FR2995614A1 - Biopuce pour la detection et/ou l'identification de bacteries du genre legionella, kit et procede d'utilisation - Google Patents
Biopuce pour la detection et/ou l'identification de bacteries du genre legionella, kit et procede d'utilisation Download PDFInfo
- Publication number
- FR2995614A1 FR2995614A1 FR1258799A FR1258799A FR2995614A1 FR 2995614 A1 FR2995614 A1 FR 2995614A1 FR 1258799 A FR1258799 A FR 1258799A FR 1258799 A FR1258799 A FR 1258799A FR 2995614 A1 FR2995614 A1 FR 2995614A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- sequence
- sequences
- seq
- nucleic acid
- bacteria
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000589248 Legionella Species 0.000 title claims abstract description 70
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 title claims abstract description 65
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 58
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 55
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 55
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 55
- 108010064250 RNA polymerase beta subunit Proteins 0.000 title abstract 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 17
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 title description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 4
- 241000894007 species Species 0.000 claims abstract description 99
- 208000007764 Legionnaires' Disease Diseases 0.000 claims abstract description 59
- 101150090202 rpoB gene Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 27
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 25
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 101100038261 Methanococcus vannielii (strain ATCC 35089 / DSM 1224 / JCM 13029 / OCM 148 / SB) rpo2C gene Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 101150085857 rpo2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 5
- 101150075489 mip gene Proteins 0.000 claims description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 34
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 claims description 28
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 claims description 28
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 101100457322 Rattus norvegicus Mipep gene Proteins 0.000 claims description 18
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 18
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 claims description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 17
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 13
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 13
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 12
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 12
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 10
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 10
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 10
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 10
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 7
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 claims description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 6
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 claims description 5
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 3
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000002118 epoxides Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 2
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 claims 1
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 claims 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 76
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 12
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 241000589242 Legionella pneumophila Species 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241001135525 Legionella birminghamensis Species 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241001135527 Legionella cincinnatiensis Species 0.000 description 6
- 241000589264 Legionella longbeachae Species 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N Pentane Chemical compound CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 229940115932 legionella pneumophila Drugs 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- RGHHSNMVTDWUBI-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzaldehyde Chemical compound OC1=CC=C(C=O)C=C1 RGHHSNMVTDWUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000004023 Legionellosis Diseases 0.000 description 4
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 4
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000000607 proton-decoupled 31P nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 4
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 3
- 241000589244 Fluoribacter bozemanae Species 0.000 description 3
- 241000589282 Fluoribacter dumoffii Species 0.000 description 3
- 241000589278 Fluoribacter gormanii Species 0.000 description 3
- 241001135524 Legionella anisa Species 0.000 description 3
- 241001135526 Legionella cherrii Species 0.000 description 3
- 241000589239 Legionella erythra Species 0.000 description 3
- 241000589259 Legionella feeleii Species 0.000 description 3
- 241000589240 Legionella hackeliae Species 0.000 description 3
- 241000589276 Legionella jordanis Species 0.000 description 3
- 241000189478 Legionella lansingensis Species 0.000 description 3
- 241001148224 Legionella oakridgensis Species 0.000 description 3
- 241000189497 Legionella parisiensis Species 0.000 description 3
- 241001135522 Legionella sainthelensi Species 0.000 description 3
- 241000122902 Legionella tucsonensis Species 0.000 description 3
- 241001135523 Legionella wadsworthii Species 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000002444 silanisation Methods 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 206010035718 Pneumonia legionella Diseases 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000224423 Acanthamoeba castellanii Species 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 208000008745 Healthcare-Associated Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 1
- GIKDYMRZQQJQFB-UHFFFAOYSA-N Methylhydrazine hydrochloride Chemical compound Cl.CNN GIKDYMRZQQJQFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010029803 Nosocomial infection Diseases 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N Phosphine Chemical compound P XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010035742 Pneumonitis Diseases 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 101100386054 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) CYS3 gene Proteins 0.000 description 1
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical compound [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 238000004378 air conditioning Methods 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- FJDQFPXHSGXQBY-UHFFFAOYSA-L caesium carbonate Chemical compound [Cs+].[Cs+].[O-]C([O-])=O FJDQFPXHSGXQBY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000024 caesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- OCLXJTCGWSSVOE-UHFFFAOYSA-N ethanol etoh Chemical compound CCO.CCO OCLXJTCGWSSVOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- UBIJTWDKTYCPMQ-UHFFFAOYSA-N hexachlorophosphazene Chemical compound ClP1(Cl)=NP(Cl)(Cl)=NP(Cl)(Cl)=N1 UBIJTWDKTYCPMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000587 hyperbranched polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- HDZGCSFEDULWCS-UHFFFAOYSA-N monomethylhydrazine Chemical compound CNN HDZGCSFEDULWCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- -1 respirators Substances 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 208000026425 severe pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 101150035983 str1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
L'invention concerne une biopuce comprenant, immobilisée(s) sur un support, au moins une molécule d'acides nucléiques rpoB-spécifique capable de s'hybrider spécifiquement avec la séquence d'une portion du gène rpoB de bactéries d'une première espèce du genre Legionella, et le cas échéant au moins une molécule d'acides nucléiques mip-spécifique capable de s'hybrider spécifiquement avec la séquence d'une portion du gène mip de bactéries d'une espèce du genre Legionella, de préférence différente de la première. Un kit pour la détection et/ou l'identification de bactéries du genre Legionella comprend, outre ladite biopuce, un premier couple d'amorces nucléiques capable d'amplifier la séquence d'une région du gène rpoB comprenant la portion avec laquelle la molécule d'acides nucléiques rpoB-spécifique est capable de s'hybrider spécifiquement, et le cas échéant un deuxième couple d'amorces nucléiques capable d'amplifier la séquence d'une région du gène mip comprenant la portion avec laquelle la molécule d'acides nucléiques mip-spécifique est capable de s'hybrider spécifiquement.
Description
La présente invention s'inscrit dans le domaine du diagnostic microbiologique, plus précisément de la détection et/ou de l'identification de bactéries du genre Legionella dans un échantillon susceptible d'être contaminé par de telles bactéries. Plus particulièrement, l'invention concerne une biopuce adaptée à une telle détection, un kit de diagnostic comprenant une telle biopuce, et un procédé la mettant en oeuvre. Les bactéries du genre Legionella (Legionella spp., ou légionelles) sont des bactéries de l'environnement hydrique susceptibles de provoquer une maladie respiratoire chez l'homme, qui peut parfois s'avérer mortelle : la légionellose, dite maladie du légionnaire, caractérisée par une pneumopathie aiguë sévère. La légionellose se contracte par inhalation d'eau contaminée par les légionelles. Ces dernières sont souvent détectées dans les réseaux de distribution d'eau et dans les dispositifs employant l'eau, tels que les tours aéro-réfrigérantes, les systèmes de climatisation, les nébuliseurs, les humidificateurs, etc. Vingt-et-une espèces de bactéries du genre Legionella ont à ce jour été mises en évidence comme pathogènes chez l'homme, la plus importante étant Legionella pneumophila (L. pneumophila) (O'Connell et al., 1996). La légionellose est associée à un taux de mortalité élevé, d'environ 20 % (Meenhorst et al., 1985). Elle peut notamment être contractée dans les hôpitaux, le plus souvent par le biais des aérosols de douche, des respirateurs, ou de l'eau utilisée pour humidifier l'oxygène. L'identification des cas d'infection nosocomiale s'avère difficile, dans la mesure où le spectre clinique de la maladie s'étend de l'état grippal anodin à la pneumopathie grave. Aucun argument clinique ou radiologique ne permet en particulier de différencier avec certitude les légionelloses des autres étiologies de pneumonie. Or, un diagnostic précoce de cette maladie est essentiel pour proposer au patient un traitement antibiotique adapté. Il existe à l'heure actuelle plusieurs méthodes de diagnostic des infections provoquées par les bactéries du genre Legionella.
La technique de culture cellulaire est généralement utilisée pour détecter et quantifier les légionelles dans les échantillons d'eaux. Cependant le délai d'obtention des résultats est long, et peut atteindre dix jours. De plus, cette technique reste peu sensible (10 à 30 %) (Ballard et al., 2000 ; Boulanger et Edelstein, 1995), notamment en cas de présence de flore interférente, inhibant la croissance des légionelles. Enfin, les cellules de légionelles peuvent exister sous une forme viable mais non cultivable, non détectées par les techniques classiques de culture mais potentiellement pathogènes (Steinert et al., 1997).
Le diagnostic peut également être réalisé par immunofluorescence directe. Là encore, la technique manque de sensibilité et peut présenter des réactions croisées avec des isolats non-légionelles, ce qui peut rendre difficile l'identification d'espèces autres (Bartie et al., 2003). La recherche d'antigènes urinaires, plus précisément par un test d'agglutination de particules de latex à l'aide d'anticorps spécifiques de la membrane externe cellulaire, est communément utilisée par les hôpitaux, mais se limite au diagnostic de L. pneumophila (von Baum et al., 2008). Un test de détection et quantification des légionelles par Réaction de Polymérisation en Chaîne (PCR) est par ailleurs décrit dans la norme NF T 90- 471. Ce test est actuellement couramment mis en oeuvre pour quantifier les bactéries de l'espèce L. pneumophila dans les tours aéro-réfrigérantes, en alternative des techniques de culture. Le taux de détection de l'ADN de légionelles par PCR est généralement élevé (plus de 90 % d'échantillons positifs) (Buchbinder et al., 2002 ; Ng et al., 1997), mais la positivité de la PCR offre trop peu d'informations sur le risque de légionellose associé. Ainsi, aucune des techniques proposées par l'art antérieur ne donne entièrement satisfaction, notamment car elles sont longues à mettre en oeuvre, peu sensibles et/ou limitées à une espèce donnée. Il subsiste par conséquent un besoin pour un test de détection, et de préférence de discrimination, de bactéries du genre Legionella dans un échantillon, qui soit rapide à effectuer, et qui présente une spécificité et une sensibilité élevées.
