CA2501445C - Polypeptides impliques dans la biosynthese des spiramycines, sequences nucleotidiques codant ces polypeptides et leurs applications. - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne l'isolement et l'identification de nouveaux gènes de la voie de biosynthèse des spiramycines et de nouveaux polypeptides impliqués dans cette biosynthèse. L'invention est également relative à un procédé de production de ces polypeptides. Elle est également relative à l'utilisation de ces gènes dans le but d'augmenter les taux de production et la pureté de la spiramycine produite. L'invention concerne notamment un microorganisme produisant de la spiramycine I mais ne produisant pas de spiramycine II et III et l'utilisation d'un tel micoorganisme. L'invention a également trait à l'utilisation des gènes de la voie de biosynthèse des spiramycines pour la construction de mutants pouvant conduire à la synthèse de nouveaux antibiotiques ou à des formes dérivées de spiramycines. L'invention concerne encore les molécules produites grâce à l'expression de ces gènes et des compositions pharmacologiquement actives d'une molécule produite grâce à l'expression de tels gênes_________________________

Description

DEMANDES OU BREVETS VOLUMINEUX
LA PRÉSENTE PARTIE DE CETTE DEMANDE OU CE BREVETS
COMPREND PL US D'UN TOME.

NOTE: Pour les tomes additionels, veillez contacter le Bureau Canadien des Brevets.
JUMBO APPLICATIONS / PATENTS
THIS SECTION OF THE APPLICATION / PATENT CONTAINS MORE
THAN ONE VOLUME.

NOTE: For additional volumes please contact the Canadian Patent Office.

POLYPEPTIDES IMPLIQUES DANS LA BIOSYNTHESE DES SPIRAMYCINES, SEQUENCES
NUCLEOTIDIQUES CODANT CES POLYPEPTIDES ET LEURS APPLICATIONS
La présente invention concerne l'isolement et l'identification de nouveaux 'gènes de la voie de biosynthèse des spiramycines et de nouveaux polypeptides impliqués dans cette biosynthèse. Elle est également relative à l'utilisation de ces gènes dans le but d'augmenter les taux de production et la pureté de la spiramycine produite.
L'invention a également trait à l'utilisation de ces gènes pour la construction de mutants pouvant conduire à la synthèse de nouveaux antibiotiques ou à des formes dérivées de spiramycines. L'invention concerne encore les molécules produites grâce à
l'expression de ces gènes et enfin des compositions pharmacologiquement actives d'une molécule produite grâce à l'expression de tels gènes.
Les Streptomyces sont des bactéries filamenteuses Gram positif du sol. Elles jouent un rôle important dans la décomposition et la minéralisation des matières organiques grâce à la grande diversité des enzymes dégadatives qu'elles sécrètent. Elles présentent des phénomènes de différenciations morphologiques uniques chez les procaryotes s'accompagnant d'une différenciation métabolique caractérisée par la production de métabolites secondaires présentant une extraordinaire diversité
de structures chimiques et d'activités biologiques. Parmi ces métabolites, on retrouve les spiramycines produites à l'état naturel par la bactérie Streptomyces ambofaciens.
La spiramycine est un antibiotique de la famille des macrolides utile aussi bien en médecine vétérinaire qu'en médecine humaine. Les macrolides sont caractérisés par la présence d'un cycle lactone sur lequel sont greffés un ou plusieurs sucres.
Streptomyces ambofaciens produit à l'état naturel la spiramycine I, II et III (cf. Figure 1), cependant l'activité antibiotique de la spiramycine I est nettement supérieure à celle des

2 spiramycines II et III (Liu et al., 1999). La molécule de spiramycine I est constituée d'un macro-cycle lactonique, appellé platénolide et de trois sucres : la forosamine, le mycaminose et le mycarose (cf. Figure 1). L'activité antibiotique des spiramycines est due à une inhibition de la synthèse protéique chez les procaryotes par un mécanisme impliquant la liaison de l'antibiotique au ribosome bactérien.
Certins composés membres de la famille des macrolides et possédant également un cycle lactone ont donné lieu à des utilisations hors du domaine des antibiotiques.
Ainsi le produit FK506 a des effets immunosuppresseurs et offre des perspectives d'application thérapeutique dans le domaine de la transplantation d'organe, de l'arthrite rhumatoïde et plus généralement dans des pathologies liées à des réactions autoimmunes. D'autres macrolides comme l'avermectine ont des activités insecticides et anti-helminthiques.
De nombreuses voies de biosynthèse, concernant des antibiotiques appartenant à

des classes variées ainsi que d'autres métabolites secondaires (pour une revue, Chater K.
, 15 1990), ont à ce jour déjà été étudiées chez les Streptomycètes.
Cependant, la :
connaissance des voies de biosynthèse des spiramycines n'est que très partielle à ce jour.
La biosynthèse des spiramycines est un processus complexe comportant de nombreuses étapes et impliquant de nombreuses enzymes (Omura et al., 1979a, Omura et al., 1979b). Les spiramycines appartiennent à la large classe des polyketides qui regroupe des molécules complexes particulièrement abondantes dans les microorganismes du sol. Ces molécules sont regroupées non pas par analogie de structure mais par une certaine similarité au niveau d'étapes de leur voie de biosynthèse.
En effet, les polyketides sont produits par une série complexe de réactions mais possèdent en commun d'avoir dans leur voie de biosynthèse une série de réactions catalysées par une ou des enzymes appelées polyketides synthases (PKS).
Chez Streptomyces ambofaciens, la biosynthèse du macro-cycle lactonique des spiramycines (platénolide) est réalisée par une série de huit modules codés par cinq gènes PKS
différents (Kuhstoss S., 1996, brevet US 5,945,320). Les spiramycines sont obtenues à

3 partir de ce cycle lactone. Cependant, les diverses étapes et enzymes impliquées dans la synthèse des sucres, ainsi que leur liaison au cycle lactone et la modification de ce cycle pour l'obtention des spiramycines restent encore inconnues à ce jour.
Le brevet US 5,514,544 décrit le clonage d'une séquence appelée srmR chez Streptomyces ambofaciens. Il est fait l'hypothèse dans ce brevet que le gène srmR code une protéine régulatrice de la transcription des gènes impliqués dans la biosynthèse des macrolides.
En 1987, Richardson et collaborateurs (Richardson et al., 1987) ont montré que la résistance à la spiramycine de S. ambofaciens est conférée par au moins trois gènes, ces derniers ont été appelés srmA, srmB et srmC. Le brevet US 4,886,757 décrit plus particulièrement la caractérisation d'un fragment d'ADN de S. ambofaciens contenant le gène srmC. Cependant la séquence de ce gène n'a pas été divulguée. En 1990, Richardson et collaborateurs (Richardson et al., 1990) ont posé l'hypothèse de l'existence de trois gènes de biosynthèse de la spiramycine proche de srmB. Le brevet US 5,098,837 rapporte le clonage de cinq gènes potentiellement impliqués dans la biosynthèse de la spiramycine. Ces gènes ont été baptisés srmD, srmE, srmF, srmd e srmH.
Une des difficultés majeures dans la production de composés tels que les spiramycines réside dans le fait que de très grands volumes de fermentation sont nécessaires à la production d'une quantité relativement faible de produit. Il est donc souhaitable de pouvoir augmenter l'efficacité de production de telles molécules afin d'en diminuer les coûts de production.
La voie de biosynthèse des spiramycines est un processus complexe et il serait souhaitable d'identifier et de supprimer les réactions parasites qui pourraient exister au cours de ce processus. Le but d'une telle manipulation est d'obtenir un antibiotique plus pur et/ou une amélioration de la productivité. A ce sujet, Streptomyces ambofaciens produit à l'état naturel la spiramycine I, II et III (cf. Figure 1), cependant l'activité
antibiotique de la spiramycine I est nettement supérieure à celle des spiramycines II et III

4 (Liu et al., 1999). Il serait donc souhaitable de pouvoir disposer de souches ne produisant que de la spiramycine I.
En raison de l'intérêt commercial des antibiotiques macrolides, l'obtention de nouveaux dérivés, notamment d'analogues de spiramycines ayant des propriétés avantageuses est inten5ivement recherchée. Il serait souhaitable de pouvoir générer en quantité suffisante les. intermédiaires de biosynthèse de la voie de biosynthèse des spiramycines ou des dérivés des spiramycines notamment dans le but de fabriquer des antibiotiques hybrides dérivés des spiramycines.
Description générale de l'invention La présente invention résulte du clonage de gènes dont le produit intervient dans la biosynthèse des spiramycines. L'invention concerne tout d'abord de nouveaux gènes de la voie de biosynthèse des spiramycines et de nouveaux polypeptides impliqués dans cette biosynthèse.
. , Les gènes de la voie de biosynthèse et les séquences codantes associées ont été
clonés et la séquence d'ADN de chacun a été déterminée. Les séquences codantes clonées seront désignées par la suite orfl*c, orf2*c, orf3*c, orf4*c, orf5*, orfe, orf7*c, orf8*, orf9*, orf.10*, orfl, orfl, orf3, orf4, orf5, orf6, orf7, orf8, orf9c, orf10, orfllc, orf12, orfl3c, orf14, orfl5c, orf16, orf17, orf18, orf19, orf20, orf21c, orf22c, orf23c, orf24c, orf25c, orf26, orf27, orf28c, orf29, orf30c, orf31, orf32c, orf33 et orf34c. La fonction des protéines codées par ces séquences dans la voie de biosynthèse des spiramycines est développée dans la discussion ci-après qui est illustrée par les figures 4,

5, 6 et 8.
1) Un premier objet de l'invention concerne un polynucléotide codant un polypeptide impliqué dans la biosynthèse des spiramycines caractérisé en ce que la séquence dudit polynucléotide est:

(a) l'une des séquences SEQ ID N 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 et 149, (b) l'une des séquences constituées par les variants des séquences (a), 5 (c) l'une des séquences dérivées des séquences (a) et (b) en raison de la dégénérescence du code génétique.
2) La présente invention a également pour objet un polynucléotide s'hybridant dans des conditions d'hybridation de forte stringence à au moins l'un des =
polynucléotides selon le paragraphe 1) ci-dessus.
3) L'invention concerne également un polynucléotide présentant au moins 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% d'identité en nucléotides avec un polynucléotide comprenant au moins 10, 12, 15, 18, 20 à 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1059, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850 ou 1900 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide selon le paragraphe.
ci dessus.
4) L'invention concerne également un polynucléotide selon le pragraphe 2) ou 3) ci-dessus caractérisé en ce qu'il est isolé à partir d'une bactérie du genre Streptomyces.
5) L'invention concerne également un polynucléotide selon le pragraphe 2), 3) ou 4) ci-dessus caractérisé en ce qu'il code une protéine impliquée dans la biosynthèse d'un macrolide.

6) L'invention concerne également un polynucléotide selon le pragraphe 2), 3) ou 4) ci-dessus caractérisé en ce qu'il code une protéine ayant une activité
similaire à la protéine codée par le polynucléotide avec lequel il s'hybride ou il présente l'identité.

7) L'invention concerne également un polypeptide résultant de l'expression d'un polynucléotide selon le pragraphe 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) ci-dessus.

8) Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide impliqué dans la biosynthèse des spiramycines caractérisée en ce que la séquence dudit polypeptide est:
(a) l'une des séquences SEQ ID N 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 108, 110, 112, 114, 116, 117, 119, 121, 142, 144, 146, 148 et 150, (b) l'une des séquences telles que définies en (a) excepté que tout au long de ladite séquence un ou plusieurs acides aminés ont été substitués, insérés ou délétés sans en affecter les propriétés fonctionnelles, (e) l'une des séquences constituées par les variants des séquences (a) et (b).

9) Un autre objet de l'invention concerne un polypeptide présentant au moins 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% d'identité en acides aminés avec un polypeptide comprenant au moins 10, 15, 20, 30 à 40, 50, 60, 70, 80, 90,100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620 ou 640 acides aminés consécutifs d'un polypeptide selon le paragraphe 8) ci-dessus.

10) Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide selon le paragraphe 9) ci-dessus caractérisé en ce qu'il est isolé à partir d'une bactérie du genre Streptomyces.

11) Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide selon le paragraphe 9) OU 10) ci-dessus caractérisé en ce qu'il code une protéine impliquée dans la biosynthèse d'un macrolide.

12) Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide selon le pragraphe 9), 10) ou 11) ci-dessus caractérisé en ce qu'il a une activité similaire à celle du polypeptide avec lequel il partage l'identité.

13) Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant caractérisé en ce qu'il comprend au moins un polynucléotide selon l'un des paragraphes 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) ci-dessus.

14) Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant selon le pragraphe 13) ci-dessus caractérisé en ce que le dit ADN recombinant est compris dans un vecteur.

15) Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant selon le paragraphe 14) ci-dessus caractérisé en ce que ledit vecteur est choisi parmi les bactériophhges, les plasmides, les phagemides, les vecteurs intégratifs, les fosmides, les cosmides, les vecteurs navettes, les BAC ou les PAC.

16) Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant selon le pragraphe 15) ci-dessus caractérisé en ce qu'il est choisi parmi pOS49.1, pOS49.11, pOSC49.12, pOS49.14, pOS49.16, pOS49.28, pOS44.1, pOS44.2, pOS44.4, pSPM5, pSPM7, pOS49.67, pOS49.88, pOS49.106, pOS49.120, pOS49.107, pOS49.32, pOS49.43, pOS49.44, pOS49.50, pOS49.99, pSPM17, pSPM21, pSPM502, pSPM504, pSPM507, pSPM508, pSPM509, pSPM1, pBXL1111, pBXL1112, pBXL1113, pSPM520, pSPM521, pSPM522, pSPM523, pSPM524, pSPM525, pSPM527, pSPM528, pSPM34, pSPM35, pSPM36, pSPM37, pSPM38, pSPM39, pSPM4Q, pSPM41, pSPM42, pSPM43, pSPM44, pSPM45, pSPM47, pSPM48, pSPM50, pSPM51, pSPM52, pSPM53, pSPM55, pSPM56, pSPM58, pSPM72, pSPM73, pSPM515, pSPM519, pSPM74, pSPM75, pSPM79, pSPM83, pSPM107, pSPM543 et pSPM106.

17) Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence d'acide nucléique codant un polypeptide selon le pragraphe 7), 8), 9), 10), 11) ou 12) ci-dessus.

18) L'invention est également relative à un système d'expression comprenant un vecteur d'expression approprié et une cellule hôte permettant l'expression d'un ou plusieurs polypeptides selon le paragraphe 7), 8), 9), 10), 11) ou 12) ci-dessus.

19) L'invention est également relative à un système d'expression selon le paragraphe 18 ci-dessus caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les systèmes d'expression procaryotes ou les systèmes d'expression eucaryotes.

20) L'invention est également relative à un système d'expression selon le paragraphe 19) ci-dessus caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les systèmes d'expression chez la bactérie E. cou, les sytèmes d'expression baculovirus permettant une expression dans des cellules d'insectes, les sytèmes d'expression permettant une expression dans des cellules de levures, les sytèmes d'expression permettant une expression dans des cellules de mammifères.

21) L'invention est également relative à une cellule hôte dans laquelle a été
introduit au moins un polynucléotide et/ou au moins un ADN recombinant et/ou au moins un vecteur d'expression selon l'un des pragraphes 1), 2), 3), 4), 5), 6), 13), 14), 15), 16) ou 17) ci-dessus.

22) L'invention est également relative à un procédé de production d'un polypeptide selon le paragraphe 7), 8), 9), 10), 11) ou 12) ci-dessus caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes:
a) insérer au moins un acide nucléique codant ledit polypeptide dans un vecteur approprié ;
b) cultiver, dans un milieu de culture 'approziprié, une cellule hôte préalablement transformée ou transfectée avec le vecteur de l'étape a) ;
c) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire;
d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape c), ledit polypeptide ;
e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.

23) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme bloqué dans une étape de la voie de biosynthèse d'au moins un macrolide.

24) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 23) ci-dessus caractérisé en ce qu'il est obtenu en inactivant la fonction d'au moins une protéine impliquée dans la biosynthèse de ce ou de ces macrolides dans un microorganisme producteur de ce ou de ces macrolide.

25) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 24) ci-dessus caractérisé en ce que l'inactivation de cette ou de ces protéines est effectuée par mutagénèse dans le ou les gènes codant ladite ou lesdites protéines ou par expression d'un ou de plusieurs ARN anti-sens complémentaires de l'ARN ou des ARN messagers codant ladite ou lesdites protéines. "

26) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 25) ci-dessus caractérisé en ce que l'inactivation de cette ou de ces protéines est effectuée par mutagénèse par irradiation, par action d'agent chimique mutagène, par mutagénèse dirigée ou par remplacement de gène.

27) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 25) ou 26) ci-dessus caractérisé en ce que la ou les mutagénèses sont effectuées in vitro ou in situ, par suppression, substitution, délétion et/ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés ou par inactivation génique.

28) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 23), 24), 25), 26) ou 27) ci-dessus caractérisé en ce que ledit..4 microorganisme est une bactérie du genre Streptomyces.

29) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 23), 24), 25), 26), 27) ou 28) ci-dessus caractérisé en ce que le macrolide est la spiramycine.

30) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 23), 24), 25), 26), 27), 28) ou 29) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorganisme est une souche de S. ambofaciens.

31) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 23), 24), 25), 26), 27), 28), 29) ou 30) ci-dessus caractérisé en ce que la mutagénèse est effectuée dans au moins un gène comprenant une séquence selon l'un des paragraphes 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) ci-dessus.

32) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 25), 26), 27), 28), 29), 30) ou 31) ci-dessus caractérisé en ce que la mutagénèse est effectuée dans un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 5 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 `et 149;

33) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 25), 26), 27), 28), 29), 30), 31) ou 32) ci-dessus caractérisé en ce que la mutagénèse consiste en l'inactivation génique d'un gène comprenant une séquence 10 correspondant à la séquence SEQ ID N 13.

34) Un autre aspect de l'invention concerne une souche de Streptomyces ambofaciens caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche choisie parmi l'une des souches déposées auprès de la ColleCtion Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2909, 1-2911, I-2912,1-ii 2913,1-2914, I-2915,1-2916 ou 1-2917.

35) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation d'un intermédiaire de biosynthèse de macrolide caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme selon l'un des paragraphes 23), 24), 25), 26), 27), 28), 29), 30), 31), 32), 33) ou 34) ci dessus, b) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, c) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape b), ledit intermédiaire de biosynthèse.

36) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation d'une molécule dérivée d'un macrolide caractérisé en ce que l'on prépare un intermédiaire de biosynthèse selon le procédé du paragraphe 35) ci-dessus et que l'on modifie l'intermédiaire ainsi produit.

37) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation selon le paragraphe 36) ci-dessus caractérisé en ce que l'on modifie ledit intermédiaire par voie chimique, biochimique, enzymatique et/ou microbiologique.

38) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation selon le paragraphe 36) ou 37) ci-dessus caractérisé en ce que l'on introduit dans ledit microorganisme un ou plusieurs gènes codant des protéines suscefetibles de modifier l'intermédiaire en s'en servant comme substrat.

39) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation selon le paragraphe 36), 37) ou 38) ci-dessus caractérisé en ce que le macrolide est la spiramycine.

40) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation selon le paragraphe 36), 37), 38) ou 39) ci-dessus caractérisé en ce que le microorganisme utilisé
est une souche de S. ambofaciens.

41) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme produisant de la = -spiramycine I mais ne produisant pas de spiramycine II et IQ

42) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 41) ci-dessus caractérisé en ce qu'il comprend l'ensemble des gènes nécessaires à la biosynthèse de la spiramycine I mais que le gène comprenant la séquence SEQ ID N 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID N 14 ou l'un de ses variants n'est pas exprimé ou a été rendu inactif.

43) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 42) ci-dessus caractérisé en ce que la dite inactivation est réalisée par mutagénèse dans le gène codant ladite protéine ou par l'expression d'un ARN
anti-sens complémentaire de l'ARN messager codant ladite protéine.

44) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 43) ci-dessus caractérisé en ce que la dite mutagénèse est effectuée dans le promoteur de ce gène, dans la séquence codante ou dans une séquence non codante de manière à rendre inactive la protéine codée ou à en empêcher son expression ou sa traduction.

45) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon la revendication 43) ou 44) ci-dessus caractérisé en ce que la mutagénèse est effectuée par irradiation, par action d'agent chimique mutagène, par mutagénèse dirigée ou par remplacement de gène.

46) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 43), 44) ou 45) ci-dessus caractérisé en ce que la mutagénèse est effectuée in vitro ou in situ, par suppression, substitution, délétion et/ou addition d'une ou plusieurs bases dans le gène considéré ou par inactivation génique.

47) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 41) ou 42) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorganisme est obtenu en exprimant les gènes de la voie de biosynthèse de la spiramycine sans que ceux-ci ne comprennent le gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID N 14 ou l'un de ses variants.

48) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 41), 42), 43), 44), 45), 46) ou 47) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorganisme est une bactérie du genre Streptomyces.

49) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47) ou 48) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorganisme est obtenu à partir d'une souche de départ produisant les spiramycines I, II et III.

50) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47), 48) ou 49) ci-dessus caractérisé
en ce qu'il est obtenu par mutagénèse dans un gène comprenant la séquence correspondant à
SEQ
ID N 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID
N 14 ou l'un de ses variants ayant la même fonction.

51) Un autre aspect de l'invention concerne im microorganisme selon le paragraphe 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47), 48), 49) ou 50) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorganisme est obtenu à partir d'une souche de S. ambofaciens produisant les spiramycines I, II et III, dans laquelle est effectuée une inactivation génique du gène comprenant la séquences correspondant à SEQ ID N 13 ou l'une des séquences dérivées de celle-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.

52) Un autre aspect de l'invention concerne une souche de S. ambofaciens caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2910.

53) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de production de spiramycine I, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
(a) cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme selon l'un des paragraphes 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47), 48), 49), 50), 51) ou 52) ci-dessus, (b) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, (c) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape b), la spiramycine I.

54) Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation d'un polynucléotide selon l'un des paragraphes 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) ci-dessus pour améliorer la production en macrolides d'un microorganisme.
=

55) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant producteur de macrolide caractérisé en ce qu'il possède une modification génétique dans au moins un gène comprenant une séquence selon l'un des paragraphes 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) ci-dessus et/ou qu'il surexprime au moins un gène comprenant une séquence selon l'un des paragraphes 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) ci-dessus.

56) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55) ci-dessus caractérisé en ce que la modification génétique consiste en une suppression, une substitution, une délétion et/ou une addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés dans le but d'exprimer une ou des protéines ayant une activité supérieure ou d'exprimer un niveau plus élevé de cette ou de ces protéines.

57) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55) ci-dessus caractérisé en ce que la surexpression du gène considéré est obtenue en augmentant le nombre de copie de ce gène et/ou en plaçant un promoteur plus actif que le promoteur sauvage.

58) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le.
paragraphe 55) ou 57) ci-dessus caractérisé en ce que la surexpression du gène considéré est obtenue en transformant un microorganisme producteur de macrolide par une construction d'ADN recombinant selon le paragraphe 13, 14 ou 17 ci-dessus, permettant la surexpression de ce gène.

59) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55), 56), 57) ou 58) ci-dessus caractérisé en ce que la modification génétique est effectuée dans un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 et 149, ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.

60) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55), 56), 57), 58) ou 59) ci-dessus caractérisé le microorganisme surexprime un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 5 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 et 149, ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.

61) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55), 56), 57), 58), 59) ou 60) ci-dessus caractérisé en ce que ledit 10 microorganisme est une bactéries du genre Streptomyces.

62) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55), 56), 57), 58), 59), 60) ou 61) ci-dessus caractérisé en ce que le macrolide est la spiramycine.

63) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le 15 paragraphe 55), 56), 57), 58), 59), 60), 61) ou 62) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorganisme est une souches de S. ambofaciens.

64) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de production de macrolides, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
(a) cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme selon l'un des paragraphes 55), 56), 57), 58), 59), 60), 61), 62), 63) ou 64) ci-dessus, (b) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, (c) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape b), le ou lesdits macrolides produits.

65) Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation d'une séquence et/ou d'un ADN recombinant et/ou d'un vecteur selon l'un des paragraphes 1), 2), 3), 4), 5), 6), 7), 8), 9), 10), 11), 12), 13), 14), 15), 16) ou 17) ci-dessus pour la préparation d'antibiotiques hybrides.

66) Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation d'au moins un polynucléotide et/ou au moins un ADN recombinant et/ou au moins un vecteur d'expression et/ou au moins un polypeptide et/ou au moins une cellule hôte selon l'un des paragraphes 1), 2), 3), 4), 5), 6), 7), 8), 9), 10), 11), 12), 13), 14), 15), 16), 17) ou 21) ci-dessus pour réaliser une ou plusieurs bioconversions.

67) Un autre aspect de l'invention concerne un polynuclêotide caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polynucléotide complémentaire de l'un des polynucléotides selon le paragraphe 1), 2), 3), 4), 5), ou 6) ci-dessus.

68) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme producteur d'au moins une spiramycine caractérisé en ce qu'il surexprime :
- un gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymérase (PCR) en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N 138) et 5' =
GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens, - ou un gène dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.

69) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 68 ou 90 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une bactérie du genre Streptomyces.

70) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 68, 69 ou 90 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une bactérie de l'espèce Streptomyces ambofaciens.

71) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 68, 69, 70 ou 90 caractérisé en ce que la surexpression dudit gène est obtenue par transformation dudit microorganisme par un vecteur d'expression.

72) Un autre aspect de l'invention concerne une souche de Streptomyces ambofaciens caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche OSC2/pSPM75(1) ou de la souche OSC2/pSPM75(2) déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 6 octobre 2003 sous le numéro d'enregistrement 1-3101.

73) Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant caractérisé
en ce qu'il comprend :
- un polynucléotide susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polyrnérase en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N 138) et 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens, - ou un fragment d'au moins 10, 12, 15, 18, 20 à 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, = 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1460, 1470, 1480, 1490 ou 1500 nucléotides consécutifs de ce polynucléotide.
e ,

74) Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant selon le paragraphe 73 ou 91 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur.

75) Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant selon le paragraphe 73, 74 ou 91 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur d'expression.

76) Un autre aspect de l'invention concerne une cellule hôte dans laquelle a été introduit au moins un ADN recombinant selon l'un des paragraphes 73, 74, 75 ou 91.

77) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de production d'un polypeptide caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes:
a) transformer une cellule hôte par au moins un vecteur d'expression selon le paragraphe 75;
=

b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, ladite cellule hôte;
c) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire;
d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape c), ledit polypeptide ;
e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.
.4

78) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme 'selon le paragraphe 51 caractérisé en ce que l'inactivation génique est effectuée par délétion en phase du gène ou d'une partie du gène comprenant la séquence correspondant à
SEQ ID N 13 ou l'une des séquences dérivées de celle-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.

79) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon l'un des paragraphes 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 ou 78 caractérisé
en ce en ce qu'il surexprime en outre :
- un gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymérase en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' _ AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGÉ 3' (SEQ ID N 138) et 5' "'" I
GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ N 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens, - ou un gène dérivé de ceux-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.

80) Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur d'expression caractérisé en ce que le polynucléotide de séquence SEQ ID N 47 ou un polynucléotide dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique est placé sous le contrôle d'un promoteur permettant l'expression de la protéine codée par le dit polynucléotide chez Streptomyces ambofaciens.

81) Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur d'expression selon le paragraphe 80 caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pSPM524 ou pSPM525.

82) Un autre aspect de l'invention concerne une souche de Streptomyces ambofaciens transformée par un vecteur selon le paragraphe 80 ou 81.

83) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon l'un des paragraphes 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 78, 79 ou 92 caractérisé en ce qu'il syrexprime en outre le gène de séquence codante SEQ ID N 47 ou d'une séquenee codante dérivée de celle-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.

84) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 83 caractérisé en ce qu'il s'agit de la souche SPM502 pSPM525 déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 26 février sous le numéro d'enregistrement 1-2977.
=

85) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de production de spiramycine(s), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
, (a) cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme selon l'in].
des paragraphes 68, 69, 70, 71, 72, 78, 79, 82, 83, 84, 90 ou 92, (b) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, (c) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape b), les spiramycines.

86) Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide caractérisé en ce que sa séquence comprend la séquence SEQ ID N 112 ou la séquence SEQ ID N 142.

87) Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide caractérisé en ce que sa séquence correspond à la séquence traduite de la séquence codante :
- d'un gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymérase (PCR) en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N 138) et 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens, - ou d'un gène dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
5 88) Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur d'expression permettant l'expression d'un polypeptide selon le paragraphe 86, 87 ou 93 chez Streptomyces .
ambofaciens.
89) Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur d'expression selon le paragraphe 88 caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pSPM75.
10 90) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 68 caractérisé en ce que le gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymérase est le gène de séquence codante SEQ ID
N
141 ou un gène dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
91) Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant selon 15 paragraphe 73 caractérisé en ce que le polynucléotide susceptible d'être obtenu paf amplification en chaîne par polymérase est mi polynucléotide de séquence SEQ
ID
N 141.
92) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 79 caractérisé en ce que le gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymérase est le gène de séquence codante SEQ ID
N
141 ou un gène dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
93) Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide caractérisé en ce que sa séquence est SEQ ID N 142.
=

Défmitions générales Le terme " isolé " au sens de la présente invention désigne un matériel biologique (acide nucléique ou protéine) qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement).
Par exemple un polymicléotide présent à l'état naturel dans une plante ou un animal n'est pas isolé. Le même polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de la plante ou l'animal est considéré comme " isolé ".
Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel.
Le terme "purifié " ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative.
Un polynucléotide est à l'état " purifié " après purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement 4 ou 5 ordres de grandeur.
Aux fins de la présente invention le terme ORF ( Open Reading Frame , c'est à
dire cadre ouvert de lecture) a été employé pour désigner en particulier la séquence codante d'un gène.
Aux fins de la présente description, l'expression" séquence nucléotidique "peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique.
L'expression" séquence nucléotidique " englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.

Les termes " acide nucléique ", "polynucléotide ", " oligonucléotide " ou encore"
séquence nucléotidique " englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple chaîne ou sous la forme de duplex.
Le terme " nucléotide " désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (1) un analogue d'une purine, (2) un analogue d'une pyrimidine, ou (3) un sucre analogue, des exemples de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N'WO 95/04 064.
Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré
comme étant " complémentaire " d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier polynucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée. Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), ou C et G.
Le terme gènes de la voie de biosynthèse des spiramycines comprend également les gènes régulateurs et les gènes conférant la résistance aux microorganisines producteurs.
On entendra par" fragment " d'un acide nucléique de référence selon l'invention, une séquence nucléotidique de longueur réduite par rapport à l'acide nucléique de référence et comprenant, sur la partie commune, une séquence en nucléotides identique à
l'acide nucléique de référence.
Un tel " fragment " d'acide nucléique selon l'invention peut être le cas échéant, compris dans un polynucléotide plus grand duquel il est constitutif.
De tels fragments comprennent ou alternativement consistent en, des polynucléotides de longueur allant de 8, 10, 12, 15, 18, 20 à 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850 ou 1900 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention.
Par" fragment " d'un polypeptide selon l'invention, on entendra un polypeptide dont la séquence d'acides aminés est plus courte que celle du polypeptide de référence et qui comprend sur toute la partie, commune avec ces polypeptides de référence, une séquence en acides aminés identiqu.e.
De tels fragments peuvent, le cas échéant, être compris au sein d'un polypeptide plus grand duquel ils font partie.
De tels fragments d'un polypeptide selon l'invention peuvent avoir une longueur de 10, 15, 20, 30 à 40, 50, 60, 70, 80, 90,100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620 ou 640 acides aminés.
Par " conditions d'hybridation de forte stringence " au sens de la présente invention, on entendra des conditions d'hybridation défavorisant l'hybridation de brins d'acides nucléiques non homologues. Des conditions d'hybridations de forte stringence peuvent être par exemple décrites comme des conditions d'hybridation dans le tampon décrit par Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984) à une température comprise entre 55 C et 65 C, de manière préférée la température d'hyridation est de 55 C, de manière encore plus préférée la températue d'hybridation est de 60 C et de manière tout à fait préférée la température d'hybridation est de 65 C, suivi d'un ou plusieurs lavages effectué en tampon 2X SSC (le tampon 1X SSC correspond à une solution aqueuse 0,15M NaC1, 15 mM de citrate de sodium) à une température comprise entre 55 C
et 65 C, de manière préférée cette température est de 55 C, de manière encore plus préférée cette températue est de 60 C et de manière tout à fait préférée cette température est de 65 C, suivi d'un ou plusieurs lavages en tampon 0.5X SSC à une température comprise entre 55 C et 65 C, de manière préférée cette température est de 55 C, de manière encore plus préférée cette températue est de 60 C et de manière tout à
fait préférée cette température est de 65 C.

Il va sans dire que les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon des techniques connues de l'homme du métier. Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'ouvrage de F. Ausubel et al (2002).
Par " variant " d'un acide nucléique selon l'invention, on entendra un acide nucléique qui diffère d'une ou plusieurs bases par rapport au polynucléotide de référence. Un acide nucléique variant peut être d'origine naturelle, tel qu'un variant allélique retrouvé naturellement, ou peut être aussi un variant non naturel obtenu par exemple par des techniques de mutagénèse.
En général, les différences entre l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique variant sont réduites de telle sorte que les séquences nucléotidiques de l'acide nucléique de référence et de l'acide nucléique variant sont très proches et, dans de nombreuses régions, identiques. Les modifications de nucléotides présentes dans un acide nucléique variant peuvent être silencieuses, ce qui signifie qu'elles n'altèrent pas les séquencs d'aminoacides codées par ledit acide nucléique variant.
Cependant, les changements de nucléotides dans un acide nucléique variant peuvent aussi résulter de substitutions, additions, délétions dans le polypeptide codé par l'acide nucléique variant par rapport aux peptides codés par l'acide nucléique de référence. En outre, des modifications de nucléotides dans les régions codantes peuvent produire des substitutions, conservatives ou non conservatives dans la séquence d' aminoacides.
De préférence, les acides nucléiques variants selon l'invention codent des polypeptides qui conservent sensiblement la même fonction ou activité
biologique que le polypeptide de l'acide nucléique de référence ou encore la capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides codés par l'acide nucléique initial.

Certains acides nucléiques variants coderont ainsi des formes mutées des polypeptides dont l'étude systématique permettra de déduire des relations structure activité des protéines en question.
Par" variant" d'un polypeptide selon l'invention, on entendra principalement un 5 polypeptide dont la séquence d'acides aminés contient une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions d'au moins un résidu d'Aide aminé, par rapport à la séquence d'acides aminés du polypeptide de référence, étant entendu que les substitutions d'aminoacides peuvent être indifféremment conservatives ou non conservatives.
De préférence, les polypeptides variants selon l'invention conservent sensiblement 10 la même fonction ou activité biologique que le polypeptide de référence ou encore la capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides initiaux.
Par polypeptide ayant" une activité similaire " à un polypeptide de référence au sens de l'invention, on entend un polypeptide ayant une activité biologique proche, mais pas nécéssairement identique, de celle du polypeptide de référence tel que mesuré dans 15 un essai biologique convenable à la mesure de l'activité biologique du polypeptide de référence.
Par" antibiotique hybride" au sens de l'invention on entend un composé, généré

par la construction d'une voie de biosynthèse artificielle utilisant la technologie de l'ADN recombinant.

Description détaillée de l'invention La présente invention a plus particulièrement pour objet, de nouveaux gènes de la voie de biosynthèse des spiramycines et de nouveaux polypeptides impliqués dans cette biosynthèse tels que présentés dans la description détaillée ci-dessous.
Les gènes de l'a voie de biosynthèse ont été clonés et la séquence d'ADN de ces gènes a été déterminée. Les séquences obtenues ont été analysées grâce au programme FramePlot (Ishikawa J & Hotta K. 1999). On a identifié, parmi les phases ouvertes de lecture, les phases ouvertes de lecture présentant un usage des codons typiques de Streptomyces. Cette analyse a montré que cette région comporte 44 ORFs, localisées de part et d'autre de cinq gènes codant l'enzyme polyketide synthase (PKS), et présentant un usage des codons typique de Streptomyces. De part et d'autre de ces cinq gènes codant la PKS, respectivement 10 et 34 ORFs ont été identifiées en aval et en amont (l'aval et l'amont étant définis par l'orientation des 5 gènes de PKS
tous orientés dans le même sens) (cf figure 3 et 37). Ainsi, les 34 phases ouvertes de lecture de ce type, occupant une région d'environ 41,7 kb (cf SEQ ID N 1 présentant une premièreA
région de 31 kb contenant 25 ORFs et SEQ ID N 140 présentant une région d'environ =
12,1 kb dont 1,4 kb chevauchent la sequence précédente (SEQ ID N 1) et environ 10,7 kb correspondent à la suite de la séquence, cette dernière partie d'environ 10,7 kb contenant 9 ORFs supplémentaires (dont un ORF de séquence partielle), cf.
également figure 3 et 37 et ci-dessous), ont été identifiées en amont des 5 gènes codant la PKS et 10 occupant une région d'environ 11,1 kb (SEQ ID N 2 et figure 3), ont été
identifiées en aval des gènes de la PKS. Les 10 gènes situés en aval des 5 gènes PKS ont ainsi été
nommés orfl*c, o1j2*c, orf3*c, orf4*c, orf5*, orf6*, orf7*c, orf8*, orf9*, orf10* (SEQ
ID N 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 et 21). Le c ajouté dans le nom du gène signifiant pour l'ORF en question que la séquence codante est dans l'orientation inverse (le brin codant est donc le brin complémentaire de la séquence donnée en SEQ ID N 2 pour ces gènes). En utilisant la même nomenclature, les 34 ORFs en amont des gènes de la PKS
ont été nommés orfl, orf2, orf3, orf4, orf5, orf6, orf7, orf8, orf9c, orf10, orfllc, orf12, orfl3c, orf14, orfl5c, orf16, orf17, orf18, orf19, orf20, orf21c, orf22c, orf23c, orf24c, =

orf25c, orf26, orf27, orf28c, orf29, o,j30c, orf31, orf32c, orf33 et orf34c (SEQ ID N
23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 et 149) (cf.
figure 3 et 37).
Les séquences protéiques déduites de ces phases ouvertes de lecture ont été
comparées avec celles présentes dans différentes bases de données grâce à
différents programmes : BLAST (Altschul et al., 1990) (Altschul et al., 1997), CD-search, COGs (Cluster of Orthologous Groups) (ces trois programmes sont accessibles notamment auprès du National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Bethesda, Maryland, , USA)), FASTA ((Pearson W. R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990), BEAUTY (Worley K. C.. et al., 1995)), (ces deux programmes sont accessibles notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France). Ces comparaisons ont permis de formuler des hypothèses sur la fonction des produits de ces gènes et d'identifier ceux susceptibles d'être impliqués dans la biosynthèse des spiramycines.
Gènes situés en aval des gènes codant les PKS
Une représentation schématique de l'organisation de la région est présentée en ' figure 3. Ainsi qu'il sera démontré ci-dessous, sur les 10 gènes identifiés en aval des gènes codant les PKS 9 semblent impliqués dans la biosynthèse ou la résistance aux spiramycines. Il s'agit des 9 gènes suivants : orfl*c, orf2*c, orf3*c, orf4*c, orf5*, orf6*, orf7*c, orf8* et orf9*.
Dans le tableau 1 suivant sont présentées les références à la séquence en ADN
et en acides aminés des 10 gènes identifiés en aval des 5 gènes PKS.
Tableau 1 Gène Position dans la Séquence ADN Séquences polypeptidiques séquence SEQ ID N 2 orfl *c 10882 à 10172 SEQ ID N 3 SEQ ID N 4 orf2*c 10052 à8781 SEQ ID N 5 SEQ ID N 6 orf3*c 8741 à 7476 SEQ ID N 7 SEQ ID N 8 orf4*c 7459 à6100 SEQ ID N 9 SEQ ID N 10 orf5* 5302 à5976 SEQ ID N 11 SEQ ID N 12 orf6* 4061 à 5305 SEQ ID N 13 SEQ ID N 14 orf7*c 3665 à2817 = SEQ ID N 15 SEQ ID N 16 orf8* 1925 à2755 SEQ ID N 17 SEQ ID N 18 orf9* 1007 à 1888 SEQ D N 19 SEQ ID N 20 orf10* 710 à937 SEQ ID N 21 SEQ ID N 22 Le e ajouté dans le nom du gène indique que la séquence codante est dans l'orientation inverse (le brin codant est donc le brin complémentaire de la séquence donnée en SEQ D N 2 pour ces gènes).
Dans le but de déterminer la fonction des polypeptides identifiés, trois types.:;
d'expériences ont été menés : la comparaison des séquences identifiées avec 4s séquences de fonctions connues, des expériences d'inactivation de gènes, conduisant à
construction de souches mutantes et des analyses de la production en spiramycines et en intermédiaires de biosynthèse des spiramycines par ces souches mutantes.
Les séquences protéiques déduites de ces phases ouvertes de lecture ont tout d'abord été comparées avec celles présentes dans différentes bases de données grâce à
différents programmes : BLAST (Altschul et al., 1990) (Altschul et al., 1997), CD-search, COGs (Cluster of Orthologous Groups), FASTA ((Pearson W. R & D. J.
Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990), BEAUTY (Worley K. C.. et al., 1995)).
Ces comparaisons ont permis de formuler des hypothèses sur la fonction des produits de ces gènes et d'identifier ceux susceptibles d'être impliqués dans la biosynthèse de spiramycine. Le tableau 2 montre les protéines présentant une forte similitude avec les produits 10 gènes situés en aval des 5 gènes PKS.

Tableau 2 Produit Protéine présentant une Numéro d'accès Score Fonction rapportée de gène similitude significative GenBank BLAST*
orfl *c Ty1MI(orf3*) (S. fradiae) CAA57473 287 N-méthyltransférase orf2*c dnrQ gene product AAD15266 153 Inconnue (Streptomyces peucetius) orf3*c Ty1MII(orf2*) (S. fradiae) CAA57472 448 Glycosyltransféras orf4*c Crotonyl-CoA réductase NP 630556 772 Crotonyl-CoA
(S. coelicolor) réductase orf5* MdmC (S. mycarofaciens) B42719 355 0-méthyltransférase orf6* 3-0-acyltransférase (S. Q00718 494 Acyltransférase mycarofaciens) orf7*c MdmA (S. A60725 380 Protéine impliquée mycarofaciens) dans la résistance, à la midécamySiiè -orf8* ABC-transporteur (S. CAC22119 191 ABC-transporteur griseus) 0r19* ABC-transporteur (S. CAC22118 269 ABC-transporteur griseus) orf10* Putative small conserved NP 627432 109 Inconnue hypothetical protein (S.
coelicolor) * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Des expériences d'inactivation de gènes ont été réalisées pour confirmer ces résultats.
Les méthodes utilisées consistent à effectuer un remplacement de gène. Le gène cible à
interrompre est remplacé par une copie de ce gène interrompue par une cassette conférant la résistance à un antibiotique (par exemple l'apramycine, la généticine ou l'hygromycine). Les cassettes utilisées sont bordées de part et d'autre par des codons de terminaison de la traduction dans toutes les phases de lecture et par des terininateurs de transcription actifs chez Streptomyces. L'insertion de la cassette dans le gène cible peut s'accompagner ou non d'une délétion dans ce gène cible. La taille des régions flanquant 5 la cassette peut aller de quelques centaines à plusieurs milliers de paires de bases. Un deuxième type de cassettes peut être utilisé polir l'inactivation de gènes :
des cassettes dites cassettes excisables . Ces cassettes présentent l'avantage de pouvoir être excisées chez Streptomyces par un événement de recombinaison de site spécifique après "
avoir été introduites dans le génome de S. ambofaciens. Le but est d'inactiver certains 10 gènes dans des souches de Streptomyces sans laisser dans la souche finale de marqueurs de sélection ou de grandes séquences d'ADN n'appartenant pas à la souche.
Après excision il subsiste uniquement une courte séquence d'une trentaine de paires de bases (appelé site cicatriciel ) dans le génome de la souche (cf. figure 10). La mise en oeuvre de ce système consiste, dans un premier temps, au remplacement de la copie sauvage du gène cible (grâce à deux événements de recombinaison homologue, cf.
figure 9) par une construction dans laquelle une cassette excisable a été insérée dans ce gètie cible. L'insertion de cette cassette est accompagnée d'une délétion dans le gène cible (Cf figure 9). Dans un deuxième temps, l'excision de la cassette excisable du génome de la souche est provoquée. La cassette excisable fonctionne grâce à un système de recombinaison site spécifique et a pour avantage de permettre l'obtention de mutants de Streptomyces ne portant finalement pas de gène de résistance. On s'affranchit également d'éventuels effets polaires sur l'expression des gènes situés en aval du ou des gènes inactivés (cf. figure 10). Les souches ainsi construites ont été testées pour leur production en spiramycines.

L'inactivation des gènes orfl*c, orf2*c, orf3*c et orf4*c n'a pas été
effectuée car les expériences de comparaison de séquence ont permis de déterminer que ces gènes avaient une similitude relativement importante avec des gènes impliqués dans la biosynthèse d'un antibiotique relativement proche. Ainsi, le gène orfl*c code une protéine présentant une identité de 66% (déterminée grâce au programme BLAST) avec 30 la protéine codée par gène ty1M1 qui code une N-méthyltransférase impliquée dans la biosynthèse de tylosine et catalysant la 3 N-méthylation durant la production du mycaminose chez Streptomyces fradiae (Gandecha,A.R. et al., 1997; Numéro d'accès GenBank : CAA57473 ; Score BLAST: 287). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique relativement proche et plus particulièrement dans la biosynthèse du mycaminose suggère que le gène orfl*c code une N-methyltransférase responsable d'une N-méthylation lors de la biosynthèse de la forosamine ou du mycaminose (cf. figure 5 et 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orfl*c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 3).
Tableau 3 Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction rapportée significative d'accès BLAST*
GenBank méthyltransferase (S. antibioticus) CAA05643 277 méthyltransférase N,N-diméthyltransferase (S. venezuelae) AAC68678 268 N,N- =
,=== fr 1, , diméthyltransférase.
probable N-méthylase snogX (S. T46679 243 N-méthyltransférase nogalater) * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène orf2*c code une protéine présentant une relative forte similitude (35%

d'identité) avec une protéine codée par le gène tylMIII codant une NDP hexose 3,4 isomérase impliquée dans la biosynthèse de la tylosine chez Streptomyces fradiae (Gandecha,A.R., et al., 1997 ; Numéro d'accès GenBank : CAA57471 ; Score BMAST
:
130). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche et plus particulièrement dans la biosynthèse du mycaminose suggère fortement que le gène ore2c code une NDP hexose 3,4 isomérase responsable d'isomérisation lors de la biosynthèse d'un des sucres de la spiramycine, éventuellement le mycaminose (cf. figure 5 et 6).
Le gène orf3*c code une protéine présentant une relative forte similitude (59%

d'identité) avec une protéine codée par le gène tylMll codant une glycosyltransférase impliquée dans la biosynthèse de la tylosine chez Streptomyes fradiae (Gandecha,A.R.
et al., 1997; Numéro d"accès GenBank : CAA57472 ; Sçore BLAST: 448). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène ore3c code une glycosyltransférase.
Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf3*c présente .
une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 4).
Tableau 4 Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction rapportéé
significative d'accès BLAST*
GrenBanic Glycosyl transférase (S. venezuelae) AAC68677 426 Glycosyltransférase Glycosyltransférase (S. antibioticus) CAA05642 425 Glycosyltransférase Glycosyltransférase CAA74710 395 Glycosyltransférase (Saccharopolyspora elythraea) Glycosyltransférase (S. antibioticus) CAA05641 394 Glycosyltransférase * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène orf4*c code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs crotonyl-CoA réductases. Notamment, la protéine codée par orf4*c possède une similitude importante avec une crotonyl CoA réductase de chez Streptomyces coelicolor (Redenbach,M et al., 1996; Numéro d'accès GenBank : NP_630556 ;
Score BLAST: 772). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orf4*e code également une crotonyl-CoA réductase. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf4*e présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 5).
Tableau 5 Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction rapportée significative d'accès BLAST*
GenBank trans-2-énoyl-CoA réductase S72400 764 trans-2-énoyl-CoA
(EC1.3.1.38) (S. collinus) réductase Crotonyl CoA réductase (S..fradiae) CAA57474 757 Crotonyl CoA réductase Crotonyl-CoA réductase S. AAD53915 747 Crotonyl-CoA réductase cinnamonensis) * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus "
élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène orf6* présente une certaine similitude avec le gène mdmB présent chez Streptomyces mycarofaciens (Hara et Hutchisnson, 1992; numéro d'accès GenBank :
A42719; Score BLAST : 489) producteur d'antibiotique macrolide. Chez ce producteur, le gène est impliqué dans l'acylation du cycle lactone. Le gène orf6* coderait donc une acyltransférase. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf6* présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 6).

Tableau 6 Protéine présentant une Numéro Score Fonction rapportée similitude significative d'accès BLAST*
GenBank AcyA (Streptomyces J4001 450 macrolide 3-0-acyltransférase thermotolerans) Midécamycine 4"-0- BAA09815 234 Midécamycine 4"-O-propionyl propionyl transférase (S. transférase mycarofaciens) Mycarose 0-acyltransférase AAG13909 189 Mycarose 0-acyltransférase (Micromonospora =
megalomicea subsp. Nigra) * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
L'inactivation du gène orf6* a ete realisee par une délétion/insertion en phase et il a été montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycine II et III
mais uniquement de la spiramycine I (cf figure 1). Ceci confirme que le gène orf6*
est bien impliqué dans la synthèse de spiramycine II et III. L'enzyme codée par ce gène est responsable de la formation de spiramycine II et III par fixation d'un groupement acétyl ou butyryl sur le carbone 3. Les souches n'exprimant plus la protéine codée par le gène orf6* sont particulièrement intéressantes puisqu'elles ne produisent plus de spiramycine II et III mais seulement de la spiramycine I. Comme il a été précisé ci-dessus, l'activité
antibiotique de la spiramycine I est nettement supérieure à celle des spiramycines II et III
(Liu et aL, 1999).
Le gène orf5* code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs 0-méthyltransférase. Notamment, la protéine codée par orf5* possède une similitude importante avec une 0-méthyltransférase (EC 2.1.1.-) MdmC de Streptomyces mycarofaciens (Hara & Hutchinson, 1992; Numéro d'accès GenBank :B42719; Score BLAST: 355). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique suggère fortement que le gène orf5*
code également une 0-méthyltransférase. Le gène orf5* serait impliqué dans la 5 formation de précurseurs incorporés dans le cycle lactone. En effet, d'après les compi:araisons de séquences, le produit du gène orf5* est également relativement proche de FkbG qui est responsable de la méthylation de l'hydroxymalonyl-ACP d'après (Wu et al., 2000 ; Hoffineister et al., 2000; Numéro d'accès GenBank: AAF86386 ;
Score W;
BLAST: 247) (cf. figure 8). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codéé
10 par le gène orf5* présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 7).
Tableau 7 Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction rapportée significative d'accès BLAST* g GenBank õ
Probable 0-méthyltransferase (EC T18553 223 0-méthy1traniféràe 2.1.1.-) sait (Myxococcus xanthus) 4-0-méthyltransferase (EC 2.1.1.-) ¨ JC4004 222 0-méthyltransférase (Streptomyces sp.) * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Grâce à l'effet polaire de l'insertion d'une cassette non excisée dans le gène orf 6*, il a pu être déterminé que le gène orf 5* est essentiel à la voie de biosynthèse des spiramycines. En effet, l'insertion de la cassette excisable dans la partie codante du gène orf 6* entraîne un arrêt total de la production en spiramycines. Cependant, une fois que la cassette insérée a été excisée (et donc lorsque seul le gène orf6* est inactivé, cf 20 exemples 14 et 15), on retrouve une production en spiramycine I. Ceci montre que le gène orf 5* est essentiel à la voie de biosynthèse des spiramycines puisque son inactivation entraîne un arrêt total de la production en spiramycines.
Le gène orf5* code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs 0-méthyltransférase. Le gène orf5* serait une 0-méthyl transférase impliquée soit directement dans la synthèse du platénolide, soit dans la synthèse d'un précurseuÉ.
méthylé (méthoxymalonyl, voir figure 8) incorporé dans le platénolide par la PKS. Pour vérifier cette hypothèse, des expériences d'analyse CL/SM et de RMN ont été
conduites sur une souche de S. ambofaciens de génotype : orf6*:.yittlQhyg+. Dans cette souche le' gène orf5* n'est pas exprimé à cause de l'effet polaire de l'insertion, dans le gène orf6*, de la cassette qui contient des terminateurs de transcription (cf. exemple 27). Il a été
montré que cette souche produit une molécule dont le spectre UV a une allure similaire à celui de la spiramycine I mais le spectre de masse montre un ion moléculaire à 829. La différence de masse de 14 par rapport à la masse de la spiramycine peut s'expliquer part.
l'absence de méthyl sur l'oxygène portée par le carbone n 4 du cycle lactone (là
:
. 15 strucutre de ce composé est présenté en figure 39). Les résultats obtenus par RMN soiiï
Y,.=!fNfi compatibles avec cette hypothèse. La présence d'un composé à 829 permet de valider,f l'hypothèse du rôle de orf5* dans la biosynthèse des spiramycines. En outre, le produit correspondant à la spiramycine sans le groupement méthyle présente une très faible activité microbologique (plus faible d'un facteur 10) par rapport à la spiramycine non modifiée, lorsque testée sur le microorganisme Micrococcus luteus.
Le gène orf7*c code une protéine présentant une relative forte similitude avec une protéine codée par le gène mdmA de Streptomyces mycarofaciens, ce dernier codant une protéine impliquée dans la résistance à la midécamycine chez cet organisme producteur (Hara et al., 1990; Numéro d'accès GenBank : A60725; Score BLAST : 380). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique suggère fortement que le gène o1j7*c code également une protéine impliquée dans la résistance à la spiramycine. Plus particulièrement, l'enzyme codée par le gène orf7*c possède une activité méthyltransférase et est impliquée dans la résistance à la spiramycine chez Streptomyces ambofaciens. Il a été démontré que ce gène confère une resistance de type MLS I, résistance dont on sait qu'elle est dûe à la mono-méthylation en position A2058 de l'ARN ribosomal 23S (Pernodet et al., 1996).
Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf7*c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 8).
Tableau 8 Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction rapportée significative d'accès BLAST*
GenBank macrolide-lincosamide-streptogramin B JC5319 238 23S
rRNA
resistance determinant (S. fradiae) méthyltransférase 23S ribosomal RNA methyltransferase AAL68827 119 23S
rRNA
ErmML (Micrococcus luteus) méthyltransférase =e.*.
!e.?
* une plus grande similitude de séquence est associe'e à un score BLAST plus, élevé (Altschul et d., 1990).
Le gène orf8* code une protéine présentant une relative forte similitude avec une protéine de type transporteur ABC chez Streptomyces griseus (Campelo, 2002, Numéro d'accés GenBank : CAC22119 ; Score BLAST: 191). Cette similitude avec une protéine de type transporteur ABC suggère fortement que le gène ore* code également une protéine de type transporteur ABC pouvant être impliquée dans la résistance à
la spiramycine. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf8* présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 9).
=

Tableau 9 Protéine présentant une similitude Numéro d'accès Score Fonction significative GenBank BLAST* rapportée AcrW (Streptomyces galilaeus) BAB72060 94 Transporteur ABC
= Daunorubicin resistance transmembrane P32011 89 Résistance à la protéine (Streptomyces peucetius) daunorubicine Probable ABC-transporter, NP 626506 89 Transporteur transmembrane component. ABC
(Streptomyces coelicolor) * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé
1.?".
(Altschul et al., 1990).
, Le gène orf9* code une protéine présentant une relative forte similitude avec une = 71;i .
protéine de type transporteur ABC chez Streptomyces griseus (CamPelo, 2002, Nuriéi,..e;
d'accés GenBank : CAC22118 ; Score BLAST : 269). Cette similitude avec une protéine de type transporteur ABC suggère fortement que le gène orf9* code également une protéine de type transporteur ABC pouvant être impliquée dans la résistance à
la spiramycine. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène olf8* présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 10).
Tableau 10 Protéine présentant une similitude significative Numéro Score Fonction d'accès BLAST* rapportée GenBank Probable ABC-type transport protein, ATP- NP 626505 231 Transporteur binding component (S. coelicolor) ABC

Putative ABC transporter ATP-binding NP 627624 228 Transporteur component (Streptomyces Coelicolor) ABC
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé
(Altschul et al., 1990).
Le gène orf10* code une brotéine présentant une relative forte similitude avec une protéine de fonction inconnue. Cependant des gènes similaires à orf10* sont retrouvés au milieu de plusieurs groupes de gènes impliqués dans la biosynthèse d'antibiotiques.
Ainsi un gène proche de 0110* est retrouvé chez S. coelicolor (Redenbach et al., 1996, numéro d'accès GenBank : NP 627432, score BLAST: 109). Un gène proche (CouY) est également retrouvé chez S. rishiriensis (Wang et al., 2000, numéro d'accès GenBank : AAG29779, score BLAST 97).
=i = =
Gènes situés en amont des gènes codant les PKS
=
, Dans la séquence d'ADN située en amont des gènes codant les PKS (l'aval et l'amont étant défini par l'orientation des 5 gènes de PKS tous orientés dans le même sens) (cf. figure 3), 34 ORFs ont été identifiées (cf. ci-dessus). Ainsi, les 34 phases ouvertes de lecture de ce type, occupant une région d'environ 41,7 kb (cf. SEQ

présentant une première région de 31 kb contenant 25 ORFs et SEQ ID N 140 présentant une région d'environ 12,1 kb dont 1,4 kb chevauchent la sequence précédente (SEQ ID N 1) et environ 10,7 kb correspondent à la suite de la séquence), cette dernière partie d'environ 10,7 kb contenant 9 ORFs supplémentaires (dont un ORF de séquence partielle), cf. également figure 3 et 37 et ci-dessous). Une représentation schématique de l'organisation de la région est présentée en figure 3 et 37. Les 34 gènes identifiés ont été
nommés : orfl, orfl, orf3, orf4, orf5, orf6, oi17, orf8, orf9c, orf10, orfllc, orf12, orfl3c, orf14, orfl5c, orf16, orf17, orf18, orf19, orf20, orf21c, orf22c, ol:123c, orf24c, orf25c, oî126, orf27, orf28c, orf29, orf30c, orf31, orf32c, orf33 et orf34c.

