FR3057166B1 - Extrait d'helichrysum italicum obtenu au moyen de solvants eutectiques profonds - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un extrait particulier d'Helichrysum italicum, qui peut être obtenu par extraction des parties aériennes de la plante au moyen de solvants eutectiques profonds. Cet extrait se caractérise par la présence d'hétérosides de flavonols dont le cycle B est dihydroxylé. L'invention concerne également une composition cosmétique contenant cet extrait et ses utilisations, notamment dans le traitement des signes cutanés du vieillissement.

Description

Extrait d'Helichrysum italicum obtenu au moyen de solvants eutectiques profonds

OBJET DE L’INVENTION

La présente invention concerne un extrait particulier ^Helichrysum italicum, ainsi qu'unecomposition cosmétique le contenant et ses utilisations, notamment dans le traitement dessignes cutanés du vieillissement.

ARRIERE-PLAN DE L’INVENTION

Les plantes du genre Helichrysum rassemblent différentes espèces d'immortelle, dontl'immortelle d'Italie ou Helichrysum italicum (également désignée par Helichrysumangustifolium D.C.). Plusieurs extraits d'immortelle ont déjà été décrits comme présentant despropriétés anti-âge. En particulier, il a été démontré dans la demande WO 03/018730 qu'unehuile essentielle d'immortelle renfermant de l'acétate de néryle présentait notamment un effetanti-radicalaire. Un effet anti-oxydant et/ou anti-inflammatoire a par ailleurs été mis enévidence pour d'autres extraits ^Helichrysum contenant des flavonoïdes, obtenus notammentpar chromatographie liquide à haute performance (Maffei et al., Journal of Chromatography,537 (1991) 449-452) ou par extraction à l'aide d'huile de jojoba (WO 2013/050902). Il est enoutre connu que des extraits aqueux ^Helichrysum italicum, riches en acide caféique,permettent de restructurer l'épiderme et de lisser la surface de la peau (FR 2 975 006).

Les flavonoïdes constituent une classe de polyphénols renfermant le squelette ci-dessous :

Ils peuvent eux-mêmes être subdivisés en différentes catégories en fonction du carbone du cycleC sur lequel est fixé le cycle B, de la présence ou non d'une ou plusieurs insaturations sur lecycle C et/ou d'un groupement oxo en position 4 et/ou d'un groupement hydroxyle en position3 du cycle C.

Une catégorie particulière de flavonoïdes est constituée des flavonols ayant la structuresuivante :

Parmi ceux-ci, on compte notamment les flavonols non substitués sur le cycle B, tels que labaicaléine, les flavonols mono-hydroxylés sur le cycle B, tels que le kaempférol, et les flavonolsdi-hydroxylés sur le cycle B, tels que la quercétine et la quercétagétine. A la connaissance dela Demanderesse, ces flavonoïdes et leurs dérivés glycosylés ne sont pas présents en quantitédétectable dans les huiles essentielles üHelichrysum. En outre, les extraits AHelichrysiimcontenant des flavonoïdes, tels que mentionnés précédemment, renferment uniquement desflavonols des deux premiers types précités ou leurs glycosides.

La Demanderesse a mis en évidence qu'un nouvel extrait üHelichrysum, renfermant de manièrecaractéristique des hétérosides de flavonols dihydroxylés sur le cycle B, présentait nonseulement des propriétés anti-oxydantes et anti-inflammatoires, mais également d'autrespropriétés biologiques avantageuses lui permettant d'exercer une activité anti-âge complète.

Cet extrait peut être obtenu par extraction des parties aériennes, comprenant notamment lessommités fleuries, AHelichrysiim italicum à l'aide d'un mélange de solvants eutectiquesprofonds (ou NaDES pour "Naturel Deep Eutectic Solvent").

Les solvants de type NaDES sont des mélanges de composés d'origine naturelle présentant lapropriété d'avoir une température de fusion unique et définie pour une composition déterminée ;le mélange eutectique présente alors certaines propriétés physiques qui sont celles des corpspurs, et notamment la propriété d'avoir la même composition en phase liquide et en phase solide.La température de fusion de l'eutectique est inférieure à la température de fusion du mélangedes mêmes corps dans d'autres proportions. Les constituants des solvants eutectiques profondssont capables de former ensemble des liaisons hydrogène fortes. On pense que les solvants detype NaDES sont présents dans les cellules végétales où ils permettent de synthétiser et stockerune diversité de métabolites non hydrosolubles tels que les flavonoïdes (Y. Dal et al., AnalyticaChimica Acta (2013) 766:61-68). Il a déjà été suggéré de les utiliser comme solvants

d'extraction de matières végétales (Y. H. Choi et al., Plant Physiology (2011) 156:1701-1705 ;WO 2011/155829) ou pour protéger des aliments contre l'oxydation ou la dégradation acide(WO 2015/165738). Toutefois, à la connaissance de la Demanderesse, il n'a encore jamais étésuggéré d'utiliser ces solvants pour extraire des flavonoïdes üHelichrysum italicum.

