JPH09286803A - 中分子ヘパリン、アミノ酸誘導体および医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、中分子ヘパリンおよび中分子ヘパ
リニル−アミノ酸または−アミノ酸低級アルキルエステ
ル、および中分子ヘパリンのアミノ酸誘導体を有効成分
とする医薬組成物を提供する。 【解決手段】 平均分子量８,５００〜９,５００を有す
る中分子ヘパリン、中分子ヘパリンから誘導される中分
子ヘパリニルアミノ酸誘導体および中分子ヘパリニルア
ミノ酸誘導体の１種を有効成分とするヘパリン活性医薬
組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、中分子ヘパリンの
アミノ酸誘導体に関する。より具体的には、中分子ヘパ
リニル−アミノ酸または−アミノ酸低級アルキルエステ
ルに関する。また、本発明は、中分子ヘパリンのアミノ
酸誘導体を有効成分とする医薬組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ヘパ
リンは、肝、小腸、肺、皮膚などに存在する複雑な構造
をもつヘテロ多糖であり、分子量4,000〜20,000の酸性
ムコ多糖である。すなわち、糖鎖はＤ−グルコサミン、
Ｄ−グルクロン酸を含んでおり、グルコサミンのアミノ
基は部分的に硫酸エステルになっている。強い血液抗凝
固活性を有しており、汎発性血管内血液凝固症候群(Ｄ
ＩＣ)の治療、種々の血栓塞栓症(静脈血栓症、心筋梗塞
症、肺塞栓症、脳塞栓症、四肢動脈血栓塞栓症、術中・
術後の血栓塞栓症など)の治療および予防のほか、血液
透析・人工心肺などの体外循環装置使用時や血管カテー
テル挿入時または輸血および血液検査の際などにおける
血液凝固の防止に用いられている。

【０００３】しかし、ヘパリンは抗Ｘa活性に基づく強
力な血液抗凝固作用を有することから、血液凝固時間の
延長に伴う出血傾向の憎悪という重篤な副作用がある。
また、脂質分解作用による高中性脂肪血症や遊離脂肪酸
増加、低ＨＤＬ血症、あるいは長期連用による血小板減
少症の発症も知られている。

【０００４】一方、血液体外循環時の灌流血液の凝固防
止やＤＩＣの治療には、メシル酸ガベキサートやメシル
酸ナファモスタットなどの蛋白分解酵素阻害剤も用いら
れているが、これらの薬剤は、代謝産物であるグアニジ
ン化合物によって消化器障害が発現する。さらに、分子
量が539ダルトンと小さく、ダイアライザーから透析除
去されるため、回路内凝血、特にダイアライザー後の静
脈側ドリップチャンバー内で凝血が発生する。

【０００５】近年、ヘパリンの解重合により得られる分
子量約5,000ダルトン以下の低分子量分画である低分子
ヘパリン(ダルテパリンナトリウム)に、血液凝固第Ｘ因
子に対する阻害活性及び活性化部分トロンボプラスチン
時間に対する延長作用の比率の増大が確認され、出血傾
向が比較的少ない血液抗凝固剤として使用されつつあ
る。しかしながら、この低分子ヘパリン製剤によっても
前記の副作用を完全に改善するには至っておらず、ま
た、高用量での使用においてヘパリンよりも高い頻度で
骨多孔症が発生することが認められている。

【０００６】また、ヘパリンとグリシンとの化合物であ
るヘパリニルグリシンが、出血傾向の少ない血液抗凝固
剤であることが報告されているが、このものは血液抗凝
固活性も低下してしまうという問題点があるため、実用
化されるには至っていない。

【０００７】以上のように、上記のヘパリンをはじめと
する血液抗凝固剤は、出血傾向の増大という重篤な副作
用などが発現するおそれがあるものの、特に、血液透析
・人工心肺などの体外循環装置使用時の血液凝固防止に
は欠かせない薬剤であり、また、代替すべき適当な他の
薬物もないことから、ある程度の危険性を承知の上で、
使用せざるを得ないのが現状であった。

【０００８】一方、ヘパリンは前述の血液抗凝固活性の
他に、リポ蛋白リパーゼ活性化作用、抗血小板凝集作
用、血圧低下作用、抗補体作用、癌転移抑制作用および
肥満細胞からの脱顆粒阻害作用などの多くの生理活性を
有することが知られている。しかしながら、血液抗凝固
活性に伴う出血傾向があまりに強いため、血液抗凝固目
的以外に用いることはできなかった。

【０００９】本発明者らは、出血傾向などの副作用の少
ない血液抗凝固剤について検討した結果、ヘパリンを解
重合して平均分子量８,５００〜９,５００の中分子ヘパ
リンの画分を採取し、さらにこの中分子ヘパリンをアミ
ノ酸誘導体化した化合物がこの目的を達成することを見
出し、本発明を完成するに至った。また、本発明の中分
子ヘパリニルアミノ酸誘導体は、本来ヘパリンが有して
いる各種の生理活性を損なうことなく、出血傾向を軽減
することができるため、従来、重篤な副作用ゆえに適用
できなかった種々の疾病に対しても有効に使用すること
ができる。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明の第１の態様は平
均分子量８,５００〜９,５００を有する中分子ヘパリン
である。

【００１１】本発明の第２は上記の中分子ヘパリンから
誘導される中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体であり、よ
り具体的には、中分子ヘパリニルアミノ酸または中分子
ヘパリニルアミノ酸低級アルキルエステルである。

【００１２】さらに、具体的には、中分子ヘパリニルア
ミノ酸誘導体が、 一般式：ＮＨ₂ＣＨ(Ｒ₁)ＣＯＯＲ₂ ［式中、Ｒ₁は、Ｈ；アミノ酸のα−アミノ基のＮおよ
びα位のＣと共にピロリジン環を形成するか；または、
ＯＨで置換されていてもよいフェニル、ＯＨ、ＮＨ₂、
ＳＨ、ＳＣＨ₃、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ₂、グアニジノ（Ｎ
Ｈ₂Ｃ(＝ＮＨ)ＮＨ−）、インドリルおよび１Ｈ−イミ
ダゾリルからなる群から選ばれる基で置換されていても
よい低級アルキルであり、Ｒ₂は、Ｈまたは低級アルキ
ルである］で示される化合物である。

【００１３】本発明のアミノ酸は、好ましくは天然のア
ミノ酸であるか、より好ましくは必須アミノ酸である。

【００１４】本発明の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体
には抗凝血活性および腎メサンギウム細胞増殖抑制活
性、癌転移抑制活性、補体活性化抑制活性、肺水腫抑制
活性、腎疾患抑制活性、ラジカルスカベンジャー活性お
よび肥満細胞からの脱顆粒阻害作用を示すことが確認さ
れているところから、本発明の第３の態様は、中分子ヘ
パリニルアミノ酸誘導体を含むこれらの活性を有する医
薬組成物である。

【００１５】本発明で用いる中分子ヘパリンは、解重合
ヘパリンの平均分子量８,５００〜９,５００の画分をい
う。最小分子量が４,５００、最大分子量１２,５００で
あり、分子量５,０００〜１０,０００が中分子ヘパリン
中７０％以上のものをいう。

【００１６】また、本発明で用いるアミノ酸は、合成
物、天然物を問わずアミノ基とカルボキシル基を有する
化合物であれば特に制限はないが、グリシン、アラニ
ン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニ
ン、チロシン、セリン、トレオニン、システイン、メチ
オニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン
酸、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、ト
リプトファン、プロリンなどのα−アミノ酸またはその
誘導体類が好適に用いられる。これらのアミノ酸はＤ
体、Ｌ体またはＤＬ体のいずれでもよい。本発明の低級
アルキルとは飽和の直鎖または分枝状の、炭素原子１〜
６個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個を
含む炭化水素残基をいう。例えばメチル、エチル、プロ
ピル、イソプロピル、ブチル、ｔ−ブチルなどが包含さ
れる。本発明の化合物には一般に生体内において遊離形
と実質的に同様の生理活性または薬理活性を発揮するも
の、例えば、本発明の化合物の誘導体および医薬的に許
容される塩、付加塩、水和物などは本発明の技術的範囲
に含まれるものである。

【００１７】中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体の製造 （１）中分子ヘパリンの調製 通常のヘパリンを酵素分解法、亜硝酸分解法、過酸化水
素分解法などの常法により解重合した後に、例えば、限
外濾過などの分画手段を用いて分画したもので、平均分
子量が８,５００〜９,５００の画分からなる。

【００１８】例えば、ヘパリンを水に溶解し、陽イオン
交換樹脂を加えてｐＨ３.３０〜３.４０とした後、濾過
する。濾液に過酸化水素水を加え、加圧加熱して解重合
する。加熱終了後、反応液に水酸化ナトリウム水溶液を
加えて、限外濾過を繰り返して分子量分画を行う。エタ
ノールによる再結晶を行い、中分子ヘパリンを得る。

