeptide ayant une activité biologique proche, mais pas nécessairement identique, de celle du polypeptide de référence tel que mesuré dans' un essai biologique convenable à la mesure de l'activité biologique du polypeptide de référence.

Par " antibiotique hybride " au sens de l'invention on entend un composé, généré par la construction d'une voie de biosynthèse artificielle utilisant la technologie de l'ADN recombinant.

Description détaillée de l'invention
La présente invention a plus particulièrement pour objet, de nouveaux gènes de la voie de biosynthèse des spiramycines et de nouveaux polypeptides impliqués dans cette biosynthèse tels que présentés dans la description détaillée ci-dessous.

Les gènes de la voie de biosynthèse ont été clonés et la séquence d'ADN de ces gènes a été déterminée. Les séquences obtenues ont été analysées grâce au programme FramePlot (Ishikawa J & Hotta K. 1999). On a identifié, parmi les phases ouvertes de lecture, les phases ouvertes de lecture présentant un usage des codons typiques de Streptomyces. Cette analyse a montré que cette région comporte 42 ORFs localisées de part et d'autre de cinq gènes codant l'enzyme polyketide synthase (PKS). De part et d'autre de ces cinq gènes codant des PKS, respectivement 10 et 32 ORFs ont été identifiées en aval et en amont (l'aval et l'amont étant définis par l'orientation des 5 gènes de PKS tous orientés dans le même sens) (cf. figure 3 et 37). Ainsi, les 32 phases ouvertes de lecture de ce type, occupant une région d'environ 40 kb (cf. SEQ ID N 1 présentant une première région de 31 kb contenant 25 ORFs et SEQ ID N 106 présentant une région d'environ 10,3 kb dont 1402 pb chevauchent la séquence précédente (SEQ ID N 1) et environ 9 kb correspondent à la suite de la séquence (avec cependant un région d'environ 450 nucléotides dont la séquence n'a pas été déterminée (région symbolisée par des N dans ladite séquence)), cette dernière partie de 9 kb contenant 7 ORFs supplémentaires (dont un ORF de séquence partielle, dûe à la région indéterminée), cf. également figure 3 et 37 et ci-dessous), ont été identifiées en amont des 5 gènes codant la PKS et 10 occupant une région d'environ Il,1 kb (SEQ ID N 2 et figure 3), ont été identifiées en aval des gènes de la PKS. Les 10 gènes situés en aval des 5 gènes PKS ont ainsi été nommés orfl *c, orf2*c, orf3*c, orf4*c, orf5*, orf6*, orf7*c, or/8* or/9* or/10* (SEQ ID N 3, 5, 7,9, 11, 13, 15,17, 19 et 21). Le c ajouté dans le nom du gène signifiant pour l'ORF en question que la séquence codante est dans l'orientation inverse (le brin codant est donc le brin complémentaire de la séquence donnée en SEQ ID N 2 pour ces gènes). En utilisant la même nomenclature, les 32 ORFs en amont des gènes de la PKS ont été nommés or/7, or/5, or/3, orf4, orf5, orf6,

orf7, orf8, orj9c, or/70, orfllc, orfl2, orfi3c, orfl4, orfl5c, orfl6, orfl7, orfl8, orfl9,

or/20, o7c, orf22c, orf23c, orf24c, orf25c, orf26, orj27, orj28c, orf29, orf30c, orf31 et orj32c (SEQ ID N 23,25, 28,30, 34,36, 40,43, 45,47, 49,53, 60,62, 64,66, 68, 70,72, 74,76, 78,80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, et 120) (cf. figure 3 et 37).

Les séquences protéiques déduites de ces phases ouvertes de lecture ont été comparées avec celles présentes dans différentes bases de données grâce à différents programmes : BLAST (Altschul et al., 1990) (Altschul et al., 1997), CD-search, COGs (Cluster of Orthologous Groups) (ces trois programmes sont accessibles notamment auprès du National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Bethesda, Maryland, USA)), FASTA ((Pearson W. R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990), BEAUTY (Worley K. C.. et al., 1995)), (ces deux programmes sont accessibles notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France). Ces comparaisons ont permis de formuler des hypothèses sur la fonction des produits de ces gènes et d'identifier ceux susceptibles d'être impliqués dans la biosynthèse des spiramycines.

Gènes situés en aval des gènes codant les PKS
Une représentation schématique de l'organisation de la région est présentée en figure 3. Ainsi qu'il sera démontré ci-dessous, sur les 10 gènes identifiés en aval des gènes codant les PKS 9 semblent impliqués dans la biosynthèse ou la résistance aux

spiramycines. Il s'agit des 9 gènes suivants : orfl *c, orf2*c, orf3*c, orf4*c, orf5*, or/6*, orf7*c, or/8* et or/9*.

Dans le tableau 1 suivant sont présentées les références à la séquence en ADN et en acides aminés des 10 gènes identifiés en aval des 5 gènes PKS.

Tableau 1

<tb>
<tb> Gène <SEP> Position <SEP> dans <SEP> la <SEP> Séquence <SEP> ADN <SEP> Séquences <SEP> polypeptidiques
<tb> séquence <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 2
<tb> orf1*c <SEP> 10882 <SEP> à <SEP> 10172 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 3 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 4
<tb>

Le c ajouté dans le nom du gène indique que la séquence codante est dans l'orientation inverse (le brin codant est donc le brin complémentaire de la séquence donnée en SEQ ID N 2 pour ces gènes).

Dans le but de déterminer la fonction des polypeptides identifiés, trois types d'expériences ont été menés : la comparaison des séquences identifiées avec des séquences de fonctions connues, des expériences d'inactivation de gènes, conduisant à la construction de souches mutantes et des analyses de la production en spiramycines et en intermédiaires de biosynthèse des spiramycines par ces souches mutantes.

Les séquences protéiques déduites de ces phases ouvertes de lecture ont tout d'abord été comparées avec celles présentes dans différentes bases de données grâce à différents programmes : BLAST (Altschul et al., 1990) (Altschul et al., 1997), CDsearch, COGs (Cluster of Orthologous Groups), FASTA ((Pearson W. R & D. J.

Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990), BEAUTY (Worley K. C.. et al., 1995)). Ces comparaisons ont permis de formuler des hypothèses sur la fonction des produits de ces gènes et d'identifier ceux susceptibles d'être impliqués dans la biosynthèse de spiramycine. Le tableau 2 montre les protéines présentant une forte similitude avec les produits 10 gènes situés en aval des 5 gènes PKS.

Tableau 2

<tb>
<tb> Produit <SEP> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> Numéro <SEP> d'accès <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> de <SEP> gène <SEP> similitude <SEP> significative <SEP> GenBank <SEP> BLAST*
<tb>

orfl *c TylMI(orf3 *) (S. fradiae) CAA57473 287 N-

<tb>
<tb> méthyltransférase
<tb> orf2*c <SEP> dnrQ <SEP> gene <SEP> product <SEP> AAD <SEP> 15266 <SEP> 153 <SEP> Inconnue
<tb> (Streptomyces <SEP> peucetius)
<tb> orf3 <SEP> *c <SEP> TylM#(orf2*) <SEP> (S. <SEP> fradiae) <SEP> CAA57472 <SEP> 448 <SEP> Glycosyltransféras
<tb> e
<tb> orf4*c <SEP> Crotonyl-CoA <SEP> réductase <SEP> NP~630556 <SEP> 772 <SEP> Crotonyl-CoA
<tb> (S. <SEP> coelicolor) <SEP> réductase
<tb> or/5* <SEP> MdmC <SEP> (S. <SEP> mycarofaciens) <SEP> B42719 <SEP> 355 <SEP> Ométhyltransférase
<tb> orf6* <SEP> 3-O-acyltransférase <SEP> (S. <SEP> Q00718 <SEP> 494 <SEP> Acyltransférase
<tb> mycarofaciens)
<tb> orf7*c <SEP> MdmA <SEP> (S. <SEP> A60725 <SEP> 380 <SEP> Protéine <SEP> impliquée
<tb> mycarofaciens) <SEP> dans <SEP> la <SEP> résistance
<tb> à <SEP> la <SEP> midécamycine
<tb> orj8* <SEP> ABC-transporteur <SEP> (S. <SEP> CAC22119 <SEP> 191 <SEP> ABC-transporteur
<tb> griseus)
<tb> orf9* <SEP> ABC-transporteur <SEP> (S. <SEP> CAC22118 <SEP> 269 <SEP> ABC-transporteur
<tb> griseus)
<tb> orf10* <SEP> putative <SEP> small <SEP> conserved <SEP> NP-627432 <SEP> 109 <SEP> Inconnue
<tb> hypothetical <SEP> protein <SEP> (S.
<tb> coelicolor)
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Des expériences d'inactivation de gènes ont été réalisées pour confirmer ces résultats.

Les méthodes utilisées consistent à effectuer un remplacement de gène. Le gène cible à interrompre est remplacé par une copie de ce gène interrompue par une cassette conférant la résistance à un antibiotique (par exemple l'apramycine, la généticine ou

l'hygromycine). Les cassettes utilisées sont bordées de part et d'autre par des codons de terminaison de la traduction dans toutes les phases de lecture et par des terminateurs de transcription actifs chez Streptomyces. L'insertion de la cassette dans le gène cible peut s'accompagner ou non d'une délétion dans ce gène cible. La taille des régions flanquant la cassette peut aller de quelques centaines à plusieurs milliers de paires de bases. Un deuxième type de cassettes peut être utilisé pour l'inactivation de gènes : des cassettes dites cassettes excisables . Ces cassettes présentent l'avantage de pouvoir être excisées chez Streptomyces par un événement de recombinaison de site spécifique après avoir été introduites dans le génome de S. ambofaciens. Le but est d'inactiver certains gènes dans des souches de Streptomyces sans laisser dans la souche finale de marqueurs de sélection ou de grandes séquences d'ADN n'appartenant pas à la souche. Après excision il subsiste uniquement une courte séquence d'une trentaine de paires de bases (appelé site cicatriciel ) dans le génome de la souche (cf. figure 10). La mise en oeuvre de ce système consiste, dans un premier temps, au remplacement de la copie sauvage du gène cible (grâce à deux événements de recombinaison homologue, cf. figure 9) par une construction dans laquelle une cassette excisable a été insérée dans ce gène cible. L'insertion de cette cassette est accompagnée d'une délétion dans le gène cible (cf. figure 9). Dans un deuxième temps, l'excision de la cassette excisable du génome de la souche est provoquée. La cassette excisable fonctionne grâce à un système de recombinaison site spécifique et a pour avantage de permettre l'obtention de mutants de Streptomyces ne portant finalement pas de gène de résistance. On s' affranchit également d'éventuels effets polaires sur l'expression des gènes situés en aval du ou des gènes inactivés (cf. figure 10). Les souches ainsi construites ont été testées pour leur production en spiramycines.

L'inactivation des gènes orfl *c, orf2*c, orf3*c et orf4*c n'a pas été effectuée car les expériences de comparaison de séquence ont permis de déterminer que ces gènes avaient une similitude relativement importante avec des gènes impliqués dans la biosynthèse d'un antibiotique relativement proche. Ainsi, le gène orfl *c code une protéine présentant une identité de 66% (déterminée grâce au programme BLAST) avec la protéine codée par gène tylMI qui code une N-méthyltransférase impliquée dans la

biosynthèse de tylosine et catalysant la 3 N-méthylation durant la production du mycaminose chez Streptomyces fradiae (Gandecha,A.R. et al., 1997 ; Numéro d'accès GenBank: CAA57473 ; Score BLAST: 287). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique relativement proche et plus particulièrement dans la biosynthèse du mycaminose suggère que le gène orfl*c code une N-methyltransférase responsable d'une N-méthylation lors de la biosynthèse de la forosamine ou du mycaminose (cf. figure 5 et 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf1*c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 3).

Tableau 3

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> méthyltransferase <SEP> (S. <SEP> antibioticus) <SEP> CAA05643 <SEP> 277 <SEP> méthyltransférase
<tb> N,N-diméthyltransferase <SEP> (S. <SEP> venezuelae) <SEP> AAC68678 <SEP> 268 <SEP> N,Ndiméthyltransférase
<tb> probable <SEP> N-méthylase <SEP> snogX <SEP> (S. <SEP> T46679 <SEP> 243 <SEP> N-méthyltransférase
<tb> nogalater)
<tb>
@ * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Le gène orf2*c code une protéine présentant une relative forte similitude (35% d'identité) avec une protéine codée par le gène tylMIII codant une NDP hexose 3,4 isomérase impliquée dans la biosynthèse de la tylosine chez Streptomyces fradiae (Gandecha,A.R., et al., 1997 ; Numéro d'accès GenBank : CAA57471 ; Score BMAST :
130). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche et plus particulièrement dans la biosynthèse du mycaminose

suggère fortement que le gène orf*2c code une NDP hexose 3,4 isomérase responsable d'isomérisation lors de la biosynthèse du mycaminose (cf. figure 5).

Le gène orj3*c code une protéine présentant une relative forte similitude (59% d'identité) avec une protéine codée par le gène tylMII codant une glycosyltransférase impliquée dans la biosynthèse de la tylosine chez Streptomycesfradiae (Gandecha,A.R. et al., 1997; Numéro d"accès GenBank: CAA57472; Score BLAST : 448). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orf*3c code une glycosyltransférase.

Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène or/3 *c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 4).

Tableau 4

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> Glycosyl <SEP> transférase <SEP> (S. <SEP> venezuelae) <SEP> AAC68677 <SEP> 426 <SEP> Glycosyltransférase
<tb> Glycosyltransférase <SEP> (S. <SEP> antibioticus) <SEP> CAA05642 <SEP> 425 <SEP> Glycosyltransférase
<tb> Glycosyltransférase <SEP> CAA74710 <SEP> 395 <SEP> Glycosyltransférase
<tb> (Saccharopolyspora <SEP> erythraea)
<tb> Glycosyltransférase <SEP> (S. <SEP> antibioticus) <SEP> CAA05641 <SEP> 394 <SEP> Glycosyltransférase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Le gène orf4 *c code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs crotonyl-CoA réductases. Notamment, la protéine codée par orf4*c possède une similitude importante avec une crotonyl CoA réductase de chez Streptomyces coelicolor (Redenbach,M et al., 1996 ; Numéro d'accès GenBank : NP~630556 ; Score

BLAST : 772). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orf4*c code également une crotonyl-CoA réductase. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf4*c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 5).

Tableau 5

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> trans-2-énoyl-CoA <SEP> réductase <SEP> S72400 <SEP> 764 <SEP> trans-2-énoyl-CoA
<tb> (EC1.3.1.38) <SEP> (S. <SEP> collinus) <SEP> réductase
<tb> Crotonyl <SEP> CoA <SEP> réductase <SEP> (S. <SEP> fradiae) <SEP> CAA57474 <SEP> 757 <SEP> Crotonyl <SEP> CoA <SEP> réductase
<tb> Crotonyl-CoA <SEP> réductase <SEP> (S. <SEP> AAD53915 <SEP> 747 <SEP> Crotonyl-CoA <SEP> réductase
<tb> cinnamonensis)
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Le gène orf6* présente une certaine similitude avec le gène mdmB présent chez Streptomyces mycarofaciens (Hara et Hutchisnson, 1992 ; numéro d'accès GenBank : A42719 ; Score BLAST : producteur d'antibiotique macrolide. Chez ce producteur, le gène est impliqué dans l'acylation du cycle lactone. Le gène or/6* coderait donc une acyltransférase. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf6* présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 6).

Tableau 6

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> similitude <SEP> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> AcyA <SEP> (Streptomyces <SEP> J4001 <SEP> 450 <SEP> macrolide <SEP> 3-O-acyltransférase
<tb> thermotolerans)
<tb> Midécamycine <SEP> 4"-O- <SEP> BAA09815 <SEP> 234 <SEP> Midécamycine <SEP> 4"-O-propiony
<tb> propionyl <SEP> transférase <SEP> (S. <SEP> transférase
<tb> mycarofaciens)
<tb>

MycaroseO-acyltransférase AAG13909 189 Mycarose O-acyltransférase

<tb>
<tb> (Micromonospora
<tb> megalomicea <SEP> subsp. <SEP> Nigra)
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

L'inactivation du gène or/6* a été réalisée par une délétion/insertion en phase et il a été montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycine II et III mais uniquement de la spiramycine I (cf figure 1). Ceci confirme que le gène orf6* est bien impliqué dans la synthèse de spiramycine II et III. L' enzyme codée par ce gène est responsable de la formation de spiramycine II et III par fixation d'un groupement acétyl ou butyryl sur le carbone 3. Les souches n'exprimant plus la protéine codée par le gène orf6* sont particulièrement intéressantes puisqu'elles ne produisent plus de spiramycine II et III mais seulement de la spiramycine I. Comme il a été précisé ci-dessus, l'activité antibiotique de la spiramycine I est nettement supérieure à celle des spiramycines II et III (Liu et al., 1999).

Le gène or/?*code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs O-méthyltransférase. Notamment, la protéine codée par orf5* possède une similitude importante avec une O-méthyltransférase (EC 2. 1.1.-) MdmC de

Streptomyces mycarofaciens (Hara & Hutchinson, 1992 ; Numéro d'accès GenBank :B42719; Score BLAST : 355). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique suggère fortement que le gène or/5* code également une O-méthyltransférase. Le gène orf5* serait impliqué dans la formation de précurseurs incorporés dans le cycle lactone. En effet, d'après les comparaisons de séquences, le produit du gène orf5 est également relativement proche de FkbG qui est responsable de la méthylation de l'hydroxymalonyl-ACP d'après (Wu et al., 2000 ; Hoffmeister et al., 2000 ; Numéro d'accès GenBank : AAF86386 ; Score BLAST : 247) (cf. figure 8). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène or/5* présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 7).

Tableau 7

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> Probable <SEP> O-méthyltransferase <SEP> (EC <SEP> T18553 <SEP> 223 <SEP> O-méthyltransférase
<tb> 2.1.1.-) <SEP> safC <SEP> (Myxococcus <SEP> xanthus)
<tb> 4-O-méthyltransferase <SEP> (EC <SEP> 2.1.1.-) <SEP> - <SEP> JC4004 <SEP> 222 <SEP> O-méthyltransférase
<tb> (Streptomyces <SEP> sp.)
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Grâce à l'effet polaire de l'insertion d'une cassette non excisée dans le gène or/6*, il a pu être déterminé que le gène orf 5* est essentiel à la voie de biosynthèse des spiramycines. En effet, l'insertion de la cassette excisable dans la partie codante du gène orf 6* entraîne un arrêt total de la production en spiramycines. Cependant, une fois que la cassette insérée a été excisée (et donc lorsque seul le gène orf6* est inactivé, cf exemples 14 et 15), on retrouve une production en spiramycine I. Ceci montre que le

gène orf 5* est essentiel à la voie de biosynthèse des spiramycines puisque son inactivation entraîne un arrêt total de la production en spiramycines.

Le gène orf7*c code une protéine présentant une relative forte similitude avec une protéine codée par le gène mdmA de Streptomyces mycarofaciens, ce dernier codant une protéine impliquée dans la résistance à la midécamycine chez cet organisme producteur (Hara et al., 1990 ; Numéro d'accès GenBank : A60725 ; Score BLAST : 380). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique suggère fortement que le gène orf7*c code également une protéine impliquée dans la résistance à la spiramycine. Plus particulièrement, l'enzyme codée par le gène orf7*c possède une activité méthyltransférase et est impliquée dans la résistance à la spiramycine chez Streptomyces ambofaciens. Il a été démontré que ce gène confère une résistance de type MLS I, résistance dont on sait qu'elle est dûe à la monométhylation en position A2058 de l'ARN ribosomal 23S (Pernodet et al., 1996). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf7*c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 8).

Tableau 8

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb>

maerolide-lincosamide-streptograminB JC5319 238 23S rRNA

<tb>
<tb> résistance <SEP> déterminant <SEP> (S. <SEP> fradiae) <SEP> méthyltransférase
<tb> 23S <SEP> ribosomal <SEP> RNA <SEP> methyltransferase <SEP> AAL68827 <SEP> 119 <SEP> 23S <SEP> rRNA
<tb> ErmML <SEP> (Micrococcus <SEP> luteus) <SEP> méthyltransférase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Le gène orf8* code une protéine présentant une relative forte similitude avec une protéine de type transporteur ABC chez Streptomyces griseus (Campelo, 2002, Numéro d'accés GenBank : CAC22119 ; Score BLAST : 191). Cette similitude avec une protéine de type transporteur ABC suggère fortement que le gène orj8* code également une protéine de type transporteur ABC pouvant être impliquée dans la résistance à la spiramycine. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf8* présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 9).

Tableau 9

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> d'accès <SEP> Score <SEP> Fonction
<tb> significative <SEP> GenBank <SEP> BLAST* <SEP> rapportée
<tb> AcrW <SEP> (Streptomyces <SEP> galilaeus) <SEP> BAB72060 <SEP> 94 <SEP> Transporteur
<tb> ABC
<tb> Daunorubicin <SEP> résistance <SEP> transmembrane <SEP> P32011 <SEP> 89 <SEP> Résistance <SEP> à <SEP> la
<tb> protéine <SEP> (Streptomyces <SEP> peucetius) <SEP> daunorubicine
<tb> Probable <SEP> ABC-transporter, <SEP> NP~626506 <SEP> 89 <SEP> Transporteur
<tb> transmembrane <SEP> component. <SEP> ABC
<tb> (Streptomyces <SEP> coelicolor)
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Le gène or/9* code une protéine présentant une relative forte similitude avec une protéine de type transporteur ABC chez Streptomyces griseus (Campelo, 2002, Numéro d'accès GenBank : CAC22118 ; Score BLAST : 269). Cette similitude avec une protéine de type transporteur ABC suggère fortement que le gène or/9* code également une protéine de type transporteur ABC pouvant être impliquée dans la résistance à la spiramycine. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène

orf8* présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 10).

Tableau 10

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> significative <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction
<tb> d'accès <SEP> BLAST* <SEP> rapportée
<tb> GenBank
<tb> Probable <SEP> ABC-type <SEP> transport <SEP> protein, <SEP> ATP- <SEP> NP~626505 <SEP> 231 <SEP> Transporteur
<tb> binding <SEP> component <SEP> (S. <SEP> coelicolor) <SEP> ABC
<tb> Putative <SEP> ABC <SEP> transporter <SEP> ATP-binding <SEP> NP~627624 <SEP> 228 <SEP> Transporteur
<tb> component <SEP> (Streptomyces <SEP> Coelicolor) <SEP> ABC
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Le gène orflO* code une protéine présentant une relative forte similitude avec une protéine de fonction inconnue. Cependant des gènes similaires à orf10* sont retrouvés au milieu de plusieurs groupes de gènes impliqués dans la biosynthèse d'antibiotiques.

Ainsi un gène proche de or/10* est retrouvé chez S. coelicolor (Redenbach et al., 1996, numéro d'accès GenBank : NP~627432, score BLAST : 109). Un gène proche (CouY) est également retrouvé chez S. rishiriensis (Wang et al., 2000, numéro d'accès GenBank : AAG29779, score BLAST 97).

Gènes situés en amont des gènes codant les PKS
Dans la séquence d'ADN située en amont des gènes codant les PKS (l'aval et l'amont étant défini par l'orientation des 5 gènes de PKS tous orientés dans le même sens) (cf. figure 3), 32 ORFs ont été identifiées (cf. ci-dessus). Ainsi, les 32 phases ouvertes de lecture de ce type, occupent une région d'environ 40 kb (cf. SEQ ID N 1 présentant une première région de 31 kb contenant 25 ORFs et SEQ ID N 106

présentant une région d'environ 10,3 kb dont 1402 pb chevauchent la séquence précédente (SEQ ID N 1) et environ 9 kb correspondent à la suite de la séquence (avec cependant un région d'environ 450 nucléotides dont la séquence n'a pas été déterminée (région symbolisée par des N dans ladite séquence)), cette dernière partie de 9 kb contient 7 ORFs supplémentaires (dont une ORF de séquence partielle, dûe à la séquence indéterminée (orf28c)), cf. également figure 3 et 37 et ci-dessous). Une représentation schématique de l'organisation de la région est présentée en figure 5 et 37.

Les 32 gènes identifiés ont été nommés : or/7, or/2, or/3, orf4, orf5, orf6, or/7, orf8,

orj9c, orfl0, orj11c, orfl2, orj73c, orfl4, orfi5c, orj76, orj77, orfl8, orfl9, orf20, orfllc, orJ22c, orf23c, orf24c, orfl5c, orf26, orfl7, orf28c, orfl9, orj30c, orj3l et orf32c.

Dans le tableau 11suivant sont présentées les références à la séquence en ADN et en acides aminés des 32 gènes identifiés en amont des 5 gènes PKS.

Tableau 11

<tb>
<tb> Gène' <SEP> Position <SEP> dans <SEP> la <SEP> Séquence <SEP> ADN <SEP> Séquence(s) <SEP> polypeptidique(s)2
<tb> séquence <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 1
<tb> orf1 <SEP> 658 <SEP> à <SEP> 1869 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 23 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 24
<tb> orf2 <SEP> 1866 <SEP> à <SEP> 2405 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 25 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 26 <SEP> et <SEP> 27
<tb> or/3 <SEP> 2402 <SEP> à <SEP> 3568 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 28 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 29
<tb> orf4 <SEP> 3565 <SEP> à <SEP> 4473 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 30 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 31, <SEP> 32 <SEP> et <SEP> 33 <SEP>
<tb> orf5 <SEP> 4457 <SEP> à <SEP> 5494 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 34 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 35
<tb> orf6 <SEP> 5491 <SEP> à <SEP> 6294 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 36 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 37, <SEP> 38 <SEP> et <SEP> 39
<tb> orf7 <SEP> 6296 <SEP> à <SEP> 7705 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 40 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 41 <SEP> et <SEP> 42
<tb> orf8 <SEP> 8011 <SEP> 1 <SEP> à <SEP> 9258 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 43 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 44
<tb> orj9c <SEP> 10081 <SEP> à <SEP> 9362 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 45 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 46
<tb>

<tb>
<tb> orflO <SEP> 10656 <SEP> à <SEP> 12623 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 47 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 48 <SEP>
<tb> orfllc <SEP> 14482 <SEP> à <SEP> 12734 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 49 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 50, <SEP> 51 <SEP> et <SEP> 52
<tb> orfl2 <SEP> 14601 <SEP> à <SEP> 16031 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 53 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 54,55, <SEP> 56,57, <SEP> 58 <SEP> et <SEP> 59
<tb> orfl3c <SEP> 17489 <SEP> à <SEP> 16092 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 60 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 61
<tb> or/14 <SEP> 17809 <SEP> à <SEP> 18852 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 62 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 63
<tb> orfl5c <SEP> 20001 <SEP> à <SEP> 18961 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 64 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 65
<tb> or)76 <SEP> 20314 <SEP> à <SEP> 21552 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 66 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 67 <SEP> ~~~~~~~~~~
<tb> or/77 <SEP> 21609 <SEP> à <SEP> 22879 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 68 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 69 <SEP> ~~~~~~~
<tb> orfl8 <SEP> 22997 <SEP> à <SEP> 24175 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 70 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 71
<tb> orfl9 <SEP> 24177 <SEP> à <SEP> 25169 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 72 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 73 <SEP>
<tb> or/20 <SEP> 25166 <SEP> à <SEP> 26173 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 74 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 75
<tb>

orj21c 27448 à 26216 SEQ ID N 76 SEQ ID N 77 ~~~~~~~~~~~

<tb>
<tb> orj22c <SEP> 28560 <SEP> à <SEP> 27445 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 78 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 79 <SEP> ~~~~~~~~~~~
<tb> orj23c <SEP> 29770 <SEP> à <SEP> 28649 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 80 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 81
<tb> orj24c <SEP> 30074 <SEP> à <SEP> 29763 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 82 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 83
<tb> orj25c <SEP> 30937 <SEP> à <SEP> 30071 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 84 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 85
<tb> Gène1 <SEP> Position <SEP> dans <SEP> la <SEP> Séquence <SEP> ADN <SEP> Séquence(s) <SEP> polypeptidique(s)2
<tb> séquence <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP>
<tb> 106
<tb> or/26 <SEP> 1647 <SEP> à <SEP> 2864 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 107 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 108
<tb> or/27 <SEP> 2914 <SEP> à <SEP> 3534 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 109 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 110
<tb> orf28c <SEP> débute <SEP> à <SEP> la <SEP> position <SEP> 4973 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 111 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 112
<tb> or/29 <SEP> 5662 <SEP> à <SEP> 6669 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 113 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 114
<tb> orf30c <SEP> 7729 <SEP> à <SEP> 6692 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 115 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 116 <SEP> et <SEP> 117
<tb> or/31 <SEP> 7760 <SEP> à <SEP> 8734 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 118 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 119
<tb>

<tb>
<tb> orf32c <SEP> 10209 <SEP> à <SEP> 8983 <SEP> SEQIDN <SEP> 120 <SEP> SEQIDN <SEP> 121
<tb>

1 Le c ajouté dans le nom du gène indique que la séquence codante est dans l'orientation inverse (le brin codant est donc le brin complémentaire de la séquence donnée en SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 106 pour ces gènes).

2 Lorsque plusieurs séquences protéiques sont indiquées pour une seule orf, les protéines correspondantes sont issues de plusieurs sites possibles de démarrage de la traduction.

Dans le but de déterminer la fonction des polypeptides identifiés dans le tableau 11 ci-dessus, trois types d'expériences ont été menées : la comparaison de l'identité des séquences identifiées avec des séquences de fonctions connues, des expériences d'inactivation de gènes et des analyses de la production en spiramycines de ces souches mutantes.

Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990), BEAUTY (Worley K. C.. et al., 1995)), (cf. cidessus). Ces comparaisons ont permis de formuler des hypothèses sur la fonction des produits de ces gènes et d'identifier ceux susceptibles d'être impliqués dans la biosynthèse de spiramycine. Le tableau 12 montre les protéines présentant une forte similitude avec les 32 gènes situés en amont des 5 gènes PKS.

Tableau 12

<tb>
<tb> Gène <SEP> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST* <SEP> rapportée
<tb> GenBank
<tb>

orfl Cytochrome P450 tylI (Streptomyces S49051 530 Cytochrome

<tb>
<tb> fradiae) <SEP> P450
<tb>

<tb>
<tb> orf2 <SEP> ORF15x4 <SEP> (Listonella <SEP> anguillarum) <SEP> AAB81630 <SEP> 113 <SEP> Inconnue
<tb> or/3 <SEP> aminotransferase-like <SEP> protein <SEP> AAF59939 <SEP> 431 <SEP> Amino-
<tb> (Streptomyces <SEP> antibioticus) <SEP> transférase
<tb> orf4 <SEP> alpha-D-glucose-1-phosphate <SEP> AAC68682 <SEP> 404 <SEP> alpha-D-glucosethymidylyltransferase <SEP> (Streptomyces <SEP> 1-phosphate
<tb> venezuelae) <SEP> thymidylyltransfé
<tb> rase
<tb> orf5 <SEP> AprE <SEP> (Streptomyces <SEP> tenebrarius) <SEP> AAG18457 <SEP> 476 <SEP> dTDP-glucose
<tb> 4,6-déshydratase
<tb> orf6 <SEP> Thioesterase <SEP> (Streptomyces <SEP> avermitilis) <SEP> BAB69315 <SEP> 234 <SEP> Thioestérase
<tb> orf7 <SEP> TylCVI <SEP> (Streptomyces <SEP> fradiae) <SEP> AAF29379 <SEP> 461 <SEP> dNTP <SEP> hexose <SEP>
<tb> 2,3-déshydratase
<tb> orf8 <SEP> probable <SEP> aminotransferase <SEP> AAG23279 <SEP> 465 <SEP> Aminotransférase
<tb> (Saccharopolyspora <SEP> spinosa)
<tb> orj9c <SEP> SrmX <SEP> (Streptomyces <SEP> ambofaciens) <SEP> S25204 <SEP> 445 <SEP> Méthyltransférase
<tb> orf10 <SEP> SrmR <SEP> (Streptomyces <SEP> ambofaciens) <SEP> S25203 <SEP> 1074 <SEP> Protéine <SEP> de
<tb> régulation
<tb> orf11c <SEP> SrmB <SEP> (Streptomyces <SEP> ambofaciens) <SEP> S25202 <SEP> 955 <SEP> Résistance <SEP> à <SEP> la
<tb> spiramycine
<tb> or/72 <SEP> UrdQ <SEP> (Streptomyces <SEP> fradiae) <SEP> AAF72550 <SEP> 634 <SEP> NDP-hexose <SEP> 3,4déshydratase
<tb> orfl3c <SEP> SC4H2.17 <SEP> (Streptomyces <SEP> coelicolor) <SEP> T35116 <SEP> 619 <SEP> Inconnue
<tb> orfl4 <SEP> putative <SEP> reductase <SEP> (Streptomyces <SEP> CAB90862 <SEP> 147 <SEP> Réductase
<tb> coelicolor)
<tb> orf15c <SEP> Probable <SEP> 3-ketoreductase <SEP> (Streptomyces <SEP> T51102 <SEP> 285 <SEP> 3-cétoréductase
<tb> antibioticus)
<tb> or/26 <SEP> Hypothetical <SEP> NDP <SEP> hexose <SEP> 3,4 <SEP> CAA57471 <SEP> 209 <SEP> NDP <SEP> hexose <SEP> 3,4 <SEP>
<tb> isomerase <SEP> (Streptomyces <SEP> fradiae) <SEP> isomérase
<tb> orf17 <SEP> Glycosyl <SEP> transférase <SEP> (Streptomyces <SEP> AAC68677 <SEP> 400 <SEP> Glycosyl
<tb> venezuelae) <SEP> transférase
<tb>

<tb>
<tb> orfl8 <SEP> Glycosyl <SEP> transférase <SEP> (Streptomyces <SEP> AAG29785 <SEP> 185 <SEP> Glycosyl
<tb> rishiriensis) <SEP> transférase
<tb> orfl9 <SEP> NDP-hexose <SEP> 4-cétoreductase <SEP> TylCIV <SEP> AAD41822 <SEP> 266 <SEP> NDP-hexose <SEP> 4-
<tb> (Streptomyces <SEP> fradiae) <SEP> cétoréductase
<tb> or/20 <SEP> EryBII <SEP> (Saccharopolyspora <SEP> erythraea) <SEP> AAB84068 <SEP> 491 <SEP> aldocéto
<tb> réductase
<tb> or/2 <SEP> le <SEP> TylCIII <SEP> (Streptomyces <SEP> fradiae) <SEP> AAD41823 <SEP> 669 <SEP> NDP-hexose <SEP> 3-Cméthyltransférase
<tb> orj22c <SEP> FkbH <SEP> (Streptomyces <SEP> hygroscopicus) <SEP> AAF86387 <SEP> 463 <SEP> Impliqué <SEP> dans <SEP> la
<tb> biosynthèse <SEP> du
<tb> méthoxymalonyl
<tb> orf23c <SEP> FkbI <SEP> (Streptomyces <SEP> hygroscopicus) <SEP> AAF86388 <SEP> 387 <SEP> Acyl <SEP> CoA
<tb> déshydrogénase
<tb> orj24c <SEP> FkbJ <SEP> (Streptomyces <SEP> hygroscopicus) <SEP> AAF86389 <SEP> 87 <SEP> Impliqué <SEP> dans <SEP> la
<tb> biosynthèse <SEP> du
<tb> méthoxymalonyl
<tb> orf25c <SEP> FkbK <SEP> (Streptomyces <SEP> hygroscopicus) <SEP> AAF86390 <SEP> 268 <SEP> Acyl <SEP> CoA
<tb> déshydrogénase
<tb> orj26 <SEP> TylCV <SEP> (Streptomyces <SEP> fradiae) <SEP> AAD41824 <SEP> 471 <SEP> Mycarosyl
<tb> transferase
<tb> or/27 <SEP> TylCVII <SEP> (Streptomyces <SEP> fradiae) <SEP> AAD41825 <SEP> 243 <SEP> NDP-hexose <SEP> 3,5-
<tb> (ou <SEP> 5-) <SEP> épimerase
<tb> orf28c <SEP> AcyB2 <SEP> (Streptomyces <SEP> thermotolerans) <SEP> JC2032 <SEP> 329 <SEP> protéine
<tb> régulatrice
<tb> or/29 <SEP> Béta-manannase <SEP> (Sorangium <SEP> AAK19890 <SEP> 139 <SEP> Glycosyl
<tb> cellulosum) <SEP> hydrolase
<tb> orf30c <SEP> Epimérase <SEP> de <SEP> sucre-nucléoside- <SEP> NP~600590 <SEP> 89 <SEP> Epimérase <SEP> de
<tb> diphosphate <SEP> (Corynebacterium <SEP> sucre-nucléosideglutamicum) <SEP> diphosphate
<tb>

<tb>
<tb> or/37 <SEP> Oxidoréductase <SEP> (Streptomyces <SEP> NP~631148 <SEP> 261 <SEP> Oxidoréductase
<tb> coelicolor)
<tb> orf32c <SEP> Protéine <SEP> régulatrice <SEP> de <SEP> la <SEP> famille <SEP> GntR <SEP> NP~625576 <SEP> 229 <SEP> Protéine
<tb> (Streptomyces <SEP> coelicolor) <SEP> régulatrice
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Des expériences d'inactivation de gènes ont été réalisées pour confirmer ces résultats. Les méthodes utilisées consistent à effectuer un remplacement de gène. Le gène cible à interrompre est remplacé par une copie de ce gène interrompue par une cassette conférant la résistance à un antibiotique (par exemple l'apramycine ou l'hygromycine). Les cassettes utilisées sont bordées de part et d'autre par des codons de terminaison de la traduction dans toutes les phases de lecture et par des terminateurs de transcription actifs chez Streptomyces. L'insertion de la cassette dans le gène cible peut s'accompagner ou non d'une délétion dans ce gène cible. La taille des régions flanquant la cassette peut aller de quelques centaines à plusieurs milliers de paires de bases. Un deuxième type de cassettes peut être utilisé pour l'inactivation de gènes : des cassettes dites cassettes excisables (cf. ci dessus). Les souches ainsi construites ont été testées pour leur production en spiramycines.

Le gène orf1 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs cytochrome P450. Notamment, la protéine codée par orfl possède une similitude importante avec la protéine codée par le gène tylI impliquée dans la biosynthèse de tylosine chez Streptomyces fradiae (Merson-Davies,L.A. et al., 1994 ; Numéro d'accès GenBank : S49051 ; Score BLAST : 530). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orfl code également une cytochrome P450. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf1 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 13).

Tableau 13

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> Putative <SEP> cytochrome <SEP> P450 <SEP> YJIB <SEP> 034374 <SEP> 248 <SEP> Cytochrome <SEP> P450
<tb> (Bacillus <SEP> subtilis)
<tb> Cytochrome <SEP> P450 <SEP> 113AI <SEP> P48635 <SEP> 237 <SEP> Cytochrome <SEP> P450
<tb> (Saccharopolyspora <SEP> erythraea)
<tb> Cytochrome <SEP> P-450 <SEP> hydroxylase <SEP> AAC46023 <SEP> 208 <SEP> Cytochrome <SEP> P-450
<tb> homolog <SEP> (Streptomyces <SEP> caelestis) <SEP> hydroxylase
<tb> Cytochrome <SEP> P450 <SEP> monooxygénase <SEP> AAC64105 <SEP> 206 <SEP> Cytochrome <SEP> P450
<tb> (Streptomyces <SEP> venezuelae) <SEP> monooxygénase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Le gène or/2 code une protéine présentant une similitude avec plusieurs protéines de fonctions inconnues (cf. Tableau 14). Notamment, la protéine codée par or/2 possède une similitude relativement importante avec la protéine codée par le gène ORF15x4 de Listonella anguillarum (numéro d'accès GenBank : AAB81630 ; Score BLAST : 113) de fonction inconnue.

Tableau 14

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> unknown(Campylobacterjejuni) <SEP> AAK12959 <SEP> 106 <SEP> Inconnue
<tb>

<tb>
<tb> WcgF <SEP> (Bacteroides <SEP> fragilis) <SEP> AA <SEP> D56738 <SEP> 105 <SEP> Inconnue
<tb> unknown <SEP> (Leptospira <SEP> borgpetersenii) <SEP> AAD12964 <SEP> 96 <SEP> Inconnue
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Le gène or/2 n'ayant pas d'homologue de fonction connue, son inactivation a été réalisée. Il a pu être montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycines.

Ceci confirme que le gène or/2 est bien impliqué dans la biosynthèse des spiramycines. La protéine codée par ce gène régule ou est responsable d'une étape de bioconversion essentielle à la biosynthèse des spiramycines.

Le gène or/3 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs aminotransférases. Notamment, la protéine codée par or/3 possède une similitude importante avec une aminotransférase de Streptomyces antibioticus impliquée dans la biosynthèse de l'oléandomycine (Draeger, G., et al.,1999 ; Numéro d'accès GenBank: AAF59939 ; Score BLAST: 431). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orf3 code une 3 amino-transférase responsable de la réaction de transamination nécessaire à la biosynthèse d'un des sucres aminés des spiramycines (cf. figure 5). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène or/3 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 15).

