FR2857598A1 - Composes anti-angiogeniques, composition pharmaceutique les comprenant, et leur utilisation - Google Patents
Composes anti-angiogeniques, composition pharmaceutique les comprenant, et leur utilisation Download PDFInfo
- Publication number
- FR2857598A1 FR2857598A1 FR0308816A FR0308816A FR2857598A1 FR 2857598 A1 FR2857598 A1 FR 2857598A1 FR 0308816 A FR0308816 A FR 0308816A FR 0308816 A FR0308816 A FR 0308816A FR 2857598 A1 FR2857598 A1 FR 2857598A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- seq
- sequence
- peptide sequence
- nucleic acid
- fgf
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 36
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 title description 22
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 111
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 8
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 6
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 94
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims description 94
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 64
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 64
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 64
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 58
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 37
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 34
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 33
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 24
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 24
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 24
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 24
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 23
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 23
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 23
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims description 10
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 9
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 claims description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 claims description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 claims description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 43
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 37
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 37
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 35
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 30
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 29
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 24
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 24
- 102400001047 Endostatin Human genes 0.000 description 23
- 108010079505 Endostatins Proteins 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 8
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 6
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 5
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 5
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 5
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 102000003971 Fibroblast Growth Factor 1 Human genes 0.000 description 4
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000015916 branching morphogenesis of a tube Effects 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 229940029303 fibroblast growth factor-1 Drugs 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 4
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 102400000068 Angiostatin Human genes 0.000 description 3
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 208000001382 Experimental Melanoma Diseases 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 102000003946 Prolactin Human genes 0.000 description 3
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 3
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 2
- 101100353517 Caenorhabditis elegans pas-2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102100030304 Platelet factor 4 Human genes 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 102000002938 Thrombospondin Human genes 0.000 description 2
- 108060008245 Thrombospondin Proteins 0.000 description 2
- 206010000496 acne Diseases 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 2
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 230000010595 endothelial cell migration Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 2
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 230000014399 negative regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710112984 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 108010001463 Collagen Type XVIII Proteins 0.000 description 1
- 102000047200 Collagen Type XVIII Human genes 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 108090000378 Fibroblast growth factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100028043 Fibroblast growth factor 3 Human genes 0.000 description 1
- 108090000382 Fibroblast growth factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 102100028075 Fibroblast growth factor 6 Human genes 0.000 description 1
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 101000582950 Homo sapiens Platelet factor 4 Proteins 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710159910 Movement protein Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- -1 PF -4 Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108090000778 Platelet factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100039037 Vascular endothelial growth factor A Human genes 0.000 description 1
- 101710090398 Viral interleukin-10 homolog Proteins 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000004996 female reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 102000034240 fibrous proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005899 fibrous proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 238000003165 hybrid screening Methods 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000000185 intracerebroventricular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000009520 phase I clinical trial Methods 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
La présente invention concerne l'utilisation d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée d'une séquence s'étendant au minimum des résidus :- 275 à 366 (SEQ ID NO : 4), et/ou- 367 à 455 (SEQ ID NO : 6), et/ou- 456 à 531 (SEQ ID NO : 8),de SEQ ID NO : 10, et au maximum à une séquence correspondant à SEQ ID NO : 10,pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de maladies liées à l'angiogenèse, telles que les cancers, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, la rétinopathie diabétique, le psoriasis, ou l'arthrite rhumatoïde.
Description
<Desc/Clms Page number 1>
COMPOSES ANTI-ANGIOGENIQUES, COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES LES COMPRENANT, ET LEUR UTILISATION
La présente invention concerne des protéines ayant une activité anti-angiogénique, les acides nucléiques les codant, ainsi que les compositions pharmaceutiques les comprenant.
La présente invention concerne des protéines ayant une activité anti-angiogénique, les acides nucléiques les codant, ainsi que les compositions pharmaceutiques les comprenant.
L'angiogenèse est un processus de croissance de nouveaux capillaires sanguins à partir de vaisseaux préexistants. Trois phénomènes particuliers sont notamment à la base de ce processus : la prolifération, la migration et la différenciation (la tubulogenèse) des cellules endothéliales. L'angiogenèse est activée par certains facteurs de croissances, dits facteurs angiogéniques, tels que le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor, facteur de croissance endothélial vasculaire), le FGF-1 (Fibroblast Growth Factor 1, facteur de croissance des fibroblastes 1) ou le FGF-2 (Fibroblast Growth Factor 2, facteur de croissance des fibroblastes 2).
En temps normal, l'angiogenèse est essentiellement restreinte au système reproducteur femelle et à la cicatrisation des plaies. Cependant, l'angiogenèse est également impliquée dans de nombreux cas pathologiques, tels que la rétinopathie diabétique, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, et les cancers. En effet, dans ce dernier cas il a été montré que la croissance tumorale était grandement favorisée par l'apparition au sein de ces tumeurs d'une néo-vascularisation sanguine résultant en particulier de la sécrétion par les tumeurs de facteurs angiogéniques.
De nombreuses tentatives de traitements thérapeutiques basées sur l'utilisation de protéines anti-angiogéniques sont en cours. Parmi ces composés, l'un des plus prometteur est l'endostatine (O'Reilly et al., Cell (1997) 88 :277-285), est actuellement en essais cliniques de phase I (Herbst et al., J Clin. Oncol. (2002) 20:3804-3814). L'endostatine est une protéine de 20 kDa correspondant à un fragment du collagène XVIII. L'activité antiangiogénique de cette protéine est due à une inhibition spécifique des cellules endothéliales.
Un des principaux inconvénients lié à l'utilisation de ces protéines en tant qu'antiangiogéniques réside dans les quantités nécessaires au traitement d'un individu. Ainsi, il a été estimé que dans le cas de l'endostatine jusqu'à plusieurs grammes de protéine recombinante devaient être administrés au patient chaque jour (Cao, Int. J Biochem. Cell Biol. (2001) 33 :357-369). Cet inconvénient pourrait être aboli par exemple en disposant d'inhibiteurs de l'angiogenèse plus puissants.
La fibronectine est une protéine fibreuse constitutive de la matrice extracellulaire (Hynes (1990) in Fibronectins (Springer, New York)). Certains fragments dérivés de cette
<Desc/Clms Page number 2>
protéine semblent également avoir une activité anti-angiogénique (Yi & Ruoslathi, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2001) 98 :620-624) d'autres fragments une activité d'inhibition de la croissance endothéliale in vitro (Homandberg et al., Am. J. Pathol. (1985) 120:327-332). Toutefois, dans certains cas il a pu être montré que d'autres fragments de fibronectine favorisaient l'adhésion de cellules métastasiques à la matrice extracellulaire (Mould & Humphries, EMBO J (1991) 10 :4089-4095). ailleurs, ces fragments ne sont pas en essais cliniques.
La présente invention a pour objet de fournir des composés ayant une activité antiangiogénique et/ou anti-tumorale pouvant être dans certains cas supérieure à celles des composés anti-angiogéniques de l'art antérieur.
La présente invention concerne l'utilisation d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus : - 275 à 366 (SEQ ID NO : 4), et/ou - 367 à 455(SEQ ID NO : 6), et/ou
456 à 531 (SEQ ID NO: 8), de SEQ ID NO : 10, et au maximum à une séquence correspondant à SEQ ID
NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, , pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de maladies liées à l'angiogenèse, telles que les cancers, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, la rétinopathie diabétique, le psoriasis, ou l'arthrite rhumatoïde.
456 à 531 (SEQ ID NO: 8), de SEQ ID NO : 10, et au maximum à une séquence correspondant à SEQ ID
NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, , pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de maladies liées à l'angiogenèse, telles que les cancers, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, la rétinopathie diabétique, le psoriasis, ou l'arthrite rhumatoïde.
SEQ ID NO : 10 correspond aux acides aminés 1447 à 1991 de la séquence peptidique de la fibronectine (SEQ ID NO : 2) (référence P02751 de la base de données SwissProt) codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1. SEQ ID NO : 4 correspond aux acides aminés 1721 à 1812 de la fibronectine, SEQ ID NO : 6 correspond aux acides aminés 1813 à 1901 de la fibronectine, et SEQ ID NO : 8 correspond aux acides aminés
1902 à 1977 de la fibronectine.
1902 à 1977 de la fibronectine.
<Desc/Clms Page number 3>
Avantageusement les séquences peptidiques de l'invention possèdent la propriété de se lier au facteur FGF-2, notamment au facteur FGF-2 de poids moléculaire 18 kDa, et d'inhiber son fonctionnement.
Avantageusement les séquences peptidiques de l'invention ont une activité antiangiogénique en bloquant l'action du facteur FGF-2, grâce à leur liaison avec ce dernier.
Plusieurs tests permettant de mesurer la liaison des séquences peptidiques de l'invention au facteur FGF-2 sont décrits dans les exemples suivants, ils font notamment appel à des méthodes bien connues de l'homme de l'art tels que le double hybride ou l'ELISA.
Le test de liaison en double hybride peut être réalisé selon la méthodologie générale décrite par Van den Berghe et al. (Mol. Endocrinol. (2000) Nov, 14(11), 1709-1724). Un fragment d'ADN codant pour le facteur FGF-2 est introduit dans le plasmide pAS2 (Clontech, numéro d'accès à Genebank : U30497) et un fragment d'ADN codant pour les séquences peptidiques dont on souhaite évaluer la liaison au facteur FGF-2 est introduite dans le plasmide pACT2 (Clontech, numéro d'accès à Genebank : U29899).
Les deux plasmides sont alors introduits dans la souche Y190 de Saccharomyces cerevisiae (Clontech ; Harper et al., Cell, 1993 ; 75:805-816 ; Flick & Johnston, Mol. Cell. Biol., 1990 ; 10 (9):4757-4769) dont l'activité p-galactosidase est mesurée. La présence d'une activité p-galactosidase traduit l'existence d'une liaison entre ladite séquence peptidique et le facteur FGF-2.
Le test de liaison en ELISA peut être réalisé comme suit. Les parois des puits d'une plaque de microtitration standard sont recouverts de facteur FGF-2. Les séquences peptidiques dont on souhaite mesurer la liaison au facteur FGF-2, couplées à une étiquette histidine, sont ajoutées aux puits en concentrations variables, puis un anticorps marqué dirigé contre l'étiquette histidine est ajouté. Après lavage, la quantité d'anticorps par puits est alors déterminée à l'aide du marqueur, qui peut être une enzyme, un chromophore ou bien un composé radioactif. La quantité d'anticorps par puits est représentative de la liaison entre lesdites séquences peptidiques et le facteur FGF-2.
On désigne par homologie le pourcentage d'acides aminés similaires pour deux séquences peptidiques alignées acide aminé par acide aminé, tel que cela peut être obtenu par la mise en #uvre de l'algorithme défini par Altschul et al., Nucleic Acids Res. (1997) 25 :3389-3402 exemple.
<Desc/Clms Page number 4>
On désigne par angiogenèse le phénomène de formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants. Ce phénomène permet notamment la croissance tumorale. L'angiogenèse se trouve sous la dépendance de facteurs angiogéniques tels que le facteur FGF-2 par exemple.