La présente invention vise ainsi à remédier aux inconvénients des méthodes de détection des bactéries du genre Legionella proposées par l'art antérieur, notamment à ceux exposés ci-avant, en proposant un outil pour la détection d'au moins une espèce de telles bactéries dans un échantillon, qu'il s'agisse d'un échantillon biologique issu d'un patient suspecté d'être atteint de légionellose, ou d'un échantillon d'eau ou d'air susceptible d'être contaminé par de telles bactéries, en particulier d'une des espèces identifiées comme pathogènes chez l'homme, ainsi qu'un procédé de détection mettant en oeuvre un tel outil. La présente invention vise plus particulièrement qu'un tel outil et un tel procédé de détection soient basés sur le génotype des bactéries, plutôt que sur leur phénotype, et qu'ils présentent des niveaux élevés de sensibilité et de spécificité. Un objectif supplémentaire de l'invention est de permettre la discrimination de différentes espèces de bactéries du genre Legionella, et l'identification, parmi une population de Legionella spp, de différentes espèces présentes, en particulier d'au moins une espèce identifiée comme pathogène chez l'homme. Selon un premier aspect, la présente invention concerne ainsi une biopuce adaptée à la détection et/ou l'identification de bactéries d'au moins une espèce du genre Legionella donnée. Cette biopuce comprend une molécule d'acides nucléiques (également désignée par le terme « sonde » dans la présente description) dite rpoB-spécifique, capable de s'hybrider spécifiquement avec la séquence d'une portion du gène rpoB de bactéries d'une première espèce du genre Legionella, ou avec sa séquence complémentaire, cette molécule étant immobilisée sur un support. Ladite espèce du genre Legionella est de préférence une des espèces identifiées comme pathogènes pour l'homme, c'est-à-dire une des espèces suivantes : L. pneumophila, L. anisa, L. birminghamensis, L. bozemanii, L. cherrii, L. cincinnatiensis, L. dumoffii, L. erythra, L. feeleii, L. gormanii, L. hackeliae, L. jordanis, L. lansingensis, L. longbeachae, L. maceachemii, L. micadei, L. oakridgensis, L. parisiensis, L. sainthelensi, L. tucsonensis, L. wadsworthii. Dans toute la présente description, on entend par biopuce tout système, de préférence miniaturisé, comportant un support sur lequel sont déposées, notamment fixées de façon covalente, des molécules d'acides nucléiques, dites sondes, chacune à un endroit précis du support. Le principe général d'une biopuce consiste à la mettre en présence avec une population d'acides nucléiques, dits cibles, et à détecter d'éventuels complexes d'hybridation spécifique d'acides nucléiques cibles avec les sondes immobilisées sur le support.
Le support de la biopuce selon l'invention est classique en lui-même, notamment dans le domaine des puces à ADN. Il peut être solide ou semisolide. Il peut par exemple être choisi parmi les supports comportant au moins une surface siliciée telle que les lames, les billes et les capillaires en verre, les supports en silicium, en plastique ou métalliques.
La sonde nucléique rpoB-spécifique peut aussi bien être commune à plusieurs espèces de Legionella, voire à toutes les espèces, qu'exclusive d'une espèce donnée. Une telle biopuce permet avantageusement de détecter de manière fiable et sensible la présence, dans un échantillon, de bactéries d'au moins une espèce du genre Legionella, et, le cas échéant, d'identifier l'espèce particulière à laquelle ces bactéries appartiennent dans les modes de réalisation particuliers dans lesquels la sonde nucléique rpoB-spécifique est exclusive d'une espèce donnée. L'invention tire ainsi avantageusement profit des caractéristiques du gène rpoB, qui code la sous-unité 13 de l'ARN polymérase, et qui comporte une région, d'environ 360 paires de bases, dite région variable, qui, bien que fortement conservée entre les différentes espèces de bactéries du genre Legionella, permet une différentiation entre nombre de ces espèces. Il est du ressort de l'homme du métier d'identifier, dans les bases de données génomiques, notamment dans la base de données Genbank, la séquence du gène rpoB appartenant à chaque espèce du genre Legionella donnée. De telles séquences y sont notamment décrites pour l'ensemble des 21 espèces identifiées comme pathogènes pour l'homme suivantes, le numéro d'accession Genbank étant, pour chacune, indiqué entre parenthèses après le nom de l'espèce : L. pneumophila (AF367748, souche ATCC 33152), L. anisa (AF367722, souche ATCC 35292), L. birminghamensis (AF367723, souche CIP 103871), L. bozemanii (AF367724, souche ATCC 33217), L. cherrii (AF367726, souche CIP 103842), L. cincinnatiensis (AF367727, souche CIP 103875), L. dumoffii (AF367728, souche ATCC 33279), L. erythra (AF367729, souche CIP 103843), L. feeleii (AF367731, souche CIP 103877), L. gormanii (AF367733, souche ATCC 33297), L. hackeliae (AF367735, souche CIP 103844), L. jordanis (AF367738, souche CIP 105268), L. lansingensis (AF367739, souche CIP 103542), L. longbeachae (AF367741, souche ATCC 33462), L. maceachernii (AF367742, souche ATCC 35300), L. micadei (AF367743, souche ATCC 33218), L. oakridgensis (AF367746, souche CIP 103884), L. parisiensis (AF367747, souche CIP 103847), L. sainthelensi (AF367751, souche CIP 103885), L. tucsonensis (AF367756, souche CIP 105113), L. wadsworthii (AF367757, souche CIP 103886).
Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, la biopuce comporte en outre une molécule d'acides nucléiques (désignée par le terme « sonde » dans la présente description) dite mip-spécifique, capable de s'hybrider spécifiquement avec la séquence d'une portion du gène mip de bactéries d'une espèce du genre Legionella, pouvant être identique ou de préférence différente de la première espèce, ou avec sa séquence complémentaire, cette molécule étant immobilisée sur le support de la biopuce. Cette sonde mip-spécifique peut, elle aussi, aussi bien être exclusive d'une espèce donnée, que commune à plusieurs espèces du genre Legionella, voire à toutes.
Le gène mip, qui code la protéine Mip, a déjà été décrit dans la littérature comme permettant, par la présence d'une région variable en fonction des espèces, la discrimination entre différentes espèces de bactéries du genre Legionella (Ratcliff et al., 1998). Là encore, l'homme du métier saura identifier, dans les bases de données génomiques, notamment dans la base de données Genbank, la séquence du gène mip appartenant à chaque espèce du genre Legionella donnée. De telles séquences y sont notamment décrites pour l'ensemble des 21 espèces identifiées comme pathogènes pour l'homme suivantes, le numéro d'accession Genbank étant, pour chacune, indiqué entre parenthèses après le nom de l'espèce : L. pneumophila (S42595, souche ATCC 33152), L. anisa (U91607, souche ATCC 35292), L. birminghamensis (U91608, souche CIP 103871), L. bozemanii (U91609, souche ATCC 33217), L. cherrii (U91635, souche CIP 103842), L. cincinnatiensis (U91636, souche CIP 103875), L. dumoffii (U91637, souche ATCC 33279), L. erythra (U92203, souche CIP 103843), L. feeleii (U92205, souche CIP 103877), L. gormanii (U91638, souche ATCC 33297), L. hackeliae (U92207, souche CIP 103844), L. jordanis (U92209, souche CIP 105268), L. lansingensis (U92210, souche CIP 103542), L. longbeachae (X83036, souche ATCC 33462), L. maceachemii (U92211, souche ATCC 35300), L. micadei (AF023175, souche ATCC 33218), L. oakridgensis (U92214, souche CIP 103884), L. parisiensis (U92215, souche CIP 103847), L. sainthelensi (U92219, souche CIP 103885), L. tucsonensis (U92224, souche CIP105113), L. wadsworthii (U92225, souche CIP 103886). Dans des modes de réalisation particulièrement préférés de l'invention, la biopuce comprend, immobilisées sur le support : - une pluralité de molécules d'acides nucléiques rpoB-spécifiques, capables de s'hybrider spécifiquement respectivement avec des séquences différentes, par une variation d'au moins un nucléotide, de portions, pouvant être situées au même locus ou à des loci différents, du gène rpoB de bactéries appartenant à une même espèce ou à au moins deux espèces différentes du genre Legionella, ou avec leurs séquences complémentaires, et - une pluralité de molécules d'acides nucléiques mip-spécifiques, capables de s'hybrider spécifiquement respectivement avec des séquences différentes, par une variation d'au moins un nucléotide, de portions, pouvant être situées au même locus ou à des loci différents, du gène mip de bactéries appartenant à une même espèce ou à au moins deux espèces différentes du genre Legionella, pouvant être identiques ou différentes de la ou des précédentes, ou avec leurs séquences complémentaires, l'ensemble de ces molécules d'acides nucléiques, c'est-à-dire des molécules rpoB-spécifiques et mip-spécifiques, étant choisi de telle sorte que les profils d'hybridation respectifs de chacune des espèces du genre Legionella visées avec ces molécules soient différents les uns des autres.