【００１９】（２）中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体の
調製 前述の中分子ヘパリンを、例えば、１−エチル−３−
(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩を
用いてカルボキシル基をエステル化した後、上記アミノ
酸のエステル体を加えて中分子ヘパリニルアミノ酸エス
テルとし、さらにアルカリ条件下で加水分解して中分子
ヘパリニルアミノ酸を得る。例えば、中分子ヘパリンを
水に溶解し、ｐＨ４.７５に調整後、対応するアミノ酸
エステル塩酸塩（中分子ヘパリンに対するモル比、１：
１００）を加える。

【００２０】さらに、１−エチル−３−(３−ジメチル
アミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（中分子ヘパリ
ンに対するモル比、１：５０）の水溶液を徐々に加え、
約４時間攪拌反応させた後、水および臭化ヘキサデシル
トリメチルアンモニウム水溶液をアンモニウム塩の沈澱
物が生じなくなるまで加える。次いでこの沈澱物を分離
後、沈澱物にヨウ化ナトリウムのエタノール溶液を加え
る。攪拌後、濾過し、沈澱物をエタノールで再結晶し
て、白色粉末の中分子ヘパリニルアミノ酸エステルを得
る。

【００２１】この中分子ヘパリニルアミノ酸エステルに
水酸化ナトリウム水溶液を加え、窒素気流下、０〜５℃
にて長時間攪拌する。反応液を酢酸でｐＨ５に調整後、
濾過し、濾液にエタノールを加えて、白色粉末の中分子
ヘパリニルアミノ酸を得る。

【００２２】こうして得られる中分子ヘパリニルアミノ
酸誘導体は、通常の方法により製剤化し、注射剤や経口
剤として投与することができる。例えば以下のような投
与法によって投与されるが、その投与量あるいは投与速
度は、通常本剤投与後、全血凝固時間または全血活性化
部分トロンボプラスチン時間を測定しつつ、年齢、症
例、適応領域あるいは目的によって決定される。

【００２３】例えば、静脈内点滴投与法では、中分子ヘ
パリニルアミノ酸誘導体の５,０００〜５０,０００ヘパ
リン単位に相当する量を５％ブドウ糖注射液、生理食塩
液またはリンゲル液１,０００ｍｌで希釈し、１分間に
２０〜３０滴前後の速度で静脈内に点滴投与する。ま
た、静脈内間歇注射法では、中分子ヘパリニルアミノ酸
誘導体の５,０００〜５０,０００ヘパリン単位に相当す
る量を４〜８時間毎に静脈内に注射する。皮下注射・筋
肉内注射法では、１回５,０００〜１０,０００ヘパリン
単位に相当する量の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体を
４時間毎に皮下注射または筋肉内注射する。

【００２４】体外循環時（血液透析・人工心肺）におけ
る使用において、人工腎では各患者の適正使用量は透析
前のヘパリン感受性試験の結果に基づいて算出される
が、全身ヘパリン化法の場合、通常透析開始に先だっ
て、１,０００〜３,０００ヘパリン単位に相当する量の
中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体を投与し、透析開始後
は、１時間あたり５００〜１,５００ヘパリン単位に相
当する量を持続的に、または１時間毎に５００〜１,５
００ヘパリン単位に相当する量を間歇的に追加する。局
所ヘパリン化法の場合は、１時間あたり１,５００〜２,
５００ヘパリン単位に相当する量を持続注入する。ま
た、人工心肺灌流時では、術式・方法によって異なる
が、１５０〜３００ヘパリン単位/kgに相当する量を投
与し、更に体外循環時間の延長に応じて適宜追加投与す
る。

【００２５】経口投与の場合は、５００〜２,０００ヘ
パリン単位/ｇに相当する量の中分子ヘパリニルアミノ
酸誘導体を１日１〜数回服用する。外用剤の場合は、１
００〜５００ヘパリン単位/ｇに相当する量の中分子ヘ
パリニルアミノ酸誘導体の軟膏として用いられ、適量を
１日１〜数回塗擦またはガーゼなどに延ばして貼付す
る。

【００２６】座剤の場合は、１,０００〜４,０００ヘパ
リン単位/ｇに相当する量の中分子ヘパリニルアミノ酸
誘導体を１日１〜２回肛門または膣に適用する。

【００２７】薬理実験 I. in vitroにおけるＡＰＴＴ測定 本発明の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体における出血
傾向の低減効果を調べるために、各化合物の活性化部分
トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）に対する影響を測
定した。ヒト正常血漿(Ｃoagulation Ｃontrol Ｐlasma
(Ｎormal)Ｌevel １：Ｐacific Ｈemostasis製)９容量
に、種々の濃度に調製したヘパリン、中分子ヘパリンお
よび中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体水溶液１容量を加
えて被験血漿とする。別にＰＢＳ（−）１容量をとり、
被験血漿と同様に操作し、対照血漿とする。被験血漿お
よび対照血漿につき、活性化部分トロンボプラスチン試
薬（ＡＰＴＴテストワコー：和光純薬工業製）および塩
化カルシウム溶液を添加後、血漿凝固時間自動測定器(A
melung-coagulometer)を用いて、各血漿のＡＰＴＴを測
定した。結果を表１に示す。ヒト正常血漿におけるＡＰ
ＴＴ延長作用は、いずれの化合物においてもヘパリンに
比べて軽度であり、出血傾向が低下していることが明ら
かになった。

【００２８】II．in vitro における抗Ｘa活性測定 本発明の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体の血液抗凝固
活性を調べるために、各化合物の抗Ｘａ活性を測定し、
ヘパリン、低分子ヘパリンおよび低分子ヘパリニルアミ
ノ酸誘導体と比較した。なお、低分子ヘパリンはヘパリ
ンを常法により解重合したもの、また、低分子ヘパリニ
ルアミノ酸誘導体は、この低分子ヘパリンを原料とし、
前述の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体の調製法に準じ
て製した。ヒト正常血漿(Ｃoagulation Ｃontrol Ｐlas
ma(Ｎormal)Ｌevel １：ＰacificＨemostasis製)２容量
に、種々の濃度に調製したヘパリン、中分子ヘパリンお
よび中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体水溶液２容量を加
え、さらに緩衝液(50mMの2−アミノ−2−ヒドロキシル
−1,3−プロパンジオール、pH8.4)を６容量加えて被験
血漿とする。

【００２９】被験血漿につき、Ｘa因子、基質液および
反応停止液を添加後、405nmにおける吸光度から残存す
るＸa因子を測定した。結果を表１に示す。ＡＰＴＴお
よび抗Ｘa活性の結果から、血液抗凝固能の指標となる
抗Ｘa/ＡＰＴＴ活性比を求めた。結果を表１に示す。ヘ
パリンを解重合して中分子画分を選別し、さらにアミノ
酸誘導体とすることにより、血液抗凝固活性を維持しつ
つ、重篤な出血傾向を軽減できることが明らかになっ
た。

【００３０】

【表１】 中分子ヘパリンおよび中分子ヘパリニルアミノ酸のＡＰＴＴ、抗Ｘa活性 および抗Ｘa/ＡＰＴＴ活性比 ＡＰＴＴ 抗Ｘa活性 抗Ｘa/APTT比 化 合 物 用量 ヘハ゜リン比 IC50 1/ヘハ゜リン比 (μg/ml)* (μg/ml) ヘパリン 4.79 1.00 0.69 1.00 1.00 低分子ヘパリン ６５．０ １３．５７ ２．８４２
０．２４４２ ３．３１ 低分子ヘハ゜リニルアルキ゛ニン ２０００．０ ４１７．５４
６０００ ０．０００１ ０．０５ 低分子ヘハ゜リニルアスハ゜ラキ゛ン酸 516.7 107.87 11138 0.0001 0.01 低分子ヘハ゜リニルフェニルアラニン 303.6 63.38 609.36 0.0011 0.07 低分子ヘハ゜リニルフ゛ロリン 650.0 135.70 106.24 0.0065 0.89低分子ヘハ゜リニルセリン 240.0 50.10 59.09 0.012 0.59 中分子ヘパリン 14.79 3.09 1.23 0.562 1.74 中分子ヘハ゜リニルク゛リシン 53.70 11.21 18.88 0.037 0.41 中分子ヘハ゜リニルアラニン 30.90 6.45 4.38 0.159 1.02 中分子ヘハ゜リニルアルキ゛ニン 85.11 17.77 27.61 0.025 0.45 中分子ヘハ゜リニルアスハ゜ラキ゛ン酸 31.56 6.59 63.21 0.011 0.07 中分子ヘハ゜リニルヒスチシ゛ン 57.54 12.01 26.37 0.026 0.32 中分子ヘハ゜リニルロイシン 35.96 7.51 8.71 0.080 0.60 中分子ヘハ゜リニルメチオニン 35.48 7.41 24.61 0.028 0.21 中分子ヘハ゜リニルフェニルアラニン 40.27 8.41 30.98 0.022 0.19 中分子ヘハ゜リニルフ゜ロリン 28.18 5.88 1.91 0.363 2.14 中分子ヘハ゜リニルセリン 26.86 5.61 10.96 0.063 0.36中分子ヘハ゜リニルチロシン 38.90 8.12 8.34 0.083 0.68 ＊ 凝固時間を100秒に延長した濃度