RESUME DE L’INVENTION L’invention a ainsi pour objet un extrait üHelichrysum italicum, caractérisé en ce qu'il renfermedes hétérosides de flavonols dont le cycle B est dihydroxylé.

Elle a également pour objet une composition cosmétique comprenant cet extrait dans un milieuphysiologiquement acceptable.

Elle a encore pour objet l'utilisation cosmétique de cet extrait, par application topique sur lapeau, pour prévenir ou traiter les signes du vieillissement cutané et/ou comme agent apaisant.

FIGURES

La Figure 1 représente la variation d'induction d’IL-8 par un extrait selon l'invention, testé àdeux concentrations.

DESCRIPTION DETAILLEE

Comme indiqué précédemment, la présente invention porte sur un nouvel extrait üHelichrysumitalicum, qui se caractérise en ce qu'il renferme des hétérosides de flavonols dont le cycle B estdihydroxylé. Ces hétérosides de flavonols comprennent en particulier au moins un hétéroside,en particulier un O-hexoside, de quercétagétine et/ou de quercétine, plus particulièrement unO-hexoside de quercétagétine et un O-hexoside-O-rhamnoside de quercétine. L'extrait selonl'invention peut renfermer au moins 50 ppm d'hétérosides de flavonols, tel que mesuré parchromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse.

Un tel extrait est notamment susceptible d'être obtenu par extraction des parties aériennesüHelichrysum italicum à l'aide d'un mélange de solvants eutectiques profonds (ci-après désignépar "solvant NaDES").

Dans une forme d'exécution préférée de l'invention, ce mélange de solvants est constitué de :(a) au moins deux solvants respectivement choisis dans au moins deux groupes distinctsconstitués (i) des acides carboxyliques, (ii) du glucose, (iii) du fructose, (iv) du sucrose, (v) dulactose, (vi) du tréhalose, (vii) des polyols et (viii) des composés azotés constitués de la choline,de ses sels inorganiques et des acides aminés et (b) éventuellement de l'eau.

Parmi les solvants précités, l'acide carboxylique est avantageusement choisi dans le groupeconstitué par les oxo-acides, tels que l'acide pyruvique ; les mono- ou polyhydroxyacides, telsque les acides malique, citrique, lactique, tartrique, ascorbique, glucuronique et neuraminique ;et les acides dicarboxyliques, tels que les acides oxalique, adipique, maléique, fumarique,succinique, aconitique, malonique et oxalique.

De son côté, le polyol est de préférence choisi dans le groupe constitué par les alcools de sucretels que le mannitol, le sorbitol, l'inositol, le ribitol, le galactitol, l'érythritol et le xylitol ; laglycérine ; le 1,3-propanediol ; et le propylène glycol.

En outre, des exemples d'acides aminés peuvent être choisis dans le groupe constitué par laproline et l'alanine.

Dans une forme d'exécution particulièrement préférée de l'invention, le mélange de solvantsformant le solvant NaDES est constitué de fructose, de glycérine et d'eau, de préférence dansun rapport massique de 50:25:25.

Avant sa mise en œuvre dans la préparation de l'extrait selon l'invention, le solvant NaDES peutêtre lui-même préparé par chauffage du mélange des solvants jusqu'à faire fondre sesconstituants solides, par exemple pendant une durée de 0,5 à 3h à une température de 50 à 80°C,généralement sous agitation, pour obtenir un liquide fondu, puis éventuellementrefroidissement à température ambiante. En outre, les parties aériennes ^Helichrysum italicumpeuvent être préalablement broyées et/ou séchées. L'extraction peut être effectuée par mise encontact de la plante éventuellement séchée et/ou broyée avec le solvant NaDES à unetempérature de 25°C à 95°C, par exemple de 60 à 80°C, pendant une durée allant de 0,5 à 24h,par exemple de 2 à 4 h. Le rapport massique de la plante éventuellement séchée et/ou broyéeau solvant NaDES peut aller de 1:99 à 50:50, par exemple de 1:99 à 10:90. A l'issue de cetteétape d'extraction, le liquide et le résidu solide obtenus peuvent être séparés par toute technique connue de l'homme de l'art et notamment par centrifugation, décantation ou pressage, depréférence par essorage centrifuge. L'extrait brut ainsi obtenu peut ensuite être clarifié parfiltration et éventuellement stérilisé.

La présente invention porte également sur une composition cosmétique comprenant, dans unmilieu physiologiquement acceptable, un extrait üHelichrysum italicum tel que définiprécédemment. L'extrait selon l'invention peut avantageusement représenter de 0,001 à 5% en poids etpréférentiellement de 0,01 à 2% en poids, par rapport au poids total de la composition.

Cette composition renferme généralement un milieu physiologiquement acceptable, enparticulier cosmétiquement acceptable, c'est-à-dire qui ne génère pas de picotements ou derougeurs incompatibles avec une utilisation cosmétique. Ce milieu renferme de préférence unephase aqueuse et éventuellement une phase grasse. On préfère que la composition se présentesous forme d'émulsion huile-dans-eau ou eau-dans-huile.

La phase aqueuse peut notamment contenir, outre de l'eau, au moins un constituant choisi parmiles gélifiants aqueux et les actifs hydrophiles tels que les humectants.

