FR2921935A1 - Procede de criblage de composes utilisables pour le traitement de troubles respiratoires - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte à l'utilisation d'un procédé de criblage pour l'identification de molécules candidates utilisables pour le traitement de troubles respiratoires chez un mammifère, ledit procédé de criblage comprenant une étape consistant à déterminer si l'activité fonctionnelle d'un polypeptide TASK-2 en présence d'une molécule test est diminuée ou supprimée par rapport à l'activité fonctionnelle dudit polypeptide TASK-2 en l'absence de ladite molécule test, la molécule test étant considérée comme étant une molécule candidate lorsqu'elle diminue ou supprime ladite activité fonctionnelle.

Description

PROCÉDÉ DE CRIBLAGE DE COMPOSÉS UTILISABLES POUR LE TRAITEMENT DE TROUBLES RESPIRATOIRES

Domaine technique de l'invention [1] La présente invention se rapporte à l'utilisation d'un procédé de criblage de composés pour le traitement de troubles respiratoires chez un mammifère. Elle trouve notamment une application dans l'identification de nouvelles molécules candidates pour le traitement des troubles respiratoires.

Art antérieur [2] L'adaptation centrale de la respiration aux besoins physiologiques est un phénomène chémosensible qui passe par des modifications de l'activité électrique de neurones spécialisés situés majoritairement dans le tronc cérébral. Il n'est donc pas surprenant que des déficiences de canaux ioniques soient impliquées dans des physiopathologies respiratoires, par exemple liées à un séjour prolongé en altitude, ou à différentes maladies comme le syndrome de l'apnée du sommeil et le syndrome de la mort subite du nourrisson.

[3] Chez les mammifères, la respiration est régulée par trois paramètres chimiques du sang artériel : i) l'augmentation en dioxyde de carbone, ou hypercapnie. ii) la diminution du pH sanguin, ou acidose. iii) la diminution de la concentration d'oxygène dans le sang, ou hypoxie.

[4] Les variations de ces paramètres sont mesurées grâce à des chémorécepteurs. Les signaux électriques des chémorécepteurs participent à l'adaptation de l'activité respiratoire aux besoins physiologiques de l'organisme. [5] Parmi les pathologies liées à des défauts de la régulation de la respiration, le syndrome de l'apnée du sommeil est un véritable problème de santé publique. Ce syndrome est souvent associé à l'obésité. Par exemple, aux Etats-Unis, environ 3 millions d'hommes et 1, 5 million de femmes souffrent du syndrome de l'apnée du sommeil. Ce syndrome pourrait avoir des conséquences négatives sur l'état de santé des personnes en souffrant, par exemple en empirant les maladies cardiovasculaires comme l'indique l'article Namen AM et al, Haponik EF (2002, Increase Physician-reported sleep apnea : the National Ambulatory Medical Care Survey, Chest 121(6) : 1741-1747.

[6] Les différentes formes d'apnée du sommeil ont en commun l'apparition durant le sommeil de pauses pathologiques dans la respiration (de plus de 10 secondes chez l'adulte, de plus de 8 secondes chez l'enfant), ce qui entraîne une hypoxie avec une alimentation en oxygène du cerveau et des tissus périphériques réduite. Les syndromes de l'apnée du sommeil ont une étiologie hétérogène et peuvent être classifiés selon les pathologies sous-jacentes probables. Par exemple, le sous-groupe des apnées obstructives du sommeil est caractérisé par une obstruction des voies respiratoires supérieures qui empêchent une ventilation correcte et efficace. Le sous-groupe des apnées centrales du sommeil est caractérisé par des défauts de la régulation de la respiration au niveau du tronc cérébral, la commande nerveuse des muscles respiratoires ne fonctionnant plus de façon transitoire. Le sous-groupe des apnées mixtes correspond à une apnée centrale suivie d'une apnée obstructive.

[7] De manière intéressante, l'une des formes centrales de l'apnée ( apnée centrale non hypercapnique ) est caractérisée par des périodes d'hyperventilation qui ont pour résultat une réduction de la concentration de dioxyde de cabone artériel appelée hypocapnie. La réduction du dioxyde de carbone, à son tour, entraîne un défaut de stimulation des centres respiratoires du tronc cérébral qui se traduit par des pauses plus longues dans la respiration, et par conséquence, provoque une réduction de la concentration de l'oxygène artériel. [8] Apparemment, les patients souffrant de ces formes d'apnée du sommeil ont un retard dans la stimulation de la respiration induite par l'hypoxie.