【００３１】副作用の指標であるＡＰＴＴについては、
本発明の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体は、いずれ
も、血液凝固時間を１００秒に延長した濃度は、ヘパリ
ンの６〜１７倍であり、ヘパリンと比較して明らかな副
作用の低減が認められた。また、低分子ヘパリン（１
３.５７）との比較においても同等若しくはそれ以上の
副作用の低減が確認された。従来、低分子ヘパリンの血
液抗凝固作用の指標として、抗Ｘa／ＡＰＴＴ活性比が
用いられ、この比が高いほど出血傾向が弱く、かつ血液
抗凝固能が強いとされている（長沼信治ら、医学ジャー
ナル、第２７巻、５５頁、１９９１年）。通常のヘパリ
ンを１としたときの抗Ｘa／ＡＰＴＴ活性比は、中分子
ヘパリニルプロリンが２.１４と高活性を示した他、低
分子ヘパリニルアミノ酸に比べて同等若しくはそれ以上
の活性を示した。

【００３２】III．中分子ヘパリニルアミノ酸の腎メサ
ンギウム細胞増殖抑制効果 近年、ヘパリンの薬理作用の一つとして、腎メサンギウ
ム細胞の増殖抑制効果が報告されていることから（Ｃas
tellot,Ｊ.Ｊ.et al.,アメリカン・ジャーナル・オブ・
パソロジー（Ａm.Ｊ.Ｐathol.）,第１２０巻、４２７
頁、１９８５年）、ヘパリンの有するこの腎メサンギウ
ム細胞増殖抑制効果について、中分子ヘパリニルアミノ
酸のうち、中分子ヘパリニルフェニルアラニンを被験薬
物とし、ヘパリンを対照として検討した。

【００３３】（１）糸球体および腎メサンギウム細胞の
培養 糸球体は種類の異なる篩を連続的に用いる方法（sievin
g method）により単離した。体重約１５０ｇのＷistar
系雄性ラット（日本チャールス・リバー）をエーテルで
麻酔し、背部を剃毛した後、頸動脈を切断し、放血し
た。放血終了後、ラットをクリーンベンチ内に入れ、背
部側から腎臓を摘出し、ＰＢＳ（−）（カルシウムおよ
びマグネシウムを含まないリン酸緩衝液）を満たしたシ
ャーレに保存した。腎臓の被膜を剥離し、腎皮質を細切
した。この細片を金属篩（篩サイズ３５５μｍ、１２５
μm、７５μmの順）上に置き、スパーテルで押し潰しな
がら篩を通過させ、篩サイズ７５μmの篩上に残った糸
球体を回収しＰＢＳ（−）に懸濁した。この懸濁液を１
０００rpmで５分間遠心分離し、上澄を除去し、得られ
た糸球体を０.２％トリプシン液で３７℃、２０分間、
さらに０.１％コラゲナーゼ液で３７℃、４０分間イン
キュベーションした。その後、糸球体を洗浄し、２０％
牛胎児血清（Ｂiowhittaker製）および０.６６Ｕ／mlの
インスリンを含有するＲＰＭＩ １６４０培養液（日水
製薬製）に懸濁し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で培養
した。培養７日目に培養液を交換し、それ以降は２〜３
回／週の頻度で培養液を交換した。培養２１日目に糸球
体周囲に増殖した腎メサンギウム細胞を培養フラスコか
らトリプシン−ＥＤＴＡ溶液で剥離し、継代した。本実
施例では、第３〜１０継代細胞を用いた。

【００３４】（２）腎メサンギウム細胞増殖に対する中
分子ヘパリニルフェニルアラニンの効果 腎メサンギウム細胞を２０％牛胎児血清添加培養液に加
え、２４−ウェルのマイクロプレート（コーニング製）
を用い、細胞数５〜８×１０³cell／wellの条件で２４
時間培養した。さらに、０.４％牛胎児血清添加培養液
に置換して３日間培養した後、１０％牛胎児血清添加培
養液に置換し、被験薬物または対照薬物を添加した。４
日後に細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液で剥離し、Ｃou
lter Ｃounter（日科機製）を用いて細胞数を測定し
た。なお、各薬物の添加量は全容量の１／１０容量とし
た。下式に示す制御率により腎メサンギウム細胞増殖に
対する抑制効果を評価した。

【数１】

【００３５】実験の結果、対照のヘパリンは１〜１００
μg／mlの用量において、腎メサンギウム細胞増殖を用
量依存的に４０.５〜８３.５％抑制した。一方、中分子
ヘパリニルフェニルアラニン１００μg／mlの抑制率
は、９５.０％であり、腎メサンギウム細胞増殖抑制効
果が認められた。

【００３６】IV．中分子ヘパリニルアミノ酸の癌転移抑
制効果 ヘパリンのグリシン誘導体であるヘパリニルグリシンに
癌転移抑制効果作用が報告されていることから（Ｖilla
nueva,Ｇ.Ｂ.et al.,アナルズ・ニューヨーク・アカデ
ミー・オブ・サイエンシズ（Ａnn.Ｎ.Ｙ.Ａcad.Ｓc
i.）、第５５６巻、４９６頁、１９８９年）、中分子ヘ
パリニルアミノ酸誘導体の癌転移抑制作用について、ヘ
パリンを対照とし、in vitroケモインベーションアッセ
イ法およびマウスの実験的腫瘍肺転移系を用いて検討し
た。

【００３７】（１）癌細胞 Ｆidlerの方法（Ｆidler,Ｉ.Ｊ.,ネイチャー（Ｎatur
e）,第２４２巻、１４８頁、１９７３年）に準じて作成
した肺高転移性のＢ１６マウスメラノーマ細胞（Ｂ１６
−Ｆ７またはＦ１０）を使用した。５％牛胎児血清含有
Ｆ１２／ＤＭＥ（１：１）培養液中、５％炭酸ガス存在
下、３７℃で培養した細胞を実験に供した。

【００３８】（２）実験動物 生後７週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣrj系マウス（日本
チャールス・リバー）を使用した。

【００３９】（３）癌転移抑制効果の検討 操作 ケモインベーション誘発因子の調製 Ｓub−confluentな状態にある３Ｔ３細胞を無血清Ｆ１
２／ＤＭＥ（１：１）培地中で３７℃炭酸ガスインキュ
ベーター内で２４時間培養後の培養上清を無血清Ｆ１２
／ＤＭＥ（１：１）培地で２倍希釈したものをケモイン
ベーション誘発因子とした。

【００４０】in vitroケモインベーション法 ２４穴プレートウェル内に上記で調製したケモインベー
ション誘発因子７００μlを入れ、チャンバー内には０.
１％ＢＳＡ含有Ｆ１２／ＤＭＥ（１：１）培地中に懸濁
されたＢ１６−Ｆ７細胞５×１０⁴個（２００μl）を添
加した。中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体をチャンバー
内に５００μg／mlとなるように加え、２４穴プレート
に蓋をした後、炭酸ガスインキュベーター内で２４時間
静置した。その後チャンバーを取り出し、チャンバー中
のメンブレン下面に浸潤したＢ１６−Ｆ７細胞をギムザ
染色後、メンブレンを切り出し、スライドグラス上に封
入した。封入終了後、Ｂ１６−Ｆ７細胞を顕微鏡下（×
２００）で、Ｍiller ocular discを用いて、０.２０２
５mm²あたりの浸潤細胞数をカウントした。

【００４１】結果 結果を表２に示す。表から明らかなように、中分子ヘパ
リンおよび中分子ヘパリニルアミノ酸は、メチオニンお
よびフェニルアラニン誘導体以外すべて浸潤癌細胞数を
減少させた。特に中分子ヘパリン、アスパラギン酸誘導
体、セリン誘導体およびアルギニン誘導体については、
ヘパリンを上回る浸潤癌細胞数抑制効果が確認された。

【００４２】

【表２】 Ｂ１６−Ｆ７細胞の浸潤阻害効果 化合物 浸潤細胞数(％)平均±ＳＥ（Ｎ） 無添加 １００ ヘパリン ７６±１１（６） 中分子ヘパリン ６５±１１（６） 中分子ヘパリニルアスパラギン酸 ６１±１６（６） 中分子ヘパリニルセリン ６７±１６（３） 中分子ヘパリニルアルギニン ７２± ６（６） 中分子ヘパリニルヒスチジン ８１±２６（３） 中分子ヘパリニルチロシン ８５±２４（３） 中分子ヘパリニルプロリン ９０±２２（６） 中分子ヘパリニルロイシン ９３±１６（３） 中分子ヘパリニルグリシン ９７± ５（３） 中分子ヘパリニルアラニン ９７±１７（３） 中分子ヘパリニルメチオニン １０４± ８（３）中分子ヘパリニルフェニルアラニン １３３± ７（３）

