HU179727B - Process for producing water-insoluble enzyme composition - Google Patents
Process for producing water-insoluble enzyme composition Download PDFInfo
- Publication number
- HU179727B HU179727B HU78KA1505A HUKA001505A HU179727B HU 179727 B HU179727 B HU 179727B HU 78KA1505 A HU78KA1505 A HU 78KA1505A HU KA001505 A HUKA001505 A HU KA001505A HU 179727 B HU179727 B HU 179727B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- enzyme
- carrier
- activity
- process according
- solution
- Prior art date
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims description 94
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims description 94
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 16
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 93
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 46
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 26
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 claims description 16
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 14
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 claims description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 claims description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 5
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 5
- KKCBUQHMOMHUOY-UHFFFAOYSA-N sodium oxide Chemical compound [O-2].[Na+].[Na+] KKCBUQHMOMHUOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910001948 sodium oxide Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 4
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 20
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 19
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 11
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 4
- DLYUQMMRRRQYAE-UHFFFAOYSA-N tetraphosphorus decaoxide Chemical compound O1P(O2)(=O)OP3(=O)OP1(=O)OP2(=O)O3 DLYUQMMRRRQYAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical compound [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004115 Sodium Silicate Substances 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 3
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 description 3
- NTHWMYGWWRZVTN-UHFFFAOYSA-N sodium silicate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Si]([O-])=O NTHWMYGWWRZVTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052911 sodium silicate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N Iron oxide Chemical compound [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N Zirconium dioxide Chemical compound O=[Zr]=O MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKUAXEQHGKSLHN-UHFFFAOYSA-N [C].[N] Chemical compound [C].[N] CKUAXEQHGKSLHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- FYSNRJHAOHDILO-UHFFFAOYSA-N thionyl chloride Chemical compound ClS(Cl)=O FYSNRJHAOHDILO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 γ-aminopropyltriethoxysilyl Chemical group 0.000 description 2
- WDMUXYQIMRDWRC-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3,4-dinitrobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C([N+]([O-])=O)=C1O WDMUXYQIMRDWRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N Alumina Chemical class [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 150000003973 alkyl amines Chemical group 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 230000008094 contradictory effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N cyanuric chloride Chemical compound ClC1=NC(Cl)=NC(Cl)=N1 MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 108010042194 dextransucrase Proteins 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229910000480 nickel oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- GNRSAWUEBMWBQH-UHFFFAOYSA-N oxonickel Chemical compound [Ni]=O GNRSAWUEBMWBQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000002444 silanisation Methods 0.000 description 1
- 150000004760 silicates Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N sulfuryl dichloride Chemical compound ClS(Cl)(=O)=O YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OGIDPMRJRNCKJF-UHFFFAOYSA-N titanium oxide Inorganic materials [Ti]=O OGIDPMRJRNCKJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás vízben oldhatatlan enzimkcszítmény előállítására.
Ismeretes, hogy enzimek szerves vagy szervetlen hordozóanyagokhoz kötve immobilizálhatók, azaz vízben oldhatatlanná tehetők. Ezáltal az enzimek ismételten felhasználhatókká és folyamatos üzemű eljárásokban alkalmazhatókká válnak.
A hordozóanyagként felhasznált szerves anyagok [például cellulóz: Biochem, J. 107 (1968), 669; nylon: Biochim. Biophys. Acta 220 (1970), 343; poliakrilamid: Sciencc 142 (1963), 678] közös hátránya, hogy mechanikai stabilitásuk nem kielégítő, egyes oldószerek hatásának nem állnak ellen, a közeg pH-jának és ionerősségénck változására érzékenyek, sőt egyes képviselőik mikroba* fertőződésre is hajlamosak, amelynek eredményeként a megkötött enzim leoldódhat a hordozóanyagról.
A fentiek figyelembevételével hordozóanyagként szervetlen anyagok alkalmazását javasolták, amelyekre az enzimek adszorpcióval (2 717 852 sz. USA szabadalmi leírás) vagy kovalens kötés útján (3 519 538 sz. USA szabadalmi leírás) rögzíthetők. Az enzim felvitelének legelőnyösebb módja minden esetben az enzim típusától és felhasználási körülményeitől, valamint a hordozóanyag minőségétől függ. Abban az esetben például, ha a szubsztrátum tömény sóoldatban van jelen, az adszorpciós felviteli mód nem alkalmazható, mert az enzim deszorpció révén eltávozhat a hordozóanyagról. Ekkor az enzimet előnyösen kovalens kötéssel rögzítik a hordozóanyagon. Ennek érdekében a hordozóanyag felületének specifikus rcakcióképes csoportokat kell tartal2 maznia, amelyek az enzimmel kovalens kémiai kötést képeznek. Minthogy a legtöbb esetben a hordozóanyag eredeti állapotában nem tartalmazza a szükséges reakcióképes csoportokat, az enzim felvitele előtt a hordozó5 anyag felületét előkezelésnek kell alávetni. Egy ismert módszer szerint például a szervetlen anyagokat szignókkal kezelik, és így a hordozóanyag felületén rcakcióképes szerves funkcionális csoportokat (például alkilamin-maradékokat) alakítanak ki, amelyek szerves 10 anyagokkal kovalens kémiai kötést képeznek (1 944 418 sz. NSZK-beli közzétett szabadalmi bejelentés, DAS). Egy másik ismert módszer szerint a szervetlen hordozóanyagot az enzim felvitele előtt szulfurilkloriddal, tionilkloriddal vagy cianurkloríddal kezelik. Ismert az is, 15 hogy a hordozóanyag felületére szabad rcakcióképes csoportokat tartalmazó, vízben oldhatatlan polimer bevonat (például a monomer-molekulák számára vonatkoztatva 10—70% szabad aldehid-csoportot tartalmazó poliakroleinből álló bevonat) vihető fel (3 821 083 sz. 20 USA szabadalmi leírás).