L'invention concerne également l'utilisation susmentionnée d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, et/ou possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité anti-angiogénique et ou une activité anti-tumorale.
On désigne par activité anti-angiogénique, une activité d'inhibition de l'angiogenèse.
Cette activité peut être par exemple mise en évidence in vitro en démontrant l'inhibition à la fois de la multiplication, de la migration et de la tubulogenèse, de cellules endothéliales par les séquences peptidiques de l'invention. La mesure de l'inhibition de la multiplication des cellules endothéliales peut être réalisée en cultivant des cellules endothéliales en présence de la séquence peptidique dont on souhaite évaluer l'activité.
La mesure de l'inhibition de la migration des cellules endothéliales peut être réalisée en effectuant une blessure sur un tapis de cellules endothéliales et en incubant ensuite les cellules en présence de la séquence peptidique à tester. On mesure alors le nombre de cellules ayant migré sur la blessure. La mesure de l'inhibition de la tubulogenèse des cellules endothéliales peut être réalisée en mesurant la longueur de tubules formés par des cellules endothéliales cultivées sur gel en présence de la séquence peptidique à tester.
On désigne par activité anti-tumorale, une activité permettant d'inhiber la croissance tumorale et/ou d'induire la régression voir la disparition de tumeurs. Cette activité peut être par exemple mise en évidence in vivo en mesurant la masse de tumeurs, dont on a induit le développement chez la souris par injection de cellules tumorales, en présence et en absence d'administration de séquences peptidiques de l'invention et/ou d'acides nucléiques exprimant les séquences peptidiques de l'invention.
L'invention concerne notamment l'utilisation telle que définie ci-dessus, d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus : - 275 à 366 (SEQ ID NO : 4), et/ou - 367 à 455 (SEQ ID NO : 6), et/ou - 456 à 531 (SEQ ID NO : 8),
<Desc/Clms Page number 5>
de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) de
SEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2. - SEQ ID NO : 12 correspond aux acides aminés 1447 à 1981 de la fibronectine.
SEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2. - SEQ ID NO : 12 correspond aux acides aminés 1447 à 1981 de la fibronectine.
L'invention concerne en particulier l'utilisation telle que définie ci-dessus, d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 367 à 531 (SEQ ID NO : 14) de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) de SEQ ID NO: 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2.
SEQ ID NO : 14 correspond aux acides aminés 1813 à 1977 de la fibronectine.
L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation telle que définie ci-dessus, d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 270 à 531 (SEQ ID NO : 16) de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) de SEQ ID NO: 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2.
SEQ ID NO : 16 correspond aux acides aminés 1716 à 1977 de la fibronectine.
<Desc/Clms Page number 6>
L'invention concerne encore plus particulièrement l'utilisation telle que définie cidessus, d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - de SEQ ID NO : 4, ou - de SEQ ID NO : 6, ou - de SEQ ID NO : 8, ou - de SEQ ID NO : 10, ou -de SEQ ID NO : 12, ou - de SEQ ID NO : 14, ou -deSEQIDNO: 16, ou - de SEQ ID NO: 18, ou - de SEQ ID NO : 20, ou - de SEQ ID NO : 22, ou - de SEQ ID NO : 24, ou - de SEQ ID NO : 26, ou - de SEQ ID NO : 28, ou - de SEQ ID NO : 30.
SEQ ID NO : 18 correspond à la séquence peptidique du clone A dans la suite, elle correspond aux acides aminés 1 à 531 de SEQ ID NO : 10 et aux acides aminés 1447 à 1977 de la fibronectine.
SEQ ID NO : 20 est désignée fibstatine (Fib) dans la suite, elle correspond aux acides aminés 270 à 535 de SEQ ID NO : 10 et aux acides aminés 1716 à 1981 de la fibronectine.
SEQ ID NO : 22 correspond aux acides aminés 275à 455 de SEQ ID NO : 10 et 1721 à 1901 de la fibronectine, elle correspond à la séquence peptidique du clone C dans la suite.
SEQ ID NO : 24 correspond aux acides aminés 275 à 531 de SEQ ID NO : 10 et 1721 à 1977 de la fibronectine.
SEQ ID NO : 26 correspond aux acides aminés 367 à 531 de SEQ ID NO : 10 et 1813 à à 1977 de la fibronectine.
SEQ ID NO :28 correspond à la séquence peptidique du clone D dans la suite, elle correspond aux acides aminés 367 à 535 de SEQ ID NO : 10 et 1813 à 1981 de la fibronectine.
<Desc/Clms Page number 7>
SEQ ID NO : 30 correspond à la séquence peptidique du clone E dans la suite, elle correspond aux acides aminés 367 à 545 de SEQ ID NO : 10 et 1813 à 1991 de la fibronectine.
L'utilisation des séquences peptidiques SEQ ID NO : 26 et 28 est avantageuse, car ces séquences présentent une taille inférieure à celle de SEQ ID NO : 20 et peuvent s'avérer plus solubles et plus stables que cette dernière.
SEQ ID NO : 30 peut exercer une activité anti-angiogénique suite à sa digestion partielle par une protéase in vitro ou in vivo pour générer une protéine ayant une activité anti-angiogénique de SEQ ID NO : 26 ou 28 par exemple.
SEQ ID NO :22 peut exercer une activité anti-angiogénique suite à son association avec une ou plusieurs séquences peptidiques, in vitro ou in vivo, pour former un complexe protéique ayant une organisation semblable à une protéine ayant une activité anti-angiogénique de SEQ ID NO : 20 ou 24 par exemple.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un acide nucléique codant pour une séquence peptidique telle que définie ci-dessus, ou de son complémentaire, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de maladies liées à l'angiogenèse, telles que les cancers, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, la rétinopathie diabétique, le psoriasis, ou l'arthrite rhumatoïde.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum aux séquences s'étendant des nucléotides : - 823 à 1098 (SEQ ID NO : 3), et/ou - 1099 à 1365 (SEQ ID NO : 5), et/ou - 1366 à 1593 (SEQ ID NO : 7), de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 9, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un nucléotide, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - à une séquence possédant une homologie d'au moins 75 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou son complémentaire, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de maladies liées à l'angiogenèse, telles que les cancers, la
<Desc/Clms Page number 8>
dégénérescence maculaire liée à l'âge, la rétinopathie diabétique, le psoriasis, ou l'arthrite rhumatoïde.
On désigne par homologie le pourcentage de nucléotides identiques pour deux séquences nucléotidiques alignées nucléotide par nucléotide, tel que cela peut être obtenu par la mise en #uvre de l'algorithme défini par Altschul et al., Nucleic Acids Res. (1997) 25 :3389-3402 exemple.
Les séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 3,5, 7 et 9 codent respectivement pour les séquences peptidiques SEQ ID NO : 4,6, 8 et 10.
Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum aux séquences s'étendant des nucléotides : - 823 à 1098 (SEQ ID NO : 3), et/ou - 1099 à 1365 (SEQ ID NO : 5), et/ou - 1366 à 1593 (SEQ ID NO : 7), de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO :11, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou à une séquence homologue.
SEQ ID NO : 11 correspond à la séquence s'étendant des nucléotides 1 à 1605 de la séquence SEQ ID NO : 9 et à la séquence s'étendant des nucléotides 4339 à 5943 de la fibronectine.
SEQ ID NO : 11code pour SEQ ID NO : 12.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 1099 1593 (SEQ ID NO : 13) de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 11, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou à une séquence homologue.
SEQ ID NO : 13 code pour SEQ ID NO : 14.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 808 à 1593 (SEQ ID NO : 15) de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 11, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou à une séquence homologue.
<Desc/Clms Page number 9>
SEQ ID NO : 15 code pour SEQ ID NO :16.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - à SEQ ID NO : 3, ou - à SEQ ID NO : 5, ou - à SEQ ID NO : 7, ou - à SEQ ID NO : 9, ou - à SEQ ID NO : 11, ou - à SEQ ID NO : 13, ou - à SEQ ID NO : 15, ou - à SEQ ID NO : 17, ou - à SEQ ID NO : 19, ou - à SEQ ID NO: 21, ou - à SEQ ID NO : 23, ou - à SEQ ID NO : 25, ou - à SEQ ID NO : 27, ou - à SEQ ID NO : 29, ou son complémentaire.
SEQ ID NO : 17 correspond à la séquence s'étendant des nucléotides 4339 à 5931 de la fibronectine.
SEQ ID NO : 19 correspond à la séquence s'étendant des nucléotides 5146 à 5943 de la fibronectine.
SEQ ID NO : 21 correspond à la séquence s'étendant des nucléotides 5161 à 5703 de la fibronectine. , SEQ ID NO : 23 correspond à la séquence s'étendant des nucléotides 5161 à 5931 de la fibronectine.
SEQ ID NO : 25 correspond à la séquence s'étendant des nucléotides 5437 à 5931 de la fibronectine.
SEQ ID NO : 27 correspond à la séquence s'étendant des nucléotides 5437 à 5943 de la fibronectine.
SEQ ID NO : 29 correspond à la séquence s'étendant des nucléotides 5437 à 5973 de la fibronectine.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active une séquence peptidique comprenant ou étant constituée :
<Desc/Clms Page number 10>
- d'une séquence s'étendant au minimum des résidus : - 275 à 366 (SEQ ID NO : 4), et/ou - 367 à 455(SEQ ID NO : 6), et/ou
456 à 531 (SEQ ID NO: 8), de la SEQ ID NO : 10, et au maximum à une séquence correspondant à SEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
456 à 531 (SEQ ID NO: 8), de la SEQ ID NO : 10, et au maximum à une séquence correspondant à SEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Les véhicules pharmaceutiquement acceptables pouvant être utilisés pour des séquences peptidiques dans le cadre de l'invention sont bien connus de l'homme de l'art.
Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent également comprendre d'autres composés, notamment protéiques, ayant une action anti-angiogénique, tels que l'endostatine, l'angiostatine, PF-4, la thrombospondine ou le fragment de prolactine de 16 kDa par exemple, ces protéines sont notamment définies dans Cao Int. J. Biochem.
Cell Biol. (2001) 33:357-369.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention conviennent notamment pour l'administration à un patient d'une dose de 15 à 600 mg/m2/jour d'une séquence peptidique selon l'invention.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention conviennent également pour une administration par voie topique, transdermique, intrapéritonéale, intracrânienne, intracéréboventriculaire, intracérébrale, intravaginale, intra-utérine, orale, rectale ou parentérale (par exemple, par voie intraveineuse, intrarachidienne, sous-cutanée ou intramusculaire).
Les compositions avantageuses selon la présente invention, destinées à une administration parentérale, comprennent des solutions d'injections stériles aqueuses et non aqueuses qui peuvent contenir des anti-oxydants, des tampons, des agents bactériostatiques et des solutés qui rendent la composition isotonique ; ainsi que des suspensions stériles aqueuses et non aqueuses qui peuvent comprendre des agents de suspension et des épaississants.
<Desc/Clms Page number 11>
Selon un mode de réalisation avantageux, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend, à titre de substance active, une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus : 5- 275 à 366 (SEQ ID NO : 4), et/ou - 367 à 455(SEQ ID NO : 6), et/ou -456à531(SEQIDNO:8), de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) de SEQ ID NO : 10, ou 10- d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou d'une séquence homologue.