Tableau 15

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> Aminotransférase <SEP> (Streptomyces <SEP> T51111 <SEP> 429 <SEP> Aminotransférase
<tb> antibioticus)
<tb>

<tb>
<tb> Transaminase <SEP> (Streptomyces <SEP> AAC68680 <SEP> 419 <SEP> Transaminase
<tb> venezuelae)
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

L'inactivation du gène or/3 a été réalisée. Il a ainsi pu être montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycines. Ceci confirme que le gène or/3 est bien impliqué dans la biosynthèse des spiramycines. L'enzyme codée par ce gène est donc bien responsable d'une étape de bioconversion essentielle à la biosynthèse des spiramycines. La production de spiramycines peut être complémentée par l'expression de la protéine TylB de S. fradiae (cf exemple 23). Ceci démontre que le gène or/3 code une 3 amino-transférase responsable de la réaction de transamination nécessaire à la biosynthèse du mycaminose (cf. figure 5). Comme le mycaminose est le premier sucre à être fixé sur le platénolide, il est attendu que la souche interrompue dans orf3 (OS49. 67) accumule du platénolide.

Les intermédaires de biosynthèse de la souche interrompue dans le gène or/3 ont été étudiés (cf. exemple 20). Ces expériences ont permis de démontrer que cette souche produit deux formes de platénolide : le platénolide A et le platénolide B, la structure déduite de ces deux molécules est présentée en figure 36.

Le gène orf4 code une protéine présentant une relative forte similitude avec

plusieurs NDP-glucose synthétases. Notamment, la protéine codée par orf4 possède une similitude importante avec une alpha-D-glucose-1-phosphate thymidylyltransférase de Streptomyces venezuelae (Xue Y et al.,1998 ; Numéro d'accès GenBank : AAC68682 ; Score BLAST 404). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orf4 code une NDP-glucose syntéthase responsable de la synthèse du NDP-glucose nécessaire à la biosynthèse des trois sucres atypiques incorporés dans la molécule de spiramycine (cf. figure 4,5 et 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène

orf4 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 16).

Tableau 16

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> Glucose-1-phosphate <SEP> BAA84594 <SEP> 402 <SEP> Glucose-1-phosphate
<tb> thymidyltransférase <SEP> (Streptomyces <SEP> thymidyltransférase
<tb> avermitilis)
<tb> AclY <SEP> (Streptomyces <SEP> galilaeus) <SEP> BAB72036 <SEP> 400 <SEP> dTDP-1-glucose
<tb> synthétase
<tb> Putative <SEP> glucose-1-phosphate <SEP> AAK83289 <SEP> 399 <SEP> glucose-1-phosphate
<tb> thymidyltransférase <SEP> thymidyltransférase
<tb> (Saccharopolyspora <SEP> spinosa)
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Le gène orf5 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs glucose déshydratases. Notamment, la protéine codée par orf5 possède une similitude importante avec une dTDP-glucose 4,6-déshydratase de Streptomyces tenebrarius (Li,T.B. et a/.,2001; Numéro d'accès GenBank : AAG18457, Score BLAST : 476). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orf5 code une NDP glucose déshydratase nécessaire à la biosynthèse des trois sucres atypiques incorporés dans la molécule de spiramycine (cf. figure 4,5 et 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf5 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 17).

Tableau 17

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> DTDP-glucose <SEP> 4,6-déshydratase <SEP> AAK83290 <SEP> 464 <SEP> DTDP-glucose <SEP> 4,6-
<tb> (Saccharopolyspora <SEP> spinosa) <SEP> déshydratase
<tb> thymidine <SEP> diphosphoglucose <SEP> 4,6- <SEP> AAA68211 <SEP> 445 <SEP> thymidine
<tb> déshydratase <SEP> (Saccharopolyspora <SEP> diphosphoglucose
<tb> erythraea) <SEP> 4,6-déshydratase
<tb> dTDPglucose <SEP> 4,6-déshydratase <SEP> (EC <SEP> S49054 <SEP> 443 <SEP> dTDPglucose <SEP> 4,6-
<tb> 4.2.1.46) <SEP> - <SEP> (Streptomyces <SEP> fradiae) <SEP> déshydratase
<tb> TDP-glucose-4,6-déshydratase <SEP> AAC68681 <SEP> 421 <SEP> TDP-glucose-4,6-
<tb> (Streptomyces <SEP> venezuelae) <SEP> déshydratase
<tb> SgcA <SEP> (Streptomyces <SEP> globisporus) <SEP> AAF13998 <SEP> 418 <SEP> dNDP-glucose-4,6déshydratase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Le gène orf6 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs thioestérases. Notamment, la protéine codée par orf6 possède une similitude importante avec une thioestérase de Streptomyces avermitilis (Omura, S. et al., 2001 ;
Numéro d'accès GenBank : BAB69315 ; Score BLAST : 234). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orf6 code également une thioestérase. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf6 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 18).

Tableau 18

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> RifR <SEP> (Amycolatopsis <SEP> mediterranei) <SEP> AAG52991 <SEP> 216 <SEP> Thioestérase
<tb> Thioestérase <SEP> - <SEP> (Streptomyces <SEP> fradiae) <SEP> S49055 <SEP> 215 <SEP> Thioestérase
<tb> Thioestérase <SEP> (Streptomyces <SEP> BAB69188 <SEP> 213 <SEP> Thioestérase
<tb> avermitilis)
<tb> Thioestérase <SEP> II <SEP> (EC <SEP> 3.1.2.-) <SEP> - <SEP> T17413 <SEP> 203 <SEP> Thioestérase
<tb> (Streptomyces <SEP> venezuelae)
<tb> Piml <SEP> protein <SEP> (Streptomyces <SEP> natalensis) <SEP> CAC20922 <SEP> 201 <SEP> Thioestérase
<tb> Thioestérase <SEP> (Streptomyces <SEP> griseus) <SEP> CAC22116 <SEP> 200 <SEP> Thioestérase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Le gène orf7 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs hexose déshydratases. Notamment, la protéine codée par orf6 possède une similitude importante avec une dNTP hexose 2,3-déshydratase (codée par lé gène TylCVI) de Streptomyces fradiae impliquée dans la biosynthèse de la tylosine (MersonDavies,L.A. et al., 1994 ; Numéro d'accès GenBank : AAF29379 ; Score BLAST : 461).

Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orf7 code également une hexose 2-3 déshydratase nécessaire à la biosynthèse de deux sucres atypiques incorporés dans la molécule de spiramycine (cf. figure 4 et 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf7 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 19).

Tableau 19

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> Rifl8 <SEP> (Amycolatopsis <SEP> mediterranei) <SEP> AAG52988 <SEP> 459 <SEP> Hexose <SEP> déshydratase
<tb> SimB3 <SEP> (Streptomyces <SEP> antibioticus) <SEP> AAK06810 <SEP> 444 <SEP> dNDP-4-keto-6-déoxyglucose-2,3-déshydratase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Le gène orf8 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs aminotransférases. Notamment, la protéine codée par or/8 possède une similitude importante avec une aminotransférase probablement impliquée dans la biosynthèse de la forosamine chez Saccharopolyspora spinosa (Waldron,C. et al., 2001 ; Numéro d'accès GenBank : AAG23279 ; score BLAST : Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orf8 code une 4 amino-transférase responsable de la réaction de transamination nécessaire à la biosynthèse de la forosamine (cf. figure 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène or/8 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 20).

Tableau 20

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> Putative <SEP> amino-sugar <SEP> biosynthesis <SEP> CAA07666 <SEP> 213 <SEP> Proteine <SEP> impliquée <SEP> dans <SEP> la
<tb> protein <SEP> (Bordetella <SEP> bronchiseptica) <SEP> biosynthèse <SEP> d'amino-sucre
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

L'inactivation du gène or/8 a été réalisée. Il a pu ainsi être montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycines. Ceci confirme que le gène or/8 est bien impliqué dans la biosynthèse des spiramycines. L'enzyme codée par ce gène est donc bien responsable d'une étape de bioconversion essentielle à la biosynthèse des spiramycines.

Le gène orf9c a déjà été identifié chez Streptomyces ambofaciens et a été désigné srmX par Geistlich et al. (Geistlich,M., et al., 1992). La similitude de la protéine codée par ce gène avec plusieurs méthyltransférases impliquées dans la voie de biosynthèse d'autres antibiotiques proches suggère fortement que le gène or9c code une méthyltransférase responsable de la réaction de méthylation nécessaire à la biosynthèse du mycaminose ou de la forosamine (cf. figure 5 et 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf9c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 21).

Tableau 21

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> N,N-diméthyltransférase <SEP> AAC68678 <SEP> 240 <SEP> N,N-
<tb> (Streptomyces <SEP> venezuelae) <SEP> diméthyltransférase
<tb>

<tb>
<tb> Méthyltransférase <SEP> (Streptomyces <SEP> CAA05643 <SEP> 232 <SEP> Méthyltransférase
<tb> antibioticus)
<tb> Putative <SEP> amino <SEP> methylase <SEP> AAF01819 <SEP> 219 <SEP> Aminométhylase
<tb> (Streptomyces <SEP> nogalater)
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Le gène orflO a déjà été identifié chez Streptomyces ambofaciens et a été désigné srmR par Geistlich et al. (Geistlich, M., et al., 1992). La protéine codée par ce gène est impliquée dans la régulation de la voie de biosynthèse des spiramycines chez Streptomyces ambofaciens. L'inactivation du gène orf10 a été réalisée. Il a pu ainsi être montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycines. Ceci confirme que le gène or/10 est bien impliqué dans la biosynthèse des spiramycines. La protéine codée par ce gène est donc bien essentielle à la biosynthèse des spiramycines.

D'autre part ; le point de démarrage de la traduction de orf 10 a été déterminé et il a pu être montré que la surexpression de ce gène entraine une amélioration de la production en spiramycines. Le site de démarrage de la traduction correspond à un ATG situé en amont de l'ATG proposé par Geistlich et al. (Geistlich, M., et al., 1992). Il a en outre été démontré que cette extrémité 5' est esentielle à la fonction de OrflO puisqu'un messager tronqué en 5' est inactif (cf. exemple 17). Pour obtenir l'effet recherché sur la production en spiramycines, il est donc essentiel que la surexpression de orflO soit réalisée en prenant garde de ne pas exprimer un messager tronqué en 5' de or/70.

Le gène orfllc a déjà été identifié chez Streptomyces ambofaciens et a été désigné srmB par Geistlich et al. (Geistlich,M. et al., 1992) et Schoner et al. (Schoner B et al., 1992). La protéine codée par ce gène est impliquée dans la résistance à la spiramycine chez Streptomyces ambofaciens et est un transporteur de type ABC.

Le gène or/72 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs hexose déshydratases. Notamment, la protéine codée par orfl2 possède une similitude importante avec une NDP-hexose 3,4-déshydratase codée par le gène UrdQ de Streptomyces fradiae et impliquée dans la biosynthèse de la tylosine (Hoffmeister,D. et al., 2000 ; Numéro d'accès GenBank : AAF72550 ; Score BLAST : 634). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orfl2 code une 3,4 déshydratase responsable de la réaction de déshydratation nécessaire à la biosynthèse de la forosamine (cf. figure 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orfl2 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 22).

Tableau 22

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> AknP <SEP> (Streptomyces <SEP> galilaeus) <SEP> AAF73452 <SEP> 625 <SEP> 3-déshydratase
<tb> NDP-hexose <SEP> 3,4-dehydratase <SEP> homolog <SEP> AAD13547 <SEP> 624 <SEP> NDP-hexose <SEP> 3,4
<tb> (Streptomyces <SEP> cyanogenus) <SEP> déshydratase
<tb> RdmI <SEP> (Streptomyces <SEP> purpurascens) <SEP> AAL24451 <SEP> 608 <SEP> hexose-C-3déshydratase
<tb> Probable <SEP> CDP-4-keto-6-deoxyglucose- <SEP> T46528 <SEP> 602 <SEP> CDP-4-céto-6-
<tb> 3-dehydratase <SEP> (El) <SEP> (Streptomyces <SEP> déoxyglucose-3violaceoruber) <SEP> déshydratase
<tb> Probable <SEP> NDP-hexose-3,4-dehydratase <SEP> AAG23278 <SEP> 582 <SEP> NDP-hexose-3,4-
<tb> (Saccharopolyspora <SEP> spinosa) <SEP> déshydratase
<tb>

<tb>
<tb> dNTP-hexose <SEP> déshydratase <SEP> AAC01730 <SEP> 576 <SEP> dNTP-hexose
<tb> (Amycolatopsis <SEP> mediterranei) <SEP> déshydratase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

L'inactivation du gène or/72 a été réalisée. Il a pu être montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycines. Ceci confirme que le gène or/72 est bien impliqué dans la biosynthèse de la spiramycine. L'enzyme codée par ce gène est donc bien responsable d'une étape de bioconversion essentielle à la biosynthèse de la spiramycine.

Le gène orf13c code une protéine présentant une relative forte similitude avec une protéine de fonction inconnue chez Streptomyces coelicolor. Cette protéine a été nommée SC4H2. 17 (numéro d'accès GeneBank : T35116; Score BLAST: 619). La protéine codée par le gène orf13c présente également une forte similitude avec d'autres protéines d'autres organismes (cf. tableau 23).

Tableau 23

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> hflX <SEP> protein <SEP> (Mycobacterium <SEP> leprae) <SEP> S72938 <SEP> 473 <SEP> Inconnue
<tb> Possible <SEP> ATP/GTP-binding <SEP> protein <SEP> NP~301739 <SEP> 470 <SEP> Protéine <SEP> fixant
<tb> (Mycobacterium <SEP> leprae) <SEP> l'ATP/GTP
<tb> GTP-binding <SEP> protein <SEP> (Mycobacterium <SEP> AAK47114 <SEP> 468 <SEP> Protéine <SEP> fixant <SEP> le
<tb> tuberculosis <SEP> CDC1551) <SEP> GTP
<tb>

<tb>
<tb> ATP/GTP-bindingprotein <SEP> T44592 <SEP> 388 <SEP> Protéine <SEP> fixant
<tb>

(Streptomyces fradiae) l'ATP/GTP * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

* Aucune fonction précise n'a été assignée aux protéines proches de celle codée par orf13c. L'inactivation du gène orfl3c a été réalisée dans le but d'étudier la fonction de ce gène dans la voie de biosynthèse des spiramycines chez Streptomyces ambofaciens. Il a pu être montré que la souche résultante produit des spiramycines. Ceci indique que le gène orfl3c n'est pas essentiel à la biosynthèse des spiramycines et qu'il n'est pas essentiel à la survie de la bactérie. L'enzyme codée par ce gène n'est donc pas responsable d'une étape de bioconversion essentielle à la biosynthèse des spiramycines.

Le gène or/74 code une protéine présentant une relative forte similitude avec une réductase putative (Redenbach,M., et al.,1996 ; Bentley et al., 2002 ; numéro d'accès GenBank : CAB90862 ; Score BLAST : 147).

L'inactivation du gène orfl4 a été réalisée. Il a pu ainsi être montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycines. Ceci confirme que le gène orfl4 est bien impliqué dans la biosynthèse des spiramycines. L'enzyme codée par ce gène est donc bien responsable d'une étape de bioconversion essentielle à la biosynthèse des spiramycines. Les intermédaires de biosynthèse de la souche interrompue dans le gène or/24 ont été étudiés (cf. exemple 20). Ces expériences ont permis de démontrer que cette souche produit du platénolide A mais ne produit pas de platénolide B (cf. figure 36).

Le gène orf15c code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs cétoréductases. Notamment, la protéine codée par orfl5c possède une similitude importante avec une 3-cétoréductase chez Streptomyces antibioticus (Numéro d'accès GenBak : T51102, Score BLAST : Cette similitude suggère fortement que

le gène orf15c code une 3 céto-réductase responsable de la réaction de réduction nécessaire à la biosynthèse de la forosamine (cf. figure 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf15c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 24).

Tableau 24

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> oxidoreductase <SEP> homolog <SEP> (Streptomyces <SEP> AAD13550 <SEP> 272 <SEP> Oxidoréductase
<tb> cyanogenus)
<tb> D-oliose <SEP> 4-cétoreductase <SEP> CAB96550 <SEP> 265 <SEP> D-oliose <SEP> 4.
<tb>

(Streptomyces <SEP> argillaceus) <SEP> cétoréductase
<tb> AknQ <SEP> (Streptomyces <SEP> galilaeus) <SEP> AAF73453 <SEP> 263 <SEP> putative <SEP> 3.
<tb> cétoréductase
<tb> Probable <SEP> NDP-hexose-3-ketoreductase <SEP> AAG23275 <SEP> 253 <SEP> NDP-hexose-3-
<tb> (Saccharopolyspora <SEP> spinosa) <SEP> cétoréductase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Le gène orfl6 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs isomérases. Notamment, la protéine codée par orfl6 possède une similitude importante avec une NDP hexose 3,4 isomérase chez Streptomyces fradiae (Gandecha et al., 1997 ; Numéro d'accès GenBak : CAA57471, Score BLAST : Cette similitude suggère fortement que le gène orfl6 code une NDP hexose 3,4 isomérase responsable de la réaction d'isomérisation nécessaire à la biosynthèse du mycarose (cf. figure 5). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf16 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 25).

Tableau 25

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> Putative <SEP> tautomerase <SEP> (Streptomyces <SEP> AAC68676 <SEP> 145 <SEP> Tautomérase
<tb> venezuelae)
<tb> TDP-4-céto-6-déoxyhexose <SEP> 3,4- <SEP> AAG13907 <SEP> 112 <SEP> TDP-4-céto-6isomérase <SEP> (Micromonospora <SEP> déoxyhexose <SEP> 3,4megalomicea <SEP> subsp. <SEP> nigra) <SEP> isomérase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Le gène orfl7 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs glycosyl transférases. Notamment, la protéine codée par or/17 possède une similitude importante avec une glycosyl transférase de Streptomyces venezuelae (Xue,Y. et al.,1998 ; Numéro d'accès GenBank : AAC68677; score BLAST: 400). La similitude de la protéine codée par le gène orfl7 avec plusieurs glycosyl transférases impliquées dans la voie de biosynthèse d'autres antibiotiques proches suggère fortement que ce gène code également une glycosyl transférase. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène or/77 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 26).

Tableau 26

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> Glycosyltransférase <SEP> (Streptomyces <SEP> CAA57472 <SEP> 399 <SEP> Glycosyltransférase
<tb> fradiae)
<tb>

<tb>
<tb> Glycosyltransférase <SEP> (Streptomyces <SEP> CAA05642 <SEP> 378 <SEP> Glycosyltransférase
<tb> antibioticus)
<tb> Glycosyltransférase <SEP> (Streptomyces <SEP> CAA05641 <SEP> 360 <SEP> Glycosyltransférase
<tb> antibioticus)
<tb> Glycosyltransférase <SEP> CAA74710 <SEP> 344 <SEP> Glycosyltransférase
<tb> (Saccharopolyspora <SEP> erythraea)
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Le gène orfl8 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs glycosyl transférases. Notamment, la protéine codée par or/75 possède une similitude importante avec une glycosyl transférase de Streptomyces rishiriensis (Wang et a/.,2000; Numéro d'accès GenBank : AAG29785; score BLAST: 185). La similitude de la protéine codée par le gène orfl8 avec plusieurs glycosyl transférases impliquées dans la voie de biosynthèse d'autres antibiotiques proches suggère fortement que ce gène code également une glycosyl transférase. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orfl8 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 27).

Tableau 27

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> NovM <SEP> (Streptomyces <SEP> spheroides) <SEP> AAF67506 <SEP> 184 <SEP> Glycosyltransférase
<tb> probable <SEP> glycosyl <SEP> transferase <SEP> T46519 <SEP> 169 <SEP> Glycosyltransférase
<tb> (Streptomyces <SEP> violaceoruber)
<tb>

<tb>
<tb> Glycosyl <SEP> transferasehomolog <SEP> AAD13553 <SEP> 167 <SEP> Glycosyltransférase
<tb> (Streptomyces <SEP> cyanogenus)
<tb> Glycosyl <SEP> transferase <SEP> homolog <SEP> AAD13555 <SEP> 163 <SEP> Glycosyltransférase
<tb> (Streptomyces <SEP> cyanogenus)
<tb> dNTP-hexose <SEP> glycosyl <SEP> transférase <SEP> AAC01731 <SEP> 160 <SEP> Glycosyltransférase
<tb> (Amycolatopsis <SEP> mediterranei)
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Le gène or/79 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs cétoréductases. Notamment, la protéine codée par orfl9 possède une similitude importante avec une NDP-hexose 4-cétoréductase (TylCIV) de Streptomyces fradiae (Bate et al.,2000 ; Numéro d'accès GenBank : AAD41822 ; score BLAST : 266). La similitude de la protéine codée par le gène orfl9 avec cette cétoréductase impliquée dans la voie de biosynthèse d'un antibiotique proche suggère fortement que ce gène code également une 4-cétoréductase responsable de la réaction de réduction nécessaire à la biosynthèse du mycarose (cf. figure 4). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orfl9 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 28).

Tableau 28

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> NDP-4-céto-6-déoxyhexose <SEP> 4- <SEP> AAL14256 <SEP> 251 <SEP> NDP-4-céto-6cétoreductase <SEP> (Streptomyces <SEP> venezuelae) <SEP> déoxyhexose <SEP> 4cétoréductase
<tb>

<tb>
<tb> EryBIV <SEP> (Saccharopolyspora <SEP> erythraea) <SEP> AAB84071 <SEP> 249 <SEP> oxidoréductase
<tb> TDP-4-céto-6-déoxyhexose <SEP> 4- <SEP> AAG13916 <SEP> 218 <SEP> TDP-4-céto-6cétoreductase <SEP> (Micromonospora <SEP> déoxyhexose <SEP> 4megalomicea <SEP> subsp. <SEP> Nigra) <SEP> cétoréductase
<tb> dTDP-4-céto-6-déoxy-L-hexose <SEP> 4- <SEP> BAA84595 <SEP> 212 <SEP> dTDP-4-céto-6réductase <SEP> (Streptomyces <SEP> avermitilis) <SEP> déoxy-L-hexose <SEP> 4réductase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Le gène or/20 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs hexose réductases. Notamment, la protéine codée par or/20 possède une similitude importante avec le gène EryBII de Saccharopolyspora erythraea qui code une dTDP-4-céto-L-6-déoxy-hexose 2,3-réductase (Summers,R.G., et al.,1997), Numéro d'accès GenBank : AAB84068 ; Score BLAST : 491). La similitude de la protéine codée par le gène or/20 avec plusieurs hexose réductases impliquées dans la voie de biosynthèse d'autres antibiotiques proches suggère fortement que ce gène code une 2-3 réductase responsable de la réaction de réduction nécessaire à la biosynthèse du mycarose (cf. figure 4). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène or/20 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 29).

Tableau 29

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> TylCII <SEP> (Streptomyces <SEP> fradiae) <SEP> AAD41821 <SEP> 464 <SEP> NDP-hexose <SEP> 2,3-
<tb> énoyl <SEP> réductase
<tb>

<tb>
<tb> TDP-4-céto-6-deoxyhexose <SEP> 2,3- <SEP> AAG13914 <SEP> 446 <SEP> TDP-4-céto-6réductase <SEP> (Micromonospora <SEP> déoxyhexose <SEP> 2,3megalomicea <SEP> subsp. <SEP> Nigra) <SEP> réductase
<tb> dTDP-4-céto-6-déoxy-L-hexose <SEP> 2,3- <SEP> BAA84599 <SEP> 377 <SEP> dTDP-4-céto-6réductase <SEP> (Streptomyces <SEP> avermitilis) <SEP> déoxy-L-hexose
<tb> 2,3-réductase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Le gène orf21c code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs hexose méthyltransférases. Notamment, la protéine codée par orf21c possède une similitude importante avec le gène TylCIII de Streptomyces fradiae qui code une NDP-hexose 3-C-méthyltransférase (Bate,N et al., 2000 ; Numéro d'accès GenBank : AAD41823 ; Score BLAST : 669). La similitude de la protéine codée par le gène orf21c avec plusieurs hexose méthyltransférases impliquées dans la voie de biosynthèse d'autres antibiotiques proches suggère fortement que ce gène code une hexose méthyltransférase responsable de la réaction de méthylation nécessaire à la biosynthèse du mycarose (cf. figure 4). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf21c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 30).

Tableau 30

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> eryH <SEP> (Saccharopolyspora <SEP> erythraea) <SEP> 228448 <SEP> 592 <SEP> Gène <SEP> de
<tb> biosynthèse <SEP> de
<tb> l' <SEP> érythromycine <SEP>
<tb>

<tb>
<tb> S-adenosyl-dependent <SEP> methyl <SEP> AAK71270 <SEP> 358 <SEP> Méthyltransferase
<tb> transferase <SEP> (Coxiella <SEP> burnetii)
<tb> NovU <SEP> (Streptomyces <SEP> spheroides) <SEP> AAF67514 <SEP> 184 <SEP> C-méthyltransférase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Le gène orf22c code une protéine présentant une relative forte similitude avec la protéine codée par le gène fkbH de Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus qui code une enzyme impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl (Wu,K. et al.,2000; Numéro d'accès GenBank : AAF86387 ; Score BLAST : 463). La similitude de la protéine codée par le gène orj22c avec cette protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre macrolide proche suggère fortement que ce gène code également une enzyme impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl chez Streptomyces ambofaciens (cf. figure 8).

Le gène orj23c code une protéine présentant une relative forte similitude avec la protéine codée par le gène fkbI de Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus qui code une acyl CoA déshydrogénase impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl (Wu,K. et al., 2000 ; Numéro d'accès GenBank : AAF86388 ; Score BLAST 387). La similitude de la protéine codée par le gène orj23c avec plusieurs acyl CoA déshydrogénases impliquées dans la voie de biosynthèse d'autres antibiotiques proches suggère fortement que ce gène code une acyl CoA déshydrogénase impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl (cf. figure 8). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf23c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 31).

Tableau 31

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> Acyl-CoA <SEP> déshydrogénase <SEP> AAK19892 <SEP> 171 <SEP> Acyl-CoA
<tb> (Polyangium <SEP> cellulosum) <SEP> déshydrogénase
<tb> Probable <SEP> acyl-CoA <SEP> dehydrogenase <SEP> - <SEP> T36802 <SEP> 160 <SEP> acyl-CoA
<tb> (Streptomyces <SEP> coelicolor) <SEP> déshydrogénase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Le gène orf24c code une protéine présentant une relative forte similitude avec la protéine codée par le gène fkbJ de Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus qui coderait la protéine de liaison du groupement acyl (Acyl Carrier Protein (ACP)) impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl (Wu,K., et al., 2000 ; Numéro d'accès GenBank : AAF86389 ; Score BLAST : 87). La similitude de la protéine codée par le gène orf24c avec cette protéine impliquées dans la voie de biosynthèse d'un autre macrolide proche suggère fortement que ce gène code une protéine impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl chez Streptomyces ambofaciens (cf. figure 8).

Le gène orj25c code une protéine présentant une relative forte similitude avec la protéine codée par le gène fkbK de Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus qui code une acyl CoA déshydrogénase impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl (Wu,K., et al., 2000 ; Numéro d'accès GenBank : AAF86390 ; score BLAST : 268). La similitude de la protéine codée par le gène orj25c avec plusieurs acyl CoA déshydrogénases impliquées dans la voie de biosynthèse d'autres antibiotiques proches suggère fortement que ce gène code une acyl CoA déshydrogénase impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl (cf. figure 8). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf25c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 32).

Tableau 32

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> Probable <SEP> 3-Hydroxybutyryl-CoA <SEP> P45856 <SEP> 177 <SEP> 3-HydroxybutyrylDehydrogenase <SEP> (Bacillus <SEP> subtilis) <SEP> CoA <SEP> déshydrogénase
<tb> 3-hydroxybutyryl-CoA <SEP> dehydrogenase <SEP> AAL32270 <SEP> 174 <SEP> 3-hydroxybutyrylprotein <SEP> (Bacillus <SEP> thuringiensis <SEP> serovar <SEP> CoA <SEP> déshydrogénase
<tb> kurstaki)
<tb> 3-hydroxybutyryl-CoA <SEP> dehydrogenase <SEP> NP~294792 <SEP> 167 <SEP> 3-hydroxybutyryl-
<tb> (Deinococcus <SEP> radiodurans) <SEP> CoA <SEP> déshydrogénase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Le gène or/26 code une protéine présentant une identité de 65% (déterminée grâce au programme BLAST) avec la protéine codée par le gène tylCV qui code une mycarosyl transferase impliquée dans la biosynthèse de tylosine chez Streptomyces fradiae (Bate,N. et al., 2000 ; Numéro d'accès GenBank : AAD41824, Score BLAST : 471). Plus particulièrement, TylCV est une glycosyl-transférase liant la molécule de mycarose lors de la synthèse de la tylosine. Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique relativement proche et plus particulièrement dans le transfert du mycarose, suggère que le gène or/26 code une glycosyl transferase. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène or/26 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 33).

Tableau 33

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> Glycosyl <SEP> transferase <SEP> (Streptomyces <SEP> BAA84592 <SEP> 218 <SEP> Glycosyl <SEP> transferase
<tb> avermitilis)
<tb> CalG4 <SEP> (Micromonospora <SEP> echinospora) <SEP> AAM70365 <SEP> 217 <SEP> Glycosyl <SEP> transferase
<tb> CalG2 <SEP> (Micromonospora <SEP> echinospora) <SEP> AAM70348 <SEP> 197 <SEP> Glycosyl <SEP> transferase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Le gène orf27 code une protéine présentant une identité de 70% (déterminée grâce au programme BLAST) avec la protéine codée par le gène tylCVII qui code une NDPhexose 3,5- (ou 5-) épimerase impliquée dans la biosynthèse de tylosine chez Streptomyces fradiae (Bate,N. et al., 2000 ; Numéro d'accès GenBank : AAD41825, Score BLAST : 243). Plus particulièrement, TylCVII est une hexose 3,5- (ou 5-) épimerase impliquée dans la biosynthèse du mycarose. Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique relativement proche et plus particulièrement dans la biosynthèse du mycarose, suggère que le gène or/27 code une épimérase. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène or/27 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 34). Une analyse des séquences proches obtenues grâce au programme BLAST suggère fortement que le gène orf27 code une 5 épimérase responsable de la réaction d'épimérisation nécessaire à la biosynthèse du mycarose (cf. figure 4).

Tableau 34

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> LanZl <SEP> (Streptomyces <SEP> cyanogenus) <SEP> AAD13558 <SEP> 172 <SEP> NDP-hexose <SEP> 3,5epimerase
<tb> Epi <SEP> (Saccharopolyspora <SEP> spinosa) <SEP> AAK83288 <SEP> 169 <SEP> TDP-4-keto-6deoxyglucose <SEP> 3,5
<tb> epimerase
<tb> dNTP-hexose <SEP> 3,5 <SEP> epimerase <SEP> AAC01732 <SEP> 166 <SEP> dNTP-hexose <SEP> 3,5
<tb> (Amycolatopsis <SEP> mediterranei) <SEP> epimerase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

La séquence d'orf28c est partielle, puisque la séquence d'une région d'environ 450 paires de bases n'a pas été déterminé (région symbolisée par des N dans la séquence SEQ ID N 106). La séquence partielle de cette ORF a néanmoins été utilisée pour l'analyse avec les différents programmes informatiques comme expliqué ci-dessus. Il a ainsi pû être déterminé que le gène orf28c code une protéine présentant une identité de 64% sur la séquence déterminée (SEQ ID N 112, qui est la séquence partielle de la protéine Orf28c) (déterminée grâce au programme BLAST) avec la protéine codée par le gène acyB2 qui code une protéine régulatrice impliquée dans la biosynthèse de carbomycine chez Streptomyces thermotolerans (Arisawa,A., et al., 1993 ; Numéro d'accès GenBank : JC2032, Score BLAST : 329). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un antibiotique relativement proche suggère que le gène orf28c code une protéine régulatrice impliquée dans la biosynthèse des spiramycines. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf28c présente également une forte similitude avec la protéine TylR qui est une

protéine régulatrice impliquée dans la biosynthèse de tylosine chez Streptomycesfradiae (Bate,N. et al., 1999 ; Numéro d'accès GenBank : AAF29380, Score BLAST : 167).

Le gène orf28c a pu être amplifié grace à des oligonucléotides situés de part et d'autre de la séquence non déterminée et sous cloné dans un vecteur d'expression. Il a pu ainsi être démontré que la surexpression du gène orf28c augmente significativement la production en spiramycines de la souche OSC2 (cf. exemple 24). Ceci démontre que la surexpression de orf28c conduit à une augmentation de la production en spiramycines et confirme son rôle en tant que régulateur de la voie de biosynthèse des spiramycines.

Le gène orj29 code une protéine présentant une identité de 31 % (déterminée grâce au programme BLAST) avec une probable glycosyl hydrolase localisée dans le groupe de gènes impliqué dans la biosynthèse de soraphen A (un antifongique de la classe des polyketides) chez Sorangium cellulosum (Ligon,J., et al., 2002 ; Numéro d'accès GenBank: AAK19890, Score BLAST: 139). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'une molécule relativement proche suggère que le gène or/29 code une protéine ayant une activité glycosyl hydrolase. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène or/29 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 35).

Une analyse de la séquence de la protéine codée par or/29 grâce au programme CDsearch (cf. ci-dessus) suggère également que le gène or/29 code une glycosyl hydrolase.

Tableau 35

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> ManA <SEP> (Caldicellulosiruptor <SEP> AAC44232 <SEP> 136 <SEP> beta-1,4-mannanase
<tb> saccharolyticus)
<tb>

<tb>
<tb> ManA <SEP> (Dictyoglomus <SEP> thermophilum) <SEP> AAB82454 <SEP> 129 <SEP> beta-mannanase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Le gène orf30c code une protéine présentant une identité de 31% (déterminée grâce au programme BLAST) avec une épimérase de sucre-nucléoside-diphosphate chez
Corynebacterium glutamicum (Numéro d'accès GenBank : NP~600590, Score BLAST :
89). Cette similitude suggère que le gène orf30c code une épimérase. Cette hypothèse est étayée par le fait qu'une analyse de la séquences grâce au programme CD-search (cf. ci-dessus) suggère également que le gène orf30c code une épimérase.

Le gène or/37 code une protéine présentant une identité de 52% (déterminée grâce au programme BLAST) avec une oxidoreductase chez Streptomyces coelicolor (Numéro d'accès GenBank : NP~631148, Score BLAST : 261). Cette similitude suggère que le gène or/37 code une réductase. Cette hypothèse est étayée par le fait qu'une analyse de la séquences grâce au programme CD-search (cf. ci-dessus) suggère également que le gène or/31 code une réductase. Cette hypothèse est également étayée par le fait que la protéine codée par le gène or/37 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 36).

Tableau 36

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> Putative <SEP> oxidoreductase <SEP> (Streptomyces <SEP> BAB79295 <SEP> 173 <SEP> Oxidoreductase
<tb> griseus)
<tb> MocA <SEP> (Xanthomonas <SEP> axonopodis) <SEP> NP~640644 <SEP> 171 <SEP> Oxidoreductase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Le gène orf32c code une protéine présentant une identité de 47% (déterminée grâce au programme BLAST) avec une protéine régulatrice de la famille GntR chez
Streptomyces coelicolor (Numéro d'accès GenBank : NP~625576, Score BLAST : 229).
Cette similitude suggère que le gène orf32c code un régulateur transcriptionel de la famille GntR. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf32c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 37).

Tableau 37

<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> SC5G8.04 <SEP> (Streptomyces <SEP> coelicolor) <SEP> NP~628991 <SEP> 209 <SEP> Protéine <SEP> régulatrice
<tb> de <SEP> la <SEP> famille <SEP> GntR
<tb> transcriptional <SEP> regulator <SEP> (Streptomyces <SEP> AAFOI064 <SEP> 176 <SEP> Régulateur
<tb> venezuelae) <SEP> transcriptionel
<tb> BH0578 <SEP> (Bacillus <SEP> halodurans) <SEP> NP~241444 <SEP> 172 <SEP> Régualteur
<tb> transcriptionl <SEP> de <SEP> la
<tb> famille <SEP> GntR
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

La présente invention a également pour objet des polynucléotides s'hybridant dans des conditions d'hybridation de forte stringence à au moins l'un des polynucléotides de séquence SEQ ID N 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111,113, 115,118, et 120, ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique. Préférentiellement, cesdit polynucléotides sont isolés à partir d'une bactérie du genre Streptomyces, plus

préférentiellement, ces polynucléotides codent des protéines impliquées dans la biosynthèse d'un macrolide et encore plus préférentiellement, ces polynucléotides codent une protéine ayant une activité similaire à la protéine codée par les polynucléotides avec lesquels ils s'hybrident. Les conditions d'hybridation de forte stringence peuvent être définies comme des conditions d'hybridation défavorisant l'hybridation de brins d'acides nucléiques non homologues. Des conditions d'hybridations de forte stringence peuvent être par exemple décrites comme des conditions d'hybridation dans le tampon décrit par Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984) à une température comprise entre 55 C et 65 C, de manière préférée la température d'hyridation est de 55 C, de manière encore plus préférée la températue d'hybridation est de 60 C et de manière tout à fait préférée la température d'hybridation est de 65 C, suivi d'un ou plusieurs lavages effectué en tampon 2X SSC à une température comprise entre 55 C et 65 C, de manière préférée cette température est de 55 C, de manière encore plus préférée cette températue est de 60 C et de manière tout à fait préférée cette température est de 65 C, suivi d'un ou plusieurs lavages en tampon 0. 5X SSC à une température comprise entre 55 C et 65 C, de manière préférée cette température est de 55 C, de manière encore plus préférée cette températue est de 60 C et de manière tout à fait préférée cette température est de 65 C. Les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon des techniques connues de l'homme du métier. Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'ouvrage de F.Ausubel et al., 2002.

L'invention concerne également un polynucléotide ayant au moins 70%, de façon plus préférée 80%, de façon plus préférée 85%, de façon encore plus préférée 90%, de façon encore plus préférée 95% et de manière tout à fait préférée 98% d'identité en nucléotides avec un polynucléotide comprenant au moins 10,12, 15,18, 20 à 25,30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750,800, 850,900, 950,1000, 1050,1100, 1150,1200, 1250,1300, 1350,1400, 1450, 1500,1550, 1600,1650, 1700,1750, 1800,1850 ou 1900 nucléotides consécutifs d'un

polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID N 3,5, 7,9, 11, 13,15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53,60, 62,64, 66,68, 70,72, 74,76, 78,80, 82,84, 107,109, 111,113, 115,118, et 120, ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique, ou un polynucléotide de séquence complémentaire. Préférentiellement, ces dits polynucléotides sont isolés à partir d'une bactérie du genre Streptomyces, plus préférentiellement, ces polynucléotides codent des protéines impliquées dans la biosynthèse d'un macrolide et encore plus préférentiellement, ces polynucléotides codent des protéines ayant des activités similaires aux protéines codées par les polynucléotides avec lesquels ils présentent l'identité. De façon tout à fait préférée, un polynucléotide selon l'invention est choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID N 3,5, 7,9, 11, 13,15, 17,19, 21,23, 25,28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111,113, 115, 118, et 120, ou un polynucléotide de séquence complémentaire.

L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus, par exemple ceux du package FASTA (Pearson W. R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990), accessible notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France. À titre d'illustration, le pourcentage d'identité de séquence pourra être déterminé à l'aide du logiciel LFASTA (Chao K.-M. et al., 1992) ou LALIGN (Huang X. et Miller W., 1991). Les programmes LFASTA et LALIGN font partie du package FASTA. LALIGN retourne les alignements locaux optimaux : ce programme est plus rigoureux, mais aussi plus lent que LFASTA.

Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide résultant de l'expression d'une séquence d'acide nucléique telle que définie ci-dessus. Préférentiellement, les polypeptides selon l'invention présentent au moins 70%, de façon plus préférée 80%, de façon plus préférée 85%, de façon encore plus préférée 90%, de façon encore plus préférée 95% et de manière tout à fait préférée 98% d'identité en acides aminés avec un polypeptide comprenant au moins 10, 15, 20, 30 à 40, 50, 60, 70, 80, 90,100, 120, 140,

160,180, 200,220, 240,260, 280,300, 320,340, 360,380, 400,420, 440,460, 480, 500,520, 540,560, 580,600, 620 ou 640 acides aminés consécutifs d'un polypeptide choisi parmi SEQ ID N 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24,26, 27,29, 31,32, 33,35, 37,38, 39,41, 42,44, 46, 48, 50,51, 52,54, 55,56, 57,58, 59,61, 63,65, 67,69, 71, 73,75, 77,79, 81,83, 85,108, 110,112, 114,116, 117,119 et 121, ou l'une de ces séquences excepté que tout au long de ladite séquence un ou plusieurs acides aminés ont été substitués, insérés ou délétés sans en affecter les propriétés fonctionnelles ou l'un des variant de ces séquences. Préferentiellement les polypeptides selon l'invention sont exprimés à l'état naturel par une bactérie du genre Streptomyces, plus préférentiellement, ces polypeptides sont impliquées dans la biosynthèse d'un macrolide et encore plus préférentiellement, ces polypeptides ont une activité similaire à celle du polypeptide avec lequel il partage l'identité. De façon préférée, un polypeptide selon l'invention est choisi dans le groupe constitué des séquences polypeptidiques SEQ ID N 4,6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 35,37, 38,39, 41,42, 44,46, 48, 50, 51, 52,54, 55,56, 57,58, 59,61, 63,65, 67,69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 108, 110, 112, 114, 116, 117,119 et 121, ou l'une de ces séquences excepté que tout au long de ladite séquence un ou plusieurs acides aminés ont été substitués, insérés ou délétés sans en affecter les propriétés fonctionnelles ou l'un des variant de ces séquences. De façon tout à fait préférée, un polypeptide selon l'invention est choisi dans le groupe constitué des séquences polypeptidiques SEQ ID N 4,6, 8,10, 12, 14,16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 50,51, 52,54, 55,56, 57,58, 59, 61, 63, 65,67, 69,71, 73,75, 77,79, 81, 83, 85, 108, 110, 112, 114, 116, 117, 119 et 121.

L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus, par exemple ceux du package FASTA (Pearson W. R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990), accessible notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France. À titre d'illustration, le pourcentage d'identité de séquence pourra être déterminé à l'aide du logiciel LFASTA (Chao K.-M. et al., 1992) ou LALIGN (Huang X. et Miller W.,

1991), en utilisant les paramètres par défaut tel que défini par le centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France. Les programmes LFASTA et LALIGN font partie du package FASTA. LALIGN retourne les alignements locaux optimaux : ce programme est plus rigoureux, mais aussi plus lent que LFASTA.

Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant comprenant au moins un polynucléotide tel que décrit ci-dessus. Préférentiellement ; cet ADN recombinant est un vecteur. Encore plus préférentiellement, le vecteur est choisi parmi les bactériophages, les plasmides, les phagemides, les vecteurs intégratifs, les fosmides, les cosmides, les vecteurs navettes, les BAC (Bacterial Artificial Chromosome) ou les PAC (Pl-derived Artificial Chromosome). A titre illustratif on peut citer comme bactériophages le phage lambda et le phage M13. Comme plasmides on peut citer les plasmides se répliquant chez E. coli par exemple pBR322 et ses dérivés, pUC18 et ses dérivés, pUC19 et ses dérivés, pGB2 et ses dérivés (Churchward G. et al., 1984), pACYC177 (numéro d'accès GenBank : X06402) et ses dérivés, pACYC184 (numéro d'accès GenBank : X06403) et ses dérivés. On peut également citer les plasmides se répliquant chez Streptomyces comme par exemple pIJ101 et ses dérivés, pSG5 et ses dérivés, SLP1et ses dérivés, SCP2* et ses dérivés (Kieser et al. 2000). Comme phagemides on peut citer à titre illustratif pBluescript II et ses dérivés (commercialisés notamment par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA)), pGEM-T et ses dérivés (commercialisé par la société Promega (Madison, Wisconcin, USA)), #ZAPII et ses dérivés (commercialisés notamment par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA)). Comme vecteurs intégratifs on peut citer à titre illustratif, les vecteurs intégratifs chez Streptomyces comme par exemple ceux dérivés de SLP1(Kieser et al, 2000), ceux dérivés de pSAM2 (Kieser et al, 2000), les vecteurs utilisant les systèmes d'intégration des phages PhiC31 (Kieser et al, 2000) (par exemple pSET152 (Bierman et al., 1992)) ou de VWB (Van Mellaert L, et al. 1998), ainsi que les vecteurs utilisant le système d'intégration de IS 117 (Kieser et al. 2000). Comme fosmides on peut citer à titre illustratif le fosmide pFOSl (commercialisé par la société New England Bioloabs Inc., Beverly, Massachussetts, USA) et ses dérivés. Comme cosmides on peut citer à titre illustratif le cosmide SuperCos et ses dérivés (commercialisés notamment par la

société Stratagene (LaJolla, Californie, USA)), le cosmide pWED15 (Wahl et al., 1987) et ses dérivés. Comme vecteurs navettes on peut citer à titre illustratif les plasmides navettes E. coli / Streptomyces comme par exemple pIJ903 et ses dérivés, la série des plasmides pUWL, pCA0106, pWHM3, pOJ446 et leurs dérivés (Kieser et al. 2000), les BAC navettes E. coli / Streptomyces comme par exemple ceux décrits dans la demande de brevet WO 01/40497. Comme BAC (Bacterial Artificial Chromosome) on peut citer à titre illustratif le BAC pBeloBACll (numéro d'accès GenBank :U51113). Comme PAC (Pl-derived Artificial Chromosome) on peut citer à titre illustratif le vecteur pCYPAC6 (numéro d'accès GenBank : AF133437). De façon tout à fait préférée, un vecteur selon l'invention est choisi parmi pOS49.1, pOS49.11, pOSC49. 12, pOS49.14, pOS49. 16, pOS49. 28, pOS44.1, pOS44. 2, pOS44. 4, pSPM5, pSPM7, pOS49.67, pOS49. 88, pOS49.106, pOS49. 120, pOS49. 107, pOS49. 32, pOS49. 43, pOS49. 44, pOS49. 50, pOS49. 99, pSPM17, pSPM21, pSPM502, pSPM504, pSPM507, pSPM508, pSPM509, pSPMl, pBXLllll, pBXL1112, pBXL1113, pSPM520, pSPM521, pSPM522, pSPM523, pSPM524, pSPM525, pSPM527, pSPM528, pSPM34, pSPM35, pSPM36, pSPM37, pSPM38, pSPM39, pSPM40, pSPM41, pSPM42, pSPM43, pSPM44, pSPM45, pSPM47, pSPM48, pSPM50, pSPM51, pSPM52, pSPM53, pSPM55, pSPM56, pSPM58, pSPM72, pSPM73, pSPM515, pSPM519, pSPM74 et pSPM75.

Un autre aspect de l'invention concerne un système d'expression comprenant un vecteur d'expression approprié et une cellule hôte permettant l'expression d'un ou plusieurs polypeptides tels que décrits ci-dessus dans un système biologique. Les vecteurs d'expression selon l'invention comprennent une séquence d'acide nucléique codant un ou plusieurs polypeptides tels que décrits ci-dessus et peuvent être destinés à l'expression des différents polypeptides selon l'invention dans diverses cellules hôtes bien connues de l'homme du métier. A titre d'exemple, on peut citer les systèmes d'expression procaryote comme les systèmes d'expression chez la bactérie E. coli, les sytèmes d'expression eucaryotes, comme le système d'expression baculovirus permettant une expression dans des cellules d'insectes, les sytèmes d'expression permettant une expression dans des cellules de levures, les sytèmes d'expression

permettant une expression dans des cellules de mammifères, notamment des cellules humaines. Les vecteurs d'expression utilisables dans de tels systèmes sont bien connus de l'homme du métier, en ce qui concerne les cellules procaryotes, on peut citer à titre illustratif les vecteurs d'expression chez E. coli par exemple, de la famille pET commercialisés par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA), les vecteurs de la famille GATEWAY commercialisés par la société Invitrogen (Carlsbad, Californie, USA), les vecteurs de la famille pBAD commercialisés par la société Invitrogen (Carlsbad, Californie, USA), les vecteurs de la famille pMAL commercialisés par la société New England Bioloabs Inc. (Beverly, Massachussetts, USA), les vecteurs d'expression inductibles par le rhamnose cités dans la publication Wilms B et al., 2001 et leurs dérivés, on peut également citer les vecteurs d'expression chez Streptomyces comme par exemple les vecteurs pIJ4123, pIJ6021, pPM927, pANT849, pANT 850, pANT 851, pANT1200, pANT1201, pANT1202 et leurs dérivés (Kieser et al., 2000).

En ce qui concerne les cellules de levures, on peut citer à titre illustratif le vecteur pESC commercialisé par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA). En ce qui concerne le système d'expression baculovirus permettant une expression dans des cellules d'insectes on peut citer à titre illustratif le vecteur BacPAK6 commercialisé par la société BD Biosciences Clontech, (Palo Alto, Californie, USA). En ce qui concerne les cellules de mammifères, on peut citer à titre illustratif des vecteurs comprenant le promoteur des gènes précoces du virus CMV (Cytomegalovirus) (par exemple le vecteur pCMV et ses dérivés commercialisés par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA), ou le promoteur des gènes immédiats (SV40 early promoter) du virus simien vacuolisant SV40 (par exemple le vecteur pSG5 commercialisé par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA).

L'invention est également relative à un procédé de production d'un polypeptide tel que décrit ci-dessus ledit procédé comprenant les étapes suivantes: a) insérer un acide nucléique codant ledit polypeptide dans un vecteur approprié

b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, une cellule hôte préalablement transformée ou transfectée avec le vecteur de l'étape a) ; c) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, par exemple par sonication ou par choc osmotique ; d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape c), ledit polypeptide ; e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.

Un polypeptide recombinant selon l'invention peut être purifié par passage sur une série appropriée de colonnes de chromatographie, selon les méthodes connues de l'homme de l'art et décrites par exemple dans F. Ausubel et al (2002). On peut citer à titre illustratif la technique du Tag-Histidine , qui consiste à ajouter une courte séquence poly-histidine au polypeptide à produire, ce dernier pouvant ensuite être purifié sur colonne de nickel. Un polypeptide selon l'invention peut être également préparé par les techniques de synthèse in vitro. A titre illustratif de telles techniques, un polypeptide selon l'invention pourra être préparé grâce au système rapid translation system (RTS) , commercialisé notamment par la société Roche Diagnostics France S.A, Meylan, France.

Un autre aspect de l'invention concerne des cellules hôtes dans laquelle a été introduit au moins un polynucléotide et/ou au moins un ADN recombinant et/ou au moins un vecteur d'expression selon l'invention.

Un autre aspect de l'invention concerne des microorganismes bloqués dans une étape de la voie de biosynthèse d'au moins un macrolide. L'intérêt réside d'une part dans l'étude de la fonction des protéines mutées et d'autre part dans la réalisation de microorganismes produisant des intermédiaires de biosynthèse. Ces intermédiaires peuvent être modifiés, éventuellement après séparation, soit par ajout de composants particuliers dans les milieux de production, soit par introduction dans les microorganismes ainsi mutés d'autres gènes codant des protéines susceptibles de

modifier l'intermédiaire en s'en servant comme substrat. Ces intermédiaires peuvent ainsi être modifiés par voie chimique, biochimique, enzymatique et/ou microbiologique.

Les microorganismes bloqués dans une étape de la voie de biosynthèse de macrolides peuvent être obtenus en inactivant la fonction d'une ou plusieurs protéines impliquées dans la biosynthèse de ce ou de ces macrolides dans des microorganismes producteurs de ce ou de ces macrolide. Selon la ou les protéines inactivées, on pourra ainsi obtenir des microorganismes bloqués dans les différentes étapes de la voie de biosynthèse de ce ou de ces macrolides. L'inactivation de cette ou de ces protéines peut être effectuée par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par mutagénèse dans le ou les gènes codant ladite ou lesdites protéines ou par l'expression d'un ou de plusieurs ARN anti-sens complémentaires de l'ARN ou des ARN messagers codant ladite ou lesdites protéines. La mutagénèse peut, par exemple, être effectuée par irradiation, par action d'agent chimique mutagène, par mutagénèse dirigée, par remplacement de gène ou toute autre méthode connue de l'homme du métier. Les conditions convenables d'une telle mutagénèse peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans les ouvrages de Kieser, T et al (2000) et Ausubel et al., (2002). La mutagénèse peut être effectuée in vitro ou in situ, par suppression, substitution, délétion et/ou addition d'une ou plusieurs bases dans le gène considéré ou par inactivation génique.

Cette mutagénèse peut être effectuée dans un gène comprenant une séquence telle que décrite ci-dessus. Préférentiellement, les microorganismes bloqués dans une étape de la voie de biosynthèse de macrolides sont des bactéries du genre Streptomyces. Plus préférentiellement, l'inactivation de la fonction d'une ou plusieurs protéines impliquées dans la biosynthèse du ou des macrolides en question est effectuée par mutagénèse.

Encore plus préférentiellement, le macrolide en question est la spiramycine et les microorganismes dans lesquels sont effectuées la ou les mutagénèses sont des souches de S. ambofaciens. Plus préférentiellement, la mutagénèse est effectuée dans un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N 3,5, 7,9, 11, 13,15, 17,19, 21,23, 25,28, 30,34, 36,40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, et 120. De façon préférée, la ou les mutagénèses sont effectuées par inactivation

génique. De façon tout à fait préférée, la mutagénèse consiste en l'inactivation génique d'un gène comprenant une séquence correspondant à la séquence SEQ ID N 13.

A titre illustratif, les microorganismes suivants peuvent être cités à titre d'exemple de tels microorganismes : OS49. 16 (or/3:: #hyg, cf. exemple 2), OS49.67 (orf3délétion en phase, cf exemple 6), OS49. 107 (or/8:: #hyg, cf. exemple 7), OS49.50

(or/10:: f2hyg, cf. exemple 8), SPM21 (oYfZ:: att3S2aac-, cf. exemple 10), SPM22 (orfZ: : att3 délétion en phase, cf. exemple 10), SPM501 (of6*: : attl S2hyg+, cf. exemple 14), SPM502 (orf6*:: attl délétion en phase, cf. exemple 14), SPM507 (orfl2::att3slaac-, cf. exemple 11), SPM508 (orfl3c: : att3S2aac-, cf. exemple 12), SPM509 (ofl4:: att3S2aac-, cf. exemple 13).

Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation d'un intermédiaire de biosynthèse de macrolide utilisant les microorganismes bloqués dans une étape de la voie de biosynthèse de macrolides, tels que décrits ci-dessus. Le procédé consiste à cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme bloqué dans une étape de la voie de biosynthèse de macrolides, tels que décrits ci-dessus, récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, par exemple par sonication ou par choc osmotique, séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape précédente, ledit intermédiaire de biosynthèse.

Les conditions de culture de tels microorganismes pourront être déterminées selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Le milieu de culture pourra par exemple être le milieu MP5 ou le milieu SL11pour les Streptomyces et notamment pour Streptomyces ambofaciens (Pernodet et al., 1993). L'homme du métier pourra notamment se référer à l'ouvrage de Kieser et al. (2000) en ce qui concerne la culture des Streptomyces. L'intermédiaire produit peut être récupéré par toutes techniques connues de l'homme du métier. L'homme du métier pourra se référer, par exemple, aux techniques enseignées dans le brevet américain US 3,000,785 et plus particulièrement aux méthodes d'extraction des spiramycines décrites dans ce brevet.

Un autre objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'une molécule dérivée d'un macrolide utilisant les microorganismes bloqués dans une étape de la voie de biosynthèse de ce macrolide, tels que décrits ci-dessus. Le procédé consiste à obtenir un intermédiaire de biosynthèse selon le procédé ci-dessus et à modifier l'intermédiaire ainsi produit, éventuellement après séparation du milieu de culture. Les conditions de culture de tels microorganismes pourront être déterminées selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Le milieu de culture pourra par exemple être le milieu MP5 ou le milieu SL11pour les Streptomyces et notamment pour Streptomyces ambofaciens (Pernodet et al., 1993). L'homme du métier pourra notamment se référer à l'ouvrage de Kieser et al. 2000 en ce qui concerne la culture des Streptomyces. Les intermédiaires produits peuvent être modifiés, éventuellement après séparation, soit par ajout de composants appropriés dans les milieux de production, soit par introduction dans les microorganismes d'autres gènes codant des protéines susceptibles de modifier l'intermédiaire en s'en servant comme substrat. Ces intermédiaires peuvent ainsi être modifiés par voie chimique, biochimique, enzymatique et/ou microbiologique. Plus préférentiellement, le macrolide en question est la spiramycine et les microorganismes dans lesquels sont effectuées la ou les mutagénèses sont des souches de S. ambofaciens.

L'invention est également relative à un microorganisme produisant de la spiramycine I mais ne produisant pas de spiramycine II et III. Ce microorganisme comprend l'ensemble des gènes nécessaires à la biosynthèse de la spiramycine I mais ne produit pas de spiramycine II et III car le gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID N 14 ou l'un de ses variants n'est pas exprimé ou a été rendu inactif.

L'inactivation de cette protéine peut être effectuée par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par mutagénèse dans le gène codant ladite protéine ou par l'expression d'un ARN anti-sens complémentaire de l'ARN messager codant ladite protéine, étant entendu que si l'expression de orf5* est affectée par cette manipulation, il sera nécessaire de procéder à une autre modification pour que le gène orf5* soit

correctement exprimé. La mutagénèse peut être effectuée dans la séquence codante ou dans une séquence non codante de manière à rendre inactive la protéine codée ou à en empêcher son expression ou sa traduction. La mutagénèse peut être effectuée par mutagénèse dirigée, par remplacement de gène ou toute autre méthode connue de l'homme du métier. Les conditions convenables d'une telle mutagénèse peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans les ouvrages de Kieser, T et al (2000) et Ausubel et al., 2002. La mutagénèse peut être effectuée in vitro ou in situ, par suppression, substitution, délétion et/ou addition d'une ou plusieurs bases dans le gène considéré ou par inactivation génique. Le microorganisme peut être également obtenu en exprimant les gènes de la voie de biosynthèse de la spiramycine sans que ceux-ci ne comprennent le gène comprenant la séquence SEQ ID N 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID N 14 ou l'un de ses variants. Préférentiellement, le microorganisme est une bactérie du genre Streptomyces.

Plus préférentiellement, le microorganisme produisant de la spiramycine 1 mais ne produisant pas de spiramycine II et III est obtenu à partir d'un microorganisme de départ produisant les spiramycines I, II et III. Encore plus préférentiellement, le microorganisme est obtenu par mutagénèse dans un gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID N 14 ou l'un de ses variants ayant la même fonction. Encore plus préférentiellement, cette mutagénèse est effectuée par inactivation génique. De manière préférée le microorganisme est obtenu à partir d'une souche de S. ambofaciens produisant les spiramycines I, II et III dans laquelle est effectuée une inactivation génique du gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N 13 ou l'une des séquences dérivées de celle-ci en raison de la dégénérescence du code génétique. De manière tout à fait préférée, l'inactivation génique est effectuée par délétion en phase du gène ou d'une partie du gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N 13 ou l'une des séquences dérivées de celle-ci en raison de la dégénérescence du code génétique. A titre illustratif, la souche SPM502 (orf6*::attl, cf. exemple 14) peut être

citée comme un microorganisme produisant de la spiramycine I mais ne produisant pas de spiramycine II et III.

L'invention est également relative à un microorganisme produisant de la spiramycine I mais ne produisant pas de spiramycine II et III tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce en ce qu'il surexprime en outre : - un gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymérase en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N 138) et 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens - ou un gène dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.

Un exemple de séquence d'un tel gène est donnée en SEQ ID N 111(ADN), cependant cette séquence est partielle puisqu'elle ne comprend pas la partie 3' de la séquence codante correspondante. La traduction en protéine de cette partie de séquence codante est donnée en SEQ ID N 112. L'homme du métier pourra aisément la compléter notamment en utilisant l'enseignement présenté dans l'exemple 24. Il est ainsi présenté dans cet exemple une méthode pour cloner le gène orf28c et pour fabriquer un vecteur d'expression permettant l'expression de orf28c. Il est également montré dans cet exemple que la surexpression du gène orf28c dans la souche OSC2 conduit à l'amélioration de la production en spiramycines de cette souche. La surexpression du gène orf28c peut être obtenue en augmentant le nombre de copies de ce gène et/ou en plaçant un promoteur plus actif que le promoteur sauvage. De façon préférée, la surexpression dudit gène est obtenue en apportant dans le microorganisme une construction d'ADN recombinant, permettant la surexpression de ce gène. De façon préférée, cette construction d'ADN recombinant augmente le nombre de copie dudit gène et permet d'obtenir une surexpression dudit gène. Dans cette construction d'ADN recombinant, la séquence codante du gène peut être placée sous le contrôle d'un promoteur plus actif que le promoteur sauvage. On peut citer à titre d'illustration le promoteur ptrc actif chez Streptomyces ambofaciens (Amann, E. et al., 1988) ainsi que

le promoteur ermE*. Ainsi, de façon préférée, la ou les copies du gène orf28c apportée sont placées sous le contrôle du promoteur ermE* comme c'est le cas dans la construction pSPM75 (cf. exemple 24).

L'invention est également relative à un microorganisme produisant de la spiramycine 1 mais ne produisant pas de spiramycine II et III tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce en ce qu'il surexprime en outre le gène de séquence codante SEQ ID N 47 ou d'une séquence codante dérivée de celle-ci en raison de la dégénérescence du code génétique. Préférentiellement, ce microorganisme est caractérisé en ce qu'il s'agit de la souche SPM502 pSPM525 déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 26 février 2003 sous le numéro d'enregistrement I- 2977.

L'invention est également relative à un procédé de production de spiramycine I, le procédé consiste à cultiver dans un milieu de culture approprié un microorganisme produisant de la spiramycine 1 mais ne produisant pas de spiramycine II et III tel que décrit ci-dessus, récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape précédente la spiramycine I. Les conditions de culture de tel microorganisme pourront être déterminées selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Le milieu de culture pourra par exemple être le milieu MP5 ou le milieu SL11 pour les Streptomyces et notamment pour Streptomyces ambofaciens (Pernodet et al., 1993). L'homme du métier pourra notamment se référer à l'ouvrage de Kieser et al. 2000 en ce qui concerne la culture des Streptomyces. La spiramycine 1 produite peut être récupérée par toutes techniques connues de l'homme du métier.

L'homme du métier pourra se référer, par exemple, aux techniques enseignées dans le brevet américain US 3,000,785 et plus particulièrement aux méthodes d'extraction des spiramycines décrites dans ce brevet.

Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation d'une séquence nucléotidique selon l'invention pour améliorer la production en macrolides d'un microorganisme.

Ainsi, l'invention concerne un microorganisme mutant producteur de macrolide caractérisé en ce qu'il possède une modification génétique dans au moins un gène comprenant une séquence telle que définie ci-dessus et/ou qu'elle surexprime au moins un gène comprenant une séquence telle que définie ci-dessus. La modification génétique peut consister en une suppression, une substitution, une délétion et/ou une addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés dans le but d'exprimer une ou des protéines ayant une activité supérieure ou d'exprimer un niveau plus élevé de cette ou de ces protéines. La surexpression du gène considéré peut être obtenue en augmentant le nombre de copies de ce gène et/ou en plaçant un promoteur plus actif que le promoteur sauvage. On peut citer à titre d'illustration le promoteur ptrc actif chez Streptomyces ambofaciens (Amann, E. et al., 1988) ainsi que le promoteur ermE* (Bibb et al., 1985), (Bibb et al., 1994). Ainsi la surexpression du gène considéré peut être obtenue en apportant dans un microorganisme producteur du macrolide considéré une construction d'ADN recombinant selon l'invention, permettant la surexpression de ce gène. En effet, certaines étapes de la biosynthèse des macrolides sont limitantes et si l'on exprime une ou plusieurs protéines plus actives ou un niveau d'expression plus important de la ou des protéines sauvages impliquées dans ces étapes limitantes, on peut améliorer la production du ou des macrolides concernés. Une augmentation du taux de production de la tylosine a par exemple été obtenue chez Streptomyces fradiae par duplication du gène codant une methyl transférase limitante convertissant la macrocine en tylosine (Baltz R, 1997). L'obtention de l'expression d'une protéine plus active peut être obtenue notamment par mutagénèse, l'homme du métier pourra par exemple se référer à ce sujet à l'ouvrage de F.Ausubel et al (2002). Préférentiellement, ces microorganismes mutants améliorés pour leur production en macrolides sont des bactéries du genre Streptomyces.

Plus préférentiellement, le macrolide en question est la spiramycine et les microorganismes dans lesquels sont effectuées la ou les mutagénèses sont des souches de S. ambofaciens. Plus préférentiellement, la modification génétique est effectuée dans un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs

des séquences SEQ ID N 3,5, 7, 9, Il, 13, 15, 17, 19,21,23,25,28,30,34,36,40,43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68,70, 72,74, 76,78, 80,82, 84,107, 109,111, 113,115, 118, et 120, ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique. De façon préférée, le microorganisme surexprime un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N 3,5, 7,9, 11,13, 15,17, 19, 21, 23, 25, 28, 30,34, 36,40, 43,45, 47,49, 53,60, 62,64, 66,68, 70,72, 74,76, 78,80, 82,84, 107, 109, 111,113, 115,118, et 120, ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique. De façon préférée, le microorganisme surexprime le gène comprenant une séquence correspondant à SEQ ID N 111, ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique. La séquence donnée en SEQ ID N 111 est partielle, cependant l'homme du métier pourra aisément la compléter notamment en utilisant l'enseignement présenté dans l'exemple 24. Il est ainsi présenté dans cet exemple une méthode pour cloner le gène orf28c et pour fabriquer un vecteur d'expression permettant l'expression de orf28c. Il est également montré dans cet exemple que la surexpression du gène orf28c dans la souche OSC2 conduit à l'amélioration de la production en spiramycines de cette souche. La surexpression du gène orf28c peut être obtenue en augmentant le nombre de copies de ce gène et/ou en plaçant un promoteur plus actif que le promoteur sauvage. De façon préférée, la surexpression du gène orf28c est obtenue en apportant dans le microorganisme une construction d'ADN recombinant, permettant la surexpression de ce gène. De façon préférée, cette construction d'ADN recombinant augmente le nombre de copie du gène orj28c et permet d'obtenir une surexpression du gène orf28c. Dans cette construction d'ADN recombinant, la séquence codante de orf28c peut être placée sous le contrôle , d'un promoteur plus actif que le promoteur sauvage. On peut citer à titre d'illustration le promoteur ptrc actif chez Streptomyces ambofaciens (Amann, E. et al., 1988) ainsi que le promoteur ermE*. Ainsi, de façon préférée, la ou les copies du gène orf28c apportée sont placées sous le contrôle du promoteur ermE* comme c'est le cas dans la construction pSPM75 (cf. exemple 24).

Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de production de macrolides utilisant les microorganismes décrits au paragraphe précédent. Ce procédé consiste à cultiver dans un milieu de culture approprié un microorganisme défini dans le paragraphe précédent, récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape précédente le ou les macrolides produits. Les conditions de culture de tels microorganismes pourront être déterminées selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Le milieu de culture pourra par exemple être le milieu MP5 ou le milieu SL11 pour les Streptomyces et notamment pour Streptomyces ambofaciens (Pernodet et al., 1993). L'homme du métier pourra notamment se référer à l'ouvrage de Kieser et al. 2000 en ce qui concerne la culture des Streptomyces. Le ou les macrolides produits peuvent être récupérés par toutes techniques connues de l'homme du métier. L'homme du métier pourra se référer, par exemple, aux techniques enseignées dans le brevet américain US 3,000,785 et plus particulièrement aux méthodes d'extraction des spiramycines décrites dans ce brevet. Préférentiellement, les microorganismes utilisés dans un tel procédé sont des bactéries du genre Streptomyces.

Plus préférentiellement, le macrolide en question est la spiramycine et les microorganismes mutants améliorés pour leur production en spiramycines sont des souches de S. ambofaciens.

Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation d'une séquence et/ou d'un vecteur selon l'invention pour la préparation d'antibiotiques hybrides. En effet, les polynucléotides selon l'invention peuvent servir à l'obtention de microorganisme exprimant une ou plusieurs protéines mutantes donnant lieu à une modification dans la spécificité du substrat ou encore être exprimés dans de multiples microorganismes producteurs d'antibiotiques dans le but de générer des antibiotiques hybrides. Ainsi les polynucléotides selon l'invention peuvent permettre, par transfert des gènes entre microorganismes producteurs, de fabriquer des antibiotiques hybrides ayant des propriétés pharmacologiquement intéressantes (Hopwood et al.,1985a, Hopwood et al.,1985b, Hutchinson et al., 1989). Le principe par lequel l'ingénierie génétique peut conduire à la production d'antibiotiques hybrides a été tout d'abord proposé par

Hopwood (Hopwood 1981). Il a ainsi été proposé que les enzymes participant à la biosynthèse d'antibiotiques acceptent souvent des substrats reliés structurellement, mais différents de leur substrat naturel. Il est généralement admis (Hopwood 1981, Hutchinson 1988, Robinson 1988) que les enzymes codées par les gènes de la voie de biosynthèse d'antibiotiques ont une spécificité de substrat moins stricte que les enzymes du métabolisme primaire. Il a ainsi pu être montré qu'un grand nombre de substrats nonnaturels sont transformés par des microorganismes producteurs d' antibiotique, leur mutants ou des enzymes purifiées de la voie de biosynthèse de ces antibiotiques (Hutchinson 1988). En utilisant cet enseignement, l'homme du métier pourra construire des microorganismes exprimant une ou plusieurs protéines mutantes donnant lieu à une modification dans la spécificité du substrat dans le but de générer des antibiotiques hybrides.

L'invention concerne également l'utilisation d'au moins un polynucléotide et/ou au moins un ADN recombinant et/ou au moins un vecteur d'expression et/ou au moins un polypeptide et/ou au moins une cellule hôte selon l'invention pour réaliser une ou plusieurs bioconversions. Ainsi l'invention permet de construire des souches bactériennes ou fongiques dans lesquelles on exprime, sous le contrôle de signaux d'expression appropriés, une ou plusieurs protéines selon l'invention. De telles souches peuvent alors être utilisées pour réaliser une ou des bioconversions. Ces bioconversions peuvent se faire soit à l'aide de cellules entières, soit à l'aide d'extraits acellulaires des dites cellules. Ces bioconversions peuvent permettre de transformer une molécule en une forme dérivée, avec une enzyme d'une voie de biosynthèse. Par exemple, Carreras et al. décrit l'utilisation de souche de Saccharopolyspora erythraea et de Streptomyces coelicolor pour la production de nouveau dérivés d'érithromycines (Carreras et al., 2002). Walczar et al. décrit l'utilisation d'une P450 mono-oxygénase de Streptomyces pour la bioconversion de désacétyladriamycine (un analogue de l'anthracycline) en de nouvelles anthracyclines (Walczar et al., 2001). Olonao et al. décrit l'utilisation d'une souche de Streptomyces lividans modifiée pour la bioconversion de rhodomycinone-

epsilon en rhodomycine D (Olonao et al., 1999). L'homme du métier pourra appliquer ce principe à tout intermédiaire de biosynthèse.

L'invention concerne également un ADN recombinant caractérisé en ce qu'il comprend : - un polynucléotide susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymérase en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N 138) et 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens - ou un fragment d'au moins 10,12, 15, 18, 20 à 25, 30, 40, 50,60, 70,80, 90,100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000,1050, 1100,1150, 1200,1250, 1300,1350, 1400,1450, 1460,1470, 1480, 1490 ou 1500 nucléotides consécutifs de ce polynucléotide.

Préférentiellement ; cet ADN recombinant est un vecteur. Encore plus préférentiellement, le vecteur est choisi parmi les bactériophages, les plasmides, les phagemides, les vecteurs intégratifs, les fosmides, les cosmides, les vecteurs navettes, les BAC (Bacterial Artificial Chromosome) ou les PAC (Pl-derived Artificial Chromosome). A titre illustratif on peut citer comme bactériophages le phage lambda et le phage M13. Comme plasmides on peut citer les plasmides se répliquant chez E. coli par exemple pBR322 et ses dérivés, pUC18 et ses dérivés, pUC19 et ses dérivés, pGB2 et ses dérivés (Churchward G. et al., 1984), pACYC177 (numéro d'accès GenBank : X06402) et ses dérivés, pACYC184 (numéro d'accès GenBank : X06403) et ses dérivés. On peut également citer les plasmides se répliquant chez Streptomyces comme par exemple pIJ101 et ses dérivés, pSG5 et ses dérivés, SLP1 et ses dérivés, SCP2* et ses dérivés (Kieser et al. 2000). Comme phagemides on peut citer à titre illustratif pBluescript II et ses dérivés (commercialisés notamment par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA)), pGEM-T et ses dérivés (commercialisé par la société Promega (Madison, Wisconcin, USA)), #ZAPII et ses dérivés (commercialisés notamment par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA)).

Comme vecteurs intégratifs on peut citer à titre illustratif, les vecteurs intégratifs chez Streptomyces comme par exemple ceux dérivés de SLP1 1 (Kieser et al, 2000), ceux dérivés de pSAM2 (Kieser et al, 2000), les vecteurs utilisant les systèmes d'intégration des phages PhiC31 (Kieser et al, 2000) (par exemple pSET152 (Bierman et al., 1992)) ou de VWB (Van Mellaert L, et al. 1998), ainsi que les vecteurs utilisant le système d'intégration de IS117 (Kieser et al. 2000). Comme fosmides on peut citer à titre illustratif le fosmide pFOSl (commercialisé par la société New England Bioloabs Inc., Beverly, Massachussetts, USA) et ses dérivés.

Comme cosmides on peut citer à titre illustratif le cosmide SuperCos et ses dérivés (commercialisés notamment par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA)), le cosmide pWED15 (Wahl et al., 1987) et ses dérivés. Comme vecteurs navettes on peut citer à titre illustratif les plasmides navettes E. coli / Streptomyces comme par exemple pIJ903 et ses dérivés, la série des plasmides pUWL, pCA0106, pWHM3, pOJ446 et leurs dérivés (Kieser et al. 2000), les BAC navettes E. coli / Streptomyces comme par exemple ceux décrits dans la demande de brevet WO 01/40497. Comme BAC (Bacterial Artificial Chromosome) on peut citer à titre illustratif le BAC pBeloBACll (numéro d'accès GenBank :U51113). Comme PAC (Pl-derived Artificial Chromosome) on peut citer à titre illustratif le vecteur pCYPAC6 (numéro d'accès GenBank : AF133437). Plus préférentiellement, cet ADN recombinant est un vecteur d'expression. Les vecteurs d'expression utilisables dans différents systèmes d'expression sont bien connus de l'homme du métier, en ce qui concerne les cellules procaryotes, on peut citer à titre illustratif les vecteurs d'expression chez E. coli par exemple, de la famille pET commercialisés par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA), les vecteurs de la famille GATEWAY commercialisés par la société Invitrogen (Carlsbad, Californie, USA), les vecteurs de la famille pBAD commercialisés par la société Invitrogen (Carlsbad, Californie, USA), les vecteurs de la famille pMAL commercialisés par la société New England Bioloabs Inc. (Beverly, Massachussetts, USA), les vecteurs d'expression inductibles par le rhamnose cités dans la publication Wilms B et al., 2001 et leurs dérivés, on peut également citer les vecteurs d'expression chez Streptomyces comme par exemple les vecteurs pIJ4123,

pIJ6021, pPM927, pANT849, pANT 850, pANT 851, pANT1200, pANT1201, pANT1202 et leurs dérivés (Kieser et al., 2000). En ce qui concerne les cellules de levures, on peut citer à titre illustratif le vecteur pESC commercialisé par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA). En ce qui concerne le système d'expression baculovirus permettant une expression dans des cellules d'insectes on peut citer à titre illustratif le vecteur BacPAK6 commercialisé par la société BD Biosciences Clontech, (Palo Alto, Californie, USA). En ce qui concerne les cellules de mammifères, on peut citer à titre illustratif des vecteurs comprenant le promoteur des gènes précoces du virus CMV (Cytomegalovirus) (par exemple le vecteur pCMV et ses dérivés commercialisés par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA), ou le promoteur des gènes immédiats (SV40 early promoter) du virus simien vacuolisant SV40 (par exemple le vecteur pSG5 commercialisé par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA). Un autre aspect de l'invention concerne des cellules hôtes dans laquelle a été introduit au moins un ADN recombinant décrit dans ce paragraphe.

Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de production d'un polypeptide caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes: a) transformer une cellule hôte par au moins un vecteur d'expression tel que décrit dans le paragraphe ci-dessus; b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, ladite cellule hôte; c) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire; d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape c), ledit polypeptide ; e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.

Le polypeptide recombinant ainsi produit peut être purifié par passage sur une série appropriée de colonnes de chromatographie, selon les méthodes connues de l'homme de l'art et décrites par exemple dans F. Ausubel et al (2002). On peut citer à titre illustratif la technique du Tag-Histidine , qui consiste à ajouter une courte séquence poly-histidine au polypeptide à produire, ce dernier pouvant ensuite être purifié sur colonne de nickel. Ce polypeptide peut également être préparé par les

techniques de synthèse in vitro. A titre illustratif de telles techniques, le polypeptide pourra être préparé grâce au système rapid translation system (RTS) , commercialisé notamment par la société Roche Diagnostics France S.A, Meylan, France.

Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme producteur d'au moins une spiramycine caractérisé en ce qu'il surexprime : -un gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymérase (PCR) en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N 138) et 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens, - ou un gène dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.

Un exemple de séquence d'un tel gène est donné en SEQ ID N 111 (ADN), cependant cette séquence est partielle puisqu'elle ne comprend pas la partie 3' de la séquence codante correspondante. La traduction en protéine de cette partie de séquence codante est donnée en SEQ ID N 112. L'homme du métier pourra aisément la compléter notamment en utilisant l'enseignement présenté dans l'exemple 24. Il est ainsi présenté dans cet exemple une méthode pour cloner le gène orj28c et pour fabriquer un vecteur d' expression permettant l' expression de orj28c. Il est également montré dans cet exemple que la surexpression du gène orj28c dans la souche OSC2 conduit à l'amélioration de la production en spiramycines de cette souche. De façon préférée, le microorganisme surexprimant - un gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymérase (PCR) en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N 138) et 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens, - ou un gène dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique est une bactérie du genre Streptomyces, de manière encore plus préférée, il s'agit d'une bactérie de l'espèce Streptomyces ambofaciens. De façon préférée, la surexpression

dudit gène est obtenue par transformation dudit microorganisme par un vecteur d'expression, de manière tout à fait préféré, la souche de microorganisme est la souche OSC2/pSPM75(l) ou de la souche OSC2/pSPM75(2).

Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de production de spiramycine(s) utilisant les microorganismes décrits au paragraphe précédent. Ce procédé consiste à cultiver dans un milieu de culture approprié un microorganisme défini dans le paragraphe précédent, récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape précédente le ou les spiramycines produites. Les conditions de culture de tels microorganismes pourront être déterminées selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Le milieu de culture pourra par exemple être le milieu MP5 ou le milieu SL11pour les Streptomyces et notamment pour Streptomyces ambofaciens (Pernodet et al., 1993). L'homme du métier pourra notamment se référer à l'ouvrage de Kieser et al. 2000 en ce qui concerne la culture des Streptomyces. Le ou les spiramycines produites peuvent être récupérés par toutes techniques connues de l'homme du métier. L'homme du métier pourra se référer, par exemple, aux techniques enseignées dans le brevet américain US 3,000,785 et plus particulièrement aux méthodes d'extraction des spiramycines décrites dans ce brevet. Préférentiellement, les microorganismes utilisés dans un tel procédé sont des bactéries du genre Streptomyces. Plus préférentiellement, les microorganismes sont des souches de S. ambofaciens.

Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur d'expression caractérisé en ce que le polynucléotide de séquence SEQ ID N 47 ou un polynucléotide dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique est placé sous le contrôle d'un promoteur permettant l'expression de la protéine codée par le dit polynucléotide chez Streptomyces ambofaciens. Des exemples de vecteurs d'expression utilisables chez Streptomyces ont été donnés ci-dessus.

Préférentiellement un tel vecteur d'expression est caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pSPM524 ou pSPM525.

Un autre aspect de l'invention concerne une souche de Streptomyces ambofaciens transformée par un vecteur défini dans le paragraphe précédent.

Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide caractérisé en ce que sa séquence comprend la séquence SEQ ID N 112. L'invention est également relative à un polypeptide caractérisé en ce que sa séquence correspond à la séquence traduite de la séquence codante : - d'un gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymérase (PCR) en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N 138) et 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens, -ou d'un gène dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.

Préferentiellement ces polypeptides sont exprimés à l'état naturel par une bactérie du genre Streptomyces, plus préférentiellement, ces polypeptides sont impliqués dans la biosynthèse des spiramycines.

Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur d'expression permettant l'expression d'un polypeptide tel que défini dans le paragraphe précédent chez Streptomyces ambofaciens. Des exemples de vecteurs d'expression utilisables chez Streptomyces ont été donnés ci-dessus. Préférentiellemnt, le vecteur d'expression en question est le plasmide pSPM75.

LISTE DES FIGURES Figure 1 : Structure chimique des spiramycines I, II et III.

Figure 2 : Cosmides utilisés pour le séquençage de la région.

Figure 3 : Organisation d'un groupe de gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des spiramycines.

Figure 4 : Voie de biosynthèse proposée du mycarose.