Par "gélifiant aqueux", on désigne un composé polymérique capable d'immobiliser desmolécules d'eau en s'hydratant et d'augmenter ainsi la viscosité de la phase aqueuse. Un telgélifiant peut être choisi parmi : les polysaccharides, tels que : la cellulose et ses dérivés, lesamidons modifiés, le carraghénane, l'agar agar, la gomme de xanthane et les gommes végétalestelles que la gomme de guar ou de caroube ; les polymères synthétiques et notamment leshomopolymères d'acrylate de sodium avantageusement réticulés, ainsi que les copolymèresacryliques, en particulier les copolymères d'acrylate de sodium et/ou de (méth)acrylate d'alkyleet/ou de (méth)acrylate d'hydroxyalkyle et/ou de (méth)acrylate de (polyéthoxy)alkyle, avec aumoins un autre monomère, avantageusement l'acide 2-acrylamido-2-méthylpropane sulfonique(AMPS), ces copolymères étant de préférence réticulés; et leurs mélanges.

De son côté, la phase grasse peut comprendre une ou plusieurs huiles volatiles et/ou nonvolatiles. Des exemples d'huiles volatiles sont les alcanes ramifiés, tels que l'isododécane, et lesalcanes linéaires en C10-C13. Comme huiles non volatiles, on peut citer notamment : - les esters d'acides et de mono-alcool choisis parmi : les mono- et polyesters d'acides linéairessaturés en C2-C10 (de préférence en C6-C10) et de mono-alcools linéaires saturés en C10-C18(de préférence C10-C14), les mono- et polyesters d'acides linéaires saturés en C10-C20 et demono-alcools ramifiés ou insaturés en C3-C20 (de préférence C3-C10) ; les mono- et polyestersd'acides ramifiés ou insaturés en C5-C20 et de mono-alcools ramifiés ou insaturés en C5-C20 ;les mono- et polyesters d'acides ramifiés ou insaturés en C5-C20 et de mono-alcools linéairesen C2-C4 ; - les triglycérides d'acides gras en C6-C12, tels que les triglycérides d'acides caprylique etcaprique et la triheptanoïne ; - les acides gras ramifiés et/ou insaturés en C10-C20 (tels que les acides linoléique, laurique etmyristique) ; - les alcools gras ramifiés et/ou insaturés en C10-C20 (tels que l'octyldodécanol et l'alcoololéylique) ; - les hydrocarbures tels que le squalane (C30), notamment le squalane végétal extrait de l'huiled'olive, et l'hémisqualane (Cl5) ; - les carbonates de dialkyle, tels que le dicaprylyl carbonate et le diéthylhexyl carbonate ; - les dialkyléthers tels que le dicaprylyl éther ; et - leurs mélanges.

On peut également citer les huiles végétales qui contiennent un ou plusieurs des constituantsprécités.

Comme esters d'acides et de monoalcools, on peut notamment citer les monoesters tels que lemélange de caprate et caprylate de coco, le macadamiate d'éthyle, l'ester éthylique de beurre dekarité, l'isostéarate d'isostéaryle, l'isononanoate d'isononyle, l'isononanoate d'éthylhexyle, lenéopentanoate d'hexyle, le néopentanoate d'éthylhexyle, le néopentanoate d'isostéaryle, lenéopentanoate d'isodécyle, le myristate d'isopropyle, le myristate d'octyldodécyle, le palmitated'isopropyle, le palmitate d'éthylhexyle, le laurate d'hexyle, le laurate d'isoamyle, le nonanoatede cétostéaryle, le capylate de propylheptyle et leurs mélanges. D'autres esters utilisables sontles diesters d'acides et de monoalcools tels que l'adipate de disopropyle, l'adipate dediéthylhexyle, le sébaçate de diisopropyle et le sébaçate de diisoamyle.

Des exemples d'huiles végétales sont notamment les huiles de germe de blé, de tournesol,d'argan, d'hibiscus, de coriandre, de pépins de raisin, de sésame, de maïs, d'abricot, de ricin, dekarité, d'avocat, d'olive, de soja, l'huile d'amande douce, de palme, de colza, de coton, de noisette, de macadamia, de jojoba, de luzerne, de pavot, de potimarron, de sésame, de courge,de cassis, d'onagre, de lavande, de bourrache, de millet, d'orge, de quinoa, de seigle, decarthame, de bancoulier, de passiflore, de rosier muscat, d'Echium, de cameline ou de camélia.

La phase grasse peut en outre comprendre au moins un structurant de phase grasse.

Par "structurant de phase grasse", on entend un composé capable d'épaissir les huiles contenuesdans la composition, choisi notamment parmi les cires, les gélifiants de phase grasse et les corpsgras pâteux, ainsi que leurs mélanges.