Un tel mode de réalisation permet avantageusement d'augmenter la sensibilité et la spécificité d'un test de détection, et le cas échéant d'identification, de bactéries appartenant à une même espèce ou même à différentes espèces du genre Legionella. Par exemple, et non limitativement, une biopuce selon l'invention peut 15 comprendre : - une première sonde spécifique d'une première séquence d'une première portion du gène rpoB d'une première espèce, - une deuxième sonde spécifique d'une deuxième séquence d'une deuxième portion du gène rpoB de la première espèce, située à un 20 locus différent de la première portion, - une troisième sonde spécifique d'une séquence d'une portion du gène rpoB d'une deuxième espèce, cette portion pouvant ou non être située sensiblement au même locus qu'une des précédentes, - une quatrième sonde spécifique d'une première séquence d'une 25 première portion du gène mip de la première espèce, - une cinquième sonde spécifique d'une séquence d'une portion du gène mip d'une troisième espèce, cette portion pouvant ou non être située sensiblement au même locus que la précédente, - etc., chacune de ces sondes pouvant être ou non exclusive de l'espèce associée. Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, la biopuce comprend, immobilisées sur le support : - au moins une molécule d'acides nucléiques rpoB-spécifique choisie parmi les molécules d'acides nucléiques de séquences respectives SEQ ID N°1 à SEQ ID N°7 ou, pour chacune desdites séquences, toute séquence présentant au moins 95 % d'identité avec ladite séquence ou avec sa séquence complémentaire, une séquence la comprenant ne comportant pas plus de 25 nucléotides de plus ou un fragment d'au moins 22 nucléotides consécutifs inclus dans ladite séquence, de préférence une pluralité, préférentiellement l'ensemble, desdites molécules - préférentiellement, au moins une molécule d'acides nucléiques mip- spécifique choisie parmi les molécules d'acides nucléiques de séquences respectives SEQ ID N°8 à SEQ ID N°17 ou, pour chacune desdites séquences, toute séquence présentant au moins 95 % d'identité avec ladite séquence ou avec sa séquence complémentaire, une séquence la comprenant ne comportant pas plus de 25 nucléotides de plus ou un fragment d'au moins 22 nucléotides consécutifs inclus dans ladite séquence, de préférence une pluralité, préférentiellement l'ensemble, desdites molécules. Dans le mode de réalisation particulier dans lequel la biopuce comprend l'ensemble des molécules d'acides nucléiques de séquences respectives SED ID N°1 à SEQ ID N°17, ou, pour chacune desdites séquences, toute séquence présentant au moins 95 % d'identité avec ladite séquence ou avec sa séquence complémentaire, une séquence la comprenant ne comportant pas plus de 25 nucléotides de plus ou un fragment d'au moins 22 nucléotides consécutifs inclus dans ladite séquence, cette biopuce permet tout à fait avantageusement non seulement de détecter la présence de bactéries appartenant à chacune des 21 espèces du genre Legionella identifiées comme pathogènes pour l'homme, citées ci-avant, mais également de discriminer ces différentes espèces, et par là-même d'identifier précisément lesquelles sont présentes dans un échantillon donné, ceci en ne mettant en oeuvre qu'un nombre relativement limité de sondes différentes. La biopuce selon un tel mode de réalisation de l'invention permet de réaliser un test de diagnostic de la présence de légionelles dans un échantillon avec des niveaux particulièrement élevés de sensibilité et de spécificité. La ou les molécules d'acides nucléiques immobilisées sur le support de la biopuce peuvent être de toute nature ou origine. Il peut notamment s'agir de molécules d'acides nucléiques simple-brin ou double-brins, d'origine naturelle ou synthétique. Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, la molécule d'acides nucléiques, le cas échéant chacune des molécules d'acides nucléiques, est un oligonucléotide obtenu par synthèse chimique, par des techniques connues de l'homme du métier. Ces oligonucléotides présentent de préférence chacun une longueur d'environ 25 à 30 nucléotides. Préférentiellement, les températures de fusion respectives de l'ensemble des oligonucléotides de la biopuce sont très proches, c'est-à-dire que la différence entre la plus basse et la plus haute température de fusion n'excède pas 8,2 °C. Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, chaque molécule d'acides nucléiques est immobilisée sur le support de la biopuce au moyen de dendrimères phosphorés possédant un noyau central contenant au moins deux groupements fonctionnels et comportant à leur périphérie une première fonction pour leur fixation covalente au support et une deuxième fonction pour la fixation covalente de la molécule d'acides nucléiques. Les biopuces ainsi formées présentent avantageusement une excellente stabilité et une sensibilité de détection particulièrement importante. Elles sont en outre faciles à fabriquer, en peu d'étapes, de manière contrôlée et reproductible, ceci à un faible coût.
Ces dendrimères présentent de préférence une taille comprise entre 1 et 20 nm. De manière générale, les dendrimères sont des polymères hyperramifiés isomoléculaires dont la taille, la topologie et la masse moléculaire peuvent être contrôlées de manière rigoureuse lors de leur formation. La molécule dendrimère, globalement sphérique à partir d'une certaine taille, résulte du branchement radial répétitif de monomères à partir d'un noyau central. Les biopuces dont les bras espaceurs sont des dendrimères présentent avantageusement une sensibilité élevée et un rapport signal sur bruit amélioré par rapport à d'autres bras espaceurs, notamment car les dendrimères permettent d'obtenir une densité importante de sondes par unité de surface du support, et une meilleure accessibilité des sondes, qui entraîne une hybridation avec l'ADN cible non pas bidimensionnelle, mais tridimensionnelle.
Préférentiellement, les dendrimères sont choisis parmi ceux constitués : - d'une couche centrale sous la forme d'un noyau central Po, éventuellement phosphoré, comprenant de 2 à 12 groupements fonctionnalisés, - de n couches intermédiaires, identiques ou différentes, chacune desdites couches intermédiaires étant constituée d'unités P1 répondant à la formule (I) suivante : dans laquelle : L est un atome d'oxygène, de phosphore, de soufre ou d'azote, M représente l'un des groupes suivants : - un groupe aromatique di-, tri- ou tétrasubstitué par des groupes alkyles, des groupes alcoxy, des groupements insaturés du type oléfinique en C1-C12, azoïques, acétylénique, tous ces groupes pouvant incorporer ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, ou - un groupe alkyle ou alcoxy comportant plusieurs substituants tels que définis lorsque M est un groupe aromatique, R1 et R2, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, 10 comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, de soufre, d'azote ou des halogènes avec R2 étant le plus souvent différent de R1, n est un nombre entier compris entre 1 et 11, E est un atome d'oxygène, de soufre ou d'azote, ledit atome d'azote pouvant être lié à un groupe alkyle, alcoxy ou aryle, tous ces groupes pouvant 15 incorporer ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, - d'une couche externe constituée d'unités P2, identiques ou différentes, et répondant à la formule (II) suivante : 20 dans laquelle : W représente l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, tous ces groupes comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, X représente un groupement aldéhyde, thiol, aminé, époxyde, acide 25 carboxylique, alcool ou phénol.
Dans des modes de réalisation préférés de l'invention, X représente un groupement aldéhyde. Des supports de biopuces fonctionnalisés par de tels dendrimères sont notamment décrits dans le document de brevet WO 03/091304.
Des biopuces conformes à l'invention peuvent être préparées par mise en oeuvre des étapes schématiques suivantes, par des techniques de synthèse chimique classiques en elles-mêmes : - le cas échéant, silanisation du support, en étape préalable, - fixation sur le support, de préférence par liaison covalente, d'un bras espaceur, en particulier d'un dendrimère phosphoré tel que défini ci-avant, - et fixation au bras espaceur, de préférence par liaison covalente, des sondes modifiées pour présenter un groupement fonctionnel à une extrémité, par exemple l'extrémité 5'.
Selon un deuxième aspect, la présente invention concerne un kit pour la détection et/ou l'identification de bactéries d'au moins une espèce du genre Legionella contenues dans un échantillon, comportant : - une biopuce répondant à l'une ou plusieurs des caractéristiques ci-avant, - et un premier couple d'amorces nucléiques, éventuellement marquées, capable d'amplifier la séquence d'une région du gène rpoB desdites bactéries comprenant la/les portion(s) avec la/les séquence(s) de laquelle/desquelles la ou les molécule(s) d'acides nucléiques rpoBspécifique(s), est/sont capable(s) de s'hybrider spécifiquement.
Ces amorces nucléiques sont préférentiellement des oligonucléotides obtenus par synthèse chimique. Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, ces amorces sont choisies pour être aptes à s'hybrider avec des séquences du gène rpoB, ou des séquences flanquantes, qui sont conservées pour toutes les espèces du genre Legionella, ou au moins pour les 21 espèces pathogènes pour l'homme. Dans des modes de réalisation préférés de l'invention, ce premier couple d'amorces nucléiques est constitué des amorces Al et A2, de séquences respectivement SEQ ID N°18 et SEQ ID N°19, ou de tout couple d'amorces dont les séquences respectives présentent au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, d'identité avec ces séquences SEQ ID N°18 et SEQ ID N°19 ou avec leurs séquences réverses complémentaires. De tels couples d'amorces, correspondant à des séquences conservées pour toutes les espèces de Legionella, permettent tout à fait avantageusement d'amplifier la séquence d'une région du gène rpoB des bactéries qui comprend la région variable permettant de discriminer les différentes espèces du genre Legionella. Cette région comprend notamment les séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°7 des sondes nucléiques rpoB-spécifiques décrites ci-avant. Ces amorces permettent d'amplifier un fragment d'ADN d'environ 360 paires de bases du gène rpoB, et ce quelle que soit l'espèce de bactéries du genre Legionella, et notamment l'espèce pathogène pour l'homme. Préférentiellement, le kit comporte en outre un deuxième couple d'amorces nucléiques, éventuellement marquées, capable d'amplifier la séquence d'une région du gène mip desdites bactéries comprenant la/les portion(s) avec la/les séquence(s) de laquelle/desquelles la ou les molécule(s) d'acides nucléiques mip-spécifique(s), est/sont capable(s) de s'hybrider spécifiquement. Les amorces nucléiques de ce deuxième couple sont également de préférence des oligonucléotides obtenus par synthèse chimique. De préférence, ces amorces sont choisies pour être aptes à s'hybrider avec des séquences du gène mip, ou des séquences flanquantes, qui sont conservées pour toutes les espèces du genre Legionella, ou au moins pour les 21 espèces pathogènes pour l'homme.
Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, ce deuxième couple d'amorces nucléiques est constitué des amorces A3 et A4, de séquences respectivement SEQ ID N°20 et SEQ ID N°21, ou de tout couple d'amorces dont les séquences respectives présentent au moins 90 %, de préférence au moins 95 °/(:), d'identité avec ces séquences SEQ ID N°20 et SEQ ID N°21 ou avec leurs séquences réverses complémentaires. De la même façon que décrit ci-avant pour le gène rpoB, de tels couples d'amorces, correspondant à des séquences conservées pour toutes les espèces de Legionella, permettent tout à fait avantageusement d'amplifier la séquence d'une région du gène mip des bactéries qui comprend la région variable permettant de discriminer les différentes espèces du genre Legionella. Cette région comprend notamment les séquences SEQ ID N°8 à SEQ ID N°17 des sondes nucléiques mip-spécifiques décrites ci-avant. Ces amorces permettent d'amplifier un fragment d'ADN d'environ 600 paires de bases du gène mip, et ce quelle que soit l'espèce de bactéries, et notamment l'espèce pathogène pour l'homme. Préférentiellement, au moins une amorce nucléique de chacun des couples ci-dessus est marquée par un marqueur détectable classique en lui-même, notamment par un marqueur fluorescent, tel qu'un fluorophore, par exemple à son extrémité 5', de sorte à générer un signal détectable et le cas échéant quantifiable. Le kit peut en outre comporter tout ou partie des réactifs nécessaires à la mise en oeuvre de l'amplification d'ADN de l'échantillon, notamment par PCR, et/ou à l'hybridation de l'ADN amplifié avec les sondes de la biopuce. Il comporte de préférence également des instructions d'utilisation, comprenant notamment les températures d'hybridation préconisées pour les amorces et/ou pour les sondes. Un troisième aspect de l'invention est un procédé de détection et/ou d'identification in vitro, de bactéries d'au moins une espèce du genre Legionella contenues dans un échantillon, au moyen d'une biopuce répondant à l'une ou plusieurs des caractéristiques ci-avant. Ce procédé comprend : - l'amplification d'une séquence d'une région du gène rpoB des bactéries contenues dans l'échantillon, cette région comprenant la/les portion(s) avec la/les séquence(s) de laquelle/desquelles la ou les molécule(s) d'acides nucléiques rpoB-spécifique(s), est/sont capable(s) de s'hybrider spécifiquement, par mise en contact avec un premier couple d'amorces nucléiques spécifiques, éventuellement marquées, de préférence par réaction de polymérisation en chaîne (PCR), - la mise en contact de l'ADN ainsi amplifié avec la biopuce, et - la détection d'un éventuel complexe d'hybridation entre une molécule d'ADN ainsi amplifiée et une sonde nucléique rpoB-spécifique de la biopuce.
L'échantillon peut être de tout type, notamment consister en un échantillon d'eau ou d'air susceptible d'être contaminé par des bactéries du genre Legionella, ou un échantillon biologique issu d'un patient suspecté d'être atteint de légionellose, par exemple issu d'un prélèvement usuel pour ce type d'infections, tel qu'un écouvillon naso-pharyngé, une expectoration, etc.
Ce procédé est de préférence mis en oeuvre sur une population d'acides nucléiques préalablement extraits des bactéries contenues dans l'échantillon, par des techniques connues de l'homme du métier, notamment par une lyse des cellules suivie d'une purification de l'ADN qui y est contenu. Préférentiellement, l'amplification d'une séquence d'une région du gène rpoB des bactéries est réalisée au moyen d'un couple d'amorces nucléiques constitué des amorces Al et A2, de séquences respectivement SEQ ID N°18 et SEQ ID N°19, ou de tout couple d'amorces dont les séquences respectives présentent au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, d'identité avec lesdites séquences SEQ ID N°18 et SEQ ID N°19 ou avec leurs séquences réverses complémentaires. Dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l'invention, le procédé comprend en outre : - l'amplification d'une séquence d'une région du gène mip des bactéries de l'échantillon, cette région comprenant la/les portion(s) avec la/les séquence(s) de laquelle/desquelles la ou les molécule(s) d'acides nucléiques mip-spécifique(s) est/sont capable(s) de s'hybrider spécifiquement, par mise en contact avec un deuxième couple d'amorces nucléiques spécifiques, éventuellement marquées, de préférence par PCR, - la mise en contact de l'ADN ainsi amplifié avec la biopuce, et - la détection d'un éventuel complexe d'hybridation entre une molécule d'ADN ainsi amplifiée et une sonde nucléique mip-spécifique de la biopuce. Préférentiellement, l'amplification d'une séquence d'une région du gène mip des bactéries est réalisée au moyen d'un couple d'amorces nucléiques constitué des amorces A3 et A4, de séquences respectivement SEQ ID N°20 et SEQ ID N°21, ou de tout couple d'amorces dont les séquences respectives présentent au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, d'identité avec lesdites séquences SEQ ID N°20 et SEQ ID N°21 ou avec leurs séquences réverses complémentaires. Dans des modes de mise en oeuvre préférés de l'invention, l'amplification de la séquence d'une région du gène rpoB et l'amplification de la séquence d'une région du gène mip des bactéries sont réalisées par un procédé de réaction de polymérisation en chaîne multiplex, dans lequel le premier couple d'amorces et le deuxième couple d'amorces sont mis en oeuvre simultanément.
Le procédé peut en outre comprendre une étape d'identification des espèces du genre Legionella présentes dans l'échantillon, par comparaison du profil d'hybridation obtenu sur la biopuce avec une matrice préétablie mettant en correspondance chaque site d'immobilisation d'une sonde nucléique sur la biopuce, avec la ou les espèces dont ladite sonde est spécifique. Les différentes étapes de comparaison et de déduction des espèces présentes dans l'échantillon sont de préférence réalisées par un calculateur du type ordinateur programmé, comportant au moins un microprocesseur, et des moyens de mémorisation (disque dur magnétique, mémoire flash, disque optique, etc.) dans lesquels est mémorisé un produit programme d'ordinateur, sous la forme d'un ensemble d'instructions de code de programme à exécuter pour mettre en oeuvre, à partir d'informations transmises par un détecteur des signaux générés au niveau de chaque site de la biopuce consécutivement à la formation d'un complexe d'hybridation, et à partir de ladite matrice préétablie, les différentes étapes de comparaison et de déduction du procédé selon l'invention. Le procédé selon l'invention permet avantageusement de réaliser un diagnostic in vitro de la présence de bactéries du genre Legionella dans un échantillon qui est fiable et précis. Ce procédé est en outre simple, rapide et peu coûteux à mettre en oeuvre, et hautement reproductible. Il permet notamment, dans des modes de mise en oeuvre préférés, de détecter et de discriminer les 21 espèces de bactéries du genre Legionella identifiées comme pathogènes pour l'homme. Selon un quatrième aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'une biopuce répondant à l'une ou plusieurs des caractéristiques ci-avant, pour la détection et/ou l'identification de bactéries d'au moins une espèce du genre Legionella, préférentiellement d'une pluralité d'espèces différentes du genre Legionella, et notamment des 21 espèces pathogènes pour l'homme. La présente invention concerne également un ensemble d'amorces nucléiques comportant les couples d'amorces suivants : - amorces Al et A2, de séquences respectivement SEQ ID N°18 et SEQ ID N°19, ou tout couple d'amorces dont les séquences respectives présentent au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, d'identité avec lesdites séquences SEQ ID N°18 et SEQ ID N°19 ou avec leurs séquences réverses complémentaires, ces amorces étant aptes à amplifier ensemble une séquence d'une région d'une longueur d'environ 360 paires de bases du gène rpoB des bactéries, quelle que soit l'espèce à laquelle elles appartiennent, cette région étant apte à discriminer certaines espèces les unes des autres, - amorces A3 et A4, de séquences respectivement SEQ ID N°20 et SEQ ID N°21, ou tout couple d'amorces dont les séquences respectives présentent au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, d'identité avec 2 9956 14 18 lesdites séquences SEQ ID N°20 et SEQ ID N°21 ou avec leurs séquences réverses complémentaires, ces amorces étant aptes à amplifier ensemble une séquence d'une région d'une longueur d'environ 600 paires de bases du gène mip des bactéries, quelle que soit l'espèce à laquelle elles appartiennent, cette 5 région étant apte à discriminer certaines espèces les unes des autres, au moins une amorce de chaque couple étant préférentiellement marquée, notamment par un marqueur fluorescent. Les caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront plus clairement à la lumière de l'exemple ci-après, fourni à simple titre illustratif et 10 nullement limitatif de l'invention, avec l'appui de la figure 1, qui montre l'image, obtenue à une longueur d'onde de 635 nm par un lecteur de fluorescence laser, d'une biopuce selon un mode de réalisation de l'invention après mise en contact avec de l'ADN obtenu par amplification PCR, au moyen de couples d'amorces respectivement spécifiques du gène rpoB et du gène mip, à partir 15 d'un échantillon contenant des souches de bactéries des espèces L. cincinnatiensis, L. longbeachae et L. birminghamensis. A/ Biopuce Une biopuce conforme à un mode de réalisation particulier de 20 l'invention est préparée de la façon suivante. Les étapes de préparation des dendrimères phosphorés et de préparation et fonctionnalisation du support par de tels dendrimères sont notamment décrites dans le document de brevet WO 03/091304 et les publications de Trévisiol et al., 2003 et Le Berre, 2003. 