JPH1057068A

JPH1057068A - ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子、該遺伝子含有組換えベクター並びにプラスミド、該遺伝子を導入した微細藻類細胞及びエタノール製造方法

Info

Publication number: JPH1057068A
Application number: JP8220062A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Nakayama; 博之中山; Shin Hirayama; 伸平山; Ryohei Ueda; 良平植田
Original assignee: Mitsubishi Heavy Industries Ltd
Current assignee: Mitsubishi Heavy Industries Ltd
Priority date: 1996-08-21
Filing date: 1996-08-21
Publication date: 1998-03-03

Abstract

(57)【要約】【課題】ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子、該遺伝子含有
組換えベクター並びにフラスミド、該遺伝子を導入した
ことによりエタノール生産能の向上した微細藻類細胞及
びこれを用いて効率良くエタノールを製造する方法を提
供する。【解決手段】配列表の配列番号１で示されるアミノ酸
をコードするピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子、該遺伝子Ｄ
ＮＡを含有しかつ当該ＤＮＡの発現調節を行なう機能を
有する組換えベクター、特に好ましくは形質変換体ＦＥ
ＲＭＰ−１５７９１から得られるプラスミドｐＣＲＰ
ＲＤＣ１。さらには該ＰＤＣ遺伝子を導入された微細藻
類細胞及び該微細藻類（好ましくはクラミドモナス属）
を培養し、該細胞内の代謝反応により蓄積した多糖類か
らエタノールを生産させることを特徴とするエタノール
の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規のピルビン酸
脱炭酸酵素遺伝子、該ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子を微
細藻類に導入するベクター並びに形質転換体プラスミ
ド、該遺伝子を導入した微細藻類細胞及び該微細藻類細
胞によるエタノール製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来エタノールは、石炭、石油などの化
石資源を原料とし、エチレンを経由して化学合成する方
法、あるいはサトウキビの糖やトウモロコシのデンプン
などのバイオマス資源を原料として、カビ、酵母などの
微生物による発酵方法により製造されている。

【０００３】バイオマス原料の中でクロレラ、ドナリエ
ラ、クラミドモナス、セネデスムス、スピルリーナなど
で代表される微細な光合成生物である微細藻の中には、
アルコールの原料となるデンプンやグリコーゲン等の多
糖類を多量に（乾重量の５０％以上）含有するものが知
られている。これらの微細藻多糖類を原料として、カビ
や酵母などの微生物による醗酵法でのエタノール生産法
が知られているが、微細藻からの多糖類の抽出、微生物
処理，糖化酵素等による多糖類の分解などの工程が必要
である。

【０００４】これに対し本発明者らは、微細藻細胞から
多糖類を抽出する必要がなく、また微生物処理あるいは
糖化酵素等による多糖類の分解も不要なため、多量のエ
ネルギーや薬剤を必要とせず、簡単なプロセスにより効
率良くエタノールを製造する次のような方法を特願平５
−２３９８４５号明細書において提案している。（１）微細藻を、光独立栄養的に明所で光合成により炭
酸同化させ増殖させるかあるいは従属栄養的に糖や有機
酸などの有機物を与えて暗所で増殖させる。（２）増殖した微細藻は細胞内に多糖類を貯蔵している
藻体を含む培養液を濃縮して得られるスラリーを暗黒か
つ嫌気性雰囲気に保持して微細藻細胞からエタノールを
生成させる。

【０００５】また、類似の技術として米国特許第５，２
７０，１７５号明細書において、培養した大型付着藻類
からエタノール等の溶解性代謝物質を製造する方法が述
べられており、ここには、大型付着藻類からのエタノー
ル生産性向上手段として、酵母の持つ公知のエタノール
生産径路を藻類に導入するべく、酵母由来のピルビン酸
脱炭酸酵素（以下「ＰＤＣ」と略記する場合もある）遺
伝子およびアルコールデヒドロゲナーゼ（以下「ＡＤ
Ｈ」と略記する場合もある）遺伝子を導入する育種方法
が記載されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記の従来方法には次
のような問題点があった。まず、特願平５−−２３９８
４５号明細書に提案する方法では、細胞中に貯蔵された
多糖類のエタノールへの変換率が４０％に留まっている
ため、単位エタノール当たりのエネルギーコストが大き
く、廃棄物量も多いこと。また上記米国特許明細書に提
案される方法では、微細藻類においては遺伝子にコード
されたアミノ酸コドンの利用状況などの遺伝子の構造
が、既存の酵母由来遺伝子と大きく異なるために、これ
ら酵母の遺伝子を導入してみても微細藻細胞内で有効に
機能させることはできず、プロセスの改良に用いること
はできていない。

【０００７】こられの問題のため、微細藻多糖類は、サ
トウキビやトウモロコシなどの農産バイオマスに比べて
利点が多いものの、現在のところ大規模に実用化される
に至っていない。本発明の目的は、前記従来技術の問題
点を解決し、光合成により蓄積した多糖類から高い変換
率でエタノールを生成する微細藻により、効率良くエタ
ノールを製造できる方法を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
の手段として本発明は、(1) 配列表の配列番号１で示さ
れるアミノ酸配列をコードするピルビン酸脱炭酸酵素遺
伝子、(2) 配列表の配列番号２で示される塩基配列であ
るＤＮＡを有する上記(1) 記載のピルビン酸脱炭酸酵素
遺伝子、を提供する。また、本発明は(3) 宿主細胞にピ
ルビン酸脱炭酸酵素活性を向上させる配列表の配列番号
１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有
し、かつ当該ＤＮＡの発現調節を行う機能を有するＤＮ
Ａを含有する組換えベクター、(4) 上記配列番号１で示
されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡが配列表の配列
番号２の塩基配列であることを特徴とする上記(3) 記載
の組換えベクター、(5) 上記当該ＤＮＡの発現調節を行
う機能を有するＤＮＡが配列表の配列番号９及び配列番
号１０のオリオヌクレオチドをアニールして得られた二
重鎖ＤＮＡであることを特徴とする上記(4) 又は(5) ５
記載の組換えベクター、及び(6) ピルビン酸脱炭酸酵素
遺伝子をコードする配列番号２のＤＮＡを、クラミドモ
ナス由来のαチュブリン遺伝子のプロモータの下流に組
み込んだ組換え体プラスミドであって、プラスミド pＣ
ＲＦ3600を制限酵素ＢamH Ｉ，ＳplＩで二重切断した断
片、プラスミド pＣＲＦ4100を制限酵素ＮcoＩ, ＳplＩ
で二重切断した断片、及びプラスミド pＣＲＦ5100を制
限酵素ＢamH Ｉ，ＮcoＩで二重切断した断片をＴ4 ＤＮ
Ａリガーゼで結合させ、大腸菌ＪＭ１０９株に導入した
形質変換体ＦＥＲＭＰ−１５７１から得られるプ
ラスミド pＣＲＰＤＣ１、を提供する。さらに本発明
は、(7) 微細藻類細胞を宿主細胞とし上記(3) ないし
(6) に記載の組換えベクターにより遺伝子導入されてな
るピルビン酸脱炭酸酵素活性の向上した組換え微細藻類
細胞、及び(8) 上記宿主細胞がクラミドモナス属に属す
る藻類細胞であることを特徴とする上記(7) 記載の組換
え微細藻類細胞、を提供する。またさらに本発明は、
(9) 宿主細胞にピルビン酸脱炭酸酵素活性を向上させる
配列表の配列番号１で示されるアミノ酸をコードするＤ
ＮＡを含有し、かつ当該ＤＮＡの発現調節を行う機能を
有するＤＮＡを含有する組換えベクターにより遺伝子導
入されたピルビン酸脱炭酸酵素活性の向上した組換え微
細藻細胞を培地で培養し、該細胞内の代謝反応によりエ
タノールを生産させることを特徴とするエタノールの製
造方法、(10)宿主細胞にピルビン酸脱炭酸酵素活性を向
上させる配列表の配列番号１で示されるアミノ酸をコー
ドするＤＮＡを含有し、かつ当該ＤＮＡの発現調節を行
う機能を有するＤＮＡを含有する組換えベクターにより
遺伝子導入されたピルビン酸脱炭酸酵素活性の向上した
組換え微細藻細胞を培地で培養し、該細胞内の代謝反応
により蓄積した多糖類からエタノールを生産させること
を特徴とするエタノールの製造方法、(11)配列表の配列
番号１で示されるアミノ酸をコードするＤＮＡが配列番
号２で示されるものであることを特徴とする上記(9）又
は(10)記載のエタノールの製造方法、(12)上記組換えベ
クターが形質転換体ＦＥＲＭＰ−１５７９１から
得られるプラスミド pＣＲＰＤＣ１であることを特徴と
する上記(10)又は(11)に記載のエタノールの製造方法、
及び(13)上記宿主細胞がクラミドモナス属に属する藻類
細胞であることを特徴とする上記(10 乃至(12)のいずれ
かに記載のエタノールの製造方法、を提供するものであ
る。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明は、微細藻細胞内の代謝経
路に着目し、微細藻類細胞中で機能する新規なＰＤＣ遺
伝子を特定できたことに基づき、該ＰＤＣ遺伝子を含有
させたベクターを保有する、あるいは該ＰＤＣ遺伝子を
染色体内に組み込んだ形質転換微細藻を用いることによ
り、高収率のエタノール製造方法を実現できたものであ
る。

【００１０】本発明者らは、微細藻細胞内の多糖類代謝
経路の各段階を検討する中で、微細藻、特にクラミドモ
ナスにおいて、多糖類が解糖系によりピルビン酸へ分解
された後、ピルビン酸脱炭酸酵素（ＰＤＣ）の働きによ
りアセトアルデヒドに変化し、これがアルコールデヒド
ロゲナーゼ（ＡＤＨ）によってエタノールへ変化する経
路が、エタノール生成の主経路であることを確認でき
た。更にこの経路において、ピルビン酸をアセトアルデ
ヒドに変換する過程が律速であることを見出した。

【００１１】ところで、図７に示すように、細胞内では
ピルビン酸はＰＤＣによるアセトアルデヒドへの代謝以
外に、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）により乳酸へ、
ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ＰＦＬ）によりアセチルＣｏ
Ａへと代謝される。このため、従来のクラミドモナス細
胞のようにＰＤＣによるピルビン酸のアセトアルデヒド
への代謝が律速の場合、ピルビン酸のかなりの量がＬＤ
ＨやＰＦＬにより乳酸やアセチルＣｏＡへ代謝されてお
り、これらが多糖類からエタノールへの変換率を低下さ
せる原因となっていたことを見いだした。

【００１２】そこで、細胞内の、ＰＤＣ量を増加させ、
ピルビン酸をアセトアルデヒドに代謝する経路を強化す
れば、多糖類のエタノールへの変換効率を向上させるこ
とが可能であると考え、鋭意研究努力を重ねた結果、微
細藻クラミドモナス・ラインハルディー Chlamydomonas
reinhardii 由来のＤＮＡからＰＤＣ遺伝子を見出すこ
とができた。また、このＰＤＣ遺伝子をクローニングす
ることに成功した。さらにこの遺伝子を導入した形質転
換微細藻を作成し、アルコール変換率を向上させること
に成功し、本発明を完成した。

【００１３】本発明における「ピルビン酸脱炭酸酵素を
コードするＤＮＡ」とは、当該ＤＮＡを適当な発現ベク
ターに組み込んだときに、当該ＰＤＣ遺伝子が発現でき
る単位のＤＮＡ鎖からなり、実質的に同等の酵素活性物
質をコードするものをすべて包含する概念のものをい
う。具体的なものとしては、配列表の配列番号１で示さ
れるアミノ酸配列をコードするすべてのＤＮＡ配列を挙
げることができ、このようなアミノ酸配列をコードし、
その発現によって生産されるタンパク質が前記ＰＤＣ活
性を示す限り、追加のアミノ酸を併せて（たとえば融合
タンパク質として）コードするものも含む。このような
ＤＮＡ配列の具体的なものとしては、配列表の配列番号
２で示されるようなＤＮＡ配列が挙げられる。

【００１４】本発明の遺伝子の１つの態様は、配列番号
１のアミノ酸番号１のMet からアミノ酸番号580 のHis
までのアミノ酸をコードするものである。しかしながら
翻訳開始コドンに対応する１位のMet は発現後プロセッ
シングにおいては除去される場合があり、また目的酵素
を他のペプチドとの融合タンパク質として発現させる場
合にも存在しない。従って、本発明の遺伝子の他の１つ
の態様は、配列番号１のアノミ酸番号２のAla から、ア
ミノ酸番号580 のHis までのアミノ酸配列を含むタンパ
ク質をコードするものである。

【００１５】この遺伝子における具体例の一つは、配列
表の配列番号２として示されるヌクレオチド番号１又は
４からヌクレオチド番号１７４０までのヌクレオチド配
列を含むものである。一般に、同種または同族に属する
微生物由来の同種の活性を有する酵素であっても、例え
ば自然突然変異、例えばヌクレオチドの置換、付加及
び、又は欠失によりアミノ酸配列のわずかな相違を伴う
酵素が存在することが知られている。しかしながら本明
細書に記載する方法によれば、配列番号１に記載するア
ミノ酸配列と全く同一ではないアミノ酸配列を有する酵
素をコードする遺伝子であってもクローニングできる。
このような酵素は、配列番号１に示すアミノ酸配列に対
して非常に高い相同性、例えば９５％以上、更には９８
％以上の相同性を有するであろう。従って、配列番号１
に示すアミノ酸配列を示すピルビン酸脱炭酸酵素をコー
ドする遺伝子のみならず、クラミドモナス・ラインハル
ディー種に属する微生物に由来し、且つ配列番号１に示
すアミノ酸配列に対して９５％以上、例えば９８％以上
の相同性を有するアミノ酸配列を有するピルビン酸脱炭
酸酵素をコードする遺伝子も本発明に属する。

【００１６】また、微細藻を含む真核生物においては、
イントロンと呼ばれるＤＮＡ配列が存在する場合があ
る。この場合はアミノ酸をコードするＤＮＡ配列が一続
きの配列ではなく、イントロン配列によって複数のフレ
ームに分断されている。従って、配列番号１に示すアミ
ノ酸配列を示すピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝
子が一続きのＤＮＡ配列ではなく、１つあるいは複数の
イントロン配列を一連の遺伝子配列の間に含むようなピ
ルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子も本発明に属す
る。

【００１７】１つの酵素において、いわゆる活性中心又
は活性領域及びそれを立体的に支持する部分以外の領域
においては、必ずしも特定のアミノ酸配列が必須ではな
く、このような必須領域においては、本来の酵素活性を
維持しながら、１ないし少数のアミノ酸の置換、欠失及
び、または付加等の修飾を行うことができることが知ら
れている。このような修飾が可能なアミノ酸の数として
は、常用の遺伝子修飾技法、例えば変異原プローブを用
いる部位特定変異誘発により修飾が容易な範囲であり、
例えばアミノ酸約２０個以下である。さらに、制限酵素
及び、又は連結酵素を用いてアミノ酸配列の置換、欠失
及び、又は付加を行うこともできる。

【００１８】従って本発明は、配列番号１に示すアミノ
酸の配列に対して、２０個以下、例えば１０個以下のア
ミノ酸の置換、欠失及び、又は付加により修飾されたア
ミノ酸配列を有するピルビン酸脱炭酸酵素をコードする
遺伝子に関する。本発明のＤＮＡは、詳細については後
述するような自体公知の方法により、各種微生物の寄託
機関から入手可能な公知の微細藻株であるクラミドモナ
ス・ラインハルディーから調製することができる。

【００１９】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
使用する微細藻株としては、例えば、クラミドモナス
ラインハルディーＣＷ１５ｎｉｔ１−３０５ (Chlamydo
monas reinhardii CW15nit1-305)株〔カレンキンドル
（セクションオブバイオケミストリー、モレキュラ
ーアンドセルバイオロジーアンドプラントサ
イエンスセンター、コーネルユニバーシティー）
(Karen L.Kindle(Section of Biochemistry, Molecular
and Cell Biology and Plant Science Center, Cornel
l University))より分与〕がある。

【００２０】本発明のＰＤＣ遺伝子は次に例示する工程
により得ることができる。（１）クラミドモナス・ラインハルディーからＤＮＡを
抽出する。（２）公知な、種々の生物のＰＤＣ遺伝子において保存
されたＤＮＡ配列領域を含む公知なＰＤＣ遺伝子のＤＮ
Ａ断片をサザンハイブリダイゼーションのプローブとす
る。（３）（１）で得たＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、
これに対して（２）で得たプローブを用いてサザンハイ
ブリダイゼーションを行う。（４）（３）で適当な陽性シグナルが得られた制限酵素
で（１）のＤＮＡ断片を切断し、陽性シグナルに該当す
る鎖長の断片を電気泳動により回収し、ベクターに結合
させ、宿主菌に導入し、クラミドモナスの遺伝子ライブ
ラリーを得る。（５）（４）で得たライブラリーに対し、（２）で得た
プローブを用い、コロニーハイブリダイゼーションを行
い、陽性シグナルが得られた宿主菌コロニーを分離、Ｄ
ＮＡを回収し、ベクターに結合した、クラミドモナス由
来のＤＮＡの配列を読み取る。（６）（５）で得られたＤＮＡ配列およびコードされた
アミノ酸配列を、公知のＰＤＣ遺伝子のＤＮＡ配列、お
よびＰＤＣのアミノ酸配列と比較し、（５）の配列に含
まれるクラミドモナス由来のＰＤＣ遺伝子構造領域の配
列の部分を明らかにする。（７）（６）の結果から判明したクラミドモナス由来の
ＰＤＣ遺伝子構造領域の配列のみを含むＤＮＡ断片をプ
ローブとして、（１）のＤＮＡを適当な制限酵素で切断
したものに対し、サザンハイブリダイゼーションを行
い、陽性シグナルが得られた宿主菌コロニーを分離、Ｄ
ＮＡを回収し、べクターに結合したクラミドモナス由来
のＤＮＡ断片の配列を読み取る。（８）（６）から（７）を繰り返し、ＰＤＣをコードす
る全領域を網羅するＤＮＡ断片群を獲得する。（９）（８）の結果を基に、ＰＤＣをコードする全領域
を含む断片が得られる制限酵素で（１）のＤＮＡを切断
し、ベクターに連結させる。この、ベクターを結合させ
たＤＮＡ断片を宿主菌に導入し、目的のＤＮＡ断片を含
む形質転換体を選択し、これより、ＰＤＣをコードする
全領域を含む断片を回収する。（１０）尚、（９）にかわる方法として、（８）で得ら
れた断片群をそれぞれ適当な制限酵素で切断、結合さ
せ、ＰＤＣをコードする全領域を含む断片を構築、取得
することもできる。（１１）（９）あるいは（１０）で得たＤＮＡ断片、あ
るいは該断片に発現調節を行う機能を有するＤＮＡを連
結したＤＮＡ断片をクラミドモナスに導入し、形質転換
体を培養し、細胞内のＰＤＣ活性の向上を確認する。

【００２１】

【実施例】以下実施例により本発明を更に詳細に説明す
るが、本発明は実施例に制限されるものではない。〔１〕クラミドモナスラインハルディー染色体ＤＮＡ
の調製：クラミドモナスラインハルディーＣＷ１５ｎ
ｉｔ１−３０５（Chlamydomonasreinhardii CW15nit1-3
05 ）を２５℃、蛍光燈照明下（２０００〜４０００lu
x）で、表１に示すＳＧII培養液中で振とう培養した。
定常状態に達した培養液７５０ｍｌから得た藻体を８ｍ
ｌのＡ緩衝液（0.1M NaCl,50mM EDTA, 20mM Tris-HCl,
pH8.0 ) に懸濁し、１００μｌのプロティナーゼＫ溶液
(10mg/ml)を加え、混合した後、０．５ｍｌの２０％Ｓ
ＤＳ溶液を加え、５０℃で、４５分放置した。更に１０
０μｌのプロティナーゼＫ溶液を加え、５０℃に４５分
放置の後、１０００μl のプロティナーゼＫ溶液を加
え、５０℃で５０分放置した。フェノール抽出の後エタ
ノール沈殿を行い、乾燥粗精製ＤＮＡを得た。ＤＮＡを
ＴＥ緩衝液（10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH8.0）で３．
８ｍｌとなるように懸濁し、４．１４ｇ塩化セシウムを
溶解させた後、０．５ｍｌの臭化エチジウム溶液(700μ
g/ml）を加え、混合した。超遠心分離機による平行密度
勾配分画により、染色体ＤＮＡを分離し、食塩飽和イソ
プロピルアルコール抽出により臭化エチジウムを除いた
後、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡを回収した。以上の
操作により、約２０μｇのＤＮＡが得られた。

【００２２】

【表１】

【００２３】〔２〕公知のＰＤＣ配列を用いたプローブ
の作成：イネ由来のＰＤＣ遺伝子断片配列（RICS77 [D1
0413])を基に配列表の配列番号3 のオリゴヌクレオチド
を合成した。また、配列番号３のオリゴヌクレオチドの
３′端にアニールする配列番号４のオリゴヌクレオチド
を合成した。配列番号３のオリゴヌクレオチド200pmol
を鋳型とし、配列番号４のオリゴヌクレオチド２００ｐ
ｍｏｌをプライマーとして、ＤＩＧＤＮＡラベリング
キット（ベーリンガーマンハイム社製）により、ジゴ
キシゲニン標識されたプローブ、プローブ１を得た。

【００２４】また、鋳型ＤＮＡは、合成オリゴヌクレオ
チド以外にも、イネやトウモロコシ等の植物、あるいは
酵母やザイモモナスのような微生物由来のＰＤＣ遺伝子
ＤＮＡを、制限酵素により断片化したものを使用するこ
とが可能である。標識の方法も、以降のサザンハイブリ
ダイゼーションにおいて使用する陽性シグナル検出方法
に応じて、ジゴキシゲニンのほか、ビオチンあるいは、
蛍光色素もしくは放射性同位元素等を用いることが可能
である。これらハイブリダイゼーションの方法について
は、Moleculer cloning （J.Sambrook.E,F.Fritsch, T.
Maniatis著 Cold Spring Harbor Laboratory Press 発
行) や試薬メーカー各社のカタログに記載されている。

【００２５】〔３〕ゲノミックサザンハイブリダイゼー
ションによるＰＤＣ遺伝子の検索：上記〔１〕で調製し
た染色体ＤＮＡ２μｇを制限酵素ＥcoＲＶで分解し
て、電気泳動に供した。次いでアガロースゲル上のＤＮ
Ａをナイロン膜に移し、上記〔２〕で作成したプローブ
１を用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。ハ
イブリダイゼーションの条件は、５０％ホルムアミド
５×ＳＳＣ、０．１％ラウロイルザルコシン、０．０２
％ＳＤＳ、２％ブロッキングリージェント（ベーリンガ
ーマンハイム社）中、４２℃で１２時間行った。ヌク
レイックアシッドデテクションキット（ベーリンガー
マンハイム社製）を用いて、プローブ１とハイブリダ
イズしたＤＮＡを検出した。その結果、約４．１kbの長
さの位置に陽性シグナルを検出した。

【００２６】〔４〕ＰＤＣ遺伝子の部分を含むＤＮＡ断
片のクローニング：上記〔１〕で調製した染色体ＤＮＡ
５μｇを制限酵素ＥcoＲＶで分解、電気泳動し、ＤＮＡ
鎖長４．１kb付近のＤＮＡをアガロースゲルより回収し
た。プラスミド pＵＣ18を制限酵素ＳmaＩで切断、アル
カリフォスファターゼ処理したものを調製し、回収断片
と混合してＴ４ＤＮＡリガーゼで結合させ、環状ＤＮＡ
を得た。このＤＮＡを大腸菌ＳＵＲＥ２（商品名、スト
ラタジーン社製）株に導入して得られた形質転換体の集
団から、実施例〔２〕で作成したプローブ１を用いて、
コロニーハイブリダイゼーションを行い、目的の形質転
換体を回収した。選択した形質転換体からプラスミドを
回収しｐＣＲＦ4100と命名した。ＤＮＡの配列を読み取
り、公知のＰＤＣのアミノ酸配列及びＰＤＣ遺伝子ＤＮ
Ａ配列との相同性を比較し、ＰＤＣのアミノ酸配列をコ
ードした領域の一部と、イントロン領域と考えられる配
列が存在することを確認した。図１に本発明に係るＤＮ
Ａ配列の部分を含むプラスミドｐＣＲＦ4100のプラスミ
ド地図を示す。

【００２７】〔５〕クラミドモナス由来ＰＤＣ遺伝子の
配列を用いたプローブの作成：上記〔４〕で判明したク
ラミドモナス由来のＰＤＣのアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡ配列を基に、配列表の配列番号５及び配列番号６
に示す２種類のオリゴヌクレオチドを合成した。これに
続き配列番号５のオリゴヌクレオチドの３′端にアニー
ルする配列番号７のオリゴヌクレオチド、および配列番
号６のオリゴヌクレオチドの３′端にアニールする配列
番号８のオリゴヌクレオチドを合成した。ＤＩＧのＤＮ
Ａラベリングキット（ベーリンガーマンハイム社製）
を用いて配列番号５のオリゴヌクレオチド２００ｐｍｏ
ｌを鋳型、配列番号７のオリゴヌクレオチド２００ｐｍ
ｏｌをプライマーとしてプローブ２のジゴキシゲニン標
識プローブ、配列番号６のオリゴヌクレオチド２００ｐ
ｍｏｌを鋳型、配列番号８のオリゴヌクレオチド２００
ｐｍｏｌをプライマーとして、プローブ３のジゴキシゲ
ニン標識プローブをそれぞれ得た。

【００２８】〔６〕ＰＤＣ遺伝子の配列の全体をカバー
する断片群のクローニング：上記〔１〕で調製した染色
体ＤＮＡ２μｇを制限酵素ＮdeＩで分解して、電気泳動
に供し、次いでアガロースゲル上のＤＮＡをナイロン膜
に移した。これを２枚作成し、それぞれ上記〔５〕で作
成したプローブ２あるいはプローブ３を用いてサザンハ
イブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーショ
ンの条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．１
％ラウロイルザルコシン、０．０２％ＳＤＳ、２％ブロ
ッキングリージェント（ベーリンガーマンハイム社
製）中４２℃で６時間行った。ヌクレイックアシッド
デテクションキット（ベーリンガーマンハイム社製）
を用いて、プローブ２又はプローブ３とハイブリダイズ
したＤＮＡを検出した。その結果、プローブ２とのハイ
ブリダイズにより約３．４kbの鎖長の位置、プローブ３
とのハイブリダイズにより約５．１kbの鎖長の位置に陽
性シグナルを検出した。

【００２９】そこで上記〔１〕で調製した染色体ＤＮＡ
5μg を制限酵素ＮdeＩで切断、電気泳動し、鎖長３．
４kb付近および５．１kb付近のＤＮＡをアガロースゲル
より回収した。プラスミドｐＵＣ18をＮdeＩで切断、ア
ルカリフォスターゼ処理したものを調製し、それぞれの
回収断片と混合してＴ４ＤＮＡリガーゼで結合させ、環
状ＤＮＡとした。このＤＮＡを大腸菌ＳＵＲＥ２（商品
名、ストラタジーン社製）株に導入して得られた形質転
換体の集団から、それぞれプローブ２、プローブ３を用
いた、コロニーハイブリダイゼーションによって、目的
の形質転換体を回収した。プローブ２によって検出した
形質転換体からプラスミドを回収し、 pＣＲＦ3400と命
名した。プローブ３によって検出した形質転換体からプ
ラスミドを回収し、 pＣＲＦ5100と命名した。