Figure 5 : Voie de biosynthèse proposée du mycaminose.

Figure 6 : Voie de biosynthèse proposée de la forosamine.

Figure 7 : Ordre préférentiel d'ajout des sucres dans la molécule de spiramycine et intermédiaires.

Figure 8 : Voie de biosynthèse proposée du méthoxymalonyl chez S. ambofaciens. Cette voie est proposée par analogie avec la biosynthèse du méthoxymalonyl chez Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus (Wu,K. et al.,2000).

Figure 9 : Etapes conduisant à l'inactivation d'un gène:
A) Clonage du gène cible dans un vecteur se répliquant chez E. coli et pas chez
Streptomyces;
B) Insertion de la cassette dans le gène cible (par clonage ou recombinaison entre courtes séquences identiques);
C) Introduction du plasmide chez Streptomyces ambofaciens (par transformation ou conjugaison) et sélection des clones ayant intégré la cassette puis criblage de clones ayant perdu la partie vecteur pour avoir un remplacement de gène;
D) Souche mutante dans laquelle le gène cible est inactivé.

Figure 10 : optionnelles suivant l'inactivation d'un gène selon la méthode décrite en figure 9, pouvant être conduites si une cassette excisable a été employée pour interrompre le gène cible :
E) Introduction dans la souche mutante du plasmide pOSV508 portant les gènes xis et int de pSAM2 dont les produits vont permettre l'excision efficace par recombinaison spécifique de site de la cassette;
F) Obtention de clones ayant perdu la cassette excisable et sensibles à l'antibiotique à laquelle la cassette donnait la résistance;
G) Après croissance et sporulation sur milieu solide sans antibiotique le plasmide pOSV508 est perdu à haute fréquence. On peut obtenir des clones sensibles au thiostrepton dans lesquels le gène cible contient une délétion en phase. La séquence du gène cible délété peut être contrôlée par PCR et séquençage du produit PCR.

Figure 11 : Amplification de la cassette excisable dans le but de l'utiliser pour une expérience de recombinaison homologue. La technique de recombinaison homologue grâce à de courtes séquences homologues a été décrite par (Chaveroche et al., 2000). Les 39 ou 40 déoxy-nucléotides situés à l'extrémité 5' de ces oligonucléotides comportent une séquence correspondant à une séquence du gène à inactiver et les 20 déoxynucléotides situés le plus en 3' correspondent à la séquence d'une des extrémités de la cassette excisable.

Figure 12 : Obtention d'une construction pour l'inactivation d'un gène cible grâce à la technique décrite par (Chaveroche et al., 2000).

Figure 13 : Carte du plasmide pWHM3. Strepto ori : origine de réplication Streptomyces.

Figure 14 : Carte du plasmide pOSV508.

Figure 15 : Exemple de structure d'une cassette excisable. Celle-ci est constituée de la cassette #hyg (Blondelet-Rouault et al., 1997) bordée des sites attR et attL (Raynal et al., 1998), entre lesquels un événement de recombinaison permettra l'excision de la cassette, grâce à l'expression des gènes xis et int.

Figure 16 : Carte du plasmide pBXLl 111.

Figure 17 : Carte du plasmide pBXL1112.

Figure 18 : Test microbiologique de production en spiramycine, basé sur la sensibilité d'une souche de Micrococcus luteus à la spiramycine. La souche de Micrococcus luteus utilisée est une souche naturellement sensible à la spiramycine mais résistante à la congocidine. Les différentes souches de Streptomyces à tester ont été cultivées en erlenmeyers de 500 ml contenant 70 ml de milieu MP5, inoculés à une concentration initiale de 2.5 106 spores/ml et mises à pousser à 27 C sous agitation orbitale de 250 rpm. Des prélèvements de moûts de fermentation ont été réalisés après 48,72 et 96 heures de culture et centrifugés. Une dilution au dixième de ces surnageants dans du milieu de culture stérile est utilisée pour le test. La souche indicatrice de Micrococcus luteus résistante à la congocidine mais sensible à la spiramycine (Gourmelen et al.,

1998) a été cultivée dans une boîte carrée de 12x12 cm. Des disques en papier Whatman AA ont été imbibés de 70 l de la dilution au dixième de chaque surnageant et déposés sur la surface de la boîte. Des disques imbibés d'une solution de spiramycine de différentes concentrations (2-4-8 ug/ml dans du milieu de culture MP5) sont utilisés comme gamme étalon. Les boîtes sont incubées à 37 C pendant 24 à 48h. Si le disque contient de la spiramycine, celle-ci diffuse dans l'agar et inhibe la croissance de la souche indicatrice de Micrococcus luteus. Cette inhibition crée un halo autour du disque, ce halo reflétant la zone où la souche de Micrococcus luteus n'a pas poussé. La présence de ce halo est donc une indication de la présence de spiramycine et permet de déterminer si la souche de S. ambofaciens correspondant au disque en question est productrice ou non productrice de spiramycine. Une comparaison avec les diamètres d'inhibition obtenus pour la gamme étalon permet d'obtenir une indication de la quantité de spiramycine produite par cette souche.

Figure 19: Chromatogramme CLHP du surnageant filtré du milieu de culture de la souche OSC2.

Figure 20 : Chromatogramme CLHP du surnageant filtré du milieu de culture de la souche SPM501.

Figure 21 : Chromatogramme CLHP du surnageant filtré du milieu de culture de la souche SPM502.

Figure 22 : Chromatogramme CLHP du surnageant filtré du milieu de culture de la souche SPM507.

Figure 23 : Chromatogramme CLHP du surnageant filtré du milieu dé culture de la souche SPM508.

Figure 24 : Chromatogramme CLHP du surnageant filtré du milieu de culture de la souche SPM509.

Figure 25 : Alignement de la protéine Orf3 (SEQ ID N 29) avec la protéine TylB (SEQ ID N 87) de S.fradiae réalisé grâce au programme FASTA.

Figure 26 : Alignement de la protéine MdmA de S. mycarofaciens (SEQ ID N 88) avec la protéine SrmD (SEQ ID N 16) réalisé grâce au programme FASTA.

Figure 27 : Exemple de séquences des sites résiduels après excision de la cassette excisable. En gras est indiqué le site att26 minimum tel que défini dans Raynal et al., 1998. La séquence de la phase 1 (attl) de 33 nucléotides est présentée en SEQ ID N 104, la séquence de la phase 2 (att2) de 34 nucléotides est présentée en SEQ ID N 105, la séquence de la phase 3 (att3) de 35 nucléotides est présentée en SEQ ID N 95.Figure 28 : Représentation schématique du gène orflO, localisation des amorces PCR utlisées et construction obtenue avec chaque couple d'amorces.

Figure 29 : Construction de la cassette pac-oritT.

Figure 30 : Carte du cosmide pWED2.

Figure 31 : Représentation schématique du groupe de gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des spiramycines et de la localisation des trois sondes utilisées pour isoler les cosmides de la banque d'ADN génomique de la souche OSC2 de Streptomyces ambofaciens chez E. coli (cf. exemple 19).Figure 32 : Localisation des inserts des cosmides isolés de la banque d'ADN génomique de la souche OSC2 de Streptomyces ambofaciens chez E. coli (cf. exemple 19).Figure 33 : Sous clonage du fragment PstIPstl du cosmide pSPM36 (insert du plasmide (pSPM58), sous clonage du fragment Stul-Stul du cosmide pSPM36 (insert du plasmide pSPM72) et sous clonage d'un fragment EcoRI-StuI (insert du plasmide pSPM73).

Figure 34 : Localisation des phases ouvertes de lecture indentifiées dans l'insert PstIPstI du plasmide pSPM58 et dans l'insert EcoRI-Stul du plasmide pSPM73.

Figure 35 : Superposition des chromatogrammes CLHP du surnageant filtré du milieu de culture de la souche OS49. 67 réalisés à 238 et 280nm (haut) et spectres UV des molécules élués à 33,4 minutes et 44,8 minutes (bas).

Figure 36 : Structure moléculaire des molécules platénolide A et platénolide B.

Figure 37 : Organisation du groupe de gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des spiramycines.

La présente invention est illustrée à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.

En résumé, les gènes de la voie de biosynthèse des spiramycines ont été isolés à partir d'une banque d'ADN génomique de Streptomyces ambofaciens. Cette banque a été obtenue par digestion partielle de l'ADN génomique de Streptomyces ambofaciens, par l'enzyme de restriction BamHI. De larges fragments d'ADN, de 35 à 45 kb en moyenne, ont été clonés dans le cosmide pWEDl (Gourmelen et al., 1998) dérivé du cosmide pWED15 (Wahl et al., 1987). Ces cosmides ont été introduits chez E. coli grâce à des particules phagiques. La banque ainsi obtenue a été hybridée avec une sonde (de séquence SEQ ID N 86) correspondant à une partie du gène tylB de S. fradiae (MersonDavies & Cundliffe, 1994, numéro d'accès GenBank : U08223). Après hybridation, un cosmide sur les 4 s'hybridant avec la sonde a été plus particulièrement sélectionné. Ce cosmide nommé pOS49. 1 a ensuite été digéré par SacI et un fragment de 3,3 kb contenant la région s'hybridant avec la sonde a été sous cloné dans le vecteur pUC19 et séquence. Quatre phases ouvertes de lectures ont été identifiées et l'une d'entre elles code une protéine (SEQ ID N 29) présentant de fortes similitudes de séquence avec la protéine TylB de S. fradiae (SEQ ID N 87) (cf. figure 25). Ce gène a été nommé or/3 (SEQ ID N 28) et a été inactivé chez S. ambofaciens. Il a pu être démontré que les clones inactivés dans le gène or/3 ne produisent plus de spiramycines. Ceci montre l'implication du gène orf3 ou de gènes situés en aval dans la biosynthèse des spiramycines.

Une fois cette confirmation obtenue, une plus grande région du cosmide pOS49.1 a été séquencée, de part et d'autre du fragment SacI précédemment étudié. Ainsi, à partir du cosmide pOS49. 1, la séquence d'une région comportant sept phases ouvertes de lecture entières et deux autres incomplètes, situées de part et d'autre de ces sept phases ouvertes complètes, a pu être obtenue. Grâce à une recherche dans les bases de données, il a pu être montré que l'une des phases ouvertes de lecture incomplète correspondait au locus srmG (région codant une enzyme appelée polyketide synthase (PKS)). Les gènes correspondants ont été clonés par Burgett S. et al. en 1996 (Brevet américain US

5,945,320). Par ailleurs, les autres phases ouvertes de lecture, les sept ORFs entières nommées : or/7, orf2, or/3, orf4, or/?, orf6, orf7 (SEQ ID N 23,25, 28,30, 34,36, 40) et le début de la huitième ORF nommé or/8 (séquence SEQ ID N 43) n'ont pas été retrouvées dans les bases de données.

Dans un deuxième temps et dans le but de cloner d'autres gènes impliqués dans la biosynthèse des spiramycines, d'autres cosmides comportant des fragments du génome de S. ambofaciens dans cette même région ont été isolés. Pour cela une nouvelle série d'hybridations sur colonies a été effectuée en utilisant trois sondes. La première sonde correspond à un fragment d'ADN de 3,7kb contenant orfl, orf2 et le début de or/3, sous cloné à partir de pOS49.1. La deuxième sonde correspond à un fragment de 2 kb d'ADN contenant une partie de orf7 et une partie de orf8 et sous cloné à partir de pOS49. 1. Une troisième sonde a également été utilisée. Cette dernière correspond à un fragment d'ADN de 1.8kb contenant le gène srmD. Le gène srmD est un gène isolé de S. ambofaciens capable de conférer la résistance à la spiramycine. En effet, des travaux antérieurs avaient permis le clonage de plusieurs déterminants de résistance de S. ambofaciens, conférant la résistance à la spiramycine à une souche de S. griseofuscus (souche sensible à la spiramycine) (Pernodet et al., 1993) (Pernodet et al., 1999). Pour l'isolement de gènes de résistances, une banque cosmidique de l'ADN génomique de la souche S. ambofaciens avait été réalisée dans le cosmide pKC505 (Richardson MA et al., 1987). Ce pool de cosmides avait été introduit chez S. griseofuscus, naturellement sensible à la spiramycine. Cinq cosmides capables de conférer la résistance à l'apramycine et la spiramycine chez S. griseofuscus avaient ainsi été obtenus. Parmi ces 5 cosmides, un cosmide nommé pOS44. 1 possède dans son insert le gène srmD qui code une protéine présentant une certaine similitude avec la protéine codée par le gène mdmA de Streptomyces mycarofaciens et impliquée dans la résistance à la midécamycine chez cet organisme producteur (Hara et al., 1990, numéro d'accès Genbank : A60725) (figure 26). La troisième sonde utilisée pour localiser les gènes de biosynthèse de spiramycine a été un insert d' environ 1.8kb comprenant le gène srmD.

Ces trois sondes ont été utilisées pour hybrider la banque d'ADN génomique décrite ci-dessus et ont permis de choisir deux cosmides (pSPM7 et pSPM5) susceptibles de contenir les inserts les plus longs et n'ayant pas de bandes communes.

Le cosmide pSMP5 hybridait avec la première et la deuxième sonde, mais n'hybridait pas avec la troisième sonde, alors que le cosmide pSPM7 hybridait avec la troisième sonde seulement. Ces deux cosmides ont été séquences en totalité par la technique du séquençage en aveugle ( shotgun sequencing ). Les séquences des inserts de ces deux cosmides : pSPM7 et pSPM5 ont pu être assemblées car bien que ne se chevauchant pas, chacun des inserts comprenait une séquence connue à l'une de ses extrémités. En effet, chacun de ces inserts comportait un fragment de la séquence d'un des gènes codant une enzyme appelée polyketide synthase (PKS). Ces 5 gènes ont été clonés par Burgett S. et al. en 1996 (Brevet américain US 5,945,320) (cf. figure 2). Ainsi, il a pu être déterminé une séquence unique d'ADN génomique de S. ambofaciens. Une séquence de 30943 nucléotides partant, en 5', d'un site EcoRI situé dans le premier gène PKS et allant jusqu'à un site BamHI en 3' est présentée en SEQ ID N 1. Cette séquence correspond à la région amont des gènes de la PKS (cf. figure 2 et 3). Une deuxième région de 11171 nucléotides, partant d'un site PstI en 5' et allant jusqu'à un site BstEII en 3' situé dans le cinquième gène de la PKS est présentée en SEQ ID N 2. Cette région est la région aval des gènes de la PKS (l'aval et l'amont étant définis par l'orientation des 5 gènes de PKS tous orientés dans le même sens) (cf. figures 2 et 3).

Dans un troisième temps et dans le but de cloner d'autres gènes impliqués dans la biosynthèse des spiramycines, d'autres cosmides comportant des fragments du génome de S. ambofaciens dans cette même région ont été isolés (cf. exemple 18 et 19).

EXEMPLE 1 : Construction d'une banque d'ADN génomique de la souche ATCC23877 de Streptomyces ambofaciens chez E. coli 1. 1. Extraction de l'ADN génomique de la souche ATCC23877 de Streptomyces ambofaciens.

La souche ATCC23877 de Streptomyces ambofaciens (accessible notamment auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, Virginie, USA), sous le numéro 23877) a été cultivée en milieu YEME (Yeast Extract-Malt Extract) ((Kieser, T, et al.,2000) et l'ADN génomique de cette souche a été extrait et purifié selon les techniques standards de lyse et précipitation (Kieser T. et al., 2000).

1.2. Construction de la banque d'ADNgénomique
L'ADN génomique de la souche ATCC23877 de Streptomyces ambofaciens tel qu'isolé ci-dessus a été digéré partiellement par l'enzyme de restriction BamHI de manière à obtenir des fragments d'ADN de taille comprise entre environ 35 et 45 kb.

Ces fragments ont été clonés dans le cosmide pWEDl (Gourmelen et al., 1998) digéré au préalable par BamHI. Le cosmide pWEDl est dérivé du cosmide pWE15 (Wahl, et al., 1987) par délétion du fragment HpaI-HpaI de 4. 1 kb contenant le module d'expression actif chez les mammifères (Gourmelen et al., 1998). Le mélange de ligation a ensuite été encapsidé in vitro dans des particules de phages lambda grâce au système Packagene Lambda DNA packaging system commercialisé par la société Prômëgà en suivant les recommandations du fabriquant. Les particules phagiques obtenues ont été utilisées pour infecter la souche SURE@ d'E. coli commercialisée par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA). La séléction des clones a été effectuée sur milieu LB + ampicilline (50 g/ml) puisque le cosmide pWEDl confère la résistance à l'ampicilline.

EXEMPLE 2 : Isolement et caractérisation de gènes impliqués dans la biosynthèse de spiramycines chez Streptomyces ambofaciens 2. 1 Hybridation sur colonie des clones d'E. coli de la banque génomique de Streptomyces ambofaciens ATCC23877
Environ 2000 clones d'E. coli de la banque obtenue ci-dessus, ont été transférés sur filtre pour hybridation sur colonies. La sonde utilisée pour l'hybridation est un fragment NaeI-NaeI d'ADN (SEQ ID N 86) comportant une partie du gène tylB de Streptomycesfradiae. Ce fragment correspond aux nucléotides 2663 à 3702 du fragment d'ADN décrit par Merson-Davies, L. A. & Cundliffe E. (Merson-Davies, L. A. & Cundliffe E., 1994, numéro d'accès GenBank : U08223), dans lequel la séquence codante du gène tylB correspond aux nucléotides 2677 à 3843.

Le fragment NaeI-NaeI d'ADN portant une partie du gène tylB de Streptomyces fradiae (SEQ ID N 86) a été marquée au 32P par la technique du random priming (Kit commercialisé par la société Roche) et utilisé comme sonde pour l'hybridation des 2000 clones de la banque, transférés sur filtre. Les membranes utilisées sont des membranes nylon Hybond N commercialisées par la société Amersham (Amersham Biosciences, Orsay, France) et l'hybridation a été effectuée à 55 C dans le tampon décrit par Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984). Un lavage a été effectué en 2X SSC à 55 C pendant 15 minutes et deux lavages successifs en 0. 5X SSC ont ensuite été effectués à 55 C, d'une durée de 15 minutes chacun. Dans ces conditions d'hybridation et de lavage, 4 clones parmi les 2000 hybridés présentaient un fort signal d'hybridation.

Ces 4 clones ont été cultivés en milieu LB+ ampicilline (50 ng/ml) et les 4 cosmides correspondants ont été extraits par lyse alcaline standard (Sambrook et al., 1989). Il a ensuite été vérifié que l'hybridation était bien due à un fragment d'ADN présent dans l'insert de ces quatre cosmides. Pour cela, les cosmides ont été digérés indépendamment par plusieurs enzymes (BamHI, PstI et SacI). Les produits de digestions ont été séparés sur gel d'agarose, transférés sur membrane Nylon et hybridés par le fragment NaeI-NaeI d'ADN comportant une partie du gène tylB de Streptomycesfradiae (cf. ci-dessus) dans

les mêmes conditions que ci-dessus. Les quatres cosmides ont pu être validés et un de ces cosmides a été plus particulièrement retenu et a été nommé pOS49.1.

2. 2 Vérification de l'implication de la région identifiée et séquençage de l'insert du cosmide pOS49.1
Plusieurs fragments de l'insert du cosmide pOS49.1 ont été sous-clonés et leurs séquences ont été déterminées. Le cosmide pOS49. 1 a été digéré par l'enzyme SacI et il a été montré par Southern blot, dans les conditions décrites précédemment, qu'un fragment de 3,3 kb contient la région s'hybridant avec la sonde tylB. Ce fragment de 3,3 kb a été isolé par électroélution à partir d'un gel d'agarose 0. 8% puis cloné dans le vecteur pUC19 (numéro d'accès GenBank M77789) et séquence. Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pOS49.11. Quatre phases ouvertes de lecture présentant un usage des codons typique de Streptomyces ont pu être identifiées dans ce fragment (deux complètes et deux tronquées), grâce au programme FramePlot (Ishikawa J & Hotta K.

1999). Des comparaisons de séquences grâce au programme FASTA (cf.. (Pearson W. R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990), accessible notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France) ont permis de montrer que la protéine déduite de l'une de ces 4 phases ouvertes de lecture présente de fortes similitudes de séquence avec la protéine TylB (SEQ ID N 87 ; Numéro d'accès GenBank : U08223) de S. fradiae (cf. figure 25). Cette protéine a été nommée Orf3 (SEQ ID N 29).

Dans le but de tester si le gène correspondant (le gène or/3 (SEQ ID N 28)) était impliqué dans la biosynthèse des spiramycines chez S. ambofaciens, ce gène a été interrompu par une cassette #hyg (Blondelet-Rouault M-H. et al.,1997, numéro d'accès GenBank : X99315). Pour cela, le plasmide pOS49.11 a été digéré par l'enzyme XhoI et le fragment contenant les quatre phases ouvertes de lecture (deux complètes et deux tronquées, dont or/3 en entier) a été sous-cloné au niveau du site XhoI du vecteur pBC SK+ commercialisé par la société Stratagene (LaJolla, Califonnie, USA). Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pOS49. 12. Dans le but d'inactiver or/3, un fragment PmlI- BstEII interne à or/3 a été remplacé par la cassette #hyg par clonage bout franc dans ce

dernier plasmide. Pour cela, le plasmide pOS49. 12 a été digéré par les enzymes PmlI et BstEII dont le site unique se trouve dans la séquence codante du gène or/3. Les extrémités du fragment correspondant au vecteur ont été rendues bouts francs par un traitement-par l'enzyme de Klenow (grand fragment de la DNA polymerase I). La cassette Qhyg a été obtenue par digestion par l'enzyme BamHI du plasmide pHP45 #hyg (Blondelet-Rouault et al., 1997, numéro d'accès GenBank : X99315). Le fragment correspondant à la cassette #hyg a été récupéré sur gel d'agarose et ses extrémités ont été rendues bouts francs par un traitement par l'enzyme de Klenow. Les deux fragments bouts francs ainsi obtenus (la cassette Qhyg et le plasmide pOS49.12) ont été ligués et le produit de ligation a été utilisé pour la transformation de bactéries E. coli. Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pOS49. 14 et contient le gène or/3 interrompu par la cassette Qhyg.

L'insert du plasmide pOS49. 14, sous la forme d'un fragment Xhol-Xhol dont les extrémités ont été rendues non cohésives par un traitement par l'enzyme de Klenow, a été cloné au niveau du site EcoRV du plasmide pOJ260 (le plasmide pOJ260 est un plasmide conjugatif capable de se répliquer chez E. coli mais incapable de se répliquer chez S. ambofaciens (Bierman M et al., 1992). Ce plasmide confère la résistance à l'apramycine chez E. coli et Streptomyces). Le plasmide obtenu (insert du plasmide pOS49. 14 cloné dans le plasmide pOJ260) a été nommé pOS49. 16. Ce dernier a été transféré dans la souche ATCC23877 de S. ambofaciens par conjugaison à l'aide de la souche conjugative E. coli S 17-1, comme décrit par Mazodier et al. (Mazodier et al., 1989). La souche E. coli S17-1 est dérivée de la souche E. coli 294 (Simon et al., 1983) (Simon, et al., 1986). Des clones transconjugants possédant le marqueur de résistance à l'hygromycine porté par la cassette Qhyg et ayant perdu le marqueur de résistance à l'apramycine porté par le vecteur pOJ260 ont pu être obtenus. Pour cela, après conjugaison, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'hygromycine. Les clones résistants à l'hygromycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec hygromycine (antibiotique B) et sur milieu avec apramycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'hygromycine (HygR) et sensibles à l'apramycine (ApraS)

sont en principe ceux où un double événement de recombinaison s'est produit et qui possèdent donc le gène orf3 interrompu par la cassette Qhyg. Le remplacement de la copie sauvage de orf3 par la copie interrompue a été vérifié par deux hybridations successives. Ainsi, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par différentes enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybridé avec une sonde correspondant à la cassette #hyg (cf. ci-dessus)) pour vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique des clones obtenus. Une deuxième hybridation a été effectuée en utilisant comme sonde l'insert XhoI-XhoI du plasmide pOS49.11 contenant les quatre phases ouvertes de lecture (deux complètes et deux tronquées, dont orf3 en entier). La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR. Un des clones or/3:: #hyg ainsi obtenu et dont le génotype a été vérifié, a été choisi et a été appelé OS49.16.

La production en spiramycine du clone OS49. 16 ainsi obtenu a été testée grâce au test de production décrit plus bas (cf. exemple 15). Il a ainsi pu être démontré que cette souche ne produit plus de spiramycine, confirmant l'implication de or/3 et/ou des gènes situés en aval comme par exemple orf4 dans la biosynthèse des spiramycines.

Une fois cette confirmation obtenue, une plus grande région du cosmide pOS49.1 a été séquencée, de part et d'autre du fragment SacI précédemment étudié. Ainsi, à partir du cosmide pOS49.1, la séquence d'une région comportant sept phases ouvertes de lecture entières et deux autres incomplètes, situées de part et d'autre de ces sept phases ouvertes complètes, a pu être obtenue. Grâce à une recherche dans les bases de données, il a pu être montré que l'une des phases ouvertes de lecture incomplète correspondait au locus srmG (région codant une enzyme appelée polyketide synthase (PKS)). Les gènes correspondants ont été clonés par Burgett S. et al. en 1996 (Brevet américain US 5,945,320). Par ailleurs, les autres phases ouvertes de lecture : sept ORFs entières nommées : orfl, orf2, orf3, orf4, or/5, orf6, or/7 (SEQ ID N 23,25, 28,30, 34,36 et 40) et le début de la huitième ORF nommée or/8 (la séquence entière de cette orf est donnée en SEQ ID N 43) n'ont pas été retrouvées dans les bases de données.

EXEMPLE 3 : Isolement et caractérisation d'autres gènes impliqués dans la biosynthèse de spiramycines chez Streptomyces ambofaciens
Dans un deuxième temps et dans le but de cloner d'autres gènes impliqués dans la biosynthèse des spiramycines, d'autres cosmides comportant des fragments du génome de S. ambofaciens dans cette même région ont été isolés. Pour cela il a été procédé à une nouvelle série d'hybridations sur colonies en utilisant trois sondes : - La première sonde utilisée correspond à un fragment d'ADN BamHI-PstI de 3,7kb contenant un fragment du gène de la PKS (Les gènes correspondant à la PKS ont été clonés par Burgett S. et al. en 1996 (Brevet américain US 5,945,320)), orfl, orf2 et le début de or/3, sous cloné à partir de pOS49.1 et allant d'un site BamHI situé 1300 paires de bases en amont du site EcoRI définissant la position 1 de SEQ ID N 1, jusqu'au site Pstl situé en position 2472 (SEQ ID N 1). Ce fragment BamHI-Pstl a été sous cloné à partir de pOS49. 1 dans le plasmide pBC SK+, ce qui a permis d'obtenir le plasmide pOS49. 28.

- La deuxième sonde utilisée correspond à un fragment d'ADN PstI-BamHI d'environ 2kb contenant un fragment d'or/7 et d'orf8, sous cloné à partir de pOS49. 1 et allant d'un site PstI situé en position 6693 de SEQ ID N 1 jusqu'au site BamHI situé en position 8714 de SEQ ID N 1. Ce fragment PstI-BamHI a été sous cloné à partir de pOS49.1 dans le plamside pBC SK+, ce qui a permis d'obtenir le plasmide pOS49.76.

- Une troisième sonde a également été utilisée. Cette dernière correspond à un fragment d'ADN de 1.8kb EcoRI-HindIII contenant le gène srmD. Le gène srmD est un gène isolé de S. ambofaciens capable de conférer la résistance à la spiramycine. En effet, des travaux antérieurs avaient permis le clonage de plusieurs déterminants de résistance de S. ambofaciens, conférant la résistance à la spiramycine à une souche de S. griseofuscus (souche sensible à la spiramycine) (Pernodet et al., 1993) (Pernodet et al., 1999). Pour isoler des gènes de résistance, une banque cosmidique de l'ADN génomique de la souche S. ambofaciens ATCC23877 avait été réalisée dans le cosmide pKC505

(Richardson MA et al., 1987). Pour cela l'ADN génomique de la souche S. ambofaciens ATCC23877 avait été digéré partiellement par Sau3AI de manière à obtenir des fragments de taille comprise entre environ 30 et 40 kb. L'ADN génomique ainsi digéré (3 g) avait été ligué avec 1 g du pKC505 préalablement digéré par l'enzyme BamHI (Pernodet et al., 1999). Le mélange de ligation avait ensuite été encapsidé in vitro dans des particules phagiques. Les particules phagiques obtenues avaient été utilisées pour infecter la souche d'E. coli HB101 (accessible notamment auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, Virginie, USA), sous le numéro 33694). Environ 20 000 clones d'E. coli résistant à l'apramycine avaient été poolés et les cosmides de ces clones avaient été extraits. Ce pool de cosmides avait été introduit par transformation de protoplastes dans la souche DSM 10191 de S. griseofuscus (Cox KL & Baltz RH. 1984), naturellement sensible à la spiramycine (Rao RN et al., 1987, cette souche est disponible notamment auprès de la German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), (Braunschweig, Allamagne), sous le numéro DSM 10191). Les transformants avaient été sélectionnés sur un milieu contenant de l'apramycine. 1300 des clones poussant sur milieu contenant de l'apramycine avaient été transférés sur milieu contenant 5 g/ml de spiramycine. Plusieurs clones résistants à l'apramycine avaient également poussé sur milieu contenant de la spiramycine et les cosmides de ces colonies avaient été extraits et utilisés pour transformer E. coli et S. griseofuscus (Pemodet et al., 1999). Cinq cosmides capables de conférer la résistance à l'apramycine à E. coli et la co-résistance à l'apramycine et la spiramycine chez S. griseofuscus avaient ainsi été obtenus. Parmi ces 5 cosmides, il a été déterminé qu'un cosmide nommé pOS44.1 possède dans son insert un gène (SEQ ID N 15) qui code une protéine (SEQ ID N 16) présentant une certaine similitude avec une protéine codée par le gène mdmA de Streptomyces mycarofaciens (SEQ ID N 88), ce gène a été nommé srmD (cf. alignement présenté en figure 26 réalisé grâce au programme FASTA (cf.. (Pearson W. R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990), accessibles notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France).

Pour isoler le déterminant de résistance contenu dans le plasmide pOS44. 1, celuici a été digéré partiellement par l'enzyme de restriction Sau3AI de manière à obtenir des fragments de taille d'environ 1,5 à 3 kb, ces fragments ont été ligués dans le vecteur pIJ486 linéarisé par l'enzyme BamHI (Ward et al., 1986). Un plasmide a été sélectionné pour sa capacité à conférer la résistance à la spiramycine chez la souche DSM 10191 de S. griseofuscus (Rao RN et al., 1987), naturellement sensible à la spiramycine (cf. cidessus). Pour cela, le pool de plasmides correspondant aux fragment Sau3AI de pOS44.1 ligués dans le vecteur pIJ486 (cf. ci-dessus), a été introduit par transformation de protoplastes dans la souche DSM 10191 et les transformants ont été sélectionnés pour leur résistance au thiostrepton (due au gène tsr porté par pIJ486). Les clones poussant sur milieu contenant du thiostrepton ont été transférés sur milieu contenant de la spiramycine. Plusieurs clones résistants au thiostrepton ont également poussé sur milieu contenant de la spiramycine et les plasmides de ces colonies ont été extraits. Un plasmide conférant la résistance et contenant un insert d'environ 1.8kb a été sélectionné et nommé pOS44. 2. Cet insert de 1. 8kb peut être sorti facilement grâce à un site HindIII et un site EcoRI présents dans le vecteur de part et d'autre de l'insert. Cet insert de 1.8kb HindIII-EcoRI a été séquence et le gène de résistance qu'il renferme a été nommé srmD. Ce fragment contenant le gène srmD a ainsi pu être facilement sous-cloné dans le vecteur pUC19 (numéro d'accès GenBank M77789) ouvert par EcoRI-HindIII, le plasmide obtenu a été nommé pOS44. 4. L'insert de 1.8kb HindIII-EcoRI, contenant le gène srmD, de ce plasmide a été utilisé comme sonde pour localiser les gènes de biosynthèse de spiramycine (cf. ci-dessous).

Un échantillon d'une souche Escherichia Coli DH5a contenant le plasmide pOS44. 4 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2918.

Environ 2000 clones de la banque, obtenus ci-dessus (cf. exemple 1), ont été transférés sur filtre pour hybridation sur colonies selon les techniques classiques (Sambrook et al., 1989).

Les trois sondes décrites ci-dessus ont été marquées au 32P par la technique du random priming (Kit commercialisé par Roche) et utilisées pour l'hybridation des 2000 clones de la banque, transférés sur filtre. L'hybridation a été effectuée à 65 C dans le tampon décrit par Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984). Un lavage a été effectué en 2X SSC à 65 C pendant 15 minutes et deux lavages successifs ont ensuite été effectués en 0.5X SSC à 65 C, d'une durée de 15 minutes chacun. Dans ces conditions d'hybridation et de lavage, 16 clones parmi les 2000 hybridés présentaient un fort signal d'hybridation avec au moins une des sondes. Cependant, aucun cosmide n'hybridait avec les trois sondes. Les 16 cosmides ont été extraits et digérés par l'enzyme de restriction BamHI. La comparaison des profils de restriction de ces différents cosmides entre eux, a conduit à choisir deux cosmides susceptibles de contenir les inserts les plus longs de la région et n'ayant pas de bandes communes. Ainsi deux cosmides l'un nommé pSPM5 et l'autre pSPM7 ont été choisis. Le cosmide pSPM5 hybridait avec les sondes orfl à orf4 et la sonde or/8, mais n'hybridait pas avec la sonde srmD. pSPM7 hybridait seulement avec la sonde srmD et pas avec les deux autres sondes.

Ces deux cosmides ont été séquences en totalité par la technique du séquençage en aveugle ( shotgun sequencing ). Les séquences des inserts de ces deux cosmides : pSPM7 et pSPM5 ont pu être assemblées car bien que ne se chevauchant pas, chacun des inserts comprenait une séquence connue à l'une de ses extrémités. En effet, chacun de ces inserts comportait un fragment de la séquence d'un des gènes codant une enzyme appelée polyketide synthase (PKS). Ces 5 gènes ont été clonés par Burgett S. et al. en 1996 (Brevet américain US 5,945,320) (cf. figure 2). Ainsi, il a pu être déterminé une séquence unique d'ADN génomique de S. ambofaciens. Une séquence de 30943 nucléotides partant en 5' d'un site EcoRI situé dans le premier gène PKS et allant jusqu'à un site BamHI en 3' est présentée en SEQ ID N 1. Cette séquence correspond à la région amont des gènes de la PKS (cf. figure 2 et 3). Une deuxième région de 11171 nucléotides, partant d'un site PstI en 5' et allant jusqu'à un site NcoI en 3' situé dans le cinquième gène de la PKS est présentée en SEQ ID N 2. Cette deuxième région est la

région aval des gènes de la PKS (l'aval et l'amont étant défini par l'orientation des 5 gènes de PKS tous orientés dans le même sens) (cf. figure 2 et 3).

EXEMPLE 4 : Analyse des séquences nucléotidiques, détermination des phases ouvertes de lecture et caractérisation des gènes impliqués dans la biosynthèse des spiramycines.

Les séquences obtenues ont été analysées grâce au programme FramePlot (Ishikawa J & Hotta K. 1999). Ceci a permis d'identifier, parmi les phases ouvertes de lecture, les phases ouvertes de lecture présentant un usage des codons typique de Streptomyces. Cette analyse a permis de déterminer que cette région comporte 35 ORFs localisées de part et d'autre de cinq gènes codant l'enzyme polyketide synthase (PKS). Respectivement 10 et 25 ORFs ont été identifiées en aval et en amont de ces gènes (l'aval et l'amont étant défini par l'orientation des 5 gènes de PKS tous orientés dans le même sens) (cf. figure 3). Ainsi, les 25 phases ouvertes de lecture de ce type, occupant une région d'environ 31 kb (SEQ ID N 1 et figure 3) ont été identifiées en amont des 5 gènes codant la PKS et 10 occupant une région d'environ 11,1kb (SEQ ID N 2 et figure 3), ont été identifiées en aval des gènes de la PKS. Les gènes de la région amont ont été nommés or/7, or/2, or/3, orf4, orf5, orf6, orf7, orf8, orf9c, or/70, orfllc,

orfl2, orfl3c, orfl4, orf]5c, orj76, orfl7, orfl8, orfl9, orflo, or/2 le, orf22c, orf23c, orf24c et orf25c (SEQ ID N 23,25, 28,30, 34,36, 40,43, 45,47, 49,53, 60,62, 64, 66,68, 70,72, 74,76, 78,80, 82 et 84). Les gènes de la région aval ont été nommés

orfl *c, orf2*c, orf3 *c, orf4 *c, or/?*, orf6*, orf7*c, orf8*, or/9* or/70* (SEQ ID N 3, 5,7, 9, 11, 13,15, 17,19 et 21). Le c ajouté dans le nom du gène signifiant pour l'ORF en question que la séquence codante est dans l'orientation inverse (le brin codant est donc le brin complémentaire de la séquence donnée en SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 2 pour ces gènes) (cf. figure 3).

Les séquences protéiques déduites de ces phases ouvertes de lecture ont été comparées avec celles présentes dans différentes bases de données grâce à différents

programmes : BLAST (Altschul et al., 1990) (Altschul et al., 1997), CD-search, COGs (Cluster of Orthologous Groups) (ces trois programmes sont accessibles notamment auprès du National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Bethesda, Maryland, USA)), FASTA ((Pearson W. R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990), BEAUTY (Worley K. C.. et al., 1995)), (ces deux programmes sont accessibles notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France). Ces comparaisons ont permis de formuler des hypothèses sur la fonction des produits de ces gènes et d'identifier ceux susceptibles d'être impliqués dans la biosynthèse de spiramycine.

EXEMPLE 5 : Inactivation de gène : principe de la construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue
Les méthodes utilisées consistent à effectuer un remplacement de gène. Le gène cible à interrompre est remplacé par une copie de ce gène interrompue par une cassette conférant la résistance à un antibiotique (par exemple l'apramycine ou l'hygromycine), comme l'illustre la figure 9. Les cassettes utilisées sont bordées de part et d'autre par des codons de terminaison de la traduction dans toutes les phases de lecture et par des terminateurs de transcription actifs chez Streptomyces.

L'insertion de la cassette dans le gène cible peut s'accompagner ou non d'une délétion dans ce gène cible. La taille des régions flanquant la cassette peut aller de quelques centaines à plusieurs milliers de paires de bases.

Les constructions nécessaires à l'inactivation du gène par la cassette ont été obtenues chez E. coli, organisme de référence pour l'obtention de constructions d'ADN recombinant. Le gène interrompu a été obtenu dans un plasmide se répliquant chez E. coli mais ne pouvant pas se répliquer chez Streptomyces.

Les constructions ont ensuite été sous-clonées dans des vecteurs pour permettre la transformation et l'inactivation du gène voulu chez S. ambofaciens. Pour cela, deux plasmides ont été utilisés :

- pOJ260 (Bierman M. et al., 1992) (cf. exemple 2) qui confère la résistance à l'apramycine chez E. coli et Streptomyces et qui a été employé quand le gène cible a été interrompu par une cassette conférant la résistance à l'hygromycine.

- pOSK1205 (4726pb). Ce plasmide dérive du plasmide pBK-CMV (commercialisé par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA)) dans lequel un fragment
Avril contenant la séquence codant la résistance à la Néomycine/Kanamycine a été remplacé par une séquence codant la résistance à l'hygromycine, tout en conservant le promoteur P SV40. Pour cela, le plasmide pHP45-#hyg (Blondelet-
Rouault et al., 1997) a été digéré par les enzymes NotI et PflmI et le fragment conférant la résistance à l'hygromycine a été sous-cloné au niveau du site Avril du vecteur pBK-CMV après que toutes les extrémités aient été rendues bout franc par traitement à l'enzyme de Klenow. Dans pOSK1205, la cassette qui confère la résistance à l'hygromycine est précédée du promoteur pSV40. Ce plasmide confère la résistance à l'hygromycine chez E. coli et Streptomyces et a été employé quand le gène cible a été interrompu par une cassette conférant la résistance à l'apramycine.

Les cassettes ont été introduites dans le gène cible soit par clonage en utilisant des sites de restriction présents dans le gène cible, soit par recombinaison entre de courtes séquences identiques comme décrit par exemple par Chaveroche et al (Chaveroche MK et al., 2000).