Selon un autre mode de réalisation pharmaceutique comprend, à titre de comprenant ou étant constituée : avantageux de l'invention, la composition substance active, une séquence peptidique 15- d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 367 à 531(SEQ ID NO : 14) de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) de SEQ ID NO : 10, ou . d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou d'une séquence homologue.
20 Selon un autre mode de réalisation pharmaceutique comprend, à titre de comprenant ou étant constituée : avantageux de l'invention, la composition substance active, une séquence peptidique - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 270 à 531 (SEQ ID NO : 16) de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535(SEQ ID NO : 12), ou 25- d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou d'une séquence homologue. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, la composition pharmaceutique comprend, à titre de comprenant ou étant constituée : 30 - de SEQ ID NO : 4, ou
- de SEQ NO : 6, ou - de SEQ ID NO : 8, ou - de SEQ ID NO : 10, ou - de SEQ ID NO : 12, ou
- de SEQ NO : 6, ou - de SEQ ID NO : 8, ou - de SEQ ID NO : 10, ou - de SEQ ID NO : 12, ou
<Desc/Clms Page number 12>
- de SEQ ID NO : 14, ou - de SEQ ID NO : 16, ou - de SEQ ID NO : 18, ou - de SEQ ID NO : 20, ou - de SEQ ID NO : 22, ou - de SEQ ID NO : 24, ou - de SEQ ID NO : 26, ou - de SEQ ID NO : 28, ou - de SEQ ID NO : 30.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active un acide nucléique codant pour une séquence peptidique telle que définie dans les compositions pharmaceutiques ci-dessus, ou son complémentaire, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Les véhicules pharmaceutiquement acceptables pouvant être utilisés pour des acides nucléiques dans le cadre de l'invention sont bien connus de l'homme de l'art.
Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent également comprendre d'autres acides nucléiques, ayant une action anti-angiogénique, soit directement, soit par le biais d'une protéine pour laquelle ils codent, telle que l'endostatine, l'angiostatine, PF-4, la thrombospondine ou le fragment de prolactine de 16 kDa par exemple, ces protéines sont notamment définies dans Cao Int. J Biochem. Cell Biol. (2001) 33:357- 369.
Avantageusement, les compositions pharmaceutiques selon l'invention conviennent pour l'administration d'une dose unitaire de 0,5 à 20 mg d'acide nucléique.
L'administration des compositions pharmaceutiques peut être, en particulier réalisée par injection intramusculaire puis électrotransfert selon des méthodologies bien connues de l'homme de l'art.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum aux séquences s'étendant des nucléotides : - 823 à 1098 (SEQ ID NO : 3), et/ou - 1099 à 1365 (SEQ ID NO : 5), et/ou - 1366 à 1593 (SEQ ID NO : 7), de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 9, ou
<Desc/Clms Page number 13>
- à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un nucléotide, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - à une séquence possédant une homologie d'au moins 75 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou son complémentaire, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation avantageux, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend, à titre de substance active, un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum aux séquences s'étendant des nucléotides : - 823 à 1098 (SEQ ID NO : 3), et/ou - 1099 à 1365 (SEQ ID NO : 5), et/ou - 1366 à 1593 (SEQ ID NO : 7), de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 11, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou à une séquence homologue.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend, à titre de substance active, un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 1099 à 1593 (SEQ ID
NO : 13) de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 11, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou à une séquence homologue.
NO : 13) de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 11, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou à une séquence homologue.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend, à titre de substance active, un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 808 à 1593 (SEQ ID NO :
15) de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 11, ou -, à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou à une séquence homologue.
15) de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 11, ou -, à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou à une séquence homologue.
<Desc/Clms Page number 14>
ou étant constituée d'une séquence correspondant : -àSEQIDNO: 3, ou
5 - à SEQ ID NO : 5, ou - à SEQ ID NO : 7, ou - à SEQ ID NO : 9, ou - à SEQ ID NO: 11, ou - à SEQ ID NO: 13, ou 10 - à SEQ ID NO: 15, ou -àSEQIDNO: 17, ou -àSEQIDNO: 19, ou -àSEQIDNO: 21, ou - à SEQ ID NO : 23, ou 15 - à SEQ ID NO : 25, ou -àSEQIDNO: 27, ou - à SEQ ID NO : 29, ou son complémentaire.
5 - à SEQ ID NO : 5, ou - à SEQ ID NO : 7, ou - à SEQ ID NO : 9, ou - à SEQ ID NO: 11, ou - à SEQ ID NO: 13, ou 10 - à SEQ ID NO: 15, ou -àSEQIDNO: 17, ou -àSEQIDNO: 19, ou -àSEQIDNO: 21, ou - à SEQ ID NO : 23, ou 15 - à SEQ ID NO : 25, ou -àSEQIDNO: 27, ou - à SEQ ID NO : 29, ou son complémentaire.
Selon une autre mode de réalisation la présente invention concerne une composition 20 pharmaceutique telle que définie ci-dessus, comprenant à titre de substance active un vecteur d'expression eucaryote comprenant un acide nucléique tel que défini dans les compositions pharmaceutiques ci-dessus, ou son complémentaire, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Les vecteurs d'expression selon l'invention peuvent également comprendre en plus des 25 acides nucléiques codant pour des séquences peptidiques ayant également une activité anti-angiogénique, telles que l'endostatine ou l'angiostatine ou PF4 ou le fragment de prolactine de 16 kDa par exemple
Selon encore un autre mode de réalisation la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active une cellule 30 eucaryote ou procaryote transformée par un acide nucléique tel que défini dans les
Selon encore un autre mode de réalisation la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active une cellule 30 eucaryote ou procaryote transformée par un acide nucléique tel que défini dans les
<Desc/Clms Page number 15>
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre substance active un anticorps anti-idiotypique dirigé contre le paratope d'un anticorps dirigé contre une séquence peptidique telle que définie dans l'une des utilisations ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
On désigne par paratope la partie d'un anticorps responsable de son interaction avec un épitope d'un antigène reconnu par ledit anticorps.
Un anticorps anti-idotypique selon l'invention peut être préparé selon des méthodes bien connues de l'homme de l'art, notamment-par injection d'un anticorps dirigé contre une séquence peptidique selon l'invention à un animal, tel qu'un lapin ou une souris par exemple.
Avantageusement, l'anticorps anti-idiotypique selon l'invention, possède des propriétés de liaison au FGF-2.
L'anticorps anti-idiotypique de l'invention peut être humanisé, par des méthodes bien connues de l'homme de l'art. Des fragments de cet anticorps peuvent également être utilisés dans les compositions pharmaceutiques de l'invention, tels que des fragments scFv, Fab ou F(ab)'2 bien connu de l'homme de l'art.
La présente invention concerne également une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 270 à 531 (SEQ ID NO : 16) de SEQ ID NO : 10 et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) de
SEQ ID NO : 10, les séquences adjacentes aux extrémités de SEQ ID NO : 12 dans la séquence totale de ladite séquence peptidique étant différentes de celles qui sont adjacentes à SEQ ID NO: 12 dans la séquence de la fibronectine humaine, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2.
SEQ ID NO : 10, les séquences adjacentes aux extrémités de SEQ ID NO : 12 dans la séquence totale de ladite séquence peptidique étant différentes de celles qui sont adjacentes à SEQ ID NO: 12 dans la séquence de la fibronectine humaine, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2.
L'invention concerne notamment une séquence peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou étant constituée : - de SEQ ID NO : 12, ou - de SEQ ID NO : 14, ou
<Desc/Clms Page number 16>
-deSEQIDNO: 16, ou - de SEQ ID NO: 18, ou - de SEQ ID NO : 20, ou - de SEQ ID NO : 24, ou - de SEQ ID NO: 26, ou - de SEQ ID NO : 28, les séquences adjacentes aux extrémités des SEQ ID NO : 12,14, 16,18, 20,24, 26 et 28 dans la séquence totale de ladite séquence peptidique étant différentes de celles qui sont respectivement adjacentes à SEQ ID NO : 12,14, 16,18, 20,24, 26 et 28 dans la séquence de la fibronectine humaine.
La présente invention concerne également un acide nucléique, comprenant ou étant constitué d'une séquence codant pour l'une des séquence peptidiques telles que définies ci-dessus, ou son complémentaire.
L'invention concerne aussi un acide nucléique s'hybridant à un acide nucléique tel que définis ci-dessus, ou à son complémentaire, dans les conditions d'hybridation suivantes : 0,75 M NaCl, 0,75 mM citrate de sodium, 60 C .
La présente invention concerne également un acide nucléique comprenant ou étant constitué d'une séquence correspondant : - au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 808 à 1593 (SEQ ID
NO : 15) de SEQ ID NO : 9 et au maximum à la séquence SEQ ID NO : 11, les séquences adjacentes aux extrémités de SEQ ID NO : 11dans ledit acide nucléique étant différentes de celles qui sont adjacentes à SEQ ID NO : 11dans la séquence de la fibronectine humaine, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un nucléotide, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - à une séquence possédant une homologie d'au moins 75 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou son complémentaire.
NO : 15) de SEQ ID NO : 9 et au maximum à la séquence SEQ ID NO : 11, les séquences adjacentes aux extrémités de SEQ ID NO : 11dans ledit acide nucléique étant différentes de celles qui sont adjacentes à SEQ ID NO : 11dans la séquence de la fibronectine humaine, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un nucléotide, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - à une séquence possédant une homologie d'au moins 75 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou son complémentaire.
L'invention concerne plus particulièrement un acide nucléique tel que défini ci-dessus, comprenant ou étant constitué d'une séquence correspondant : - à SEQ ID NO : 11, ou
<Desc/Clms Page number 17>
- à SEQ ID NO : 13, ou - à SEQ ID NO : 15, ou - à SEQ ID NO : 17, ou - à SEQ ID NO : 19, ou - à SEQ ID NO : 23, ou - à SEQ ID NO : 25, ou - à SEQ ID NO : 27, les séquences adjacentes aux extrémités de SEQ ID NO : 11, 13,15, 17, 19, 23,
25 et 27 dans ledit acide nucléique étant respectivement différentes de celles qui sont adjacentes aux SEQ ID NO : 11, 13,15, 17,19, 23,25 et 27 dans la séquence de la fibronectine humaine, ou son complémentaire.
25 et 27 dans ledit acide nucléique étant respectivement différentes de celles qui sont adjacentes aux SEQ ID NO : 11, 13,15, 17,19, 23,25 et 27 dans la séquence de la fibronectine humaine, ou son complémentaire.
L'invention concerne notamment un vecteur d'expression eucaryote ou procaryote comprenant un acide nucléique tel que défini ci-dessus.
Selon un autre mode de réalisation la présente invention concerne une cellule eucaryote ou procaryote transformée par un acide nucléique tel que défini dans les compositions décrites ci-dessus.
L'invention concerne également un anticorps dirigé contre une séquence peptidique telle que définie dans l'une des utilisations ci-dessus.
