FR2864090A1 - Derives carboxy-reduits de l'acide hyaluronique, leur preparation, leur application comme medicament et les compositions pharmaceutiques les renfermant - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne les dérivés carboxy-réduits de l'acide Hyaluronique de formule (I) :dans laquelle R ou R1 représentent H ou SO3M, n est un entier compris entre 0 et 25000, M est un métal alcalin, isolés ou en mélanges, leurs diastéréoisomères, leur procédé de préparation, leurs applications à titre de médicament et les compositions pharmaceutiques les contenant.
Description
OH
OR NHAc OR NHAc n 2864090 1 DERIVES CARBOXY-REDUITS DE L'ACIDE HYALURONIQUE, LEUR PREPARATION, LEUR APPLICATION COMME MEDICAMENT ET LES
COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES LES RENFERMANT
La présente invention concerne de nouveaux Glycosaminoglycanes ainsi que leurs sels d'addition pharmaceutiquement acceptable et plus précisément des dérivés carboxy-réduits et chemiosélectivement O-sulfatés de l'acide Hyaluronique, isolés ou en mélange, leurs applications à titre de médicament et les compositions pharmaceutiques les contenant.
Les Glycosaminoglycanes (GAGS) sont essentiellement formés de motifs alternés acide uronique-sucre aminé (ou l'inverse), du type de ceux rencontrés dans les chaînes oligo ou polysaccharidiques de GAGs naturels biologiquement actifs comme l'héparine, l'heparanesulfate, le dermatansulfate, les chondroïtines, les chondroïtines sulfates ou l'acide hyaluronique.
Les motifs acides uroniques répondent plus spécialement à la structure acide D-glucoronique ou L-iduronique et les motifs sucres aminés à celle de la D-glucosamine ou de la D-galactosamine.
Les GAGs naturels présentent des activités thérapeutiques en tant qu'inhibiteurs de la Thrombine. Ils présentent donc une activité antithrombotique et anticoagulante et sont utilisés dans les pathologies cardiovasculaires dans lesquelles il y a un risque de thrombose.
Des dérivés 0-persulfatés de l'acide hyaluronique ont été décrits et étudiés pour leurs propriétés anticoagulantes (JP200080102-A).
Des dérivés N, O-sulfatés de l'acide Hyaluronique ont été décrits et étudiés pour leurs propriétés antiulcère (WO- 00/01394-A1) ou pour leurs propriétés anti-coagulantes (W099/43728-A1, WO 98/45335-A1).
De même, des dérivés sulfatés de l'acide Hyaluronique sont décrits pour leurs propriétés anticoagulantes 5 (FR2584728).
Par ailleurs, des dérivés 0-persulfatés de l'acide Hyaluronique ont été décrits et étudiés pour leurs propriétés dans l'arthrite rhumatoïde (W09213541-A1).
La présente invention a pour objet un nouveau procédé mettant en uvre une étape de carboxy-réduction et une étape de sulfatation permettant d'obtenir de nouveaux dérivés de l'acide Hyaluronique présentant des propriétés avantageuses permettant de traiter ou de prévenir des désordres qui affichent une activité accrue d'au moins une des métalloprotéinases de matrice.
Les dérivés carboxy-réduits et chemiosélectivement O-sulfatés de l'acide hyaluronique de formule (I) selon l'invention possèdent une structure polymérique très régulière avec des degrés de pureté de l'ordre de 90 %.
Il en résulte des propriétés biologiques reproductibles et inattendues.
Dans l'état pathologique de l'ostéoarthrose, la dégradation de l'aggrécan, le protéoglycane principal du cartilage articulaire, représente un événement très précoce et crucial. La perte pathologique de l'aggrécan est provoquée par des clivages protéolytiques dans son domaine interglobulaire. Les analyses de séquences d'acides aminés des métabolites de protéoglycane isolés à partir du liquide synovial des patients souffrant de dommages articulaires, d'ostéoarthrose ou de désordre inflammatoire des articulations, ont montré qu'il existe un clivage protéolytique entre les acides aminés Glu373 et 2864090 3 A1a374 dans le domaine interglobulaire de l'aggrécan humain (Lohmander, et al., Arthritis Rheum., 36. 1214-1222 (1993)). L'activité protéolytique responsable de ce clivage est dénommée "aggrécanase" et peut être attribuée à la superfamille des métalloprotéinases (MP) ou métalloprotéinases de matrice (MMP).
Le zinc est un élément essentiel dans le centre catalytiquement actif des métalloprotéinases. Les MMP clivent le collagène, la laminine, les protéoglycanes, l'élastine ou la gélatine dans des conditions physiologiques. Donc, elles jouent un rôle important dans le tissu osseux et conjonctif. Un grand nombre de différents inhibiteurs des MMP sont connus (voir, par exemple les demandes de brevet EP0606046 ou W094/28889).
Toutefois, les inhibiteurs connus des MMP ont fréquemment un désavantage significatif. Ils manquent de spécificité pour toute classe particulière de MMP. Au contraire, la plupart des inhibiteurs de MMP inhibent simultanément une pluralité de MMP.
Par conséquent, il existe un besoin d'inhibiteurs de MMP ayant des spécificités plus étroitement définies afin de mieux traiter ou de prévenir des désordres spécifiques. L'invention a tout particulièrement pour objet les dérivés carboxy-réduits de l'acide Hyaluronique de formule (I) :
OH
dans laquelle R représente SO3M, et R1 représente H ou SO3M, n est un entier compris entre 0 et 25000, M est un 2864090 4 métal alcalin, les dits dérivés étant sous la forme d'un composé isolé ou sous forme de mélanges, ainsi que leurs diastéréoisomères.
En particulier, l'invention a pour objet les dérivés carboxy-réduits de l'acide Hyaluronique selon la formule (I) caractérisés en ce que le M est choisi parmi sodium, calcium, magnésium et potassium.
Parmi les aspects préférés de l'invention, M est un atome de sodium.
L'invention a plus particulièrement pour objet les dérivés carboxyréduits de l'acide Hyaluronique tels que décrits plus haut caractérisés en ce que R et R1 représentent SO3Na.