Le plasmide portant le gène interrompu par la cassette peut ensuite être introduit chez Streptomyces ambofaciens, par exemple par conjugaison entre E. coli et Streptomyces (Mazodier P, et al., 1989). Cette technique a été utilisée dans le cas où le vecteur de base est le vecteur pOJ260. Une deuxième technique peut être utilisée : la technique de la transformation de protoplastes après dénaturation par traitement alcalin de l'ADN (Kieser, T et al., 2000), pour augmenter la fréquence de recombinaison comme décrit par exemple par Oh & Chater (Oh & Chater, 1997). Cette technique a été utilisée dans le cas où le vecteur de base est pOJ260 ou pOSK1205 (cf. ci-dessous). Les transformants sont ensuite sélectionnés avec l'antibiotique correspondant à la cassette présente dans le

gène cible (cf. figure 9, antibiotique B). On sélectionne ainsi un mélange de clones parmi lesquels il y a eu intégration par un seul ou par deux événements de recombinaison. Dans un deuxième temps on recherche les clones sensibles à l'antibiotique pour lequel le gène de résistance est présent dans le vecteur (hors de la cassette de recombinaison) (cf. figure 9, antibiotique A). On peut ainsi sélectionner les clones pour lesquels il y a eu en principe deux événements de recombinaison aboutissant au remplacement du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette. Ces étapes sont schématisées figure 9.

Plusieurs cassettes peuvent être utilisées pour l'interruption des gènes cibles. On peut par exemple utiliser la cassette Qhyg qui confère la résistance à l'hygromycine (Blondelet-Rouault et al., 1997, numéro d'accès GenBank : X99315).

EXEMPLE 6: Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue en phase dans le gène or/3
Le gène orf 3 avait été interrompu par la cassette Qhyg (cf. exemple 2. 2) et il a pu être démontré qu'une souche or/3:: #hyg ne produit plus de spiramycine, confirmant l'implication d'un ou plusieurs gènes de la région clonée dans la biosynthèse des spiramycines (cf. exemple 2. 2). Au vu de leur orientation, une cotranscription des ORFs 1 à 7 est probable (cf. figure 3) et le phénotype observé (non producteur de spiramycines) peut être dû à l'inactivation d'un ou plusieurs des gènes co-transcrits avec or/3. Pour confirmer l'implication de orf3 dans la biosynthèse de spiramycines, une nouvelle inactivation du gène or/3 a été effectuée, cette dernière étant réalisée en phase.

Pour cela, un fragment DraIII interne à or/3 de 504 paires de bases a été délété. Un fragment d'ADN obtenu à partir de pOS49. 1, allant du site EcoRI situé en position 1 (SEQ ID N 1) jusqu'au site SacI situé en position 5274 (SEQ ID N 1) et qui comporte une délétion entre les deux sites DraIII aux positions 2563 et 3067 (504 nucléotides retirés) a été cloné dans le plasmide pOJ260 (Bierman M. et al., 1992). Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pOS49.67.

L'insert de pOS49. 67 est donc constitué par un fragment d'ADN de S. ambofaciens contenant les gènes orfl, or/5, or/3 avec la délétion en phase, orf4 et une partie de orf5.

Le vecteur dans lequel cet insert a été sous-cloné est pOJ260, le plasmide pOS49.67 confère donc la résistance à l'apramycine et a été introduit par transformation de protoplastes dans la souche OS49.16 (cf. exemple 2). La souche OS49. 16 étant résistante à l'hygromycine, des transformants hygR et apraR ont été obtenus. Après deux passages de tels clones sur milieu non sélectif, les clones sensibles à l'apramycine et à l'hygromycine (apraS et hygS) ont été recherchés. Dans certains de ces clones, on s'attend en effet à ce qu'un événement de recombinaison entre séquences homologues conduise au remplacement de la copie de orf3 interrompue par la cassette #hyg (contenu dans le génome de la souche OS49. 16) par la copie de or/3 avec la délétion en phase présente sur le vecteur. Les clones résultant de cette recombinaison sont attendus comme apraS et hygS après l'élimination des séquences du vecteur. Le génotype des souches ainsi obtenues peut être vérifié par hybridation ou par PCR et séquençage du produit de PCR (pour vérifier que seule une copie de or/3 délétée en phase est présente dans le génome des clones obtenus). Des clones n'ayant que la copie de or/3 avec une délétion en phase ont ainsi été obtenus et leur génotype a été vérifié. Un clone présentant les caractéristiques recherchées a été plus particulièrement sélectionné et a été nommé OS49. 67.

Un échantillon de la souche OS49. 67 a été déposé auprès de la Collection' Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2916.

EXEMPLE 7: Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue dans le gène orf8
Pour réaliser l'inactivation du gène or/8, une construction dans laquelle la cassette #hyg a été introduite dans la séquence codante de or/8 a été obtenue. Pour cela, le

plasmide pOS49. 88 a tout d'abord été construit. Le plasmide pOS49. 88 est dérivé du plasmide pUC19 (numéro d'accès GenBank M77789) par insertion d'un fragment de 3.7 kb (fragment PstI-EcoRI obtenu à partir du cosmide pSPM5), contenant la fin de or/7, or/8 et le début de or/9, cloné dans les sites PstI-EcoRI de pUC19. La cassette #hyg (sous forme d'un fragment BamHI, rendu bout franc par traitement à l'enzyme de Klenow) a été clonée au niveau du site unique Sali de pOS49. 88 situé dans or/8 après que toutes les extrémités aient été rendues bout franc par traitement à l'enzyme de Klenow.

* Le clonage étant bout franc, deux types de plasmides ont été obtenus selon le sens d'insertion de la cassette : pOS49. 106 dans lequel les gènes hyg et orf8 sont dans la même orientation et pOS49. 120 dans lequel les gènes hyg et orf8 sont dans des orientations opposées. L'insert du plasmide pOS49. 106 a ensuite été sous-cloné dans le plasmide pOJ260 pour donner pOS49. 107. Pour cela, le plasmide pOS49. 106 a été digéré par l'enzyme Asp718I et les extrémités ont été rendues bout franc par traitement à l'enzyme de Klenow, ce produit de digestion a été redigéré par l'enzyme PstI et le fragment contenant le gène or/8 dans lequel la cassette #hyg a été insérée, a été cloné dans le vecteur pOJ260 (cf. ci dessus). Pour cela, le vecteur pOJ260 a été digéré par les enzymes EcoRV et PstI et utilisé pour la ligation. Cette manipulation permet donc d'obtenir une ligation orientée puisque chacun des deux fragments est bout franc d'un côté et PstI de l'autre. Le plasmide obtenu a été nommé pOS49.107.

Le plasmide pOS49. 107 a été introduit dans la souche ATCC23877 de S. ambofaciens par transformation de protoplastes (Kieser, T et al., 2000). Après transformation des protoplastes, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'hygromycine. Les clones résistants à l'hygromycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec hygromycine (antibiotique B) et sur milieu avec apramycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'hygromycine (HygR) et sensibles à l'apramycine (ApraS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène orf8 interrompu par la cassette Qhyg.

Le remplacement de la copie sauvage de orf8 par la copie interrompue par la cassette #hyg a été vérifié par Southern Blot. Ainsi, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybridé avec une sonde correspondant à la cassette Qhyg pour vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique des clones obtenus. Une deuxième hybridation a été effectuée en utilisant comme sonde l'insert PstI-EcoRI contenant la fin de or/7, or/8 et le début de or/9 d'une taille d'environ 3,7 kb du plasmide pOS49. 88. La vérification du génotype peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR.

Un clone orj8::Qhyg a été choisi et nommé OS49.107. Un échantillon de la souche OS49. 107 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2917.

EXEMPLE 8: Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue dans le gène orf10
Un fragment d'ADN de 1,5 kb interne au gène or/70 a été obtenu par PCR en utilisant comme matrice, l'ADN génomique de S. ambofaciens et les amorces suivantes : SRMRl : 5' CTGCCAGTCCTCTCCCAGCAGTACG 3' (SEQ ID N 89) SRMR2 : 5' TGAAGCTGGACGTCTCCTACGTCGG 3' (SEQ ID N 90) Ce fragment d'ADN issu de la PCR a été cloné dans le vecteur pCR2.1 commercialisé par la société Invitrogen (Carlsbad, Californie, USA). Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pOS49. 32. La cassette Qhyg (sous forme d'un fragment BamHI, cf. ci-dessus) a été clonée au niveau du site unique BstEII interne au fragment du gène orf10, après que toutes les extrémités aient été rendues bout franc par traitement à l' enzyme de Klenow.

Le clonage étant bout franc, deux types de plasmides ont été obtenus selon le sens d'insertion de la cassette : pOS49. 43 dans lequel les gènes hyg et or/70 sont dans la même orientation et pOS49. 44 dans lequel les gènes hyg et or/10 sont dans des orientations opposées. L'insert du plasmide pOS49. 43 a été transféré (sous forme d'un fragment Asp718I-XbaI dont les extrémités ont été rendues bout franc par traitement à l'enzyme de Klenow) dans le site EcoRV du plasmide pOJ260 ce qui a permis d'obtenir le plasmide pOS49. 50. Le plasmide pOS49. 50 contenant le fragment du gène orf10 interrompu par la cassette Qhyg a été introduit dans la souche ATCC23877 de Streptomyces ambofaciens. Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'hygromycine. Les clones résistants à l'hygromycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec hygromycine (antibiotique B) et sur milieu avec apramycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'hygromycine (HygR) et sensibles à l'apramycine (ApraS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène orflO interrompu par la cassette Qhyg. Des clones qui possédaient le marqueur de résistance à l'hygromycine porté par la cassette et qui avaient perdu le marqueur de résistance à l'apramycine porté par le vecteur pOJ260 ont ainsi été obtenus. L'événement de remplacement de la copie sauvage de or/70 par la copie interrompue orflO::Qhyg a été vérifié par Southern Blot. Ainsi, l'ADN génomique total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybridé avec une sonde correspondant à la cassette #hyg pour vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique des clones obtenus. Une deuxième hybridation a été effectuée en utilisant comme sonde le produit PCR de 1,5 kb interne au gène orf10 (cf. ci-dessus).

Un clone présentant les caractéristiques attendues (orf10::#hyg) a été plus particulièrement sélectionné et nommé OS49.50. Il a pu en effet être vérifié grâce aux deux hybridations que la cassette Qhyg était bien présente dans le génome de ce clone et que l'on obtient bien le profil de digestion attendu dans le cas d'un remplacement, à la suite d'un double événement de recombinaison, du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette Qhyg dans le génome de ce clone. La vérification du

génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR.

EXEMPLE 9 : Inactivation de gènes : principe de la construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue selon la technique des cassettes excisables (cf. Figure 9 et 10)
Un deuxième type de cassettes peut être utilisé pour l'inactivation de gènes : les cassettes dites cassettes excisables . Ces cassettes présentent l'avantage de pouvoir être excisées chez Streptomyces par un événement de recombinaison spécifique de site après avoir été introduites dans le génome de S. ambofaciens. Le but est d'inactiver certains gènes dans des souches de Streptomyces sans laisser dans la souche finale de marqueurs de sélection ou de grandes séquences d'ADN n'appartenant pas à la souche.

Après excision il subsiste uniquement une courte séquence d'environ une trentaine de paires de bases (appelé site cicatriciel ) dans le génome de la souche (cf. figure 10).

La mise en oeuvre de ce système consiste, dans un premier temps, au remplacement de la copie sauvage du gène cible (grâce à deux événements de recombinaison homologue, cf. figure 9) par une construction dans laquelle une cassette excisable a été insérée dans ce gène cible. L'insertion de cette cassette est accompagnée d'une délétion dans le gène cible (cf. figure 9). Dans un deuxième temps, l'excision de la cassette excisable du génome de la souche est provoquée. La cassette excisable fonctionne grâce à un système de recombinaison spécifique de site et a pour avantage de permettre l'obtention de mutants de Streptomyces ne portant finalement pas de gène de résistance. On s'affranchit également d'éventuels effets polaires sur l'expression des gènes situés en aval du ou des gènes inactivés (cf. figure 10).

L'emploi de cassettes excisables a été décrit et utilisé chez de nombreux organismes dont les cellules de mammifère, de levures et chez E. coli (Bayley et al., 1992 ; Brunelli et Pall, 1993 ; Camilli et al., 1994 ; Dale et Ow, 1991 ; Russell et al., 1992 ; Lakso et al., 1992). Ces cassettes excisables utilisent toutes la recombinase spécifique de site Cre agissant sur les sites lox. Ce système de recombinaison provient du bactériophage PI .

Pour la construction d'un système de type cassette excisable chez Streptomyces, il a été tiré partie du système de recombinaison spécifique de site décrit pour l'élément génétique mobile pSAM2 de Streptomyces ambofaciens (Boccard et al., 1989a et b). Le système mis en place consiste dans un premier temps à construire un vecteur recombinant comportant le gène à interrompre dans lequel est insérée une cassette excisable. L'insertion dans le gène cible de la cassette excisable s'accompagne d'une délétion dans le gène cible. Elle peut être réalisée par clonage en utilisant des sites de restriction présents dans le gène cible ou par recombinaison entre de courtes séquences identiques comme décrit par exemple par Chaveroche et al (Chaveroche MK et al., 2000). La cassette excisable peut être construite en utilisant par exemple la cassette Qhyg (Blondelet Rouault et al., 1997). Cette cassette a été bordée par des séquences attR et attL qui flanquent normalement la copie intégrée de pSAM2 (cf. figure 15). Les séquences attL et attR contiennent tous les sites nécessaires à la recombinaison sitespécifique permettant l'excision de pSAM2 ou de tout fragment d'ADN situé entre ces deux régions (Sezonov et al., 1997, Raynal et al.,1998). La construction d'une telle cassette n'est évidemment pas limitée à l'utilisation d'une cassette Qhyg, mais d'autres cassettes de résistances peuvent servir de base à la construction de cette cassettte (par exemple la cassette #aac ou Qvph (Blondelet Rouault et al., 1997)).

Après l'obtention de cette construction, la souche de Streptomyces est transformée avec le plasmide recombinant. Les transformants sont ensuite sélectionnés avec l'antibiotique correspondant à la cassette présente dans le gène cible (cf. figure 9, antibiotique B, il s'agit par exemple d'une sélection par l'hygromycine si la cassette excisable dérive de la cassette Qhyg). On sélectionne ainsi un mélange de clones parmi lesquels il y a eu intégration par un seul ou par deux événements de recombinaison.

Dans un deuxième temps on recherche les clones sensibles à l'antibiotique pour lesquels le gène de résistance est présent dans le vecteur (hors de la cassette de recombinaison) (cf. figure 9, antibiotique A). On peut ainsi sélectionner les clones pour lesquel il y a eu en principe deux événements de recombinaison aboutissant au remplacement du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette. Ces étapes sont schématisées figure 9, le génotype des clones ainsi obtenus est vérifié par Southern blot et une souche présentant les caractéristiques voulues (le remplacement du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette excisable) est sélectionnée.

Dans un deuxième temps, la souche sélectionnée ci-dessus, est transformée par un plasmide permettant l'expression des gènes xis et int qui sont tous deux nécessaires à la recombinaison spécifique de site entre les sites attR et attL. Cette recombinaison entraîne le départ de la cassette excisable du génome de la souche, grâce à un événement de recombinaison (cf. figure 10) (Raynal et al., 1998). Il est intéressant de choisir le vecteur portant les gènes xis et int parmi les vecteurs relativement instables chez Streptomyces (par exemple dérivé du vecteur Streptomyces pWHM3, (Vara et al., 1989)), ceci permet d'obtenir une souche ayant perdu ce dernier vecteur après quelques cycles de sporulation en absence de pression de sélection.

Pour exciser la cassette, on peut par exemple utiliser le plasmide pOSV508 (cf. figure 14) qui est introduit par transformation de protoplastes dans la souche de S. ambofaciens contenant un gène interrompu par la cassette excisable. Le plasmide pOSV508 est dérivé du plasmide pWHM3 (Vara J et al.,1989) (cf. figure 13) dans lequel ont été ajoutés les gènes xis et int de pSAM2 (Boccard F. et al., 1989b) placés sous le contrôle du promoteur ptrc (Amann, E. et al., 1988). Les gènes xis et int placés sous le contrôle du promoteur ptrc ont été sous clonés dans le plasmide pWHM3 à partir du plasmide pOSint3 (Raynal et al., 1998) (cf. figure 14). L'introduction dans la souche mutante du plasmide pOSV508 portant les gènes xis et int de pSAM2 va permettre l'excision efficace par recombinaison spécifique de site de la cassette excisable entre les sites attL et attR flanquant cette cassette (Raynal A. et al., 1998) (figure 10). Parmi les transformants, sélectionnés pour leur résistance au thiostrepton due au gène tsr porté par

pOSV508, on choisit ceux devenus sensibles à l'antibiotique auquel la présence de la cassette confère la résistance (cf. figure 10). L'excision est efficace et il a été observé que plus de 90% des transformants sont de ce type. Après un ou plusieurs cycles de croissance et sporulation sur un milieu solide dépourvu de thiostrepton, on obtient des clones ayant perdu le plasmide pOSV508. Ces clones sont repérables par leur sensibilité au thiostrepton. La séquence du gène cible délété peut être vérifiée par PCR et séquençage du produit PCR.

Finalement, la souche résultante porte au niveau du gène inactivé (délétion interne par exemple) un site att cicatriciel correspondant au site attB minimal (Raynal et al., 1998), issu de la recombinaison entre les sites attR et attL. Ce site attB minimal qui subsiste est semblable à celui présent naturellement dans les souches de Streptomyces ambofaciens, Streptomyces pristinaespiralis et Streptomyces lividans (Sezonov et al., 1997).

Le gène que l'on veut inactiver peut être cotranscrit avec d'autres gènes situés en aval. Pour éviter que l'inactivation d'un des gènes ait un effet polaire sur l'expression des gènes en aval dans l'opéron, il est important d'obtenir une délétion en phase après excision de la cassette. Le système des cassettes excisables tel que décrit ci-dessus permet de répondre à une telle exigence. L'homme du métier pourra, en effet, aisément construire trois cassettes excisables distinctes, celles-ci laissant après excision une séquence de 33, 34 ou 35 nucléotides respectivement, sans codon stop quelle que soit la phase de lecture. Connaissant la séquence du gène cible et la taille de la délétion associée à l'insertion de la cassette, il est possible de choisir entre ces trois cassettes excisables de façon à ce que l'excision conduise à une délétion en phase. Sur les 33,34 ou 35 nucléotides rajoutés, 26 correspondent à la séquence attB minimale (cf. figure 27).

Dans le cas de la présente demande, deux cassettes excisables ont été utilisées. Ces deux cassettes sont les suivantes : att1#hyg+ (SEQ ID N 91) et att3Qaac- (SEQ ID N 92), ces cassette laissent respectivement 33 et 35 nucléotides après excision. Elles comportent respectivement la cassette Qhyg ou la cassette Qaac, les signes + et correspondant à l'orientation de la cassette de résistance. Ces deux cassettes ont été

construites et clonées au niveau du site EcoRV du vecteur pBC SK+ dont le site HindIII a été suprimé au préalable. Les plasmides obtenus ont été nommés patt1#hyg+ et patt3Qaac- respectivement. Les cassettes excisables peuvent être facilement sorties par une digestion du plasmide par EcoRV.

EXEMPLE 10: Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue dans le gène orf2
L'inactivation du gène orf2 a été réalisée grâce à la technique des cassettes excisables (cf. ci-dessus). La souche de départ utilisée est la souche Streptomyces ambofaciens OSC2 qui dérive de la souche ATCC23877. Cependant, la souche OSC2 diffère de la souche ATCC23877 en ce qu'elle a perdu l'élément génétique mobile pSAM2 (Boccard et al., 1989a et b). Cet élément mobile peut être perdu de manière spontanée au cours de la protoplastisation (action du lysozyme pour digérer la paroi bactérienne et fragmenter le mycélium (Kieser et al., 2000)) et de la régénération des protoplastes de la souche ATCC23877. Pour sélectionner les clones ayant perdu l'élément pSAM2, il a été mis en place un crible, basé sur la répression du gènepra par le répresseur de transcription KorSA (Sezonov et al., 1995) (Sezonov G. et al., 2000).

Pour cela, un fragment d'ADN contenant le promoteur du gène pra placé en amont du gène aph (conférant la résistance à la kanamycine et dépourvu de son propre promoteur) a été cloné dans le vecteur instable pWHM3Hyg, ce dernier dérivant du plasmide pWHM3 (Vara et al., 1989) dans lequel le gène tsr a été remplacé par le gène hyg (conférant la résistance à l'hygromycine). Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pOSV510. La souche ATCC23877 a été transformée après protoplastisation par le plasmide pOSV510. Le promoteur Pra est un promoteur réprimé par le répresseur KorSA, le gène codant ce dernier étant situé au sein de l'élément mobile pSAM2 (Sezonov G. et al., 2000). Après transformation par le plasmide pOSV510, les bactéries transformées sont sélectionnées pour leur résistance à la kanamycine (due au gène aph porté par pOSV510). Les clones ayant perdu l'élément intégratif pSAM2 ont perdu le répresseur KorSA et le promoteur Pra n'est donc plus réprimé et permet l'expression du

gène de résistance à la kanamycine aph. Une sélection par la kanamycine après transformation par le plasmide pOSV510 permet donc de sélectionner les clones ayant perdu l'élément intégratif pSAM2 (et donc KorSA) et possédant le plasmide pOSV510.

Le plasmide pOSV510 étant instable, après quelques cycles de sporulation sans antibiotique, des clones isolés sont repiqués sur milieu avec kanamycine, sur milieu avec hygromycine et sur milieu sans antibiotique. Les clones sensibles à la kanamycine et à l'hygromycine ont perdu pOSV510. La perte de l'élément pSAM2 a été vérifiée par hybridation et PCR. Un clone présentant les caractéristiques souhaitées a été sélectionné et a été nommé OSC2.

Un échantillon de la souche OSC2 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement I- 2908.

L'inactivation du gène or/2 a été réalisée grâce à la technique des cassettes excisables (cf. ci-dessus et figure 10). Pour cela, un insert de 4,5 kb dont la séquence part du site EcoRI situé en position 1 jusqu'au site BamHI situé en position 4521 (SEQ ID N 1) a été sous-cloné au niveau des sites EcoRI et BamHI du plasmide pUC19 (numéro d'accès GenBank M77789) à partir du cosmide pSPM5. Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pOS49.99.

Ce plasmide a été introduit dans la souche E. coli KS272 qui contenait déjà le plasmide pKOBEG (Chaveroche et al., 2000) (cf. figure 12).

En parallèle, la cassette excisable att3Qaac- (SEQ ID N 92, cf. ci dessus) a été amplifiée par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pOSK1102 (Le plasmide pOSK1102 est un plasmide dérivé du vecteur pGP704Not (Chaveroche et al., 2000) (Miller VL & Mekalanos JJ, 1988) dans lequel la cassette att3Qaac- a été clonée comme un fragment EcoRV dans le site unique EcoRV de pGP704Not) et à l'aide des amorces suivantes :

ORF2A 5' CCCGCGCGGCAGCCTCTCCGTGATCGAGTCCGGCGTGACCATCGCGCGCGCTTCGTTCGG-3' (SEQ ID N 93) ORF2B 5' GCTCCGTGCGTCATGCAGGAAGGTGTCGTAGTCGCGGTAGATCTGCCTCTTCGTCCCGAA-3' (SEQ ID N 94)
Les 40 déoxy-nucléotides situés à l'extrémité 5' de ces oligonucléotides comportent une séquence correspondant à une séquence dans le gène cible (orj2 dans le cas présent) et les 20 déoxy-nucléotides situés le plus en 3' (figuré en gras ci-dessus) correspondent à la séquence d'une des extrémités de la cassette excisable att3Qaac- (cf. figure 11).

Le produit de PCR ainsi obtenu a été utilisé pour transformer la souche E. coli contenant les plasmides pKOBEG et pOS49. 99 comme décrit (Chaveroche et al., 2000) (cf. figure 12). Ainsi, les bactéries ont été transformées par électroporation et sélectionnées pour leur résistance à l'apramycine. Les plasmides des clones obtenus ont été extraits et digérés par plusieurs enzymes de restriction, dans le but de vérifier que le profil de digestion obtenu correspond au profil attendu s'il y a eu insertion de la cassette (att3Qaac-) dans le gène cible (or/2), c'est à dire si il y a bien eu recombinaison homologue entre les extrémités du produit PCR et le gène cible (Chaveroche et al., 2000). La vérification de la construction peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR. Un clone dont le plasmide possède le profil attendu a été sélectionné et le plasmide correspondant a été nommé pSPM17. Ce plasmide dérive de pOS49. 99 dans lequel orf2 est interrompue par la cassette apramycine (cf. figure 12).

L'insertion de la cassette s'accompagne d'une délétion dans or/2, entre les nucléotides 211 et 492 de la partie codante de or/2.

Le plasmide pSPM17 a été digéré par l'enzyme EcoRI puis les extrémités ont été rendues bout franc par traitement à l'enzyme de Klenow, ce produit de digestion a été ensuite digéré par l'enzyme XbaI et l'insert contenant le gène orf2 délété a été cloné dans le vecteur pOSK1205 (cf. ci dessus). Pour cela, le vecteur pOSK1205 a été digéré par l'enzyme BamHI puis les extrémités ont été rendues bout franc par traitement à

l'enzyme de Klenow, ce produit a été ensuite digéré par l'enzyme XbaI, et utilisé pour la ligation avec l'insert obtenu à partir de pSPM17 comme ci-dessus. Cette manipulation permet donc d'obtenir une ligation orientée puisque chacun des deux fragments est bout franc d'un côté et Xbal de l'autre. Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pSPM21, il porte un gène de résistance à l'hygromycine (partie vecteur) et un insert dans lequel le gène orf2 délété est remplacé par la cassette att3Qaac-.

Le vecteur pSPM21 a été introduit dans la souche Streptomyces ambofaciens OSC2 (cf. ci dessus) par transformation de protoplastes (Kieser, T et al., 2000). Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine Les clones résistants à l'apramycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec apramycine (antibiotique B) et sur milieu avec hygromycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'apramycine (ApraR) et sensibles à l'hygromycine (HygS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène or/2 interrompu par la cassette att3#aac-. Ces clones ont été sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de orf2 par la copie interrompue par la cassette a été vérifié. La présence de la cassette att3Qaac- a été vérifiée par PCR sur colonie. Une hybridation a également été effectuée. Pour cela, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybridé avec une sonde de 3 kb correspondant à un fragment EcoRl- BamHI de l'insert du plasmide pOS49.99 (cf. ci-dessus). La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR.

Un clone présentant les caractéristiques attendues a été sélectionné et nommé SPM21. Il a pu être vérifié grâce à la PCR et à l'hybridation que la cassette att3#aac- était bien présente dans le génome de ce clone et que l'on obtient bien le profil de digestion attendu dans le cas d'un remplacement, à la suite d'un double événement de recombinaison, du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette att3Qaac- dans le génome de ce clone. Ce clone possède donc le génotype : orf2::att3#aac-.

Un échantillon de la souche SPM21 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement I- 2914.

La souche SPM21 a été transformée par le vecteur pOSV508 par transformation de protoplastes pour provoquer l'excision de la cassette (cf. figure 14). Le plasmide pOSV508 est dérivé du plasmide pWHM3 (Vara J et al.,1989) (cf. figure 13) dans lequel il a été ajouté les gènes xis et int de pSAM2 (Boccard F. et al., 1989b) placé sous le contrôle du promoteur ptrc (Amann, E. et al., 1988) (cf. figure 14). L'introduction dans la souche SPM21 du plasmide pOSV508 portant les gènes xis et int de pSAM2 permet l'excision efficace par recombinaison spécifique de site de la cassette excisable entre les sites attL et attR flanquant cette cassette (Raynal A. et al., 1998) (figure 10).

Parmi les transformants sélectionnés pour leur résistance au thiostrepton due au gène tsr porté par pOSV508, on choisit ceux devenus sensibles à l'apramycine dont le gène de résistance est porté par la cassette att3#aac-, l'excision entraîne en effet la perte de ce gène de résistance (cf. figure 10). Le plasmide pOSV508 est instable et après deux passages successifs sur milieu sans antibiotique des clones isolés sont repiqués sur milieu avec thiostrepton et sur milieu sans thiostrepton. Les clones sensibles au thiostrepton ont perdu pOSV508. Il a été vérifié que l'excision de la cassette aboutit bien à une délétion en phase dans le gène orf2 par PCR et séquençage du produit PCR, l'excision de la cassette laisse en effet une séquence cicatricielle att3 caractéristique (qui est similaire au site attB d'origine après recombinaison entre les sites attL et attR) : 5' ATCGCGCGCGCTTCGTTCGGGACGAAGAGGTAGAT 3' (SEQ ID N 95).

La souche ainsi obtenue et possédant le génotype voulu (orf2::att3) a été nommée SPM22.

Un échantillon de la souche SPM22 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux

75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement I- 2915.

EXEMPLE 11: Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue dans le gène orfl2
Pour l'inactivation de or/12, orf13c et orfl4 un même plasmide de départ (pSPM504) a été employé pour introduire à différentes positions une cassette de type cassette excisable . Ce plasmide possède un insert de 15,1 kb qui correspond à la région de or/7 à orfl7. Pour construire ce plasmide un fragment BglII de 15,1 kb provenant de la digestion du cosmide pSPM7 (cf. ci-dessus) a été cloné dans le plasmide pMBL18 (Nakano et al., 1995) digéré par BamHI. Les extrémités BamHI et BglII étant compatibles, on obtient après ligation, le plasmide pSPM502. La totalité de l'insert de pSPM502 a ensuite été sous-cloné (sous forme d'un fragment HindIII/NheI) dans le plasmide pOSK1205 (digéré par HindIII/NheI) ce qui a permis d'obtenir le plasmide pSPM504.

En parallèle, la cassette excisable att3Qaac- a été amplifiée par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pOSK1102 (le plasmide pOSKl 102 est un plasmide dérivé du vecteur pGP704Not (Chaveroche et al., 2000) (Miller VL & Mekalanos JJ, 1988) dans lequel la cassette att3#aac- a été clonée comme un fragment EcoRV dans le site unique EcoRV de pGP704Not), les amorces utilisées sont les suivantes : EDR8:5' CGGGATGATCGCTTGTCCGGCGGCCGGATGCCTAGCCTCATCGCGCGCGCTTCGTTCGG 3' (SEQ ID N 96)

EDR9:5' CCCGATCCAGAACGTCTGGTCGGTGATCAGGTCGCTGTTCATCTGCCTCTTCGTCCCGAA 3' (SEQ ID N 97)
Les 40 (seulement 39 pour EDR8) déoxy-nucléotides situés à l'extrémité 5' de ces oligonucléotides comportent une séquence correspondant à une séquence dans le gène cible (or/72 dans le cas présent) et les 20 déoxy-nucléotides situés le plus en 3' (figuré en gras ci-dessus) correspondent à la séquence d'une des extrémités de la cassette excisable att3Qaac- (cf. figure 11).

Le produit de PCR ainsi obtenu a été utilisé pour transformer la souche E. coli KS272 contenant les plasmides pKOBEG et pSPM504 (cf ci-dessus), comme décrit par Chaveroche et al. (Chaveroche et al., 2000) (cf. figure 12 pour le principe, le plasmide pOS49. 99 doit être remplacé par le plasmide pSPM504 et le plasmide obtenu n'est plus pSPM17 mais pSPM507). Ainsi, les bactéries ont été transformées par électroporation par ce produit de PCR et les clones ont été sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les plasmides des clones obtenus ont été extraits et digérés par plusieurs enzymes de restriction, dans le but de vérifier que le profil de digestion obtenu correspond au profil attendu s'il y a eu insertion de la cassette (att3Qaac-) dans le gène cible (orf12), c'est à dire si il y a bien eu recombinaison homologue entre les extrémités du produit PCR et le gène cible (Chaveroche et al., 2000). La vérification de la construction peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR. Un clone dont le plasmide possède le profil attendu a été sélectionné et le plasmide correspondant a été nommé pSPM507. Ce plasmide dérive de pSPM504 dans lequel or/12 est interrompue par la cassette att3Qaac- (cf. figure 12). L'insertion de la cassette s'accompagne d'une délétion dans le gène orfl2, l'interruption commence au niveau du trentième codon de orfl2. Il reste après la cassette les 46 derniers codons de or/12.

Le vecteur pSPM507 a été introduit dans la souche Streptomyces ambofaciens OSC2 (cf. ci-dessus) par transformation de protoplastes (Kieser, T et al., 2000). Après

transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les clones résistants à l'apramycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec apramycine (antibiotique B) et sur milieu avec hygromycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'apramycine (ApraR) et sensibles à l'hygromycine (HygS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène orfl2 interrompu par la cassette att3Qaac-. Ces clones ont été plus particulièrement sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de orfl2 par la copie interrompue par la cassette a été vérifié par hybridation. Ainsi, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybridé avec une sonde correspondant à la cassette att3Qaac- pour vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique des clones obtenus. Une deuxième hybridation a été effectuée en utilisant comme sonde un fragment d'ADN obtenu par PCR et correspondant à une très large partie de la séquence codante du gène orf12.

La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR.

Un clone présentant les caractéristiques attendues (orfl2::att3SZaac-) a été plus particulièrement sélectionné et nommé SPM507. Il a pu en effet être vérifié grâce aux deux hybridations que la cassette att3#aac- était bien présente dans le génome de ce clone et que l'on obtient bien le profil de digestion attendu dans le cas d'un remplacement, à la suite d'un double événement de recombinaison, du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette att3Qaac- dans le génome de ce clone. Ce clone

possède donc le génotype : orfl2::att3s2aac- et a été nommé SPM507. Il est inutile de procéder à l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de orfl2, au vu de l'orientation des gènes (cf. figure 3). En effet, le fait que orf13c soit orienté en sens opposé à orfl2 montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits. L'utilisation d'une cassette excisable permet en revanche d'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de sélection à tout moment, notamment par transformation par le plasmide pOSV508. Un échantillon de la souche SPM507 a été déposé auprès de la Collection

Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2911.

EXEMPLE 12: Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue dans le gène orfl3c
La cassette excisable att3Qaac- a été amplifiée par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pOSK1102 (cf. ci-dessus) à l'aide des amorces suivantes : EDR3:5' ACCGGGGCGGTCCTCCCCTCCGGGGCGTCACGGCCGCGGAATCTGCCTCTTCGTCCCGAA 3' (SEQ ID N 98) EDR4:5' CACGCAGCGAGCCGACGCACTGATGGACGACACGATGGCCATCGCGCGCGCTTCGTTCGG 3' (SEQ ID N 99)
Les 40 déoxy-nucléotides situés à l'extrémité 5' de ces oligonucléotides comportent une séquence correspondant à une séquence dans le gène cible (orf13c dans le cas présent) et les 20 déoxy-nucléotides situés le plus en 3' (figuré en gras ci-dessus) correspondent à la séquence d'une des extrémités de la cassette excisable att3Qaac- (cf figure 11).

Le produit de PCR ainsi obtenu a été utilisé pour transformer la souche E. coli KS272 contenant les plasmides pKOBEG et pSPM504 (cf. ci-dessus), comme décrit par Chaveroche et al. (Chaveroche et al., 2000) (cf. figure 12 pour le principe, le plasmide pOS49. 99 doit être remplacé par le plasmide pSPM504 et le plasmide obtenu n'est plus pSPM17 mais pSPM508). Ainsi, les bactéries ont été transformées par électroporation par le produit de PCR et les clones ont été sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les plasmides des clones obtenus ont été extraits et digérés par plusieurs enzymes de restriction, dans le but de vérifier que le profil de digestion obtenu correspond au profil attendu s'il y a eu insertion de la cassette (att3Qaac-) dans le gène

cible (orfl3c), c'est à dire si il y a bien eu recombinaison homologue entre les extrémités du produit PCR et le gène cible (Chaveroche et al., 2000). La vérification de la construction peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR. Un clone dont le plasmide possède le profil attendu a été sélectionné et le plasmide correspondant a été nommé pSPM508. Ce plasmide dérive de pSPM504 dans lequel orfl3c est interrompue par la cassette apramycine (cf. figure 12). L'insertion de la cassette s'accompagne d'une délétion dans le gène orfl3c, l'interruption commence au niveau du sixième codon de orfl3c. Il reste après la cassette les 3 derniers codons de orfl3c.

Le vecteur pSPM508 a été introduit dans la souche Streptomyces ambofaciens OSC2 (cf. ci-dessus) par transformation de protoplastes (Kieser, T et al., 2000). Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les clones résistants à l'apramycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec apramycine (antibiotique B) et sur milieu avec hygromycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'apramycine (ApraR) et sensibles à l'hygromycine (HygS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène orfl3c interrompu par la cassette att3Qaac-. Ces clones ont été plus particulièrement sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de orfl3c par la copie interrompue par la cassette a été vérifié par hybridation. Ainsi, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybridé avec une sonde correspondant à la cassette att3Qaac- pour vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique des clones obtenus. Une deuxième hybridation a été effectuée en utilisant comme sonde un produit de PCR correspondant à une séquence débordant d'une centaine de paires de base en amont et en aval de la séquence codante de orfl3c. La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR.

Un clone présentant les caractéristiques attendues (orfl3c::att3Qaac-) a été plus particulièrement sélectionné et nommé SPM508. Il a pu en effet être vérifié grâce aux deux hybridations que la cassette att3Qaac- était bien présente dans le génome de ce clone et que l'on obtient bien le profil de digestion attendu dans le cas d'un remplacement, à la suite d'un double événement de recombinaison, du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette att3Qaac- dans le génome de ce clone. Ce clone

possède donc le génotype : orfl3c::att3P,.aac- et a été nommé SPM508. Il est inutile de procéder à l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de orfl3c, au vu de l'orientation des gènes (cf. figure 3), le fait que orfl4 soit orienté en sens opposé à orfl3c montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits. L'utilisation d'une cassette excisable permet en revanche d'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de sélection à tout moment. Un échantillon de la souche SPM508 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2912.

EXEMPLE 13 Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue dans le gène orfl4
La cassette excisable att3Qaac- a été amplifiée par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pOSK1102 (cf. ci-dessus) à l'aide des amorces suivantes : EDR5: 5'GGGCGTGAAGCGGGCGAGTGTGGATGTCATGCGAGTACTCATCGCGCGCGCTTCGTTCGG 3' (SEQ ID N 100) EDR6: 5'CGGGAAACGGCGTCGCACTCCTCGGGGGCCGCGTCAGCCCATCTGCCTCTTCGTCCCGAA 3' (SEQ ID N 101)

Les 40 déoxy-nucléotides situés à l'extrémité 5' de ces oligonucléotides comportent une séquence correspondant à une séquence dans le gène cible (or/74 dans le cas présent) et les 20 déoxy-nucléotides situés le plus en 3' (figuré en gras ci-dessus) correspondent à la séquence d'une des extrémités de la cassette excisable att3Qaac- (cf. figure 11).

Le produit de PCR ainsi obtenu a été utilisé pour transformer la souche E. coli KS272 contenant les plasmides pKOBEG et pSPM504 (cf. ci-dessus), comme décrit par Chaveroche et al. (Chaveroche et al., 2000) (cf. figure 12 pour le principe, le plasmide pOS49. 99 doit être remplacé par le plasmide pSPM504 et le plasmide obtenu n'est plus pSPM17 mais pSPM509). Ainsi, les bactéries ont été transformées par électroporation par le produit de PCR et les clones ont été sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les plasmides des clones obtenus ont été extraits et digérés par plusieurs enzymes de restriction, dans le but de vérifier que le profil de digestion obtenu correspond au profil attendu s'il y a eu insertion de la cassette (att3Qaac-) dans le gène cible (orfl4), c'est à dire si il y a bien eu recombinaison homologue entre les extrémités du produit PCR et le gène cible (Chaveroche et al., 2000). La vérification de la construction peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR. Un clone dont le plasmide possède le profil attendu a été sélectionné et le plasmide correspondant a été nommé pSPM509. Ce plasmide dérive de pSPM504 dans lequel orfl4 est interrompu par la cassette apramycine (cf. figure 12). L'insertion de la cassette s'accompagne d'une délétion dans le gène orfl4, l'interruption commence au niveau du quatrième codon de orfl4. Il reste après la cassette le dernier codon de orfl4.

Le vecteur pSPM509 a été introduit dans la souche Streptomyces ambofaciens OSC2 (cf. ci-dessus) par transformation de protoplastes (Kieser, T et al., 2000). Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les clones résistants à l'apramycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec apramycine (antibiotique B) et sur milieu avec hygromycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'apramycine (ApraR) et sensibles à l'hygromycine (HygS)

sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène orfl4 interrompu par la cassette att3Qaac-. Ces clones ont été plus particulièrement sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de orfl4 par la copie interrompue par la cassette a été vérifié par hybridation. Ainsi, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybridé avec une sonde correspondant à la cassette att3#aac- pour vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique des clones obtenus. Une deuxième hybridation a été effectuée en utilisant comme sonde un produit de PCR correspondant à une séquence débordant d'une centaine de paires de base en amont et en aval de la séquence codante de orfl4. La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR.

