WO2005010047A2 - Composes anti-angiogeniques, compositions pharmaceutiques les comprenant, et leur utilisation - Google Patents

Composes anti-angiogeniques, compositions pharmaceutiques les comprenant, et leur utilisation Download PDF

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Loïc VAN DEN BERGHE
Henrik Laurell
Marc Abitbol
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    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Definitions

  • the present invention relates to proteins having anti-angiogenic activity, the nucleic acids encoding them, as well as pharmaceutical compositions comprising them.
  • Angiogenesis is a process of growth of new blood capillaries from pre-existing vessels. Three particular phenomena are in particular at the base of this process: the proliferation, migration and differentiation (tubulogenesis) of endothelial cells.
  • Angiogenesis is activated by certain growth factors, known as angiogenic factors, such as NEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), FGF-1 (Fibroblast Growth Factor 1, fibroblast growth factor 1) or FGF-2 (Fibroblast Growth Factor 2, fibroblast growth factor 2).
  • NEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • FGF-1 Fibroblast Growth Factor 1, fibroblast growth factor 1
  • FGF-2 Fibroblast Growth Factor 2, fibroblast growth factor 2
  • angiogenesis is also involved in many pathological cases, such as diabetic retinopathy, psoriasis, rheumatoid arthritis, age-related macular degeneration, and cancers.
  • pathological cases such as diabetic retinopathy, psoriasis, rheumatoid arthritis, age-related macular degeneration, and cancers.
  • tumor growth is greatly favored by the appearance within these tumors of a blood neovascularization resulting in particular from the secretion by tumors of angiogenic factors.
  • Many attempts at therapeutic treatments based on the use of anti-angiogenic proteins are in progress.
  • endostatin O'Reilly et al, Cell (1997) 88: 277-285
  • Endostatin is a 20 kDa protein corresponding to a fragment of collagen XNIII.
  • the anti-angiogenic activity of this protein is due to a specific inhibition of endothelial cells.
  • One of the main drawbacks related to the use of these proteins as anti-angiogenic agents lies in the quantities necessary for the treatment of an individual. Thus, it has been estimated that in the case of endostatin up to several grams of recombinant protein should be administered to the patient each day (Cao, Int. J. Biochem. Cell Biol (2001) 33: 357-369). This drawback could be eliminated, for example, by having more potent angiogenesis inhibitors.
  • Fibronectin is a fibrous protein that makes up the extracellular matrix (Hynes (1990) in Fibronectins (Springer, New York)). Some fragments derived from this protein also appear to have anti-angiogenic activity (Yi & Ruoslathi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001) 98: 620-624) and other fragments to inhibit endothelial growth in vitro (Homandberg et al., Am. J. Pathol (1985) 120: 327-332). However, in certain cases it has been possible to show that other fibronectin fragments favor the adhesion of metastatic cells to the extracellular matrix (Mold & Humphries, EMBO J. (1991) 10: 4089-4095).
  • the object of the present invention is to provide compounds having an anti-angiogenic and / or anti-tumor activity which may in certain cases be greater than those of the anti-angiogenic compounds of the prior art.
  • the present invention relates to the use of a peptide sequence comprising or consisting of: - a sequence extending at least from the residues: - 275 to 366 (SEQ ID NO: 4), and / or - 367 to 455 ( SEQ ID NO: 6), and / or - 456 to 531 (SEQ ID NO: 8), of SEQ ID NO: 10, and at most a sequence corresponding to SEQ ID NO: 10, or - a derived sequence sequences defined above by insertion, deletion or mutation of at least one amino acid, provided that said peptide sequence has a binding activity to factor FGF-2, or - a sequence having a homology of at least 85% with one of the sequences defined above, provided that said peptide sequence exhibits factor FGF-2 binding activity
  • SEQ ID NO: 10 corresponds to amino acids 1447 to 1991 of the fibronectin peptide sequence (SEQ ID NO: 2) (reference P02751 from the SwissProt database) encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 4 corresponds to amino acids 1721 to 1812 of fibronectin
  • SEQ ID NO: 6 corresponds to amino acids 1813 to 1901 of fibronectin
  • SEQ ID NO: 8 corresponds to amino acids 1902 to 1977 of fibronectin.
  • the peptide sequences of the invention have the property of binding to factor FGF-2, in particular to factor FGF-2 of molecular weight 18 kDa, and of inhibiting its functioning.
  • the anti-angiogenic activity of the peptide sequences of the invention may be due to the blocking of the action of factor FGF-2, thanks to their bond with the latter.
  • the double hybrid binding test can be carried out according to the general methodology described by Van den Berghe et al. (Mol. Endocrinol (2000) Nov, 14 (11), 1709-1724).
  • a DNA fragment coding for the factor FGF-2 is introduced into the plasmid pAS2 (Clontech, Genebank access number: U30497) and a DNA fragment coding for the peptide sequences whose binding to factor FGF is to be evaluated.
  • -2 is introduced into the plasmid pACT2 (Clontech, Genebank access number: U29899).
  • the two plasmids are then introduced into the strain Y 190 of Saccharomyces cerevisiae (Clontech; Harper et al., Cell, 1993; 75: 805-816; Flick & Johnston, Mol. Cell Biol, 1990; 10 (9): 4757- 4769) whose activity / 3-galactosidase is measured.
  • Saccharomyces cerevisiae Clontech; Harper et al., Cell, 1993; 75: 805-816; Flick & Johnston, Mol. Cell Biol, 1990; 10 (9): 4757- 4769
  • the presence of a / 3-galactosidase activity reflects the existence of a link between said peptide sequence and the factor FGF-2.
  • the ELISA binding test can be performed as follows.
  • the well walls of a standard microtiter plate are coated with FGF-2 factor.
  • the peptide sequences whose binding to factor FGF-2 is to be measured, coupled to a histidine label, are added to the wells in variable concentrations, then a labeled antibody directed against the histidine label is added.
  • the amount of antibody per well is then determined using the marker, which can be an enzyme, a chromophore or a radioactive compound.
  • the quantity of antibodies per well is representative of the bond between said peptide sequences and the factor FGF-2.
  • the term "homology” denotes the percentage of similar amino acids for two peptide sequences aligned amino acid by amino acid, as can be obtained by the implementation of the algorithm defined by Altschul et al, Nucleic Acids Res. (1997) 25: 3389-3402 for example.
  • the term “angiogenesis” designates the phenomenon of the formation of new blood vessels from preexisting vessels. This phenomenon notably allows tumor growth. Angiogenesis is under the dependence of angiogenic factors such as factor FGF-2 for example.
  • the invention also relates to the aforementioned use of a sequence derived from the sequences defined above by insertion, deletion or mutation of at least one amino acid, and / or having a homology of at least 85% with one sequences defined above, provided that said peptide sequence exhibits anti-angiogenic activity and or anti-tumor activity.
  • anti-angiogenic activity denotes an activity of inhibiting angiogenesis.
  • This activity can, for example, be demonstrated in vitro by demonstrating the inhibition of both the multiplication, migration and tubulogenesis of endothelial cells by the peptide sequences of the invention.
  • the measurement of the inhibition of the multiplication of endothelial cells can be carried out by culturing endothelial cells in the presence of the peptide sequence whose activity it is desired to evaluate.
  • the measurement of the inhibition of the migration of endothelial cells can be carried out by carrying out a “wound” on a carpet of endothelial cells and then incubating the cells in the presence of the peptide sequence to be tested. The number of cells that have migrated to the wound is then measured.
  • the measurement of the inhibition of tubulogenesis of endothelial cells can be carried out by measuring the length of tubules formed by endothelial cells cultured on gel in the presence of the peptide sequence to be tested.
  • anti-tumor activity denotes an activity which makes it possible to inhibit tumor growth and / or to induce regression or even the disappearance of tumors. This activity can for example be demonstrated in vivo by measuring the mass of tumors, the development of which has been induced in mice by injection of tumor cells, in the presence and in the absence of administration of peptide sequences of the invention and / or nucleic acids expressing the peptide sequences of the invention.
  • the invention relates in particular to the use as defined above, of a peptide sequence comprising or consisting of: - a sequence extending at least from the residues: - 275 to 366 (SEQ ID NO: 4) , and / or - 367 to 455 (SEQ ID NO: 6), and / or - 456 to 531 (SEQ ID NO: 8), of SEQ ID NO: 10, and a maximum of residues 1 to 542 (SEQ ID NO: 26) of SEQ ID NO: 10, or - of a sequence derived from the sequences defined above by insertion, deletion or mutation of at least one amino acid, provided that said peptide sequence exhibits FGF-2 binding activity, or - a sequence having at least 85% homology with one of the sequences defined above, under provided that said peptide sequence exhibits binding activity to factor FGF-2.
  • SEQ ID NO: 26 corresponds to amino acids 1447 to 1988 of fibronectin.
  • the invention relates in particular to the use as defined above, of a peptide sequence comprising or consisting of: - a sequence extending at least from the residues: - 275 to 366 (SEQ ID NO: 4), and / or - 367 to 455 (SEQ ID NO: 6), and / or - 456 to 531 (SEQ ID NO: 8), of SEQ ID NO: 10, and at most residues 1 to 535 (SEQ ID NO: 12) of SEQ ID NO: 10, or - of a sequence derived from the sequences defined above by insertion, deletion or mutation of at least one amino acid, provided that said peptide sequence exhibits binding activity to factor FGF -2, or - of a sequence having a homology of at least 85% with one of the sequences defined above, provided that said peptide sequence exhibits a binding activity to factor FGF-2.
  • SEQ ID NO: 12 corresponds to amino acids 1447 to 1981 of fibronectin.
  • the invention relates in particular to the use as defined above, of a peptide sequence comprising or consisting of - a sequence extending at least from residues 456 to 531 (SEQ ID NO: 8) of SEQ ID NO : 10, and at most one sequence corresponding to SEQ ID NO: 10, in particular corresponding to SEQ ID NO: 26, and more particularly corresponding to SEQ ID NO: 12, - of a sequence derived from the sequence defined above above by insertion, deletion or mutation of at least one amino acid, provided that said peptide sequence exhibits binding activity to factor FGF-2, or - A sequence having a homology of at least 85% with one of the sequences defined above, provided that said peptide sequence exhibits a binding activity to factor FGF-2.
  • the invention relates in particular to the use as defined above, of a peptide sequence comprising or consisting of: - a sequence extending at least from residues 367 to 531 (SEQ ID NO: 14) of SEQ ID NO: 10, and a maximum of residues 1 to 542 (SEQ ID NO: 26) of SEQ ID NO: 10, or - from a sequence derived from the sequences defined above by insertion, deletion or mutation of at least an amino acid, provided that said peptide sequence exhibits factor FGF-2 binding activity, or - a sequence having at least 85% homology with one of the sequences defined above, provided that said peptide sequence exhibits binding activity to factor FGF-2.
  • SEQ ID NO: 14 corresponds to the amino acids 1813 to 1977 of fibronectin.
  • the invention relates more particularly to the use as defined above, of a peptide sequence comprising or consisting of: - a sequence extending at least from residues 367 to 531 (SEQ ID NO: 14) of SEQ ID NO: 10, and a maximum of residues 1 to 535 (SEQ ID NO: 12) of SEQ ID NO: 10, or - from a sequence derived from the sequences defined above by insertion, deletion or mutation of at least an amino acid, provided that said peptide sequence exhibits binding activity to factor FGF-2, or - of a sequence having at least 85% homology with one of the sequences defined above, provided that said peptide sequence exhibits binding activity to factor FGF-2.
  • the invention relates very particularly to the use as defined above, of a peptide sequence comprising or consisting of: - a sequence extending at least from residues 270 to 531 (SEQ ID NO: 16) of SEQ ID NO: 10, and a maximum of residues 1 to 542 (SEQ ID NO: 26) of SEQ ID NO: 10, or - from a sequence derived from the sequences defined above by insertion, deletion or mutation of at least an amino acid, provided that said peptide sequence exhibits binding activity to factor FGF-2, or - A sequence having a homology of at least 85% with one of the sequences defined above, provided that said peptide sequence exhibits a binding activity to factor FGF-2.
  • SEQ TD NO: 16 corresponds to the amino acids 1716 to 1977 of fibronectin.
  • the invention relates more particularly to the use as defined above, of a peptide sequence comprising or consisting of: - a sequence extending at least from residues 270 to 531 (SEQ ID NO: 16) of SEQ ID NO: 10, and at most residues 1 to 535 (SEQ ID NO: 12) of SEQ ID NO: 10, or - from a sequence derived from the sequences defined above by insertion, deletion or mutation of at at least one amino acid, provided that said peptide sequence exhibits factor FGF-2 binding activity, or - a sequence having at least 85% homology with one of the sequences defined above, subject to that said peptide sequence exhibits binding activity to factor FGF-2.
  • the invention preferably relates to the use as defined above, of a peptide sequence comprising or consisting of: - from SEQ ID NO: 4, or - from SEQ ID NO: 6, or - from SEQ ID NO: 8 , or - of SEQ ID NO: 10, or - of SEQ ID NO: 12, or - of SEQ ID NO: 14, or - of SEQ ID NO: 16, or - of SEQ ID NO: 18, or - of SEQ ID NO: 20, or - of SEQ ID NO: 22, or - of SEQ ID NO: 24, or - of SEQ ID NO: 26, or - of SEQ ID NO: 28, or - of SEQ ID NO: 30.
  • SEQ ID NO: 18 corresponds to the peptide sequence of clone A in the following, it corresponds to amino acids 1 to 531 of SEQ ID NO: 10 and to amino acids 1447 to 1977 of fibronectin.
  • SEQ ID NO: 20 is designated fibstatin (Fib) in the following, it corresponds to amino acids 270 to 535 of SEQ ID NO: 10 and to amino acids 1716 to 1981 of fibronectin.
  • SEQ ID NO: 22 corresponds to amino acids 275 to 455 of SEQ ID NO: 10 and 1721 to 1901 of fibronectin, it corresponds to the peptide sequence of clone C below.
  • SEQ ID NO: 24 corresponds to amino acids 275 to 531 of SEQ ID NO: 10 and 1721 to
  • SEQ ID NO: 28 corresponds to the peptide sequence of clone D below, it corresponds to amino acids 367 to 535 of SEQ ID NO: 10 and 1813 to 1981 of fibronectin.
  • SEQ ID NO: 30 corresponds to the peptide sequence of clone E in the following, it corresponds to amino acids 367 to 545 of SEQ ID NO: 10 and 1813 to 1991 of fibronectin.
  • the use of the peptide sequences SEQ ID NO: 14 and 28 is advantageous, since these sequences have a size smaller than that of SEQ ID NO: 20 and may prove to be more soluble and more stable than the latter.
  • SEQ ID NO: 30 can exert an anti-angiogenic activity following its partial digestion by a protease in vitro or in vivo to generate a protein having an anti-angiogenic activity of SEQ ID NO: 14 or 28 for example.
  • SEQ ID NO: 22 can exert an anti-angiogenic activity following its association with one or more peptide sequences, in vitro or in vivo, to form a protein complex having an organization similar to a protein having an anti-angiogenic activity of SEQ ID NO: 20 or 24 for example.
  • the present invention also relates to the use of a nucleic acid coding for a peptide sequence as defined above, or to its complement, for the preparation of a medicament intended for the prevention or treatment of diseases linked to the angiogenesis, such as cancers, age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, psoriasis, or rheumatoid arthritis.
  • the present invention also relates to the use of a nucleic acid comprising or consisting of a sequence corresponding: - at least to the sequences extending from the nucleotides: - 823 to 1098 (SEQ ID NO: 3), and / or - 1099 to 1365 (SEQ ID NO: 5), and / or - 1366 to 1593 (SEQ ID NO: 7), from SEQ ID NO: 9, and at most to SEQ ID NO: 9, or - to a sequence derived from the sequences defined above by insertion, deletion or mutation of at at least one nucleotide, provided that said nucleic acid codes for a peptide sequence which exhibits binding activity to factor FGF-2, or - to a sequence having at least 75% homology with one of the sequences defined above , provided that said nucleic acid encodes a peptide sequence which exhibits activity of binding to factor FGF-2, or its complement, for the preparation of a medicament intended for the prevention or treatment of diseases linked to angiogenesis, such as than
  • the invention relates to the use of an acid nucleic acid comprising or consisting of a sequence corresponding: - at least to the sequences extending from the nucleotides: - 823 to 1098 (SEQ ID NO: 3), and / or - 1099 to 1365 (SEQ ID NO: 5), and / or - 1366 to 1593 (SEQ ID NO: 7), from SEQ ID NO: 9, and at most to SEQ ID NO: 25, or - to a sequence derived from the sequences defined above or to a homologous sequence.
  • SEQ ID NO: 25 corresponds to the sequence extending from nucleotides 1 to 1626 of the sequence SEQ ID NO: 9 and to the sequence extending from nucleotides 4339 to 5964 of fibonectin.
  • SEQ DD NO: 25 code for SEQ ID NO: 26.
  • the invention relates to the use of a nucleic acid comprising or consisting of a corresponding sequence: - at least to the sequences extending from the nucleotides: - 823 to 1098 (SEQ ID NO: 3), and / or - 1099 to 1365 (SEQ ID NO: 5), and / or - 1366 to 1593 (SEQ ID NO: 7), from SEQ ID NO: 9, and at most to SEQ ID NO: 11, or
  • SEQ ID NO: 11 corresponds to the sequence extending from nucleotides 1 to 1605 of the sequence SEQ ID NO: 9 and to the sequence extending from nucleotides 4339 to 5943 of fibronectin.
  • SEQ ID NO: 11 code for SEQ ID NO: 12.
  • the invention relates to the use of a nucleic acid comprising or consisting of a corresponding sequence:
  • SEQ ID NO: 7 nucleotides 1366 to 1593 (SEQ ID NO: 7) of SEQ ID NO: 9, and at most SEQ ID NO: 9, in particular SEQ ID NO: 25, and more particularly at SEQ ID NO: 11, or
  • the invention relates to the use of a nucleic acid comprising or consisting of a corresponding sequence:
  • SEQ ID NO: 13 code for SEQ ID NO: 14.
  • the invention relates to the use of a nucleic acid comprising or consisting of a corresponding sequence:
  • the invention relates to the use of a nucleic acid comprising or consisting of a corresponding sequence: - at least the sequence extending from nucleotides 808 to 1593 (SEQ ID NO: 15) of SEQ ID NO: 9, and at most SEQ ID NO: 25, or
  • SEQIDNO: 15 code for SEQIDNO: 16.
  • the invention relates to the use of a nucleic acid comprising or consisting of a corresponding sequence:
  • the invention relates to the use of a nucleic acid comprising or consisting of a sequence corresponding: - to SEQ ID NO: 3, or - to SEQIDNO: 5, or - to SEQ ID NO: 7, or - to SEQ ID NO: 9, or - to SEQIDNO: 11, or - to SEQIDNO: 13, or - to SEQIDNO: 15, or - to SEQIDNO: 17, or - to SEQIDNO: 19, or -to SEQIDNO: 21, or -to SEQIDNO: 23, or - to SEQ ID NO: 25, or - to SEQ ID NO: 27, or - to SEQ ID NO: 29, or its complement.
  • SEQ ID NO: 17 corresponds to the sequence extending from nucleotides 4339 to 5931 of fibronectin.
  • SEQ ID NO: 19 corresponds to the sequence extending from nucleotides 5146 to 5943 of fibronectin.
  • SEQ ID NO: 21 corresponds to the sequence extending from nucleotides 5161 to 5703 of fibronectin.
  • SEQ ID NO: 23 corresponds to the sequence extending from nucleotides 5161 to 5931 of fibronectin.
  • SEQ ID NO: 27 corresponds to the sequence extending from nucleotides 5437 to 5943 of fibronectin.
  • SEQ ID NO: 29 corresponds to the sequence extending from nucleotides 5437 to 5973 of fibonectin.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, as active substance, a peptide sequence comprising or consisting of: - a sequence extending at least from the residues: - 275 to 366 (SEQ ID NO: 4), and / or - 367 to 455 (SEQ ID NO: 6), and / or - 456 to 531 (SEQ ID NO: 8), of SEQ ID NO: 10, and at most a sequence corresponding to SEQ ID NO: 10, or - of a sequence derived from the sequences defined above by insertion, deletion or mutation of at least one amino acid, provided that said peptide sequence exhibits a binding activity to factor FGF-2, or - of a sequence having a homology of at least 85% with one of the sequences defined above, provided that said peptide sequence exhibits binding activity to factor FGF-2, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • compositions of the invention can; also include other compounds, in particular proteins, having an anti-angiogenic action, such as endostatin, angiostatin, PF-4, thrombospondin or the prolactin fragment of 16 kDa for example, these proteins are notably defined in Cao Int. J. Biochem. Cell Biol. (2001) 33: 357-369.
  • the pharmaceutical compositions according to the invention are particularly suitable for the administration to a patient of a dose of 15 to 600 mg / m 2 / day of a peptide sequence according to the invention.
  • compositions according to the invention are also suitable for topical, transdermal, intraperitoneal administration.
  • intracranial, intracereboventricular, intracerebral, intravaginal, intrauterine, oral, rectal or parenteral for example, intravenously, intraspinal, subcutaneous or intramuscular.
  • compositions according to the present invention intended for parenteral administration, include aqueous and non-aqueous sterile injection solutions which may contain antioxidants, buffers, bacteriostatic agents and solutes which make the composition isotonic; as well as aqueous and non-aqueous sterile suspensions which may include suspending agents and thickeners.
  • the pharmaceutical composition according to the invention comprises, as active substance, a peptide sequence comprising or consisting of: - a sequence extending at least from the residues: - 275 to 366 (SEQ ID NO: 4), and / or - 367 to 455 (SEQ ID NO: 6), and / or - 456 to 531 (SEQ ID NO: 8), from SEQ ID NO: 10, and at most residues 1 to 542 (SEQ ID NO: 26) of SEQ ID NO: 10, or - from a sequence derived from the sequences defined above or from a homologous sequence.
  • a peptide sequence comprising or consisting of: - a sequence extending at least from the residues: - 275 to 366 (SEQ ID NO: 4), and / or - 367 to 455 (SEQ ID NO: 6), and / or - 456 to 531 (SEQ ID NO: 8), from SEQ ID NO: 10, and at most residues 1 to 542 (SEQ ID NO: 26)
  • the pharmaceutical composition according to the invention comprises, as active substance, a peptide sequence comprising or consisting of: - a sequence extending at least from the residues: - 275 to 366 (SEQ ID NO: 4), and / or - 367 to 455 (SEQ ID NO: 6), and / or - 456 to 531 (SEQ ID NO: 8), from SEQ ID NO: 10, and at most residues 1 to 535 (SEQ ID NO: 12) of SEQ ID NO: 10, or - from a sequence derived from the sequences defined above or from a homologous sequence.
  • a peptide sequence comprising or consisting of: - a sequence extending at least from the residues: - 275 to 366 (SEQ ID NO: 4), and / or - 367 to 455 (SEQ ID NO: 6), and / or - 456 to 531 (SEQ ID NO: 8), from SEQ ID NO: 10, and at most residues 1 to 535 (SEQ ID NO: 12)
  • the pharmaceutical composition comprises, as active substance, a peptide sequence comprising or consisting of: - a sequence extending at least from residues 456 to 531 (SEQ ID NO: 8) of SEQ ID NO: 10, and to the maximum corresponding to SEQ ID NO: 10, in particular to SEQ ID NO: 26, and more particularly at SEQ ID NO: 12, or - from a sequence derived from the sequences defined above or from a homologous sequence.
  • the pharmaceutical composition comprises, as active substance, a peptide sequence comprising or consisting of: - a sequence extending at least from residues 367 to 531 (SEQ ID NO : 14) of SEQ ID NO: 10, and at most residues 1 to 542 (SEQ ID NO: 262) of SEQ ID NO: 10, or - of a sequence derived from the sequences defined above or of a sequence counterpart.
  • the pharmaceutical composition comprises, as active substance, a peptide sequence comprising or consisting of: - a sequence extending at least from residues 367 to 531 (SEQ ID NO : 14) of SEQ ID NO: 10, and at most residues 1 to 535 (SEQ ID NO: 12) of SEQ ID NO: 10, or - of a sequence derived from the sequences defined above or of a sequence counterpart.
  • the pharmaceutical composition comprises, as active substance, a peptide sequence comprising or consisting of: - a sequence extending at least residues 270 to 531 (SEQ ID NO : 16) of SEQ ID NO: 10, and at most residues 1 to 542 (SEQ ID NO: 26), or - of a sequence derived from the sequences defined above or of a homologous sequence.
  • the pharmaceutical composition comprises, as active substance, a peptide sequence comprising or consisting of: - a sequence extending at least residues 270 to 531 (SEQ ID NO : 16) of SEQ ID NO: 10, and a maximum of residues 1 to 535 (SEQ ID NO: 12), or - a sequence derived from the sequences defined above or a homologous sequence.
  • the pharmaceutical composition comprises, as active substance, a peptide sequence comprising or consisting of: - of SEQ ID NO: 4, or - of SEQ ID NO: 6, or - from SEQ ID NO: 8, or - from SEQ ID NO: 10, or - from SEQ ID NO: 12, or - from SEQ ID NO: 14, or - from SEQ ID NO: 16, or - from SEQ ID NO: 18, or - from SEQ ID NO: 20, or - from SEQ ID NO: 22, or - from SEQ ID NO: 24, or - from SEQ ID NO: 26, or - from SEQ ID NO: 28, or - of SEQ ID NO: 30.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, as active substance, a nucleic acid coding for a peptide sequence as defined in the above pharmaceutical compositions, or its complement, in combination with a pharmaceutical vehicle acceptable.
  • a pharmaceutical vehicle acceptable which can be used for nucleic acids in the context of the invention are well known to those skilled in the art.
  • compositions of the invention can also comprise other nucleic acids, having an anti-angiogenic action, either directly or through a protein for which they code, such as endostatin, Fangiostatin, PF-4 , thrombospondin or the prolactin fragment of 16 kDa for example, these proteins are notably defined in Cao Int. J. Biochem. Cell Biol. (2001) 33: 357-
  • the pharmaceutical compositions according to the invention are suitable for the administration of a unit dose of 0.5 to 20 mg of nucleic acid.
  • the administration of the pharmaceutical compositions can in particular be carried out by intramuscular injection then electro transfer according to methodologies well known to the man of Part.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a nucleic acid comprising or consisting of a sequence corresponding: - at least to the sequences extending from the nucleotides: - 823 to 1098 (SEQ ID NO: 3), and / or - 1099 to 1365 (SEQ ID NO: 5), and / or - 1366 to 1593 (SEQ ID NO: 7), from SEQ ID NO: 9, and at most to SEQ ID NO: 9, or - to a sequence derived from the sequences defined above by insertion, deletion or mutation of at least one nucleotide, provided that said nucleic acid encodes a peptide sequence which exhibits binding activity to factor FGF-2, or - to a sequence having homology of at least 75% with one of the sequences defined above, provided that said nucleic acid encodes a peptide sequence which exhibits binding activity to factor FGF-2, or its complement, in combination with a vehicle pharmaceutically acceptable .
  • the pharmaceutical composition according to the invention comprises, as active substance, a nucleic acid comprising or consisting of a sequence corresponding: - at least to the sequences extending from the nucleotides:, - - 823 to 1098 (SEQ ID NO: 3), and / or - 1099 to 1365 (SEQ ID NO: 5), and / or - 1366 to 1593 (SEQ ID NO: 7), from SEQ ID NO: 9, and at most at SEQ ID NO: 25, or - a sequence derived from the sequences defined above or a homologous sequence.
  • a nucleic acid comprising or consisting of a sequence corresponding: - at least to the sequences extending from the nucleotides:, - - 823 to 1098 (SEQ ID NO: 3), and / or - 1099 to 1365 (SEQ ID NO: 5), and / or - 1366 to 1593 (SEQ ID NO: 7), from SEQ ID NO: 9, and at most at SEQ ID NO:
  • the pharmaceutical composition according to the invention comprises, as active substance, a nucleic acid comprising or consisting of a sequence corresponding: - at least to the sequences extending from the nucleotides: - 823 to 1098 (SEQ ID NO: 3), and / or - 1099 to 1365 (SEQ ID NO: 5), and / or - 1366 to 1593 (SEQ ID NO: 7), from SEQ ID NO: 9, and at most at SEQ ID NO: 11, or - to a sequence derived from the sequences defined above or to a homologous sequence.
  • a nucleic acid comprising or consisting of a sequence corresponding: - at least to the sequences extending from the nucleotides: - 823 to 1098 (SEQ ID NO: 3), and / or - 1099 to 1365 (SEQ ID NO: 5), and / or - 1366 to 1593 (SEQ ID NO: 7), from SEQ ID NO: 9, and at most at SEQ ID NO: 11, or -
  • the pharmaceutical composition according to the invention comprises, as active substance, a nucleic acid comprising or consisting of a sequence corresponding: - at least to the sequence extending from nucleotides 1366 to 1593 (SEQ ID NO: 7) from SEQ ID NO: 9, and at most to SEQ ID NO: 9, in particular to SEQ ID NO: 25, and more particularly to SEQ ID NO: 11, or - to a sequence derived from sequences defined above or to a homologous sequence.
  • the pharmaceutical composition according to the invention comprises, as active substance, a nucleic acid comprising or consisting of a sequence corresponding: - at least to the sequence extending from nucleotides 1099 to 1593 (SEQ ID NO: 13) of SEQ ID NO: 9, and at most SEQ ID NO: 25, or - to a sequence derived from the sequences defined above or to a homologous sequence.
  • the pharmaceutical composition according to the invention comprises, as active substance, a nucleic acid comprising or consisting of a sequence corresponding: - at least to the sequence extending from nucleotides 1099 to 1593 (SEQ ID NO: 13) of SEQ ID NO: 9, and at most SEQ ID NO: 11, or - to a sequence derived from the sequences defined above or to a homologous sequence.
  • the pharmaceutical composition according to the invention comprises, as active substance, a nucleic acid comprising or consisting of a sequence corresponding: - at least to the sequence extending from nucleotides 808 to 1593 (SEQ ED NO: 15) from SEQ ID NO: 9, and at most to SEQ ID NO: 25, or - to a sequence derived from the sequences defined above or to a homologous sequence.
  • the pharmaceutical composition according to the invention comprises, as active substance, a nucleic acid comprising or consisting of a sequence corresponding: - at least to the sequence extending from nucleotides 808 to 1593 (SEQ ID NO: 15) of SEQ ID NO: 9, and at most SEQ ID NO: 11, or - to a sequence derived from the sequences defined above or to a homologous sequence.
  • the pharmaceutical composition according to the invention comprises, as active substance, a nucleic acid comprising or consisting of a sequence corresponding: - to SEQ ID NO: 3, or - to SEQ ID NO: 5, or - to SEQ ID NO: 7, or - to SEQ ID NO: 9, or - to SEQ ID NO: 11, or - to SEQ H) NO: 13, or - to SEQ ID NO: 15, or - to SEQ ID NO: 17, or - to SEQ ID NO: 19, or - to SEQ ID NO: 21, or - to SEQ ID NO: 23, or - to SEQ ID NO: 25, or - to SEQ ID NO: 27, or - to SEQ ID NO: 29, or its complement.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition as defined above, comprising as active substance a eukaryotic expression vector comprising a nucleic acid as defined in the above pharmaceutical compositions, or its complement , in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the expression vectors according to the invention can also comprise, in addition, nucleic acids coding for peptide sequences also having activity anti-angiogenic, such as endostatin or angiostatin or PF 4 or the prolactin fragment of 16 kDa for example
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, as active substance, a eukaryotic or prokaryotic cell transformed with a nucleic acid as defined in the above compositions, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • Cells capable of being transformed include in particular E. coli, HeLa,
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, as active substance, an anti-idiotypic antibody directed against the paratope of an antibody directed against a peptide sequence as defined in one of the uses above, in association with a pharmaceutical vehicle acceptable.
  • the paratope designates the part of an antibody responsible for its interaction with an epitope of an antigen recognized by said antibody.
  • An anti-idotypic antibody according to the invention can be prepared according to methods well known to humans, including by injection of an antibody directed against a peptide sequence according to the invention into an animal, such as a rabbit or a mouse for example.
  • the anti-idiotypic antibody according to the invention has binding properties to FGF-2.
  • the anti-idiotypic antibody of the invention can be humanized, by methods well known to humans. Fragments of this antibody can also be used in the pharmaceutical compositions of the invention, 1 such as scFv, Fab or F (ab) ' 2 fragments well known to humans.
  • the present invention also relates to a peptide sequence comprising or consisting of: - a sequence extending at least from residues 367 to 531 (S ⁇ Q LD NO: 14) of S ⁇ Q ID NO: 10 and at most from residues 1 to 542 ( S ⁇ Q BD NO: 26) of S ⁇ Q ID NO: 10, the sequences adjacent to the ends of S ⁇ Q ID NO: 26 in the total sequence of said peptide sequence being different from those which are adjacent to S ⁇ Q ID NO: 12 in the sequence of human fibonectin, or - a sequence derived from the sequences defined above by insertion, deletion or mutation of at least one amino acid, provided that said peptide sequence has a binding activity to factor FGF-2, or - a sequence having homology of at least 85% with one of the sequences defined above, provided that said peptide sequence exhibits binding activity to factor FGF-2.
  • the present invention relates in particular to a peptide sequence comprising or consisting of: - a sequence extending at least from residues 367 to 531 (SEQ ID NO: 14) of SEQ ID NO: 10 and at most from residues 1 to 535 (SEQ ID NO: 12) of SEQ ED NO: 10, the sequences adjacent to the ends of SEQ ID NO: 12 in the total sequence of said peptide sequence being different from those which are adjacent to SEQ ID NO: 12 in the sequence of human fibonectin, or - a sequence derived from the sequences defined above by insertion, deletion or mutation of at least one amino acid, provided that said peptide sequence exhibits binding activity to factor FGF-2, or - of a sequence having at least 85% homology with one of the sequences defined above, provided that said peptide sequence exhibits a binding activity to factor FGF-2.
  • the present invention also relates to a peptide sequence comprising or consisting of: - a sequence extending at least from residues 270 to 531 (SEQ ID NO: 16) of SEQ ID NO: 10 and at most from residues 1 to 535 ( SEQ ID NO: 12) of SEQ ED NO: 10, the sequences adjacent to the ends of SEQ ID NO: 12 in the total sequence of said peptide sequence being different from those which are adjacent to SEQ ID NO: 12 in the sequence of human fibonectin, or - a sequence derived from the sequences defined above by insertion, deletion or mutation of at least one amino acid, provided that said peptide sequence exhibits binding activity to factor FGF-2, or - d a sequence having at least 85% homology with one of the sequences defined above, provided that said peptide sequence exhibits a binding activity to factor FGF-2.
  • the invention relates in particular to a peptide sequence as defined above, comprising or consisting of: - from SEQ ID NO: 12, or - from SEQ ED NO: 14, or - from SEQ ID NO: 16, or - from SEQ ID NO: 18, or - of SEQ ID NO: 20, or - of SEQ ID NO: 24, or - of SEQ ID NO: 26, or - of SEQ ED NO: 28, the sequences adjacent to the ends of SEQ ID NO : 12, 14, 16, 18, 20, 24, 26 and
  • the present invention also relates to a nucleic acid, comprising or consisting of a sequence coding for one of the peptide sequence as defined above, or its complement.
  • the invention also relates to a nucleic acid hybridizing to a nucleic acid as defined above, or to its complement, under the following hybridization conditions: 0.75 M NaCl, 0.75 mM sodium citrate, 60 ° C.
  • the present invention also relates to a nucleic acid comprising or consisting of a sequence corresponding: - at least to the sequence extending from nucleotides 1099 to 1593 (SEQ ID NO: 13) of SEQ ED NO: 9 and at most to the sequencer SEQ ID NO: 25, the sequences adjacent to the ends of SEQ ID NO: 25 in said nucleic acid being different from those which are adjacent to SEQ ID NO: 11 in the sequence of human fibonectin, or - to a sequence derived from sequences defined above by insertion, deletion or mutation of at least one nucleotide, provided that said nucleic acid encodes a peptide sequence which exhibits binding activity to factor FGF-2, or - to a sequence having homology of at least 75% with one of the sequences defined above, provided that said nucleic acid encodes a peptide sequence which exhibits binding activity to factor FGF-2, or its complement.
  • the present invention also relates to a nucleic acid comprising or consisting of a sequence corresponding: - at least to the sequence extending from nucleotides 1099 to 1593 (SEQ ID NO: 13) of SEQ ID NO: 9 and at most to the sequence SEQ ID NO: 11, the sequences adjacent to the ends of SEQ ID NO: 11 in said nucleic acid being different from those which are adjacent to SEQ ID NO: 11 in the sequence of human fibonectin, or - to a sequence derived from sequences defined above by insertion, deletion or mutation of at least one nucleotide, provided that said nucleic acid encodes a peptide sequence which exhibits binding activity to factor FGF-2, or - to a sequence having homology of at least 75% with one of the sequences defined above, provided that said nucleic acid encodes a peptide sequence which exhibits binding activity to factor FGF-2, or its complement area.
  • the present invention also relates to a nucleic acid comprising or consisting of a sequence corresponding: - at least to the sequence extending from nucleotides 808 to 1593 (SEQ ID NO: 15) of SEQ ED NO: 9 and at most to the sequence SEQ ID NO: 11, the sequences adjacent to the ends of SEQ ID NO: 11 in said nucleic acid being different from those which are adjacent to SEQ ID NO: 11 in the sequence of human fibonectin, or - to a sequence derived from sequences defined above by insertion, deletion or mutation of at least one nucleotide, provided that said nucleic acid encodes a peptide sequence which exhibits binding activity to factor FGF-2, or - to a sequence having homology of at least 75% with one of the sequences defined above, provided that said nucleic acid encodes a peptide sequence which exhibits binding activity to factor FGF-2, or its complementa ire.
  • the invention relates more particularly to a nucleic acid as defined above, comprising or consisting of a sequence corresponding: - to SEQ ID NO: 11, or - to SEQ ID NO: 13, or - to SEQ ID NO: 15, or - to SEQ ID NO: 17, or - to SEQ ID NO: 19, or - to SEQ ID NO: 23, or - to SEQ ID NO: 25, or - at SEQ ID NO: 27, the sequences adjacent to the ends of SEQ ID NO: 11, 13, 15, 17, 19, 23, 25 and 27 in said nucleic acid being respectively different from those which are adjacent to SEQ ID NO: 11, 13, 15, 17, 19, 23, 25 and 27 in the sequence of human fibonectin, or its complement.
  • the invention relates in particular to a eukaryotic or prokaryotic expression vector comprising a nucleic acid as defined above.
  • the present invention relates to a eukaryotic or prokaryotic cell transformed with a nucleic acid as defined in the compositions described above.
  • the invention also relates to an antico ⁇ s directed against a peptide sequence as defined in one of the uses above.
  • This antico ⁇ s can in particular be prepared according to methods well known to humans, by injecting the peptide sequences according to the invention into animals such as horses, rabbits, rats or mice and extracting the serum from said animals.
  • Such an antico ⁇ s is in particular useful for the manufacture of kits making it possible to assay the peptide sequences according to the invention, for example in fluids or natural tissues, such as blood, serum, plasma or extracts of muscles for example
  • the assay can for example be carried out according to the ELIS A method.
  • the invention also relates to fragments of Pantico ⁇ s above, such as Fab, F (ab) ' 2 or scFv fragments for example.
  • the invention also relates to an anti-idiotypic antico ⁇ s directed against the paratope of the antico ⁇ s defined above. DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 represents the results of an ELISA test measuring the interaction established between the factor FGF-2 fixed on the walls of the wells of a microtitration plate and fibstatin, the presence of fibstatin being revealed by an antico ⁇ s labeled with horseradish peroxidase.
  • the ordinate axis represents the optical density at 490 nm.
  • the abscissa axis represents the fibstatin concentration (in ⁇ g / ml).
  • FIG. 2 represents the effect of conditioned medium diluted 3/4 (black column) or 1/2 (white column) containing fibstatin (Fib) or endostatin (Endo) on the growth of endothelial cells in culture, by comparison with control endothelial cells (hatched column).
  • the ordinate axis represents the percentage of growth relative to the growth of the control cells.
  • Figure 3 shows the effect of recombinant fibstatin (black columns) or recombinant endostatin (white columns) on the growth of endothelial cells in culture.
  • the ordinate axis represents the percentage of growth inhibition relative to the growth of control cells, the abscissa axis represents the concentration of recombinant protein (in ⁇ g / ml).
  • Figure 4 shows the effect of fibstatin (white column) on the growth of non-endothelial B16 and NIH-3T3 cells compared to a control (black column).
  • the ordinate axis represents the percentage of cell growth.
  • Figure 5 shows the effect of fibstatin on cell migration of endothelial cells. The effect of fibstatin and FGF-2 is compared to the effect of FGF-2 alone. The ordinate axis represents the number of cells that have migrated.
  • Figure 6A, Figure 6B, Figure 6C and Figure 6D
  • Figures 6 A, B, C and D show the effect of fibstatin on cell differentiation into tubules of endothelial cells.
  • Figure 6A is a photograph representing endothelial cells (black dots) cultured in MatriGel TM (Becton and Dickinson, Bedford, MA) in the absence of FGF-2 and fibstatin.
  • Figure 6B is a photograph representing endothelial cells (black lines) cultivated in MatriGel TM in the presence of FGF-2 and in the absence of fibstatin.
  • Figure 6C is a photograph representing endothelial cells (black dots) cultured in MatriGel TM in the presence of FGF-2 and fibstatin.
  • FIG. 6D represents the sizes of the tubules formed from endothelial cells cultivated in the absence of FGF-2 and fibstatin (left column), in the presence of FGF-2 and in the absence of fibstatin (middle column) and in the presence of FGF-2 and fibstatin (right column).
  • the ordinate axis represents the size of the tubules (in arbitrary units).
  • Figure 7 shows the effect of fibstatin on the migration of endothelial cells in vivo.
  • the number of endothelial cells (x 10 "4 ) having colonized 100 mg of MatriGel TM is represented on the ordinate, according to the addition to the gel of FGF-2 (black column), FGF-2 and fibstatin (column hatched) and FGF-2 and endostatin (white column).
  • Figure 8 shows the diagram of the plasmid pSCT-Fib.
  • the restriction sites are represented with their location in kb.
  • Amp represents the ampicillin resistance gene
  • CMV represents the cytomegalovirus promoter
  • pT7 represents the phage T7 promoter
  • PS represents the sequence coding for the signal peptide of VEGF
  • HA represents the sequence coding for an epitope derived from hemaglutinin A
  • Fib His represents the coding sequence of fibstatin fused with a hexahistidine tag
  • IVS2- ⁇ represents the intron of rabbit ⁇ -globin
  • Ori SV40 represents the origin of replication of the SV40 virus and ORI represents an origin of bacterial replication.
  • FIG. 9A represents the activity / 3-galactosidase (on the ordinate, arbitrary units) expressed by a plasmid co-injected into a mouse muscle with a plasmid coding for the fibstatin (hatched column), endostatin (white column) or a control plasmid (black column).
  • Figure 9B represents the serum endostatin concentration (ordinate, ng / ml) for a control mouse (black column) or having received an injection of plasmid coding for endostatin (white column).
  • Figure 10 shows the effect of fibstatin on tumor growth.
  • the mass of B16 melanoma tumors (ordinate, mg) was measured for mice having received an injection of B16 cells and having been treated with the injection of a control plasmid (black column), or of a plasmid coding for the fibstatin (hatched column) or endostatin (white column).
  • Figure 11 represents the quantity of ⁇ -galactosidase activity (as a percentage of the activity measured for fibstatin) (abscissa axis) resulting from the double hybrid association of fibronectin and FGF-2 factor fragments .
  • Figure 12A and Figure 12B Figure 12A shows sections of tumors marked with an anti-CD31 antibody for a control mouse (top, right and left), a mouse treated with endostatin (in the middle, right and left) and a mouse treated with fibstatin (bottom, right and left).
  • the white arrows represent segments, branches and lights of blood vessels.
  • Figure 12B represents the percentage of blood vessels marked with an anti-CD31 antibody for a control mouse (hatched column), a mouse treated with endostatin (white column) and a mouse treated with fibstatin (black column).
  • the double-hybrid cloning and expression system was carried out as described by Van den Berghe et al. Mol. Endocrinol (2000) Nov, 14 (11), 1709-1724. Briefly, the 18 kDa form of factor FGF-2 was used as bait, and the corresponding cDNA was inserted into the vector ⁇ AS2 (Clontech).
  • a human placenta bank (Clontech, Palo Alto, CA) cloned into the vector pACT2 (Clontech) was screened in strain Y 190 (Clontech) of Saccharomyces cerevisiae.
  • fragment A One of the cloned fragments, fragment A, has a size; of 1593 base pairs and codes for a fibronectin fragment of 531 amino acids while fragment B of 798 base pairs codes for a fragment of 266 amino acids, which has been named fibstatin (Fib).
  • Fb fibstatin
  • fragments derived from clone B were generated by PCR, cloned in the plasmid pACT2 and tested in double hybrid as described above. These fragments are as follows: a fragment from a clone C corresponding to residues 1721 to 1901 of fibronectin, a fragment from a clone D corresponding to residues 1813 to 1981 of fibronectin, a fragment from a clone E corresponding to residues 1813 to 1991 of fibronectin, a fragment from a clone F corresponding to residues 1721 to 1812 from fibronectin a fragment from a clone G corresponding to residues 1812 to 1901 from fibronectin a fragment from a clone H corresponding to residues 1902 to 1981 from fibronectin.
  • the fibstatin subfragment D therefore appears to carry the FGF-2 binding activity. Furthermore, it is conceivable that in vivo the fragment E has; a binding activity to FGF-2 following a proteolytic cleavage, on the contrary it also seems possible that the fragments C, F and G can associate with another protein fragment to reconstitute an active fragment.
  • FGF-2 In order to verify the specific interaction of FGF-2 with fibstatin, the interaction of this fragment with other members of the FGF family: FGF-1, FGF-3 and FGF-6, was tested in double hybrid.
  • FGF-1, FGF-3 and FGF-6 the cDNAs coding for different members of the FGF family and fibstatin were fused to the DNA binding domain (DB) or to the activation domain (AD) of Gal4 and co-transfected in yeast. Intensities interactions evaluated by measuring the ⁇ -galactosidase activity revealed that fibstatin interacted specifically with FGF-2.
  • the fibstatin coding sequence was amplified by PCR from the plasmid pACT2 containing the fibstatin cDNA isolated by the double-hybrid screening.
  • the sense primer was 5'-AAACTCGAGACCATGGGAACCCAGTCCACAGCT-3 '(SEQ ED NO: 31) and the antisense primer 5'-AAAGGATCCTTACTTCAGGGCAATGACATA-3' (SEQ ID NO: 32).
  • Endo was amplified by RT-PCR from RNA from NIH-3T3 cells.
  • the sense primer was 5'-AAACCATGGGAATTCATACTCATCAGGAC TTTCAGCC-3 '(SEQ ID NO: 33) and the antisense primer 5'-GGATCCTTAC TATTTGGAGAAAGAGGTCATGAAGC-3' (SEQ ID NO: 34).
  • the coding sequences of fibstatin and endostatin were then inserted into the plasmid pET-15b (Novagen) in phase with the histidine tag for the production of recombinant proteins in Escherichia coli, to give the plasmids pET-Fib and pET -Endo.
  • the fibstatin and endostatin cDNAs have also been cloned into the eukaryotic expression vectors, pUHD10-3 (Grossen & Bujard, 1992, PNAS (1992) June 15; 89 (12) 5547-5551) to form pUHD -Fib and pUHD-Endo, and pSCT (Prats, 1992, Mol. Cell. Biol (1992) October; 12 (10) 4796-4805), to form pSCT-Fib ( Figure 8 and pSCT-Endo, in phase with signal peptide of VEGF-A (Huez et al, 2001, Mol. Endocrinol.
  • Pepitope HA hemagglutinin epitope
  • E. coli BL21 bacteria were transformed with the plasmids p ⁇ T-Fib, p ⁇ T- ⁇ ndo or a control plasmid allowing the expression of GST (Glutathione S Transferase) fused to the 6 histidines. 100 ml of bacterial culture overnight was then diluted in one liter of LB medium (Luria-Bertani). The expression of the proteins was induced at an OD 6 oo n m of 0.6-0.8 by addition of ⁇ PTG (isopropyl- / 3-D-thiogalactopyranoside) at the concentration of 0.5 mM.
  • ⁇ PTG isopropyl- / 3-D-thiogalactopyranoside
  • the bacteria were recovered by centrifugation for 10 min at 5000 rpm.
  • the bacterial pellet was then lysed by resuspension in 30 ml of buffer A (20 mM Tris pH 7.4, 0.5 M NaCl, 6 M guanidinium chloride, 4 mM octyglucoside, 10 mM imidazole).
  • the suspension of bacteria was sonicated and then centrifuged at 13,000 rpm for 30 min. The supernatant obtained was incubated with 0.75 ml of nickel-agarose beads previously equilibrated in buffer A.
  • the beads were washed successively with 50 ml of Buffer B (Tris 20 mM pH 7.4, 2 M NaCl, urea 6 M, imidazole 20 mM) then with 100 ml of Buffer C (Tris 20 mM pH 7.4, 0.15 M NaCl, imidazole 20 mM). After the last wash, the beads were placed on a Polyprep chromatography column (Biorad) and eluted with fractions of 500 ⁇ l of Buffer C containing 200 mM imidazole. The presence of protein was verified by assay of Bradford (BioRad 500-0114, California) and SDS-PAG ⁇ followed by staining with Coomassie blue.
  • the cDNAs coding for fibstatin and endostatin fused with 6 histidines were cloned into a vector allowing their expression and their secretion by the Baculovirus system.
  • the proteins secreted in the culture medium of insect cells, devoid of serum, were purified by successive precipitation with ammonium sulphate (20, 50 then 80%). The majority of the recombinant proteins being in the 50% fraction, this was dialyzed in PBS at 4 ° C. and the proteins were purified on a column of nickel agarose. After several washes with PBS + 20 mM imidazole, the proteins were eluted with PBS + 200 mM imidazole. The presence of protein is verified by assay of Bradford and SDS-PAG ⁇ followed by staining with Coomassie blue. 3. Interaction of fibstatin with factor FGF-2
  • a 96-well plate was lined overnight at 4 ° C. with FGF-2 or SAB (Bovine Albumin Serum) at 10 ⁇ g / ml. The plate was rinsed with 0.2% PBS-tween and 100 ⁇ l of blocking solution were added per well for 1 h at 37 ° C. The blocking solution was drained and the plate rinsed. Varying concentrations of fibstatin with a histidine tag were added for 2 h at 37 ° C. After three rinses, antico ⁇ s directed against the histidine label conjugated to horseradish peroxidase (1/1000) were added for 1 h at 37 ° C.
  • FGF-2 or SAB Bovine Albumin Serum
  • the cells were cultured in DMEM supplemented with glutamine (1%), amphotericin B (1%), gentamicin (0.5%) and by 10% SVF or 10% SV (Newborn Calf Serum) for HeLa cells. (ATCC number: CCL2) and ABAE respectively (Couderc, 1991, Cell. Regul, vol 2, pages 709-718).
  • ABAE cells were also cultured in the presence of 1 ng / ml of FGF-2.
  • B16 cells (ATCC CRL6475) were cultured in RPMI (Roswell Park Memorial Institute) supplemented with glutamine (1%), amphotericin B (1%), gentamicin (0.5%) and in 10% SV. The cells were cultivated in ovens at 5% CO 2 for HeLa and B16 cells and 10% CO 2 for ABAE.
  • the ABAE cells were seeded with 5 ⁇ 10 4 cells / ml of medium. The following day the medium was changed and the cells were incubated in the presence of conditioned medium prepared according to paragraph 2a and diluted to 1/4 or 1/2 in the presence of 0.5 ng / ml of FGF-2. 72 hours later, the cells were trypsinized and counted.
  • the results obtained shown in Figure 2 show that the presence of Fib in the medium inhibits the proliferation of ABAE in a manner comparable to that of endostatin. Similar experiments were carried out with recombinant fibstatin prepared in
  • FGF-2 (0.5 ng / ml) with or without fibstatin (1 ⁇ g / ml) was added to the wells and the plates were incubated overnight at 37 ° C. After removal of the medium, the culture was fixed and the length of the tubule network was measured using the Q Win system from Leica (Leica microsystem, Rueil-Malmaison, France). The results presented in FIGS. 6A, B, C and D reveal that the addition of 1 ⁇ g of Fib inhibits the formation of the tubules. The absence of toxicity under these conditions was verified by measuring LDH (Lactate dehydrogenase) released into the culture medium using the CytoTox 96 Kit (Promega).
  • LDH Lacate dehydrogenase
  • Three-dimensional collagen gel was prepared by mixing 7.5 volumes of a type I collagen solution of rat tail tendons (2 mg / ml, Sigma) with a volume of minimum essential medium 10X (Gibco), 1 , 5 volumes of sodium bicarbonate (15.6 mg / ml) and 0.1 volume of 1M NaOH, on ice. 400 ⁇ l of this mixture were distributed in 18 mm cell culture wells and were left to form a gel at 37 ° C. for 30 min. BAE or ACE cells were then seeded on the collagen gels at 1.0x10 5 cells / well in 500 ⁇ l of DMEM F12 supplemented with 10% newborn calf serum and were left to grow until confluence (2 at 3 days).
  • the serum concentration was reduced to 2% and the cells were treated with FGF-1 (20 ng / ml) + heparin (500 ng / ml), FGF-2 (20 ng / ml), or VEGF (20 ng / ml), or were not treated (controls), in the presence or absence of fibstatin or endostatin.
  • the media and the treatments were renewed after 2 and 4 days.
  • the cells were photographed after 4 to 7 days.
  • mice 6 to 10 weeks old were kept in stainless steel cages in groups of 5, at controlled temperature with 12 hour day-night cycles, and fed with standard laboratory food. All procedures were performed according to the recommendations of VEuropean Accrgregation of Laboratory Animal Care. 2. Inhibition of angiogenesis in vivo
  • MatriGel TM 300 ⁇ l of MatriGel TM supplemented with 100 ng of FGF-2 in the presence or absence of 10 ⁇ g of fibstatin or endostatin (prepared in insect cells), were injected subcutaneously into female mice C57B1 / 6 . 1 week later, the MatriGel TM implants were recovered, dissolved by MatriSperse (Beckton and Dickinson) and the endothelial cells counted at the Malassez cell.
  • Fibstatin inhibits angiogenesis induced by FGF-2 by 50%, this effect is greater than that induced by endostatin.
  • the plasmid expressing it was electrotransferred in vivo to mice carrying B16 melanomas.
  • mice Female C57B1 / 6 mice anesthetized by intraperitoneal injection of ketamine (150 mg / kg) received a subcutaneous injection of 10 6 B16 tumor cells in 100 ⁇ l of PBS (incubation time: approximately 10 minutes before injection of the plasmids ).
  • 50 ⁇ g of plasmid (5 ⁇ g of LacZ plasmid + 45 ⁇ g of pSCT Fib ( Figure 8), pSCT Endo or pSCT) prepared using the Maxiprep Endofree kit (Qiagen, France) and diluted in 50 ⁇ l of PBS were injected into the quadriceps of mice with a 26G 0.45x10 syringe.
  • the injected plasmids were then immediately electro transferred by two electrodes of 10 mm in diameter, separated by 4 mm, in contact with the skin using an ElectroSquare Porator ECM830 device (BTX, Genetronics, San Diego, CA) by 8 pulses of 20 ms at 80V.
  • the efficiency of electroporation was favored by the use of an ultrasound gel applied to the paw.
  • the injection followed by the electrotransfer of the plasmids was restarted 5 days later. 10 days after the first injection, the tumors and electro transferred muscles were recovered and weighed. The muscles were then lysed in 350 ⁇ l of ⁇ -Gal lysis buffer (Tropix) and homogenized using an ultra-turax (Polylabo).
  • the suspension was centrifuged at 13,000 rpm for 10 min.
  • the assay for ⁇ -galactosidase activity was then carried out on 20 ⁇ l of supernatant using the Galacto Light TM kit (Tropix).
  • the mouse serum was also recovered using Capiject tubes (Terumo) containing a silica gel facilitating the recovery of the serum.
  • the circulating endostatin was assayed using the Mouse Endostatin Accucyte ELISA kit (Cytimmune).
  • mice having received an injection of the plasmid pSCT-Fib have a tumor mass reduced by half compared to the mice injected with the control plasmid.
  • the mice having received an injection of the plasmid pSCT-Endo also exhibit a decrease in their tumor mass but statistically insignificant (FIG. 10). The results were obtained using 14 mice per group.
  • tumor capillaries were examined by anti-CD31 immunostaining. Briefly, the density of the tumor microvessels was analyzed on frozen sections (5 ⁇ m) of B16 melanomas using an anti-mouse CD31 rat monoclonal antibody (Pharmingen, San Diego, CA). After fixing in paraformaldehyde for 1 h at 4 ° C., the sections were washed 3 times with PBS and were permeabilized using a PBS-0.25% Triton X100-3% SAB mixture for one hour.
  • FIG. 12A representative sections of mouse tumors treated with fibstatin and endostatin show a significant decrease in labeling of CD31, in comparison to sections of control mouse tumors. Quantification of microvessels at 200-fold magnification indicates that the CD31 labeling positive surface in tumors of control mice was 2.2% ⁇ 0.58 (mean ⁇ standard deviation), compared to 0.74% ⁇ 0.58 and 0.94% ⁇ 0.58 for tumors treated with fibstatin and endostatin respectively (Figure 12BV Together, these results demonstrate that the transfer of the fibstatin gene inhibits the angiogenic response in vivo.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée d'une séquence s'étendant au minimum des résidus : - 275 à 366 (SEQ ID NO : 4), et/ou - 367 à 455 (SEQ ID NO : 6), et/ou - 456 à 531 (SEQ ID NO : 8), de SEQ ID NO : 10, et au maximum à une séquence correspondant à SEQ ID NO : 10, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de maladies liées à l'angiogenèse, telles que les cancers, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, la rétinopathie diabétique, le psoriasis, ou l'arthrite rhumatoïde.

Description

COMPOSES ANTI-ANGIOGENIQUES, COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES LES COMPRENANT, ET LEUR UTILISATION
La présente invention concerne des protéines ayant une activité anti-angiogénique, les acides nucléiques les codant, ainsi que les compositions pharmaceutiques les comprenant. L'angiogenèse est un processus de croissance de nouveaux capillaires sanguins à partir de vaisseaux préexistants. Trois phénomènes particuliers sont notamment à la base de ce processus : la prolifération, la migration et la différenciation (la tubulogenèse) des cellules endothéliales. L'angiogenèse est activée par certains facteurs de croissances, dits facteurs angiogéniques, tels que le NEGF (Vascular Endothelial Growth Factor, facteur de croissance endothelial vasculaire), le FGF-1 (Fibroblast Growth Factor 1, facteur de croissance des fibroblastes 1) ou le FGF-2 (Fibroblast Growth Factor 2, facteur de croissance des fibroblastes 2). En temps normal, l'angiogenèse est essentiellement restreinte au système reproducteur femelle et à la cicatrisation des plaies. Cependant, l'angiogenèse est également impliquée dans de nombreux cas pathologiques, tels que la rétinopathie diabétique, le psoriasis, l' arthrite rhumatoïde, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, et les cancers. En effet, dans ce dernier cas il a été montré que la croissance tumorale était grandement favorisée par l'apparition au sein de ces tumeurs d'une néo-vascularisation sanguine résultant en particulier de la sécrétion par les tumeurs de facteurs angiogéniques. De nombreuses tentatives de traitements thérapeutiques basées sur l'utilisation de protéines anti-angiogéniques sont en cours. Parmi ces composés, l'un des plus prometteur est l'endostatine (O'Reilly et al, Cell (1997) 88:277-285), qui est actuellement en essais cliniques de phase I (Herbst et al, J. Clin. Oncol (2002) 20:3804- 814). L'endostatine est une protéine de 20 kDa correspondant à un fragment du collagène XNIII. L'activité anti- angiogénique de cette protéine est due à une inhibition spécifique des cellules endothéliales. Un des principaux inconvénients lié à l'utilisation de ces protéines en tant qu'anti- angiogéniques réside dans les quantités nécessaires au traitement d'un individu. Ainsi, il a été estimé que dans le cas de l'endostatine jusqu'à plusieurs grammes de protéine recombinante devaient être administrés au patient chaque jour (Cao, Int. J. Biochem. Cell Biol (2001) 33:357-369). Cet inconvénient pourrait être aboli par exemple en disposant d'inhibiteurs de l'angiogenèse plus puissants. La fibronectine est une protéine fibreuse constitutive de la matrice extracellulaire (Hynes (1990) in Fibronectins (Springer, New York)). Certains fragments dérivés de cette protéine semblent également avoir une activité anti-angiogénique (Yi & Ruoslathi, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2001) 98:620-624) et d'autres fragments une activité d'inhibition de la croissance endothéliale in vitro (Homandberg et al., Am. J. Pathol (1985) 120:327-332). Toutefois, dans certains cas il a pu être montré que d'autres fragments de fîbronectine favorisaient l'adhésion de cellules métastasiques à la matrice extracellulaire (Mould & Humphries, EMBO J. (1991) 10:4089-4095). Par ailleurs, ces fragments ne sont pas en essais cliniques. La présente invention a pour objet de fournir des composés ayant une activité anti- angiogénique et/ou anti-tumorale pouvant être dans certains cas supérieure à celles des composés anti-angiogéniques de l'art antérieur. La présente invention concerne l'utilisation d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s 'étendant au minimum des résidus : - 275 à 366 (SEQ ID NO : 4), et/ou - 367 à 455 (SEQ ID NO : 6), et/ou - 456 à 531 (SEQ ID NO : 8), de SEQ ID NO : 10, et au maximum à une séquence correspondant à SEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de maladies liées à l'angiogenèse, telles que les cancers, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, la rétinopathie diabétique, le psoriasis, ou l'arthrite rhumatoïde. SEQ ID NO : 10 correspond aux acides aminés 1447 à 1991 de la séquence peptidique de la fîbronectine (SEQ ID NO : 2) (référence P02751 de la base de données SwissProt) codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1. SEQ ID NO : 4 correspond aux acides aminés 1721 à 1812 de la fîbronectine, SEQ ID NO : 6 correspond aux acides aminés 1813 à 1901 de la fîbronectine, et SEQ ID NO : 8 correspond aux acides aminés 1902 à 1977 de la fîbronectine. Avantageusement les séquences peptidiques de l'invention possèdent la propriété de se lier au facteur FGF-2, notamment au facteur FGF-2 de poids moléculaire 18 kDa, et d'inhiber son fonctionnement. Avantageusement, l'activité anti-angiogénique des séquences peptidiques de l'invention peut être due au blocage de l'action du facteur FGF-2, grâce à leur liaison avec ce dernier.
Plusieurs tests permettant de mesurer la liaison des séquences peptidiques de l'invention au facteur FGF-2 sont décrits dans les exemples suivants, ils font notamment appel à des méthodes bien connues de l'homme de l'art tels que le double hybride ou l'ELISA. Le test de liaison en double hybride peut être réalisé selon la méthodologie générale décrite par Van den Berghe et al. (Mol. Endocrinol (2000) Nov, 14(11), 1709-1724). Un fragment d'ADN codant pour le facteur FGF-2 est introduit dans le plasmide pAS2 (Clontech, numéro d'accès à Genebank : U30497) et un fragment d'ADN codant pour les séquences peptidiques dont on souhaite évaluer la liaison au facteur FGF-2 est introduite dans le plasmide pACT2 (Clontech, numéro d'accès à Genebank : U29899).
Les deux plasmides sont alors introduits dans la souche Y 190 de Saccharomyces cerevisiae (Clontech ; Harper et al., Cell, 1993; 75:805-816 ; Flick & Johnston, Mol. Cell Biol, 1990; 10(9):4757-4769) dont l'activité /3-galactosidase est mesurée. La présence d'une activité /3-galactosidase traduit l'existence d'une liaison entre ladite séquence peptidique et le facteur FGF-2.
Le test de liaison en ELISA peut être réalisé comme suit. Les parois des puits d'une plaque de microtitration standard sont recouvertes de facteur FGF-2. Les séquences peptidiques dont on souhaite mesurer la liaison au facteur FGF-2, couplées à une étiquette histidine, sont ajoutées aux puits en concentrations variables, puis un anticorps marqué dirigé contre l'étiquette histidine est ajouté. Après lavage, la quantité d'anticorps par puits est alors déterminée à l'aide du marqueur, qui peut être une enzyme, un chromophore ou bien un composé radioactif. La quantité d'anticorps par puits est représentative de la liaison entre lesdites séquences peptidiques et le facteur FGF-2. On désigne par « homologie » le pourcentage d'acides aminés similaires pour deux séquences peptidiques alignées acide aminé par acide aminé, tel que cela peut être obtenu par la mise en œuvre de l'algorithme défini par Altschul et al, Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389-3402 par exemple. On désigne par « angiogenèse » le phénomène de formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants. Ce phénomène permet notamment la croissance tumorale. L'angiogenèse se trouve sous la dépendance de facteurs angiogéniques tels que le facteur FGF-2 par exemple. L'invention concerne également l'utilisation susmentionnée d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, et/ou possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité anti-angiogénique et ou une activité anti-tumorale. On désigne par activité anti-angiogénique, une activité d'inhibition de l'angiogenèse.
Cette activité peut être par exemple mise en évidence in vitro en démontrant l'inhibition à la fois de la multiplication, de la migration et de la tubulogenèse, de cellules endothéliales par les séquences peptidiques de l'invention. La mesure de l'inhibition de la multiplication des cellules endothéliales peut être réalisée en cultivant des cellules endothéliales en présence de la séquence peptidique dont on souhaite évaluer l'activité.
La mesure de l'inhibition de la migration des cellules endothéliales peut être réalisée en effectuant une « blessure » sur un tapis de cellules endothéliales et en incubant ensuite les cellules en présence de la séquence peptidique à tester. On mesure alors le nombre de cellules ayant migré sur la blessure. La mesure de l'inhibition de la tubulogenèse des cellules endothéliales peut être réalisée en mesurant la longueur de tubules formés par des cellules endothéliales cultivées sur gel en présence de la séquence peptidique à tester.
On désigne par activité anti-tumorale, une activité permettant d'inhiber la croissance tumorale et/ou d'induire la régression voir la disparition de tumeurs. Cette activité peut être par exemple mise en évidence in vivo en mesurant la masse de tumeurs, dont on a induit le développement chez la souris par injection de cellules tumorales, en présence et en absence d'administration de séquences peptidiques de l'invention et/ou d'acides nucléiques exprimant les séquences peptidiques de l'invention. L'invention concerne en particulier l'utilisation telle que définie ci-dessus, d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus : - 275 à 366 (SEQ ID NO : 4), et/ou - 367 à 455 (SEQ ID NO : 6), et/ou - 456 à 531 (SEQ ID NO : 8), de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 542 (SEQ ID NO : 26) de SEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2.
SEQ ID NO : 26 correspond aux acides aminés 1447 à 1988 de la fîbronectine. L'invention concerne notamment l'utilisation telle que définie ci-dessus, d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus : - 275 à 366 (SEQ ID NO : 4), et/ou - 367 à 455 (SEQ ID NO : 6), et/ou - 456 à 531 (SEQ ID NO : 8), de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) de SEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2.
SEQ ID NO : 12 correspond aux acides aminés 1447 à 1981 delà fîbronectine. L'invention concerne notamment l'utilisation telle que définie ci-dessus, d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 456 à 531 (SEQ ID NO : 8) de SEQ ID NO : 10, et au maximum à une séquence correspondant à SEQ ID NO : 10, en particulier correspondant à SEQ ID NO : 26, et plus particulièrement correspondant à SEQ ID NO : 12, - d'une séquence dérivée de la séquence définie ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2.
L'invention concerne en particulier l'utilisation telle que définie ci-dessus, d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 367 à 531 (SEQ ID NO : 14) de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 542 (SEQ ID NO : 26) de SEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2. SEQ ID NO : 14 correspond aux acides aminés 1813 à 1977 de la fîbronectine.
L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation telle que définie ci-dessus, d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 367 à 531 (SEQ ID NO : 14) de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) de SEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2. L'invention concerne tout particulièrement l'utilisation telle que définie ci-dessus, d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 270 à 531 (SEQ ID NO : 16) de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 542 (SEQ ID NO : 26) de SEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2.
SEQ TD NO : 16 correspond aux acides aminés 1716 à 1977 de la fîbronectine. L'invention concerne encore plus particulièrement l'utilisation telle que définie ci- dessus, d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 270 à 531 (SEQ ID NO : 16) de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) de SEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2.
L'invention concerne preférentiellement l'utilisation telle que définie ci-dessus, d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - de SEQ ID NO : 4, ou - de SEQ ID NO : 6, ou - de SEQ ID NO : 8, ou - de SEQ ID NO : 10, ou - de SEQ ID NO : 12, ou - de SEQ ID NO : 14, ou - de SEQ ID NO : 16, ou - de SEQ ID NO : 18, ou - de SEQ ID NO : 20, ou - de SEQ ID NO : 22, ou - de SEQ ID NO : 24, ou - de SEQ ID NO : 26, ou - de SEQ ID NO : 28, ou - de SEQ ID NO : 30. SEQ ID NO : 18 correspond à la séquence peptidique du clone A dans la suite, elle correspond aux acides aminés 1 à 531 de SEQ ID NO : 10 et aux acides aminés 1447 à 1977 de la fîbronectine. SEQ ID NO : 20 est désignée fibstatine (Fib) dans la suite, elle correspond aux acides aminés 270 à 535 de SEQ ID NO : 10 et aux acides aminés 1716 à 1981 de la fîbronectine.
SEQ ID NO : 22 correspond aux acides aminés 275 à 455 de SEQ ID NO : 10 et 1721 à 1901 de la fîbronectine, elle correspond à la séquence peptidique du clone C dans la suite.
SEQ ID NO : 24 correspond aux acides aminés 275 à 531 de SEQ ID NO : 10 et 1721 à
1977 de la fîbronectine.
SEQ ID NO : 28 correspond à la séquence peptidique du clone D dans la suite, elle correspond aux acides aminés 367 à 535 de SEQ ID NO : 10 et 1813 à 1981 de la fîbronectine.
SEQ ID NO : 30 correspond à la séquence peptidique du clone E dans la suite, elle correspond aux acides aminés 367 à 545 de SEQ ID NO : 10 et 1813 à 1991 de la fîbronectine. L'utilisation des séquences peptidiques SEQ ID NO : 14 et 28 est avantageuse, car ces séquences présentent une taille inférieure à celle de SEQ ID NO : 20 et peuvent s'avérer plus solubles et plus stables que cette dernière.
SEQ ID NO : 30 peut exercer une activité anti-angiogénique suite à sa digestion partielle par une protéase in vitro ou in vivo pour générer une protéine ayant une activité anti-angiogénique de SEQ ID NO : 14 ou 28 par exemple.
SEQ ID NO : 22 peut exercer une activité anti-angiogénique suite à son association avec une ou plusieurs séquences peptidiques, in vitro ou in vivo, pour former un complexe protéique ayant une organisation semblable à une protéine ayant une activité anti-angiogénique de SEQ ID NO : 20 ou 24 par exemple. La présente invention concerne également l'utilisation d'un acide nucléique codant pour une séquence peptidique telle que définie ci-dessus, ou de son complémentaire, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de maladies liées à l'angiogenèse, telles que les cancers, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, la rétinopathie diabétique, le psoriasis, ou l'arthrite rhumatoïde. La présente invention concerne également l'utilisation d'un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum aux séquences s'étendant des nucléotides : - 823 à 1098 (SEQ ID NO : 3), et/ou - 1099 à 1365 (SEQ ID NO : 5), et/ou - 1366 à 1593 (SEQ ID NO : 7), de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 9, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un nucléotide, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - à une séquence possédant une homologie d'au moins 75 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou son complémentaire, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de maladies liées à l'angiogenèse, telles que les cancers, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, la rétinopathie diabétique, le psoriasis, ou l' arthrite rhumatoïde.
On désigne par « homologie » le pourcentage de nucléotides identiques pour deux séquences nucléotidiques alignées nucléotide par nucléotide, tel que cela peut être obtenu par la mise en œuvre de l'algorithme défini par Altschul et al, Nucleic Acids
Res. (1997) 25:3389-3402 par exemple. Les séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 3, 5, 7 et 9 codent respectivement pour les séquences peptidiques SEQ ID NO : 4, 6, 8 et 10. Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum aux séquences s'étendant des nucléotides : - 823 à 1098 (SEQ ID NO : 3), et/ou - 1099 à 1365 (SEQ ID NO : 5), et/ou - 1366 à 1593 (SEQ ID NO : 7), de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 25, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou à une séquence homologue.
SEQ ID NO : 25 correspond à la séquence s'étendant des nucléotides 1 à 1626 de la séquence SEQ ID NO : 9 et à la séquence s'étendant des nucléotides 4339 à 5964 de la fîbronectine.
SEQ DD NO : 25 code pour SEQ ID NO : 26.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum aux séquences s'étendant des nucléotides : - 823 à 1098 (SEQ ID NO : 3), et/ou - 1099 à 1365 (SEQ ID NO : 5), et/ou - 1366 à 1593 (SEQ ID NO : 7), de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 11, ou
- à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou à une séquence homologue.
SEQ ID NO : 11 correspond à la séquence s'étendant des nucléotides 1 à 1605 de la séquence SEQ ID NO : 9 et à la séquence s'étendant des nucléotides 4339 à 5943 de la fîbronectine.
SEQ ID NO : 11 code pour SEQ ID NO : 12.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant :
- au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 1366 à 1593 (SEQ ID NO : 7) de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 9, en particulier à SEQ ID NO : 25, et plus particulièrement à SEQ ID NO : 11, ou
- à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou à une séquence homologue.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant :
- au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 1099 à 1593 (SEQ ID NO : 13) de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 25, ou
- à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou à une séquence homologue. SEQ ID NO : 13 code pour SEQ ID NO : 14.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant :
- au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 1099 à 1593 (SEQ ID NO : 13) de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 11, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou à une séquence homologue. Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 808 à 1593 (SEQ ID NO : 15) de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 25, ou
- à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou à une séquence homologue. SEQIDNO: 15 code pour SEQIDNO: 16.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant :
- au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 808 à 1593 (SEQ ID NO : 15) de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 11, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou à une séquence homologue.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - à SEQ ID NO : 3, ou -à SEQIDNO: 5, ou - à SEQ ID NO : 7, ou - à SEQ ID NO : 9, ou -à SEQIDNO: 11, ou -à SEQIDNO: 13, ou -à SEQIDNO: 15, ou -à SEQIDNO: 17, ou -à SEQIDNO: 19, ou -à SEQIDNO: 21, ou -à SEQIDNO: 23, ou - à SEQ ID NO : 25, ou - à SEQ ID NO : 27, ou - à SEQ ID NO : 29, ou son complémentaire. SEQ ID NO : 17 correspond à la séquence s'étendant des nucléotides 4339 à 5931 de la fîbronectine. SEQ ID NO : 19 correspond à la séquence s'étendant des nucléotides 5146 à 5943 de la fîbronectine. SEQ ÏÏD NO : 21 correspond à la séquence s'étendant des nucléotides 5161 à 5703 de la fîbronectine. SEQ ID NO : 23 correspond à la séquence s'étendant des nucléotides 5161 à 5931 de la fîbronectine.
SEQ ID NO : 27 correspond à la séquence s'étendant des nucléotides 5437 à 5943 de la fîbronectine. SEQ ID NO : 29 correspond à la séquence s'étendant des nucléotides 5437 à 5973 de la fîbronectine.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus : - 275 à 366 (SEQ ID NO : 4), et/ou - 367 à 455 (SEQ ID NO : 6), et/ou - 456 à 531 (SEQ ID NO : 8), de SEQ ID NO : 10, et au maximum à une séquence correspondant à SEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Les véhicules pharmaceutiquement acceptables pouvant être utilisés pour des séquences peptidiques dans le cadre de l'invention sont bien connus de l'homme de l'art.
Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent; également comprendre d'autres composés, notamment proteiques, ayant une action anti-angiogénique, tels que l'endostatine, l'angiostatine, PF-4, la thrombospondine ou le fragment de prolactine de 16 kDa par exemple, ces protéines sont notamment définies dans Cao Int. J. Biochem. Cell Biol. (2001) 33:357-369. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention conviennent notamment pour l'administration à un patient d'une dose de 15 à 600 mg/m2/jour d'une séquence peptidique selon l'invention.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention conviennent également pour une administration par voie topique, transdermique, intrapéritonéale. intracrânienne, intracéréboventriculaire, intracérébrale, intravaginale, intra-utérine, orale, rectale ou parentérale (par exemple, par voie intraveineuse, intrarachidienne, sous-cutanée ou intramusculaire).
Les compositions avantageuses selon la présente invention, destinées à une administration parentérale, comprennent des solutions d'injections stériles aqueuses et non aqueuses qui peuvent contenir des anti-oxydants, des tampons, des agents bactériostatiques et des solutés qui rendent la composition isotonique ; ainsi que des suspensions stériles aqueuses et non aqueuses qui peuvent comprendre des agents de suspension et des épaississants.
Selon un mode de réalisation avantageux, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend, à titre de substance active, une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus : - 275 à 366 (SEQ ID NO : 4), et/ou - 367 à 455 (SEQ ID NO : 6), et/ou - 456 à 531 (SEQ ID NO : 8), de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 542 (SEQ ID NO : 26) de SEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou d'une séquence homologue. Selon autre un mode de réalisation avantageux, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend, à titre de substance active, une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus : - 275 à 366 (SEQ ID NO : 4), et/ou - 367 à 455 (SEQ ID NO : 6), et/ou - 456 à 531 (SEQ ID NO : 8), de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) de SEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou d'une séquence homologue. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, la composition pharmaceutique comprend, à titre de substance active, une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 456 à 531 (SEQ ID NO : 8) de SEQ ID NO : 10, et au correspondant au maximum à SEQ ID NO : 10, en particulier à SEQ ID NO : 26, et plus particulièrement à SEQ ID NO : 12, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou d'une séquence homologue.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, la composition pharmaceutique comprend, à titre de substance active, une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 367 à 531 (SEQ ID NO : 14) de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 542 (SEQ ID NO : 262) de SEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou d'une séquence homologue.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, la composition pharmaceutique comprend, à titre de substance active, une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 367 à 531 (SEQ ID NO : 14) de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) de SEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou d'une séquence homologue. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, la composition pharmaceutique comprend, à titre de substance active, une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 270 à 531 (SEQ ID NO : 16) de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 542 (SEQ ID NO : 26), ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou d'une séquence homologue.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, la composition pharmaceutique comprend, à titre de substance active, une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 270 à 531 (SEQ ID NO : 16) de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12), ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou d'une séquence homologue. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, la composition pharmaceutique comprend, à titre de substance active, une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - de SEQ ID NO : 4, ou - de SEQ ID NO : 6, ou - de SEQ ID NO : 8, ou - de SEQ ID NO : 10, ou - de SEQ ID NO : 12, ou - de SEQ ID NO : 14, ou - de SEQ ID NO : 16, ou - de SEQ ID NO : 18, ou - de SEQ ID NO : 20, ou - de SEQ ID NO : 22, ou - de SEQ ID NO : 24, ou - de SEQ ID NO : 26, ou - de SEQ ID NO : 28, ou - de SEQ ID NO : 30. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active un acide nucléique codant pour une séquence peptidique telle que définie dans les compositions pharmaceutiques ci-dessus, ou son complémentaire, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Les véhicules pharmaceutiquement acceptables pouvant être utilisés pour des acides nucléiques dans le cadre de l'invention sont bien connus de l'homme de l'art.
Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent également comprendre d'autres acides nucléiques, ayant une action anti-angiogénique, soit directement, soit par le biais d'une protéine pour laquelle ils codent, telle que l'endostatine, Fangiostatine, PF-4, la thrombospondine ou le fragment de prolactine de 16 kDa par exemple, ces protéines sont notamment définies dans Cao Int. J. Biochem. Cell Biol. (2001) 33:357-
369.
Avantageusement, les compositions pharmaceutiques selon l'invention conviennent pour P administration d'une dose unitaire de 0,5 à 20 mg d'acide nucléique. L'administration des compositions pharmaceutiques peut être en particulier réalisée par injection intramusculaire puis électro transfert selon des méthodologies bien connues de l'homme de Part.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum aux séquences s'étendant des nucléotides : - 823 à 1098 (SEQ ID NO : 3), et/ou - 1099 à 1365 (SEQ ID NO : 5), et/ou - 1366 à 1593 (SEQ ID NO : 7), de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 9, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un nucléotide, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - à une séquence possédant une homologie d'au moins 75 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou son complémentaire, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation avantageux, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend, à titre de substance active, un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum aux séquences s'étendant des nucléotides :,• - 823 à 1098 (SEQ ID NO : 3), et/ou - 1099 à 1365 (SEQ ID NO : 5), et/ou - 1366 à 1593 (SEQ ID NO : 7), de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 25, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou à une séquence homologue. Selon un autre mode de réalisation avantageux, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend, à titre de substance active, un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum aux séquences s'étendant des nucléotides : - 823 à 1098 (SEQ ID NO : 3), et/ou - 1099 à 1365 (SEQ ID NO : 5), et/ou - 1366 à 1593 (SEQ ID NO : 7), de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 11, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou à une séquence homologue. Selon un autre mode de réalisation avantageux, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend, à titre de substance active, un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 1366 à 1593 (SEQ ID NO : 7) de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 9, en particulier à SEQ ID NO : 25, et plus particulièrement à SEQ ID NO : 11, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou à une séquence homologue. Selon un autre mode de réalisation avantageux, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend, à titre de substance active, un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 1099 à 1593 (SEQ ID NO : 13) de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 25, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou à une séquence homologue. Selon un autre mode de réalisation avantageux, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend, à titre de substance active, un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 1099 à 1593 (SEQ ID NO : 13) de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 11, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou à une séquence homologue.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend, à titre de substance active, un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 808 à 1593 (SEQ ED NO : 15) de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 25, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou à une séquence homologue.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend, à titre de substance active, un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 808 à 1593 (SEQ ID NO : 15) de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 11, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou à une séquence homologue. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend, à titre de substance active, un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - à SEQ ID NO : 3, ou - à SEQ ID NO : 5, ou - à SEQ ID NO : 7, ou - à SEQ ID NO : 9, ou - à SEQ ID NO : 11, ou - à SEQ H) NO : 13, ou - à SEQ ID NO : 15, ou - à SEQ ID NO : 17, ou - à SEQ ID NO : 19, ou - à SEQ ID NO : 21, ou - à SEQ ID NO : 23, ou - à SEQ ID NO : 25, ou - à SEQ ID NO : 27, ou - à SEQ ID NO : 29, ou son complémentaire.
Selon une autre mode de réalisation la présente invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, comprenant à titre de substance active un vecteur d'expression eucaryote comprenant un acide nucléique tel que défini dans les compositions pharmaceutiques ci-dessus, ou son complémentaire, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Les vecteurs d'expression selon l'invention peuvent également comprendre en plus des acides nucléiques codant pour des séquences peptidiques ayant également une activité anti-angiogénique, telles que l'endostatine ou l'angiostatine ou PF4 ou le fragment de prolactine de 16 kDa par exemple
Selon encore un autre mode de réalisation la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active une cellule eucaryote ou procaryote transformée par un acide nucléique tel que défini dans les compositions ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Les cellules susceptibles d'être transformées comprennent notamment E. coli, HeLa,
CHO et NIH3T3. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre substance active un anticorps anti-idiotypique dirigé contre le paratope d'un anticorps dirigé contre une séquence peptidique telle que définie dans l'une des utilisations ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
On désigne par paratope la partie d'un anticorps responsable de son interaction avec un épitope d'un antigène reconnu par ledit anticorps.
Un anticorps anti-idotypique selon l'invention peut être préparé selon des méthodes bien connues de l'homme de Part, notamment par injection d'un anticorps dirigé contre une séquence peptidique selon l'invention à un animal, tel qu'un lapin ou une souris par exemple. Avantageusement, l'anticorps anti-idiotypique selon l'invention, possède des propriétés de liaison au FGF-2.
L'anticorps anti-idiotypique de l'invention peut être humanisé, par des méthodes bien connues de l'homme de Part. Des fragments de cet anticorps peuvent également être utilisés dans les compositions pharmaceutiques de l'invention,1 tels que des fragments scFv, Fab ou F(ab)'2 bien connu de l'homme de Part.
La présente invention concerne également une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 367 à 531 (SΕQ LD NO : 14) de SΕQ ID NO : 10 et au maximum des résidus 1 à 542 (SΕQ BD NO : 26) de SΕQ ID NO : 10, les séquences adjacentes aux extrémités de SΕQ ID NO : 26 dans la séquence totale de ladite séquence peptidique étant différentes de celles qui sont adjacentes à SΕQ ID NO : 12 dans la séquence de la fîbronectine humaine, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2. La présente invention concerne en particulier une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 367 à 531 (SEQ ID NO : 14) de SEQ ID NO : 10 et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) de SEQ ED NO : 10, les séquences adjacentes aux extrémités de SEQ ID NO : 12 dans la séquence totale de ladite séquence peptidique étant différentes de celles qui sont adjacentes à SEQ ID NO : 12 dans la séquence de la fîbronectine humaine, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2.
La présente invention concerne également une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 270 à 531 (SEQ ID NO : 16) de SEQ ID NO : 10 et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) de SEQ ED NO : 10, les séquences adjacentes aux extrémités de SEQ ID NO : 12 dans la séquence totale de ladite séquence peptidique étant différentes de celles qui sont adjacentes à SEQ ID NO : 12 dans la séquence de la fîbronectine humaine, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2. L'invention concerne notamment une séquence peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou étant constituée : - de SEQ ID NO : 12, ou - de SEQ ED NO : 14, ou - de SEQ ID NO : 16, ou - de SEQ ID NO : 18, ou - de SEQ ID NO : 20, ou - de SEQ ID NO : 24, ou - de SEQ ID NO : 26, ou - de SEQ ED NO : 28, les séquences adjacentes aux extrémités des SEQ ID NO : 12, 14, 16, 18, 20, 24, 26 et
28 dans la séquence totale de ladite séquence peptidique étant différentes de celles qui sont respectivement adjacentes à SEQ ID NO : 12, 14, 16, 18, 20, 24, 26 et 28 dans la séquence de la fîbronectine humaine. La présente invention concerne également un acide nucléique, comprenant ou étant constitué d'une séquence codant pour l'une des séquence peptidiques telles que définies ci-dessus, ou son complémentaire.
L'invention concerne aussi un acide nucléique s'hybridant à un acide nucléique tel que définis ci-dessus, ou à son complémentaire, dans les conditions d'hybridation suivantes : 0,75 M NaCl, 0,75 mM citrate de sodium, 60°C .
La présente invention concerne également un acide nucléique comprenant ou étant constitué d'une séquence correspondant : - au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 1099 à 1593 (SEQ ID NO : 13) de SEQ ED NO : 9 et au maximum à la séquerice SEQ ID NO : 25, les séquences adjacentes aux extrémités de SEQ ID NO : 25 dans ledit acide nucléique étant différentes de celles qui sont adjacentes à SEQ ID NO : 11 dans la séquence de la fîbronectine humaine, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un nucléotide, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - à une séquence possédant une homologie d'au moins 75 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou son complémentaire.
La présente invention concerne également un acide nucléique comprenant ou étant constitué d'une séquence correspondant : - au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 1099 à 1593 (SEQ ID NO : 13) de SEQ ID NO : 9 et au maximum à la séquence SEQ ID NO : 11 , les séquences adjacentes aux extrémités de SEQ ID NO : 11 dans ledit acide nucléique étant différentes de celles qui sont adjacentes à SEQ ID NO : 11 dans la séquence de la fîbronectine humaine, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un nucléotide, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - à une séquence possédant une homologie d'au moins 75 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou son complémentaire.
La présente invention concerne également un acide nucléique comprenant ou étant constitué d'une séquence correspondant : - au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 808 à 1593 (SEQ ID NO : 15) de SEQ ED NO : 9 et au maximum à la séquence SEQ ID NO : 11 , les séquences adjacentes aux extrémités de SEQ ID NO : 11 dans ledit acide nucléique étant différentes de celles qui sont adjacentes à SEQ ID NO : 11 dans la séquence de la fîbronectine humaine, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un nucléotide, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - à une séquence possédant une homologie d'au moins 75 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou son complémentaire.
L'invention concerne plus particulièrement un acide nucléique tel que défini ci-dessus, comprenant ou étant constitué d'une séquence correspondant : - à SEQ ID NO : 11, ou - à SEQ ID NO : 13, ou - à SEQ ID NO : 15, ou - à SEQ ID NO : 17, ou - à SEQ ID NO : 19, ou - à SEQ ID NO : 23, ou - à SEQ ID NO : 25, ou - à SEQ ID NO : 27, les séquences adjacentes aux extrémités de SEQ ID NO : 11, 13, 15, 17, 19, 23, 25 et 27 dans ledit acide nucléique étant respectivement différentes de celles qui sont adjacentes aux SEQ ID NO : 11, 13, 15, 17, 19, 23, 25 et 27 dans la séquence de la fîbronectine humaine, ou son complémentaire.
L'invention concerne notamment un vecteur d'expression eucaryote ou procaryote comprenant un acide nucléique tel que défini ci-dessus. Selon un autre mode de réalisation la présente invention concerne une cellule eucaryote ou procaryote transformée par un acide nucléique tel que défini dans les compositions décrites ci-dessus.
L'invention concerne également un anticoφs dirigé contre une séquence peptidique telle que définie dans l'une des utilisations ci-dessus. Cet anticoφs peut notamment être préparé selon des méthodes bien connues de l'homme de Part, par injection des séquences peptidiques selon l'invention à des animaux tels que des chevaux, des lapins, des rats ou des souris et l'extraction du sérum desdits animaux.
Un tel anticoφs est notamment utile pour la fabrication de kits permettant de doser les séquences peptidiques selon l'invention, par exemples dans des fluides ou des tissus naturels, tels que du sang, du sérum, du plasma ou des extraits de muscles par exemple
Le dosage peut par exemple être réalisé selon la méthode ELIS A.
L'invention concerne également des fragments de Panticoφs ci-dessus, tels que des fragments Fab, F(ab)'2 ou scFv par exemple. L'invention concerne également un anticoφs anti-idiotypique dirigé contre le paratope de l'anticoφs défini ci-dessus. DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1
La Figure 1 représente les résultats d'un test ELISA mesurant l'interaction établie entre le facteur FGF-2 fixé sur les parois des puits d'une plaque de microtitration et la fibstatine, la présence de fibstatine étant révélée par un anticoφs marqué à la péroxydase de raifort. L'axe des ordonnées représente la densité optique à 490 nm. L'axe des abscisses représente la concentration en fibstatine (en μg/ml).
Figure 2
La Figure 2 représente l'effet de milieu conditionné dilué au 3/4 (colonne noire) ou au 1/2 (colonne blanche) contenant de la fibstatine (Fib) ou de l'endostatine (Endo) sur la croissance de cellules endothéliales en culture, par comparaison avec des cellules endothéliales témoins (colonne hachurée). L'axe des ordonnées représente le pourcentage de croissance par rapport à la croissance des cellules témoins.
Figure 3
La Figure 3 représente l'effet de la fibstatine recombinante (colonnes noires) ou de l'endostatine recombinante (colonnes blanches) sur la croissance de cellules endothéliales en culture. L'axe des ordonnées représente le pourcentage d'inhibition de croissance par rapport à la croissance de cellules témoins, l'axe des abscisses représente la concentration en protéine recombinante (en μg/ml).
Figure 4 La Figure 4 représente l'effet de la fibstatine (colonne blanche) sur la croissance de cellules non-endothéliales B16 et NIH-3T3 par rapport à un témoin (colonne noire). L'axe des ordonnées représente le pourcentage de croissance cellulaire.
Figure 5 La Figure 5 représente l'effet de la fibstatine sur la migration cellulaire de cellules endothéliales. L'effet de la fibstatine et du FGF-2 est comparé à l'effet du FGF-2 seul. L'axe des ordonnées représente le nombre de cellules ayant migré. Figure 6A, Figure 6B, Figure 6C et Figure 6D
Les Figures 6 A, B, C et D représentent l'effet de la fibstatine sur la différenciation cellulaire en tubules des cellules endothéliales.
La Figure 6A est une photographie représentant des cellules endothéliales (points noirs) cultivées en MatriGel™ (Becton et Dickinson, Bedford, MA) en absence de FGF-2 et de fibstatine.
La Figure 6B est une photographie représentant des cellules endothéliales (traits noirs) cultivées en MatriGel™ en présence de FGF-2 et en absence de fibstatine. La Figure 6C est une photographie représentant des cellules endothéliales (points noirs) cultivées en MatriGel™ en présence de FGF-2 et de fibstatine.
La Figure 6D représente la tailles des tubules formés à partir des cellules endothéliales cultivées en absence de FGF-2 et de fibstatine (colonne de gauche), en présence de FGF-2 et en absence de fibstatine (colonne du milieu) et en présence de FGF-2 et de fibstatine (colonne de droite). L'axe des ordonnées représente la taille des tubules (en unités arbitraires).
Figure 7
La Figure 7 représente l'effet de la fibstatine sur la migration de cellules endothéliales in vivo. Le nombre de cellules endothéliales (x 10"4) ayant colonisé 100 mg de MatriGel™ est représenté en ordonnée, en fonction de l'ajout dans le gel de FGF-2 (colonne noire), de FGF-2 et de fibstatine (colonne hachurée) et de FGF-2 et d'endostatine (colonne blanche).
Figure 8
La Figure 8 représente le schéma du plasmide pSCT-Fib. Les sites de restriction sont représentés avec leur localisation en kb. Amp représente le gène de résistance à Pampicilline, CMV représente le promoteur du cytomegalovirus, pT7 représente le promoteur du phage T7, PS représente la séquence codant le peptide signal du VEGF, HA représente la séquence codant un épitope dérivé de l'hémaglutinine A, Fib His représente la séquence codante de la fibstatine fusionnée avec une étiquette hexahistidine, IVS2-β représente l'intron de la β- globine de lapin, Ori SV40 représente l'origine de réplication du virus SV40 et ORI représente une origine de réplication bactérienne.
Figure 9A et Figure 9B
La Figure 9A représente l'activité /3-galactosidase (en ordonnées, unités arbitraires) exprimée par un plasmide co-injecté dans un muscle de souris avec un plasmide codant pour la fibstatine (colonne hachurée), l'endostatine (colonne blanche) ou un plasmide témoin (colonne noire).
La Figure 9B représente la concentration sérique en endostatine (en ordonnée, ng/ml) pour une souris témoins (colonne noire) ou ayant reçu une injection de plasmide codant pour l'endostatine (colonne blanche).
Figure 10
La Figure 10 représente l'effet de la fibstatine sur la croissance tumorale. La masse de tumeurs de mélanome B16 (en ordonnées, mg) a été mesurée pour des souris ayant reçu une injection de cellules B16 et ayant été traitées par Pinjection d'un plasmide témoin (colonne noire), ou d'un plasmide codant pour la fibstatine (colonne hachurée) ou l'endostatine (colonne blanche).
Figure 11 La Figure 11 représente la quantité d'activité β-galactosidase (en pourcentage de l'activité mesurée pour la fibstatine) (axe des abscisses) résultant de l'association en double hybride de fragments de la fîbronectine et du facteur FGF-2.
Figure 12A et Figure 12B La Figure 12A représente des sections de tumeurs marquées par un anticoφs anti-CD31 pour une souris témoins (en haut, droite et gauche), une souris traitées à l'endostatine (au milieu, droite et gauche) et une souris traitée à la fibstatine (en bas, droite et gauche). Les flèches blanches représentent des segments, des embranchements et des lumières de vaisseaux sanguins. La Figure 12B représente le pourcentage de vaisseaux sanguins marqués par un anticoφs anti-CD31 pour une souris témoins (colonne hachurée), une souris traitées à l'endostatine (colonne blanche) et une souris traitée à la fibstatine (colonne noire). EXEMPLES
EXEMPLE 1
Identification de fragments de fîbronectine se liant au facteur FGF-2 par la méthode du double hybride
Le système de clonage et d'expression double-hybride a été réalisé comme décrit par Van den Berghe et al. Mol. Endocrinol (2000) Nov, 14(11), 1709-1724. Brièvement la forme de 18 kDa du facteur FGF-2 a été utilisée comme appât, et l'ADNc correspondant a été inséré dans le vecteur ρAS2 (Clontech). Une banque humaine de placenta (Clontech, Palo Alto, CA) clonée dans le vecteur pACT2 (Clontech) a été criblée dans la souche Y 190 (Clontech) de Saccharomyces cerevisiae. L'activité β-galactosidase d'extraits obtenus à partir de 10 colonies de levures poussées sur la nuit dans 4 ml de milieu de sélection (DOB-Tφ/-Leu) (milieu "Drop Out Base" : sans tryptophane, sans leucine), a été mesurée à l'aide du test Galacto-Light (Tropix Inc. Bedford, MA) dans les conditions décrites par le fabriquant.
Le criblage de la banque de placenta en utilisant comme appât la forme du FGF-2 de 18 kDa (155 a.a.) a permis d'isoler deux clones A et B contenant chacun un ADNc codant pour une protéine susceptible d'interagir avec le FGF-2. Après séquençage et recherche d'homologie dans les banques de données, il a pu être mis en évidence que les deux ADNc isolés étaient identiques à 100 % à une région particulière de l'ADNc codant pour la fîbronectine
L'un des fragments clones, le fragment A, présente une taille; de 1593 paires de bases et code pour un fragment de fîbronectine de 531 acides aminés tandis que le fragment B de 798 paires de bases code pour un fragment de 266 acides aminés, qui a été nommé fibstatine (Fib). Ces deux clones correspondent à la même région de la fîbronectine. Le clone A correspond aux acides aminés 1447 à 1977 de la fîbronectine (SEQ ID NO : 2) et le clone B aux acides aminés 1716 à 1981.
Afin de définir plus précisément la région responsable de la liaison au FGF-2, divers fragments dérivés du clone B ont été générés par PCR, clones dans le plasmide pACT2 et testés en double hybride comme décrit ci-dessus. Ces fragments sont les suivants: - un fragment issu d'un clone C correspondant aux résidus 1721 à 1901 de la fîbronectine, un fragment issu d'un clone D correspondant aux résidus 1813 à 1981 de la fîbronectine, un fragment issu d'un clone E correspondant aux résidus 1813 à 1991 de la fîbronectine, un fragment issu d'un clone F correspondant aux résidus 1721 à 1812 de la fîbronectine un fragment issu d'un clone G correspondant aux résidus 1812 à 1901 de la fîbronectine un fragment issu d'un clone H correspondant aux résidus 1902 à 1981 de la fîbronectine.
Les résultats obtenus sont portés dans le tableau 1 ci-dessous :
Clone testé Interaction avec FGF-2 _ _
B +++ C D +++ E F G H + Tableau 1 : résultat du test en double hybride de l'interaction entre des fragments de fîbronectine et le facteur FGF-2
Ces résultats sont également présentés dans la Figure 11.
Le sous-fragment D de la fibstatine semble donc être porteur de l'activité de liaison au FGF-2. Par ailleurs, il est envisageable que in vivo le fragment E ait; une activité de liaison à FGF-2 suite à une coupure proteolytique, a contrario il semble également possible que les fragments C, F et G puissent s'associer à un autre fragment protéique pour reconstituer un fragment actif.
Afin de vérifier la spécificité d'interaction du FGF-2 avec la fibstatine, l'interaction de ce fragment avec d'autres membres de la famille des FGF : le FGF-1, le FGF-3 et le FGF-6, a été testée en double hybride. Pour cela, les ADNc codant pour différents membres de la famille des FGF et la fibstatine ont été fusionnés au domaine de liaison à PADN (DB) ou au domaine d'activation (AD) de Gal4 et co-transfectés dans la levure. Les intensités d'interactions évaluées par la mesure de l'activité β-galactosidase ont révélé que la fibstatine interagissait de manière spécifique avec le FGF-2.
EXEMPLE 2 Effets anti-angiogénique in vitro de fragments de fîbronectine se liant au facteur FGF-2
1. Clonage du gène de la Fibstatine
La séquence codante de la fibstatine a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pACT2 contenant l'ADNc de la fibstatine isolé par le criblage en double-hybride. L'amorce sens était 5'-AAACTCGAGACCATGGGAACCCAGTCCACAGCT-3' (SEQ ED NO : 31) et l'amorce antisense 5'-AAAGGATCCTTACTTCAGGGCAATGACATA-3' (SEQ ID NO : 32). La séquence codante de l'endosatine (Endo) a été amplifiée par RT-PCR à partir d'ARN de cellules NIH-3T3. L'amorce sens était 5'-AAACCATGGGAATTCATACTCATCAGGAC TTTCAGCC-3' (SEQ ID NO : 33) et l'amorce antisens 5'-GGATCCTTAC TATTTGGAGAAAGAGGTCATGAAGC-3' (SEQ ID NO : 34). Les séquences codantes de la fibstatine et de l'endostatine ont alors été insérées dans le plasmide pET-15b (Novagen) en phase avec l'étiquette histidine pour la production de protéines recombinantes dans Escherichia coli, pour donner les plasmides pET-Fib et pET-Endo. Les ADNc de la fibstatine et de l'endostatine ont également été clones dans les vecteurs d'expression eucaryotes, pUHD10-3 (Grossen & Bujard, 1992, PNAS (1992) June 15 ; 89(12) 5547-5551) pour former pUHD-Fib et pUHD-Endo, et pSCT (Prats, 1992, Mol. Cell. Biol (1992) Octobre ; 12(10) 4796-4805), pour former pSCT-Fib (Figure 8 et pSCT-Endo, en phase avec le peptide signal de VEGF-A (Huez et al, 2001, Mol. Endocrinol. (2001) décembre 15(12) 2197-2210) et Pépitope HA (épitope hémagglutinine), utilisables respectivement pour une expression en milieu conditionné et en électrotransfert. Toutes les séquences ont été vérifiées par séquençage à l'aide du kit ABI Prism Dye Terminator (Applied Biosystems, Foster City, CA).
2. Production de la fibstatine a. Production en milieu conditionné Des cellules HeLa HT (Cayrol, Journal of Virology, July 1995 ; 69(7) 4206-4212) ensemencées à 1,2 * 106 par boîte de diamètre 100 mm ont été transfectées au Fugene (Roche, Allemagne) le lendemain, par 17 μg de plasmide pUHD-Fib, pUHD-Endo ou pUHD10-3. 24h après la transfection, les cellules ont été incubées dans 6 ml de milieu DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium)(Invitrogen) + 1 % SVF (Sérum de Veau Fœtal). Le milieu conditionné a été récupéré 24h après, centrifugé 5 min à 1700 tpm, filtré (sur filtre de 45 μm) et congelé à - 80°C.
b. Production par Escherichia coli Des bactéries E. coli BL21 ont été transformées avec les plasmides pΕT-Fib, pΕT-Εndo ou un plasmide contrôle permettant l'expression de la GST (Glutathion S Transférase) fusionnée aux 6 histidines. 100 ml de culture bactérienne sur la nuit a ensuite été diluée dans un litre de milieu LB (Luria-Bertani). L'expression des protéines a été induite à une DO6oonm de 0,6-0,8 par addition d'ΕPTG (isopropyl-/3-D-thiogalactopyranoside) à la concentration de 0,5 mM. Après 4h d'expression à 37°C, les bactéries ont été récupérées par centrifugation 10 min à 5000 tpm. Le culot bactérien a alors été lysé par resuspension dans 30 ml de tampon A (Tris 20 mM pH 7,4, NaCl 0,5 M, chlorure de guanidinium 6 M, octyglucoside 4 mM, imidazole 10 mM). La suspension de bactéries a été soniquée puis centrifugée à 13000 tpm durant 30 min. Le surnageant obtenu a été incubé avec 0,75 ml de billes de nickel-agarose préalablement équilibrées dans le tampon A. Après 2 h d'incubation sur une roue à 4°C, les billes ont été lavées successivement par 50 ml de Tampon B (Tris 20 mM pH 7,4, NaCl 2 M, urée 6 M, imidazole 20 mM) puis par 100 ml de Tampon C (Tris 20 mM pH 7,4, NaCl 0,15 M, imidazole 20 mM). Après le dernier lavage, les billes ont été déposées sur une colonne de chromatographie Polyprep (Biorad) et éluées avec des fractions de 500 μl de Tampon C contenant 200 mM d'imidazole. La présence de protéine a été vérifiée par dosage de Bradford (BioRad 500-0114, Californie) et SDS-PAGΕ suivi d'une coloration au bleu de Coomassie.
c. Production en cellules d'insecte
Les ADNc codant pour la fibstatine et l'endostatine fusionnées avec 6 histidines ont été clones dans un vecteur permettant leur expression et leur sécrétion par le système Baculovirus. Les protéines sécrétées dans le milieu de culture des cellules d'insecte, dépourvu de sérum, ont été purifiées par précipitations successives au sulfate d'ammonium (20, 50 puis 80 %). La majorité des protéines recombinantes se trouvant dans la fraction 50 %, celle-ci a été dialysée dans du PBS à 4°C et les protéines ont été purifiées sur colonne de nickel agarose. Après plusieurs lavages au PBS + 20 mM imidazole, les protéines ont été éluées par du PBS + 200 mM imidazole. La présence de protéine est vérifiée par dosage de Bradford et SDS-PAGΕ suivi d'une coloration au bleu de Coomassie. 3. Interaction de la fibstatine avec le facteur FGF-2
Une plaque de 96 puits a été tapissée sur la nuit à 4°C par du FGF-2 ou de la SAB (Sérum Albumine Bovine) à 10 μg/ml. La plaque a été rincée avec du PBS-tween 0,2% et 100 μl de solution de blocage ont été ajoutés par puits pendant 1 h à 37°C. La solution de blocage a été évacuée et la plaque rincée. Des concentrations variables de fibstatine avec une étiquette histidine ont été ajoutées pendant 2 h à 37°C. Après trois rinçages, des anticoφs dirigés contre l'étiquette histidine conjugués à de la peroxydase de raifort (1/1000) ont été ajoutés pendant 1 h à 37°C. Trois rinçages ont alors été effectués et les complexes ont été révélés à l'aide de 100 μl par puits de o-phénylènediamine (4 mg/ml) contenant 0,03% (v/v) de peroxyde d'hydrogène dans 0,1 M de tampon citrate, pH 5,0. Après 20 minutes, les réactions ont été arrêtées avec 50 μl de H2SO4 2 M et Pabsorbance a été mesurée à 490 nm. Les résultats obtenus après soustraction du signal non spécifique (interaction Fib/BSA) révèlent que la fibstatine est capable d'interagir de manière directe et dose dépendante avec le FGF-2 (Figure 1).
4. Effets de la fibstatine sur les cellules endothéliales
a. Culture des cellules
Les cellules ont été cultivées dans du DMEM supplémenté en glutamine (1 %), amphotéricine B (1 %), gentamicine (0,5 %) et par 10 % SVF ou 10 % SV (Sérum de Veau nouveau né) pour les cellules HeLa (numéro ATCC : CCL2) et ABAE respectivement (Couderc, 1991, Cell. Regul, vol 2, pages 709-718). Les cellules ABAE ont par ailleurs été cultivées en présence de 1 ng/ml de FGF-2. Les cellules B16 (ATCC CRL6475) ont été cultivées en RPMI (Roswell Park Mémorial Institute) supplémenté en glutamine (1 %), amphotéricine B (1 %), gentamicine (0,5 %) et en 10 % SV. Les cellules ont été cultivées dans des étuves à 5 % CO2 pour les cellules HeLa et B16 et 10 % CO2 pour les ABAE.
b. Inhibition de la prolifération
Pour le test de prolifération, les cellules ABAE ont été ensemencées à 5 x 104 cellules/ml de milieu. Le lendemain le milieu a été changé et les cellules ont été incubées en présence de milieu conditionné préparé selon le paragraphe 2a et dilué au 1/4 ou au 1/2 en présence de 0,5 ng/ml de FGF-2. 72h après, les cellules ont été trypsinées et comptées. Les résultats obtenus représentés Figure 2 montrent que la présence de Fib dans le milieu inhibe la prolifération des ABAE de manière comparable à celle de l'endostatine. Des expériences similaires ont été réalisées avec de la fibstatine recombinante préparée chez
E. coli.
Les résultats obtenus après comptage des cellules et représentés Figure 3 confirment l'effet inhibiteur et dose-dépendant de la fibstatine sur la prolifération des ABAΕ stimulées par FGF- 2. En effet, à 1 μg/ml Fib inhibe à 50% la prolifération des cellules induite par FGF-2. De plus, dans nos conditions expérimentales, l'effet de la fibstatine paraît supérieur à celui de l'endostatine. Les fragments anti-angiogéniques décrits jusqu'à présent inhibent de manière spécifique la prolifération des cellules endothéliales. Afin de vérifier si Fib présente cette même caractéristique, l'effet de Fib a été testé sur la prolifération de fibroblastes NIH-3T3 et sur celle de cellules de mélanome B16. Les résultats présentés Figure 4 révèlent que la fibstatine ne provoque aucune inhibition de la prolifération de ces cellules, suggérant que l'effet anti-prolifératif de Fib est spécifique des cellules endothéliales.
c. Inhibition de la migration
3 x 105 cellules ABAE ont été ensemencées dans des boîtes de diamètre 35 mm dans leur milieu de culture supplémenté en FGF-2 (1 ng/ml). Après 48h, les cellules ont été cultivées en absence de sérum durant 24h. Une "blessure" a ensuite été réalisée sur le tapis cellulaire à l'aide d'un cône, les cellules ont été lavées et incubées dans du milieu sans sérum supplémenté en FGF-2 (5 ng/ml) en présence ou non de 1 μg/ml de Fib ou d'endostatine. Les cellules ayant migré sur la "blessure" ont été comptabilisées 14 h plus tard. Les résultats présentés Figure 5 montrent que la fibstatine inhibe fortement l'effet activateur du FGF-2 sur la migration des ABAE.
d. Inhibition de la différenciation La fibstatine a été testée dans un modèle d'angiogenèse in vitro permettant d'évaluer le niveau de tubulogenèse de cellules endothéliales. Des plaques de 24 puits ont été tapissées avec 300 μl de MatriGel™ par puits (mélange de protéines issues de membranes basales de sarcomes murins à teneur réduite en facteurs de croissance, liquide à 4°C et solide à 37°C (Becton et Dickinson, Bedford, MA)), et laissées à polymériser pendant 1 h à 37°C. Des cellules ABAE (2 x 105 cellules/ml) en suspension dans 500 μl de milieu de culture ont été ajoutées dans chaque puits. Du FGF-2 (0,5 ng/ml) avec ou sans fibstatine (1 μg/ml) a été ajouté aux puits et les plaques ont été incubées sur la nuit à 37°C. Après le retrait du milieu, la culture a été fixée et la longueur du réseau de tubules a été mesurée à l'aide du système Q Win de Leica (Leica microsystem, Rueil-Malmaison, France). Les résultats présentés Figures 6A, B, C et D révèlent que l'addition de 1 μg de Fib inhibe la formation des tubules. L'absence de toxicité dans ces conditions a été vérifiée par mesure de LDH (Lactate déhydrogénase) libérée dans le milieu de culture à l'aide du Kit CytoTox 96 (Promega).
Alternativement, le protocole suivant a également été utilisé. Des gel tridimensionnels de collagène ont été préparés en mélangeant 7,5 volumes d'une solution de collagène de type I de tendons de queues de rats (2 mg/ml, Sigma) avec un volume de milieu minimum essentiel 10X (Gibco), 1,5 volumes de bicarbonate de sodium (15,6 mg/ml) et 0,1 volume de NaOH 1M, sur la glace. 400 μl de ce mélange ont été répartis dans des puits de culture de cellules de 18 mm et ont été laissés former un gel à 37°C pendant 30 min. Des cellules BAE ou ACE ont alors été ensemencées sur les gels de collagène à l,0xl05 cellules/puits dans 500 μl de DMEM F12 supplémentés par 10% de sérum de veau nouveau né et ont été laissé à croître jusqu'à confluence (2 à 3 jours). Ensuite, la concentration de sérum a été réduite à 2% et les cellules ont été traitées par du FGF-1 (20 ng/ml) + héparine (500 ng/ml), du FGF-2 (20 ng/ml), ou du VEGF (20 ng/ml), ou n'ont pas été traitées (témoins), en présence ou en absence de fibstatine ou d'endostatine. Les milieux et les traitements ont été renouvelés après 2 et 4 jours. Les cellules ont été photographiées après 4 à 7 jours.