Dans le tableau 11 suivant sont présentées les références à la séquence en ADN
et en acides aminés des 34 gènes identifiés en amont des 5 gènes PKS.
Tableau 11 Gène Position dans la Séquence ADN Séquence(s) polypeptidique(s)2 séquence SEQ ID N 1 orfl 658à 1869 SEQ ID N 23 SEQIDN 24 orf2 1866 à 2405 SEQ ID N 25 SEQ ID N 26 et 27 orf3 2402 à3568 SEQ ID N 28 SEQ ID N 29 orf4 3565 à4473 SEQ ID N 30 SEQIDN 31,32 et 33 orf5 4457 à 5494 SEQ LD N 34 SEQ ID N 35 orf6 5491 à 6294 SEQ ID N 36 SEQ ID N 37,38 et 39 orf7 6296 à 7705 SEQ ID N 40 SEQ ID N 41 et 42 :
orf8 8011 à9258 SEQ ID N 43 SEQ ID N 44 ori9c 10081 à 9362 SEQ ID N 45 SEQ ID N 46 orf10 10656 à 12623 SEQ ID N 47 SEQ ID N 48 orfllc 14482 à 12734 SEQ ID N 49 SEQ ID N 50,51 et 52 orf12 14601 à 16031 SEQ ID N 53 SEQ ID N 54, 55, 56, 57, 58 et orfl3c 17489 à 16092 SEQ ID N 60 SEQ ID N 61 orf14 17809 à 18852 SEQ ID N 62 SEQ ID N 63 orfl5c 20001 à 18961 SEQ ID N 64 SEQ ID N 65 orf16 20314 à 21552 SEQ ID N 66 SEQ ID N 67 orf17 21609 à22879 SEQ ID N 68 SEQ ID N 69 orf18 22997 à24175 SEQ ID N 70 SEQ ID N 71 orf19 24177 à25169 SEQ ID N 72 SEQ ID N 73 orf20 25166 à26173 SEQ ID N 74 SEQ ID N 75 orf21c 27448 à26216 SEQ ID N 76 SEQ ID N 77 orf22c 28560 à27445 SEQ ID N 78 SEQ ID N 79 orf23c 29770 à 28649 SEQ ID N 80 SEQ ID N 81 orf24c 30074 à 29763 SEQ D N 82 SEQ ID N 83 orf25c 30937 à 30071 SEQ ID N 84 SEQ ID N 85 Gène' Position dans la Séquence ADN Séquence(s) polypeptidique(s)2 séquence SEQ ID NO:

orf26 1647 à 2864 SEQ ID N 107 SEQ ID N 108 orf27 2914 à 3534 SEQ ID N 109 SEQ ID N 110 =
orf28c 4967 à 3804 SEQ ID N 141 SEQ ID N 142 =
orf29 5656 à 6663 SEQ ID N 113 SEQ ID N 114 .
orf30c 7723 à6686 SEQ ID N 115 SEQ ID N 116 et 117 7534 à 6686 SEQ ID N 143 SEQ D N 144 orf31 7754 à 8728 SEQ ID N 118 SEQ ID N 119 orf32c 10488 à8977 SEQ ID N 145 SEQ ID N 146 orf33 10562 à 10837 SEQ ID N 147 SEQ ID N 148 orf34c 12134à 10899 SEQ ID N 149 SEQ ID N 150 Le e ajouté dans le nom du gène indique que la séquence codante est dans l'orientation inverse (le brin codant est donc le brin complémentaire de la séquence donnée en SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 140 pour ces gènes).
2 Lorsque plusieurs séquences protéiques sont indiquées pour une seule orf, les protéines correspondantes sont issues de plusieurs sites possibles de démarrage de la traduction.

Dans le but de déterminer la fonction des polypeptides identifiés dans le tableau 11 ci-dessus, trois types d'expériences ont été menées : la comparaison de l'identité des séquences identifiées avec des séquences de fonctions connues, des expériences d'inactivation de gènes et des analyses de la production en spiramycines de ces souches mutantes.
Les séquénces protéiques déduites de ces phases ouvertes de lecture ont tout d'abord été comparées avec celles présentes dans différentes bases de données grâce à
différents programmes : BLAST (Altschul et al., 1990) (Altschul et al., 1997), CD-search, COGs (Cluster of Orthologous Groups), FASTA ((Pearson W. R & D. J.
Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990), BEAUTY (Worley K. C.. et al., 1995)), (cf. ci-dessus). Ces comparaisons ont permis de formuler des hypothèses sur la fonction des produits de ces gènes et d'identifier ceux susceptibles d'être impliqués dans la biosynthèse de spirarnycine. Le tableau 12 montre les protéines présentant une forte similitude avec les 34 gènes situés en amont des 5 gènes PKS.
= 15 Tableau 12 ;=Mè.5 =
Gène Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction =''' significative d'accès BLAST* rapportée GenBank 69f1 Cytochrome P450 tylI (Streptomyces S49051 530 Cytochrome P45 fradiae) orf2 ORF15x4 (Listonella anguillarum) AAB81630 113 Inconnue orf3 aminotransferase-like protein AAF59939 431 Amino-(Streptomyces antibioticus) transférase orf4 alpha-D-glucose-l-phosphate AAC68682 404 alpha-D-glucose.
thymidylyltransferase (Streptomyces 1-phosphate venezuelae) thymidylyltranst rase otf.5 AprE (Streptomyces tenebrarius) AAG18457 476 dTDP-glucose 4,6-déshydratase orf6 'Thioesterase (Streptomyces avermitilis) BAB69315 234 Thioestérase orf7 TylCVI (Streptomyces fradiae) AAF29379 461 dNTP hexose 2,3-déshydratas( orf8 probable aminotransferase AAG23279 465 Aminotransféras (Saccharopolyspora spinosa) orf9c SrmX (Streptomyces ambofaciens) S25204 ' 445 Méthyltransfém orf10 SrmR (Streptomyces ambofaciens) S25203 1074 Protéine de régulation orfl lc SrmB (Streptomyces ambofaciens) S25202 955 Résistance à
la spiramycine orf12 UrdQ (Streptomyces fradiae) AAF72550 634 NDP-hexose 3,4 déshydratase orfl3c SC4H2.17 (Streptomyces coelicolor) T35116 619 Inconnue orf14 putative reductase (Streptomyces CAB90862 147 Réductase coelicolor) = :1 . .
, =Iµitt orfl5c Probable 3-ketoreductase (Streptomyces T51102 285 3-cétorédudaie:
antibioticu,$) , orf16 Hypothetical NDP hexose 3,4 CAA57471 209 NDP hexose 3,4 isomerase (Streptomyces fradiae) isomérase orfl 7 Glycosyl transférase (Streptomyces AAC68677 400 Glycosyl venezuelae) transférase orf18 Glycosyl transférase (Streptomyces AAG29785 185 Glycosyl rishiriensis) transférase orf19 NDP-hexose 4-cétoreductase TylCIV AAD41822 266 NDP-hexose 4-(Streptomyces fi-adiae) cétoréductase orf20 EryBII (Saccharopolyspora erythraea) AAB84068 491 aldocéto réductase orfilc TylCIII (Streptomyces fradiae) AAD41823 669 NDP-hexose 3-C
méthyltransféras( orf22c FkbH (Streptomyces hygroscopicus) AAF86387 463 Impliqué
dans la biosynthèse du méthoxymalony]
orf23c FkbI (Streptomyces hygroscopicus) AAF86388 387 Acyl CoA
déshydrogénase orf24c FkbJ (Streptomyces. hygroscopicus) AAF86389 87 Impliqué
dans la biosynthèse du méthoxymalonyl orf25c FkbK (Streptomyces hygroscopicus) AAF86390 268 Acyl CoA
déshydrogénase orf26 TylCV (Streptomyces fradiae) AAD41824 471 Mycarosyl transferase orf27 TylCVII (Streptomyces fradiae) AAD41825 243 NDP-hexose 3,5.
(ou 5-) épimeras orf28c AcyB2 (Streptomyces thermotolerans) JC2032 451 protéine régulatrice tr= =
=
orf29 Béta-manannase (Sorangium. AAK19890 139 Glycosyl celtulosum) hydrolase =
orf30c Epimérase de sucre-nucléoside- NP 600590 89 Epimérase de diphosphate (Colynebacterium sucre-nucléoside-glutamicum) diphosphate orf31 Oxidoréductase (Streptomyces NP 631148 261 Oxidoréductase coelicolor) orf32c Protéine régulatrice de la famille GntR NP_824604 282 Protéine (Streptomyces avermitilis) régulatrice orf33 Protéine hypothetique (Xanthomonas NP_635564 54 Inconnue campestris) o7:134c Arabinofuranosidase (Streptomyces NP 630049 654 Arabinofuranosid coelicolor) ase * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
=

Des expériences d'inactivation de gènes ont été réalisées pour confirmer ces résultats. Les méthodes utilisées consistent à effectuer un remplacement de gène. Le gène cible à interrompre est remplacé par une copie de ce gène interrompue par une cassette conférant la résistance à un antibiotique (par exemple l'apramycine ou 5 l'hygromycine). Les cassettes utilisées sont bordées de part et d'autre par des codons de terminaison de la traduction dans toutes les phases de lecture et par 4es terminateurs de transcription actifs chez Streptomyces. L'insertion de la cassette dans le gène cible peut s'accompagner ou non d'une délétion dans ce gène cible. La taille des régions flanquant la cassette peut aller de quelques centaines à plusieurs milliers de paires de bases. Lin 10 deuxième type de cassettes peut être utilisé pour l'inactivation de gènes : des cassettes dites cassettes excisables (cf. ci dessus). Les souches ainsi construites ont été testées pour leur production en spiramycines.
Le gène orfl code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs cytochrome P450. Notamment, la protéine codée par orfl possède une' 15 similitude importante avec la protéine codée par le gène tylI impliquée dans la ;;=:;; biosynthèse de tylosine chez Streptomyces fraelia Merson-Davies,LA.
et al., 1994, -"
Numéro d'accès GenBank : S49051 ; Score BLAS't : 530). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orfl code également une cytochrome P450. Cette hypothèse est 20 étayée par le fait que la protéine codée par le gène orfl présente une forte similitude - avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 13).
Tableau 13 Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction rapportée significative d'accès BLAST*
GenB ank Putative cytochrome P450 YJIB 034374 248 Cytochrome (Bacillus subtilis) Cytochrome P450 113A1 P48635 237 Cytochrome P450 (Saccharopolyspora erythraea) Cytochrome P-450 hydroxylase AAC46023 208 Cytochrome P-homolog (Streptomyces caelestis) hydroxylase Cytochrome P450 monooxygénase AAC64105 206 Cytochrome P450 (Streptomyces venezuelae) monooxygénase * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène orfl code une protéine présentant une relative forte similitude avec une dTDP-6-deoxy-3,4-keto-hexulose isomerase de Aneurinibacillus thermoaerophilus (Pfoestl,A. et al., 2003, Numéro d'accès GenBank : AA.006351 ; Score BLAST :
118).
Cette similitude suggère fortement que le gène orfl code une isomérase responsable de la réaction d'isomérisation nécessaire à la biosynthèse d'un des sucres présents dans la = ?*, molécule de spiramycine, ce sucre pouvant être le mycarose (cf. figure 5).
L'inactivation du gène orf2 a été réalisée. Il a pu être montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycines. Ceci confirme que le gène orfl est bien impliqué dans la biosynthèse des spiramycines.
Le gène orf3 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs aminotransférases. Notamment, la protéine codée par orf3 possède une similitude importante avec une aminotransférase de Streptomyces antibioticus impliquée dans la biosynthèse de l'oléandomycine (Draeger,G., et a/.,1999 ; Numéro d'accès GenBank : AAF59939 ; Score BLAST : 431). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orf3 code une 3 amino-transférase responsable de la réaction de transamination nécessaire à la biosynthèse d'un des sucres aminés des spiramycines (cf.
figure 5). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf3 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 15).
Tableau 15 Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction rapportée significative d'accès BLAST*
GenBank Aminotransférase (Streptomyces T51111 429 Aminotransférase antibioticus) Transaminase (Streptomyces AAC68680 419 Transaminase venezuelae) * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
L'inactivation du gène orf3 a été réalisée. Il a ainsi pu être montré que la souche.:.;, , résultante ne produit plus de 'spiraniycines. Ceci confirme que le gène orf3 est bien impliqué dans la biosynthèse des spiramycines. L'enzyme codée par ce gène est donc bien responsable d'une étape de bioconversion essentielle à la biosynthèse des spiramycines. La production de spiramycines peut être complémentée par l'expression de la protéine TylB de S. fradiae (cf exemple 23). Ceci démontre que le gène orf3 code une 3 amino-transférase responsable de la réaction de transamination nécessaire à la biosynthèse du mycaminose (cf. figure 5). Comme le mycaminose est le premier sucre à
être fixé sur le platénolide, il est attendu que la souche interrompue dans orf3 (0S49.67) accumule du platénolide.
Les intennédaires de biosynthèse de la souche interrompue dans le gène orf3 ont été étudiés (cf. exemple 20). Ces expériences ont permis de démontrer que cette souche produit deux formes de platénolide: le platénolide A et le platénolide B, la structure déduite de ces deux molécules est présentée en figure 36. Cette souche produit également du platénolide A + mycarose et du platénolide B + mycarose (cf.
exemple 20 et figure 40). Ces composés comportent un sucre mais ne comportent pas de mycaminose. De plus si on les compare à de la spiramycine (cf. figure 1), ces composés comportent du mycarose à la place du mycaminose. Ces résultats sont en accord avec l'implication du produit du gène orf3 dans la biosynthsèe du mycaminose et son rôle en tant que 3 amino-transférase responsable de la réaction de transamination nécessaire à la biosynthèse du mycaminose (cf. figure 5). On peut remarquer que la spécificité
de glycosylation ne semble pas absolue puisque l'on trouve des molécules avec le mycarose fixé à la position noramalement occupée par le mycaminose (cf. figure 40).
Le gène orf4 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs NDP-glucose synthétases. Notamment, la protéine codée par orf4 possède une similitude importante avec une alpha-D-glucose-1 -phosphate thymidylyltransférase de Streptomyces venezuelae (Xue Y et cd.,1998 ; Numéro d'accès GenBank : AAC68682 ;
Score BLAST 404). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de , biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orf4 code une NDP-glucose syntéthase responsable de la synthèse du NDP-glucose nécessaire à
la biosynthèse des trois sucres atypiques incorporés dans la molécule de spiramycine (d.
figure 4, 5 et 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf4 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 16).
Tableau 16 Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction rapportée significative d'accès BLAST*
GenBank Glucose-1-phosphate BAA84594 402 Glucose-1 -phosphate thymidyltransférase (Streptomyces thymidyltransférase avermitilis) AclY (Streptomyces galilaeus) BAB72036 400 dTDP-1-glucose synthétase Putative glucose-1-phosphate AAK83289 399 glucose-l-phosphate thymidyltransférase thymidyltransférase (Saccharopolyspora spinosa) * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène orf5 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs glucose déshydratases. Notamment, la protéine codée par orf5 possède une similitude importante avec une dTDP -glucose 4,6-déshydratase de Streptomyces tenebrarius (Li,T.B. et cd.,2001 ; Numéro d'accès GenBank : AAG18457, Score BLAST : 476). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orf5 code une NDP
, glucose déshydratase nécessaire à la biosynthèse des trois sucres atypiques incorporég.:, ' '5`' = 10 dans la molécule de spiramycine (cf. figure 4, 5 et 6). Cette hypothèse est étayée par lé
fait que la protéine codée par le gène orf5 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 17).
Tableau 17 Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction rapportée significative d'accès BLAST*
GenBank DTDP-glucose 4,6-déshydratase AAK83290 464 DTDP-glucose 4,6-(Saccharopolyspora spinosa) déshydratase thymidine diphosphoglucose 4,6- AAA68211 445 thymidine déshydratase (Saccharopo/yspora diphosphoglucose etythraea) 4,6-déshydratase dTDPglucose 4,6-déshydratase (EC S49054 443 dTDPglucose 4,6-4.2.1.46) ¨ (Streptomyces fradiae) déshydratase TDP-glucose-4,6-déshydratase AAC68681 421 TDP-glucose-4,6-(Streptomyces venezuelae) déshydratase SgcA (Streptomyces globisporus) AAF13998 418 dNDP-glucose-4,6-déshydratase * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène orf6 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs thioestérases. Notamment, la protéine codée par orf6 possède une similitude 5 importante avec une thioestérase de Streptomyces avermitilis (Omura,S. et al., 2001;
Numéro d'accès GenBank : BAB69315 ; Score BLAST : 234). Cette similitude avec une , protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre, antibiotique proche suggère õ.
, , fortement que le gène orf6 code également 1.#w thioestérase Cette hypothèse est etayée par le fait que la protéine codée par le gène orf6 présente une forte similitude avec 10 d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 18).
Tableau 18 Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction rapportée significative d'accès BLAST*
GenBank RifR (Amycolatopsis mediterranei) AAG52991 216 Thioestérase Thioestérase ¨ (Streptomyces fradiae) S49055 215 Thioestérase Thioestérase (Streptomyces BAB69188 213 Thioestérase avermitilis) Thioestérase II (EC 3.1.2.-) ¨ T17413 203 Thioestérase (Streptomyces venezuelae) PimI protein (Streptomyces natalensis) CAC20922 201 Thioestérase Thioestérase (Streptomyces griseus) CAC22116 200 Thioestérase = * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST
plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène orf7 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs hexose déshydratases. Notamment, la protéine codée par orf7 possède une similitude importante avec une dNTP hexose 2,3-déshydratase (codée par lé gène TylCVI) de Streptomyces fradiae impliquée dans la biosynthèse de la tylosine (Merson-Davies,L.A. et al., 1994 ; Numéro d'accès GenBank : AAF29379 ; Score BLAST :
461).
Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orf7 code également une hexose 2-3 ' 10 déshydratase nécessaire à la biosynthèse de deux sucres atypiques incorporés dans' la molécule de spiramycine (cf. figure 4 et 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf7 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 19).
Tableau 19 Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction rapportée significative d'accès BLAST*
GenBank Rifl 8 (Amycolatopsis inediterranei) AAG52988 459 Hexose déshydratase SimB3 (Streptomyces antibioticus) AAK06810 444 dNDP-4-keto-6-déoxy-glucose-2,3-déshydratase * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Le gène orf8 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs aminotransférases. Notamment, la protéine codée par orf8 possède une similitude importante avec une aminotransférase probablement impliquée dans la biosynthèse de la forosamine chez Saccharopolyspora spinosa (Waldron,C. et al., 2001 ;
Numéro d'accès GenBank : AAG23279 ; score BLAST : 465). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proché.
suggère fortement que le gène orf8 code une 4 amino-transférase responsable de la réaction de transamination nécessaire à la biosynthèse de la forosamine (cf. figure 6).
Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf8 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf.
tableau 20).
Tableau 20 Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction rapportée =
significative d'accès BLAST*
GenBank Putative amino-sugar biosynthesis CAA07666 213 Proteine impliquée dans 'la.
protein (Bordetella bronchiseptica) biosynthèse d' amino-sucre * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
L'inactivation du gène orf8 a été réalisée. Il a pu ainsi être montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycines. Ceci confirme que le gène orf8 est bien impliqué dans la biosynthèse des spiramycines. L'enzyme codée par ce gène est donc bien responsable d'une étape de bioconversion essentielle à la biosynthèse des spiramycines. La validation de l'hypothèse du rôle joué par le produit du gène orf8 dans la biosynthèse de la forosamine est apportée par le fait qu'un mutant incativé
pour le gène orf8 produit de la forocidine, ce mutant est donc bloqué au stade de la forocidine et ne produit pas de néo-spiramycine (cf. figure 7 et exemple 25). Ces résultats sont en accord avec une implication du produit du gène orf8 dans la biosynthèse de forosamine (cf. figure 6).
Le gène orf9c a déjà été identifié chez Streptomyces ambofaciens et a été
désigné
srrnX par Geistlich et al. (Geistlich,M., et al., 1992). La similitude de la protéine codée par ce gène avec plusieurs méthyltransférases impliquées dans la voie de biosynthèse d'autres aritibiotiques proches suggère fortement que le gène or9c code une méthyl-transférase responsable de la réaction de méthylation nécessaire à la biosynthèse du mycaminose ou de la forosamine (cf. figure 5 et 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf9c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 21).
Tableau 21 Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction rapportée significative d'accès BLAST*
GenBank ; N,N-diméthyltransférase AAC68678 240 N,N-(Streptomyces venezuelae) diméthyltransférasè
Méthyltransférase (Streptomyces CAA05643 232 Méthyltransférase antibloticus) Putative amino methylase AAF01819 219 Aminométhylase (Streptomyces nogalater) * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène orf10 a déjà été identifié chez Streptomyces ambofaciens et a été
désigné
srmR par Geistlich et al. (Geistlich,M., et al., 1992). La protéine codée par ce gène est impliquée dans la régulation de la voie de biosynthèse des spiramycines chez Streptomyces ambofaciens. L'inactivation du gène orf10 a été réalisée. Il a pu ainsi être montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycines. Ceci confirme que le =

gène orf10 est bien impliqué dans la biosynthèse des spiramycines. La protéine codée par ce gène est donc bien essentielle à la biosynthèse des spiramycines.
D'autre part ; le point de démarrage de la traduction de orf 10 a été
déterminé et il a pu être montré que la surexpression de ce gène entraine une amélioration de la production en spiramycines. Le site de démarrage de la traduction correspond à
un ATG
situé en amont de l'ATG proposé par Geistlich et al. (Geistlich,M., et al., 1992). Il a en outre été démontré que cette extrémité 5' est esentielle à la fonction de Orf10 puisqu'un messager tronqué en 5' est inactif (cf. exemple 17). Pour obtenir l'effet recherché sur la , production en spiramycines, il est donc essentiel que la surexpression de orf10 soit réalisée en prenant garde de ne pas exprimer un messager tronqué en 5' de orf10.
Le gène orfl le a déjà été identifié chez Streptomyces ambofaciens et a été
désigné
srmB par Geistlich et al. (Geistlich,M. et al., 1992) et Schoner et al.
(Schoner B et al., .
1992). La protéine codée par ce gène est impliquée dans la résistance à la spiramycin,e chez Streptomyces ambofaciens et est un transporteur de type ABC.
'ft;
Le gène off12 code une protéine présentant une relative forte similitude Miêêl:%1 plusieurs hexose déshydratases. Notamment, la protéine codée par orf12 possède une similitude importante avec une NDP-hexose 3,4-déshydratase codée par le gène UrdQ
de Streptomyces fradiae et impliquée dans la biosynthèse de l'urdamycine (Hoffmeister,D. et al., 2000 ; Numéro d'accès GenBank : AAF72550 ; Score BLAST
:
634). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orf12 code une 3,4 déshydratase responsable de la réaction de déshydratation nécessaire à la biosynthèse de la forosamine (cf. figure 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf12 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 22).

Tableau 22 Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction rapportée significative d'accès BLAST*
GenBank AknP (Streptomyces galilaeus) AAF73452 625 3 -déshydratase NDP-hexose 3,4-dehydratase homolog D13547 624 NDP-hexose 3,4-(Streptomyces cyanogenus) déshydratase RdmI (Streptomyces purpurascens) AAL24451 608 hexose-C-déshydratase Probable CDP-4-keto-6-deoxyglucose- T46528 602 CDP-4-céto-6-3-dehydratase (El) (Streptomyces déoxyglucose-3-violaceoruber) déshydratase Probable NDP-hexose-3,4-dehydratase AAG23278 582 NDP-hexose-3,4-. = . (Saecharopolyspora spinoSa) déshydratase ;
dNTP-hexose déshydratase AAC01730 576 dNTP-hexose (Amycolatopsis mediterranei) déshydratase * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
L'inactivation du gène orf12 a été réalisée. Il a pu être montré que la souche 5 résultante ne produit plus de spiramycines. Ceci confirme que le gène orf12 est bien impliqué dans la biosynthèse de la spiramycine. L'enzyme codée par ce gène est donc bien responsable d'une étape de bioconversion essentielle à la biosynthèse de la spiramycine. La validation de l'hypothèse du rôle joué par Orf12 dans la biosynthèse de la forosamine est apportée par le fait qu'un mutant incativé pour le gène orf12 ne produit 10 plus de forosamine. Il produit cependant une faible quantité de forocidine. Ce mutant est donc bloqué au stade de la forocidine et ne produit pas de néo-spiramycine (cf. figure 7 et exemple 26). Ce mutant produit en outre un composé de structure présentée en figure 38. Ce dernier composé comporte deux sucres, le mycaminose et le mycarose mais ne comporte pas de forosamine. De plus si on le compare à la structure de la spiramycine (cf. figure 1), ce composé comporte le sucre mycarose à la place attendue de la forosamine. Ces résultats sont en accord avec l'implication du produit du gène orf12 ' dans la biosynthsèe de la forosamine (cf. figure 6). On peut remarquer que la spécificité
de glycosylation n'est pas absolue puisque l'on observe des molécules dans lesquelles le mycarose est fixé à la position normalement occupée par la forosamine (voir figure 38).
Le gène orfl3c code une protéine présentant une relative forte similitude avec une protéine de fonction inconnue chez Streptomyces coelicolor. Cette protéine a été
nommée SC4H2.17 (numéro d'accès GeneBank : T35116 ; Score BLAST: 619). La protéine codée par le gène orfl3c présente également une forte similitude avec d'autres =
=
protéines d'autres organismes (cf. tableau 23).
Tableau 23 =
= ;' Protéine présentant Une similitude' Ninnérô Score Fonction rapPiiFteë,: ,Ym ' significative d'accès BLAST*
.
GenBank hflX protein (Mycobacterium leprae) S72938 473 Inconnue Possible ATP/GTP-binding protein NP_301739 470 Protéine fixant (Mycobacterium leprae) l'ATP/GTP
GTP-binding protein (Mycobacterium AAK47114 468 Protéine fixant le tuberculosis CDC1551) GTP
ATP/GTP-binding protein T44592 388 Protéine fixant (Streptomyces fradiae) l'ATP/GTP
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).

Aucune fonction précise n'a été assignée aux protéines proches de celle codée par orfl3c. L'inactivation du gène orfl3c a été réalisée dans le but d'étudier la fonction de ce gène dans la voie de biosynthèse des spiramycines chez Streptomyces ambofaciens. Il a pu être montré que la souche résultante produit des spiramycines. Ceci indique que le gène orfl3c n'est pas essentiel à la biosynthèse des spiramycines et qu'il n'est pas essentiel à la survie de la bIctérie. L'enzyme codée par ce gène n'est donc pas responsable d'une étape de bioconversion essentielle à la biosynthèse des spiramycines.
Le gène orf14 code une protéine présentant une relative forte similitude avec une '= z;
réductase putative (Redenbach,M., et a/.,1996 ; Bentley et al., 2002; numéro d'accès GenBank : CAB90862 ; Score BLAST : 147).
L'inactivation du gène orf14 a été réalisée. Il a pu ainsi être montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycines. Ceci confirme que le gène orf14 est bien impliqué dans la biosynthèse des spiramycines. L'enzyme codée par ce gène est donc bien responsable d'une étape de bioconversion essentielle à la biosynthèse dei:
= 15 spiramycines. Les interinédaires de biosynthèse de la souche interrompue dans le enlé:Ii =
' orf14 ont été étudiés (cf. exéniPle 20). Ces expériences ont permis de démontrer que cette souche produit du platénolide A mais ne produit pas de platénolide B
(cf. figure 36).
Le gène orfl5c code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs cétoréductases. Notamment, la protéine codée par orfl 5c possède une similitude importante avec une 3-cétoréductase chez Streptomyces antibioticus (Numéro d'accès GenBak : T51102, Score BLAST : 285). Cette similitude suggère fortement que le gène orfl5c code une 3 céto-réductase responsable de la réaction de réduction nécessaire à la biosynthèse de la forosamine (cf. figure 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orfl5e présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 24).

Tableau 24 Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction rapportée significative d'accès BLAST*
GenBank oxidoreductase homolog (Streptomyces AAD13550 272 Oxidoréductase cyanogeims) D-oliose 4-cétoreductase CAB96550 265 D-oliose 4-(Streptomyces argillaceus) cétoréductase AlmQ (Streptomyces galilaeus) AAF73453 263 putative 3-cétoréductase Probable NDP-hexose-3-ketoreductase AAG23275 253 NDP-hexose-3-(Saccharopolyspora spinosa) cétoréductase * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus ;
élevé (Altschul et. al., 1990). , Le gène orf76 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs isomérases. Notamment, la protéine codée par orf16 possède une similitude importante avec une NDP hexose 3,4 isomérase chez Streptomyces fradiae (Gandecha et al., 1997 ; Numéro d'accès GenBak : CAA57471, Score BLAST : 209). Cette similitude suggère fortement que le gène orf16 code une protéine impliquée dans la biosynthèse d'un des sucres de la spiramycine (cf. figure 5 et 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf16 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 25).

Tableau 25 Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction rapportée significative d'accès BLAST*
GenBank Putative tautomerase (Streptomyces AAC68676 145 Tautomérase venezuelae) TDP-4-céto-6-déoxyhexose 3,4- AAG13907 112 TDP-4-céto-6-isomérase (Micromonospora déoxyhexose 3,4-megalomicea subsp. nigra) isomérase * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène orf17 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs glycosyl transférases. Notamment, la protéine codée par orfl 7 possède ug&'=
=
similitude importante avec une glycosyl trensférase de Streptomyces venezuelae (Xue,r.. , el , = = =
; = , et cd.,1998 Numéro d'accès .0enBaniu AAC68677 ; score BLAST : 400)La =
similitude de la protéine codée par le gène orf17 avec plusieurs glycosyl transférases impliquées dans la voie de biosynthèse d'autres antibiotiques proches suggère fortement que ce gène code également une glycosyl transférase. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orfl 7 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 26).
Tableau 26 Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction rapportée significative d'accès BLAST*
GenBank Glycosyltransférase (Streptomyces CAA57472 399 Glycosyltransférase fradiae) =
Glycosyltransférase (Streptomyces CAA05642 378 Glycosyltransférase antibioticus) Glycosyltransférase (Streptomyces CAA05641 360 Glycosyltransférase antibloticus) Glycosyltransférase = CAA74710 344 Glycosyltransférase (Saccharopolyspora eiythraea) * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène orf18 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs glycosyl transférases. Notamment, la protéine codée par otf18 possède une 5 similitude importante avec une glycosyl transférase de Streptomyces rishiriensis (Wang et cd.,2000 ; Numéro d'accès GenBank : AAG29785 ; score BLAST: 185). La similitude de la protéine codée par le gène orf18 avec plusieurs glycosyl transférases , = ' . =
,impliquées dans la voie dé biosynthèse d'autres antibiotiques proches suggère fortement que ce gène code également une glycosyl transférase. Cette hypothèse est étayée par le 10 fait que la protéine codée par le gène orf18 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 27).
Tableau 27 Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction rapportée significative d'accès BLAST*
GenB ank NovM (Streptomyces spheroides) AAF67506 184 Glycosyltransférase probable glycosyl transferase T46519 169 Glycosyltransférase (Streptomyces violaceoruber) Glycosyl transferase homolog AAD13553 167 Glycosyltransférase (Streptomyces cyanogenus) Glycosyl transferase homolog AAD13555 163 Glycosyltransférase (Streptomyces cyanogenus) dNTP-hexose glycosyl transférase AAC01731 160 Glycosyltransférase (Amycolatopsis mediterranei) * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène oif19 code une protéine présentant une relative forte similitude avec , plusieurs cétoréductases. Notamment, la protéine codée par orf19 possède une similitude importante avec une NDP-hexose 4-cétoréductase (TylCIV) de Streptomyces (Bate et aL,2000 ; Numéro d'accès GenBank AAD41822 ; score BLAST: 266).
similitude de la protéine codée Par le 'gène grip avec cette cétoréductase impliquée dsnsie la voie de biosynthèse d'Un antibiotique pro.Che suggère forteniént que ce gène' C4de également une 4-cétoréductase responsable de la réaction de réduction nécessaire à la biosynthèse du mycarose (cf. figure 4). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf19 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 28).
Tableau 28 Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction rapportée significative d'accès BLAST*
GenBank NDP-4-céto-6-déoxyhexose 4- AAL14256 251 NDP-4-céto-cétoreductase (Streptomyces venezuelae) déoxyhexose 4-cétoréductase EryBIV (Saccharopolyspora erythraea) AAB84071 249 oxidoréductase TDP-4-céto-6-déoxyhexose 4- AAG13916 218 TDP-4-céto-6-cétoreductase (Micromonospora déoxyhexose megalomicea subsp. Nigra) cétoréductase dTDP-4-céto-6-déoxy-L-hexose 4- BAA84595 212 dTDP-4-céto-6-réductase (Streptomyces avermitilis) déoxy-L-hexose réductase * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène orf20 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs hexose réductases. Notamment, la protéine codée par od20 possède une similitude importante avec le gène EryBIT de Saccharopolyspora elythraea qui code une :-dTDP-4-céto-L-6-déoxy-hexose 2,3-réductase (Surnmers,R.G., et cd.,1997), Numéro =
d'accès GenBank : A.AB84068 ; Score BLAST : 491). La similitude de la protéine code . = ed" ;
par le gène orj20 avec plusieurs hexose réductases impliquées dans la voie de biosynthèse d'autres antibiotiques proches suggère fortement que ce gène code une 2-3 réductase responsable de la réaction de réduction nécessaire à la biosynthèse du mycarose (cf. figure 4). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf20 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 29).
Tableau 29 Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction rapportée significative d'accès BLAST*
GenBank TylCII (Streptomyces fradiae) AAD41821 464 NDP-hexose 2,3-énoyl réductase =

TDP-4-céto-6-deoxyhexose 2,3- AAG13914 446 TDP-4-céto-6-réductase (Micromonospora déoxyhexose 2,3-megalomicea subsp. Nigra) réductase dTDP-4-céto-6-déoxy-L-hexose 2,3- BAA84599 377 dTDP-4-céto-6-réductase (Streptomyces avermitilis) déoxy-L-hexose 2,3-réductase * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène orf21c code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs hexose méthyltransférases. Notamment, la protéine codée par orfilc possède une similitude importante avec le gène TylCIII de Streptomyces fradiae qui code une NDP-hexose 3-C-méthyltransférase (Bate,N et al., 2000; Numéro d'accès GenBank :
, = AAI/41823 ; Score BLAST: 669). La similitude de la protéine codée par le gène orf21c ?.
=
avec plusieurs hexose méthyltransféra.ses impliquées dans la voie de biosynthèse' ' . . = , =
d'autres antibiotiques proches suggère fortement que ce gène code une hexose =0;, méthyltransférase responsable de la réaction de méthylation nécessaire à la biosynthèse du mycarose (cf. figure 4). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf21c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 30).
Tableau 30 Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction rapportée significative d'accès BLAST*
GenBank EryH (Saccharopolyspora erythraea) 228448 592 Gène de biosynthèse de érythromycine =

S-adenosyl-dependent methyl AAK71270 358 Méthyltransferase transferase (Coxiella burnetii) NovU (Streptomyces spheroides) AAF67514 184 C-méthyltransférase * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990). =
Le gène orf22c code une protéine présentant une relative forte similitude avec la .
protéine codée par le gène fkbH de Streptomyces hygroscopicus var.
ascomyceticus qui code une enzyme impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl (Wu,K. et aL,2000 ; Numéro d'accès GenBank : AAF86387 ; Score BLAST: 463). La similitude de la protéine codée par le gène orf22c avec cette protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre macrolide proche suggère fortement que ce gène code également une enzyme impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl chez Streptomyces:
ambofaciens (cf. figure 8).
Le gène orf23c gode une protéine:préSentant,une,relative forte similitude ave9,4eit:
protéine codée par le gène fie de StreptomyCes..hygrèsëopicus var.
ascomyceticus ui code une acyl CoA déshydrogénase impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl (Wu,K. et al., 2000; Numéro d'accès GenBank : AAF86388 ; Score BLAST 387). La similitude de la protéine codée par le gène orf23c avec plusieurs acyl CoA
déshydrogénases impliquées dans la voie de biosynthèse d'autres antibiotiques proches suggère fortement que ce gène code une acyl CoA déshydrogénase impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl (cf. figure 8). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf23c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 31).
=

Tableau 31 Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction rapportée significative d'accès BLAST*
GenBank Acyl-CoA déshydrogénase AAK19892 171 Acyl-CoA
(Polyangium cellulosum) déshydrogénase Probable acyl-CoA dehydrogenase ¨ T36802 160 acyl-CoA
(Streptomyces coelicolor) déshydrogénase * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène orf24c code une protéine présentant une relative forte similitude avec la 5 protéine codée par le gène fiebJ de Streptomyces hygroscopicus var ascomyceticus qui coderait la protéine de liaison du groupement acyl (Acyl Carrier Protein (ACP)) impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl (Wu,K., et al., 2000; Numérc?
. d'accès genBai* :AAP8630. ;,Score BLAST 87). La similitude de la protéine '0004t par le gène olf24c avec cette protéine impliquées dans la voie de biosynthèse d'un autre 10 macrolide proche suggère fortement que ce gène code une protéine impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl chez Streptomyces ambofaciens (cf. figure 8).
Le gène orf25c code une protéine présentant une relative forte similitude avec la protéine codée par le gène fkbK de Streptomyces hygroscopicus var.
ascomyceticus qui code une acyl CoA déshydrogénase impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl 15 (Wu,K., et al., 2000 ; Numéro d'accès GenBank : AAF86390 ; score BLAST:
268). La similitude de la protéine codée par le gène orf25c avec plusieurs acyl CoA
déshydrogénases impliquées dans la voie de biosynthèse d'autres antibiotiques proches suggère fortement que ce gène code une acyl CoA déshydrogénase impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl (cf. figure 8). Cette hypothèse est étayée par le fait que 20 la protéine codée par le gène orf25c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 32).

Tableau 32 Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction rapportée significative d'accès BLAST*
GenBank Probable 3-Hydroxybutyryl-CoA P45856 177 3 -Hydroxybutyryl-Dehydrogenase (Bacillus subtilis) CoA déshydrogénase 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase AAL32270 174 3 -hydroxybutyryl-protein (Bacillus thuringiensis serovar CoA déshydrogénasé
kurstaki) 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase NP_294792 167 3-hydroxybutyryl-(Deinococcus radiodurans) CoA déshydrogénase * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
, Le gène orf26 code une protéine pres.é.41P:hi :Prie identité de 65%
(déterrninée gràcê
au programme BLAST) avec la protéine codée par le gène lylCV qui code une mycarésyf transferase impliquée dans la biosynthèse de tylosine chez Streptomyces fradiae (Bate,N.
et al., 2000; Numéro d'accès GenBank : AAD41824, Score BLAST: 471). Plus particulièrement, TylCV est une glycosyl-transférase liant la molécule de mycarose lors de la synthèse de la tylosine. Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique relativement proche et plus particulièrement dans le transfert du mycarose, suggère que le gène 01126 code une glycosyl transferase. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf26 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf.
tableau 33).

Tableau 33 Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction rapportée significative d'accès BLAST*
GenBank Glycosyl transferase (Streptomyces BAA84592 218 Glycosyl transferase avermitilis) =
Ca1G4 (Micromonospora echinospora).AAM70365 217 Glycosyl transferase Ca1G2 (Micromonospora echinospora) AAM70348 197 Glycosyl transferase * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène orf27 code une protéine présentant une identité de 70% (déterminée grâce au programme BLAST) avec la protéine codée par le gène tylC VII qui code une NDP-hexose 3,5- (ou 5-) épimerase impliquée dans la biosynthèse de tylosine chez =- e Streptomyces fradiae (Bate,N.= 'et ai.; 2000, Numéro d'accès Gen13ank :
AAD41825,1 Score BLAST: 243). Plus 'pàrtiCulièrenient, tYléVil est une hexose 3,5- (ou 54 t:!:
épimerase impliquée dans la biosynthèse du mycarose. Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique relativement proche et plus particulièrement dans la biosynthèse du mycarose, suggère que le gène orf27 code une épimérase. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf27 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 34). Une analyse des séquences proches obtenues grâce au programme BLAST suggère fortement que le gène orf27 code une épimérase responsable de la réaction d'épimérisation nécessaire à la biosynthèse du mycarose (cf. figure 4).

Tableau 34 Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction rapportée significative d'accès BLAST*
GenBank LanZ1 (Streptomyces cyanogenus) AAD13558 172 NDP-hexose 3,5-epimerase , Epi (Saccharopolyspora spinosa) AAK83288 169 TDP-4-keto-6-.
deoxyglucose 3,5 epimerase dNTP-hexose 3,5 epimerase AAC01732 166 dNTP-hexose 3,5 (Amycolatopsis mediterranei) epimerase * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
.
.
La séquence d'od28c a dans un premier temps été déterminée de manière partielle,.u, :
= ==
-= 5 puisque la séquence d'une région d'environ 450 paires de bases n'a été
déterminée.''',', qu'après reséquençage (cette région est symbolisée par des N dans la séquence incomplète SEQ ID N 106). La séquence partielle de cette ORF (SEQ ID N 111) a néanmoins été utilisée pour l'analyse avec les différents programmes informatiques comme expliqué ci-dessus. Il a ainsi pû être déterminé que le gène orf28c code une protéine présentant une identité de 64% sur la séquence déterminée (SEQ ID N
112, qui est la séquence partielle de la protéine Orf28c) (déterminée grâce au programme BLAST) avec la protéine codée par le gène acyB2 qui code une protéine régulatrice impliquée dans la biosynthèse de carbomycine chez Streptomyces thermotolerans (Arisawa,A., et al., 1993; Numéro d'accès GenBank : JC2032, Score BLAST: 329).
Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un antibiotique relativement proche suggère que le gène orf28c code une protéine régulatrice impliquée dans la biosynthèse des spiramycines. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf28c présente également une forte similitude avec la protéine Ty1R qui est une protéine régulatrice impliquée dans la biosynthèse de tylosine chez Streptomyces fradiae (Bate,N. et al., 1999;
Numéro d'accès GenBank : AAF29380, Score BLAST : 167).
Le gène orf28c a pu être amplifié grace à des oligonucléotides situés de part et d'autre de la séquence non déterminée et sous cloné dans un vecteur d'expression. Il a pu ainsi être démontré que la surexpression du gène orf28c augmente significativement la production en spiramycines de la souche OSC2 (cf. exemple 24). Ceci démontre que la surexpression de orf28c conduit à une augmentation de la production en spiramycinest.' =
et confirme son rôle en tant que régulateur de la voie de biosynthèse des spiramycines. e La séquence partielle d' orf28c a été complétée par la suite et la région manquante d'environ 450 paires de bases a été déterminée (cf. SEQ ID N 140 et SEQ ID N
141).
La séquence complète de cette ORF (SEQ ID N 141) a été utilisée pour l'analyse avec -les différents programmes informatiques comme expliqué ci-dessus. Il a ainsi pû être déterminé que le gène orf28c code une protéine présentant une identité de 69%
sur , 15 séquence déterminée (SEQ ID N 142, qui est la séquence complète de la protéM014 0rf28c) (déterminée grâce au programme BLAST) avec la protéine codée par le gèhéle acyB2 qui code une protéine régulatrice impliquée dans la biosynthèse de carbomycine chez Streptomyces thermotolerans (Arisawa,A., et al., 1993; Numéro d'accès GenBank : JC2032, Score BLAST : 451). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la régulation de la biosynthèse d'un antibiotique relativement proche suggère que le gène orf28c code une protéine régulatrice impliquée dans la biosynthèse des spiramycines. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf28c présente également une forte similitude avec la protéine Ty1R qui est une protéine régulatrice impliquée dans la régulation de la biosynthèse de tylosine chez Streptomyces fradiae (Bate,N. et al., 1999; Numéro d'accès GenBank : AAF29380, Score BLAST
:
224). Les résultats de la surexpression de ce gène (cf exemple 24) confirment son rôle en tant que régulateur de la voie de biosynthèse des spiramycines.

L'inactivation du gène orf28e a été réalisée. Il a pu ainsi être montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycines. Ceci confirme que le gène orf28c est bien impliqué dans la biosynthèse des spiramycines et est essentiel à la biosynthèse des spiramycines. Ces résultats associés aux résultats de la surexpression de ce gène (cf.
5 exemple 24) sont en accord avec un rôle d'activateur essentiel à la biosynthèse des spiramycines d' 01128 c.
Le gène orf29 code une protéine présentant une identité de 31% (déterminée grâce au programme BLAST) avec une probable glycosyl hydrolase localisée dans le groupe , de gènes impliqué dans la biosynthèse de soraphen A (un antifongique de la classe dès 10 polyketides) chez Sorangium cellulosum (Ligon,J., et al., 2002 ;
Numéro d'accès GenBank : AAK19890, Score BLAST: 139). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'une molécule relativement proche suggère que le gène orf29 code une protéine ayant une activité glycosyl hydrolase. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf29 présente une forte similitude 15 avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 35). .;
Ygn.
Une analyse de la séquence de la protéine codée par orf29 grâce au Programme CD,4A,1 . , search (cf. ci-dessus) suggère également que le gène orf29 code une glycosyl hydrolase Tableau 35 Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction rapportée significative d'accès BLAST*
GenBank ManA (Caldicellulosiruptor AAC44232 136 beta-1,4-mannanase saccharolyticus) ManA (Dictyoglomus thermophilum) AAB82454 129 beta-mannanase * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé
20 (Altschul et al., 1990).
L'analyse de la séquence protéique déduite de Porf29 par le programme SignalP
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) (Nielsen,H., et al., 1997) montre que cette protéine possède une séquence signal C-terminale avec un site de coupure prédit entre les positions 30 et 31 (QSA/QA). On peut prédire que cette protéine est extra-cellulaire.
Elle pourrait, en temps que glycosyl-hydrolase, avoir un rôle dans la réactivation de la spiramycine inactivé par glycosylation par les glycosyl-transferases GimA
et/ou GimB
(Gourmelen et al, 1998).
Le gène co:f30c code une protéine présentant une identité de 31% (déterminée grâce au programme BLAST) avec une épimérase de sucre-nucléoside-diphosphate de Cotynebacterium glutamicum (Numéro d'accès GenBank : NP_600590, Score BLAST
89). Cette similitude suggère que le gène orf30c code une épimérase. Cette hypothèse est étayée par le fait qu'une analyse de la séquences grâce au programme CD-search (cf. ci-dessus) suggère également que le gène orf30c code une épimérase.
L'orf30c présente deux codons d'initiations possibles (cf. SEQ ID N 115) qui donnent deux protéines possibles de 345 et 282 acides aminés respectivement (SEQ
N 116 et 117). Toutefois, l'usage des codons est typique de Streptomyces seulement à
; 15 partir du deuxième ATG de plus, la séquence protéique déduite de la séquence entre le . õ õ
' premier ATG et le deuxième ne s'aligne pitâ avec les séquences proches identifiées,,.
=
alors que la séquence protéique la plus courte (à partir du 2ème ATG: SEQ ID N
144) s'aligne bien avec le début de ces protéines. On peut donc en déduire que le deuxième ATG est le bon codon d'initiation et que la séquence de cet off est donc celui présenté
en SEQ ID N 143 qui une fois traduit corespond à la protéine de séquence SEQ
ID N
144.
Le gène orf31 code une protéine présentant une identité de 52% (déterminée grâce au programme BLAST) avec une oxidoreductase chez Streptomyces coelicolor (Numéro d'accès GenBank : NP 631148, Score BLAST: 261). Cette similitude suggère que le gène orf31 code une réductase. Cette hypothèse est étayée par le fait qu'une analyse de la séquences grâce au programme CD-search (cf. ci-dessus) suggère également que le gène orf31 code une réductase. Cette hypothèse est également étayée par le fait que la =

protéine codée par le gène orf31 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 36).
Tableau 36 Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction rapportée significative d'accès BLAST*
GenBank Putative oxidoreductase (Streptomyces BAB79295 173 Oxidoreductase griseus) =
MocA (Xanthomonas axonopodis) NP 640644 171 Oxidoreductase * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé
(Altschul et al., 1990).
L'inactivation du gène orf31 a été réalisée. Il a pu ainsi être montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycines. Ceci confirme que le gène orf31 est bien:.
impliqué dans la biosynthèse des spirarnycines. L'enzyme codée par ce gène est. don6,:.;
=
bien responsable d'une étape de bioconversion essentielle à la biosynthèse des '4 =
spiramycines.
La séquence d'or:02c a tout d'abord été déterminée de manière partielle (cf.
exemple 19), puisque la séquence codante en 5' n'a été déterminée que dans un second temps. La séquence partielle de cette orf (SEQ ID N 120) a néanmoins été
utilisée pour l'analyse avec les différents programmes informatiques comme expliqué ci-dessus. Il a ainsi pû être déterminé que le gène orf32c code une protéine présentant une identité de 47% sur la séquence déterminée (SEQ ID N 121, qui est la séquence partielle de la protéine Orf32c) (déterminée grâce au programme BLAST) avec une protéine régulatrice de la famille GntR chez Streptomyces coelicolor (Numéro d'accès GenBank :
NP 625576, Score BLAST: 229). Cette similitude suggère que le gène orf32c code un régulateur transcriptionel de la famille GntR. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf32c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes.
La séquence partielle d' orf32c a été complétée par la suite et la région manquante a été déterminée (cf. SEQ ID N 140 et SEQ ID N 145). La séquence complète de cette orf code une protéine présentant une identité de 44% (déterminée grâce au programme BLAST) avec une protéine régulatrice de la famille GntR chez Streptomyces avermitilis (Numéro d'accès GenBank : NP 824604, Score BLAST: 282). Cette similitude suggère que le gène orf32c code un régulateur transcriptionel de la famille GntR.
Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf32c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 37).
Tableau 37 Protéine présentant une similitude Numéro Score Fonction rapportée significative d'accès BLAST*
GenBank tµ;
Protéine régulatrice de la famille GntR Np-e8:241: 276 Protéine régulatrice., = =
(Streptomyces avermitilis) de la famille GntR
Protéine régulatrice de la famille GntR NP 625576 266 Protéine régulatrice Streptomyces coelicolor) de la famille GntR
SC5G8 .04 (Streptomyces coelicolor) NP_628991 258 Protéine régulatrice de la famille GntR
transcriptional regulator (Streptomyces AAF01064 224 Régulateur venezuelae) transcriptionel Protéine régulatrice de la famille GntR NP_827432 239 Protéine régulatrice (Streptomyces avermitilis) de la famille GntR

* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé
(Altschul et al., 1990).
L'inactivation du gène orf32c a été réalisée dans le but d'étudier la fonction de ce gène dans la voie de biosynthèse des spiramycines chez Streptomyces ambofaciens. Il a pu être montré que la souche résultante produit des spiramycines. Ceci indique que le gène orf32 n'est pas essentiel à la biosynthèse des spiramycines et qu'il n'est pas essentiel à la survie de la bactérie.
Le gène orf33 code une protéine présentant une identité de 49% (déterminée grâce au programme BLAST) avec une protéine hypothétique de Xanthomonas campestris (Numéro d'accès GenBank : NP 635564, Score BLAST : 54).
La séquence d'orf34c est partielle. En effet, les comparaisons effectuées entre le produit de cette orf et les banques de données suggèrent que la partie C-terminale cette protéine n'est pas dans le produit déduit de la séquence nucléotidique et donc que =
=
cette orf serait plus longue et continuerait en dehors de la région séquencée.
La séquence partielle de cette ORF a néanmoins été utilisée pour l'ealyse avec les différents ; = programmes informatiques comme expliqué ci-dessus. Il a ainsi pû
être déterminé que le gène orf34c code une protéine présentant une identité de 91% sur la séquence déterminée (SEQ ID N 150, qui est la séquence partielle de la protéine Orf34c) (déterminée grâce au programme BLAST) avec une arabinofuranosidase de chez Streptomyces coelicolor (Bentley et al., 2002; Numéro d'accès GenBank : NP
630049, Score BLAST: 654). Chez S. coelicolor le gène codant cette arabinofuranosidase ne semble pas impliqué dans la biosynthèse de métabolite secondaire. Chez S.
ambofaciens, ce gène n'est donc probablement pas impliqué dans la biosynthèse de spiramycine.
La présente invention a également pour objet des polynucléotides s'hybridant dans des conditions d'hybridation de forte stringence à au moins l'un des polynucléotides de séquence SEQ ID N 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 et 149, ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
Préférentiellement, cesdit polynucléotides sont isolés à partir d'une bactérie du genre Streptomyces, plus préférentiellement, ces polynucléotides codent des protéines impliquées dans la biosynthèse d'un macrolide et encore plus préférentiellement, ces 5 polynucléotides codent une protéine ayant une activité similaire à la protéine codée par les polynucléotides avec lesquels ils s'hybrident. Les conditions d'hybridation de forte stringence peuvent être définies comme des conditions d'hybridation défavorisant l'hybridation de brins d'acides nucléiques non homologues. Des conditions d'hybridations de forte stingence peuvent être par exemple décrites comme des =
10 conditions d'hybridation dans le tampon décrit par Church & Gilbert (Church &
Gilbert, 1984) à une température comprise entre 55 C et 65 C, de manière préférée la température d'hyridation est de 55 C, de manière encore plus préférée la températue d'hybiidation est de 60 C et de manière tout à fait préférée la température d'hybridation' est de 65 C, suivi d'un ou plusieurs lavages effectué en tampon 2X SSC à une 15 température comprise entre 55 C et 65 C, de manière préférée cette température est de 55 C, de manière encore plus préférée cette températue est de 60 C et de manière tout àq fait préférée cette température est de 65 C, suivi d'uri,beplusieirs lavages en tampon =
0.5X SSC à une température comprise entre 55 C ét 65 C, de manière préférée cette température est de 55 C, de manière encore plus préférée cette températue est de 60 C
20 et de manière tout à fait préférée cette température est de 65 C. Les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon des techniques connues de l'homme du métier. Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'ouvrage de F.Ausubel et al., 25 2002.
L'invention concerne également un polynucléotide ayant au moins 70%, de façon plus préférée 80%, de façon plus préférée 85%, de façon encore plus préférée 90%, de façon encore plus préférée 95% et de manière tout à fait préférée 98%
d'identité en nucléotides avec un polynucléotide comprenant au moins 10, 12, 15, 18, 20 à
25, 30, 30 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850 ou 1900 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID N
3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 et 149, ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique, ou un polynucléotide de séquence complémentaire. Préférentiellement, ces dits polynucléotides sont isolés à
partir d'une bactérie du genre Streptomyces, plus préférentiellement, ces polynucléotides codent des protéines impliquées dans la biosynthèse d'un macrolide et encore plus préférentiellement, ces polynucléotides codent des protéines ayant des activités similaires aux protéines codées par les polynucléotides avec lesquels ils présentent l'identité. De façon tout à fait préférée, un polynucléotide selon l'invention est choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID N 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, =..
76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 et 149, ou tel; 4.e polynucléotide de séquence conipléineritaire.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus, par exemple ceux du package FASTA (Pearson W. R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990), accessible notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France. A titre d'illustration, le pourcentage d'identité de séquence pourra être determiné à
l'aide du logiciel LFASTA (Chao K.-M. et al., 1992) ou LALIGN (Huang X. et Miller W., 1991). Les programmes LFASTA et LALIGN font partie du package FASTA. LALIGN
retourne les alignements locaux optimaux : ce programme est plus rigoureux, mais aussi plus lent que LFASTA.
Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide résultant de l'expression d'une séquence d'acide nucléique telle que définie ci-dessus.
Préferentiellement, les polypeptides selon l'invention présentent au moins 70%, de façon plus préférée 80%, de façon plus préférée 85%, de façon encore plus préférée 90%, de façon encore plus préférée 95% et de manière tout à fait préférée 98% d'identité en acides aminés avec un polypeptide comprenant au moins 10, 15, 20, 30 à 40, 50, 60, 70, 80, 90,100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620 ou 640 acides aminés consécutifs d'un polypeptide d. choisi parmi SEQ ID N 4, 6,8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 35, = 37, 38, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 108, 110, 112, 114, 116, 117, 119, 121, 142, 144, 146, 148 et 150, ou l'une de ces séquences excepté que tout au long de ladite séquence un ou i'qr;i plusieurs acides aminés ont été substitués, insérés ou délétés sans en affecter les propriétés fonctionnelles ou l'un des variant de ces séquences.
Préferentiellement les polypeptides selon l'invention sont exprimés à l'état naturel par une bactérie du genre Streptomyces, plus préférentiellement, ces polypeptides sont impliqués dans .1a, biosynthèse d'un macrolide et encore plus préférentiellement, ces polypeptides ont unéi.
activité similaire à celle du polypeptide avec lequel il partage l'identité.
De faç4,:.:!Z
préférée, un polypeptide selon l'invention est choisi dans le groupe constituè*1 séquences polypeptidiques SEQ ID N 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, :4 31, 32, 33, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, r.
65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 108, 110, 112, 114, 116, 117, 119, 121, 142, 144, 146, 148 et 150, ou l'une de ces séquences excepté que tout au long de ladite séquence un ou plusieurs acides aminés ont été substitués, insérés ou délétés sans en affecter les propriétés fonctionnelles ou l'un des variant de ces séquences.
De façon tout à fait préférée, un polypeptide selon l'invention est choisi dans le groupe constitué des séquences polypeptidiques SEQ ID N 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 108, 110, 112, 114, 116, 117, 119, 121, 142, 144, 146, 148 et 150.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus, par exemple ceux du package FASTA (Pearson W. R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990), accessible notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France. A titre d'illustration, le pourcentage d'identité de séquence pourra être determiné à
l'aide du logiciel LFASTA (Chao K.-M. et al., 1992) ou LALIGN (Huang X. et Miller W., 1991), en utilisant les paramètres par défaut tel que défini par le centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France. Les programmes LFASTA et LALIGN font partie du package FASTA. LALIGN retourne les alignements locaux optimaux : ce programme est plus rigoureux, mais aussi plus lent que LFASTA.
Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant comprenant au moins un polynucléotide tel que décrit ci-dessus. Préférentiellement ; cet ADN
recombinant est un vecteur. Encore plus préférentiellement, le vecteur est choisi parmi les bactériophages, les plasmides, les phagemides, les vecteurs intégratifs, les fosmides, , les cosmides, les vecteurs navettes, les BAC (Bacterial Artificial Chromosome) ou les PAC (P1-derived Artificial Chromosome). A titre illustratif on peut citer comme bactériophages le phage lambda et le phage M13. Comme plasmides on peut citer les , . , plasmides se répliquant chez E coli par exemple pl3R322 et ses dérivés, pUC18 et sese n = dérivés, pijC19 et ses dérivés, pGÉ2 et ses dérivés (Churchward G.
et al., 1984)1,e..7.1 pACYC177 (numéro d'accès GenBank : X06402) et ses dérivés, pACYC184 (numéro d'accès GenBank : X06403) et ses dérivés. On peut également citer les plasmides se répliquant chez Streptomyces comme par exemple pIJ101 et ses dérivés, pSG5 et ses dérivés, SLP1 et ses dérivés, SCP2* et ses dérivés (Kieser et al. 2000). Comme phagemides on peut citer à titre illustratif pBluescript II et ses dérivés (commercialisés notamment par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA)), pGEM-T et ses dérivés (commercialisé par la société Promega (Madison, Wisconcin, USA)), 1ZAPII et ses dérivés (commercialisés notamment par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA)). Comme vecteurs intégratifs on peut citer à titre illustratif, les vecteurs intégratifs chez Streptomyces comme par exemple ceux dérivés de SLP1 (Kieser et al, 2000), ceux dérivés de pSAM2 (Kieser et al, 2000), les vecteurs utilisant les systèmes d'intégration des phages PhiC31 (Kieser et al, 2000) (par exemple pSET152 (Bierman et al., 1992)) ou de VWB (Van Mellaert L, et al. 1998), ainsi que les vecteurs utilisant le système d'intégration de IS117 (Kieser et al. 2000). Comme fosmides on peut citer à
titre illustratif le fosmide pF0S1 (commercialisé par la société New England Bioloabs Inc., Beverly, Massachussetts, USA) et ses dérivés. Comme cosmides on peut citer à
titre illustratif le cosmide SuperCos et ses dérivés (commercialisés notamment par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA)), le cosmide pWED15 (Wahl et al., 1987) et ses dérivés. Comme vecteurs navettes on peut citer à titre illustratif les plasmides navettes E.. cou i I Streptomyces comme par exemple pIJ903 et ses dérivés, la série des plasmides pUWL, pCA0106, pWHM3, p0J446 et leurs dérivés (Kieser et al. 2000), les BAC navettes E. cou i I Streptomyces comme par exemple ceux décrits dans la demande de brevet WO 01/40497. Comme BAC (Bacterial Artificial Chromosome) on peut citer à titre illustratif le BAC pBe1oBAC11 (numéro d'accès GenBank :U51113). Comme PAC (P1 -derived Artificial Chromosome) on peut citer à titre illustratif le vecteur , pCYPAC6 (numéro d'accès GenBank : AF133437). De façon tout à fait préférée, un ;:.
vecteur selon l'invention est choisi parmi pOS49.1, pOS49.11, pOSC49.12, pOS49.14, , , 15 pOS49.16, pOS49.28, pOS44.1, pOS44.2, pOS44.4, pSPM5, pSPM7, pOS49.67, --e pOS49.88, pOS49.106, pOS49.120, pffl9.107, p0S493 2, pOS49A3, pOS49 44, pOà49:50, iifà$49.99, pSPM17, P$PM21 PeM502, 'f;SPM504, pSPM507, pSPM508; ,1 pSPM509, pSPM1, pBXL1111, pBXL1112, pBXL1113, pSPM520, pSPM521, -pSPM522, pSPM523, pSPM524, pSPM525, pSPM527, pSPM528, pSPM34, pSPM35, pSPM36, pSPM37, pSPM38, pSPM39, pSPM40, pSPM41, pSPM42, pSPM43, pSPM44, pSPM45, pSPM47, pSPM48, pSPM50, pSPM51, pSPM52, pSPM53, pSPM55, pSPM56, pSPM58, pSPM72, pSPM73, pSPM515, pSPM519, pSPM74, pSPM75, pSPM79, pSPM83, pSPM107, pSPM543 et pSPM106.
Un autre aspect de l'invention concerne un système d'expression comprenant un vecteur d'expression approprié et une cellule hôte permettant l'expression d'un ou plusieurs polypeptides tels que décrits ci-dessus dans un système biologique.
Les vecteurs d'expression selon l'invention comprennent une séquence d'acide nucléique codant un ou plusieurs polypeptides tels que décrits ci-dessus et peuvent être destinés à
l'expression des différents polypeptides selon l'invention dans diverses cellules hôtes bien connues de l'homme du métier. A titre d'exemple, on peut citer les systèmes d'expression procaryote comme les systèmes d'expression chez la bactérie E.
cou, les sytèmes d'expression eucaryotes, comme le système d'expression baculovirus permettant une expression dans des cellules d'insectes, les sytèmes d'expression permettant une expression dans des cellules de levures, les sytèmes d'expression 5 permettant une expression dans des cellules de mammifères, notamment des cellules humaines. Les vecteurs d'expression utilisables dans de tels systèmes sont bien connus de l'homme du métier, en ce qui concerne les cellules procaryotes, on peut citer à titre illustratif les vecteurs d'expression chez E. cou i par exemple, de la famille pET
commercialisés par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA), les vecteurs de la .;
10 famille GATEWAY commercialisés par la société Invitrogen (Carlsbad, Californie, USA), les vecteurs de la famille pBAD commercialisés par la société Invitrogen (Carlsbad, Californie, USA), les vecteurs de la famille pMAL commercialisés par la société New England Bioloabs Inc. (Beverly, Massachussetts, USA), les vecteurs d'expression inductibles par le rhamnose cités dans la publication Wilms B et al., 2001 15 et leurs dérivés, on peut également citer les vecteurs d'expression chez Streptomyces comme par exemple les vecteurs pll4123, 0-6021, pPM927, pANT849, pANT
pANT 851, pA11T1200, pANT1201, pANT1202 et leurs dérives (Kieser et al., 2000). , En ce qui concerne les cellules de levures, on peut citer à titre illustratif le vecteur pESC
commercialisé par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA). En ce qui concerne 20 le système d'expression baculovirus permettant une expression dans des cellules d'insectes on peut citer à titre illustratif le vecteur BacPAK6 commercialisé
par la société BD Biosciences Clontech, (Palo Alto, Californie, USA). En ce qui concerne les cellules de mammifères, on peut citer à titre illustratif des vecteurs comprenant le promoteur des gènes précoces du virus CMV (Cytomegalovirus) (par exemple le 25 vecteur pCMV et ses dérivés commercialisés par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA), ou le promoteur des gènes immédiats (SV40 early promoter) du virus simien vacuolisant SV40 (par exemple le vecteur pSG5 commercialisé par la société
Stratagene (LaJolla, Californie, USA).
L'invention est également relative à un procédé de production d'un polypeptide 30 tel que décrit ci-dessus ledit procédé comprenant les étapes suivantes:

a) insérer un acide nucléique codant ledit polypeptide dans un vecteur approprié
b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, une cellule hôte préalablement transformée ou transfectée avec le vecteur de l'étape a) ;
e) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, par exemple par sonication ou par choc osmotique ; =
d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape c), ledit polypeptide ;
e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.
Un polypeptide recombinant selon l'invention peut être purifié par passage sur une série appropriée de colonnes de chromatographie, selon les méthodes connues de l'homme de l'art et décrites par exemple dans F.Ausubel et al (2002). On peut citer à
titre illustratif la technique du Tag-Histidine , qui consiste à ajouter une courte =.,;v:;;
à.
. , séquence poly-histidine au polypeptide à produire, ce dernier pouvant ensuite êtreige purifié sur colonne de nickel. Un polypeptide selon l'invention peut être également préparé par les techniques de synthèse in vitro. A titre illustratif de telles techniques, un polypeptide selon l'invention pourra être préparé grâce au système rapid translation system (RTS) , commercialisé notamment par la société Roche Diagnostics France S.A, Meylan, France.
Un autre aspect de l'invention concerne des cellules hôtes dans laquelle a été
introduit au moins un polynucléotide et/ou au moins un ADN recombinant et/ou au moins un vecteur d'expression selon l'invention.
Un autre aspect de l'invention concerne des microorganismes bloqués dans une étape de la voie de biosynthèse d'au moins un macrolide. L'intérêt réside d'une part dans l'étude de la fonction des protéines mutées et d'autre part dans la réalisation de microorganismes produisant des intermédiaires de biosynthèse. Ces intermédiaires peuvent être modifiés, éventuellement après séparation, soit par ajout de composants particuliers dans les milieux de production, soit par introduction dans les microorganismes ainsi mutés d'autres gènes codant des protéines susceptibles de modifier l'intermédiaire en s'en servant comme substrat. Ces intermédiaires peuvent ainsi être modifiés par voie chimique, biochimique, enzymatique et/ou microbiologique.
Les microorganismes bloqués dans une étape de la voie de biosynthèse de macrolides peuvent être obtenus en inactivant la fonction d'une ou plusieurs protéines impliquées dans la biosynthèse de ce ou de ces macrolides dans des microorganismes producteurs de ce ou de ces macrolide. Selon la ou les protéines inactivées, on pourra ainsi obtenir des microorganismes bloqués dans les différentes étapes de la voie de biosynthèse de ce ou de ces macrolides. L'inactivation de cette ou de ces protéines peut être effectuée par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par mutagenèse dans le ou les gènes codant ladite ou lesdites protéines ou par l'expression d'un ou de plusieurs , ARN anti-sens complémentaires de l'ARN ou des ARN messagers codant ladite ou lesdites protéines. La mutagenèse peut, par exemple, être effectuée par irradiation, par action d'agent chimique mutagène, par mutagenèse dirigée, par remplacement de gènelai\,:.
t'At !.
; 4 ou toute autre méthode connue. l'homme du, Métier._ Les conditions convenables ei d'une telle mutagénèse peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans les ouvrages de Kieser, T et al (2000) et Ausubel et al., (2002). La mutagenèse peut être effectuée in vitro ou in situ, par suppression, substitution, délétion et/ou addition d'une ou plusieurs bases dans le gène considéré ou par inactivation génique.
Cette mutagénèse peut être effectuée dans un gène comprenant une séquence telle que décrite ci-dessus. Préférentiellement, les microorganismes bloqués dans une étape de la voie de biosynthèse de macrolides sont des bactéries du genre Streptomyces.
Plus préférentiellement, l'inactivation de la fonction d'une ou plusieurs protéines impliquées dans la biosynthèse du ou des macrolides en question est effectuée par mutagénèse.
Encore plus préférentiellement, le macrolide en question est la spiramycine et les microorganismes dans lesquels sont effectuées la ou les mutagénèses sont des souches de S. ambofaciens. Plus préférentiellement, la mutagénèse est effectuée dans un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 et 149. De façon préférée, la ou les mutagénèses sont effectuées par inactivation génique. De façon tout à fait préférée, la mutagénèse consiste en l'inactivation génique d'un gène comprenant une séquence correspondant à la séquence SEQ ID N 13.
A titre illustratif, les microorganismes suivants peuventêtre cités à titre d'exemple de tels microorganismes : 0S49.16 (orf3:; ..Qhyg, cf. exemple 2), 0S49.67 (orf3délétion en phase, cf exemple 6), 0S49.107 (orf8;: 12hyg, cf. exemple 7), 0S49.50 (orf10:: .0,hyg, cf. exemple 8), SPM21 (orf2::att3.(2aac-, cf. exemple 10), (orf2::att3 délétion en phase, cf. exemple 10), SPM501 (orf6*::attl.Qhyg+, cf.
exemple 14), SPM502 (orf6*::attl délétion en phase, cf. exemple 14), SPM507 .
(orf12::att3f2aac-, cf. exemple 11), SPM508 (orfl3c::att3flaac-, cf. exemple 12), SPM509 (orf14::att3.C2aac-, cf. exemple 13), SPM107 (orf28c::att3aac+, cf.
exemple =
29), SPM543 (orfil::att3aac+, cf. exemple 30), SPM106 (oif32c::att3aac+, !
, .
4, e,ît exemple 31).
Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation d'un intermédiaire de biosynthèse de macrolide utilisant les microorganismes bloqués dans une étape de la voie de biosynthèse de macrolides, tels que décrits ci-dessus.
Le procédé
consiste à cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme bloqué dans une étape de la voie de biosynthèse de macrolides, tels que décrits ci-dessus, récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, par exemple par sonication ou par choc osmotique, séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape précédente, ledit intermédiaire de biosynthèse.
Les conditions de culture de tels microorganismes pourront être déterminées selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Le milieu de culture pourra par exemple être le milieu MP5 ou le milieu SL11 pour les Streptomyces et notamment pour Streptomyces ambofaciens (Pernodet et al., 1993). L'homme du métier pourra notamment se référer à l'ouvrage de Kieser et al. (2000) en ce qui concerne la culture des Streptomyces. L'intermédiaire produit peut être récupéré par toutes techniques connues de l'homme du métier. L'homme du métier pourra se référer, par exemple, aux techniques enseignées dans le brevet américain US 3,000,785 et plus particulièrement aux méthodes d'extraction des spiramycines décrites dans ce brevet.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'une molécule dérivée d'un macrolide utilisant les microorganismes bloqués dans une étape de la voie de biosynthèse de ce macrolide, tels que décrits ci-dessus. Le procédé
consiste à obtenir un intermédiaire de biosynthèse selon le procédé ci-dessus et à modifier l'intermédiaire ainsi produit, éventuellement après séparation du milieu de culture. Les conditions de ' culture de tels microorganismes pourront être déterminées selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Le milieu de culture pourra par exemple être le milieu MP5 ou le milieu SL11 pour les Streptomyces et notamment pour Streptomyces ambofaciens (Pernodet et al., 1993). L'homme du métier pourra notamment se référer à
l'ouvrage de Kieser et al. 2000 en ce qui concerne la culture des Streptomyces. Les intermédiaires produits peuvent être modifiés, éventuellement après séparation, soit par ajout de composants appropriés dans les milieux de production, soit par introduction .
dans les microorganismes d'autres gènes codant des protéines susceptibles de modifier l'intermédiaire en s'en servant comme substrat. Ces intermédiaires peuvent ainsi être modifiés par voie chimique, biochimique, enzymatique et/ou microbiologique.
Plus préférentiellement, le macrolide en question est la spiramycine et les microorganismes dans lesquels sont effectuées la ou les mutagénèses sont des souches de S.
ambofaciens.
L'invention est également relative à un microorganisme produisant de la spiramycine I mais ne produisant pas de spiramycine II et III. Ce microorganisme comprend l'ensemble des gènes nécessaires à la biosynthèse de la spiramycine I
mais ne produit pas de spiramycine II et III car le gène comprenant la séquence correspondant à
SEQ ID N 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID N 14 ou l'un de ses variants n'est pas exprimé ou a été rendu inactif.

L'inactivation de cette protéine peut être effectuée par toute méthode comme de l'homme du métier, par exemple par mutagénèse dans le gène codant ladite protéine ou par l'expression d'un ARN anti-sens complémentaire de l'ARN messager codant ladite protéine, étant entendu que si l'expression de orf5* est affectée par cette manipulation, il sera nécessaire de procéder à une autre modification pour que le gène orf5*
soit 5 correctement exprimé. La mutagénèse peut être effectuée dans la séquence codante ou dans une séquence non codante de manière à rendre inactive la protéine eodée ou à en empêcher son expression ou sa traduction. La mutagénèse peut être effectuée par mutagénèse dirigée, par remplacement de gène ou toute autre méthode connue de l'homme du métier. Les conditions convenables d'une telle mutagénèse peuvent par 10 exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans les ouvrages de ICieser, T et al (2000) et Ausubel et al., 2002. La mutagénèse peut être effectuée in vitro ou in situ, par suppression, substitution, délétion et/ou addition d'une ou plusieurs bases dans le gène considéré ou par inactivation génique. Le microorganisme peut être également obtenu en exprimant les gènes de la ,voie de biosynthèse de la spiramycine sans que 15 ceux-ci ne comprennent le gène comprenant la séquence SEQ ID N 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du' =:*
code géne'tique et codant un .polypeptide de séquence SEQµ ID N 14 ou l'un de sé:ate variants. Préférentiellement, le microorganisme est une bactérie du genre Streptomyces.
Plus préférentiellement, le microorganisme produisant de la spiramycine I mais ne 20 produisant pas de spiramycine II et III est obtenu à partir d'un microorganisme de départ produisant les spiramycines I, II et III. Encore plus préférentiellement, le microorganisme est obtenu par mutagénèse dans un gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide 25 de séquence SEQ ID N 14 ou l'un de ses variants ayant la même fonction.
Encore plus préférentiellement, cette mutagénèse est effectuée par inactivation génique.
De manière préférée le microorganisme est obtenu à partir d'une souche de S. ambofaciens produisant les spiramycines I, II et III dans laquelle est effectuée une inactivation génique du gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N 13 ou l'une des 30 séquences dérivées de celle-ci en raison de la dégénérescence du code génétique. De manière tout à fait préférée, l'inactivation génique est effectuée par délétion en phase du gène ou d'une partie du gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N
13 ou l'une des séquences dérivées de celle-ci en raison de la dégénérescence du code génétique. A titre illustratif, la souche SPM502 (orf6*::attl, cf. exemple 14) peut être citée comme un microorganisme produisant de la spiramycine I mais ne produisant pas de spiramycine II et III.
L'invention est également relative à un microorganisme produisant = de la spiramycine I mais ne produisant pas de spiramycine II et III tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce en ce qu'il surexprime en outre :
- un gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymérase en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N 138) et 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens, plus , préférentiellement il s'agit du gène de séquence codante SEQ ID N 141, .5=1i ;e , ¨ ou un gène dérivé de ceux-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
, Un exemple de séquence d'un tel gène est donné en SEQ ID N 111 (ADN), cependant cette séquence est partielle puisqu'elle ne comprend pas la partie 3' de la séquence codante correspondante. La traduction en protéine de cette partie de séquence codante est donnée en SEQ ID N 112. L'homme du métier pourra aisément la compléter notamment en utilisant l'enseignement présenté dans l'exemple 24. La séquence indéterminée dans SEQ ID N 111 a été déterminée dans un second temps et la séquence complète de cette orf (orf28c) est donnée en SEQ ID N 141. La traduction en protéine de cette séquence codante est donnée en SEQ ID N 142. Il est présenté dans l'exemple 24 une méthode pour cloner le gène orf28c et pour fabriquer un vecteur d'expression permettant l'expression de orf28c. Il est également montré dans cet exemple que la surexpression du gène orf28c dans la souche OSC2 conduit à l'amélioration de la production en spiramycines de cette souche. La surexpression du gène orf28c peut être obtenue en augmentant le nombre de copies de ce gène et/ou en plaçant un promoteur plus actif que le promoteur sauvage. De façon préférée, la surexpression dudit gène est obtenue en apportant dans le microorganisme une construction d'ADN
recombinant, permettant la surexpression de ce gène. De façon préférée, cette construction d'ADN
recombinant augmente le nombre de copie dudit gène et permet d'obtenir une surexpression dudit gène. Dans cette construction d'ADN recombinant, la séquence codante du gène peut être placée sous le contrôle d'un promoteur plus actif que 14e promoteur sauvage. On peut citer à titre d'illustration le promoteur ptrc actif chez Streptomyces ambofaciens (Amann, E. et al., 1988) ainsi que le promoteur ermE*.
Ainsi, de façon préférée, la ou les copies du gène orf28c apportée sont placées sous le .
contrôle du promoteur ermE* comme c'est le cas dans la construction pSPM75 (cf.
exemple 24).
L'invention est également relative à un microorganisme produisant de la spiramycine I mais ne produisant pas de spiramycine II et HI tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce en ce qu'il surexpiime en outre le gène de séquence codante SEQ ID
N 47 ou d'une séquence codante dérivée de celle-ci en raison de la dégénérescence du.*
'.µ code génétique. Préférentiellement, ce microorganisme est caractérisé
en ce qu'il s'agit::,'2!
de la souche SPM502 pSPM525 déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 26 février 2003 sous le numéro d'enregistrement 1-2977.
L'invention est également relative à un procédé de production de spiramycine I, le procédé consiste à cultiver dans un milieu de culture approprié un microorganisme produisant de la spiramycine I mais ne produisant pas de spiramycine II et III
tel que décrit ci-dessus, récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape précédente la spiramycine I. Les conditions de culture de tel microorganisme pourront être déterminées selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Le milieu de culture pourra par exemple être le milieu MP5 ou le milieu SL11 pour les Streptomyces et notamment pour Streptomyces ambofaciens (Pernodet et al., 1993). L'homme du métier pourra notamment se référer à
l'ouvrage de

88 Kieser et al. 2000 en ce qui concerne la culture des Streptomyces. La spiramycine I
produite peut être récupérée par toutes techniques connues de l'homme du métier.
L'homme du métier pourra se référer, par exemple, aux techniques enseignées dans le brevet américain US 3,000,785 et plus particulièrement aux méthodes d'extraction des spiramycines décrites dans ce brevet.
Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation d'une séquence nucléotidique selon l'invention pour améliorer la production en macrolides d'un microorganisme.
Ainsi, l'invention concerne un microorganisme mutant producteur de macrolide :

caractérisé en ce qu'il possède une modification génétique dans au moins un gène comprenant une séquence telle que définie ci-dessus et/ou qu'elle surexpiime au moins un gène comprenant une séquence telle que définie ci-dessus. La modification génétique peut consister en une suppression, une substitution, une délétion et/ou une addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés dans le but d'exprimer une ou des protéines ayant une activité supérieure ou d'exprimer un niveau plus élevé de cette ou lzk ces protéines. La surexpression du gène considéré peut être obtenue en augmentant , , r = =
nombre de copies de ce gène et/ou en plaçant un promoteur plus actif que le prottiçtent:51 sauvage. On peut citer à titre d'illustration le promoteur ptrc actif chez Streptomycesieb ambofaciens (Amann, E. et al., 1988) ainsi que le promoteur ermE* (Bibb et al., 1985), (Bibb et al., 1994). Ainsi la surexpression du gène considéré peut être obtenue en apportant dans un microorganisme producteur du macrolide considéré une construction d'ADN recombinant selon l'invention, permettant la surexpression de ce gène.
En effet, certaines étapes de la biosynthèse des macrolides sont limitantes et si l'on exprime une ou plusieurs protéines plus actives ou un niveau d'expression plus important de la ou des protéines sauvages impliquées dans ces étapes limitantes, on peut améliorer la production du ou des macrolides concernés. Une augmentation du taux de production de la tylosine a par exemple été obtenue chez Streptomyces fradiae par duplication du gène codant une methyl transférase limitante convertissant la macrocine en tylosine (Baltz R, 1997). L'obtention de l'expression d'une protéine plus active peut être obtenue notamment par mutagénèse, l'homme du métier pourra par exemple se référer à ce sujet à l'ouvrage de F.Ausubel et al (2002). Préférentiellement, ces microorganismes mutants

89 PCT/FR2003/002962 améliorés pour leur production en macrolides sont des bactéries du genre Streptomyces.
Plus préférentiellement, le macrolide en question est la spiramycine et les microorganismes dans lesquels sont effectuées la ou les mutagénèses sont des souches de S. ambofaciens. Plus préférentiellement, la modification génétique est effectuée dans un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40,43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 et 149, ou l'un de ses variants ou l'une des séquences:
dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique. De façon préférée, le microorganisme surexprime un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ D N 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 et 149, ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la = -.-dégénérescence du code génétique. De façon préférée, le microorganisme surexprime 1e7 gène comprenant une séquence correspondant à SEQ ID N 111 ou 141, ou l'un de ses = =
= = .à;
e:,!: t; = variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescenceli ,L) .1' code génétique. La séquence donnée en SEQ II) N 111 est partielle, cependant l'homme du métier pourra aisément la compléter notamment en utilisant l'enseignement présenté dans l'exemple 24. La séquence indéterminée dans SEQ ID N 111 a été
déterminée dans un second temps et la séquence complète de cette orf (orf28c) est donnée en SEQ ID N 141. La traduction en protéine de cette séquence codante est donnée en SEQ ID N 142. Il est ainsi présenté l'exemple 24 une méthode pour cloner le gène orf28c et pour fabriquer un vecteur d'expression permettant l'expression de orf28c.
fi est également montré dans cet exemple que la surexpression du gène orf28c dans la souche OSC2 conduit à l'amélioration de la production en spiramycines de cette souche.
La surexpression du gène orf28c peut être obtenue en augmentant le nombre de copies de ce gène et/ou en plaçant un promoteur plus actif que le promoteur sauvage.
De façon préférée, la surexpression du gène orf28c est obtenue en apportant dans le microorganisme une construction d'ADN recombinant, permettant la surexpression de ce gène. De façon préférée, cette construction d'ADN recombinant augmente le nombre de copie du gène orf28c et permet d'obtenir une surexpression du gène orf28c.
Dans cette construction d'ADN recombinant, la séquence codante de orf28c peut être placée sous le contrôle d'un promoteur plus actif que le promoteur sauvage. On peut citer à titre 5 d'illustration le promoteur ptrc actif chez Streptomyces ambofaciens (Amann, E. et al., 1988) ainsi que le promoteur ermE*. Ainsi, de façon préférée, la ou les copies du gène . orf28c apportée sont placées sous le contrôle du promoteur ermE* comme c'est le cas dans la construction pSPM75 (cf. exemple 24).
=
Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de production de macrolides 1.0 utilisant les microorganismes décrits au paragraphe précédent. Ce procédé consiste à
cultiver dans un milieu de culture approprié un microorganisme défini dans le paragraphe précédent, récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape précédente le ou les macrolides produits. Les conditions 4 15 culture de tels microorganismes pourront être déterminées selon des techniques bien , . connues de l'homme du métier. Le milieu de culture pourra par exemple être le mili.41;,e . n-MP5 ou le milieu SL11 pour les Streptomyces et notamment pour Streptomycéee ambofaciens (Pemodet et al., 1993). L'homme du métier pourra notamment se référer à
l'ouvrage de Kieser et al. 2000 en ce qui concerne la culture des Streptomyces. Le ou les 20 macrolides produits peuvent être récupérés par toutes techniques connues de l'homme du métier. L'homme du métier pourra se référer, par exemple, aux techniques enseignées dans le brevet américain US 3,000,785 et plus particulièrement aux méthodes d'extraction des spiramycines décrites dans ce brevet.
Préférentiellement, les microorganismes utilisés dans un tel procédé sont des bactéries du genre Streptomyces.
25 Plus préférentiellement, le macrolide en question est la spiramycine et les microorganismes mutants améliorés pour leur production en spiramycines sont des souches de S. ambofaciens.
Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation d'une séquence et/ou d'un vecteur selon l'invention pour la préparation d'antibiotiques hybrides. En effet, les polynucléotides selon l'invention peuvent servir à l'obtention de microorganismes exprimant une ou plusieurs protéines mutantes donnant lieu à une modification dans la spécificité du substrat ou encore être exprimés dans de multiples microorganismes producteurs d'antibiotiques dans le but de générer des antibiotiques hybrides.
Ainsi les polynucléotides selon l'invention peuvent permettre, par transfert des gènes entre microorganismes producteurs, de fabriquer des antibiotiques hybrides ayant des propriétés pharmacologiquement intéressantes (Hopwood et a/.,1985a, Hopwood et aL,1985b, Hutchinson et aL,1989). Le principe par lequel l'ingénierie génétique peut conduire à la production d'antibiotiques hybrides a été tout d'abord proposé
par Hopwood (Hopwood 1981). Il a ainsi été proposé que les enzymes participant à
la biosynthèse d'antibiotiques acceptent souvent des substrats reliés structurellement, mais différents de leur substrat naturel. Il est généralement admis (Hopwood 1981, Hutchinson 1988, Robinson 1988) que les enzymes codées par les gènes de la voie dé
biosynthèse d'antibiotiques ont une spécificité de substrat moins stricte que les enzymes du métabolisme primaire. Il a ainsi pu être montré qu'un grand nombre de substrats non7...;
= , naturels sont transformés par des microorganismes producteurs d'antibiotique, lenyliq mutants ou des enzymes purifiées de la Voie -de biosynthèse de ces antibiotique , (Hutchinson 1988). En utilisant cet enseignement, l'homme du métier pourra construire des microorganismes exprimant une ou plusieurs protéines mutantes donnant lieu à une modification dans la spécificité du substrat dans le but de générer des antibiotiques hybrides.
L'invention concerne également l'utilisation d'au moins un polynucléotide et/ou au moins un ADN recombinant et/ou au moins un vecteur d'expression et/ou au moins un polypeptide et/ou au moins une cellule hôte selon l'invention pour réaliser une ou plusieurs bioconversions. Ainsi l'invention permet de construire des souches bactériennes ou fongiques dans lesquelles on exprime, sous le contrôle de signaux d'expression appropriés, une ou plusieurs protéines selon l'invention. De telles souches peuvent alors être utilisées pour réaliser une ou des bioconversions. Ces bioconversions peuvent se faire soit à l'aide de cellules entières, soit à l'aide d'extraits acellulaires des dites cellules. Ces bioconversions peuvent permettre de transformer une molécule en une =

forme dérivée, avec une enzyme d'une voie de biosynthèse. Par exemple, Carreras et al.
décrit l'utilisation de souche de Saccharopolyspora etythraea et de Streptomyces coelicolor pour la production de nouveau dérivés d'érithromycines (Carreras et al., 2002). Walczar et al. décrit l'utilisation d'une P450 mono-oxygénase de Streptomyces pour la bioconversion de désacétyladriamycine (un analogue de l'anthracycline) en de nouvelles anthracyclines (Walczar et al., 2001). Olonao et al. décrit l'utilisation d'une souche de Streptomyces lividans modifiée pour la bioconversion de rhodomycinone-epsilon en rhodomycine D (Olonao et al., 1999). L'homme du métier pourra appliquer ce principe à tout intermédiaire de biosynthèse.
õ
L'invention concerne également un ADN recombinant caractérisé en ce qu'il comprend :
- un polynucléotide susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymérase en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N 138) et 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N 139) et comme =
`;;s = matrice le cos/nide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens, plusi5:eie préférentiellement il s'agit d'un polynucléotide de séquence SEQ ID N 141, - ou un fragment d'au moins 10, 12, 15, 18, 20 à 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80,

90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1460, 1470, 1480, 1490 ou 1500 nucléotides consécutifs de ces polynucléotides.
Préférentiellement ; cet ADN recombinant est un vecteur. Encore plus préférentiellement, le vecteur est choisi parmi les bactériophages, les plasmides, les phagemides, les vecteurs intégratifs, les fosmides, les cosmides, les vecteurs navettes, les BAC (Bacterial Artificial Chromosome) ou les PAC (P1 -derived Artificial Chromosome). A titre illustratif on peut citer comme bactériophages le phage lambda et le phage M13. Comme plasmides on peut citer les plasmides se répliquant chez E.
cou i par exemple pBR322 et ses dérivés, pUC18 et ses dérivés, pUC19 et ses dérivés, pGB2 et ses dérivés (Churchward G. et al., 1984), pACYC177 (numéro d'accès GenBank: X06402) et ses dérivés, pACYC184 (numéro d'accès GenBank: X06403) et ses dérivés. On peut également citer les plasmides se répliquant chez Streptomyces comme par exemple pIJ101 et ses dérivés, pSG5 et ses dérivés, SLP1 et ses dérivés, SCP2* et ses dérivés (Kieser et al. 2000). Comme phagemides on peut citer à
titre illustratif pBluescript II et ses dérivés (commercialisés notamment par la société
Stratagene (LaJolla, Californie, USA)), pGEM-T et ses dérivés (commercialisé
par la société Promega (Madison, Wisconcin, USA)), 1ZAPII et ses dérivés (commercialisés notamment par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA)).
Comme vecteurs intégratifs on peut citer à titre illustratif, les vecteurs intégratifs chez Streptomyces comme par exemple ceux dérivés de SLP1 (Kieser et al, 2000), ceux dérivés de pSAM2 (Kieser et al, 2000), les vecteurs utilisant les systèmes d'intégration des phages PhiC31 (Kieser et al, 2000) (par exemple pSET152 (Bierman et al., 1992)) ou de VWB (Van Mellaert L, et al. 1998), ainsi que les :
vecteurs utilisant le système d'intégration de IS117 (Kieser et al. 2000).
Comme f:
fosmides on peut citer à titre illustratif le fosmide pF0S1 (commercialisé par la société New England Bioloabs Inc., Beverly, Massachussetts, USA) et ses dérivé,,s;'''.'"'qià
Comme cosrnides on peut citer à titre illustratif le cosmide SuperCos et ses dérivés' (commercialisés notamment par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA)), le cosmide pWED15 (Wahl et al., 1987) et ses dérivés. Comme vecteurs navettes on peut citer à titre illustratif les plasmides navettes E. cou I Streptomyces comme par exemple pIJ903 et ses dérivés, la série des plasmides pUWL, pCA0106, pWHM3, p0J446 et leurs dérivés (Kieser et al. 2000), les BAC navettes E. cou I
Streptomyces comme par exemple ceux décrits dans la demande de brevet WO 01/40497. Comme BAC (Bacterial Artificial Chromosome) on peut citer à titre illustratif le BAC
pBeloBAC11 (numéro d'accès GenBank :U51113). Comme PAC (Pl-derived Artificial Chromosome) on peut citer à titre illustratif le vecteur pCYPAC6 (numéro d'accès GenBank : AF133437). Plus préférentiellement, cet ADN recombinant est un vecteur d'expression. Les vecteurs d'expression utilisables dans différents systèmes d'expression sont bien connus de l'homme du métier, en ce qui concerne les cellules procaryotes, on peut citer à titre illustratif les vecteurs d'expression chez E. cou i par exemple, de la famille pET commercialisés par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA), les vecteurs de la famille GATEWAY commercialisés par la société Invitrogen (Carlsbad, Californie, USA), les vecteurs de la famille pBAD
commercialisés par la société Invitrogen (Carlsbad, Californie, USA), les vecteurs de la famille pMAL commercialisés par la société New England Bioloabs Inc.
(Beverly, Massachussetts, USA),, les vecteurs d'expression inductibles par le rharnnose cités dans la publication Wilms B et al., 2001 et leurs dérivés, on peut également citer les vecteurs d'expression chez Streptomyces comme par exemple les vecteurs p114123, pll6021, pPM927, pANT849, pANT 850, pANT 851, pANT1200, pANT1201, .
pANT1202 et leurs dérivés (Kieser et al., 2000). En ce qui concerne les cellules de levures, on peut citer à titre illustratif le vecteur pESC commercialisé par la société
Stratagene (LaJolla, Californie, USA). En ce qui concerne le système d'expression baculovirus permettant une expression dans des cellules d'insectes on peut citer à titre _ illustratif le vecteur BacPAK6 commercialisé par la société BD Biosciences Clontech, (Palo Alto, Californie, USA). En ce qui concerne les cellules de ' mammifères, on peut citer à titre illustratif des vecteurs comprenant le promoteur des .
gènes précoces du virus CMV (Cytomegalovirus) (par exemple le vecteur pCMV et' :i't5.à"
ses dérivés commercialisés par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA), ou le promoteur des gènes immédiats (SV40 early promoter) du virus simien vacuolisant SV40 (par exemple le vecteur pSG5 commercialisé par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA). Un autre aspect de l'invention concerne des cellules hôtes dans laquelle a été introduit au moins un ADN recombinant décrit dans ce paragraphe.
Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de production d'un polypeptide caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes:
a) transformer une cellule hôte par au moins un vecteur d'expression tel que décrit dans le paragraphe ci-dessus;
b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, ladite cellule hôte;
c) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire;
d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape c), ledit polypeptide ;
=

e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.
Le polypeptide recombinant ainsi produit peut être purifié par passage sur une série appropriée de colonnes de chromatographie, selon les méthodes connues de l'homme de l'art et décrites par exemple dans F. Ausubel et al (2002). On peut citer à
5 titre illustratif la technique du Tag-Histidine , qui consiste à
ajouter une courte séquence poly-histidine au pblypeptide à produire, ce dernier pouvant ensuite être purifié sur colonne de nickel. Ce polypeptide peut également être préparé par les techniques de synthèse in vitro. A titre illustratif de telles techniques, le polypeptide =
pourra être préparé grâce au système rapid translation system (RTS) , commercialisé 7;
10 notamment par la société Roche Diagnostics France S.A, Meylan, France.
Un autre aspect de l'invention àonceme un microorganisme producteur d'au moins une spiramycine caractérisé en ce qu'il surexprime :
-un gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymérase (PCR) en=
, utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' 15 AAGCTMTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N 138) et GGATCCCGCGACGGACACGACOGCCGCGCA 3' (SEQ ID N 139) et commei matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens, plus préférentiellement il s'agit du gène de séquence codante SEQ ID N 141, - ou un gène dérivé de ceux-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
20 Un exemple de séquence d'un tel gène est donné en SEQ ID N 111 (ADN), cependant cette séquence est partielle puisqu'elle ne comprend pas la partie 3' de la séquence codante correspondante. La traduction en protéine de cette partie de séquence codante est donnée en SEQ ID N 112. L'homme du métier pourra aisément la compléter notamment en utilisant l'enseignement présenté dans l'exemple 24. Il est ainsi présenté
25 dans cet exemple une méthode pour cloner le gène orf28c et pour fabriquer un vecteur d'expression permettant l'expression de orf28c. Il est également montré dans cet exemple que la surexpression du gène orf28c dans la souche OSC2 conduit à
l'amélioration de la production en spiramycines de cette souche. De façon préférée, le microorganisme surexprimant - un gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymérase (PCR) en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N 138) et 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens, plus préférentiellement il s'agit du gène de séquence codante SEQ ID N 141, - ou un gène dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique est une bactérie du genre Streptomyces, de manière encore plus préférée, il s'agit d'une bactérie de l'espèce Streptomyces ambofaciens. De façon préférée, la surexpression dudit gène est obtenue par transformation dudit microorganisme par un vecteur d'expression, de manière tout à fait préféré, la souche de microorganisme est la souche OSC2/pSPM75(1) ou de la souche OSC2/pSPM75(2) déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 6 octobre 2003 sous le numéro d'enregistrement t.
1-3101.
f Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de production !sie , 11 spiramycine(s) utilisant lés 'microorganismes décrits au paragraphe précédent té
procédé consiste à cultiver dans un milieu de culture approprié un microorganisme défini dans le paragraphe précédent, récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire Obtenu à l'étape précédente le ou les spiramycines produites. Les conditions de culture de tels microorganismes pourront être déterminées selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Le milieu de culture pourra par exemple être le milieu MP5 ou le milieu SL11 pour les Streptomyces et notamment pour Streptomyces ambofaciens (Pertiodet et al., 1993). L'homme du métier pourra notamment se référer à l'ouvrage de Kieser et al. 2000 en ce qui concerne la culture des Streptomyces. Le ou les spiramycines produites peuvent être récupérés par toutes techniques connues de l'homme du métier. L'homme du métier pourra se référer, par exemple, aux techniques enseignées dans le brevet américain US 3,000,785 et plus particulièrement aux méthodes d'extraction des spiramycines décrites dans ce brevet.

Préférentiellement, les microorganismes utilisés dans un tel procédé sont des bactéries du genre Streptomyces. Plus préférentiellement, les microorganismes sont des souches de S. ambofaciens.
Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur d'expression caractérisé
en ce que le polynucléotide de séquence SEQ ID N 47 ou un polynucléotide dérivé
de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique est placé sous le contrôle d'un promoteur permettant l'expression de la protéine codée par le dit polynucléotide chez Streptomyces ambofaciens. Des exemples de vecteurs d'expression utilisables chez Streptomyces ont été donnés ci-dessus.
Préférentiellement un tel vecteur d'expression est caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pSPM524 ou pSPM525.
Un autre aspect de l'invention concerne une souche de Streptomyces ambofaciens transformée par un vecteur défini dans le paragraphe précédent.
Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide caractérisé en ce que =
sa séquence comprend la séquence SEQ N
112. L'invention est éga1ementi'Mr4..
relative à un polypeptide caractérisé en ce que sa séquence correspond à la séquence traduite de la séquence codante :
- d'un gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymérase (PCR) en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N 138) et 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens, plus préférentiellement il s'agit du gène de séquence codante SEQ ID N 141, -ou d'un gène dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
Préferentiellement ces polypeptides sont exprimés à l'état naturel par une bactérie du genre Streptomyces, plus préférentiellement, ces polypeptides sont impliqués dans la biosynthèse des spiramycines.

Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur d'expression permettant l'expression d'un polypeptide tel que défini dans le paragraphe précédent chez Streptomyces ambofaciens. Des exemples de vecteurs d'expression utilisables chez Streptomyces ont été donnés ci-dessus. Préférentiellemnt, le vecteur d'expression en question est le plasmide pSPM75.
LISTE DES FIGURES
Figure 1: Structure chimique des spiramycines I, II et III.
Figure 2 : Cosmides utilisés pour le séquençage de la région.
Figure 3 : Organisation d'un groupe de gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des spiramycines.
Figure 4 : Voie de biosynthèse proposée du mycarose.
Figure 5 : Voie de biosynthèse proposée du mycaminose.
Figure 6 : Voie de biosynthèse proposée de la forosamine.
Figure 7 : Ordre préférentiel d'ajout des sucres dans la molécule de spiramycine 9t -intermédiaires.
. . :
Figure 8 : Voie de biosynthèse proposée du méthoxymalonyl chez S
canbofaciens.'eti.é.
voie est proposée par analogie avec la biosynthèse du méthoxymalonyl chez Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus (Wu,K. et ai., 2000).
Figure 9 : Etapes conduisant à l'inactivation d'un gène:
A) Clonage du gène cible dans un vecteur se répliquant chez E. cou i mais pas chez Streptomyces;
B) Insertion de la cassette de résistance dans le gène cible (par clonage ou recombinaison entre courtes séquences identiques);
C) Introduction du plasmide chez Streptomyces ambofaciens (par transformation ou conjugaison avec E. cou) et sélection des clones ayant intégré
la cassette puis criblage de clones ayant perdu la partie vecteur pour avoir un remplacement de gène;
D) Région du chromosome de la souche mutante dans laquelle le gène cible est inactivé par remplacement de gène.

Figure 10 : Etapes optionnelles suivant l'inactivation d'un gène selon la méthode décrite en figure 9, pouvant être conduites si une cassette excisable a été employée pour interrompre le gène cible :
E) Introduction dans la souche mutante du plasmide pOSV508 portant les gènes xis et int de pSAM2 dont les produits vont permettre l'excision efficace par recombinaison spécifique de sites entre les séquences attL et attR bordant la cassette;
F) Obtention de clones ayant perdu la cassette excisable et sensibles à
l'antibiotique à laquelle la cassette conférait la résistance;
G) Après croissance et sporulation sur milieu solide sans antibiotique le plasmide pOSV508 est perdu à haute fréquence. On peut ainsi obtenir des clones sensibles au thiostrepton dans lesquels le gène cible contient une délétion en phase. La séquence du gène cible délété peut être contrôlée par amplification PCR et séquençage du produit PCR.
Figure 11 : Amplification de la cassette excisable dans le but de l'utiliser pour une =
, expérience de recombinaison homologue La teditticiué de recombinaison homologue >
. .
;K =
grâce à de courtes séquences homologues a été déCrite par (Chaveroche et al., 2000). Lés 39 ou 40 déoxy-nucléotides situés à l'extrémité 5' de ces oligonucléotides comportent une séquence correspondant à une séquence du gène à inactiver et les 20 déoxy-nucléotides, situés le plus en 3' correspondent à la séquence d'une des extrémités de la cassette excisable.
Figure 12: Obtention d'une construction pour l'inactivation d'un gène cible grâce à la technique décrite par (Chaveroche et al., 2000).
Figure 13: Carte du plasmide pWHM3. Strepto on: origine de réplication Streptomyces.
Figure 14: Carte du plasmide pOSV508.
Figure 15 : Exemple de structure d'une cassette excisable. Celle-ci est constituée de la cassette fllzyg (Blondelet-Rouault et al., 1997) bordée des sites attR et attL
(Raynal et al., 1998), entre lesquels un événement de recombinaison permettra l'excision de la cassette, grâce à l'expression des gènes xis et int.
Figure 16 : Carte du plasmide pBXL1111.
Figure 17 : Carte du plasmide pBXL1112.
Figure 18: Test microbiologique de production de spiramycine, basé sur la sensibilité
d'une souche de Micrococcus luteus à la spiramycine. La souche de Micrococcus luteus utilisée est une souche naturellement sensible à la spiramycine mais résistante à la congocidine. Les différentes souches de Streptomyces à tester ont été
cultivées en erlenmeyers de 500 ml contenant 70 ml de milieu MP5, inoculés à une concentration initiale de 2.5 106 spores/mi et mises à pousser à 27 C sous agitation orbitale de 250 rpm. Des prélèvements de moûts de fermentation ont été réalisés après 48, 72 et 96 heures de culture et centrifugés. Une dilution au dixième de ces surnageants dans du milieu de culture stérile est utilisée pour le test. La souche indicatrice de Micrococcus luteus résistante à la congocidine mais sensible à la spiramycine (Gourmelen et al., 1998) a été cultivée dans une boîte carrée de 12x12 cm. Des disques en papier Whatman AA ont été imbibés de 70 pl de la dilution au dixième de chaque surnageant et déposés ,4 sur la surface de la boîte. Des disques imbibés d'une solution de spiramycine'de,,,e =
différentes concentrations (2-4-8 pg/m1 dans du milieu de culture MP5) sont utilisés =
comme gamme étalon. Les boîtes sont incubées à 37 C pendant 24 à 48h. Si le disque contient de la spiramycine, celle-ci diffuse dans l'agar et inhibe la croissance de la souche indicatrice de Micrococcus luteus. Cette inhibition crée un halo autour du disque, ce halo reflétant la zone où la souche de Micrococcus luteus n'a pas poussé. La présence de ce halo est donc une indication de la présence de spiramycine et permet de determiner si la souche de S. ambofaciens en question est productrice ou non productrice de spiramycine. Une comparaison avec les diamètres d'inhibition obtenus pour la gamme étalon permet d'obtenir une indication de la quantité de spiramycine produite par cette souche.
Figure 19: Chromatogramme CLHP du surnageant filtré du milieu de culture de la souche OSC2.

Figure 20: Chromatogramme CLHP du surnageant filtré du milieu de culture de la souche SPM501.
Figure 21: Chromatogramme CLHP du surnageant filtré du milieu de culture de la souche SPM502.
Figure 22: Chromatogramme CLHP du surnageant filtré du milieu de culture de la souche SPM507.
Figure 23: Chromatogramme CLHP du surnageant filtré du milieu =de culture de la souche SPM508.
Figure 24: Chromatogramme CLHP du surnageant filtré du milieu de culture de la souche SPM509.
Figure 25 : Alignement de la protéine Orf3 (SEQ ID N 29) avec la protéine TylB (SEQ
ID N 87) de S. fradiae réalisé grâce au programme FASTA.
Figure 26 : Alignement de la protéine MdmA de S. mycarofaciens (SEQ N 88) avec la protéine SrmD (SEQ ID N 16) réalisé grâce au programme FASTA.
Figure 27: Exemple de séquences des sites résiduels après excision de la cassette excisable. En gras est indiqué le site att26 minimum tel que défini dans Raynal et ' 1998. La séquence de la phase 1 (att de 33 nucléotides est présentée, en SEQ
ID 1.4 :i.t;õ.%
õ
;.en.
104, la séquence de la phase 2 (att) de 34 nucléotides est présentée en SEQ ID
N 105, la séquence de la phase 3 (att3) de 35 nucléotides est présentée en SEQ ID N
95.Figure 28: Représentation schématique du gène orf10, localisation des amorces PCR
utlisées et construction obtenue avec chaque couple d'amorces.
Figure 29 : Construction de la cassette pac-oritT.
Figure 30 : Carte du cosmide pWED2.
Figure 31: Représentation schématique du groupe de gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des spiramycines et de la localisation des trois sondes utilisées pour isoler les cosmides de la banque d'ADN génomique de la souche OSC2 de Streptomyces ambofaciens chez E. colt (cf. exemple 19).Figure 32: Localisation des inserts des cosmides isolés de la banque d'ADN génomique de la souche OSC2 de Streptomyces ambofaciens chez E. colt (cf. exemple 19).

Nouvelle banque d'ADN cosmidique.Figure 33 : Sous clonage du fragment Pstl-Pstl du cosmide pSPM36 (insert du plasmide (pSPM58), sous clonage du fragment StuI-StuI du cosmide pSPM36 (insert du plasmide pSPM72) et sous clonage d'un fragment EcoRI-Stul (insert du plasmide pSPM73).
Figure 34: Localisation des phases ouvertes de lecture indentifiées dans l'insert Pstl-PstI du plasmide pSPM58 et dans l'insert EcoRI-Stul du plasmide pSPM73.
Figure 35: Superposition des chromatogrammes CLHP du surnageant filtré du milieu de culture de la souche 0S49.67 réalisés à 238 et 280nm (haut) et spectres UV
des molécules élués à 33,4 minutes et 44,8 minutes (bas). , Figure 36: Structure moléculaire des molécules platénolide A et platénolide B.
Figure 37: Organisation du groupe de gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des spiramycines.
Figure 38: Structure moléculaire d'un intermédiaire de biosynthsèe produit par la V V:
souche SPM507.
Figure 39: Structure d'un intermédiaire de biosynthsèse produit par une souche de S.
ambofaciens de génotype mf6*::attg2hyg+ obtenue à partir d'une souche' ¨
surproduisant les spiramycines. L'insertion de la cassette attE2hyk-i- dans oie* exéeçè
un effet polaire empéchant l'expression de orf5*.
Figure 40: Structure moléculaire des molécules platénolide A + mycarose et platénolide B + mycarose produites par la souche 0S49.67 Figure 41: Sous clonage d'un fragment Pstl-Pstl du cosmide pSPM36 (insert du plasmide (pSPM79)), localisation des phases ouvertes de lecture indentifiées dans l'insert Pstl-Pstl du plasmide pSPM79 et localisation de la séquence SEQ ID N
140.

La présente invention est illustrée à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
En résumé, les gènes de la voie de biosynthèse des spiramycines ont été isolés à
partir d'une banque d'ADN génomique de Streptomyces ambofaciens. Cette banque a été
obtenue par digestion partielle de l'ADN génomique de Streptomyces ambofaciens, par l'enzyme de restriction BamHI. De larges fragments d'ADN, de 35 à 45 kb en moyeiiiie, ont été clonés dans le cosmide pWED1 (Gourmelen et al., 1998) dérivé du cosmide pWED15 (Wahl et al., 1987). Ces cosmides ont été introduits chez E. cou i grâce à des particules phagiques. La banque ainsi obtenue a été hybridée avec une sonde (de =
séquence SEQ ID N 86) correspondant à une partie du gène tylB de S. fradiae (Merson-Davies & Cundliffe, 1994, numéro d'accès GenBank : U08223). Après hybridation, un cosmide sur les 4 s'hybridant avec la sonde a été plus particulièrement sélectionné. Ce cosmide nommé pOS49.1 a ensuite été digéré par Sad et un fragment de 3,3 kb contenant la région s'hybridant avec la sonde a été sous cloné dans le vecteur pUC19 et séquencé. Quatre phases ouvertes de lectures ont été identifiées et l'une d'entre elles code une protéine (SEQ ID N 29) présentant de fortes similitudes de séquence avec ia!,!;) =
=
protéine TylB de S. fradiae (SEQ N 87) (cf. figure 25). Ce gène a été nommé
(SEQ ID N 28) et a été inactivé chez S. ambofaciens. Il a pu être démontré
que les clones inactivés dans le gène orj3 ne produisent plus de spiramycines. Ceci montre l'implication du gène orf3 ou de gènes situés en aval dans la biosynthèse des spiramycines.
Une fois cette confirmation obtenue, une plus grande région du cosmide pOS49.1 a été séquencée, de part et d'autre du fragment Sad précédemment étudié.
Ainsi, à partir du cosmide pOS49.1, la séquence d'une région comportant sept phases ouvertes de lecture entières et deux autres incomplètes, situées de part et d'autre de ces sept phases ouvertes complètes, a pu être obtenue. Grâce à une recherche dans les bases de données, il a pu être montré que l'une des phases ouvertes de lecture incomplète correspondait au locus srmG (région codant une enzyme appelée polyketide synthase (PKS)).
Les gènes correspondants ont été clonés par Burgett S. et al. en 1996 (Brevet américain US

5,945,320). Par ailleurs, les autres phases ouvertes de lecture, les sept ORFs entières nommées : orfl, orf2, orf3, orf4, orf5, orf6, o'17 (SEQ ID N 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40) et le début de la huitième ORF nommé orf8 (séquence SEQ ID N 43) n'ont pas été
retrouvées dans les bases de données.
Dans un deuxième temps et dans le but de cloner d'autres gènes impliqués dans la biosynthèse des spiramycines, d'autres cosmides comportant des fragments du génome de S. ambofaciens dans cette même région ont été isolés. Pour cela une nouvelle série d'hybridations sur colonies a été effectuée en utilisant trois sondes. La première sonde correspond à un fragment d'ADN de 3,7kb contenant orfl, orf2 et le début de orf3, sous cloné à partir de pOS49.1. La deuxième sonde correspond à un fragment de 2 kb d'ADN
contenant une partie de orf7 et une partie de oie et sous cloné à partir de pOS49.1. Une troisième sonde a également été utilisée. Cette dernière correspond à un fragment d'ADN à
;
de 1.8 kb contenant le gène srmD. Le gène srmD est un gène isolé de S.
ambofacietts.
capable de conférer la résistance à la spiramycine. En effet, des travaux antérie avaient permis le clonage de plusieurs déterminants de résistance de S.
ambofaciens, õ
conférant la résistance à la spiramYciiie à une souche de S. griseofuscus (souche sensiblef=
= I. =
à la spiramycine) (Pernodet et al., 1993) (Pemodet et al., 1999). Pour l'isolement de gènes de résistances, une banque cosmidique de l'ADN génomique de la souche S.

ambofaciens avait été réalisée dans le cosmide pKC505 (Richardson MA et al., 1987).
Ce pool de cosmides avait été introduit chez S. griseofuscus, naturellement sensible à la spiramycine. Cinq cosmides capables de conférer la résistance à l'apramycine et la spiramycine chez S. griseofuscus avaient ainsi été obtenus. Parmi ces 5 cosmides, un cosmide nommé pOS44.1 possède dans son insert le gène srmD qui code une protéine présentant une certaine similitude avec la protéine codée par le gène mdmA de Streptomyces mycarofaciens et impliquée dans la résistance à la midécamycine chez cet organisme producteur (Hara et al., 1990, numéro d'accès Genbank : A60725) (figure 26). La troisième sonde utilisée pour localiser les gènes de biosynthèse de spiramycine a été un insert d'environ 1.8kb comprenant le gène srmD.