25 1/ Préparation de dendrimères phosphorés On prépare de la façon suivante des dendrimères phosphorés dits DP4, répondant à la formule générale (III) : C H 1\,/èH M H e Me N_N C =N-N- O C N-N- 6 Dans un premier temps, on synthétise le N- méthyldichlorothiophosphorhydrazide (IV), synthon primordial pour l'obtention du dendrimère, selon le schéma réactionnel : /CI H2N.N CHC13 Se S=P-CI + -P\-CI H2N-N Cl CI H (IV) -60°C Ceci est réalisé par addition en goutte à goutte, sous argon, d'une solution de méthylhydrazine (1,9 équiv.) dans du chloroforme CHCI3, sur une solution de trichlorothiophosphine équiv.) dans du chloroforme, en conservant la température du mélange à -60 °C tout au long de l'addition. Le mélange est ensuite laissé remonter lentement à température ambiante durant la nuit, tout en maintenant l'agitation. Le lendemain, la réaction est contrôlée par RMN 31P{1H} et laissée sous agitation si nécessaire pendant un à deux jours de plus. Le chlorhydrate de monométhylhydrazine obtenu est ensuite filtré sous argon à l'aide d'une canule filtrante. Le N-méthyldichlorothiophosphorhydrazide est conservé en solution dans le chloroforme à basse température (-20 °C) et il est utilisé tel quel par la suite. Dans l'étape suivante, on prépare le dendrimère à extrémités aldéhydes libres (V), précurseur des dendrimères phosphorés (III) : 2 9956 14 20 (V) Pour ce faire, sont mélangés dans un ballon sous argon, de l'hexachlorocyclotriphosphazène (1 équiv.), du 4-hydroxybenzaldéhyde (6,6 équiv.) et du THF distillé, prélevés sous argon. Ce mélange est agité 5 jusqu'à totale dissolution des solides. Du carbonate de potassium (12 équiv.) est alors additionné spatule par spatule, et le mélange est laissé sous agitation toute une nuit à température ambiante. Le lendemain, la réaction est contrôlée par RMN 31P{1H}. Le 10 carbonate de potassium est filtré sur papier filtre et le filtrat est concentré à l'évaporateur rotatif pour donner un solide blanc. A température ambiante, le solide est repris dans du méthanol, filtré sur fritté et rincé 2 fois avec du méthanol et 2 fois avec de l'éther. On obtient alors le dendrimère répondant à la formule générale (V) ci-dessus, dit de génération 0, nommé DPO. 15 Le dendrimère phosphoré utilisé pour fonctionnaliser les lames de verre, dit de quatrième génération, nommé DP4, répondant à la formule générale (III) ci-dessus, est ensuite obtenu par répétition d'une même séquence de deux réactions, et ce jusqu'à obtention de la 4ème génération : 1/ Sous argon, sont mélangés du DPn (n représentant la génération de 20 dendrimère, et n = 0 à 3) (1 équiv.), du CHCI3 et la solution de N- méthyldichlorothiophosphorhydrazide préparée comme décrit ci-avant (7, 13, 27 et 53 équiv., respectivement).
Après 2 h d'agitation pour les petites générations, et 3 h pour les grandes, à température ambiante, la réaction est contrôlée par RMN 31P{1H}. Le mélange est concentré de moitié sous pression réduite, au moyen d'un évaporateur rotatif, transféré dans une ampoule à brome et additionné en goutte à goutte à un grand volume de pentane, afin de précipiter le produit. Le précipité est filtré à l'aide d'une canule. Le solide est repris dans un minimum de chloroforme, précipité une nouvelle fois dans un mélange pentane/éther diéthylique : 4/1 et filtré à l'aide d'une canule. On obtient ainsi des dendrimères à extrémités chlores de 1ère, 2ème, 3ème et 4ème génération, nommés respectivement DP'1, DP'2, DP'3, DP'4. 2/ Sous atmosphère d'argon et à température ambiante, sont introduits le DP'n (n = 1 à 4) (1 équiv.) et du 4-hydroxybenzaldéhyde (13, 28, 55 et 110 équiv., respectivement), puis du THF distillé prélevé sous argon. Du carbonate de césium (20, 40, 60 et 120 équiv., respectivement) est ensuite additionné spatule par spatule. Le mélange est laissé sous agitation à température ambiante pendant 16 h (une nuit). Le lendemain la réaction est contrôlée par RMN 31P{1H}. Les sels sont éliminés par filtration sur papier filtre pour les petites générations puis à l'aide de la centrifugeuse, et le filtrat est évaporé sous pression réduite pour donner un solide blanc. Le solide est solubilisé dans un minimum de chloroforme et additionné goutte à goutte à un grand volume d'un mélange pentane/éther afin de précipiter le produit. Le précipité est filtré sur fritté. Le solide est repris dans le chloroforme, précipité à nouveau et filtré. On obtient ainsi les dendrimères à extrémités aldéhyde de lère, 2ème, 3ème et 4ème génération, nommés DP1, DP2, DP3 et DP4. 2/ Préparation et fonctionnalisation du support Le support utilisé est constitué d'une lame de verre modifiée par les étapes suivantes : - Silanisation : la lame est tout d'abord lavée dans une solution à 2,5 M de soude alcoolique (NaOH dans un mélange H2O milliQ / EtOH 96%), pendant 2 heures. Après retour à la neutralité par 3 lavages successifs avec de l'eau milliQ, la lame est plongée dans de l'éthanol à 96% (pendant au moins 5 min et au maximum 2 h), puis elle est immergée dans le bain de silanisation comportant du 3'-aminopropyltriméthoxysilane (APTES) dans de l'éthanol EtOH à 96%. La lame est laissée dans ce bain pendant 1 nuit sous agitation à température ambiante. Elle est ensuite laissée à l'air libre pendant 30 min, puis rincée plusieurs fois avec de l'eau milliQ, dont une fois en utilisant un bain à ultrasons pour ôter les résidus collés sur la lame, et plongée dans un bain d'EtOH 96%, puis d'EtOH absolu, avant d'être séchée par centrifugation. La lame est enfin maintenue à 120 °C pendant 3 h afin d'assurer la réticulation du revêtement à base de silane sur la lame. - Fonctionnalisation par des dendrimères : la lame est plongée dans une solution de dendrimères DP4, préparés comme décrit ci-avant, à 58 i_iM dans du tétrahydrofurane (THF), pendant 6 h à température ambiante. Elle est ensuite rincée une fois au THF, une fois à l'EtOH 96% et enfin à l'EtOH absolu, avant d'être séchée par centrifugation. 3/ Immobilisation des sondes nucléiques sur le support Les sondes nucléiques mises en oeuvre sont indiquées dans le Tableau 1 ci-après, avec notamment, pour chacune, sa séquence et le gène cible associé. Ces sondes sont des oligonucléotides obtenus par synthèse chimique, par des techniques classiques en elles-mêmes. Leurs séquences sont spécifiques de Legionella spp., plus précisément, pour chacune d'entre elles, d'au moins une espèce particulière du genre Legionella. De manière générale, pour chaque sonde, un alignement de séquences avec la séquence du gène cible rpoB ou mip de chaque espèce d'intérêt disponible dans les bases de données génomiques, notamment la base de données Genbank, permet de savoir de quelle(s) espèce(s) particulière(s) elle est spécifique.
Désignation Séquence (5'....3') SEQ ID N° Gène cible R1 AAAGAACGTTTAAGTTTGGTTGAGT 1 rpoB R2 GGTTAAAGAACGTTTAAGTTTGGTT 2 R3 ACAGAAAACCAATTTAGAGTTGGTCTTG 3 R4 GTTTAGAGTAAGTCTTGTTCGTGTTG 4 R5 GAAAGAGCAGTTAAAGAACGATTAAG 5 R6 GTTAAAGAGCGATTGAGTTTAGTTG 6 R7 GGATCAAGTAAACCCATTATCAGGG 7 M1 GAAGAGAACAAGGCTAAAGGTGAAG 8 mip M2 AAAAGCAGAAGAAAACAAAGCAAAA 9 M3 AAAAGCTGAAGAAAACAAAGCTAAG 10 M4 GAAGAAAATAAAGCGAAAGGTGAAG 11 M5 GAAGAAAACAAGATTAAAGGCGAAG 12 M6 GAAGAGAATAAGTCGAAAGGAGAAG 13 M7 GAAGACAATAAGGCAAAAGGAGAAG 14 M8 AAAATCTGAAGAAAACAAAGCAAAA 15 M9 GAAGAAAACAAAGCAAAAGGTGAAA 16 M10 CTGTCCCAGAACAAAACCAAAGAAG 17 Tableau 1 - Description des sondes nucléiques fixées sur la biopuce Ces sondes présentent toutes une température de fusion Tm comprise entre 54,7 et 62,90 °C. Ces sondes sont déposées sur le support fonctionnalisé par les dendrimères sous forme d'oligonucléotides C6-NH2 modifiés, à une concentration de 20 uM, dans un tampon phosphate 0,1 M à pH 9, au moyen d'un robot à aiguille de type Q-Array Mini (Genetix), tout autre robot apte à effectuer un tel dépôt pouvant autrement être mis en oeuvre.
Une réduction est ensuite effectuée pour consolider la liaison covalente entre l'aldéhyde libre d'un dendrimère et l'extrémité NH2 de chaque oligonucléotide. La lame est mise à tremper pendant 3 h dans une solution de NaBH4 à 3,5 mg/ml, puis lavée 3 fois pendant 5 min dans de l'eau milliQ, et enfin séchée par centrifugation Chaque sonde est déposée en triplicat, c'est-à-dire au niveau de 3 sites d'immobilisation différents de la lame, afin de s'assurer de la fiabilité du résultat des hybridations. Il est établi une matrice consignant l'emplacement de chaque sonde sur la lame.