EXEMPLE 3
Effets anti-angiogénique et anti-tumoral in vivo de fragments de fîbronectine se liant au facteur FGF-2
1. Animaux utilisés
Des souris C57B1/6 âgées de 6 à 10 semaines ont été maintenues dans des cages en acier inoxydable en groupe de 5, à température contrôlée avec des cycles jour-nuit de 12 heures, et nourries avec de la nourriture de laboratoire standard. Toutes les procédures ont été réalisées selon les recommandations de VEuropean Accréditation of Laboratory Animal Care. 2. Inhibition de l'angiogenèse in vivo
300 μl de MatriGel™ supplémentés avec 100 ng de FGF-2 en présence ou non de 10 μg de fibstatine ou d'endostatine (préparés dans des cellules d'insectes), ont été injectés en sous- cutané à des souris femelles C57B1/6. 1 semaine après, les implants de MatriGel™ ont été récupérés, dissous par du MatriSperse (Beckton et Dickinson) et les cellules endothéliales comptées à la cellule de Malassez.
Comme le montre la Figure 7. la fibstatine inhibe à 50 % l'angiogenèse induite par FGF-2, cet effet est supérieur à celui induit par l'endostatine.
3. Inhibition de la croissance tumorale in vivo
Afin d'évaluer l'effet anti-tumoral de la fibstatine, le plasmide l'exprimant a été électrotransféré in vivo à des souris porteuses de mélanomes B16.
Des souris femelles C57B1/6 anesthésiées par injection intra-péritonéale de kétamine (150 mg/kg) ont reçu une injection sous cutanée de 106 cellules tumorales B16 dans 100 μl de PBS (temps d'incubation : environ 10 minutes avant injection des plasmides). 50 μg de plasmide (5μg de plasmide LacZ + 45 μg de pSCT Fib (Figure 8), pSCT Endo ou pSCT) préparés à l'aide du kit Maxiprep Endofree (Qiagen, France) et dilués dans 50 μl de PBS ont été injectés dans le quadriceps des souris avec une seringue 26G 0,45x10. Les plasmides injectés ont alors été immédiatement électro transférés par deux électrodes de 10 mm de diamètre, séparées de 4 mm, en contact avec la peau à l'aide d'un appareil ElectroSquare Porator ECM830 (BTX, Genetronics, San Diego, CA) par 8 impulsions de 20 ms à 80V. L'efficacité de l'électroporation a été favorisée par l'utilisation d'un gel à ultrason appliqué sur la patte. L'injection suivie de P électrotransfert des plasmides a été recommencée 5 jours plus tard. 10 jours après la première injection, les tumeurs et les muscles électro transférés ont été récupérés et pesés. Les muscles ont ensuite été lysés dans 350 μl de tampon de lyse β-Gal (Tropix) et homogénéisés à Paide d'un ultra-turax (Polylabo). La suspension a été centrifugée à 13000 tpm durant 10 min. Le dosage de l'activité β-galactosidase a alors été réalisé sur 20 μl de surnageant à l'aide du kit Galacto Light™ (Tropix). Le sérum des souris a également été récupéré à l'aide de tubes Capiject (Terumo) contenant un gel de silice facilitant la récupération du sérum. L'endostatine circulante a été dosée à l'aide du kit ELISA Mouse Endostatine Accucyte (Cytimmune).
Les résultats présentés Figure 9A confirment que les plasmides codant pour LacZ, co-injectés avec pSCT-Fib, pSCT-Endo ou pSCT, ont bien été injectés dans le muscle et étaient correctement exprimés. Les résultats obtenus pour l'endostatine circulante dans le sérum des souris électrotransférées avec pSCT-Endo confirment que la protéine est bien exprimée et sécrétée, atteignant une concentration moyenne de 15 ng/ml dans le sérum des souris (Figure 9B).
L'analyse des tumeurs a permis de montrer que les souris ayant reçu une injection du plasmide pSCT-Fib présentent une masse tumorale diminuée de moitié par rapport aux souris injectées avec le plasmide contrôle. Les souris ayant reçu une injection du plasmide pSCT- Endo présentent également une diminution de leur masse tumorale mais statistiquement non significative (Figure 10). Les résultats ont été obtenus en utilisant 14 souris par groupe.
Par ailleurs ces résultats ont été complétés par une expérience similaire réalisée avec un plasmide pSCT-D exprimant le fragment D de l'Exemple I, correspondant aux résidus 1813 à 1981 de la fîbronectine. Les résultats obtenus indiquent que l'injection intramusculaire de ce plasmide, suivie d'un électrotransfert, induit également une diminution de la masse tumorale par rapport à des souris n'ayant reçu que le plasmide pSCT.
Afin de confirmer que l'effet du transfert du gène codant la fibstatine était dû à une inhibition de l'angiogenèse, des capillaires tumoraux ont été examinés par immunomarquage anti-CD31. Brièvement, la densité des microvaisseaux tumoraux a été analysée sur des sections congelées (5 μm) de mélanomes B16 en utilisant un anticoφs monoclonal de rat anti-CD31 de souris (Pharmingen, San Diego, CA). Après fixation dans du paraformaldéhyde pendant lh à 4°C, les sections ont été lavées 3 fois par du PBS et ont été perméabilisées à l'aide d'un mélange PBS-0,25% Triton X100-3% SAB pendant une heure. Après un blocage à l'aide d'un mélange sérum de lapin 5% / PBS-Tween 0,1% pendant lh à température ambiant, les sections ont été incubées sur la nuit avec PanticoφS anti-CD31 de souris, dilué au 1/50 dans une solution de dilution d'anticoφs (DAKO, Caφinteria, CA). Les sections ont été lavées trois fois à l'aide de PBS et incubées avec des IgG anti-rat (Vector Labs, Burlingame, CA) dilués au 1/200 dans une solution de dilution d'anticoφs pendant 2h à température ambiante. Après trois lavages au PBS, un conjugué Streptavidine Alexa Fluor 488 (Molecular probes, Eugène, OR) dilué au 1/200 dans une solution de dilution d'anticoφs a été utilisé pour la détection des anticoφs liés. Le logiciel Visolab 2000 (Biocom, Paris, France) a été utilisé pour quantifier la surface anti-CD31 marquée.
Comme représenté dans la Figure 12A, des sections représentatives de tumeurs de souris traitées par la fibstatine et l'endostatine présentent une diminution significative du marquage de CD31, en comparaison de sections de tumeurs de souris contrôles. La quantification des microvaisseaux à un grossissement de 200 fois, indique que la surface positive au marquage de CD31 dans les tumeurs des souris contrôles était de 2,2% ± 0,58 (moyenne ± écart type), à comparer à 0,74% ± 0,58 et 0,94% ± 0,58 pour les tumeurs traitées à la fibstatine et à l'endostatine respectivement (Figure 12BV Ensemble, ces résultats démontrent que le transfert du gène de la fibstatine inhibe la réponse angiogénique in vivo.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus : - 275 à 366 (SEQ ED NO : 4), et/ou - 367 à 455 (SEQ ID NO : 6), et/ou - 456 à 531 (SEQ ID NO : 8), de SEQ ID NO : 10, et au maximum à une séquence correspondant à SEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de maladies liées à l'angiogenèse, telles que les cancers, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, la rétinopathie diabétique, le psoriasis, ou l'arthrite rhumatoïde.
2. Utilisation selon la revendication 1, d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus : - 275 à 366 (SEQ ID NO : 4), et/ou - 367 à 455 (SEQ ID NO : 6), et/ou - 456 à 531 (SEQ ID NO : 8), de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ED NO : 12) de SEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 367 à 531 (SEQ ID NO : 14) de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) de SEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2.
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 270 à 531 (SEQ ID NO : 16) de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) de SEQ ID NO : 10, ou - d'une' séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2.
5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - de SEQ ID NO : 4, ou - de SEQ ID NO : 6, ou - de SEQ ID NO : 8, ou - de SEQ ID NO : 10, ou - de SEQ ID NO : 12, ou - de SEQ ID NO : 14, ou - de SEQ ID NO : 16, ou - de SEQ ID NO : 18, ou - de SEQ ID NO : 20, ou - de SEQ ID NO : 22, ou - de SEQ ID NO : 24, ou - de SEQ ED NO : 26, ou - de SEQ ED NO : 28, ou - de SEQ ED NO : 30.
6. Utilisation d'un acide nucléique codant pour une séquence peptidique telle que définie dans l'une des revendications 1 à 5, ou de son complémentaire, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de maladies liées à l'angiogenèse, telles que les cancers, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, la rétinopathie diabétique, le psoriasis, ou l'arthrite rhumatoïde.
7. Composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus : - 275 à 366 (SEQ ID NO : 4), et/ou - 367 à 455 (SEQ ID NO : 6), et/ou - 456 à 531 (SEQ ID NO : 8), de SEQ ED NO : 10, et au maximum à une séquence correspondant à SEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
8. Composition pharmaceutique selon la revendication 7, comprenant à titre de substance active une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus : - 275 à 366 (SEQ ID NO : 4), et/ou - 367 à 455 (SEQ ED NO : 6), et/ou - 456 à 531 (SEQ ID NO : 8), de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) de SEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
9. Composition pharmaceutique selon la revendication 7 ou 8, comprenant à titre de substance active une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 367 à 531 (SEQ ID NO : 14) de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) de SEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
10. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 7 à 9, comprenant à titre de substance active une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 270 à 531 (SEQ ID NO : 16) de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) de SEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
11. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 7 à 10, comprenant à titre de substance active une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - de SEQ ID NO : 4, ou - de SEQ ID NO : 6, ou - de SEQ ID NO : 8, ou - de SEQ ID NO : 10, ou - de SEQ ID NO : 12, ou - de SEQ ID NO : 14, ou - de SEQ ID NO : 16, ou - de SEQ ID NO : 18, ou - de SEQ ID NO : 20, ou - de SEQ ID NO : 22, ou - de SEQ ID NO : 24, ou - de SEQ ID NO : 26, ou - de SEQ ID NO : 28, ou - de SEQ ED NO : 30. en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
12. Composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active un acide nucléique codant pour une séquence peptidique telle que définie dans l'une des revendications 7 à 11, ou son complémentaire, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
13. Composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum aux séquences s'étendant des nucléotides : - 823 à 1098 (SEQ ID NO : 3), et/ou - 1099 à 1365 (SEQ ED NO : 5), et/ou - 1366 à 1593 (SEQ ID NO : 7), de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ED NO : 9, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un nucléotide, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - à une séquence possédant une homologie d'au moins 75 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou son complémentaire, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
14. Composition pharmaceutique selon la revendication 13, comprenant à titre de substance active un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum aux séquences s'étendant des nucléotides : - 823 à 1098 (SEQ ID NO : 3), et/ou - 1099 à 1365 (SEQ ID NO : 5), et/ou - 1366 à 1593 (SEQ ID NO : 7), de SEQ ED NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 11, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un nucléotide, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - à une séquence possédant une homologie d'au moins 75 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou son complémentaire, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
15. Composition pharmaceutique selon la revendication 13 ou 14, comprenant à titre de substance active un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 1099 à 1593 (SEQ ID NO : 13) de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 11, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un nucléotide, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - à une séquence possédant une homologie d'au moins 75 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou son complémentaire, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
16. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 12 à 15, comprenant à titre de substance active un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 808 à 1593 (SEQ ID NO : 15) de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 11, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un nucléotide, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - à une séquence possédant une homologie d'au moins 75 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou son complémentaire, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
17. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 12 à 16, comprenant à titre de substance active un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - à SEQ ID NO : 3, ou - à SEQ ID NO : 5, ou - à SEQ ID NO : 7, ou - à SEQ ID NO : 9, ou - à SEQ ED NO : 11, ou - à SEQ ID NO : 13, ou - à SEQ ID NO : 15, ou - à SEQ ID NO : 17, ou - à SEQ ID NO : 19, ou - à SEQ ID NO : 21, ou - à SEQ ID NO : 23, ou - à SEQ ID NO : 25, ou - à SEQ ID NO : 27, ou - à SEQ ID NO : 29, ou son complémentaire, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
18. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 12 à 17, comprenant à titre de substance active un vecteur d'expression eucaryote comprenant un acide nucléique tel que défini dans l'une des revendications 12 à 17, ou son complémentaire, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
19. Composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active une cellule eucaryote ou procaryote transformée par un acide nucléique tel que défini dans l'une des revendications 12 à 18, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
20. Composition pharmaceutique comprenant à titre substance active un anticoφs anti- idiotypique dirigé contre le paratope d'un anticoφs dirigé contre une séquence peptidique telle que définie dans l'une des revendications 1 à 5, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
21. Séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 367 à 531 (SEQ ID NO : 14) de SEQ ED NO : 10 et au maximum à une séquence correspondant à SEQ ID NO : 12, les séquences adjacentes aux extrémités de SEQ ID NO : 12 dans la séquence totale de ladite séquence peptidique étant différentes de celles qui sont adjacentes à SEQ ID NO : 12 dans la séquence de la fîbronectine humaine, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2.
22. Séquence peptidique selon la revendication 21, comprenant ou étant constituée : - de SEQ ID NO : 12, ou - de SEQ ID NO : 14, ou - de SEQ ID NO : 16, ou - de SEQ ID NO : 18, ou - de SEQ ID NO : 20, ou - de SEQ ID NO : 24, ou - de SEQ ID NO : 28, les séquences adjacentes aux extrémités des SEQ ID NO : 12, 14, 16, 18, 20, 24 et 28 dans la séquence totale de ladite séquence peptidique étant différentes de celles qui sont respectivement adjacentes à SEQ ID NO : 12, 14, 16, 18, 20, 24 et 28 dans la séquence de la fîbronectine humaine.
23. Acide nucléique, comprenant ou étant constitué d'une séquence codant pour l'une des séquence peptidiques définies dans les revendications 21 et 22, ou son complémentaire.
24. Acide nucléique s'hybridant à un acide nucléique selon la revendication 23, ou à son complémentaire, dans les conditions d'hybridation suivantes : 0,75 M NaCl, 0,75 mM citrate de sodium, 60°C.
25. Acide nucléique comprenant ou étant constitué d'une séquence correspondant : - au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 1099 à 1593 (SEQ ID NO : 13) de SEQ ID NO : 9 et au maximum à la séquence SEQ ID NO : 11, les séquences adjacentes aux extrémités de SEQ ID NO : 11 dans ledit acide nucléique étant différentes de celles qui sont adjacentes à SEQ ID NO : 11 dans la séquence de la fîbronectine humaine, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un nucléotide, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - à une séquence possédant une homologie d'au moins 75 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou son complémentaire.
26. Acide nucléique selon la revendication 25, comprenant ou étant constitué d'une séquence correspondant : - à SEQ ID NO : 11, ou - à SEQ ID NO : 13, ou - à SEQ ID NO : 15, ou - à SEQ ID NO : 17, ou - à SEQ ID NO : 19, ou - à SEQ ID NO : 23, ou - à SEQ ID NO : 27, les séquences adjacentes aux extrémités de SEQ ID NO : 11, 13, 15, 17, 19, 23 et 27 dans ledit acide nucléique étant respectivement différentes de celles qui sont adjacentes aux SEQ ID NO : 11, 13, 15, 17, 19, 23 et 27 dans la séquence de la fîbronectine humaine, ou son complémentaire.
27. Vecteur d'expression eucaryote ou procaryote comprenant un acide nucléique tel que défini dans l'une des revendications 23 à 26.
28. Cellule eucaryote ou procaryote transformée par un acide nucléique tel que défini dans l'une des revendications 23 à 26.
29. Anticoφs dirigé contre une séquence peptidique telle que définie dans l'une des revendications 1 à 5.
30. -Anticoφs anti-idiotypique dirigé contre le paratope de l'anticoφs défini dans la revendication 29.
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