L'invention a plus particulièrement pour objet les dérivés carboxyréduits de l'acide Hyaluronique tels que décrits plus haut caractérisés en ce que R représente SO3Na et R1 représente H. Les polysaccharides selon l'invention comportent ainsi un nombre pair de saccharides.
Les dérivés persulfatés carboxy-réduits de l'acide Hyaluronique selon l'invention sont obtenus selon le procédé mettant en oeuvre successivement les étapes suivantes: - trans-salification de l'acide Hyaluronique Sulfatation en milieu organique de l'acide Hyaluronique trans- salifié suivie d'une salification, carboxy-réduction du dérivé persulfaté - Soit a) au moyen d'un dérivé de carbodiimide 30 en présence d'un agent réducteur, 2864090 5 - Soit b) par estérification, le dérivé persulfaté étant le cas échéant préalablement trans-salifié par un sel d'ammonium quaternaire, suivie d'une réduction du dérivé ester correspondant par action d'un agent réducteur puis, - le cas échéant, trans-salification du dérivé persulfaté carboxy-réduit par un sel d'ammonium quaternaire puis resulfatation suivie d'une salification.
Le schéma réactionnel suivant illustre la présente invention: Transalification Chlorure de Benzethonium a OH n
OH
OH n
Acide Hyaluronique, sel de sodium 1-Py-SO3 / DMF
OH
2- AcONa / MeOH Soit 1- EDCI, pH 4,75 2- NaBH4 Soit 1- Transalification Chlorure de Benzethonium 2- Mel / CH2Cl2 3- Na BH4 1- Transalification Chlorure de Benzethonium 2- Py - SO3 / DMF 3- AcONa / MeOH Le procédé selon la présente invention est caractérisé par la forte chemiosélectivité des réactions de carboxyréduction et de sulfatation. Les produits qui en résultent sont remarquablement homogènes et conduisent à des polymères vrais. Les dérivés de l'acide Hyaluronique carboxy-réduit possèdent des pureté de l'ordre de 90 %. Cette homogéneité est déterminée par analyse structurale RMN et Infrarouge.
2864090 7 Il en résulte des propriétés biologiques reproductibles et inattendues.
Les réactions de persulfatation s'effectuent de préférence en milieu organique au moyen d'un complexe d'anhydride sulfurique avec une base organique telle que la pyridine ou la triméthylamine. Elles sont suivies en général par une réaction de salification par exemple par action d'acétate de sodium.
Pour une chemiosélectivité optimale des réactions de persulfatation, il est préférable de mettre en oeuvre le sel de benzéthonium en présence de 10 à 30 équivalents de complexe pyridine - anhydride sulfurique par fonction hydroxyle à sulfater. De même, la réaction sera effectuée préférentiellement à des températures comprises entre 10 et 70 C.
La persulfatation du sel de benzéthonium de l'acide Hyaluronique est réalisée tout particulièrement entre 50 et 70 C. Ceci est illustré à l'exemple 2a ou 2b.
Lors de la sulfatation du dérivé sulfaté carboxy -réduit, sel de benzéthonium, (composés de formule (I) avec R1=H et R=SO3Na, deuxième sulfatation) il est préférable d'opérer en milieu organique au moyen d'un complexe d'anhydride sulfurique avec une base organique telle que la pyridine à des températures voisines de 20 C. Ceci est illustré à l'exemple 3.
La carboxy-réduction des dérivés de l'acide Hyaluronique est réalisée en présence d'un dérivé carbodiimide. A titre d'exemple, il est possible d'utiliser le chlorhydrate de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide.
2864090 8 Par dérivés de l'acide Hyaluronique, on entend les dérivés persulfatés de l'acide Hyaluronique, le sel de benzéthonium de l'acide Hyaluronique, les dérivés persulfatés sels de benzéthonium de l'acide Hyaluronique ainsi que l'acide Hyaluronique sel de sodium.
La réduction proprement dite est réalisée de préférence avec un borohydrure de métal alcalin. A titre d'exemple, la réaction avec le dérivé carbodiimide est réalisée avec le borohydrure de sodium.
La réaction de formation de l'adduit avec le dérivé carbodiimide met préférentiellement en présence 5 à 20 équivalents de réactif et à un pH compris entre 4 et 5.
Encore plus préférentiellement, la réaction avec le dérivé carbodiimide est réalisée en présence de 7 à 13 équivalents de réactif et à un pH compris entre 4,3 et 4,9.
La réduction proprement dite de l'adduit activé du dérivé de l'acide hyaluronique est réalisée avec 10 à 300 équivalents de borohydrure de métal alcalin à une température comprise entre 10 et 70 C. Plus préférentiellement, la réduction de l'adduit sus mentionné est réalisée en présence de 140 à 250 équivalents de borohydrure de métal alcalin à une température comprise entre 20 et 50 C.
Selon un autre mode de la présente invention, la carboxyreduction peut être réalisée par réduction d'un ester des dérivés de l'acide Hyaluronique. A titre d'exemple, il est possible d'utiliser un dérivé ester méthylique.
On estérifie l'acide Hyaluronique préalablement trans- salifié sous forme de sel de Benzéthonium, par les méthodes classiques d'estérification connues de l'homme 2864090 9 du métier en mettant en oeuvre un halogénure d'alkyle refermant de 1 à 6 atomes de carbone tel que le iodure de méthyle ou un halogénure d'arylalkyle tel que le chlorure de benzyle en milieu organique. L'estérification proprement dite du dérivé d'acide Hyaluronique, sel de benzéthonium est réalisée de façon préférentielle, dans le dichlorométhane en présence de 2 à 20 équivalents d'iodure de méthyle et à une température voisine de 20 C.
En particulier, l'estérification est réalisée dans le dichlorométhane en présence de 4 à 10 équivalents d'iodure de méthyle pendant environ 6 jours et à une température voisine de 20 C.
La réduction proprement dite de l'ester méthylique du dérivé de l'acide Hyaluronique est réalisée avec 10 à 300 équivalents de borohydrure de métal alcalin à une température comprise entre 10 et 70 C. A titre d'exemple, la réduction de l'ester méthylique est réalisée avec le borohydrure de sodium.