Szervetlen hordozóanyagként alumíniumoxidok, nikkeloxid, vasoxid, titánoxid, cirkóniumoxid, hidroxiapatit, szilikátok és porózus üvegek alkalmazását javasolták. (Tmmobilized Enzymes, Antigens, Antibodies and 25 Peptides: Preparation and Characterization, kiadó: Howard H. Weetall, New York, 1975, 41 -44. oldal.) Valamennyi javaslat megegyezik abban, hogy a hordozóanyag pórusszerkezetének lehetővé kell tennie az enzim és a szubsztrátum behatolását a belső felülethez; a hor30 dozóanyag további kívánt jellemzőiről, így például az
197727 optimális póruseloszlásról és a felület nagyságáról azonban nagymértékben eltérő és ellentmondó adatok állnak rendelkezésünkre.
Az alkalmazott felviteli módoktól függetlenül eddig még egyik ismert hordozóanyagon sem sikerük az enzimeket úgy immobilizálni, hogy azok specifikus aktivitása immobílizák állapotban megközelítse a szabad enzimek specifikus aktivitását. D. L. Latigue adatai szerint (Immobilized Enzymes fór Industrial Reactors, London, 1975, 127. oldal) a legkedvezőbb immobilizációs körülmények között is a hordozóanyagra felvitt enzim legföljebb 80%-a van aktív állapotban jelen.
A találmány értelmében a vízben oldhatatlan enzimkészítmények előállítására alkalmazott, önmagában ismert eljárást, amelynek során egy kovalens kötések kialakítására alkalmas, reakcióképes csoportokat hordozó szervetlen hordozóanyagot enzimoldattal hoznak érintkezésbe, oly módon kívánjuk tökéletesíteni, hogy minimális enzimfelhasználás mellett maximális aktivitással rendelkező enzimkészítményekhez jussunk.
Találmányunk tárgya eljárás vízben oldhatatlan enzimkészítmények előállítására, valamely enzim kovalens megkötésére alkalmas funkciós csoportokat tartalmazó szervetlen hordozóanyag és valamely enzim-oldat érintkezésbe hozása, az enzimnek a hordozón önmagában ismert eljárással történő megkötése és a kapott enzimkészítmények elkülönítése útján, oly módon, hogy először a leggyakoribb pórusátmérőben különböző hordozókat az enzim-koncentrációban különböző enzimoldatokkal hozunk érintkezésbe, az enzimet a hordozón megkötjük, az enzimkészítményeket izoláljuk, aktivitásukat meghatározzuk, és a felhasznált különböző hordozók közül azzal a leggyakoribb pórusátmérővel rendelkező hordozót választjuk ki, mely a rajta megkötött enzimmennyiség ellenére a legnagyobb aktivitású készítményt biztosítja, majd a kiválasztott hordozóanyagot enzimtartalmukban különböző enzim-oldatokkal hozzuk érintkezésbe, az enzimet a hordozón megkötjük, az enzimkészltményeket izoláljuk, aktivitásukat és fajlagos aktivitásukat meghatározzuk, és a felhasznált különböző enzim-oldatok közül azt az enzim-oldatot választjuk ki, mely a legnagyobb aktivitású és az enzim szabad állapotban mért fajlagos aktivitásához közelesö vagy azzal azonos fajlagos aktivitású készítményt biztosítja.
A találmány értelmében hordozóanyagként olyan leggyakoribb pórusátmérővcl rendelkező szervetlen anyagot alkalmazunk, amely a megkötött enzimmcnnyiscgtől függetlenül maximális aktivitású enzimkészítményt szolgáltat, és ezt a hordozóanyagot olyan enzimoldattal hozzuk érintkezésbe, amely csupán annyi enzimet tartalmaz, hogy az így kialakult készítmény specifikus enzimaktivitása elérje vagy megközelítse az enzim szabad állapotban meghatározott specifikus aktivitását.
A találmány szerint először különböző leggyakoribb pórusátmérővel rendelkező hordozóanyagokat ismert módon olyan kapcsolószerekkel kezelünk, amelyek egyrészt megfelelő szilárdsággal kapcsolódnak a hordozóanyaghoz, másrészt pedig alkalmasak arra, hogy az enzimmel kovalens kötést képezzenek. A kapcsolószert előnyösen kovalens kötés kialakításával rögzítjük a hordozóanyagon. E tekintetben különösen előnyösnek bizonyult a szervetlen hordozóanyagok szilánozása, kapcsolószerként azonban — miként már említettük — egyéb anyagokat is felhasználhatunk. A hordozóanyagnak kellően nagy számú kapcsoló tagot kell tartalmazo riia; a felvihető kapcsoló tagok száma nagymértékben függ a hordozóanyag felületi jellemzőitől.
A fentiek szerint előkezelt hordozóanyagokat ezután változó mennyiségű enzimmel (azaz változó koncentrációjú enzimoldatokkal) hozzuk érintkezésbe, és az enzimet ismert módon, kovalens kötés kialakítása révén a kapcsoló tagokhoz (és ezzel a hordozóanyaghoz) rögzítjük. E kísérletsorozat végén meghatározzuk a kapott enzimkészítmények aktivitását. Az eredmények azt mutatják, hogy az enzimkészítmények aktivitása — a megkötött enzimmcnnyiscgtől függetlenül — a leggyakoribb pórusátmcrőtől függően változik, és az aktivitás/leggyakoribb pórusátmérő görbe maximumon megy keresztül. Az eredmények azt is igazolják, hogy a maximum helyzete független a hordozóanyag szemcseméretétől ; a hordozóanyag szemcsemérete csupán a maximum abszolút értékét befolyásolja. A hordozóanyag szemcsemérete tehát alárendelt jelentőségű tényező, és ténylegesen alkalmazandó értékét elsősorban egyéb körülmények, így az enzim felhasználási területe, a szubsztrátum viszkozitása, az eljárásmód és hasonlók szabják meg.