B/ Kit de diagnostic Un kit de diagnostic pour l'identification des espèces de bactéries du genre Legionella présentes dans un échantillon, conforme à un mode de réalisation particulier de l'invention, comporte : - la biopuce décrite ci-dessus, - le premier couple d'amorces suivant, permettant d'amplifier une séquence d'environ 360 paires de base du gène rpoB des bactéries : Al (sens) : 5'-GATGATATCGATCAYCTDGG-3' (SEQ ID N°18) A2 (antisens) : 5'-TTC VGGCGTTTCAATNGGAC-3' (SEQ ID N°19) où Y représente C ou T, D représente A ou G ou T, V représente A ou C ou G, et N représente A ou T ou G ou C - le deuxième couple d'amorces suivant, permettant d'amplifier une séquence d'environ 600 paires de base du gène mip des bactéries : A3 (sens) : 5'-TTTATGAAGATGARAYTGGTCRCTGC-3' (SEQ ID N°20) A4 (antisens) : 5'-GTCCANCCNGGDATNACYTG-3' (SEQ ID N°21) où Y représente C ou T, D représente A ou G ou T, R représente A ou G, et N représente A ou T ou G ou C Ces amorces sont préparées selon les techniques classiques de synthèse d'oligonucléotides. Plus précisément, chacune correspond à un mélange équimolaire de plusieurs oligonucléotides de séquences différentes, correspondant chacun à une des combinaisons possibles des nucléotides représentés par les lettres Y, D, V, N et R.
Chacune des amorces antisens A2 et A4 est en outre marquée par un marqueur fluorescent, plus particulièrement par le fluorophore Cy5, à son extrémité 5'. Là encore, le marquage est réalisé par des techniques connues de l'homme du métier. Ces amorces présentent toutes une température de fusion Tm comprise entre 47,7 et 57,1 °C. C/ Procédé de diagnostic in vitro 1/ Préparation de l'échantillon Un échantillon aqueux comportant des bactéries des espèces L. cincinnatiensis, L. longbeachae et L. birminghamensis, est préparé de la façon suivante. Ces espèces présentent les caractéristiques listées dans le Tableau 2 ci-dessous. Espèce L. cincinnatiensis L. longbeachae L. birminghamensis Souche CIP 103875 ATCC 33462 CIP 103871 N° d'accession Genbank AF367727.1 AF367741.1 AF367723.1 du gène rpoB (GI:21702419) (GI:21702447) (GI:21702411) (SEQ ID N°) (SEQ ID N°22) (SEQ ID N°24) (SEQ ID N°26) N° d'accession Genbank U91636.1 X83036.1 U91608.1 du gène mip (GI:2231689) (GI:897774) (GI:2231683) (SEQ ID N°) (SEQ ID N°23) (SEQ ID N°25) (SEQ ID N°27) Région du gène mip 430-980 548-1098 38-585 amplifiée par les amorces A3 et A4 Sondes de la biopuce R3, R5, M2, M9 R3, R5, R6, M9 M8, M9 spécifiques de l'espèce Tableau 2 - Caractéristiques des espèces de l'échantillon Pour chacune des espèces ci-dessus, les amorces A3 et A4 20 permettent d'amplifier la séquence du gène mip entre les positions nucléotidiques des séquences respectives SEQ ID N°23, SEQ ID N°25 et SEQ ID N°27 indiquées dans le Tableau 2. Les amorces Al et A2 sont aptes à s'hybrider sur des régions du gène rpoB encadrant les séquences respectives SEQ ID N°22, SEQ ID N°24 et 5 SEQ ID N°26. Pour chacune des 3 espèces, pour chacun des gènes rpoB et mip, la région amplifiée par les amorces comprend les sites d'hybridation des sondes associées indiquées dans le Tableau 2. Chacune des souches est cultivée pendant 48 à 72 heures à 37 °C, 10 sur un milieu BCYE (pour l'anglais Buffered Charcoal Yeast Extract). Une colonie de chaque souche est prélevée et ensemencée dans 200 µl d'eau. Les trois suspensions ainsi obtenues sont mélangées à concentrations égales pour former l'échantillon sur lequel un procédé conforme à une mode de mise en oeuvre particulier de l'invention sera appliqué. 15 2/ Extraction de l'ADN de l'échantillon Pour chaque souche, l'ADN est extrait au moyen d'un kit « High Pure PCR Template Preparation Kit » (Roche Applied Science). 3/ Amplification d'ADN L'amplification et le marquage de l'ADN extrait sont effectués par PCR 20 multiplex dans un volume total de 50 pL. Les réactifs utilisés sont les suivants : 35 !IL de Tamponl OX (Sigma-Aldrich), 2 mM de MgCl2 (Sigma-Aldrich), 200 µM d'un mix de dNTP (Sigma-Aldrich), 1,411M de chacune des amorces Al et A2, 111M de chacune des amorces A3 et A4 et 2,5 U de JumpStart® Taq DNA polymerase (Sigma- 25 Aldrich)]. Ces réactifs sont mélangés à 5 !IL d'ADN extrait des souches dans des microtubes PCR de 0,2 ml. La réaction est réalisée dans un thermocycleur GTQ-Cycler 96 (Hain LifeScience), selon le programme suivant : - une étape de dénaturation initiale et d'activation de l'enzyme pendant 1 minute à 94 °C, - 40 cycles d'amplification [dénaturation 10 secondes à 94 °C, hybridation 20 secondes à 54 °C, élongation 30 secondes à 72 °C], - une élongation finale pendant 1 minute à 72 °C. Après amplification, les produits d'amplification obtenus sont purifiés à l'aide du kit « MinElute® PCR Purification Kit » (Qiagen). L'ADN ainsi amplifié et marqué, et purifié, est dénaturé pendant 2 minutes à 94 °C, puis incubé immédiatement dans la glace pour éviter la reformation de la double hélice. 4/ Hybridation d'ADN sur la biopuce La totalité du produit PCR purifié est ensuite mélangée à 70 !IL de tampon d'hybridation (5X solution Denhardt (Invitrogen), 5X SSC (Sigma-Aldrich), 10 pg ADN de sperme de saumon (Invitrogen, concentration finale 100 pg/m1), H20 qsp 100 pL). Le mélange homogénéisé est déposé sur la biopuce, qui est alors incubée pendant 30 minutes à 60 °C, de sorte à permettre l'hybridation éventuelle d'ADN avec les sondes de la biopuce. Les hybridations non spécifiques sont ensuite éliminées par les trois lavages successifs suivants, réalisés à température ambiante et sous agitation, 20 par immersion successive de la biopuce dans 40 ml de : - tampon de lavage T1 [2X SSC (Sigma-Aldrich), 0,2 % SDS (Fluka)], pendant 3 minutes, - à nouveau tampon de lavage T1, pendant 3 minutes - tampon de lavage T2 [0,2 X SSC], pendant 3 minutes. 25 La biopuce est ensuite séchée par centrifugation. 5/ Détection des complexes d'hybridation Après hybridation éventuelle d'ADN de l'échantillon avec une ou des sondes de la puce, les éventuels complexes d'hybridation sont révélés par lecture de la fluorescence à 635 nm (résolution 10 pm) avec un lecteur du type à laser. On obtient l'image représentée sur la figure 1, sur laquelle chaque point indiqué en clair représente une sonde reconnue par l'ADN extrait de l'échantillon. Une valeur de fluorescence est attribuée à chaque sonde de la biopuce, en établissant le rapport signal/bruit associé. Pour chaque sonde déposée sur la lame en triplicat, la moyenne des trois valeurs est calculée, pour obtenir la valeur relative Vh caractérisant l'hybridation d'ADN sur chaque sonde. On obtient les résultats indiqués dans le Tableau 3 ci-après. Sonde R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 M1 M2 Vh 0 0 1125 0 5 1254 0 0 12 Sonde M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 Vh 0 0 0 0 0 10 34 0 Tableau 3 - Valeur relative Vh caractérisant l'hybridation de chaque sonde avec l'ADN extrait de l'échantillon Le profil d'hybridation de l'échantillon ainsi obtenu est comparé à une matrice qui associe les sondes aux différentes espèces de bactéries du genre Legionella. On en déduit que l'échantillon comporte les espèces suivantes : L. cincinnatiensis, L. longbeachae et L. birminghamensis. Il s'agit bien des espèces initialement présentes dans l'échantillon. Un tel procédé conforme à un mode de réalisation particulier de l'invention, simple et rapide à mettre en oeuvre, permet avantageusement de détecter et de discriminer de nombreuses espèces de Legionella, notamment les 21 espèces identifiées comme pathogènes pour l'homme listées ci-avant, et ce même si ces espèces sont en mélange les unes avec les autres ou avec des micro-organismes autres. Ce procédé est hautement reproductible, et il présente des niveaux de sensibilité et de spécificité élevés. Il peut en outre être mis en oeuvre, du moins pour les étapes finales de traitement des données et d'obtention des résultats, de manière automatisée.