Le terme "cire" désigne, dans le contexte de cette description, un corps gras solide à 25°C, àchangement d'état solide / liquide réversible, ayant un point de fusion généralement comprisentre 30 et 160°C, de préférence entre 50 et 90°C, tel que mesuré par Calorimétrie à BalayageDifférentiel (DSC). Des exemples de cires sont en particulier les cires d'origine animale ouvégétale, telles que les cires d'abeille, de candelilla, de carnauba ou d'acacia ; les huilesvégétales hydrogénées et éventuellement modifiées par l'acide isostéarique, notamment leshuiles de colza, de soja, de tournesol, de jojoba, de coprah et de ricin hydrogénées ; les estersd'acides gras linéaires saturés en C14-C30 et d'alcools gras linéaires saturés en C16-C36 ; les acideslinéaires et saturés en C10-C30 ; les alcools linéaires et saturés en C8-C30 ; et leurs mélanges. Cescires peuvent se trouver sous forme micronisée, c'est-à-dire sous la forme d'une poudre dont lesparticules présentent une taille moyenne en nombre inférieure ou égale à 50 pm, et notammentallant de 0,5 à 50 pm, de préférence allant de 1 à 30 pm, voire allant de 3 à 20 pm, où la « taillemoyenne en nombre » correspond à la dimension donnée par la distribution granulométriquestatistique à la moitié de la population, dite D50.

Par "gélifiants de phase grasse", il est fait référence aux composés modifiant la rhéologie de laphase grasse par formation d'un réseau tridimensionnel. Comme composés de ce type, on peutnotamment citer les argiles (en particulier les bentonites et les hectorites) modifiéeshydrophobes, notamment par du chlorure de di-stéaryl di-méthyl ammonium ; les silicespyrogénées modifiées hydrophobes ; le palmitate et le myristate de dextrine ; les polyamides,les copolymères oléfme(s) / styrène, les poly(acrylates d'alkyle) ; les glycérides d'acides gras(de préférence linéaires et saturés) en C16-C26 tels que le composé Nomcort® HKG ; les dérivésde cellulose et les mélanges en contenant ; et leurs mélanges. Certaines huiles végétaleshydrogénées peuvent également être considérées comme des gélifiants de phase grasse.

Enfin, les corps gras pâteux utilisables comme structurants de phase grasse sont définis commedes corps gras à changement d'état liquide / solide réversible, présentant à l'état solide uneorganisation cristalline anisotrope et comportant à une température de 23°C une fraction liquideet une fraction solide. On préfère utiliser les beurres végétaux. Les beurres de karité, de cacaoet de mangue constituent des exemples de tels corps gras pâteux.

La composition utilisée selon l'invention peut par ailleurs comprendre un ou plusieursémulsionnants, parfums, conservateurs, séquestrants, anti-oxydants, ajusteurs de pH, filtresUV, charges pulvérulentes, pigments, colorants et leurs mélanges.

Selon une forme d'exécution préférée, cette composition renferme en outre au moins un actifanti-âge, en particulier un actif adapté à prévenir et/ou traiter les rides, le relâchement cutanéet/ou la formation de taches pigmentaires, qui peut notamment être choisi parmi les agents anti-radicalaires, les agents stimulant la différenciation et/ou la prolifération des kératinocytes et/oudes fibroblastes ; les agents stimulant la synthèse de glycosaminoglycanes et/ou de collagèneet/ou de fibrilles d'ancrage dermo-épidermique ; les agents prévenant la dégradation ducollagène et/ou des glycosaminoglycanes et/ou des fibrilles d'ancrage dermo-épidermique ; lesagents anti-glycation ; les agents dépigmentants et/ou inhibant la mélanogénèse ; et leursmélanges. En variante et/ou en plus, la composition selon l'invention peut comprendre au moinsun actif à effet neuronal.

Des exemples de tels actifs anti-âge et/ou à effet neuronal sont notamment : l'acide ascorbique,ses sels, ses éthers et ses esters, notamment le glucoside d'ascorbyle ; l'adénosine ; le ribose ;les extraits de miel ; les protéines et glycoprotéines, extraites notamment d'amande douce ; lesprotéines végétales hydrolysées, notamment issues du riz, des graines d'hibiscus ou du lupin ;les polypeptides et les pseudodipeptides, tels que le chlorhydrate de carcinine, le palmitoylpentapeptide-4 (Pal-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser) et le palmitoyl tripeptide-38 commercialisésnotamment par SEDERMA sous les dénominations commerciale Matrixyl® 3000 et Matrixyl®Synthe'6, respectivement, le palmitoyl tripeptide-8 commercialisé par la société LUCASMEYER sous la référence commerciale Nutrazen®, le pentapeptide-18 commercialisé par lasociété LIPOTEC sous la dénomination commerciale Leuphasyl® Solution, le sh-decapeptide-9 commercialisé par la société SANDREAM sous la dénomination commercialeNeoendorphin® et le palmitoyl hexapeptide-52 commercialisé par la société INFINITEC sous la référence commerciale X50 Myocept® Powder ; les silanes tels que le mannuronate deméthylsilanol ; les arabinoxylanes, extraits en particulier de farine de seigle et lesgalactoarabinanes, issus notamment du mélèze ; l'acide hyaluronique et ses sels ; lespolyphénols, extraits en particulier de mimosa ; les alpha-hydroxyacides, dont ceux extraits decitron; les extraits aqueux de plantes telles que le trèfle d'eau, la pensée sauvage, la prêle deschamps, le chardon aux ânes (Onopordum acanthium), le millefeuille (Achillea millefolium,contenu notamment dans le produit Neurobiox® de la société BASF), l'embelia (Embeliaconcinna, telle que commercialisée par la société SEPPIC), le figuier de Barbarie (Opuntia ficusindica, commercialisé notamment par MIBELLE AG BIOCHEMISTRY sous la dénominationcommerciale AquaCacteen®), la sauge (Salvia officinalis, vendue notamment par PROVITALGROUP), Vitex negundo (commercialisé notamment par les LABORATOIRESEXPANSCIENCE sous la référence commerciale Neurovity®), la châtaigne, la papaye,l'arganier, l'avoine, le tournesol, la pâquerette, la pivoine ou l'aneth ; les extraits aqueuxd'algues et notamment de coralline, de janie rouge, d'Ungaria pinnatifada, dAlaria esculentaou de Nannochlorosis oculata \ les huiles essentielles, notamment d'immortelle ou de myrte ;les gluconates de zinc et/ou de cuivre ; et leurs mélanges.