A leggyakoribb pórusátmérő szempontjából értékelt és optimálisnak bizonyult hordozóanyagokat ezután változó mennyiségű enzimmel hozzuk érintkezésbe, és vizsgáljuk az enzimkoncentráció és az aktivitás összefüggését. E vizsgálatok alapján megállapítható, hogy meghatározott enzimkoncentrációk alkalmazásakor olyan enzimkészítményekhez jutunk, amelyek specifikus enzimaktivitása eléri vagy megközelíti az enzim szabad állapotban mért aktivitását, azaz relatív aktivitásuk 100% vagy ahhoz közel eső érték.
A találmány értelmében optimális tulajdonságokkal rendelkező szilíciumdioxid-gél-alapú hordozóanyagokat alakíthatunk ki úgy, hogy a gél nátriumoxidban kifejezett és száraz anyagra vonatkoztatott alkálitartalmát 0,1—0,5 súly% értékre állítjuk be, a gélt szárítjuk, majd 400—850 C°-os, előnyösen 570—750 C°-os vízgöztartalmú levegőáramban 5—10 órán át hevítjük.
A gélt előnyösen vízgőzzel telített levegőben, 180— 200. C°-on szárítjuk. A gél hevítésekor célszerűen 40— 80% relatív nedvességtartalmú levegőáramot használunk fel.
A fentiek szerint előállított hordozóanyag leggyakoribb pórusátméröje 175 A és 3000 Á közötti, előnyösen 250 A és 600 A közötti, kiemelkedően előnyösen 340 A körüli érték.
A találmány szerinti immobilizációs eljárást az összes technikai és analitikai szempontból jelentős enzim rögzítésére alkalmazhatjuk. A felhasználható enzimek közül példaként a következőket említjük meg: hidrolázok (így amilázok, glükozidázok és protcázok), oxidoreduktázok (így glükóz-oxidáz és kataláz), izomerázok (így glükóz-izomeráz) és transzferázok (így dextrán-szacharáz).
Abban az esetben, ha enzimként szabad állapotban 10—15 egység/mg specifikus aktivitással rendelkező amiloglükozidázt használunk fel, akkor jutunk optimális tulajdonságokkal rendelkező enzimkészítményekhez, ha az optimális leggyakoribb pórusátmérővcl rendelkező hordozóanyagot olyan enzimoldattal hozzuk érintkezésbe, amely 1 g hordozóanyagra vonatkoztatva 25—75 mg, előnyösen 50 mg amiloglükozidázt tartalmaz.
Szabad állapotban 50—70 egység/mg specifikus aktivitással rendelkező glükóz-izomeráz felhasználásakor úgy alakíthatunk ki optimális tulajdonságokkal rendelkező enzimkészltményeket, ha az optimális leggyakoribb pórusátmérővel rendelkező hordozóanyagot olyan enzimoldattal hozzuk érintkezésbe, amely 1 g hordozóanyagra vonatkoztatva 20—50 mg, előnyösen 25 mg glükóz-izomerázt tartalmaz.
A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük.
1. példa
A hordozóanyagot a következőképpen állítjuk elő: Nátriumszilikát-oldatból kénsawal kicsapott, 0,3 súly% nátriumoxidot tartalmazó szilíciumdioxid-gélt vízgőzzel telített levegőben 3 órán át 180 C3-on szárítunk. 1 kg így kapott anyagot 2 1/perc sebességű, 80%-os relatív páratartalmú levegőáramban 6 órán át 730 C°-on hevítünk. Az így kapott hordozóanyag (1. hordozóanyag) leggyakoribb pórusátmérője 1400 Á. Az 1. hordozóanyagot szitáljuk, és a következő műveleteket a szitálással elkülönített, 0,25 -0,5 mm szemcseméretű frakcióval hajtjuk végre.
150 g, a fentiek szerint előállított hordozóanyag-frakcióhoz 4 liter 10%-os benzolos γ-amino-propil-trietcxiszilárL-oIdatot adunk, ésazelegyet8 órán át visszafolyatás közben forraljuk. Lehűlés után a szilárd anyagot 3 x 1000 ml benzollal és 3 x 1000 ml acetonnal mossuk. Az oldószert szobahőmérsékleten, vákuumban lepároljuk, és a kapott hordozóanyagot 0,05 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH=7) kétszer, majd kétszer desztillált vízzel háromszor mossuk. A hordozóanyagot vákuumban foszforpentoxid fölött szárítjuk. A szén- és nitrogéntartalom meghatározásakor kapott átlagértékek szerint az 1. hordozóanyag 0,13 mólekvivalens/g szilánt tartalmaz. z g, a fentiek szerint előállított hordozóanyagot 1 g amiloglükozidázt (Merek 1330) tartalmazó 20 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldatban (pH=7) szuszpendálunk. A felhasznált amiloglukozidáz aktivitása 11,75 egység/mg (1 egység=az enzim 1 perc alatt 25 C’-on 1 uniói glükózt fejleszt). A szuszpenziót 20 percig vákuumban tartjuk, majd ismét levegőztetjük, és 2 óra elteltével újabb 20 percre vákuum alá helyezzük. 4 óra elteltével a hordozóanyagot kiszűrjük, kétszer desztillált vízzel háromszor, majd 0,01 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH=5) háromszor mossuk, végül a kapott mintát (1.1. minta) 4 C'-on foszfátpuffer-oldatban (pH—5) tároljuk. Szén- és nitrogénelemzés alapján a minta fehérjetartalma 16,5 mg/g.
g, a korábbiakban ismertetett módon szilánozott
1. hordozóanyagot 0,5 g amiloglükozidáz (Merch 1330) 20 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH=7) készített oldatában szuszpendálunk. A szuszpenziót az 1.1. minta előállításánál ismertetett módon dolgozzuk fel. Az így kapott minta (1.2. minta) szén- és nitrogénelemzés alapján 9,0 mg/g fehérjét tartalmaz.
2. példa
A hordozóanyagot a következőképpen állítjuk elő: nátriumszilikát-oldatból kénsavval kicsapott, 0,3 súly% nátriumoxidot tartalmazó szilíciumdioxid-gélt az 1. példában ismertetett módon szárítunk. 1 kg így kapott anyagot 2 1/perc sebességű, 80% relatív páratartalmú levegőáramban 6 órán át 680 Cc-on hevítünk. A kapott hordozóanyag (2. hordozóanyag) leggyakoribb pórusátmérője 340 A. A 2. hordozóanyagot szitáljuk, és a következő műveleteket a szitálással elkülönített, 0,25— 0,5 mm szemcseméretű frakcióval végezzük.