【００４３】（４）中分子ヘパリニルアスパラギン酸お
よび中分子ヘパリニルセリンの癌転移抑制効果の検討 中分子ヘパリニルアスパラギン酸および中分子ヘパリニ
ルセリンにつき、さらに検討を加えた。Ｂ１６−Ｆ１０
癌細胞（１×１０⁵個／マウス）を対照薬物（１０、３
０、１００μg／マウス）または被験薬物（１００、３
００、１０００μg／マウス）と同時にマウス尾静脈内
に投与し、２０日後に肺を摘出して、癌細胞生着による
肺結節数を測定した。同量の癌細胞と同容量の溶媒のみ
を投与する対照群および無処置正常群を設定し、比較し
た。一群の例数は６ないし７匹とした。また、同容量の
対照薬物または被験薬物をマウス尾静脈内に投与し、そ
の１時間後にネンブタール麻酔下腹部大動脈より採血
（３.８％クエン酸ナトリウム溶液：血液＝１：９）
し、遠心分離後、血漿サンプルを得た。この血漿サンプ
ルに試薬を加え、アメルング−コアグロメーターＫＣ１
０Ａ（アメルング製）を用いてＡＰＴＴを測定した。な
お、対照として同容量（０.１ml）のＰＢＳ（−）（溶
媒）を投与した群を設けた。一群の例数は３または５匹
とした。

【００４４】肺メラノーマ結節数の測定結果並びに当該
投与量におけるＡＰＴＴ値を表３に示す。中分子ヘパリ
ニルアスパラギン酸および中分子ヘパリニルセリンは、
統計学的に有意（ｐ＜０.０１）な結節形成抑制効果を
示した。ＡＰＴＴ値より判断して、ヘパリンでは出血助
長の副作用のために癌転移抑制薬としての応用は不可能
であるのに対し、中分子ヘパリニルアミノ酸は出血傾向
が軽減されていることから、癌転移抑制薬としての臨床
応用が期待できる。

【００４５】

【表３】 中分子ヘパリニルアミノ酸のＡＰＴＴ値および肺メラノーマ結節数 増加抑制効果 化合物 ＡＰＴＴ(秒) 肺メラノーマ結節数 (対照に対する減少率％) 平均±S.D. (N) 平均±S.D.(N) 無処置正常群 0±0 (6)** 対照 23.7±1.9 (3) 271±77 (7) 10μg/マウス 22.9±1.2 205±49 (7) [24] ヘパリン 30μg/マウス 180< 111±36 (7)** [59] 100μg/マウス 180< 49±20 (7)** [82] 中分子 100μg/マウス 24.3±2.3 (3) 164±62 (7) [39] ヘパリニル 300μg/マウス 27.9±0.7 (3) 170±20 (7) [37]アスパラギン 1000μg/マウス 32.4±2.4 (3) 118±30 (7)** [56] 中分子 100μg/マウス 21.9±1.2 (3) 202±98 (7) [25] ヘパリニル 300μg/マウス 29.2±0.9 (3) 158±81 (7) [42]セリン 1000μg/マウス 61.4±11.3 (5) 111±44 (7)** [59] ** 対照に対して危険率１％未満で有意差あり（チューキー法による）

【００４６】Ｖ．中分子ヘパリニルアミノ酸の補体活性
化抑制効果 中分子ヘパリニルアミノ酸の抗補体作用について、clas
sical pathwayの活性化に基づく感作ヒツジ赤血球の溶
血反応を指標とし、メシル酸ナファモスタットを陽性対
照として検討した。なお、被験薬物はin vitro試験では
ゼラチンベロナール緩衝液（ＧＶＢ）に、in vivo試験
では生理食塩液に溶解して使用した。

【００４７】生後６週齢の雄性Ｈartley系モルモット
（日本チャールス・リバー）を購入し、１２時間の明暗
サイクル（明期：７時〜１９時）、温度２３±２℃、湿
度５０±５％の条件下で１週間の予備飼育後、実験に供
した。実験当日までの予備飼育の期間は、自由に摂食・
摂水させた。

【００４８】（２）補体活性化抑制効果の検討 in vitroにおけるモルモット補体classical pathway
活性化による感作ヒツジ赤血球の溶血反応に対する作用

【００４９】操作 ５×１０⁸cells／mlの濃度になるように感作ヒツジ赤血
球（デンカ生検）をＧＶＢに浮遊させる。この液２００
μlにＧＶＢで溶解、希釈した補体（乾燥補体、デンカ
生検）を加え、さらにＧＶＢを加えて全量１.５mlとし
た。３７℃の恒温槽中で１時間反応させた後に、３００
０rpmで１０分間遠心分離し、上清のヘモグロビン量の
測定波長５４２nmにおける吸光値を測定した（ＵＶＩＤ
ＥＣ−７７Σ）。同時に物理的溶血として補体の代わり
にＧＶＢを加えたもの、及び１００％溶血として補体及
びＧＶＢの代わりに純水を加えた検体の吸光値を測定し
た。各被験薬物の作用検討は、補体の活性化による溶血
率が約５０％となる条件下で行った。また、被験薬物の
添加量は、全容量の１／１００容とした。

【００５０】結果 ヘパリンは２〜５０μg／mlの用量において９.６〜８
３.４％の溶血抑制作用を示し、そのＩＣ５０値は２０.
１μg／mlであった。中分子ヘパリンも同様に、１０〜
４００μg／mlの用量において、１０〜９７.８％の溶血
抑制作用を示したが、そのＩＣ５０値は６６.８μg／ml
とヘパリンの約３.３倍であり、作用の低下が認められ
た。しかしながら、中分子ヘパリンにフェニルアラニン
を導入した場合、ＩＣ５０値は中分子ヘパリンの０.０
９倍の６.１μg／mlとなり、また、チロシンを導入した
場合には、ＩＣ５０値は中分子ヘパリンの０.３２倍の
２１.４μg／mlとなり、中分子ヘパリンに比べて溶血抑
制作用は増強した（表４）。

【００５１】in vivoにおけるモルモット補体classic
al pathway活性化による感作ヒツジ赤血球の溶血反応に
対する作用 操作 １０¹⁰cells／mlの感作ヒツジ赤血球浮遊液１mlをモル
モット背中足静脈より静脈内投与し、その３分後に外頸
静脈より０.５mlの血液を採取した。直ちに、その血液
に０.０１％のＥＤＴＡ−Ｓalineを４.５ml加え、２０
００rpmで１０分間遠心分離し、上清のヘモグロビン量
の測定波長５４２nmにおける吸光値を測定した。被験薬
物は感作ヒツジ赤血球投与の１分前に背中足静脈より静
脈内投与した。

【００５２】

【表４】 in vitroにおける補体classical pathway活性化による感作ヒツジ赤血球溶血 に対する中分子ヘパリニルアミノ酸の抑制効果 補体活性化抑制作用 APTTを100秒に延長する濃度 ＩＣ５０ （μg／ml） （μg／ml） アミノ酸 ヘハ゜リン ヘハ゜リン ヘハ゜リン ヘハ゜リン ヘハ゜リン ヘハ゜リン 中分子 低分子 中分子 低分子 なし 47.9 147.9 650.0 20.1 66.8 208.0 グリシン 104.7 537.0 − 35.2 157.6 − アスパラギン酸 144.5 315.6 − 25.9 79.2 −フェニルアラニン 239.9 402.7 3036.0 2.9 6.1 55.8 アラニン 128.8 309.0 − 45.8 150.9 − メチオニン 153.1 354.8 − 26.4 71.9 − アルギニン 245.5 851.1 − 56.1 166.4 − チロシン 323.6 389.0 − 9.2 21.4 − ヒスチジン 288.4 575.4 − 64.9 191.5 − プロリン 117.5 281.8 − 46.5 80.5 − セリン − 268.6 − − 119.4 −ロイシン − 359.6 − − 78.6 −

【００５３】結果 陽性対照であるメシル酸ナファモスタットは、０.１〜
１.０mg／kgの静脈内投与によって８.５〜７６.６％の
抑制作用を示した。中分子ヘパリニルフェニルアラニン
も３〜３０mg／kgの静脈内投与によって２３.８〜９１.
１％の溶血抑制作用を示した。中分子ヘパリニルアミノ
酸は低分子ヘパリニルアミノ酸と比較すると明らかによ
り強力な溶血抑制効果および補体活性化抑制作用を示し
た。

【００５４】VI．中分子ヘパリニルアミノ酸の肺水腫抑
制効果 中分子ヘパリニルアミノ酸のサソリ毒誘発肺水腫抑制効
果について検討した。 （１）実験動物 生後６週齢の雄性Ｗistar系ラット（日本チャールス・
リバー）を購入し、１２時間の明暗サイクル（明期：７
時〜１９時）、温度２３±２℃、湿度５０±５％および
換気オールフレッシュ１５回／時間の条件下で１週間の
予備飼育後、実験に供した。

【００５５】（２）肺水腫抑制効果の検討 操作 Ｌineu,Ｆ.Ｍ.およびＩone,Ｍ.Ｄ.Ｍ.の方法（トキシコ
ン(Ｔoxicon)、第３１巻、１２０７頁、１９９３年）に
準じて操作した。すなわち、ラットにヘパリン、中分子
ヘパリンまたは中分子ヘパリニルアミノ酸あるいは同容
量のＳalineを静脈内に投与し、３０分後にサソリ毒
（Ｔityus serrulatus venom,シグマ製）を静脈内に投
与した。１時間後にラットを致死せしめ、瀉血後、肺を
摘出し、湿重量を測定した。肺の湿重量よりＬＢＩ（Ｌ
ung／Ｂody Ｉndex：Ｌung weight（g）×１００／Ｂ
ody weight（g））および炎光光度計（ＭＦ−３０３
型、日本分光工業製）により肺組織中Ｎa⁺／Ｋ⁺比を求
め、各被験化合物の肺水腫抑制効果を算定した。一群の
例数は４〜１４匹とし、群間の有意性は、Ｂartlett法
にて分散の均一性を確認した後、Ｄuncan法により検定
した。