Un clone présentant les caractéristiques attendues (orfl4.: att3d2aac-) a été plus particulièrement sélectionné et nommé SPM509. Il a pu en effet être vérifié grâce aux deux hybridations que la cassette att3Qaac- était bien présente dans le génome de ce clone et que l'on obtient bien le profil de digestion attendu dans le cas d'un remplacement, à la suite d'un double événement de recombinaison, du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette att3Qaac- dans le génome de ce clone. Ce clone possède donc le génotype : orf14::att3#aac- et a été nommé SPM509. Il est inutile de procéder à l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de orfl4, au vu de l'orientation des gènes (cf. figure 3), le fait que orf15c soit orienté en sens opposé à orfl4 montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits. L'utilisation d'une cassette excisable permet en revanche d'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de sélection à tout moment. Un échantillon de la souche SPM509 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2913.

EXEMPLE 14: Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue dans le gène orf6*
L'inactivation du gène orf6* a été réalisée grâce à la technique des cassettes excisables (cf. ci-dessus et figure 10). Pour cela, le cosmide pSPM7 a été utilisé comme matrice pour amplifier un fragment du gène orf6* grâce aux oligonucléotides suivants : C9583 : 5' CTGCAGGTGCTCCAGCGCGTCGATCT 3' (oligo sens) (SEQ ID N 102) C9584 : 5' CTGCAGACGGAGGCGGACCTGCGGCT 3' (oligo antisens) (SEQ ID N 103)
Les 20 déoxy-nucléotides situés à l'extrémité 3' de ces oligonucléotides correspondent à une séquence située dans la partie codante du gène orf6* (SEQ ID N 13) et les 6 déoxy-nucléotides situés les plus en 5' correspondent à la séquence d'un site PstI permettant de faciliter le clonage par la suite. Le fragment d'ADN amplifié fait une taille d'environ 1,11 kb. Ce produit de PCR est cloné dans le vecteur pGEM-T Easy (commercialisé par la société Promega (Madison, Wisconcin, USA)) ce qui a permis d'obtenir le plasmide nommé pBXLl 111 (cf. figure 16).

La cassette excisable att1#hyg+ a ensuite été introduite dans la séquence codante du gène orf6*. Pour cela, le plasmide pBXL1111 a été digéré par les enzymes de restriction SmaI et Asp718I et le produit de digestion a été traité par l'enzyme de Klenow. Cette manipulation permet de réaliser une délétion interne de 120 pb dans la séquence codante du gène orf6* (cf. figure 15). De plus, de part et d'autre des sites de restrictions, il reste respectivement 511 pb et 485 pb de la séquence de orf6* qui permettront la recombinaison homologue pour l'inactivation du gène orf6*. La cassette

excisable attl2hyg+ a été préparée à partir du plasmide pattlS2hyg+ (cf. ci-dessus) par digestion de ce plasmide par EcoRV. Cette dernière a ensuite été sous-clonée dans le vecteur pBXLl 111 préalablement préparé comme décrit ci-dessus (digestion SmaI et Asp718I puis traitement à l' enzyme de Klenow). Le plasmide obtenu a été nommé

pBXL1112 (cf. figure 17). Dans cette construction, le gène or/6* comporte une délétion de 120pb et est interrompu par la cassette att1#hyg+.

Le plasmide pBXL1112 a été ensuite digéré par l'enzyme PstI (site bordant la cassette puisque présent dans les oligonucléotides PCR) et l'insert PstI de 3. 7 kb comprenant une partie de orf6* interrompu par la cassette att1#hyg+ a ensuite été cloné au niveau du site PstI du plasmide pOJ260 (cf. ci-dessus). Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pBXLl 113.

Le vecteur pBXL1113 a été introduit dans la souche Streptomyces ambofaciens OSC2 (cf. ci-dessus) par transformation de protoplastes (Kieser, T et al., 2000). Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'hygromycine. Les clones résistants à l'hygromycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec hygromycine (antibiotique B) et sur milieu avec apramycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'hygromycine (HygR) et sensibles à l'apramycine (ApraS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène or/0* interrompu par la cassette att1#hyg+. Ces clones ont été plus particulièrement sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de orf6* par la copie interrompue par la cassette a été vérifié par la technique du Southern blot. Ainsi, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybridé avec une sonde correspondant au gène hyg (obtenu par PCR) pour vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique des clones obtenus. Une deuxième hybridation a été effectuée en utilisant comme sonde l'insert PstI-PstI contenant le gène orf6*, d'une taille d'environ 1,1 kb et obtenu à partir du plasmide pBXLllll (cf. ci-dessus et figure 16). La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR.

Un clone présentant les caractéristiques attendues (orf6*::attl2hyg+) a été plus particulièrement sélectionné et nommé SPM501. Il a pu en effet être vérifié grâce aux deux hybridations que la cassette att1#hyg+ était bien présente dans le génome de ce

clone et que l'on obtient bien le profil de digestion attendu dans le cas d'un remplacement, à la suite d'un double événement de recombinaison, du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette att1#hyg+ dans le génome de ce clone. Ce clone possède donc le génotype : orf6*::att1#hyg+ et a été nommé SPM501. Un échantillon de la souche SPM501 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2909.

La souche SPM501 a été transformée par le vecteur pOSV508 par transformation de protoplastes pour provoquer l'excision de la cassette (cf. figure 14). Le plasmide pOSV508 est dérivé du plasmide pWHM3 (Vara J et al.,1989) (cf. figure 13) dans lequel les gènes xis et int de pSAM2 (Boccard F. et al., 1989b) placés sous le contrôle du promoteur ptrc (Amann, E. et al., 1988) ont été ajoutés (cf. figure 14). L'introduction dans la souche SPM501 du plasmide pOSV508 portant les gènes xis et int de pSAM2 permet l'excision efficace par recombinaison site spécifique de la cassette excisable entre les sites attL et attR flanquant cette cassette (Raynal A. et al., 1998) (figure 10). Parmi les transformants, sélectionnés pour leur résistance au thiostrepton due au gène tsr porté par pOSV508, on choisit ceux devenus sensibles à l'hygromycine dont le gène de résistance est porté par la cassette att1#hyg+, l'excision entraîne en effet la perte de ce gène de résistance (cf. figure 10). Le plasmide pOSV508 est instable et après deux passages successifs sur milieu sans antibiotique des clones isolés sont repiqués sur milieu avec thiostrepton et sur milieu sans thiostrepton. Les clones sensibles au thiostrepton ont perdu pOSV508. Il a été vérifié que l'excision de la cassette a bien eu lieu en phase dans le gène orf6* par PCR et séquençage du produit PCR. L'interruption commence au 158tème codon, 40 codons sont délétés (120pb) et l'excision de la cassette laisse une séquence cicatricielle attl caractéristique de 33pb : 5' ATCGCGCGCTTCGTTCGGGACGAAGAGGTAGAT 3' (SEQ ID N 104).

La souche ainsi obtenue et possédant le génotype voulu (orf6*::attl) a été nommée SPM502.

Un échantillon de la souche SPM502 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2910.

EXEMPLE 15 : Analyse des souches de Streptomyces ambofaciens interrompue dans les gènes or/2, orf3, or/8, orflO, orfl2, orfl3c, orfl4, orf6*
Pour tester la production en spiramycine des diverses souches obtenues, un test microbiologique basé sur la sensibilité d'une souche de Micrococcus luteus a été mis au point (cf. (Gourmelen A. et al., 1998)). La souche de Micrococcus luteus utilisée est une souche dérivée de la souche DSM1790 naturellement sensible à la spiramycine (cette souche est disponible notamment auprès de la German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), (Braunschweig, Allemagne), sous le numéro DSM1790), la souche utilisée dans le présent test diffère de la souche DSM1790 en ce qu'elle est résistante à la congocidine. Cette souche est un mutant spontané obtenu par sélection sur milieu contenant des doses croissantes de congocidine. Une telle souche a été sélectionnée du fait que Streptomyces ambofaciens produit à la fois de la spiramycine et de la congocidine. Le but étant de doser la production en spiramycine des diverses souches obtenues grâce à un test microbiologique basé sur la sensibilité d'une souche de Micrococcus luteus, il est nécessaire de disposer d'une souche résistante à la congocidine.

Les différentes souches de Streptomyces à tester ont été cultivées dans des erlenmeyers à baffles (erlenmeyers chicanés) de 500 ml contenant 70 ml de milieu MP5 (Pernodet et al., 1993). Les erlenmeyers chicanés ont été inoculés à une concentration initiale de 2.5 106 spores/ml des différentes souches de S. ambofaciens et mises à pousser à 27 C sous agitation orbitale de 250 rpm. Des prélèvements de 2 ml de suspensions ont été réalisés après 48,72 et 96 heures de culture et centrifugés. Les

différents surnageants ont ensuite été congelés à -20 C. Une dilution au dixième de ces surnageants dans du milieu de culture stérile est utilisée pour le test (cf. figure 18).

La souche indicatrice de Micrococcus luteus résistante à la congocidine mais sensible à la spiramycine a été cultivée dans du milieu 2TY (Sambrook et al., 1989) contenant de la congocidine à 5 g/ml pendant 48h à 37 C. La densité optique (DO) de la culture est mesurée et cette culture est diluée de façon à ajuster la densité optique à 4.

0,4 ml de cette pré-culture est dilué dans 40 ml de milieu DAM5 (Difco Antibiotic Médium 5, commercialisé par la société Difco), préalablement porté à une température d'environ 45 C. Ce milieu est ensuite coulé dans une boîte carrée de 12x12 cm et laissé à reposer à température ambiante.

Une fois le milieu refroidi et solidifié, des disques en papier Whatman AA (cf.

Gourmelen A. et al., 1998) de 12 mm de diamètre ont été imbibés de 70 III de la dilution au dixième de chaque surnageant et déposés sur la surface de la boîte. Des disques imbibés d'une solution de spiramycine de différentes concentrations (2-4-8 g/ml dans du milieu de culture MP5) sont utilisés comme gamme étalon. Les boîtes sont laissées à 4 C pendant 2 h de façon à permettre la diffusion des antibiotiques dans l'agar puis sont incubées à 37 C pendant 24 à 48h.

Si le disque contient de la spiramycine, celle-ci diffuse dans l'agar et inhibe la croissance de la souche indicatrice de Micrococcus luteus. Cette inhibition crée un halo autour du disque, ce halo reflétant la zone où la souche de Micrococcus luteus n'a pas poussé. La présence de ce halo est donc une indication de la présence de spiramycine et permet de déterminer si la souche de S. ambofaciens correspondant au disque en question est productrice ou non productrice de spiramycine. Une comparaison avec les diamètres d'inhibition obtenus pour la gamme étalon permet d'obtenir une indication de la quantité de spiramycine produite par cette souche.

Les différentes souches décrites dans les exemples précédents ont été utilisées dans ce test pour détecter leur production en spiramycine. Les résultats obtenus ont été regroupés dans le Tableau 38.

Tableau 3

<tb>
<tb> Souche <SEP> Gène <SEP> inactivé <SEP> Exemple <SEP> dans <SEP> Phénotype <SEP> : <SEP>
<tb> lequel <SEP> la <SEP> Producteur <SEP> (+) <SEP> ou
<tb> souche <SEP> est <SEP> non-producteur <SEP> (-) <SEP> de
<tb> décrite <SEP> spiramycine
<tb> ATCC23877 <SEP> Aucun <SEP> 1 <SEP> (+)
<tb> OS49. <SEP> 16 <SEP> orf3::#hyg <SEP> 2 <SEP> (-)
<tb> OS49. <SEP> 67 <SEP> orf3délétion <SEP> en <SEP> phase <SEP> 6 <SEP> (-)
<tb> OS49. <SEP> 107 <SEP> orf8::#hyg <SEP> 7 <SEP> (-)
<tb> OS49. <SEP> 50 <SEP> orf10:: <SEP> #hyg <SEP> 8 <SEP> (-)
<tb> OSC2 <SEP> Aucun <SEP> 10 <SEP> (+)
<tb> SPM21 <SEP> orf2::att3#aac- <SEP> 10 <SEP> (-)
<tb> SPM22 <SEP> orf2::att3 <SEP> délétion <SEP> en <SEP> phase <SEP> 10 <SEP> (-)
<tb> SPM501 <SEP> orf6*::att1#hyg+ <SEP> 14 <SEP> (-)
<tb> SPM502 <SEP> orf6*::attl <SEP> délétion <SEP> en <SEP> phase <SEP> 14 <SEP> (+)
<tb>

SPM507 orfl2: : att3.l.aac- 11 (-) SPM508 orfl3c: : att3.aac- 12 (+)

Ces résultats permettent de tirer un certain nombre de conclusions en ce qui concerne la fonction des différents gènes impliqués dans la biosynthèse de la

spiramycine. Ainsi le gène or/3 est essentiel à la biosynthèse de la spiramycine. En effet une inactivation en phase dans ce gène conduit à une souche (OS49.67, (cf. exemple 6)) ne produisant plus de spiramycine. L'inactivation en phase permet d'écarter l'hypothèse d'une éventuelle influence de la cassette introduite sur l'expression des gènes situés en aval de or/3.

De même, les gènes orf8 et orf10 codent des protéines essentielles à la biosynthèse de la spiramycine puisque les souches OS49.107 et OS49.50 ont un phénotype non producteur. De plus, dans ces deux dernières souches, c'est bien l'inactivation du gène correspondant qui est responsable de ce phénotype non producteur, puisqu'au vu de l'orientation des différentes orfs (cf. figure 3), la construction introduite ne peut avoir d'effet polaire.

L'étude des souches possédant une cassette excisable permet également de tirer un certain nombre de conclusion en ce qui concerne la fonction des gènes interrompus. La

souche SPM507 possède le génotype : orfl2: : att3SZaac-. Il est inutile de procéder à l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de orfl2, au vu de l'orientation des gènes (cf. figure 3). Le fait que orfl3c soit orienté en sens opposé à orfl2 montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits. L'utilisation d'une cassette excisable permet en revanche d'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de sélection à tout moment. Le phénotype de la souche SPM507 est non producteur, on peut donc en conclure que le gène orfl2 est un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens.

La souche SPM508 possède le génotype : orfl3c: : att3S2aac-. Il est inutile de procéder à l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de orfl3c, au vu de l'orientation des gènes (cf. figure 3). Le fait que orfl4 soit orienté en sens opposé à orfl3c montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits. L'utilisation d'une cassette excisable permet en revanche d 'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de sélection à tout moment. Le phénotype de la souche SPM508 est producteur, on peut

donc en conclure que le gène orf13c n'est pas un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens.

La souche SPM509 possède le génotype : orfl4: : att3Saac-. Il est inutile de procéder à l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de or/14, au vu de l'orientation des gènes (cf. figure 3), le fait que orfl5c soit orienté en sens opposé à or/14 montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits. L'utilisation d'une cassette excisable permet en revanche d'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de selection à tout moment. Le phénotype de la souche SPM509 est non producteur, on peut donc en conclure que le gène or/14 est un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens.

La souche SPM21 possède le génotype : orf2::att3#aac-. Le phénotype de cette souche est non producteur de spiramycines. Cependant, l'orientation des gènes orf1 à orf8 (cf. figure 3) laisse penser que ces gènes sont cotranscrits. Aussi, le phénotype observé peut être dû à un effet polaire de la cassette introduite dans or/2 sur l'expression de gènes situés en aval dans l'opéron. La souche SPM22 possède le génotype orf2::att3 et a été obtenue après excision en phase de la cassette introduite. L'excision de la cassette laisse seulement une séquence cicatricielle caractéristique (cf. exemple 10).

La souche SPM22 étant également de phénotype non producteur, on peut en conclure que le gène or/2 est un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens. On observe ici uniquement l'effet dû à l'inactivation de or/2.

La souche SPM501 possède le génotype : orf6*:: attl.s2hyg+. Le phénotype de cette souche est non producteur de spiramycines. Cependant, les gènes orf5* et orf6* (cf. figure 3) ayant la même orientation, le phénotype observé peut être dû à un effet polaire de la cassette introduite dans orf6* sur l'expression de orf5*. La disposition de ces gènes laisse penser qu'ils peuvent être cotranscrits. Pour répondre à cette question, la souche SPM502 a été obtenue après excision en phase de la cassette introduite. Dans cette souche, on observe uniquement l'effet de l'inactivation de orf6*. Cette souche

possède le génotype orf6*::attl (cf. exemple 14). L'excision de la cassette laisse seulement une séquence cicatricielle en phase (cf. exemple 14). La souche SPM502 possède un phénotype producteur (cette souche ne produit cependant que de la spiramycine I (cf*. exemple 16)). On peut donc conclure que le gène orf5*est un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens, puisque son inactivation indirecte dans la souche SPM501 conduit à un phénotype non producteur. Par contre ; le gène orf6* n'est pas un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine I chez S. ambofaciens (par contre il est essentiel à la production de spiramycine II et III (cf. exemple 16)).

EXEMPLE 16. Dosage de la production des spiramycines I, II et III dans les souches mutantes obtenues
Les différentes souches à tester ont été cultivées chacune dans 7 erlensmeyers chicanés de 500 mL contenant 70 ml de milieu MP5 (Pernodet et al., 1993). Les erlens ont été inoculés par 2.5 106 spores/ml des différentes souches de S. ambofaciens et mises à pousser à 27 C sous agitation orbitale de 250 rpm pendant 72 heures. Les cultures correspondant au même clone sont rassemblées, éventuellement filtrées sur filtre plissé, et centrifugées 15 min à 7000 tr/min. Les différents surnageants ont ensuite été stockés à-30 C.

Les dosages ont été effectués par Chromatographie Liquide à Haute Performance (CLHP) par appariement d'ions. L'analyse CLHP du milieu de culture permet de déterminer précisément la concentration des trois formes de spiramycine. La colonne utilisée (Macherey-Nagel) est remplie avec une phase Nucleosil de silice greffée octyle.

La granulométrie est de 5 m et la taille des pores 100 . Le diamètre interne de la colonne est de 4,6mm et sa longueur 25cm. La phase mobile est un mélange de tampon H3PO4 (pH2,2) et d'acétonitrile 70/30 (v/v) contenant 6,25g/L de perchlorate de NaC104. L'analyse est réalisée en régime isocratique avec un débit fixé à 1 ml/min. La

colonne est thermorégulée à 23 C. La détection est assurée par spectrophotométrie UV à 238nm. L'échantillon est réfrigéré à +10 C et la quantification est déterminée à partir de l'aire des pics (par étalonnage externe). Dans ces conditions, les temps de rétention de la spiramycine I, II et III sont respectivement d'environ 17 ; et 30 minutes, comme il a pu être vérifié grâce à un échantillon commercial comprenant les trois formes de spiramycine.

La souche OSC2 possède un phénotype producteur de spiramycine. C'est la souche parentale utilisée pour l'obtention des souches possédant une cassette excisable (cf. exemple 15). Cette souche a donc été utilisée comme témoin positif de production des trois formes de spiramycine. Cette souche produit bien les trois formes de spiramycines comme il a été vérifié par CLHP (cf. figure 19).

L'étude des souches possédant une cassette excisable permet de tirer un certain nombre de conclusions en ce qui concerne la fonction des gènes interrompus. La souche

SPM507 possède le génotype : of f12:: att3,aac-. Le phénotype de la souche SPM507 est non producteur (cf. exemple 15), on peut donc en conclure que le gène orfl2 est un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens. Cette souche ne produit plus de spiramycines comme il a été vérifié par CLHP (cf. figure 22). Ce résultat confirme le caractère essentiel du gène or/72 dans la biosynthèse de la spiramycine.

La souche SPM508 possède le génotype : orfl3c: : att3S2aac-. Le phénotype de la souche SPM508 est producteur de spiramycine (cf. exemple 15), on peut donc en conclure que le gène orfl3c n'est pas un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens. Cette souche produit de la spiramycine I, II et III comme il a été vérifié par CLHP (cf. figure 23). Ce résultat confirme que le gène orfl3c n'est pas un gène essentiel à la biosynthèse des spiramycines I, II et III ches S. ambofaciens.

La souche SPM509 possède le génotype : orf14::att3#aac-. Le phénotype de la souche SPM509 est non producteur, on peut donc en conclure que le gène orfl4 est un

gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens. Cette souche ne produit plus de spiramycines comme il a été vérifié par CLHP (cf. figure 24). Ce résultat confirme l'essentialité du gène or/14 dans la biosynthèse de la spiramycine.

La souche SPM501 possède le génotype : orf6*: : attl S2hyg+. Le phénotype de cette souche est non producteur de spiramycines. Cette souche ne produit plus de spiramycines comme il a été vérifié par CLHP (cf. figure 20). Cependant, les gènes orf5* et orf6* (cf. figure 3) ayant la même orientation, le phénotype observé peut être dû à un effet polaire de la cassette introduite dans orf6*sur l'expression de orf5* dans l'opéron. Ceci laisse penser que ces gènes sont cotranscrits. Pour répondre à cette question, la souche SPM502 a été obtenue par excision de la cassette introduite, produisant une délétion en phase dans le gène or6* et restaurant l'expression de orf5*.

Cette souche possède le génotype orf6*::attl (cf. exemple 14 et 15). L'excision de la cassette laisse seulement une séquence att cicatricielle en phase (cf. exemple 14). La souche SPM502 possède un phénotype producteur de spiramycine. Cependant, comme il a été prouvé par CLHP, cette souche ne produit que de la spiramycine I et ne produit pas de spiramycine II et III (cf. figure 21). On peut donc conclure de ces résultats que le gène or/5* est un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens, puisque son inactivation indirecte dans la souche SPM501 conduit à un phénotype non producteur de spiramycine (cf. figure 20). Par contre ; le gène orf6* n'est pas un gène, essentiel à la biosynthèse de la spiramycine I chez S. ambofaciens, puisque l'inactivation de ce gène conduit à un phénotype producteur de spiramycine I (cf. figure 21).

Cependant, orf6* est essentiel à la production de spiramycine II et III (cf. exemple 16)).

Le gène orf6* code donc bien une acyl-transférase responsable de la modification du platénolide à la position 3 (cf. figure 1).

EXEMPLE 17 : Détermination du point de démarrage de la traduction de orf 10 et amélioration de la production en spiramycines
17. 1 Construction des plasmides pSPM523. pSPM524 et pSPM525 :
Le gène orf10 a été identifié chez Streptomyces ambofaciens et a été désigné srmR par Geistlich et al. (Geistlich, M., et al., 1992). L'inactivation du gène orf10 a été réalisée (cf. exemple 8). Il a pu ainsi être montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycines (cf. exemple 15). Ceci confirme que le gène or/70 est bien impliqué dans la biosynthèse des spiramycines. La protéine codée par ce gène est donc bien essentielle à la biosynthèse des spiramycines. Cependant, l'analyse de la séquence montre que deux codons ATG situés dans la même phase de lecture peuvent être utilisés pour la traduction de orf10 (cf. Figure 28). Un des deux codons possible (le codons le plus en amont) démarre à la position 10656 de la séquence donnée en SEQ ID N 1, alors que l'autre codon possible situé plus en aval démarre à la position 10809 (cf. SEQ ID N 1). Avant de tester un éventuel effet de la surexpression de srmR sur la production de spiramycine, il est important de déterminer dans un premier temps le point de démarrage de la traduction.

Dans le but de déterminer le site de démarrage de la traduction, trois constructions comportant trois formes d'orf10 ont été réalisées. Ces dernières ont été obtenues par PCR en utilisant des oligonucléotides comportant soit un site de restriction HindIII soit un site de restriction BamHI.

Le premier couple utilisé pour l'amplification correspond aux oligonucléotides suivants : EDR39 : 5'CCCAAGCTTGAGAAGGGAGCGGACATTCATGGCCCGCGCCGAACGC3' (SEQ ID N 122) (le site HindIII figure en gras) EDR42 : 5'CGGGATCCGGCTGACCATGGGAGACGGGCGCATCGCCGAGTTCAGC3' (SEQ ID N 123) (le site BamHI figure en gras)

Le couple d'amorces EDR39-EDR42 permet l'amplification d'un fragment d'or/70 comportant l'ATG situé le plus en 3' (position 10809 dans la séquence donnée en SEQ ID N 1) (cf. Figure 28). Le fragment obtenu fait une taille d'environ 2 kb et sera appelé par la suite "orf10 court", il ne contient pas le promoteur de or/70. Ce fragment de 2kb a été cloné dans le vecteur pGEM-T easy pour donner naissance au plasmide pSPM520.

Le deuxième couple utilisé pour l'amplification correspond aux oligonucléotides suivants : EDR40 : 5'CCCAAGCTTGAGAAGGGAGCGGACATTCAATGCTTTGGTAAAGCAC3' (SEQ ID N 124) (le site HindIII figure en gras) EDR42 : 5'CGGGATCCGGCTGACCATGGGAGACGGGCGCATCGCCGAGTTCAGC3' (SEQ ID N 123) (le site BamHI figure en gras) Le couple d'amorces EDR40-EDR42 permet l'amplification d'un fragment d'orf10 comportant l'ATG situé le plus en 5' (position 10656 dans la séquence donnée en SEQ ID N 1) (cf. Figure 28). Ce fragment de 2,2 kb appelé par la suite "orf10 long" a été cloné dans le vecteur pGEM-T easy pour donner naissance au plasmide pSPM521, ce plasmide ne contient pas le promoteur de or/70.

Le troisième couple utilisé pour l'amplification correspond aux oligonucléotides suivants : EDR41 : 5'-CCCAAGCTTTCAAGGAACGACGGGGTGGTCAGTCAAGT-3' (SEQ ID N 125) (le site HindIII figure en gras) EDR42 : 5'CGGGATCCGGCTGACCATGGGAGACGGGCGCATCGCCGAGTTCAGC3' (SEQ ID N 123) (le site BamHI figure en gras) Le couple d'amorces EDR41-EDR42 permet l'amplification du gène orf10 avec les deux ATG, ainsi que son propre promoteur (cf. Figure 28). Ce fragment de 2,8 kb

appelé par la suite "orf10 pro" a été cloné dans le vecteur pGEM-T easy pour donner naissance au plasmide pSPM522.

Le fragment "orf10 pro" a été obtenu en utilisant comme matrice l'ADN chromosomique de la souche OSC2. Les fragments "orf10 court" et "orf10 long" ont quant à eux été obtenus en utilisant comme matrice l'ADN du fragment "orf10 pro" préalablement purifié.

Les inserts HindIII-BamHI des plasmides pSPM520, pSPM521 et pSPM522 ont ensuite été sous-clonés dans le vecteur pUWL201 (plamside dérivé du plasmide pUWL199 (Wehmeier UF, 1995) dans lequel le fragment KpnI-BamHI de la région du promoteur de ermE (cf. Bibb et al., 1985, notamment figure 2) portant une mutation augmentant la force du promoteur (promoteur ermE*) (Bibb et al., 1994) a été introduit (cf. Doumith et al., 2000)) préalablement digéré par les enzymes HindIII-BamHI. Ainsi, il a été obtenu trois plasmides : pSPM523 (dérivé du pUWL201 avec la forme "orf10 court" comme insert), pSPM524 (dérivé du pUWL201 avec la forme "orf10 long" comme insert) et pSPM525 (dérivé du pUWL201 avec la forme "orf10 pro") (Figure 28).

17. 2 Transformation de la souche OS49. 50 par les constructions pSPM523, pSPM524 et pSPM525 :
La souche OS49. 50 (souche interrompue dans le gène orf10, cf. exemple 8) a été transformée indépendamment par transformation de protoplastes (Kieser, T et al., 2000) par chacun des plasmides pSPM523, pSPM524 et pSPM525. Un témoin négatif a également été réalisé en transformant la souche OS49.50 par le plasmide pUWL201 sans insert. Après transformation des protoplastes, les clones sont sélectionnés pour leur résistance au au thiostrepton. La transformation des clones par chacun des plamides est vérifiée par extraction de ces plasmides. Ainsi quatre nouvelles souches ont été obtenues : la souche OSC49.50 pUWL201, issue de la transformation par le plasmide pUWL201 sans insert, la souche OSC49. 50 pSPM523, issue de la transformation par le plasmide pSPM523, la souche OSC49. 50 pSPM524, issue de la transformation par le

plasmide pSPM524 et enfin la souche OS49. 50 pSPM525, issue de la transformation par le plasmide pSPM525.

La production de spiramycines de chacune de ces quatre souches a été testée par CLHP. Pour cela, les différentes souches de Streptomyces à tester ont été cultivées dans des erlenmeyers à baffles (erlenmeyers chicanés) de 500 ml contenant 70 ml de milieu MP5 (Pernodet et al., 1993). Lorsque la souche contient le plasmide pUWL201 ou l'un de ses dérivés, il est ajouté 5 g/ml de thiostrepton. Les erlenmeyers chicanés ont été inoculés à une concentration initiale de 2.5 106 spores/ml des différentes souches de S. ambofaciens et les cultures ont été incubées à 27 C sous agitation orbitale de 250 rpm pendant 96 heures. Les cellules ont ensuite été séparées du milieu par centrifugation et le surnageant a été analysé par CLHP (cf. exemple 16) pour déterminer la quantité de spiramycine produite. Grâce à un échantillon étalon et à la mesure de l'air des pics, il a été possible de déterminer la quantité de chacune des spiramycines produites par ces souches. Les résultats de cette analyse sont présentés dans le tableau 40, les données sont exprimées en mg par litre de surnageant. Les résultats correspondent à la production totale en spiramycines (obtenue en additionnant la production en spiramycine I, II et III).

Tableau 40. Production en spiramycines des souches dérivées de OS49.50, (résultats exprimés en mg/1).

Souche <SEP> Production <SEP> en <SEP> Spiramycines
<tb> OS49.50 <SEP> 0
<tb> pUWL201
<tb> OS49.50 <SEP> 0
<tb> pSPM523
<tb> OS49. <SEP> 50 <SEP> 93
<tb> pSPM524
<tb>

Comme le montre les résultats donnés dans le tableau 40, le témoin négatif (souche OS49. 50 transformée par le plasmide pUWL201) ne produit pas de spiramycine. Lorsque le plasmide pSPM523 (qui contient la forme "orflO court" ) est introduit dans la souche OS49. 50, aucune production de spiramycine n'est observée.

En revanche, la présence du plasmide pSPM524 (qui contient la forme "orf10 long") et du plasmide pSPM525 (qui contient la forme "orf10 pro") restaure la production de spiramycine dans la souche hôte OS49. 50. Ainsi, seuls les fragments de orf10 contenant l'ATG le plus en amont permettent de restaurer la synthèse de spiramycine.

Dans le but de confirmer ces résultats, le plasmide pSPM521 (plasmide pGEM-T easy contenant la forme "orflO long") a été digéré par l'enzyme de restriction XhoI (cette enzyme possède un site unique dans ce plasmide, localisé entre les deux ATG (cf. Figure 28)). Les extrémités XhoI ont ensuite été rendues bout franc par traitement à l'enzyme de Klenow. Le plasmide a alors été refermé sur lui-même par action de la T4 DNA ligase pour donner naissance au plasmide pSPM527. Si l'ATG le plus en amont (position 10656 dans la séquence donnée en SEQ ID N 1) est bien utilisé comme site d'initiation de la traduction, ce traitement entrainera un décalage du cadre de lecture au niveau du site XhoI et aura pour effet la production d'une protéine ne présentant pas d'activité activatrice. Par contre si l'initiation de la traduction a lieu au niveau de l'ATG plus en aval (position 10809 dans la séquence donnée en SEQ ID N 1), ce traitement devrait avoir peu ou pas d'effet sur l'expression de OrflO (compte tenu de la localisation du point de démarrage de la transcription) et aucun effet sur la protéine produite.

L'insert BamHI-HindIII de pSPM527 a ensuite été sous-cloné dans le vecteur pUWL201 pour donner naissance au plasmide pSPM528. Ce plasmide a été introduit dans la souche OS49. 50 et un clone possédant le plasmide voulu a plus particulièrement été sélectionné. La production de spiramycine de la souche

résultante a ensuite été testée par CLHP (Cf. exemple 16 et ci-dessus). Contrairement à ce qui avait été observé avec le plasmide pSPM524 (cf. tableau 40), la présence du plasmide pSPM528 dans la souche OS49.50 ne rétablit pas la production de spiramycine. Ceci confirme que le démarrage de la traduction du gène orf10 est l'ATG situé le plus en aval (ATG 1 cf. Figure 28).

17. 3 Amélioration de la production en spiramycines de la souche OSC2 de S. ambofaciens :
Afin de tester l'effet de la surexpression du gène orf10 sur la production de spiramycines, les plasmides pSPM523, pSPM524, pSPM525 et pSPM528 ont été introduits dans la souche OSC2. Pour cela, des protoplastes de la souche OSC2 ont été transformés (Kieser, T et al., 2000) indépendamment par chacun des plasmides pSPM523, pSPM524, pSPM525 et pSPM528. Un témoin négatif a également été réalisé en transformant la souche OSC2 par le plasmide pUWL201 sans insert. Après transformation des protoplastes, les clones sont sélectionnés pour leur résistance au au thiostrepton. Ainsi cinq nouvelles souches ont été obtenues : la souche OSC2 pUWL201, issue de la transformation par le plasmide pUWL201 sans insert, la souche OSC2 pSPM523, issue de la transformation par le plasmide pSPM523, la souche OSC2 pSPM524, issue de la transformation par le plasmide pSPM524, la souche OSC2 pSPM525, issue de la transformation par le plasmide pSPM525 et enfin la souche OSC2 pSPM528, issue de la transformation par le plasmide pSPM528. La production en spiramycines de ces souches a alors été analysée par CLHP (de la même manière que dans l'exemple 17. 2). L'analyse de la production en spiramycine de la souche OSC2 a également été effectée en parallèle pour comparaison. Les résultats de cette analyse sont présentés dans le tableau 41, les données sont exprimées en mg par litre de surnageant. Les résultats correspondent à la production totale en spiramycines (obtenue en additionnant la production en spiramycine I, II et III).

Tableau 41. Production en spiramycines des souches dérivées de OSC2, (résultats exprimés en mg/1).

Souche <SEP> Production <SEP> en <SEP> spiramycines
<tb> OSC2 <SEP> 69
<tb> OSC2 <SEP> 103
<tb> pUWL201
<tb> OSC2 <SEP> 19
<tb> pSPM523
<tb> OSC2 <SEP> 135
<tb> pSPM524
<tb> OSC2 <SEP> 278
<tb> pSPM525
<tb> OSC2 <SEP> 68
<tb> pSPM528
<tb>

Ainsi, il est observé que la présence du plasmide pSPM524 ou du plasmide pSPM525 augmente significativement la production en spiramycines de la souche OSC2. Ceci démontre bien que la surexpression de OrflO a un effet positif sur la production en spiramycines. Le plasmide pSPM528 n'a par contre pas d'effet sur la production en spiramycines.

Les plasmides pSPM525 et pUWL201 ont de la même manière été introduit dans la souche SPM502 (cf. exemple 14). Ainsi deux nouvelles souches ont été obtenues : la souche SPM502 pUWL201, issue de la transformation par le plasmide

pUWL201 sans insert, et la souche SPM502 pSPM525, issue de la transformation par le plasmide pSPM525.

Un échantillon de la souche SPM502 pSPM525 (cette souche contient le plasmide pSPM525, cf. ci-dessus) a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 26 février 2003 sous le numéro d'enregistrement 1-2977.

La production en spiramycines des souches SPM502 pUWL201 et SPM502 pSPM525 a été analysée par CLHP (de la même manière que dans l'exemple 17.2).

L' analyse de la production en spiramycines de la souche SPM502 a également été effectée en parallèle pour comparaison. Les résultats de cette analyse sont présentés dans le tableau 42, les données sont exprimées en mg par litre de surnageant. Les résultats correspondent à la production en spiramycine I. En effet, aucune de ces souches ne produit de spiramycine II et III.

Tableau 42. Production en spiramycine 1 des souches dérivées de SPM502, (résultats exprimés en mg/1).

Souche <SEP> Spiramycine <SEP> 1
<tb> SPM502 <SEP> 47
<tb> SPM502 <SEP> pUWL201 <SEP> 72
<tb> SPM502 <SEP> pSPM525 <SEP> 130
<tb>

Ainsi, il a pu être observé que la surexpression du gène orf10 dans la souche SPM502 augmente de facon importante la production de spiramycine I.

EXEMPLE 18 : Construction d'une banque d'ADN génomique de la souche OSC2 de Streptomyces ambofaciens chez E. coli dans la cosmide pWED2.

18. 1 Construction du cosmide pWED2 :
Dans le but de faciliter l'inactivation de gènes chez Streptomyces, un cosmide portant la séquence oriT du plasmide RK2 (ce qui permet son introduction par conjugaison dans Streptomyces à partir d'une souche appropriée de E. coli) et portant également un gène de résistance à un antibiotique conférant un phénotype repérable chez Streptomyces, a été construit. Un tel cosmide contenant de grands inserts d'ADN génomique de Streptomyces ambofaciens peut être utilisé dans des expériences d'inactivation de gènes.

Pour construire ce vecteur, une cassette pac-oriT (fragment EcoRV) a été introduite dans le cosmide pWEDl (Gourmelen et al., 1998) , dérivé du cosmide pWED15 (Wahl et al., 1987), au niveau du site unique HpaI. La cassette pac-oriT a été obtenue par PCR. Pour cela, le gène pac a été amplifié par PCR à partir du plasmide pVF 10.4 (Vara et al., 1985 ; Lacalle et al., 1989) en utilisant comme première amorce, l'amorce A (de séquence 5'CCAGTAGATATCCCGCCAACCCGGAGCTGCAC-3' (SEQ ID N 126), le site de restriction EcoRV a été souligné et la séquence en gras de 20 nucléotides correspond à une région en amont du promoteur du gène pac) et comme deuxième amorce, l'amorce B (de séquence 5'GAAAAGATCCGTCATGGGGTCGTGCGCTCCTT-3' (SEQ ID N 127), qui comporte à son extrémité 5' une séquence de 12 nucléotides correspondant au début de la séquence oriT (souligné double) et une séquence de 20 nucléotides (en gras) correspondant à la fin du gènepac (cf. Figure 29, 1 ère PCR).

Le gène oriT a quant à lui été amplifié par PCR à partir du plasmide pPM803 (Mazodier,P. et al., 1989) en utilisant comme première amorce, l'amorce C (de séquence 5'-CACGACCCCATGACGGATCTTTTCCGCTGCAT-3' (SEQ ID N 128)), qui comporte à son extrémité 5' une séquence de 12 nucléotides correspondant à une séquence en aval de la séquence codante du gène pac (en gras) et une séquence de

20 nucléotides correspondant au début de la séquence on?) et comme deuxième amorce, l'amorce D (de séquence 5'GAGCCGGATATCATCGGTCTTGCCTTGCTCGT-3' (SEQ ID N 129)) qui comporte le site de restriction EcoRV (souligné simple) et une séquence de 20 nucléotides correspondant à la fin de la séquence oriT (souligné double) (cf. Figure 29, 2ième PCR).

Le produit d'amplification obtenu avec les amorces A et B et celui obtenu avec les amorces C et D ont à une de leur extrémité, une séquence commune de 24 nucléotides. Une troisième PCR a été réalisée en mélangeant les deux produits d'amplification obtenus précédemment et en utilisant comme amorces, les amorces A et D (cf. figure 29, 3ième PCR). Ceci a permis d'obtenir un produit d'amplification correspondant à l'ensemble pac+oriT. Ce fragment pac-oriT a alors été clone dans le vecteur pGEM-T Easy (commercialisé par la société Promega (Madison, Wisconcin, USA)), ce qui a permis d'obtenir le plasmide pGEM-T-pac-oriT. L'insert de ce plasmide a ensuite été sous cloné dans le cosmide pWEDl. Pour cela le plasmide pGEM-pac-oriT a été digéré par l'enzyme EcoRV et l'insert EcoRV contenant l'ensemble pac+oriT a été inséré dans le cosmide pWEDl ouvert au préalable par l'enzyme HpaI. Le cosmide ainsi obtenu a été baptisé pWED2 (cf. Figure 30).

Ce cosmide permet de faciliter l'inactivation de gènes chez Streptomyces.

En effet, il porte la séquence oriT (ce qui permet son introduction par conjugaison dans Streptomyces à partir d'une souche appropriée de E. coli) mais également un gène de résistance à un antibiotique conférant un phénotype repérable chez Streptomyces. Un tel cosmide contenant de grands inserts d'ADN génomique de Streptomyces ambofaciens peut être utilisé dans des expériences d'inactivation de gènes.

Ainsi un cosmide dérivé de pWED2 contenant le gène cible pourra par exmeple être introduit dans la souche de E. coli KS272 contenant le plasmide pKOBEG (cf. Chaveroche et al. 2000) et une cassette sera introduite dans le gène cible selon la technique décrite par Chaveroche et al. 2000. Le cosmide obtenu par cette technqiue (cosmide dans lequel le gène cible est inactivé), pourra ensuite être

introduit dans une souche de E. coli telle que la souche S 17.1 ou toute autre souche permettant de transférer par conjugaison des plasmides contenant la séquence oriT vers Streptomyces.

Après conjugaison entre E. coli et Streptomyces, des clones de Streptomyces dans lesquelles la copie sauvage du gène cible aura été remplacée par la copie interrompue pourront être obtenues comme décrit dans l'exemple 2.