[9] Plusieurs facteurs conduisant à la réduction de la stimulation de la respiration peuvent aggraver les syndromes de l'apnée du sommeil : par exemple les substances ayant un effet sur la respiration, comme l'alcool et les tranquillisants, ou un séjour à haute altitude.

[10] Actuellement, la thérapie des syndromes de l'apnée du sommeil comprend des procédures chirurgicales et des dispositifs pour établir une pression positive au niveau des voies respiratoires supérieures.

[11] Le traitement par ventilation assistée par pression positive continue par voie nasale (nCPAP) durant le sommeil est le procédé le plus efficace à ce jour pour améliorer les symptômes cliniques. Cependant, ce traitement nécessite que le patient soit connecté de manière permanente au système par l'intermédiaire d'un masque. Ainsi, le fait que la technique soit peu pratique limite son succès thérapeutique. [12] À côté des interventions chirurgicales et du traitement nCPAP, quelques approches pharmacologiques ont été réalisées pour améliorer la respiration chez des patients souffrant d'apnée du sommeil, par exemple en utilisant de la progestérone, de la théophylline, de l'acétazolamide et de la protriptyline. [13] Même si ces substances sont capables de stimuler la respiration au moins chez une partie des patients, aucune d'entre elles ne s'est avérée réellement efficace pour le traitement des syndromes de l'apnée du sommeil. En outre, certaines de ces substances présentent des effets secondaires importants. Ainsi, de nombreuses industries pharmaceutiques cherchent de nouvelles molécules qui permettraient de traiter le syndrome des apnées du sommeil.

[14] Des chercheurs se sont intéressés dans le passé au développement d'inhibiteurs de canaux potassiques TASK-1 qui semblent stimuler la respiration. Les canaux TASK-1 sont abondants dans le cerveau, les glandes surrénales, les vaisseaux sanguins et le coeur. Sur la base des observations faites sur des souris knock-out pour TASK-1, il a été noté que l'inactivation génétique de TASK-1 conduit à des troubles de la sécrétion d'aldostérone, à de l'hypertension artérielle et à des changements dans l'électrocardiogramme. De plus, une hypertension pulmonaire peut également être observée. Pour ces différentes raisons, il est apparu que l'utilisation d'inhibiteurs de TASK-1 pour un traitement thérapeutique ne soit pas une solution acceptable.

[15] Le terme syndrome de mort subite du nourrisson est utilisé pour les cas inexpliqués de mort des jeunes enfants et qui représente la principale cause de mortalité chez les enfants âgés d'un mois à un an. Dans la plupart des cas, la cause de la mort n'est pas clairement identifiée, mais les troubles de la respiration semblent jouer un rôle important. Pour les enfants à risque, un système de surveillance respiratoire est disponible, mais il n'existe pas aujourd'hui de traitement pharmaceutique.

[16] A haute altitude, l'hypoxie conduit à une augmentation de la ventilation qui conduit elle-même à une réduction du dioxyde de carbone artériel (hypocapnie) et a pour conséquence une augmentation du pH artériel (alcalose respiratoire). L'alcalose respiratoire affecte la régulation de la respiration et conduit à des modes de respiration irrégulière, particulièrement pendant les phases de sommeil. Il a été montré que des substances capables d'inhiber l'alcalose respiratoire, par exemple l'acétazolamide, peuvent améliorer les modes respiratoires et les symptômes associés à la haute altitude par augmentation de l'élimination du bicarbonate par les reins, ce qui a pour conséquence la diminution du pH artériel. Toutefois, l'utilisation d'acétazolamide peut causer des effets secondaires, en perturbant par exemple l'homéostasie électrolytique.

[17] En résumé, peu de substances sont actuellement connues pour traiter ces troubles respiratoires, et celles qui sont connues sont soit insuffisamment efficaces, soit présentent des effets secondaires négatifs qui limitent leur utilisation pour des traitements dans la durée. En outre, les chercheurs ne disposent pas de suffisamment de moyens pour mettre en évidence de nouvelles substances candidates pour le traitement des troubles respiratoires. [18] II existe donc un réel besoin de nouveaux moyens permettant d'identifier de nouvelles molécules candidates pour le traitement des troubles respiratoires.

Exposé de l'invention [19] La présente invention répond précisément au besoin précité en fournissant un procédé de criblage pour l'identification de molécules candidates pour le traitement de troubles respiratoires chez un mammifère, ledit procédé de criblage comprenant une étape consistant à déterminer si l'activité fonctionnelle d'un polypeptide canal ionique TASK-2 (KCNK5) en présence d'une molécule test est diminuée ou supprimée par rapport à l'activité fonctionnelle dudit canal ionique TASK-2 en l'absence de ladite molécule test. [20] S'il est déterminé que l'activité de TASK-2 est diminuée ou supprimée lors de la mise en oeuvre du procédé de l'invention, alors la molécule test est considérée comme une molécule candidate pour le traitement de troubles respiratoires chez un mammifère.