Ces trois sondes ont été utilisées pour hybrider la banque d'ADN génomique décrite ci-dessus et ont permis de choisir deux cosmides (pSPM7 et pSPM5) susceptibles de contenir les inserts les plus longs et n'ayant pas de bandes communes. Le cosmide pSMP5 hybridait avec la première et la deuxième sonde, mais n'hybridait pas avec la troisième sonde, alors que le cosmide pSPM7 hybridait avec la troisième sonde seulement. Ces deux cosmides ont été séquencés en totalité par la technique du séquençage en aveugle ( shotgun sequencing ). Les séquences des inserts de ces deux cosmides : pSPM7 et pSPM5 ont pu être assemblées car bien que ne se chevauchant pas, chacun des inserts comprenait une séquence connue à l'une de ses extrémités.
En effet;
chacun de ces inserts comportait un fragment de la séquence d'un des gènes codant une enzyme appelée polyketide synthase (PKS). Ces 5 gènes ont été clonés par Burgett S.
et al. en 1996 (Brevet américain US 5,945,320) (cf. figure 2). Ainsi, il a pu être déterminé une séquence unique d'ADN génomique de S. ambofaciens. Une séquence de 30943 nucléotides partant, en 5', d'un site EcoRI situé dans le premier gène PKS et ; 15 allant jusqu'à un site B amHI en 3' est présentée en SEQ ID N 1.
Cette séquence correspond à la région amont des gènes de la PKS (cf figure 2 et 3). Une deuxièrné;.4;
, région de 11171 nucléotides, partant d'un site PstI en 5' et allant jusqu'à un site 441A
-en 3' situé dans le cinquième gène de la PKS est présentée en SEQ D N 2. Cette région est la région aval des gènes de la PKS (l'aval et l'amont étant définis par l'orientation des 5 gènes de PKS tous orientés dans le même sens) (cf. figures 2 et 3).
Dans un troisième temps et dans le but de cloner d'autres gènes impliqués dans la biosynthèse des spiramycines, d'autres cosmides comportant des fragments du génome de S. ambofaciens dans cette même région ont été isolés (cf. exemple 18 et 19).

EXEMPLE 1 : Construction d'une banque d'ADN génomique de la souche ATCC23877 de Streptomyces ambofaciens chez E. coui 1.1. Extraction de l'ADN génomique de la souche ATCC23877 de Streptomyces ambofaciens.
1 La souche ATCC23877 de Streptomyces ambofaciens (accessible notamment 'auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, Virginie, USA), sous le numéro 23877) a été cultivée en milieu YEME (Yeast Extract-Malt Extract) ((Kieser, :
T, et cd.,2000) et l'ADN génomique de cette souche a été extrait et purifié
selon leà
techniques standards de lyse et précipitation (Kieser T. et al., 2000).
1.2. Construction de la banque d'ADN génomique L'ADN génomique de la souche ATCC23877 de Streptomyces ambofaciens tel qu'isolé ci-dessus a été digéré partiellement par l'enzyme de restriction B
amHI de ;>i = ..........................................................................
manière à obtenir des fragments d'ADN de taille comprise entre environ 35 et .Ces fragments ont été clonés dans le cosmide pWED1 (Gourmelen et al, 1998) digéré
, '1.5 au préalable par BamHI. Le cosmide pWED1 est dérivé du cosmide pWE15 (Wahl; â:A
al., 1987) par délétion du fragment Hpal-Hpal de 4.1 kb contenant le module d'expression actif chez les mammifères (Gourmelen et al., 1998). Le mélange de ligation a ensuite été encapsidé in vitro dans des particules de phages lambda grâce au système Packagene Lambda DNA packaging system commercialisé par la société
Promega en suivant les recommandations du fabriquant. Les particules phagiques obtenues ont été utilisées pour infecter la souche SURE d'E. cou i commercialisée par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA). La séléction des clones a été effectuée sur milieu LB + ampicilline (50 tg/ml) puisque le cosmide pWED1 confère la résistance à l' ampicilline.

EXEMPLE 2 : Isolement et caractérisation de gènes impliqués dans la biosynthèse de spiramycines chez Streptomyces ambofaciens 2.1 Hybridation sur colonie des clones d' E. cou i de la banque génomique de Streptomyces ambofaciens ATCC23877 d Environ 2000 clones d' E. cou i de la banque obtenue ci-dessus, ont été
transférés sur filtre pour hybridation sur colonies. La sonde utilisée pour l'hybridation est un fragment Nael-Nael d'ADN (SEQ ID N 86) comportant une partie du gène tylB de Streptomyces fradiae. Ce fragment correspond aux nucléotides 2663 à 3702 du fragment d'ADN décrit par Merson-Davies, L.A. & Cundliffe E. (Merson-Davies, L.A. &
Cundliffe E., 1994, numéro d'accès GenBank : U08223), dans lequel la séquence codante du gène tylB correspond aux nucléotides 2677 à 3843.
Le fragment Nael-Nael d'ADN portant une partie du gène tylB de Streptomyces fradiae (SEQ ID N 86) a été marquée au 32P par la technique du random priming (Kit commercialisé par la société Roche) et utilisé comme sonde pour l'hybridation des 1.5 2000 clones de la banque, transférés sur filtre. Les membranes utilisées sont .déSS
= =;:;.
membranes nylon Hybond N commercialisées par la société Amersham (Amersham Biosciences, Orsay, France) et l'hybridation a été effectuée à 55 C dans le tampon décrit par Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984). Un lavage a été effectué en 2X
SSC à
55 C pendant 15 minutes et deux lavages successifs en 0.5X SSC ont ensuite été
effectués à 55 C, d'une durée de 15 minutes chacun. Dans ces conditions d'hybridation et de lavage, 4 clones parmi les 2000 hybridés présentaient un fort signal d'hybridation.
Ces 4 clones ont été cultivés en milieu LB+ ampicilline (50 itg/ml) et les 4 cosmides correspondants ont été extraits par lyse alcaline standard (Sambrook et al., 1989). Il a ensuite été vérifié que l'hybridation était bien due à un fragment d'ADN
présent dans l'insert de ces quatre cosmides. Pour cela, les cosmides ont été digérés indépendamment par plusieurs enzymes (BamHI, Pstl et Sac . Les produits de digestions ont été
séparés sur gel d'agarose, transférés sur membrane Nylon et hybridés par le fragment Nael-Nael d'ADN comportant une partie du gène tylB de Streptomyces fradiae (cf. ci-dessus) dans les mêmes conditions que ci-dessus. Les quatres cosmides ont pu être validés et un de ces cosmides a été plus particulièrement retenu et a été nommé pOS49.1.
2.2 Vérification de l'implication de la région identifiée et séquençage de l'insert du cosmide pOS49.1 Plusieirs fragments de l'insert du cosmide pOS49.1 ont été sons-clonés et leurs séquences ont été déterminées. Le cosmide pOS49.1 a été digéré par l'enzyme Sacl et il a été montré par Southern blot, dans les conditions décrites précédemment, qu'un fragment de 3,3 kb contient la région s'hybridant avec la sonde ty1B. Ce fragment de 3,3 kb a été isolé par électroélution à partir d'un gel d'agarose 0.8% puis cloné
dans le vecteur pUC19 (numéro d'accès GenBank M77789) et séquencé. Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pOS49.11. Quatre phases ouvertes de lecture présentant un usage des codons typique de Streptomyces ont pu être identifiées dans ce fragment (deux complètes et deux tronquées), grâce au programme FramePlot (Ishikawa J & Hotta K.
1999). Des comparaisons de séquences grâce au programme FASTA (cf. (Pearson W.
R
& D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W R, 1990), accessible notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France) Ont permis de montrer que la protéine?' déduite de l'une de ces 4 phases ouvertes de lecture présente de fortes similitudes de séquence avec la protéine TylB (SEQ ID N 87; Numéro d'accès GenBank : U08223) de S. fradiae (cf. figure 25). Cette protéine a été nommée Orf3 (SEQ ID N 29).
Dans le but de tester si le gène correspondant (le gène orf3 (SEQ ID N 28)) était impliqué dans la biosynthèse des spiramycines chez S. ambofaciens, ce gène a été
interrompu par une cassette .s2hyg (Blondelet-Rouault M-H. et a/.,1997, numéro d'accès GenBank: X99315). Pour cela, le plasmide pOS49.11 a été digéré par l'enzyme Xhol et le fragment contenant les quatre phases ouvertes de lecture (deux complètes et deux tronquées, dont orf3 en entier) a été sous-cloné au niveau du site XhoI du vecteur pBC
SK+ commercialisé par la société Stratagene (LaJolla, Califormie, USA). Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pOS49.12. Dans le but d'inactiver orf3, un fragment Pmll-BstEll interne à orf3 a été remplacé par la cassette ..Qhyg par clonage bout franc dans ce dernier plasmide. Pour cela, le plasmide pOS49.12 a été digéré par les enzymes Pmll et BstEll dont le site unique se trouve dans la séquence codante du gène orf3.
Les extrémités du fragment correspondant au vecteur ont été rendues bouts francs par un traitement par l'enzyme de Klenow (grand fragment de la DNA polymerase I). La cassette Qhyg a été obtenue par digestion par l'enzyme BamHI du plasmide pHP45 Qhyg (Blondelet-Rouault et al., 1997, numéro d'accès GenBank : X99315). Le fragment correspondant à la. cassette Qhyg a été récupéré sur gel d'agarose et ses extrémités ont été rendues bouts francs par un traitement par l'enzyme de Klenow. Les deux fragments bouts francs ainsi obtenus (la cassette Qhyg et le plasmide pOS49.12) ont été
ligués et le produit de ligation a été utilisé pour la transformation de bactéries E. cou.
Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pOS49.14 et contient le gène orf3 interrompu par la cassette Qhyg.
L'insert du plasmide pOS49.14, sous la forme d'un fragment Xhol-Xhol dont les extrémités ont été rendues non cohésives par un traitement par l'enzyme de Klenow, a été cloné au niveau du site EcoRV du plasmide p0J260 (le plasmide p0J260 est un , . ,= plasmide conjugatif capable de se répliquer chez E.' cou i mais incapable de se répliquer 1.ïe chez S. ambofaciens .(Bieiman M et al., 1992). Ce plasmide confère la résistance 'à
l'apramycine chez E. cou i et Streptomyces). Le plasmide obtenu (insert du plasmide pOS49.14 cloné dans le plasmide p0J260) a été nommé pOS49.16. Ce dernier a été
transféré dans la souche ATCC23877 de S. ambofaciens par conjugaison à l'aide de la souche conjugative E. cou S17-1, comme décrit par Mazodier et al. (Mazodier et al., 1989). La souche E. cou S17-1 est dérivée de la souche E. cou i 294 (Simon et al., 1983) (Simon, et al., 1986). Des clones transconjugants possédant le marqueur de résistance à
l'hygromycine porté par la cassette Qhyg et ayant perdu le marqueur de résistance à
l'apramycine porté par le vecteur p0J260 ont pu être obtenus. Pour cela, après conjugaison, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à
l'hygromycine. Les clones résistants à l'hygromycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec hygromycine (antibiotique B) et sur milieu avec apramycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'hygromycine (HygR) et sensibles à l'apramycine (ApraS) sont en principe ceux où un double événement de recombinaison s'est produit et qui possèdent donc le gène orf3 interrompu par la cassette Qhyg. Le remplacement de la copie sauvage de orf3 par la copie interrompue a été vérifié par deux hybridations successives. Ainsi, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par différentes enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybridé avec une sonde correspondant à la cassette Qhyg (cf. ci-dessus)) pour vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique ,des clones obtenus. Une deuxième hybridation a été
effectuée en utilisant comme sonde l'insert XhoI-4,YhoI du plasmide pOS49.11 contenant les quatre phases ouvertes de lecture (deux complètes et deux tronquées, dont orf3 en entier). La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR. Un des clones orf3:: Dhyg ainsi obtenu et dont le génotype a été vérifié, a été choisi et a été appelé 0S49.16.
La production en spiramycine du clone 0S49.16 ainsi obtenu a été testée grâce au test de production décrit plus bas (cf. exemple 15). Il a ainsi pu être démontré que cette souche ne produit plus de spiramycine, confirmant l'implication de orf3 et/ou des gènes ,==it=
situés en aval comme par exemple olf4 dans la biosynthèse des spiramycines.
. ..;. ..
Une fois cette confirmation obtenue, une plus grande région du cosmide pOS49.1 a été séquencée, de part et d'autre du fragment Sad précédemment étudié.
Ainsi, à partir du cosmide pOS49.1, la séquence d'une région comportant sept phases ouvertes de lecture entières et deux autres incomplètes, situées de part et d'autre de ces sept phases ouvertes complètes, a pu être obtenue. Grâce à une recherche dans les bases de données, il a pu être montré que l'une des phases ouvertes de lecture incomplète correspondait au locus srmG (région codant une enzyme appelée polyketide synthase (PKS)).
Les gènes correspondants ont été clonés par Burgett S. et al. en 1996 (Brevet américain US
5,945,320). Par ailleurs, les autres phases ouvertes de lecture: les sept ORFs entières nommées : orfi, olf2, orf3, orf4, orf5, orf6, orf7 (SEQ ID N 23, 25, 28, 30, 34, 36 et 40) et le début de la huitième ORF nommée orf8 (la séquence entière de cette orf est donnée en SEQ ID N 43) n'ont pas été retrouvées dans les bases de données.

EXEMPLE 3 : Isolement et caractérisation d'autres gènes impliqués dans la biosynthèse de spiramycines chez Streptomyces ambofaciens Dans un deuxième temps et dans le but de cloner d'autres gènes impliqués dans la biosynthèse des spiramycines, d'autres cosmides comportant des fragments du génome de S. ambofaciens dans cette même région ont été isolés. Pour cela il a été
procédé à une nouvelle série d'hybridations sui colonies en utilisant trois sondes :
- La première sonde utilisée correspond à un fragment d'ADN BamHI-PstI de 3,7kb contenant un fragment du gène de la PKS (Les gènes correspondant à la PKS ont été
clonés par Burgett S. et al. en 1996 (Brevet américain US 5,945,320)), orfl, orf2 et le début de orf3, sous cloné à partir de pOS49.1 et allant d'un site BamHI situé
1300 paires de bases en amont du site EcoRI définissant la position 1 de SEQ ID N 1, jusqu'au site PstI situé en position 2472 (SEQ ID N 1). Ce fragment BamHI-PstI a été sous cloné à
partir de pOS49.1 dans le plasmide pBC SK+, ce qui a permis d'obtenir le plasmide .
pOS49.28.
- La deMiiénie sonde Utilisée c'Orr' p¨ond à un fragment d'ADN PstI-BamHI
2kb contenant un fragment d'orf7 et d'orf8, sous cloné à partir de pOS49.1 et allant d'un site PstI situé en position 6693 de SEQ ID N 1 jusqu'au site BamHI situé en position 8714 de SEQ ID N 1. Ce fragment PstI-BamHI a été sous cloné à partir de pOS49.1 dans le plamside pBC SK+, ce qui a permis d'obtenir le plasmide pOS49.76.
- Une troisième sonde a également été utilisée. Cette dernière correspond à un fragment d'ADN de 1.8kb EcoRI-HindIII contenant le gène srmD. Le gène srmD est un gène isolé de S. ambofaciens capable de conférer la résistance à la spiramycine. En effet, des travaux antérieurs avaient permis le clonage de plusieurs déterminants de résistance de S. ambofaciens, conférant la résistance à la spiramycine à une souche de S.
griseofuscus (souche sensible à la spiramycine) (Pernodet et al., 1993) (Pernodet et al., 1999). Pour isoler des gènes de résistance, une banque cosmidique de l'ADN
génomique de la souche S. ambofaciens ATCC23877 avait été réalisée dans le cosmide pKC505 (Richardson MA et al., 1987). Pour cela l'ADN génomique de la souche S.
ambofaciens ATCC23877 avait été digéré partiellement par Sau3A1 de manière à obtenir des fragments de taille comprise entre environ 30 et 40 kb. L'ADN génomique ainsi digéré
(3pg) avait été ligué avec 1 pg du pKC505 préalablement digéré par l'enzyme BamHI
(Pemodet et al., 1999). Le mélange de ligation avait ensuite été encapsidé in vitro dans des particules phagiques. Les particuiles phagiques obtenues avaient été
utilisées pour infecter la souche d'E. cou HB101 (4ccessible notamment auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, Virginie, USA), sous le numéro 33694).
Environ 20 000 clones d'E. cou résistant à l'apramycine avaient été poolés et les cosmides de ces clones avaient été extraits. Ce pool de cosmides avait été introduit par transformation de protoplastes dans la souche DSM 10191 de S. griseofuscus (Cox KL & Baltz RH.
1984), naturellement sensible à la spiramycine (Rao RN et al., 1987, cette souche est disponible notamment auprès de la German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen (imbH, DSMZ), .';
(Braunschweig, Allamagne), sous le numéro DSM 10191). Les transformants avaient été
sélectionnés sur un milieu contenant de l'apramycine. 1300 des clones poussant sur " = = .. milieu contenant de l'àiiramYcine*A:14ent été transférés sur Milieu contenant 51.tg/m1jFle:::r1 õ
spiramycine. Plusieurs clones résistants à l'apramycine avaient également poussé Sur =
milieu contenant de la spiramycine et les cosmides de ces colonies avaient été
extraits et utilisés pour transformer E. cou i et S. griseofuscus (Pernodet et al., 1999).
Cinq cosmides capables de conférer la résistance à l'apramycine à E. cou i et la co-résistance à
l'apramycine et la spiramycine chez S. griseofuscus avaient ainsi été obtenus.
Parmi ces 5 cosmides, il a été déterminé qu'un cosmide nommé pOS44.1 possède dans son insert un gène (SEQ ID N 15) qui code une protéine (SEQ ID N 16) présentant une certaine similitude avec une protéine codée par le gène mdmA de Streptomyces mycarofaciens (SEQ ID N 88), ce gène a été nommé srmD (cf. alignement présenté en figure 26 réalisé
grâce au programme FASTA (cf.. (Pearson W. R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W.
R., 1990), accessibles notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France).

Pour isoler le déterminant de résistance contenu dans le plasmide pOS44.1, celui-ci a été digéré partiellement par l'enzyme de restriction Sau3A1 de manière à
obtenir des fragments de taille d'environ 1,5 à 3 kb, ces fragments ont été ligués dans le vecteur pIJ486 linéarisé par l'enzyme BamHI (Ward et al., 1986). Un plasmide a été
sélectionné
pour sa capacité à conférer la résistance à la spiramycine chez la souche DSM
10191 de S. griseofuscus (Rao RN et al., 1987), naturellement sensible à la spiramycine (cf. ci-dessus). Pour cela, le pool de plasmides correspondant aux fragment Sau3A1 de pOS44.1 ligués dans le vecteur pI.1486 (cf. ci-dessus), a été introduit par transformation de protoplastes dans la souche DSM 10191 et les transformants ont été
sélectionnés pour leur résistance au thiostrepton (due au gène tsr porté par pli-486). Les clones poussant sur milieu contenant du thiostrepton ont été transférés sur milieu contenant de la spiramycine. Plusieurs clones résistants au thiostrepton ont également poussé
sur milieu contenant de la spiramycine et les plasmides de ces colonies ont été extraits.
Un plasmide conférant la résistance et contenant un insert d'environ 1.8kb a été
sélectionné
et nommé pOS44.2. Cet insert de 1.8kb peut être sorti facilement grâce à un site Hinall .
et un site EcoRI présents dans le vecteur de part et d'autre de l'insert. Cet insert de 1.8kb gène résistance"1 HindlII-EcoRI a été séqüenCê e d e qu'il renferme a été nommé snnD., . , Ce fragment contenant le gène srmD a ainsi pu être facilement sous-cloné dans le vecteur pUC19 (numéro d'accès GenBank M77789) ouvert par EcoRI-HindIII, le plasmide obtenu a été nommé pOS44.4. L'insert de 1.8kb HindIII-EcoRI, contenant le gène srmD, de ce plasmide a été utilisé comme sonde pour localiser les gènes de biosynthèse de spiramycine (cf. ci-dessous).
Un échantillon d'une souche Escherichia Cou DH5a contenant le plasmide pOS44.4 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2918.
Environ 2000 clones de la banque, obtenus ci-dessus (cf. exemple 1), ont été
transférés sur filtre pour hybridation sur colonies selon les techniques classiques (Sambrook et al., 1989).

Les trois sondes décrites ci-dessus ont été marquées au 32P par la technique du random priming (Kit commercialisé par Roche) et utilisées pour l'hybridation des 2000 clones de la banque, transférés sur filtre. L'hybridation a été effectuée à 65 C dans le tampon décrit par Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984). Un lavage a été
effectué en 2X SSC à 65 C pendant 15 minutes et deux lavages successifs ont ensuite été effectués en 0.5X SSC à 65 C, d'une duréç de 15 minutes chacun. Dans ces conditions d'hybridation et de lavage, 16 clones parmi les 2000 hybridés présentaient un fort signal d'hybridation avec au moins une des sondes. Cependant, aucun cosmide n'hybridait avec les trois sondes. Les 16 cosmides ont été extraits et digérés par l'enzyme de restriction BamHI. La comparaison des profils de restriction de ces différents cosmides entre eux, a conduit à choisir deux cosmides susceptibles de contenir les inserts les plus longs de la région et n'ayant pas de bandes communes.
Ainsi deux cosmides l'un nommé pSPM5 et l'autre pSPM7 ont été choisis. Le cosmide pSPM5 hybridait avec les sondes orfl à orf4 et la sonde orf8, mais n'hybridait pas avec la sonde srmD. pSPM7 hybridait seulement avec la sonde srmD et pas avec les deux autres sondes.
=
, Ces deux cosmides ont été séquencés en totalité par la technique du séquençage én:
aveugle ( shotgun sequencing ). Les séquences des inserts de ces deux cosmides:
pSPM7 et pSPM5 ont pu être assemblées car bien que ne se chevauchant pas, chacun des inserts comprenait une séquence connue à l'une de ses extrémités. En effet, chacun de ces inserts comportait un fragment de la séquence d'un des gènes codant une enzyme appelée polyketide synthase (PKS). Ces 5 gènes ont été clonés par Burgett S. et al.
en 1996 (Brevet américain US 5,945,320) (cf. figure 2). Ainsi, il a pu être déterminé une séquence unique d'ADN génomique de S. ambofaciens. Une séquence de 30943 nucléotides partant en 5' d'un site EcoRI situé dans le premier gène PKS et allant jusqu'à un site BamHI en 3' est présentée en SEQ ID N 1. Cette séquence correspond à
la région amont des gènes de la PKS (cf. figure 2 et 3). Une deuxième région de 11171 nucléotides, partant d'un site PstI en 5' et allant jusqu'à un site Ncol en 3' situé dans le cinquième gène de la PKS est présentée en SEQ ID N 2. Cette deuxième région est la région aval des gènes de la PKS (l'aval et l'amont étant défini par l'orientation des 5 gènes de PKS tous orientés dans le même sens) (cf. figure 2 et 3).
EXEMPLE 4 : Analyse des séquences nucléotidiques, détermination des phases ouvertes de lecture et caractérisation des gènes impliqués dans la biosynthèse des spiramycines.
Les séquences obtenues ont été analysées grâc.e au programme FramePlot (Ishikawa J & Hotta K. 1999). Ceci a permis d'identifier, parmi les phases ouvertes de lecture, les phases ouvertes de lecture présentant un usage des codons typique de Streptomyces. Cette analyse a permis de déterminer que cette région comporte 35 ORFs localisées de part et d'autre de cinq gènes codant l'enzyme polyketide synthase (PKS). Respectivement 10 et 25 ORFs ont été identifiées en aval et en amont de ces gènes (l'aval et l'amont étant défini par l'orientation des 5 gènes de PKS
tous orientés dans le même sens) (cf. figure 3). Ainsi, les 25 phases ouvertes de lecture de ce type, , occupant une région d'environ 31 kb (SEQ ID N 1 et figure 3) ont été
identifiées en ln.
=
. 15 amont des 5 gènes codant la PKS et 10 occupant une région d'environ 11,1 kb (SEQ
. .
, N 2 et figure 3), ont été identifiées en aval des' gènes de la PKS. Les gènes de la iéiidn',4 =
, :
amont ont été nommés mil, orfl, or13, orf4, orf5, orf6, orf7, orf8, orf9c, orf10, orfl lc, orf12, orfl3c, o7114, orfl5c, orf16, od17, orf18, orf19, orf20, orf21c, orf22c, orf23c, ot:124c et orf25c (SEQ ID N 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82 et 84). Les gènes de la région aval ont été
nommés orfl *c, orf2*c, orf3*c, orf4*c, orf5*, orf6*, orf7*c, orf8*, orf9*, orf10*
(SEQ ID N 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 et 21). Le c ajouté dans le nom du gène signifiant pour l'ORF en question que la séquence codante est dans l'orientation inverse (le brin codant est donc le brin complémentaire de la séquence donnée en SEQ ID N 1 ou SEQ ID

pour ces gènes) (cf. figure 3).
Les séquences protéiques déduites de ces phases ouvertes de lecture ont été
comparées avec celles présentes dans différentes bases de données grâce à
différents programmes : BLAST (Altschul et al., 1990) (Altschul et al., 1997), CD-search, COGs (Cluster of Orthologous Groups) (ces trois programmes sont accessibles notamment auprès du National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Bethesda, Maryland, USA)), FASTA ((Pearson W. R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990), BEAUTY (Worley K. C.. et al., 1995)), (ces deux programmes sont accessibles notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France). Ces comparaisons ont permis de formuler des hypothèses sur la fonction des produits de ces gènes et d'identifier ceux susceptibles d'être impliqués dans la biosynthèse de spiramycine.
EXEMPLE 5 : Inactivation de gène : principe de la construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue Les méthodes utilisées consistent à effectuer un remplacement de gène. Le gène cible à interrompre est remplacé par une copie de ce gène interrompue par une cassette conférant la résistance à un antibiotique (par exemple l'apramycine ou l'hygromycine), comme l'illustre la figure 9. Les cassettes utilisées sont bordées de part et d'autre par des codons de terminaison de la traduction dans toutes les phases de lecture et par des terminateurs de transcription actifs chez Streptomyces.
, . , = L'insertion de la cassette dâriile gérte.cible' peut s'iccornpagner ou non d'une délétiotil''' dans ce gène cible. La taille des régions flanquant la cassette peut aller de quelques centaines à plusieurs milliers de paires de bases.
Les constructions nécessaires à l'inactivation du gène par la cassette ont été
obtenues chez E. cou, organisme de référence pour l'obtention de constructions d'ADN
recombinant. Le gène interrompu a été obtenu dans un plasmide se répliquant chez E.
cou i mais ne pouvant pas se répliquer chez Streptomyces.
Les constructions ont ensuite été sous-clonées dans des vecteurs pour permettre la transformation et l'inactivation du gène voulu chez S. ambofaciens. Pour cela, deux plasmides ont été utilisés :
- p0J260 (Bierman M. et al., 1992) (cf. exemple 2) qui confère la résistance à

l'apramycine chez E. cou i et Streptomyces et qui a été employé quand le gène cible a été interrompu par une cassette conférant la résistance à l'hygromycine.

-pOSK1205 (4726pb). Ce plasmide dérive du plasmide pBK-CMV (commercialisé
par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA)) dans lequel un fragment Avril contenant la séquence codant la résistance à la Néomycine/Kanamycine a été remplacé par une séquence codant la résistance à l'hygromycine, tout en conservant le promoteur P SV40. Pour cela, le plasmide pHP45-Qhyg (Blondelet-Rouault et al., 1997) a été digéré par les enzymes Noti et Pflml et le fragment conférant la résistance à l'hygromycine a été sous-cloné au niveau du site Avril du vecteur pBK-CMV après que toutes les extrémités aient été rendues bout franc par traitement à l'enzyme de Klenow. Dans pOSK1205, la cassette qui confère la résistance à l'hygromycine est précédée du promoteur pSV40. Ce plasmide confère la résistance à l'hygromycine chez E. cou i et Streptomyces et a été
employé quand le gène cible a été interrompu par une cassette conférant la résistance à l'apramycine.
Les cassettes ont été introduites dans le gène cible soit par clonage en utilisant des sites de restriction présents dans le gène cible, soit par recombinaison entre de courtesu sequences identiques comme décrit par exemple par Ceayeréche et al (Chaveroche MK:H;
:
et al., 2000).
Le plasmide portant le gène interrompu par la cassette peut ensuite être introduit chez Streptomyces ambofaciens, par exemple par conjugaison entre E. cou i et Streptomyces (Mazodier P, et al., 1989). Cette technique a été utilisée dans le cas où le vecteur de base est le vecteur p0J260. Une deuxième technique peut être utilisée : la technique de la transformation de protoplastes après dénaturation par traitement alcalin de l'ADN
(Kieser, T et al., 2000), pour augmenter la fréquence de recombinaison comme décrit par exemple par Oh & Chater (Oh & Chater, 1997). Cette technique a été
utilisée dans le cas où le vecteur de base est p0J260 ou pOSK1205 (cf. ci-dessous). Les transformants sont ensuite sélectionnés avec l'antibiotique correspondant à la cassette présente dans le gène cible (cf. figure 9, antibiotique B). On sélectionne ainsi un mélange de clones parmi lesquels il y a eu intégration par un seul ou par deux événements de recombinaison. Dans un deuxième temps on recherche les clones sensibles à

l'antibiotique pour lequel le gène de résistance est présent dans le vecteur (hors de la cassette de recombinaison) (cf. figure 9, antibiotique A). On peut ainsi sélectionner les clones pour lesquels il y a eu en principe deux événements de recombinaison aboutissant au remplacement du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette. Ces étapes sont schématisées figure 9.
Plusieurs cassettes peuvent être utilisées pour l'interruption des gènes cibles. On peut par exemple utiliser la cassette Qhyg qui confère la résistance à
l'hYgromycine (Blondelet-Rouault et al., 1997, numéro d'accès GenBank : X99315).
EXEMPLE 6: Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue en phase dans le gène orf3 =
Le gène oif 3 avait été interrompu par la cassette Qhyg (cf. exemple 2.2) et il a pu être démontré qu'une souche orf3:: ..<2.hyg ne produit plus de spiramycine, confirmant . .
l'implication d'un ou plusieurs gènes de la région clonée dans la biosynthèse des spiramycines (CE exemple 2.2). Au vu de leur une C.Otrana'cription des Édeeei 1 à 7 est probable (cf. figure 3) et le phénotype observé (non producteur de spiramycines) peut être dû à l'inactivation d'un ou plusieurs des gènes co-transcrits avec orf3. Pour confirmer l'implication de orf3 dans la biosynthèse de spiramycines, une nouvelle inactivation du gène orf3 a été effectuée, cette dernière étant réalisée en phase.
Pour cela, un fragment DraIII interne à orf3 de 504 paires de bases a été
délété. Un fragment d'ADN obtenu à partir de pOS49.1, allant du site EcoRI situé en position 1 (SEQ ID N 1) jusqu'au site Sad situé en position 5274 (SEQ ID N 1) et qui comporte une délétion entre les deux sites DraIII aux positions 2563 et 3067 (504 nucléotides retirés) a été cloné dans le plasmide p0J260 (Bierman M. et al., 1992). Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pOS49.67.
L'insert de pOS49.67 est donc constitué par un fragment d'ADN de S.
ambofaciens contenant les gènes orfl, orf2, orf3 avec la délétion en phase, orf4 et une partie de orf5.
Le vecteur dans lequel cet insert a été sous-cloné est p0J260, le plasmide pOS49.67 confère donc la résistance à l'apramycine et a été introduit par transformation de protoplastes dans la souche 0S49.16 (cf. exemple 2). La souche 0S49.16 étant résistante à l'hygromycine, des transformants hygR et apraR ont été obtenus. Après deux passages de tels clones sur milieu non , sélectif, les clones sensibles à l'apramycine et à
l'hygromycine (apraS et hygS) ont été recherchés. Dans certains de ces clones, on s'attend en effet à ce qu'un événement de recombinaison entre séquences homologues conduise au remplacement de la copie de orf3 interrompue par la cassette .(2hyg (contenu dans le génome de la souche 0S49.16) par la copie de orf3 avec la délétion en phase présente sur le vecteur. Les clones résultant de cette recombinaison sont attendus comme.
apraS et hygS après l'élimination des séquences du vecteur. Le génotype des souches ainsi obtenues peut être vérifié par hybridation ou par PCR et séquençage du produit de PCR (pour vérifier que seule une copie de orf3 délétée en phase est présente dans le génome des clones obtenus). Des clones n'ayant que la copie de orf3 avec une délétion en phase ont ainsi été obtenus et leur génotype a été vérifié. Un clone présentant les,, , 15 caractéristiques recherchées a été plus particulièrement sélectionné et a été nominé

4,11 ';' =
= , ' Un échantillon de la souché 0É49.67 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2916.
EXEMPLE 7: Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue dans le gène orf8 Pour réaliser l'inactivation du gène orf8, une construction dans laquelle la cassette Ohyg a été introduite dans la séquence codante de ore a été obtenue. Pour cela, le plasmide pOS49.88 a tout d'abord été construit. Le plasmide pOS49.88 est dérivé du plasmide pUC19 (numéro d'accès GenBank M77789) par insertion d'un fragment de 3.7 kb (fragment PstI-EcoRI obtenu à partir du cosmide pSPM5), contenant la fin de orfi, orf8 et le début de orf9, cloné dans les sites PstI-EcoRI de pUC19. La cassette flhyg (sous forme d'un fragment BamHI, rendu bout franc par traitement à l'enzyme de Klenow) a été clonée au niveau du site unique Sal1 de pOS49.88 situé dans orf8 après que toutes les extrémités aient été rendues bout franc par traitement à
l'enzyme de Klenow.
Le clonage étant bout franc, deux types de plasmides ont été obtenus selon le' sens d'insertion de la cassette : pOS49.106 dans lequel les gènes hyg et orf8 sont dans la même orientation et pOS49.120 dans lequel les gènes hyg et orf8 sont dans des orientations opposées. L'insert du plasmide pOS49.106 a ensuite été sous-cloné
dans le plasmide p0J260 pour donner pOS49.107. Pour cela, le plasmide pOS49.106 a été
digéré par l'enzyme Asp718I et les extrémités ont été rendues bout franc par traitement à
= l'enzyme de Klenow, ce produit de digestion a été redigéré par l'enzyme PstI et le fragment contenant le gène orf8 dans lequel la cassette f2hyg a été insérée, a été cloné .!!
dans le vecteur p0J260 (cf. ci dessus). Pour cela, le vecteur p0J260 a été
digéré par les , 15 enzymes EcoRV et PstI et utilisé pour la ligation. Cette manipulation permet donc9.kio . . . = d'obtenir une ligation orientée puisque chacun des deux fragments est bout franc côté et PstI de l'autre. Le plasmide obtenu a été nommé pOS49.107.
Le plasmide pOS49.107 a été introduit dans la souche ATCC23877 de S.
ambofaciens par transformation de protoplastes (Kieser, T et al., 2000). Après transformation des protoplastes, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à
l'hygromycine. Les clones résistants à l'hygromycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec hygromycine (antibiotique B) et sur milieu avec apramycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à
l'hygromycine (HygR) et sensibles à l'apramycine (ApraS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène orf8 interrompu par la cassette Ohyg.
Le remplacement de la copie sauvage de orf8 par la copie interrompue par la cassette Qhyg a été vérifié par Southern Blot. Ainsi, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré
par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybridé avec une sonde correspondant à la cassette Qhyg pour vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique des clones obtenus. Une deuxième hybridation a été effectuée en utilisant comme sonde l'insert PstI-EcoRI contenant la fin de orf7, orf8 et le début de orf9 d'une taille d'environ 3,7 kb du plasmide pOS49.88. La vérification du génotype peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séqtfpnçage du produit de PCR.
Un clone orf8::Qhyg a été choisi et nommé 0S49.107. Un échantillon de la souche 0S49.107 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de*A
Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex =
15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2917.
EXEMPLE 8: Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue dans le gène orf10 .
, õ
Un fragment d'ADN de te:g.,,int-ème au gène orf10 a été obtenu par PCII!en;',:i';
;
" 15 utilisant comme matrice, l'ADN génomique de S. ambofaciens et les amorces suivantes : ¨
SRMR1 : 5' CTGCCAGTCCTCTCCCAGCAGTACG 3' (SEQ ID N 89) SRMR2 : 5' TGAAGCTGGACGTCTCCTACGTCGG 3' (SEQ ID N 90) Ce fragment d'ADN issu de la PCR a été cloné dans le vecteur pCR2.1 commercialisé
par la société Invitrogen (Carlsbad, Californie, USA). Le plasmide ainsi obtenu a été
nommé pOS49.32. La cassette Qhyg (sous forme d'un fragment BamHI, cf. ci-dessus) a été clonée au niveau du site unique BstEII interne au fragment du gène orf10, après que toutes les extrémités aient été rendues bout franc par traitement à l'enzyme de Klenow.
Le clonage étant bout franc, deux types de plasmides ont été obtenus selon le sens d'insertion de la cassette : pOS49.43 dans lequel les gènes hyg et orf10 sont dans la même orientation et pOS49.44 dans lequel les gènes hyg et orf10 sont dans des orientations opposées. L'insert du plasmide pOS49.43 a été transféré (sous forme d'un fragment Asp7181-Xbal dont les extrémités ont été rendues bout franc par traitement à
l'enzyme de Klenow) dans le site EcoRV du plasmide p0J260 ce qui a permis d'obtenir le plasmide pOS49.50. Le plasmide pOS49.50 contenant le fragment du gène orf10 interrompu par la cassette Qhyg a été introduit dans la souche ATCC23877 de Streptomyces ambofaciens. Après transformation, les clones;sont sélectionnés pour leur résistance à l'hygromycine. Les clones résistants à l'hygromycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec hygromycine (antibiotique B) et sur milieu avec apramycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à
l'hygromycine (HygR) et sensibles à l'apramycine (ApraS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène otf10 interrompu par la cassette Qhyg. Des clones qui possédaient le marqueur de résistance à l'hygromycine porté par la cassette et qui avaient perdu le marqueur de résistance à l'apramycine porté
par le vecteur p0J260 ont ainsi été obtenus. L'événement de remplacement de la copie sauvage =
de orf10 par la copie interrompue orf10::Qhyg a été vérifié par Southern Blot.
Ainsi, l'ADN génomique total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé
-.; , , = = , .
sur gel d'agarose, transféré sur Membrane et hybridé avec une sonde correspondant à là
cassette Qhyg pour vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique des clones obtenus. Une deuxième hybridation a été effectuée en utilisant comme sonde le produit PCR de 1,5 kb interne au gène orf10 (cf. ci-dessus).
Un clone présentant les caractéristiques attendues (orf10::Dhyg) a été plus particulièrement sélectionné et nommé 0S49.50. Il a pu en effet être vérifié
grâce aux deux hybridations que la cassette Qhyg était bien présente dans le génome de ce clone et que l'on obtient bien le profil de digestion attendu dans le cas d'un remplacement, à la suite d'un double événement de recombinaison, du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette Qhyg dans le génome de ce clone. La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR.

EXEMPLE 9: Inactivation de gènes : principe de la construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue selon la technique des cassettes excisables (cf. Figure 9 et 10) Un deuxième type de cassettes peut être utilisé pour l'inactivation de gènes :
les cassettes dites cassettes excisables . Ces cassettes présentent l'avantage de pouvoir être excisées chez Streptomyces par un événement de recombinaison spécifique de site après avoir été introduites dans le génome de S. ambofaciens. Le but est d'inactiver certains gènes dans des souches de Streptomyces sans laisser dans la souche finale de marqueurs de sélection ou de grandes séquences d'ADN n'appartenant pas à la souche.
Après excision il subsiste uniquement une courte séquence d'environ une trentaine de paires de bases (appelé site cicatriciel ) dans le génome de la souche (cf.
figure 10).
La mise en oeuvre de ce système consiste, dans un premier temps, au remplacement , de la copie ,sauvage du gène ciblé (grâce" à deux événements de recombinaison = homologue, cf. figure 9) par une construction dans laquelle une cassette excisable a été
insérée dans ce gène cible. L'insertion de cette cassette est accompagnée d'une délétion dans le gène cible (cf. figure 9). Dans un deuxième temps, l'excision de la cassette excisable du génome de la souche est provoquée. La cassette excisable fonctionne grâce à un système de recombinaison spécifique de site et a pour avantage de permettre l'obtention de mutants de Streptomyces ne portant finalement pas de gène de résistance.
On s'affranchit également d'éventuels effets polaires sur l'expression des gènes situés en aval du ou des gènes inactivés (cf. figure 10).
L'emploi de cassettes excisables a été décrit et utilisé chez de nombreux organismes dont les cellules de mammifère, de levures et chez E. cou (Bayley et al., 1992 ; Brunelli et Pall, 1993 ; Camilli et al., 1994 ; Dale et Ow, 1991 ; Russell et al., 1992; Lakso et al., 1992). Ces cassettes excisables utilisent toutes la recombinase spécifique de site Cre agissant sur les sites lox. Ce système de recombinaison provient du bactériophage Pi.

Pour la construction d'un système de type cassette excisable chez Streptomyces, il a été tiré partie du système de recombinaison spécifique de site décrit pour l'élément génétique mobile pSAM2 de Streptomyces ambofaciens (Boccard et al., 1989a et b). Le système mis en place consiste dans un premier temps à construire un vecteur recombinant comportant le gène à interrompre dans lequel est insérée une cassette excisable. L'insertion dans le gène cible de la cassette excisable s'accompagne d'une délétion dans le gène cible. Elle peut être réalisée par clonage en utilisant des sites de restriction présents dans le gène cible ou par recombinaison entre de courtes séquences identiques comme décrit par exemple par Chaveroche et al (Chaveroche MK et al.;
2000). La cassette excisable peut être construite en utilisant par exemple la cassette Qhyg (Blondelet Rouault et a/.,1997). Cette cassette a été bordée par des séquences attR
et attL qui flanquent normalement la copie intégrée de pSAM2 (cf. figure 15).
Les séquences attL et attR contiennent tous les sites nécessaires à la recombinaison site-spécifique permettant l'excision de pSAM2 ou de tout fragment d'ADN situé
entre ces deux régions (Sezonov et al., 1997, Raynal et a/.,1998). La construction d'une telle . cassette n'est évidemment pas limitée à l'utilisation d'une cassette Qhyg, mais d'autre' ; =
cassettes de résistances jaelivént servir de base à là cénstruction de cette cassettte (Pà.ea e ;!µ
exemple la cassette Qaac ou Qvph (Blondelet Rouault et a/.,1997)).
Après l'obtention de cette construction, la souche de Streptomyces est transformée avec le plasmide recombinant. Les transformants sont ensuite sélectionnés avec l'antibiotique correspondant à la cassette présente dans le gène cible (cf.
figure 9, antibiotique B, il s'agit par exemple d'une sélection par Phygromycine si la cassette excisable dérive de la cassette Qhyg). On sélectionne ainsi un mélange de clones parmi lesquels il y a eu intégration par un seul ou par deux événements de recombinaison.
Dans un deuxième temps on recherche les clones sensibles à l'antibiotique pour lesquels le gène de résistance est présent dans le vecteur (hors de la cassette de recombinaison) (cf. figure 9, antibiotique A). On peut ainsi sélectionner les clones pour lesquel il y a eu en principe deux événements de recombinaison aboutissant au remplacement du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette. Ces étapes sont schématisées figure 9, le génotype des clones ainsi obtenus est vérifié par Southern blot et une souche =

présentant les caractéristiques voulues (le remplacement du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette excisable) est sélectionnée.
Dans un deuxième temps, la souche selectionnée ci-dessus, est transformée par un plasmide permettant l'expression des gènes xis et int qui sont tous deux nécessaires à la recombinaison spécifique de site entre les sites attR et attL. Cette recombinaison entraîne lé départ de la cassette excisable du génome de la souche, grâce à un événement de recombinaison (cf. figure 10) (Raynal et al., 1998). Il est intéressant de choisir le vecteur portant les gènes xis et int parmi les vecteurs relativement instables chei>.
Streptomyces (par exemple dérivé du vecteur Streptomyces pWHM3, (Vara et al., 1989)), ceci permet d'obtenir une souche ayant perdu ce dernier vecteur après quelques cycles de sporulation en absence de pression de sélection.
Pour exciser la cassette, on peut par exemple utiliser le plasmide pOSV508 (cf. figure.
14) qui est introduit par transformation de protoplastes dans la souche de S.
ambofaciens, , ' contenant un gène interrompu par la cassette excisable. Le plasmide pOSV508 est dérivé
õ
le=;Y='. 15 du plasmide pWHM3 (Vara J et al ,1989) (cf, figure 13) dans lequel ont été ajoutes IOS
=
gènes xis et int de pSAM2 (Boccard F. et al., 198.9b) placés sous le contrôle' diïç'P'l promoteur ptrc (Amann, E. et al., 1988). Les gènes xis et int placés sous le contrôle du promoteur pire ont été sous clonés dans le plasmide pWHM3 à partir du plasmide pOSint3 (Raynal et al., 1998) (cf. figure 14). L'introduction dans la souche mutante du plasmide pOSV508 portant les gènes xis et int de pSAM2 va permettre l'excision efficace par recombinaison spécifique de site de la cassette excisable entre les sites attL
et attR flanquant cette cassette (Raynal A. et al., 1998) (figure 10). Parmi les transformants, sélectionnés pour leur résistance au thiostrepton due au gène tsr porté par pOSV508, on choisit ceux devenus sensibles à l'antibiotique auquel la présence de la cassette confère la résistance (cf. figure 10). L'excision est efficace et il a été observé
que plus de 90% des transformants sont de ce type. Après un ou plusieurs cycles de croissance et sporulation sur un milieu solide dépourvu de thiostrepton, on obtient des clones ayant perdu le plasmide pOSV508. Ces clones sont repérables par leur sensibilité

au thiostrepton. La séquence du gène cible délété peut être vérifiée par PCR
et séquençage du produit PCR.
Finalement, la souche résultante porte au niveau du gène inactivé (délétion interne par exemple) un site att cicatriciel correspondant au site attB minimal (Raynal et al., 1998), issu de la recombinaison entre les sites attR et attL. Ce site attB
minimal qui subsiste est semblable à celui présent naturellement dans les souches de Streptomyces ambofaciens, Streptomyces pristinaespiralis et Streptomyces lividans (Sezonov et al., 1997).
Le gène que l'on veut inactiver peut être cotranscrit avec d'autres gènes situés en aval. Pour éviter que l'inactivation d'un des gènes ait un effet polaire sur l'expression des gènes en aval dans l'opéron, il est important d'obtenir une délétion en phase après excision de la cassette. Le système des cassettes excisables tel que décrit ci-dessus permet de répondre à une telle exigence. L'homme du métier pourra, en effet, aisément construire trois cassettes excisables distinctes, celles-ci laissant après excision une 15, séquence de 33, 34 ou 35 nucléotides respectivement, sans codon stop quelle que soit la õ
:= '=
phase de lecture. Connaissant la 'séquence du gène cible et la taille de la délétion associée à l'insertion de la cassette, il est possible de choisir entre ces trois cassettes excisables de façon à ce que l'excision conduise à une délétion en phase. Sur les 33, 34 ou 35 nucléotides rajoutés, 26 correspondent à la séquence attB minimale (cf.
figure 27).
Dans le cas de la présente demande, deux cassettes excisables ont été
utilisées. Ces deux cassettes sont les suivantes : attlQhyg+ (SEQ ID N 91) et att3Daac- (SEQ
ID N
92), ces cassettes laissent respectivement 33 et 35 nucléotides après excision. Elles comportent respectivement la cassette Qhyg ou la cassette Qaac, les signes +
et ¨
correspondant à l'orientation de la cassette de résistance. Ces deux cassettes ont été
construites et clonées au niveau du site EcoRV du vecteur pBC SK+ dont le site HindlIl a été suprimé au préalable. Les plasmides obtenus ont été nommés patt1f1hyg+
et patt3naac- respectivement. Les cassettes excisables peuvent être facilement sorties par une digestion du plasmide par EcoRV.

EXEMPLE 10: Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue dans le gène orfl L'inactivation du gène orf2 a été réalisée grâce à la technique des cassettes excisables (cf. ci-dessus). La souche de départ utilisée est la souche Streptomyces ambofaciens OSC2 qui dérive de la souche ATCC23877. Cependant, la souche OSC2 diffère de la souche ATCC23877 en ce qu'elle a perdu l'élément génétique mobile pSAM2 (Boccard et al., 1989a et b). Cet élément mobile peut être perdu de manière spontanée au cours de la protoplastisation (action du lysozyme pour digérer la paroi bactérienne et fragmenter le mycélium (Kieser et al., 2000)) et de la régénération des protoplastes de la souche ATCC23877. Pour sélectionner les clones ayant perdu l'élément pSAM2, il a été mis en place un crible, basé sur la répression du gène pra par le répresseur de transcription KorSA (Sezonov et al., 1995) (Sezonov G. et al., 2000).
Pour cela, un fragment d'ADN contenant le promoteur du gène pra placé en amont du .::;
gène aph (conférant la résistance à la kanamycine et dépourvu de son propre promoteur) er, a été cloné dans le vecteur instable pWHM3Hyg, ce dernier dérivant du plasmide,i' Pe-= pWHM3 (Vara et al., 1989) dans lequel le gène tsr a été remplacé par le gèneleé:;;:t1 =
(conférant la résistance à l'hygromycine). Le plasmide ainsi obtenu a été
nomnié
pOSV510. La souche ATCC23877 a été transformée après protoplastisation par le plasmide pOSV510. Le promoteur Pra est un promoteur réprimé par le répresseur KorSA, le gène codant ce dernier étant situé au sein de l'élément mobile pSAM2 (Sezonov G. et al., 2000). Après transformation par le plasmide pOSV510, les bactéries transformées sont sélectionnées pour leur résistance à la kanamycine (due au gène aph porté par pOSV510). Les clones ayant perdu l'élément intégratif pSAM2 ont perdu le répresseur KorSA et le promoteur Pra n'est donc plus réprimé et permet l'expression du gène de résistance à la kanamycine aph. Une sélection par la kanamycine après transformation par le plasmide pOSV510 permet donc de sélectionner les clones ayant perdu l'élément intégratif pSAM2 (et donc KorSA) et possédant le plasmide pOSV510.
Le plasmide pOSV510 étant instable, après quelques cycles de sporulation sans antibiotique, des clones isolés sont repiqués sur milieu avec kanamycine, sur milieu avec hygromycine et sur milieu sans antibiotique. Les clones sensibles à la kanamycine et à

l'hygromycine ont perdu pOSV510. La perte de l'élément pSAM2 a été vérifiée par hybridation et PCR. Un clone présentant les caractéristiques souhaitées a été
sélectionné
et a été nommé OSC2.
Un échantillon de la souche OSC2 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement I-2908.
L'inactivation du gène oie a été réalisée grâce à la technique des cassettes excisables (cf. ci-dessus et figure 10). Pour cela, un insert de 4,5 kb dont la séquence part du site EcoRI situé en position 1 jusqu'au site BamHI situé en position 4521 (SEQ
ID N 1) a été sous-cloné au niveau des sites Ecolb et BamHI du plasmide pUC19 .
(numéro d'accès GenBank M77789) à partir du cosmide pSPM5. Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pOS49.99.
Ce plasmide a été introduit dans la souche E colt KS272 qui contenait déjà:14, , plasmide pKOBÉG (Chaveroche et al., 2000) (cf. figure 12).
' ="'' En parallèle, la cassette excisable att3Qaac- (SEQ ID N 92, cf. ci dessus) a été
amplifiée par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pOSK1102 (Le plasmide pOSK1102 est un plasmide dérivé du vecteur pGP704Not (Chaveroche et al., 2000) (Miller VL & Mekalanos JJ, 1988) dans lequel la cassette att3Qaac- a été
clonée comme un fragment EcoRV dans le site unique EcoRV de pGP704Not) et à l'aide des amorces suivantes :

5' COCGCGCGGCAGOCTOTCCGTGATCGAGTCCGGCGTGACCATCGCGCGCGOTTCGTTCGG-31 (SEQ
ID N 93) 5' GCTOCGTGCGTCATGCAGGAA3GTGTCGTAGTCGCGGTAGATCTGCCTOTTCGTCCCGAA-3, (SEQ
ID N 94) Les 40 déoxy-nucléotides situés à l'extrémité 5' de ces oligonucléotides comportent une séquence correspondant à une séquence dan' s le gène cible (orf2 dans le cas présent) et les 20 déoxy-nucléotides situés le plus en 3' (figuré en gras ci-dessus) correspondent à la séquence d'une des extrémités de la cassette excisable att3Qaac- (cf.
figure 11).
Le produit de PCR ainsi obtenu a été utilisé pour transformer la souche E.
épli contenant les plasmides pKOBEG et pOS49.99 comme décrit (Chaveroche et al., 2000) (cf.
figure 12). Ainsi, les bactéries ont été transformées par électroporation et sélectionnées pour leur résistance à Papramycine. Les plasmides des clones obtenus ont été
extraits et digérés par plusieurs enzymes de restriction, dans le but de vérifier que le profil de digestion obtenu correspond au profil attendu s'il y a eu insertion de la cassette (att3Qaac-) dans le gène cible (orf2), c'est à dire si il y a bien eu recombinaison .
homologue entre les extrémités du produit PCR et le gène cible (Chaveroche et al., 2000). La vérification de la construction peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides .
= appropriés et séquençage du produit de PCR. Un clone dont le plasmide possède lé
¨
profil attendu a été sélectionné et le plasmide correspondant a été nominé
pSPM17.
plasmide dérive de pOS49.99 dans lequel o,12 est interrompue par la cassette apramycine (cf. figure 12).
L'insertion de la cassette s'accompagne d'une délétion dans orf2, entre les nucléotides 211 et 492 de la partie codante de orfl.
Le plasmide pSPM17 a été digéré par l'enzyme EcoRI puis les extrémités ont été

rendues bout franc par traitement à l'enzyme de Klenow, ce produit de digestion a été
ensuite digéré par l'enzyme XbaI et l'insert contenant le gène orf2 délété a été cloné
dans le vecteur pOSK1205 (cf. ci dessus). Pour cela, le vecteur pOSK1205 a été
digéré
par l'enzyme BamHI puis les extrémités ont été rendues bout franc par traitement à
l'enzyme de Klenow, ce produit a été ensuite digéré par l'enzyme Xbal, et utilisé pour la ligation avec l'insert obtenu à partir de pSPM17 comme ci-dessus. Cette manipulation permet donc d'obtenir une ligation orientée puisque chacun des deux fragments est bout franc d'un côté et Xbal de l'autre. Le plasmide ainsi obtenu a été nommé
pSPM21, il porte un gène de résistance à l'hygromycine (partie vecteur) et un insert dans lequel le gène orf2 délété est remplacé par la cassette att32aac-.
Le vecteur pSPM21 a été introduit dans la souche Streptomyces ambofaciens OSC2 (cf. ci dessus) par transformation de protoplastes (Kieser, T et al., 2000).
Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à
l'apramycine Les clones résistants à l'apramycine sont ensuite repiqués respectivement sur mili4 avec apramycine (antibiotique B) et sur milieu avec hygpromycine (antibiotique A) (cf. 'figure 9). Les clones résistants à l'apramycine (ApraR) et sensibles à l'hygromycine (HygS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène orf2 interrompu par la cassette att3Daac-. Ces clones ont été
sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de orf2 par la copie interrompue par la cassette a été vérifié. La présence de la cassette att3Daac- a été vérifiée par PCR sur colonie. Une hybridation a également été effectuée. Pour cela, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur , , membrane et hybridé avec une sonde de 3 kb correspondant à un fragment EcoR1-BamHI de l'insert du plasmide pOS49.99 (cf ci-dessus). La vérification du génotYpe,'',..
peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier èt.'!.=?.i notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR.
Un clone présentant les caractéristiques attendues a été sélectionné et nommé
SPM21. Il a pu être vérifié grâce à la PCR et à l'hybridation que la cassette att3Qaac-était bien présente dans le génome de ce clone et que l'on obtient bien le profil de digestion attendu dans le cas d'un remplacement, à la suite d'un double événement de recombinaison, du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette att3Qaac- dans le génome de ce clone. Ce clone possède donc le génotype : orf2::att312aac-.
Un échantillon de la souche SPM21 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement I-2914.