Le gène de résistance exprimé chez Streptomyces présent sur ce nouveau cosmide est le gène pac de Streptomyces alboniger (Vara, J et al., 1985 ; Lacalle et al., 1989) qui code la puromycine N-acétyl transférase et qui confère la résistance à la puromycine. Lors d'expériences d'inactivation de gène, on cherchera les clones dans lesquels un double événement de recombinaison aura eu lieu. Ces clones auront éliminer le cosmide pWED2 et seront donc redevenus sensibles à la puromycine.

18. 2 Construction d'une banque d'ADN génomique de la souche OSC2 de Streptomyces ambofaciens chez E. coli dans le cosmide pWED2
L'ADN génomique de la souche OSC2 de Streptomyces ambofaciens a été digéré partiellement par l'enzyme de restriction BamHI de manière à obtenir des fragments d'ADN de taille comprise entre environ 35 et 45 kb. Ces fragments ont ensuite été clonés dans le cosmide pWED2, ce dernier ayant été au préalable digéré par BamHI, puis traité par la phosphatase alcaline. Le mélange de ligation a ensuite été encapsidé in vitro dans des particules de phages lambda grâce au système Packagene Lambda DNA packaging système commercialisé par la société Promega (Madison, Wisconcin, USA) en suivant les recommandations du fabriquant. Les particules phagiques obtenues ont été utilisées pour infecter la souche SURE@ d'E. coli commercialisée par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA). La séléction des clones a été effectuée sur milieu LB + ampicilline (50 g/ml), le cosmide pWED2 conférant la résistance à l'ampicilline.

EXEMPLE 19 : Isolement de cosmides de la nouvelle banque couvrant la région de la voie de biosynthèse des spiramycines
19. 1 Hybridation sur colonies de la banque génomique de Streptomyces ambofaciens OSC2 :
Des cosmides de la nouvelle banque de Streptomyces ambofaciens OSC2 (cf. exemple 18) couvrant les orfl * à orf10* ou une partie ou la totalité des orfl à orf25c, ou une région plus en amont de l'orf25c ont été isolés. Pour cela, des hybridations successives sur les colonies d'E. coli obtenues selon l'exemple 18 ont été réalisées en utilisant les 3 sondes suivantes (cf. figure 31): - La première sonde utilisée correspond à un fragment d'ADN d'environ 0,8kb amplifié par PCR en utilisant comme matrice le cosmide pSPM5 et les amorces suivantes : ORF23c: 5'-ACGTGCGCGGTGAGTTCGCCGTTGC-3' (SEQ ID N 130) et ORF25c : 5'-CTGAACGACGCCATCGCGGTGGTGC-3' (SEQ ID N 131).

Le produit de PCR ainsi obtenu contient un fragment du début de l'orf23c, l'orf24c en entier et la fin de l'orf25c (cf. figure 31, sonde I).

- La deuxième sonde utilisée correspond à un fragment d'ADN d'environ 0,7kb amplifié par PCR en utilisant comme matrice l'ADN total de la souche S. ambofaciens ATCC23877 et les amorces suivantes : ORFl*c: 5'-GACCACCTCGAACCGTCCGGCGTCA-3' (SEQ ID N 132) et ORF2*c : 5'-GGCCCGGTCCAGCGTGCCGAAGC-3' (SEQ ID N 133).

Le produit de PCR ainsi obtenu contient un fragment de la fin de l'orfl *c et du début de l'orf2*c (cf. figure 31, sonde II).

- La troisième sonde utilisée correspond à un fragment EcoRI-BamHI d'environ 3kb contenant les orfl, or/2 et orf3 et obtenu par digestion du plasmide pOS49.99 (cf. figure 31, sonde III).

Environ 2000 clones de la banque obtenue dans l'exemple 18. 2 ont été transférés sur filtre pour hybridation sur colonies selon les techniques classiques (Sambrook et al., 1989).

La première sonde (cf. figure 31, sonde I) a été marquée au 32P par la technique du random priming (Kit commercialisé par la société Roche) et utilisées pour l'hybridation sur 2000 clones de la banque, après transfert sur filtre. L'hybridation a été effectuée à 65 C dans le tampon décrit par Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984). Deux lavages ont été effectués en 2x SSC, 0,1% SDS à 65 C, le premier pendant 10 minutes et le deuxième pendant 20 minutes et un troisième lavage d'une durée de 30 minutes a ensuite été effectué en 0. 2X SSC, 0,1% SDS à 65 C. Dans ces conditions d'hybridation et de lavage, 20 clones parmi les 2000 hybridés présentaient un fort signal d'hybridation avec la première sonde. Ces 20 clones ont été cultivés en milieu LB+ ampicilline (50 g/ml) et les 20 cosmides correspondants ont été extraits par lyse alcaline (Sambrook et al., 1989) puis ils ont été digérés par l'enzyme de restriction BamHI. Les produits de digestions ont ensuite été séparés sur gel d'agarose, transférés sur membrane de Nylon et hybridés par la première sonde (cf. ci-dessus : le produit de PCR ORF23c-ORF25c, sonde I) dans les mêmes conditions que ci-dessus. Douze cosmides possédaient un fragment BamHI hybridant fortement avec la sonde utilisée.

Ces 12 cosmides ont été nommés pSPM34, pSPM35, pSPM36, pSPM37, pSPM38, pSPM39, pSPM40, pSPM41, pSPM42, pSPM43, pSPM44 et pSPM45. Les profils, après digestion par BamHI, de ces 12 cosmides ont été comparés entre eux et avec celui du cosmide pSPM5. De plus des expériences d'amplification par PCR en utilisant différentes amorces correspondant à différents gènes déjà identifiés dans la région orflorf25c ont permis de positionner l'insert de certains de ces cosmides les uns par rapport aux autres et de déterminer également la localisation de ces inserts dans la région orflorf25c déjà connue (cf. Figure 32). Le cosmide pSPM36 a plus particulièrement été choisi car il était susceptible de contenir une grande région en amont de l'orf25c (cf.

Figure31 et 32).

Dans un deuxième temps, et en utilisant les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus, les 2000 clones de la banque de Streptomyces ambofaciens OSC2 ont été hybridés avec la deuxième sonde correspondant au produit de PCR : ORF1*c- ORF2*c (cf. figure 31, sonde II). Cette hybridation a permis d'isoler des cosmides dont l'insert est situé dans la région de orfl*c à orf10*c. Dans les conditions d'hybridation utilisés, 16 clones parmi les 2000 hybridés présentaient un fort signal d'hybridation avec cette deuxième sonde. Ces 16 clones ont été cultivés en milieu LB+ ampicilline (50 p,g/ml) et les 16 cosmides correspondants ont été extraits par lyse alcaline (Sambrook et al., 1989) puis ils ont été digérés par l'enzyme de restriction BamHI. Les profils de digestion (après digestion par BamHI) de ces 16 cosmides ont été comparés entre eux et avec celui du cosmide pSPM7. Des expériences d'amplication par PCR avec les amorces ORFl*c et ORF2*c ont permis de choisir deux cosmides qui renfermaient bien les gènes orf1*c et orf2*c et dont les profils possédaient des bandes communes mais aussi des bandes différentes. De plus d'autres expériences d'amplification par PCR en utilisant différentes amorces correspondant à différents gènes déjà identifiés dans la région orf1*c à orfl0*c ont permis de positionner l'insert de ces cosmides les uns par rapport aux autres et de déterminer également la localisation de ces inserts dans la région orfl *c à orfl0*c déjà connue (cf. Figure 32). Les deux cosmides plus particulièrement sélectionnés ont été nommés pSPM47 et pSPM48 (cf. Figure 32).

En utilisant les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus, les 2000 clones de la banque de Streptomyces ambofaciens OSC2 ont également été hybridés avec la troisième sonde correspondant au fragment d'ADN EcoRI-BamHI du plasmide pOS49. 99 (cf. figure 31 sonde ni). Cette hybridation a permis d'isoler les cosmides contenant la région de l'orfl jusqu'à l'orf3 et susceptibles de contenir soit une grande partie des gènes des PKS, soit une grande partie des gènes orfl à orf25c de la voie de biosynthèse des spiramycines. Dans ces conditions d'hybridation, 35 clones parmi les 2000 hybridés présentaient un fort signal d'hybridation avec la troisième sonde. Ces 35 clones ont été cultivés en milieu LB+ ampicilline (50 g/ml) et les 35 cosmides correspondants ont été extraits par lyse alcaline (Sambrook et al., 1989) puis digérés par

l'enzyme de restriction BamHI. Les profils, après digestion par BamHI, de ces 35 cosmides ont été comparés entre eux et avec celui du cosmide pSPM5. De plus des expériences d'amplification par PCR en utilisant différentes amorces correspondant à différents gènes déjà identifiés dans la région orfl à orf25c ont permis de vérifier que ces cosmides renfermaient bien des inserts provenant de la région orfl à orf25c et de positionner les inserts de ces cosmides les uns par rapport aux autres et par rapport à la la région orf1 à orf25c déjà connue (cf. Figure 32). Cinq cosmides ont été plus particulièrement sélectionnés, ils ont été nommés pSPM50, pSPM51, pSPM53, pSPM55 et pSPM56 (cf. Figure 32).

19. 2 Sous clonage et séquençage d'une partie de l'insert du cosmide pSPM36.

La sonde d'environ 0,8 kb obtenue par PCR avec les amorces ORF23c et ORF25c (cf. ci-dessus et figure 31, sonde I) a également été utilisée dans des expériences de Southern Blot sur l'ADN total de S. ambofaciens OSC2 digéré par l'enzyme PstI. Dans les conditions d'hybridation décrite ci-dessus, cette sonde révèle un fragment unique PstI d'environ 6 kb lorsque hybridé sur l'ADN total de S. ambofaciens OSC2 digéré par l'enzyme PstI. Il existe un site Pstl au niveau de l'orf23c (cf. SEQ ID N 80) mais aucun autre site Pstl jusqu'à l'extrémité (site BamHI) de la séquence connue (cf. SEQ ID N 1). Ce fragment PstI-BamHI a une taille d'environ 1. 4 kb. Le fragment PstI de 6 kb hybridé sur l'ADN total de S. ambofaciens digéré par l'enzyme PstI contient donc une région d'environ 4,6 kb située en amont de orj25c. Cette région est susceptible de contenir d'autres gènes dont les produits sont impliqués dans la voie de biosynthèse de la spiramycine. Il a été vérifié par digestion que le cosmide pSPM36 contenait bien ce fragment Pstl de 6 kb. Ce fragment a été isolé à partir de pSPM36, dans le but de déterminer la séquence plus en amont de orf25c. Pour cela, le cosmide pSPM36 a été digéré par l'enzyme de restriction PstI Le fragment Pstl-Pstl d'une taille d'environ 6kb a été isolé par électroélution à partir d'un gel d'agarose 0. 8% puis cloné dans le vecteur pBK-CMV (4512bp) (commercialisé par la société Stratagene (La Jolla, Californie, USA)). Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pSPM58 (cf. Figure 33) et la séquence de son insert a été déterminée. La séquence de cet insert est présentée en SEQ ID N 134.

Toutefois, toute la séquence n'a pas été déterminée et il subsite un trou d'environ 450 nucléotides, la partie de la séquence non déterminée a été notée par une succession de N dans la séquence correspondante.

19. 3 Analyse des nouvelles séquences nucléotidiques, détermination des phases ouvertes de lecture et caractérisation des gènes impliqués dans la biosynthèse des spiramycines.

La séquence de l'insert du cosmide pSPM58 obtenue a été analysée grâce au programme FramePlot (Ishikawa J & Hotta K. 1999). Ceci a permis d'identifier, parmi les phases ouvertes de lecture, les phases ouvertes de lecture présentant un usage des codons typique de Streptomyces. Cette analyse a permis de déterminer que cet insert comporte 4 nouvelles ORFs en amont de l'orf25c (cf. figure 34). Ces gènes ont été nommés or/26 (SEQ ID N 107), or/27 (SEQ ID N 109), orj28c (SEQ ID N 111, la séquence de cette orf n'a pas été déterminée complètement puisqu'un trou d'environ 450 nucléotide subsite lors du séquençage de l'insert de pSPM58, ces 450 nucléotides figurent sous la forme d'une sére de N dans la séquence SEQ ID N 111) et orf29 (la séquence de cette dernière orf était incomplète dans cette insert). Le c ajouté dans le nom du gène signifiant pour l'ORF en question que la séquence codante est dans l'orientation inverse (cf. figure 34).

Les séquences protéiques déduites de ces phases ouvertes de lecture ont été comparées avec celles présentes dans différentes bases de données grâce à différents programmes : BLAST (Altschul et al., 1990) (Altschul et al., 1997), CD-search, (ces deux programmes sont accessibles notamment auprès du National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Bethesda, Maryland, USA)), FASTA ((Pearson W.

R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990) (ce programme est accessible notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France). Ces comparaisons ont permis de formuler des hypothèses sur la fonction des produits de ces gènes et d'identifier ceux susceptibles d'être impliqués dans la biosynthèse de spiramycines.

19. 4 Sous clonage et séquençage d'une autre partie de l'insert du cosmide pSPM36.

La sonde d'environ 0,8 kb obtenue par PCR avec les amorces ORF23c et ORF25c (cf. ci-dessus et figure 31, sonde 1) a également été utilisée dans des expériences de Southern Blot sur l'ADN total de la souche OSC2 digéré par l'enzyme StuI. Dans les conditions d'hybridation décrite ci-dessus pour cette sonde, cette sonde révèle un fragment unique StuI d'environ 10 kb lorsque hybridé sur l'ADN total de la souche OSC2 digéré par l'enzyme StuI. Compte tenu de la présence d'un site StuI dans l'orf23c (cf. SEQ ID N 80) et de la localisation de ce site par rapport au site PstI, ce fragment de 10 kb inclut la totalité du fragment PstI précédemment étudié (insert de pSPM58) et permet d'avoir accès à une région non encore étudiée d'environ 4 kb. (cf figure 33). Il a été vérifié par digestion que le cosmide pSPM36 contenait bien ce fragment StuI de 10 kb. Ce fragment a été isolé à partir du cosmide pSPM36, dans le but de déterminer la séquence de la fin d'or/29 et d'autres gènes plus en amont de orfl9. Pour cela, le cosmide pSPM36 a été digéré par l'enzyme de restriction StuI. Le fragment StuI-StuI d'une taille d'environ 10 kb a été isolé par électroélution à partir d'un gel d'agarose 0. 8% puis cloné dans le vecteur pBK-CMV (4512bp) (commercialisé par la société Stratagene (La Jolla, Californie, USA)). Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pSPM72 (cf. Figure 33). Ce dernier a ensuite été digéré par EcoRI (site EcoRI dans l'insert de pSPM58) et HindIII (site HindIII dans le site de clonage multiple du vecteur, immédiatement après le site StuI de l'extrémité de l'insert) (cf. Figure 33). Le fragment d'ADN EcoRI-HindIII ainsi obtenu, correspond à un fragment de l'insert du plasmide pSPM72 (cf. figure 33) et a été sous-cloné dans le vecteur pBC-SK+ (commercialisé par la société Stratagene (La Jolla, Californie, USA)) digéré au préalable par EcoRI et HindIII. Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pSPM73 et la séquence de son insert a été déterminée. La séquence de cet insert est présentée en SEQ ID N 135.

19. 5 Analyse des nouvelles séquences nucléotidiques, détermination des phases ouvertes de lecture et caractérisation des gènes impliqués dans la biosynthèse des spiramycines.

La séquence partielle de l'insert du cosmide pSPM73 obtenue a été analysée grâce au programme FramePlot (Ishikawa J & Hotta K. 1999). Ceci a permis d'identifier, parmi les phases ouvertes de lecture, les phases ouvertes de lecture présentant un usage des codons typique de Streptomyces. Cette analyse a permis de déterminer que cet insert comporte 4 ORFs, une incomplètes et trois complètes (cf. figure 34). L'ORF incomplète correspond à la partie 3' de la séquence codante de or/29 ce qui à permis de compléter la séquence de ce gène grâce à la séquence partielle de ce même orf obtenue lors du séquençage de l'insert du plasmide pSPM58 (cf. exemple 19. 2 et 19. 3), l'ensemble des deux séquences à ainsi permis d'obtenir la séquence complète de orj29. Les 4 gènes ont ainsi été nommés or/29 (SEQ ID N 113), orf30c (SEQ ID N 115), or/31 (SEQ ID N 118) et orf32c (SEQ ID N 120). Le c ajouté dans le nom du gène signifiant pour l'ORF en question que la séquence codante est dans l'orientation inverse (cf. figure 34).

Les séquences protéiques déduites de ces phases ouvertes de lecture ont été comparées avec celles présentes dans différentes bases de données grâce à différents programmes : BLAST (Altschul et al., 1990) (Altschul et al., 1997), CD-search, (ces deux programmes sont accessibles notamment auprès du National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Bethesda, Maryland, USA)), FASTA ((Pearson W. R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990) (ce programme est accessible notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France). Ces comparaisons ont permis de formuler des hypothèses sur la fonction des produits de ces gènes et d'identifier ceux susceptibles d'être impliqués dans la biosynthèse de spiramycines.

EXEMPLE 20 : Analyse de la production d'intermédiaires de biosynthèse de spiramycines :
20. 1 Préparation des échantillons :
Les différentes souches à tester ont été cultivées chacune dans 7 erlenmeyers chicanés de 500 ml contenant 70 ml de milieu MP5 (Pemodet et al., 1993). Les erlens ont été inoculés par 2.5 106spores/ml des différentes souches de S. ambofaciens et mises à pousser à 27 C sous agitation orbitale de 250 rpm pendant 96 heures. Les cultures correspondant au même clone sont rassemblées, éventuellement filtrées sur filtre plissé, et centrifugées 15 min à 7000 tr/min.

Le pH du moût est ensuite ajusté à 9 avec de la soude et le surnageant est extrait par de la méthyl iso-butyryl cétone (MIBK). La phase organique (MIBK) est alors récupérée et évaporée. L'extrait sec est ensuite repris dans 1ml d'acétonitrile, puis dilué au 1/10 (100 l qsp lml avec de l'eau) avant d'être utilisé pour les analyses en chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (CL/SM).

20. 2 Analyse des échantillons en CL/SM :
Les échantillons ont été analyés en CL/SM dans le but de déterminer la masse des différents produits synthétisés par les souches à tester.

La colonne de chromatographie liquide haute performance utilisée est une colonne Kromasil C8 150*4,6mmm, 5mmm, 100 .

La phase mobile est un gradient constitué d'un mélange d'acétonitrile et d'une solution aqueuse d'acide trifluoroacétique à 0. 05%, le débit est fixé à 1 ml/min. La température du four colonne est maintenue à 30 C.

La détection UV en sortie de la colonne a été effectuée à deux longueurs d'onde différentes : 238 nm et 280 nm.

Le spectrométre de masse couplé à la colonne de chromatographie est un appareil Simple Quadripole commercialisé par la société Agilent, avec des tensions de cone à 30 et à 70V.

20. 3 Analyse des intermédiaires de biosynthèse produits par la souche OS49.67 :
La souche OS49. 67 dans laquelle le gène or/3 est inactivé par une délétion en phase ne produit pas de spiramycines (cf. exemple 6 et 15).

Un échantillon a été préparé selon la méthode décrite ci-dessus (cf. paragraphe 20.1) et a été analysé par CL/SM comme décrit ci-dessus (cf. le paragraphe 20.2).

Plus particulièrement, l'analyse par chromatographie a été réalisée en gradient de solvant avec comme phase mobile : 20% d'acétonitrile du temps T=0 à 5min puis montée linéaire à 30% à T=35 minutes, suivie d'un palierjusqu'à T=50 minutes.

Dans ces conditions, deux produits ont plus particulièrement été observés : un absorbant à 238 nm (temps de rétention de 33.4 min) et un absorbant à 280 nm (temps de rétention de 44.8 min) (cf. figure 35). La figure 35 montre la superposition des chromatogrammes CLHP réalisés à 238 et 280nm (haut) ainsi que les spectres UV des molécules élués à 33,4 minutes et 44,8 minutes (bas).

Les conditions d'analyses en spéctrométrie de masse couplée étaient les suivantes : le balayage se fait en mode scan, couvrant une gamme de masse comprise entre 100 et 1000 Da. Le gain de l'électro-multiplicateur était de IV. Concernant la source électrospray, la pression du gaz de nébulisation était de 35 psig, le débit du gaz séchant de 12.0 1.min-1, la température du gaz séchant de 350 C, la tension du capilaire était portée à +/- 3000 V. Ces expériences ont permis de déterminer la masse des deux produits séparés. Ces masses sont respectivement de 370 g/mole pour le produit élué en premier ([M-H2O]+=353 produit majoritaire) et 368 g/mole pour le second produit ([MH2O]+=351 produit majoritaire).

Afin d'obtenir la structure, les produits mentionnés ci-dessus ont été isolés et purifiés dans les conditions suivantes : la phase mobile est un mélange d'une solution aqueuse d'acide trifluoroacétique à 0. 05% et d'acétonitrile 70/30 (v/v). La chromatographie est réalisée en régime isocratique avec un débit fixé de 1 ml/min. Dans ces conditions, les temps de rétention des 2 produits sont respectivement de 8 et 13.3 minutes. De plus dans ce cas, l'échantillon préparé (cf. paragraphe 20.1) n'est pas dilué dans l'eau avant injecton de 10 l.

Les 2 produits sont récupérés à la sortie de la colonne chromatographique et isolés dans les conditions suivantes : une cartouche Oasis HLB 1 cc 30mg (Waters) est conditionnée séquentiellement par 1 ml d'acétonitrile, puis 1 ml d'eau/acétonitrile (20v/80v) et 1ml d'eau/acétonitrile 80/20. L'échantillon est ensuite introduit et la cartouche lavée successivement par 1 ml d'eau/acétonitrile (95/5), lml d'eau/acétonitrile deutéré (95/5), puis éluée avec 600ul d'eau/acétonitrile deutéré 40/60.

La solution récupérée est ensuite directement analysée en RMN.

Les spectres RMN obtenus pour ces deux composés sont les suivants : - Premier produit élue: Platenolide A : (Spectre 9646V) Spectre 1H dans CD3CN (déplacements chimiques en ppm): 0,90 (3H, t, J=6Hz), 0,93 (3H, d, J=5Hz), 1,27 (3H, d, J=5Hz), entre 1,27 et 1,40 (3H, m), 1,51 (1H, m), 1,95 (1H, m), 2,12 (1H, m), 2,30 (1H, d, J=12Hz), 2,50 (1H, d, J=llHz), 2,58 (1H, dd, J=9 et 12 Hz), 2,96 (1H, d, J=7Hz), 3,43 (3H, s), 3,70 (1H, d, J=9Hz), 3,86 (1H, d, J=7Hz), 4,10 (1H, m), 5,08 (1H, m), 5,58 (1H, dt, J=3 et 12Hz), 5,70 (1H, dd, J=8 et 12 Hz), 6,05 (1H, dd, J=9 et 12 Hz), 6,24 (1H, dd, J=9 et 12Hz).

-Deuxième produit élue: Platenolide B : (Spectre 9647V) Spectre 1H dans CD3CN (déplacements chimiques en ppm): 0,81 (3H, t, J=6Hz), 0,89 (1H, m), 1,17 (3H, d, J=5Hz), 1,30 (4H, m), 1,47 (2H, m), 1,61 (1H, t, J=10Hz), 2,20 (1H, m), 2,38 (1H, d, J=13Hz), 2,52 (1H, m), 2,58 (1H, m), 2,68 (1H, dd, J=8 et 13Hz), 3,10 (1H, d, J=7Hz), 3,50 (3H, s), 3,61 (1H, d, J=8Hz), 3,82 (1H, d, J=7Hz), 5,09 (1H, m), 6,20 (1H, m), 6,25 (1H, dd, J=9 et 12 Hz), 6,58 (1H, d, J=12 Hz), 7,19 (1H, dd, J=9 et 12Hz).

Ces expériences ont ainsi permis de déterminer la structure de ces deux composés.

Le premier produit élué est le platénolide A et le deuxième est le platénolide B, la structure déduite de ces deux méolécules est présentée en figure 36.

20.4 Analyse des intermédiaires de biosynthèse produits par la souche SPM509 :

La souche SPM509 dans laquelle le gène orfl4 est inactivé (orfl4:: att3,slaac-) ne produit pas de spiramycines (cf. exemple 13,15 et 16). Un échantillon a été préparé selon la méthode décrite ci-dessus (cf. paragraphe 20. 1) et a été analysé par CL/SM comme décrit ci-dessus (cf. le paragraphe 20. 2 et 20.3). L'analyse des intermédiaires de biosynthèse présents dans le surnageant de culture de la souche SPM509 cultivée en milieu MP5 a montré que cette souche ne produisait que la forme B du platénolide ( platénolide B , cf. figure 36) mais pas la forme A ( platénolide A , cf. figure 36).

EXEMPLE 21 : Interruption du gène orfl4 dans une souche interrompue dans le gène orf3 (OS49.67)
Le produit du gène orfl4 est indispensable à la biosynthèse des spiramycines (cf. exemple 13,15 et 16 : la souche SPM509 dans laquelle ce gène est interrompu ne produit plus de spiramycines). L'analyse des intermédiaires de biosynthèse présents dans le surnageant de culture de la souche SPM509 cultivée en milieu MP5 a montré que cette souche ne produisait que la forme B du platénolide mais pas la forme A (cf. exemple 20). Une des hypothèses pouvant expliquer cette observation est que le produit de orfl4 soit impliqué dans la conversion de la forme B du platénolide en forme A par une étape enzymatique de réduction. Pour tester cette hypothèse, le gène orfl4 a été inactivé dans un mutant ne produisant plus de spiramycine, mais produisant les formes A et B du platénolide. C'est le cas de la souche OS49. 67 (cf. exemple 6 et 20) dans laquelle le gène or/3 est inactivé par une délétion en phase (#orf3). Pour inactiver le gène orfl4 dans cette souche le plasmide pSPM509 a été introduit par transformation de protoplastes de la souche OS49. 67 (Kieser, T et al., 2000). L'inactivation du gène or/74 a déjà été décrite dans le cas de la souche OSC2 (cf. exemple 13) et il a été procédé de la même manière pour l'inactivation du gène orfl4 dans la souche OS49. 67. Après transformation par le plasmide pSPM509, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les clones résistants à

l'apramycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec apramycine et sur milieu avec hygromycine. Les clones résistants à l'apramycine (ApraR) et sensibles à l'hygromycine (HygS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et dans lesquels le gène orfl4 a été remplacé par une copie de orfl4 interrompue par la cassette att3#aac-. Ces clones ont été plus particulièrement sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de orfl4 par la copie interrompue par la cassette a été vérifié par hybridation. Ainsi, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybridé avec une sonde correspondant à la cassette att3#aac- pour vérifier que le remplacement de gène avait bien eu lieu. La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit PCR.

Un clone présentant les caractéristiques attendues (Aorf3, orfl4::att3S2aac-) a été plus particulièrement sélectionné et nommé SPM510. Il a pu en effet être vérifié grâce aux deux hybridations que la cassette att3#aac- était bien présente dans le génome de ce clone et que l'on obtient bien le profil de digestion attendu dans le cas d'un remplacement, à la suite d'un double événement de recombinaison, du gène sauvage orfl4 par la copie interrompue par la cassette att3#aac- dans le génome de ce clone.

EXEMPLE 22 : Complémentation fonctionnelle de l'interruption du gène orfl4
22. 1 Construction du plasmide pSPM519 :
Le gène orfl4 a été amplifié par PCR en utilisant le couple d'oligonucléotides suivant : EDR31 : 5' CCCAAGCTTCTGCGCCCGCGGGCGTGAA 3' (SEQ ID N 136) et EDR37 : 5' GCTCTAGAACCGTGTAGCCGCGCCCCGG 3' (SEQ ID N 137) et comme matrice l'ADN chromosomique de la souche OSC2. Les

oligonucléotides EDR31 et EDR37 portent respectivement le site de restriction HindIII et Xbal (séquence en gras). Le fragment de 1,2 kb ainsi obtenu a été cloné dans le vecteur pGEM-T easy (commercialisé par la société Promega (Madison, Wisconcin, USA)) pour donner naissance au plasmide pSPM515. Ce plasmide a ensuite été digéré par les enzymes de restriction HindIII et XbaI. L'insert HindIII/XbaI de 1,2 kb obtenu a été cloné dans le vecteur pUWL201 (cf. exemple 17. 1) préalablement digéré par les mêmes enzymes. Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pSPM519.

22. 1 Transformation des souches SPM509 et SPM510 par le plasmide pSPM519 :
Le plasmide pSPM519 a été introduit dans les souches SPM509 (cf. exemple 13) et SPM510 (cf. exemple 17) par transformation de protoplastes (Kieser, T et al., 2000). Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance au thiostrepton. Les clones sont ensuite repiqués sur un milieu contenant du thiostrepton.

La souche SPM509 est une souche non productrice de spiramycines (cf. exemple 13,15 et 16 et figure 24). La production en spiramycines de la souche SPM509 transformée par le vecteur pSPM519 (souche nommée SPM509 pSPM519) a été analysée en cultivant cette souche dans du milieu MP5 en présence de thiostrepton. Les surnageants de culture ont ensuite été analysés par CLHP (cf. exemple 16 et 17). Les résultats de cette analyse sont présentés dans le tableau 43, les données sont exprimées en mg par litre de surnageant. Les résultats correspondent à la production totale en spiramycines (obtenue en additionnant la production en spiramycine I, II et III). Il a été observé que la présence du vecteur pSPM519 dans la souche SPM509 restaure la production de spiramycines (cf. tableau 43).

Tableau 43. Production en spiramycines de la souche SPM509 transformée par le vecteur pSPM519, (résultats exprimés en mg/1 de surnageant).

Souche <SEP> Production <SEP> en <SEP> spyramicines
<tb> SPM509 <SEP> pSPM519 <SEP> 58
<tb>

La souche SPM510 transformée par le plasmide pSPM519 a été nommée SPM510 pSPM509.

EXEMPLE 23 : fonctionnelle de l'interruption du gène orf3 par le gène tylB de S. fradiae
23. 1 Construction du plasmide pOS49.52 :
Le plasmide pOS49. 52 correspond à un plasmide permettant l'expression de la protéine TylB chez S. ambofaciens. Pour le construire, la séquence codante du gène tylB de S. fradiae (Merson-Davies & Cundliffe, 1994, numéro d'accès GenBank: U08223 (séquence de la région), SFU08223 (séquence ADN) et AAA21342 (séquence protéique)) a été introduite dans le plasmide pKC1218 (Bierman et al., 1992, Kieser et al., 2000, une souche de E. coli contenant ce plasmide est accessible notamment auprès de l'ARS (NRRL) Agricultural Research Service Culture Collection) (Peoria, minois, USA), sous le numéro B-14790). De plus cette séquence codante à été placée sous le contrôle du promoteur ermE* (cf. cidessus, notamment exemple 17.1, Bibb et al., 1985, Bibb et al., 1994).

23. 1 Transformation de la souches OS49. 67 par le plasmide pOS49.52 :
La souche OS49. 67 dans laquelle le gène or/3 est inactivé par une délétion en phase ne produit pas de spiramycines (cf. exemple 6 et 15). Le plasmide pOS49. 52 a été introduit dans la souche OS49. 67 par transformation de protoplastes (Kieser, T et al., 2000). Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à

l'apramycine. Les clones sont ensuite repiqués sur un milieu contenant de l'apramycine. Un clone a été plus particulièrement sélectionné et a été nommé OS49.67pOS49.52.

Comme il a été démontré ci-dessus, la souche OS49.67 ne produit pas de spiramycines (cf. exemple 6 et 15). La production en spiramycines de la souche OS49. 67 transformée par le vecteur pOS49.52 a été analysée par la technique décrite dans l'exemple 15. Il a ainsi pu être démontré que cette souche possède un phénotype producteur de spiramycines. Ainsi la protéine TylB permet la complémentation fonctionnelle de l'interruption du gène orf3.

EXEMPLE 24 : Amélioration de la production en spiramycines par surexpression du gène orfl8c
24. 1 Construction du plasmide pSPM75 :
Le gène orf28c a été amplifié par PCR en utilisant un couple d'oligonucléotides comportant un site de restriction HindIII ou un site de restriction BamHI. Ces amorces ont la séquence suivante : KF30 : 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N 138) avec un site de restriction HindIII (qui figure en gras) KF31 : 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N 139) avec le site de restriction BamHI (qui figure en gras) Les amorces KF30 et KF31 portent respectivement le site de restriction HindIII et BamHI (séquence en gras). Le couple d'amorces KF30 et KF31 permet d'amplifier un fragment d'ADN d'une taille d'environ 1,5 kb contenant le gène orj28c en utilisant comme matrice le cosmide pSPM36 (cf. ci-dessus). Le fragment de 1,5 kb ainsi obtenu a été cloné dans le vecteur pGEM-T easy (commercialisé par la société Promega (Madison, Wisconcin, USA)) pour donner naissance au plasmide pSPM74. Le plasmide pSPM74 a ensuite été digéré par les enzymes de restriction HindIII et BamHI et l'insert HindIII/BamHI d'environ 1,5 kb obtenu a été sous cloné dans le vecteur pUWL201 (cf.

exemple 17.1) préalablement digéré par les mêmes enzymes. Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pSPM75, il contient l'ensemble de la séquence codante de orf28c placée sous le contrôle du promoteur ermE*.

* 24. 2 Transformation de la souche OSC2 par le plasmide pSPM75 :
Le plasmide pSPM75 a été introduit dans les souches OSC2 par transformation de protoplastes (Kieser, T et al., 2000). Après transformation des protoplastes, les clones sont sélectionnés pour leur résistance au thiostrepton. Les clones sont ensuite repiqués sur un milieu contenant du thiostrepton et la transformation par le plasmide est vérifiée par extraction de plasmides. Deux clones ont plus particulièrement été sélectionnés et nommés OSC2/pSPM75(l) et OSC2/pSPM75 (2).

Afin de tester l'effet de la surexpression du gène orj28c sur la production de spiramycines, la production en spiramycines des clones OSC2/pSPM75(l) et OSC2/pSPM75 (2) a été testée par la technique décrite dans l'exemple 15. L'analyse de la production en spiramycines de la souche OSC2 a également été effectée en parallèle pour comparaison. Il a ainsi pu être observé que la présence du plasmide pSPM75 augmente significativement la production en spiramycines de la souche OSC2. Ceci démontre que la surexpression de orf28c conduit à une augmentation de la production en spiramycines et confirme son rôle en tant que régulateur.

La production en spiramycines des clones OSC2/pSPM75(l) et OSC2/pSPM75 (2) a également été analysée par CLHP (de la même manière que dans l'exemple 17. 2). L'analyse de la production en spiramycines de la souche OSC2 a également été effectée en parallèle pour comparaison. Les résultats de cette analyse sont présentés dans le tableau 44, les données sont exprimées en mg par litre de surnageant. Les résultats correspondent à la production totale en spiramycines (obtenue en additionnant la production en spiramycine I, II et III).

Tableau 44. Production en spiramycines des souches dérivées de OSC2 transformé par pSPM75, (résultats exprimés en mg/1).

Souche <SEP> Spiramycines
<tb> OSC2 <SEP> 50
<tb> OSC2/pSPM75(l) <SEP> 120
<tb> OSC2/pSPM75 <SEP> (2) <SEP> 155
<tb>

Ainsi, il est observé que la présence du plasmide pSPM75 augmente significativement la production en spiramycines de la souche OSC2. Ceci démontre bien que la surexpression de orf28c a un effet positif sur la production en spiramycines.

Liste des constructions décrites dans la présente demande Liste des abréviations : Am : Ampicilline ; Hyg : Hygromycine ; Sp : Spiramycine ; Ts : Thiostrepton ; Cm : Chloramphénicol. Kn : Kanamycine, Apra : apramycine.