【００５６】結果 ヘパリン、中分子ヘパリンおよび中分子ヘパリニルアミ
ノ酸のサソリ毒誘発肺水腫に対する抑制効果を表５に示
した。その結果、ヘパリンにはサソリ毒誘発肺水腫抑制
効果は認められなかったが、中分子ヘパリンおよび中分
子ヘパリニルアミノ酸はいずれも対照群に比べてＬＢＩ
を減少させ、ヒスチジン、メチオニン、アルギニン、チ
ロシン誘導体では有意な肺水腫抑制効果が確認された。
また、フェニルアラニン、ヒスチジン、アルギニンおよ
びチロシン誘導体では、Ｎa⁺／Ｋ⁺比の値においても改
善効果が認められた。

【００５７】

【表５】 ヘパリン、中分子ヘパリンおよび中分子ヘパリニルアミノ酸の サソリ毒誘発肺水腫に対する作用 化合物 ＬＢＩ Ｎa⁺／Ｋ⁺ (平均値±Ｓ.Ｅ.) (平均値±Ｓ.Ｅ.) 正常群 0.47±0.01** 0.81±0.02** 対照群 0.73±0.02 1.54±0.13 ヘパリン 0.81±0.02 1.87±0.26 中分子ヘパリン 0.69±0.05 1.77±0.18 中分子ヘパリニルアラニン 0.69±0.07 1.54±0.20 中分子ヘパリニルアスパラギン酸 0.72±0.01 1.70±0.03 中分子ヘパリニルフェニルアラニン 0.66±0.08 1.39±0.29 中分子ヘパリニルグリシン 0.70±0.05 1.61±0.18 中分子ヘパリニルヒスチジン 0.64±0.03* 1.36±0.15 中分子ヘパリニルロイシン 0.75±0.06 1.94±0.19 中分子ヘパリニルメチオニン 0.65±0.03* 1.59±0.13 中分子ヘパリニルプロリン 0.69±0.06 1.79±0.25 中分子ヘパリニルアルギニン 0.52±0.02** 1.00±0.07** 中分子ヘパリニルセリン 0.66±0.03 1.64±0.15中分子ヘパリニルチロシン 0.59±0.04** 1.18±0.11 投与量：５０００μg／kg ＊および＊＊：対照に対して危険率５％および１％未満でそれぞれ有意差あり

【００５８】VII．中分子ヘパリニルアミノ酸の腎疾患
治療効果 微小変化型ネフローゼ症候群に近似した病態を生ずるこ
とが知られているピューロマイシンアミノヌクレオシド
（ＰＡＮ）腎疾患モデルを用い、被験薬物に中分子ヘパ
リニルフェニルアラニンを選択し、中分子ヘパリニルア
ミノ酸誘導体の腎疾患治療効果について検討した。

【００５９】（１）実験動物 生後６週齢の雄性Ｃｒｊ：ＣＤ系ラット（日本チャール
ス・リバー）を使用した。

【００６０】（２）腎疾患抑制効果の検討 ラットをエーテルで麻酔し、先端にシリコンチューブ
（内径０.７mm、外径１.３mm、イマムラ製）を付けたア
ルザ浸透圧ポンプ（モデル２００２、アルザ製）を頸部
皮下に埋め込んだ。シリコンチューブは右頸静脈内に挿
入固定した。ラットが覚醒した後、１００mg/kgのＰＡ
Ｎを腹腔内に単回投与して腎疾患を惹起した。腎疾患惹
起後１、４、７、１０および１４日目にラットを代謝ケ
ージ内に収容して採尿し、尿量および尿中蛋白濃度（マ
イクロＴＰ−テストワコー、和光純薬工業製）を測定
し、尿中蛋白排泄量／日を算出した。中分子ヘパリニル
フェニルアラニンの投与量は０.３、１および３mg/kg/d
ayとし、投与期間は２週間とした。各群の動物数は６例
とした。結果を表６に示す。その結果、中分子ヘパリニ
ルフェニルアラニン、３mg/kg/day投与群において、４
日目以降に有意な尿中蛋白排泄抑制効果が認められた。
これは文献によるヘパリンの尿中蛋白排泄抑制効果を大
幅に凌駕するものであった。

【００６１】

【表６】中分子ヘパリニルフェニルアラニンの尿中蛋白排泄抑制効果（抑制率(％)） １日 ４日 ７日 １０日 １４日 ヘハ゜リン 3.45mg/kg/day 44.7¹⁾ 中分子ヘハ゜リニルフェニルアラニン 0.3mg/kg/day -25.0 52.8 8.3 11.5 37.1 １mg/kg/day 25.0 67.1 30.1 -5.4 43.7 ３mg/kg/day 33.3 93.7** 65.6* 63.7* 61.2 １）Diamond,J.R., Karnovsky,M.J., リーナル・フィジオロジー（Renal Physio l.）、第９巻、３６６頁（１９８６年） ＊および＊＊：対照に対して５％および１％未満の危険率で有意差あり（ダンカ ン法）

【００６２】VIII．中分子ヘパリニルアミノ酸のラジカ
ルスカベンジャー効果 ヘパリンは、ラジカルスカベンジャーとしての作用を有
することが報告されている（Hiebert,L.M.、Liu,Ji-mi
n、アテロスクレローシス（Atherosclerosis）、第８３
巻、４７頁、１９９０年）そこで、キサンチン（Ｘ）お
よびキサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）を用い、これらの
化合物から発生したフリーラジカルによる培養細胞の傷
害に対するラジカルスカベンジャーとしての中分子ヘパ
リニルアミノ酸誘導体の傷害抑制効果を検討した。

【００６３】（１）培養細胞 培養細胞にはヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶ−ＥＣ：大
日本製薬製）を使用し、２０％ウシ胎児血清、ウシ脳抽
出液、Epidermal Growth Factor（ＥＧＦ）、ハイドロ
コーチゾン、ゲンタマイシンおよびアンフォテリシンを
含むヘパリンフリーの血管内皮細胞培養用添加因子セッ
ト（ＥＧＭ−ＭＶ添加因子セット：三光純薬製）を含有
するＭ−１９９培地（大日本製薬製）を用いて培養し
た。

【００６４】（２）ＨＵＶ−ＥＣがフリーラジカルによ
って受ける傷害に対する中分子ヘパリニルフェニルアラ
ニン、中分子ヘパリニルチロシンおよび中分子ヘパリニ
ルロイシンの効果 フラスコ内でサブコンフルエントな状態のＨＵＶ−ＥＣ
を０.２５％トリプシン：０.２５％ＥＤＴＡ＝１：１の
混合溶液で処理後、回収し、６穴プレートに１.５×１
０⁵cells/wellの細胞密度で分注した後、１％ウシ胎児
血清のみを含有するＭ−１９９培地を用いて２４時間培
養した。その後にＸ（０.０１μM/ｍｌ）およびＸＯ
（０.２Ｕ/ｍｌ）（ともに和光純薬工業製）を培地中に
２４時間作用させることによりフリーラジカルを発生さ
せた。Ｘ及びＸＯ作用２４時間後にプレート中のＨＵＶ
−ＥＣを再び前記のトリプシン：ＥＤＴＡ＝１：１混合
溶液で処理した後、回収した。回収された細胞浮遊液に
同量の０.２％トリパンブルー溶液を加え、この混液中
の細胞質・核全体が青染された細胞（死細胞）と非染色
細胞（生細胞）を区別し、血球計算盤を用いてそれぞれ
の細胞数を計測し、セルバイアビリティー（生細胞数／
全細胞数）を求めた。なお、ヘパリンおよび中分子ヘパ
リニルアミノ酸誘導体はＰＢＳ（−）に溶解した後、５
０μg/ｍｌの用量でＸおよびＸＯを作用させると同時に
培地中に添加した。また、ＸおよびＸＯを作用させない
正常群並びにヘパリンあるいは中分子ヘパリニルアミノ
酸誘導体の溶媒のみを添加した対照群も設けた。

【００６５】実験の結果を表７に示す。ＸとＸＯによる
傷害により、対照群においては著しいセルバイアビリテ
ィーの低下がみられたが、中分子ヘパリニルフェニルア
ラニン、中分子ヘパリニルチロシンあるいは中分子ヘパ
リニルロイシンを添加することにより、統計学的に有意
にセルバイアビリティーの低下を抑制することができ
た。また、この抑制効果はヘパリンを上回るものであっ
た。

【００６６】

【表７】 キサンチンおよびキサンチンオキシダーゼ誘発細胞傷害に対する 中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体の傷害抑制効果 セルバイアビリティー（％） 化 合 物 平均値±標準誤差（例数） 正常 １００.０±０.０ （３）** 対照 ５１.６±３.３ （３） ヘパリン ８４.２±９.６ （３） 中分子ヘパリニルフェニルアラニン ９４.８±５.４ （３）* 中分子ヘパリニルチロシン ９３.１±６.３ （３）*中分子ヘパリニルロイシン ９２.６±８.２ （３）* ＊ 対照に対して危険率５％未満にて有意差あり ＊＊ 対照に対して危険率１％未満にて有意差あり（チューキー法による）

【００６７】XI．中分子ヘパリニルアミノ酸のアレルギ
ー抑制効果 近年、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、慢性蕁麻疹など
のアレルギー性疾患が増加する傾向にあるが、これらの
疾患は肥満細胞からの脱顆粒を主たる発症原因のひとつ
とする。一方、ヘパリンには肥満細胞からの脱顆粒を阻
害する作用のあることが知られている。（T.Ahmed et.a
l.、アメリカン・レビュー・オブ・レスピレイトリー・
ディシーズ（Am. Rev. Respir. Dis.）、第１４５巻、
５６６頁、１９９２年）。そこで、本発明の中分子ヘパ
リニルアミノ酸誘導体のアレルギー抑制効果について、
ラット４８時間の同種受動的皮膚アナフィラキシー（Ｐ
ＣＡ）反応に対する作用を指標とし、検討した。

【００６８】（１）実験動物 生後８週齢の雄性Wistar系ラット（日本チャールス・リ
バー）および５週齢の雌性Wistar系ラット（日本チャー
ルス・リバー）を１２時間の明暗サイクル（明期：７時
〜１９時）、室温２３±２℃、湿度５０±５％および換
気オールフレッシュ１５回／時間の条件下で１週間の予
備飼育をした後、実験に供した。

【００６９】（２）中分子ヘパリニルフェニルアラニン
のラット４８時間同種ＰＣＡ反応に対する作用 操作 Stotlandらの方法（カナディアン・ジャーナル・オブ・
フィジオロジー・アンド・ファーマコロジー（Can. J.
Physiol. Pharmacol.）、第５２巻、１１１９頁、１９
７４年）に準拠して抗ovalbumin（ＯＶＡ）ラット血清
を調製した。すなわち、雌性ラットの脾臓を摘出して４
日後に、ＯＶＡ（生化学工業製）２.０mg／mlを含む生
理食塩液と２％水酸化アルミニウムゲル（和光純薬工業
製）の等量混合液１.０mlを四肢の皮下に４分割して投
与し、さらに百日咳死菌体（和光純薬工業製）２×１０
¹⁰cell／１.０mlを腹腔内に投与することにより感作し
ておく。投与５日後にＯＶＡ２.０mg／mlを含む生理食
塩液と２％水酸化アルミニウムゲルの等量混合液をさら
に１.０ml投与し、追加感作した。最終感作から２週間
後に麻酔下にて腹部大動脈より採血し、血液を遠心分離
し、抗ＯＶＡラット血清を採取した。このもののラット
４８時間ＰＣＡ抗体価は１２８であった。

【００７０】このようにして得られた抗ＯＶＡラット血
清を生理食塩液で抗体価が１６となるように希釈し、そ
の１００μl／siteを雄性ラットの剃毛した背部皮内の
６箇所に投与して受動感作させた。感作４８時間後に体
重１kgあたり０.３、３.０および３０.０mgの中分子ヘ
パリニルフェニルアラニンを１０ml／kgの液量となるよ
うに尾静脈内に投与した。対照には同容量の生理食塩液
を用いた。投与５分後に１mgのＯＶＡを含有するエバン
スブルー生理食塩液溶液１mlを尾静脈内に投与した。こ
のＯＶＡはＰＣＡ反応を誘発し、その強度はエバンスブ
ルー（色素）が感作部位の周囲の組織へ拡散する程度に
比例する。ＯＶＡ含有エバンスブルー生理食塩液溶液を
投与して３０分後に断頭放血致死させ、Katayamaらの方
法（マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（Mi
crobiol.Immunol.）、第２２巻、８９頁、１９７８年）
により、ラット背部皮膚の感作部位の組織内色素漏出量
（μg／site）ならびに色素漏出部位面積（mm²）を測定
した。なお、一群の例数は４〜５匹とした。また、群間
の有意性は、Bartlett法にて分散の均一性を確認した
後、Spjotvoll ＆ Stoline法（補正チューキー法）を用
いて検定することにより確認した。

【００７１】結果 中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体のラット４８時間ＰＣ
Ａ反応に対する抑制効果を表８に示す。

【表８】 中分子ヘパリニルフェニルアラニンのラット４８時間ＰＣＡ反応に 対する抑制効果 用量 組織内色素漏出量 色素漏出部位面積 (mg/kg) (μg/site) (mm²) (平均値±標準誤差) (平均値±標準誤差) 生理食塩水（対照） 40.02±4.46 130.50±11.39 中分子ヘハ゜リニルフェニルアラニン 0.3 31.80±2.89 191.14±79.08 3.0 29.40±4.13 90.84±10.10 30.0 13.08±0.43** 82.02±3.74 **：対照に対して危険率１％未満で有意差あり（Spjotvoll ＆ Stoline法）

【００７２】中分子ヘパリニルフェニルアラニン投与群
において、組織内色素漏出量ならびに色素漏出部位面積
を用量依存的に抑制する傾向が認められ、特に３０.０m
g／kg投与群においては組織内色素漏出量を生理食塩液
（対照）投与群と比べて約３０％と有意（Ｐ＜０.０
１）に減少させ、アレルギー反応の抑制効果が顕著であ
った。アレルギー性疾患に用いる薬剤には、症状の改善
もさることながら、発症を未然に防止する効果を併せ持
つことが要求される。本発明の中分子ヘパリニルアミノ
酸誘導体は、上記の結果より、アレルギー性疾患の予防
剤や治療剤として用い得る。

【００７３】実施例 実施例１ 中分子ヘパリンの調製 ヘパリン(サイエンティフィック・プロテイン・ラボラ
トリーズ製)３ｇを水に溶かして５２.５ｍｌとしたもの
に、陽イオン交換樹脂(Dowex HCR-W2 20-50mesh)を加え
てｐＨ３.３０〜３.４０とした後、濾過する。濾液に３
０％過酸化水素水(三菱瓦斯化学製)３.５ｍｌを加え、
オートクレーブ中、１２３℃、１.４ｋｇｆ/ｃｍ²、１
０分間の条件で加圧加熱して解重合する。加熱終了後、
反応液に水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ６.８と
し、限外濾過（ウルトラフリーＣＬ:ミリポア製、ウル
トラセント-１０:東ソー製、モルカットII:ミリポア
製、モルカットＬ:ミリポア製）を繰り返して分子量分
画を行った。エタノールによる再結晶で、白色粉末の中
分子ヘパリン(２.１ｇ、収率７０.１０％)を得た。

【００７４】実施例２ 中分子ヘパリニルアミノ酸（アラニン、アルギニン、ア
スパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、メチ
オニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、チロシ
ン）の調製 中分子ヘパリン０.６４ｇに水を加えて１５ｍｌとし、
ｐＨ４.７５に調整後、対応するアミノ酸エステル塩酸
塩（中分子ヘパリン１Ｍに対して、１００Ｍ）を加える
（Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩：シグマ製、Ｌ−
アルギニンメチルエステル二塩酸塩：シグマ製、Ｌ−ア
スパラギン酸ジメチルエステル塩酸塩：シグマ製、Ｌ−
グリシンメチルエステル塩酸塩：半井テスク製、Ｌ−ヒ
スチジンメチルエステル二塩酸塩：半井テスク製、Ｌ−
ロイシンメチルエステル塩酸塩：東京化成製、Ｌ−メチ
オニンメチルエステル塩酸塩：シグマ製、Ｌ−フェニル
アラニンメチルエステル塩酸塩：アルドリッチ製、Ｌ−
プロリンメチルエステル塩酸塩：東京化成製、Ｌ−セリ
ンメチルエステル塩酸塩：半井テスク製、Ｌ−チロシン
メチルエステル塩酸塩：和光純薬工業製）。

【００７５】さらに、１−エチル−３−(３−ジメチル
アミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(半井テスク製)
０.９８ｇの水溶液５ｍｌを徐々に加え、４時間攪拌し
た後、少量の水および臭化ヘキサデシルトリメチルアン
モニウム(半井テスク製)の５％水溶液をアンモニウム塩
の沈澱物が生じなくなるまで加える。次いでこの沈澱物
を遠心分離により完全に分離後、沈澱物にヨウ化ナトリ
ウム(半井テスク製)の５％エタノール溶液５０ｍｌを加
える。１時間攪拌後、濾過し、沈澱物をエタノールで再
結晶して、白色粉末の中分子ヘパリニルアミノ酸エステ
ルを得る。この中分子ヘパリニルアミノ酸エステルに
０.１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１０ｍｌを加え、窒素
気流下、０〜５℃で２日間攪拌する。反応液を酢酸でｐ
Ｈ５に調整後、濾過し、濾液にエタノールを加えて、白
色粉末の中分子ヘパリニルアミノ酸を得た。各収率を表
９に示す。

【００７６】

【表９】 中分子ヘパリニルアミノ酸の収率(中分子ヘパリンを原料とした収率) アミノ酸 収率(％) アミノ酸 収率(％) グリシン ４４.１ メチオニン ６３.２ アラニン ３９.４ フェニルアラニン ６８.６ アルギニン ３６.６ プロリン ３８.３ アスパラギン酸 ７０.１ セリン ６０.３ ヒスチジン ６５.０ チロシン ５７.５ ロイシン ４９.７