En variante ou en plus, la composition utilisée selon l'invention peut comprendre au moins unpolymère tenseur, c'est-à-dire capable de tendre la peau par action mécanique et de réduire ainsil'apparence des rides et des ridules. Il peut s'agir d'un polymère synthétique ou naturel, enparticulier d'un polysaccharide, notamment d'un extrait d'algue ou de plancton marin ou d'unegomme végétale.

Cette composition peut se présenter sous toute forme adaptée à une application topique sur lapeau et notamment sous forme de lait, de crème, de lotion, de gel ou de masque. Il s'agitgénéralement d'une composition non rincée.

Elle peut être utilisée, par application topique sur la peau, pour prévenir ou traiter les signes duvieillissement cutané et/ou comme agent apaisant. Il est ainsi possible de prévenir et/ou réduirela formation de rides et ridules, le relâchement cutané et/ou la perte d'éclat du teint, notammenten renforçant la barrière cutanée, en augmentant la différenciation des kératinocytes, enprotégeant la peau contre le stress oxydant et en prévenant la glycation des protéines cutanées.Pour ce faire, la composition selon l'invention peut être appliquée sur la peau du visage et/ou du corps, plus particulièrement sur le visage et/ou le décolleté, à raison d'une à deux fois parjour, de préférence matin et/ou soir.

EXEMPLES L’invention sera mieux comprise à la lumière des exemples suivants, qui sont donnés à titrepurement illustratif et n’ont pas pour but de limiter la portée de l’invention, définie par lesrevendications annexées.

Exemple 1 : Préparation d'un extrait selon l'invention

On a préparé un extrait selon l'invention suivant le procédé décrit ci-dessous.

Les parties aériennes fleuries sèches ^Helichrysum italicum ont été broyées à l'aide d'unbroyeur à couteaux équipé d'une grille de maille 12 mm. Le solvant d'extraction a séparémentété préparé par mélange pendant 1 à 2h à 70°C de fructose, de glycérine et d'eau dans un rapportmassique de 50:25:25, conduisant à un liquide limpide et incolore. Le solvant a été introduitdans un réacteur auquel la plante broyée a été ajoutée dans un rapport massique plante sèchebroyée / solvant de 5/95. L'extraction a été effectuée pendant 3h à 70°C sous agitation continue.On a ensuite procédé à une séparation liquide / solide au moyen d'une essoreuse centrifuge, puisl'extrait brut a été clarifié par filtration frontale sur différents grades de plaques de filtration enprofondeur. L'extrait clarifié a alors été filtré sur une cartouche contenant une membrane ayantun seuil de coupure de 0,22 pm. On a ainsi obtenu un extrait sous forme de liquide ambré.

Exemple 2 : Caractérisation de l'extrait

On a comparé la composition en polyphénols de l'extrait de l'Exemple 1 avec celle d'extraitshuileux et aqueux üHelichrysum italicum. L'extrait huileux a été obtenu comme suit. On amélangé 9% en poids de poudre de plante séchée et broyée avec 91% d'une huile de tournesoldésodorisée à l'aide d'ultrasons, dans un récipient refroidi à 10°C. L'extraction a été réaliséependant 30 min, sous ultrasons, avec une agitation de 500 tours/min. L'extraction a étépoursuivie au micro-ondes sous un flux d'azote de 0,4 L/min. Les phases solide et liquidehuileuse obtenues ont été séparées par décantation, puis la phase huileuse a été filtrée et stockéesous atmosphère inerte, à l'abri de la lumière.

Matériel - Chromatographie liquide ultra haute performance (Agilent Technologies, USA) - Injecteur automatique 1290 sériés - Détecteur à barrette de diodes (DAD) 1260 sériés - Spectromètre de Masse : Esquire 6000 (Bruker Daltonics, Bremen) équipé d'une sourced'ionisation Electrospray (ESI).