150 g, a fentiek szerint kapott hordozóanyag-frakcióhoz 4 liter 10%-os benzolos γ-amino-propil-trictoxiszilán-oldatot adunk, és az elegyet az 1. példában közöltek szerint kezeljük. Á kapott 2. hordozóanyag a szenes nitrogénelemzés átlagértékei alapján grammonként 0,19 mólekvivalens szilánt tartalmaz.
g, a fentiek szerint előállított hordozóanyagot 1 g amiloglukozidáz (Merek 1330) 20 ml, 0,05 mólos foszfátpufferoldattal (pH=7) készített oldatában szuszpéndálunk, és a szuszpenziót az 1. példában közöltek szerint kezeljük. A kapott 2.1. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 30,8 mg fehérjét tartalmaz.
g, a korábbiakban ismertetett módon szilánozott
2. hordozóanyagot 0,5 g amiloglukozidáz (Merek 1330) 20 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH=7) készített oldatában szuszpendálunk, majd a szuszpenziót az 1.2. minta előállításánál közöltek szerint kezeljük. A kapott
2.2. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 17,4 mg fehérjét tartalmaz.
3. példa
A 3. hordozóanyagot a következőképpen állítjuk elő: nátriumszilikát-oldatból kénsavval kicsapott, 0,3 súly% nátriumoxidot tartalmazó szilíciumdioxid-gélt az 1. példában ismertetett módon szárítunk. 1 kg így kapott anyagot 2 1/perc sebességű, 60% relatív páratartalmú levegőáramban 6 órán át 640 C°-on hevítünk. A kapott
3. hordozóanyag leggyakoribb pórusátmérője 180 A. A 3. hordozóanyagot szitáljuk, és a következő műveleteket a szitálással elkülönített, 0,25—0,5 mm szemcseméretű frakcióval végezzük.
150 g, a fentiek szerint kapott hordozóanyag-frakcióhoz 4 liter 10%-os benzolos γ-amino-propil-trietoxi-szilán-oldatot adunk, és az clcgyct az í. példában közöltek szerint kezeljük. A kapott 3. hordozóanyag a szén- és nitrogénelemzés átlagértékei alapján grammonként 0,51 mólekvivalens szilánt tartalmaz.
g, a fentiek szerint előállított hordozóanyagot 1 g amiloglükozidáz (Merek 1330) 20 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH=7) készített oldatában szuszpendálunk, és a szuszpenziót az 1. példában közöltek szerint kezeljük. A kapott 3.1. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 26,2 mg fehérjét tartalmaz.
g, a korábbiakban ismertetett módon szilánozott
3. hordozóanyagot 0,5 g amiloglükozidáz (Merek 1330) 20 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH=7) készített oldatában szuszpendálunk, és a szuszpenziót az 1. példában közöltek szerint kezeljük. A kapott 3.2. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 12,7 mg fehérjét tartalmaz.
4. példa
A 2. hordozóanyagból szitálással elkülönítjük a 0,25— 0,5 mm szemcseméretű frakciót. 50 g így elkülönített, 340 A leggyakoribb pórusátmérőjű hordozóanyag-frakciót 500 ml 12,5%-os vizes glutárdialdehid-oldathoz adunk, és az elegyet 5 percig szobahőmérsékleten, kever jük. Ezután azelegvhez 500 ml telített, vizes ammóniumklorid-oldatot adiink, és az elegye t 4 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután a szilárd anyagot leszűrjük, vízzel k lórid mentesre.- mossuk, és vákuumban foszforpentoxid fölött szárítjuk. 10 g így kapott hordozóanyagot 1 g amiloglükozidáz (Merek 1330) 20. ml 0,05 mqífls foszfátpuffer-oldattal (pH=7) készített oldatában szuszpendálunk, és a szuszpenziót az 1. példában közöltek szerint kezeljek.
Az így kapott 4.L minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 29,8 mg fehérjét tartalmaz.
További 10 g, az előzőek szer-int előkezelt 2. hordozóanyagot 0,5 g amiloglükozidá?. (Merek 1330) 20 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH—7) készített oldatában szuszpendálunk, és a szuszpenziót az 1. példában az 1.2. minta előállításánál közöltek szerint kezeljük. A kapott
4.2. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 17,9 mg fehérjét tartalmaz,
A 4.1. és 4.Λ mintával végzett kísérletek eredményei —τ amelyeket a későbbiekben ismertetünk — azt igazolják, hogy a kapcsolószer minősege semmiképpen nem befolyásolja az enzimkészítmeny aktivitását.
5. példa g 1. hordozóanyagot (leggyakoribb pórusátmérő: 1400 Á) 0,5 g gliikóz-izomcráz [Y. Takasaki: Agr. BióC Chem. 33, Nr. 11, 1527—1534 (1969)] 40 ml 0,05 mólos .foszfátpuffer-oldattal (pH =7) készített oldatában szuszpendálunk. A szuszpenziót 30 percig szobahőmérsékleten.tartjuk. A reakcióedényt 10 percenként evakuáljuk, majd a reakció lezajlása után az oldat maradékát leszívatjuk· A szilárd anyagot vízzel és 0,05 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH—7) háromszor mossuk. Az így kapott 5.1. minta szén-'és nitrogénelemzés alapján grammonként 4,8 mg fehérjét tartalmaz.
Az 5.2. minta előállítása során 10 g 1. hordozóanyagot 40 mj 0,05 mólos foszfátpuffer-oldatban (pH=7), amely 0,25 g glükóz-izomerázt tartalmaz, szuszpendálunk, majd a szuszpenziót az 5.1, minta előállításánál ismertetett módon kezeljük. A kapott. 5.2. minta szenes nitrogénelemzés alapján grammonként 2,0 mg fehérjét tartalmaz. ,
6. példa . 10 g 2. hordozóanyagot (leggyakoribb pórusátmérő: 340 Á) 0,5 g glükóz-izomerázt tartalmazó 40 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldatban (pH =7) szuszpendálunk. A szuszpenziót az 5. példában közöltek szerint kezeljük. Az így kapott 6.1. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 22,0 mg fehérjét tartalmaz.