Plus préférentiellement, la réduction de l'ester méthylique sus mentionné est réalisée en présence de 140 à 250 équivalents de borohydrure de métal alcalin à une température voisine de 20 C.
En particulier l'invention a pour objet le procédé mettant en uvre les étapes suivantes: - Trans-salification de l'Acide Hyaluronique par le chlorure de Benzéthonium - Sulfatation d'un sel d'ammonium quaternaire de l'acide Hyaluronique en milieu organique au moyen d'un complexe d'anhydride sulfurique avec la pyridine ou la triméthylamine,suivie d'une salification par l'acétate de sodium, 2864090 10 - Soit a) Carboxy-réduction au moyen du chlorhydrate de 1-(3-diméthyl aminopropyl)-3-éthylcarbodiimide en présence du borohydrure de sodium, soit b) estérification par action de iodure de méthyle sur le dérivé de l'Acide Hyaluronique préalablement trans-salifié par le chlorure de Benzéthonium puis réduction de 1' ester méthylique correspondant par le borohydrure de sodium.
- le cas échéant trans-salification du dérivé sulfaté carboxy-réduit par le chlorure de Benzéthonium puis resulfatation par le complexe d'anhydride sulfurique - base organique, suivie d'une salification par l'acétate de sodium.
Au cas où l'on désire obtenir des dérivés isolés à partir du mélange de dérivés carboxy-réduits de l'acide Hyaluronique tels qu'obtenus selon le procédé décrit plus haut, le procédé suivant doit ensuite être appliqué au mélange: - Fractionnement du mélange par chromatographie sur des colonnes remplies de gel de type polyacrylamide agarose ou un gel de polyacrylamide. Le mélange est élué par une solution d'hydrogénocarbonate de sodium.
De préférence, la solution d'hydrogénocarbonate de sodium est une solution de 0,1 à 1 mole/1. Encore plus préférentiellement, la séparation est réalisée à une concentration de 1 mole/1. La détection est réalisée par réfractometrie.
L'invention a également pour objet les Dérivés carboxyréduits et chemiosélectivement O-sulfatés de l'acide hyaluronique, isolés ou en mélange tels que définis plus haut, susceptibles d'être obtenus selon le ou les procédés tels que définis précédemment.
2864090 11 Les polysaccharides de formule (I), isolés ou en mélanges sont utilisables à titre de médicaments.
Ces polysaccharides présentent en particulier une forte activité inhibitrice de certaines métalloproteases de matrice. Ces inhibiteurs sont particulièrement indiqués pour le traitement d'états pathologiques où une forte augmentation de l'activité des métalloproteinases de matrice est constatée.
Les états pathologiques auxquels la présente invention fait référence impliquent une augmentation de l'activité d'au moins une des métalloproteinases de matrice suivante: la neutrophile elastase, la matrilysin (MMP-7), l'aggrecanase, l'hADAMTSl et la gélatinase A (MMP-2).
Les composés peuvent donc être utilisés, pour la prévention et le traitement de maladies telles que les désordres joint dégénératifs (tels que l'ostéoarthrose), les spondyloses, les chondrolyse associéees avec les joint Trauma ou les immobilisations prolongées jointes (souvent suite à une blessure du ménisque ou patellar ou les ruptures de ligaments), les désordres liés à des blessures, les désordres periodontique, les désordres chroniques du système locomoteur ( tels que arthritides chroniques ou aigues inflammatoires, immunologique ou du métabolisme), les arthropathies, myalgas ou les désordres liés au métabolisme osseux.
L'invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques renfermant les composés de formule (I) isolés ou en mélange ainsi qu'un ou plusieurs excipients, véhicule ou additifs pharmaceutiquement acceptable.
Un autre aspect de l'invention est un procédé de préparation des compositions pharmaceutiques renfermant les composés de formule (I) caractérisés en ce qu'on 2864090 12 mélange une quantité correspondant à un dosage désiré d'un composé de formule (I) avec un ou plusieurs excipients, véhicule additifs pharmaceutiquement acceptable.
Les composés de formule (I) peuvent être administrés par différente voie. Elles peuvent inclure sans être limité aux injections par voie subcutanée, intraarticulaire, intrapéritonée ou intraveineuse.
L'administration peut également être rectale, orale, par 10 inhalation, ou encore par voie transdermique.
Dans le cas de solutions pour injection (par exemple sous forme d'ampoule) , les doses peuvent s'échelonner de 5 g à environ 200 mg de composé de formule (I) et de préférence de 10 g à 40 mg.
Le dosage quotidien indiqué pour le traitement d'un patient adulte d'environ 70 Kg est de 10 g à 500 mg d' ingrédients actifs généralement de 20 mg à environ 100 mg. Cependant selon les circonstances des doses quotidiennes plus hautes ou plus basses peuvent être appropriées.
Ces doses peuvent être administrées une fois par jour sous la forme d'une seule unité de dosage.
Alternativement, les doses peuvent être administrées dans une pluralité de doses plus petites données de manière 25 répétée à des intervalles définis au cours du temps.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
L'acide Hyaluronique utilisé pour la préparation des composés illustrant cette invention présente une masse moléculaire de 2,7 106 Daltons. Il est préparé et 2864090 13 commercialisé par la société CAREF sous le nom d'Hyaluronate Na F100.
Exemple 1: Préparation de l'acide hyaluronique carboxy réduit, sel de sodium (sans l'étape essentielle de 5 sulfatation) NHAc
OH
OH OH OH 1- EDCI, pH 4,75
OH _ n
(Polysaccharide de formule (I) avec n = 0 à 25000, R = R1 H) A une température voisine de 20 C, on prépare une 10 solution de 1 g d'acide hyaluronique sel de sodium dans ml d'eau. Le pH est ajusté à pH 4,7 0,1 avec une solution d'acide chlorhydrique 0,1 N. On ajoute 4,48 g de chlorhydrate de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide puis on agite en maintenant le pH à 4,7 0,1. Lorsque le pH n'évolue plus, on ajoute alors par petites portions 17, 89 g de borohydrure de sodium ainsi que 250 ml d'eau. Le milieu réactionnel est agité environ 2 heures à une température voisine de 50 C. Après refroidissement à une température voisine de 5 C, le milieu réactionnel est neutralisé par de l'acide chlorhydrique à un pH voisin de 7 (volume d'acide 160ml). La suspension blanche est chargé dans une membrane en ester de cellulose PM 10000 et mise en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 72 heures (le troisième bain est réalisé avec une solution de chlorure de sodium 0, 2 N). Le contenu des membranes est lyophilisé. On obtient 0,86 g d'un lyophilisat blanc. Le rendement obtenu est de 95 %.
Spectre proton dans D20, 400MHz, T=333 K (8 en ppm - Mélange des épimères en C5) : 2,0 (3H, s), 3,3 (1H, m), entre 3,4 et 3,55 (5H, m), 3,6 (1H, d, J=7Hz), entre 3,63 et 3,85 (4H, m), 3,89 (1H, d, J=7Hz), 4,45 (1H, s), 4, 57 (1H, m).
EXEMPLE 2 a: Préparation de l'acide hyaluronique persulfaté carboxy réduit, sel de sodium (Polysaccharide de formule (I) avec n = 0 à 25000, R = SO3Na, Ri = H) n
OH
Transalification Chlorure de Benzethonium NHAc
OH
OH n
1- Py-S03 / DMF
OH
2- AcONa / McOH 1- EDCI, pH 4,75 2- NaBH4 a) Preparation du sel de benzéthonium de l'acide hyaluronique (Trans-salification) A une solution de 20 g d'acide hyaluronique sel de sodium dans 3,6 1 d'eau, on ajoute en environ 20 minutes une solution de 23,5 g de chlorure de benzéthonium dans 200 ml d'eau. Un précipité blanc se forme. Après 1 h d'agitation, on laisse sédimenter pendant environ 1 h et le surnageant est écarté puis remplacé par la même quantité d'eau (2,8 1). Après 1 h d'agitation, on laisse 2864090 15 sédimenter pendant environ 1 h et le surnageant est écarté puis remplacé par la même quantité d'eau (3 1). Après 1 h d'agitation, on laisse sédimenter pendant environ 1 h et le surnageant est écarté puis remplacé par la même quantité d'eau (3,2 1) Le produit est filtré, lavé avec trois portions de 1 1 d'eau puis séché sur claie. Le produit est ensuite broyé puis séché pendant environ 48 h à une température voisine de 50 C sous pression réduite (6kPa). On obtient 35,6 g de sel de benzéthonium de l'acide hyaluronique. Le rendement de la réaction est quantitatif.
b) Préparation de l'acide hyaluronique persulfaté, sel de sodium (Sulfatation) A une température voisine de 60 C et sous atmosphère inerte, on dissout 3 g d'acide hyaluronique, sel de benzéthonium dans 240 ml de diméthylformamide anhydre. A la solution obtenue, on ajoute une solution de 36,24 g de complexe pyridine - anhydride sulfurique dans 210 ml de diméthylformamide anhydre. Après 3 heures d'agitation à une température voisine de 60 C, le milieu réactionnel est refroidi à une température voisine de - 5 C. On ajoute au milieu réactionnel un mélange de 225 ml d'eau et 1350 ml d'une solution à 10 % d'acétate de sodium dans le méthanol. Le milieu réactionnel est filtré et le gâteau est lavé par trois portions de 60 ml de méthanol. Le solide obtenu est dissout dans l'eau puis est chargé dans une membrane en ester de cellulose PM 10000 et mis en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 72 heures (le deuxième bain est réalisé avec une solution de chlorure de sodium 0,2N). Le contenu de la membrane est lyophilisé. On obtient 2,65 g d'un lyophilisat blanc. Le rendement obtenu est de 86 %.
2864090 16 Spectre proton dans D20, 400MHz, T=298 K, S en ppm: 2,1 (3H, s) , 3,85 (2H, m), 4,07 (1H, m), 4,17 (2H, m), 4,38 (1H, m), 4,42 (2H, m), 4, 55 (1H, d, J=7Hz), 4,8 (2H, m), 4,88 (1H, m).
c) Préparation de l'acide hyaluronique persulfaté carboxy -réduit, sel de sodium (Carboxy-réduction) On prépare une solution de 0,5g d'acide hyaluronique persulfaté sel de sodium dans 30 ml d'eau. Le pH est ajusté 4,7 0,1 avec une solution d'acide chlorhydrique 0,1 N. On ajoute 1,11 g de chlorhydrate de 1-éthyl-3-(3- diméthylaminopropyl) carbodiimide puis on agite en maintenant le pH à 4,7 0,1. Lorsque le pH n'évolue plus, on ajoute alors par petites portions 4,44 g de borohydrure de sodium. Le milieu réactionnel est agité environ 2 heures à une température voisine de 50 C. Après refroidissement à une température voisine 10 C, le milieu réactionnel est neutralisé à pH 7 avec de l'acide chlorhydrique concentré (12 N). La suspension blanche est chargée dans une membrane en ester de cellulose PM 10000 et mise en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 72 heures (le deuxième bain est réalisé avec une solution de chlorure de sodium 0,2N). Le contenu de la membrane est lyophilisé. On obtient 0,36 g d'un lyophilisat blanc. Le rendement obtenu est de 76 %.
Spectre proton dans D20, 400MHz, T=333 K, S en ppm: 2,0 (3H, s), entre 3, 6 et 3,72 (3H, m), 3,8 (1H, t, J=6Hz), 4,05 (2H, m), 4,13 (1H, dd, J=7 et 3Hz), 4,2 (1H, t, J=7Hz), 4,4 (1H, t, J=3Hz), 4,48 (1H, d, J=8Hz), 4,6 (1H, t, J=3Hz), 4,75 (1H, d, J=7Hz), 4,82 (1H, d, J=3Hz).
EXEMPLE 2 b: Préparation de l'acide hyaluronique persulfaté carboxyréduit, sel de sodium (Polysaccharide de formule (I) avec n = 0 à 25000, R = SO3Na, R1 = H) Transalification Chlorure de Benzethonium
OH
OH _n
1- Py - SO3 / DMF
OH
2- AcONa / McOH 1- Transalification Chlorure de Benzethonium o
- OSON OSOa
OSO,Na va NHAC 3- Na BH4 2- Mel / CH2Cl2 a) Préparation du sel de benzéthonium de l'acide hyaluronique (Trans-salification) Le sel de benzéthonium de l'acide hyaluronique est préparé selon l'exemple 2 a.
b) Préparation de l'acide hyaluronique persulfaté, sel de 10 sodium (Sulfatation) L'acide hyaluronique persulfaté, sel de sodium est préparé selon l'exemple 2 a.
c) Préparation du sel de benzéthonium de l'acide hyaluronique persulfaté (Trans-salification) A une solution de 1,96 g d'acide hyaluronique persulfaté sel de sodium dans 115 ml d'eau, on ajoute en environ 5 minutes une solution de 5,6 g de chlorure de benzéthonium dans 100 ml d'eau. Un précipité blanc se forme. Après 1 h 2864090 18 d'agitation, on laisse sédimenter pendant une nuit. Le produit est filtré, lavé avec deux portions de 80 ml d'eau puis séché en dessiccateur sous vide. On obtient 5,3 g de sel de benzéthonium de l'acide hyaluronique persulfaté. Le rendement de la réaction est de 80 %.
d) Préparation de l'ester méthylique de l'acide hyaluronique persulfaté, sel de sodium A une solution de 2,76 g d'acide hyaluronique persulfaté sel de benzéthonium dans 14,7 g de dichlorométhane, on ajoute 2,7 g de tamis moléculaire 4 A. Le mélange est agité pendant 3 h 30. Le tamis moléculaire est séparé de la solution, rincé par 2,3 g de dichlorométhane. On ajoute 2,4 g d'iodure de méthyle à la solution anhydre d'acide hyaluronique persulfaté, sel de benzéthonium dans le dichlorométhane. Le mélange est agité à une température voisine de 20 C pendant 6 jours. Le mélange est ajouté à 45 ml d'une solution à 10% d'acétate de sodium dans le méthanol. Après 1 h d'agitation, on laisse sédimenter pendant environ 1 h et le surnageant est écarté puis remplacé par la même quantité de méthanol (35 ml). Après 15 minutes d'agitation, le produit est filtré, lavé par du méthanol (2 fois 5 ml), séché en dessiccateur puis séché à une température voisine de 50 C sous pression réduite (6kPa). On obtient 0,5 g d'ester méthylique de l'acide hyaluronique persulfaté, sel de sodium. Le rendement de la réaction est de 78 %.
Spectre proton dans D20, 400 MHz, T = 298 K, 8 en ppm: 2,0 (3H, s), 3,68 (1H, m), 3,71 (3H, s), 3,80 (1H, m), 4,05 (2H, m), 4,22 (1H, m), 4,26 (1H, m), 4,35 (1H, m), entre 4,4 et 4,55 (2H, m), 4,70 (2H, m), 4,83 (1H, m).
e) Préparation de l'acide hyaluronique persulfaté carboxy -réduit, sel de sodium (Carboxy-réduction) A une solution de 0,1g d'ester méthylique de l'acide hyaluronique persulfaté, sel de sodium dans 6 ml d'eau, on ajoute 0,93 g de NaBH4 par petites portions, à une température voisine de 20 C. Le mélange obtenu est agité à une température voisine de 20 C pendant environ 18h. Après refroidissement à une température voisine de 5 C, le milieu réactionnel est neutralisé à pH 7 avec de l'acide chlorhydrique concentré (12 N). Le mélange obtenu est chargé dans une membrane en ester de cellulose PM 10000 et mis en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 4 jours. Le contenu de la membrane est lyophilisé. On obtient 44 mg d'un lyophilisat blanc. Le rendement obtenu est de 44 %.
Spectre proton dans D20, 400MHz, T=333 K, â en ppm: 2,0 (3H, s), entre 3,6 et 3,72 (3H, m), 3,8 (1H, t, J=6Hz), 4,05 (2H, m), 4, 13 (1H, dd, J=7 et 3Hz), 4,2 (1H, t, J=7Hz), 4,4 (1H, t, J=3Hz), 4,48 (1H, d, J=8Hz), 4,6 (1H, t, J=3Hz), 4,75 (1H, d, J=7Hz), 4,82 (1H, d, J=3Hz).
EXEMPLE 3: Préparation de l'acide hyaluronique carboxy - 20 réduit et persulfaté, sel de sodium (Polysaccharide de formule (I) avec n = 0 à 25000, R = R1 = SO3Na) 1- Transalification Chlorure de Benzethonium - 2Py - SO3 / DMF 3- AcONa / McOH a) Préparation de l'acide hyaluronique persulfaté carboxy -réduit, sel de benzéthonium (trans-salification) A une solution de 0,218 g d'acide hyaluronique carboxy - réduit persulfaté, sel de sodium tel que décrit à l'exemple 2a ou 2b, dans 15 ml d'eau, on ajoute une 2864090 20 solution de 0,507 g de chlorure de benzéthonium dans 10 ml d'eau. Le produit est filtré, lavé à l'eau et séché. Après séchage pendant 48 h sous pression réduite (environ 6kPa) à une température voisine de 55 C. On obtient 0,453 g d'un solide blanc. Le rendement obtenu est de 69 %.
b) Préparation de l'acide hyaluronique carboxy-réduit persulfaté, sel de sodium (sulfatation) On dissout 0,45g d'acide hyaluronique persulfaté carboxy réduit, sel de benzéthonium dans 35 ml de diméthylformamide anhydre. A une température voisine de 20 C et sous agitation, on ajoute une solution de 0,61 g de complexe pyridine - anhydride sulfurique dans 28 ml de diméthylformamide anhydre. Après 3 heures d'agitation à une température voisine de 20 C, on ajoute un mélange de 32 ml d'eau et 190 ml d'une solution à 10 % d'acétate de sodium dans le méthanol. La suspension est filtrée. Le gâteau est lavé avec 4 portions de 50 ml de méthanol. Lesolide blanc obtenu est dissout dans 10 ml d'eau puis filtré sur membrane 0,45 m. Le filtrat est chargé dans une membrane en ester de cellulose PM 10000 et mis en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 24 heures. Le contenu des membranes est lyophilisé. On obtient 0,197g d'un lyophilisat blanc. Le rendement obtenu est quantitatif.
Spectre proton dans D20, 400MHz, T=303 K, 8 en ppm: 2,1 (3H, s), entre 3, 8 et 4,0 (3H, m), 4,1 (1H, t, J=7Hz), entre 4,2 et 4,6 (5H, m), 4,6 (1H, d, J=6Hz), entre 4,68 et 4,8 (3H, m), 5,18 (1H, s).
Tests pharmacologiques Effet des dérivés carboxyréduits sur l'Aggrecanase des fluides synoviaux ou sur des préparations de protéine recombinante ADAMTS.
2864090 21 L'analyse est effectuée sur des plaques 96-puits. Avant l'analyse, des dilutions sérielles des composés de l'essai sont préparées dans une solution aqueuse Digestion: Dans chaque puits, un volume fixe de fluide synovial ou d'activité aggrécanase générant une augmentation connue, entre 1,0 et 1,4 unités d'absorbance (405 nm) dans les conditions de l'analyse est mélangé avec 3 l de solution de composé de l'étape de dilution respective. Le milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) est ajouté à chaque puits pour fournir un volume final de 300 l. Ensuite, la plaque est incubée 1 heure à 37 C dans une atmosphère de dioxyde de carbone.
Après un ajout de 5 l d'une solution de 1 g/ l de substrat recombinant Aggimut dans le DMEM à chaque puits (substrat tel que décrit par Bartnik E. et al., EP 785274, 1997), le mélange réactif est incubé pendant 4 heures à 37 C sous atmosphère de dioxyde de carbone.
Préparation de la plaque d'analyse: Lors d'une première étape, la microplaque est enduite au moyen de 100 l par puits d'un anticorps antisouris de chèvre IgG du commerce pendant 1 heure à température ambiante (5 g/ml dans une solution saline de phosphate tamponnée pH 7,4 [Tampon PBS]). Après lavage avec le tampon PBS contenant 0,1% de Tween-20 (tampon de lavage), les puits sont bloqués par une étape d'une heure d'incubation au moyen de 100 l par puits de 5% de sérum d'albumine bovin dans un tampon PBS contenant 0,05 % de Tween-20. A la suite d'un autre rinçage au moyen du tampon de lavage, chaque puits est incubé avec 100 l d'une solution diluée à 1:1000 d'anticorps BC-3 dans un tampon PBS contenant 0, 05 % de Tween 20 et 0,5 % d'albumine de sérum bovin à température ambiante pendant une heure. Cet anticorps reconnaît les fragments de 2864090 22 clivage typiques de l'aggrécanase (Hughes C.E. et al., Biochem. J. 305 (3), 799-804, 1995).
Mode opératoire de l'essai: Après un autre rinçage de la plaque d'analyse avec le tampon de lavage, le jeu complet des mélanges provenant de la digestion précédente est transféré puits par puits vers cette plaque et incubé à température ambiante pendant une heure. La plaque est à nouveau lavée tel que ci-dessus. Ensuite, 100 gl du second anticorps (anticorps anti-humain IgG, marqué à la peroxydase, 1:1000 dans du PBS contenant 0, 5% de ASB et 0,05% de Tween-20) sont ajoutés à chaque puits, avec une incubation ultérieure à température ambiante pendant à nouveau une heure. A la suite d'un rinçage final avec le tampon de lavage, le développement de la couleur est initié par ajout de 100 gl de solution de substrat ABTS (2mg/ml, acide 2,2'-azinobis (3 ethylbenzothiazoline) sulfonique)dans 40 mM de citrate de sodium plus 60 mM d'hydrogenophosphate disodique, ajusté à un pH 4,4 par ajout d'acide acétique; 0,25 gl de peroxyde d'hydrogène à 35 % ajouté par ml immédiatement avant la mesure). La mesure est effectuée au moyen du mode de tamis à l'aide d'une détection à 405 nm par rapport à un filtre de référence (620 nm) avec des lectures automatiques à des intervalles de 5 secondes. Le développement est arrêté dès que le signal maximum (405 nm) dans la gamme d'absorbance de 1,0 à 1,4 est atteint.
Tableau 1
Concentration % Conversion deglycosaminoglycan (pg/ml) Produit Produit Produit exemple 2 exemple 3 exemple 1 17,4 21 100 1 16,9 27.4 100 0,1 17,0 28 100 0,01 47,6 54.3 100 0,001 88,9 84.9 100 0,0001 98 93 100 IC50 (gg/ml) 0,0088 0,025 pas d'inhibition d'inhibition Dans ce test, l'acide hyaluronique de départ ne montre pas d'activité inhibitrice de l'aggrecanase.
Effet du dérivé persulfaté carboxy-réduit (exemple 2) sur 5 l'aggrécanase de chondrocytes bovins cultivés dans des billes d'Alginate Afin de générer une activité de l'aggrécanase, les chondrocytes bovins mis en culture dans des gels de matrice d'alginate sont stimulés avec 10 ng/ml de IL-la pendant 3 jours conformément au procédé de Hughes C.E. et al., J. Biol. Chem. 273, 30576-30582, 1998.
Dans chaque puits d'une plaque de culture cellulaire 96 puits, 200 l de surnageant chondrocyte contenant une 2864090 24 activité de l'aggrécanase sont mélangés avec 100 gl de milieu de culture cellulaire DMEM. Aux concentrations à tester, 5 gl d'une solution aqueuse du produit de l'exemple 2 est ajouté pour inhiber l'activité de l'aggrécanase, une heure avant l'ajout de 5 gg de substrat recombinant Agglmut (Bartnik E. et al., EP 785274, 1997). Le mélange est incubé à 37 C pendant 17 heures et ensuite transféré dans une plaque ELISA afin de détecter les néoépitopes générés par l'activité de l'aggrécanase en liant de l'anticorps BC-3 tel que décrit auparavant (Hughes C.E. et al., Biochem. J. 305 (3), 799-804, 1995).
Tableau 2
(% d'inhibition de la conversion du substrat par activité 15 de l'aggrécanase dans le surnageant) Concentration % Inhibition du produit de
l'exemple 2
( g/ml) 85 83,9 1 13,7 0,1 0 0,01 0 IC50: 0,0033 mg/ml Inhibition du facteur Xa Pour la calibration, un échantillon standard d'héparine de bas poids moléculaire (Enoxaparine) a été utilisé comme référence Les dilutions sérielles du composé de l'essai sont préparées dans un tampon de 0,046 M Tris pH 8,4 contenant 0,15 M NaCl, 0,007 M EDTA, 0,1% de Tween 80 et 0,12 IU/ml d'antithrombine humaine III. Les échantillons de 50 gl des dilutions respectives sont incubés avec 50 gl de facteur bovin Xa (13, 6 U/ml) à 37 C pendant 80 secondes. Ensuite, 50 gl de substrat chromogénique 1,1 mM S-2765 sont ajoutés. L'absorbance à 405 nm est mesurée dans un photomètre. L'activité du facteur débloqué Xa est indiquée par l'émission de p-nitroaniline à partir du substrat.
Lorsque comparés au composé d'héparine de bas poids moléculaire de référence (100 U/mg), les glycosamonoglycanes présentent un facteur Xa d'activité inhibitrice bien inférieur: Produit exemple 2: 0,485 U/mg Produit exemple 3: 1,75 U/mg Effet du dérivé persulfate carboxy-réduit (exemple 2) des métalloproteases humaines MMP-2 (gelatinase-A) et MMP7 Des Kit ELISA commerciaux (comme ceux fournis par exemple par la société Amersham Biosciences, kits RPN2617 and RPN 2620) ont été respectivement utilisés pour la détermination de l'activité inhibitrice des enzymes MMP2 et MMP-7. Les concentrations des enzymes sont respectivement de 800 ng/ml pour MMP-2 et 300 ng/ml pour MMP-7. Les tests ont été réalisés en accord avec les recommandations du fabricant en réalisant une série de dilutions du composé à étudier dans un tampon PBS pH 7.5.
2864090 26 Les enzymes MMP-2 et MMP-7 ont été toutes deux inhibées de façon concentration -dépendante.
Dérivé obtenu selon l'exemple 2 IC50: 0.8 pg/ml (effect on MMP-2) 0.2 pg/ml (effect on MMP-7) Effets des dérivés carboxy-réduits selon l'invention sur l'Elastase de Neutrophiles humains Une enzyme disponible dans le commerce (par exemple, de l'élastase neutrophile humaine, Sigma n E8140) est reconstituée en aliquots de 0,1 mg par fiole à l'aide de 0,276 ml de tampon d'acétate de sodium à 50 mM pH 5,5 contenant 200 mM NaCl (solution mère de l'enzyme); 11 gl de cette solution mère sont dilués avec 1,1 ml du tampon HEPES ci-dessus (solution d'essai de l'enzyme).
La solution de substrat est préparée en dissolvant 118 mg de Methoxysuccinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Val-p- nitroanilide dans 1 ml de DMSO (solution mère, par exemple, Sigma n M4765). En vue de l'application dans l'analyse, 9 gl de solution mère sont ensuite dilués dans 20 1,19 ml d'eau.
Les dilutions sérielles des composés de l'essai sont préparées dans 100 mM de tampon HEPES contenant 500 mM NaCl. L'analyse est effectuée sur des microplaques en polystyrène 96 puits incolores (par exemple, Corning Costar, n 3695).
gl de solution d'enzyme d'essai sont mélangés avec 10 gl de la solution respective de composé dilué et 10 gl de la solution de substrat. Au bout de 15 min d'incubation, le clivage du substrat est lu en tant qu'augmentation de l'absorbance à 405 nm 2864090 27 Le produit de l'exemple 2 inhibe l'elastase de neutrophile humain avec une IC50 de 0,15 pg/ml.
L'inhibition par le produit de l'exemple 3 est significativement inférieure avec une IC50 de 7,0 pg/ml.
2864090 28
Claims (26)
1. Dérivés carboxy-réduits et chemiosélectivement O-sulfatés de l'acide hyaluronique, isolés ou en mélange, ainsi que leurs sels.
2. Dérivés carboxy-réduits de l'acide hyaluronique selon la revendication 1 de formule (I) :
OH
dans laquelle R représente SO3M et R1 représentent H ou SO3M, n est un entier compris entre 0 et 25000, M est un métal alcalin, les dits dérivés étant sous la forme d'un composé isolé ou sous forme de mélanges, ainsi que leurs diastéréoisomères.
3. Dérivés carboxy-réduits de l'acide Hyaluronique selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que le M est 15 choisi parmi sodium, calcium, magnésium et potassium.
4. Dérivés carboxy-réduits de l'acide Hyaluronique selon la revendication 2 ou 3 caractérisé en ce que M est un atome de sodium.
5. Dérivés carboxy-réduits de l'acide Hyaluronique selon 20 l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que R et R1 représentent SO3Na.
6. Dérivés carboxy-réduits de l'acide Hyaluronique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que R représente SO3Na et R1 représente H. 2864090 29
7. Procédé de préparation des dérivés carboxy-réduits de l'acide Hyaluronique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel on met en uvre successivement les étapes suivantes: - trans-salification de l'acide Hyaluronique par un sel d'ammonium quaternaire, - Sulfatation en milieu organique de l'acide Hyaluronique transalifiée suivie d'une salification, - carboxy-réduction du dérivé persulfaté - Soit a) au moyen d'un dérivé de carbodiimide ( pour former un adduit activé) et en présence d'un agent réducteur, - Soit b) par estérification, le dérivé persulfaté étant le cas échéant préalablement trans- salifié par un sel d'ammonium quaternaire, suivie d'une réduction du dérivé ester correspondant par action d'un agent réducteur puis, - le cas échéant, trans-salification du dérivé persulfaté carboxy-réduit par un sel d'ammonium quaternaire puis resulfatation suivie d'une salification.
8. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que la sulfatation s'effectue en milieu organique au moyen d'un complexe d'anhydride sulfurique avec une base organique telle que la pyridine ou la triméthylamine.
9. Procédé selon la revendication 7 ou 8 caractérisé en ce que la sulfatation s'effectue à partir d'un sel de benzéthonium de l'acide hyaluronique, en présence de 10 à 30 équivalents de complexe pyridine anhydride sulfurique par fonction hydroxyle à sulfater, et à une température comprise entre 10 et 70 C et notamment entre 50 et 70 C.
2864090 30
10. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que la carboxy- réduction s'effectue au moyen de chlorhydrate de 1-(3-diméthyl aminopropyl)-3-éthylcarbodiimide en présence du borohydrure de métal alcalin tel que le borohydrure de sodium.
11. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'on utilise préférentiellement 5 à 20 équivalents de chlorhydrate de 1-(3-diméthyl aminopropyl)-3-éthylcarbodiimide et à un pH compris entre 4 et 5.
12. Procédé selon la revendication 10 à 11 caractérisé en ce qu'on utilise encore plus préférentiellement 7 à 13 équivalents de chlorhydrate de 1-(3-diméthyl aminopropyl)-3-éthylcarbodiimide et à un pH compris entre 4,3 et 4,9.
13. Procédé selon la revendication 10 à 12 caractérisé en ce que la réduction de l'adduit activé du dérivé de l'acide hyaluronique est réalisée avec 10 à 300 équivalents de borohydrure de métal alcalin à une température comprise entre 10 et 70 C.
14. Procédé selon la revendication 10 à 12 caractérisé en ce que la réduction de l'adduit activé est réalisée en présence de 140 à 250 équivalents de borohydrure de métal alcalin à une température comprise entre 20 et 50 C.
15. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que la carboxyréduction s'effectue par réduction d'un ester méthylique en présence de borohydrure de métal alcalin tel que le borohydrure de sodium.
16. Procédé selon la revendication 15 caractérisé en ce qu'on prépare l'ester méthylique à partir d'un dérivé de l'acide Hyaluronique, sel de benzéthonium, en solution dans le dichlorométhane en présence de 2 à 20 équivalents 2864090 31 et en particulier de 4 à 10 équivalents d'iodure de méthyle.
17. Procédé selon la revendication 15 à 16 caractérisé en ce que la réduction de l'ester du dérivé de l'acide Hyaluronique est réalisée avec 10 à 300 équivalents de borohydrure de métal alcalin à une température comprise entre 10 et 50 C.
18. Procédé selon la revendication 15 à 17 caractérisé en ce que la réduction de l'ester est réalisée en présence de 140 à 250 équivalents de borohydrure de métal alcalin à une température voisine de 20 C.
19. Procédé selon la revendication 7 pour l'obtention des dérivés de formule (I) tels que définis à la revendication 5 caractérisé en ce que la sulfatation du dérivé persulfaté carboxy-reduit, sel de benzéthonium tel que défini à la revendication 6, s'effectue en milieu organique au moyen d'un complexe d'anhydride sulfurique avec une base organique telle que la pyridine ou la triméthylamine à environ 20 C.
20. procédé selon la revendication 7 mettant en oeuvre les étapes suivantes: - Trans-salification de l'Acide Hyaluronique par le chlorure de Benzéthonium - Sulfatation d'un sel d'ammonium quaternaire de l'acide Hyaluronique en milieu organique au moyen d'un complexe d'anhydride sulfurique avec la pyridine ou la triméthylamine,suivie d'une salification par l'acétate de sodium, - Soit a) Carboxy-réduction au moyen du chlorhydrate 30 de 1-(3-diméthyl aminopropyl)-3-éthylcarbodiimide en présence du borohydrure de sodium, 2864090 32 - soit b) estérification par action de iodure de méthyle sur le dérivé de l'Acide Hyaluronique préalablement trans-salifié par le chlorure de Benzéthonium puis réduction de 1' ester méthylique correspondant par le borohydrure de sodium.
- le cas échéant trans-salification du dérivé sulfaté carboxy-réduit par le chlorure de Benzethonium puis resulfatation par le complexe d'anhydride sulfurique - base organique, suivie d'une salification par l'acétate de sodium.
21. Procédé d'obtention des dérivés isolés de l'acide hyaluronique carboxy-réduits et chemiosélectivement O-sulfatés selon la revendication 1 à 6 à partir du mélange de dérivés carboxyréduits de l'acide Hyaluronique tels qu'obtenus selon le procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 20, caractérisé en ce qu'on fractionne le mélange par chromatographie sur des colonnes remplies de gel de type polyacrylamide agarose ou un gel de polyacrylamide, le mélange étant élué par une solution d'hydrogénocarbonate de sodium, notamment de 0,1 à 1 mole/l.
22. A titre de médicaments les composés tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 6.
23. A titre de médicaments selon la revendication 22, les composés tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour traiter ou prévenir les désordres qui affichent une activité accrue d'au moins une des métalloprotéinases de matrice, telle que l'elastase neutrophile, la matrilysine (MMP-7), l'aggrécanase hADAMTS1 et la gélatinase A (MMP-2) .
24. A titre de médicaments selon la revendication 22 ou 23, les composés tels que définis à l'une quelconque des 2864090 33 revendications 1 à 6 pour traiter ou prévenir des désordres tels que la dégénérescence articulaire, la spondylose, la chondrolyse, associée à un traumatisme de l'articulation ou une immobilisation prolongée de l'articulation, les désordres des tissus conjonctifs, les troubles de la cicatrisation de plaie, les désordres parodontaux, les désordres chroniques du système locomoteur, les arthropathies, les myalgies, ou les désordres du métabolisme osseux.
25. les compositions pharmaceutiques renfermant un médicament tel que défini à l'une quelconque des revendications 22 à 24 et un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
26. Dérivés carboxy-réduits et chemiosélectivement 0- sulfatés de l'acide hyaluronique, isolés ou en mélange tels que définis selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, susceptibles d'être obtenus selon le procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications 7 à 21.
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