【００７７】中分子ヘパリニルアミノ酸の機器分析 （１）ＨＰＬＣ分析による分子量の測定 ヘパリン、中分子ヘパリン、および中分子ヘパリンの各
アミノ酸誘導体を０．１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液で５ｍ
ｇ／ｍｌに調整し、試料溶液とする。一方、ポリエチレ
ングリコール（分子量１０,０００：アルドリッチ製、
分子量８,５００および平均分子量３,０００：東京化成
製、平均分子量１,４５０：関東化学製）を標準物質と
し、試料溶液と同様に調整し、標準溶液とする。試料溶
液および標準溶液につき、以下の測定機器および操作条
件でＨＰＬＣ分析を行い、検量線法により、ヘパリン、
中分子ヘパリンおよび中分子ヘパリニルアミノ酸の分子
量を測定した。結果を表１０に示す。 使用機器 送液ポンプ：ＬＣ−１０ＡＤ（島津製作所製） 示差屈折計：ＲＩ−８０２０（東ソー製） オ―トサンプラ―：ＫＭＴ−６０Ａ−１１（協和精密製） デ―タ処理装置：Ｃ−Ｒ３Ａ（島津製作所製） カラム：ＴＳＫ−Ｇel Ｇ3000ＰＷＸＬ(7.8mm×30cm:東ソー製） を２本連結して使用 操作条件 流速：１.０ｍｌ／分 圧力：４３ｋｇ／ｃｍ² 感度：ＲＩ ５１２×１０^-6 ＲＩＶＦＳ カラム温度：４０℃ 検出感度：８〜１０ 注入量：２００μｌ

【００７８】

【表１０】 ヘパリン、中分子ヘパリンおよび中分子ヘパリニルアミノ酸の分子量化 合 物 最大分子量 最小分子量 平均分子量 ヘパリン 18,000 7,000 13,000-14,000 中分子ヘハ゜リン 12,500 4,500 8,500-9,500 中分子ヘハ゜リニルク゛リシン 12,500-13,500 3,500-4,500 8,500-9,500 中分子ヘハ゜リニルアラニン 12,500-13,500 3,500-4,500 8,500-9,500 中分子ヘハ゜リニルアルキ゛ニン 12,500-13,500 3,500-4,500 8,500-9,500 中分子ヘハ゜リニルアスハ゜ラキ゛ン酸 12,500-13,500 3,500-4,500 9,000-10,000 中分子ヘハ゜リニルヒスチシ゛ン 12,500-13,500 3,500-4,500 8,500-9,500 中分子ヘハ゜リニルロイシン 12,500-13,500 3,500-4,500 8,500-9,500 中分子ヘハ゜リニルメチオニン 12,500-13,500 3,500-4,500 8,500-9,500 中分子ヘハ゜リニルフェニルアラニン 12,500-13,500 3,500-4,500 8,500-9,500 中分子ヘハ゜リニルフ゜ロリン 12,500-13,500 3,500-4,500 8,500-9,500 中分子ヘハ゜リニルセリン 12,500-13,500 3,500-4,500 8,500-9,500中分子ヘハ゜リニルチロシン 12,500-13,500 3,500-4,500 8,500-9,500

【００７９】（２）赤外吸収スペクトルの測定 中分子ヘパリン、および中分子ヘパリンの各アミノ酸誘
導体をそれぞれ約３ｍｇ秤量し、約１００ｍｇの臭化カ
リウムと混ぜ合わせ、ハンディープレスでペレットを作
成した。このものにつき、臭化カリウム錠剤法により、
以下の測定機器および操作条件で赤外吸収スペクトルを
測定した。結果を表１１に示す。 使用機器 フーリエ変換赤外分光計：ＦＴ−２００（堀場製作所製） 操作条件 スキャン回数：５０回 測定分解能：４ｃｍ^-1 ゲイン：ＡＵＴＯ 測定範囲：４,０００〜４００ｃｍ^-1 装置関数：ハップガンツェル（Ｈ−Ｇ） スペクトル：％Ｔ 走査速度：５ｍｍ／秒

【００８０】

【表１１】 中分子ヘパリニルアミノ酸の赤外吸収スペクトル 化 合 物 波 数（ｃｍ^-1） 中分子ヘハ゜リン 3,316-3,645(OH,COOH),1,727(COO),1,622(CO) 中分子ヘハ゜リニルク゛リシン 3,273-3,623(OH,COOH),1,727(COO),1,668(CO),1,550(NH) 中分子ヘハ゜リニルアルキ゛ニン 3,200-3,600(OH,COOH),1,739(COO),1,667(CO),1,541(NH) 中分子ヘハ゜リニル 3,300-3,600(OH,COOH),1,739(COO),1,676(CO),1,543(NH) アスハ゜ラキ゛ン酸 中分子ヘハ゜リニル 3,150-3,600(OH,COOH),1,730(COO),1,667(CO),1,541(NH) フェニルアラニン 中分子ヘハ゜リニルフ゜ロリン 3,140-3,630(OH,COOH),1,748(COO),1,657(CO),1,531(NH)中分子ヘハ゜リニルセリン 3,280-3,610(OH,COOH),1,729(COO),1,667(CO),1,531(NH)

【００８１】（３）アミノ酸分析 中分子ヘパリン、および中分子ヘパリンの各アミノ酸誘
導体約１００μｇを試料用試験管に秤量し、この試験管
を反応バイアル瓶に入れ減圧乾燥した。次に反応バイア
ル瓶の底に加水分解用６Ｎ塩酸（１％フェノール含有）
１００μｌを入れ、減圧下、反応バイアル瓶内の空気を
窒素で置換した後、１０５℃で２４時間加熱し、加水分
解した。冷却後、試料用試験管を取り出し、０．０２Ｎ
塩酸１００μｌを加えてよく混合し、フィルターで濾過
し、濾液を試料溶液とした。試料溶液と加水分解前の原
料を用いて、以下の測定機器および操作条件でアミノ酸
の含有量を測定した。その結果すべての中分子ヘパリニ
ルアミノ酸において、中分子ヘパリンに対するカルボン
酸の約９０％以上の比率でアミノ酸に置換していた。 使用機器 アミノ酸自動分析計：Ｌ−８５００（日立製作所製） 操作条件 溶離液：クエン酸緩衝液(ｐＨ３.５、４.０、５.５) 流速：溶離液 ０．１５ｍｌ／分 ニンヒドリン溶液 ０．２ｍｌ／分 カラム：イオン交換樹脂 （日立カスタムイオン＃２６２０、４.６ｍｍ×８０ｍｍ) カラム温度：５０〜６５℃ 注入量：標準溶液 １０μｌ 試料溶液 ３０μｌ

【００８２】（４）¹Ｈおよび¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル
の測定 中分子ヘパリン、および中分子ヘパリンの各アミノ酸誘
導体をＤ₂Ｏに溶解し、¹Ｈおよび¹³Ｃ−ＮＭＲスペクト
ルを測定した（ＸＬ−３００：バリアン製、３００ＭＨ
ｚ、７５.４ＭＨｚ）。結果を図１〜図１２に示す。

【００８３】（５）元素分析 ヘパリン、中分子ヘパリンおよび中分子ヘパリンの各ア
ミノ酸誘導体につき、ＣＨＮ ＣＯＲＤＥＲ（柳本製）
を用い、燃焼法により測定した。結果を表１２に示す。

【表１２】 ヘパリン、中分子ヘパリンおよび中分子ヘパリニルアミノ酸の元素分析 化 合 物 炭素(％) 水素(％) 窒素(％) 酸素・イオウ(％) ヘパリン 22.25 3.82 2.11 71.83 中分子ヘハ゜リン 22.23 3.95 2.04 71.79 中分子ヘハ゜リニルアルキ゛ニン 26.73 4.79 7.70 60.79 中分子ヘハ゜リニルアスハ゜ラキ゛ン酸 26.53 4.71 4.00 64.77 中分子ヘハ゜リニルフェニルアラニン 30.33 4.63 3.63 61.42 中分子ヘハ゜リニルフ゜ロリン 30.33 4.63 3.63 61.42中分子ヘハ゜リニルセリン 25.03 4.41 3.60 66.97

【００８４】（６）ウロン酸の定量 カルバゾール硫酸法(Bitter-Muirの改良法：アナリティ
カル・バイオケミストリー(Anal. Biochem.)、第４巻、
３３０頁、１９６２年）により、ウロン酸含量を測定し
た。ヘパリン、中分子ヘパリンおよび中分子ヘパリンの
各アミノ酸誘導体の水溶液０.５ｍｌを試験管にとり、
氷水で冷却しながら３.０ｍｌの硫酸溶液（四ホウ酸ナ
トリウム１０水和物(キシダ化学製)０.９５ｇを濃硫酸
１００ｍｌに溶かしたもの)を滴下し、０.１ｍｌの０.
１２５％カルバゾール溶液（カルバゾール（和光純薬工
業製）１２.５ｍｇを１０ｍｌのエタノールに溶かした
もの）を加え、十分混合した後、ガラス球で栓をし、沸
騰水浴中で２０分間加熱する。室温に冷却後、５３０ｎ
ｍにおける吸光度を測定した(UVIDEC-77Σ：日本分光工
業製）。