A 6.2..minta előállítása során 10 g 2. hordozóanyagot 0,25 g glükóz-izomerázt tartalmazó 40 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldatban (pH^7) szuszpendálunk, majd a szuszpenziót az 5. példában közöltek szerint kezeljük. A kapott 6.2. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 10,2 mg fehérjét tartalmaz.
7. példa g 3. hordozóanyagot (leggyakoribb pórusátmérő: 180 Á) 0,5 g glükóz-izomerázt tartalmazó 40 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldatban (pH=7) szuszpendálunk, és a szuszpenziót az 5. példában közöltek szerint kezeljük. Az így kapott 7.1. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 11,2 mg fehérjét tartalmaz.
A 7.2. minta előállítása során 10 g 3. hordozóanyagot 0,25 g glükóz-izomerázt tartalmazó 40 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldatban (pH=7) szuszpendálunk, majd a szuszpenziót az 5.1. minta előállításánál ismertetett módon kezeljük. A kapott 7.2. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 5,1 mg fehérjét tartalmaz.
8. példa g, a 4. példában ismertetett hordozóanyagot (leggyakoribb pórusátmérő: 340 Á; vizes glutárdialdehidoldattal kezelt anyag) 0,5 g glükóz-izomerázt tartalmazó 40 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldatban (pH=7) szuszpendálunk, és a szuszpenziót az 5. példában közöltek szerint kezeljük. A kapott 8.1. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 21,3 mg fehérjét tartalmaz.
A 8.2. minta előállítása során 10 g, a fentiekben közölt minőségű hordozóanyagot 0,25 g glükóz-izomerázt tartalmazó 40 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldatban (pH= =7) szuszpendálunk, majd a szuszpenziót az 5.1. minta előállításánál megadottak szerint kezeljük. A 8.2· minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 9,8 mg fehérjét tartalmaz.
9. példa
Az 1—4. példában ismertetett 1.1., 1.2,, 2.1., 2.2., 3.1., 3.2., 4.1. és 4.2. minta, valamint a hordozóanyagon rögzített szabad enzim (amiloglükozidáz, Merek 1330) aktivitását dinitroszalicílsavas módszerrel határoztuk meg [Rick, V., Stcgbauer, ÍI. P.: Meth. d. Enzymatischcn Analyse (szerk.: Bergmeyer, H. U., kiadó: Verlag Chcrnie 1970), 848, és következő oldalak]. Egy aktivitási egységnek (U) azt az enzimmennyiséget tekintjük, amely az inkubálás körülményei között percenként 1 mikroekvivalens redukálandó csoportot (glükózt) szabadít fel.
Az inkubálást a következő körülmények között végeztük: 2%-os szubsztrátum-oldat (Zulkowsky-keményítő, Merek 1257); oldószer: 0,1 mólos acetát-puffcr (pH=5,0); hőmérséklet: 25 C°; reakcióidő: 30perc.
A hordozón rögzített enzimkészítményeket 40 ml-es reaktorba mértük be, és a szuszpenziót a fenti körülmények között 600/’perc sebességgel kevertük. A termék képződési sebessége független a keverés sebességétől.
Az enzimkészítmények fehérjetartalmát a szén- és nitrogénmeghatározáskor kapott átlagértékek alapján számítottuk ki. A hordozóanyagok leggyakoribb pórusátmérőjét a póruseloszlás vizsgálatakor kapott adatokból határoztuk meg. A póruseloszlást nagynyomású poroziméter felhasználásával határoztuk meg.
Az 1.1.—4.2. minta jellemző adatait az 1, táblázatban soroljuk fel. Az 1. táblázatban felsorolt rövidítések jelentése a következő:
| D: | leggyakoribb pórusátmérő, Á, |
| CE: | enzimfelvétel, mg enzim/g hordozó- |
| anyag, | |
| U: | aktivitás, egység/g minta, |
(=U/CE):
Us specifikus aktivitás, cgység/mg enzim,
USF: szabad állapotban észlelhető specifikus aktivitás, egység/mg enzim, n, flOOxLU
Ure): relatív aktivitás i = -I.
I USF I
1.táblázat
Rögzített amiloglükozidáz
| Minta száma | Aktivitási adatok | |||||
| D | cE | u | u. | USF | ||
| 1.1. | 1400 | 16,5 | . 98,4 | 5,96 | 51 | 11,75 |
| 1.2. | 9.0 | 100,5 | 11,16 | 95 | ||
| 2.1. | 340 | 30,8 | 208,8 | 6,77 | 58 | |
| 2.2. | 17,4 | 203,9 | 11,71 | 100 | ||
| 3.1. | 180 | 26,2 | 150,0 | 5,72 | 49 | |
| 3.2. | 12,7 | 149,5 | 11,77 | 100 | ||
| 4.1. | 340 | 29,8 | 199,7 | 6,70 | 57 | |
| 4.2. | 17,9 | 209,4 | 11,70 | 100 |
10. példa
Az 5—8. példában ismertetett 5.1., 5.2., 6.1., 6.2., 7.1., 7.2., 8.1. és 8.2. sz. minta, valamint a hordozóanyagon rögzített szabad enzim (glükcz-izomcráz) aktivitását Takasaki-módszenel határoztuk meg [lásd Y. Takasaki: Agr. Bioi. Chem. 30 (12), 1247—1253 (1966) és Z. Dische és E. Borenfreund: J. Bioi. Chem. 192, 583 (1951)]. Egy aktivitási egységnek (U) azt az enzimmennyiséget tekintjük, amely az inkubálás körülményei között 1 mgfruktózt képez.