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Ballard et al., 2000. Detection of Legionella pneumophila using a real-time PCR hybridization assay. J. Clin. Microbiol. 38, 4215-4218 Bartie et al., 2003. Identification methods for Legionella from environmental 5 samples. Water Res. 37, 1362-1370 Boulanger et Edelstein, 1995. Precision and accuracy of recovery of Legionella pneumophila from seeded tap water by filtration and centrifugation. Appt. Environ. Microbiol. 61, 1805-1809 Buchbinder et al., 2002. Evaluation of detection of Legionella spp. in water 10 samples by fluorescence in situ hybridization, PCR amplification and bacterial culture. Int. J. Med. Microbiol. 292, 241-245 Le Berre et al., 2003. Dendrimeric coating of glass slides for sensitive DNA microarrays analysis. Nucleic Acids Research 31, 88e-88 Meenhorst et al., 1985. Water-related nosocomial pneumonia caused by 15 Legionella pneumophila serogroups 1 and 10. J. Infect. Dis. 152, 356-364 Ng et al., 1997. Comparison of polymerase chain reaction and conventional culture for the detection of legionellae in cooling tower waters in Singapore. Lett. Appt. Microbiol. 24, 214-216 O'Connell et al., 1996. Infection of macrophage-like cells by Legionella species 20 that have not been associated with disease. Infect. Immun. 64, 4381-4384 Ratcliff et al., 1998, Journal of Clinicat Microbiology, Vol. 36, No. 6, 1560-1537 Steinert et al., 1997. Resuscitation of viable but nonculturable Legionella pneumophila Philadelphia JR32 by Acanthamoeba castellanii. Appt. Environ. Microbiol. 63, 2047-2053 25 Trévisiol et al., 2003. Dendrislides, dendrichips: a simple chemical functionalization of glass slides with phosphorus dendrimers as an effective means for the preparation of biochips. New Journal of Chemistry 27, 1713 von Baum et al., 2008. Community-acquired Legionella pneumonia: new insights from the German competence network for community acquired pneumonia. Clin. Infect. Dis. 46,1356-1364
Claims (19)
- REVENDICATIONS1. Biopuce comprenant une molécule d'acides nucléiques dite rpoBspécifique, capable de s'hybrider spécifiquement avec la séquence d'une portion du gène rpoB de bactéries d'une première espèce du genre Legionella, ou avec sa séquence complémentaire, ladite molécule étant immobilisée sur un support.
- 2. Biopuce selon la revendication 1, comprenant une molécule d'acides nucléiques dite mip-spécifique, capable de s'hybrider spécifiquement avec la séquence d'une portion du gène mip de bactéries d'une espèce du genre Legionella, de préférence différente de ladite première espèce, ou avec sa séquence complémentaire, ladite molécule étant Immobilisée sur ledit support.
- 3. Biopuce selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, comprenant, immobilisées sur ledit support : - une pluralité de molécules d'acides nucléiques rpoB-spécifiques, capables de s'hybrider spécifiquement respectivement avec des séquences différentes de portions du gène rpoB de bactéries appartenant à une même espèce ou à au moins deux espèces différentes du genre Legionella, ou avec leurs séquences complémentaires, et - une pluralité de molécules d'acides nucléiques mip-spécifiques, capables de s'hybrider spécifiquement respectivement avec des séquences différentes de portions du gène mip de bactéries appartenant à une même espèce ou à au moins deux espèces différentes du genre Legionella, ou avec leurs séquences complémentaires, l'ensemble desdites molécules d'acides nucléiques étant choisi de telle sorte que les profils d'hybridation de chacune desdites espèces du genre Legionella avec lesdites molécules d'acides nucléiques sont différents les unsdes autres.
- 4. Biopuce selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle ladite molécule d'acides nucléiques, le cas échéant chacune desdites molécules d'acides nucléiques, est un oligonucléotide obtenu par synthèse chimique, de préférence de longueur d'environ 25 à 30 nucléotides.
- 5. Biopuce selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant, immobilisées sur ledit support : - au moins une molécule d'acides nucléiques rpoB-spécifique choisie parmi les molécules d'acides nucléiques de séquences respectives SEQ ID N°1 à SEQ ID N°7 ou, pour chacune desdites séquences, toute séquence présentant au moins 95 % d'identité avec ladite séquence ou avec sa séquence complémentaire, une séquence la comprenant ne comportant pas plus de 25 nucléotides de plus ou un fragment d'au moins 22 nucléotides consécutifs inclus dans ladite séquence, de préférence une pluralité, préférentiellement l'ensemble, desdites molécules, - préférentiellement, au moins une molécule d'acides nucléiques mipspécifique choisie parmi les molécules d'acides nucléiques de séquences respectives SEQ ID N°8 à SEQ ID N°17 ou, pour chacune desdites séquences, toute séquence présentant au moins 95 % d'identité avec ladite séquence ou avec sa séquence complémentaire, une séquence la comprenant ne comportant pas plus de 25 nucléotides de plus ou un fragment d'au moins 22 nucléotides consécutifs inclus dans ladite séquence, de préférence une pluralité, préférentiellement l'ensemble, desdites molécules.
- 6. Biopuce selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ladite molécule d'acides nucléiques, le cas échéantchacune desdites molécules d'acides nucléiques, est immobilisée sur ledit support au moyen de dendrimères phosphorés possédant un noyau central contenant au moins deux groupements fonctionnels et comportant à leur périphérie une première fonction pour leur fixation covalente audit support et une deuxième fonction pour la fixation covalente de ladite molécule d'acides nucléiques.
- 7. Biopuce selon la revendication 6, dans laquelle les dendrimères sont choisis parmi ceux constitués : - d'une couche centrale sous la forme d'un noyau central Po, 10 éventuellement phosphore, comprenant de 2 à 12 groupements fonctionnalisés, - de n couches intermédiaires, identiques ou différentes, chacune desdites couches intermédiaires étant constituée d'unités P1 répondant à la formule (I) suivante : - -P M F E 15 dans laquelle : L est un atome d'oxygène, de phosphore, de soufre ou d'azote, M représente l'un des groupes suivants : - un groupe aromatique di-, tri- ou tétrasubstitué par des groupes 20 alkyles, des groupes alcoxy, des groupements insaturés du type oléfinique en C1-C12, azoïques, acétylénique, tous ces groupes pouvant incorporer ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, ou - un groupe alkyle ou alcoxy comportant plusieurs substituants 25 tels que définis lorsque M est un groupe aromatique,R1 et R2, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, de soufre, d'azote ou des halogènes avec R2 étant le plus souvent différent de R1, n est un nombre entier compris entre 1 et 11, E est un atome d'oxygène, de soufre ou d'azote, ledit atome d'azote pouvant être lié à un groupe alkyle, alcoxy ou aryle, tous ces groupes pouvant incorporer ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, - d'une couche externe constituée d'unités P2, identiques ou différentes, et répondant à la formule (II) suivante : dans laquelle : W représente l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, tous ces 15 groupes comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, X représente un groupement aldéhyde, thiol, aminé, époxyde, acide carboxylique, alcool ou phénol.
- 8. Kit pour la détection et/ou l'identification de bactéries d'au moins 20 une espèce du genre Legionella contenues dans un échantillon, comportant : - une biopuce selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, - un premier couple d'amorces nucléiques, éventuellement marquées, capable d'amplifier la séquence d'une région du gène rpoB desdites bactéries comprenant la portion avec la séquence de laquelle laditemolécule d'acides nucléiques rpoB-spécifique est capable de s'hybrider spécifiquement, le cas échéant chaque portion avec la séquence de laquelle au moins une desdites molécules d'acides nucléiques rpoB-spécifiques est capable de s'hybrider spécifiquement.
- 9. Kit selon la revendication 8, dans lequel ledit premier couple d'amorces nucléiques est constitué des amorces Al et A2, de séquences respectivement SEQ ID N°18 et SEQ ID N°19, ou de tout couple d'amorces dont les séquences respectives présentent au moins 90 % d'identité avec lesdites séquences SEQ ID N°18 et SEQ ID N°19 ou avec leurs séquences réverses complémentaires.
- 10. Kit selon l'une quelconque des revendications 8 à 9, comportant en outre un deuxième couple d'amorces nucléiques, éventuellement marquées, capable d'amplifier la séquence d'une région du gène mip desdites bactéries comprenant la portion avec la séquence de laquelle ladite molécule d'acides nucléiques mip-spécifique est capable de s'hybrider spécifiquement, le cas échéant chaque portion avec la séquence de laquelle au moins une desdites molécules d'acides nucléiques mip-spécifiques est capable de s'hybrider spécifiquement.
- 11. Kit selon la revendication 10, dans lequel ledit deuxième couple d'amorces nucléiques est constitué des amorces A3 et A4, de séquences respectivement SEQ ID N°20 et SEQ ID N°21, ou de tout couple d'amorces dont les séquences respectives présentent au moins 90 % d'identité avec lesdites séquences SEQ ID N°20 et SEQ ID N°21 ou avec leurs séquences réverses complémentaires.
- 12. Procédé de détection et/ou d'identification in vitro de bactéries d'au moins une espèce du genre Legionella contenues dans un échantillon, au moyen d'une biopuce selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, ledit procédé comprenant : 2 9 956 14 37 - l'amplification d'une séquence d'une région du gène rpoB desdites bactéries comprenant la portion avec la séquence de laquelle ladite molécule d'acides nucléiques rpoB-spécifique est capable de s'hybrider spécifiquement, le cas échéant chaque portion avec la 5 séquence de laquelle au moins une desdites molécules d'acides nucléiques rpoB-spécifiques est capable de s'hybrider spécifiquement, par mise en contact avec un premier couple d'amorces nucléiques spécifiques, éventuellement marquées, de préférence par réaction de polymérisation en chaîne, 10 - la mise en contact de l'ADN amplifié avec ladite biopuce, et - la détection d'un éventuel complexe d'hybridation.
- 13. Procédé selon la revendication 12, dans lequel ladite amplification d'une séquence d'une région du gène rpoB desdites bactéries est réalisée au moyen d'un couple d'amorces nucléiques constitué des amorces Al et A2, de 15 séquences respectivement SEQ ID N°18 et SEQ ID N°19, ou de tout couple d'amorces dont les séquences respectives présentent au moins 90 % d'identité avec lesdites séquences SEQ ID N°18 et SEQ ID N°19 ou avec leurs séquences réverses complémentaires.