La souche SPM21 a été transformée par le vecteur pOSV508 par transformation de protoplastes pour provoquer l'excision de la cassette (cf. figure 14). Le plasmide pOSV508 est dérivé du plasmide pWHM3 (Vara J et a/.,1989) (cf. figure 13) dans lequel il a été ajouté les gènes xis et int de pSAM2 (Boccard F. et al., 1989b) placé sous le contrôle du promoteur ptrc (Amann, E. et al., 1988) (cf. figure 14).
L'introduction dans la souche SPM21 du plasmide pOSV508 portant les gènes xis et int de pSAM2 permet l'excision efficace par recombinaison spécifique de site de la cassette excisable entre les sites attL et attR flanquant cette cassette (Raynal A. et al., 1998) (figure 10).
Parmi les transformants sélectionnés pour leur résistance au thiostrepton due au gène tsr porté par pOSV508, on choisit ceux devenus sensibles à l'apramycine dont le gène de résistance est porté par la cassette ataaaac-, l'excision entraîne en effet la perte de ce gène de résistance (cf. figure 10). Le plasmide pOSV508 est instable et après deux passages successifs sur milieu sans antibiotique des clones isolés sont repiqués sur ;-' milieu avec thiostrepton et sur milieu sans thiostrepton. Les clones sensibles au ',==
thiostrepton ont perdu pOSV508. Il a été vérifié que l'excision de la cassette aboutit bien , . .
. à une délétion en phase dans le gène orf2 par PCR et séquençage du produit Pqt, l'excision de la cassette laisse en effet une séquence ' cicatricielle att3 caractérisfiquè
(qui est similaire au site attB d'origine après recombinaison entre les sites attL et attR):
5' ATCGCGCGCGCTTCGTTCGGGACGAAGAGGTAGAT 3' (SEQ ID N 95).
La souche ainsi obtenue et possédant le génotype voulu (orf2::att3) a été
nommée SPM22.
Un échantillon de la souche SPM22 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement I-2915.

EXEMPLE 11: Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue dans le gène m112 Pour l'inactivation de orf12, orfl3c et orf14 un même plasmide de départ (pSPM504) a été employé pour introduire à différentes positions une cassette de type cassette excisable . Ce plasmide possède un insert de )5,1 kb qui correspond à la région de orf7 à orf17. Pour construire ce plasmide un' fragment Bg111 de 15,1 kb provenant de la digestion du cosmide pSPM7 (cf. ci-dessus) a été cloné dans le plasmide pMBL18 (Nalçano et al., 1995) digéré par BamHI. Les extrémités BamHI et Bg111 étant compatibles, on obtient après ligation, le plasmide pSPM502. La totalité de l'insert de pSPM502 a ensuite été sous-cloné (sous forme d'un fragment HinclIIIINhel) dans le plasmide pOSK1205 (digéré par Hindln/NheI) ce qui a permis d'obtenir le plasmide pSPM504.
Ce plasmide a été introduit dans la souche E. cou KS272 qui contenait déjà le =
plasmide pKOBEG (Chaveroche et al., 2000) (cf. figure 12).
=
õ
,,r. =
=
. it En parallèle, la cassette excisable att3e2aac- a été amplifiée par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pOSK1102 (le plasmide pOSK1102 est un plasmide dérivé
du vecteur pGP704Not (Chaveroche et al., 2000) (Miller VL & Mekalanos JJ, 1988) dans lequel la cassette att3Qaac- a été clonée comme un fragment EcoRV dans le site unique EcoRV de pGP704Not), les amorces utilisées sont les suivantes :
EDR8:5' CGGGATGATCGCTTGTCCGGCGGCCGGATGCCTAGCCTCATCGCGCGCGCTTCGTTCGG 3' (SEQ ID N 96) EDR9:5' CCCGATCCAGAACGTCTGGTCGGTGATCAGGTCGCTGTTCATCTGCCTCTTCGTCCCGAA 3' (SEQ ID N 97) Les 40 (seulement 39 pour EDR8) déoxy-nucléotides situés à l'extrémité 5' de ces oligonucléotides comportent une séquence correspondant à une séquence dans le gène cible (orf12 dans le cas présent) et les 20 déoxy-nucléotides situés le plus en 3' (figuré en gras ci-dessus) correspondent à la séquence d'une des extrémités de la cassette excisable att3Qaac- (cf. figure 11).
Le produit de PCR ainsi obtenu a été utilisé pour transformer la souche E. cou KS272 contenant les plasmides, pKOBEG et pSPM504 (cf. ci-dessus), comme décrit par Chaveroche et al. (Chaveroche* et al., 2000) (cf. figure 12 pour le principe, le plasmide pOS49.99 doit être remplacé par le plasmide pSPM504 et le plasmide obtenu n'est plus pSPM17 mais pSPM507). Ainsi, les bactéries ont été transformées par électroporation par ce produit de PCR et les clones ont été sélectionnés pour leur résistance à
l'apramycine. Les plasmides des clones obtenus ont été extraits et digérés par plusieurs enzymes de restriction, dans le but de vérifier que le profil de digestion obtenu correspond au profil attendu s'il y a eu insertion de la cassette (att3Qaac-) dans le gène cible (orf12), c'est à dire si il y a bien eu recombinaison homologue entre les extrémités du produit PCR et le gène cible (Chaveroche et al., 2000). La vérification de la construction peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en Utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR. Un clone dont le plasmide possède le profil attendu a été
sélectionné
et le plasmide correspondant a été nommé pSPM507. Ce plasmide dérive de pSPM504 dans lequel orf12 est interrompue par la cassette att32aac- (cf. figure 12).
L'insertion de la cassette s'accompagne d'une délétion dans le gène orf12, l'interruption commence au niveau du trentième codon de orf12. Il reste après la cassette les 46 derniers codons de orf12.
Le vecteur pSPM507 a été introduit dans la souche Streptomyces ambofaciens (cf. ci-dessus) par transformation de protoplastes (Kieser, T et al., 2000).
Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à
l'apramycine. Les clones résistants à l'apramycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec apramycine (antibiotique B) et sur milieu avec hygromycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'apramycine (ApraR) et sensibles à l'hygromycine (HygS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène orf12 interrompu par la cassette att3Qaac-. Ces clones ont été plus particulièrement sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de orf12 par la copie interrompue par la cassette a été vérifié par hybridation. Ainsi, l'ADN
total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré
sur membrane et hybridé avec une sonde correspondant à la cassette att3Qaac-pour vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique des clones obtenus.
Une deuxième hybridation a été effectuée en utilisant comme sonde un fragment d'ADN
obtenu par PCR et correspondant à une très large partie de la séquence codante du gène orf12.
La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de , l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR.
Un clone présentant les caractéristiques attendues (orf12::att3Qaac-) a été
plus particulièrement sélectionné et nommé SPM507. II a pu en effet être vérifié
grâce aux . .
deux hybridations que la cassette att3Qaac- était bien présente dans le génome de ce clone et que l'on obtient bien le profil de digestion attendu dans le cas d'un remplacement, à la suite d'un doublé événement de recombinaison, du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette att3Qaac- dans le génome de ce clone. Ce clone possède donc le génotype : orf12::att3É2aac- et a été nommé SPM507. Il est inutile de procéder à l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de orf12, au vu de l'orientation des gènes (cf. figure 3). En effet, le fait que orfl3c soit orienté en sens opposé à orf12 montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits.
L'utilisation d'une cassette excisable permet en revanche d'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de sélection à tout moment, notamment par transformation par le plasmide pOSV508. Un échantillon de la souche SPM507 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2911.

EXEMPLE 12: Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue dans le gène orfl3c La cassette excisable att3Qaac- a été amplifiée par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pOSK1102 (cf. ci-dessus) à l'aide des amorces suivantes :

ACCGGGGCGGTCCTCCCCTCCGGGGCGTCACGGCCGCGGAATCTGCCTCTTCGTCCCGAA 3' (SEQ ID N 98) EDR4:5' CACGCAGCGAGCCGACGCACTGATGGACGACACGATGGCCATCGCGCGCGCTTCGTTCGG
(SEQ ID N 99) =
Les 40 déoxy-nucléotides situés à l'extrémité 5' de ces oligonucléotides comportent une séquence correspondant à une séquence dans le gène cible (orf1.3c dans le cas présent) et les 20 déoxy-nucléotides situés le plus en 3' (figuré en gras ci-dessus) correspondent à la séquence d'une des extrémités de la cassette excisable att3Qaac- (c figure 11).
=,.1:;), Le produit de PCR ainsi obtenu a été utilisé pour transformer la souche E
P =
' KS272 contenant les plasmides pKOBEG et pSPM504 (cf. ci-dessus), comme décrit par Chaveroche et al. (Chaveroche et al., 2000) (cf. figure 12 pour le principe, le plasmide pOS49.99 doit être remplacé par le plasmide pSPM504 et le plasmide obtenu n'est plus pSPM17 mais pSPM508). Ainsi, les bactéries ont été transformées par électroporation par le produit de PCR et les clones ont été sélectionnés pour leur résistance à
l'apramycine. Les plasmides des clones obtenus ont été extraits et digérés par plusieurs enzymes de restriction, dans le but de vérifier que le profil de digestion obtenu correspond au profil attendu s'il y a eu insertion de la cassette (att3Qaac-) dans le gène cible (orfl3e), c'est à dire si il y a bien eu recombinaison homologue entre les extrémités du produit PCR et le gène cible (Chaveroche et al., 2000). La vérification de la construction peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR. Un clone dont le plasmide possède le profil attendu a été
sélectionné
et le plasmide correspondant a été nommé pSPM508. Ce plasmide dérive de pSPM504 dans lequel orfl3c est interrompue par la cassette apramycine (cf. figure 12).
L'insertion de la cassette s'accompagne d'une délétion dans le gène orfl3c, l'interruption commence au niveau du sixième codon de orfl3c. Il reste après la cassette les 3 derniers codons de orfl3c.
Le vecteur pSPM508 a été introduit dans la souche Streptomyces ambofaciens OSC2 (cf. ci-aessus) par transformation de protoplastes (Kieser, T et al., 2000). Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à
l'apramycine. Les clones résistants à l'apramycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec , .
apramycine (antibiotique B) et sur milieu avec hygromycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'apramycine (ApraR) et sensibles à l'hygromycine (HygS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène orfl3c interrompu par la cassette att3Qaac-. Ces clones ont été plus particulièrement sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de orfl3c par la copie interrompue par la cassette a été vérifié par hybridation. Ainsi, l'ADN
total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré":;:, =
k -rê= sur membrane et hybridé avec une sonde correspondant à la cassette att3Qaac- pour.
vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique des clones obtenus.
Une = ' deuxième hybridation a été effectuée en utilisant comme sonde un produit de PCR
correspondant à une séquence débordant d'une centaine de paires de base en amont et en aval de la séquence codante de orfl3c. La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR.
Un clone présentant les caractéristiques attendues (orfl3c::att3f2aac-) a été
plus particulièrement sélectionné et nommé SPM508. Il a pu en effet être vérifié
grâce aux deux hybridations que la cassette att3Qaac- était bien présente dans le génome de ce clone et que l'on obtient bien le profil de digestion attendu dans le cas d'un remplacement, à la suite d'un double événement de recombinaison, du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette att3Qaac- dans le génome de ce clone. Ce clone possède donc le génotype : orfl3c::att3f2aac- et a été nommé SPM508. Il est inutile de procéder à l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de orfl3c, au vu de l'orientation des gènes (cf. figure 3), le fait que orf14 soit orienté
en sens opposé à
orfl3c montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits. L'utilisation d'une cassette excisable permet en revanche d'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de sélection à tout moment. Un échantillon de la souche SPM508 a été déposé
auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2912.
EXEMPLE 13 Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens =
interrompue dans le gène orf14 La cassette excisable att312aac- a été amplifiée par PCR en utilisant comme ;
matrice le plasmide pOSK1102 (cf. ci-dessus) à l'aide des amorces suivantes :
, EDR5: 5'GG6CGTGAAàCGGGCGAGTàTOdâTàTCAI'déGAG.T'ACTdATCOCGdOCGCTirCGTTCGC
, (SEQ ID N 100) EDR6: 5'CGGGAAACGGCGTCGCACTCCTCGGGGGCCGCGTCAGCCCATCTGCCTCTTCGTCCCGAA 3' (SEQ ID N 101) Les 40 déoxy-nucléotides situés à l'extrémité 5' de ces oligonucléotides comportent une séquence correspondant à une séquence dans le gène cible (orf14 dans le cas présent) et les 20 déoxy-nucléotides situés le plus en 3' (figuré en gras ci-dessus) correspondent à la séquence d'une des extrémités de la cassette excisable att3Qaac- (cf.
figure 11).
Le produit de PCR ainsi obtenu a été utilisé pour transformer la souche E.
coui KS272 contenant les plasmides pKOBEG et pSPM504 (cf. ci-dessus), comme décrit par Chaveroche et al. (Chaveroche et al., 2000) (cf. figure 12 pour le principe, le plasmide pOS49.99 doit être remplacé par le plasmide pSPM504 et le plasmide obtenu n'est plus pSPM17 mais pSPM509). Ainsi, les bactéries ont été transformées par électroporation par le produit de PCR et les clones ont été sélectionnés pour leur résistance à
l'apramycine. Les plasmides des clones obtenus ont été extraits et digérés par plusieurs enzymes de restriction, dans le but de vérifier que le profil de digestion obtenu correspond au profil attendu s'il y a eu insertion de la cassette (att3Qaac-) dans le gène cible (orf14), c'est à dire si il y a bien eu recombinaison homologue entre les extrémités , du produit PCR et le gène cible (Chaveroche et al., 2000). La vérification de la construction peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR. Un clone dont le plasmide possède le profil attendu a été
sélectionné
et le plasmide correspondant a été nommé pSPM509. Ce plasmide dérive de pSPM504 ' dans lequel orf14 est interrompu par la cassette apramycine (cf. figure 12).
L'insertion de ... ;
la cassette s'accompagne d'une délétion dans le gène orf14, l'interruption commence au =
=
niveau du quatrième codon de Orf14. 11 reste après la cassette le dernier codon de olf14., Le vecteur pSPM509 a été introduit dans la souche Streptomyces ambofaciens' OSC2 (cf. ci-dessus) par transformation de protoplastes (Kieser, T et al., 2000). Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à
l'apramycine. Les clones résistants à l'apramycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec apramycine (antibiotique B) et sur milieu avec hygromycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'apramycine (ApraR) et sensibles à l'hygromycine (HygS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène orf14 interrompu par la cassette att3Qaac-. Ces clones ont été plus particulièrement sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de orf14 par la copie interrompue par la cassette a été vérifié par hybridation. Ainsi, l'ADN
total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré
sur membrane et hybridé avec une sonde correspondant à la cassette att3Qaac-pour vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique des clones obtenus.
Une deuxième hybridation a été effectuée en utilisant comme sonde un produit de PCR

correspondant à une séquence débordant d'une centaine de paires de base en amont et en aval de la séquence codante de orf14. La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR.
Un clone présentant les caractéristiques attendues (orf14::att3.0aac-) a été
plus particulièrement sélectionné et nommé SPM509. Il a pu en effet être vérifié
grâce aux deux hybridations que la cassette att3Qaac- était bien présente dans le génome de ce clone et que l'on obtient bien le profil de digestion attendu dans le cas d'un remplacement, à la suite d'un double événement de recombinaison, du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette att3Qaac- dans le génome de ce clone. Ce clone possède donc le génotype : orf14::att3.0aac- et a été nommé SPM509. Il est inutile de procéder à l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de orf14, au vu de l'orientation des gènes (cf. figure 3), le fait que orfl5c soit orienté
en sens opposé=
à orf14 montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits. L'utilisation d'une cassette ' . 15 excisable permet en revanche d'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur deAi sélection à tout moment Un échantillon de la souche SPM509 à été déposé auprès dela =
Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2913.
EXEMPLE 14: Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue dans le gène orf6*
L'inactivation du gène orf6* a été réalisée grâce à la technique des cassettes excisables (cf. ci-dessus et figure 10). Pour cela, le cosmide pSPM7 a été
utilisé comme matrice pour amplifier un fragment du gène orf6* grâce aux oligonucléotides suivants :
C9583 : 5' CTGCAGGTGCTCCAGCGCGTCGATCT 3' (oligo sens) (SEQ ID No 102) C9 5 8 4 : 5' CTGCAGACGGAGGCGGACCTGCGGCT 3' (oligo antisens) (SEQ ID No 1 0 3 ) Les 20 déoxy-nucléotides situés à l'extrémité 3' de ces oligonucléotides correspondent à une séquence située dans la partie codante du gène orf6* (SEQ
N
13) et les 6 déoxy-nucléotides situés les plus en 5' correspondent à la séquence d'un site Pstl permettant de faciliter le clonage par la suite. Le fragment d'ADN
amplifié fait une taille d'environ 1,11 kb. Ce produit de PCR est cloné dans le vecteur pGEM-T
Easy (commercialisé par la société Promega (Madison, Wisconcin, USA)) ce qui a permis d'obtenir le plasmide nommé pBXL1111 (cf. figure 16).
La cassette excisable attlayg+ a ensuite été introduite dans la séquence codante du gène orf6*. Pour cela, le plasmide pBXL1111 a été digéré par les enzymes de restriction Smal et Asp718I et le produit de digestion a été traité par l'enzyme de Klenow. Cette manipulation permet de réaliser une délétion interne de 120 pb dans la séquence codante du gène orf6* (cf figure 15). De plus, de part et d'autre des sites de restrictions, il reste respectivement 511 pb et 485 pb de la séquence de orf6*
.44 = . .
permettront la recombinaison homologue pour l'inactivation du gène orf6*. La casseif0 excisable attLahyg+ a été préparée à partir du plasmide pattlnhyg+ (cf. ci-dessus) par digestion de ce plasmide par EcoRV. Cette dernière a ensuite été sous-clonée dans le vecteur pBXL1111 préalablement préparé comme décrit ci-dessus (digestion Smal et Asp718I puis traitement à l'enzyme de Klenow). Le plasmide obtenu a été nommé
pBXL1112 (cf. figure 17). Dans cette construction, le gène orf6* comporte une délétion de 120pb et est interrompu par la cassette attLe2hyg+.
Le plasmide pBXL1112 a été ensuite digéré par l'enzyme Pstl (site bordant la cassette puisque présent dans les oligonucléotides PCR) et l'insert Pstl de 3.7 kb comprenant une partie de orf6* interrompu par la cassette attli2hyg+ a ensuite été cloné
au niveau du site Pstl du plasmide p0J260 (cf. ci-dessus). Le plasmide ainsi obtenu a été
nommé pBXL1113.

Le vecteur pBXL1113 a été introduit dans la souche Streptomyces ambofaciens OSC2 (cf. ci-dessus) par transformation de protoplastes (Kieser, T et al., 2000). Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à
Phygromycine. Les clones résistants à Phygromycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec hygromycine (antibiotique B) et sur milieu avec apramycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à Phygromycine (HygR) et:sensibles à l'apramycine (ApraS) sont en principe ceux où un double événement de Crossing over s'est produit et qui possèdent le gène orf6* interrompu par la cassette attl f2hyg+. Ces clones ont été plus particulièrement sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de orf6*
par là
copie interrompue par la cassette a été vérifié par la technique du Southern blot. Ainsi, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybridé avec une sonde correspondant au gène hyg (obtenu par PCR) pour vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique des clones obtenus. Une deuxième hybridation a été effectuée en utilisant comme sondé
l'insert PstI-PstI contenant le gène orf6*, d'une taille d'environ 1,1 kb et obtenu à partjr ;.= du plasmide pBXL1111 (cf ci-dessus et figure 16). La vérification du génotype Pei#.1µe ..=
également être réalisée par toute méthode cOnnite l'homme du métier et notamMent.
=
par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR.
Un clone présentant les caractéristiques attendues (orf6*::att.1 f2hyg+) a été
plus particulièrement sélectionné et nommé SPM501. Il a pu en effet être vérifié
grâce aux deux hybridations que la cassette attl f2hyg+ était bien présente dans le génome de ce clone et que l'on obtient bien le profil de digestion attendu dans le cas d'un remplacement, à la suite d'un double événement de recombinaison, du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette attl flhyg+ dans le génome de ce clone.
Ce clone possède donc le génotype : orf6*::att. 1.0hyg+ et a été nommé SPM501. Un échantillon de la souche SPM501 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2909.

La souche SPM501 a été transformée par le vecteur pOSV508 par transformation de protoplastes pour provoquer l'excision de la cassette (cf. figure 14). Le plasmide pOSV508 est dérivé du plasmide pWHM3 (Vara J et a/.,1989) (cf. figure 13) dans lequel les gènes xis et int de pSAM2 (Boccard F. et al., 1989b) placés sous le contrôle du promoteur ptrc (Amann, E. et al., 1988) ont été ajoutés (cf. figure 14).
L'introduction dans la souche SPM501 du plasmide pOSV508 portant leg. gènes xis et int de pSAM2 permet l'excision efficace par recombinaison site spécifique de la cassette excisable entre les sites attL et attR flanquant cette cassette (Raynal A. et al., 1998) (figure 10).
Parmi les transformants, sélectionnés pour leur résistance au thiostrepton due au gène tsr porté par pOSV508, on choisit ceux devenus sensibles à l'hygromycine dont le gène de résistance est porté par la cassette attl f2hyg+, l'excision entraîne en effet la perte de ce gène de résistance (cf. figure 10). Le plasmide pOSV508 est instable et après deux passages successifs sur milieu sans antibiotique des clones isolés sont repiqués sur milieu avec thiostrepton et sur milieu sans thiostrepton. Les clones sensibles au thiostrepton ont perdu pOSV508. Il a été vérifié que l'excision de la cassette a bien qu - lieu en phase dans le gène orf6* par PCR.. et séquençage du produit PCR. L'interruptioA1,1, commence au 158ième codon, 40 codons sont délétés (1/0pIi) et l'excision de la casseier,:
laisse une séquence cicatricielle attl caractéristique de 33pb : 5' ATCGCGCGC'TTCGTTCGGGACGAAGAGGTAGAT 3' (SEQ ID N 104).
La souche ainsi obtenue et possédant le génotype voulu (orf6*::attl) a été
nommée SPM502.
Un échantillon de la souche SPM502 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2910.

EXEMPLE 15: Analyse des souches de Streptomyces ambofaciens interrompue dans les gènes orf2, orf3, orf8, orf10, orf12, orfl3c, orf14, orf6*
Pour tester la production en spiramycine des diverses souches obtenues, un test microbiologique basé sur la sensibilité d'une souche de Micrococcus luteus a été mis au point (cf. (Gourmelen A. et al.,11998)). La souche de Micrococcus luteus utilisée est une souche dérivée de la souche DSM1790 naturellement sensible à la spiramycine (cette souche est disponible notamment auprès de la Gerinan Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH,' DSMZ), (Braunschweig, Allemagne), sous le numéro DSM1790), la souche utilisée dans le présent test diffère de la souche DSM1790 en ce qu'elle est résistante à la congocidine. Cette souche est un mutant spontané obtenu par sélection sur milieu contenant des doses croissantes de congocidine. Une telle souche a été
sélectionnée du fait que Streptomyces ambofaciens produit à la fois de la spiramycine et de la congocidine. Le but étant de doser la production en spiramycine des diverses souches 4f.*
. 15 obtenues grâce à un test microbiologique basé sur la sensibilité d'une souche dé:',1 " s = .
= , Micrococcus luteus,. il est :nécessaire de disposer d'une souche résistante à
laâ15 congocidine.
Les différentes souches de Streptomyces à tester ont été cultivées dans des erlenmeyers à baffles (erlenmeyers chicanés) de 500 ml contenant 70 ml de milieu MP5 (Pernodet et al., 1993). Les erlenmeyers chicanés ont été inoculés à une concentration initiale de 2.5 106 spores/mi des différentes souches de S. ambofaciens et mises à
pousser à 27 C sous agitation orbitale de 250 ipm. Des prélèvements de 2 ml de suspensions ont été réalisés après 48, 72 et 96 heures de culture et centrifugés. Les différents surnageants ont ensuite été congelés à ¨20 C. Une dilution au dixième de ces surnageants dans du milieu de culture stérile est utilisée pour le test (cf.
figure 18).
La souche indicatrice de Micrococcus luteus résistante à la congocidine mais sensible à la spiramycine a été cultivée dans du milieu 2TY (Sambrook et al., 1989) contenant de la congocidine à 5 pg/m1 pendant 48h à 37 C. La densité optique (DO) de la culture est mesurée et cette culture est diluée de façon à ajuster la densité optique à 4.
0,4 ml de cette pré-culture est dilué dans 40 ml de milieu DAM5 (Difco Antibiotic Medium 5, commercialisé par la société Difco), préalablement porté à une température d'environ 45 C. Ce milieu est ensuite coulé dans une boîte carrée de 12x12 cm et laissé
à reposer à température ambiante.
Une fois le milieu refroidi et se:ffidifié, des disques en papier Whatman AA
(cf.
Gourmelen A. et al., 1998) de 12 mm de diamètre ont été imbibés de 70 id de la dilution au dixième de chaque surnageant et déposés sur la surface de la boîte. Des disques imbibés d'une solution de spiramycine de différentes concentrations (2-4-8 ,g/m1 dans du milieu de culture MP5) sont utilisés comme gamme étalon. Les boîtes sont laissées à
4 C pendant 2 h de façon à permettre la diffusion des antibiotiques dans l'agar puis sont incubées à 37 C pendant 24 à 48h.
=
Si le disque contient de la spiramycine, celle-ci diffuse dans l'agar et inhibe la croissance de la souche indicatrice de Micrococcus luteus. Cette inhibition crée un =
. : 15 halo autour du disque, ce halo reflétant la zone où la souche de Micrococcus -n'a pas Poussé. La présence de ce' halo est donc une indication de la présence spiramycine et permet de déterminer si la souche de S. ambofaciens correspondant au disque en question est productrice ou non productrice de spiramycine. Une comparaison avec les diamètres d'inhibition obtenus pour la gamme étalon permet d'obtenir une indication de la quantité de spiramycine produite par cette souche.
Les différentes souches décrites dans les exemples précédents ont été
utilisées dans ce test pour détecter leur production en spiramycine. Les résultats obtenus ont été
regroupés dans le Tableau 38.

Tableau 38 Souche Gène inactivé Exemple dans Phénotype :
lequel la Producteur (+) ou souche est non-producteur (-) de décrite spiramycine , ATCC23877 Aucun 1 ( ) , 0S49.16 orf3;:12hyg 2 (-) , 0S49.67 oedélétion en phase 6 (-) 0S49.107 orf8;:f2hyg 7 (-) , 0S49.50 orf10:: Élhyg ' 8 ' (-) ;
OSC2 Aucun . 10 (+) .
,=:.. ; -...e.
. .=
SPM21 orf2::att3f2aae- 10 (-) =
SPM22 orf2::att3 délétion en phase 10 (-) SPM501 orf6*::attlflhyg+ 14 (-) SPM502 orf6*::attl délétion en phase 14 (4-) SPM507 orf12::att3r2aac- 11 (-) SPM508 orfl3e::att3 Daae- 12 (+) SPM509 orf14: :att3 É2aae- 13 (-) Ces résultats permettent de tirer un certain nombre de conclusions en ce qui concerne la fonction des différents gènes impliqués dans la biosynthèse de la spiramycine. Ainsi le gène orf3 est essentiel à la biosynthèse de la spiramycine. En effet une inactivation en phase dans ce gène conduit à une souche (0S49.67, (cf.
exemple 6)) ne produisant plus de spiramycine. L'inactivation en phase permet d'écarter l'hypothèse d'une éventuelle influence de la cassette introduite sur l'expression des gènes situés en aval de orf3.
d De même,. les gènes orf8 et 0rf10 codent des protéines essentielles à la biosynthèse de la spiramycine puisque les souches 0S49.107 et 0S49.50 ont un phénotype non producteur. De plus, dans ces deux dernières souches, c'est bien l'inactivation du gène ' correspondant qui est responsable de ce phénotype non producteur, puisqu'au vu de l'orientation des différentes orfs (cf. figure 3), la construction introduite ne peut avoir d'effet polaire.
L'étude des souches possédant une cassette excisable permet également de tirer un certain nombre de conclusion en ce qui concerne la fonction des gènes interrompus. La souche SPM507 possède le génotype : orf12::attlanac-. Il est inutile de procéder Ià
, -- 15 l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de orf12, au vu de"
l'orientation des gènes (cf. figure 3). Le fait que orfl3c soit orienté en sens opposé à
orf12 montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits. L'utilisation d'une cassette excisable permet en revanche d'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de selection à tout moment. Le phénotype de la souche SPM507 est non producteur, on peut donc en conclure que le gène orf12 est un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens.
La souche SPM508 possède le génotype : orfl3c::att3S2aac-. Il est inutile de procéder à l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de orfl3c, au vu de l'orientation des gènes (cf. figure 3). Le fait que orf14 soit orienté
en sens opposé
à orfl3c montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits. L'utilisation d'une cassette excisable permet en revanche d 'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de selection à tout moment. Le phénotype de la souche SPM508 est producteur, on peut donc en conclure que le gène orfl3c n'est pas un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens.
La souche SPM509 possède le génotype : orf14::att3 flaac-. Il est inutile de procéder à l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de orf14, au vu de l'orientation des gènes (cf. figure 3), le fait que orfl5c soit orienté
en sens opposé
à orf14 montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits. L'utilisation d'une cassette excisable permet en revanche d'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de selection à tout moment. Le phénotype de la souche SPM509 est non producteur, on .
peut donc en conclure que le gène orf14 est un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens.
La souche SPM21 possède le génotype : orf2::att3.0aac-. Le phénotype de cette souche est non producteur de spiramycines. Cependant, l'orientation des gènes orfl à
ore (cf. figure 3) laisse penser que ces gènes sont cotranscrits. Aussi, le phénotype .
observé peut être dû à un effet polaire de la cassette introduite dans orf2 sur l'expression .;.
de gènes situés en aval dans l'o.péron. La souche SPM22 possède le génotype orf2::ciii3 -et a été obtenue après excision en phase de la cassette introduite. L'excision de la cassette laisse seulement une séquence cicatricielle caractéristique (cf.
exemple 10).
La souche SPM22 étant également de phénotype non producteur, on peut en conclure que le gène orf2 est un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S.
ambofaciens. On observe ici uniquement l'effet dû à l'inactivation de orf2.
La souche SPM501 possède le génotype : orf6*::attlx2hyg+. Le phénotype de cette souche est non producteur de spiramycines. Cependant, les gènes orf5* et orf6*
(cf. figure 3) ayant la même orientation, le phénotype observé peut être dû à
un effet polaire de la cassette introduite dans orf6* sur l'expression de orf5*. La disposition de ces gènes laisse penser qu'ils peuvent être cotranscrits. Pour répondre à
cette question, la souche SPM502 a été obtenue après excision en phase de la cassette introduite.
Dans cette souche, on observe uniquement l'effet de l'inactivation de orf6*. Cette souche possède le génotype orf6*::attl (cf. exemple 14). L'excision de la cassette laisse seulement une séquence cicatricielle en phase (cf. exemple 14). La souche possède un phénotype producteur (cette souche ne produit cependant que de la spiramycine I (ce. exemple 16)). On peut donc conclure que le gène orf5* est un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens, puisque son inactivation indirecte dans la souche SPM501 conduit à un phénotype non producteur.
Par contre ; le gène orf6* n'est pas un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine I
chez S. ambofaciens (par contre il est essentiel à la production de spiramycine II et III
(cf. exemple 16)).
EXEMPLE 16. Dosage de la production des spiramycines I, II et III dans les = souches mutantes obtenues , == r Les différentes souches à tester ont été cultivées chacune dans 7 erlensmeyere,4 =
chicanés de 500 mL contenant 70 ml de milieu MP5 (Pernodet et al., 1993). Les ei1éiie4 =i ont été inoculés par 2.5 106 spores/m1 des différentes souches de S.
ambofaciens à =
mises à pousser à 27 C sous agitation orbitale de 250 rpm pendant 72 heures.
Les cultures correspondant au même clone sont rassemblées, éventuellement filtrées sur filtre plissé, et centrifugées 15 min à 7000 tr/min. Les différents surnageants ont ensuite été stockés à ¨30 C.
Les dosages ont été effectués par Chromatographie Liquide à Haute Performance (CLHP) par appariement d'ions. L'analyse CLHP du milieu de culture permet de déterminer précisément la concentration des trois formes de spiramycine. La colonne utilisée (Macherey-Nagel) est remplie avec une phase Nucleosil de silice greffée octyle.
La granulométrie est de 5 m et la taille des pores 100Å. Le diamètre interne de la colonne est de 4,6mm et sa longueur 25 cm. La phase mobile est un mélange de tampon H3PO4 (pH2,2) et d'acétonitile 70/30 (v/v) contenant 6,25g/L de perchlorate de NaC104. L'analyse est réalisée en régime isocratique avec un débit fixé à 1 ml/min. La =

colonne est thermorégulée à 23 C. La détection est assurée par spectrophotométrie UV
à 238nm. L'échantillon est réfrigéré à +10 C et la quantification est déterminée à partir de l'aire des pics (par étalonnage externe). Dans ces conditions, les temps de rétention de la spiramycine I, II et III sont respectivement d'environ 17; 21 et 30 minutes, comme il a pu être vérifié grâce à un échantillon commercial comprenant les trois formes de spiramycine. 4.
La souche OSC2 possède un phénotype producteur de spiramycine. C'est la souche parentale utilisée pour l'obtention des souches possédant une cassette excisable (cf. exemple 15). Cette souche a donc été utilisée comme témoin positif de production des trois formes de spiramycine. Cette souche produit bien les trois formes de spiramycines comme il a été vérifié par CLHP (cf. figure 19).
L'étude des souches possédant une cassette excisable permet de tirer un certain nombre de conclusions en ce qui concerne la fonction des gènes interrompus. La souche ;..
SPM507 possède le génotype : orf12::att312aac-. Le phénotype de la souche SPM507, ==
f est non producteur (cf exemple 15), on peut donc en conclure que le gène orf12 est , .
gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens. Cette souche ne ' produit plus de spiramycines comme il a été vérifié par CLHP (cf. figure 22).
Ce résultat confirme le caractère essentiel du gène orf12 dans la biosynthèse de la spiramycine.
La souche SPM508 possède le génotype : orfl3c::att3e2aac-. Le phénotype de la souche SPM508 est producteur de spiramycine (cf. exemple 15), on peut donc en conclure que le gène orfl3c n'est pas un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens. Cette souche produit de la spiramycine I, II
et III
comme il a été vérifié par CLHP (cf. figure 23). Ce résultat confirme que le gène orfl3c n'est pas un gène essentiel à la biosynthèse des spiramycines I, II et III
ches S.
ambofaciens.
La souche SPM509 possède le génotype : orf14::att3É2aac-. Le phénotype de la souche SPM509 est non producteur, on peut donc en conclure que le gène orf14 est un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens. Cette souche ne produit plus de spiramycines con-mie il a été vérifié par CLHP (cf. figure 24). Ce résultat confirme l'essentialité du gène orf14 dans la biosynthèse de la spiramycine.
La souche SPM501 possède le génotype : orf6*::attl.C2hyg+. Le phénotype de cette souche est non producteur de spiramycines. Cette souche ne produit Mus de spiramycines comme il a été vérifié par CLHP (cf. figure 20). Cependant, les gènes orf5* et orf6* (cf. figure 3) ayant la même orientation, le phénotype observé
peut être dû
à un effet polaire de la cassette introduite dans orf6* sur l'expression de orf5* dans l'opéron. Ceci laisse penser que ces gènes sont cotranscrits. Pour répondre à
cette question, la souche SPM502 a été obtenue par excision de la cassette introduite, produisant une délétion en phase dans le gène or6* et restaurant l'expression de orf5*.
Cette souche possède le génotype orf6*::attl (cf. exemple 14 et 15).
L'excision de la cassette laisse seulement une séquence att cicatricielle en phase (cf.
exemple 14). La souche SPM502 possède un phénotype producteur de spiramycine. Cependant, comme il *- = 15 a été prouvé par CLHP, cette souche ne produit que de la spiramycine I
et ne produit ;... =
':=?5'=
- de spiramycine II et III (cf figure 21). On peut donc conclure de ces résultats que le gêné ..!.
orf5 * est un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S.
ambofaciens, puisque son inactivation indirecte dans la souche SPM501 conduit à un phénotype non producteur de spiramycine (cf. figure 20). Par contre ; le gène orf6* n'est pas un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine I chez S. ambofaciens, puisque l'inactivation de ce gène conduit à un phénotype producteur de spiramycine I (cf. figure 21).

Cependant, orf6* est essentiel à la production de spiramycine II et III (cf.
exemple 16)).
Le gène orf6* code donc bien une acyl-transférase responsable de la modification du platénolide à la position 3 (cf. figure 1).

EXEMPLE 17 : Détermination du point de démarrage de la traduction de orf 10 et amélioration de la production en spiramycines 17.1 Construction des plasmides pSPM523, pSPM524 et pSPM525 :
Le gène orflO a été identifié chez Streptomyces ambofaciens et a été désigné
srmR par Geistlich et al. (Geistlich, M., et al., 1994 L'inactivation du gène orf10 a été réalisée (cf. exemple 8). Il a pu ainsi être montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycines (cf. exemple 15). Ceci confirme que le gène orfl 0 est bien impliqué dans la biosynthèse des spiramycines. La protéine codée par ce gène :!*
est donc bien essentielle à la biosynthèse des spiramycines. Cependant, l'analyse de la séquence montre que deux codons ATG situés dans la même phase de lecture peuvent être utilisés pour la traduction de orf10 (cf. Figure 28). Un des deux codons possible (le codons le plus en amont) démarre à la position 10656 de la séquence donnée en SEQ ID N 1, alors que l'autre codon possible situé plus en aval démarre à
la position 10809 (cf SEQ ID N 1). Avant de tester un éventuel effet de la:¨
, , 15 surexpression de tsret sur' la 'production de spiramycine, il est important de';;U
- = , , :tel,-.TN
; déterminer dans un premier ténipg lé point dé dértiarrage'dé la traduction.
Dans le but de determiner le site de démarrage de la traduction, trois constructions comportant trois formes d' orf10 ont été réalisées. Ces dernières ont été
obtenues par PCR en utilisant des oligonucléotides comportant soit un site de restriction HindIII soit un site de restriction BamHI.
Le premier couple utilisé pour l'amplification correspond aux oligonucléotides suivants :
EDR39 :
5'CCCAAGCTTGAGAAGGGAGCGGACATTCATGGCCCGCGCCGAACGC3' (SEQ ID N 122) (le site HindIII figure en gras) EDR42 :
5'CGGGATCCGGCTGACCATGGGAGACGGGCGCATCGCCGAGTTCAGC3' (SEQ ID N 123) (le site BamHI figure en gras) Le couple d'amorces EDR39-EDR42 permet l'amplification d'un fragment d' orf10 comportant l'ATG situé le plus en 3' (position 10809 dans la séquence donnée en SEQ ID N 1) (cf. Figure 28). Le fragment obtenu fait une taille d'environ 2 kb et sera appelé par la suite "orf10 court", il ne contient pas le promoteur de orf10. Ce fragment de 2kb a été cloné dans le vecteur pGEM-T easy pour donner naissance au plasmide pSPM520.
Le deuxième couple utilisé pour l'amplification correspond aux oligonucléotides suivants :
=
EDR40 :
5'CCCAAGCTTGAGAAGGGAGCGGACATTCAATGCTTTGGTAAAGCAC3' (SEQ ID N 124) (le site HindIII figure en gras) EDR42 :
5'CGGGATCCGGCTGACCATGGGAGACGGGCGCATCGCCGAGTTCAGC3' (SEQ N 123) (le site B andll figure en gras) .
Le couple d'amorces EDR40-EDR42 permet l'amplification d'un fragment d' orf10 comportant l'ATG situé le plus en 5' (position 10656 dans la séquence donnée en =
' = = =-;'!µ..tî(?,f5 SEQ ID N 1) (cf. Figure 28). Ce fragment de 2,2 kb 'appelé par la suite "o/f/0 long"
a été cloné dans le vecteur pGEM-T easy pour donner naissance au plasmide pSPM521, ce plasmide ne contient pas le promoteur de orf10.
Le troisième couple utilisé pour l'amplification correspond aux oligonucléotides suivants :
EDR41 :
5'-CCCAAGCTTTCAAGGAACGACGGGGTGGTCAGTCAAGT-3' (SEQ ID N 125) (le site Hi n dIII figure en gras) EDR42 :
5'CGGGATCCGGCTGACCATGGGAGACGGGCGCATCGCCGAGTTCAGC3' (SEQ ID N 123) (le site BamHI figure en gras) Le couple d'amorces EDR41-EDR42 permet l'amplification du gène orf10 avec les deux ATG, ainsi que son propre promoteur (cf. Figure 28). Ce fragment de 2,8 kb appelé par la suite "orf10 pro" a été cloné dans le vecteur pGEM-T easy pour donner naissance au plasmide pSPM522.
Le fragment "orf10 pro" a été obtenu en utilisant comme matrice l'ADN
chromosomique de la souche OSC2. Les fragments "orf10 court" et "orf10 long"
ont quant à eux été obtenus en utilisant comme matrice l'ADN du fragment "orf10 pro"
préalablement purifié.
Les inserts HindIII-BamHI des plasmides pSPM520, pSPM521 et pSPM522 ont ensuite été sous-clonés dans le vecteur pUWL201 (plamside dérivé du plasmide pUWL199 (Wehmeier UF, 1995) dans lequel le fragment Kpnl-BamHI de la région du promoteur de ermE (cf. Bibb et al., 1985, notamment figure 2) portant une mutation augmentant la force du promoteur (promoteur ermE*) (Bibb et al., 1994) a été introduit (cf. Doumith et al., 2000)) préalablement digéré par les enzymes Hind111-BamHI. Ainsi, il a été obtenu trois plasmides : pSPM523 (dérivé du PLTWL201 avec la forme "orf10 court" comme insert), pSPM524 (dérivé du . 15 pUWL201 avec la forme "orf10 long" comme insert) et pSPM525 (dérivé du.
pUWL201 avec la forme "orf10 pro") (Figure 28).
17.2 Transformation de la souche 0S49.50 par les constructions pSPM523, pSPM524 et pSPM525:
La souche 0S49.50 (souche interrompue dans le gène orf10, cf. exemple 8) a été
transformée indépendamment par transformation de protoplastes (Kieser, T et al., 2000) par chacun des plasmides pSPM523, pSPM524 et pSPM525. Un témoin négatif a également été réalisé en transformant la souche 0S49.50 par le plasmide pUWL201 sans insert. Après transformation des protoplastes, les clones sont sélectionnés pour leur résistance au au thiostrepton. La transformation des clones par chacun des plamides est vérifiée par extraction de ces plasmides. Ainsi quatre nouvelles souches ont été
obtenues : la souche 0SC49.50 pUWL201, issue de la transformation par le plasmide pUWL201 sans insert, la souche 0SC49.50 pSPM523, issue de la transformation par le plasmide pSPM523, la souche 0SC49.50 pSPM524, issue de la transformation par le plasmide pSPM524 et enfin la souche 0S49.50 pSPM525, issue de la transformation par le plasmide pSPM525.
La production de spiramycines de chacune de ces quatre souches a été testée par CLHP. Pour cela, les différentes souches de Streptomyces à tester ont été
cultivées dans des erlenmeyers à baffles (erlenmeyers chicanés) de 500 ml contenant 70 ml de milieu MP5 (Pernodet et al., .1993). Lorsque la souche contient le plasmide pUWL201 ou l'un de ses dérivés, il est ajouté 5 .tg/ml de thiostrepton. Les erlenmeyers chicanés ont été inoculés à une concentration initiale de 2.5 106 spores/m1 des différentes souches de S. ambofaciens et les cultures ont été
incubées à
27 C sous agitation orbitale de 250 rpm pendant 96 heures. Les cellules ont ensuite été séparées du milieu par centrifugation et le surnageant a été analysé par CLHP (cf.
exemple 16) pour déterminer la quantité de spiramycine produite. Grâce à un échantillon étalon et à la mesure de l'air des pics, il a été possible de déterminer la `-quantité de chacune des spiramycines produites par ces souches. Les résultats de cette analyse sont présentés dans le tableau 39, les données sont exprimées en mg par litre õ
A:e : de surnageant Les résultats- ef.édop[iid9fit la production totale en spiramycinesq,'.
. õ
. r z (obtenue en additionnant la production en spiramycine I, II et III).
Tableau 39. Production en spiramycines des souches dérivées de 0S49.50, (résultats exprimés en mg/1).
Souche Production en Spiramycines 0S49.50 0 pUWL201 0S49.50 0 pSPM523 0S49.50 93 pSPM524 0S49.50 149 pSPM525 Comme le montre les résultats donnés dans le tableau 39, le témoin négatif (souche 0S49.50 transformée par le plasmide pUWL201) ne produit pas de spiramyciiie. Lorsque le plasmide pSPM523 (qui contient la forme "orf10 court") est introduit dans la souche 0S49.50, aucune production de spiramycine n'est observée.
En revanche, la présence du plasmide pSPM524 (qui contient la forme "orf10 long") et du plasmide pSPM525 (qui contient la forme "orf10 pro") restaure la production de spiramycine dans la souche hôte 0S49.50. Ainsi, seuls les fragments de orf10 contenant l'ATG le plus en amont permettent de restaurer la synthèse de spiramycine.
Dans le but de confirmer ces résultats, le plasmide pSPM521 (plasmide ,:=
pGEM-T easy contenant la forme 7orf10 long") a été digéré par l'enzyme de restriction XhoI (cette enzyme possède un site unique dans ce plasmide, localisé entre les deux ATG (cf Figure 28)). Les extrémités XhoI ont ensuite été rendues bout franc., , .
par traitement à l'enzyme de Klenow. Le plasmide a alors été refermé sur lui-même,24 par action de la T4 DNA ligase pour donner naissance au plasmide pSPM527. Si l'ATG le plus en amont (position 10656 dans la séquence donnée en SEQ ID N 1) est bien .utilisé comme site d'initiation de la traduction, ce traitement entrainera un décalage du cadre de lecture au niveau du site XhoI et aura pour effet la production d'une protéine ne présentant pas d'activité activatrice. Par contre si l'initiation de la traduction a lieu au niveau de l'ATG plus en aval (position 10809 dans la séquence donnée en SEQ ID N 1), ce traitement devrait avoir peu ou pas d'effet sur l'expression de Orf10 (compte tenu de la localisation du point de démarrage de la transcription) et aucun effet sur la protéine produite.
L'insert BamHI-HincIIII de pSPM527 a ensuite été sous-cloné dans le vecteur pUWL201 pour donner naissance au plasmide pSPM528. Ce plasmide a été introduit dans la souche 0S49.50 et un clone possédant le plasmide voulu a plus particulièrement été sélectionné. La production de spiramycine de la souche résultante a ensuite été testée par CLHP (Cf. exemple 16 et ci-dessus).
Contrairement à ce qui avait été observé avec le plasmide pSPM524 (cf. tableau 39), la présence du plasmide pSPM528 dans la souche 0S49.50 ne rétablit pas la production de spiramycine. Ceci confirme que le démarrage de la traduction du gène orf10 est l'ATG situé le plus en aval (ATG 1 cf. Figure 28).
17.3 Amélioration de la production en spiramycines de la souche OSC2 de S.
ambofaciens :
Afin de tester l'effet de la surexpression du gène orf10 sur la production de spiramycines, les plasmides pSPM523, pSPM524, pSPM525 et pSPM528 ont été
introduits dans la souche OSC2. Pour cela, des protoplastes de la souche OSC2 ont été transformés (Kieser, T et al., 2000) indépendamment par chacun des plasmides pSPM523, pSPM524, pSPM525 et pSPM528. Un témoin négatif a également été
= réalisé en transformant la souche OSC2 par le plasmide PUWL201 sans insert. Après transformation des protoplastes, les clones sont sélectionnés pour leur résistance au au thiostrepton. Ainsi cinq nouvelles souches ont été obtenues : la souche = pUWL201, issue de la transformation par le plasmide pUWL201 sans insert, la s.,=;===
souche OSC2 pSPM523, issue de la transformation par le plasmide pSPM523, la souche OSC2 pSPM524, issue de la transformation par le plasmide pSPM524, la souche OSC2 pSPM525, issue de la transformation par le plasmide pSPM525 et enfin la souche OSC2 pSPM528, issue de la transformation par le plasmide pSPM528. La production en spiramycines de ces souches a alors été analysée par CLHP (de la même manière que dans l'exemple 17.2). L'analyse de la production en spiramycine de la souche OSC2 a également été effectée en parallèle pour comparaison. Les résultats de cette analyse sont présentés dans le tableau 40, les données sont exprimées en mg par litre de surnageant. Les résultats correspondent à
la production totale en spiramycines (obtenue en additionnant la production en spiramycine I, II et III).

Tableau 40. Production en spiramycines des souches dérivées de OSC2, (résultats exprimés en mg/1).
Souche Production en spiramycines = OSC2 103 pUWL201 pSPM523 pSPM524 7Z.
pSPM525 = -=
, . =
i,,; = õ -, srpqr=
. .
=

pSPM528 Ainsi, il est observé que la présence du plasmide pSPM524 ou du plasmide pSPM525 augmente significativement la production en spiramycines de la souche OSC2. Ceci démontre bien que la surexpression de Orf10 a un effet positif sur la production en spiramycines. Le plasmide pSPM528 n'a par contre pas d'effet sur la production en spiramycines.
Les plasmides pSPM525 et pUWL201 ont de la même manière été introduit dans la souche SPM502 (cf. exemple 14). Ainsi deux nouvelles souches ont été
obtenues : la souche SPM502 pUWL201, issue de la transformation par le plasmide pUWL201 sans insert, et la souche SPM502 pSPM525, issue de la transformation par le plasmide pSPM525.
Un échantillon de la souche SPM502 pSPM525 (cette souche contient le plasmide pSPM525, cf. ci-dessus) a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 26 février 2003 sous le numéro d'enregistrement 1-2977.
La production en spiramycines des souches SPM502 pUWL201 et SPM502 pSPM525 a été analysée par CLHP (de la même manière que dans l'exemple 17.2).
=
L'analyse de la production en spiramycines de la souche SPM502 a également été
effectée en parallèle pour comparaison. Les résultats de cette analyse sont présentés dans le tableau 41, les données sont exprimées en mg par litre de surnageant.
Les résultats correspondent à la production en spiramycine I. En effet, aucune de ces = souches ne produit de spiramycine II et III.
= !!
: Tableau 41. Production en spiramycine I des souches dérivées de SPM502, '1 P7-4 eij ' = = , õ .
(résultats exprimés en nig/1).
Souche Spiramycine I

SPM502 pUWL201 72 SPM502 pSPM525 130 Ainsi, il a pu être observé que la surexpression du gène orf10 dans la souche SPM502 augmente de facon importante la production de spiramycine I.

EXEMPLE 18 : Construction d'une banque d'ADN génomique de la souche OSC2 de Streptomyces ambofaciens chez E. cou l dans la cosmide pWED2.
18.1 Construction du cosmide pWED2 :
Dans le but de faciliter l'inactivation de gènes chez Streptomyces, un cosmide portant la séquence oriT du plasmide RK2 (ce qui permet son introduction par conjugaison dans Streptomyces à partir d'une souche appropriée de E. cou) et portant également un gène de résistance à un antibiotique conférant un phénotype -repérable chez Streptomyces, a été construit. Un tel cosmide contenant de grands inserts d'ADN génomique de Streptomyces ambofaciens peut être utilisé dans des expériences d'inactivation de gènes.
Pour construire ce vecteur, une cassette pac-oriT (fragment EcoRV) a été
introduite dans le cosmide pWED1 (Gourmelen et al., 1998) , dérivé du cosmide pWED15 (Wahl et al., 1987), au niveau du site unique Hpal. La cassette pac-oriT a .
été obtenue par PCR. Pour cela, le gène pac a été amplifié par PCR à partir du ,. . 15 plasmide pVF 10.4 (Vara et al., 1985; Laçalle et 01., 1989) en utilisant comme tt = première amorce, l'amorce A (de séquence CCAGTAGATATCCCGCCAACCCGGAGCTGCAC-3' (SEQ ID N 126), le site de restriction EcoRV a été souligné et la séquence en gras de 20 nucléotides correspond à une région en amont du promoteur du gène pac) et comme deuxième amorce, l'amorce B (de séquence 5'-GAAAAGATCCGTCATGGGGTCGTGCGCTCCTT-3' (SEQ ID N 127), qui comporte à son extrémité 5' une séquence de 12 nucléotides correspondant au début de la séquence oriT (souligné double) et une séquence de 20 nucléotides (en gras) correspondant à la fin du gènepac (cf. Figure 29, 1ère PCR).
Le gène oriT a quant à lui été amplifié par PCR à partir du plasmide pPM803 (Mazodier,P. et al., 1989) en utilisant comme première amorce, l'amorce C (de séquence 5'-CACGACCCCATGACGGATCTTTTCCGCTGCAT-3' (SEQ ID N
128)), qui comporte à son extrémité 5' une séquence de 12 nucléotides correspondant à
une séquence en aval de la séquence codante du gène pac (en gras) et une séquence de 20 nucléotides correspondant au début de la séquence oril) et comme deuxième amorce, l'amorce D (de séquence 5'-GAGCCGGATATCATCGGTCTT CTTGCT GT-3' (SEQ ID N 129)) qui comporte le site de restriction EcoRV (souligné simple) et une séquence de 20 nucléotides correspondant à la fin de la séquence oriT (souligné double) (cf.
Figure 29, 2ième PCR).
Le produit d'amplification obtenu avec les amorces A et B et celui obtenu àvec les amorces C et D ont à une de leur extrémité, une séquence commune de 24 nucléotides. Une troisième PCR a été réalisée en mélangeant les deux produits d'amplification obtenus précédemment et en utilisant comme amorces, les amorces A et D (cf. figure 29, 3ièlne PCR). Ceci a permis d'obtenir un produit d'amplification correspondant à l'ensemble pac+oriT. Ce fragment pac-oriT a alors été cloné
dans le vecteur pGEM-T Easy (commercialisé par la société Promega (Madison, Wisconcin, USA)), ce qui a permis d'obtenir le plasmide pGEM-T-pac-oriT. L'insert de ce plasmide a ensuite été sous cloné dans le cosmide pWED1. Pour cela le plasmide..-., .;
;=;!..
pGEM-pac-oriT a été digéré par l'enzyme _EcoRV et l'insert EcoRV contenant = . ;
ez.e l'ensemble Pae+oriT a été inséré dans le CCSinide pWED1 ouvert au pre'àlàble par t.
l'enzyme Hpal. Le cosmide ainsi obtenu a été baptisé pWED2 (cf. Figure 30).
Ce cosmide permet de faciliter l'inactivation de gènes chez Streptomyces.
En effet, il porte la séquence oriT (ce qui permet son introduction par conjugaison dans Streptomyces à partir d'une souche appropriée de E. cou) mais également un gène de résistance à un antibiotique conférant un phénotype repérable chez Streptomyces. Un tel cosmide contenant de grands inserts d'ADN génomique de Streptomyces ambofaciens peut être utilisé dans des expériences d'inactivation de gènes.
Ainsi un cosmide dérivé de pWED2 contenant le gène cible pourra par exmeple être introduit dans la souche de E. cou KS272 contenant le plasmide pKOBEG (cf. Chaveroche et al. 2000) et une cassette sera introduite dans le gène cible selon la technique décrite par Chaveroche et al. 2000. Le cosmide obtenu par cette technqiue (cosmide dans lequel le gène cible est inactivé), pourra ensuite être introduit dans une souche de E. cou i telle que la souche S17.1 ou toute autre souche permettant de transférer par conjugaison des plasmides contenant la séquence oriT
vers Streptomyces.
Après conjugaison entre E. cou i et Streptomyces, des clones de Streptomyces dans lesquelles la copie sauvage du gène cible aura été remplacée par la copie interrompue pourront être obtenues comme décrit dais l'exemple 2.
Le gène de résistance exprimé chez StreptOmyces présent sur ce nouveau cosmide est le gène pac de Streptomyces alboniger (Vara, J et al., 1985;
Lacalle et al., 1989) qui code la puromycine N-acétyl transférase et qui confère la résistance à la *
puromycine. Lors d'expériences d'inactivation de gène, on cherchera les clones dans lesquels un double évènement de recombinaison aura eu lieu. Ces clones auront éliminer le cosmide pWED2 et seront donc redevenus sensibles à la puromycine.
= 18.2 Construction d'une banque d'ADN genomique de la souche OSC2 de Streptomyces ambofaciens chez E cOli &ma le cosmide pWED2 e ' !. 7 =

-L'ADN génomique de .la =Skiuclic OSC2 de Streptomyces ambofaciens a 'eféA
digéré partiellement 'par rem:plie de restriction BeinzHI de manière à obtenir d'è4 fragments d'ADN de taille comprise entre environ 35 et 45 kb. Ces fragments ont ensuite été clonés dans le cosmide pWED2, ce dernier ayant été au préalable digéré par BamHI, puis traité par la phosphatase alcaline. Le mélange de ligation a ensuite été
encapsidé in vitro dans des particules de phages lambda grâce au système Packagene Lambda DNA packaging system commercialisé par la société Promega (Madison, Wisconcin, USA) en suivant les recommandations du fabriquant. Les particules phagiques obtenues ont été utilisées pour infecter la souche SURE d'E. cou commercialisée par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA). La séléction des clones a été effectuée sur milieu LB + ampicilline (50 g/m1), le cosmide pWED2 confèrant la résistance à l'ampicilline.