Préparation des échantillons L’extrait aqueux a été dilué au 10eme dans un mélange MeOH/HzO (50/50). L'extrait selon l'invention été dilué au 5eme dans un mélange MeOH/HzO (50/50). - L'extrait huileux a été préparé par dissolution de 2g de d’extrait huileux dans lmLd’hexane. Cette solution huileuse a été extraite 3 fois par 2mL d’un mélange MeOH/HzO(60/40). Les phases MeOH/FLO ont ensuite été regroupées. Méthode d’analyse

Les solutions obtenues après dilution/extraction ont été filtrées sur filtre PTFE (0,45 pm) puisinjectées (lpL) sur une colonne Agilent C18 (2,1 mm x 100 mm ; 1,8 pm) à une températuremaintenue à 25°C et à un débit de 0,4 mL/min. On a utilisé comme solvants : A = H2O/HCOOH(0,1%) et B = ACN/HCOOH (0,1%). Le gradient d'élution des polyphénols était le suivant :

Tableau 1 : gradient d’élution des polyphénols A la sortie du détecteur à barrette de diode, l’éluant a été injecté dans le spectromètre de masse.Les analyses ont été réalisées en mode négatif ou positif.

Les spectres de LC-MS ont été acquis sur l'ensemble de la gamme des masses (m/z) allant de100 à 1400. L'ensemble des données a ensuite été collecté et traité par le logiciel Hystar version3.0. Résultats

n.d : non détecté ; <LQ : détecté mais inférieur à la limite de quantification

Tableau 2 : composition majoritaire de la fraction polyphénolique des extraits d’immortelle

Comme il ressort de ce tableau, l'extrait selon l'invention se caractérise par une teneur élevéeen hétérosides de flavonoïdes, en particulier en O-hexosides de flavonols dihydroxylés sur lecycle B. Ils sont également plus riches en acide chlorogénique et en acide dicaféoyl quiniqueque les extraits aqueux. Il a par ailleurs été confirmé par chromatographie en phase liquide etspectrométrie de masse que le "flavonoïde O-hexoside" ne correspondait à aucun autre descomposés cités ci-dessus.

Exemple 3 : Test in vitro sur expiant de peau humaine 3.1 Matériels &amp; Méthodes

Traitement des expiants 3 expiants de peau provenant de plastie abdominale d’un donneur féminin ont été incubésindépendamment en présence de l’extrait préparé dans l'Exemple 1, pendant 72h dans un milieude culture de peau (Biopredic) à 37°C et à 5% de CO2 à l’interface air-liquide. L’extrait selonl'invention a été directement dilué dans le milieu de culture à la concentration de 0,5%. 3 expiants de peau non traités ont été incubés dans les mêmes conditions.

Extraction des protéines

Le pool de 3 expiants non traités ou traités avec l'extrait selon l'invention à 0,5% a été broyé àl'aide d'un mixeur à immersion (Kinematica, Polytron PT1200E) équipé d'un axe de 5 mm dansun tampon contenant du DTT, de l’EDTA et un cocktail d’antiprotéases. Les protéines deshomogénats ont été extraites par chauffage puis sonication sur glace en présence de 2% de SDS.Les lysats ont été centrifugés (15000 g, 10 minutes). Les protéines ont été dosées à l'aide du kitPierce 660nm Protein Assay (Thermo, Cat N°22660).

Préparation des peptides

Les extraits peptidiques ont été préparés selon la méthode FASP (Filter Aided SamplePréparation). 250 pg de protéines de chaque extrait ont été chargés sur un ultrafiltre (AmiconUltra 0.5, lOkDa MWCO). Les protéines ont été réduites (Dithiothréitol), alkylées(Iodoacétamide) et digérées (Trypsine). Les peptides issus de cette digestion ont été dessaléspar SPE (SepPak Cl8), séchés et solubilisés dans 100 pl d’une solution contenant 5%d’acétonitrile et 0.1% d’acide formique.

Les peptides ont été dosés par la méthode BCA.

Analyse par spectrométrie de masse / chromatographie en phase liquide en tandem (LC-MS/MS)

Pour chaque échantillon, 2,5 μΐ d’extrait peptidique ajusté à 100 ng/μΐ ont été injectés entriplicat. La chromatographie a été réalisée avec Ultimate 3000 (Dionex). La colonnechromatographique utilisée était une colonne C18 (75 pm x 50 cm, 3 pm). Après une périodede 2 minutes de piégeage sur pré-colonne, un gradient de 5 à 35% d’acétonitrile a été appliquépendant 60 minutes avec un débit de 300 nl/minute.

Les données ont été acquises avec un Q-Exactive HF (Thermo). Le scan MS a été réalisé à60000 de résolution avec un délai transitoire de 100 ms. Le scan MS/MS a été réalisé à 17500de résolution sur les 20 ions les plus intenses avec un temps d’accumulation de 60 ms. 2800cycles ont été réalisés soit 23 cycles (mesures) par pic chromatographique.

Les paramètres expérimentaux suivants ont été appliqués à cette analyse :

* L’énergie de collision est déterminée automatiquement en fonction de la masse et de la charge ducomposé analysé.