- 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 13, 20 comprenant : - l'amplification d'une séquence d'une région du gène mip desdites bactéries comprenant la portion avec la séquence de laquelle ladite molécule d'acides nucléiques mip-spécifique est capable de s'hybrider spécifiquement, le cas échéant chaque portion avec la 25 séquence de laquelle au moins une desdites molécules d'acides nucléiques mip-spécifiques est capable de s'hybrider spécifiquement, par mise en contact avec un deuxième couple d'amorces nucléiques spécifiques, éventuellement marquées, de préférence par réaction de polymérisation en chaîne,- la mise en contact de l'ADN amplifié avec une biopuce selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, et - la détection d'un éventuel complexe d'hybridation.
- 15. Procédé selon la revendication 14, dans lequel ladite amplification d'une séquence d'une région du gène mip desdites bactéries est réalisée au moyen d'un couple d'amorces nucléiques constitué des amorces A3 et A4, de séquences respectivement SEQ ID N°20 et SEQ ID N°21, ou de tout couple d'amorces dont les séquences respectives présentent au moins 90 % d'identité avec lesdites séquences SEQ ID N°20 et SEQ ID N°21 ou avec leurs séquences réverses complémentaires.
- 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 15, dans lequel l'amplification de ladite séquence d'une région du gène rpoB et l'amplification de ladite séquence d'une région du gène mip desdites bactéries sont réalisées par un procédé de réaction de polymérisation en chaîne multiplex dans lequel le premier couple d'amorces et le deuxième couple d'amorces sont mis en oeuvre simultanément.
- 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 16, mis en oeuvre sur une population d'acides nucléiques préalablement extraits des bactéries contenues dans ledit échantillon.
- 18. Utilisation d'une biopuce selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour la détection et/ou l'identification de bactéries d'au moins une espèce du genre Legionella, le cas échéant d'une pluralité d'espèces différentes du genre Legionella.
- 19. Ensemble d'amorces nucléiques comportant les couples 25 d'amorces : - amorces Al et A2, de séquences respectivement SEQ ID N°18 et SEQ ID N°19, ou tout couple d'amorces dont les séquences respectives présentent au moins 90 % d'identité avec lesdites séquences SEQ ID N°18 etSEQ ID N°19 ou avec leurs séquences réverses complémentaires, - amorces A3 et A4, de séquences respectivement SEQ ID N°20 et SEQ ID N°21, ou tout couple d'amorces dont les séquences respectives présentent au moins 90 % d'identité avec lesdites séquences SEQ ID N°20 et 5 SEQ ID N°21 ou avec leurs séquences réverses complémentaires, au moins une amorce de chacun desdits couples étant préférentiellement marquée.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1258799A FR2995614B1 (fr) | 2012-09-19 | 2012-09-19 | Biopuce pour la detection et/ou l'identification de bacteries du genre legionella, kit et procede d'utilisation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1258799A FR2995614B1 (fr) | 2012-09-19 | 2012-09-19 | Biopuce pour la detection et/ou l'identification de bacteries du genre legionella, kit et procede d'utilisation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2995614A1 true FR2995614A1 (fr) | 2014-03-21 |
| FR2995614B1 FR2995614B1 (fr) | 2016-03-25 |
Family
ID=47178180
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR1258799A Expired - Fee Related FR2995614B1 (fr) | 2012-09-19 | 2012-09-19 | Biopuce pour la detection et/ou l'identification de bacteries du genre legionella, kit et procede d'utilisation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2995614B1 (fr) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003067319A1 (fr) * | 2002-02-04 | 2003-08-14 | Bioneer Corporation | Adn qui codent pour le gene de la sous-unite beta de l'arn polymerase de l'espece legionella, amorces specifiques pour ces adn et procede de discrimination associe de l'espece legionella |
| FR2838737A1 (fr) * | 2002-04-23 | 2003-10-24 | Centre Nat Rech Scient | Supports solides fonctionnalises par des dendrimeres phosphores, leur procede de preparation et applications |
| WO2005059156A2 (fr) * | 2003-12-19 | 2005-06-30 | Mobidiag Oy | Sondes d'acide nucleique, amorces a large spectre et procede dans lesquels elles sont utilisees |
-
2012
- 2012-09-19 FR FR1258799A patent/FR2995614B1/fr not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003067319A1 (fr) * | 2002-02-04 | 2003-08-14 | Bioneer Corporation | Adn qui codent pour le gene de la sous-unite beta de l'arn polymerase de l'espece legionella, amorces specifiques pour ces adn et procede de discrimination associe de l'espece legionella |
| FR2838737A1 (fr) * | 2002-04-23 | 2003-10-24 | Centre Nat Rech Scient | Supports solides fonctionnalises par des dendrimeres phosphores, leur procede de preparation et applications |
| WO2005059156A2 (fr) * | 2003-12-19 | 2005-06-30 | Mobidiag Oy | Sondes d'acide nucleique, amorces a large spectre et procede dans lesquels elles sont utilisees |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| H.-P. SU ET AL: "Identification of Legionella Species by Use of an Oligonucleotide Array", JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, vol. 47, no. 5, 4 March 2009 (2009-03-04), pages 1386 - 1392, XP055046616, ISSN: 0095-1137, DOI: 10.1128/JCM.02225-08 * |
| KO KWAN SOO ET AL: "Detection and identification of Legionella pneumophila by PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of the RNA polymerase gene (rpoB)", JOURNAL OF MICROBIOLOGICAL METHODS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 54, no. 3, 1 September 2003 (2003-09-01), pages 325 - 337, XP002479256, ISSN: 0167-7012, DOI: 10.1016/S0167-7012(03)00065-4 * |
| MARIUSZ ZAK: "Development of a miniaturized DNA microarray for identification of 66 virulence genes of Legionella pneumophila", POSTEPY HIG MED DOSW, 1 January 2011 (2011-01-01), pages 838 - 848, XP055046619, Retrieved from the Internet <URL:http://www.phmd.pl/fulltxt.php?ICID=971126> [retrieved on 20121204] * |
| SUIHUA MA ET AL: "<title>Study on the SPR responses of various DNA probe concentrations by parallel scan spectral SPR imaging</title>", PROCEEDINGS OF SPIE, 11 December 2008 (2008-12-11), pages 72801H - 72801H-5, XP055046620, ISSN: 0277-786X, DOI: 10.1117/12.823908 * |
| YZERMAN ED ET AL: "Comparative genome analysis of a large Dutch Legionella pneumophila strain collection identifies five markers highly correlated with clinical strains", BMC GENOMICS, BIOMED CENTRAL LTD, LONDON, UK, vol. 11, no. 1, 15 July 2010 (2010-07-15), pages 433, XP021072730, ISSN: 1471-2164, DOI: 10.1186/1471-2164-11-433 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2995614B1 (fr) | 2016-03-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US12281357B1 (en) | In situ spatial barcoding | |
| CA2103933A1 (fr) | Fragments d'adn de mycobacteries, amorces d'amplification, sondes d'hybridation, reactifs et procede de detection de mycobacteries | |
| US12516446B2 (en) | Array and method for detecting spatial information of nucleic acids | |
| CA2134113A1 (fr) | Procede de destabilisation d'une structure secondaire intracatenaire d'un polynucleotide simple brin, et de capture dudit polynucleotide | |
| CA2174753C (fr) | Fragments nucleotidiques capables de s'hybrider specifiquement a l'adnr ou arnr des rickettsia et leur utilisation comme sondes ou amorces | |
| WO2003057913A2 (fr) | Procede de detection et/ou d'identification de l'espece animale d'origine de la matiere animale contenue dans un echantillon | |
| WO1995003412A2 (fr) | Fragment nucleotidique de l'arn ribosomique 23s de mycobacteries, sondes et amorces derivees, reactif et procede de detection | |
| FR2738827A1 (fr) | Detection des enterobacteries | |
| EP1334211B1 (fr) | Procede d'analyse de la predisposition genetique d'un patient au diabete insulino-dependant, dispositif et jeu d'amorces | |
| FR2995614A1 (fr) | Biopuce pour la detection et/ou l'identification de bacteries du genre legionella, kit et procede d'utilisation | |
| CA2175515A1 (fr) | Fragment nucleotidique de l'arn ribosomique 16s de corynebacteries, sondes et amorces derivees, reactif et procede de detection | |
| US20230159989A1 (en) | Multiplexed fluorescence in situ hybridization method capable of rapid detection of billions of targets | |
| EP1802773B1 (fr) | Procédé pour le diagnostic d'une intolérance à l'aspirine | |
| FR2659086A1 (fr) | Fragments nucleotidiques caracteristiques de fragments d'adn de mycobacteries. leur utilisation comme amorce pour la detection d'une infection due a des mycobacteries. | |
| EP1673479B1 (fr) | Methode de detection rapide de micro-organismes sur puces a adn | |
| EP0725836B1 (fr) | Sonde et procede de detection des levures de l'espece candida krusei | |
| EP1330542B1 (fr) | Methode rapide de detection d'organismes dans un echantillon | |
| WO2024115365A1 (fr) | Support solide fonctionnalisé par des dendrimères, biopuce comprenant un tel support solide et utilisation pour la détection d'une molécule cible dans un milieu | |
| JP2002034571A (ja) | メガスフェラ・セレビシエ検出のための核酸プローブ、およびビール混濁の原因となる細菌物質の検出方法 | |
| FR2856410A1 (fr) | Methodes de preparation de puces genetiques et utilisations | |
| FR2907793A1 (fr) | Procede d'identification moleculaire et genotypage des bacteries du complexe mycobactrium tuberculosis. | |
| CN101448954A (zh) | 用于真菌分类的试剂、方法和试剂盒以及抗真菌疗法的指导 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 4 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 5 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 6 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 7 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 8 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 9 |
|
| ST | Notification of lapse |
Effective date: 20220505 |