Cet anticorps peut notamment être préparé selon des méthodes bien connues de l'homme de l'art, par injection des séquences peptidiques selon l'invention à des animaux tels que des chevaux, des lapins, des rats ou des souris et l'extraction du sérum desdits animaux.
Un tel anticorps est notamment utile pour la fabrication de kis permettant de doser les séquences peptidiques selon l'invention, par exemples dans des fluides ou des tissus naturels, tels que du sang, du sérum, du plasma ou des extraits de muscles par exemple Le dosage peut par exemple être réalisé selon la méthode ELISA.
L'invention concerne également des fragments de l'anticorps ci-dessus, tels que des fragments Fab, F(ab)'2 ou scFv par exemple.
L'invention concerne également un anticorps anti-idiotypique dirigé contre le paratope de l'anticorps défini ci-dessus.
<Desc/Clms Page number 18>
DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 La Figure 1 représente les résultats d'un test ELISA mesurant l'interaction établie entre le facteur FGF-2 fixé sur les parois des puits d'une plaque de microtitration et la fibstatine, la présence de fibstatine étant révélée par un anticorps marqué à la péroxydase de raifort. L'axe des ordonnées représente la densité optique à 490 nm. L'axe des abscisses représente la concentration en fibstatine (en g/ml).
10 Figure 2
La Figure 2 représente l'effet de milieu conditionné dilué au 3/4 (colonne noire) ou au 1/2 (colonne blanche) contenant de la fibstatine (Fib) ou de l'endostatine (Endo) sur la croissance de cellules endothéliales en culture, par comparaison avec des cellules endothéliales témoins (colonne hachurée). L'axe des ordonnées représente le pourcentage de croissance par rapport 15 à la croissance des cellules témoins.
La Figure 2 représente l'effet de milieu conditionné dilué au 3/4 (colonne noire) ou au 1/2 (colonne blanche) contenant de la fibstatine (Fib) ou de l'endostatine (Endo) sur la croissance de cellules endothéliales en culture, par comparaison avec des cellules endothéliales témoins (colonne hachurée). L'axe des ordonnées représente le pourcentage de croissance par rapport 15 à la croissance des cellules témoins.
Figure 3
La Figure 3 représente l'effet de la fibstatine recombinante (colonnes noires) ou de l'endostatine recombinante (colonnes blanches) sur la croissance de cellules endothéliales en 20 culture. L'axe des ordonnées représente le pourcentage d'inhibition de croissance par rapport à la croissance de cellules témoins, l'axe des abscisses représente la concentration en protéine recombinante (en g/ml).
La Figure 3 représente l'effet de la fibstatine recombinante (colonnes noires) ou de l'endostatine recombinante (colonnes blanches) sur la croissance de cellules endothéliales en 20 culture. L'axe des ordonnées représente le pourcentage d'inhibition de croissance par rapport à la croissance de cellules témoins, l'axe des abscisses représente la concentration en protéine recombinante (en g/ml).
Figure 4 @ 25 La Figure 4 représente l'effet de la fibstatine (colonne blanche) sur la croissance de cellules non-endothéliales B16 et NIH-3T3 par rapport à un témoin (colonne noire). L'axe des ordonnées représente le pourcentage de croissance cellulaire.
Figure 5 30 La Figure 5 représente l'effet de la fibstatine sur la migration cellulaire de cellules endothéliales. L'effet de la fibstatine et du FGF-2 est comparé à l'effet du FGF-2 seul. L'axe des ordonnées,représente le nombre de cellules ayant migré.
<Desc/Clms Page number 19>
Figure 6A, Figure 6B, Fleure 6C et Figure 6D
Les Figures 6A, B, C et D représentent l'effet de la fibstatine sur la différenciation cellulaire en tubules des cellules endothéliales.
Les Figures 6A, B, C et D représentent l'effet de la fibstatine sur la différenciation cellulaire en tubules des cellules endothéliales.
La Figure 6A est une photographie représentant des cellules endothéliales (points noirs)
5 cultivées en MatriGel (Becton et Dickinson, Bedford, MA) en absence de FGF-2 et de fibstatine.
5 cultivées en MatriGel (Becton et Dickinson, Bedford, MA) en absence de FGF-2 et de fibstatine.
La Figure 6B est une photographie représentant des cellules endothéliales (traits noirs) cultivées en MatriGel en présence de FGF-2 et en absence de fibstatine.
La Figure 6C est une photographie représentant des cellules endothéliales (points noirs) 10 cultivées en MatriGel en présence de FGF-2 et de fibstatine.
La Figure 6D représente la tailles des tubules formés à partir des cellules endothéliales cultivées en absence de FGF-2 et de fibstatine (colonne de gauche), en présence de FGF-2 et en absence de fibstatine (colonne du milieu) et en présence de FGF-2 et de fibstatine (colonne de droite). L'axe des ordonnées représente la taille des tubules (en unités arbitraires).
15
Figure 7
La Figure 7 représente l'effet de la fibstatine sur la migration de cellules endothéliales in vivo.
Figure 7
La Figure 7 représente l'effet de la fibstatine sur la migration de cellules endothéliales in vivo.
Le nombre de cellules endothéliales (x 10-4) ayant colonisé 100 mg de MatriGel est représenté en ordonnée, en fonction de l'ajout dans le gel de FGF-2 (colonne noire), de FGF-2 20 et de fibstatine (colonne hachurée) et de FGF-2 et d'endostatine (colonne blanche).
Figure 8
La Figure 8 représente le schéma du plasmide pSCT-Fib. Les sites de restriction sont représentés avec leur localisation en kb. Amp représente le gène de résistance à l'ampicilline, 25 CMV représente le promoteur du cytomégalovirus, pT7 représente le promoteur du phage T7,
PS représente la séquence codant le peptide signal du VEGF, HA représente la séquence codant un épitope dérivé de l'hémaglutinine A, Fib His représente la séquence codante de la fibstatine fusionnée avec une étiquette hexahistidine, IVS2-P représente l'intron de la ss- globine de lapin, Ori SV40 représente l'origine de réplication du virus SV40 et ORI 30 représente une origine de réplication bactérienne.
La Figure 8 représente le schéma du plasmide pSCT-Fib. Les sites de restriction sont représentés avec leur localisation en kb. Amp représente le gène de résistance à l'ampicilline, 25 CMV représente le promoteur du cytomégalovirus, pT7 représente le promoteur du phage T7,
PS représente la séquence codant le peptide signal du VEGF, HA représente la séquence codant un épitope dérivé de l'hémaglutinine A, Fib His représente la séquence codante de la fibstatine fusionnée avec une étiquette hexahistidine, IVS2-P représente l'intron de la ss- globine de lapin, Ori SV40 représente l'origine de réplication du virus SV40 et ORI 30 représente une origine de réplication bactérienne.
Figure 9A et Figure 9B La Figure 9A représente l'activité ss-galactosidase (en ordonnées, unités arbitraires) exprimée par un plasmide co-injecté dans un muscle de souris avec un plasmide codant pour la
<Desc/Clms Page number 20>
fibstatine (colonne hachurée), l'endostatine (colonne blanche) ou un plasmide témoin (colonne noire).
La Figure 9B représente la concentration sérique en endostatine (en ordonnée, ng/ml) pour une souris témoins (colonne noire) ou ayant reçu une injection de plasmide codant pour 5 l'endostatine (colonne blanche).
Figure 10
La Figure 10 représente l'effet de la fibstatine sur la croissance tumorale. La masse de tumeurs de mélanome B16 (en ordonnées, mg) a été mesurée pour des souris ayant reçu une 10 injection de cellules B16 et ayant été traitées par l'injection d'un plasmide témoin (colonne noire), ou d'un plasmide codant pour la fibstatine (colonne hachurée) ou l'endostatine (colonne blanche).
La Figure 10 représente l'effet de la fibstatine sur la croissance tumorale. La masse de tumeurs de mélanome B16 (en ordonnées, mg) a été mesurée pour des souris ayant reçu une 10 injection de cellules B16 et ayant été traitées par l'injection d'un plasmide témoin (colonne noire), ou d'un plasmide codant pour la fibstatine (colonne hachurée) ou l'endostatine (colonne blanche).
<Desc/Clms Page number 21>
EXEMPLE 1 Identification de fragments de fibronectine se liant au facteur FGF-2 par la méthode du double hybride
Le système de clonage et d'expression double-hybride a été réalisé comme décrit par
Van den Berghe et al. Brièvement la forme de 18 kDa du facteur FGF-2 a été utilisée comme appât, et l'ADNc correspondant a été inséré dans le vecteur pAS2 (Clontech). Une banque 10 humaine de placenta (Clontech, Palo Alto, CA) clonée dans le vecteur pACT2 (Clontech) a été criblée dans la souche Y190 (Clontech) de Saccharomyces cerevisiae. L'activité B-galactosidase d'extraits obtenus à partir de 10 colonies de levures poussées sur la nuit dans
4 ml de milieu de sélection (DOB-Trp/-Leu) (milieu "Drop Out Base" : sans tryptophane, sans leucine), a été mesurée à l'aide du test Galacto-Light (Tropix Inc. Bedford, MA) dans les 15 conditions décrites par le fabriquant.
Le système de clonage et d'expression double-hybride a été réalisé comme décrit par
Van den Berghe et al. Brièvement la forme de 18 kDa du facteur FGF-2 a été utilisée comme appât, et l'ADNc correspondant a été inséré dans le vecteur pAS2 (Clontech). Une banque 10 humaine de placenta (Clontech, Palo Alto, CA) clonée dans le vecteur pACT2 (Clontech) a été criblée dans la souche Y190 (Clontech) de Saccharomyces cerevisiae. L'activité B-galactosidase d'extraits obtenus à partir de 10 colonies de levures poussées sur la nuit dans
4 ml de milieu de sélection (DOB-Trp/-Leu) (milieu "Drop Out Base" : sans tryptophane, sans leucine), a été mesurée à l'aide du test Galacto-Light (Tropix Inc. Bedford, MA) dans les 15 conditions décrites par le fabriquant.
Le criblage de la banque de placenta en utilisant comme appât la forme du FGF-2 de
18 kDa (155 a. a.) a permis d'isoler deux clones A et B contenant chacun un ADNc codant pour une protéine susceptible d'interagir avec le FGF-2. Après séquençage et recherche 20 d'homologie dans les banques de données, il a pu être mis en évidence que les deux ADNc isolés étaient identiques à 100 % à une région particulière de l'ADNc codant pour la fibronectine
L'un des fragments clonés, le fragment A, présente une taille .de 1593 paires de bases 25 et code pour un fragment de fibronectine de 531acides aminés tandis que le fragment B de
798 paires de bases code pour un fragment de 266 acides aminés, qui a été nommé fibstatine (Fib). Ces deux clones correspondent à la même région de la fibronectine. Le clone A correspond aux acides aminés 1447 à 1977 de la fibronectine (SEQ ID NO : 2) et le clone B aux acides aminés 1716 à 1981.