<tb>
<tb> Nom <SEP> de <SEP> la <SEP> Marqueur <SEP> Principales <SEP> caractéristiques <SEP> Référence
<tb> construction <SEP> de <SEP> sélection
<tb>

pWE15 Am (Wahl, et al., I987)

<tb>
<tb> pWED1 <SEP> Am <SEP> pWE15 <SEP> dans <SEP> lequel <SEP> un <SEP> (Gourmelen <SEP> et <SEP> al.,
<tb> fragment <SEP> HpaI-HpaI <SEP> de <SEP> 4.1 <SEP> kb <SEP> 1998)
<tb> a <SEP> été <SEP> délété
<tb> pOJ260 <SEP> Apra <SEP> Conjugatif, <SEP> non <SEP> réplicatif <SEP> chez <SEP> (Bierman <SEP> et <SEP> al.,
<tb> Streptomyces <SEP> 1992)
<tb> pHP45 <SEP> Qhyg <SEP> Hyg <SEP> Cassette <SEP> Qhyg <SEP> dans <SEP> pHP45. <SEP> (Blondelet-Rouault
<tb> et <SEP> al., <SEP> 1997)
<tb> pKC505 <SEP> Apra <SEP> Cosmide <SEP> (Richardson <SEP> MA <SEP> et
<tb> al., <SEP> 1987)
<tb> pIJ486 <SEP> Ts <SEP> Plasmide <SEP> réplicatif <SEP> (Ward <SEP> et <SEP> al., <SEP> 1986)
<tb> multicopies <SEP> Streptomyces
<tb> pOSint3 <SEP> Am <SEP> ptrc-xis-int <SEP> dans <SEP> pTrc99A <SEP> (Raynal <SEP> et <SEP> al., <SEP> 1998)
<tb> pWHM3 <SEP> Am, <SEP> Ts <SEP> Vecteur <SEP> navette <SEP> réplicatif <SEP> E. <SEP> (Vara <SEP> et <SEP> al., <SEP> 1989)
<tb> coli/Streptomyces.
<tb> pKOBEG <SEP> Cm <SEP> (Chaveroche <SEP> et <SEP> al.,
<tb> 2000)
<tb> pGP704Not <SEP> Am <SEP> (Chaveroche <SEP> et <SEP> al.,
<tb> 2000)
<tb> pMBL18 <SEP> Am <SEP> (Nakano <SEP> et <SEP> al.,
<tb> 1995)
<tb> pGEM-T <SEP> Easy <SEP> Am <SEP> vecteur <SEP> E. <SEP> coli <SEP> pour <SEP> clonage <SEP> Mezei <SEP> et <SEP> al., <SEP> 1994
<tb> de <SEP> produits <SEP> PCR
<tb>

<tb>
<tb> pOS49. <SEP> 1 <SEP> Am <SEP> pWED <SEP> avec <SEP> insert <SEP> au <SEP> niveau <SEP> Exemple <SEP> 2
<tb> du <SEP> site <SEP> BamHI
<tb> pOS49. <SEP> 11 <SEP> Am <SEP> Fragment <SEP> SacI <SEP> de <SEP> pOS49. <SEP> 1 <SEP> Exemple <SEP> 2
<tb> dans <SEP> pUC <SEP> 19. <SEP>
<tb> pOSC49. <SEP> 12 <SEP> Ch <SEP> Fragment <SEP> XhoI <SEP> de <SEP> pOS49. <SEP> 11 <SEP> Exemple <SEP> 2
<tb> dans <SEP> pBC <SEP> SK+
<tb> pOS49. <SEP> 14 <SEP> Cm,Hyg <SEP> pOSC49.12 <SEP> avec <SEP> le <SEP> gène <SEP> or/3 <SEP> Exemple <SEP> 2
<tb> interrompu <SEP> par <SEP> la <SEP> cassette
<tb> #hyg
<tb> pOS49. <SEP> 16 <SEP> Apra, <SEP> Hyg <SEP> Insert <SEP> de <SEP> pOS49. <SEP> 14 <SEP> dans <SEP> Exemple <SEP> 2
<tb> pOJ260
<tb> Cm <SEP> Fragment <SEP> BamHI-PstI <SEP> de <SEP> Exemple <SEP> 3
<tb> pOS49. <SEP> 28 <SEP> 3,7kb <SEP> de <SEP> pOS49. <SEP> 1 <SEP> dans <SEP> pBC
<tb> SK+
<tb> pOS44. <SEP> 1 <SEP> Apra, <SEP> Sp <SEP> pKC505 <SEP> contenant <SEP> un <SEP> insert <SEP> (Pernodet <SEP> et <SEP> al.,
<tb> conférant <SEP> la <SEP> résistance <SEP> la <SEP> 1999)
<tb> spiramycine <SEP> chez <SEP> S.
<tb> griseofuscus
<tb> pOS44. <SEP> 2 <SEP> Ts, <SEP> Sp <SEP> Fragment <SEP> Sau3AI <SEP> de <SEP> 1,8 <SEP> kb <SEP> Exemple <SEP> 3
<tb> pOS44. <SEP> 1 <SEP> dans <SEP> pIJ486 <SEP>
<tb> pOS44. <SEP> 4. <SEP> Am <SEP> Insert <SEP> de <SEP> pOS44. <SEP> 2 <SEP> dans <SEP> Exemple <SEP> 3
<tb> pUC19
<tb> pSPM5 <SEP> Am <SEP> pWED <SEP> avec <SEP> insert <SEP> d'ADN <SEP> de <SEP> Exemple <SEP> 3
<tb> S. <SEP> ambofaciens <SEP> au <SEP> niveau <SEP> du
<tb> site <SEP> BamHI
<tb> pSPM7 <SEP> Am <SEP> pWEDl <SEP> avec <SEP> insert <SEP> d'ADN <SEP> de <SEP> Exemple <SEP> 3
<tb> S. <SEP> ambofaciens <SEP> au <SEP> niveau <SEP> du
<tb> site <SEP> BamHI
<tb>

<tb>
<tb> pOSK1205 <SEP> Hyg <SEP> pBK-CMV <SEP> dans <SEP> lequel <SEP> hyg <SEP> Exemple <SEP> 5 <SEP>
<tb> remplace <SEP> neo
<tb> pOS49. <SEP> 67 <SEP> Apra <SEP> Fragment <SEP> EcoRI-SacI <SEP> de <SEP> Exemple <SEP> 6
<tb> pOS49. <SEP> 1, <SEP> comportant <SEP> une
<tb> délétion <SEP> interne <SEP> de <SEP> 504
<tb> nucléotides, <SEP> dans <SEP> pOJ260
<tb> pOS49. <SEP> 88 <SEP> Am <SEP> Fragment <SEP> de <SEP> 3. <SEP> 7 <SEP> kb <SEP> PstI- <SEP> Exemple <SEP> 7 <SEP>
<tb> EcoRI <SEP> de <SEP> pOS49. <SEP> 1 <SEP> dans
<tb> pUC19
<tb> pOS49. <SEP> 106 <SEP> Am <SEP> p049.88 <SEP> avec <SEP> hyg <SEP> dans <SEP> or/8 <SEP> Exemple <SEP> 7
<tb> (hyg <SEP> et <SEP> or/8 <SEP> dans <SEP> la <SEP> même
<tb> orientation)
<tb> pOS49. <SEP> 120 <SEP> Am <SEP> pOS49.88 <SEP> avec <SEP> hyg <SEP> dans <SEP> or/8 <SEP> Exemple <SEP> 7
<tb> (hyg <SEP> et <SEP> or/8 <SEP> dans <SEP> des
<tb> orientations <SEP> opposées)
<tb> pOS49. <SEP> 107 <SEP> Apra, <SEP> Hyg <SEP> Insert <SEP> de <SEP> pOS49.106 <SEP> dans <SEP> Exemple <SEP> 7
<tb> pOJ260
<tb> pOS49. <SEP> 32 <SEP> Am, <SEP> Kn <SEP> Fragment <SEP> de <SEP> 1,5 <SEP> kb <SEP> interne <SEP> à <SEP> Exemple <SEP> 8 <SEP>
<tb> orf10 <SEP> dans <SEP> pCR2.1-TOPO
<tb> pOS49. <SEP> 43 <SEP> Am, <SEP> Kn <SEP> pOS49. <SEP> 32 <SEP> avec <SEP> hyg <SEP> dans <SEP> or/70 <SEP> Exemple <SEP> 8
<tb> (hyg <SEP> et <SEP> orflO <SEP> dans <SEP> la <SEP> même
<tb> orientation)
<tb> pOS49. <SEP> 44 <SEP> Am, <SEP> Kn <SEP> pOS49. <SEP> 32 <SEP> avec <SEP> hyg <SEP> dans <SEP> or/76' <SEP> Exemple <SEP> 8 <SEP>
<tb> (hyg <SEP> et <SEP> or/70 <SEP> dans <SEP> des
<tb> orientations <SEP> opposées)
<tb> pOS49. <SEP> 50 <SEP> Apra, <SEP> Hyg <SEP> Insert <SEP> de <SEP> pOS49. <SEP> 43 <SEP> dans <SEP> Exemple <SEP> 8 <SEP>
<tb> pOJ260
<tb> pWHM3Hyg <SEP> Am, <SEP> Hyg <SEP> pWHM3 <SEP> dans <SEP> lequel <SEP> tsr <SEP> est <SEP> Exemple <SEP> 10
<tb> remplacé <SEP> par <SEP> hyg
<tb>

<tb>
<tb> pOSV508 <SEP> Am, <SEP> Ts <SEP> ptrc-xis-int <SEP> dans <SEP> pWHM3 <SEP> Exemple <SEP> 9
<tb>

pattlS2hyg+ Cm, Hyg Cassette att1Ohyg+ dans pBC Exemple 9

<tb>
<tb> SK+ <SEP> dont <SEP> le <SEP> site <SEP> HindIII <SEP> a <SEP> été
<tb> supprimé
<tb>

patt3naac- Cm, Gn Cassette att32aac- dans pBC Exemple 9

<tb>
<tb> SK+ <SEP> dont <SEP> le <SEP> site <SEP> HindIII <SEP> a <SEP> été
<tb> supprimé
<tb> pOSV510 <SEP> Am, <SEP> Hyg <SEP> pro <SEP> pra-Amh <SEP> dans <SEP> Exemple <SEP> 10
<tb> pWHM3Hyg
<tb> pOS49. <SEP> 99 <SEP> Am <SEP> Fragment <SEP> EcoRI-BamHI <SEP> de <SEP> Exemple <SEP> 10
<tb> 4,5 <SEP> kb <SEP> de <SEP> pSPM5 <SEP> dans <SEP> pUC19
<tb> pOSK1102 <SEP> Am, <SEP> Apra <SEP> pGP704Not <SEP> contenant <SEP> la <SEP> Exemple <SEP> 10
<tb> cassette <SEP> att3QaacpSPM17 <SEP> Am, <SEP> Apra <SEP> pOS49. <SEP> 99 <SEP> dans <SEP> lequel <SEP> or/2 <SEP> est <SEP> Exemple <SEP> 10
<tb> interrompue <SEP> par <SEP> la <SEP> cassette
<tb> att3QaacpSPM21 <SEP> Hyg, <SEP> Apra <SEP> pOSK1205 <SEP> contenant <SEP> l'insert <SEP> Exemple <SEP> 10
<tb> EcoRI-XbaI <SEP> de <SEP> pSPM17 <SEP> (dans
<tb> lequel <SEP> orf2 <SEP> est <SEP> interrompue
<tb> par <SEP> la <SEP> cassette <SEP> att3#aac-)
<tb> pSPM502 <SEP> Am <SEP> Fragment <SEP> BglII <SEP> de <SEP> 15,1 <SEP> kb <SEP> de <SEP> Exemple <SEP> 11
<tb> pSPM7danspMBL18
<tb> pSPM504 <SEP> Hyg <SEP> Insert <SEP> de <SEP> pSPM502 <SEP> dans <SEP> Exemple <SEP> 11
<tb> pOSK1205
<tb> pSPM507 <SEP> Hyg, <SEP> Apra <SEP> pSPM504 <SEP> dans <SEP> lequel <SEP> or/72 <SEP> Exemple <SEP> 11
<tb> est <SEP> interrompue <SEP> par <SEP> la <SEP> cassette
<tb> att3#aacpSPM508 <SEP> Hyg, <SEP> Apra <SEP> pSPM504 <SEP> dans <SEP> lequel <SEP> orfl3c <SEP> Exemple <SEP> 12
<tb> est <SEP> interrompue <SEP> par <SEP> la <SEP> cassette
<tb> att3Qaac-
<tb>

<tb>
<tb> pSPM509 <SEP> Hyg, <SEP> Apra <SEP> pSPM504 <SEP> dans <SEP> lequel <SEP> orfl4 <SEP> Exemple <SEP> 13
<tb> est <SEP> interrompue <SEP> par <SEP> la <SEP> cassette
<tb> att3QaacpBXLllll <SEP> Am <SEP> Fragment <SEP> de <SEP> 1,11 <SEP> kb <SEP> Exemple <SEP> 14
<tb> contenant <SEP> or/6* <SEP> amplifié <SEP> par
<tb> PCR <SEP> à <SEP> partir <SEP> de <SEP> pSPM7, <SEP> dans
<tb> le <SEP> vecteur <SEP> pGEM-T <SEP> Easy
<tb> pBXL1112 <SEP> Am, <SEP> Hyg <SEP> pBXLllll <SEP> dans <SEP> lequel <SEP> la <SEP> Exemple <SEP> 14
<tb> cassette <SEP> attlQhyg+ <SEP> a <SEP> été
<tb> introduite <SEP> après <SEP> délétion <SEP> de
<tb> 120 <SEP> pb <SEP> dans <SEP> la <SEP> séquence
<tb> codante <SEP> du <SEP> gène <SEP> or/6*
<tb> pBXLI <SEP> 113 <SEP> Apra, <SEP> Hyg <SEP> Insert <SEP> PstI <SEP> de <SEP> 3. <SEP> 7 <SEP> kb <SEP> de <SEP> Exemple <SEP> 14
<tb> pBXLl <SEP> 112 <SEP> dans <SEP> pOJ260
<tb> pSPM520 <SEP> Am <SEP> Fragment <SEP> de <SEP> PCR <SEP> amplifié <SEP> par <SEP> Exemple <SEP> 17
<tb> les <SEP> oligonucléotides <SEP> EDR39EDR42 <SEP> dans <SEP> pGEM-T <SEP> Easy
<tb> pSPM521 <SEP> Am <SEP> Fragment <SEP> de <SEP> PCR <SEP> amplifié <SEP> par <SEP> Exemple <SEP> 17
<tb> les <SEP> oligonucléotides <SEP> EDR40EDR42 <SEP> dans <SEP> pGEM-T <SEP> Easy
<tb> pSPM522 <SEP> Am <SEP> Fragment <SEP> de <SEP> PCR <SEP> amplifié <SEP> par <SEP> Exemple <SEP> 17
<tb> les <SEP> oligonucléotides <SEP> EDR41EDR42 <SEP> dans <SEP> pGEM-T <SEP> Easy
<tb> pUWL201 <SEP> Am,Ts <SEP> (Doumith <SEP> et <SEP> al.,
<tb> 2000)
<tb> pSPM523 <SEP> Am, <SEP> Ts <SEP> Fragment <SEP> HindIII-BamHI <SEP> de <SEP> Exemple <SEP> 17
<tb> l'insert <SEP> du <SEP> plasmide <SEP> pSPM520
<tb> dans <SEP> le <SEP> vecteur <SEP> pUWL201
<tb> pSPM524 <SEP> Am, <SEP> Ts <SEP> Fragment <SEP> HindIII-BamHI <SEP> de <SEP> Exemple <SEP> 17
<tb> l'insert <SEP> du <SEP> plasmide <SEP> pSPM521
<tb>

<tb>
<tb> dans <SEP> le <SEP> vecteur <SEP> pUWL201
<tb> pSPM525 <SEP> Am, <SEP> Ts <SEP> Fragment <SEP> HindIII-BamHI <SEP> de <SEP> Exemple <SEP> 17
<tb> l'insert <SEP> du <SEP> plasmide <SEP> pSPM522
<tb> dans <SEP> le <SEP> vecteur <SEP> pUWL201
<tb> pSPM527 <SEP> Am <SEP> pSPM521 <SEP> avec <SEP> décalage <SEP> du <SEP> Exemple <SEP> 17
<tb> cadre <SEP> de <SEP> lecture <SEP> au <SEP> niveau <SEP> du
<tb> site <SEP> XhoI <SEP>
<tb> pSPM528 <SEP> Am <SEP> , <SEP> Ts <SEP> Fragment <SEP> HindIII-BamHI <SEP> de <SEP> Exemple <SEP> 17
<tb> l'insert <SEP> du <SEP> plasmide <SEP> pSPM527
<tb> dans <SEP> le <SEP> vecteur <SEP> pUWL201 <SEP>
<tb> pVF <SEP> 10.4 <SEP> (Vara <SEP> et <SEP> al., <SEP> 1985 <SEP> ;
<tb> Lacalle <SEP> et <SEP> al., <SEP> 1989)
<tb> pPM803 <SEP> Ts <SEP> (Mazodier,P. <SEP> et <SEP> al.,
<tb> 1989)
<tb> pGEM-T-pac- <SEP> Am <SEP> Cassette <SEP> pac-oriT <SEP> (amplifiée <SEP> Exemple <SEP> 18
<tb> oriT <SEP> par <SEP> PCR <SEP> à <SEP> partir <SEP> de <SEP> pVF <SEP> 10.4
<tb> et <SEP> pPM803) <SEP> dans <SEP> dans <SEP> pGEMT <SEP> Easy <SEP>
<tb> pWED2 <SEP> Am <SEP> Cassette <SEP> pac-oriT <SEP> obtenue <SEP> à <SEP> Exemple <SEP> 18
<tb> partir <SEP> de <SEP> pGEM-T-pac-oriT
<tb> insérée <SEP> dans <SEP> pWEDl
<tb> pSPM34 <SEP> Am <SEP> pWED2 <SEP> avec <SEP> insert <SEP> au <SEP> niveau <SEP> Exemple <SEP> 19
<tb> du <SEP> site <SEP> BamHI
<tb> pSPM35 <SEP> Am <SEP> pWED2 <SEP> avec <SEP> insert <SEP> au <SEP> niveau <SEP> Exemple <SEP> 19
<tb> du <SEP> site <SEP> BamHI
<tb> pSPM36 <SEP> Am <SEP> pWED2 <SEP> avec <SEP> insert <SEP> au <SEP> niveau <SEP> Exemple <SEP> 19
<tb> du <SEP> site <SEP> BamHI
<tb> pSPM37 <SEP> Am <SEP> pWED2 <SEP> avec <SEP> insert <SEP> au <SEP> niveau <SEP> Exemple <SEP> 19
<tb> du <SEP> site <SEP> BamHI
<tb>

<tb>
<tb> pSPM38 <SEP> Am <SEP> pWED2 <SEP> avec <SEP> insert <SEP> au <SEP> niveau <SEP> Exemple <SEP> 19
<tb> du <SEP> site <SEP> BamHI
<tb> pSPM39 <SEP> Am <SEP> pWED2 <SEP> avec <SEP> insert <SEP> au <SEP> niveau <SEP> Exemple <SEP> 19
<tb> du <SEP> site <SEP> BamHI
<tb> pSPM40 <SEP> Am <SEP> pWED2 <SEP> avec <SEP> insert <SEP> au <SEP> niveau <SEP> Exemple <SEP> 19
<tb> du <SEP> site <SEP> BamHI
<tb> pSPM41 <SEP> Am <SEP> pWED2 <SEP> avec <SEP> insert <SEP> au <SEP> niveau <SEP> Exemple <SEP> 19
<tb> du <SEP> site <SEP> BamHI
<tb> pSPM42 <SEP> Am <SEP> pWED2 <SEP> avec <SEP> insert <SEP> au <SEP> niveau <SEP> Exemple <SEP> 19
<tb> du <SEP> site <SEP> BamHI
<tb> pSPM43 <SEP> Am <SEP> pWED2 <SEP> avec <SEP> insert <SEP> au <SEP> niveau <SEP> Exemple <SEP> 19
<tb> du <SEP> site <SEP> BamHI
<tb> pSPM44 <SEP> Am <SEP> pWED2 <SEP> avec <SEP> insert <SEP> au <SEP> niveau <SEP> Exemple <SEP> 19
<tb> du <SEP> site <SEP> BamHI
<tb> pSPM45 <SEP> Am <SEP> pWED2 <SEP> avec <SEP> insert <SEP> au <SEP> niveau <SEP> Exemple <SEP> 19
<tb> du <SEP> site <SEP> BamHI
<tb> pSPM47 <SEP> Am <SEP> pWED2 <SEP> avec <SEP> insert <SEP> au <SEP> niveau <SEP> Exemple <SEP> 19
<tb> du <SEP> site <SEP> BamHI
<tb> pSPM48 <SEP> Am <SEP> pWED2 <SEP> avec <SEP> insert <SEP> au <SEP> niveau <SEP> Exemple <SEP> 19
<tb> du <SEP> site <SEP> BamHI
<tb> pSPM50 <SEP> Am <SEP> pWED2 <SEP> avec <SEP> insert <SEP> au <SEP> niveau <SEP> Exemple <SEP> 19
<tb> du <SEP> site <SEP> BamHI
<tb> pSPM51 <SEP> Am <SEP> pWED2 <SEP> avec <SEP> insert <SEP> au <SEP> niveau <SEP> Exemple <SEP> 19
<tb> du <SEP> site <SEP> BamHI
<tb> pSPM52 <SEP> Am <SEP> pWED2 <SEP> avec <SEP> insert <SEP> au <SEP> niveau <SEP> Exemple <SEP> 19
<tb> du <SEP> site <SEP> BamHI
<tb> pSPM53 <SEP> Am <SEP> pWED2 <SEP> avec <SEP> insert <SEP> au <SEP> niveau <SEP> Exemple <SEP> 19
<tb> du <SEP> site <SEP> BamHI
<tb> pSPM55 <SEP> Am <SEP> pWED2 <SEP> avec <SEP> insert <SEP> au <SEP> niveau <SEP> Exemple <SEP> 19
<tb>

<tb>
<tb> du <SEP> site <SEP> BamHI
<tb> pSPM56 <SEP> Am <SEP> pWED2 <SEP> avec <SEP> insert <SEP> au <SEP> niveau <SEP> Exemple <SEP> 19
<tb> du <SEP> site <SEP> BamHI
<tb> pSPM58 <SEP> Kn <SEP> Fragment <SEP> PstI-PstI <SEP> d'environ <SEP> Exemple <SEP> 19
<tb> 6kb <SEP> de <SEP> l'insert <SEP> de <SEP> pSPM36
<tb> dans <SEP> pBK-CMV
<tb> pSPM72 <SEP> Kn <SEP> Fragment <SEP> StuI-StuI <SEP> d'environ <SEP> Exemple <SEP> 19
<tb> 10 <SEP> kb <SEP> de <SEP> l'insert <SEP> de <SEP> pSPM36
<tb> cloné <SEP> dans <SEP> pBK-CMV
<tb> pSPM73 <SEP> Cm <SEP> Fragment <SEP> EcoRI-HindIII <SEP> de <SEP> Exemple <SEP> 19
<tb> l'insert <SEP> de <SEP> pSPM72 <SEP> dans <SEP> pBCSK+
<tb> pSPM515 <SEP> Am <SEP> Fragment <SEP> de <SEP> PCR <SEP> amplifié <SEP> par <SEP> Exemple <SEP> 22
<tb> EDR31-EDR37 <SEP> dans <SEP> pGEM-T
<tb> easy
<tb> pSPM519 <SEP> Am, <SEP> Ts <SEP> Insert <SEP> HindIII/XbaI <SEP> de <SEP> Exemple <SEP> 22
<tb> pSPM515 <SEP> dans <SEP> pUWL201
<tb> pOS49. <SEP> 52 <SEP> Apra <SEP> Séquence <SEP> codante <SEP> de <SEP> tylB <SEP> sous <SEP> Exemple <SEP> 23
<tb> contrôle <SEP> du <SEP> promoteur <SEP> ermE*
<tb> dans <SEP> le <SEP> plasmide <SEP> pKC1218
<tb> pSPM74 <SEP> Am <SEP> Fragment <SEP> de <SEP> PCR <SEP> amplifié <SEP> par <SEP> Exemple <SEP> 24
<tb> KF30-KF31 <SEP> dans <SEP> pGEM-T
<tb> easy
<tb> pSPM75 <SEP> Am, <SEP> Ts <SEP> Insert <SEP> HindIII/BamHI <SEP> de <SEP> Exemple <SEP> 24
<tb> pSPM74 <SEP> dans <SEP> pUWL201
<tb>

Dépôt de matériel biologique
Les organismes suivants ont été déposés le 10 juillet 2002 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France, selon les dispositions du Traité de Budapest.

- Souche OSC2 sous le numéro d'enregistrement 1-2908.

- Souche SPM501 sous le numéro d'enregistrement 1-2909.

- Souche SPM502 sous le numéro d'enregistrement 1-2910.

- Souche SPM507 sous le numéro d'enregistrement 1-2911.

- Souche SPM508 sous le numéro d'enregistrement 1-2912.

- Souche SPM509 sous le numéro d'enregistrement 1-2913.

- Souche SPM21 sous le numéro d'enregistrement 1-2914.

- Souche SPM22 sous le numéro d'enregistrement 1-2915.

- Souche OS49. 67 sous le numéro d'enregistrement 1-2916.

- Souche OS49. 107 sous le numéro d'enregistrement 1-2917.

- Souche Escherichia Coli DH5a contenant le plasmide pOS44. 4 sous le numéro d'enregistrement 1-2918.

Les organismes suivants ont été déposés le 26 février 2003 auprès de la
Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 25 rue du Docteur
Roux, 75724 Paris Cedex 15, France, selon les dispositions du Traité de Budapest.

- Souche SPM502 pSPM525 sous le numéro d'enregistrement 1-2977.

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Brown,S., Chandra,G., Chen,C.W., Collins,M., Cronin,A., Fraser,A., Goble, A.,
Hidalgo, J., Homsby,T., Howarth,S., Huang,C.H., Kieser, T., Larke, L., Murphy,L.,
Oliver,K., O'Neil,S., Rabbinowitsch,E., Rajandream,M.A., Rutherford,K.,
Rutter, S., Seeger, K., Saunders,D., Sharp, S., Squares,R., Squares, S., Taylor, K.,
Warren,T., Wietzorrek, A., Woodward, J., Barrell,B.G., Parkhill,J. et
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Claims

REVENDICATIONS

1. Polynucléotide codant un polypeptide impliqué dans la biosynthèse des spiramycines caractérisé en ce que la séquence dudit polynucléotide est : (a) l'une des séquences SEQ ID N 3,5, 7,9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30,34, 36,40, 43,45, 47,49, 53,60, 62,64, 66,68, 70,72, 74,76, 78,80, 82,84, 107,109, 111,113, 115,118, et 120, (b) l'une des séquences constituées par les variants des séquences (a), (c) l'une des séquences dérivées des séquences (a) et (b) en raison de la dégénérescence du code génétique.

2. Polynucléotide s'hybridant dans des conditions d'hybridation de forte stringence à au moins l'un des polynucléotides selon la revendication 1.

3. Polynucléotide présentant au moins 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% d'identité en nucléotides avec un polynucléotide comprenant au moins 10, 12, 15, 18, 20 à 25,30, 40,50, 60,70, 80,90, 100, 150, 200, 250,300, 350, 400, 450, 500,550, 600,650, 700,750, 800,850, 900,950, 1000,1050, 1100,1150, 1200,1250, 1300, 1350,1400, 1450,1500, 1550,1600, 1650,1700, 1750,1800, 1850 ou 1900 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide selon la revendication 1.

4. Polynucléotide selon la revendication 2 ou 3 caractérisé en ce qu'il est isolé à partir d'une bactérie du genre Streptomyces.

5. Polynucléotide selon la revendication 2,3 ou 4 caractérisé en ce qu'il code une protéine impliquée dans la biosynthèse d'un macrolide.

6. Polynucléotide selon la revendication 2,3, 4 ou 5 caractérisé en ce qu'il code une protéine ayant une activité similaire à la protéine codée par le polynucléotide avec lequel il s'hybride ou il présente l'identité.

7. Polypeptide résultant de l'expression d'un polynucléotide selon la revendication 1, 2,3, 4,5 ou 6.

8. Polypeptide impliqué dans la biosynthèse des spiramycines caractérisée en ce que la séquence dudit polypeptide est : (a) l'une des séquences SEQ ID N 4,6, 8,10, 12,14, 16, 18, 20, 22,24, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 108, 110, 112, 114, 116, 117, 119 et 121, (b) l'une des séquences telles que définies en (a) excepté que tout au long de ladite séquence un ou plusieurs acides aminés ont été substitués, insérés ou délétés sans en affecter les propriétés fonctionnelles, (c) l'une des séquences constituées par les variants des séquences (a) et (b).

9. Polypeptide présentant au moins 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% d'identité en acides aminés avec un polypeptide comprenant au moins 10, 15, 20, 30 à 40, 50, 60, 70, 80, 90,100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360,380, 400,420, 440, 460, 480, 500,520, 540,560, 580,600, 620 ou 640 acides aminés consécutifs d'un polypeptide selon la revendication 8.

10. Polypeptide selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'il est isolé à partir d'une bactérie du genre Streptomyces.

11. Polypeptide selon la revendication 9 ou 10 caractérisé en ce qu'il code une protéine impliquée dans la biosynthèse d'un macrolide.

12. Polypeptide selon la revendication 9, 10 ou 11caractérisé en ce qu'il a une activité similaire à celle du polypeptide avec lequel il partage l'identité.

13. ADN recombinant caractérisé en ce qu'il comprend au moins un polynucléotide selon l'une des revendications 1,2, 3, 4, 5 ou 6.

14. ADN recombinant selon la revendication 13 caractérisé en ce que le dit ADN recombinant est compris dans un vecteur.

15. ADN recombinant selon la revendication 14 caractérisé en ce que ledit vecteur est choisi parmi les bactériophages, les plasmides, les phagemides, les vecteurs intégratifs, les fosmides, les cosmides, les vecteurs navettes, les BAC ou les PAC.

16. ADN recombinant selon la revendication 15 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi pOS49. 1, pOS49. 11, pOSC49. 12, pOS49. 14, pOS49. 16, pOS49.28, pOS44. 1, pOS44. 2, pOS44. 4, pSPM5, pSPM7, pOS49. 67, pOS49. 88, pOS49.106, pOS49. 120, pOS49. 107, pOS49. 32, pOS49. 43, pOS49. 44, pOS49. 50, pOS49. 99, pSPM17, pSPM21, pSPM502, pSPM504, pSPM507, pSPM508, pSPM509, pSPMl, pBXL1111, pBXL1112, pBXL1113, pSPM520, pSPM521, pSPM522, pSPM523, pSPM524, pSPM525, pSPM527, pSPM528, pSPM34, pSPM35, pSPM36, pSPM37, pSPM38, pSPM39, pSPM40, pSPM41, pSPM42, pSPM43, pSPM44, pSPM45, pSPM47, pSPM48, pSPM50, pSPM51, pSPM52, pSPM53, pSPM55, pSPM56, pSPM58, pSPM72, pSPM73, pSPM515, pSPM519, pSPM74 et pSPM75.

17. Vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence d'acide nucléique codant un polypeptide selon la revendication 7,8, 9,10, 11 ou 12.

18. Système d'expression comprenant un vecteur d'expression approprié et une cellule hôte permettant l'expression d'un ou plusieurs polypeptides selon la revendication 7, 8, 9, 10, 11 ou 12.

19. Système d'expression selon la revendication 18 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les systèmes d'expression procaryotes ou les systèmes d'expression eucaryotes.

20. Système d'expression selon la revendication 19 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les systèmes d'expression chez la bactérie E. coli, les sytèmes d'expression baculovirus permettant une expression dans des cellules d'insectes, les sytèmes d'expression permettant une expression dans des cellules de levures, les sytèmes d'expression permettant une expression dans des cellules de mammifères.

21. Cellule hôte dans laquelle a été introduit au moins un polynucléotide et/ou au moins un ADN recombinant et/ou au moins un vecteur d'expression selon l'une des revendications 1, 2, 3, 4, 5, 6, 13, 14, 15, 16 ou 17.

22. Procédé de production d'un polypeptide selon la revendication 7,8, 9,10, 11ou 12 caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes: a) insérer au moins un acide nucléique codant ledit polypeptide dans un vecteur approprié ; b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, une cellule hôte préalablement transformée ou transfectée avec le vecteur de l'étape a) ; c) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire; d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape c), ledit polypeptide ; e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.

23. Microorganisme bloqué dans une étape de la voie de biosynthèse d'au moins un macrolide.

24. Microorganisme selon la revendication 23 caractérisé en ce qu'il est obtenu en inactivant la fonction d'au moins une protéine impliquée dans la biosynthèse de ce ou de ces macrolides dans un microorganisme producteur de ce ou de ces macrolide.

25. Microorganisme selon la revendication 24 caractérisé en ce que l'inactivation de cette ou de ces protéines est effectuée par mutagénèse dans le ou les gènes codant ladite ou lesdites protéines ou par expression d'un ou de plusieurs ARN anti-sens complémentaires de l'ARN ou des ARN messagers codant ladite ou lesdites protéines.

26. Microorganisme selon la revendication 25 caractérisé en ce que l'inactivation de cette ou de ces protéines est effectuée par mutagénèse par irradiation, par action d'agent chimique mutagène, par mutagénèse dirigée ou par remplacement de gène.

27. Microorganisme selon la revendication 25 ou 26 caractérisé en ce que la ou les mutagénèses sont effectuées in vitro ou in situ, par suppression, substitution, délétion et/ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés ou par inactivation génique.

28. Microorganisme selon la revendication 23,24, 25,26 ou 27 caractérisé en ce que ledit microorganisme est une bactérie du genre Streptomyces.

29. Microorganisme selon la revendication 23,24, 25, 26, 27 ou 28 caractérisé en ce que le macrolide est la spiramycine.

30. Microorganisme selon la revendication 23,24, 25,26, 27,28 ou 29 caractérisé en ce que ledit microorganisme est une souche de S. ambofaciens.

31. Microorganisme selon la revendication 23,24, 25,26, 27,28, 29 ou 30 caractérisé en ce que la mutagénèse est effectuée dans au moins un gène comprenant une séquence selon l'une des revendication 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.

32. Microorganisme selon la revendication 25,26, 27,28, 29,30 ou 31 caractérisé en ce que la mutagénèse est effectuée dans un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N 3,5, 7, 9, 11, 13,15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30,34, 36,40, 43,45, 47,49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70,72, 74,76, 78,80, 82,84, 107,109, 111,113, 115,118, et 120,

33. Microorganisme selon la revendication 25,26, 27,28, 29,30, 31 ou 32 caractérisé en ce que la mutagénèse consiste en l'inactivation génique d'un gène comprenant une séquence correspondant à la séquence SEQ ID N 13.

34. Souche de Streptomyces ambofaciens caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche choisie parmi : - l'une des souches déposées auprès de la Collection Nationale de Cultures de

Microorganismes (CNCM) le 10 juillet 2002 sous le numéro d' enregistrement I- 2909,1-2911,1-2912,1-2913,1-2914,1-2915,1-2916 ou 1-2917 - la souche SPM510.

35. Procédé de préparation d'un intermédiaire de biosynthèse de macrolide caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme selon l'une des revendications 23,24, 25,26, 27,28, 29,30, 31,32, 33 ou 34, b) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, c) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape b), ledit intermédiaire de biosynthèse.

36. Procédé de préparation d'une molécule dérivée d'un macrolide caractérisé en ce que l'on prépare un intermédiaire de biosynthèse selon le procédé de la revendication 35 et que l'on modifie l'intermédiaire ainsi produit.

37. Procédé de préparation selon la revendication 36 caractérisé en ce que l'on modifie ledit intermédiaire par voie chimique, biochimique, enzymatique et/ou microbiologique.

38. Procédé de préparation selon la revendication 36 ou 37 caractérisé en ce que l'on introduit dans ledit microorganisme un ou plusieurs gènes codant des protéines susceptibles de modifier l'intermédiaire en s'en servant comme substrat.

39. Procédé de préparation selon la revendication 36,37 ou 38 caractérisé en ce que le macrolide est la spiramycine.

40. Procédé de préparation selon la revendication 36, 37, 38ou 39 caractérisé en ce que le microorganisme utilisé est une souche de S. ambofaciens.

41. Microorganisme produisant de la spiramycine I mais ne produisant pas de spiramycine II et III.

42. Microorganisme selon la revendication 41 caractérisé en ce qu'il comprend l' ensemble des gènes nécessaires à la biosynthèse de la spiramycine I mais que le gène comprenant la séquence SEQ ID N 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID N 14 ou l'un de ses variants n'est pas exprimé ou a été rendu inactif.

43. Microorganisme selon la revendication 42 caractérisé en ce que la dite inactivation est réalisée par mutagénèse dans le gène codant ladite protéine ou par

l'expression d'un ARN anti-sens complémentaire de l'ARN messager codant ladite protéine.

44. Microorganisme selon la revendication 43 caractérisé en ce que la dite mutagénèse est effectuée dans le promoteur de ce gène, dans la séquence codante ou dans une séquence non codante de manière à rendre inactive la protéine codée ou à en empêcher son expression ou sa traduction.

45. Microorganisme selon la revendication 43 ou 44 caractérisé en ce que la mutagénèse est effectuée par irradiation, par action d'agent chimique mutagène, par mutagénèse dirigée ou par remplacement de gène.

46. Microorganisme selon la revendication 43, 44 ou 45 caractérisé en ce que la mutagénèse est effectuée in vitro ou in situ, par suppression, substitution, délétion et/ou addition d'une ou plusieurs bases dans le gène considéré ou par inactivation génique.

47. Microorganisme selon la revendication 41 ou 42 caractérisé en ce que ledit microorganisme est obtenu en exprimant les gènes de la voie de biosynthèse de la spiramycine sans que ceux-ci ne comprennent le gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID N 14 ou l'un de ses variants.

48. Microorganisme selon la revendication 41,42, 43,44, 45,46 ou 47 caractérisé en ce que ledit microorganisme est une bactérie du genre Streptomyces.

49. Microorganisme selon la revendication 41,42, 43,44, 45,46, 47 ou 48 caractérisé en ce que ledit microorganisme est obtenu à partir d'une souche de départ produisant les spiramycines I, II et III.

50. Microorganisme selon la revendication 41,42, 43,44, 45, 46, 47, 48 ou 49 caractérisé en ce qu'il est obtenu par mutagénèse dans un gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID N 14 ou l'un de ses variants ayant la même fonction.

51. Microorganisme selon la revendication 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 caractérisé en ce que ledit microorganisme est obtenu à partir d'une souche de S. ambofaciens produisant les spiramycines I, II et III, dans laquelle est effectuée une inactivation génique du gène comprenant la séquences correspondant à SEQ ID N 13 ou l'une des séquences dérivées de celle-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.

52. Souche de S. ambofaciens caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2910.

53. Procédé de production de spiramycine I, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (a) cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme selon l'une des revendications 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 ou 52, (b) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, (c) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape b), la spiramycine I.

54. Utilisation d'un polynucléotide selon l'une des revendications 1, 2,3, 4, 5 ou 6 pour améliorer la production en macrolides d'un microorganisme.

55. Microorganisme mutant producteur de macrolide caractérisé en ce qu'il possède une modification génétique dans au moins un gène comprenant une séquence selon l'une des revendication 1,2, 3,4, 5 ou 6 et/ou qu'il surexprime au moins un gène comprenant une séquence selon l'une des revendication 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.

56. Microorganisme mutant selon la revendication 55 caractérisé en ce que la modification génétique consiste en une suppression, une substitution, une délétion et/ou une addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés dans le but d'exprimer une ou des protéines ayant une activité supérieure ou d'exprimer un niveau plus élevé de cette ou de ces protéines.

57. Microorganisme mutant selon la revendication 55 caractérisé en ce que la surexpression du gène considéré est obtenue en augmentant le nombre de copie de ce gène et/ou en plaçant un promoteur plus actif que le promoteur sauvage.

58. Microorganisme mutant selon la revendication 55 ou 57 caractérisé en ce que la surexpression du gène considéré est obtenue en transformant un microorganisme producteur de macrolide par une construction d'ADN recombinant selon la revendication 13, 14 ou 17, permettant la surexpression de ce gène.

59. Microorganisme mutant selon la revendication 55,56, 57 ou 58 caractérisé en ce que la modification génétique est effectuée dans un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N 3,5, 7,9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30,34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70,72, 74,76, 78,80, 82,84, 107,109, 111,113, 115,118, et 120, ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.

60. Microorganisme mutant selon la revendication 55,56, 57,58 ou 59 caractérisé le microorganisme surexprime un ou plusieurs gènes comprenant une des

séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N 3,5, 7,9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72,74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115,118, et 120, ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.

61. Microorganisme mutant selon la revendication 55,56, 57,58, 59 ou 60 caractérisé en ce que ledit microorganisme est une bactéries du genre Streptomyces.

62. Microorganisme mutant selon la revendication 55,56, 57,58, 59,60 ou 61 caractérisé en ce que le macrolide est la spiramycine.

63. Microorganisme mutant selon la revendication 55,56, 57,58, 59,60, 61 ou 62 caractérisé en ce que ledit microorganisme est une souches de S. ambofaciens.

64. Procédé de production de macrolides, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (a) cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme selon l'une des revendications 55,56, 57,58, 59,60, 61, 62, 63 ou 64, (b) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, (c) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape b), le ou lesdits macrolides produits.

65. Utilisation d'une séquence et/ou d'un ADN recombinant et/ou d'un vecteur selon l'une des revendication 1, 2,3, 4,5, 6,7, 8,9, 10, 11, 12,13, 14,15, 16 ou 17 pour la préparation d'antibiotiques hybrides.

66. Utilisation d'au moins un polynucléotide et/ou au moins un ADN recombinant et/ou au moins un vecteur d'expression et/ou au moins un polypeptide

et/ou au moins une cellule hôte selon l'une des revendications 1, 2, 3,4, 5,6, 7,8, 9, 10, 11, 12 13, 14, 15, 16, 17 ou 21 pour réaliser une ou plusieurs bioconversions.

67. Polynucléotide caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polynucléotide complémentaire de l'un des polynucléotides selon la revendication 1,2, 3, 4, 5, ou 6.

68. Microorganisme producteur d'au moins une spiramycine caractérisé en ce qu'il surexprime : -un gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymérase (PCR) en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N 138) et 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens, -ou un gène dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.

69. Microorganisme selon la revendication 68 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une bactérie du genre Streptomyces.

70. Microorganisme selon la revendication 68 ou 69 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une bactérie de l'espèce Streptomyces ambofaciens.

71. Microorganisme selon la revendication 68,69 ou 70 caractérisé en ce que la surexpression dudit gène est obtenue par transformation dudit microorganisme par un vecteur d'expression.

72. Souche de Streptomyces ambofaciens caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche OSC2/pSPM75(l) ou de la souche OSC2/pSPM75(2).

73. ADN recombinant caractérisé en ce qu'il comprend : - un polynucléotide susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymérase en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5'

AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N 13 8) et 5'

1460,1470, 1480,1490 ou 1500 nucléotides consécutifs de ce polynucléotide.

850,900, 950,1000, 1050,1100, 1150,1200, 1250,1300, 1350,1400, 1450,

100,150, 200,250, 300,350, 400,450, 500,550, 600,650, 700,750, 800,

GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens, - ou, un fragment d'au moins 10, 12, 15, 18, 20 à 25,30, 40,50, 60,70, 80,90,

74. ADN recombinant selon la revendication 73 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur.

75. ADN recombinant selon la revendication 73 ou 74 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur d'expression.

76. Cellule hôte dans laquelle a été introduit au moins un ADN recombinant selon l'une des revendications 73,74 ou 75.

77. Procédé de production d'un polypeptide caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes: a) transformer une cellule hôte par au moins un vecteur d'expression selon la revendication 75; b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, ladite cellule hôte; c) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire; d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape c), ledit polypeptide ; e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.

78. Microorganisme selon la revendication 51 caractérisé en ce que l'inactivation génique est effectuée par délétion en phase du gène ou d'une partie du gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N 13 ou l'une des séquences dérivées de celle-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.

79. Microorganisme selon l'une des revendications 41,42, 43,44, 45,46, 47, 48, 49, 50, 51 ou 78 caractérisé en ce en ce qu'il surexprime en outre : - un gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymérase en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5'

AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N 138) et 5'

GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens, - ou un gène dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.

80. Vecteur d'expression caractérisé en ce que le polynucléotide de séquence SEQ ID N 47 ou un polynucléotide dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique est placé sous le contrôle d'un promoteur permettant l'expression de la protéine codée par le dit polynucléotide chez Streptomyces ambofaciens.

81. Vecteur d'expression selon la revendication 80 caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pSPM524 ou pSPM525.

82. Souche de Streptomyces ambofaciens transformée par un vecteur selon la revendication 80 ou 81.

83. Microorganisme selon l'une des revendications 41,42, 43,44, 45,46, 47, 48, 49, 50,51, 78 ou 79 caractérisé en ce qu'il surexprime en outre le gène de séquence codante SEQ ID N 47 ou d'une séquence codante dérivée de celle-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.

84. Microorganisme selon la revendication 83 caractérisé en ce qu'il s'agit de la souche SPM502 pSPM525 déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux

75724 Paris Cedex 15, France, le 26 février 2003 sous le numéro d' enregistrement 1-2977.

85. Procédé de production de spiramycine(s), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (a) cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme selon l'une des revendications 68, 69, 70, 71, 72, 78,79, 82,83 ou 84, (b) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, (c) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape b), les spiramycines.

86. Polypeptide caractérisé en ce que sa séquence comprend la séquence SEQ ID N 112.

87. Polypeptide caractérisé en ce que sa séquence correspond à la séquence traduite de la séquence codante : - d'un gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymérase (PCR) en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N 138) et 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens, -ou d'un gène dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.

88. Vecteur d'expression permettant l'expression d'un polypeptide selon la revendication 86 ou 87 chez Streptomyces ambofaciens.

89. Vecteur d'expression selon la revendication 88 caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pSPM75.