Analyse des données

Identification des protéines : L’identification a été effectuée à l’aide de l’algorithmeMASCOT (version 2.4) contre une base de données Uniprot KB regroupant le protéome deréférence humain et la protéase utilisée pour la digestion (trypsine de porc).

Quantification des protéines : l’analyse a été réalisée grâce aux logiciels Skyline 3.5.1 etMarker View 1.2.1.

Une bibliothèque de peptides identifiés par leur masse exacte et leur temps de rétention a étégénérée à partir des interrogations MASCOT. Les XIC (Extract Ion Chromatograms) ont étégénérés par le logiciel Skyline 3.5.0 avec pour paramètre une précision en masse de +/-10 ppmet une précision en temps de rétention de +/- 2,5 minutes. L’analyse statistique des résultats aété effectuée à l’aide du logiciel Marker View 1.2.1. Pour pallier aux variations expérimentales,les aires de chaque protéine ou peptide ont été normalisées par la somme des aires de toutes lesprotéines ou tous les peptides. Deux tests statistiques ont été effectués : une analyse encomposante principale (ACP Pareto) pour évaluer graphiquement l’homogénéité des résultatspour un même échantillon et les différences entre échantillons et un test de Student pourdéterminer si les différences observées entre échantillons sont statistiquement significatives(seuil : p <0,05). Résultats 619 protéines ont été identifiées dans les échantillons traités et non traités parmi lesquelles 240protéines sont significativement régulées (p<0,05) par traitement avec l’extrait selon l'inventionà 0,5%. Sur ces 240 protéines, 106 protéines sont régulées avec un facteur de variation ("foldchange" en anglais) supérieur ou égal à 1,3 ou inférieur ou égal à 0,77 comparativement aucontrôle non traité (p<0,05).

Les voies de signalisation qui ont été mises en évidence à l’aide de l’analyse CORAVALIDcomme enrichies par traitement avec l’extrait selon l'invention à 0,5% sont :

Mécanisme de réparation de l’ADN Mécanisme de protection contre le stress oxydantPrévention de la glycation

Différenciation épidermique : fonction barrière

Adhésion cellulaire

Synthèse protéique : Prolifération cellulaire Régénération tissulaire Mécanisme de réparation de l’ADN:

Mécanisme de protection contre le stress oxydant :

Prévention de la glycation

Différenciation épidermique: Fonction barrière

Adhésion cellulaire:

Synthèse protéique (transcription/traduction/modifîcation des protéines): Proliférationcellulaire

Réponse régénérât!ve (cicatrisation tissulaire):

Conclusion L’extrait d’immortelle selon l'invention permet d'augmenter la différenciation des cellulesépidermiques, de renforcer la fonction barrière de la peau et de maintenir une meilleurehydratation. Il permet également une meilleure adhésion cellulaire associée à des capacitésaccrues de régénération tissulaire et à une augmentation de la synthèse protéique. Par ailleurs,l’extrait d’immortelle selon l'invention stimule les défenses de la peau contre le stress oxydantet accroît les capacités de réparation de l’ADN, ainsi que la prévention de la glycation. Il peutdonc avantageusement être utilisé dans une composition cosmétique pour prévenir ou traiter lessignes cutanés du vieillissement.

Exemple 4 : Test in vitro sur culture de kératinocytes humains

Matériels &amp; Méthode

Culture cellulaire

Des kératinocytes, provenant d’une biopsie mammaire réalisée sur un donneur féminin de 60ans, ont été ensemencés dans des plaques 96 puits (Nunc) à raison de 8000 cellules par puitsdans un milieu de croissance de kératinocytes (KGM Gold, Lonza) supplémenté d’extraitpituitaire bovin, d’EGF, d’insuline, d’épinephrine et de calcium. Les cellules ont été maintenues3 jours en culture à 37°C et sous 5% de CO2. A la fin de ce temps de culture de 3 jours, le

milieu de culture a été remplacé par du milieu KGM Gold (Lonza) sans hydrocortisone qui estun anti-inflammatoire pouvant interférer avec le test.

Evaluation de la production d’IL-8 induite par un stress inflammatoire

Après 24h de privation en hydrocortisone, les cellules ont été stressées à l’aide de 200 ng/ml deflagelline (Invivogen) et traitées en même temps avec l’extrait d’immortelle selon l'Exemple 1à différentes concentrations ou avec des molécules anti-inflammatoires de référence : le gallated'épigallocatéchine (EGCG; Enzo LifeSciences) à 10 μΜ ou l’hydrocortisone (HC, Sigma-Aldrich) à 500 ng/ml. Un contrôle « non traité » sans addition de flagelline ni traitement a étéréalisé. Il représente le niveau basal d’IL-8 en conditions non inflammatoires.

La culture a été maintenue pendant 2 jours sans changement de milieu.

Après 2 jours de culture, les milieux de culture ont été prélevés pour doser la production de lacytokine IL-8 induite par la flagelline à 200 ng/ml.