18 kDa (155 a. a.) a permis d'isoler deux clones A et B contenant chacun un ADNc codant pour une protéine susceptible d'interagir avec le FGF-2. Après séquençage et recherche 20 d'homologie dans les banques de données, il a pu être mis en évidence que les deux ADNc isolés étaient identiques à 100 % à une région particulière de l'ADNc codant pour la fibronectine
L'un des fragments clonés, le fragment A, présente une taille .de 1593 paires de bases 25 et code pour un fragment de fibronectine de 531acides aminés tandis que le fragment B de
798 paires de bases code pour un fragment de 266 acides aminés, qui a été nommé fibstatine (Fib). Ces deux clones correspondent à la même région de la fibronectine. Le clone A correspond aux acides aminés 1447 à 1977 de la fibronectine (SEQ ID NO : 2) et le clone B aux acides aminés 1716 à 1981.
30
Afin de définir plus précisément la région responsable de la liaison au FGF-2, divers fragments dérivés du clone B ont été générés par PCR, clonés dans le plasmide pACT2 et testés en double hybride comme décrit ci-dessus. Ces fragments sont les suivants: - un fragment issu d'un clone C correspondant aux résidus 1721 à 1901 de la fibronectine,
Afin de définir plus précisément la région responsable de la liaison au FGF-2, divers fragments dérivés du clone B ont été générés par PCR, clonés dans le plasmide pACT2 et testés en double hybride comme décrit ci-dessus. Ces fragments sont les suivants: - un fragment issu d'un clone C correspondant aux résidus 1721 à 1901 de la fibronectine,
<Desc/Clms Page number 22>
- un fragment issu d'un clone D correspondant aux résidus 1813 à 1981 de la fibronectine, - un fragment issu d'un clone E correspondant aux résidus 1813 à 1991 de la fibronectine.
Les résultats obtenus sont portés dans le tableau 1 ci-dessous :
Clone testé Interaction avec FGF-2 A +
B +
C
D +
E Tableau 1 : du test en double hybride de l'interaction entre des fragments de fibronectine et le facteur FGF-2
Le sous-fragment D de la fibstatine semble donc être porteur de l'activité de liaison au
FGF-2.
Clone testé Interaction avec FGF-2 A +
B +
C
D +
E Tableau 1 : du test en double hybride de l'interaction entre des fragments de fibronectine et le facteur FGF-2
Le sous-fragment D de la fibstatine semble donc être porteur de l'activité de liaison au
FGF-2.
10 Par ailleurs, il est envisageable que in vivo le fragment E ait une activité de liaison à
FGF-2 suite à une coupure protéolytique, a contrario il semble également possible que le fragment C puisse s'associer à un autre fragment protéique pour reconstituer un fragment actif.
FGF-2 suite à une coupure protéolytique, a contrario il semble également possible que le fragment C puisse s'associer à un autre fragment protéique pour reconstituer un fragment actif.
15 Afin de vérifier la spécificité d'interaction du FGF-2 avec la fibstatine, l'interaction de ce fragment avec d'autres membres de la famille des FGF : le FGF-l, le FGF-3 et le FGF-6, a été testée en double hybride. Pour cela, les ADNc codant pour différents membres de la famille des FGF et la fibstatine ont été fusionnés au domaine de liaison à l'ADN (DB) ou au domaine d'activation (AD) de Gal4 et co-transfectés dans la levure. Les intensités 20 d'interactions évaluées par la mesure de l'activité ss-galactosidase ont révélé que la fibstatine interagissait de manière spécifique avec le FGF-2.
EXEMPLE 2
Effets anti-angiogénique in vitro de fragments de fibronectine se liant au facteur FGF-2 25
1. Clonage du gène de la Fibstatine
La séquence@codante de la fibstatine a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pACT2 contenant l'ADNc de la fibstatine isolé par le criblage en double-hybride. L'amorce sens était
Effets anti-angiogénique in vitro de fragments de fibronectine se liant au facteur FGF-2 25
1. Clonage du gène de la Fibstatine
La séquence@codante de la fibstatine a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pACT2 contenant l'ADNc de la fibstatine isolé par le criblage en double-hybride. L'amorce sens était
<Desc/Clms Page number 23>
5'-AAACTCGAGACCATGGGAACCCAGTCCACAGCT-3' (SEQ ID NO : 31) et l'amorce antisense 5'-AAAGGATCCTTACTTCAGGGCAATGACATA-3' (SEQ ID N0:32). La séquence codante de l'endosatine (Endo) a été amplifiée par RT-PCR à partir d'ARN de cellules NIH-3T3. L'amorce sens était 5'-AAACCATGGGAATTCATACTCATCAGGAC
5 TTTCAGCC-3' (SEQ ID N0:33) et l'amorce antisens 5'-GGATCCTTAC
TATTTGGAGAAAGAGGTCATGAAGC-3' (SEQ ID NO : 34). Les séquences codantes de la fibstatine et de l'endostatine ont alors été insérées dans le plasmide pET-15b (Novagen) en phase avec l'étiquette histidine pour la production de protéines recombinantes dans
Escherichia coli, pour donner les plasmides pET-Fib et pET-Endo. Les ADNc de la fibstatine 10 et de l'endostatine ont également été clonés dans les vecteurs d'expression eucaryotes, pUHDlO-3 (Grossen & Bujard, 1992, PNAS (1992) June 15 ; 5547-5551) pour former pUHD-Fib et pUHD-Endo, et pSCT (Prats, 1992, Mol. Cell. Biol. (1992) Octobre ; 12 (10)
4796-4805), pour former pSCT-Fib (Fleure 8) et pSCT-Endo, en phase avec le peptide signal de VEGF-A (Huez et al., 2001, Mol. Endocrinol. (2001) décembre 15 (12) et 15 l'épitope HA (épitope hémagglutinine), utilisables respectivement pour une expression en milieu conditionné et en électrotransfert. Toutes les séquences ont été vérifiées par séquençage à l'aide du kit ABI Prism Dye Terminator (Applied Biosystems, Foster City, CA).
5 TTTCAGCC-3' (SEQ ID N0:33) et l'amorce antisens 5'-GGATCCTTAC
TATTTGGAGAAAGAGGTCATGAAGC-3' (SEQ ID NO : 34). Les séquences codantes de la fibstatine et de l'endostatine ont alors été insérées dans le plasmide pET-15b (Novagen) en phase avec l'étiquette histidine pour la production de protéines recombinantes dans
Escherichia coli, pour donner les plasmides pET-Fib et pET-Endo. Les ADNc de la fibstatine 10 et de l'endostatine ont également été clonés dans les vecteurs d'expression eucaryotes, pUHDlO-3 (Grossen & Bujard, 1992, PNAS (1992) June 15 ; 5547-5551) pour former pUHD-Fib et pUHD-Endo, et pSCT (Prats, 1992, Mol. Cell. Biol. (1992) Octobre ; 12 (10)
4796-4805), pour former pSCT-Fib (Fleure 8) et pSCT-Endo, en phase avec le peptide signal de VEGF-A (Huez et al., 2001, Mol. Endocrinol. (2001) décembre 15 (12) et 15 l'épitope HA (épitope hémagglutinine), utilisables respectivement pour une expression en milieu conditionné et en électrotransfert. Toutes les séquences ont été vérifiées par séquençage à l'aide du kit ABI Prism Dye Terminator (Applied Biosystems, Foster City, CA).
2. Production de la fibstatine 20 a. Production en milieu conditionné
Des cellules HeLa HT (Cayrol, Journal of Virology, July 1995; 69 (7) 4206-4212) ensemencées à 1,2 x 106 par boîte de diamètre 100 mm ont été transfectées au Fugene (Roche,
Allemagne) le lendemain, par 17 g de plasmide pUHD-Fib, pUHD-Endo ou pUHDlO-3. 24h après la transfection, les cellules ont été incubées dans 6 ml de milieu DMEM (Dulbecco 25 Modified Eagle Medium)(Invitrogen) + 1 % SVF (Sérum de Veau F#tal). Le milieu conditionné a été récupéré 24h après, centrifugé 5 min à 1700 tpm, filtré (sur filtre de 45 m) et congelé à - 80 C. b. Production par Escherichia coli 30 Des bactéries E. coli BL21 ont été transformées avec les plasmides pET-Fib, pET-Endo ou un plasmide contrôle permettant l'expression de la GST (Glutathion S Transférase) fusionnée aux 6 histidines. 100 ml de culture bactérienne sur la nuit a ensuite été diluée dans un litre de milieu LB (Luria-Bertani). L'expression des protéines a été induite à une DO600 nm de 0,6-0,8 par addition d'IPTG (isopropyl-p-D-thiogalactopyranoside) à la concentration de 0,5 mM.
Des cellules HeLa HT (Cayrol, Journal of Virology, July 1995; 69 (7) 4206-4212) ensemencées à 1,2 x 106 par boîte de diamètre 100 mm ont été transfectées au Fugene (Roche,
Allemagne) le lendemain, par 17 g de plasmide pUHD-Fib, pUHD-Endo ou pUHDlO-3. 24h après la transfection, les cellules ont été incubées dans 6 ml de milieu DMEM (Dulbecco 25 Modified Eagle Medium)(Invitrogen) + 1 % SVF (Sérum de Veau F#tal). Le milieu conditionné a été récupéré 24h après, centrifugé 5 min à 1700 tpm, filtré (sur filtre de 45 m) et congelé à - 80 C. b. Production par Escherichia coli 30 Des bactéries E. coli BL21 ont été transformées avec les plasmides pET-Fib, pET-Endo ou un plasmide contrôle permettant l'expression de la GST (Glutathion S Transférase) fusionnée aux 6 histidines. 100 ml de culture bactérienne sur la nuit a ensuite été diluée dans un litre de milieu LB (Luria-Bertani). L'expression des protéines a été induite à une DO600 nm de 0,6-0,8 par addition d'IPTG (isopropyl-p-D-thiogalactopyranoside) à la concentration de 0,5 mM.
<Desc/Clms Page number 24>
Après 4h d'expression à 37 C, les bactéries ont été récupérées par centrifugation 10 min à
5000 tpm. Le culot bactérien a alors été lysé par resuspension dans 30 ml de tampon A (Tris
20 mM pH 7,4, NaCl 0,5 M, chlorure de guanidinium 6 M, octyglucoside 4 mM, imidazole 10 mM). La suspension de bactéries a été soniquée puis centrifugée à 13000 tpm durant 30 min.
5000 tpm. Le culot bactérien a alors été lysé par resuspension dans 30 ml de tampon A (Tris
20 mM pH 7,4, NaCl 0,5 M, chlorure de guanidinium 6 M, octyglucoside 4 mM, imidazole 10 mM). La suspension de bactéries a été soniquée puis centrifugée à 13000 tpm durant 30 min.