【００３０】pＣＲＦ3400及び pＣＲＦ5100のＤＮＡの
配列を読み取り、それぞれ、一部がプラスミド pＣＲＦ
4100の配列と重複することを確認した。図２に本発明に
係るＤＮＡ配列の部分を含む pＣＲＦ3400のプラスミド
地図を、図３に本発明に係るＤＮＡ配列の部分を含む p
ＣＲＦ5100のプラスミド地図を示す。重複する配列部分
を重ね合せ、連結し、約８．８kbの配列を得た。この配
列と、公知のＰＤＣのアミノ酸配列及びＰＤＣ遺伝子Ｄ
ＮＡ配列との相同性を比較した結果、約８．８kbの本配
列中に、イントロン配列によって分断された、配列番号
１に示すクラミドモナス由来のＰＤＣのアミノ酸配列を
コードした領域を表す配列番号２のＤＮＡ配列が含まれ
ていることを確認した。

【００３１】〔７〕発現調節を行う機能を有するＤＮＡ
の作成クラミドモナス由来のαチュブリン遺伝子のプロモータ
領域配列（CRTBA1G[K01805])を基に配列表の配列番号９
のオリゴヌクレオチドを合成した。また、配列番号９の
相補鎖である配列番号１０のオリゴヌクレオチドを合成
した。両者をアニールさせ、クラミドモナス細胞内で有
効に発現調節を行う二重鎖ＤＮＡを得た。なお、この二
重鎖ＤＮＡの両端は、上記〔６〕で得たプラスミド pＣ
ＲＦ3400を制限酵素Ｄra III切断した断片と連結可能
な、３塩基「Ｇ、Ｃ、Ｇ」の３′端の突出を有する。

【００３２】〔８〕発現調節を行う機能を有するＤＮＡ
とＰＤＣ遺伝子部分との連結：上記〔６〕で得たプラス
ミド pＣＲＦ3400を制限酵素Ｄra IIIで切断し、上記
〔７〕で得た発現調節機能を有するＤＮＡと、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼで結合させ、環状ＤＮＡとした。両者の連結
により、制限酵素Ｄra III切断点が消失するが、プラス
ミド pＣＲＦ3400が自己閉環した場合、Ｄra III切断点
が維持されるので、改めて制限酵素Ｄra IIIで処理し、
プラスミド pＣＲＦ3400が自己閉環したものを直鎖ＤＮ
Ａ化して形質転換効率を低減させ、発現調節ＤＮＡを連
結したプラスミドが優先的に形質転換されるようにし
た。このＤＮＡ試料を大腸菌ＪＭ１０９株に導入して得
られた形質転換体の集団から、数株を分離し、プラスミ
ドＤＮＡを回収した。それぞれのＤＮＡの配列を読み取
り、発現制御領域が連結された、目的のプラスミドＤＮ
Ａを選別し、 pＣＲＰ3600と命名した。図４にＰＤＣ遺
伝子発現制御配列と、本発明に係るＰＤＣ遺伝子のＤＮ
Ａ配列を含むプラスミド pＣＲＰ3600のプラスミド地図
を示す。

【００３３】

〔９〕ＰＤＣ遺伝子の構築：上記〔８〕で
得たプラスミド pＣＲＰ3600を制限酵素ＢamＨＩ、Ｓpl
Ｉで二重切断し、電気泳動し、約5.7kb の断片をアガロ
ースゲルより回収した。プラスミド pＣＲＦ4100を制限
酵素Ｎco I、ＳplＩで二重切断し電気泳動し、約１．７
kbの断片をアガロースゲルより回収した。プラスミド p
ＣＲＦ5100を制限酵素ＢamＨＩ、ＮcoＩで二重切断し、
電気泳動し、約4.2kb の断片をアガロースゲルより回収
した。この３種の断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで
結合させた。次に大腸菌ＪＭ１０９株に導入して得られ
た形質転換体の集団から、数種のクローンを取り、それ
ぞれプラスミドを回収した。それぞれのＤＮＡの配列を
読み取り、目的どおり３種の断片が連結されたプラスミ
ド（ pＣＲＰＤＣ 1と命名) を含む形質転換体を選択し
た。この形質転換体の識別名をＪＭ−１０９−ＰＣＲＰ
ＤＣ１と命名し、工業技術院生命工学技術研究所に寄託
し、ＦＥＲＭＰ−１５７９１として平成８年８月２０
日に受託された。改めて該形質転換体を培養し、培養菌
体からプラスミド pＣＲＰＤＣ１を得た。図５にＰＤＣ
遺伝子発現制御配列と、本発明に係る（ＰＤＣ遺伝子
の）ＤＮＡ配列を含むプラスミド pＣＲＰＤＣ１のプ
ラスミド地図を示す。

【００３４】ＦＥＲＭＰ−１５７９１の科学的性質：
Chlamydomonas reinhardii のピルビン酸脱炭酸酵素遺
伝子並びにα−チュブリン遺伝子のフロモータ配列を含
むプラスミドを保有する Escherichia coliＫ１２株で
ある。このプラスミドを保有する大腸菌は、Ampicillin
耐性である。ＦＥＲＭＰ−１５７９１の分類学上の位置：Escheric
hia coli Ｋ１２株

【００３５】〔１０〕クラミドモナス細胞へのＰＤＣ遺
伝子の導入：クラミドモナス・ラインハルディーＣＷ１
５ｎｉｔ１−３０５（Chlamydomonas reinhardii CW15n
it1-305 ）を２５℃、蛍光燈照明下（２０００〜４００
０lux ）で、ＳＧII培養液中で振とう培養した。対数増
殖期の培養液２００mlから得た藻体を、表２に示す組成
のＳＧＩＩ（ＮＨ₄-) 培養液１０mlずつで４回洗った
後、細胞濃度が１０⁸cells/ml となるようにＳＧＩＩ
（ＮＨ₄-) 培養液に懸濁した。

【００３６】

【表２】

【００３７】

【表３】

【００３８】あらかじめ洗浄、乾熱滅菌した直径０．５
mmのガラスビーズ０．３ｇをマイクロサンプリングチュ
ーブに入れ、これに藻体懸濁液３００μｌ、２０％ＰＥ
Ｇ6000溶液４００μｌ、選択マーカーとなる硝酸塩還元
酵素の遺伝子を含むプラスミド pＭＮ24[ カレンキン
ドル( セクションオブバイオケミストリー、モレュ
ラーアンドセルバイオロジーアンドプラント
サイエンスセンター、コーネルユニバーシティー）
(Karen L.Kindle(Section of Biochemistry, Molecular
and Cell Biology and Plant Science Center, Cornel
l University))より分与〕１０μｇ、プラスミド pＣＲ
ＰＤＣ１５０μg を混合し、ボルテックスミキサーで
30秒間激しく振とうした後、表４に組成を示すＨＳ (Ｎ
a ＮＯ₃）プレート培地にひろげ、連続明条件(2000lux)
２５℃で培養した。１４日間培養の後、形成した形質
転換体コロニーを分離し、形質転換体から染色体ＤＮＡ
を調製し、制限酵素ＰvuＩで分解し、電気泳動した後、
プローブ３を用いてサザンハイブリダイゼーションを行
った。形質転換を行わない株の染色体ＤＮＡが、約２５
kb一ケ所に陽性シグナルを示すのに対し、形質転換株
は、約２５kb以外にも複数の陽性シグナルを示し、ＰＤ
Ｃ遺伝子が導入されていることが確認された。なお、本
株は平成８年８月２０日に工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託申請したが、「緑藻であるため」の理由に
より受託拒否された。

【００３９】

【表４】

【００４０】

【表５】

【００４１】〔１１〕ＰＤＣ遺伝子導入クラミドモナス
によるアルコール製造：上記〔１０〕で得たクラミドモ
ナス・ラインハルディーＣＷ１５ｎｉｔ１−３０５（Ch
lamydomonas reinhardii CW15nit1-305 ）のプラスミド
pＣＲＰＤＣ１による形質転換体を、２５℃、蛍光燈照
明下 (15000lux) で、ＳＧII培養液中で５０ml/ 分０．
５％ＣＯ₂含有空気通気培養した。対数増殖末期の培養
液１０００mlから得た藻体をユニバーサル緩衝液（Ｈ₃
ＰＯ₃−酢酸−ホウ酸−ＮａＯＨpＨ７．５）で洗浄し
た後、遠心沈殿法により濃縮し、乾燥藻体９０mg／mlの
藻体スラリー液試料とした。この試料１０mlを容量５０
mlの容器に入れ、窒素ガスを短時間スラリー液に注入し
て容器内の酸素を除去した後、密閉し暗黒条件下で２５
℃に保ちながら振とうし、エタノールの生成を行わせ
た。一方、形質転換を行わない通常のクラミドモナス・
ラインハルディーＣＷ１５ｎｉｔ１−３０５を用いて、
全く同一の条件でエタノールの生成を行なわせた。

【００４２】両者のエタノール生成工程中におけるスラ
リー液中のエタノール濃度の経時変化の状況を図６に示
す。図６中、実線は本発明の形質転換藻体スラリーを用
いた場合、破線は通常の藻体スラリーを用いた場合の結
果を示す。これより、通常のクラミドモナス藻体を用い
た場合には、4500mg／リットル程度のエタノール濃度に
とどまったのに対し、形質転換クラミドモナス藻体を用
いた場合のエタノール濃度は、5500mg／リットルに達
し、ＰＤＣ遺伝子の藻体細胞への導入によってエタノー
ルの生産が高められることがわかった。

【００４３】

【発明の効果】本発明により、微細藻クラミドモナスの
細胞内蓄積多糖類のエタノールへの変換率を向上させる
機能を有するＰＤＣ遺伝子ＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する
組換えベクター、該ＤＮＡ及びこれの発現調節機能を有
するプラスミドを導入した大腸菌から得られるプラスミ
ドが提供された。また、本発明ＤＮＡを導入することに
より、細胞内蓄積多糖のエタノールへの変換率が向上し
た形質転換微細藻が提供された。更に、この形質転換微
細藻を用いることにより、従来よりも効率良くエタノー
ルを生産する方法が提供された。

【００４４】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：５８０配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源：クラミドモナス・ラインハルディー (Chlamydomo
nas reinhardii) 配列： Met Ala Thr Thr Val Ser Pro Ala Asp Ala Asn Leu Gly Leu His Ile 5 10 15 Ala Asn Arg Leu Val Glu Ile Gly Cys Thr Ser Cys Phe Ala Val Pro 20 25 30 Gly Glu Phe Asn Leu Leu Leu Leu Asp Gln Leu Leu Lys Gln Pro Glu 35 40 45 Leu Ser Leu Val Trp Cys Cys Asn Glu Leu Asn Ala Gly Tyr Ala Ala 50 55 60 Asp Gly Tyr Ala Arg Lys Arg Gly Val Gly Cys Leu Cys Val Thr Phe 65 70 75 80 Cys Val Gly Gly Phe Ser Ala Leu Asn Ala Val Gly Gly Ala Tyr Ser 85 90 95 Glu Asp Leu Pro Leu Ile Val Ile Ser Gly Gly Pro Asn Ser Gln Asp 100 105 110 His Ala Ser Asn Arg Ile Leu His His Thr Thr Gly Ala Asn Glu Tyr 115 120 125 Gly Gln Gln Leu Arg Ala Phe Arg Glu Val Thr Cys Cys Gln Val Val 130 135 140 Ile Gln His Ile Glu Asp Ala His Met Leu Leu Asp Thr Ala Ile Ser 145 150 155 160 Glu Ala Met Leu Lys Arg Lys Pro Val Tyr Ile Glu Val Ala Cys Asn 165 170 175 Leu Ala Asp Leu Thr His Pro Ser Phe Ala Arg Pro Pro Val Pro Tyr 180 185 190 Ala Leu Ala Ser Ser His Thr Asn Ala Ala Ser Leu Glu Ala Ala Val 195 200 205 Glu Ala Ala Val Glu Trp Leu Gly Gly Gly Val Lys Pro Leu Leu Leu 210 215 220 Ala Gly Val Arg Thr Arg Pro Pro Ala Ala Arg Lys Ala Met Leu Ala 225 230 235 240 Leu Ala Glu Ala Ser Arg Tyr Pro Val Ala Val Met Pro Asp Ala Lys 245 250 255 Gly Met Phe Pro Glu Asp His Glu Gln Tyr Ile Gly Met Tyr Trp Gly 260 265 270 Pro Val Ser Thr Pro Cys Val Cys Glu Val Val Glu Ser Ser Asp Ile 275 280 285 Val Leu Cys Val Gly Gly Val Trp Thr Asp Tyr Ser Thr Ala Gly Tyr 290 295 300 Ser Leu Leu Leu Lys Pro Glu Lys Met Leu Arg Val Asp Asn Asn Arg 305 310 315 320 Val Thr Leu Gly Asn Gly Pro Thr Phe Gly Cys Ile Val Met Thr Asp 325 330 335 Phe Leu Glu Ala Leu Ala Lys Arg Val Ala Pro Asn Asp Thr Gly His 340 345 350 Val Ile Tyr Lys Arg Met Ala Leu Pro Pro Ser Glu Pro Pro Pro Gln 355 360 365 Ala Glu Gly Glu Leu Leu Arg Thr Asn Val Leu Phe Lys His Ile Gln 370 375 380 His Met leu Thr Pro Ser Thr Ser Leu Ile Ser Glu Val Gly Asp Ser 385 390 395 400 Trp Phe Asn Thr Leu Lys Leu Lys Leu Pro Ala Gly Cys Glu Tyr Glu 405 410 415 Leu Gln Met Arg Tyr Gly Ser Ile Gly Trp Ser Val Gly Ala Val Leu 420 425 430 Gly Tyr Gly Val Ala Glu Arg Gln Thr Ala Pro Asp Arg Arg Val Val 435 440 445 Ala Cys Ile Gly Asp Gly Ser Phe Gln Met Thr Ala Gln Glu Val Ser 450 455 460 Thr Met Leu Arg Tyr Gly Leu Asp Pro Ile Ile Phe Leu Ile Asn Asn 465 470 475 480 Gly Gly Tyr Thr Ile Glu Val Glu Ile His Asp Gly Pro Tyr Asn Val 485 490 495 Ile Lys Asn Trp Asp Tyr Pro Gly Met Val Arg Ala Leu His Asn Gly 500 505 510 Gln Gly Lys Leu Trp Thr Ala Glu Ala Arg Thr Glu Pro Glu Leu Gln 515 520 525 Ala Ala Val Ala Glu Ala Val Gln Arg Arg Gly Glu Leu Cys Phe Ile 530 535 540 Met Val Val Thr His Arg Asp Asp Cys Ser Lys Glu Leu Leu Glu Trp 545 550 555 560 Gly Ser Arg Val Ala Ala Ala Asn Ser Arg Lys Pro Pro Thr Thr Gly 565 570 575 Tyr Gly Gly His 580

【００４５】配列番号：２配列の長さ：１７４３配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）起源：クラミドモナス・ラインハルディー(Chlamydomon
as reinhardii) 配列： ATG GCC ACC ACC GTG TCG CCC GCA GAC GCC AAC CTC GGC CTG CAC ATT 48 GCC AAC CGG CTT GTT GAG ATC GGC TGC ACC AGC TGC TTC GCG GTG CCC 96 GGC GAA TTC AAC CTG CTG CTG CTG GAC CAG CTG CTC AAG CAG CCC GAG 144 CTG TCC CTG GTG TGG TGC TGC AAC GAG CTG AAT GCG GGC TAC GCG GCG 192 GAC GGC TAC GCC CGC AAG CGC GGC GTG GGC TGC CTG TGC GTG ACC TTC 240 TGT GTG GGA GGC TTC TCC GCC CTG AAC GCT GTG GGC GGT GCC TAC AGT 288 GAG GAC CTG CCG CTC ATC GTC ATC AGC GGG GGG CCC AAC TCG CAG GAC 336 CAC GCC TCC AAC CGC ATC CTG CAC CAC ACC ACG GGC GCC AAC GAG TAC 384 GGC CAG CAG CTG CGC GCC TTC AGG GAG GTG ACC TGC TGC CAG GTG GTC 432 ATC CAG CAC ATC GAG GAC GCG CAC ATG CTG CTG GAT ACG GCC ATC AGT 480 GAG GCG ATG CTG AAG CGC AAG CCC GTG TAC ATC GAG GTG GCA TGC AAC 528 CTG GCG GAC CTG ACC CAC CCC AGC TTC GCC CGC CCC CCG GTG CCG TAC 576 GCG CTG GCC TCC TCC CAC ACC AAC GCC GCC AGC CTG GAG GCC GCG GTG 624 GAG GCG GCG GTG GAG TGG CTG GGC GGT GGC GTG AAG CCG CTG CTG CTG 672 GCG GGC GTG CGC ACG CGC CCG CCC GCC GCG CGC AAG GCG ATG CTG GCC 720 CTG GCG GAG GCC AGC CGC TAC CCC GTG GCC GTG ATG CCG GAC GCC AAG 768 GGC ATG TTC CCC GAG GAC CAC GAG CAG TAC ATC GGC ATG TAC TGG GGC 816 CCG GTG TCC ACG CCG TGT GTG TGC GAG GTG GTG GAG AGC AGC GAC ATC 864 GTG CTG TGC GTG GGA GGA GTG TGG ACG GAC TAC TCC ACT GCC GGC TAC 912 TCG CTG CTG CTC AAG CCC GAG AAG ATG CTG CGC GTG GAC AAC AAC CGC 960 GTC ACA TTG GGC AAC GGA CCG ACG TTT GGC TGC ATC GTG ATG ACC GAC 1008 TTC CTG GAG GCC CTG GCC AAG CGG GTG GCG CCC AAC GAC ACC GGC CAC 1056 GTC ATC TAC AAG CGC ATG GCT CTG CCG CCC TCG GAG CCG CCG CCG CAG 1104 GCC GAG GGC GAA CTG CTG CGC ACC AAC GTG CTG TTC AAA CAC ATC CAG 1152 CAC ATG CTG ACT CCC TCC ACC AGC CTC ATC AGC GAG GTG GGC GAC TCC 1200 TGG TTC AAC ACA CTC AAG CTC AAG CTG CCC GCC GGC TGC GAG TAC GAG 1248 CTG CAG ATG CGC TAC GGC TCC ATT GGC TGG AGT GTG GGC GCG GTG CTG 1296 GGC TAC GGC GTG GCG GAG CGG CAG ACG GCG CCC GAC CGC CGC GTG GTG 1344 GCG TGC ATC GGC GAC GGC TCC TTC CAG ATG ACC GCA CAG GAG GTG AGC 1392 ACC ATG CTG CGC TAC GGC CTG GAC CCC ATC ATC TTC CTC ATC AAC AAC 1440 GGC GGC TAC ACC ATC GAG GTG GAG ATC CAC GAC GGC CCC TAC AAC GTG 1488 ATC AAG AAC TGG GAC TAC CCC GGT ATG GTG CGC GCG CTG CAC AAC GGC 1536 CAG GGC AAG CTG TGG ACC GCC GAG GCC CGC ACC GAG CCC GAG CTG CAG 1584 GCC GCC GTG GCC GAG GCT GTG CAG CGG CGC GGC GAG CTG TGC TTC ATC 1632 ATG GTG GTG ACT CAC CGT GAC GAC TGC AGC AAG GAG CTG CTG GAG TGG 1680 GGC AGC CGC GTG GCG GCG GCC AAC AGC CGC AAG CCG CCC ACC ACC GGC 1728 TAC GGC GGC CAC TGA 1743

【００４６】配列番号：３配列の長さ：１５４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成配列： ACG CTC GGA TAC CCCAGGGC CCAAGGACAA GCGCTGTCAT CTCTGCATCG GCGACGGAAG 60 CTTCCAGATG ACGGCGCAGG ACGTGTCGAC GATGCTGCGC TGCGGGCAGA AGAGCATCAT 120 CTTCCTCATC AACAACGGCG GGTACACCAT CGAG 154

【００４７】配列番号：４配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成配列： CTCGATGGTG TACCCGCCGT T 21

【００４８】配列番号：５配列の長さ：１３５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成配列： AAC CTG GCG GAC CTGACCCA CCCCAGCTTC GCCCGCCCCC CGGTGCCGTA CGCGCTGGCC 60 TCCTCCCACA CCAACGCCGC CAGCCTGGAG GCCGCGGTGG AGGCGGCGGT GGAGTGGCTG 120 GGCGGTGGCG TGAAG 135

【００４９】配列番号：６配列の長さ：９７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成配列： CACCCGTCGT GGATCTCCAC CTCGATGGTG TAGCCGCCGT TGTTGATGAG GAAGATGATG 60 GGGTCCAGGC CGTAGCGCAG CATGGTGCTC ACCTCCT 97

【００５０】配列番号：７配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成配列： CTTCACGCCA CCGCCCAGCC ACTCCA 26

【００５１】配列番号：８配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成配列： AG GAG GTG AGC ACCATGCTG CG 22

【００５２】配列番号：９配列の長さ：１９７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成配列： AATTACGTCA GCACGGAATG CATCACGCCT GCAAGCGCGC TCGAAGGCTC GAAGTCGGCA 60 TCGTACAGCC CCATTCCGGG GCGGGGGAGT GCTTATAAGC AACGGCGCCC GATTTGCCAG 120 GCATTCACAG CTCTGCTTTT ACTCCCCTTA ACCTTACATT ATCATCCCAG TTGGGACGCG 180 GGTCATTACC CCTCGCG 197

【００５３】配列番号：１０配列の長さ：１９７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成配列： GAGGGGTAAT GACCCGCGTC CCAACTGGGA TGATAATGTA AGGTTAAGGG GAGTAAAAGC 60 AGAGCTGTGA ATGCCTGGCA AATCGGGCGC CGTTGCTTAT AAGCACTCCC CCGCCCCGGA 120 ATGGGGCTGT ACGATGCCGA CTTCGAGCCT TCGAGCGCGC TTGCAGGCGT GATGCATTCC 180 GTGCTGACGT AATTGC 197

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＤＮＡ配列の部分を含むプラスミド
pＣＲＦ4100のプラスミド地図を示す図である。

【図２】本発明のＤＮＡ配列の部分を含むプラスミド
pＣＲＦ3400のプラスミド地図を示す図である。

【図３】本発明のＤＮＡ配列の部分を含むプラスミド
pＣＲＦ5100のプラスミド地図を示す図である。

【図４】遺伝子発現制御配列と、本発明のＤＮＡ配列
の部分を含むプラスミドpCRP3600のプラスミド地図を示
す図である。

【図５】遺伝子発現制御配列と、本発明のＤＮＡ配列
を部分を含むプラスミドpCRPDC1 のプラスミド地図を示
す図である。

【図６】本発明のＤＮＡを導入した組換え藻類細胞に
よるエタノール生成工程中におけるスラリー液中のエタ
ノール濃度の経時変化を示す図である。図中、実線は形
質転換藻体スラリーを用いた場合、破線は対照として通
常の藻体スラリーを用いた場合の結果を示す。

【図７】ピルビン酸の代謝経路の一部を説明する模式
図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/12 Ｃ１２Ｒ 1:89） (Ｃ１２Ｐ 7/06 Ｃ１２Ｒ 1:89）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配
列をコードするピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子。
【請求項２】配列表の配列番号２で示される塩基配列で
あるＤＮＡを有する請求項１記載のピルビン酸脱炭酸酵
素遺伝子。
【請求項３】宿主細胞にピルビン酸脱炭酸酵素活性を向
上させる配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を
コードするＤＮＡを含有し、かつ当該ＤＮＡの発現調節
を行う機能を有するＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項４】上記配列番号１で示されるアミノ酸配列を
コードするＤＮＡが配列表の配列番号２の塩基配列であ
ることを特徴とする請求項３記載の組換えベクター。
【請求項５】上記当該ＤＮＡの発現調節を行う機能を有
するＤＮＡが配列表の配列番号９及び配列番号１０のオ
リオヌクレオチドをアニールして得られた二重鎖ＤＮＡ
であることを特徴とする請求項３又は請求項４記載の組
換えベクター。
【請求項６】ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子をコードする
配列番号２のＤＮＡを、クラミドモナス由来のαチュブ
リン遺伝子のプロモータの下流に組み込んだ組換え体プ
ラスミドであって、プラスミド pＣＲＦ3600を制限酵素
ＢamH Ｉ，ＳplＩで二重切断した断片、プラスミド pＣ
ＲＦ4100を制限酵素ＮcoＩ, ＳplＩで二重切断した断
片、及びプラスミド pＣＲＦ5100を制限酵素ＢamH Ｉ，
ＮcoＩで二重切断した断片をＴ4 ＤＮＡリガーゼで結合
させ、大腸菌ＪＭ１０９株に導入した形質変換体（ＦＥ
ＲＭＰ−１５７９１）から得られるプラスミド pＣＲ
ＰＤＣ１。
【請求項７】微細藻類細胞を宿主細胞とし請求項３乃至
請求項６に記載の組換えベクターにより遺伝子導入され
てなるピルビン酸脱炭酸酵素活性の向上した組換え微細
藻類細胞。
【請求項８】上記宿主細胞がクラミドモナス属に属する
藻類細胞であることを特徴とする請求項７記載の組換え
微細藻類細胞。
【請求項９】宿主細胞にピルビン酸脱炭酸酵素活性を向
上させる配列表の配列番号１で示されるアミノ酸をコー
ドするＤＮＡを含有し、かつ当該ＤＮＡの発現調節を行
う機能を有するＤＮＡを含有する組換えベクターにより
遺伝子導入されたピルビン酸脱炭酸酵素活性の向上した
組換え微細藻細胞を培地で培養し、該細胞内の代謝反応
によりエタノールを生産させることを特徴とするエタノ
ールの製造方法。
【請求項１０】宿主細胞にピルビン酸脱炭酸酵素活性を
向上させる配列表の配列番号１で示されるアミノ酸をコ
ードするＤＮＡを含有し、かつ当該ＤＮＡの発現調節を
行う機能を有するＤＮＡを含有する組換えベクターによ
り遺伝子導入されたピルビン酸脱炭酸酵素活性の向上し
た組換え微細藻細胞を培地で培養し、該細胞内の代謝反
応により蓄積した多糖類からエタノールを生産させるこ
とを特徴とするエタノールの製造方法。
【請求項１１】配列表の配列番号１で示されるアミノ酸
をコードするＤＮＡが配列番号２で示されるものである
ことを特徴とする請求項９又は請求項１０記載のエタノ
ールの製造方法。
【請求項１２】上記組換えベクターが形質転換体（ＦＥ
ＲＭＰ−１５７９１）から得られるプラスミド pＣＲ
ＰＤＣ１であることを特徴とする請求項９又は請求項１
０に記載のエタノールの製造方法。
【請求項１３】上記宿主細胞がクラミドモナス属に属す
る藻類細胞であることを特徴とする請求項９乃至請求項
１２のいずれかに記載のエタノールの製造方法。