Le dosage de l’IL-8 dans les milieux de culture a été réalisé à l’aide du kit « IL8 single analyteELISArray kit» (Qiagen). Le protocole de dosage d'IL-8 utilisé était celui du fournisseur.Brièvement, le tampon de dilution contenant 1% de BSA (concentration finale) a été préparépour diluer les échantillons au 1/5 et la gamme d’étalonnage effectuée en dilution sérielle demoitié de 200 pg/ml à 31,3 pg/ml. Le tampon d'essai contenant 0,2% de BSA a également étépréparé. Ensuite, sur la plaque revêtue de l’anticorps IL-8 (fournie dans le kit), 50 μΐ de tampond'essai ont été ajoutés puis 50 μΐ d’échantillons dilués au 1/5 ou la gamme ont été ajoutés danschaque puits et incubés à température ambiante pendant 2h. Après ces 2h d’incubation, lasolution d'anticorps de détection a été ajoutée, suivie de 3 lavages de la plaque avec une solutionde tampon de lavage. Une solution de conjugué « Avidin-HRP » a été ajoutée dans chaque puitset incubée pendant 30 minutes à l’obscurité, suivie de 4 lavages avec la solution de tampon delavage. Une solution de développement a été ajoutée à chaque puits et incubée pendant 15 min.Puis une solution d'arrêt a été ajoutée pour arrêter la réaction. L’absorbance a été lue à 450 nmpuis corrigée par celle lue à 470 nm. La valeur obtenue à 470 nm a été soustraite de la valeurobtenue à 450 nm.

En parallèle, la viabilité cellulaire a été évaluée de la manière suivante.

Après avoir prélevé les milieux de culture pour le dosage d'IL-8, les cellules ont été incubéesavec une solution de XTT à 0,3 mg/ml (Roche Diagnostics) pendant 2h à 37°C et sous 5% deCO2. A la fin de la période d’incubation, l’absorbance a été mesurée à 450 nm.

La viabilité cellulaire a été calculée de la manière suivante : % viabilité = (moyenne des DO mesurées dans les puits traités - blanc)/ (moyenne des DOmesurées dans les puits non traités - blanc) X 100

Le seuil de toxicité était fixé à 80% de viabilité cellulaire.

Etudes statistiques

Les études statistiques ont été faites par le test One Way ANOVA. Résultats

Cytotoxicité de l’extrait selon l'invention L’extrait d’immortelle selon l'invention n’était pas toxique pour les kératinocytes humains auxconcentrations évaluées.

Production d’IL-8 induite par un stress inflammatoire

Le traitement avec la flagelline à 200 ng/ml pendant 48h a induit une augmentation deproduction d’IL-8 par les kératinocytes. Cette augmentation était de 789,2 ± 344,9% (p<0,001)par rapport au contrôle non traité (100 ± 4,1%). Ce résultat a permis de valider le stressinflammatoire induit par la flagelline à 200 ng/ml.

En présence d’HC à 500 ng/ml ou d’EGCG à 10 μΜ (témoins positifs), la production d’IL-8par les kératinocytes était respectivement diminuée de 58,4% (p<0,05) et de 89,2% (p<0,005)par rapport à la production induite par la flagelline à 200 ng/ml. Ce résultat a permis de validerl’expérience. L'extrait d’immortelle selon l'invention aux concentrations de 0,1% et 0,05% diminuaitégalement significativement la production d’IL-8 de 68,4% (p<0,01) et de 86,4% (p<0,005).

Conclusion

Cet exemple démontre que l’extrait d’immortelle selon l'invention diminue la production d’IL-8 induite par un stress inflammatoire dans des kératinocytes humain en culture. Il est ainsipossible d'envisager son utilisation comme agent apaisant dans des compositions cosmétiques,notamment dans le traitement des peaux sensibles.

Exemple 4 : Composition cosmétique

La composition suivante a été préparée de manière classique pour l'homme de l'art, enmélangeant les ingrédients ci-dessous dans les proportions pondérales indiquées.

Emulsionnants non ioniques 6,00 %

Beurre de karité 2,00 %

Epaississants de phase grasse 6,50 %

Huiles 8,25 %

Adénosine 0,04 %

Glycérine 6,00 %

Epaississants de phase aqueuse 2,50 %

Extrait selon l'invention 1,00%

Hydroxyde de sodium 1,00%

Conservateurs qs

Parfum qs

Eau qsp 100,00%

Claims (5)

1. REVENDICATIONS
2. 1. Extrait iïHelichrysum italicum, caractérisé en ce qu'il renferme des hétérosides de flavonolsdônt le cycle B est dihydroxylé. 2. Extrait selon la revendication 1, caractérisé en ce que les hétérosides de flavonolscomprennent au moins un hétéroside, notamment un O-hexoside, de quercétagétine et/ou unhétéroside de quercétine.
3. 3. Extrait selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il renferme au moins 50 ppmd'hétérosides de flavonols.
4. 4. Composition cosmétique comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable, unextrait à'Helichrysum italicum selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
5. 5. Utilisation cosmétique d'un extrait dlHelichrysum italicum selon l'une quelconque desrevendications 1 à 3, par application topique sur la peau, pour prévenir ou traiter les signes duvieillissement cutané et/ou comme agent apaisant.