EXEMPLE 19 : Isolement de cosmides de la nouvelle banque couvrant la région de la voie de biosynthèse des spiramycines. Sous clonage et séquençage de fragments de ces cosmides.
19.1 Hybridation sur colonies de la banque génomique de Streptomyces ambofaciens OSC2 :
Des cosmides de la nouvelle banque de Streptomyces ambofaciens OSC2 (cf.
exemple 18) couvrant les orf1* à orf10* ou une partie ou la totalité des orfl à orf25c, ou une région plus en amont de P orf25c ont été isolés. Pour cela, des hybridations successives sur les colonies d'E. cou i obtenues selon l'exemple 18 ont été
réalisées en utilisant les 3 sondes suivantes (cf. figure 31):
- La première sonde utilisée correspond à un fragment d'ADN d'environ 0,8kb amplifié par PCR en utilisant comme matrice le cosmide pSPM5 et les amorces suivantes :
pst ORF23c : 5'-ACGTGCGCGGTGAGTTCGCCOTTOO' (SEQ ID N 130) .
e III
= = =
ORIF'25c : 5'-CTGAACGAéGCaTC6CadmeGC-3' (SEQ lb N 131).
Le produit de PCR ainsi obtenu contient un fragment du début de P orf23c, l'orf24c en entier et la fin de l'orf25c (cf. figure 31, sonde I).
- La deuxième sonde utilisée correspond à un fragment d'ADN d'environ 0,7kb amplifié par PCR en utilisant comme matrice l'ADN total de la souche S.
ambofaciens ATCC23877 et les amorces suivantes :
ORF1*c : 5'-GACCACCTCGAACCGTCCGGCGTCA-3' (SEQ ID N 132) et ORF2*c : 5'-GGCCCGGTCCAGCGTGCCGAAGC-3' (SEQ ID N 133).
Le produit de PCR ainsi obtenu contient un fragment de la fin de 1 'orfl *c et du début de 1 'orfl*c (cf. figure 31, sonde II).
- La troisième sonde utilisée correspond à un fragment EcoRI-BamHI d'environ 3kb contenant les orfl , orfl et orf3 et obtenu par digestion du plasmide pOS49.99 (cf. figure 31, sonde III).

Environ 2000 clones de la banque obtenue dans l'exemple 18.2 ont été
transférés sur filtre pour hybridation sur colonies selon les techniques classiques (Sambrook et al., 1989).
La première sonde (cf. figure 31, sonde I) a été marquée au 32P par la technique du random priming (Kit commercialisé par la société Roche) et utilisées pour l'hybridation sur 2000 clones de la banque, après transfert sur filtre.
L'hybridation a été
effectuée à 65 C dans le tampon décrit par Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984).
Deux lavages ont été effectués en 2x SSC, 0,1% SDS à 65 C, le premier pendant 10 ;
minutes et le deuxième pendant 20 minutes et un troisième lavage d'une durée de 30 minutes a ensuite été effectué en 0.2X SSC, 0,1% SDS à 65 C. Dans ces conditions d'hybridation et de lavage, 20 clones parmi les 2000 hybridés présentaient un fort signal d'hybridation avec la première sonde. Ces 20 clones ont été cultivés en milieu LB+ =
ampicilline (50 ptg/m1) et les 20 cosmides correspondants ont été extraits par lyse alcaline (Sambrook et ai, 1989) puis ils ont été digérés par l'enzyme de restriction y Bamili. Les produits de digestions ont ensuite été séparés sur gel d'agarose, tans, férW:i:q sur Membrane de Nylon et hybridés par la première sonde (cf ci-dessus : le produit de PCR ORF23c-ORF25c, sonde I) dans les mêmes conditions que ci-dessus. Douze cosmides possédaient un fragment BamHI hybridant fortement avec la sonde utilisée.
Ces 12 cosmides ont été nommés pSPM34, pSPM35, pSPM36, pSPM37, pSPM38, pSPM39, pSPM40, pSPM41, pSPM42, pSPM43, pSPM44 et pSPM45. Les profils, après digestion par BamHI, de ces 12 cosmides ont été comparés entre eux et avec celui du cosmide pSPM5. De plus des expériences d'amplification par PCR en utilisant différentes amorces correspondant à différents gènes déjà identifiés dans la région orfl-orf25e ont permis de positionner l'insert de certains de ces cosmides les uns par rapport aux autres et de déterminer également la localisation de ces inserts dans la région orfl-orP5e déjà connue (cf. Figure 32). Le cosmide pSPM36 a plus particulièrement été
choisi car il était susceptible de contenir une grande région en amont de Porf25e (cf.
Figure31 et 32).

Dans un deuxième temps, et en utilisant les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus, les 2000 clones de la banque de Streptomyces ambofaciens OSC2 ont été hybridés avec la deuxième sonde correspondant au produit de PCR: ORF1*c-ORF2*c (cf. figure 31, sonde II). Cette hybridation a permis d'isoler des cosmides dont l'insert est situé dans la région de orfl*c à orflec. Dans les conditions d'hybridation utilisés, 16 clones parmi les 2000 hybtidés présentaient un fort signal d'hybridation avec cette deuxième sonde. Ces 16 clones ont été cultivés en milieu LB+ ampicilline (50 gg/m1) et les 16 cosmides correspondants ont été extraits par lyse alcaline (Sambrook et al., 1989) puis ils ont été digérés par l'enzyme de restriction BamHI. Les profils de digestion (après digestion par Bamill) de ces 16 cosmides ont été comparés entre eux et avec celui du cosmide pSPM7. Des expériences d'amplication par PCR avec les amorces ORF1*c et ORF2*c ont permis de choisir deux cosmides qui renfermaient bien les gènes orfl*c et orf2*c et dont les profils possédaient des bandes communes mais aussi des bandes différentes. De Plus d'autres expériences d'amplification par PCR en = 15 utilisant différentes amorces correspondant à différents gènes déjà
identifiés dans la région orfl*c à oiflO*c ont permis de positionner l'insert de ces cosmides les uns = rapport aux autres et dé déterminer également la localisation de ces inserts' dans la régiOn orfl*c à orflO*c déjà connue (cf. Figure 32). Les deux cosmides plus particulièrement sélectionnés ont été nommés pSPM47 et pSPM48 (cf. Figure 32).
En utilisant les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus, les 2000 clones de la banque de Streptomyces ambofaciens OSC2 ont également été hybridés avec la troisième sonde correspondant au fragment d'ADN EcoRI-Bam111 du plasmide pOS49.99 (cf. figure 31 sonde III). Cette hybridation a permis d'isoler les cosmides contenant la région de l'orfl jusqu'à l'orf3 et susceptibles de contenir soit une grande partie des gènes des PKS, soit une grande partie des gènes orfl à orf25c de la voie de biosynthèse des spiramycines. Dans ces conditions d'hybridation, 35 clones parmi les 2000 hybridés présentaient un fort signal d'hybridation avec la troisième sonde. Ces 35 clones ont été cultivés en milieu LB+ ampicilline (50 g/mi) et les 35 cosmides correspondants ont été extraits par lyse alcaline (Sambrook et al., 1989) puis digérés par l'enzyme de restriction BamHI. Les profils, après digestion par BamHI, de ces cosmides ont été comparés entre eux et avec celui du cosmide pSPM5. De plus des expériences d'amplification par PCR en utilisant différentes amorces correspondant à
différents gènes déjà identifiés dans la région orfl à orf25c ont permis de vérifier que ces cosmides renfermaient bien des inserts provenant de la région orfl à
orf25c et de positionner les inserts de ces cosmides les uns, par rapport aux autres et par rapport à la la région orfl à orf25c déjà connue (cf. Figure 32). Cinq cosmides ont été
plus particulièrement sélectionnés, ils ont été nommés pSPM50, pSPM51, pSPM53, pSPM55 et pSPM56 (cf. Figure 32).
19.2 Sous clonage et séquençage d'une partie de l'insert du cosmide pSPM36.
La sonde d'environ 0,8 kb obtenue par PCR avec les amorces ORF23c et ORF25c (cf. ci-dessus et figure 31, sonde I) a également été utilisée dans des expériences de Southern Blot sur l'ADN total de S. ambofaciens OSC2 digéré par l'enzyme Pst!.
Dans.:/,':' les conditions d'hybridation décrite ci-dessus, cette sonde révèle un fragment umque .
:
=: 15 Pst! d'environ 6 kb lorsque hybridé sur total 4 S. ambofaciens OSC2 digéré pet"
l'enzyme Pst!. Il existe un site Pst! au niveau de l'orf23c (cf. SEQ ID N 80) mais auctin.
autre site PstI jusqu'à l'extrémité (site BamHI) de la séquence connue (cf.
SEQ ID N
1). Ce fragment PstI-BamHI a une taille d'environ 1.4 kb. Le fragment PstI de 6 kb hybridé sur l'ADN total de S. ambofaciens digéré par l'enzyme PstI contient donc une région d'environ 4,6 kb située en amont de orf25c. Cette région est susceptible de contenir d'autres gènes dont les produits sont impliqués dans la voie de biosynthèse de la spiramycine. Il a été vérifié par digestion que le cosmide pSPM36 contenait bien ce fragment PstI de 6 kb. Ce fragment a été isolé à partir de pSPM36, dans le but de déterminer la séquence plus en amont de orf25c. Pour cela, le cosmide pSPM36 a été
digéré par l'enzyme de restriction PstI. Le fragment PstI-PstI d'une taille d'environ 6kb a été isolé par électroélution à partir d'un gel d'agarose 0.8% puis cloné
dans le vecteur pBK-CMV (4512bp) (commercialisé par la société Stratagene (La Jolla, Californie, USA)). Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pSPM58 (cf. Figure 33) et la séquence de son insert a été déterminée. La séquence de cet insert est présentée en SEQ ID
N 134.

Toutefois, toute la séquence n'a pas été déterminée et il subsite un trou d'environ 450 nucléotides, la partie de la séquence non determinée a été notée par une succession de N dans la séquence correspondante.
19.3 Analyse des nouvelles séquences nucléotidiques, détermination des phases ouvertes de lecture et caractérisation des gènes impliqués dans la biosynthèse des spiramycines.
La séquence de l'insert du cosmide pSPM58 obtenue a été analysée grâce au programme FramePlot (Ishikawa J & Hotta K. 1999). Ceci a permis d'identifier, parmi les phases ouvertes de lecture, les phases ouvertes de lecture présentant un usage des codons typique de Streptomyces. Cette analyse a permis de déterminer que cet insert comporte 4 nouvelles ORFs en amont de l'orf25e (cf. figure 34). Ces gènes ont été
nommés orf26 (SEQ ID N 107), orf27 (SEQ ID N 109), orf28c (SEQ ID N 111, la séquence de cette orf n'a pas été déterminée complètement puisqu'un trou d'environ 450 ,.
nucléotide subsite lors du séquençage de l'insert de pSPM58, ces 450 nucléotides ;
,15 figurent sous la forme d'une sére de N. dans la sequence SEQ ID N
111) et or129 (la - = 0.1J
séquence de cette dernière orf était incernplète dans cette insert). Lé c ajouté dans le nom du gène signifiant pour l'ORF en question que la séquence codante est dans l'orientation inverse (cf. figure 34).
Les séquences protéiques déduites de ces phases ouvertes de lecture ont été
comparées avec celles présentes dans différentes bases de données grâce à
différents programmes : BLAST (Altschul et al., 1990) (Altschul et al., 1997), CD-search, (ces deux programmes sont accessibles notamment auprès du National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Bethesda, Maryland, USA)), FASTA ((Pearson W.
R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990) (ce programme est accessible notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France). Ces comparaisons ont permis de formuler des hypothèses sur la fonction des produits de ces gènes et d'identifier ceux susceptibles d'être impliqués dans la biosynthèse de spiramycines.

19.4 Sous clonage et séquençage d'une autre partie de l'insert du cosmide pSPM36.
La sonde d'environ 0,8 kb obtenue par PCR avec les amorces ORF23c et ORF25c (cf. ci-dessus et figure 31, sonde I) a également été utilisée dans des expériences de Southern Blot sur l'ADN total de la souche OSC2 digéré par l'enzyme StuI. Dans les conditions d'hybridation décrite ci-dessus pour cette solide, cette sonde révèle un fragment unique StuI d'environ 10 kb lorsque hybridé sur l'ADN total de la souche OSC2 digéré par l'enzyme StuI. Compte tenu de la présence d'un site StuI dans l' oif23c (cf. SEQ ID N 80) et de la localisation de ce site par rapport au site Pstl, ce fragment de 10 kb inclut la totalité du fragment Pstl précédemment étudié (insert de pSPM58) et permet d'avoir accès à une région non encore étudiée d'environ 4 kb. (cf figure 33). Il a été vérifié par digestion que le cosmide pSPM36 contenait bien ce fragment StuI de 10 kb. Ce fragment a été isolé à partir du cosmide pSPM36, dans le but de déterminer la séquence de la fin d' orf29 et d'autres gènes plus en amont de orf29. Pour cela, le .
= 15 cosmide pSPM36 a été digéré par l'enzyme de restriction StuL Le fragment StuI-StuI
. .
' . d'une taille d'environ 10 kb a été isolé par 61ectrôélution à partir d'un gel d'agarO444.>
0.8% puis cloné dans le vecteur pBK-CMV (4512bp) (commercialisé par la société

Stratagene (La Jolla, Californie, USA)). Le plasmide ainsi obtenu a été nommé
pSPM72 (cf. Figure 33). Ce dernier a ensuite été digéré par EcoRI (site EcoRI dans l'insert de pSPM58) et HindIII (site II n en dans le site de clonage multiple du vecteur, immédiatement après le site StuI de l'extrémité de l'insert) (cf. Figure 33).
Le fragment d'ADN EcoRI-HindIII ainsi obtenu, correspond à un fragment de l'insert du plasmide pSPM72 (cf. figure 33) et a été sous-cloné dans le vecteur pBC-SK+
(commercialisé par la société Stratagene (La Jolla, Californie, USA)) digéré au préalable par EcoRI et HindIII. Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pSPM73 et la séquence de son insert a été déterminée. La séquence de cet insert est présentée en SEQ ID N 135.
Un assemblage des séquences des inserts de pSPM58 et pSPM73 est présenté en SEQ
ID N 106. Cette séquence part du site Pstl au niveau de l'orf23c (cf. SEQ ID
N 80) et va jusqu'au site StuI au niveau de l'orf32c (cf. figure 34). La séquence de l'orf28c (SEQ
ID N 111), n'étant pas complète (cf. exemple 19.3), une région d'environ 450 nucléotides n'est pas séquencée, ces 450 nucléotides figurent sous la forme d'une série de N dans la sequence SEQ ID N 106).
19.5 Analyse des nouvelles séquences nucléotidiques, détermination des phases ouvertes de lecture et caractérisation des gènes impliqués dans la biosynthèse des spiramycines.
La séquence partielle de l'insert du cosmide pSPM73 obtenue a été analysée grâce au programme FramePlot (Ishikawa J & Hotta K. 1999). Ceci a permis d'identifier, =
parmi les phases ouvertes de lecture, les phases ouvertes de lecture présentant un usage des codons typique de Streptomyces. Cette analyse a permis de déterminer que cet insert comporte 4 ORFs, une incomplètes et trois complètes (cf. figure 34). L'ORF
incomplète correspond à la partie 3' de la séquence codante de orf29 ce qui à permis de compléter la:
séquence de ce gène grâce à la séquence partielle de ce même orf obtenue lors du séquençage de l'insert du plasmide pSPM58 (cf exemple 19.2 et 19.3), l'ensemble des 4 deux séquences à ainsi permis d'obtenir la Séquence complète de orf29.
Les 4 gènes ont ; : - ,;;. = ; : ::õ
' ainsi été n-oiiiniés .6d29 (SEQ 113), 'od30c (SEQ' ID Nb 115), orf31 (SEQ
118) et orf32c (SEQ ID N 120). Le c ajouté dans le nom du gène signifiant pour l'ORF en question que la séquence codante est dans l'orientation inverse (cf.
figure 34).
Les séquences protéiques déduites de ces phases ouvertes de lecture (SEQ ID N
114 pour orf29, SEQ ID N 116 et 117 pour orf30c, SEQ ID N 119 pour orf31 et SEQ
ID N 121 pour orf32c) ont été comparées avec celles présentes dans différentes bases de données grâce à différents programmes : BLAST (Altschul et al., 1990) (Altschul et al., 1997), CD-search, (ces deux programmes sont accessibles notamment auprès du National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Bethesda, Maryland, USA)), FASTA ((Pearson W. R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990) (ce programme est accessible notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France).
Ces comparaisons ont permis de formuler des hypothèses sur la fonction des produits de ces gènes et d'identifier ceux susceptibles d'être impliqués dans la biosynthèse de spiramycines.
19.6 Sous clonage et séquençage d'une troisième partie de l'insert du cosmide pSPM36.
Une sonde (fragment d'ADN de 0,8 kb) correspondant à une séquence interne à
orf32c a été obtenue par PCR en utilisant comme matrice l'ADN total de la souche de Streptomyces ambofaciens et les amorces suivantes KF36: 5'- TTGCCGTAGCCGAGGACCAGCG-3' (SEQ ID N 151) et KF37: 5'- CACATGGCCCTGGAGGACCCTG-3' (SEQ ID N 152).
Le produit PCR ainsi obtenu représente une séquence interne de l'orf32c. cettY
µ.
sonde à été utilisée dans des expériences de Southem Biot sur l'ADN
chromosomique de la souche OSC2 et sur l'ADN du cosmide pSPM36 digérés par l'enzyme Pstl.Ei "
utilisant. les Mêmes conditions d'hYbridatién.que:,celles décrites ci-dessus (cf exemplet = 19.1), cette sonde révèle deux fragments Pstl d'environ 3,4kb et 2,5kb lorsque hybridée sur l'ADN total de la souche OSC2 et sur l'ADN du cosmide pSPM36 digérés par l'enzyme Pstl. Compte tenu de la présence d'un site Pstl dans la sonde utilisée on peut expliquer ces résultats. Le premier fragment d'ADN qui a une taille d'environ 3,4kb est un fragment dont la séquence est déjà connue en totalité. La séquence du fragment de 2,5 kb n'est connue que partiellement, sur une région de 700 pb. Ce fragment.
a été isolé
à partir du cosmide pSPM36 dans le but de déterminer la séquence de la fin de l' orf32c et d'autres gènes en amont de ce dernier. Pour cela, le cosmide pSPM36 a été
digéré par l'enzyme de restriction Pstl. Le fragment Pstl-Pstl d'une taille d'environ 2,5kb a été
isolé par purification à partir d'un gel d'agarose 0.8% puis cloné dans le vecteur pBK-CMV (4518bp) (commercialisé par la société Stratagene (La Jolla, Californie, USA)). Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pSPM79 (cf. Figure 41) et la séquence de son insert a été déterminée.

La séquence de P orf28c (SEQ ID N 111) n'était pas complète (cf. exemple 19.3).
En effet, une région d'environ 450 nucléotides n'avait pas pu être déterminée, ces 450 nucléotides figurent sous la forme d'une sére de N dans la sequence SEQ ID
N 106.
La séquence de la totalité de la région manquante a été déterminée par reséquençage de cette région. La séquence des inserts de pSPM58 et pSPM73 a donc été
déterminée en entier. La séquence complète de la partie codante de P orf28c est présentée en SEQ ID
N 141 et la protéine déduite de cette séquence en SEQ ID N 142. La séquence de l'insert du plasmide pSPM79 est présentée en SEQ ID N 161.
Un assemblage des séquences des inserts de pSPM58, pSPM73 et pSPM79 est présentée en SEQ ID N 140 (cf. figure 41). Cette séquence part du site Pst!
au niveau de Porf23c (cf. SEQ ID N 80) et va jusqu'au site PstI au niveau de Potf34c (cf. figure 41).
19.7 Analyse des nouvelles séquences nucléotidioues, détermination des phases ouvertes de lecture et caractérisation ,des gènes pouvant être impliqués dans la ;'5õ , = ' = = :" ',..=

biosynthèse des spiramycinta. = ', =
= .
La séquence de l'insert du plasmide pSPM79 obtenue a été analysée grâce au programme FramePlot (Ishikawa J & Hotta K. 1999). Ceci a permis d'identifier, parmi les phases ouvertes de lecture, les phases ouvertes de lecture présentant un usage des codons typique de Streptomyces. Cette analyse a permis de déterminer que cet insert comporte 3 ORFs, deux incomplètes (orf32c et orf34c) et une complète (orf33) (cf.
figure 41).
La première ORF incomplète correspond à la partie 5' de la séquence codante de orf32c. Ceci a permis de compléter la séquence de ce gène grâce à la séquence partielle de cette même orf obtenue lors du séquençage de l'insert du plasmide pSPM73 (cf.
exemple 19.4 et 19.5), l'ensemble des deux séquences à ainsi permis d'obtenir la séquence complète de orf32c. (SEQ ID N 145). Le c ajouté dans le nom du gène signifie pour l'ORF en question que la séquence codante est dans l'orientation inverse (cf. figure 41). L'off complète a été nommée orf33 (SEQ ID N 147). La troisième ORF
a été nommée orf34c (SEQ ID N 149). Le e ajouté dans le nom du gène signifie pour l'ORF en question que la séquence codante est dans l'orientation inverse (cf. figure 37). Les comparaisons effectuées entre le produit de cette off et les banques de données suggèrent que la partie C-terminale de cette protéine n'est pas dans le produit déduit dé.
la séquence nucléotidique et donc que cette off serait plus longue et continuerait en dehors de la région séquencée.
Les séquences protéiques déduites de ces phases ouvertes de lecture ont été
comparées avec celles présentes dans différentes bases de données grâce à
différents programmes : BLAST (Altschul et al., 1990) (Altschul et al., 1997), CD-search, (ces deux programmes sont accessibles notamment auprès du National Center for Bioteclmology Information (NCBI) (Bethesda, Maryland, USA)), FASTA ((Pearson W..., R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R, 1990) (ce programme est accessible =
,=ri = 15 notamment auprès du centre de ressources 1NFOBIOGeN,:.Eµ4=Y France) Ces comparaisons Ont permis de formuler des hypothèses sur la fonction' des produits dé CèS
gènes et d'identifier ceux susceptibles d'être impliqués dans la biosynthèse de spiramycines.
EXEMPLE 20: Analyse de la production d'intermédiaires de biosynthèse de spiramycines :
20.1 Préparation des échantillons :
Les différentes souches à tester ont été cultivées chacune dans 7 erlenmeyers chicanés de 500 ml contenant 70 ml de milieu MP5 (Pernodet et al., 1993). Les erlens ont été inoculés par 2.5 106 spores/mi des différentes souches de S.
ambofaciens et mises à pousser à 27 C sous agitation orbitale de 250 rpm pendant 96 heures.
Les cultures correspondant au même clone sont rassemblées, éventuellement filtrées sur filtre plissé, et centrifugées 15 min à 7000 tr/min.
Le pH du moût est ensuite ajusté à 9 avec de la soude et le surnageant est extrait par de la méthyl iso-butyryl cétone (MIBK). La phase organique (MIBK) est alors récupérée et évaporée. L'extrait sec est ensuite repris dans lml d'acétonitrile, puis dilué
au 1/10 (100111 qsp lml avec de l'eau) avant d'être utilisé pour les analyses en chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (CL/SM).
20.2 Analyse des échantillons en CL/SM:
Les échantillons ont été analyés en CL/SM dans le but de déterminer la masse des différents produits synthétisés par les souches à tester.
La colonne de chromatographie liquide haute performance utilisée est une .
colonne Kromasil C8 150*4,6mm,m, 5gunrn, 100Å.
. =
La phase mobile est un gradient constitué d'un mélange d'acétonitrile et d'une solution aqueuse d'acide trifluoroacétique à 0.0%,,4, débit est fixé k 1 ml/min. La température s = .
= du four colonne est inaintenife à 30 C.;
La détection UV en sortie de la colonne a été effectuée à deux longueurs d'onde différentes : 238 mn et 280 nm.
Le spectrométre de masse couplé à la colonne de chromatographie est un appareil Simple Quadripole commercialisé par la société Agilent, avec des tensions de cone à 30 et à 70V.
20.3 Analyse des intermédiaires de biosynthèse produits par la souche 0S49.67:

La souche 0S49.67 dans laquelle le gène orf3 est inactivé par une délétion en phase ne produit pas de spiramycines (cf. exemple 6 et 15).
Un échantillon a été préparé selon la méthode décrite ci-dessus (cf.
paragraphe 20.1) et a été analysé par CL/SM comme décrit ci-dessus (cf. le paragraphe 20.2).

Plus particulièrement, l'analyse par chromatographie a été réalisée en gradient de solvant avec comme phase mobile : 20% d'acétonitrile du temps T=0 à 5min puis montée linéaire à 30% à T=35 minutes, suivie d'un palier jusqu'à T=50 minutes.
Dans ces conditions, deux produits ont plus particulièrement été observés : un absorbant à 238 nm (temps de rétention de 33.4 min) et un absorbant à 280 nm (temps de rétention de 44.8 min) (cf. figure 35). La figure 35 montre la superposition des chromatogrammes CLHP réalisés à 238 et 280nm (haut) ainsi que les spectres UV
des molécules élués à 33,4 minutes et 44,8 minutes (bas).
Les conditions d'analyses en spéctrométrie de masse couplée étaient les suivantes 4, : le balayage se fait en mode scan, couvrant une gamme de masse comprise entre 100 et 1000 Da. Le gain de l'électro-multiplicateur était de 1V. Concernant la source électrospray, la pression du gaz de nébulisation était de 35 psig, le débit du gaz séchant de 12.0 1.min-1, la température du gaz séchant de 350 C, la tension du capilaire était , portée à +/- 3000 V. Ces expériences ont permis de déterminer la masse des deux produits séparés. Ces masses sont respectivement de 370 g/mole pour le produit élué en premier ([M-1120]+=-33 produit majoritaire) et 368 Wmple pour le second produit (t1W,ii.':r.
=kpei " H20]+=351 Produit =
Afin d'obtenir la structure, les produits mentionnés ci-dessus ont été isolés et purifiés dans les conditions suivantes : la phase mobile est un mélange d'une solution aqueuse d'acide trifluoroacétique à 0.05% et d'acétonitrile 70/30 (v/v). La chromatographie est réalisée en régime isocratique avec un débit fixé de 1 lui/min. Dans ces conditions, les temps de rétention des 2 produits sont respectivement de 8 et 13.3 minutes. De plus dans ce cas, l'échantillon préparé (cf. paragraphe 20.1) n'est pas dilué
dans l'eau avant injecton de 100.
Les 2 produits sont récupérés à la sortie de la colonne chromatographique et isolés dans les conditions suivantes : une cartouche Oasis HLB 1 cc 30mg (Waters) est conditionnée séquentiellement par 1 ml d'acétonitrile, puis 1 ml d' eau/acétonitrile (20v/80v) et lml d'eau/acétonitrile 80/20. L'échantillon est ensuite introduit et la cartouche lavée successivement par 1 ml d'eau/acétonitrile (95/5), lml d'eau/acétonitrile deutéré (95/5), puis éluée avec 600111 d'eau/acétonitrile deutéré 40/60.
La solution récupérée est ensuite directement analysée en RMN.
Les spectres RMN obtenus pour ces deux composés sont les suivants :
- Premier produit élué: Platenolide A: (Spectre 9646V) Spectre 1H dans CD3CN(déplacements chimiques en ppm): 0,90 (3H, t, J=6Hz), 0,93 (3H, d, J=5Hz), 1,27 (311; d, J=5Hz), entre 1,27 et 1,40 (3H, m), 1,51 (1H, m), 1,95 (1H, m), 2,12 (1H, m), 2,30 (1H, d, J=12Hz), 2,50 (1H, d, J=11Hz), 2,58 (1H, dd, J=9 et 12 Hz), 2,96 (1H, d, J=7Hz), 3,43 (3H, s), 3,70 (1H, d, J=9Hz), 3,86 (1H, d, J=7Hz), 4,10 (1H, m), 5,08 (1H, m), 5,58 (1H, dt, J=3 et 12Hz), 5,70 (1H, dd, J=8 et 12 Hz), 6,05 (1H, dd, J=9 et 12 Hz), 6,24 (1H, dd, J=9 et 12Hz).
-Deuxième produit élué: Platenolide B: (Spectre 9647V) Spectre 1H dans CD3CN (déplacements chimiques en ppm): 0,81 (3H, t, J=6Hz), 0,89 (1H, m), 1,17 (3H, d, J=5Hz), 1,30 (4H, m), 1,47 (2H, m), 1,61 (1H, t, J=10Hz), 2,20 (1H, m), 2,38 (1H, d, J=13Hz), 2,52 (IH, m), 2,58 (1H, m), 2,68 (1H, dd, J=8 et .131.1z);,,rti 3,10 (111., d, J=71-1), 3,50 (3H, s), 3,61 (IH, d, T-='811z);" 3,82 (111, d, J=71-Ii), -m), 6,20 (1H, m), 6,25 (1H, dd, J=9 et 12 Hz), 6,58 (1H, d, J=12 Hz), 7,19 (1H, dd, J=9 et 12Hz).
Ces expériences ont ainsi permis de déterminer la structure de ces deux composés.
Le premier produit élué est le platénolide A et le deuxième est le platénolide B, la structure déduite de ces deux méolécules est présentée en figure 36.
Il a également pu être déterminé grâce à la technique de CL/SM associée à la RMN, dans des conditions légèremment différentes de celles décrites précédemment mais dont la mise au point est bien connue de l'homme du métier, que la souche 0S49.67 produit en plus du platénolide A et B un dérivé de ces deux composés.
Il s'agit du platénolide A+mycaorse et du platénolide B+mycarose (la strucutre de ces deux composés est présenté en figure 40). Les résultats de l'analyse du moût de la souche 0S49.67 sont présentés tableau 42.
Tableau 42. Les résultats de l'analyse CL/SM du moût de la souche 0S49.67 Identité ] Masses des ions Max (mg/L) /. d'absorption [M + Na]
Platénolide A 16,1 393,0 23 lnrn [M +K]
Masse exacte=370 408,9 [M ¨ H20 + H]+
Formule 353,0 Moléculaire,-----C201-13406 [2M +
763,2 [M ¨ H20 +
Platénolide B 1.4 351,0 283nrn ./ [M + Na]
Masse exacte=368 391,0 [M +Kr' Formule .
Moléculaire=C2o1132,-,1-1 406,9e .

[2M + Na] =
-759,1 [M + Na]
Platénolide A + `mycarose' 4,27 537,0 230mn Masse exacte=514 [M +Kr 553,0 Formule Moléculaire=C27H4609 [M + Na]
Platénolide B + `mycarose' ND 535,0 284nrn [M +Kr Masse exacte=512 550,9 Formule [PlatB - H20 +
Moléculaire=C27H4409 H1+350,9 20.4 Analyse des intermédiaires de biosynthèse produits par la souche SPM509 :

La souche SPM509 dans laquelle le gène orf14 est inactivé (orf14::att3.Qaae-) ne produit pas de spiramycines (cf. exemple 13, 15 et 16). Un échantillon a été
préparé
selon la méthode décrite ci-dessus (cf. paragraphe 20.1) et a été analysé par CL/SM
comme décrit ci-dessus (cf. le paragraphe 20.2 et 20.3). L'analyse des intermédiaires de biosynthèse présents dans le surnageani de culture de la souche SPM509 cultivée en milieu MP5 a montré que cette souche ne produisait que la forme B du platénolide ( platénolide B , cf. figure 36) mais pas la forme A ( platénolide A , cf.
figure 36).
EXEMPLE 21: Interruption du gène orf14 dans une souche interrompue dans le -gène orf3 (0S49.67) Le produit du gène orf14 est indispensable à la biosynthèse des spiramycines (C:.,!;=
;.e.;
= Pi exemple 13, 15 et 16 : la souche SPM509 dans laquelle ce gène est interrompu nèS,e..
1:1 produit, plus de spipMyeines)., L'analyse des intetmécligires de biosynthèse présents danai7,,:'.i : '1.5 le surnageant de culture de la souche" SPM509 cultivée en milieu MP5 a montré que` -e cette souche ne produisait que la forme B du platénolide mais pas la forme A
(cf.
exemple 20). Une des hypothèses pouvant expliquer cette observation est que le produit de orf14 soit impliqué dans la conversion de la forme B du platénolide en forme A par une étape enzymatique de réduction. Pour tester cette hypothèse, le gène orf14 a été
inactivé dans un mutant ne produisant plus de spiramycine, mais produisant les formes A et B du platénolide. C'est le cas de la souche 0S49.67 (cf. exemple 6 et 20) dans laquelle le gène orf3 est inactivé par une délétion en phase (Aorf3). Pour inactiver le gène orf14 dans cette souche le plasmide pSPM509 a été introduit par transformation de protoplastes de la souche 0S49.67 (Kieser, T et al., 2000). L'inactivation du gène orf14 a déjà été décrite dans le cas de la souche OSC2 (cf. exemple 13) et il a été
procédé de la même manière pour l'inactivation du gène orf14 dans la souche 0S49.67. Après = transformation par le plasmide pSPM509, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les clones résistants à l'apramycine sont ensuite repiqués =

respectivement sur milieu avec apramycine et sur milieu avec hygromycine. Les clones résistants à Papramycine (ApraR) et sensibles à Phygromycine (HygS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et dans lesquels le gène orf14 a été remplacé par une copie de orf14 interrompue par la cassette att3É2aac-. Ces clones ont été plus particulièrement sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de orf14 par la copie interrompue par la cassette a été vérifié par hybridation Ainsi, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybridé avec une sonde correspondant à la cassette att3Daac- pour vérifier que le remplacement de gène avait bien eu lieu. La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit PCR.
Un clone présentant les caractéristiques attendues (Aorf3, orf14::att3Daac-) a été
plus particulièrement sélectionné et nommé SPM510. Il a pu en effet être vérifié grâce aux deux hybridations que la cassette att3Paac- était bien présente dans le génome de. el , ce clone et que l'on obtient bien' le 'profil dé digestion attendu' dans "le cas d'un remplacement, à la suite d'un double événement de recombinaison, du gène sauvage orf14 par la copie interrompue par la cassette att3É2aac- dans le génome de ce clone.
EXEMPLE 22 : Complémentation fonctionnelle de l'interruption du gène orf14 22.1 Construction du plasmide pSPM519 :
Le gène orf14 a été amplifié par PCR en utilisant le couple d'oligonucléotides suivant : EDR31 : 5' CCCAAGCTTCTGCGCCCGCGGGCGTGAA 3' (SEQ ID N
136) et EDR37 : 5' GCTCTAGAACCGTGTAGCCGCGCCCCGG 3' (SEQ ID N
137) et comme matrice l'ADN chromosomique de la souche OSC2. Les oligonucléotides EDR31 et EDR37 portent respectivement le site de restriction HindlIl et Xbal (séquence en gras). Le fragment de 1,2 kb ainsi obtenu a été cloné dans le vecteur pGEM-T easy (commercialisé par la société Promega (Madison, Wisconcin, USA)) pour donner naissance au plasmide pSPM515. Ce plasmide a ensuite été digéré par les enzymes de restriction Hinall et XbaI. L'insert HindIllabal de 1,2 kb obtenu a été cloné
dans le vecteur pUWL201 (cf. exemple 17.1) préalablement digéré par les mêmes enzymes.
Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pSPM519.
22.1 Transformation des souches SPM509 et SPM510 par le plasmide pSPM519:
Le plasmide pSPM519 a été introduit dans les souches SPM509 (cf. exemple 13) et SPM510 (cf. exemple 17) par transformation de protoplastes (Kieser, T et al., 2000).
Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance au thiostrepton.
Les clones sont ensuite repiqués sur un milieu contenant du thiostrepton.
La souche SPM509 est une souche non productrice de spiramycines (cf exemple 13, 15 et 16 et figure 24). ta production en spiramycines de la souche SPM509:'.
. . . transformée par le vecteur pSPM519 (souche nommée SPM509 pSPM519) a ,été
, analysée en cultivant cette Sôu.Clie dans du milieu W5, ei:t:::pr¨éSetieé de thiostrepton Les -surnageants de culture ont ensuite été analysés par CLHP (cf. exemple 16 et 17). tés résultats de cette analyse sont présentés dans le tableau 43, les données sont exprimées en mg par litre de surnageant. Les résultats correspondent à la production totale en spiramycines (obtenue en additionnant la production en spiramycine I, II et III). Il a été
observé que la présence du vecteur pSPM519 dans la souche SPM509 restaure la production de spiramycines (cf. tableau 43).
Tableau 43. Production en spiramycines de la souche SPM509 transformée par le vecteur pSPM519, (résultats exprimés en mg/1 de surnageant).
Souche Production en spyramicines SPM509 pSPM519 58 La souche SPM510 transformée par le plasmide pSPM519 a été nommée SPM510 pSPM509.
EXEMPLE 23 : Complémentation fonctionnelle de l'interruption du gène orf3 par le gène tylB de S. fradiae 23.1 Construction du plasmide pOS49.52:
Le plasmide pOS49.52 correspond à un plasmide permettant l'expression de la protéine TylB chez S. ambofaciens. Pour le construire, la séquence codante du gène tyl.13 de S. fradiae (Merson-Davies & Cundliffe, 1994, numéro d'accès GenBank :

(séquence de la région), SFU08223 (séquence ADN) et AAA21342 (séquence protéique)) a été introduite dans le plasmide pKC1218 (Bierman et al., 1992, Kieser et al., 2000, une souche de E. cou i contenant ce plasmide est accessible notamment auprès de l'ARS (NRRL) Agricultural Research Service Culture Collection) (Peoria, USA), sous le numéro B-14790). De plus cette séquence codante à été placée sous le:4 r;µ=e=-=== 15 contrôle du promoteur ermE* (cf nô , lent exemple 17.1113,4.lb, et ai., 1985, , , Bibb et al., 1994).
23.1 Transformation de la souches 0S49.67 par le plasmide pOS49.52:
La souche 0S49.67 dans laquelle le gène orf3 est inactivé par une délétion en phase ne produit pas de spiramycines (cf. exemple 6 et 15). Le plasmide pOS49.52 a été
introduit dans la souche 0S49.67 par transformation de protoplastes (Kieser, T
et al., 2000). Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à
l'apramycine. Les clones sont ensuite repiqués sur un milieu contenant de 1' apramycine.
Un clone a été plus particulièrement sélectionné et a été nommé 0S49.67 pOS49.52.
Comme il a été démontré ci-dessus, la souche 0S49.67 ne produit pas de spiramycines (cf. exemple 6 et 15). La production en spiramycines de la souche 0S49.67 transformée par le vecteur pOS49.52 a été analysée par la technique décrite dans l'exemple 15. Il a ainsi pu être démontré que cette souche possède un phénotype =

producteur de spiramycines. Ainsi la protéine TylB permet la complémentation fonctionnelle de l'interruption du gène orf3.
EXEMPLE 24 : Amélioration de la production en spiramycines par surexpression du gène orfl8c 24.1 Construction du plasmide pSPM75:
Le gène orf28c a été amplifié par PCR en utilisant un couple d'oligonucléotides comportant un site de restriction Hind111 ou un site de restriction BamHI. Ces amorces ont la séquence suivante :
KF30 :5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N 138) avec un site de restriction HindlII (qui figure en gras) KF31 : 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N 139) -avec le site de restriction B amHI (qui figure en gras) Les amorces KF30 et KF31 portent *respectivement le site de restriction Hinall :

B amHI (séquence en gras). Le couple d'amorces le30 et k.F31 permet d'amplifier un , =
fragment d'ADN d'une taillecl'en.
1,5 kb contènint le 'gène- O rfi8c' en utiliSanIA
comme matrice le cosmide pSPM36 (cf. ci-dessus). Le fragment de 1,5 kb ainsi obtenu a été cloné dans le vecteur pGEM-T easy (commercialisé par la société Promega (Madison, Wisconcin, USA)) pour donner naissance au plasmide pSPM74. Le plasmide pSPM74 a ensuite été digéré par les enzymes de restriction HindlIl et BamHI et l'insert HindIll1BamHI d'environ 1,5 kb obtenu a été sous cloné dans le vecteur pUWL201 (cf.
exemple 17.1) préalablement digéré par les mêmes enzymes. Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pSPM75, il contient l'ensemble de la séquence codante de orfl8e placée sous le contrôle du promoteur ermE*.
24.2 Transformation de la souche OSC2 par le plasmide pSPM75:
Le plasmide pSPM75 a été introduit dans les souches OSC2 par transformation de protoplastes (Kieser, T et al., 2000). Après transformation des protoplastes, les clones sont sélectionnés pour leur résistance au thiostrepton. Les clones sont ensuite repiqués sur un milieu contenant du thiostrepton et la transformation par le plasmide est vérifiée par extraction de plasmides. Deux clones ont plus particulièrement été
sélectionnés et nommés OSC2/pSPM75(1) et OSC2/pSPM75(2).
Un échantillon de la souche OSC2/pSPM75(2) a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institüt Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 6 octobre 2003 sous le numéro d'enregistrement 1-3101.
Afin de tester l'effet de la surexpression du gène orfl8c sur la production de spiramycines, la production en spiramycines des clones OSC2/pSPM75(1) et OSC2/pSPM75(2) a été testée par la technique décrite dans l'exemple 15.
L'analyse de la production en spiramycines de la souche OSC2 a également été effectée en parallèle pour comparaison. Il a ainsi pu être observé que la présence du plasmide pSP1v115 augmente significativement la production en spiramycines de la souche OSC2.
Ceci démontre que la surexpression de orfl8c conduit à une augmentation de la production ' .15 en spiramycines et confirme son rôle en tant que régulateur. .
La production en spiramycines des clones OSC2/pSPM75(1) et ' OSC2/pSPM75(2) a également été analysée par CLHP (de la même manière que dans l'exemple 17.2). L'analyse de la production en spiramycines de la souche OSC2 a également été effectée en parallèle pour comparaison. Les résultats de cette analyse sont présentés dans le tableau 44, les données sont exprimées en mg par litre de surnageant.
Les résultats correspondent à la production totale en spiramycines (obtenue en additionnant la production en spiramycine I, II et III).
Tableau 44. Production en spiramycines des souches dérivées de OSC2 transformé par pSPM75, (résultats exprimés en mg/1).
Souche Spiramycines OSC2/pSPM75(1) 120 OSC2/pSPM75(2) 155 Ainsi, il est observé que la présence du plasmide pSPM75 augmente significativement la production en spiramycines de la souche OSC2. Ceci démontre bien que la surexpression de orf28e a un effet positif sur la production en spiramycines.
EXEMPLE 25: Analyse de la production d'intermédiaires de biosynthèse de spiramycines d'une souche inactivée dans le gène orf8 :
La souche 0S49.107, dans laquelle le gène orf8 est inactivé par insertion de là
cassette Dhyg, ne produit pas de spiramycines (cf. exemple 7 et 15). Le gène orf8 code ' 10 une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs aminotransférases et ,:-fe=
,..=, . :=====::
..= suggère fortement que le gène oie code ,une 4 iiMino4ransférase responsable de la ed.'.;eW
réaction de transamination nécessaire à la biosynthèse de la forésamine (cf.
figure 6)4?,Irii On s'attend donc à ce que la biosynthèse des spiramycines soit bloquée au stade de la forocidine (cf. figure 7). La souche 0S49.107 qui est non productrice de spiramycine devrait donc produire de la forocidine.
Un échantillon de surnageant de la souche 0S49.107 a été préparé selon la méthode décrite ci-dessus (cf. exemple 16, sans extraction au MIBK) et a été
analysé par CL/SM comme décrit ci-dessus (cf. le paragraphe 20.2 et 20.3). En mode SIM, la masse 558 relative à l'ion moléculaire de la forocidine a été sélectionné et plusieurs pics ont été détectés. La présence de composés de masse 558 est compatible avec l'hypothèse du rôle de orf8 dans synthèse de forosamine.

EXEMPLE 26: Analyse de la production d'intermédiaires de biosynthèse de spiramycines d'une souche inactivée dans le gène orf12 :
La souche SPM507, dans laquelle le gène orf12 est inactivé, ne produit pas de spiramycines (cf. exemple 11 et 15). Le gène orf12 coderait une 3,4 déshydratase responsable de la réaction de déshydratation nécessaire à la biosynthèse de la forosamine (cf. figure 6). On s'attend donc à ce que la biosynthèse des spiramycines soit bloquée au stade de la forocidine (cf. figure 7). La souche SPM507 qui est non productrice de spiramycine devrait donc produire de la forocidine. .
Un échantillon de surnageant de la souche SPM507 a été préparé selon la méthode décrite ci-dessus (cf. exemple 16, sans extraction au MIBK) et a été analysé
par CL/SM
comme décrit ci-dessus (cf. le paragraphe 20.2 et 20.3). Dans ces conditions, le temps de rétention de la forocidine est d'environ 12,9 minutes. En mode SIM, la masse relative à l'ion moléculaire [M+Hr de la forocidine a été sélectionné et un pic a été
détecté. La présence d'un composé à 558 permet de valider l'hypothèse du rôle du ?;
=
produit de orf12 dans la biosynthèse des spiramycines.
. s{e -e Toutefois, la forocidine est présente en 'quantité relativement faible et dans ces conditions, un produit absorbant à 238 nm a plus particulièrement été observé
(temps Clé
rétention de 17,1 min). L'analyse en LC/SM a permis de déterminer la masse de ce composé qui est de 744,3 g/mole ([M+Hr=744,3 produit majoritaire).
Afin d'obtenir la structure, le produits mentionné ci-dessus a été isolé et purifié
dans les conditions décrites précedemment (cf. paragraphe 20.1) ). La phase organique (MIBK) est alors récupérée et évaporée. L'extrait sec est repris avec de l'eau et extrait avec de l'heptane. La solution aqueuse est ensuite extraite par fixation sur une cartouche Oasis HLB 1 g (Waters SAS, St-Quentin en-Yvelines, France). Le composé est récupéré
par élution avec un mélange eau/acétonitrile 30/70. Cette solution est ensuite injectée (100 L) sur la colonne analytique et les fractions récupérées sur cartouche Oasis HLB 1 cc 30mg (Waters). Avant utilisation, les cartouches Oasis HLB 1 cc 30mg (Waters) sont conditionnées séquentiellement par de l'acétonitrile, puis un mélangeeau/acétonitrile (20v/80v) et un mélanged'eau/acétonitrile 80/20.
=

La cartouche Oasis HLB 1 cc 30mg (Waters) est ensuite lavée successivement par 1 ml d'eau/acétonitrile (95/5), lml d'eau/acétonitrile deutéré (95/5), puis éluée avec 600111 d'eau/acétonitrile deutéré 40/60. La solution récupérée est ensuite directement analysée en RMN.
Le spectre RMN obtenu pour ce composé est le suivant (Spectre RMN 19312V) :
Spectre 1H dans CD3CN/D20 (déplacements chimiques en ppm): 0,92 (3H, d, J=6Hz), 1,10 (1H, m), 1,14 (3H, s), 1,17 (3H, d, J=6Hz), 1,22 (3H, d, J=6Hz), 1,25 (3H, d, J=6Hz), 1,40 (1H, m), 1,75 (1H, dd, J=12 et 2Hz), 1,81 (1H, m), 1,90 (1H, d, J=12Hz), 2,05 (1H, m), 2,12 (3H, s), 2,15 (1H, m), 2,35 (2H, m), 2,45 (6H, s large), 2,53 (1H, m), 2,64 (1H, dd, J=12 et 9Hz), 2,80 (1H, dd, J=9 et 16Hz), 2,95 (1H, d, J=8Hz), 3,23 (2H, m), 3,34 (1H, d, J=7Hz), 3,45 (3H, s), 3,49 (1H, m), 3,93 (1H, dd, J=7 et 3Hz), 4,08 (1H, m), 4,37 (1H, d, J=6Hz), 4,88 (1H, m), 5,05 (2H, m), 5,65 (2H, m), 6,08 (1H, dd, J=8 et 12Hz), 6,40 (1H, dd, J=12 et 9Hz), 9,60(1H, s).
Ces expériences ont ainsi permis de déterminer la structure de ce composé, cellé-lb , 0 ci est présentée en figure 38. .=
-e"- *O."- " = = - =
EXEMPLE 27: Analyse de la production d'intermédiaires de biosynthèse de spiramycines d'une souche inactivée dans le gène orf5* :
La souche SPM501 possède le génotype orf6*::attlQhyg+. Grâce à l'effet polaire de l'insertion de la cassette att1S2hyg+ dans le gène orf 6*, il a pu être déterminé que le gène orf 5* est indispensable à la voie de biosynthèse des spiramycines. En effet, l'insertion de la cassette excisable dans la partie codante du gène orf 6*
entraîne un arrêt total de la production en spiramycines par effet polaire sur l'expression du gène orf5*.
Cependant, une fois que la cassette insérée a été excisée (et donc lorsque seul le gène orf6* est inactivé, cf exemples 14 et 15), on restaure une production de spiramycine I.
Ceci démontre que le gène orf 5* est indispensable à la biosynthèse des spiramycines puisque son inactivation entraîne un arrêt total de la production en spiramycines.

Le gène orf5* code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs 0-méthyltransférases. Le gène orf5* serait une 0-méthyl transférase impliquée dans la biosynthèse du platénolide. Pour vérifier cette hypothèse, des expériences d'analyse CL/SM et de RMN ont été conduites sur une souche de S. ambofaciens de génotype orf6*::attlDhyg+ obtenue à partir d'une souche surproduisant les spiramycines.
Un échantillon du surnageant de cette souche a été préparé selon la méthode décrite ci-dessus (cf. exemple 16, sans extraction au MIBK) et a été analysé
par CL/SM
=
comme décrit ci-dessus (cf le paragraphe 20.2 et 20.3). Toutefois, la colonne utilisée est 7 ;'=
une colonne X-Terra (Waters SAS, St-Quentin en-Yvelines, France), et la tension de cone du spectromètre est réglée à 380V pour obtenir la fragmentation du composé
analysé. Dans ces conditions, un produit dont le temps de rétention est d'environ 13,1 , minutes est observé. Le spectre de masse de ce composé a une allure similaire à celui de' la spiramycine I mais l'ion moléculaire est à 829. La différence de masse de 14 par rapport à la masse de la spiramycine peut s'expliquer par l'absence de groupement .t1 méthyl sur l'oxygène portée par le carbone n 4 du cycle lactone (la strucutre de ce . .
composé est présenté en figure 39). La présence d'un CUMPOaé à 829 permet de viiIi4r:.:"44, l'hypothèse du rôle de orf5* dans la biosynthèse des spiramycines.
Par un test microbioogique effectué sur une souche sensible de M. luteus (cf.
exemple 15 et figure 18) il a été démontré que la molécule intermédiaire (spiramycine moins groupement méhyle dont la structure est présentée en figure 39) produite par la souche orf6* .....Qatthyg+ est beaucoup moins active (d'un facteur 10) que la spiramycine d'origine avec le groupement méthyl en position 4.
EXEMPLE 28 : Construction de nouvelles cassettes excisables :
De nouvelles cassettes excisables ont été construites. Ces cassettes sont très semblables aux cassettes excisables déjà décrites dans l'exemple 9. La différence principale entre les anciennes et les nouvelles cassettes est l'absence dans ces dernières des séquences correspondant aux extrémités de l'inteiposon n, séquences qui contiennent un terminateur de transcription provenant du phage T4.
Dans les cassettes sans terminateur, le gène qui confère la résistance à un antibiotique est flanqué des séquences attR et attL permettant l'excision. Le gène de résistance est le gène aac(3)IV qui code une acétyltransferase qui confère la résistance à
l'apramycine. Ce gène est présent dans la cassette Daac (numéro d'accès GenBank :
X99313, Blondelet-Rouault, M.H. et al., 1997) et e été amplifié par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pOSK1102 (cf. ci-dessus) et comme amorces les .
oligonucléotides KF42 et KF'43 contenant chacun le site de restriction Hind111 (en gras)(AAGCTT) en 5'.
KF42: 5'-AAGCTTGTACGGCCCACAGAATGATGTCAC-3' (SEQ ID N 153) et KF43: 5'-AAGCTTCGACTACCTTGGTGATCTCGCCTT-3' (SEQ ID N 154).
= Le produit PCR obtenu d'environ lkb a été cloné dans le vecteur E cou pGEMT.
Easy donnant naissance au plasmide pSPM83. .
Le vecteur pSPM83 a été digéré Par l'enzyme de restriction HindIII. Le fragniere . . , Hindi:II-âne' de l'insert a-été isolé par purification à Partir d'un *gel d'agarose puis cloné dans le site HindIII situé entre les séquences attL et attR des différents plasmides portant les différentes cassettes excisables possibles (cf. exemple 9 et figure 27) de façon à remplacer le fragment HindlIl correspondant à Qacc par le fragment Hinc1111 correspondant au gène aac seul. Ceci a permit d'obtenir les cassettes attlaac, att2aac et att3aac (selon la phase souhaitée, cf. exemple 9). Selon l'orientation du gène aac par rapport aux séquences attL et attR, on distingue attlaac+, attlaac-, att2aac+, att2aac-, att3aac+ et att3aac- (selon les mêmes conventions que celles adoptées dans l'exemple 9).

