FR3104169A1 - Souche de champignon ayant une viscosite diminuee - Google Patents

Souche de champignon ayant une viscosite diminuee Download PDF

Info

Publication number
FR3104169A1
FR3104169A1 FR1913766A FR1913766A FR3104169A1 FR 3104169 A1 FR3104169 A1 FR 3104169A1 FR 1913766 A FR1913766 A FR 1913766A FR 1913766 A FR1913766 A FR 1913766A FR 3104169 A1 FR3104169 A1 FR 3104169A1
Authority
FR
France
Prior art keywords
gene
fungus
strain according
strain
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
FR1913766A
Other languages
English (en)
Other versions
FR3104169B1 (fr
Inventor
Frédérique Bidard-Michelot
Etienne Jourdier
Fadhel BEN CHAABANE
Thiziri AOUAM
Sabine PRIGENT
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
IFP Energies Nouvelles IFPEN
Original Assignee
IFP Energies Nouvelles IFPEN
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to FR1913766A priority Critical patent/FR3104169B1/fr
Application filed by IFP Energies Nouvelles IFPEN filed Critical IFP Energies Nouvelles IFPEN
Priority to BR112022010772A priority patent/BR112022010772A2/pt
Priority to EP20842255.0A priority patent/EP4069718A1/fr
Priority to US17/780,088 priority patent/US20230025155A1/en
Priority to PCT/FR2020/052282 priority patent/WO2021111090A1/fr
Priority to CA3159388A priority patent/CA3159388A1/fr
Priority to CN202080083889.8A priority patent/CN114746435B/zh
Publication of FR3104169A1 publication Critical patent/FR3104169A1/fr
Application granted granted Critical
Publication of FR3104169B1 publication Critical patent/FR3104169B1/fr
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungi isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G OR C10K; LIQUIFIED PETROLEUM GAS; USE OF ADDITIVES TO FUELS OR FIRES; FIRE-LIGHTERS
    • C10L1/00—Liquid carbonaceous fuels
    • C10L1/02—Liquid carbonaceous fuels essentially based on components consisting of carbon, hydrogen, and oxygen only
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G OR C10K; LIQUIFIED PETROLEUM GAS; USE OF ADDITIVES TO FUELS OR FIRES; FIRE-LIGHTERS
    • C10L2200/00—Components of fuel compositions
    • C10L2200/04—Organic compounds
    • C10L2200/0461—Fractions defined by their origin
    • C10L2200/0469—Renewables or materials of biological origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/885—Trichoderma
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

L’invention concerne une souche de champignon ayant une viscosité diminuée, dans laquelle le gène ID 78713 (GEL3) a été invalidé. L’invention concerne également les différentes utilisations de cette souche, ainsi que le procédé de modification génétique. (pas de figure)