5 Le surnageant obtenu a été incubé avec 0,75 ml de billes de nickel-agarose préalablement équilibrées dans le tampon A. Après 2 h d'incubation sur une roue à 4 C, les billes ont été lavées successivement par 50 ml de Tampon B (Tris 20 mM pH 7,4, NaCl 2 M, urée 6 M, imidazole 20 mM) puis par 100 ml de Tampon C (Tris 20 mM pH 7,4, NaCl 0,15 M, imidazole 20 mM). Après le dernier lavage, les billes ont été déposées sur une colonne de 10 chromatographie Polyprep (Biorad) et éluées avec des fractions de 500 l de Tampon C contenant 200 mM d'imidazole. La présence de protéine a été vérifiée par dosage de Bradford (BioRad 500-0114, Californie) et SDS-PAGE suivi d'une coloration au bleu de Coomassie. c. Production en cellules d'insecte 15 Les ADNc codant pour la fibstatine et l'endostatine fusionnées avec 6 histidines ont été clonés dans un vecteur permettant leur expression et leur sécrétion par le système
Baculovirus. Les protéines sécrétées dans le milieu de culture des cellules d'insecte, dépourvu de sérum, ont été purifiées par précipitations successives au sulfate d'ammonium (20,50 puis
80 %). La majorité des protéines recombinantes se trouvant dans la fraction 50 %, celle-ci a 20 été dialysée dans du PBS à 4 C et les protéines ont été purifiées sur colonne de nickel agarose. Après plusieurs lavages au PBS + 20 mM imidazole, les protéines ont été éluées par du PBS + 200 mM imidazole. La présence de protéine est vérifiée par dosage de Bradford et
SDS-PAGE suivi d'une coloration au bleu de Coomassie.
Baculovirus. Les protéines sécrétées dans le milieu de culture des cellules d'insecte, dépourvu de sérum, ont été purifiées par précipitations successives au sulfate d'ammonium (20,50 puis
80 %). La majorité des protéines recombinantes se trouvant dans la fraction 50 %, celle-ci a 20 été dialysée dans du PBS à 4 C et les protéines ont été purifiées sur colonne de nickel agarose. Après plusieurs lavages au PBS + 20 mM imidazole, les protéines ont été éluées par du PBS + 200 mM imidazole. La présence de protéine est vérifiée par dosage de Bradford et
SDS-PAGE suivi d'une coloration au bleu de Coomassie.
25 3. Interaction de la fibstatine avec le facteur FGF-2
Une plaque de 96 puits a été tapissée sur la nuit à 4 C par du FGF-2 ou de la SAB (Sérum
Albumine Bovine) à 10 g/ml. La plaque a été rincée avec du PBS-tween 0,2% et 100 l de solution de blocage ont été ajoutés par puits pendant 1 h à 37 C. La solution de blocage a été évacuée et la plaque rincée. Des concentrations variables de fibstatine avec une étiquette 30 histidine ont été ajoutées pendant 2 h à 37 C. Après trois rinçages, des anticorps dirigés contre l'étiquette histidine conjugués à de la peroxydase de raifort (1/1000) ont été ajoutés pendant 1 h à 37 C. Trois rinçages ont alors été effectués et les complexes ont été révélés à l'aide de 100 l par puits de o-phénylènediamine (4 mg/ml) contenant 0,03% (v/v) de
Une plaque de 96 puits a été tapissée sur la nuit à 4 C par du FGF-2 ou de la SAB (Sérum
Albumine Bovine) à 10 g/ml. La plaque a été rincée avec du PBS-tween 0,2% et 100 l de solution de blocage ont été ajoutés par puits pendant 1 h à 37 C. La solution de blocage a été évacuée et la plaque rincée. Des concentrations variables de fibstatine avec une étiquette 30 histidine ont été ajoutées pendant 2 h à 37 C. Après trois rinçages, des anticorps dirigés contre l'étiquette histidine conjugués à de la peroxydase de raifort (1/1000) ont été ajoutés pendant 1 h à 37 C. Trois rinçages ont alors été effectués et les complexes ont été révélés à l'aide de 100 l par puits de o-phénylènediamine (4 mg/ml) contenant 0,03% (v/v) de
<Desc/Clms Page number 25>
peroxyde d'hydrogène dans 0,1 M de tampon citrate, pH 5,0. Après 20 minutes, les réactions ont été arrêtées avec 50 l de H2S04 2 M et l'absorbance a été mesurée à 490 nm.
Les résultats obtenus après soustraction du signal non spécifique (interaction Fib/BSA) révèlent que la fibstatine est capable d'interagir de manière directe et dose dépendante avec le FGF-2 (Figure 1). 4. Effets de la fibstatine sur les cellules endothéliales a. Culture des cellules 10 Les cellules ont été cultivées dans du DMEM supplémenté en glutamine (1 %), amphotéricine
B (1 %), gentamicine (0,5 %) et par 10 % SVF ou 10 % SV (Sérum de Veau nouveau né) pour les cellules HeLa (numéro ATCC : CCL2) et ABAE respectivement (Couderc, 1991,
Cell. Regul., vol 2, pages 709-718). Les cellules ABAE ont par ailleurs été cultivées en présence de 1 ng/ml de FGF-2. Les cellules B16 (ATCC CRL6475) ont été cultivées en RPMI 15 (Roswell Park Memorial Institute) supplémenté en glutamine (1 %), amphotéricine B (1 %), gentamicine (0,5 %) et en 10 % SV. Les cellules ont été cultivées dans des étuves à 5 % CO2 pour les cellules HeLa et B 16 et 10 % CO2 pour les ABAE. b. Inhibition de la prolifération 20 Pour le test de prolifération, les cellules ABAE ont été ensemencées à 5 x 104 cellules/ml de milieu. Le lendemain le milieu a été changé et les cellules ont été incubées en présence de milieu conditionné préparé selon le paragraphe 2a et dilué au 1/4 ou au 1/2 en présence de 0,5 ng/ml de FGF-2.72h après, les cellules ont été trypsinées et comptées.
B (1 %), gentamicine (0,5 %) et par 10 % SVF ou 10 % SV (Sérum de Veau nouveau né) pour les cellules HeLa (numéro ATCC : CCL2) et ABAE respectivement (Couderc, 1991,
Cell. Regul., vol 2, pages 709-718). Les cellules ABAE ont par ailleurs été cultivées en présence de 1 ng/ml de FGF-2. Les cellules B16 (ATCC CRL6475) ont été cultivées en RPMI 15 (Roswell Park Memorial Institute) supplémenté en glutamine (1 %), amphotéricine B (1 %), gentamicine (0,5 %) et en 10 % SV. Les cellules ont été cultivées dans des étuves à 5 % CO2 pour les cellules HeLa et B 16 et 10 % CO2 pour les ABAE. b. Inhibition de la prolifération 20 Pour le test de prolifération, les cellules ABAE ont été ensemencées à 5 x 104 cellules/ml de milieu. Le lendemain le milieu a été changé et les cellules ont été incubées en présence de milieu conditionné préparé selon le paragraphe 2a et dilué au 1/4 ou au 1/2 en présence de 0,5 ng/ml de FGF-2.72h après, les cellules ont été trypsinées et comptées.
Les résultats obtenus représentés Figure 2 montrent que la présence de Fib dans le milieu 25 inhibe la prolifération des ABAE de manière comparable à celle de l'endostatine.
Des expériences similaires ont été réalisées avec de la fibstatine recombinante préparée chez
E. coli.
E. coli.
Les résultats obtenus après comptage des cellules et représentés Figure 3 confirment l'effet inhibiteur et dose-dépendant de la fibstatine sur la prolifération des ABAE stimulées par FGF- 30 2. En effet, à 1 ug/ml Fib inhibe à 50% la prolifération des cellules induite par FGF-2. De plus, dans nos conditions expérimentales, l'effet de la fibstatine paraît supérieur à celui de l'endostatine.
Les fragments anti-angiogéniques décrits jusqu'à présent inhibent de manière spécifique la prolifération des cellules endothéliales. Afin de vérifier si Fib présente cette
<Desc/Clms Page number 26>
même caractéristique, l'effet de Fib a été testé sur la prolifération de fibroblastes NIH-3T3 et sur celle de cellules de mélanome B16. Les résultats présentés Figure 4 révèlent que la fibstatine ne provoque aucune inhibition de la prolifération de ces cellules, suggérant que l'effet anti-prolifératif de Fib est spécifique des cellules endothéliales.
5 c. Inhibition de la migration
3 x 105 cellules ABAE ont été ensemencées dans des boîtes de diamètre 35 mm dans leur milieu de culture supplémenté en FGF-2 (1 ng/ml). Après 48h, les cellules ont été cultivées en absence de sérum durant 24h. Une "blessure" a ensuite été réalisée sur le tapis cellulaire à 10 l'aide d'un cône, les cellules ont été lavées et incubées dans du milieu sans sérum supplémenté en FGF-2 (5 ng/ml) en présence ou non de 1 g/ml de Fib ou d'endostatine. Les cellules ayant migré sur la "blessure" ont été comptabilisées 14 h plus tard.
3 x 105 cellules ABAE ont été ensemencées dans des boîtes de diamètre 35 mm dans leur milieu de culture supplémenté en FGF-2 (1 ng/ml). Après 48h, les cellules ont été cultivées en absence de sérum durant 24h. Une "blessure" a ensuite été réalisée sur le tapis cellulaire à 10 l'aide d'un cône, les cellules ont été lavées et incubées dans du milieu sans sérum supplémenté en FGF-2 (5 ng/ml) en présence ou non de 1 g/ml de Fib ou d'endostatine. Les cellules ayant migré sur la "blessure" ont été comptabilisées 14 h plus tard.
Les résultats présentés Figure 5 montrent que la fibstatine inhibe fortement l'effet activateur du FGF-2 sur la migration des ABAE.
15 d. Inhibition de la différenciation
La fibstatine a été testée dans un modèle d'angiogenèse in vitro permettant d'évaluer le niveau de tubulogénèse de cellules endothéliales.
La fibstatine a été testée dans un modèle d'angiogenèse in vitro permettant d'évaluer le niveau de tubulogénèse de cellules endothéliales.
Des plaques de 24 puits ont été tapissées avec 300 l de MatriGel par puits (mélange 20 de protéines issues de membranes basales de sarcomes murins à teneur réduite en facteurs de croissance, liquide à 4 C et solide à 37 C (Becton et Dickinson, Bedford, MA)), et laissées à polymériser pendant 1 h à 37 C. Des cellules ABAE (2 x 105 cellules/ml) en suspension dans
500 l de milieu de culture ont été ajoutées dans chaque puits. Du FGF-2 (0,5 ng/ml) avec ou sans fibstatine (1 g/ml) a été ajouté aux puits et les plaques ont été incubées sur la nuit à 25 37 C. Après le retrait du milieu, la culture a été fixée et la longueur du réseau de tubules a été mesurée à l'aide du système Q Win de Leica (Leica microsystem, Rueil-Malmaison, France).
500 l de milieu de culture ont été ajoutées dans chaque puits. Du FGF-2 (0,5 ng/ml) avec ou sans fibstatine (1 g/ml) a été ajouté aux puits et les plaques ont été incubées sur la nuit à 25 37 C. Après le retrait du milieu, la culture a été fixée et la longueur du réseau de tubules a été mesurée à l'aide du système Q Win de Leica (Leica microsystem, Rueil-Malmaison, France).
Les résultats présentés Figures 6A, B, C et D révèlent que l'addition de 1 g de Fib inhibe la formation des tubules. L'absence de toxicité dans ces conditions a été vérifiée par mesure de LDH (Lactate déhydrogénase) libérée dans le milieu de culture à l'aide du Kit 30 CytoTox 96 (Promega).