EXEMPLE 29: Construction d'une souche de S. ambofaciens interrompue dans le gène orf28c :
L'inactivation du gène orf28c a été réalisée grâce à la technique des cassettes excisables. La cassette excisable att3aac+ (cf. exemple 28) a été amplifiée par PCR en ' utilisant comme matrice le plasmide pSPM101 (Le plasmide pSPM101 est un plasmide = dérivé du vecteur pGP704Not (Chaveroche et al., 2000) (Miller VL &
Mekalanos JJ, 1988) dans lequel la cassette att3aac+ a été clonée comme un fragment EcoRV
dans l9 site unique EcoRV de pGP704Not) et à l'aide des amorces suivantes :
KF32:
5' CAACCGCTTGAGCTGCTCCATCAACTGCTGGGCCGAGGTATCGCGCGCG
CTTCGTTCGGGACGAA 3' (SEQ ID N 155) et KF33:
.=
5' TGGGTCCCGCCGCGCGGCACGACTTCGACTCGCTCGTCTATCTGCCTCTT
.-" 15 CGTCCCGAAGCAACT 3' (SEQ ID N 156) = = ;
-=
=
= Les 39 nucléotides situés à l'extrémité 5' de ces oligonucléotides comportent une .z ..=
séquence correspondant à une séquence dans le gène orfl8e et les 26 nucléotides situés le plus en 3' (figuré en gras et soulignés ci-dessus) correspondent à la séquence d'une des extrémités de la cassette excisable att3aac+
Le produit de PCR ainsi obtenu a -été utilisé pour transformer la souche E.
cou hyper-recombinante DY330 (Yu et al., 2000) (cette souche contient les gènes exo, bet et gain du phage lambda intégrés dans son chromosome, ces gènes sont exprimés à 42 C, elle a été utilisée à la place de la souche E. cou KS272 (Chaveroche et al., 2000)) contenant le cosmide pSPM36. Ainsi, les bactéries ont été transformées par électroporation par ce produit de PCR et les clones ont été sélectionnés pour leur résistance à
l'apramycine. Les cosmides des clones obtenus ont été extraits et digérés par l'enzyme de restriction BamHI, dans le but de vérifier que le profil de digestion obtenu correspondait au profil attendu s'il y a eu insertion de la cassette (att3aac+) dans le gène o,128c, c'est à dire s'il y avait bien eu recombinaison homologue entre les extrémités du produit PCR et le gène cible. La vérification de la construction peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR. Un clone dont le cosmide possède le profil attendu a été sélectionné et le cosmide correspondant a été nommé pSPM107. Ce cosmide est un dérivé de pSPM36 dans lequel orf28c est interrompue par la cassette att3aac+. L'insertion de la cassette, s'accompagne d'une délétion dans le gène orf28c, l'interruption commence au niveau du 28ème codon de orf28c Il reste après la cassette les 137 derniers codons de orf28c.
;
Le cosmide pSPM107 a dans un premier temps été introduit dans la souche E. cou DII5a puis dans la souche Streptomyces ambofaciens OSC2 par transformation de protoplastes. Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à
l'apramycine. Les clones résistants à l'apramycine sont ensuite repiqués respectivement l;
=
sur milieu avec apramycine (antibiotique B) et sur milieu avec puromycine (antibiotique 15 A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'apramycine (ApraR) et sensibles à la.
=
I "=''' puromycine (PuroS) sont en principe, ceux où un double événement de crossing ove s'est produit e qui Possèdent le gène ief28e interrompu par la cassette att3aac+.Ces clones ont été plus particulièrement sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de orf28c par la copie interrompue par la cassette a été vérifié par hybridation. Ainsi, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybridé avec une sonde correspondant à la cassette att3aac+ pour vérifier la présence de la cassette au locus attendu dans l'ADN
génomique des clones obtenus. La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR.
Un clone présentant les caractéristiques attendues (orf28c::att3aac+) a été
plus particulièrement sélectionné et nommé SPM107. Ce clone possède donc le génotype :
orf28c::att3aac+ et a été nommé SPM107. Il est inutile de procéder à
l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de orf28c, au vu de l'orientation des gènes (cf. figure 3). En effet, le fait que orf29 soit orienté en sens opposé
à orf28c montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits. L'utilisation d'une cassette excisable permet en revanche d'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de sélection à
tout moment, notamment par transformation par le plasmide pOSV508.
Afin de tester l'effet de l'extinction du gène orf28c sur la production de spiramycines, la production en spiramycines de la souche SPM107 a été testée par la techniqiie décrite dans l'exemple 15. Il a ainsi pu être démontré que cette souche possède un phénotype non producteur de spiramycines. Ceci démontre que le gène orf28c est un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S.
ambofaciens.
EXEMPLE 30: Construction d'une souche de S. ambofaciens interrompue dans le gène orf31 :
L'inactivation du gène orf31 a été réalisée grâce à la teclmique des cassetteSM., excisables. La cassette excisable att3aac+ a été amplifiée par PCR en utilisant comii.W.,i15 matrice le plasmide pSPM101 et les oligonucléotides EDR71 et EDR72.
, EDR71: õ
'"
I" ,;=1:',`e 5' CGTCATCGACGTGCGGGGAAGACAGAGGTGATACCGATGATCGCGCGC ' GCTTCGTTCGGGACGAA 3' (SEQ ID N 157) EDR72:
5' GCCAGCACCTCGTCCAGCTGCTCGACGGAACTCACCCCCATCTGCCTCT
TCGTCCCGAAGCAACT 3' (SEQ ID N 158) Les 39 nucléotides situés à l'extrémité 5' de ces oligonucléotides comportent une séquence correspondant à une séquence dans le gène orf31 et les 26 nucléotides situés le plus en 3' (figurés en gras et soulignés ci-dessus) correspondent à la séquence d'une des extrémités de la cassette excisable att3aac+.
Le produit de PCR ainsi obtenu a été utilisé pour transformer la souche E.
colt KS272 contenant le plasmide pKOBEG et le cosmide pSPM36, comme décrit par Chaveroche et al. (Chaveroche et al., 2000) (cf. figure 12 pour le principe, le plasmide pOS49.99 doit être remplacé par le cosmide pSPM36 et le plasmide obtenu n'est plus pSPM17 mais pSPM543). Ainsi, les bactéries ont été transformées par électroporation par ce produit de PCR et les clones ont été sélectionnés pour leur résistance à
l'apramycine. Les cosmides des clones obtenus ont été extraits et digérés par plusieurs enzymes de restriction, dans le but de vérifier que le profil de digestion obtenu correspond au profil attendu s'il y a eu insertion .de la cassette (att3aac+) dans le gène oi131, c'est à dire s'il y a bien eu recombinaison homologue entre les extrémités du produit PCR et le gène cible. La vérification de la construction peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR. Un clone dont le cosmide possède le profil attendu a été sélectionné et le cosmide correspondant a été nommé pSPM543. Ce cosmide est un dérivé de pSPM36 dans lequel orf3/ est interrompue par la cassette att3aac+ (cf. figure 12). L'insertion de la cassette s'accompagne d'une délétion dans le gène orf3/, l'interruption commence au niveau de , trente sixième codon de orf31. Il reste après la cassette les 33 derniers codons de orf31., =
Le cosmide pSPM543 à été: mtroduit dans la âoùèhé Streptomyces ambofacienS, OSC2 (cf. ci-dessus) par transformation de protoplastes (Kieser, T et al., 2000). Après ' transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à
l'apramycine. Les clones résistants à l'apramycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec apramycine (antibiotique B) et sur milieu avec puromycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'apramycine (ApraR) et sensibles à la puromycine (PuroS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène orf31 interrompu par la cassette att3aac+. Ces clones ont été plus particulièrement sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de orf31 par la copie interrompue par la cassette a été vérifié par hybridation. Ainsi, l'ADN
total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré
sur membrane et hybridé avec une sonde correspondant à la cassette att3aac+
pour vérifier la présence de la cassette au locus attendu dans l'ADN génomique des clones obtenus. Une deuxième hybridation a été effectuée en utilisant comme sonde un fragment d'ADN obtenu par PCR et correspondant à une très large partie de la séquence codante du gène orf31.
La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR.
Un clone prég.éntant les caractéristiques attendues (orf31::att3aac+) a été
plus particulièrement sélectionné et nommé SPM543. Il a pu en effet être vérifié
grâce aux deux hybridations que la cassette att3aac+ était bien présente dans le génome de ce clone et que l'on obtient bien le profil de digestion attendu dans le cas d'un remplacement, à la suite d'un double événement de recombinaison, du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette att3aac+ dans le génome de ce clone. Ce clone possède donc le génotype : orf31::att3aac+ et a été nommé SPM543. Il est inutile de procéder à l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de orf31, au vu de l'orientation des gènes (cf. figure 3). En effet, le fait que orf32c soit orienté en ' sens opposé à 0131 montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits.
L'utilisation d'une .!- . cassette excisable permet en revanche d'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de sélection à tout théMént, notamment par transformation Par le plaitnidé, , .
pOSV508.
Afin de tester l'effet de l'extinction du gène orf31 sur la production de spiramycines, la production en spiramycines de la souche SPM543 a été testée par la technique décrite dans l'exemple 15. Il a ainsi pu être démontré que cette souche possède un phénotype non producteur de spiramycines. Ceci démontre que le gène orf31 est un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens.
EXEMPLE 31 Construction d'une souche de S. ambofaciens interrompue dans le gène orf32c:
L'inactivation du gène orf32c a été réalisée grâce à la technique des cassettes excisables. La cassette excisable att3aac+ a été amplifiée par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pSPM101 et à l'aide des amorces suivantes :
=

KF52:
5' GATCCGCCAGCCTCACGTCACGCCGCGCCGCCTCCCTGACATCGCGCGC
GCTTCGTTCGGGACGAA 3' (SEQ ID N 159).
et KF53:
5' GAGGCGGACGTCGGTACGCGGTGGGAGCCGGAGTTCGACAATCTGCCTC
TTCGTCCCGAAGCAACT 3' (SEQ ID N 160).
Les 40 nucléotides situés à l'extrémité 5' de ces oligonucléotides comportent une , séquence correspondant à une séquence dans le gène orf32c et les 26 nucléotides situés le plus en 3' (figuré en gras et soulignés ci-dessus) correspondent à la séquence d'une des extrémités de la cassette excisable att3aac+.
Le produit de PCR ainsi obtenu a été utilisé pour transformer la souche E.
colt hyper-recombinante DY330 (Yu et al., 2000) contenant le cosmide pSPM36. Ainsi, les -bactéries ont été transformées par électroporation par ce produit de PCR et les clones ont été sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les cosmides des clones .
obtenus ont été extraits et digérés par l'enzymes de restriction Bamill, dans le but de .Z.
; =
;
= vérifier que le profil de digestion obtenu' correspOnd au profil attendu s'il y a eirl.
insertion de la cassette (att3aac+) dans le gène orf32c, c'est à dire s'il y a bien eu recombinaison homologue entre les extrémités du produit PCR et le gène cible.
La vérification de la construction peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR. Un clone dont le cosmide possède le profil attendu a été sélectionné et le cosmide correspondant a été nommé pSPM106. Ce cosmide est un dérivé de pSPM36 dans lequel orf32c est interrompue par la cassette att3aac+.
L'insertion de la cassette s'accompagne d'une délétion dans le gène orf32c, l'interruption commence au niveau du 112ème codon de orf32c. Il reste après la cassette les

91 derniers codons de orf32c.
Le cosmide pSPM106 a dans un premier temps été introduit dans la souche E.
coli DH5a puis, dans la souche Streptomyces ambofaciens OSC2 par transformation.
Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à
l'apramycine. Les clones résistants à l'apramycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec apramycine (antibiotique B) et sur milieu avec puromycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'apramycine (ApraR) et sensibles à la puromycine (PuroS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène orf32c interroeu par la cassette att3aac+. Ces clones ont été plus particulièrement sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de orf32c par la copie interrompue par la cassette a été vérifié par hybridation. Ainsi, l'ADN
total des' clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré
sur membrane et hybridé avec une sonde correspondant à la cassette att3aac+
pour vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique des clones obtenus.
La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés i.q et séquençage du produit de PCR.
!lt Un clone présentant les caractéristiques attendues (orf32c::att3aac+) a été
pluS.
re:
particulièrement sélectionné : ce chine pôssède donc le génotype :
orj32c::att3aact't , õ
4e, été nommé SPM106. Il est inutile de procéder à l'excision de la cassette pour l'étude de' l'effet de l'inactivation de orf32c, au vu de l'orientation des gènes (cf.
figure 3). En effet, le fait que orf33 soit orienté en sens opposé à orf32c montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits. L'utilisation d'une cassette excisable permet en revanche d'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de sélection à tout moment, notamment par transformation par le plasmide pOSV508.
Afin de tester l'effet de l'extinction du gène orf32c sur la production de spiramycines, la production en spiramycines de la souche SPM106 a été testée par la technique décrite dans l'exemple 15. Il a ainsi pu être démontré que cette souche possède un phénotype producteur de spiramycines. Ceci démontre que le gène orf32c n'est pas un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S.
ambofaciens.

Liste des constructions décrites dans la présente demande Liste des abréviations : Am: Ampicilline ; Hyg: Hygromycine ; Sp : Spiramycine ; Ts:
Thiostrepton ; Cm: Chloramphénicol. Kn : Kanamycine, Apra: apramycine.
Nom de la Marqueur Principales caractéristiques Référence construction de sélection pWE15 Am (Wahl, et at, 1987) pWED1 Am pWE 1 5 dans lequel un (Gourmeleri et al., fragment Hpal-Hpal de 4.1 kb 1998) a été délété
p0J260 Apra Conjugatif, non réplicatif chez (Bierman et al., Streptomyces 1992) pHP45 Qhyg Hyg Cassette Qhyg dans pHP45. (Blondelet-Rouault et al., 1997) =
pKC505 Apra Cosmide (Richardson MA
et al., 1987) ; r p11486 Ts réplicatif (Ward et al., 1986) = i;.`
, =
' inülticôpieSsSWeptonzyces =
pOSint3 Am ptrc-xis-int dans pTrc99A (Raynal et al., 1998) pWHM3 Am, Ts Vecteur navette réplicatif E. (Vara et al., 1989) coli/Streptomyces.
pKOBEG Cm (Chaveroche et al., 2000) pGP704Not Am (Chaveroche et al., 2000) pMBL18 Am (Nakano et al., 1995) pGEM-T Easy Am vecteur E. cou i pour clonage Mezei et al., de produits PCR
=

pOS49.1 Am pWED1 avec insert au niveau Exemple 2 du site BamHI
pOS49.11 Am Fragment SacI de pOS49.1 Exemple 2 dans pUC19.
pOSC49.12 Ch Fragment xhoj de pOS49.11 Exemple 2 dans pBC SK+1:
pOS49.14 Cm, Hyg pOSC49.12 avec le gène orf3 Exemple 2 interrompu par la cassette Dhyg pOS49.16 Apra, Hyg Insert de pOS49.14 dans Exemple 2 p0J260 Cm Fragment BamHI-PstI de Exemple 3 pOS49.28 3,7kb ,de pOS49.1 dans pBC
;i.
SK+
= pOS44.1 Apra, Sp pKC505 contenant un insert (Pernodet et al., = =:!=
conférant la résistance la 1999) spiramycine chez S.
griseofuscus pOS44.2 Ts, Sp Fragment Sau3AI de 1,8 kb Exemple 3 pOS44.1 dans p11486 pOS44.4. Am Insert de pOS44.2 dans Exemple 3 pUC19 pSPM5 Am pWED1 avec insert d'ADN de Exemple 3 S. ambofaciens au niveau du site BamHI
pSPM7 Am pWED1 avec insert d'ADN de Exemple 3 S. ambofaciens au niveau du site B amHI

pOSK1205 Hyg pBK-CMV dans lequel hyg Exemple 5 remplace neo pOS49.67 Apra Fragment EcoRI-SacI de Exemple 6 pOS49.1, comportant une délétion interne de 504 nucléotides, dans p0J260 pOS49.88 Am Fragment de 3.7 kb Pstl- Exemple 7 EcoRI de pOS49.1 dans I
pUC19 pOS49.106 Am p049.88 avec hyg dans ore Exemple 7 (hyg et ore dans la même orientation) pOS49.120 Am pOS49.88 avec hyg dans orf8 Exemple 7 (hyg et orf8 dans des orientations opposées) .
pOS4 107 Apra, Hyg Insert ::40 pC)S49.I.06 dans E/44.ppl9 p0J260 pOS49.32 Am, Kn Fragment de 1,5 kb interne à Exemple 8 orf10 dans pCR2.1-TOPO
pOS49.43 Am, Kn pOS49.32 avec hyg dans orf10 Exemple 8 (hyg et orf10 dans la même orientation) pOS49.44 Am, Kn pOS49.32 avec hyg dans orf10 Exemple 8 (lzyg et orf10 dans des orientations opposées) pOS49.50 Apra, Hyg Insert de pOS49.43 dans Exemple 8 p0J260 pWHM3Hyg Am, Hyg pWHM3 dans lequel tsr est Exemple 10 remplacé par hyg pOSV508 Am, Ts ptrc-xis-int dans pWHM3 Exemple 9 pattlnhyg+ Cm, Hyg Cassette attl nhyg+ dans pBC Exemple 9 SK+ dont le site HindIII a été
supprimé
patt3naac- Cm, Gn Cassette att3Shac- dans pBC Exemple 9 SK+ dont le site Hindd a été
supprimé
pOSV510 Ain, Hyg pro pra-Amh dans Exemple 10 pWHM3Hyg .;
pOS49.99 Am Fragment EcoRI-BamHI de Exemple 10 4,5 kb de pSPM5 dans pUC19 pOSK1102 Am, Apra pGP704Not contenant la Exemple 10 cassette att3Qaac-pSPM17 Am, Apra pOS49.99 dans lequel orf2 est Exemple 10 interrompue par la cassette att3Qàac-pSPM21 Hyg, Apra pOSK1205 contenant l'insert Exemple 10 EcoRI-XbaI de pSPM17 (dans lequel orf2 est interrompue par la cassette att3Qaac-) pSPM502 Am Fragment BglII de 15,1 kb de Exemple 11 pSPM7 dans pMBL18 pSPM504 Hyg Insert de pSPM502 dans Exemple 11 pOSK1205 pSPM507 Hyg, Apra pSPM504 dans lequel orf12 Exemple 11 est interrompue par la cassette att3Qaac-pSPM508 Hyg, Apra pSPM504 dans lequel orfl 3c Exemple 12 est interrompue par la cassette att3Qaac-pSPM509 Hyg, Apra pSPM504 dans lequel orf14 Exemple 13 est interrompue par la cassette att3Qaac-pBXL1111 Am Fragment de 1,11 kb Exemple 14 contenant orf6* amplifié par PCR à partir de pSPM7, dans le vecteur pGEM-T Easy pBXL1112 Am, Hyg pBXL1111 dans lequel la Exemple 14 cassette attl Qhyg+ a été
introduite après délétion de 120 pb dans la séquence codante du gène orf6*
pBXL1113 Apra, Hyg Insert Pstl de 3.7 kb de Exemple 14 , pBXL1112 dans p0J260 =.õ
pSPM520 Mn Fragment de PCR amplifié par Exemple 17 .
= M4(4 les oligonucléotides EDR39r=
EDR42 dàriS PbÉM-T Easy r pSPM521 Am Fragment de PCR amplifié par Exemple 17 les oligonucléotides EDR40-EDR42 dans pGEM-T Easy pSPM522 Am Fragment de PCR amplifié par Exemple 17 les oligonucléotides EDR41-EDR42 dans pGEM-T Easy pUWL201 Am , Ts (Doumith et al., 2000) pSPM523 Am, Ts Fragment HindIII-BamHI de Exemple 17 l'insert du plasmide pSPM520 dans le vecteur pUWL201 pSPM524 Am, Ts Fragment HindIII-BamHI de Exemple 17 l'insert du plasmide pSPM521 dans le vecteur pUWL201 pSPM525 Am, Ts Fragment HindIII-BamHI de Exemple 17 l'insert du plasmide pSPM522 dans le vecteur pUWL201 pSPM527 Am pSPM521 avec décalage du Exemple 17 cadre de lecture au niveau du site XhoI
pSPM528 Am , Ts Fragment HindIII-BamHI de Exemple 17 l'insert du plasmide pSPM527 dans le vecteur pUWL201 pVF 10.4 (Vara et al., 1985; , Lacalle et al., 1989) pPM803 Ts (Mazodier,P. et al., e1,1 ' 1989) =
= =-,:ee, pGEM-T-pac- Am Cassette pac-oriT (amplifiée Exemple 18 oriT par PCR à partir de pVF 10.4 et pPM803) dans dans pGEM-T Easy pWED2 Am Cassette pac-oriT obtenue à Exemple 18 partir de pGEM-T-pac-oriT
insérée dans pWED1 pSPM34 Am pWED2 avec insert au niveau Exemple 19 du site BamHI
pSPM35 Am pWED2 avec insert au niveau Exemple 19 du site BamHI
pSPM36 Am pWED2 avec insert au niveau Exemple 19 du site BamHI

pSPM37 Am pWED2 avec insert au niveau Exemple 19 du site B amHI
pSP M38 Am pWED2 avec insert au niveau Exemple 19 du site B amHI
pSPM39 Am pWED2 avec insert au niveau Exemple 19 du site B amHI
pSPM40 Am pWED2 avec insert au niveau Exemple 19 du site B amHI
pSPM41 Am pWED2 avec insert au niveau Exemple 19 du site B amHI
pSPM42 Am pWED2 avec insert au niveau Exemple 19 du site B amHI
pSPM43 Mn pWED2 avec insert au niveau Exemple 19 du site B amHI
ty pSPM44 Mn pWED2 avec insert au niveau Exemple 19 du site Banigl pSPM45 Mn pWED2 avec insert au niveau Exemple 19 du site B amHI
pSPM47 Mn pWED2 avec insert au niveau Exemple 19 du site BamHI
pSPM48 Mn pWED2 avec insert au niveau Exemple 19 du site B amHI
pSPM50 Am pWED2 avec insert au niveau Exemple 19 du site BamHI
pSPM51 Am pWED2 avec insert au niveau Exemple 19 du site B amHI
pSPM52 Am pWED2 avec insert au niveau Exemple 19 du site B amHI

pSPM53 Am pWED2 avec insert au niveau Exemple 19 du site BamHI
pSPM55 Am pWED2 avec insert au niveau Exemple 19 du site BamHI
pSPM56 Am pWED2 avec insert au niveau Exemple 19 , =
du site BamHI
pSPM58 Kn Fragment Psd-PstI d'environ Exemple 19 6kb de l'insert de pSPM36 dans pBK-CMV
pSPM72 Kn Fragment StuI-&uI d'environ Exemple 19 kb de l'insert de pSPM36 cloné dans pBK-CMV
= pSPM73 Cm Fragment EcoRI-HindIII de Exemple 19 .1 =
l'insert de pSPM72 dans pBC-.
=a SK+
,. pSPM515 Mn Fragment 4 PCR amplifié par exepapié 22 =
EDR31-EDR37 dans pGEM-T
easy pSPM519 Am, Ts Insert HindIllabal de Exemple 22 pSPM515 dans pUWL201 pOS49.52 Apra Séquence codante de tylB sous Exemple 23 contrôle du promoteur ermE*
dans le plasmide pKC1218 pSPM74 Am Fragment de PCR amplifié par Exemple 24 KF30-KF31 dans pGEM-T
easy pSPM75 Am, Ts Insert Hind1111BamHI de Exemple 24 pSPM74 dans pUWL201 pSPM79 Kn Fragment Pstl-Pstl d'environ Exemple 19 2,5kb de l'insert de pSPM36 dans pBK-CMV
pSPM83 Am Fragment de PCR amplifié par Exemple 28 KF42-KF43 dans pGEM-T
easy pSPM107 Am, Apra pSPM36 dans lequel orfl8c Exemple 29 est interrompue par la cassette ,..
att3aac-F
pSPM543 Am, Apra pSPM36 dans lequel orf31 est Exemple 30 interrompue par la cassette att3aac+
pSPM106 Am, Apra pSPM36 dans lequel od32c Exemple 31 ' est interrompue par la cassette , , att,3aaC+
, :s!
õ .
=

Dépôt de matériel biologique Les organismes suivants ont été déposés le 10 juillet 2002 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France, selon les dispositions du Traité de Budapest.
- Souche OSC2 sous le numéro d'enregistrement 1-2908.
- Souche SPM501 sous le numéro d'enregistrement 1-2909.
- Souche SPM502 sous le numéro d'enregistrement 1-2910.
- Souche SPM507 sous le numéro d'enregistrement 1-2911.
- Souche SPM508 sous le numéro d'enregistrement 1-2912.
.
='`k - Souche SPM509 sous le numéro d'enregistrement 1-2913.
, ; É
! : = - Souche SPM21 sous le numéro d'enregistrement 1-2914.
- Souche SPM22 sous le numéro d'enregistrement 1-2915.
, - Souche 0S49.67 sous le numéro d'enregistrement 1-2916.
- Souche 0S49.107 sous le numéro d'enregistrement 1-2917.
- Souche Escherichia cou i DH5a contenant le plasmide pOS44.4 sous le numéro d'enregistrement 1-2918.
Les organismes suivants ont été déposés le 26 février 2003 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France, selon les dispositions du Traité de Budapest.
- Souche SPM502 pSPM525 sous le numéro d'enregistrement 1-2977.

Les organismes suivants ont été déposés auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux Paris Cedex 15, France, le 6 octobre 2003 selon les dispositions du Traité de Budapest.
- Souche OSC2/pSPM75(2) sous le numéro d'enregistrement 1-3101.
, . . = =
= ==,, =

Toutes les publications et brevets cités sont incorporés à la présente demande par référence.
Bibliographie :
- Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. (1990). 215 (3):403-410.
- Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ.
Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. (1997). 25 (17):3389-402.
- Amatm,E., Ochs,B. and Abel,K.J. Tightly regulated tac promoter vectors useful for the expression of unfused and fused proteins in Escherichia cou i Gene (1988) 69 (2), 301-315.
- Arisawa,A., Kawamura,N., Tsunekawa,H., Okamura,K., Tone,H. and Okamoto,R. Cloning and nucleotide sequences of two genes involved in the 4"-0-acylation of macrolide antibiotics from Streptomyces thermotolerans. BioscE
BiotechnoL Biochem. (1993). 57 (12) : 2020-2025.
=
=
.. - Arisawa A, Kawamura N, Takeda K, Tsunekawa H, Okamura K, Okamoto R.
c.
Cloning of the macrolide antibiotic bios3mthesis gene acyA, winch encodes 3-0-=
acyltransferase, from Streptomyces thermotolerans and its use for direct fermentative production of ,;,a lerid macrOlide antibiotic Appl Environ MicrobioL (1994). 60 (7):2657-2666. ¨
:te , .
- August,P.R., Tang,L., Yoon,Y.J., Ning,Streptomyces, Mueller,R., Yu,T.W., Taylor,M., Hoffinann,D., Kim,C.G., Zhang,X., Hutchinson,C.R. et Floss,H.G.
Biosynthesis of the ansamycin antibiotic rifamycin: deductions from the molecular analysis of the rif biosynthetic gene cluster of Amycolatopsis mediterranei S699. Chem. Biol. (1998) 5 (2), 69-79.
-Ausubel Fred M., Brent Roger, Kingston Robert E., Moore David D., Seidman J.G., Smith John A., Struhl Kevin (Editeurs). Current Protocols in Molecular Biology, publié par John Wiley & Sons Inc. Current Protocols Customer Service, 605 Third Avenue, 9th Floor New York, NY 10158 USA (édition mise à jour de Mars 2002).
- Baltz RH, McHenney MA, Cantwell CA, Queener SW, Solenberg PJ.
Applications of transposition mutagenesis in antibiotic producing streptomycetes.
Antonie Van Leeuwenhoek. (1997). 71 (1-2): 179-187.
- Bate N, Butler AR, Gandecha AR, Cundliffe E. Multiple regulatory genes in the tylosin biosynthetic cluster of Streptomyces fradiae. Chem Biol. (1999). 6 (9):
617-624.
=

- Bate,N., Butler,A.R., Smith,I.P. et Cundliffe,E. The mycarose-biosynthetic genes of Streptomyces fradiae, producer of tylosin. Microbiology (2000). 146 (Pt 1), 139-146.
- Bayley C., Morgan, Dale E. C., Ow D. W. Exchange of gene activity in transgenic plants catalysed by the Cre-lox site specific system. Plant Mol.
Biol (1992). 18 :353-361.
- Bentley,S.D., Chater,K.F., Cérdeno-Tarraga,A.M., Challis,G.L., Thomson,N.R., James,K.D., Harris,D.E., Quail,M.A., Kieser,H., Harper,D., Bateman,A., Brown,S., Chandra,G., Chen,C.W., Collins,M., Cronin,A., Fraser,A., Goble,A., Hidalgo,J., Hornsby,T., Howarth,S., Huang,C.H., Kieser,T., Larke,L., Murphy,L., Oliver,K., O'Neil,S., Rabbinowitsch,E., Rajandream,M.A., Rutherford,K., Rutter,S., Seeger,K., Saunders,D., Sharp,S., Squares,R., Squares,S., Taylor,K., Waffen,T., Wietzorrek,A., Woodward,J., Barrell,B.G., Parkhill,J. et Hopwood,D.A. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature (2002). 417 (6885), 141-147.
- Bibb MJ, Findlay PR, Johnson MW. The relationship between base composition and codon usage in bacterial genes and its use for the simple and reliable .
identification of protein-coding sequences. Gene. (1984) 30 (1-3):157-166.
- Bibb MJ, Janssen GR, Ward J1v1. Cloning and analysis of the promoter region of =
the erythromycin resistance gene (ermE) of Streptomyces erythraeus.Gene , , . (1985). 38 (1-3) : 215-26.
= .
= -;
=
- Bibb MJ, White J, Ward JM, Janssen GR. The mRNA for the 23S rRNA
methylase encoded by the ermE gene of Saccharopolyspora erythraea is translated in the absence of a conventional ribosome-binding site. Mol Microbiol.
(1994). 14 (3): 533-45.
- Bierman M, Logan R, O'Brien K, Seno ET, Rao RN, Schoner BE. Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia cou i to Streptomyces spp. Gene. 1992;116(1):43-9.
- Blondelet-Rouault M-H., Weiser J., Lebrihi A., Branny P. and Pernodet J-L.
Antibiotic resistance gene cassettes derived from the n interposon for use in E.
coli and Streptomyces. Gene (1997) 190 : 315-317.
- Boccard F., Smokvina T., J.-L., Pernodet Fridmann A., and Guérineau M., Structural analysis of loci involved in pSAM2 site-specific integration in Streptomyces. Plasmid, (1989a). 21 : 59-70.
- Boccard F., Smokvina T., J.-L., Pernodet Fridmann A., and Guérineau M.. The integrated conjugative plasmpid pSAM2 of Streptomyces ambofaciens is related to temperate bacteriophages. EMBO J. (1989b) 8 : 973-980.

- Brunelli J.P., Pall M.L., A series of Yeast/ E. cou i lambda expression vectors designed for direct ional cloning of cDNA and cre/lox mediated plasmid excision.
Yeast. (1993) 9: 1309-1318.
- Camilli A., Beattie D. T. et Mekalanos J. J. Use of genetic recombination as a reporter of gene expression. Froc. NatL Acad. Sci. USA (1994) 91(7), 2634-2638.
- Ciampelo,A.B. and Gil,J.A. The candicidin gene cluster from Streptomyces griseus IMRU 3570. Microbiology (2002) 148 (Pt 1), 51-59.
- Carreras C, Frykman S, Ou S, Cadapan L, Zavala S, Woo E, Leaf T, Carney J, Burlingame M, Patel S, Ashley G, Licari P. Saccharopolyspora erythraea-catalyzed bioconversion of 6-deoxyerythronolide B analogs for production of novel erythromycins. J BlotechnoL (2002). 92(3): 217-28.
- Chao K.-M., Pearson W.R., Miller W. Aligning two sequences within a specified diagonal band. Comput. AppL Biosci. (1992) 8 : 481-487.
- Chater K. F. The improving prospects for yield increase by genetic engineering in antibiotic-producing Streptomycetes. Biotechnology. (1990). 8 (2) : 115-121.
- Chaveroche MK, Ghigo JM, d'Enfert C. A rapid method for efficient gene replacement in the filamentous finigus Aspergillus nidulans. Nucleic Acids Re 2000,28(22) :E97.
, r.4=;%:=5 =
e, =;
, r Church GM, Gilbert W. Genornic sequencing. Proc Natl Acad Sci USA. (1984) 81(7):1991-5.
- Churchward G, Belin D, Nagamine Y. A pSC101-derived plasmid which shows no sequence homology to other commonly used cloning vectors. Gene. (1984) 31 (1-3): 165-71.
- Comstock,L.E., Coyne,M.J., Tzianabos,A.O. and Kasper,D.L. Interstrain variation of the polysaccharide B biosynthesis locus of Bacteroides fragilis:
characterization of the region from strain 638R J. Bacteriol. (1999). 181 (19) :
6192-6196.
- Cox KL, Baltz RH. Restriction of bacteriophage plaque formation in Streptomyces spp. J Bacteriol. (1984) 159(2): 499-504.
- Dale E.C., Ow D.W., Gene transfer with subsequent removal of the selection gene from the host genome. Froc. NatL Acad. Sei. USA (1991). 88 : 10558-10562.
- Doumith M, Weingarten P, Wehmeier UF, Salah-Bey K, Benhamou B, Capdevila C, Michel JM, Piepersberg W, Raynal MC. Analysis of genes involved in 6-deoxyhexose biosynthesis and transfer in Saccharopolyspora erythraea. Mol Gen Genet. (2000) 264(4): 477-485.
- Draeger,G., Park,Streptomyces-H.H. et Floss,H.G. Mechanism of the 2-deoxygenation step in the biosynthesis of the deoxyhexose moieties of the antibiotics granaticin and oleandomycin J. Am. Chem. Soc. (1999) 121: 2611-2612.
- Gandecha,A.R., Large,S.L. et Cundliffe,E. =Analysis of four tylosin biosynthetic genes from the tylLM region of the Streptomyces fradiae genome. Gene. (1997).
184 (2) :197-203.
- Geistlich,M., Losick,R., Turner,J.R. et Rao,R.N. Characterization of a novel regulatory gene governing the expression of a polyketide s3mthase gene in Streptomyces ambofaciens. Mol. Microbiol. (1992). 6 (14) : 2019-2029.
- Gourmelen A, Blondelet-Rouault MH, Pernodet JL. Characterization of a glycosyl transferase inactivating macrolides, encoded by gimA from Streptomyces ambofaciens. Antimicrob Agents Chemother. (1998). 42(10): 2612- ' 9.
- Huang X. et Miller W. A time-efficient, linear-space local similarity algorithrn.
Adv. AppL Math. (1991). 12 : 337-357.
=

i}t:ref' Hara O et Hutchinsen CR. Cloiiing "Of Midecamycin(MLS)-resistance genes froM.
2i3 Streptomyces mycaredacienà, Streptem3rces lividans and Streptomyces coelicolor A3(2). J Antibiot (Tokyo). (1990). 43 (8):977-991.
- Hara 0 et Hutchinson CR. A macrolide 3-0-acyltransferase gene from the midecamycin-producing species Streptomyces mycarofaciens. J Bacteriol.
(1992). 174(15) :5141-5144.
- Hoffmeister D, Ichinose K, Domann S, Faust B, Trefzer A, Drager G, Kirschning A, Fischer C, Kunzel E, Bearden D, Rohr J et Bechthold A. The NDP-sugar co-substrate concentration and the enzyme expression level influence the substrate specificity of glycosyltransferases: cloning and characterization of deoxysugar biosynthetic genes of the urdamycin biosynthetic gene cluster. Chem Biol.
(2000). 7 (11):821-831.
- Hopwood, D.A. Future possibilities for the discovery of new antibiotics by genetic engineering. In Beta-lactam antibiotics. Edited by M.R.J. Salton and G.D.
Shockman. New York: Academic Press. (1981). 585-598.
- Hopwood D. A., Malpartida F., Kieser H. M., Ikeda H., Duncan J., Fujii I., Rudd A. M., Floss H. G. et Omura S. Production of 'hybrid' antibiotics by genetic engineering. Nature. (1985a). 314 (6012): 642-644.

- Hopwood D. A., Malpartida F., Kieser H. M., Ikeda H. et Omura S. (1985b) In Microbiology (ed S. Silver). American Society for Microbiology, Washington D.
C., 409-413.
- Houben Weyl, 1974, in Meuthode der Organischen Chemie, E. Wunsch Ed., Volume 15-1 et 15-II, -Hutchinson, C.R. Prospects for the discovery of new (hybrid) antibiotics by genetic engineering of antibiotic-producing bacteria. Med Res Rev. (1988). 8 (4) :
557-567.
-Hutchinson C. R., Borell C. W., Otten S. L., Stutzman-Engwall K. J. et Wang Y.
Drug discovery and development through the genetic engineering of antibiotic-producing microorganisms J. Med. Chem. (1989) 32 (5) : 929-937.
-Ishikawa J, Hotta K. FramePlot: a new implementation of the frame analysis for predicting protein-coding regions in bacterial DNA with a high G + C content.
FEMS Microbiol Lett. (1999) 174(2):251-3.
- Kieser, T, Bibb, MJ, Buttner MJ, Chater KF, Hopwood DA. Practical Streptomyces Genetics. 2000. The John limes Foundation, Norwich UK.
-Kuhstoss et al. Production of a novel polyketide through the construction of g = hybrid polyketide synthase. Gene. (1996). 183(1-2): 231-236tt , Y.!
= = = . = , - Lacalle RA, Pulido D, Vara J, Zalacain M, Jimenez A. Molecùlar analysis of thé :'e!1 pac gene encoding a puromycin N-acetyl transferase from Streptomyces alboniger. Gene. (1989). 79(2):375-380.
-Lakso M, Sauer B, Mosinger B Jr, Lee EJ, Manning RW, Yu SH, Mulder KL, Westphal H. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA. (1992) 89 (14) :6232-6.
- Li,T.B., Shang,G.D., Xia,H.Z. and Wang,Y.G. Cloning of the sugar related biosynthesis gene cluster from Streptomyces tenebrarius H6. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao (2001). 17 (3) : 329-331.
- Ligon,J., Hill,S., Beck,J., Zirkle,R., Molnar,I., Zawodny,J., Money,S. and Schupp,T. Characterization of the biosynthetic gene cluster for the antifungal polyketide soraphen A from Sorangium cellulosum So ce26. Gene (2002). 285 (1-2), 257-267.
-Liu L, Saevels J, Louis P, Nelis H, Rico S, Dierick K, Guyomard S, Roets E, Hoogmartens J. Interlaboratory study comparing the microbiological potency of spiramycins I, II and III. J Pharm Biomed Anal. (1999). 20 (1-2):217-24.

- Mazodier P, Petter R, Thompson C. Intergeneric conjugation between Escherichia cou i and Streptomyces species.JBacteriol. (1989). 171 (6):3583-5.
- Merrifield RB, 1965a, Nature, 207(996): 522-523.
- Merrifield RB., 1965b, Science, 150(693): 178-185.
- Merson-Davies,L.A. et Cundliffe,E. Analysis of five tyl9sin biosynthetic genes from the tyllBA region of the Streptomyces fradiae genome, Molecular microbiology. (1994). 13 (2) : 349-355.
- Miller VL, Mekalanos JJ. A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR. J Bacteriol. (1988) 170(6):2575-83.
- Nakano, Y., Yoshida, Y., Yamashita, Y. & Koga, T. Construction of a series of pACYC-derived plasmid vectors. Gene (1995). 162: 157-8.
- Nielsen H., Engelbrecht J., Brunak S. et von Heijne G. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites., Protein Engineering (1997). 10: 1-6.
t.õ
- Oh SH, Chater KF. Denaturation of circ .plar or linear DNA
facilitates targeted=;:A
=. .= =
=== . integrative transformation Of StreptOinyee "ekielicelor43(2):
possible 7 to other organisrns. J
- Olano C, Lomovskaya N, Fonstein L, Roll JT, Hutchinson CR. A two-plasmid system for the glycosylation of polyketide antibiotics: bioconversion of epsilon-rhodomycinone to rhodomycin D. Chem Biol. (1999). 6 (12):845-55.
- Omura S, Kitao C, Hamada H, Ikeda H. Bioconversion and biosynthesis of 16-membered macrolide antibiotics. X. Final steps in the biosynthesis of spiramycin, using enzyme inhibitor: cerulenin. Chem Pharm Bull (Tokyo). (1979a). 27(1):
176-82.
- Omura S, Ikeda H, Kitao C. Isolation and properties of spiramycin I 3-hydroxyl acylase from Streptomyces and ambofaciens. J Biochem (Tokyo). (1979b). 86(6):
1753-8.
- Omura,S., lkeda,H., Ishikawa,J., Hanamoto,A., Takahashi,C., Shinose,M., Takahashi,Y., Horikawa,H., Nakazawa,H., Osonoe,T., Kikuchi,H., Shiba,T., Sakaki,Y. and Hattori,M. Genome sequence of an industrial microorganism Streptomyces avermitilis: Deducing the ability of producing secondary metabolites. Proc. Nati. Acad. Sei. U.S.A. (2001). 98 (21), 12215-12220.

- Pearson W.R. and D. J. Lipman. Improved Tools for Biological Sequence Analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85: 2444-2448.
- Pearson W. R. Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA. Methods in Enzymology. 1990, 183: 63-98.
- Pernodet JL, Simonet JM, Guerineau M. Plasmids in different strains of Streptomyces ambofaciens; free and integrated form of plasmid pSAM2. Mol Gen Genet. (1984);198 (1):35-41.
- Pernodet JL, Alegre MT, Blondelet-Rouault MH, Guerineau M. Resistance to spiramycin in Streptomyces ambofaciens, the producer organism, involves at least two different mechanisms. J Gen Microbiol. (1993) ; 139 ( Pt 5):1003-11.
- Pernodet JL, Fish S, Blondelet-Rouault MH, Cundliffe E. The macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance phenotypes characterized by using a specifically deleted, antibiotic-sensitive strain of Streptomyces lividans.
Antimicrob Agents Chemother. (1996), 40 (3): 581-5.
- Pernodet JL, Gourmelen A, Blondelet-Rouault MH, Cundliffe E. Dispensable ribosomal resistance to spiramycin conferred by srmA in the spiramycin producer.
Streptomyces ambofaciens. Microbio/ogy. (1999), 145 (Pt 9):2355-64.
- Pfoestl,A., Hofinger,A., Kosma,P. and Messner,P. Biosynthesis of dTDP
' ' acetamido-3,6-dideoxy-alpha-p-galactos'è in Aneurinibacillus thermoaerop/ulus e - 20 - L420-91t. J Biol. Chen. (2003), 278 (29): 26410-26417.
= 4.
- Rao RN, Richardson MA, Kuhstoss S. Cosmid shuttle vectors for cloning and analysis of Streptomyces DNA. Methods Enzymol. (1987); 153: 166-98.
- Raynal A, Tuphile K, Gerbaud C, Luther T, Guerineau M, and Pernodet JL..
Structure of the chromosomal insertion site for pSAM2: functional analysis in Escherichia coll. Molecular Microbiology (1998) 28 (2) 333-342.
- Redenbach,M., Kieser,H.M., Denapaite,D., Eichner,A., Cullum,J., Kinashi,H. et Hopwood,D.A. A set of ordered cosmids and a detailed genetic and physical map for the 8 Mb Streptomyces coelicolor A3(2) chromosome Mol. Microbiol.
(1996). 21 (1) : 77-96.
- Richardson MA, Kuhstoss S, Solenberg P, Schaus NA, Rao RN. A new shuttle cosmid vector, pKC505, for streptomycetes: its use in the cloning of three different spiramycin-resistance genes from a Streptomyces ambofaciens library.

Gene. (1987); 61 (3):231-41.
- Robinson, J.A. Enzymes of Secondary Metabolism in Microorganisms.
Chem Soc Rev. (1988). 17:383-452.

- Russell SH, Hoopes JL, Ode!! JT. Directed excision of a transgene from the plant genome. Mol Gen Genet. (1992). 234 (1): 49-59.
- Sambrook J, Frisch EF, Maniatis T . Molecular Cloning : a laboratory manual 2nd cd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York USA
(1989).
- Schoner B, Geistlich M, Rosteck P Jr, Rao RN, Seno E, Reynolds, P, Cox K, Burgett S et Hershberger C. Sequence similarity between macrolide-resistance determinants and ATP-binding transport proteins. Gene. (1992). 115 (1-2), 93-96.
- Sezonov G, Hagege J, Pernodet JL, Friedmann A and Guerineau M.
Characterization of pra, a gene for replication control in pSAM2, the integrating element of Streptomyces ambofaciens. Mol Microbiol. (1995). 17(3): 533-44.
- Sezonov G., Blanc V., Bamas-Jacques N., Friedmann A., Pernodet J.L.
and M.
Guerineau, Complete conversion of antibiotic precursor to pristinamycin HA by over expression of Streptomyces pristinaespiralis biosynthetic genes, Nature Biotechnology. (1997) 15 : 349-353.
- Sezonov G, Possoz C, Friedmann A, Pernodet JL, Guerineau M. KorSA
from the Streptomyces integrative element pSAM2 is a central transcriptional represscee target genes and binding sites.'J Bacteriol. (2000). 182(5):1243-50.
"
- Simon R., Priefer U and Piihier. A broad IMst range mobilisation system for vivo genetic engeneering : transposon mutagenesis in gram negative bacteria.
Bio/Technology (1983). 1 : 784-791.
- Simon, et al., Plasmid vectors for the genetic analysis and manipulation of rhiweziosbshia and th h (eods.e)r, mameth-ondes atiinveebnzarncterioiao, gy., 6v4001-659 gr g P 18.
,InAAo.adWemeiisosbpacrhes, san , Orlando, 1986 - Summers,R.G., Donadio,Streptomyces, Staver,M.J., Wendt-Pienkowski,E., Hutchinson,C.R. et Katz,L. Sequencing and mutagenesis of genes from the erythromycin biosynthetic gene cluster of Saccharopolyspora erythraea that are involved in L-mycarose and D-desosamine production. Microbiology (1997). 143 (Pt 10) : 3251-3262.
- Van Mellaert L, Mei L, Lammertyn E, Schacht S, Aime J. Site-specific integration of bacteriophage VWB genome into Streptomyces venezuelae and construction of a VWB-based integrative vector. Microbiology. (1998). 144 ( Pt 12): 3351-8.
=

- Vara J, Lewandowska-Skarbek M, Wang YG, Donadio S, Hutchinson CR.Cloning of genes governing the deoxysugar portion of the erythromycin biosynthesis pathway in Saccharopolyspora erythraea (Streptomyces erythreus).
J
Bacteriol. (1989). 171(11): 5872-81.
- Vara J, Malpartida F, Hopwood DA, Jimenez A. Cloning and expression of a puromycin N-acetyl transferase gene from Streptomyces alboniger in Streptomyces lividans and Escherichia cgli. Gene. (1985). 33(2): 197-206.
=
- Wahl, G. M., K. A. Lewis, J. C. Ruiz, B: Rothenberg, J. Zhao, and G. A.
Evans.
Cosmid vectors for rapid genomic walking, restriction mapping, and gene transfer. Proc. Nad. Acad. Sci. USA (1987). 84: 2160-2164.
- Waldron,C., Matsushima,P., Rosteck,P.R., Broughton,M.C., Turner,., Madduri,K., Crawford,K.P., Merlo,D.J. et Baltz,R.H. Cloning and analysis of the spinosad biosynthetic gene cluster of Saccharopolyspora spinosa(1) Chem. Biol.

(2001) 8 (5) : 487-499.
- Walczak RJ, Hines JV, Strohl WR, Priestley ND.Bioconversion of the anthracycline analogue desacetyladriamycin by recombinant DoxA, a P450- ;..
monooxygenase from Streptomyces sp. strain C5. Org Lett. (2001). 3 (15):2277-9. , =
- Wang,ZX., Li,S M µet, s Identification of the coumermycin A(1)1 bioSynthetie gène cluster . of Sir'étjtôniY.C'és rishiriensis DSM 40489.
Antimic,V1 Agents Chemother'. (2000) 44 (11), 3640-3048.
- Ward, J.M., Janssen, G.R., Kieser, T, Bibb, M.J., Buttner, M.J. & Bibb, M.J.

Construction and characterization of a suies of multi-copy promoter-probe plasmid vectors for Streptomyces using the aminoglycoside phosphotransferase from Tn5 as indicator. Mol Gen Genet (1986). 203 : 468-478.
- Wehmeier UF. New multifunctional Escherichia coli-Streptomyces shuttle vectors allowing blue-white screening on XGal plates. Gene. (1995). 165(1):
149-150.
- Wilms B, Hauck A, Reuss M, Syldatk C, Mattes R, Siemann M, Altenbuchner J.
High-cell-density fermentation for production of L-N-carbamoylase using an expression system based on the Escherichia coli rhaBAD promoter. Biotechnol Bioeng. (2001). 73(2) :95-103.
- Worley K. C., Wiese B. A., and Smith R. F. BEAUTY: An enhanced BLAST-based search tool that integrates multiple biological information resources into sequence similarity search results. Genome Research (1995). 5: 173-184.

- Wu K, Chung L, Revill WP, Katz L et Reeves CD. The FK520 gene cluster of Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus (ATCC 14891) contains genes for biosynthesis of unusual polyketide extender units. Gene. (2000). 251 (1):

90.
- Xue Y, Zhao L, Liu IIW et Sherman DH. A gene cluster for macrolide antibiotic biospthesis in Streptomyces venezuelae: architecture of metabolic diversity.
Proe Natl Acad Sei S A. (1998). 95 (21): 12111-12116.
- Yu D, Ellis HM, Lee EC, Jenkins NA, Copeland NG et Court DL. An efficient .
recombination system for chromosome engineering in Escherichia cou. Froc Natl Acad Sci USA. (2000). 97(11): 5978-83.

SEQUENCE LISTING
<110> Aventis Pharma SA
CNRS
<120> POLYPEPTIDES IMPLIQUES DANS LA BIOSYNTHESE DES SPIRAMYCINES, SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES CODANT CES POLYPEPTIDES ET LEURS
APPLICATIONS
<140> 2,501,445 <141> 2003-10-08 <130> 11246-62 <150> FR 0212489 <151> 2002-10-08 <150> FR 0302439 <151> 2003-02-27 <150> US 60/493,490 <151> 2003-08-07 <160> 161 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 30943 <212> DNA
<213> Streptomyces ambofaciens <400> 1 gaattcggca attcccgggg cgccgggaaa ccggcacgcc attccgacca cggcaacggc 60 gtcggaccgg tcgtcactgc gggaaatcgc gagttctcca gacacctgca tccctcatat 120 gttcgccgta ccacgccgtg gcttttctgc cttttcttga tcttcccgag cgtacagcgg 180 gcgaactgcc gggcgacagg aacggccggt gaacgacaat caattgtgtc aagttcggag 240 attgtccacc gattctcgtc accggagacg gcgcgggatc atgcgggacc acacggcatc 300 gcaccaggtc cgcagggtcg gcgctccgac gtcccggccg gtcgcgcact ccggtgacct 360 gcacgcggag tcctgggcga gcggagaaga tttcagtacc tcgcggcgcg ggacaaccac 420 ttcgcgacga atatgtcagg tctccccgag cggtccgtgc cgccccgccc tgacccgtcc 480 gcgcccgtcc cgctccgccc cggtcgtcat ctcggccgga atttcagtcg gcagctcatt 540 gtgtcaggtt cgccttgccg acattctccg gagattccta agctctgccg gtaaccggga 600 ccggaaccac cgtgccgcgc gttcggtcca cacaccgctt ttcgaggagt ccgactgatg 660 ggtgaggccg tgacgggacc gatggagctg agcaaggacg cggacgcccg ggggctgctt 720 gagtggttcg cgtacaacag gacgcgtcat ccggtgttct gggacgagac ccgacaggcg 780 tggcaggtct tcggctacga cgactacgtg acggtgtcga acaacccgca gttcttctcc 840 tcggacttca acatggtgat gccgacgccg cccgaactgg agatgatcat cggtccgggc 900 acgatcggcg cgctggaccc gcccgcgcac ggaccgatgc gcaagctggt gagccaggcg 960 ttcacccccc gacggatcgc ccggctggag cccagggtgc gcgcgatcac cgaggagctc 1020 ctggacaagg tggggcagca ggacgtcgtc gacgccgtgg gtgacctgtc ctacgcgctg 1080 ccggtcatcg tgatcgccga actgctgggc atacccgccg gcgaccgtga cctgttccgg 1140 gagtgggtcg acaccctgct gacgaacgag ggcctggagt acccgaacct cccggacaac 1200 ttcaccgaga cgatcgcgcc cgcgctcaag gagatgaccg actacctcct gaagcagatc 1260 cacgccaagc gggacgcgcc cgccgacgac ctggtcagcg ggctggtcca ggcggagcag 1320 gacggccgcc ggctgaccga cgtcgagatc gtcaacatcg tcgcgctgct cctgacggcg 1380 gggcacgtct cctccagcac cctgctcagc aacctgttcc tggtcctgga ggagaacccg 1440 caggcgctgg aggacctgcg ggccgatcgc tccctggtgc ccggcgcgat cgaggagacg 1500 ctgcgctacc gcagcccctt caacaacatc ttccggttcg tcaaggagga caccaccgtc 1560 ctcggtccgc tcatggagaa gggccagatg gtgatcgcct ggagccagtc cgccaaccgg 1620 gacccccggc acttcccgga cccggacacc ttcgacatcc gccgctcgga cggcacccgg 1680 cacatggcct tcgggcacgg catccaccac tgcctgggtg ccgccctcgc ccgcctggag 1740 ggcaaggtca tgctcgaact cctcctggac cgggtccaag gcttccgcat cgaccacgag 1800 cA 02501445 2005-12-05 cacaccgtgt tctacgaggc cgaccagctc actccgaagt acctgcccgt ccgggtcgac 1860 tggaactgaa cccgagggtc tcgtcccgga gtccagggcc gtcccgagcc ggccctggac 1920 ctcacgaccg cccgataagg agcgccgcca tcgccgagaa cacagccgag ctccctgccc 1980 ggcgggtcgg caggatcaag ccgtgccggc tgatcaggct cgagcagcac atcgacccgc 2040 gcggcagcct ctccgtgatc gagtccggcg tgaccgtgga cttccccgtc cgacgcgtct 2100 actacatgca tggccagacc cagtcctctc ccccgcgcgg cctgcacgcg caccgcaccc 2160 tggaacaact cgtcatcgcc gtccacggcg ccttctccat caccctcgac gacggcttcc 2220 agcacgccac ctaccgtctg gacgaacccg gagccggact ctgcatcggc cccatggtct 2280 ggcgcgtcct gaaggacttc gaccccgaca ccgtggccct ggtcctcgcc tcgcagcact 2340 acgaggagtc cgactactac cgcgactacg acaccttcct gcatgacgca cggagcctca 2400 catgaccatc cccttcctcg acgcgggcgc cggctaccgg gagttgcgag ccgagatcga 2460 cgcggccctg cagcgggtgt ccgcctccgg ccgctatctg ctcgacgcgg aactcgcggc 2520 cttcgaggag gagttcgccg cgtactgcga caacgaccac tgtgtggcgg tgggcagtgg 2580 ctgcgacgcg ctggagctgt ccctgcgggc gctggacatc ggtcccgggg acgaggtggt 2640 ops 50500550v 553060500 og6056056 ;066bp0630 ;505605550 D-466366355 0817 ;504500506 000655oP5 6266660-40D .0600-e.565q. 0000q4.006v 0-4.005E.ft06 ou7E 355055-4035 05v5;520q0 5000v00025 686056Dopo 5055005500 0-260-e60060 09 -2;00553000 36503-20600 0005-450000 u-40-200q-e5; 000v5e00-45 655006-250-e pou P554055005 005364.05y5 06060655 3505;05334 -26;50-2-45q0 DvD56-45-456 017n 000e-500655 q.000;0500 0;6500D-45D 350Tebo53 peq5500-455 5-430065606 081 680vg660up 500660-2055 0065600500 35055450 60-e50-40650 5035q0e0 luTE 056505;05-4 50055055,0 0445e50-250 4056330q0 000-250-4050 6-455p6o06 090E 5002q5-e5v 655053;355 05-4.00505 ;05-446600g P56o5e.6005 5;5455004.0 000E v5-455600-4 68;5535055 0560E.55555 ;y0050650-4 00-25.056 3030E-40-44.0 (fl,6 5p0-4-45060;
564.6020065 60;0550;y6 5p05006555 00;460006 3560E.30355 088 06053050E.
56P50455-45 0055-403560 20653v5500 506355q0 -43603060 ouz ;00E.500653 0006560E.0 5-40006-4.56 006Te6;300 62600650 ;03000-405 09Lz 05505555; 65-4.3506503 0e53;000q0 q05550550 050-e500325 0;50056;66 00L. 305500585 6002-4060o; 6450065;06 5;005550-4 0-4.g03200 6060006-465 SO-ZT-SOOZ St,VCOSZO Vo ttttcctcta gtgacggaga aacgatgacc gaggtcatgt cagggcgtcc cggaatgaaa 3600 gggatcatcc tcgcaggcgg cggagggacc cgcctacgcc ccttgaccgg cacgctgtcc 3660 aagcaactgc tgcccgtcta cgacaagccg atgatctact acccgctgtc cgtcctgatg 3720 ctgggcggca tccgcgagat cctcgtcgtc tcctccaccc agcacatcga gctgttccag 3780 cggctgctgg gcgacggctc ccgcctcggc ctcgacatca cctacgccga acaggccgag 3840 cccgagggca tagcgcaggc catcaccatc ggcaccgacc acatcggcga ctcaccggtc 3900 gcgctcatcc tgggcgacaa catcttccac ggccccggct tctcggccgt gctccagggc 3960 agcatccgcc acctcgacgg ctgtgtgctg ttcggctacc cggtcagcga cccgaagcgc 4020 tacggcgtcg gcgagatcga cgaccagggc gtactgctgt ccctggagga gaaaccggcc 4080 cggccccgct ccaacctcgc cgtcaccggc ctctacctct acgacaacga cgtggtcgac 4140 atcgccaaga acatccggcc ctcggcgcgc ggcgaactcg agatcacgga cgtcaacagg 4200 acctacctgg agcagaaacg cgcccggctc atcgaactgg gccacggctt cgcctggctc 4260 gacatgggca cccacgactc cctcctccag ggcggccagt acgtccagct catcgagcag 4320 cgccagggag tgcggatcgc ctgcatcgag gagatcgccc tgcgcatggg cttcatcgac 4380 gccgacaccc tccaccggct cggccgcgaa ctgggcacct ccggatacgg cgcgtacctg 4440 cA 02501445 2005-12-05 atggaggtgg ccacccgtgc aggcaccgaa tgagacgccg cgccggcccg cccgctccgc 4500 cggccgacgg ccgccggccc ggatcctcgt caccgggggc gccggcttca tcggctcgcg 4560 cttcgtgaac gcgctgctgg acggctccct gccggagttc ggcaaacccg aggtgagggt 4620 gctcgacgcg ctcacctacg cgggcaacct ggccaatctg gccccggtgg gcgactgtcc 4680 ccggctgcgg atcttcccgg gggacatccg cgaccgcggc gcggtcaccc aggcgatggc 4740 gggggtcgac ctggtggtgc acttcgcggc cgagtcgcac gtggaccgct cgatcgacga 4800 cgccgacgcc ttcgtgcgca ccaacgtgct gggcacccag gtcctcctcc aggaggcact 4860 ggccgtacgc cccgggctgt tcgtgcacgt ctcgacggac gaggtgtacg gctccatcga 4920 ggaggggtcc tggcccgagg agcacccgct gaaccccaac tcgccctacg ccgcctcgaa 4980 ggcgtcctcc gacctgctgg cgctggccca ccaccgcacg cacggactgc cggtgtgcgt 5040 cacccgctgc tccaacaact acgggcccta ccagtacccg gagaagatca tcccgctgtt 5100 caccagcagc ctcctcgacg gcgggaccgt cccgctctac ggggacggcg gcaaccggcg 5160 cgactggctg cacgtggacg accactgccg gggcatcgcc ctggtggccc ggggcggccg 5220 gcccggcgag gtctacaaca tcggcggcgg caccgagctg agcaacgtcg agctcacgga 5280 gcgtctgctg aaactgtgcg gagccgactg gtcggcggtg cggcgggtgc ccgaccgcaa 5340 gggccacgac cggcgctact ccgtcgacta caccaagatc gcggacgagc tgggttacgc 5400 gccgcggatc accatcgacg aagggctgga gcggaccgtg cactggtacc gggagaaccg 5460 cgcgtggtgg gcgcccgcga agagggggcg atgacggtga cgaccgcatc cgtggacccg 5520 ctcgacctgt ggctccgccg gtaccagccg tccgcgtcac ccgccgtccg gctggtgtgc 5580 ttcccgcacg cgggcggctc ggcgagttcg ttcctgccgt tcacccggca gctgccggac 5640 cggatcgagg tcgtggccgt ccagtacccc gggcgccagg accgcaggag cgaaccgctg 5700 gtcgacacca tcgagggact ggccgagccc ctggccggcc tgctggaggc gcaggccggc 5760 cccccggtgg tgctgttcgg gcacagcatg ggcgcgctgg tggcctacga ggtcgcccgc 5820 gcgctccagc ggcggggagc ggctccggtg cgcctggtgg tctccgggcg ccgggccccc 5880 gccgtcgacc ggccgatgac cgtgcacctc tacgacgacg accggctggt cgaggaactc 5940 cgcaagctcg acggcaccga cagccaggtg ttcgccgatc cggagctgct ccggctggtg 6000 ctgcccgtga tccgcaacga ctaccgggcc gtggcggcct acgcccaccg cccgggggcg 6060 ccgctggact gccccctcac cgtgttcacc ggcgccgacg accccaccgt gaccgcggcc 6120 gaggcggcgg cctggcacga ggcggcggcg tccgacgtcg agacgcgcac cttccccggt 6180 080L .eo5-4;6035D 600.e525666 ouqpqopogo 603505-4D5D 65o55op3gg 33q.D'ebo.25;
ozoL 553.e5D533 D5oo65o.eo 605Doepoo5 go46;3356-4 DErgq.bobo oppou65-1.3 0969 E.EØ46ogo3v 50.255.epogp Bq:25-4366pp booTeEveD55 5ogoop.e6qp 55;DE.Dogq.5 0069 aboo50-e6DD 55253Teo.25 op.E.o.25pg-e6 E.5o.q.63;55; 'PD0500'We 0D.89 q.Doqq.56qp-e. bo685.ep-e-e6 pogftoDgpo 6-epp5oq.e5q. Dog565op5D
o6boopp5op 08L9 .epogvoqqop oDbogoogq. booDo-epoq5 530550-230.e o5q6fie5ov6 oqqp-e.e.o.6.ep ozo 5350-epo66.2 pErg663.2Doo po3oqp5v36 go6553-epog 5D-23653oo 5-2530pp-2.2o 0999 065.235.4-e5q. DoggoppEr4o 5;5655op63 qq5-2656opo 654poquo65 ogo5;35556 0099 -45.6.253036.2 o5q5DTepTe 5oo5-epog6; 533350-456D ogeboobo-26 Bogob-eopPo 09 5o6q.D5566e 65gboogoqq. 3q40503655 p-e5-e6o355 o6goo536E) opo556305 00E79 p5oggpoq55 ;5835633-43 55opp6oqqo opoq-e6=6.2 5pg5D-epogq. o5oopp5355 0zt/9 5ODPODP*42 6555-4065.4 D6 3305.456 p55365;p6o 6033;5530 o5oE,55-1.po 099 ou.D.e5op6op gog556-25-45 5531.55o6D 3-2.46056pae opq5pobppq 6250-455op 00E9 655q5DP6q5 566app5opq 55635530;6 q5635D50-e5 66o055D-45; obqp6o35.e5 0pz9 ogo50-eo5D ;55qpop565 6o5q5q565 5o5oo-25535 op.e-1.5opog goggoDo55 En SO-ZT-SOOZ St,VCOSZO VO

cA 02501445 2005-12-05 cgatctgcac gccatcacca gctgcctcac cgacgtccgg gcgctgcggg tgctgcgcca 7140 gcagagcgtg ccgctcgacg acgcccggcg ggacggctgg gagcggaccg ggagcgcgat 7200 ccggcatcgc agcggcaggc atttcgagat catggcggtg gaggtgaccg cggagcgccg 7260 tgaagtggcc tcgtggaccc agccgttgct gcgcccgtgc tcgcagggac tggcggccct 7320 gatcacccgg cggatcaacg gggtgctgca cgccctggtg gcggcgcggt cggaggtcgg 7380 cacgctcaac gtcgccgagt tcggaccgac cgtccagtgc cggcccgacg aggcggacgg 7440 ccagtcgccc ccgtacctgg accgggtgct gacggccgga gccgaccgcg tccgctacga 7500 cgtggtgcag tcggaggagg gcgggcgctt ctaccacgcg cgcaaccgct atctggtggt 7560 cgaggcgggg ccggagctcg acacgggctg cccgcccggc ttctgctggg ctaccttcgg 7620 ccagctcacc gaactgctcg cgcacggcaa ctatctcaac gtcgaactcc gcaccctcat 7680 ggcgtgcgca cacgcctcct actgaatggt cacgaaagct gcaccgcgcg ggagaatcgg 7740 cagcgcgcca ccggccggcc ggcacccgga aggtaaagcg ccgttctccc gcatcggcgc 7800 cctgcgggaa acggcggaac ggccggcccg gaccgcgcgc aattcccggc gggacacggt 7860 gggagcccgc acgaggaacc gctttccccg ccttcggtgc gcccggccgc gggaccaccc 7920 ccgcctcccg gccgggccgc ggaatacgac gggggcggcc gaggacattc ctttcccgcc 7980 cA 02501445 2005-12-05 tccggaaaag cgcgccccga gggcccccga atgccgggcg ggacggacgg cgactgcgcg 8040 cggacggcgg cccggcgtcg aacgcacctg cccgagtccg gacgagacag cgcgacgcga 8100 gaggcgaaaa tgatcaatct cttccagccc cagatggggg ccgaggaact ggcggcggtg 8160 tccgaggtct tcgacgacca atggctcggt cacggacccc ggaccgcggc gttcgagtcc 8220 gcgttcgccg agcacctcgg ggtcggcccc gagcacgtcg tcttcctcaa ctcgggcacc 8280 gccggcctct tcctggccct ggagtcgctc ggcctgcggc ccggcgacga ggtcgtgctc 8340 ccctcgccca gcttcctcgc cgcggcgaac gccgtacagc tctcgggagc gcgcccggtg 8400 ttctgcgaca ccgacccgcg gacgctgaac cccgccctgg agcacatcga ggcggccgtc 8460 accccgcgca ccagggccgt catcgcgctc cactacggcg gccaccccgg cgacatcgtg 8520 cgcatcgccg agcgctgccg ggagcggggc atcaccctga tcgaggacgc cgcgtgctcc 8580 gtggcctccc gcgtcgacgg ccgaccggtc ggcaccttcg gcgacctcgc catgtggagc 8640 ttcgacgcca tgaaggtcct ggtcaccggc gacggaggga tgatctacgt caaggacccc 8700 ggggcggccg cccggatccg gcgcctcgcc taccacggcc tcacgcggtc cagcggcctg 8760 ggatacgcca gggtctcggc gcgctggtgg gagatggacg tccccgaacc gggccgccgc 8820 gtcatcggga acgacctcac cgcggccatc ggcgcggtcc agttgcgccg gcttcccggc 8880 ttcgtggccc gccgcaggga gatcgtcgcc ctgtacgaca gcgaactgag ctcgctggag 8940 ggcgtgctga caccgcccgc gccacccgcg gggcacgagt ccacgcacta cttctactgg 9000 atccagctgg cccccggcgt ccgggaccgg gtggcacgcg acctgctcac cgacggcatc 9060 tacaccacct tccgctacgc acctctgcac aaggtgcccg cctacggcca caccggaggc 9120 gaactgcccg gcgtggagcg ggcgtccgaa cggaccctgt gcctgcccct gcaccccggc 9180 ctgtcggacg ccgacgtccg caccgtcgtg tcctccctgc gcagagccct gagcgccgcg 9240 gatccggccc ccgcctgacg cgcgcacgcg ccacggcccc tgtcccggcg gtgaccgccg 9300 ggacaggggc cgtggcgcgt cctgcggacg gtccgggcca ccccgccgtc ccgtcggtgc 9360 gtcagcgacg cgtgccgagg aagaagcccg gtgagccctc gcccgtcacg acgtactcga 9420 cgtccaggcc ggccttgcgg tacgcggcct cgtactccgc acgcgagaac agcgtgaggt 9480 agtccacctc gctgcggtgc cggatgccct ccgcggtgtg cgcgatcagg tagtggatct 9540 ccatccgggt ccgcccgccc tcccgggtcg agtgggagac acgggcgacg ccctggtcgc 9600 ccggtgccgt ccgcagggcg tgggtggaga cgtggccgtc caggaaggtg tcggggaagt 9660 accacggttc gacggccagg acaccgtccg cggtcaggtg ccgcgccatg gcggcgacgg 9720 cA 02501445 2005-12-05 cgtcctccag gtcggccgtg gtctccaggt acccgatcga gctgaacatg cagaccacgg 9780 cgtcgaacgt ctcgccgagg tcgaacgccc gcatgtcacc gcggtggagg gtgacgccgg 9840 ggagccgctc ctcggcgcgg gccgccatcc actcggacag ctccaggccg ctcacgcggt 9900 cgtagagctt ggcgaaggcc tccaggtggg taccggtgcc gcacgcgatg tcgagcaggc 9960 tggccgcgtc cggcgtacgt tcccggatca ggtcggtgac ccgggcggcc tcacccgcgt 10020 agtccttgcg gtcctggtag agcaggtcgt agacctcggc ggcactgtcg ttctcgtaca 10080 tgggaatcct ccgggccgtg aagggggaac cgtgggtctg tcgaagagga gtgcgccgtg 10140 cgctcggggc gggggcggcc tgccgccggc ccctcgcgat gatctccgta cggacaccca 10200 acagttcacg ccgagccggg gtcaaggaac gacggggtgg tcagtcaagt cgggcgctcc 10260 gcccccgggg cggggcgcgc cggcgacgcg cacggattcg gccaaccggt tgctcgttcc 10320 gccggaaatc acggtgtggc ccccgggcca ccgggtagct tatgcctcgt tcaccgcagc 10380 ggttgaagag gcagccttca accccggccc ggcctttatg gaattcattt ccaccgtgcc 10440 gcaacaccca ctgaaggacg gccggatatc ggccatgaag ccccggcctt tcagccaggc 10500 accctctctt gtcgaataga gtatgtcctc cgctgaagcc gccgaagacg gacgaagggg 10560 acgaacggtc acctcggtcg atctagacgg aatccttgaa agcgtaatag cctgtcaatg 10620 ozsii DE.4;50;0.5 0360550536 5poE.55-;v5; 55.E.353.e0g5 5qopv350-46 00.;00530 09v11 533;66.e353 03eo536353 q300500PD6 33065.25055 3Te3p65p30 5o5qopp056 oopu 50;p003.25 opago6p65 v60;55;066 opp-20506u6 0Te5356;56 060056;0;E.
omIT 50063;350; 06;505;00 vo-466-26pp -eppoo3p6qo qu.06505;65 E.0q6opp630 08z11 60350Eg3q0 0-;65655.5 p0pp536655 53350553 630353355 ;30550535 ozzu 05;3055v6 0050630;60 q.DE.5op60.; 60056260-1.5 ou.06opoggp 6vo-E.555 09111 50qopegop5 50333.255o ;4003;0606 33503-e353 655q-e0050 655-43.e.5605 00111 606005503 6;05.5pogo 56poboq. 55y3;5605 o-evo55053 0606-e5q36-4 or7ou 56;553055 003560365 E.66.e5006; op660;50e; 33;05065 go55;06-4 08601 050553v05 .25.e0503053 .1.00-45.255-; 05;33-e66-ep 055663650o 060360;5o;

0z601 q5-253u,3505 0350v50;56 ;00365053; o5,65356E,5 5500505op 500-eq560;
09801 -e5q.263-45ep 63600'eogoo D63;05633E. oq.;0505.E.5 5go-e500605 gv5500.265 00801 605306056 50-4060-e50 050530056; E.3;05500p5 ovqp5o55 6opo0o560 017L01 -1.6633050; ogq5-e50433 gq0350qopo 60-e60p653; 5u505.2E.5.e .500q.556'e 08901 55-455qoq. -4555;03e5; 6.26;p56605 goo5q56656 q.655-eopo6 -e.e.e.;55;;;0 SO-ZT-SOOZ St,t,TOSZO VD

0u71 35ovo3335p 65.e3565oq6 E,55goopqfq. 555E.5gogo-e. 3pogq.55.4o; P5boypqqp5 09u1 DOEDOD.20'25 oPqop6o;66 gb000p553; .26o=e5o.255.e. oquouq.-456o opoq.50.25D-e oom p6u65-26338 ogooq.35q.D 55ogDpgq-45 55qope5opq. op5o5g5obo p.e356056py 017zzI 50650653;p 6D5o6Dogpo o5Er4o.q.6 q.5-2535o36 bE.q.630-2o5 35o.e5op5o;
0811 E.D653-e53-46 33-26Dqop5o poo55D6pq 66855;5=e og5ooDD-236 55DDED6DoE.
uTzT 5opE.5;35E.6 boopp6Dobo oEyeobobbq boobogboop p.e53-253563 Do6go5go5-4 0901 30.453.45005 3650p55535 q.53535q.15q. D556355ogo 6555o53 q.3-26Do6o6 Hoz' booqop65pb 5436606338 ogoov558o6 oppo5535 5 55-455-436 q55-460E.obo m'Eu Do5oo5oo4-4 p&eog000go gq5fq.poo 5350.2E.555.e oqpogo6Dpo opeD;Dboop 08811 05055550q2 5-1.opf,p6o ggo-qq.555 opoo6P5o 6o56.2poop ol.p5op6o.e.
()nu oEyeopq5o6o Eqoppo5-435 o5D-4Doovo5 opp5og5Erve BooDgo5gDo ODO;500.6D0 09LIT -ep-pooP5635 ae653o1.55o gopu5oov6; ofq.opqq.355 0363366B 55Dopggo5q.
()nu 00005466op 65-4o-455555 opoo55q5op qopopp553 D65oDp5-250 3533555=5 017911 op5q5o5535 p5o5go.e.e55 D-epopoo5pq 6opoo6D5go Do-e555o2g5 eboD6ogo6o oggii op6D556ogo 6poo6o5q.5 gpo5boD5p5 6D65o55ogo 5055v5pD5o p65pubp6o;
6U, SO-ZT-SOOZ St,t,TOSZO VO

09u1 6ogE.65=55 5Do53g4fiop 606p6pQ5q. Eq3pE.666qq. bopoboop6 qqpv56q6ft Hui PDE.o533o 35ppe563p3 oqq5E,pogo5 boogElopboo 5v5po.e0635 oboo5o55 opui opop6oD5q. -e5po5opErgp ogbogog5o5 5ftoop6355 6opq6-20-455 oupftob000 080E1 555o556; op35600pqo op5pq.66.2po qpDgE)545o.6 pogogggfto 5.ep.e5o&ebo ozocI ob5u.oE-e6q.D 555D653.45 bpoboo5pg5 oboogqopq pop5.1.05p56 096t 055poTe5og 0g25355500 frepo.eogo6D -4.655oTeopq 56p35-2o5-eo boogflogo5 006u 55-455q455-4 56E.5;56563 opp5Dppop googDpE.opq obq036.4625 oboog5-1.56 or78zI oboo6o650 6opppv5opf, .4555-48o;55 of)Dogobo op566oDE.5 q5boo5D566 onzi Do5e3;65; poogogboop 5ofq.p6obbo qp-epEqp5DE. 5oD5poqq56 ;506=3555 onu poo-456-ebo 50q5Dopoo q.55opoo56 opoofq.q.5 0555o5EYeD 5pD5o6o4E.5 099u 6o6o550;53 po5oopp5o8 635550.2065 pogogoop6; 5.e5o6o61.35 oTe553gobq pont 5oo155boDD 5-25pp-45366 poupbogoo gpqp5o55o; obo5;56PD; .eqogo56o5q.
of/qm opo55qoppo vq.u.DE55-405 -456535653 DE.ogEyeo65; op55E.5565 go5qp-eq5o6 0817zi 5oTep6o5-e5 5.4D563650-e go-1.503.2pp E.5DoovoEq6 o5o5gopou.6 -25.eo6005gE, SO-ZT-SOOZ St,t,TOSZO vo cA 02501445 2005-12-05 tcagggagtc cacggcgagc cgacccgcga cgcgcacgtc ggtgagttcg gccaccgcct 13320 cctccgcctc cgggcccgcg gtgtcgatgc gggcggcgaa ggacaacggg tcggcgggag 13380 cgtggaccgg gttctcggtc agctgcgcca cgcgttgctt cgcgttgcgg atccgcacca 13440 tcgcgccgtg gtcgcgccct cgcctgcggt aggcgccgtg gccgaacacg gagagggaca 13500 tcttgcgcgg gatgccgtcc atccgcgcca cgttggaggt gatcagcccg cggttgcggt 13560 cgagttcggc acgccactcc tcgtactccc gcagccgccg ctcgcgttcc acggccttgg 13620 ccgtcaggta gccctcgtag ccgttgccgt agcgggtgac gctgccggag tcgacctcca 13680 ggatcgtggt ggtgagccgg tcgaggaaga cccggtcgtg ggtgaccgcg atcaccgtgc 13740 cgcggtggcc ggccaggtgg tcctccagcc attccatcgc ccggtcgtcg aggtcgttgg 13800 tcggttcgtc caggagcagc agctccggcg acgaggcgag ggtcgcggcg agcgcgaggc 13860 gggagcgttc gccaccggag agggttccga gcttgcggtc gcggtccagg ctcggcagtc 13920 cgaggccgtg cagcgcgacc tccacgcgca cgtcggcctc gtagccgcca cgcgcctggt 13980 actgctcgac cagagcggcg tagcgctgga ggccggcgga cagctcgcgc tcggagccgt 14040 tctcgtcgct ctcgcccagc tccgcctcgg cctcgcgcat cgccgcttcg agctcgcgca 14100 ggtcggacag ggccaggtcg acggcgtcct ggacggtggc gtcgaggggc agttccagtg 14160 cA 02501445 2005-12-05 tctgcgccag gtagccgacg ccgccgggag cgaccacggt gagcgcgccg ttgtcgggct 14220 ccacgcggcc ggcgaggatc ttgagcagcg tggacttgcc ggaaccgttg tcgccgatca 14280 cgccgacctt ctcgcccggc ttgatgctga aaccgacccg gtcgagcacg acacagtcgt 14340 ggtagcgctt cgtgatgtcg tgtagggcgt attgcgcaat cgacacgcgt aagtctcctg 14400 tttccacgat gaggatgagt ggatgcgtga gcgcgctcgc agaaagaacg gaaagcagaa 14460 gggacgccac cactgcggac atggccggtc agggggtgtc acgagcacgc tgctggatgc 14520 ggcaggcgga gtcagctcaa cgccgggcat cctcatctat cacagagatc ccatgcgaag 14580 aactatagcc gtgctacccg gtgccgcgca acggtatgcg tgtcgcaccg gccgacgtga 14640 tgcagtcgga ccgggatgat cgcttgtccg gcggccggat gcctagcctc gggagcaacc 14700 acagcggtct ttcacgagag gggtcgacca tgggcgatct caggaaccgc atcaccgagc 14760 tggtccgcgc gtaccaccgg gaacaggcgc ccgggggctt cgttcccggg acgacgcacg 14820 taccggtctc cggcgcggtg ctgagcgagg aggaccggct ggcgctggtg gagacggcgc 14880 tggagatgcg gatcgcggcc ggcccggcct cccggggctt cgagcggcag ttcgcccggt 14940 acctcgggct ccggaaggcg cacctgacca actccggttc ctccgccaac ctcctcgccc 15000 tcggcgcgct cacctcgccg cagctggagg agagacggct gcgtccgggg gacgaggtcg 15060 096g1 33gg3-45556 Dqp55goT45 op5oo-e5Do poqp5goo-e5 o6feo.e'e5,55 -4DDogo5603 006gi -4.5.45563p-eg 560q5pot.53 ovougoo5op povo6605q5 ogoo3555 663;q6;036 omgi op6opoPp5P oTe5500505 oqeu56goop op.e5pq.56go op55p5.65o 5o.2.4605op oust 53-256poo.e5 5-45Do-eDg-eo qopq4556D; ;55-4pEceboo qp5o5e0556 00.20E'DOE)Te ongT oqop5;35qp Eq.0-4650005 qp566D-e55; ;5 633605o 6q.ogo.66o6 6.4330606 0991 o5ftoo65.E.5 op-epqq6v55 .e5oTe65poo p5goEyeoppg 6;05663qop 05.63.66o6q.
009T ODP5D0.260; 5.6-4333 .2qq.553-450-2 obogoggpq-e. opq6E-23.eop .25opq.565op cu,ssT Dboo6qopp6 ;555q-e5E.5 oppboq-465 o5ogoo5q. o5ooppe65 P5q.556po6 0817gT 605;56;05; p53505566 6;o63535; opq.'e5Erq6 3g-256 6056 goop55qopp ou7gi voubooE.ogo 5q5o6q3655 555v6;655q. pbobol.ovo op6o6opoq. pqoqqoftog 09EsT 5oop5og5qo DE,5065ogqo oqobboo-epq 0652o55550 ou,go600pq5 555-455353-e 00EgI 535go'epE.5 5P5ogpoqpo qq6ygo5-2565 o5v5Dp6635 ogoo5Doo55 -456533 of,zqi 55.e5ogqopo D.E.3556goo o5ovo63534 5-4,oq..2506 5533-256Do opp563-400 HIST 555o55oqu. p6o55pop5 DE.53oupp-e q.60356ogo 5p5pq5D.e56 q5oggo.4533 ozIsT p5.466-4o665 p.e.D'epoqqo qv5opouvoq 55D5oppo Dg-4555305p o6D;55o.eog EU
SO-ZT-SOOZ St,t,TOSZO vo 00891 ogbboobboo ogb3u.pq-456 033.1.30-1.053 q500536;q5 qqoppo&eop 6op-250665.e opoi 5356338-2.5 -455qq.5355o oBggovEq.6 35 5555356p5553 3g3553353P
08991 05P33P33qD gq.53555.23 -e5o55;555p opg5g5og5E. 3v353p5333 5og53g5o55 555;p53550q5q5 150.eopo5re6 pg6DE.6;56 v56505;86-4 09g91 65.eop.epoqo 363-e-2560.eu, 85;533,253; gog335353 og53535q85 .e.DDDft.ofq.
0091 6DE.3pP53-45 o3u535;55 503;5655pp 53535go5pD D55p53ov35 353q3p.e.o5p 0m791 o53o3q53-e3 3353553353 g3E.56.1.563-1. 33P53PO3P5 opElTeggoo 553q.3E.535 08E91 33;555335 p-285-253568 D5,35pDpq. 36goog3553 3.48353Te53 5o.E.DE,6535 oz91 553.5333E. 533335Te53 -3,5oqp5-2053 o3.146e3g6 3;55355'235 35.638;555 09z91 53.1.33-e33g3 3p33q33E,53 .ogE,5555.eq. bogE,Dgoopo go56pou.op 53.6poo.235-4 00z9T Sog53goop5 ogoovo6v5; o5q.65ogo5; 5;535533;3 3354555p35 -25;5535353 0f7191 o3E.55;5555 3g555355p 533q.35u53 3-4535553 5oo56Doq6 3655533;33 08091 ;33553555 50355u656 655;53535 ;55655opq5 6065D5656P 6g33goo5 0091 ,3q.35-4535-4 5566poqp5 o2op53653; E.ogoo53-4-2 5q.e5.266opo ou.ogo55op tEG
SO-ZT-SOOZ St,VCOSZO VD

ttcagctgct ccagctcccg gcggagcctg gccatcttgt cgttgatccg ccgccggtcc 16860 gtctcgatct tcgtctcacc gggaccgcgc gtggccatgc caccgccgcc accgccgccc 16920 atctgccggg acagcgactg gccccagccg cgcagccgcg gcagcatgta ctgcatctgc 16980 gccagcgcca cctgcgcctt gccctcccgg gactgggcgt gctgcgcgaa gatgtccagg 17040 atcagggccg tgcggtccac gaccttgacc ccgacgacct cctccaggtg catcagctga 17100 ctggggctca gttccccgtc gcacaccacg gtgtcggcgc cggtctcctc gacgatgtcg 17160 cgcagctgcg acgccttgcc cgagccgatg tacgtcgccg ggtccggctt ctgccggcgc 17220 tgcacgacgc cgtccagcac gagggcgccc gcggtctcgg cgagcgccgc cagctcggcg 17280 agcgaactgt cggcctccgc ggccgttccc gaggtccaga tgccgacgag caccacccgc 17340 tcgagtcgca gctggcggta ctcgacctcg gagacgtcgg tcagttcggt ggagagcccc 17400 gcgacgcggc ggagggaggc ccggtcctcg cggtctaact gatcgccgtc ccattcctcg 17460 gcgtcggcgc cggccatcgt gtcgtccatc agtgcgtcgg ctcgctgcgt gccggcgaag 17520 tcctcgggat gcgtcaaagt acttccaatc tggggggttc gagagcgttc cggggcgggg 17580 cgcgtccggc ctgcggggcc gggcgcgggg ccggggggtc ggggccgacg tgtccgcacc 17640 tcgccgtcgg gggccggtgc cgtggaggtc gctgccggaa ctcacatgcc gtccacccta 17700 00981 633q6v6;50 65ovo52600 60034665 6.2606065 5q655335 660600650;
017s8I q6533.e.3366 .evoq.505;5u 550.23;05g; 5.255660q40 0.230.eou-e5e ci8ts1 3Poq63g2o qq33636533 -2;63065026 6353;305;o E,50;30653-4 ;0;53363;6 0p81 .;5060q.50 .e50;6-1.005 o6Te0656q5 55opoopo 656300063; 06;666306o 0981 3-e35-256565 E.63350;635 35;236355; 5;355;0050 6ogo6qp05 06qp03vou.6 00E81 3u.35335563 goog2o-46q6 60066505;o 006goope5 500666060; qopp65006 ovzu 5;53350636 v506;065op 55-5;03.45 o66 ;o6; 66360360-2 po6603e55 08181 3053p55035 3335q3.e50.2 poo5q0opoq 3-263p53p65 ;5603600-; 56066.23506 ouu 66go60336 go35goo5og -E.06-203q3q6 opqogoogo 0.20.e56053 065600;6;0 09081 5355360056 ogoo55566; 663v063330 6504650 5.1.03.20.256; 6056050-e5 00081 65q0.2356- 5600;6;66; 06636551.3 0p6o560366 ;555350op 605666-eog6 of/6LI 5355263;63 660305qopy 6oppo5835p oq6;666503 E.E.ogq.5033 E.0;655poup 088L1 5565350356 q0.E.056.2533 6006oggoo6 5503655;6o qq.5E.D0q.q.6 55553Tegg 0z8L1 ogo.eq5.e606 1.0q5-4p55; 6;5536663 55-450555 06003536;o .eq56503.235 ouLT -1.6q.b.efrep-e6 -435.e3333g0 3-20;v53550 Teq53e55.cre 35;555563 0535g2305 SO-ZT-SOOZ St,t,TOSZO vo 0061 638;55e5 65056o55p 5q56v6550 553605 55o ;50;63-45q.E. D5062-4653;
0pr76I 5553-46.1.63 06336Do5D6 q.5.E.355pg5 gq6Do5D.25 .4656o6Po5o Do5bo6D5E.D

08E61 5q5e.256.253 pq.555oggEie p6o55-eog56 op5D55D-206 -235056D.23;
56D55356Do 061 o35oE.5DE,33 556005yq.3 5065p3E)6 3663565565 g3op5peo35 53665;55e5 0961 p6Eye-e6006q .epogq6q6oD 52;55o6-e63 053-2-463;o5 -208q6op6go Eq.E.6D36-26o 01361 56o655E,o; 355;532 5;50-46655o p-45.4356q55 q.5556oE,-45 o5oD5Po55 5D65gool.55 ;86opogooq. 363ED563 65632opq.55 3o6q5p-eboe 3qq6q.E.65.80 08061 .253ou5ce.265 3550.23533-e 3q.5533355 3g33.453.e.5.2 55 553;o-25 3pq6o65053 o061 5.2o5355qo3 5oopo5Poo.2 .6D-453goTe5 3voo555353 55oloq_55pE, 5155opp2q3 09681 5535355553 0353550p3; Er45q.opq.505 p65o563335 5053333500 q6;5353;p5 00681 35535v5585 obogo6opog gq5op5o63 6q5p555po poo5505op5 qp555365p5 0d,881 5D6-4553563 bogo5o565 qop5op6ogo 5go5E,558 p5560055; poo-45q0385 08/.81 o5q0663055 D6Dgo5oo5q. owe55oopq5 poo65op55 5Dog5pq.55v 565qop5ou6 ()nu 55o5q5Dovo E'Dogroggoo 355opErqop6 6;3;65505o o556o33535 p6opE.0655 09981 Do56o555-45 q5ogDpo-eop 5550535po o-e6poo5;66 5g5Te5o36; DD.255o.e.56;
LEZ
SO-ZT-SOOZ St,t,TOSZO Vo 0t,c0z 535853385 3234880602 55385;5553 6086855888 5865;35035 08365553o 08z0z =6635885o 0;56=5385 353385;553 8330535535 D585;558;3 8653335336 puin 5;55355583 855;5;3;88 D08500638; 083853085 ;360338;5p boopo5q.563 0910z ;5=855585 3350633E35 83838543;8 5036588366 38606388p3 0553560338 0010z go5885;poo 553555;880 6533-;336pq 585383038p 8363850355 3886;5E35o cu,00z 583835838o 1.56q855opq 653;8835o oq365;886; 835636658 0=8;68868 08661 3583;35538 8536535;55 533566365o 53355poggo 5385565338 o583635886 0661 33;063;880 358353353; 5385350335 538505555 8355535552 3586855;55 09861 565306;56o 83583;5580 5385335;35 5350;635pp -46533366.13 3355583335 00861 ;335;58853 q.68.353;036 3386363565 8;53;33555 835800;353 55653;5383 017L61 3;53553858 ;5;2535338 355E335;83 58365365o ;383335535 3353353583 08961 5opoboop5; ;35;538558 53833g3qqo 6663860553 55;355;535 50;6353356 O961 5355238853 68;803556o pogobobooq 58338;583; 833;3;3588 5;83885585 09S61 5;5552585 ;35;5355;5 6386;34355 5832833;33 5630835E38 533;3;358o SO-ZT-SOOZ St,VCOSZO vo cA 02501445 2005-12-05 gccgaccgcg aactggggcg cagactgcac cggatacgcg gcgtccactg gtatttcggc 20400 aaccacggtg acccgtacgc cctcatcctg cgcggtcaga ccgacgaccc gtcggtgtac 20460 gaggagcggg tccgcgaggg cgggccgctg ttccgcagcc gtaccgggac ctgggtgacc 20520 gcggacccgg aggtggccgc ggccgtgctg ggcgactcgc gcttcggtgc gctggaccgc 20580 gccggacggc gcccggagga gtacctccag ccgtcgcccg ccacgtacct ggggctggac 20640 cgcgccgcgt acgcgcgtct gcggcgggtg gccgagcccg tgctgggcgc ggacgccgcc 20700 gccgcgtggc gccggctcgg cgaggacgtc gggcgccggc tgctcgccgg ccgcggttcc 20760 ggcctcgacc tgacggcgga cttcgcccgc cggctgccgg cattggtcct ggccgcgtgg 20820 ctcggggtgc cgggcgaacg gtgcgacgag tgggaggagt cgctgcgggc ggcggggccg 20880 ctgctggacg gtctgctgtg tccgcagacg ctggcggcca cccgtgcggc ggactcggcc 20940 gccgaggggc tgcgcgcgct gttggacgag gtggtcgccg cgcgtcccgg cgggtccggc 21000 gagggtgcgg tggcccgcat ggtcggcgcc ggagccgccc ccgacgacgc ggtggccgcc 21060 gccgtgtgcc tggcgctctc ggccgtcgaa ccgacgacga ccctggtgtg cgaagcggtc 21120 cggctgctgc tcgaccgacc cgagtggtgg cggcggttgt gcgactcccc cgctctggcg 21180 ccggccgcgg tccggcacac cctgcggcac gcgcccccgg tgcggctgga gagccgggtg 21240 gcccacgagg acgtgacggt ggcggatcgt ccgctgcccg ccgggagcca cgtggtggtg 21300 ctcgtgggcg cggcacggcg cgcgggcgcc ccggccgcgg agccggcgga cctggcgggc 21360 gcaccggcgg cggagctgcc ggacgacctg tggttcgcgc tgtccgggga gttcgtcggc 21420 cgtgccgccg agaccgcgct gggcgtgctg gccgaggccg ccccgggact gcggcgggac 21480 ggcgacatcg tccggcggcg ccgttccccg gtcctcggca ggtacgcgcg gttccccgtc 21540 gcgtactcct gacgggcccg cggccggcgt cccctcagtc ccccacgacg tttcatgaaa 21600 ggagtgccgt gcgcgtcctg gtgacctcca tcccgcacca cacgcactac taccacctgg 21660 taccgctgat ctgggctctg cgtgcctcgg ggcacgaggt ggtggcggcc ggccagccgt 21720 cgctggtcga cgccatcacc gccagcggca tcccggcgtt cgccctggcc gaggaggagt 21780 cgctggcgca gatcttcgag gaggtcgagg gcgatctcca gccgtatcag cacggcatcg 21840 acgagttcga cttcttcggc accctgaagg acgagctgga ctgggagaag ctgctcgccc 21900 agcaggtgat cctgtccggc ctgtggctgg aaccgctcaa cggcgccacg accctcgaca 21960 gcatcgtcga cttcgcccgg gcctggaagc ccgacctggt gctgtgggag ccgttcacct 22020 atgcggggcc ggtggcggcc cgggcgtgcg gggccgcgca cgcccgcgtc ctgtgggggc 22080 cggacacgat cgggctgctg cggacgaagt tccttcaggc ccaggcgcgt cagcccgagg 22140 agcaccggga cgacccggtc gcggagtgga tgacctgggc cctggcgcgc tacgggtgcg 22200 acttccggga ggaggacgtg ctcggtcagt ggagcgtgga cccgatggcg gagggcgtca 22260 gtctgggcct cgacctgccg accgtcccga tgcgctacac cccgtacaac gggtcggcgg 22320 tgatccccga ctggctgacc gaggaaccga aacggcctcg ggtctgcctg accctggggg 22380 tgtcctcgcg ggagcacagt gaggacgagg tcccggtgca gaggtttatc gaggcgctgg 22440 ccgatctcga catcgagctg gtggcgaccc tggacgacgc ccagcgggac ctgctgccga 22500 ggatcccgga caacacgcgc atcgtcgact tcgtgcccat ggacgcgttg ctgccgacgt 22560 gctcggcgat catcaaccac agcggttcgg gcacgtgcaa caccgccgcg ctgcacgggg 22620 tgccgcagat catcctcggc ggcatcctgg acgccgccgt acggcagcac atgttcgcgc 22680 agaactccgc cgccctcacc ttcgctccgg aggaggtgac cggcgcgtcg ctgaggagcg 22740 cgctggtgcg cctgctcgag gagccgcggt tccgcgacgg cgcgcggcgg ctgaaggagc 22800 ggatgcgggc catgcccagc ccggccggga tcgtgccgac cctggagcgc ctcacggccc 22860 agcaccgccg ggcgtgttga accggcgcgc gggcccgtgc cggcggtgac cgcccgaccc 22920 gactctcgcg tgtgatcgat ctcgtcgact cagccgtgga ccggttcgcc tgtccgcgcc 22980 cgacactgga gtgctgatgc gggccctctt cacgaccgcg ccgctcgcgg gccacctgct 23040 tccgctggtg cccatcgcgt gggccctgcg ggcggccggc cacgaggtac tggtggcgac 23100 ccgggaggac ttcgtgccgg tcgccctgcg gtcggggctg ccgtccgcct cgtgcgggcc 23160 gcccgccgcg gacctggcgg gcgcggccga ggcgggggcg ctcgcgcggc cccgcggagc 23220 ggcggaggct cggggggtcc tgagcggggc gctggcgcgc gtcgcccggg gcagtctggc 23280 gggggtgcgg cggctggcgg acgcctggcg gccggatctg atcgtcagcg aacgggccga 23340 gttcgccggg ccgctggtcg cggcggccct cggggtcccg tgggtccgct accactggtc 23400 ggtctcgtcc ctggaggagt accggcgagc ggccgaggcc gagttcgcgc ccgagctggc 23460 ggcgctcggc ctcgaccggt tcccggaggc ggcgcgcgtg ctcgatccgt ggccggtgtc 23520 gctgcgccgg ccggacgcgg tcgcccacga cggggtccgg cacgtaccgg cccacgggga 23580 cgcccccgtc cccgactggg cgttcacgcg cggtcgcggg ccgcggatct gcgtgacgct 23640 cggcaccatg ctgccccggt acggcgccgc cgggatggcc gacttcctga cggagctggt 23700 ggcggagacc cgcggagggg actgcgaact gctcgtggcg gtcgacgacg acgtcgtcgc 23760 gcggtggccg tcgctgccct ccgcggtgcg gtacgccggc cggctgccgc tggcggaggt 23820 gctgcccgcg tgcgacgcgg tggtgcacca cggcgggcag ggcacgtccc tgaccgcgct 23880 ggccgcgggt cggccgcagg tcgtcatggc gcggctcgac gaccagttcg acaacgcgcg 23940 ggcactggcg gcggcggggg cggccctgct cgtaccgccg tcccgggcca ctcccgcggc 24000 cgtggccgcg gggtgcgccg aagtgctgga gaacgccctg tatgccaagg cggcagccgg 24060 gctcgccgag gagatggcgc tgctgccgtc gccgtcggcg gcggtcggac tcctggaaca 24120 cccggggccc gggccggaca tgccgcggag ttacccgaac gaggatgcgg tgtgacgtga 24180 atctggaagt actcaaccgt tcgaacgatc cgcgcgggcc ggtgatcacg gtggtcggcg 24240 cgtccggctt catcgggtcc gccctggtcg ccgagctggc gcgcatgccg gtgcggctgc 24300 gggcggtggc ccggcgcgag acccccgttc ccgcgggggc acgggccgcc gtcgaggtcc 24360 gccgggcgga cctcgcccgg ccggacgagg tcggggccgc cgtcgagggg gcggacgccg 24420 tcgtgcacct cgccgcccac atcggcggcg cgcggtcgtg gcgcgcggcc gacgagcggt 24480 cgctgcgggt gaacgtcggt ctgctgcgcg acgtggccga cgcgttccgg gaccgctcgg 24540 ggcccgcccc ggccgtggtc ctggccagta ccctccaggc cggcgtcgag ctgtcccggc 24600 agggcccgta cgcccggcag aagtcggcgg ccgaggaggt cctgctgcgg gccgcctccg 24660 aggaggtggt ccgcggcgtc gtgctgcggc tgccgaccgt ctacgggcgc agcccgctga 24720 ccgggtggac gggccgcggg gtggtcgcgt cggtggcacg gcaggccgtc tcgggcgagc 24780 cggtcacgat gtggcacgac ggcacggtcg ggcgcgatct gctccacgtg gaggacgcgg 24840 cccgcgcctt cgcggcggcg ctcggtcacg tggagcggct ggacggcggc acgtggtccg 24900 tcggtacggg ccggctggag cccttgggag aggtgttctc ggccctcgcc gggctggtgg 24960 ccgagcggac ggggaggccc cccgtaccgg tggtctccac ggagccgccc gaccatgccg 25020 aggcgggcga cttcgagagc gcggtctgtg acccctccgc gttccgcgcg gtgaccgggt 25080 ggtctcccct cgttccgttg cgggcggggc tcggcgccgt ggtggagacg atggtggccg 25140 acggagcgag gggtgggatc cgaacgtgag cacggaccgg gagcaggccg cgcacacgcg 25200 gctcggtcgc agcgcgaccc tggtgagccg gctctggctg ggcaccgtga acttcagcgg 25260 ccgggtcgag gacggtgacg cgatgcagct gatggaggcg gcggtcgacc gcggcatcaa 25320 ctgcatcgac accgcggaca tctacggctg gcggatccac aagggccaca ccgaggaact 25380 ggtgggccgg tggctggcca agagcgccgc gcggcgggag gacgtcctgc tggccaccaa 25440 ggtcggcggg gacatgagcg aacggctcaa cgacggcggc ctgtcggcgc ggcacatcgt 25500 cacggcctgc gagcagtcgc tgcggcgcct gggcgtggac cacatcgacc tgtaccagat 25560 gcaccgcgtc gaccacgccg cgccgtggga cgagatctgg caggcgatgg accgtctggt 25620 ggcgagcggc aaggtgacct acgtggggtc gtcgaacttc gccggctgga acgtcgccgc 25680 cA 02501445 2005-12-05 cgcgcaggac gcggcccggc ggcgccagtc cctcggtctg gtgtccgagc agtgcctgta 25740 caacctggcg gtgcgccacg ccgagctgga actgctgccg gccgcccagg cgtacggact 25800 gggcgtgttc gcctggtcgc cgctgcacgg cgggctgctc agcggggtgc tgcgcaagct 25860 cgcggcgggc gtcgcggtga agtcggcaca ggggcgggcc cagctgctgc tgcccgagct 25920 gcgcgcgacg atcgaggcgt acgaggggtt ctgcggccgg atcggcgcgg atccggccga 25980 ggtcggtctg gcctgggtgc tgtcccggcc ggggatcagc ggcgcggtga tcggtccgcg 26040 cacggtggac cagctggact cggcgctgcg gtccctggac ctggtcctcg gggaggccga 26100 actggccgag ctggacgcca tcttcccgcc cctgggcaag ggcggccggg cgccggacgc 26160 gtggatcagc tgaagggggt gcatcggccg acgtcacgcc ggccgatgcc gccggtcaca 26220 cgacgtcgag cgcgggcagc gggaagacca gtcggccgcc gccgtcgagg aactcccgct 26280 cccgttcgac gaacccgtcc cggtagatcc agggcaggac cagcaactgg tccggcttct 26340 gcgccttcgc gtcctcctcg gacacgatgg ggatgcccgt cccgggggtg aaacgccccg 26400 ccttctcctc gctcacctcg ccgatgcacg gcaggtcccg ttcggtgatc ccgcagtact 26460 ggaggatgac gttgcccttg gtggaggcgc cgtacccgag ggtcagcagg ccctcttggc 26520 gggagcggtc caggaagccg cgcagggcgt cccgctggtc ggcgacgcgg cgggcgaagg 26580 cctcgaacgg tgccatgccg tccagtcccg cggcggcctc ggcggcccgg atgcgggcca 26640 ggcccgcctc gtccctcggg tgccgggaac cggtcctggc gagcgtgacg cacaggctgc 26700 cgccgtacac ctcggtgagc tcggcccgga tgacggtgag gccgacgcgt tccgccatcc 26760 actcgatctg gcgcagcgcg tagtactcca ggtgctcgtg gcagacgatg tcgtacgcgt 26820 cggcttcgag catggcgggc aggtagctct gctccatcat ccagacgccg tcctcggcga 26880 ggacgtcgcg gacgtcgctc atgaagcgca gcgggtccgg caggtcgtag aacatcgcga 26940 tggaggtgac ggccttcgcc cgccgcgccc cgaagcggtt ctcgaaggtc gcgcgggtga 27000 agtagtccac gaccaactcg gcgttcggcg ggtacaggtc gcggaacttg ccgccggtcg 27060 ggtcgatgcc gaccagtcgc gggccgtcgg cggggtagcc cttgaggagc gtggcgtcgt 27120 tgctgccgat gtcgaggacc aggtcgtccg ggccgaggtc caccagccgg cggacggcgg 27180 cgaccttgcc atgcaggtgg tcgaccatga agggccggat gcccgagcgg tagccgtagc 27240 cctcgccgta catgaggtcc gggtcggggg tgtggcgcag ttgcacgagg ccgcatccgg 27300 ccggggaaca cgcgacgagt tccagcggga ccgacggcac gacctcgtcg cggtcggccg 27360 ggaacacccc ggtgagcgcc tgttcgccca ggtcgagtac ggagagcagc tccttgttgc 27420 ozuz ;00qP50052 00006660T; 0E.50;q0u,60 0-e65050;0; e50560;550 050-;q6v.e6 09m? 05065005; 666.e6066.ep 5g:25060;5 5;0665u2b0 ;46000560; 00.e.b;655;5 00m? 0-;45P05500 ;005505q6 6E-46065055 0;061.0060; 6560050q6 500656560 otuz 0q0E,254055 60006;550 5-456060q5 -e60;665.056 066.06u55-; oug66;0060 0808? 55-e.55065 000;50650; 0500660q5 e5q.5500q6 660;60600; 6E560606 onsz .e506E.00;5; 6600q.060 02E1;05505 05.6;505665 E.00;050-25 06000.2500 096L? 0.;q6.20;566 -20506;6E40 56;0g-20;45 055;6500;0 E.0645.eq.6.25 60;00460;0 006/2 506050555 .25;50;60; 65660;65;6 0-40006p00 P5;561.650.e 6-;650;605 0178Lz 500.2555 q60060600 50060p600 6p0606006 050055550; 0066e00500 onLz T25;405.206 e00551.55-e6 D206500023 0.e0-2505-e00 00066006;5 ODPDTP55VD
onu 60500ft0-; 500-455;005 05;5600055 0000.e.06;65 .e500;0660; 5E.6500066 099/2 ;550g-4605g ;6500;e0Te 00-;;0005.6 ug650.660 .6600q-e-e6q5 50;60g:2566 009u p05560p065 ;00;505ft6 5055056;56 006060-450 06606606-; 55-e000560 or7sL2 ,565655005 560565660; 6;656E.550-e 6=2004;066 660q65006 5;60006600 08tu 5005056650 056;00;v55 50;4;00;55 55q.e0;:e05 6;56060205 5060-e5.2060 LtZ
SO-ZT-SOOZ St,VCOSZO vo cA 02501445 2005-12-05 cgggagcacg aagtactcgg cgacgccgag ctgttcgagc ttcgcccagg cgtgatcgtg 28380 gtcgttcttg ctggccaccg cctgcaggat gccgcgcgcg tccagctcgg tgatggtccg 28440 caggacgtcc ggggcgagcc ggacctcgtc ctcctcgagg agggtgccct gccagagggt 28500 gttgtccagg tcccagacca ggcatttgac caacggctcg gcggcgttgt cccggtgcac 28560 gtcgttccct tctctcgata cggcggttgc gaccgcgact cctcgacagg gcgtacgcgg 28620 cccgcggccg gcggggacac gggccggttc acccggccgc ggacatcacg tgccgggcca 28680 ggaccagttc gcagatctcg ttgctgccct cgatgatctc catgagcttg gcgtcgcggt 28740 gcgcccgtgc gacgacgtgt ccctcccgcg ccccggccga cgccagcacc tgcacggccc 28800 gttcggcccc gcgtgcggcg ccggtggccg cgacgtgctt ggccaggacg gcggcgacca 28860 ccatgtcggg gctgccctcg tcccactggg cgctggcgtg ctcgcacgcc cgggcggcgt 28920 gctgttcggc gacgaacagt tcggcgaggt gccgggcgac gagctggtgg tccgagagcc 28980 gcgtgccgaa ctgctcccgt ccgccggcgt gacgtgcggc ggcggccagg caggcgcgca 29040 ggatgcccag ggagccccag gccaccgaca tccggccgta gctcagcgcg gtggtgacca 29100 gcagggcggg ggtgcggtcg tggccctgga gcagggcgtc tgccggcagc cggaccccgt 29160 ccaggtggat gtcggcgtgt ccggccgcgc ggcagccgtg cgcgtcggtg atgcgctcga 29220 DEMANDES OU BREVETS VOLUMINEUX
LA PRÉSENTE PARTIE DE CETTE DEMANDE OU CE BREVETS
COMPREND PLUS D'UN TOME.

NOTE. Pour les tomes additionels, veillez contacter le Bureau Canadien des Brevets.
JUMBO APPLICATIONS / PATENTS
THIS SECTION OF THE APPLICATION / PATENT CONTAINS MORE
THAN ONE VOLUME.

NOTE For additional volumes please contact the Canadian Patent Office.

Claims (18)

REVENDICATIONS

1. Polynucléotide codant un polypeptide impliqué dans la biosynthèse des spiramycines caractérisé en ce que la séquence dudit polynucléotide est:
(a) l'une des séquences SEQ ID N o 111 ou 141, (b) l'une des séquences dérivées de la séquence en (a) en raison de la dégénérescence du code génétique, ou (c) un polynucléotide présentant au moins 80%, 90%, 95% ou 98% d'identité
en nucléotides avec un polynucléotide de la séquence en (a).

2. Polynucléotide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est isolé
à partir d'une bactérie du genre Streptomyces.

3. Polypeptide résultant de l'expression d'un polynucléotide selon la revendication 1 ou 2.

4. Polypeptide selon la revendication 3, ledit polypeptide étant impliqué dans la biosynthèse des spiramycines.

5. Polypeptide selon la revendication 3 ou 4, ledit polypeptide ayant une séquence comprenant la séquence SEQ ID N o 142.

6. Polypeptide selon la revendication 3 ou 4, ledit polypeptide ayant une séquence comprenant la séquence SEQ ID N o 112.

7. Vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence d'acide nucléique codant un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 3 à
6.

8. Cellule hôte comprenant un vecteur d'expression approprié permettant l'expression d'un ou plusieurs polypeptides selon l'une quelconque des revendications 3 à 6.

9. Procédé de production d'un polypeptide selon la revendication 3, 4, 5 ou 6 caractérisé
en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes:
a) insérer au moins un acide nucléique codant ledit polypeptide dans un vecteur approprié;
b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, une cellule hôte préalablement transformée ou transfectée avec le vecteur de l'étape a);
c) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire;

d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore â partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape c), ledit polypeptide ; et e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.

10. Bactérie du genre Streptomyces productrice de spiramycine caractérisée en ce qu'elle possède une suppression, une substitution, une délétion et/ou une addition d'une ou plusieurs bases dans au moins un gène comprenant une des séquences SEQ ID N~ 111 ou 141 ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et/ou qu'elle surexprime au moins un gène comprenant une des séquences SEQ ID N~ 111 ou 141 ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique , ledit au moins un gène possédant une suppression, une substitution, une délétion et/ou une addition d'une ou plusieurs bases et/ou étant surexprimé codant pour un polypeptide impliqué dans la biosynthèse des spiramycines.

11. Bactérie du genre Streptomyces selon la revendication 10 caractérisée en ce que la surexpression du gène considéré est obtenue en augmentant le nombre de copie de ce gène et/ou en plaçant un promoteur plus actif que le promoteur sauvage.

12. Procédé de production de spiramycine(s), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
(a) cultiver, dans un milieu de culture approprié, une bactérie selon l'une quelconque des revendications 10 à 11;
(b) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire; et (c) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape b), la ou lesdites spiramycines produites.

13. Utilisation d'une séquence selon l'une quelconque des revendications 1, et 2, d'un vecteur selon la revendication 7 ou d'une cellule hôte selon la revendication 8 pour la préparation d'antibiotiques hybrides.

14. Souche de Streptomyces selon l'une quelconque des revendications 10 à 11 caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche OSC2/pSPM75(1) ou de la souche OSC2/pSPM75(2) déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 6 octobre 2003 sous le numéro d'enregistrement 1-3101.

15. ADN recombinant caractérisé en ce qu'il comprend :
(a) un polynucléotide codant pour un polypeptide impliqué dans la biosynthèse des spiramycines susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymérase en utilisant le Couple d'amorces de séquence suivante :
5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N~ 138) et 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N~ 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens, ; ou (b) un fragment d'au moins 1200, 1400, 1450, ou 1500 nucléotides consécutifs de ce polynucléotide codant pour un polypeptide impliqué dans la biosynthèse des spiramycines.

16. Fragment selon la revendication 15(b), ledit fragment étant efficace pour amplifier les séquences définies dans la revendication 1 ou 2.

17. Cellule hôte dans laquelle a été introduit au moins un ADN recombinant tel que défini dans la revendication 15 ou la revendication 16.

18. Procédé de production de spiramycine(s), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a. cultiver, dans un milieu de culture approprié, une cellule hôte selon la revendication 17;
b. récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire; et c. séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape b), les spiramycines.