[21] Les inventeurs de la présente invention sont en effet les premiers à avoir mis en évidence que les canaux TASK-2, également nommés KCNK5, sont présents dans certaines régions des centres respiratoires du tronc cérébral et jouent de manière surprenante un rôle dans la respiration. Des expériences in vitro sur une préparation de tronc cérébral provenant de souris nouveaux-nés, présentent une forte diminution de l'activité respiratoire lors d'une anoxie. Cette diminution n'est plus observée sur des préparations de tronc cérébral provenant de souris invalidées pour le canal TASK-2. L'inhibition ou l'absence de TASK-2 protège donc contre l'anoxie. Ces données indiquent que l'expression de ces canaux au niveau de certains neurones est directement ou indirectement associée à la chémoréception.

[22] Les inventeurs de la présente invention ont en outre démontré l'expression de ces canaux TASK-2 au niveau de certains neurones connus pour être directement ou indirectement associée à la chémoréception.

[23] Les inventeurs ont montré par ailleurs que les souris mutantes invalidées pour le canal TASK-2 inactifs ( knock-out TASK-2) présentent un remarquable maintien de la respiration au cours d'une hypoxie, contrairement aux souris de type sauvage qui présentent une forte dépression respiratoire. Ces résultats démontrent que chez la souris en condition in vivo l'inactivation des canaux TASK-2 modifie profondément la réponse ventilatoire à l'hypoxie et résulte en une stimulation de la respiration. [24] De manière intéressante, il a été mis en évidence à partir d'un système de culture cellulaire in vitro que l'expression de TASK-2 est réduite après plusieurs heures d'hypoxie due à la sensibilité à l'hypoxie du promoteur TASK-2 (Brazier et al., (2005) Cloning of the human TASK-2 (KCNK5) promoter and its regulation by chronic hypoxia, Biochem Biophys Res Commun 336 :1251-1258). [25] Ainsi, l'adaptation à l'hypoxie (par exemple lors d'un séjour à haute altitude), peut inclure un mécanisme de défense du corps par réduction de l'expression des canaux TASK-2. Cependant, cette adaptation physiologique nécessite probablement plusieurs heures et ne fonctionne pas pour une réponse immédiate à une hypoxie à court terme.

[26] Dans ces cas d'hypoxie à court terme, l'inactivation pharmacologique de TASK-2 peut permettre d'anticiper les mécanismes de défense de régulation négative de l'expression de TASK-2. [27] En outre, contrairement aux canaux TASK-1 et TASK-3, qui sont probablement eux aussi impliqués dans la régulation de la respiration, l'expression de TASK-2 dans le système nerveux central est extrêmement faible et limitée à des groupes restreints de neurones des circuits de la respiration. De plus, TASK-2 n'est pas ou très faiblement exprimé dans le coeur où TASK-1 est très fortement exprimé. Ainsi, l'expression très limitée de TASK-2 dans le système nerveux central et son absence virtuelle dans le coeur constitue un énorme avantage pour l'inhibition spécifique de TASK-2. [28] La séquence peptidique de TASK-2, son organisation au niveau des membranes cellulaires et le gène codant sont décrits dans WO 00/27871 (PCT/IB99/01886 û appartenant au CNRS, déposée le 9 novembre 1999 et publiée le 18 mai 2000). Ce document décrit également la distribution cellulaire de TASK-2 chez l'humain et chez la souris, la distribution d'ARNm TASK-2 dans le rein adulte, la carte chromosomique de TASK-2, l'expression de TASK-2 dans des cellules COS transfectées et dans des ovocytes de xenope, la sensibilité des courants de TASK-2 au pH, ainsi que la régulation de TASK-2 en fonction du pH, ainsi que les propriétés biophysiques et pharmacologiques de TASK-2. Ces éléments sont utilisables dans la présente pour comprendre et mettre en oeuvre la présente invention.

[29] On entend par troubles respiratoires des insuffisances respiratoires dues à un dysfonctionnement du système nerveux central, en particulier toute insuffisance respiratoire liée à un défaut de fonctionnement des centres respiratoires cérébraux situés au niveau du tronc cérébral.