<Desc/Clms Page number 27>
EXEMPLE 3 Effets anti-angiogénique et anti-tumoral in vivo de fragments de fibronectine se liant au facteur FGF-2 1. Animaux utilisés Des souris C57B1/6 âgées de 6 à 10 semaines ont été maintenues dans des cages en acier inoxydable en groupe de 5, à température contrôlée avec des cycles jour-nuit de 12 heures, et nourries avec de la nourriture de laboratoire standard. Toutes les procédures ont été réalisées selon les recommandations de l'European Accreditation of Laboratory Animal Care.
2. Inhibition de l'angiogenèse in vivo
300 l de MatriGelTM supplémentés avec 100 ng de FGF-2 en présence ou non de 10 g de fibstatine ou d'endostatine (préparés dans des cellules d'insectes), ont été injectés en sous- cutané à des souris femelles C57B1/6. 1 semaine après, les implants de MatriGel ont été 15 récupérés, dissous par du MatriSperse (Beckton et Dickinson) et les cellules endothéliales comptées à la cellule de Malassez.
300 l de MatriGelTM supplémentés avec 100 ng de FGF-2 en présence ou non de 10 g de fibstatine ou d'endostatine (préparés dans des cellules d'insectes), ont été injectés en sous- cutané à des souris femelles C57B1/6. 1 semaine après, les implants de MatriGel ont été 15 récupérés, dissous par du MatriSperse (Beckton et Dickinson) et les cellules endothéliales comptées à la cellule de Malassez.
Comme le montre la Figure 7, la fibstatine inhibe à 50 % l'angiogenèse induite par FGF-2, cet effet est supérieur à celui induit par l'endostatine.
20 3. Inhibition de la croissance tumorale in vivo
Afin d'évaluer l'effet anti-tumoral de la fibstatine, le plasmide l'exprimant a été électrotransféré in vivo à des souris porteuses de mélanomes B16.
Afin d'évaluer l'effet anti-tumoral de la fibstatine, le plasmide l'exprimant a été électrotransféré in vivo à des souris porteuses de mélanomes B16.
Des souris femelles C57B1/6 anesthésiées par injection intra-péritonéale de kétamine (150 mg/kg) ont reçu une injection sous cutanée de 106 cellules tumorales B16 dans 100 l de PBS 25 (temps d'incubation : environ 10 minutes avant injection des plasmides). 50 g de plasmide (5 g de plasmide LacZ + 45 g de pSCT Fib (Figure 8\ pSCT Endo ou pSCT) préparés à l'aide du kit Maxiprep Endofree (Qiagen, France) et dilués dans 50 l de PBS ont été injectés dans le quadriceps des souris avec une seringue 26G 0,45x10. Les plasmides injectés ont alors été immédiatement électrotransférés par deux électrodes de 10 mm de diamètre, séparées de 4 30 mm, en contact avec la peau à l'aide d'un appareil ElectroSquare Porator ECM830 (BTX,
Genetronics, San Diego, CA) par 8 impulsions de 20 ms à 80V. L'efficacité de l'électroporation a été favorisée par l'utilisation d'un gel à ultrason appliqué sur la patte.
Genetronics, San Diego, CA) par 8 impulsions de 20 ms à 80V. L'efficacité de l'électroporation a été favorisée par l'utilisation d'un gel à ultrason appliqué sur la patte.
L'injection suivie de l'électrotransfert des plasmides a été recommencée 5 jours plus tard. 10 jours après la première injection, les tumeurs et les muscles électrotransférés ont été récupérés
<Desc/Clms Page number 28>
et pesés. Les muscles ont ensuite été lysés dans 350 l de tampon de lyse P-Gal (Tropix) et homogénéisés à l'aide d'un ultra-turax (Polylabo). La suspension a été centrifugée à 13000 tpm durant 10 min. Le dosage de l'activité ss-galactosidase a alors été réalisé sur 20 l de surnageant à l'aide du kit Galacto LightTM (Tropix). Le sérum des souris a également été
5 récupéré à l'aide de tubes Capiject (Terumo) contenant un gel de silice facilitant la récupération du sérum. L'endostatine circulante a été dosée à l'aide du kit ELISA Mouse
Endostatine Accucyte (Cytimmune).
5 récupéré à l'aide de tubes Capiject (Terumo) contenant un gel de silice facilitant la récupération du sérum. L'endostatine circulante a été dosée à l'aide du kit ELISA Mouse
Endostatine Accucyte (Cytimmune).
Les résultats présentés Figure 9A confirment que les plasmides codant pour LacZ, co-injectés avec pSCT-Fib, pSCT-Endo ou pSCT, ont bien été injectés dans le muscle et étaient 10 correctement exprimés. Les résultats obtenus pour l'endostatine circulante dans le sérum des souris électrotransférées avec pSCT-Endo confirment que la protéine est bien exprimée et sécrétée, atteignant une concentration moyenne de 15 ng/ml dans le sérum des souris (Figure
9B).
9B).
L'analyse des tumeurs a permis de montrer que les souris ayant reçu une injection du 15 plasmide pSCT-Fib présentent une masse tumorale diminuée de moitié par rapport aux souris injectées avec le plasmide contrôle. Les souris ayant reçu une injection du plasmide pSCT-
Endo présentent également une diminution de leur masse tumorale mais statistiquement non significative (Figure 10). Les résultats ont été obtenus en utilisant 14 souris par groupe.
Endo présentent également une diminution de leur masse tumorale mais statistiquement non significative (Figure 10). Les résultats ont été obtenus en utilisant 14 souris par groupe.
20 Par ailleurs ces résultats ont été complétés par une expérience similaire réalisée avec un plasmide pSCT-D exprimant le fragment D de l'Exemple I, correspondant aux résidus 1813 à
1981 de la fibronectine. Les résultats obtenus indiquent que l'injection intramusculaire de ce plasmide, suivie d'un électrotransfert, induisent également une diminution de la masse tumorale par rapport à des souris n'ayant reçu que le plasmide pSCT.
1981 de la fibronectine. Les résultats obtenus indiquent que l'injection intramusculaire de ce plasmide, suivie d'un électrotransfert, induisent également une diminution de la masse tumorale par rapport à des souris n'ayant reçu que le plasmide pSCT.
Claims (3)
- 456 à 531 (SEQ ID NO : 8), de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) de SEQIDNO: 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2.<Desc/Clms Page number 30>3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 367 à 531 (SEQ ID NO : 14) de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) de SEQIDNO: 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2.4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 270 à 531 (SEQ ID NO : 16) de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) de SEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2. 5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - de SEQ ID NO : 4, ou - de SEQ ID NO: 6, ou - de SEQ ID NO : 8, ou -deSEQIDNO 10, ou - de SEQ ID NO : 12, ou . - de SEQ ID NO : 14, ou - de SEQ ID NO : 16, ou - de SEQ ID NO : 18, ou<Desc/Clms Page number 31>- de SEQ ID NO : 20, ou - de SEQ ID NO : 22, ou - de SEQ ID NO : 24, ou - de SEQ ID NO : 26, ou 5 - de SEQ ID NO : 28, ou - de SEQ ID NO : 30.6. Utilisation d'un acide nucléique codant pour une séquence peptidique telle que définie dans l'une des revendications 1 à 5, ou de son complémentaire, pour la 10 préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de maladies liées à l'angiogenèse, telles que les cancers, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, la rétinopathie diabétique, le psoriasis, ou l'arthrite rhumatoïde.7. Composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active une séquence 15 peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus : - 275 à 366 (SEQ ID NO -367à455(SEQIDNO - 456 à 531 (SEQ ID NO 4), et/ou 6), et/ou 8), 20 de SEQ ID NO : 10, et au maximum à une séquence correspondant à SEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au acteur FGF-2, ou 25- d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 30 8. Composition pharmaceutique substance active une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus : : 4), et/ou : 6), et/ou<Desc/Clms Page number 32>- 456 à 531 (SEQ ID NO : 8), de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) deSEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 9. Composition pharmaceutique selon la revendication 7 ou 8, comprenant à titre de substance active une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 367 à 531 (SEQ ID NO : 14) de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) deSEQ ID NO: 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 10. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 7 à 9, comprenant à titre de substance active une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 270 à 531 (SEQ ID NO : 16) de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) deSEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou<Desc/Clms Page number 33>- de SEQ ID NO : 4, ou - de SEQ ID NO : 6, ou 10 - de SEQ ID NO : 8, ou -deSEQIDNO: 10, ou - de SEQ ID NO : 12, ou -deSEQIDNO: 14, ou -deSEQIDNO: 16, ou 15 -deSEQIDNO: 18, ou - de SEQ ID NO : 20, ou - de SEQ ID NO : 22, ou -deSEQIDNO: 24, ou - de SEQ ID NO : 26, ou 20 - de SEQ ID NO : 28, ou - de SEQ ID NO : 30.12. Composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active un acide 25 nucléique codant pour une séquence peptidique telle que définie dans l'une des revendications 7 à 11, ou son complémentaire, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.13. Composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active un acide 30 nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum aux séquences s'étendant des nucléotides :<Desc/Clms Page number 34>de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 9, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un nucléotide, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - à une séquence possédant une homologie d'au moins 75 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou son complémentaire, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.14. Composition pharmaceutique selon la revendication 13, comprenant à titre de substance active un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum aux séquences s'étendant des nucléotides : - 823 à 1098 (SEQ ID NO : 3), et/ou - 1099 à 1365 (SEQ ID NO : 5), et/ou - 1366 à 1593 (SEQ ID NO : 7), de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 11, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un nucléotide, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - à une séquence possédant une homologie d'au moins 75 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou son complémentaire, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 15. Composition pharmaceutique selon la revendication 13 ou 14, comprenant à titre de substance active un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 1099 à 1593 (SEQ IDNO : 13) de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 11, ou<Desc/Clms Page number 35>- à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un nucléotide, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - à une séquence possédant une homologie d'au moins 75 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou son complémentaire, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 16. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 12 à 15, comprenant à titre de substance active un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 808 à 1593 (SEQ ID NO :15) de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 11, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un nucléotide, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - à une séquence possédant une homologie d'au moins 75 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou son complémentaire, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 17. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 12 à 16, comprenant à titre de substance active un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - à SEQ ID NO : 3, ou - à SEQ ID NO : 5, ou - à SEQ ID NO : 7, ou , - à SEQ ID NO: 9, ou - à SEQ ID NO : 11, ou - à SEQ ID NO : 13, ou<Desc/Clms Page number 36>-àSEQIDNO: 15, ou - à SEQ ID NO : 17, ou - à SEQ ID NO: 19, ou - à SEQ ID NO: 21, ou -àSEQIDNO: 23, ou - à SEQ ID NO: 25, ou - à SEQ ID NO : 27, ou - à SEQ ID NO : 29, ou son complémentaire, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 18. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 12 à 17, comprenant à titre de substance active un vecteur d'expression eucaryote comprenant un acide nucléique tel que défini dans l'une des revendications 12 à 17, ou son complémentaire, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 19. Composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active une cellule eucaryote ou procaryote transformée par un acide nucléique tel que défini dans l'une des revendications 12 à 18, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.20. Composition pharmaceutique comprenant à titre substance active un anticorps antiidiotypique dirigé contre le paratope d'un anticorps dirigé contre une séquence peptidique telle que définie dans l'une des revendications 1 5, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.21. Séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 270 à 531 (SEQ ID NO : 16) de SEQ ID NO : 10 et au maximum à une séquence correspondant à SEQ ID NO :12, les séquences adjacentes aux extrémités de SEQ ID NO : 12 dans la séquence totale de ladite séquence peptidique étant différentes de celles qui sont adjacentes à SEQ ID NO :
- 12 dans la séquence de la fibronectine humaine, ou<Desc/Clms Page number 37>- d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2.22. Séquence peptidique selon la revendication-21, comprenant ou étant constituée : - de SEQ ID NO : 12, ou - de SEQ ID NO : 14, ou -deSEQIDNO: 16, ou -deSEQIDNO: 18, ou - de SEQ ID NO : 20, ou - de SEQ ID NO : 24, ou - de SEQ ID NO : 26, ou - de SEQ ID NO : 28, les séquences adjacentes aux extrémités des SEQ ID NO : 12,14, 16, 18, 20, 24, 26 et 28 dans la séquence totale de ladite séquence peptidique étant différentes de celles qui sont respectivement adjacentes à SEQ ID NO : 12,14, 16,18, 20,24, 26 et 28 dans la séquence de la fibronectine humaine.23. Acide nucléique, comprenant ou étant constitué d'une séquence codant pour l'une des séquence peptidiques définies dans les revendications 21 et 22, ou son complémentaire. 24. Acide nucléique s'hybridant à un acide nucléique selon la revendication 23, ou à son complémentaire, dans les conditions d'hybridation suivantes : 0,75 M NaCl, 0,75 mM citrate de sodium, 60 C.25. Acide nucléique comprenant ou étant constitué d'une séquence correspondant : - au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 808 à 1593 (SEQ ID , NO : 15) de SEQ ID NO : 9 et au maximum à la séquence SEQ ID NO : 11, les séquences adjacentes aux extrémités de SEQ ID NO : 11dans ledit acide<Desc/Clms Page number 38>nucléique étant différentes de celles qui sont adjacentes à SEQ ID NO : 11dans la séquence de la fibronectine humaine, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un nucléotide, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - à une séquence possédant une homologie d'au moins 75 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou son complémentaire.26. Acide nucléique selon la revendication 25, comprenant ou étant constitué d'une séquence correspondant : - à SEQ ID NO: 11, ou - à SEQ ID NO : 13, ou - à SEQ ID NO : 15, ou -àSEQIDNO: 17, ou -àSEQIDNO: 19, ou - à SEQ ID NO : 23, ou - à SEQ ID NO : 25, ou - à SEQ ID NO: 27, les séquences adjacentes aux extrémités de SEQ ID NO : 11,13, 15,17, 19, 23,
- 25 et 27 dans ledit acide nucléique étant respectivement différentes de celles qui sont adjacentes aux SEQ ID NO : 11,13, 15, 17,, 19,23, 25 et 27 dans la séquence de la fibronectine humaine, ou son complémentaire. 27. Vecteur d'expression eucaryote ou procaryote comprenant un acide nucléique tel que défini dans l'une des revendications 23 à 26. 28. Cellule eucaryote ou procaryote transformée par un acide nucléique tel que défini dans l'une des revendications 23 à 26.<Desc/Clms Page number 39>29. Anticorps dirigé contre une séquence peptidique telle que définie dans l'une des revendications 1 à 5.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0308816A FR2857598A1 (fr) | 2003-07-18 | 2003-07-18 | Composes anti-angiogeniques, composition pharmaceutique les comprenant, et leur utilisation |
| EP04767718A EP1786835A2 (fr) | 2003-07-18 | 2004-07-16 | Composes anti-angiogeniques, compositions pharmaceutiques les comprenant, et leur utilisation |
| PCT/FR2004/001894 WO2005010047A2 (fr) | 2003-07-18 | 2004-07-16 | Composes anti-angiogeniques, compositions pharmaceutiques les comprenant, et leur utilisation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0308816A FR2857598A1 (fr) | 2003-07-18 | 2003-07-18 | Composes anti-angiogeniques, composition pharmaceutique les comprenant, et leur utilisation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2857598A1 true FR2857598A1 (fr) | 2005-01-21 |
Family
ID=33548260
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR0308816A Pending FR2857598A1 (fr) | 2003-07-18 | 2003-07-18 | Composes anti-angiogeniques, composition pharmaceutique les comprenant, et leur utilisation |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1786835A2 (fr) |
| FR (1) | FR2857598A1 (fr) |
| WO (1) | WO2005010047A2 (fr) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9249794B2 (en) | 2006-01-24 | 2016-02-02 | American Air Liquide, Inc. | Condition-based and predictive maintenance of compressor systems |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0399806A1 (fr) * | 1989-05-26 | 1990-11-28 | Takara Shuzo Co. Ltd. | Dérivé de fibronectine |
| US5770563A (en) * | 1991-12-06 | 1998-06-23 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Heparin- and sulfatide binding peptides from the type I repeats of human thrombospondin and conjugates thereof |
| US6426042B1 (en) * | 1995-11-13 | 2002-07-30 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Methods and kits for improving retroviral-mediated gene transfer utilizing molecules, or mixture thereof, containing retroviral binding domains and target cell binding domains |
| WO2003013590A1 (fr) * | 2001-08-09 | 2003-02-20 | Novartis Forschungsstiftung | Agents anti-tumoraux et methodes d'identification d'agents anti-tumoraux |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2729712B2 (ja) * | 1991-04-23 | 1998-03-18 | 寳酒造株式会社 | 機能性ポリペプチド |
-
2003
- 2003-07-18 FR FR0308816A patent/FR2857598A1/fr active Pending
-
2004
- 2004-07-16 EP EP04767718A patent/EP1786835A2/fr not_active Withdrawn
- 2004-07-16 WO PCT/FR2004/001894 patent/WO2005010047A2/fr not_active Ceased
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0399806A1 (fr) * | 1989-05-26 | 1990-11-28 | Takara Shuzo Co. Ltd. | Dérivé de fibronectine |
| US5770563A (en) * | 1991-12-06 | 1998-06-23 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Heparin- and sulfatide binding peptides from the type I repeats of human thrombospondin and conjugates thereof |
| US6426042B1 (en) * | 1995-11-13 | 2002-07-30 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Methods and kits for improving retroviral-mediated gene transfer utilizing molecules, or mixture thereof, containing retroviral binding domains and target cell binding domains |
| WO2003013590A1 (fr) * | 2001-08-09 | 2003-02-20 | Novartis Forschungsstiftung | Agents anti-tumoraux et methodes d'identification d'agents anti-tumoraux |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| D'AMORE PATRICIA A ET AL: "Tales of the cryptic: unveiling more angiogenesis inhibitors.", TRENDS IN MOLECULAR MEDICINE. ENGLAND JUL 2002, vol. 8, no. 7, July 2002 (2002-07-01), pages 313 - 315, XP002281094, ISSN: 1471-4914 * |
| HANENBERG H ET AL: "COLOCALIZATION OF RETROVIRUS AND TARGET CELLS ON SPECIFIC FIBRONECTIN FRAGMENTS INCREASES GENETIC TRANSDUCTION OF MAMMALIAN CELLS", NATURE MEDICINE, NATURE PUBLISHING, CO, US, vol. 2, no. 8, 1996, pages 876 - 882, XP000916458, ISSN: 1078-8956 * |
| SCHENK SUSANN ET AL: "Tales from the crypt[ic] sites of the extracellular matrix.", TRENDS IN CELL BIOLOGY. ENGLAND JUL 2003, vol. 13, no. 7, July 2003 (2003-07-01), pages 366 - 375, XP002281093, ISSN: 0962-8924 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9249794B2 (en) | 2006-01-24 | 2016-02-02 | American Air Liquide, Inc. | Condition-based and predictive maintenance of compressor systems |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2005010047A2 (fr) | 2005-02-03 |
| EP1786835A2 (fr) | 2007-05-23 |
| WO2005010047A3 (fr) | 2005-04-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20060014444A (ko) | 멜라노코르틴 수용체 4 (ｍｃ4) 작용제 및 그의 용도 | |
| CZ20011608A3 (cs) | Nukleotidové a proteinové sekvence genů Nogo a metody na nich zaloľené | |
| EP3829621A1 (fr) | Hémicanaux modifiés, vésicules modifiées et utilisations associées | |
| US11041157B2 (en) | Slit2D2-HSA fusion protein and use thereof against tumours | |
| CA2934558A1 (fr) | Proteines recombinantes possedant une activite de facteur h | |
| Fliss et al. | Expression cloning and characterization of PREB (prolactin regulatory element binding), a novel WD motif DNA-binding protein with a capacity to regulate prolactin promoter activity | |
| JP3725473B2 (ja) | 新規血管形成阻害剤 | |
| AU2014233219B2 (en) | Methods for treatment of nephrotic syndrome and related conditions | |
| JP4581115B2 (ja) | そう痒性皮膚疾患の治療又は予防剤 | |
| KR20240099216A (ko) | 슈반 세포로의 표적화 전달을 위한 설계자 세포외 소낭 | |
| JP4808623B2 (ja) | 血管形成を減少させるためのクラスｉｉｉのｓｌｒｐのアゴニスト | |
| WO2000021553A2 (fr) | Procede de regulation de l'expression genique | |
| FR2857598A1 (fr) | Composes anti-angiogeniques, composition pharmaceutique les comprenant, et leur utilisation | |
| Hagiwara et al. | RETRACTED: Introduction of antisense oligonucleotides to heat shock protein 47 prevents pulmonary fibrosis in lipopolysaccharide-induced pneumopathy of the rat | |
| CA2279241A1 (fr) | Thioredoxine mammalienne | |
| CN109106943B (zh) | 抗癫痫的毒素Martentoxin及其应用 | |
| WO2005011725A2 (fr) | Agent anti-angiogenique et son utilisation, notamment dans le cadre du traitement des cancers | |
| EP0914426A1 (fr) | Sequences en amont du gene sm22, vecteurs les contenant et leurs utilisations therapeutiques, notamment dans le traitement des maladies vasculaires | |
| EP0750675A1 (fr) | ADENOVIRUS RECOMBINANTS CODANT POUR LE FACTEUR DE CROISSANCE DES FIBROBLASTES ACIDES (aFGF) | |
| EP0686194B1 (fr) | Facteurs de croissance de la famille de l'harp, procede d'obtention et applications | |
| WO1998048824A1 (fr) | Peptides bioactifs derives de proteines de transcription regulees par la cocaine et les amphetamines | |
| EP0750676A1 (fr) | Adenovirus recombinants codant pour le facteur neurotrophique derive du cerveau (bdnf) | |
| WO2016035804A1 (fr) | Agent thérapeutique ou prophylactique contre des maladies de la peau provoquant des démangeaisons | |
| CN118401249A (zh) | 用于治疗疼痛的肽和方法 | |
| WO1992002537A1 (fr) | Procede d'obtention d'un peptide ayant une activite facteur de croissance, produit obtenu et son application comme medicament |