Az inkubálást a következő körülmények között végeztük: hőmérséklet: 65 C3; reakcióidő: 1 óra; szubsztrátum: 0,1 mól glükózxH2O-t (Merek 8342) és 0,0004 mól niagnéziumszulfátot tartalmazó 0,05 mólos foszfátpuffer-oldat (pH—8,0).
A hordozóra felvitt enzimkészítményeket a 9. példában ismertetett módon, standard körülmények között keverős reaktorban szuszpendáltuk. A készítmények fehérje-tartalmát a szén- és nitrogénelemzés átlagértékei alapján számítottuk ki.
A vizsgálatok eredményeit a 2. táblázatban közöljük. A 2. táblázatban feltüntetett rövidítések jelentése azonos a 9. példában közöltekkel.
2. táblázat
Rögzített glükóz-izemeráz
| Minta száma | Aktivitási adatok | |||||
| D | CE | u | Us | urc] | uSF | |
| 5.1. | 1400 | 4,8 | 115,4 | 24,0 | 41 | 58,9 |
| 5.2. | 2,0 | 117,3 | 58,7 | 99 | ||
| 6.1. | 340 | 22,0 | 558,5 | 25,4 | 43 | |
| 6.2. | 10,2 | 556,1 | 54,5 | 93 | ||
| 7.1. | 180 | 11,2 | 291,0 | 26,0 | 44 | |
| 7.2. | 5,1 | 292,3 | 57,3 | 97 | ||
| 8.1. | 340 | 21,3 | 543,2 | 25,5 | 43 | |
| 8.2. | 9,8 | 544,0 | 55,5 | 94 |
A felsorolt adatok alapján a következőket állapíthatjuk meg:
1. A vizsgált minták aktivitása (U) maximumgörbe szerint változik; a maximum helyzete a hordozóanyag leggyakoribb pórusátmérőjétöl függ.
2. A minták specifikus aktivitása (IJJ az enzimfelvételtől függően változik, és meghatározott CE enzimkoncentráció esetén eléri az enzim szabad állapotban mért aktivitását (USF), azaz ebben az esetben Urel értéke 100%. E meghatározott crizimkoncentráció túllépésekor a minták specifikus aktivitása csökken, mimellett Us és Ch szorzata állandó érték marad.
3. A hordozó által felvett enzimmennyiség a leggyakoribb pórusátmérő függvényében változik. Az enzimből és hordozóanyagból kialakított rendszer maximális aktivitása a lehető legkisebb enzimkoncentráció alkalmazásakor jelentkezik ; ekkor az optimálisnak bizonyult, 340 Á leggyakoribb pórusátmérővel rendelkező 2. hordozó grammonként 17,4 mg amiloglükozidázt (2.2. minta), illetve grammonként 10,2 mg glükóz-izomerázt (6.2. minta) vesz fel.
4. A vizsgált minták cnzimfeivétclc és aktivitása független az alkalmazott kapcsolószer minőségétől.
Az enzimes műveletek gazdaságosságát jelentős mértékben befolyásolja a felhasznált enzim költsége, amely rendszerint eleve nagy, és a kívánt tisztasági fok növelésével igen nagy mértékben fokozódik. A találmány szerinti eljárás elsőként nyújt lehetőséget arra, hogy költséges enzimeket ipari méretekben is gazdaságosan alkalmazhassunk, a találmány szerinti eljárással ugyanis a maximális aktivitás eléréséhez szükséges enzimmennyiseget optimálj·'' értékre állíthatjuk be.
Claims (8)
1. Eljárás vízben oldhatatlan enzimkészítmények előállítására, valamely enzim kovalens megkötésére alkalmas funkciós csoportokat tartalmazó szervetlen hordozóanyag és valamely enzim-oldat érintkezésbe hozása, az enzimnek a hordozón önmagában ismert eljárással történő megkötése és a kapott enzimkészítmények elkülönítése útján azzal jellemezve, hogy a leggyakoribb pórusátmérőben egymástól különböző hordozókat az enzim-koncentrációban különböző enzim-oldatokkal hozunk érintkezésbe, az enzimet a hordozón megkötjük, az enzimkészítményeket izoláljuk, aktivitásukat meghatározzuk, és a felhasznált különböző hordozók közül azzal a leggyakoribb pórusátmérővel rendelkező hordozót választjuk ki, mely a rajta megkötött enzimmennyiségtöl függetlenül a legnagyobb aklivitású készítményt biztosítja, majd a kiválasztott hordozóanyagot enzimtartalmukban különböző enz’m-oldatokkal hozzuk érintkezésbe, az enzimet a hordozón megkötjük, az enzimkészítményeket izoláljuk, aktivitásukat és fajlagos aktivitásukat meghatározzuk és a felhasznált különböző enzim-oldatok közül azt az enzim-oldatot választjuk ki, mely a legnagyobb aktivitású és az enzim szabad állapotban mért fajlagos aktivitásához közel eső vagy azzal azonos fajlagos aktivitású készítményt biztosítja.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy hordozóanyagként nátriumoxidban kifejezve 0,1—0,5 súly% alkálitartalmú, szárított, majd 400 850 C;-os, előnyösen 570- 750 C°-os
II vízgőztartalmú levegőáramban 5—10 órán át hevített szilíciumdioxid-gélt használunk fel.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a gélt vízgőzzel telített levegőben 180— 200C°-on szárítjuk.
4. A 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a gélt 40—80% relatív nedvességtartalmú levegöáramban hevítjük.
5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy enzimként amiloglükozidázt használunk fel.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy szabad állapotban 10 — 15 egység/mg specifikus aktivitással rendelkező amiloglü kozidázt használunk fel, és a hordozóanyagot 1 g hordozóanyagra vonatkoztatva 25—75 mg, előnyösen 50 mg amiloglükozidázt tartalmazó oldattal hozzuk érintkezésbe.