[30] Parmi les troubles respiratoires, on peut citer, sans s'y limiter : le syndrome des apnées du sommeil, les formes respiratoires du syndrome de mort subite du nourrisson, les modèles de respiration pathologique due à l'altitude, le syndrome d'Ondine ou syndrome d'hypoventilation alvéolaire congénitale, les troubles dus à une intoxication accidentelle ou volontaire par un médicament (par exemple par absorption de barbituriques ou de morphiniques), la dépression respiratoire liée à une anesthésie générale, l'insuffisance respiratoire aigue et l'hypoxémie sévère. [31] On entend par molécule test une molécule testée par le procédé de l'invention pour déterminer si elle diminue ou supprime l'activité du canal TASK-2 ou son expression. [32] On entend par molécule candidate une molécule identifiée par la mise en oeuvre de la présente invention comme diminuant ou supprimant l'activité du canal TASK-2 ou son expression.

La présente invention permet d'identifier des molécules candidates pour le traitement de troubles respiratoires chez un mammifère, qu'il soit humain ou animal. [33] Les molécules test pour la mise en oeuvre de la présente invention peuvent être choisies par exemple de manière aléatoire dans des banques moléculaires ou, par exemple, parmi des molécules biologiquement acceptables et capables d'interagir avec un canal ionique. [34] Comme molécules test susceptibles de diminuer ou supprimer l'activité de TASK-2, on peut citer par exemple la quinine, la quinidine, le clofilium, la lidocaïne, la bupivacaïne, le doxapram ainsi que les anesthésiques volatils tels que l'halothane. 10 [35] Comme molécule candidate, on peut citer par exemple aussi un anticorps dirigé contre TASK-2. Cet anticorps peut être fabriqué par les techniques connues de l'homme du métier. Cet anticorps peut être par exemple un anticorps polyclonal, monoclonal, chimérique, un fragment 15 Fab.

[36] On entend par activité fonctionnelle la capacité du canal potassique à conduire et contrôler les mouvements ioniques à travers la membrane cellulaire. 20 [37] Selon l'invention, l'étape de détermination de l'activité fonctionnelle de TASK-2 peut être réalisée suivant une des méthodes connues de l'homme du métier pour déterminer l'activité d'un canal ionique. Il peut s'agir à titre d'exemple d'une méthode telle que celle décrite pour le canal 25 KCNK2 dans le document WO 05/054866 (PCT/EP/2004/012823 û Bayer Healthcare AG, déposée le 12 novembre 2004 et publiée le 16 juin 2005), d'une méthode telle que celle décrite pour les canaux TASK-2, TWIK-1, TREK-1 et TASK-1 dans le document WO 00/27871 précité, ou encore d'une méthode telle que celle décrite pour le canal TREK-2 décrite dans 30 WO 02/00715 (PCT/IB01/01436 û CNRS, déposée le 27 juin 2001 et publiée le 3 janvier 2002).5 [38] Selon l'invention, l'étape consistant à déterminer si l'activité fonctionnelle du polypeptide TASK-2 est diminuée ou supprimée peut comprendre : i) une mise en contact d'une cellule exprimant un polypeptide TASK-2 présentant une activité fonctionnelle, avec ladite molécule test, et ii) une mesure de l'activité fonctionnelle du polypeptide TASK-2 et/ou de son expression en présence de ladite molécule test. 10 [39] Des exemples de mise en oeuvre de cette étape sont notamment décrits dans les trois documents précités.

[40] Selon l'invention, la cellule exprimant le polypeptide TASK-2 peut 15 l'exprimer de manière endogène ou sous forme recombinante. Des procédés permettant de faire exprimer ce polypeptide par des cellules pour la mise en oeuvre de la présente invention sont décrits par exemple dans WO 00/27871 (cellules COS ou ovocytes de xenope) et dans les autres documents précités. 20 [41] De manière générale, selon l'invention, l'activité fonctionnelle peut être mesurée par un ou plusieurs paramètre(s) choisi(s) dans le groupe comprenant : le courant ionique traversant le polypeptide TASK-2, le changement du potentiel membranaire de la cellule exprimant le 25 polypeptide TASK-2, le changement de la concentration ionique intracellulaire de la cellule exprimant le polypeptide TASK-2. Des exemples de mesure d'activité fonctionnelle d'un canal utilisables dans la présente invention sont donnés par exemple dans chacun des trois documents précités. 30 [42] Selon l'invention, l'activité fonctionnelle peut être déterminée par exemple par mesure du courant ionique traversant le polypeptide TASK-2, le courant ionique traversant le polypeptide TASK-2 pouvant être par exemple un efflux d'ions rubidium. De préférence, la mesure du courant ionique traversant le polypeptide TASK-2 est réalisée par la mesure de l'efflux d'ions rubidium, cette mesure pouvant être réalisée par exemple par spectroscopie d'absorption atomique, par exemple comme indiqué dans Gill, S., R. Gill, D. Wicks and D. Liang (2007) "A cell-based rb(+)-flux assay of the kvl .3 potassium channel " Assay Drug Dev Technol 5, 373-80.

[43] Selon l'invention, une molécule test qui diminue l'activité de TASK-2 de préférence d'au moins 10%, de préférence d'au moins 50%, et encore plus préférentiellement 75, 90 ou 100% est identifiée comme une molécule candidate pour diminuer l'activité de TASK-2.

[44] L'invention permet notamment l'identification de molécules candidates pour le traitement de troubles respiratoires choisis dans le groupe comprenant le syndrome des apnées du sommeil, les formes respiratoires du syndrome de mort subite du nourrisson, les modèles de respiration pathologique due à l'altitude. [45] Une étape ultérieure à l'identification d'une molécule candidate peut être une étape d'étude de l'effet de ladite molécule sur les troubles respiratoires, par exemple après administration de la molécule candidate à un modèle animal présentant des troubles de la respiration ou mis dans des conditions entraînant des troubles respiratoires. [46] Un autre aspect de l'invention concerne donc l'utilisation d'une molécule modulant l'activité fonctionnelle du polypeptide TASK-2 et/ou inhibant son expression, pour la préparation d'une composition pour le traitement de troubles respiratoires. [47] Suivant une variante de la présente invention, il est également possible de cribler des molécules pour rechercher celles qui ont la capacité30 d'augmenter, de diminuer ou de supprimer l'expression génique de TASK-2. II s'agit par exemple de déterminer, pour chaque molécule testée, le niveau d'ARNm codant TASK-2 ou de TASK-2 généré. Cette détermination peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier. Il peut s'agir d'une méthode qualitative ou quantitative. Des méthodes de détermination utilisables dans la présente invention peuvent être trouvées par exemples dans les documents WO 05/054866, WO 00/27871 et WO 02/00715. La présence d'un ARNm codant TASK-2 ou de TASK-2 peut être déterminée par exemple par l'une des méthodes immunochimiques 1 o connues de l'homme du métier, par exemple par immuno-dosage, une technique Western blot ou par immunohistochimie.

[48] Le criblage de la présente invention peut être réalisé dans un système sans cellule ou avec cellule. N'importe quelle cellule exprimant 15 TASK-2 peut être utilisée. Le polypeptide TASK-2 peut être exprimé naturellement dans la cellule ou peut y être introduit par une technique de recombinaison génétique connue de l'homme du métier. Des exemples de protocoles de recombinaison génétique utilisables pour'la mise en oeuvre de la présente invention sont décrits dans les trois documents précités. 20 [49] Ainsi, selon cette variante, une molécule candidate peut être par exemple une séquence complémentaire de la séquence polynucléotidique codant TASK-2 (ou KCNK5) qui est susceptible de bloquer la transcription de canal. 25 [50] Les vecteurs d'expression dérivés des rétrovirus, adénovirus, du virus de la vaccine ou de l'herpès ou d'autres virus bactériens peuvent être utilisés pour délivrer des séquences nucléotidiques complémentaires aux organes cibles, tissus ou populations cellulaires. Des procédés connus de 30 l'homme du métier peuvent être utilisés pour la construction de vecteurs qui expriment la séquence d'acide nucléique complémentaire aux polynucléotides des gènes codant TASK-2 (Scott and Smith (1990) Science 249 :386-390). Des méthodes connues de l'homme du métier peuvent être utilisées pour construire des vecteurs d'expression contenant des séquences codant TASK-2 ainsi que les éléments contrôlant la transcription et la traduction. Ces méthodes incluent les techniques d'ADN recombinant in vitro, les techniques synthétiques et la recombinaison génétique in vivo. Les trois documents précités décrivent des méthodes utilisables pour la construction de vecteurs pour la mise en oeuvre de la présente invention. [51] D'autres avantages apparaîtront encore à la lecture des exemples qui suivent donnés à titre illustratif en référence aux figures annexées.

Brève description des figures [52] La figure 1 est une photographie de canaux TASK-2 présents à la surface ventrale du bulbe rachidien rostral. [53] La figure 2 est un histogramme représentant les résultats expérimentaux de l'exemple 1 ci-dessous de mise en évidence de l'expression de TASK-2 dans les cellules neuronales du tronc cérébral. Sur cette figure, l'axe des ordonnées représente la fréquence de l'activité rythmique respiratoire (exprimée en nombre de cycles par minute), et l'axe des abscisses, les différents tests mis en oeuvre dans cet exemple. Les barres blanches correspondent aux résultats obtenus sur les souris sauvages et les barres noires sur les souris TASK-2 mutantes. [54] La figure 3 est un histogramme représentant les résultats expérimentaux de l'exemple 3 ci-dessous de mise en évidence in vivo de l'intervention des canaux TASK-2 dans les mécanismes de la respiration. Sur cette figure, l'axe des ordonnées représente le débit ventilatoire par minute ( minute volume ou MV) exprimé en ml/g de poids corporel, et l'axe des abscisses, les différents tests mis en oeuvre dans cet exemple. [55] La figure 4 représente un enregistrement en patch-clamp du courant TASK2 (intensité I en picoampères (pA)) sur des cellules HEK transfectées avec de l'ADN codant pour le canal TASK2 humain.

EXEMPLES

Exemple 1 : Mise en évidence de l'expression de TASK-2 dans les cellules neuronales du tronc cérébral [56] Les expériences de cet exemple démontrent la présence de canaux TASK-2 dans une structure nerveuse majeure appartenant aux centres respiratoires du tronc cérébral. Ces expériences ont été réalisées à partir de souris mutantes hétérozygotes adultes (TASK-2+"-). Le gène TASK-2 qui est invalidé est remplacé par une séquence codante pour une enzyme, la beta-galactosidase. Grâce à cette enzyme, les cellules qui expriment normalement les canaux TASK-2 peuvent être facilement identifiée par la technique histochimique classique de révélation utilisant l'X-Gal comme substrat qui devient bleu lorsqu'il est hydrolysé. [57] Après un protocole de fixation au para-formaldéhyde, le tissu nerveux est prélevé puis la technique de révélation X-GAL est pratiquée sur des coupes transversales de tronc cérébral de 30pm d'épaisseur, obtenues à l'aide d'un cryostat. À l'issue de cette réaction, les cellules exprimant les canaux TASK-2 sont colorées en bleu (flèche sur la figure 1). [58] Les résultats obtenus montrent la présence de cellules exprimant TASK-2 dans des zones discrètes du tronc cérébral. À titre d'exemple, la figure 1 illustre les canaux TASK-2 présents à la surface ventrale du bulbe rachidien rostral. II s'agit d'une coupe transversale illustrant la présence de marquage X-gal dans des neurones de la surface ventrale du bulbe rachidien rostral (noyau rétrotrapézoïdal, RTN). [59] Comme le montrent de très nombreuses études, cette zone joue un rôle fondamental dans la chémosensibilité centrale, c'est-à-dire dans les processus d'adaptation de la ventilation en réponse à une variation chimique du milieu intérieur (sang, liquide cérébrospinal ou LCR). Grâce à la localisation unique de ces canaux dans des zones clés impliquées dans le contrôle de la respiration, il est donc envisageable de moduler spécifiquement la respiration par un procédé agissant sur TASK-2.

Exemple 2 : Mise en évidence in vitro de l'intervention des canaux TASK-2 dans les mécanismes de la respiration

[60] Dans cet exemple, les inventeurs ont utilisé des souris type sauvage (canaux TASK-2 actifs) et des souris TASK-2 mutantes n'exprimant pas de canaux TASK-2 actifs ( TASK-2-1- ). Ces souris ont été produites initialement par le laboratoire de W. SKARNES à San Francisco (Mitchell, K. J., Pinson, K. I., Kelly, O. G., Brennan, J., Zupicich, J., Scherz, P., Leighton, P. A., Goodrich, L. V., Lu, X., Avery, B. J., et al. (2001). Functional analysis of secreted and transmembrane proteins critical to mouse development. Nat Genet 28, 241-249) dans le domaine public. Elles ont été rétrocroisées dans le fond génétique C57BI/6J puis élevées et produites au sein même des laboratoires des inventeurs.

[61] Les expériences de cet exemple démontrent des changements dans l'activité respiratoire lors d'une anoxie. Ces expériences ont été réalisées sur la préparation de tronc cérébral isolé in vitro à partir de souriceaux âgés de 1 à 3 jours préparation "en bloc").

[62] Le tronc cérébral de souris sauvages ou mutantes (TASK-2'-) est rapidement disséqué dans la glace, isolé des tissus adjacents, puis placé dans du LCR artificiel (LCRa) équilibré dans du carbogène (95% 02, 5% CO2). La racine ventrale du segment spinal C4 est à l'origine du nerf phrénique qui innerve le diaphragme. Cette racine nerveuse est aspirée à l'intérieur d'une électrode de verre afin de recueillir l'activité respiratoire rythmique générée spontanément par la préparation. L'activité électrique de la racine C4 est filtrée, amplifiée, visualisée et stockée sur ordinateur pour analyser a posteriori les paramètres respiratoires (fréquence, amplitude, durée). Les tests ont consisté à modifier la quantité de gaz dissous dans le LCRa ou sa composition chimique et à comparer les activités respiratoires. [63] La figure 2 est un histogramme représentant les résultats expérimentaux de cet exemple (préparation en bloc : fréquence respiratoire û activité électrique de la racine C4 du nerf phrénique û enregistrée sur tronc cérébrale de souris sauvage et task-2-/-. Contrôle : LCR artificiel équilibré en 95% 02 , 5% CO2 . Anoxie : 95% N2 , 5% CO2)/ L'axe des ordonnées représente la fréquence de l'activité rythmique respiratoire (exprimée en nombre de cycles par minute), et l'axe des abscisses, les différents tests mis en oeuvre dans cet exemple. Les barres blanches correspondent aux résultats obtenus sur les souris sauvages et les barres noires sur les souris TASK-2 mutantes.

[64] Les résultats obtenus montrent qu'en condition contrôle (95% 02, 5% CO2), la fréquence respiratoire ne diffère pas entre les animaux sauvages et TASK-2 mutants. En anoxie (LCRa équilibré dans un gaz dépourvu d'oxygène : 95% N2i 5% CO2), la fréquence respiratoire des animaux sauvages chute d'environ 40%. Cette réponse classique, appelée dépression respiratoire hypoxique, n'est plus observée chez les souriceaux mutants TASK-21- (comparaison statistique, *** : p<0.001). [65] Ces expériences démontrent que l'activité respiratoire in vitro des souriceaux soumis à une anoxie est significativement plus fréquente après invalidation du gène codant pour les canaux TASK-2. Ainsi, dans des conditions de dépression respiratoire, il est envisageable de restaurer l'activité respiratoire centrale par un procédé agissant sur TASK-2.

Exemple 3 : Mise en évidence in vivo de l'intervention des canaux TASK-2 dans les mécanismes de la respiration

[66] Dans cet exemple, les inventeurs ont également utilisé des souris type sauvage et des souris TASK-2 mutantes. [67] La respiration des souris a été mesurée avec un appareil pléthysmographique (EMKA technologies, France).

[68] La figure 3 est un histogramme représentant les résultats 15 expérimentaux de cet exemple illustrant les réponses ventilatoires des souris sauvages et TASK-2-/- lors d'une exposition prolongée à l'hypoxie (8% 02). Sur cette figure, l'axe des ordonnées représente le débit ventilatoire par minute ( minute volume ou MV) exprimé en ml/g de poids corporel, et l'axe des abscisses, les différents tests mis en oeuvre 20 dans cet exemple. Les barres blanches correspondent aux résultats obtenus sur les souris sauvages et les barres noires sur les souris TASK-2 mutantes.

[69] Différentes conditions d'exposition à l'oxygène ont été testées. Le 25 débit ventilatoire par minute (ml/g) a été mesuré pendant le contrôle (con) (21% de d'oxygène) et lors d'une hypoxie à 8% d'oxygène correspondant à une altitude de 6500m au-dessus du niveau de la mer. L'hypoxie a été testée pendant 1 à 6 heures.

30 [70] L'hypoxie a entraîné une augmentation transitoire de la respiration chez tous les animaux (hyperventilation consécutive à la stimulation des chémorécepteurs périphériques) (non illustrée). Secondairement,10 l'exposition prolongée à l'hypoxie a entraîné une réduction des mouvements respiratoires ou dépression qui s'observe uniquement chez les souris de type sauvage. La réduction de dioxyde de carbone artériel consécutive à l'hyperventilation initiale a été un facteur important chez les souris de type sauvage (en blanc sur l'histogramme de la figure 1) pour réduire leur respiration.

[71] Les animaux invalidés pour le canal TASK2 présentent au contraire une hyperventilation soutenue pendant toute la durée de l'hypoxie. [72] Il apparaît clairement que suite à l'inactivation des canaux TASK-2, l'hypoxie est un stimulus puissant pour la respiration, y compris dans des conditions d'hypocapnie (alcalose respiratoire). Il est probable que l'alcalose respiratoire ne soit plus capable d'activer les canaux TASK-2 du système nerveux central.

[73] Les résultats de ces expériences démontrent clairement qu'une souris TASK-2 knock-out présente une respiration augmentée pendant l'hypoxie en comparaison à une souris de type sauvage. [74] Ainsi, l'inhibition de TASK-2 apparaît comme un moyen de traitement des troubles de la respiration.

[75] En conclusion, il apparaît que l'inactivation des canaux potassiques 25 TASK-2 comme moyen pour stimuler la respiration dans des conditions hypoxiques est une nouvelle stratégie qui se distingue des approches thérapeutiques utilisées dans l'art antérieur. 30 Exemple 4 : Mise en oeuvre d'un criblage selon la présente invention [76] La distribution de TASK-2 chez un être humain adulte, sa cartographie chromosomique, ses propriétés biophysique et pharmacologiques, sa régulation par le pH externe ont été étudiées d'après le document WO 00/27871. [77] Le criblage suivant a été mis en oeuvre . Des cellules HEK (Human Embryonnic Kidney cells) ont été transfectées avec un plamide contenant le DNA complémentaire du gène du canal TASK-2 humain (pIRES-CD8-hTASK2) par la méthode à la lipofectamine. Après 24 heures de culture, les courants TASK-2 sont enregistrés par la méthode du voltage-clamp (patch-clamp en configuration cellules entière). Les courants sont activés par des sauts de voltage depuis un potentiel de repos à -95V jusqu'à des valeurs variables comprises entre -80 et +45mV. [78] Les courants sont enregistrés en configuration cellule entière au moyen d'un amplificateur EPC-10 (HEKA). La pipette de patch contient une solution 95 K-gluconate, 30 mM KCI, 4,8 mM Na2HPO4 , 1,2 mM NaH2PO4 , 5 mM glucose, 2,38 mM MgCl2 , 0,726 mM CaCl2 ,1 mM EGTA, 3 mM ATP, pH 7,2. La solution externe est une solution RINGER : 145 mM NaCl, 0,4 mM KH2PO4 , 1,6 mM K2HPO4 , 5 mM glucose, 1 mM MgCl2 , 1,3 mM CaCl2, , 5 mM HEPES, pH 7,4.

[79] Différentes drogues peuvent être appliquées à différentes concentrations par perfusion du bain externe et leurs effets sont évalués 25 par la modification des courants par rapport aux conditions contrôles.

[80] Dans l'exemple de la Figure 4, on voit que l'application de Doxapram à 0,9 mM dans le bain a provoqué une diminution de 25% du courant évoqué par les sauts de potentiel. 30

Claims (7)

REVENDICATIONS

1. Utilisation d'un procédé de criblage pour l'identification de molécules candidates pour le traitement de troubles respiratoires chez un mammifère, ledit procédé de criblage comprenant une étape consistant à déterminer si l'activité fonctionnelle d'un polypeptide canal ionique TASK-2 en présence d'une molécule test est diminuée ou supprimée par rapport à l'activité fonctionnelle dudit canal ionique TASK-2 en l'absence de ladite molécule test, la molécule test étant considérée comme étant une molécule candidate lorsqu'elle diminue ou supprime ladite activité fonctionnelle.

2. Utilisation selon la revendication 1, dans laquelle l'étape consistant à déterminer si l'activité fonctionnelle du polypeptide TASK-2 est diminuée ou supprimée comprend : i) une mise en contact d'une cellule exprimant un polypeptide TASK-2 présentant une activité fonctionnelle, avec ladite molécule test, et ii) une mesure de l'activité fonctionnelle du polypeptide TASK-2 et/ou de son expression en présence de ladite molécule test.

3. Utilisation selon la revendication 2, dans laquelle ladite cellule exprime le polypeptide TASK-2 de manière endogène.

4. Utilisation la revendication 3, dans laquelle ladite cellule exprime le polypeptide TASK-2 sous forme recombinante.

5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 30 4, dans laquelle ladite activité fonctionnelle est déterminée par une mesure choisie dans le groupe comprenant : une mesure du courant ionique traversant le polypeptide TASK-2, une mesure du changement du potentiel25membranaire de la cellule exprimant le polypeptide TASK-2, une mesure du changement de la concentration ionique intracellulaire de la cellule exprimant le polypeptide TASK-2.

6. Utilisation selon la revendication 5, dans laquelle ladite activité fonctionnelle est déterminée par mesure du courant ionique traversant le polypeptide TASK-2, et dans laquelle le courant ionique traversant le polypeptide TASK-2 est un efflux d'ions rubidium.

7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour l'identification de molécules utilisables pour le traitement de troubles respiratoires choisis dans le groupe comprenant le syndrome des apnées du sommeil, les formes respiratoires du syndrome de mort subite du nourrisson, les modèles de respiration pathologique due à l'altitude.15