【００８５】（７）硫酸基の定量 T.T.Terho et al.の方法（アナリティカル・バイオケミ
ストリー(Anal. Biochem.)、第４１巻、４７１頁、１９
７１年）に準じ、ロジゾン酸法により硫酸基を測定し
た。すなわち、ヘパリン、中分子ヘパリンおよび中分子
ヘパリンの各アミノ酸誘導体約０.２ｍｇを含む１Ｎ塩
酸溶液０.５ｍｌをガラス栓付試験管にとり、密栓す
る。沸騰水浴中で１時間加熱して加水分解した後、減圧
乾固して塩酸を除去し、このものを１.０ｍｌの水に溶
かした。この溶液０.５ｍｌをガラス栓付遠心管にと
り、エタノール２.０ｍｌを加える。さらに１.０ｍｌの
塩化バリウム溶液（２.０Ｍ酢酸１０ｍｌ、５ｍＭ塩化
バリウム２ｍｌ、２０ｍＭ炭酸水素ナトリウム８ｍｌを
混合し、エタノールを加えて１００ｍｌとしたもの）、
および１.５ｍｌのロジゾン酸ナトリウム溶液（ロジゾ
ン酸ナトリウム（和光純薬工業製）５ｍｇを水２０ｍｌ
に溶かし、１００ｍｇのＬ−アスコルビン酸を加えて溶
かし、さらにエタノールを加えて１００ｍｌとしたも
の）を加えてよく攪拌する。室温暗所に１０分間放置し
た後、５２０ｎｍにおける吸光度を測定した(UVIDEC-77
Σ：日本分光工業製)。結果を表１３に示す。

【００８６】

【表１３】 ヘパリン、中分子ヘパリンおよび中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体の硫酸基 およびヘキソサミン含量 化 合 物 窒素(％) イオウ(％) 窒素／イオウ比 ヘキソサミン ヘパリン 2.11 12.06 5.73 30.34 中分子ヘハ゜リン 2.04 11.01 5.41 27.14 中分子ヘハ゜リニルアルキ゛ニン 7.70 13.91 1.81 25.13 中分子ヘハ゜リニルアスハ゜ラキ゛ン酸 4.00 11.97 2.99 22.36 中分子ヘハ゜リニルフェニルアラニン 3.63 12.19 3.36 35.22 中分子ヘハ゜リニルフ゜ロリン 3.63 10.96 3.02 29.47中分子ヘハ゜リニルセリン 3.60 10.08 2.80 25.21

【００８７】実施例３ 注射剤 中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体２５０μg〜２.５ｍｇ
をとり、生理食塩液１０ｍｌを加えて溶かした後、アン
プルに充填、密封および滅菌して注射剤とする。

【００８８】実施例４ 錠剤 中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体２.５〜１０ｍｇをと
り、賦形剤として乳糖３００ｍｇを加えて均等に混和し
たものを、直接圧縮成形して錠剤とする。

【００８９】実施例５ カプセル剤 中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体２.５〜１０ｍｇをと
り、賦形剤として乳糖３００ｍｇを加えて均等に混和し
たものをカプセルに充填してカプセル剤とする。

【００９０】実施例６ 坐剤 中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体５.０〜２０ｍｇをと
り、基剤としてマクロゴール２ｇを加えて均等に混和
し、一定の形状に成形して、坐剤とする。

【図面の簡単な説明】

【図１】 中分子ヘパリンの¹³Ｃ ＮＭＲスペクトルを
示す。

【図２】 中分子ヘパリンの¹Ｈ ＮＭＲスペクトルを示
す。

【図３】 中分子ヘパリニルフェニルアラニンの¹³Ｃ
ＮＭＲスペクトルを示す。

【図４】 中分子ヘパリニルフェニルアラニンの¹Ｈ Ｎ
ＭＲスペクトルを示す。

【図５】 中分子ヘパリニルアルギニンの¹³Ｃ ＮＭＲ
スペクトルを示す。

【図６】 中分子ヘパリニルアルギニンの¹Ｈ ＮＭＲス
ペクトルを示す。

【図７】 中分子ヘパリニルセリンの¹³Ｃ ＮＭＲスペ
クトルを示す。

【図８】 中分子ヘパリニルセリンの¹Ｈ ＮＭＲスペク
トルを示す。

【図９】 中分子ヘパリニルプロリンの¹³Ｃ ＮＭＲス
ペクトルを示す。

【図１０】 中分子ヘパリニルプロリンの^１Ｈ ＮＭＲ
スペクトルを示す。

【図１１】 中分子ヘパリニルアスパラギン酸の¹³Ｃ
ＮＭＲスペクトルを示す。

【図１２】 中分子ヘパリニルアスパラギン酸の¹Ｈ Ｎ
ＭＲスペクトルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 31/725 ＡＣＶ Ａ６１Ｋ 31/725 ＡＣＶ ＡＤＵ ＡＤＵ (72)発明者 中村 一基 大阪府大阪市城東区森之宮２−３−30 扶 桑薬品工業株式会社研究開発センター内 (72)発明者 大谷 裕也 大阪府大阪市城東区森之宮２−３−30 扶 桑薬品工業株式会社研究開発センター内 (72)発明者 西村 幸容 大阪府大阪市城東区森之宮２−３−30 扶 桑薬品工業株式会社研究開発センター内 (72)発明者 島田 千明 大阪府大阪市城東区森之宮２−３−30 扶 桑薬品工業株式会社研究開発センター内 (72)発明者 武田 誠一 大阪府大阪市城東区森之宮２−３−30 扶 桑薬品工業株式会社研究開発センター内 (72)発明者 河合 健蔵 大阪府大阪市城東区森之宮２−３−30 扶 桑薬品工業株式会社研究開発センター内 (72)発明者 北川 知津子 大阪府大阪市城東区森之宮２−３−30 扶 桑薬品工業株式会社研究開発センター内 (72)発明者 桑原 正明 宮城県仙台市青葉区柏木３−７−16 (72)発明者 安部 智之 大阪府大阪市城東区森之宮２−３−30 扶 桑薬品工業株式会社研究開発センター内

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 平均分子量８,５００〜９,５００を有す
   る中分子ヘパリン。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の中分子ヘパリンから誘
   導される中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体。
3. 【請求項３】 アミノ酸誘導体が、アミノ酸またはアミ
   ノ酸低級アルキルエステルである、請求項２記載の中分
   子ヘパリニルアミノ酸誘導体。
4. 【請求項４】 上記アミノ酸誘導体が、一般式： ＮＨ₂ＣＨ(Ｒ₁)ＣＯＯＲ₂ ［式中、Ｒ₁は、 ・Ｈ； ・アミノ酸のα−アミノ基のＮおよびα位のＣと共にピ
   ロリジン環を形成するか；または、 ・ＯＨで置換されていてもよいフェニル、ＯＨ、Ｎ
   Ｈ₂、ＳＨ、ＳＣＨ₃、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ₂、グアニジ
   ノ、インドリルおよび１Ｈ−イミダゾリルからなる群か
   ら選ばれる基で置換されていてもよい低級アルキルであ
   り、 Ｒ₂は、Ｈまたは低級アルキルである］で示される、請
   求項２記載の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体。
5. 【請求項５】 アミノ酸が天然のアミノ酸である、請求
   項４記載の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体。
6. 【請求項６】 アミノ酸が必須アミノ酸である、請求項
   ５記載の中分子ヘパリニルアミノ酸誘導体。
7. 【請求項７】 請求項２に記載の中分子ヘパリニルアミ
   ノ酸誘導体の少なくとも１種を有効成分とする抗凝血活
   性医薬組成物。
8. 【請求項８】 請求項２に記載の中分子ヘパリニルアミ
   ノ酸誘導体の少なくとも１種を有効成分とする腎メサン
   ギウム細胞増殖抑制活性医薬組成物。
9. 【請求項９】 請求項２に記載の中分子ヘパリニルアミ
   ノ酸誘導体の少なくとも１種を有効成分とする癌転移抑
   制活性医薬組成物。
10. 【請求項１０】 請求項２に記載の中分子ヘパリニルア
    ミノ酸誘導体の少なくとも１種を有効成分とする補体活
    性化抑制活性医薬組成物。
11. 【請求項１１】 請求項２に記載の中分子ヘパリニルア
    ミノ酸誘導体の少なくとも１種を有効成分とする肺水腫
    抑制活性医薬組成物。
12. 【請求項１２】 請求項２に記載の中分子ヘパリニルア
    ミノ酸誘導体の少なくとも１種を有効成分とする腎疾患
    治療用医薬組成物。
13. 【請求項１３】 請求項２に記載の中分子ヘパリニルア
    ミノ酸誘導体の少なくとも１種を有効成分とするラジカ
    ルスカベンジャー活性医薬組成物。
14. 【請求項１４】 請求項２に記載の中分子ヘパリニルア
    ミノ酸誘導体の少なくとも１種を有効成分とするアレル
    ギー性疾患予防および治療用医薬組成物。