Description

SOUCHE DE CHAMPIGNON AYANT UNE VISCOSITE DIMINUEE
La présente invention concerne une souche de champignon, notamment filamenteux, ayant une viscosité diminuée, dans laquelle le gène ID78713 (GEL3) a été invalidé. L’invention concerne également les différentes utilisations de cette souche, ainsi que le procédé de modification génétique permettant d’obtenir une souche selon l’invention.
Contexte de l’invention
Les souches de champignon, notamment filamenteux, tel que le champignonTrichoderma reesei,sont aujourd’hui majoritairement utilisées pour la production d’enzymes. Ces enzymes, par exemple les cellulases, sont en effet utilisées pour hydrolyser la biomasse cellulosique ou lignocellulosique en sucres simples. Les enzymes produites par les champignons filamenteux sont donc utiles dans les filières de production de biocarburants de seconde génération ou encore des produits biosourcés issus de sucres provenant de biomasse (ligno)cellulosique.
Afin d’améliorer la production de biocarburants de seconde génération ou encore des produits biosourcés, il a ainsi été envisagé d’améliorer la production de cellulases.
Par exemple, le brevet EP 448 430 B1 décrit une production industrielle optimisée de cellulases parTrichoderma reesei. Cette production est réalisée en protocole fed-batch (alimentation sans soutirage) en utilisant une solution d'alimentation contenant du lactose comme sucre inducteur de la production de cellulases. Ce procédé de fermentation comprend deux étapes : une première étape de croissance du champignon en présence d’un excès de source carbonée et une deuxième étape de production d’enzymes grâce à l’ajout d’un inducteur dans le milieu avec un débit optimisé. Ces étapes sont réalisées en milieu liquide dans des bioréacteurs sous une agitation et en présence d’oxygène car le champignon est aérobie stricte. Un autre exemple de procédé optimisé de production de cellulases est décrit dans le brevet EP 2744899 B1.
En plus de l’optimisation des procédés de production de cellulases, il a également été envisagé de modifier génétiquement les souches de champignons afin de modifier leur capacité de production. Ainsi, la demande de brevet EP 18197 010.4 décrit une souche deTrichoderma reeseihyperproductrice d’enzymes cellulolytiques.
Des procédés de fermentation et souches utiles pour améliorer la production d’enzymes cellulolytiques par des champignons filamenteux, et ce faisant de produits biosourcés mais également des biocarburants de seconde génération, sont donc déjà décrits dans l’art antérieur.
Néanmoins, la morphologie des champignons filamenteux industriels a des conséquences non négligeables sur la conception et la conduite des procédés de fermentation car elle augmente la viscosité du milieu de culture. La viscosité a ainsi un effet négatif sur le transfert en oxygène et limite la concentration maximale en champignon qui peut être visée à la fin de l’étape de croissance (et donc par conséquence, ceci limite la quantité d’enzymes cellulolytiques pouvant être produites).
Afin de pallier ce problème, il a dans un premier temps été envisagé d’agiter les fermenteurs à des vitesses plus importantes. Cependant, l’augmentation de l’agitation n’est pas une solution idéale car cela engendre une dépense énergétique accrue et une augmentation du cisaillement sur le mycélium, ce qui a également un impact négatif sur la production d’enzymes cellulolytiques.
Il a également été envisagé d’altérer la viscosité de champignons filamenteux en modifiant leur génome. Ces modifications consistent principalement à invalider des gènes, l’absence des protéines ou enzymes produites par ces gènes entrainant un changement dans le fonctionnement des cellules (Bodie et Pratt 2012; Dodge, Virag et Ward 2012).
Ainsi, Bodie et Pratt ont envisagé dans la demande PCT/US2012/034379 d’invalider le gènempglafin d’altérer la viscosité d’une souche de champignon. Des invalidations supplémentaires ont également été envisagées (parmi les gènessfb3,sebl,gas1,crzlou encoretps2).
De leur côté, Dodge, Virag et Ward ont envisagé dans la demande PCT/US2011/049164 d’invalider le gènesfb3.
Des souches de champignons modifiées génétiquement dans le but d’altérer leur viscosité par rapport à des souches non mutées (i.e.les souches parentes) sont donc déjà décrites dans l’art antérieur. Il est cependant à noter que l’art antérieur est muet quant à des valeurs spécifiques d’amélioration de la viscosité par rapport aux souches parentes.
Par ailleurs, il existe toujours un besoin pour de nouvelles souches moins visqueuses. De plus, il existe toujours un besoin pour de nouvelles souches plus performantes, permettant une meilleure croissance du champignon par rapport aux souches parentes.
Bref exposé de l’invention
La présente invention repose ainsi sur les résultats inattendus des inventeurs qui ont mis en évidence que l’invalidation du gène ID78713 (GEL3), dans une souche de champignon (appartenant notamment à la classe des sordariomycètes), permettait d’obtenir une souche ayant une viscosité drastiquement diminuée par rapport à une souche parente dans laquelle ledit gène ID78713 (GEL3) n’a pas été invalidé. Les inventeurs ont en effet mis en évidence que l’invalidation du gène ID78713 (GEL3) altérait la viscosité desdits champignons, notamment les champignons filamenteux. L’utilisation d’une telle souche permet ainsi de réduire la viscosité d’un moût de fermentation à iso concentration de champignons (c’est-à-dire pour une même concentration de champignons dans le moût), ce qui permet ainsi de réduire les coûts des procédés de fermentation des champignons filamenteux. Cela permet en outre d’augmenter la productivité du procédé en obtenant des concentrations en champignon plus élevées. En effet la productivité volumique en enzymes est proportionnelle à la concentration en champignon et à la vitesse spécifique de production d’enzymes. Ainsi, le fait d’avoir une souche moins visqueuse permet de monter à des concentrations en champignon plus élevées et d’augmenter la productivité du procédé en enzymes.
Les inventeurs de la présente invention sont ainsi les premiers à avoir mis en évidence que le gène ID78713 (GEL3) pouvait influencer le phénotype viscosité des souches de champignons. En effet, le gène ID78713 (GEL3) code pour une protéine de la famille 72 des glycosides hydrolases, notamment une 1,3-β-glucanosyltransferase. Le document Mouynaet al., Microbiology (1998), 144,3171-3180, décrit l’obtention d’un mutant d’Aspergillus fumigatus(un champignon appartenant à la classe desEurotiomycetes), dans lequel le gène codant pour une 1,3-β-glucanosyltransferase BGT1 est invalidé, néanmoins les auteurs en concluent que la souche variante ne présentent pas de phénotype différent pas rapport à la souche parente.
La présente invention concerne donc une souche de champignon dans laquelle le gène ID78713 (GEL3) a été invalidé.
La présente invention concerne aussi un procédé de modification génétique d’une souche de champignon selon l’invention, comprenant une étape d’invalidation du gène ID78713 (GEL3).
La présente invention concerne aussi un procédé de production de biomasse de champignon, comprenant une étape de culture d'une souche de champignon selon l’invention, dans un milieu de culture comprenant un substrat approprié.
La présente invention concerne également un procédé de production de protéines d’intérêt, notamment des enzymes, comprenant une étape de culture d'une souche de champignon selon l’invention, dans un milieu de culture comprenant un substrat approprié.
La présente invention concerne en outre un procédé de production de produits biosourcés à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant une étape d’utilisation de la souche de champignon selon l’invention, pour produire des enzymes cellulolytiques.
La présente invention concerne aussi un procédé de production d'un biocarburant à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant une étape d’utilisation de la souche dechampignonselon l’invention, pour produire des enzymes cellulolytiques.
La présente invention concerne également différentes utilisations de la souche selon l’invention, pour la production de protéines d’intérêt, pour l'hydrolyse de la cellulose ou de la lignocellulose en glucose, pour la production de produits biosourcés à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, ou encore pour la production de biocarburant.
Enfin, la présente invention concerne l’utilisation d'une souche de champignon selon l’invention, pour améliorer les propriétés d’une souche compatible, notamment industrielle.
Dans un premier aspect, la présente invention concerne ainsi une souche de champignon dans laquelle le gène ID78713 (GEL3) a été invalidé. Ainsi, dans la souche selon l’invention, le gène ID78713 (GEL3) n’est plus fonctionnel. Cela signifie également que dans la souche selon l’invention le gène ID78713 (GEL3) est invalidé. La présente invention concerne ainsi une souche variante de champignon, dans laquelle le gène ID78713 (GEL3) a été invalidé.
Selon l’invention, le terme «souche variante» s’entend d’une souche modifiée génétiquement par rapport à une souche parente. Selon l’invention, le terme «souche parente» s’entend ainsi d’une souche dont est issue ou dérivée la souche variante, et dans laquelle le gène ID78713 (GEL3) n’a pas été invalidé. La souche selon l’invention correspond ainsi à une souche variante dérivée d’une souche parente, ladite souche variante possédant une viscosité diminuée par rapport à la souche parente et ladite souche variante comprenant au moins une modification génétique correspondant à l’invalidation du gène ID78713 (GEL3).
L’expression «une viscosité diminuée par rapport à la souche parente» signifie que la souche variante a une viscosité inférieure à celle de la souche parente. L’homme du métier sait que la viscositéde la souche variante selon l’invention et celle dela souche parente doivent être comparée pour une même concentration en champignon dans le moût de fermentation.
Selon l’invention la viscosité est préférentiellement mesurée par la méthode décrite dans l’Exemple 2, également décrite dans la publication Hardyet al.,Rhéologie, Vol. 27, 43-48 (2015), ou encore à l’aide des paramètres suivants:
- le mobile (rotor) utilisé est une hélice d’un diamètre de 38 mm, d’une hauteur de 32 mm, d’un pas de 29 mm et avec un ruban de 8 mm de largeur;
- un godet (stator) de 45 mm de diamètre intérieur;
- un espace vertical entre le rotor et le stator de 500 μm; et du protocole suivant:
- remplissage du godet avec 70 mL d’un milieu dont on souhaite mesurer la viscosité;
- mesures de viscosité par un balayage logarithmique de taux de cisaillements compris entre 4 s-1et 100 s-1, puis de 100 s-1à 4 s-1, à une température de 27°C;
- optionnellement, réalisation des mesures en duplicate.
Préférentiellement, la viscosité selon l’invention est mesurée à l’aide d’un rhéomètre AR2000 de TA Instruments, notamment par un balayage logarithmique de taux de cisaillements compris entre 4 et 100 s-1à une température de 27°C, encore plus préférentiellement à l’aide d’un balayage réalisé en un aller-retour (de 4 s-1à 100 s-1puis de 100 s-1à 4 s-1). Selon un mode de réalisation, la souche selon l’invention a une viscosité d’environ 1.5 Pa.s, telle que mesurée à 27°C, à l’aide d’un rhéomètre AR2000 de TA Instruments par balayage logarithmique à un taux de cisaillements de 5 s-1, lorsque la concentration en champignon est d’environ 35 g/L. La «concentration en champignon» s’entend de la concentration dans le milieu dans lequel la viscosité est mesurée. Typiquement le milieu correspond à un moût de fermentation. Selon l’invention le terme «environ» signifie que les valeurs ne doivent pas être comprises comme des valeurs strictes. Ainsi, «environ 1.5 Pa.s» s’entend des valeurs comprises entre 1.45 Pa.s à 1.55 Pa.s, et «environ 35 g/L» s’entend des valeurs comprises entre 34.5 g/L à 35.5 g/L.
Selon l’invention, et dans un autre mode de réalisation particulier, la souche selon l’invention a une viscosité diminuée d’au moins 50% par rapport à une souche parente. Selon l’invention le terme «au moins 50%» signifie toutes les valeurs comprises entre 50% et 100%, notamment les valeurs de 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% et 100%. Préférentiellement, la souche selon l’invention a une viscosité diminuée d’au moins 65% par rapport à une souche parente. L’homme du métier sait calculer un pourcentage de diminution. Un tel taux de diminution peut par exemple se calculer selon la formule suivante: ((valeur finale – valeur initiale)/valeur initiale)*100.
Le gèneGEL3(également nommé ID 78713 dans le génome de référence deTrichoderma reesei, voir https://www.uniprot.org/uniprot/G0RL27) code pour une protéine qui appartient à la famille 72 des glycosides hydrolases. Ces enzymes sont par exemple des β-1,3-glucanosyltransglycosylases qui interviennent dans la biogénèse de la paroi cellulaire chez les champignons. Selon l’invention le terme ID 78713 est préféré au termeGEL3.
Selon l’invention, le gène ID78713 (GEL3) est représenté par la SEQ ID NO: 2, mais peut également correspondre à un variant de ce gène ou à un gène orthologue. Préférentiellement, le gène ID78713 (GEL3) est uniquement représenté par la SEQ ID NO: 2.
Selon l’invention, «un variant de gène ou un gène orthologue» s’entend d’un gène qui code également pour une protéine qui appartient à la famille 72 des glycosides hydrolases. Le variant du gène ID78713 (GEL3) ou un gène orthologue du gène ID78713 (GEL3) est typiquement représenté par une séquence ayant au moins 80% d’identité avec le gène de SEQ ID NO: 2. Le variant du gène ID78713 (GEL3) ou un gène orthologue du gène ID78713 (GEL3) correspond ainsi à un gène dérivé de la séquence représentée par SEQ ID NO: 2. Plus particulièrement, le variant du gène ID78713 (GEL3) ou un gène orthologue du gène ID78713 (GEL3) est représenté par une séquence ayant au moins 90% d’identité avec le gène de SEQ ID NO: 2, notamment au moins 95%, de préférence au moins 98% ou 99%.
Le gène ID78713 (GEL3) est représenté par la SEQ ID NO: 2, et la protéine codée par le gène ID78713 (GEL3) est représentée par la SEQ ID NO: 3. Ainsi, le variant du gène ID78713 (GEL3) ou un gène orthologue du gène ID78713 (GEL3) code soit pour la protéine de SEQ ID NO: 3, soit pour une séquence ayant au moins 80% d’identité avec ladite SEQ ID NO: 3, notamment au moins 90%, plus particulièrement au moins 95%, 98% ou 99%.
Selon l’invention le terme «au moins 80%» signifie toutes les valeurs comprises entre 80% et 100%, notamment les valeurs de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% et 100%. L’homme du métier sait calculer un pourcentage d’identité entre deux séquences. Par exemple, selon l’invention, le pourcentage d'identité d'une séquence donnée par rapport à SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO: 3 s’entend du pourcentage d’identité sur la longueur totale des séquences. Le pourcentage correspond ainsi au nombre de nucléotides/résidus identiques entre cette séquence donnée et SEQ ID NO : 2 ou 3 divisé par le nombre de nucléotides ou résidus dans la plus longue des deux séquences.
Ainsi, dans un mode de réalisation, dans ladite souche selon l’invention, le gène ID78713 (GEL3) invalidé correspond à un gène représenté par la SEQ ID NO: 2 ou à un gène ayant au moins 80% d’identité avec le gène de SEQ ID NO: 2, notamment au moins 90% et plus particulièrement au moins 95%. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, dans ladite souche selon l’invention, le gène ID78713 (GEL3) invalidé correspond à un gène représenté par la SEQ ID NO: 2. Selon ce dernier mode de réalisation, la souche selon l’invention comprend ainsi une délétion du gène codant pour la protéine représentée par la SEQ ID NO: 3.
Dans un aspect préféré, dans la souche selon l’invention, le gène ID78713 (GEL3) a été invalidé par mutagénèse ou par recombinaison homologue. Selon l’invention, l’invalidation consiste en une délétion de tout ou partie du gène ID78713 (GEL3). Préférentiellement, dans la souche selon l’invention, le gène ID78713 (GEL3) a été invalidé à l’aide d’une cassette d’invalidation. Encore plus préférentiellement, ladite cassette d’invalidation est représentée par la SEQ ID NO: 1, et est notamment utilisée chez un champignon appartenant à l’espèceTrichoderma reesei.
La mutagénèse est une technique communément utilisée en génie génétique. Elle vise à introduire volontairement des mutations dans l’ADN afin de créer des gènes génétiquement modifiés. Selon l’invention, la mutagénèse s’entend plus particulièrement de la mutagénèse dirigée. La mutagénèse dirigée permet en effet d’introduire des mutations identifiées dans un gène précis. Pour ce faire, l’ADN d’intérêt (ici le gène ID78713 (GEL3)) contenant les mutations est synthétisé puis introduit dans la cellule à muter, typiquement à l’aide d’un vecteur, où le mécanisme de réparation de l’ADN s’occupe de l’intégrer dans le génome.
La recombinaison homologue est une technique communément utilisée en génie génétique qui consiste à un échange entre molécules d’ADN, typiquement à l’aide d’un vecteur.
Le terme «vecteur» s’entend de toute séquence d’ADN dans laquelle il est possible d’insérer des fragments d’acide nucléique étranger, les vecteurs permettant d’introduire de l’ADN étranger dans une cellule hôte. Des exemples de vecteurs sont les plasmides, les cosmides, les chromosomes artificiels de levures (YAC), les chromosomes artificiels de bactéries (BAC) et les chromosomes artificiels dérivés du bactériophage P1 (PAC), les vecteurs dérivés de virus. Le vecteur selon l'invention permet l'introduction d'une mutation ou d'une délétion.
Dans un mode de réalisation préféré, ladite cassette d’invalidation comprend trois fragments d'ADN:
(1) une région en amont du gène cible,
(2) un marqueur de sélection, et
(3) une région en aval du gène cible.
Dans le cas de la présente invention, le «gène cible» s’entend du gèneID78713 (GEL3). Les régions en amont et en aval du gène cible sont deux éléments de recombinaison, un à chaque extrémité du gène, et sont nécessaires pour cibler de façon précise la séquence à invalider.
Selon l’invention, la région en amont du gène cible (c’est-à-dire la séquence 5’ en amont du gène ID78713 (GEL3)) est notamment représentée par la séquence de SEQ ID NO: 10.
Selon l’invention, la région en aval du gène cible (c’est-à-dire la séquence 3’ en aval du gène ID78713 (GEL3)) est notamment représentée par la séquence de SEQ ID NO: 12.
L’expression «marqueur de sélection» s’entend d’un gène dont l’expression confère aux cellules qui le contiennent une caractéristique permettant de les sélectionner. L’utilisation d’un marqueur de sélection permet en effet d’identifier les cellules ayant intégré une modification génétique par rapport à celles qui ne l’ont pas intégrée. Il s’agit par exemple d’un gène de résistance aux antibiotiques, notamment le gène de résistance à l’antibiotique hygromycinehph, tel que représenté par la SEQ ID NO: 11.
Plus précisément, selon l’invention, la cassette d’invalidation est préférentiellement constituée d’un gène de résistance placé sous le contrôle d’un promoteur et d’un terminateur, avec en amont et en aval les régions flanquantes 5’ et 3’ du gène ID78713 (GEL3). Encore plus préférentiellement, selon l’invention, la cassette d’invalidation est constituée d’un gène de résistance à l’antibiotique hygromycinehphplacé sous le contrôle du promoteur GPDa et du terminateur TRPc (Punt et van den Hondel, 1992) avec en amont et en aval les régions flanquantes 5’ et 3’ du gène ID78713 (GEL3). Selon l’invention, ladite cassette d’invalidation pourra être liée opérationnellement à un promoteur, un terminateur ou toute autre séquence nécessaire à son expression dans une cellule hôte.
La cassette d’invalidation peut être amplifiée selon les techniques classiques bien connues de l'homme du métier, typiquement par une méthode choisie parmi le clonage classique, la fusion PCR, ou encore le clonagein vivopar PCR. Préférentiellement, cette cassette d’invalidation est amplifiée par PCR, notamment à l’aide des séquences représentée par les SEQ ID NO: 4 et SEQ ID NO: 5. Le cassette d’invalidation est ensuite introduite par recombinaison dans une souche, notamment deTrichoderma reesei,qui n'exprime pas un gène du marqueur de sélection. L'homme du métier peut aisément identifier les gènes de marqueur de sélection pertinents pour la mise en œuvre de l'invention. Après culture, les souches variantes/mutantes ayant incorporé la cassette d’invalidation sont sélectionnées en fonction de l'expression ou non du marqueur de sélection; les clones ayant été transformés exprimant ledit marqueur de sélection. Il s’agit des souches selon l’invention. Préférentiellement, les souches mutantes sont identifiées à l’aide des amorces de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 et SEQ ID NO: 9. Ces techniques de recombinaison génétiques sont bien connues de l’homme du métier. Dans un aspect préféré, selon l’invention, le champignon est un champignon filamenteux. Encore plus préférentiellement, le champignon filamenteux est choisi parmi les classes des orbiliomycètes, des pézizomycètes, des dothideomycètes, des eurotiomycètes, des lecanoromycètes, des léotiomycètes, des sordariomycètes et des saccharomycètes. De façon avantageuse, le champignon filamenteux selon l’invention appartient à la classe des sordariomycètes, notamment au genreTrichoderma, et plus particulièrement à l’espèceTrichoderma reesei.
Lorsque le champignon appartient à l’espèceTrichoderma reesei, selon l’invention, la souche parente deTrichoderma reeseipeut être la souche QM6a (déposée sous le numéro ATCC 13631), ou encore une souche issue de l’isolat naturel QM6a (notamment obtenue par mutagénèse aléatoire ou dirigée), telle que la souche Rut-C30(déposée sous le numéro ATCC 56765), la souche déposée sous le numéro CNCM I-5221 (déposée le 03 août 2017 auprès de la CNCM, Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l’Institut Pasteur, située 25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris cedex 15), la souche NG14 (déposée sous le numéro ATCC 56767) ou encore la souche QM9414 (déposée sous le numéro ATCC 26921). Typiquement, les souches selon l’invention présentent un phénotype de faible viscosité tout en conservant leur capacité à produire des protéines d’intérêt.
Dans un deuxième aspect, l’invention concerne également un procédé de modification génétique d’une souche de champignon selon l’invention, telle que mentionné ci-dessus, comprenant une étape d’invalidation du gène ID78713 (GEL3). Le procédé de modification génétique d’une souche selon l’invention permet ainsi d’obtenir des souches de champignon moins visqueuses par rapport à la souche de champignon parent. C’est pourquoi la souche selon l’invention peut être considérée comme un variant de la souche de champignon parent. Ainsi, durant sa croissance, la souche de champignon selon l’invention génère une viscosité moins élevée par rapport à la souche parente pour un taux de cisaillement donné, à même concentration en biomasse, et à même température.
Préférentiellement, dans ledit procédé de modification génétique selon l’invention, l’étape d’invalidation du gène ID78713 (GEL3) est réalisée à l’aide d’une étape de mutagénèse ou de recombinaison homologue. Encore plus préférentiellement, dans ledit procédé de modification génétique selon l’invention, l’étape d’invalidation du gène ID78713 (GEL3) est réalisée à l’aide d’une cassette d’invalidation telle que mentionnée ci-dessus, notamment représentée par la SEQ ID NO: 1, chez un champignon appartenant à l’espèceTrichoderma reesei.
Dans un troisième aspect, la présente invention concerne aussi un procédé de production de biomasse de champignon, comprenant une étape de culture d'une souche de champignon selon l’invention, dans un milieu de culture comprenant un substrat approprié. Cette étape permet ainsi la croissance de la souche de champignon selon l’invention. L’homme du métier connait les substrats appropriés à la croissance des souches de champignon.
Dans un quatrième aspect, la présente invention concerne également un procédé de production de protéines d’intérêt, notamment des enzymes, comprenant une étape de culture d'une souche de champignon selon l’invention, dans un milieu de culture comprenant un substrat approprié. L’invention concerne ainsi l’utilisation d’une souche de champignon selon l’invention, pour la production de protéines d’intérêt.
De façon avantageuse, ledit procédé comprend ainsi une phase de croissance d’une souche de champignon selon l’invention, puis une phase de croissance et de production de protéines d’intérêt par ladite souche. Encore plus préférentiellement, ladite phase de croissance est réalisée en présence d’un substrat de croissance et ladite phase de croissance et de production de protéines d’intérêt est réalisée en présence d’un susbtrat inducteur. Le substrat de croissance et le substrat inducteur sont de préférence des substrats carbonés.
Ainsi, le substrat carboné de croissance est choisi de préférence parmi le lactose, le glucose, le xylose, les résidus obtenus après fermentation éthanolique des sucres monomères des hydrolysats enzymatiques de biomasse cellulosique, et/ou un extrait brut de pentoses hydrosolubles provenant du prétraitement d’une biomasse cellulosique.
Le substrat carboné inducteur est ainsi choisi de préférence parmi le lactose, le cellobiose, le sophorose, les résidus obtenus après fermentation éthanolique des sucres monomères des hydrolysats enzymatiques de biomasse cellulosique, et/ou un extrait brut de pentoses hydrosolubles provenant du prétraitement d’une biomasse cellulosique.
Selon l’invention, les protéines d’intérêt sont toutes les protéines pouvant être produites par un champignon, de façon naturelle ou bien par modification génétique (par exemple après transformation à l’aide d’un vecteur approprié).
De façon avantageuse, les protéines d’intérêt selon l’invention sont des enzymes, notamment des enzymes cellulolytiques telles que des cellulases ou des hémicellulases. De façon préférée, les enzymes sont des cellulases. Selon l’invention, le terme «cellulases» s’entend plus particulièrement des enzymes choisies parmi les endoglucanases, les exoglucanases et les glucosidases, et plus particulièrement la β-glucosidase. Le terme «cellulase» fait plus particulièrement référence à une enzyme adaptée à l'hydrolyse de la cellulose et permettant aux microorganismes (tels queTrichoderma reesei) qui les produisent d'utiliser la cellulose comme source de carbone, en hydrolysant ce polymère en sucres simples (glucose). La production de cellulases par une souche selon l’invention, notammentTrichoderma reesei, peut être déterminée par toutes techniques usuelles pour l’homme du métier, ou encore par les techniques décrites dans les brevets EP 448 430 B1 ou EP 2744899 B1.
Une corrélation entre protéines totales sécrétées et cellulases peut être faite car chezT. reesei, les exoglucanases (CBHI, CBHII) et les endoglucanases (EGI, EGII) principales peuvent représenter jusqu’à 90% de la quantité totale de protéines sécrétées (voir par exemple Markov, A.V., Gusakov, A.V., Kondratyeva, E.G., Okunev, O.N., Bekkarevich, A.O., and Sinitsyn, A.P. (2005). New Effective Method for Analysis of the Component Composition of Enzyme Complexes from Trichoderma reesei. Biochemistry (Moscow)70, 657-663).
Dans un cinquième aspect, la présente invention concerne également un procédé de production de produits biosourcés à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant une étape d’utilisation de la souche de champignon selon l’invention, pour produire des enzymes cellulolytiques. L’invention concerne donc également l’utilisation d’une souche de champignon selon l’invention, pour la production de produits biosourcés à partir de de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques.
Dans un sixième aspect, la présente invention concerne un procédé de production d'un biocarburant à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant une étape d’utilisation de la souche de champignon selon l’invention pour produire des enzymes cellulolytiques. L’invention concerne ainsi l’utilisation d’une souche de champignon selon l’invention, pour la production de biocarburant à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques.
Selon l’invention, le terme «biocarburant» s’entend plus particulièrement d’un biocarburant de seconde génération, c’est-à-dire issu de ressources non alimentaires. Selon l’invention, le terme «biocarburant» peut également être défini comme étant tout produit issu de la transformation de la biomasse et pouvant être utilisé à des fins énergétiques. D’une part et sans vouloir se limiter, on peut citer à titre d’exemple des biogaz, des produits pouvant être incorporés (éventuellement après transformation ultérieure) à un carburant ou être un carburant à part entière, tels que des alcools (l’éthanol, le butanol et/ou l’isopropanol selon le type d’organisme fermentaire utilisé), des solvants (acétone), des acides (butyrique), des lipides et leurs dérivés (acides gras à courtes ou longues chaînes, esters d’acides gras), ainsi que l’hydrogène. De manière préférée, le biocarburant selon l’invention est un alcool, par exemple l’éthanol, le butanol et/ou l’isopropanol. Plus préférentiellement, le biocarburant selon l’invention est l’éthanol. Dans un autre mode de réalisation, le biocarburant est du biogaz. Dans un autre mode de réalisation, le produit est une molécule intéressant l'industrie chimique, comme par exemple, un autre alcool tel que le 1,2-propane diol, le 1,3-propane diol, le 1,4-butane diol, le 2,3-butane diol, des acides organiques comme l'acide acétique, propionique, acrylique, butyrique, succinique, malique, fumarique, citrique, itaconique, ou des hydroxyacides comme l'acide glycolique, hydroxypropionique, ou lactique.
Dans un aspect préféré, le procédé de production d'un biocarburant à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques selon l’invention, comprend:
i) une étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique afin d’obtenir un substrat prétraité,
ii) une étape d’utilisation de la souche selon l’invention pour produire des enzymes cellulolytiques,
iii) une étape d'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité obtenu à l’étape i), en présence des enzymes cellulolytiques obtenues à l’étape ii), afin d’obtenir un hydrolysat,
iv) une étape de fermentation alcoolique de l'hydrolysat obtenu,
v) une étape de séparation, notamment par distillation.
Dans un aspect encore plus préféré, le procédé de production d'un biocarburant à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques selon l’invention, comprend:
i) une étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique afin d’obtenir un substrat prétraité,
ii) une étape d’utilisation de la souche selon l’invention pour produire des enzymes cellulolytiques,
iii) une étape d'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité obtenu à l’étape i), en présence des enzymes cellulolytiques obtenues à l’étape ii), afin d’obtenir un hydrolysat,
iv) une étape de fermentation alcoolique de l'hydrolysat obtenu,
v) une étape de séparation, notamment par distillation,
lesdites étapes iii) et iv) étant réalisées simultanément. Cela est typiquement le cas dans les procédés de production dits «SSF» (Simultaneous Saccharification and Fermentation).
Selon un mode de réalisation particulier, l’étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique est une étape de mise en suspension en phase aqueuse dudit substrat cellulosique ou lignocellulosique.
Selon un mode de réalisation particulier, l’hydrolysat obtenu à l’étape iii) est un hydrolysat contenant du glucose.
Selon un mode de réalisation particulier, l’étape de fermentation alcoolique de l'hydrolysat obtenu est une étape de fermentation, en présence d'un organisme fermentaire, du glucose issu de l'hydrolysat de manière à produire un moût de fermentation. Un organisme fermentaire est par exemple une levure.
Selon un mode de réalisation particulier, l’étape de séparation est une séparation du biocarburant et du moût de fermentation, notamment par distillation.
Selon un mode de réalisation encore plus préféré, le substrat cellulosique ou lignocellulosique à hydrolyser est mis en suspension en phase aqueuse à raison de 6 à 40% de matière sèche, de préférence 20 à 30%. Le pH est ajusté entre 4 et 5,5, de préférence entre 4,8 et 5,2 et la température entre 40°C et 60°C, de préférence entre 45°C et 50°C. La réaction d'hydrolyse est démarrée par l'ajout des enzymes agissant sur le substrat prétraité. La quantité d’enzymes habituellement utilisée est de 10 à 30 mg de protéines excrétées par gramme de substrat prétraité ou moins. La réaction dure généralement de 15 à 48 heures. La réaction est suivie par dosage des sucres libérés, notamment le glucose. La solution de sucres est séparée de la fraction solide non hydrolysée, essentiellement constituée de lignine, par filtration ou centrifugation et ensuite traitée dans une unité de fermentation.
Selon un autre mode de réalisation encore plus préféré, lorsque l’étape d’hydrolyse et de fermentation sont réalisées conjointement, les enzymes et l'organisme fermentaire sont ajoutés simultanément puis incubés à une température comprise entre 30°C et 35°C pour produire un moût de fermentation. Selon ce mode de réalisation, la cellulose présente dans le substrat pré-traité est convertie en glucose, et en même temps, dans le même réacteur, l'organisme fermentaire (par exemple une levure) convertit le glucose en produit final selon un procédé de SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation) connu de l'homme du métier. Selon les capacités métaboliques et hydrolytiques de l'organisme fermentaire, le bon déroulement de l'opération peut nécessiter l'addition d'une quantité plus ou moins importante de mélange cellulolytique exogène.
Dans un septième aspect, l’invention concerne également l’utilisation d’une souche de champignon selon l’invention, pour l'hydrolyse de la cellulose ou de la lignocellulose en glucose.
Dans un huitième aspect, l’invention concerne également l’utilisation d'une souche de champignon selon l’invention, pour améliorer les propriétés d’une souche compatible, notamment industrielle.
Dans la présente description, les définitions et préférences indiquées dans un aspect s’appliquentmutatis mutandisaux autres aspects. Par exemples, toutes les définitions et préférences indiquées dans le premier aspect de l’invention ci-dessus s’appliquent également aux deuxième, troisième, quatrième, cinquième, sixième, septième et huitième aspect.
Brève description des Figures
D’autres caractéristiques, détails et avantages de l’invention apparaîtront à la lecture des Figures annexées.
Fig. 1
représente les viscosités apparentes mesurées à un cisaillement de 5 s-1 pour différentes souches cultivées en fioles agitées
Fig. 2
représente les viscosités apparentes mesurées à un cisaillement de 5s-1 pour différentes souches cultivées en bioréacteur
Séquences de la présente invention
Nom de la séquence Séquence
SEQ ID NO: 1 gactaagaga gagagagagg gagcattggc ctctatcgtg atgcctcggt gaatagagag agtgagtgtg tgtgtggtat ttcccactgc tgcgagcttc aattgagagc aatggccatg atattacaca aggttcctac ctaggtaagg taatgcaagg tactacagcg aggtacagta atactagcac gcaaacaaac atgggccgca acacgagagt cgtaaatccc atcgtctacc tactgcctac gagtacatgt agcctcgtga ccaactcccc tccccccctt gtcctacgag gctctttgtg cctggacagc acaggtttcc aaccgtcgca cctcgagcca agaaatccga gccgtttagt agccaattga tgccggatcc tcttcatcct cgtctggggc actttccacc cacccctgtt tttttttctc ttttcttttt tgcgagctac tgctagtcgc attctggcag ctaacggcaa agatggggaa attgaaaggc tagacaggac gatatccttg attttccctg ttcgtatcgt atctggcttg aaaagatggg gggggtctga agcggaacta gtaggacagg gcaggacggg acaggacagg acagggtcaa ggccaaggcc gaggtcgtgg tgcatgctgg tgtacaagta cgatgccata acaatctcat catcgcgctt ctcttgctgg tggacgggat ctgcaggttt cctcctcttt tctcttacca ttcttttgac tctctcggtg cctctgcagc cgctctttct tgcattcgcc ggcttcaatc gcggttgctg gggttattca ctgttggatc caatcactcg ctctttagat aaaacccact ggcttgccag ctgtcgaggc ccgtccgtcc accgctctcg cttcctctcg tctctctcaa ccctcgctcg ctcgctcgct ctctctctgg gtcacgttgc gctcactttc ttggttttcc cccctttccg cctctggggg acaatctgtg gccaaacaat tcttgggttg ggacgagaaa aaaatccgcc ttgtgctcgg ttccctcttt cttttacctt tctctcagtt tcggttttga acccattgac gagcttctct tcttggttgg tttggatctg ctcgaccaca tcgcgagccc ttcattcatc ccatctttct tttttttttt ctcttgttcg ccaagagttt tggaacagtg aacagaattc gatttaccgc cgcttccctt tggaaccaac agcttacctg catttcgact gtgtgacaca cgcaagtgta cctgtgcatt ctgggtaaac gactcatagg agagttgtaa aaaagtttcg gccggcgtat tgggtgttac ggagcattca ctaggcaacc atgcatcctt actattgtat accatcttag taggaatgat ttcgaggttt atacctacga tgaatgtgtg tcctgtaggc ttgagagttc aaggaagaaa catgcaatta tctttgcgaa cccagggctg gtgacggaat tttcatagtc aagctatcag agtaaagaag aggagcatgt caaagtacaa ttagagacaa atatatagtc gcgtggagcc aagagcggat tcctcagtct cgtaggtctc ttgacgaccg ttgatctgct tgatctcgtc tcccgaaaat gaaaatagct ctgctaagct attcttctct tcgccggagc ctgaaggcgt tactaggttg cagtcaatgc attaatgcat tgcagatgag ctgtatctgg aagaggtaaa cccgaaaacg cgttttattc ttgttgacat ggagctatta aatcactaga aggcactctt tgctgcttgg acaaatgaac gtatcttatc gagatcctga acaccatttg tctcaactcc ggctagcgaa ttctcgactc attcctttgc cctcggacga gtgctggggc gtcggtttcc actatcggcg agtacttcta cacagccatc ggtccagacg gccgcgcttc tgcgggcgat ttgtgtacgc ccgacagtcc cggctccgga tcggacgatt gcgtcgcatc gaccctgcgc ccaagctgca tcatcgaaat tgccgtcaac caagctctga tagagttggt caagaccaat gcggagcata tacgcccgga gtcgtggcga tcctgcaagc tccggatgcc tccgctcgaa gtagcgcgtc tgctgctcca tacaagccaa ccacggcctc cagaagaaga tgttggcgac ctcgtattgg gaatccccga acatcgcctc gctccagtca atgaccgctg ttatgcggcc attgtccgtc aggacattgt tggagccgaa atccgcgtgc acgaggtgcc ggacttcggg gcagtcctcg gcccaaagca tcagctcatc gagagcctgc gcgacggacg cactgacggt gtcgtccatc acagtttgcc agtgatacac atggggatca gcaatcgcgc atatgaaatc acgccatgta gtgtattgac cgattccttg cggtccgaat gggccgaacc cgctcgtctg gctaagatcg gccgcagcga tcgcatccat agcctccgcg accggttgta gaacagcggg cagttcggtt tcaggcaggt cttgcaacgt gacaccctgt gcacggcggg agatgcaata ggtcaggctc tcgctaaact ccccaatgtc aagcacttcc ggaatcggga gcgcggccga tgcaaagtgc cgataaacat aacgatcttt gtagaaacca tcggcgcagc tatttacccg caggacatat ccacgccctc ctacatcgaa gctgaaagca cgagattctt cgccctccga gagctgcatc aggtcggaga cgctgtcgaa cttttcgatc agaaacttct cgacagacgt cgcggtgagt tcaggctttt tcatgatggc cctcctaccg gtgatctcag ctgtaggaaa gagaagaagg ttagtagtcg acatggtggc cctcctatag tgagtcgtat tatactatgc cgatatacta tgccgatgat taattgtcaa cactaggcgc cggtcacaac tagtagatat cacttacgtg ttgagaggcg gcatgcgata agaggtgtaa ttacctgaga acatcttgtt gccctgcttt ccgtgcgaaa tactaccggt acttttggga aacaagggaa caggagggcg ctgctgtgcg cggttctgag tgttcaggat tgaagctgaa gaaggtgctg aggaagcgta gaactgttgc ggacgcgagt tctgagaaga gctgtaccga ttggtgaaag ccgaagaagt gagttggtgc cctgttgcct ggataatgtt tgcaactcgc tggttctgca gagacggaga caaatgctgg ctacgatgtt gctgattcag gttgatacct cggtcgagac actgttttgg tttgataggg tggatttggt tgcagagaag agaaaggaag gtcaaagagg gaaaactggg cggagggaag gattttgtat caggcagcaa actgccactg cagtggccct ggcagtgccg ggcgaggcac ccacgcacgg ccgcgcaacc ggttggtcct tgcccaccac gaaacccttc tgaaaggtca gatggaagtg tgcgacagtg cgcgtcccca agccaatgca ggcgccatgc actccccacc cgcaagattc actgtgcgtt cttattggtt gccgcaaggc cagccaaagg gggaagtatg agtcacagca ccgatacaag aaaattgcag aactaacata tggatgcgcg cgctattctg tagagctctg ggcaaagcac caatcctgcg ggtcggtaca cacactagca ctgccattct ggccgtcaag accgaaactg tcagcgtggc caccgagacc ggtaccagca cggcggagag caccgcagac agcacctctg gcgacagcac gggtgctgcc acgacttcta ccccgaaatc atcatcttcc accacctcta gcgccgaaag cacggagacg tccaacggca gccccttgga caagcgcgtc actgcgtttg gtgccggcct ggttggcgtc gttttgggtg ctgcggtctt gttgtaagat ggattcaagt tggttcgttg gatttgtatc gtcaaatcag tatcagatac ccatctactt ctcgccatgc ttttctgctc tttgtttctt ttttttgatg ttaccaaggg gcttgagctt gttggcctaa attcccccct aatgctcttt gtatgatggc tgaacgtttg gagaggggat ggttttgttc tatgacattt gccgcgtaac gaggcatgac tttattatat taatgcatga ggatatgttg tacatgaggt gtgaagagcc cttgcttatt tatggtgtgg tgtggtctga cgccgaccaa ccctgtcatc gtgttcttgt tattatgcca cgcgctatcc tagctgaaat acgggaaccg ataattgccc tcgcgttgtg aaccctcgcg ttgtgaaccc ttgcgttgtg aaccctcgaa aaccgtgttt cccccttttc atatatgctt tttcatcttc tttctatcca atatctgcgg ttttggtttc atctagtgga actgtaatcg taggtgagag tagtgttttt aggccagtaa tggttatagt tgtgattgtt tctgaagtat tctgattcag cctggtggca ctgatattcg tcgtcgacaa aggtatctcg gtcgacaaag gtatgctggt cgaggcggtt gtatcgtcgt cgtcagagga ggaagaggac gagtaggtcc tgacggccga gttgccgacg aagacgaggc tgacggtgaa gatggcgagg acggaggcac agaggaggcc catggccagg tagcggatgc gcgggtcgta gcggtggggg gaagagcccc agggggtgcg ggtgtgggtt tggcattgga ggttgtcgat catttatacg gttttttttc tcttgttttg attttgtagg ttgtttgagc ttgattgatg ttgctgaagt atgtggttga gaatt
SEQ ID NO: 2 ATGCGTTGGTCTTCGGTTGCCGTTGCGCTGGCGAGCGCCAAATCCTTTGCCGTGGCGCTGGATCCCGTCTCCGTCGTGGGAAACAAGTTCTTCAACAAGGACGGCTCGCAGTTCTTTATCAAGGGCATTGCGTACCAGCTTGTTCCGCAGGACCCCCTCGTGGACACTGACCAGTGCAAACGCGATGCTAAGCTCATGGCCGAGCTCGGAACAAACACCATCCGCGTCTATCACGTCGACCCGGACGCCGACCATGACGGCTGCATGAGTGCGTTTGACGACGCCGGCATCTACGTCCTTGCTGATCTGGATACCTTTGATACCTACATTATTCCCCAAAATAACTACTGGAATAAGACAAAGTTCGACAGGTATGCCGAGGTCCTGGACACGTTCCAAAAGTACGACAACCTCCTGGGCGTCTTCGTCGGAAACGAGAACATCGCTACTAAAGATGACTCGCCCACGGCGCCCTACCTCAAGGCTGCTGCCCGCGACATGAAGGCGTACCGCGACGCCCAGGGCTACCGCGAGATCCCCGTCGGCTACTCGGCCGCCGATATCTTGCAGCTTCGCCCCATGCTCCAGGACTACCTGACCTGCGGCGGCAACTCGTCCGAGACAGTCGACTTCTTCGCCCTCAACTCGTACTCGTGGTGCGACCCCAGCACGTACAAGGAGTCCACCTACGACCAGCTTGAGGCCTACGCCAAGAAATTCCCCGTGCCCATCTTCCTCTCCGAGACAGGCTGCATCGTTCCCGGCCCTCGCCAGTTCGACGACCAGGACGCCATCTTTGGCCCTGAGATGGTCAATGACTGGAGCGGCGCCATCATCTACGAGTGGATTCAGGAGGAAAACGGCTACGGAATTATAACATATGCCCCAGCCGGCCAAGCTGCTGGACCCAACGTCGAGGGTGGCTTCCTTCGCAAGGGCACTCCCACGCCAAAGCTGCCCGACTTCACCGCGCTCAAGTCCAAGTGGGCGACCAACACCCCTACCGGCGTCAGCCGAGACGACTACGACGCAAAGGACGTGTCGACCCGTGCGTGTCCTTCGTCCACTGCCGGCGGCTGGTGGCAGGTGGATGGCGATGCCAAATTGCCCACCCTGGGCCAG
SEQ ID NO: 3 MRWSSVAVALASAKSFAVALDPVSVVGNKFFNKDGSQFFIKGIAYQLVPQDPLVDTDQCKRDAKLMAELGTNTIRVYHVDPDADHDGCMSAFDDAGIYVLADLDTFDTYIIPQNNYWNKTKFDRYAEVLDTFQKYDNLLGVFVGNENIATKDDSPTAPYLKAAARDMKAYRDAQGYREIPVGYSAADILQLRPMLQDYLTCGGNSSETVDFFALNSYSWCDPSTYKESTYDQLEAYAKKFPVPIFLSETGCIVPGPRQFDDQDAIFGPEMVNDWSGAIIYEWIQEENGYGIITYAPAGQAAGPNVEGGFLRKGTPTPKLPDFTALKSKWATNTPTGVSRDDYDAKDVSTRACPSSTAGGWWQVDGDAKLPTLGQ
SEQ ID NO: 4 GACTAAGAGAGAGAGAGAGGGAGC
SEQ ID NO: 5 AATTCTCAACCACATACTTCAGCA
SEQ ID NO: 6 AACACCCAATACGCCGGC
SEQ ID NO: 7 GCTCTGGGCAAAGCACCAA
SEQ ID NO: 8 GTGCGGGATGCATGAAGACG
SEQ ID NO: 9 CCACCCTACGATTCTGCAACC
SEQ ID NO: 10 gactaagaga gagagagagg gagcattggc ctctatcgtg atgcctcggt gaatagagag agtgagtgtg tgtgtggtat ttcccactgc tgcgagcttc aattgagagc aatggccatg atattacaca aggttcctac ctaggtaagg taatgcaagg tactacagcg aggtacagta atactagcac gcaaacaaac atgggccgca acacgagagt cgtaaatccc atcgtctacc tactgcctac gagtacatgt agcctcgtga ccaactcccc tccccccctt gtcctacgag gctctttgtg cctggacagc acaggtttcc aaccgtcgca cctcgagcca agaaatccga gccgtttagt agccaattga tgccggatcc tcttcatcct cgtctggggc actttccacc cacccctgtt tttttttctc ttttcttttt tgcgagctac tgctagtcgc attctggcag ctaacggcaa agatggggaa attgaaaggc tagacaggac gatatccttg attttccctg ttcgtatcgt atctggcttg aaaagatggg gggggtctga agcggaacta gtaggacagg gcaggacggg acaggacagg acagggtcaa ggccaaggcc gaggtcgtgg tgcatgctgg tgtacaagta cgatgccata acaatctcat catcgcgctt ctcttgctgg tggacgggat ctgcaggttt cctcctcttt tctcttacca ttcttttgac tctctcggtg cctctgcagc cgctctttct tgcattcgcc ggcttcaatc gcggttgctg gggttattca ctgttggatc caatcactcg ctctttagat aaaacccact ggcttgccag ctgtcgaggc ccgtccgtcc accgctctcg cttcctctcg tctctctcaa ccctcgctcg ctcgctcgct ctctctctgg gtcacgttgc gctcactttc ttggttttcc cccctttccg cctctggggg acaatctgtg gccaaacaat tcttgggttg ggacgagaaa aaaatccgcc ttgtgctcgg ttccctcttt cttttacctt tctctcagtt tcggttttga acccattgac gagcttctct tcttggttgg tttggatctg ctcgaccaca tcgcgagccc ttcattcatc ccatctttct tttttttttt ctcttgttcg ccaagagttt tggaacagtg aacagaattc gatttaccgc cgcttccctt tggaaccaac agcttacctg catttcgact gtgtgacaca cg
SEQ ID NO: 11 caagtgta cctgtgcatt ctgggtaaac gactcatagg agagttgtaa aaaagtttcg gccggcgtat tgggtgttac ggagcattca ctaggcaacc atgcatcctt actattgtat accatcttag taggaatgat ttcgaggttt atacctacga tgaatgtgtg tcctgtaggc ttgagagttc aaggaagaaa catgcaatta tctttgcgaa cccagggctg gtgacggaat tttcatagtc aagctatcag agtaaagaag aggagcatgt caaagtacaa ttagagacaa atatatagtc gcgtggagcc aagagcggat tcctcagtct cgtaggtctc ttgacgaccg ttgatctgct tgatctcgtc tcccgaaaat gaaaatagct ctgctaagct attcttctct tcgccggagc ctgaaggcgt tactaggttg cagtcaatgc attaatgcat tgcagatgag ctgtatctgg aagaggtaaa cccgaaaacg cgttttattc ttgttgacat ggagctatta aatcactaga aggcactctt tgctgcttgg acaaatgaac gtatcttatc gagatcctga acaccatttg tctcaactcc ggctagcgaa ttctcgactc attcctttgc cctcggacga gtgctggggc gtcggtttcc actatcggcg agtacttcta cacagccatc ggtccagacg gccgcgcttc tgcgggcgat ttgtgtacgc ccgacagtcc cggctccgga tcggacgatt gcgtcgcatc gaccctgcgc ccaagctgca tcatcgaaat tgccgtcaac caagctctga tagagttggt caagaccaat gcggagcata tacgcccgga gtcgtggcga tcctgcaagc tccggatgcc tccgctcgaa gtagcgcgtc tgctgctcca tacaagccaa ccacggcctc cagaagaaga tgttggcgac ctcgtattgg gaatccccga acatcgcctc gctccagtca atgaccgctg ttatgcggcc attgtccgtc aggacattgt tggagccgaa atccgcgtgc acgaggtgcc ggacttcggg gcagtcctcg gcccaaagca tcagctcatc gagagcctgc gcgacggacg cactgacggt gtcgtccatc acagtttgcc agtgatacac atggggatca gcaatcgcgc atatgaaatc acgccatgta gtgtattgac cgattccttg cggtccgaat gggccgaacc cgctcgtctg gctaagatcg gccgcagcga tcgcatccat agcctccgcg accggttgta gaacagcggg cagttcggtt tcaggcaggt cttgcaacgt gacaccctgt gcacggcggg agatgcaata ggtcaggctc tcgctaaact ccccaatgtc aagcacttcc ggaatcggga gcgcggccga tgcaaagtgc cgataaacat aacgatcttt gtagaaacca tcggcgcagc tatttacccg caggacatat ccacgccctc ctacatcgaa gctgaaagca cgagattctt cgccctccga gagctgcatc aggtcggaga cgctgtcgaa cttttcgatc agaaacttct cgacagacgt cgcggtgagt tcaggctttt tcatgatggc cctcctaccg gtgatctcag ctgtaggaaa gagaagaagg ttagtagtcg acatggtggc cctcctatag tgagtcgtat tatactatgc cgatatacta tgccgatgat taattgtcaa cactaggcgc cggtcacaac tagtagatat cacttacgtg ttgagaggcg gcatgcgata agaggtgtaa ttacctgaga acatcttgtt gccctgcttt ccgtgcgaaa tactaccggt acttttggga aacaagggaa caggagggcg ctgctgtgcg cggttctgag tgttcaggat tgaagctgaa gaaggtgctg aggaagcgta gaactgttgc ggacgcgagt tctgagaaga gctgtaccga ttggtgaaag ccgaagaagt gagttggtgc cctgttgcct ggataatgtt tgcaactcgc tggttctgca gagacggaga caaatgctgg ctacgatgtt gctgattcag gttgatacct cggtcgagac actgttttgg tttgataggg tggatttggt tgcagagaag agaaaggaag gtcaaagagg gaaaactggg cggagggaag gattttgtat caggcagcaa actgccactg cagtggccct ggcagtgccg ggcgaggcac ccacgcacgg ccgcgcaacc ggttggtcct tgcccaccac gaaacccttc tgaaaggtca gatggaagtg tgcgacagtg cgcgtcccca agccaatgca ggcgccatgc actccccacc cgcaagattc actgtgcgtt cttattggtt gccgcaaggc cagccaaagg gggaagtatg agtcacagca ccgatacaag aaaattgcag aactaacata tggatgcgcg cgctattctg tagagctctg ggcaaagcac caatcctgcg ggtcggtaca cacactagca ctgcc
SEQ ID NO: 12 attct ggccgtcaag accgaaactg tcagcgtggc caccgagacc ggtaccagca cggcggagag caccgcagac agcacctctg gcgacagcac gggtgctgcc acgacttcta ccccgaaatc atcatcttcc accacctcta gcgccgaaag cacggagacg tccaacggca gccccttgga caagcgcgtc actgcgtttg gtgccggcct ggttggcgtc gttttgggtg ctgcggtctt gttgtaagat ggattcaagt tggttcgttg gatttgtatc gtcaaatcag tatcagatac ccatctactt ctcgccatgc ttttctgctc tttgtttctt ttttttgatg ttaccaaggg gcttgagctt gttggcctaa attcccccct aatgctcttt gtatgatggc tgaacgtttg gagaggggat ggttttgttc tatgacattt gccgcgtaac gaggcatgac tttattatat taatgcatga ggatatgttg tacatgaggt gtgaagagcc cttgcttatt tatggtgtgg tgtggtctga cgccgaccaa ccctgtcatc gtgttcttgt tattatgcca
cgcgctatcc tagctgaaat acgggaaccg ataattgccc tcgcgttgtg aaccctcgcg ttgtgaaccc ttgcgttgtg aaccctcgaa aaccgtgttt cccccttttc atatatgctt tttcatcttc tttctatcca atatctgcgg ttttggtttc atctagtgga actgtaatcg taggtgagag tagtgttttt aggccagtaa tggttatagt tgtgattgtt tctgaagtat tctgattcag cctggtggca ctgatattcg tcgtcgacaa aggtatctcg gtcgacaaag gtatgctggt cgaggcggtt gtatcgtcgt cgtcagagga ggaagaggac gagtaggtcc tgacggccga gttgccgacg aagacgaggc tgacggtgaa gatggcgagg acggaggcac agaggaggcc catggccagg tagcggatgc gcgggtcgta gcggtggggg gaagagcccc agggggtgcg ggtgtgggtt tggcattgga ggttgtcgat catttatacg gttttttttc tcttgttttg attttgtagg ttgtttgagc ttgattgatg ttgctgaagt atgtggttga gaatt
Liste des références citées dans la présente demande de brevet
Guangtao Z, Hartl L, Schuster A, Polak S, Schmoll M, Wang T, Seidl V, Seiboth B., (2009). Gene targeting in a nonhomologous end joining deficient Hypocrea jecorina. J Biotechnol. 139(2):146-51.
Montenecourt, B. S.; Eveleigh, D. E. (1977) Semiquantitative Plate Assay for Determination of Cellulase Production by Trichoderma viride. In : Applied and environmental microbiology, vol. 33, n° 1, p. 178–183
Penttilä M, Nevalainen H, Rättö M, Salminen E, Knowles J., (1987). A versatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungusTrichoderma reesei.Gene. 61(2):155-64.
Punt, P. J.; van den Hondel, C. A., (1992) Transformation of filamentous fungi based on hygromycin B and phleomycin resistance markers. In : Methods in enzymology, vol. 216, p. 447–457.
Te'o VS, Bergquist PL, Nevalainen KM.,(2002). Biolistic transformation ofTrichoderma reeseiusing the Bio-Rad seven barrels Hepta Adaptor system. J Microbiol Methods. 51(3):393-9.
Exemples
Exemple 1 : Invalidation du gène ID78713 ( GEL3 ) dans une souche hyperproductrice
La cassette d’invalidation pour ID78713 (GEL3) est constituée du gène de résistance à l’antibiotique hygromycinehphplacé sous le contrôle du promoteurGPDaet du terminateurTRPc(Punt et van den Hondel, 1992) avec en amont et en aval les régions flanquantes 5’ et 3’ du gène ID78713 (GEL3). Cette séquence est représentée en SEQ ID NO: 1. La cassette d’ADN a été synthétisée et la cassette est insérée dans un plasmide pEX-A (disponible par exemple auprès d’Addgene). Après amplification et extraction du plasmide, la cassette d’invalidation a été amplifiée par PCR (Polymerase Chain Reaction) à l’aide des amorces p61 et p62 (voir le Tableau 2 ci-après).
Nom des amorces Séquences correspond à l’amorce
P61 SEQ ID NO: 4
P62 SEQ ID NO: 5
P78 SEQ ID NO: 6
P79 SEQ ID NO: 7
P91 SEQ ID NO: 8
P92 SEQ ID NO: 9
Séquences des amorces de la présente invention
La souche utilisée pour la transformation est la souche hyperproductrice RutC30 (Montenecourt et Eveleigh, 1977) dont le gèneKU70(ID 63200) a été invalidé en remplaçant la séquence codante par le gène codant pour le marqueur de sélection AmdS (Pentilläet al., 1987). L’invalidation de ce gène favorise la recombinaison homologue (Guangtaoet al., 2009). Cette souche est appelée TR3126.
Les transformations de la souche TR3126 avec la cassette représentée par la SEQ ID NO: 1 ont été effectuées par Biolistique (Te'oet al., 2002) en utilisant 5 µg de cassette purifiée. L’intégration au locus de la cassette d’invalidation a été vérifiée par PCR avec une amorce (p91) en amont de la cassette et une amorce (p78) dans le gènehph(vérification 5’) et une amorce (p92) en aval de la cassette et une amorce (p79) dans le gènehph(vérification 3’). Les souches invalidées pour le gène ID78713 (GEL3) ainsi obtenues sont nommées TR3126-ΔGEL3.
Exemple 2 : Méthode de mesure de la viscosité
Pour la mesure de rhéologie, le mobile (rotor) utilisé est une hélice large en acier inoxydable d’un diamètre de 38 mm, d’une hauteur de 32 mm, d’un pas de 29 mm et avec un ruban de 8 mm de largeur. Cette hélice est utilisée avec un godet (stator) de 45 mm de diamètre intérieur et un espace vertical entre le rotor et le stator de 500 μm. Après calibration, l’hélice est assimilée à un cylindre de Couette d’un rayon de 14 mm.
Le godet est rempli avec 70mL d’un moût de fermentation prélevé dans un réacteur (fiole agitée, par exemple comme indiqué dans l’Exemple 3, ou bioréacteur). Les mesures de viscosité sont réalisées par un balayage logarithmique de taux de cisaillements compris entre 4 s-1et 100 s-1, à une température de 27°C. Cette gamme correspond au taux de cisaillement moyen attendu à l’échelle industrielle. Le balayage est réalisé en un aller-retour (de 4 s-1à 100 s-1puis de 100 s-1à 4 s-1). Les mesures de rhéologie ont été effectuées en duplicate.
Toutes les mesures ont été effectuées sur le rhéomètre AR2000 de TA Instruments.
Exemple 3: Protocole de culture en fioles agitées
Les cultures en fioles agitées sont réalisées dans des fioles de Fernbach de 19 cm de diamètre, contenant 400mL de milieu de culture, ensemencées avec des spores de différentes souches à partir de cryotubes, et mises en incubation à 150 rpm et 30°C dans un incubateur Infors Multitron.
Le milieu de culture possède la composition finale suivante:
- 5,6 g/L de (NH4)2SO4
- 4,4 g/L de K2HPO4
- 0,3 g/L de MgSO4,7H2O
- 0,15 g/L de CaCl2,2H2O
- 1 mL/L de solution d’oligo éléments (FeSO4: 5 g/L, MnSO4: 1,4 g/L, ZnSO4: 1,4 g/L, CoCl2: 3,7 g/l)
- 5,85 g/L de BTCA (butane tetracarboxylic acid)
- 3,0 g/L de KOH en cristaux
- 1,5 g/L de cornsteep (par exemple Roquette Solulys®)
- 30 g/L de glucose
Le pH du milieu de culture est ajusté à 6.0 avec de la soude 30%.
Les composants sont stérilisés durant 20 minutes à 121°C (le glucose est stérilisé séparément des autres composés).
Des prélèvements réguliers de 2 mL sont effectués pour suivre le glucose résiduel. Puis quand le glucose résiduel est inférieur à 5 g/L (ce qui correspond à une concentration en champignon de l’ordre de 10g/L), un prélèvement de 100mL est effectué pour mesurer précisément la concentration en champignon (par filtration puis séchage sur filtres de 1,2µm) et la viscosité du moût (selon la méthode décrite dans l’exemple 2).
Exemple 4: comparaison des viscosités dans des cultures en fiole agitées
Deux souches ont été cultivées en duplicate selon la méthode décrite dans l’Exemple 3, puis la viscosité du moût de fermentation a été caractérisée selon la méthode décrite dans l’Exemple 2:
Les deux souches testées sont:
- La souche TR3126-ΔGEL3présentant l’invalidation du gène ID78713 (GEL3) ;
- La souche parente TR3126 utilisée comme contrôle de viscosité forte
Les mesures de concentration en champignons montrent que les concentrations sont du même ordre dans toutes les cultures réalisées, autour de 10g/L de champignon en suspension (voir le Tableau 3 ci-dessous).
Souches Concentration en champignon (g/L)
Réplicat 1 Réplicat 2
TR3126 9,4 8,7
TR3126-ΔGEL3 8,6 11,6
Concentration en champignon pour les souches testées (expériences réalisées en duplicate)
Les mesures de viscosité (présentées en Figure 1) montrent que l’invalidation du gène ID78713 (GEL3) a entrainé une baisse drastique de la viscosité. A un cisaillement de 5 s-1, la viscosité obtenue pour la souche TR3126-ΔGEL3est environ 8 à 10 fois plus faible que celle du témoin visqueux (TR3126).
Exemple 5: Protocole de culture en bioréacteur
Les cultures en bioréacteurs sont réalisées dans des fermenteurs de 16 cm de diamètre, contenant 2L de milieu de culture, ensemencés à 10%v/v à partir d’une pré-culture réalisée selon le protocole décrit dans l’Exemple 3. L’agitation est effectuée par une turbine Rayneri de 8cm de diamètre, à une vitesse fixe de 1000 rpm. La température est contrôlée à 27°C, et le pH est contrôlé à 4,8 par ajout automatique d’une solution d’ammoniaque à 5N.
Le milieu de culture possède la composition finale suivante:
- 3 mL/L d’acide orthophosphorique à 85%
- 0,25 mL/L d’acide sulfurique à 96%
- 1,66 g/L de potasse KOH en cristaux
- 2,8 g/L de (NH4)2SO4
-0,6 g/L de MgSO4,7H2O
- 0,6 g/L de CaCl2,2H2O
- 0,12 g/L de Na2HPO4,12H2O
- 1 mL/L de solution d’oligos éléments (FeSO4: 5 g/L, MnSO4: 1,4 g/L, ZnSO4: 1,4 g/L, CoCl2: 3,7 g/l)
- 1 g/L de cornsteep (par exemple Roquette Solulys®)
- 80 g/L de glucose
Les composés sont stérilisés durant 20 minutes à 121°C (le glucose est stérilisé séparément des autres composés)
Le pH du milieu de culture est ajusté puis contrôlé à 4,8 avec la solution d’ammoniaque servant au contrôle du pH
Des prélèvements réguliers d’environ 100 mL sont effectués pour: (i) suivre le glucose résiduel, (ii) mesurer précisément la concentration en champignon (par filtration puis séchage sur filtres de 1,2µm) et (iii) mesurer la viscosité du moût (selon la méthode décrite dans l’Exemple 2).
Exemple 6: Comparaison des viscosités dans des cultures en bioréacteur
Deux souches ont été cultivées en duplicate selon la méthode décrite dans l’Exemple 5, et la viscosité du moût de fermentation a été caractérisée (pour différentes concentrations en champignon dans le moût) selon la méthode décrite dans l’Exemple 2:
- La souche TR3126-ΔGEL3présentant l’invalidation du gène ID78713 (GEL3)
- La souche de référence Rut-C30 (utilisée comme contrôle de viscosité forte)
La caractérisation de la viscosité à différentes concentrations en champignon montre un réel avantage apporté par l’invalidation du gène ID78713 (GEL3) (voir la Figure 2) avec:
- comme en fioles agitées, une viscosité environ 10 fois plus faible quand la concentration en champignon est de l’ordre de 10 g/L;
- une viscosité environ 3 fois plus faible quand la concentration est de l’ordre de 25 g/L;
- la viscosité de la souche invalidée pour ID78713 (GEL3) (TR3126-ΔGEL3) à 35g/L du même ordre que la viscosité de la souche sauvage (Rut-C30) à 15 g/L.
Ainsi, une culture de la souche invalidée pour ID78713 (GEL3) à 35g/L ne demande pas plus d’énergie pour l’agitation qu’une culture de la souche sauvage à 15g/L, ce qui permet d’augmenter la productivité de la culture à même dépense énergétique.

Claims (15)

  1. Souche de champignon dans laquelle le gène ID78713 a été invalidé.
  2. Souche de champignon selon la revendication 1, dans laquelle le gène ID78713 a été invalidé par mutagénèse ou par recombinaison homologue, notamment à l’aide d’une cassette d’invalidation telle que représentée par la SEQ ID NO: 1.
  3. Souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2, dans laquelle le champignon est un champignon filamenteux, notamment appartenant à la classe des sordariomycètes plus particulièrement appartenant au genreTrichoderma, et encore plus particulièrement à l’espèceTrichoderma reesei.
  4. Souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le gène ID78713 correspond à un gène représenté par la SEQ ID NO: 2 ou un gène ayant au moins 80% d’identité avec le gène de SEQ ID NO: 2, notamment au moins 90% et plus particulièrement au moins 95%.
  5. Procédé de modification génétique d’une souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant une étape d’invalidation du gène ID78713.
  6. Procédé de modification génétique d’une souche de champignon selon la revendication 5, dans lequel l’étape d’invalidation du gène ID78713 est réalisée par mutagénèse, par recombinaison homologue ou plus préférentiellement à l’aide d’une cassette d’invalidation représentée par la SEQ ID NO: 1.
  7. Procédé de production de biomasse de champignon, comprenant une étape de culture d'une souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 dans un milieu de culture comprenant un substrat approprié.
  8. Procédé de production de protéines d’intérêt, notamment des enzymes, comprenant une étape de culture d'une souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 dans un milieu de culture comprenant un substrat approprié.
  9. Procédé de production de produits biosourcés à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant une étape d’utilisation de la souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 pour produire des enzymes cellulolytiques.
  10. Procédé de production d'un biocarburant à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant une étape d’utilisation de la souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 pour produire des enzymes cellulolytiques.
  11. Procédé de production d'un biocarburant à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques selon la revendication 10, comprenant:
    - i) une étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique afin d’obtenir un substrat prétraité,
    - ii) une étape d’utilisation de la souche selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 pour produire des enzymes cellulolytiques,
    - iii) une étape d'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité, en présence des enzymes cellulolytiques obtenues à l’étape ii) et d'un substrat approprié, afin d’obtenir un hydrolysat,
    - iv) une étape de fermentation alcoolique de l'hydrolysat obtenu, l’étape iv) étant optionnellement réalisée en simultané avec l’étape iii).
    - v) une étape de séparation, notamment par distillation.
  12. Utilisation d’une souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, pour la production de protéines d’intérêt, plus particulièrement des enzymes, notamment des enzymes cellulolytiques telles que des cellulases.
  13. Utilisation d’une souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, pour l'hydrolyse de la cellulose ou de la lignocellulose en glucose.
  14. Utilisation d’une souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, pour la production de produits biosourcés à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques.
  15. Utilisation d’une souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, pour la production de biocarburant à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques.
FR1913766A 2019-12-04 2019-12-04 Souche de champignon ayant une viscosite diminuee Active FR3104169B1 (fr)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1913766A FR3104169B1 (fr) 2019-12-04 2019-12-04 Souche de champignon ayant une viscosite diminuee
EP20842255.0A EP4069718A1 (fr) 2019-12-04 2020-12-04 Souche de champignon ayant une viscosite diminuee
US17/780,088 US20230025155A1 (en) 2019-12-04 2020-12-04 Fungus Strain Having Decreased Viscosity
PCT/FR2020/052282 WO2021111090A1 (fr) 2019-12-04 2020-12-04 Souche de champignon ayant une viscosite diminuee
BR112022010772A BR112022010772A2 (pt) 2019-12-04 2020-12-04 Cepa de fungo que tem viscosidade reduzida
CA3159388A CA3159388A1 (fr) 2019-12-04 2020-12-04 Souche de champignon ayant une viscosite diminuee
CN202080083889.8A CN114746435B (zh) 2019-12-04 2020-12-04 具有降低的粘度的真菌菌株

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1913766 2019-12-04
FR1913766A FR3104169B1 (fr) 2019-12-04 2019-12-04 Souche de champignon ayant une viscosite diminuee

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FR3104169A1 true FR3104169A1 (fr) 2021-06-11
FR3104169B1 FR3104169B1 (fr) 2022-10-21

Family

ID=70295247

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FR1913766A Active FR3104169B1 (fr) 2019-12-04 2019-12-04 Souche de champignon ayant une viscosite diminuee

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20230025155A1 (fr)
EP (1) EP4069718A1 (fr)
CN (1) CN114746435B (fr)
BR (1) BR112022010772A2 (fr)
CA (1) CA3159388A1 (fr)
FR (1) FR3104169B1 (fr)
WO (1) WO2021111090A1 (fr)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3128470A1 (fr) 2021-10-22 2023-04-28 IFP Energies Nouvelles Souche de champignon hyperproductrice de proteines

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0448430B1 (fr) 1990-03-19 1996-01-10 Institut Français du Pétrole Composition d'enzymes adaptée à l'hydrolyse des polysaccharides d'un substrat lignocellulosique, sa préparation et son utilisation
WO2012145584A1 (fr) * 2011-04-22 2012-10-26 Danisco Us Inc. Champignons filamenteux présentant un phénotype de viscosité modifié
WO2012145592A1 (fr) * 2011-04-22 2012-10-26 Danisco Us Inc. Champignons filamenteux présentant un phénotype de viscosité modifié
EP2744899B1 (fr) 2011-08-19 2016-02-24 IFP Energies nouvelles Procédé de production de cellulases par un champignon filamenteux adapté à un fermenteur ayant un faible coefficient de transfert volumetrique d'oxygène kla

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0448430B1 (fr) 1990-03-19 1996-01-10 Institut Français du Pétrole Composition d'enzymes adaptée à l'hydrolyse des polysaccharides d'un substrat lignocellulosique, sa préparation et son utilisation
WO2012145584A1 (fr) * 2011-04-22 2012-10-26 Danisco Us Inc. Champignons filamenteux présentant un phénotype de viscosité modifié
WO2012145592A1 (fr) * 2011-04-22 2012-10-26 Danisco Us Inc. Champignons filamenteux présentant un phénotype de viscosité modifié
EP2744899B1 (fr) 2011-08-19 2016-02-24 IFP Energies nouvelles Procédé de production de cellulases par un champignon filamenteux adapté à un fermenteur ayant un faible coefficient de transfert volumetrique d'oxygène kla

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE UniProt [online] 31 July 2019 (2019-07-31), "RecName: Full=1,3-beta-glucanosyltransferase {ECO:0000256|RuleBase:RU361209}; EC=2.4.1.- {ECO:0000256|RuleBase:RU361209};", XP055720561, retrieved from EBI accession no. UNIPROT:A0A024SD41 Database accession no. A0A024SD41 *
DATABASE UniProt [online] 8 May 2019 (2019-05-08), "RecName: Full=1,3-beta-glucanosyltransferase {ECO:0000256|RuleBase:RU361209}; EC=2.4.1.- {ECO:0000256|RuleBase:RU361209}; Flags: Fragment;", XP055720560, retrieved from EBI accession no. UNIPROT:G0RL27 Database accession no. G0RL27 *
GUANGTAO ZHARTL LSCHUSTER APOLAK S.SCHMOL M.WANG TSEIDL VSEIBOTH B.: "Gene targeting in a nonhomologous end joining deficient Hypocrea jecorina", J BIOTECHNOL., vol. 139, no. 2, 2009, pages 146,51, XP025842466, DOI: 10.1016/j.jbiotec.2008.10.007
HARDY ET AL., RHÉOLOGIE, vol. 27, 2015, pages 43 - 48
ISABELLE MOUYNA ET AL: "Deletion of GEL2 encoding for a [beta](1-3)glucanosyltransferase affects morphogenesis and virulence in Aspergillus fumigatus : GEL deletions affect A. fumigatus morphogenesis and virulence", MOLECULAR MICROBIOLOGY., vol. 56, no. 6, 29 April 2005 (2005-04-29), GB, pages 1675 - 1688, XP055716077, ISSN: 0950-382X, DOI: 10.1111/j.1365-2958.2005.04654.x *
KAMEI MASAYUKI ET AL: "Deletion and expression analysis of beta-(1,3)-glucanosyltransferase genes inNeurospora crassa", FUNGAL GENETICS AND BIOLOGY, SAN DIEGO, CA, US, vol. 52, 27 December 2012 (2012-12-27), pages 65 - 72, XP029000808, ISSN: 1087-1845, DOI: 10.1016/J.FGB.2012.12.001 *
MARKOV, A.V.GUSAKOV, A.V.KONDRATYEVA, E.G.OKUNEV, O.N.BEKKAREVICH, A.O.SINITSYN, A.P.: "New Effective Method for Analysis of the Component Composition of Enzyme Complexes from Trichoderma reesei", BIO-CHEMISTRY (MOSCOW, vol. 70, 2005, pages 657 - 663, XP008068738, DOI: 10.1007/s10541-005-0166-4
MONTENECOURT, B. S.EVELEIGH, D.E: "Semiquantitative Plate Assay for Determination of Cellulase Production by Trichoderma viride", APPLIED AND ENVIRINMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 33, no. 1, 1977, pages 178,183
MOUYNA ET AL., MICROBIOLOGY, vol. 144, 1998, pages 3171 - 3180
PENTTILA M.NEVALAINEN HRATTO MSALMINEN EKNOWLES J.: "A versatile transformation system for the cellulolytic filamentours fungus Trichoderma reeesei", GENE, vol. 61, no. 2, 1987, pages 155 - 64
PUNT, P. J.VAN DEN HONDEL, C. A.: "Transformation of filamentous fungi based on hygromycin B and phleomycin résistance markers", METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 216, 1992, pages 447 - 457, XP000985888, DOI: 10.1016/0076-6879(92)16041-H
TE'O VSBERGQUIST PLNEVALAINEN KM.: "Biolistic transformation of Trichoderma reesei using the Bio-Rad seven barrels Hepta Adaptor system", J MICROBIOL METHODS, vol. 51, no. 3, 2002, pages 393 - 9

Also Published As

Publication number Publication date
BR112022010772A2 (pt) 2022-08-23
EP4069718A1 (fr) 2022-10-12
CN114746435B (zh) 2025-09-23
US20230025155A1 (en) 2023-01-26
FR3104169B1 (fr) 2022-10-21
WO2021111090A1 (fr) 2021-06-10
CA3159388A1 (fr) 2021-06-10
CN114746435A (zh) 2022-07-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3440202B1 (fr) Procede de production de cellulases avec du marc lignocellulosique pretraite
FR3073230A1 (fr) Variants d'exoglucanases a activite amelioree et leurs utilisations
EP2593543B1 (fr) Procédé de production d'enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques amélioré
WO2021260310A1 (fr) Procédé de production de proteines par une souche de champignon trichoderma dans laquelle le gène cel1 a est invalidé
EP4069718A1 (fr) Souche de champignon ayant une viscosite diminuee
EP3158076B1 (fr) Variants d'exoglucanases a activite amelioree et leurs utilisations
FR3128470A1 (fr) Souche de champignon hyperproductrice de proteines
EP3850091A1 (fr) Procédé de production de cellulases par un champignon filamenteux
FR3013732A1 (fr) Variants d'endoglucanases a activite amelioree et leurs utilisations
FR3013731A1 (fr) Variants d'endoglucanases a activite amelioree et leurs utilisations
WO2022229574A1 (fr) Insertion multicopies d'un gène d'intérêt dans le génome d'un champignon
WO2025074069A1 (fr) Marqueur de selection non antibiotique pour les champignons filamenteux
WO2023186568A1 (fr) Procédé de production d'enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulytiques
FR2994981A1 (fr) Polypeptide a activite beta-glucosidase renforcee a basse temperature
FR3083245A1 (fr) Souches de saccharomyces cerevisiae exprimant des enzymes glucoamylase et xylanase exogenes et leur utilisation dans la production de bioethanol
WO2025109289A1 (fr) Souche de champignon hyperproductrice de proteines
FR3113291A1 (fr) Procédé de production d’alcool par hydrolyse enzymatique et fermentation de biomasse lignocellulosique
JPH1057068A (ja) ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子、該遺伝子含有組換えベクター並びにプラスミド、該遺伝子を導入した微細藻類細胞及びエタノール製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
PLFP Fee payment

Year of fee payment: 2

PLSC Publication of the preliminary search report

Effective date: 20210611

PLFP Fee payment

Year of fee payment: 3

PLFP Fee payment

Year of fee payment: 4

PLFP Fee payment

Year of fee payment: 5

PLFP Fee payment

Year of fee payment: 6

PLFP Fee payment

Year of fee payment: 7