5
7. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy enzimként glükóz-izomerázt használunk fel.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy szabad állapotban 50—70 egy10 ség/mg specifikus aktivitással rendelkező glükóz-izomcrázt használunk fel, és a hordozóanyagot 1 g hordozóanyagra vonatkoztatva 20—50 mg, előnyösen 25 mg glükóz-izomerázt tartalmazó oldattal hozzuk érintkezésbe.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2726188A DE2726188C2 (de) | 1977-06-10 | 1977-06-10 | Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen Enzympräparats |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU179727B true HU179727B (en) | 1982-11-29 |
Family
ID=6011173
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU78KA1505A HU179727B (en) | 1977-06-10 | 1978-06-05 | Process for producing water-insoluble enzyme composition |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4230803A (hu) |
| EP (1) | EP0000028B1 (hu) |
| JP (1) | JPS548789A (hu) |
| AR (1) | AR222972A1 (hu) |
| AU (1) | AU517551B2 (hu) |
| BE (1) | BE868020A (hu) |
| BG (1) | BG28720A3 (hu) |
| CA (1) | CA1100066A (hu) |
| CS (1) | CS216234B2 (hu) |
| DD (1) | DD135495A5 (hu) |
| DE (2) | DE2726188C2 (hu) |
| DK (1) | DK149757C (hu) |
| ES (1) | ES470069A1 (hu) |
| FI (1) | FI62139C (hu) |
| FR (1) | FR2393810A1 (hu) |
| GB (1) | GB1600339A (hu) |
| HU (1) | HU179727B (hu) |
| IT (1) | IT1094879B (hu) |
| NL (1) | NL7805996A (hu) |
| PL (1) | PL126637B1 (hu) |
| RO (1) | RO74644A (hu) |
| SE (1) | SE7806679L (hu) |
| YU (1) | YU137078A (hu) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2726188C2 (de) * | 1977-06-10 | 1979-05-10 | Kali-Chemie Ag, 3000 Hannover | Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen Enzympräparats |
| DE3148603C1 (de) * | 1981-12-09 | 1983-07-21 | Kali-Chemie Ag, 3000 Hannover | Verfahren und Anlage zur Herstellung von Isomerose |
| FR2525629B1 (fr) * | 1982-04-27 | 1985-06-14 | Ags Bmp Argiles Mineraux | Support de fixation de micro-organismes |
| EP0093027A1 (fr) * | 1982-04-27 | 1983-11-02 | ARGILES & MINERAUX AGS-BMP | Support de fixation de micro-organismes |
| US4530963A (en) * | 1982-08-20 | 1985-07-23 | Devoe-Holbein International, N.V. | Insoluble chelating compositions |
| DE3405035C1 (de) * | 1984-02-13 | 1985-04-25 | Kali-Chemie Ag, 3000 Hannover | Verfahren zur Herstellung von lsoglucose |
| US4683203A (en) * | 1984-04-14 | 1987-07-28 | Redco N.V. | Immobilized enzymes, processes for preparing same, and use thereof |
| US4654322A (en) * | 1985-08-05 | 1987-03-31 | Devoe-Holbein International, N.V. | Insoluble compositions for removing mercury from a liquid medium |
| US4749653A (en) * | 1985-10-21 | 1988-06-07 | Owens-Corning Fiberglas Corporation | Enzyme immobilization on non-porous glass fibers |
| DE3719324C1 (de) * | 1987-06-10 | 1988-12-15 | Kali Chemie Ag | Verfahren zur Herstellung traegergebundener Enzyme |
| US5504042A (en) * | 1994-06-23 | 1996-04-02 | Texas Instruments Incorporated | Porous dielectric material with improved pore surface properties for electronics applications |
| US6319852B1 (en) | 1995-11-16 | 2001-11-20 | Texas Instruments Incorporated | Nanoporous dielectric thin film formation using a post-deposition catalyst |
| US5807607A (en) * | 1995-11-16 | 1998-09-15 | Texas Instruments Incorporated | Polyol-based method for forming thin film aerogels on semiconductor substrates |
| US6037277A (en) * | 1995-11-16 | 2000-03-14 | Texas Instruments Incorporated | Limited-volume apparatus and method for forming thin film aerogels on semiconductor substrates |
| US6130152A (en) | 1995-11-16 | 2000-10-10 | Texas Instruments Incorporated | Aerogel thin film formation from multi-solvent systems |
| US6063714A (en) * | 1995-11-16 | 2000-05-16 | Texas Instruments Incorporated | Nanoporous dielectric thin film surface modification |
| US5753305A (en) * | 1995-11-16 | 1998-05-19 | Texas Instruments Incorporated | Rapid aging technique for aerogel thin films |
| US6380105B1 (en) | 1996-11-14 | 2002-04-30 | Texas Instruments Incorporated | Low volatility solvent-based method for forming thin film nanoporous aerogels on semiconductor substrates |
| US5736425A (en) * | 1995-11-16 | 1998-04-07 | Texas Instruments Incorporated | Glycol-based method for forming a thin-film nanoporous dielectric |
| CA2353307A1 (fr) * | 2001-07-13 | 2003-01-13 | Carmen Parent | Appareil et procede pour le traitement des effluents gazeux |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3519538A (en) * | 1968-09-05 | 1970-07-07 | Corning Glass Works | Chemically coupled enzymes |
| US3850751A (en) * | 1973-02-16 | 1974-11-26 | Corning Glass Works | Enzymes immobilized on porous inorganic support materials |
| US3892580A (en) * | 1973-03-26 | 1975-07-01 | Corning Glass Works | Method of making porous inorganic bodies |
| US3930951A (en) * | 1974-05-28 | 1976-01-06 | Corning Glass Works | Bonding enzymes to porous inorganic carriers |
| DE2726188C2 (de) * | 1977-06-10 | 1979-05-10 | Kali-Chemie Ag, 3000 Hannover | Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen Enzympräparats |
-
1977
- 1977-06-10 DE DE2726188A patent/DE2726188C2/de not_active Expired
-
1978
- 1978-05-05 BG BG039644A patent/BG28720A3/xx unknown
- 1978-05-22 ES ES470069A patent/ES470069A1/es not_active Expired
- 1978-05-29 AR AR272349A patent/AR222972A1/es active
- 1978-05-30 GB GB24510/78A patent/GB1600339A/en not_active Expired
- 1978-05-30 IT IT23967/78A patent/IT1094879B/it active
- 1978-05-31 US US05/911,227 patent/US4230803A/en not_active Expired - Lifetime
- 1978-06-01 EP EP78100045A patent/EP0000028B1/de not_active Expired
- 1978-06-01 DE DE7878100045T patent/DE2860632D1/de not_active Expired
- 1978-06-01 NL NL7805996A patent/NL7805996A/xx not_active Application Discontinuation
- 1978-06-05 FR FR787816697A patent/FR2393810A1/fr active Pending
- 1978-06-05 HU HU78KA1505A patent/HU179727B/hu not_active IP Right Cessation
- 1978-06-05 RO RO7894265A patent/RO74644A/ro unknown
- 1978-06-07 FI FI781821A patent/FI62139C/fi not_active IP Right Cessation
- 1978-06-07 CS CS783707A patent/CS216234B2/cs unknown
- 1978-06-08 DD DD78205886A patent/DD135495A5/xx not_active IP Right Cessation
- 1978-06-08 YU YU01370/78A patent/YU137078A/xx unknown
- 1978-06-08 CA CA305,057A patent/CA1100066A/en not_active Expired
- 1978-06-08 AU AU36926/78A patent/AU517551B2/en not_active Expired
- 1978-06-08 SE SE7806679A patent/SE7806679L/xx unknown
- 1978-06-09 PL PL1978207511A patent/PL126637B1/pl unknown
- 1978-06-09 DK DK257678A patent/DK149757C/da not_active IP Right Cessation
- 1978-06-09 BE BE6046498A patent/BE868020A/xx unknown
- 1978-06-09 JP JP6973078A patent/JPS548789A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL126637B1 (en) | 1983-08-31 |
| NL7805996A (nl) | 1978-12-12 |
| JPS548789A (en) | 1979-01-23 |
| DE2726188B1 (de) | 1978-08-31 |
| EP0000028B1 (de) | 1981-04-22 |
| BE868020A (fr) | 1978-12-11 |
| DE2726188C2 (de) | 1979-05-10 |
| DD135495A5 (de) | 1979-05-09 |
| IT7823967A0 (it) | 1978-05-30 |
| DE2860632D1 (en) | 1981-07-30 |
| US4230803A (en) | 1980-10-28 |
| CA1100066A (en) | 1981-04-28 |
| DK149757C (da) | 1987-03-02 |
| GB1600339A (en) | 1981-10-14 |
| FR2393810A1 (fr) | 1979-01-05 |
| AR222972A1 (es) | 1981-07-15 |
| RO74644A (ro) | 1980-10-30 |
| EP0000028A1 (de) | 1978-12-20 |
| DK149757B (da) | 1986-09-22 |
| AU517551B2 (en) | 1981-08-06 |
| AU3692678A (en) | 1979-12-13 |
| BG28720A3 (bg) | 1980-06-16 |
| JPS6133557B2 (hu) | 1986-08-02 |
| DK257678A (da) | 1978-12-11 |
| FI62139C (fi) | 1982-11-10 |
| ES470069A1 (es) | 1979-01-01 |
| IT1094879B (it) | 1985-08-10 |
| FI781821A7 (fi) | 1978-12-11 |
| YU137078A (en) | 1983-02-28 |
| PL207511A1 (pl) | 1979-05-07 |
| CS216234B2 (en) | 1982-10-29 |
| SE7806679L (sv) | 1978-12-11 |
| FI62139B (fi) | 1982-07-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU179727B (en) | Process for producing water-insoluble enzyme composition | |
| EP0158909B1 (en) | Immobilized enzymes, processes for preparing same and use thereof | |
| US3959080A (en) | Carrier matrix for the fixation of biochemically effective substances and process for the preparation thereof | |
| US5116962A (en) | Material for affinity chromatography which is a sulfated polysaccharide bonded to an insoluble polymer | |
| JPS5840474B2 (ja) | 酵素反応により有機物質を少くとも１種類の他の有機物質に変換する酵素利用法 | |
| KR940005581B1 (ko) | 효소의 고정화방법 및 고정화 효소 | |
| JPH02291265A (ja) | 水―不溶性グルコースイソメラーゼ結晶およびその製造法 | |
| US5085779A (en) | Polyethyleneimine matrixes for affinity chromatography | |
| EP0154315B1 (en) | Improved diazonium affinity matrixes | |
| Stöllner et al. | Activation of cellulose membranes with 1, 1′-carbonyldiimidazole or 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate as a basis for the development of immunosensors | |
| US5508185A (en) | Lipase immobilized on a chitosan carrier | |
| EP0153763B1 (en) | Affinity chromatography matrix with built-in reaction indicator | |
| Fukui et al. | Production ofl-tryptophan, l-tyrosine and their analogues by use of immobilized tryptophanase and immobilized β-tyrosinase | |
| Stults et al. | Immobilization of proteins on partially hydrolyzed agarose beads | |
| US4562251A (en) | Agarose derivatives of amino phenyl boronic acid | |
| KR100457546B1 (ko) | 폴리프럭토오스 또는 그 유도체를 이용한 미소구 및 그제조방법 | |
| US4206286A (en) | Immobilization of proteins on inorganic supports | |
| Kennedy et al. | Immobilization of enzymes on crosslinked gelatin particles activated with various forms and complexes of titanium (IV) species | |
| Kálmán et al. | A novel polyacrylamide-type support prepared by p-benzoquinone activation | |
| KR830002697B1 (ko) | 고정화 효소의 제조방법 | |
| KR950014967B1 (ko) | 모라노린 유도체의 제법 | |
| US4778888A (en) | Boron containing 1,3,5-triazines | |
| JPH05344885A (ja) | 生理活性物質固定化材料 | |
| CN102888390A (zh) | 肝素酶ⅲ的固定化方法 | |
| CN102888391B (zh) | 肝素酶ⅱ的固定化方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HU90 | Patent valid on 900628 | ||
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |