HU183201B - Microbiological process for preparing derivatives of cholanic acid - Google Patents
Microbiological process for preparing derivatives of cholanic acid Download PDFInfo
- Publication number
- HU183201B HU183201B HU205180A HU205180A HU183201B HU 183201 B HU183201 B HU 183201B HU 205180 A HU205180 A HU 205180A HU 205180 A HU205180 A HU 205180A HU 183201 B HU183201 B HU 183201B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- arthrobacter
- acid
- ferm
- atcc
- strain
- Prior art date
Links
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 12
- 150000001830 cholanoic acids Chemical class 0.000 title description 5
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 claims abstract description 132
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 118
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 57
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 claims abstract description 27
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 24
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims abstract description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 150000001340 alkali metals Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical group 0.000 claims abstract description 4
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims abstract 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 78
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 33
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 33
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 claims description 26
- 208000002881 Colic Diseases 0.000 claims description 26
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 25
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 15
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 claims description 3
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 43
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 abstract description 40
- 239000004380 Cholic acid Substances 0.000 abstract description 37
- 229960002471 cholic acid Drugs 0.000 abstract description 37
- BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N (3alpha,5alpha,7alpha,12alpha)-3,7,12-trihydroxy-cholan-24-oic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 35
- 235000019416 cholic acid Nutrition 0.000 abstract description 35
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 30
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 abstract description 9
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 abstract description 8
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 abstract description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 abstract description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 abstract description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 abstract description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 49
- 239000000047 product Substances 0.000 description 48
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 46
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 39
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 26
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 26
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 26
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 26
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 24
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 19
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 16
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 16
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 15
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 15
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 15
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 14
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 14
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 14
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 11
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 11
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 10
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 10
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 10
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 10
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 9
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 8
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 8
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 8
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 8
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 8
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 8
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 8
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 8
- CCGNIYCPGXLHNA-UHFFFAOYSA-N 1H-indole sulfane Chemical compound S.C1=CC=C2NC=CC2=C1 CCGNIYCPGXLHNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 7
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 7
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 7
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 7
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 7
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 7
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 7
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 7
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 7
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 7
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000010422 painting Methods 0.000 description 7
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 7
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 7
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 7
- 230000019086 sulfide ion homeostasis Effects 0.000 description 7
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 6
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 6
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 6
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 6
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 6
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 6
- 241000203720 Pimelobacter simplex Species 0.000 description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 6
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 6
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 6
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 6
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 6
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- MIHNUBCEFJLAGN-DMMBONCOSA-N 3alpha,7alpha-dihydroxy-12-oxo-5beta-cholanic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)C(=O)C1 MIHNUBCEFJLAGN-DMMBONCOSA-N 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 5
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 5
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 5
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 4
- 239000003763 cholanic acid derivative Substances 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 4
- OEKUSRBIIZNLHZ-DJDNIQJZSA-N 7alpha,12alpha-dihydroxy-3-oxo-5beta-cholan-24-oic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)C(=O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 OEKUSRBIIZNLHZ-DJDNIQJZSA-N 0.000 description 3
- LOGQGKJLNOCUQM-RGMYPYHHSA-N 7alpha-Hydroxy-3,12-dioxo-5beta-cholan-24-oic Acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)C(=O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)C(=O)C1 LOGQGKJLNOCUQM-RGMYPYHHSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 3
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 3
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 3
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 3
- NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N (2s)-2,6-diaminohexanoic acid;(2s)-2-hydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 2
- YYROPELSRYBVMQ-UHFFFAOYSA-N 4-toluenesulfonyl chloride Chemical compound CC1=CC=C(S(Cl)(=O)=O)C=C1 YYROPELSRYBVMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RPKLZQLYODPWTM-LVVAJZGHSA-N 5beta-cholanic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)CCC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 RPKLZQLYODPWTM-LVVAJZGHSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001478240 Coccus Species 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 241000157908 Paenarthrobacter aurescens Species 0.000 description 2
- 241001524178 Paenarthrobacter ureafaciens Species 0.000 description 2
- 241000185994 Pseudarthrobacter oxydans Species 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000813918 Streptomyces gelaticus Species 0.000 description 2
- GZCGUPFRVQAUEE-KCDKBNATSA-N aldehydo-D-galactose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-KCDKBNATSA-N 0.000 description 2
- 230000003113 alkalizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- MBRXVOBWAQSXOY-HGZXIFPPSA-N chol-4-en-24-oic acid Chemical compound C1CC2=CCCC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]1(C)CC2 MBRXVOBWAQSXOY-HGZXIFPPSA-N 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N hydrazine monohydrate Substances O.NN IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002431 hydrogen Chemical group 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 2
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 2
- FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N potassium nitrate Chemical compound [K+].[O-][N+]([O-])=O FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 2
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 2
- NRHMKIHPTBHXPF-TUJRSCDTSA-M sodium cholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 NRHMKIHPTBHXPF-TUJRSCDTSA-M 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- SXFBQAMLJMDXOD-UHFFFAOYSA-N (+)-hydrogentartrate bitartrate salt Chemical class OC(=O)C(O)C(O)C(O)=O.OC(=O)C(O)C(O)C(O)=O SXFBQAMLJMDXOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MPDDTAJMJCESGV-CTUHWIOQSA-M (3r,5r)-7-[2-(4-fluorophenyl)-5-[methyl-[(1r)-1-phenylethyl]carbamoyl]-4-propan-2-ylpyrazol-3-yl]-3,5-dihydroxyheptanoate Chemical compound C1([C@@H](C)N(C)C(=O)C2=NN(C(CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC([O-])=O)=C2C(C)C)C=2C=CC(F)=CC=2)=CC=CC=C1 MPDDTAJMJCESGV-CTUHWIOQSA-M 0.000 description 1
- KPBSVBXLODLPIY-LDTZHDHYSA-N (4R)-4-[(5S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-oxopentanoic acid Chemical compound C[C@H](CC(=O)C(O)=O)[C@H]1CC[C@H]2[C@@H]3CC[C@@H]4CCCC[C@]4(C)[C@H]3CC[C@]12C KPBSVBXLODLPIY-LDTZHDHYSA-N 0.000 description 1
- KKAJSJJFBSOMGS-UHFFFAOYSA-N 3,6-diamino-10-methylacridinium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(N)C=C2[N+](C)=C(C=C(N)C=C3)C3=CC2=C1 KKAJSJJFBSOMGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MKNQNPYGAQGARI-UHFFFAOYSA-N 4-(bromomethyl)phenol Chemical compound OC1=CC=C(CBr)C=C1 MKNQNPYGAQGARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical class OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 101000878457 Macrocallista nimbosa FMRFamide Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000406195 Nonala Species 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007868 Raney catalyst Substances 0.000 description 1
- NPXOKRUENSOPAO-UHFFFAOYSA-N Raney nickel Chemical compound [Al].[Ni] NPXOKRUENSOPAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000564 Raney nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000158504 Rhodococcus hoagii Species 0.000 description 1
- 241000204914 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Give Species 0.000 description 1
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006856 Wolf-Kishner-Huang Minlon reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 229940023020 acriflavine Drugs 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-KVTDHHQDSA-N aldehydo-D-mannose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-VPENINKCSA-N aldehydo-D-xylose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-VPENINKCSA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-VAYJURFESA-N aldehydo-L-arabinose Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-VAYJURFESA-N 0.000 description 1
- 150000001341 alkaline earth metal compounds Chemical class 0.000 description 1
- -1 alkaline earth metal salt Chemical class 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XTEGARKTQYYJKE-UHFFFAOYSA-N chloric acid Chemical compound OCl(=O)=O XTEGARKTQYYJKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940005991 chloric acid Drugs 0.000 description 1
- RPKLZQLYODPWTM-KBMWBBLPSA-N cholanoic acid Chemical class C1CC2CCCC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]1(C)CC2 RPKLZQLYODPWTM-KBMWBBLPSA-N 0.000 description 1
- 229940099352 cholate Drugs 0.000 description 1
- 239000002812 cholic acid derivative Substances 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 1
- 230000001112 coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000112 colonic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000005243 fluidization Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 208000001130 gallstones Diseases 0.000 description 1
- 150000004688 heptahydrates Chemical class 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- CEQFOVLGLXCDCX-WUKNDPDISA-N methyl red Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1\N=N\C1=CC=CC=C1C(O)=O CEQFOVLGLXCDCX-WUKNDPDISA-N 0.000 description 1
- JZMJDSHXVKJFKW-UHFFFAOYSA-N methyl sulfate Chemical compound COS(O)(=O)=O JZMJDSHXVKJFKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 238000003798 microbiological reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 239000004323 potassium nitrate Substances 0.000 description 1
- 235000010333 potassium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000012265 solid product Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
A találmány tárgya javított mikrobiológiai eljárás az (I) általános képletű kolánsav-származékok előállítására ,OH — áltól X oxigénatomot vagyz csoportot jelent, XH es R jelentése hidrogénatom, alkálifém-atom vagy alkáliföldféni-atom. A találmány szerinti eljárás során kólsavat vagy egy kólsav-sót tartalmazó tápközegben az adott tápközegen növekedni képes, (I) általános képletű kolánsav-származékokat termelő, az Arthrobacter, Brevibacterium vagy Corynebacterium nemzetségbe tartozó mikroorganizmust, nevezetesen az Arthrobacter CA-35, Brevibacterium CA-6 vagy Corynebacterium CA-53 törzsek valamelyikét, illetve ezek mutánsait vagy variánsait tenyésztik, majd a kapott termékeket elkülönítik. Ezzel az eljárással a kívánt kolánsav-származékok jó hozammal, rövid tenyésztési idő alatt állíthatók elő. Az (I) általános képletű vegyületek a kenodezoxikólsav és a dezoxi-kólsav előállításának értékes közbenső termékei, illetve kiindulási anyagai. -1-FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to an improved microbiological process for the preparation of the cholinic acid derivatives of formula (I), X is O or OH, XH and R are hydrogen, an alkali metal atom or an alkaline earth metal atom. In the process of the present invention, a microorganism producing Arthrobacter, Brevibacterium, or Corynebacterium, namely Arthrobacter CA-35, Brevibacterium CA-6, can be grown in a medium containing cholic acid or a cholic acid salt medium in the medium. or Corynebacterium CA-53 strains or mutants or variants thereof are cultured and the resulting products are isolated. By this method, the desired cholinic acid derivatives can be produced in good yield during a short culture time. The compounds of formula (I) are valuable intermediates and starting materials for the preparation of cane deoxycholic acid and deoxycholic acid. -1-
Description
(57) KIVONAT(57) EXTRAS
A találmány tárgya javított mikrobiológiai eljárás az (I) általános képletű kolánsav-származékok előállítására ,OH — ahol X oxigénatomot vagyz csoportot jelent, XH esThe present invention relates to an improved microbiological process for the preparation of collanic acid derivatives of the formula I, wherein X is O or Z , X H and
R jelentése hidrogénatom, alkálifém-atom vagy alkáliföldfém-atom.R is hydrogen, an alkali metal or an alkaline earth metal.
A találmány szerinti eljárás során kólsavat vagy egy kólsav-sót tartalmazó tápközegben az adott tápközegen növekedni képes, (I) általános képletű kolánsav-származékokat termelő, az Arthrobacter, Brevibacterium vagy Corynebacterium nemzetségbe tartozó mikroorganizmust, nevezetesen az Arthrobacter CA-35, Brevibacterium CA-6 vagy Corynebacterium CA-53 törzsek valamelyikét, illetve ezek mutánsait vagy variánsait tenyésztik, majd a kapott termékeket elkülönítik. Ezzel az eljárással a kívánt kolánsav-származékok jó hozammal, rövid tenyésztési idő alatt állíthatók elő.In the process of the present invention, a microorganism belonging to the genus Arthrobacter, Brevibacterium or Corynebacterium, which is capable of growing on said medium and which is capable of growing on said medium, is a medium of Arthrobacter CA-35, Brevibacterium CA-6. or Corynebacterium CA-53 strains, or mutants or variants thereof, and isolate the resulting products. By this method, the desired collanic acid derivatives can be obtained in good yield and in a short culture time.
Az (I) általános képletű vegyületek a kenodezoxikólsav és a dezoxi-kólsav előállításának értékes közbenső termékei, illetve kiindulási anyagai.The compounds of formula (I) are valuable intermediates and starting materials for the preparation of kenodeoxycholic acid and deoxycholic acid.
183 201183,201
A találmány tárgya mikrobiológiai eljárás az (I) általános képletű kolánsav-származékok előállítására - aholThe present invention relates to a microbiological process for the preparation of the collanic acid derivatives of the formula I wherein:
OHOH
X oxigénatomot vagy ;'?, csoportot jelent, és riX represents an oxygen atom or a group, and ri
R jelentése hidrogénatom, alkálifém-atom vagy alkáliföldfém-atom.R is hydrogen, an alkali metal or an alkaline earth metal.
A találmány szerinti eljárással az (I) általános képletű kolánsav-származékokat rövid idő alatt, nagy hozammal állíthatjuk elő úgy, hogy egy szubsztrátűmként kólsavat vagy kóísav-sót tartalmazó fernrentlében specifikus mikroorganizmusokat tenyésztünk.The process of the present invention provides the preparation of the collanic acid derivatives of formula (I) in a short time and high yield by culturing specific microorganisms in a superfamily containing a colonic acid or a salt of a chloric acid as a substrate.
Az X helyén^csoportot tartalmazó (I) általános képletű kolánsav-származék, az,az a 3a,7a-dihidroxi-12keto-5(3-ko!ánsav és sói az epekőoldó hatással rendelkező kenodezoxi-kólsav (CDCA) előállításának értékes közbenső termékei. Az X helyén oxigénatomot tartalmazó (I) általános képletű kolánsav-származék, azaz a 7 ahidroxi-3,12-diketo-50-kolánsav és sói a dezoxi-kólsav előállításában használhatók fel közbenső termékekként. A dezoxi-kólsav a progeszteron és számos adrenokortikoszteroid-származék előállításának értékes kiindulási anyaga.The cholanic acid derivative of the formula (I), which is 3a, 7a-dihydroxy-12keto-5 (3-colloic acid and its salts), is a valuable intermediate in the preparation of bile-deoxygenated cholic acid (CDCA). The cholanic acid derivative of the formula I, wherein X is an oxygen atom, i.e. the 7-hydroxy-3,12-diketo-50-cholanoic acid and its salts, can be used as intermediates in the preparation of deoxycholic acid, which is a progesterone and many adrenocorticosteroids. is a valuable starting material for the production of a derivative
Már korábban is ismertettek mikrobiológiai eljárásokat az (I) általános képletű kolánsav-származékok előállítására, amelyekben szubsztrátumként kólsavat vagy kóísav-sókat használtak fel. A Hayakawa és munkatársai által kidolgozott eljárás szerint a 3a,7a-dihidroxi-12keto-5j3-ko)ánsavat Streptomyces gelaticus i 164 törzs felhasználásával állítják elő [The Journal of Biochemistry (Japan), 44 (2), 109-113 (1957); Proceedings of Japan Academy, 32, 519—522 (1956)]. Hasegawa és munkatársai eljárást ismertettek 3a,7a-dihidroxi-12keto-50-kolánsav előállítására Aspergillus cinnamomeus HŰT 2026 törzs felhasználásával [Hiroshima Journal of Medical Science, 8 (3), 277—283 (1959)]. A Kikuchi és munkatársai által közölt eljárásban a 3a,7a-dihidroxi-12keto-5,3-kolánsav előállításához Staphylococcus epidermidis H-l törzset alkalmaznak [Journal of Biochemistry, 72 (1), 165—172 (1972)]. A Hayakawa és munkatársai által ismertetett, Streptomyces gelaticus 1164 törzset felhasználó eljárás 7a-hidroxi-3,12-diketo-5j3-kolánsav előállítására is alkalmas [Proceedings of Japan Academy, 32, 519-522(1956)].Microbiological processes for the preparation of the collanic acid derivatives of formula (I) in which cholic acid or salts of cholic acid have been used as substrates have been described previously. According to the procedure developed by Hayakawa et al., 3a, 7a-dihydroxy-12keto-5β-co) acetic acid is prepared using Streptomyces gelaticus 164 strain (The Journal of Biochemistry (Japan), 44 (2), 109-113 (1957)). ; Proceedings of Japan Academy, 32, 519-522 (1956)]. Hasegawa et al., Described a method for the preparation of 3a, 7a-dihydroxy-12keto-50-cholanoic acid using Aspergillus cinnamomeus strain 2026 (Hiroshima Journal of Medical Science, 8 (3), 277-283 (1959)). Staphylococcus epidermidis H-1 strain is used in the preparation of 3a, 7a-dihydroxy-12keto-5,3-cholanoic acid by Kikuchi et al., 1972, Journal of Biochemistry, 72 (1), 165-172. The method of Streptomyces gelaticus 1164, described by Hayakawa et al., Is also suitable for the preparation of 7α-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholanic acid (Proceedings of Japan Academy, 32, 519-522 (1956)).
Valamennyi ismert eljárás közös hátránya, hogy a fermentlé a kólsav szubsztrátumot kis - például 10 g/l-t meg nem haladó - koncentrációban tartalmazza. Kísérleteink szerint a kolánsav-származékok előállítására irányuló ismert mikrobiológiai eljárásokban azért kell a kólsav koncentrációját kis értéken tartani, mert ellenkező esetben (20 g/l-t meghaladó kólsav-koncentráció esetén) a felhasznált mikroorganizmusok visszafejlődnek vagy alig növekednek. Az ismert mikrobiológiai eljárások további hátránya, hogy a tenyésztéshez igen hosszú időt igényelnek. Olyan eljárás kidolgozására van tehát szükség, amellyel a kolánsav-származékok rövid idő alatt nagy hozammal állíthatók elő. Azt tapasztaltuk, hogy az Arthrobacter, Brevibacterium és Corynebacterium nemzetségbe tartozó egyes mikroorganizmusok széles határok között változó mennyiségű kólsavat vagy kólsav-sót tartalmazó táptalajokon is növekednek, és nagy hozammal, rövid idő alatt termelnek (I) általános képletű kolánsav-származékokat.A common disadvantage of all known processes is that the fermentation broth contains a low concentration of the sulfuric acid substrate, for example not exceeding 10 g / l. In our experiments, the known microbiological processes for the preparation of collanic acid derivatives have to keep the concentration of colic acid low, because otherwise (at concentration of 20 g / l sulfuric acid) the microorganisms used will regress or barely grow. A further disadvantage of known microbiological methods is that they take a very long time to grow. Thus, there is a need to develop a process for the preparation of collanic acid derivatives in high yield in a short period of time. It has been found that certain microorganisms of the genus Arthrobacter, Brevibacterium and Corynebacterium also grow on medium containing varying amounts of the sulfuric acid or salt of sulfuric acid and produce high yields of the collanic acid derivatives of formula I in a short time.
A találmány tárgya tehát eljárás (I) általános képletű kolánsav-származékok előállítására mikrobiológiai úton. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy kólsavat vagy egy kólsav-sót tartalmazó tápközegben az adott tápközegen növekedni képes, (I) általános képletű kolánsavszármazékokat termelő, az Arthrobacter, Brevibacterium vagy Corynebacterium nemzetségbe tartozó mikroorganizmust, nevezetesen az Arthrobacter CA-35, Brevibacterium CA-6 vagy Corynebacterium CA-53 törzsek valamelyikét, illetve ezek mutánsait vagy variánsait tenyésztjük, majd a kapott termékeket elkülönítjük.The present invention therefore relates to a process for the preparation of colanic acid derivatives of formula (I) by microbiological processes. According to the present invention, a microorganism of the genus Arthrobacter, Brevibacterium or Corynebacterium, which is capable of growing on said medium and which is capable of growing on said medium, is a culture of Arthrobacter, Brevibacterium or Corynebacterium, namely Arthrobacter CA-35, Brevib. 6 or Corynebacterium CA-53, or mutants or variants thereof, and the resulting products are isolated.
A találmány szerinti eljárásban talajból elkülönített mikroorganizmusokat, azok természetes mutánsait, illetve az azokból mutagén kezeléssel (például röntgensugárzással vagy ultraibolya fénnyel végzett besugárzással, mutagén vegyszerek, így N-metil-N -niíro-N-nitrozoguanidin, 4-rutrokinolin-N-oxid, akriflavin vagy etilmetán-szulfonát felhasználásával, illetve e módszerek kombinálásával) kialakított mutánsokat használhatjuk fel.In the process of the present invention, microorganisms isolated from soil, their natural mutants or mutagenic therapies (e.g., by X-ray or UV light), mutagenic chemicals such as N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine, 4-rutroquinoline-N-oxide, mutants formed using acriflavine or ethyl methanesulfonate or a combination of these methods).
A kólsavat vagy kólsav-sókat tartalmazó tápközegeken (I) általános képletű kolánsav-származékokat termelő, általunk elkülönített mikroorganizmusokat a Fermentation Research ínstitute, Agency of Industrial Science and Technology intézetben (Japán; a továbbiakban: FERM), illetve az Amerikai Egyesült Államok-beli American Type Culture Collection törzsgyűjteményben (a továbbiakban: ATCC) helyeztük letétbe. A letétbe helyezett törzsek a következők: Arthrobacter CA-35 (FERM-P No. 5145, ATCC No. 31651), Arthrobacter CA-35-A589-29-32 (FERM-P No. 5522, ATCC No. 31652), Arthrobacter CA-35-A589-47 (FERM-P No. 5523, ATCC No. 31653). Arthrobacter CA-35-A849 (FERM-P No. 5524, ATCC No. 31654), Arthrobacter CA-35-A-1071-15 (FERM-P No. 5525, ATCC No. 31655), Arthrobacter CA-35-A-1448 (FERM-P No. 5526, ATCC No. 31656). Arthrobacter CA-35-A-1475 (FERM-P No. 5527, ATCC No. 31657), Arthrobacter CA-35-A-l 766-15 (FERM-P No. 5528, ATCC No. 31658), Arthrobacter CA-35-M-965-3 (FERM-P No. 5529, ATCC No. 31659), Arthrobacter CA-35-Y-37-12 (FERM-P No. 5530, ATCC No 31660), Brevibacterium CA-6 (FERM-P No. 5144, ATCC No. 31661) és Corynebacterium CA-53 (FERM-P No. 5532, ATCC No. 31662). Az Arthrobacter CA-35, Brevibacterium CA-6 és Corynebacterium CA-53 törzs természetből elkülönített („vad”) törzs; a további kilenc Arthrobacter törzs pedig az Arthrobacter CA-35 törzs mutánsa. Az Arthrobacter CA-35-Y-37-12 törzset ultraibolya fénnyel végzett besugárzással alakítottuk ki, mig az Arthrobacter CA-35 törzs további nyolc mutánsa esetén az alaptörzset Nmetil-N -nítro-N-nitrozo-guanidinnel kezeltük.Microorganisms which we produce on medium containing sulfuric acid or salts of sulfuric acid are isolated by us from the Fermentation Research Institute, Agency for Industrial Science and Technology, Japan (hereinafter FERM), and the United States of America. Type Culture Collection ("ATCC"). Deposited strains include Arthrobacter CA-35 (FERM-P No. 5145, ATCC No. 31651), Arthrobacter CA-35-A589-29-32 (FERM-P No. 5522, ATCC No. 31652), Arthrobacter CA-35-A589-47 (FERM-P No. 5523, ATCC No. 31653). Arthrobacter CA-35-A849 (FERM-P No. 5524, ATCC No. 31654), Arthrobacter CA-35-A-1071-15 (FERM-P No. 5525, ATCC No. 31655), Arthrobacter CA-35-A -1448 (FERM-P No. 5526, ATCC No. 31656). Arthrobacter CA-35-A-1475 (FERM-P No. 5527, ATCC No. 31657), Arthrobacter CA-35-Al 766-15 (FERM-P No. 5528, ATCC No. 31658), Arthrobacter CA-35- M-965-3 (FERM-P No. 5529, ATCC No. 31659), Arthrobacter CA-35-Y-37-12 (FERM-P No. 5530, ATCC No. 31660), Brevibacterium CA-6 (FERM-P) No. 5144, ATCC No. 31661) and Corynebacterium CA-53 (FERM-P No. 5532, ATCC No. 31662). Arthrobacter CA-35, Brevibacterium CA-6 and Corynebacterium CA-53 are strains isolated from nature ("wild"); and the other nine Arthrobacter strains are mutants of Arthrobacter CA-35. The Arthrobacter CA-35-Y-37-12 strain was created by irradiation with ultraviolet light, while the other eight mutants of the Arthrobacter CA-35 strain were treated with Nmethyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine.
A felsorolt törzsek morfológiai, tenyésztési és élettani jellemzőit az 1. táblázatban foglaljuk össze, összehasonlítás céljából az Arthrobacter CA-35 törzzsel rokon Arthrobacter simplex IÁM 1660 törzs megfelelő adatait is feltüntetjük.The morphological, breeding and physiological characteristics of the listed strains are summarized in Table 1, with corresponding data for Arthrobacter simplex IAM 1660, related to the strain Arthrobacter CA-35.
Az 1. táblázatban említett BCP-tej táptalajt úgy készítjük, hogy a tejből centrifugálással eltávolítjuk a zsiradékot, majd a sovány tejhez brómkrezol-bíbort (BCP) adunk. A vizsgáit mikroorganizmus növekedőképességét az indikátor (BCP) színváltozása jelzi.The BCP milk medium mentioned in Table 1 is prepared by removing the fat from the milk by centrifugation and adding to the skim milk the bromocresol (BCP). The growth potential of the micro-organism tested is indicated by the change in the color of the indicator (BCP).
-2183 201-2183 201
1. táblázatTable 1
Élettani jellemzők1 Physiological characteristics 1
183 201183,201
Tenyésztési jellemzők:Breeding characteristics:
g/1 kólsavat tartalmazó húsleves-agar lemez Zselatin-szúrás Lakmusz-tej BCP-tej körkörös, lapos, sárga, sima, csillogó, átlátszatlan elfolyósodás a lakmusz redukálódik, a tej nem koagulál, nem peptonizál lúgos, nem koagulál, nem peptonizál körkörös, lapos, sárga, sima, csillogó, átlátszatlan elfolyósodás a lakmusz redukálódik, a tej nem koagulál, nem peptonizál lúgos, nem koagulál, nem peptonizálbroth agar plate containing g / l of colic acid Gelatin strain Litmus milk BCP milk circular, flat, yellow, smooth, glittering, opaque liquefaction litmus is reduced, milk does not coagulate, does not peptonize alkaline, does not coagulate, does not peptonize flat, yellow, smooth, glittering, opaque liquefaction litmus is reduced, milk does not coagulate, does not peptonize alkaline, does not coagulate, does not peptonize
183 201183,201
183 201183,201
Oxidációs/fermentációs próba oxidatív oxidatívOxidation / fermentation test oxidative oxidative
183 201183,201
-Ί1-Ί1
183 201183,201
183 201183,201
183 201183,201
Jellemzők Arthrobacter CA-35-A-1766-15 törzs Arthrobacter CA-35-M-965-3 törzsFeatures Arthrobacter CA-35-A-1766-15 Strain Arthrobacter CA-35-M-965-3
Jellemzők Arthrobacter CA-35-Y-37-12 törzs Brevibacterium CA-6 törzsArthrobacter strain CA-35-Y-37-12 Brevibacterium strain CA-6
Mikroszkópos jellemzők: Alak Osztódás Méret (μ)Microscopic Characteristics: Shape Division Size (μ)
Flagellumflagellum
SpóraSpore
Gram-festésGram stain
Saválló festésAcid-resistant painting
Tenyésztési jellemzők: Húsleves-agar lemez g/1 kólsavat tartalmazó húsleves-agar lemez Zselatin-szúrás Lakmusz-tejBreeding characteristics: Broth-agar plate Broth-agar plate containing g / l of colic acid Gelatin prick litmus milk
BCP-tej rövid pálcaBCP milk short sticks
0,8-1,0 X 1,5-2,5 tlagelluín nincs pozitív nem festödik pálca0.8-1.0 X 1.5-2.5 tlagellulin no positive no stains
1,0 X 2,5-4,0 poláros flageflum nincs pozitív nem festödik körkörös, lapos, sárga, sima, csillogó, átlátszatlan körkörös, lapos, krémszínű, sima, csillogó, átlátszatlan elfolyósodás a lakmusz redukálódik, a tej nem koagulál, nem peptonizá!1.0 X 2.5-4.0 polar flageflum no positive no stains circular, flat, yellow, smooth, sparkling, opaque circular, flat, cream, smooth, sparkling, opaque liquefaction litmus is reduced, milk does not coagulate, no peptonizá!
lúgos, nem koagulál, nem peptonizál hullámos, enyhén kiemelkedő, színtelen, sima, csillogó, áttetsző elfolyósodás peptonizál és meglúgosodik peptonizál és meglúgosodikalkaline, non-coagulating, non-peptonizing wavy, slightly prominent, colorless, smooth, shiny, translucent fluidization peptonizing and alkalizing peptonizing and alkalizing
-10183 201-10183 201
-111-111
183 201183,201
-121-121
183 201183,201
Megjegyzések az 1. táblázathoz:Notes to Table 1:
1) Az „Élettani jellemzők” című felsorolásban használt jelek jelentése a következő:1) Symbols used in the list "Physiological characteristics" have the following meaning:
+:A törzs az adott jellemzővel rendelkezik, illetve az adott anyagot termeli.+: The strain has the given property or produces the given substance.
±: Csak nehezen határozható meg, illetve nem dönthető el teljes bizonyossággal, hogy a törzs rendelkezik-e az adott jellemzővel vagy termelí-e az adott anyagot.±: It is difficult to determine or determine with certainty whether a strain has a particular trait or produces a given substance.
— :A törzs nem rendelkezik az adott jellemzővel, illetve nem termeli az adott anyagot.-: The strain does not have the specified property or produces the given substance.
2) A „Savak és gázok fejlesztése szénhidrátokból” című felsorolásban használt jelek jelentése a következő:2) The symbols used in the list "Developing acids and gases from carbohydrates" have the following meaning:
(i) Növekedés, savak és gázok:(i) Growth, acids and gases:
A törzseket Hugh-Leifson tápközegen tenyésztettük, azzal az eltéréssel, hogy a Hugh-Leifson tápközeg eredeti szénforrását az 1-15. sz. szénhidráttal helyettesítettük. Megfigyeltük a törzsek növekedését, illetve a savés gáztermelést.The strains were cultured on Hugh-Leifson medium except that the original carbon source of the Hugh-Leifson medium was as shown in Figures 1-15. s. carbohydrate. Strain growth and acidic gas production were observed.
+ : A törzs növekedik, illetve savat vagy gázt fejleszt.+: The strain grows or produces acid or gas.
±: Nem dönthető el teljes bizonyossággal, hogy a törzs növekedik-e,illetve fejleszt-e savat vagy gázt.±: It is not possible to determine with certainty whether the strain is growing or developing acid or gas.
—: A törzs nem növekedik, illetve sem savat, sem gázt nem fejleszt.-: The strain does not grow or develops acid or gas.
(ii) Asszimiláció:(ii) Assimilation:
mm átmérőjű kémcsőbe 2 g/1 ammónium-nitrátot, 2 g/3 kálium-dihidrogénfoszfátot, 5 g/1 dikálium-hidrogénfoszfátot, 0,2 g/1 magnéziumszulfát-heptahidrátot, 0,1 g/1 élesztőkivonatot és 5 g/1 szénhidrátot tartalmazó tápközeget töltöttünk, a törzset rázás közben tenyésztettük a tápközegen, és megfigyeltük a szénforrás asszimilációját, azaz a törzs növekedését.mm test tube 2 g / l ammonium nitrate, 2 g / 3 potassium dihydrogen phosphate, 5 g / l dipotassium hydrogen phosphate, 0.2 g / l magnesium sulphate heptahydrate, 0.1 g / l yeast extract and 5 g / l carbohydrate containing the medium, culturing the strain on the medium with shaking and observing the assimilation of the carbon source, i.e. growth of the strain.
—: A törzs nem növekedik.-: The strain does not grow.
±: A törzs gyengén növekedik.±: Strain weakly growing.
+ : A törzs növekedik.+: The strain grows.
++: A törzs jól növekedik.++: The strain grows well.
+++: A törzs igen jól növekedik.+++: The strain grows very well.
A törzseket a felsorolt morfológiai, tenyésztési és élettani jellemzők alapján a Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology című szakkönyv 7. és 8. kiadásában közöltek szerint osztályoztuk.The strains were classified according to the morphological, breeding and physiological characteristics listed, as described in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7th and 8th editions.
Megállapítottuk, hogy az Arthrobacter CA-35 törzs mikroszkópos képe (alakja, Gram-festése stb ) és élettani jellemzői alapján rokonságot mutat az Arthrobacter simplex törzsekkel. Az Arthrobacter CA-35 törzs azonban pigment-termelése, szénhidrát-asszimilációja és kólsavat tartalmazó közegben észlelt növekedése szempontjából eltér az Arthrobacter simplex IÁM 1660 törzstől. Az Arthrobacter CA-35 törzs egyedüli szénforrásként nagy mennyiségű (például kb. 20-500 g/1) nátriumkolátot tartalmazó tápközegeken növekedni képes és ilyen körülmények között fő anyagcsere-termékként 7ahidroxi-3,12-diketo-5/J-kolánsavat, 3a,7a-dihidroxi-12keto-5/3-kolánsavat, 7a,12a-dihidroxi-3-keto-50-kolánsavat és/vagy ezek nátriumsóját termeli; ezzel szemben az Arthrobacter simplex IÁM 1660 törzs egyedüli szénforrásként 10 g/1 nátrium-kolátot tartalmazó tápközegen alig növekedik.We found that the Arthrobacter CA-35 strain was related to the Arthrobacter simplex strains by its microscopic image (shape, Gram staining, etc.) and physiological characteristics. However, the Arthrobacter CA-35 strain differs from the Arthrobacter simplex IAM 1660 in terms of pigment production, carbohydrate assimilation, and growth in a sulfuric acid medium. Arthrobacter CA-35 is the only carbon source capable of growing on media containing high amounts (e.g., about 20-500 g / L) of sodium cholate and under these conditions, 7ahydroxy-3,12-diketo-5 N-cholanic acid, 3a, 7a-dihydroxy-12keto-5/3-cholanoic acid, 7a, 12a-dihydroxy-3-keto-50-cholanoic acid and / or their sodium salts; in contrast, Arthrobacter simplex strain 1660 as the sole carbon source in growth medium containing 10 g / l sodium cholate.
Az Arthrobacter CA-35 törzs sárga-krémszínű pigmentet termel. Az Arthrobacter nemzetségbe három további pigment-termelő mikroorganizmus, éspedig az Arthrobacter oxydans, az Arthrobacter aurescens és az Arthrobacter ureafaciens tartozik. Az Arthrobacter CA35 törzs azonban mindhárom pigment-termelő Arthrobacter mikroorganizmustól eltér, mert az Arthrobacter oxydans és az Arthrobacter aurescens törzsek rendszerint Gram-negatívok és a keményítőt elhidrolizálják, az Arthrobacter ureafaciens-törzsek pedig rendszerint Gram-negatívok és a nitrátokat nem redukálják. Feltevésünk szerint tehát az Arthrobacter CA-35 törzs az Arthrobacter nemzetségbe tartozó új törzstípusnak tekintendő, mert különbözik az Arthrobacter nemzetségbe tartozó egyéb törzstípusoktól.The Arthrobacter CA-35 strain produces a yellow-cream pigment. There are three other pigment producing microorganisms in the genus Arthrobacter, namely Arthrobacter oxydans, Arthrobacter aurescens and Arthrobacter ureafaciens. However, Arthrobacter CA35 strain differs from all three pigment producing Arthrobacter microorganisms because Arthrobacter oxydans and Arthrobacter aurescens strains are usually Gram-negative and starch is hydrolyzed, while Arthrobacter ureafaciens strains are usually Gram-negative and nitrate-free. Thus, it is believed that the Arthrobacter CA-35 strain is considered to be a new strain of the genus Arthrobacter because it is different from other strains of the genus Arthrobacter.
Noha az Arthrobacter CA-35 törzs mutánsai közül egyesek a flagellumok tekintetében alapvetően eltérnek a kiindulási törzstől, ezeket a mutánsokat az Arthrobacter nemzetségbe soroltuk, mert az általánosan alkalmazott osztályozási elvek szerint a mutánsokat az alaptörzsével azonos nemzetségbe sorolják.Although some of the mutants in the Arthrobacter CA-35 strain are fundamentally different from the parent strain with respect to flagella, these mutants are classified in the genus Arthrobacter because, according to generally used classification principles, mutants are classified in the same genus as their parent strain.
-13183 201-13183 201
Megállapítottuk, hogy a Brevibacterium CA-6 törzs mikroszkópos képe (például Gram-festése stb.) és élettani jellemzői alapján a Brevibacterium nemzetségbe sorolható. A Brevibacterium CA-6 törzs azonban több jellemző tekintetében eltér a Brevibacterium nemzetségbe tartozó egyéb törzstípusoktól,' így például a Brevibacterium nemzetségbe tartozó egyéb törzseknek ostorokkal borított flagellumai vannak, míg a Brevibacterium CA-6 törzs flagellumai polárosak stb.It was found that the Brevibacterium CA-6 strain can be classified into the genus Brevibacterium by microscopic imaging (e.g., Gram staining, etc.) and physiological characteristics. However, the Brevibacterium CA-6 strain differs in several features from other strains of the genus Brevibacterium, such as other strains of the genus Brevibacterium having whip-covered flagellas, while the flagellas of the Brevibacterium CA-6 strain are polar, etc.
Megállapítottuk azt is, hogy a Corynebacterium CA53 törzs szoros rokonságban van a Corynebacterium equi törzzsel.It was also found that the Corynebacterium CA53 strain is closely related to the Corynebacterium equi strain.
Miként már közöltük, a találmány értelmében úgy járunk el, hogy szubsztrátumként kólsavat vagy kólsavsót tartalmazó tápközegen az adott tápközegen növekedni képes, a fentieknek megfelelő, az Arthrobacter, Brevibacterium vagy Corynebacterium nemzetségbe tartozó mikroorganizmus-törzset tenyésztünk.As stated above, the present invention comprises cultivating as a substrate a strain of a microorganism of the genus Arthrobacter, Brevibacterium or Corynebacterium capable of growing on a medium containing sulfuric or salt thereof.
A találmány szerinti eljárásban szubsztrátunrként szabad kólsavat is felhasználhatunk, azonban a kólsavat alkálifém-vagy alkáliföldfém-sója, például nátrium-kólát, kálium-kólát, kalcium-kólát vagy magnézium-kólát formájában is felhasználhatjuk. Szubsztrátűmként előnyösen alkálifém-kolátokat alkalmazunk. Ha szubsztrátumként kólátokat használunk fel, a kólátokból vízzel előre meghatározott koncentrációjú oldatot készítünk. Eljárhatunk úgy is, hogy a kólsawal sót képező, előre meghatározott mennyiségű alkálifém- vagy alkáliföldfémvegyületet oldunk fel vízben, és ehlrez az oldathoz adjuk a kólsavat; ekkor előre meghatározott mennyiségű kolátot tartalmazó vizes oldatot kapunk. A táptalaj kólsav-, illetve kólsavsó-tartahna széles határok között változhat; a táptalaj a szubsztrátumot (kólsavban kifejezve) például körülbelül 1—500 g/1 koncentrációban tartalmazhatja. Az (I) általános képletű kolánsav-származékok elérni kívánt hozamát, a tenyésztés körülményeit és a gazdasági hatékonyság (például kezelhetőség, feldolgozhatóság stb.) követelményeit figyelembe véve a kólsavat, illetve a kólsav-sókat előnyösen körülbelül 5-300 g/1, célszerűen körülbelül 10—200 g/1 koncentrációban alkalmazzuk (a megadott értékek kólsavra vonatkoznak).In the process of the invention, free sulfuric acid may also be used as the substrate, but it may also be used in the form of an alkali metal or alkaline earth metal salt such as sodium, potassium, calcium or magnesium. Alkali metal cholates are preferably used as substrates. When using chlates as the substrate, the chelates are prepared with a predetermined concentration of water. Alternatively, a predetermined amount of the alkali metal or alkaline earth metal compound which forms the salt with the colic acid is dissolved in water and the sulfuric acid is added thereto; an aqueous solution containing a predetermined amount of cholate is obtained. The medium may contain a wide variety of salts of tartaric acid and tartaric acid tartrate; the medium may contain, for example, from about 1 g to about 500 g / l of substrate (expressed as colic acid). Depending on the desired yield of the collanic acid derivatives of the formula (I), the culture conditions and the requirements of economic efficiency (e.g., manageability, processability, etc.), the sulfuric acid or salts thereof are preferably from about 5 to about 300 g / L, preferably about It is used at a concentration of 10-200 g / l (values given for colic acid).
A tenyésztést önmagában ismert módon hajthatjuk végre. Rendszerint rázott vagy szubmerz tenyésztést végzünk, folyékony tápközeg felhasználásával.The cultivation may be carried out in a manner known per se. Usually shake or submerged culture is performed using liquid medium.
Tápközegként a felhasznált mikroorganizmus számára asszimilálható tápanyagokat tartalmazó közegeket használhatunk fel. A tápközeg egyedüli szénforrásként is tartalmazhatja a kólsavat vagy a kólsav-sót, a tápközeghez azonban adott esetben további szénforrást, például pentózokat (így arabinózt vagy hasonló vegyületeket), hexózokat (így glükózt, mannózt, fruktózt, galaktózt stb.), diszacharidokat (így maltózt vagy hasonló vegyületeket), keményítő-bomlástermékeket (például dextrir.t vagy hasonló vegyületeket), cukoralkoholokat (például szorbitot vagy Hasonló vegyületeket), polialkoholokat (például glicerint vagy hasonló vegyületeket), a felsorolt szénforrások elegyeit és/vagy egyéb tápanyagokat, például polipeptont, peptont, húskivonatot, malátakivonatot, kukoricalekvárt, élesztőkivonatot, aminosavakat, a felsorolt tápanyagok elegyeit és hasonló anyagokat adhatunk. A további szénforrást és/vagy további tápanyagokat rendszerint körülbelül 0,1-10 g/1 koncentrációban adhatjuk a tápközeghez. Nitrogénforrásként például ammónium-szulfátot, ammónium-kloridot, ammónium-foszfátot, ammónium-nitrátot, nátrium-nitrátot, kálium-nitrátot és a felsorolt vegyületek elegyeit használhatjuk fel. A nitrogénforrást rendszerint körülbelül 0,5—5 g/1 koncentrációban adhatjuk a tápközeghez. A táptalajhoz továbbá szervetlen sókat, igy dikáliumhidrogénfoszfátoí, kálium-dihidrogénfoszfátot, magnézium-szulfátot és hasonló vegyületeket is adhatunk, rendszerint körülbelül 0,1-10 g/1 koncentrációban. A mikroorganizmust rázott vagy szubmerz tenyészetben 25-35 °C-on tenyészthetjük; a tenyésztés például 6 órától 5 napig terjedő időt vehet igénybe.Media containing assimilable nutrients for the microorganism used may be used as media. The medium may also contain the sole source of carbonic acid or the salt of sulfuric acid, but may optionally include additional carbon sources such as pentoses (such as arabinose or the like), hexoses (such as glucose, mannose, fructose, galactose, etc.), disaccharides (such as or similar compounds), starch degradation products (e.g., dextrir or the like), sugar alcohols (e.g., sorbitol or the like), polyalcohols (e.g., glycerol or the like), mixtures of the carbon sources listed, and / or other nutrients, such as polypeptone, peptone , meat extract, malt extract, corn jam, yeast extract, amino acids, mixtures of the listed nutrients and the like. The additional carbon source and / or additional nutrients may usually be added at a concentration of about 0.1 to about 10 g / L. Nitrogen sources include, for example, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium nitrate, sodium nitrate, potassium nitrate, and mixtures thereof. The nitrogen source is usually added at a concentration of about 0.5-5 g / l. Additionally, inorganic salts such as dipotassium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, magnesium sulfate and the like may be added to the medium, usually at a concentration of about 0.1 to about 10 g / L. The microorganism can be cultured in shake or submerged culture at 25-35 ° C; for example, breeding may take from 6 hours to 5 days.
A találmány szerinti eljárás során a szubsztrátumként felhasznált kólsav vagy kólsav-sók (1) általános képletű kolánsav-származékokká alakulnak, ezen kivül — amenynyiben a fermentációhoz Arthrobacter CA-35 törzset használunk fel - csekély mennyiségben 7a,12a-dihidroxi-3-keto-50-kolánsav is képződik. Amennyiben az Arthrobacter CA-35 törzs korábban felsorolt mutánsait használjuk fel, tapasztalataink szerint főtermékként az X helyén;csoportot tartalmazó (I) általános képletű kolánsav-származék, azaz 3a,7a-dihidroxi-12-keto-5j3kolánsav vagy e vegyület sója képződik. Abban az esetben tehát, ha 3a,7a-dihidroxi-12-keto-5j3-kolánsavat vagy e vegyület sóit kívánjuk előállítani, a fermentációhoz előnyösen az Arthrobacter CA-35 törzs mutánsait, célszerűen az Arthrobacter CA-35-A589-29-32 (FERM-P No. 5522, ATCC No. 31652), Arthrobacter CA-35A589-47 (FERM-P No. 5523, ATCC No. 31653) vagy Arthrobacter CA-35-A-1766-15 (FERM-P No. 5528, ATCC No. 31658) törzset használjuk fel. Ebből a szempontból különösen előnyösnek bizonyult az Arthrobacter CA-35-A589-29-32 és az Arthrobacter CA-35A589-47 törzs. Ha a fermentációhoz Brevibacterium CA-6 törzset használunk fel, a kólsav, illetve a kólsav-só (1) általános képletű kolánsav-származékokká alakul, és ugyanakkor csekély mennyiségben 7a-hidroxi-3,12diketo-Δ4 -kolénsav vagy' e vegyület sója is képződik. Ha a fermentációt Corynebacterium CA-53 törzzsel végezzük, a kólsav, illetve a kólsav-só (I) általános képletű kolánsav-származékokká és 7a-hidroxi-3,l2-diketoΔ4-kolénsawá vagy e vegyület sójává alakul át.The process according to the invention converts the sulfuric acid or salts of the sulfuric acid used as a substrate into the colanoic acid derivatives of the formula (1), except that, when fermenting with Arthrobacter CA-35, small amounts of 7a, 12a-dihydroxy-3-keto-50 are used. -colanoic acid is also formed. When using the above-listed mutants of the Arthrobacter CA-35 strain, it has been found that the main product is the cholanic acid derivative of the formula (I), i.e. 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5β-cholanoic acid or a salt thereof. Thus, in the case where 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5β-cholanoic acid or salts thereof are desired, mutants of the Arthrobacter CA-35 strain, preferably Arthrobacter CA-35-A589-29-32 (preferably FERM-P No. 5522, ATCC No. 31652), Arthrobacter CA-35A589-47 (FERM-P No. 5523, ATCC No. 31653) or Arthrobacter CA-35-A-1766-15 (FERM-P No. 5528). , ATCC No. 31658). In this regard, the strains Arthrobacter CA-35-A589-29-32 and Arthrobacter CA-35A589-47 have proved particularly advantageous. When the fermentation was used Brevibacterium strain CA-6, cholic acid or cholic acid salt (1) is formed cholanic acid derivatives of formula, in combination with low amounts of 7-hydroxy-Δ 4 3,12diketo -kolénsav or salt thereof 'in this compound is also formed. When fermented with Corynebacterium strain CA-53, the sulfuric acid or the salt of the sulfuric acid is converted to the collanic acid derivatives of formula (I) and 7α-hydroxy-3,12-diketoΔ 4 -cholinic acid or a salt thereof.
A fermentáció lezajlása után a felhalmozódott termékeket elkülönítjük a fermentléből, majd a termékeket tisztítjuk. Először az oldhatatlan anyagokat, például mikroorganizmus-sejteket stb. távolítjuk el a fermentléből önmagukban ismert módszerekkel, így szűréssel, centrifugálással vagy hasonló eljárással. Ezután a szűrlethez vagy a felülúszóhoz savat adunk; a sav (például sósav) hatására a termékek kiválnak a folyadékfázisból. Ugyanekkor az át nem alakult kólsav vagy kólsav-só is kiválik szabad kólsav formájában. A kivált csapadékot elkülönítjük, majd a szűrletet vagy a felülúszót közömbös szerves oldószerrel (például etilacetáttal) extraháljuk, és az extraktumot bepároljuk. Ezzel a módszerrel a fermentlében oldva maradt terméket és szubsztrátumot csaknem teljes egészében visszanyerhetjük. A bepárlás során kapott maradékot egyesítjük a savas kezeléskor kapott csapadékkal.After the fermentation is complete, the accumulated products are separated from the fermentation broth and the products are purified. First, insoluble materials such as microorganism cells, etc. is removed from the fermentation broth by methods known per se, such as filtration, centrifugation or the like. Subsequently, acid is added to the filtrate or supernatant; acid (such as hydrochloric acid) causes the products to separate from the liquid phase. At the same time, the unconverted cholic acid or the salt of cholic acid precipitates in the form of free cholic acid. The precipitate was collected and the filtrate or supernatant was extracted with an inert organic solvent (e.g. ethyl acetate) and the extract was evaporated. By this method, the product and substrate remaining dissolved in the fermentation broth can be recovered almost completely. The residue obtained by evaporation is combined with the precipitate from the acid treatment.
Az így kapott szilárd anyagból - amely a mikrobiológiai reakció során képződött termékek és a kólsav elegye - kromatográfiás úton különítjük el az egyes vegyületeket. Az Arthrobacter CA-35 törzs vagy mutánsai felhasználásakor kapott szilárd anyagot például a következőképpen dolgozhatjuk fel: A termékeket és a kólsavat a megfelelő metilészterekké alakítjuk, majdThe resulting solid, which is a mixture of the products formed during the microbiological reaction and the sulfuric acid, is chromatographed to separate the individual compounds. For example, the solid obtained using Arthrobacter CA-35 strain or mutants can be processed as follows: The products and the cholic acid are converted to the corresponding methyl esters and then
-14183 201 a metilészterek elegyét szilikagéllel töltött oszlopon kromatografáljuk. Eluálószerként rendre kloroformot, 99:1 térfogatarányú kloroform : etanol elegyet, végül 97:3 térfogatarányú kloroform : etanol elegyet használunk fel. A kívánt 7a-hidroxi-3,12-diketo-50-kolánsavmetilészter a kloroformos eluátumban jelenik meg. Az eluálást 99:1 térfogatarányú kloroform : etanol eleggyel folytatva először a melléktermékként képződött 7a,12ű-dihidroxi-3-keto-5|3-kolánsav oldódik le; a további eluátumfrakciók a kívánt 3a,7a-dihidroxi-12-keto-5/3kolánsav-metilésztert tartalmazzák. Végül az eluálást 97:3 térfogatarányú kloroform : etanol eleggyel fejezzük be; ekkor a kólsav-metilésztert oldjuk le az oszlopról. A kapott nietilésztereket ismert módon, hidrolízissel alakíthatjuk át a szabad savakká.The mixture of methyl esters was chromatographed on a silica gel column. Chloroform, 99: 1 chloroform: ethanol (v / v) and 97: 3 v / v chloroform: ethanol were used as eluent, respectively. The desired 7α-hydroxy-3,12-diketo-50-cholanoic acid methyl ester appears in the chloroform eluate. Elution with chloroform: ethanol (99: 1, v / v) first solves the 7a, 12? -Dihydroxy-3-keto-5? -Colanoic acid formed as a by-product; the remaining eluate fractions contain the desired methyl 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5/3-cholanoic acid. Finally, elution was completed with 97: 3 chloroform: ethanol; then dissolve the sulfuric acid methyl ester from the column. The resulting ethyl esters can be converted to the free acids by known methods of hydrolysis.
Abban az esetben, ha a fermentációt Brevibacterium CA-6 törzzsel vagy Corynebacterium CA-53 törzzsel végeztük, a termékeket például a következőképpen különíthetjük el: A termékek és a kólsav elegyét közvetlenül felvisszük egy szilikagéllel töltött oszlopra, és az oszlopot először 98:2, majd 97:3 térfogatarányú kloroform : etanol eleggyel eluáljuk. A kívánt 7a-hidroxi3.12- diketo-5)3-kolánsavat a 98:2 térfogatarányú kloroform : etanol elegy oldja le az oszlopról. Az eluálást 97:3 térfogatarányú kloroform : etanol eleggyel folytatva először a melléktermékként képződő 7a-hidroxi3.12- diketo-A4-kolénsavat oldjuk le; a további eluátumfrakciók a kívánt 3a,7a-dihidroxi-12-keto-5/5-kolánsavat tartalmazzák.In the case of fermentation with Brevibacterium CA-6 strain or Corynebacterium CA-53 strain, for example, the products can be isolated as follows: The mixture of products and cholic acid is directly applied to a column packed with silica gel and the column is first 98: 2 followed by Elute with 97: 3 v / v chloroform: ethanol. The desired 7α-hydroxy-3β, 12-diketo-5β-cholanoic acid is dissolved from the column using 98: 2 chloroform: ethanol. Elution with 97: 3 v / v chloroform: ethanol first solubilized the by-product 7a-hydroxy-3,12-diketo-A 4 -cholenic acid; the remaining eluate fractions contain the desired 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5/5-cholanoic acid.
A találmány szerinti eljárással előállított 3a,7a-dihidroxi-12-keto-5|3-kolánsavat vagy sóit Huang Minlon módszerrel redukálva könnyen átalakíthatjuk a kiváló epekőoldó hatással rendelkező kenodezoxi-kólsawá (CDCA).The 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5β-cholanoic acid or salts thereof produced by the process of the present invention can be readily converted to the excellent gallstone solubilizing keno-deoxycholic acid (CDCA) by the Huang Minlon method.
A 7a-hidroxi-3,12-diketo-50-kólsavat vagy sóit könynyen átalakíthatjuk dezoxi-kólsawá. Miként már közöltük, a dezoxi-kólsav a progeszteron és az adreno-kortikoszteroid-származékok szintézisének értékes kiindulási anyaga. A dezoxi-kólsav előállítása során a 7a-hidroxi3.12- diketo-5|3-kólsavat először vízelvonásnak vetjük alá, majd a kapott terméket ismert módon hidrogénezzük.The 7a-hydroxy-3,12-diketo-50-cholic acid or its salts can be readily converted to the deoxycholic acid. As stated above, deoxycholic acid is a valuable starting material for the synthesis of progesterone and adrenocorticosteroids. In the preparation of deoxycholic acid, the 7a-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholic acid is first dehydrated and the product obtained is hydrogenated in a known manner.
A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük.The following examples illustrate the invention without limiting it.
A. példaExample A
Mutánsok előállításaProduction of mutants
Arthrobacter CA-35 törzset (FERM-P No. 5145, ATCC No. 31651) ferde tenyészetben 0,5 % nátriumhidroxidot, 5,0 % kólsavat, 0,5 % peptont, 0,5 % élesztőkivonatot, 0,5 % nátriumkloridot és 1,5 % agart tartalmazó táptalajon („A” táptalaj) tenyésztünk. A tenyészetből platinakacsnyi mintát veszünk, és a mintával 200 mm hosszú, 21 mm átmérőjű kémcsőbe töltött 10 ml „B” tápközeget oltunk be. A „B” tápközeg 1 % nátriumhidroxidot, 10 % kólsavat, 0,2 % ammóniumnitrátot, 0,2 % kálium-dihidrogénfoszfátot, 0,5 % dikálium-hidrogénfoszfátot, 0,02 % magnéziumszulfátheptaliidrátot és 0,01 % élesztőkivonatot tartalmaz. Az elegyet rázás közben 24 órán át 30 °C-on inkubáljuk. Az így kapott tenyészetből 0,3 ml térfogatú mintát veszünk, és a mintával egy 200 mm hosszú, 21 mm átmérőjű kémcsőbe töltött 10 ml „C” tápközeget oltunk be. A ,,C” tápközeg 0,05 % nátriumhidroxidot, 0,5 % kólsavat, 0,5 % glükózt, 0,2 % ammónium-nitiátot, 0,2 % kálium-dihidrogénfoszfátot, 0,5 % dikáliumhidrogénfoszfátot, 0,02 % magnéziumszulfát-heptahidrátot és 0,01 % élesztőkivonatot tartalmaz. Az elegyet rázáf közben 15-16 órán át 30°C-on inkubáljuk.Arthrobacter CA-35 strain (FERM-P No. 5145, ATCC No. 31651) in oblique culture 0.5% sodium hydroxide, 5.0% sulfuric acid, 0.5% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride and The medium was grown on 1.5% agar medium (Medium A). A platinum loop sample was taken from the culture and the sample was inoculated with 10 ml of Medium B into a 200 mm long, 21 mm diameter test tube. Medium B contains 1% sodium hydroxide, 10% sulfuric acid, 0.2% ammonium nitrate, 0.2% potassium dihydrogen phosphate, 0.5% dipotassium hydrogen phosphate, 0.02% magnesium sulfate heptalohydrate and 0.01% yeast extract. The mixture was incubated for 24 hours at 30 ° C with shaking. A sample of 0.3 ml was taken from the resulting culture and the sample was inoculated with 10 ml of "C" media into a 200 mm long, 21 mm diameter test tube. Medium C contains 0.05% sodium hydroxide, 0.5% sulfuric acid, 0.5% glucose, 0.2% ammonium nitrate, 0.2% potassium dihydrogen phosphate, 0.5% dipotassium hydrogen phosphate, 0.02% Contains magnesium sulfate heptahydrate and 0.01% yeast extract. The mixture was incubated under shaking for 15-16 hours at 30 ° C.
A logaritmikus szaporodási szakaszban lévő mikroorganizmus-sejteket 0,45 μ pórusméretű membránszűrőn aszeptikus körülmények között kiszűrjük, 20 ml 0,1 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH = 7,0) mossuk, majd 25 ml, a mosófolyadékkal azonos pufferoldatban szuszpendáljuk.The microorganism cells in the logarithmic growth phase are aseptically filtered through a 0.45 μm membrane filter, washed with 20 ml of 0.1 M phosphate buffer pH 7.0 and resuspended in 25 ml of the same wash solution.
A mutagén kezelést a következőképpen végezzük:The mutagenic treatment is carried out as follows:
ml sejtszuszpenziót egy 200 mm hosszú, 21 mm átmérőjű kémcsőbe töltünk, a sejtszuszpenzióhoz 50 pg/ml végső koncentrációnak megfelelő mennyiségű N-metilN'-nitro-N-nitrozo-guanidint adunk, és az elegyet rázás közben 45 percig 30°C-on inkubáljuk. Ilyen körülmények között az Arthrobacter CA-35 törzs sejtjeinek körülbelül 80 %-a elpusztul.The cell suspension was transferred to a 200 mm long, 21 mm diameter tube, the final concentration of N-methylN'-nitro-N-nitrosoguanidine corresponding to a final concentration of 50 pg / ml was added and the mixture was incubated for 45 minutes at 30 ° C. . Under these conditions, approximately 80% of the cells of the Arthrobacter CA-35 strain are killed.
A kezelt sejteket 0,45 μ pórusméretű membránszűrőn aszeptikus körülmények között kiszűrjük, 20 ml 0,1 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH = 7,0) mossuk, majd 25 ml, a mosófolyadékkal azonos pufferoldatban szuszpendáljuk. A kapott sejtszuszpenziót steril normál vizes nátriumklorid-oldattal hígítjuk, majd agar-lemezeken terítjük szét. A felhasznált táptalaj („D” táptalaj) 0,1 % nátriumhidroxidot, 1,0 % kólsavat, 0,2 % ammóniumnitrátot, 0,2 % kálium-dihidrogénfoszfátot, 0,5 % dikálium-hidrogénfoszfátot, 0,02 % magnéziumszulfátheptahidrátot, 0,01 % élesztőkivonatot és 1,5 % agart tartalmaz. A lemezekre annyi sejtszuszpenziót viszünk fel, hogy minden egyes lemezen 300-500 telep képződjék A lemezeket 4 napon át 30°C-on inkubáljuk. A kialakult, tűhegynyi telepeket elkülönítjük, majd agarlemezen 24 órán át 30 °C-on inkubáljuk. A felhasznált táptalaj („E” táptalaj) 0,5 % peptont, 0,5 % élesztőkivonatot, 0,5 % nátriumkloridot és 1,5 % agart tartalmaz. Az „E” táptalajból készített lemezeken fejlődő telepeket replika-módszerrel a „D” táptalajból készített lemezekre visszük át, majd 20 órán át 30 °C-on inkubáljuk.Treated cells were aseptically filtered through a 0.45 μm membrane filter, washed with 20 mL of 0.1 M phosphate buffer, pH 7.0, and resuspended in 25 mL of the same buffer. The resulting cell suspension was diluted with sterile normal aqueous sodium chloride solution and spread on agar plates. The medium used (Medium D) was 0.1% sodium hydroxide, 1.0% sulfuric acid, 0.2% ammonium nitrate, 0.2% potassium dihydrogen phosphate, 0.5% dipotassium hydrogen phosphate, 0.02% magnesium sulfate heptahydrate, 0 , Contains 01% yeast extract and 1.5% agar. Plates of cell suspensions are plated to produce 300-500 colonies per plate. Plates are incubated for 4 days at 30 ° C. The formed needle-tip colonies were harvested and incubated on an agar plate for 24 hours at 30 ° C. The medium used (Medium E) contains 0.5% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride and 1.5% agar. Colonies developing on plates prepared from medium "E" were replicated onto plates prepared from medium "D" and incubated for 20 hours at 30 ° C.
Az „E” táptalajról elkülönített azon telepeket, amelyek a következő tenyésztési lépésben a „D” táptalajból készített lemezen nem növekednek, ferde agar-tenyészetben 24 órán át 30 °C-on inkubáljuk. A felhasznált táptalaj („F” táptalaj) 0,1 % nátriumhidroxidot, 1,0% kólsavat, 0,5 % peptont, 0,5 % élesztőkivonatot, 0,5 % nátriumkloridot és 1,5 % agart tartalmaz. A ferde tenyészetből platinakacsnyi mintát veszünk, a mintával egy 200 mm hosszú, 21 mm átmérőjű kémcsőbe töltött 10 ml tápközeget oltunk be, és az elegyet rázás közben 3 napon át 30 °C-on inkubáljuk. A felhasznált tápközeg („G” táptalaj) 0,5 % nátriumhidroxidot, 5,0% kólsavat, 0,5 % glükózt, 0,2 % ammónium-nitrátot, 0,2 % káliumdihidrogénfoszfátot, 0,5 % dikálium-hidrogénfoszfátot, 0,02 % magnéziumszulfát-heptahidrátot és 0,01 % élesztőkivonatot tartalmaz.Colonies isolated from Medium E, which do not grow on the plate from Medium D in the next culture step, are incubated in inclined agar culture at 30 ° C for 24 hours. The medium used (Medium F) contains 0.1% sodium hydroxide, 1.0% colic acid, 0.5% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride and 1.5% agar. A sample of platinum loop was taken from the slant culture, the sample was inoculated with 10 ml of medium into a 200 mm long, 21 mm diameter test tube and incubated for 3 days at 30 ° C with shaking. The medium used (medium "G") was 0.5% sodium hydroxide, 5.0% cholic acid, 0.5% glucose, 0.2% ammonium nitrate, 0.2% potassium dihydrogen phosphate, 0.5% dipotassium hydrogen phosphate, 0 , 02% magnesium sulfate heptahydrate and 0.01% yeast extract.
A „G” tápközegben felhalmozódott termékeket vékonyrétegkromatográfiásan elemezzük. A törzset, amely az elemzési adatok szerint szelektíven 3a,7a-dihidroxi-12-keto-5(3-kolánsavat, illetve e sav sóit termeli, Arthrobacter CA-35-M-965-3 törzsnek neveztük el.Products accumulated in Medium G are analyzed by TLC. The strain which selectively produced 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5- (3-cholanoic acid and salts of this acid) was named Arthrobacter CA-35-M-965-3.
A fenti eljárást a következőkben ,,M” eljárásnak nevezzük. Ezután az „M” eljárást az Arthrobacter CAJ5The above procedure is hereinafter referred to as the "M" procedure. Thereafter, the "M" procedure is performed on Arthrobacter CAJ5
-151-151
183 201183,201
35-Μ-965-3 törzsön hajtjuk végre. A mutagén kezelés hatására három olyan törzset kapunk, amely szelektíven 3a,7a-dihidroxi-12-keto-5/3-kolánsavat, illetve e sav sóit termeli. Ezeket a törzseket Arthrobacter CA-35-A589, Arthrobacter CA-35-A849, illetve Arthrobacter CA-35A-1071 törzseknek neveztük el.35-Μ-965-3. Mutagen treatment results in three strains which selectively produce 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5/3-cholanoic acid and salts thereof. These strains were named Arthrobacter CA-35-A589, Arthrobacter CA-35-A849, and Arthrobacter CA-35A-1071.
Az Arthrobacter CA-35-A589 törzs telepeiből két jobb termelőképességű törzset különítettünk el. Ezeket a törzseket Artlirobacter CA-35-A589-29-32, illetve Arthrobacter CA-35-A589-47 törzsnek neveztük el. Az Artlirobacter CA-35-A-1071 törzs telepeiből is elkülönítettünk egy jobb termelőképességű törzset, amit Arthrobacter CA-35-A-1071-15 törzsnek neveztünk.Colonies of Arthrobacter CA-35-A589 strains were isolated with two higher productivity strains. These strains were named Artlirobacter CA-35-A589-29-32 and Arthrobacter CA-35-A589-47. Colonies of Artlirobacter CA-35-A-1071-15 were also isolated from colonies of Artlirobacter CA-35-A-1071-15.
Az „M” eljárást az Arthrobacter CA-35-A849 törzsre alkalmazva egy további jobb termelőképességű törzset kaptunk, amit Arthrobacter CA-35-A-1448 törzsnek neveztünk. Az Arthrobacter CA-35-A-1475 törzset úgy alakítottuk ki, hogy az „M” eljárást az Arthrobacter CA-35-A-1448 törzsön hajtottuk végre. Az Arthrobacter CA-35-A-1766 törzset szintén az „M” eljárással alakítottuk ki; ebben az esetben alaptörzsként az Arthrobacter CA-35-A-1071 törzset alkalmaztuk. Az Arthrobacter CA-35-A-1766-15 törzset a kapott Artlirobacter CA-35A-1766 törzs telepeiből különítettük el.Applying the "M" procedure to Arthrobacter CA-35-A849 gave an additional strain with higher productivity, called Arthrobacter CA-35-A-1448. The Arthrobacter CA-35-A-1475 strain was constructed by performing procedure "M" on the Arthrobacter CA-35-A-1448 strain. Arthrobacter strain CA-35-A-1766 was also generated by the "M" procedure; in this case, the strain Arthrobacter CA-35-A-1071 was used as the base strain. Arthrobacter CA-35-A-1766-15 was isolated from colonies of the resulting Artlirobacter CA-35A-1766.
Az Artlirobacter CA-35-Y-37-12 törzset a következő eljárással alakítjuk ki:The Artlirobacter strain CA-35-Y-37-12 was developed by the following procedure:
Az Arthrobacter CA-35 törzs (FERM-P No. 5145, ATCC No. 31651) „A” táptalajon készített ferde tenyészetéből platinakacsnyi mintát veszünk. A mintával 200 mm hosszú, 21 mm átmérőjű kémcsőbe töltött 10 ml „B” tápközeget oltunk be, és az elegyet rázás közben 20 órán át 30°C-on inkubáljuk. A mikroorganizmussejteket 10 000 fordulat/perc sebességgel végzett centrifugálással elkülönítjük; a centrifugálást 5 percig 5 °C-on, aszeptikus körülmények között végezzük. A kapott sejteket 10 ml steril vízben szuszpendáljuk, a szuszpenziótAn aliquot of platinum was taken from the slant culture of Arthrobacter CA-35 strain (FERM-P No. 5145, ATCC No. 31651) in culture medium A. The sample was inoculated with 10 ml of medium B into a 200 mm long, 21 mm diameter test tube and incubated with shaking for 20 hours at 30 ° C. The microorganism cells were harvested by centrifugation at 10,000 rpm; centrifugation for 5 minutes at 5 ° C under aseptic conditions. The resulting cells were suspended in 10 ml of sterile water, the suspension
7,5 cm átmérőjű Petri-csészébe töltjük, a Petri-csészét csíramentes dobozban elhelyezett 15 W-os ultraibolya fényforrás (2537 A) alá helyezzük (a csésze és a fényforrás távolsága kb. 27 cm), és 10 percig ultraibolya fénnyel besugározzuk. Ilyen körülmények között az Arthrobacter CA-35 törzs sejtjeinek körülbelül 99,9 %-a elpusztul.Place in a 7.5 cm Petri dish, place the Petri dish under a 15 W ultraviolet light source (2537 A) in a seed-free box (approx. 27 cm distance between the dish and the light source) and irradiate with ultraviolet light for 10 minutes. Under these conditions, approximately 99.9% of the cells of the Arthrobacter CA-35 strain are killed.
Besugárzás után a mikroorganizmus-sejteket membránszűrőn elkülönítjük, 0,1 mólos foszfátpuffer-oldattal mossuk, majd a felhasznált mosófolyadékkal azonos foszfátpuffer-oldatban szuszpendáljuk. A kapott szuszpenziót normál vizes nátriumklorid-oldattal hígítjuk, majd a „D”-,,G” tápközegeken tenyésztjük a korábban közöltek szerint. Az alaptörzsnél jobb termelőképességű mutáns törzset kapunk, amely szelektíven 3a,7a-dihidroxi-12-keto-50-kolánsavat, illetve e vegyület sóit termeli.After irradiation, the microorganism cells were separated on a membrane filter, washed with 0.1 M phosphate buffer, and resuspended in the same phosphate buffer as the washing liquid used. The resulting suspension is diluted with normal aqueous sodium chloride solution and cultured on media "D" to "G" as previously described. A mutant strain with higher productivity than the parent strain is produced which selectively produces 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-50-cholanoic acid or salts thereof.
7. példaExample 7
Arthrobacter CA-35 törzset (FERM-P No. 5145, ATCC No- 31651) tenyésztünk a következő körülmények között:Arthrobacter CA-35 strain (FERM-P No. 5145, ATCC No. 31651) was cultured under the following conditions:
A tápközeg összetétele:Composition of the medium:
Kólsav 100 gCholic acid 100 g
Ammónium-nitrát 2,0 gAmmonium nitrate 2.0 g
A komponensek összekeverésével kapott, 1 liter térfogatú tápközeget 100 ml-es részletekben 10, egyenként 500 ml űrtartalmú Sakaguchi-lombikba töltjük szét, majd a lombikokba töltött táptalajt 15 percig 120 C-on autoklávban kezeljük. Az egyes lombikokhoz 10-10 ml oltótenyészetet adunk (az oltótenyészet előállítása során az Artlirobacter CA-35 törzset a fenti összetételű tápközegen, rázás közben 2 napig 30°C-on inkubáljuk). Az egyes lombikokba töltött elegyeket rázógépen 2 napon át 30 °C-on inkubáljuk.The 1 liter medium obtained by mixing the components is dispensed in 100 ml portions into 10 Sakaguchi flasks of 500 ml each, and the flasks are autoclaved for 15 minutes at 120 ° C. To each flask was added 10-10 ml seed culture (Artlirobacter CA-35 strain was incubated for 2 days at 30 ° C with shaking to prepare seed culture). The mixtures in each flask were incubated on a shaker for 2 days at 30 ° C.
A tenyésztés befejeztével a fermentleveket egyesítjük, és a mikroorganizmus-sejteket centrifugálással eltávolítjuk. A felülúszót 600 ml 1 n vizes sósavoldattal megsavanyítjuk. A kivált csapadékot elkülönítjük, és a folyadékfázist 1 liter etilacetáttal extraháljuk. Az extrák tumból forgó bepárlókészüléken lepároljuk az etilacetátot, és a kapott maradékot egyesítjük az előzőekben elkülönített csapadékkal. 85 g szilárd anyagot kapunk, amely kólsav és kolánsav-származékok keveréke,At the end of the culture, the fermentation broths are pooled and the microorganism cells are removed by centrifugation. The supernatant was acidified with 600 ml of 1 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate was collected and the liquid phase was extracted with 1 L of ethyl acetate. The extracts were evaporated from ethyl acetate on a rotary evaporator and the resulting residue was combined with the previously separated precipitate. 85 g of a solid are obtained which is a mixture of colic acid and colanoic acid derivatives
A kapott elegy kis mintájából 1 %-os metanolos oldatot készítünk. 10 μΐ metanolos oldatot μBondaρak C-J8 oszloppal felszerelt nagysebességű folyadékkromatográfiás berendezésbe (HLC-GPC-244 típusú berendezés; gyártja a Waters cég, Amerikai Egyesült Államok) fecskendezünk.A small sample of the resulting mixture was prepared into a 1% methanol solution. 10 μΐ of methanolic solution was injected into a high performance liquid chromatography apparatus (type HLC-GPC-244, manufactured by Waters, USA) equipped with μBondaρak C-J8 column.
Az oszlopot 1 ml/perc sebességgel 30:70 térfogatarányú víz - metanol eleggyel (pH - 2,5) eluáljuk, és mérjük az eluátum törésmutatóját.The column is eluted with water / methanol (pH = 2.5) (30:70 v / v) and the refractive index of the eluate is measured.
A kapott kromatogramot az 1. ábrán mutatjuk be. Az 1. ábrán feltüntetett A, B, C és D csúcs — a felvett referenciamintákkal összehasonlítva - rendre a következő vegyületeknek felel meg: 7a-hidroxi-3,12-dikeíoSú-kolánsav, 3a,7a-dihidroxi-l 2-keto-5Ú-kolánsav,The chromatogram obtained is shown in Figure 1. The peaks A, B, C, and D in Figure 1, when compared with the reference samples taken, correspond respectively to the following compounds: 7a-hydroxy-3,12-dicarboxylic acid, 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5? cholanic,
7a,12a-dihidroxi-3-keto-5i3-kolánsav és kólsav.7a, 12a-dihydroxy-3-keto-5β-cholanoic acid and colic acid.
Az A, B és C csúcsoknak megfelelő frakciókból elkülönítjük a termékeket, és a termékek szerkezetét tömegspektrum, infravörös spektrum és NMR-spektrum felvételévei vizsgáljuk. A spektrumok adatai egyértelműen igazolják, hogy termékekként rendre 7a-hidroxi3,12-diketo-5ú-kolánsavat, 3a,7a-dihidroxi-12-keto-5/3kolánsavat és 7a,Í2oí-dihidroxi-3-keto-5/3-kolánsavat kaptunk. A 2., 3. és 4. ábrán az A, B és C csúcsnak megfelelő frakciókból elkülönített vegyületek metilésztereinek infravörös spektrumát mutatjuk be, a hiteles minták (A1, B', illetve C* jelű termékek) spektrumaival összehasonlítva.The products from the fractions corresponding to peaks A, B and C were separated and the structure of the products was analyzed by mass spectra, infrared spectra and NMR spectra. The data of the spectra clearly show that 7a-hydroxy-3,12-diketo-5? -Cholanoic acid, 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5/3-cholanoic acid and 7a, 12'-dihydroxy-3-keto-5/3-cholanoic acid, respectively we got. Figures 2, 3 and 4 show the infrared spectra of the methyl esters of the compounds isolated from the fractions corresponding to peaks A, B, and C as compared to those of authentic samples (products A 1 , B ', and C *).
Az A, B és C csúcsnak megfelelő vegyületek és metilésztereik olvadáspont-értékeit a 2. táblázatban közöljük.The melting point values of the compounds corresponding to peaks A, B and C and their methyl esters are shown in Table 2.
Az egyes termékek hozamát, valamint az át nem alakult kólsav mennyiségét az 1. ábrán bemutatott kromatogram alapján, az egyes görbeszakaszok alatti területek arányából számítottuk ki. Az eredményeket a 3. táblázatban közöljük.The yields of each product and the amount of unconverted cholic acid were calculated from the ratio of areas under each curve from the chromatogram shown in Figure 1. The results are shown in Table 3.
-16183 201-16183 201
2. táblázatTable 2
3. táblázatTable 3
2. példaExample 2
Az 1. példában közöltek szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a tápközeghez 5,0 g/l glükózt is adunk. 91,0 g szilárd terméket kapunk, amely átalakulatlan kólsav és kolánsav-származékok keveréke. Ezt a szilárd anyagot 270 ml metanolban oldjuk, és az oldathoz 9 ml tömény vizes sósavoldatot adunk. A kapott oldatot 20 percig visszafolyatás közben forralva a szabad savakat a megfelelő rnetilészterekké alakítjuk.The procedure of Example 1 was followed except that 5.0 g / L glucose was added to the medium. 91.0 g of a solid product are obtained, which is a mixture of unconverted cholic acid and collanic acid derivatives. This solid was dissolved in methanol (270 mL) and concentrated hydrochloric acid (9 mL) was added. The resulting solution is refluxed for 20 minutes to convert the free acids to the corresponding methyl esters.
1200 mm hosszú, 70 mm átmérőjű oszlopba 1500 g szilikagél C-200-at töltünk, és a fentiek szerint előállított metilésztereket a szilikagélen adszorbcáltatjuk. A géloszlopot kloroformmal eluáljuk; ekkor 25,1 g 7a-hidroxi3,12-diketo-5/3-kolánsav-metilésztert kapunk. Ezután az eluálást 99:1 térfogatarányú kloroform : etanol eleggyel folytatjuk. Az első frakciókból 1,40 g 7a,12a-dihidroxi3-keto-5(3-kolánsav-metilésztert, majd a további frakciókból 56,4 g 3a,7a-dihidroxi-12-keto-50-kolánsavmetilésztert különítünk el.A 1200 mm long column, 70 mm in diameter, is loaded with 1500 g of silica gel C-200 and the methyl esters prepared as above are adsorbed onto silica gel. The gel column was eluted with chloroform; 25.1 g of methyl 7a-hydroxy-3,12-diketo-5/3-cholanoic acid are obtained. The elution was then continued with chloroform: ethanol (99: 1 by volume). From the first fractions 1.40 g of 7a, 12a-dihydroxy-3-keto-5- (3-cholanoic acid methyl ester) and from the remaining fractions 56.4 g of 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-50-cholanoic acid methyl ester were isolated.
A kapott metilészterek hidrolízisével 24,8 g 7ahidroxi-3,12-diketo-50-kolánsavat, 1,38 g 7a,12a-dihidroxi-3-keto-5|8-kolánsavat és 56,0 g 3a,7a-dilridroxi12 keto-5/3-kolánsavat állítunk elő.Hydrolysis of the resulting methyl esters yielded 24.8 g of 7-hydroxy-3,12-diketo-50-cholanoic acid, 1.38 g of 7a, 12a-dihydroxy-3-keto-5,8-cholanoic acid and 56.0 g of 3a, 7a-dilridroxy -5 / 3-cholanoic acid was prepared.
3. példaExample 3
Az 1. példában közöltek szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy változtatjuk a kólsav koncentrációját, és a reakcíóelegyhez a felhasznált kólsav mennyiségére vonatkoztatva 10 súly % nátriumhidroxidot is adunk. A képződött termékek és az át nem alakult kólsav mennyiségét a 4. táblázatban soroljuk fel.The procedure of Example 1 was followed except that the concentration of the sulfuric acid was changed and 10% by weight of sodium hydroxide was added to the reaction mixture based on the amount of sulfuric acid used. The amount of formed products and the amount of unconverted cholic acid are listed in Table 4.
4. táblázatTable 4
-17183 201-17183 201
4. példaExample 4
A 2. példában közöltek szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a lombikokat rázógépen, 24 órán át 30°C-on inkubáljuk. 98,0 g szilárd anyagot kapunk, amely a termékek és az át nem alakult kólsav elegye. Az elegy összetételét az 1. példában ismertetett nagysebességű folyadékkromatográfiás eljárással határozzuk meg. Az eredményeket az 5. táblázatban közöljük.The procedure of Example 2 was followed, except that the flasks were incubated for 24 hours at 30 ° C. 98.0 g of a solid are obtained which is a mixture of the products and the unconverted cholic acid. The composition of the mixture was determined by high performance liquid chromatography as described in Example 1. The results are reported in Table 5.
5. táblázatTable 5
Glükóz 5,0 gGlucose 5.0 g
Csapvíz q.s. ad 1 literTap water q.s. gives 1 liter
A tápközeg komponenseit — a glükóz kivételével csapvízzel keverjük össze, az oldat térfogatát 800 ml-re állítjuk be, és az oldatot autoklávban 15 percig 120 C-on hőkezeljük. A glükózt 200 ml csapvízben oldjuk, és az oldatot autoklávban 30 percig 110°C-on hőkezeljük. Lehűlés után az oldatokat egyesítjük, és a kapott, 1 liter térfogatú fermentációs közeget egyenlő részletekben 10 db, egyenként 500 ml térfogatú Sakaguchi-lombikba töltjük szét aszeptikus körülmények között. Minden egyes lombikba 2 ml oltótenyészetet mérünk be. Az oltótenyészet előállítása során a törzset a fentivel azonos összetételű tápközegen rázás közben 14 órán át 30 C-on tenyésztjük. A lombikokat 3 napon át rázógépen, 30 °C-on inkubáljuk.The medium components - with the exception of glucose - are mixed with tap water, the solution is made up to 800 ml and the solution is autoclaved for 15 minutes at 120 ° C. The glucose was dissolved in 200 ml of tap water and the solution was autoclaved for 30 minutes at 110 ° C. After cooling, the solutions were combined and the resulting fermentation medium (1 liter) was aliquoted into 10 Sakaguchi flasks (500 ml each) under aseptic conditions. Add 2 ml seed culture to each flask. The seed culture is prepared by culturing the strain in a medium of the same composition as above with shaking for 14 hours at 30 ° C. The flasks were incubated for 3 days on a shaker at 30 ° C.
A tenyésztési időszak végén a fennentieveket egyesítjük, és a mikroorganizmus-sejteket centrifugáiással eltávolítjuk. A felülúszót 600 ml 1 n vizes sósavoldattal megsavanyítjuk. A kivált csapadékot elkülönítjük, és az oldatot 1 liter etilacetáttal extraháljuk. Az extraktumból forgó bepárlókészüléken lepároljuk az etilacetátot, és a maradékot egyesítjük az előzőekben elkülönített csapadékkal. 99,3 g szilárd anyagot kapunk, amely kolánsavszármazékok és kólsav elegye.At the end of the culture period, the supernatants were pooled and the microorganism cells removed by centrifugation. The supernatant was acidified with 600 ml of 1 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate was collected and the solution was extracted with ethyl acetate (1 L). The extract was evaporated from the extract on a rotary evaporator and the residue was combined with the previously separated precipitate. 99.3 g of a solid is obtained which is a mixture of collanic acid derivatives and cholic acid.
A kapott elegy kis mintájából 2 %-os metanolos oldatot készítünk. 10 μΐ metanolos oldatot μBondapak C-l8 oszloppal felszerelt nagysebességű folyadékkromatográfiás berendezésbe (HLC-GPC-244 típusú berendezés) fecskendezünk.A small sample of the resulting mixture was prepared into a 2% methanol solution. 10 μΐ of methanolic solution was injected into a high performance liquid chromatography apparatus (HLC-GPC-244 type) equipped with μBondapak C-18 column.
Az oszlopot 1 ml/perc sebességgel 30:70 térfogatarányú víz: metanol eleggyel (pH = 4,0) eluáljuk, és mérjük az eluátum törésmutatóját.The column was eluted with water / methanol (pH 4.0), 30:70 (v / v) at 1 ml / min and the refractive index of the eluate was measured.
A kapott kromatogramot az 5. ábrán mutatjuk be. Az 5. ábrán megjelölt B és D csúcs megfelel a 3a,7a-dihidroxi-12-keto-5/3-kolánsav, illetve a kólsav hiteles mintáján mért csúcsnak.The chromatogram obtained is shown in Figure 5. The peaks B and D in Figure 5 correspond to the peak of the authentic sample of 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5/3-cholanoic acid and colic acid, respectively.
A B csúcsnak megfelelő frakcióból elkülönítjük a terméket, és a termék szerkezetét tömegspektrum, infravörös spektrum és NMR-spektrum felvételével vizsgáljuk. A spektrumok adatai egyértelműen igazolják, hogy termékként 3a,7a-dihidroxi-l 2-keto-50-kolánsavat kaptunk.The product from the fraction corresponding to peak B was isolated and the structure of the product was examined by mass spectra, infrared spectra and NMR spectra. The spectral data clearly indicate that 3a, 7a-dihydroxy-1,2-keto-50-cholanoic acid was obtained as a product.
Az egyes termékek hozamát, valamint az át nem alakult kólsav mennyiségét az 5. ábrán bemutatott kromatogram alapján, az egyes görbeszakaszok alatti területek arányából számítottuk ki. Az eredményeket a 7. táblázatban közöljük. ’The yields of each product and the amount of unconverted cholic acid were calculated on the basis of the chromatogram depicted in Figure 5 and the ratio of areas under each curve. The results are shown in Table 7. '
6. példaExample 6
Arthrobacter CA-35-A589-29-32 (FERM-P No. 5521, ATCC No. 31652) törzset tenyésztünk a következő körülmények között:Arthrobacter CA-35-A589-29-32 (FERM-P No. 5521, ATCC No. 31652) was cultured under the following conditions:
A tápközeg összetétele:Composition of the medium:
7. táblázatTable 7
*A konverzióarányt a területarány alapján számítottuk 65 ki.* The conversion rate was calculated based on the area ratio of 65.
-181-181
7. példaExample 7
183 201183,201
9. példaExample 9
A 6. példában közöltek szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a lombikokba a 6. példa szerint felhasznált 2 ml oltótenyészet helyett mikroorganizmus-sejtszuszpenziót adunk. A sejtszuszpenziót úgy állítjuk elő, hogy 10 ml oltótenyészetből centrifugálással elkülönítjük a sejteket, majd a sejteket 10 ml steril vízben szuszpendáljuk. Termékként 99,5 g szilárd anyagot kapunk, amely kolánsav-származékok és át nem alakult kólsav elegye. Ezt a szilárd anyagot 270 ml metanolban oldjuk, és az oldathoz 9 ml tömény vizes sósavoldatot adunk. A kapott oldatot 20 percig visszafolyatás közben forralva a kólsavat és a fermentáció tennékeit a megfelelő metilészterekké alakítjuk.The procedure of Example 6 was followed, except that the flasks were replaced with a microorganism cell suspension instead of the 2 ml seed culture used in Example 6. The cell suspension is prepared by separating the cells from the seed culture by centrifugation in 10 ml of seed culture and resuspending in 10 ml of sterile water. 99.5 g of product are obtained in the form of a solid which is a mixture of collanic acid derivatives and unconverted cholic acid. This solid was dissolved in methanol (270 mL) and concentrated hydrochloric acid (9 mL) was added. The resulting solution was refluxed for 20 minutes to convert the sulfuric acid and the fermentation products to the corresponding methyl esters.
1200 mm hosszú, 70 mm átmérőjű oszlopba 1500 g szilikagél C-2Ö0-at töltünk, és a fentiek szerint előállított metilésztereket a szilikagélen adszorbeáltatjuk. A géloszlopot 99:1 térfogatarányú kloroform: etanol eleggyel eluáljuk. 102,0 g 3a,7a-dihidroxi-12-keto-5(3-kolánsavmetilésztert kapunk, amelyből hidrolízissel 98,5 g 3α,7adihidroxi-12-keto-5/3-kolánsavat állítunk elő.A column of 1200 mm length, 70 mm diameter, is loaded with 1500 g of silica gel C-20,000 and the methyl esters prepared as above are adsorbed onto silica gel. The gel column was eluted with 99: 1 chloroform: ethanol (v / v). 102.0 g of 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5- (3-cholanoic acid methyl ester) are obtained, which is hydrolyzed to give 98.5 g of 3α, 7adihydroxy-12-keto-5/3-collanoic acid.
8. példaExample 8
A 6. példában közöltek szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy változtatjuk a kólsav koncentrációját, a fermentációs elegyhez a felhasznált kólsav mennyiségére vonatkoztatva 10 súly % nátriumhidroxidot adunk, és a csapadék leválasztása során 1 g nátriumhidroxidra vonatkoztatva 60 ml 1 n vizes sósavoldatot használunk fel. A konverzió-arányokat, az elért hozamot, valamint az át nem alakult kólsav mennyiségét a 8. táblázatban tüntetjük fel.Example 6, except that the concentration of the sulfuric acid was changed, 10% by weight of sodium hydroxide was added to the fermentation broth and 60 ml of 1N aqueous hydrochloric acid solution per 1 g of sodium hydroxide was added to the precipitate. . The conversion rates, yields, and amount of unconverted cholic acid are shown in Table 8.
A 6. példában közöltek szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy az Arthrobacter CA-35-A589-29-32 törzs helyett Arthrobacter CA-35-A589-47 törzset (FERM-P No. 5523, ATCC No. 31653) használunk fel, 50 g/1 kólsavat és 5 g/1 nátriumhidroxidot adunk a fermentációs közeghez, és az egyes lombikokat 35 órán át 30°C-on inkubáljuk. 49,31 g szilárd anyagot kapunk, amely a fermentációs termékek és az át nem alakult kólsav elegye.The procedure of Example 6 was followed except that Arthrobacter CA-35-A589-47 (FERM-P No. 5523, ATCC No. 31653) was used in place of Arthrobacter CA-35-A589-29-32. 50 g / l sulfuric acid and 5 g / l sodium hydroxide were added to the fermentation medium and each flask was incubated for 35 hours at 30 ° C. 49.31 g of a solid is obtained which is a mixture of fermentation products and unconverted sulfuric acid.
Az elegyet a 6. példában közölt körülmények között nagysebességű folyadékkromatográfiás elemzésnek vetjük alá.The mixture was subjected to high performance liquid chromatography under the conditions described in Example 6.
A kapott kromatogramot a 6. ábrán mutatjuk be. A kromatogram A, B, C és D csúcs - hiteles mintákkal végzett összehasonlítás alapján - rendre a 7a-hidroxi3,12-diketo-5/3-kolánsavnak, 3a,7a-dihidroxi-12-keto-5/ikolánsavnak, 7a,12a-dihidroxi-3-keto-5/3-kolánsavnak, illetve kólsavnak felel meg.The chromatogram obtained is shown in Figure 6. The chromatogram peaks A, B, C and D for 7a-hydroxy-3, 12-diceto-5/3-cholanoic acid, 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5 / icolanoic acid, 7a, 12a, respectively, corresponding to -dihydroxy-3-keto-5/3-cholanoic acid or colic acid.
Az A, B, C és D csúcsnak megfelelő frakciókat elkülönítjük, majd vékonyrétegkromatográfiának vetjük alá. A kromatográfiás elemzés szerint a B, C és D csúcsnak megfelelő frakciók egyetlen vegyületet tartalmaznak, míg az A csúcsnak megfelelő frakció a 7a-hidroxi-3,12diketo-5/J-kolánsav mellett egy azonosítatlan anyagot is tartalmaz.Fractions corresponding to peaks A, B, C and D were separated and subjected to TLC. Chromatographic analysis showed that the fractions corresponding to peaks B, C, and D contained a single compound, whereas the fraction corresponding to peak A contained an unidentified substance in addition to 7α-hydroxy-3,12-diceto-5β-cholanic acid.
Az egyes termékek hozamát, valamint az át nem alakult kólsav mennyiségét a 6. ábrán feltüntetett kromatogram alapján, az egyes görbeszakaszok alatti területek arányából számítottuk ki. Az eredményeket a 9. táblázatban közöljük.The yields of each product and the amount of unconverted cholic acid were calculated from the ratio of the areas under each curve on the chromatogram shown in Figure 6. The results are shown in Table 9.
8. táblázatTable 8
*Konverzióarány* Conv
9. táblázatTable 9
-191-191
183 201183,201
10. példaExample 10
A 9. példában közöltek szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy az Arthrobacter CA-35-A589-47 törzs helyett Arthrobacter CA-35-A849 törzset (FERM-P No. 5524, ATCC No. 31654) használunk fel. 49,34 g szilárd anyagot kapunk, amely a fermentációs termékek és az át nem alakult kólsav elegye.The procedure of Example 9 was followed except that Arthrobacter CA-35-A849 (FERM-P No. 5524, ATCC No. 31654) was used instead of Arthrobacter CA-35-A589-47. 49.34 g of a solid is obtained which is a mixture of fermentation products and unconverted sulfuric acid.
Az elegyet a 6. példában ismertetett körülmények között nagysebességű folyadékkromatográfiás elemzésnek vetjük alá.The mixture was subjected to high performance liquid chromatography under the conditions described in Example 6.
A kromatogramot a 7. ábrán mutatjuk be. A kromatogram A, B, C és D csúcsa — hiteles mintákkal végzett összehasonlítás alapján — rendre a 7a-hidroxi-3,12-diketo-50-kolánsavnak, 3a,7a-diliidroxi-l 2-keto-5(3-kolánsavnak, 7a,12a-dihidroxi-3-keto-50-kolánsavnak, illetve kólsavnak felel meg.The chromatogram is shown in Figure 7. The peaks A, B, C and D of the chromatogram are, according to comparison with authentic samples, for 7a-hydroxy-3,12-diketo-50-cholanoic acid, 3a, 7a-diylhydroxy-1,2-keto-5 (3-collanoic acid, respectively). Corresponds to 7a, 12a-dihydroxy-3-keto-50-cholanoic acid and colic acid, respectively.
Az A, B, C és D csúcsnak megfelelő frakciókat elkülönítjük, majd vékonyrétegkromatográfiásan vizsgáljuk. Valamennyi frakció csak egyetlen vegyületet tartalmaz.The fractions corresponding to peaks A, B, C and D were separated and subjected to thin layer chromatography. Each fraction contains only one compound.
Az egyes termékek hozamát, valamint az át nem alakult kólsav mennyiségét a 7. ábrán feltüntetett kromai togram alapján, az egyes görbeszakaszok alatti területek arányából számítottuk ki. Az eredményeket a 10.táblázatban közöljük.The yields of each product and the amount of unconverted cholic acid were calculated from the ratio of the areas under each curve on the chroma togram in Figure 7. The results are reported in Table 10.
11. példaExample 11
A 9. példában közöltek szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy az Arthrobacter CA-35-A589-47 törzs helyett Arthrobacter CA-35-A-1071-15 törzset (FERM-PThe procedure of Example 9 was followed except that Arthrobacter CA-35-A-1071-15 (FERM-P) was substituted for Arthrobacter CA-35-A589-47.
No. 5525, ATCC No. 31655) használunk fel. 49,31 g szilárd anyagot kapunk, amely a fermentációs termékek és az át nem alakult kólsav elegye.No. 5525, ATCC No. 31655). 49.31 g of a solid is obtained which is a mixture of fermentation products and unconverted sulfuric acid.
A kapott elegyet a 6. példában ismertetett körülmé13 nyék között nagysebességű folyadékkromatográfiás elemzésnek vetjük alá.The resulting mixture was subjected to high performance liquid chromatography under the conditions described in Example 6.
A kromatogramot a 8. ábrán mutatjuk be. A kromatogram A, B, C és D csúcsa - hiteles mintákká! végzett összehasonlítás alapján - rendre a 7a-hidroxi-3,12-di15 keto-50-kolánsavnak, 7a,3a-dihidroxi-l2-keto-5|3-kolánsavnak, 7a,12a-dihidroxi-3-keto-50-kolánsavnak és kólsavnak felel meg.The chromatogram is shown in Figure 8. A, B, C and D of the chromatogram - into authentic samples! by comparison with - 7a, respectively, of 3,12-di-hydroxy-15-keto-50-cholanic acid, 7a, 3a-dihydroxy-5-keto-l2 | three-cholanic acid, 7a, 12a-dihydroxy-3-keto-50- corresponds to collanic acid and colic acid.
Az A, B, C és D csúcsnak megfelelő frakciókat elkülönítjük, majd vékonyrétegkromatográfiásan vizsgáljuk.The fractions corresponding to peaks A, B, C and D were separated and subjected to thin layer chromatography.
A B, C és D csúcsnak megfelelő frakciók csak egy vegyületet tartalmaznak, míg az A csúcsnak megfelelő frakció a 7a-hidroxi-3,12-diketo-5/3-kolánsav mellett egy további azonosítatlan anyagot is tartalmaz.The fractions corresponding to peaks B, C and D contain only one compound, while the fraction corresponding to peaks A contains, in addition to 7a-hydroxy-3,12-diketo-5/3-cholanoic acid, an additional unidentified material.
Az egyes termékek hozamát, valamint az át nem ala25 kult kólsav mennyiségét a 8. ábrán feltüntetett kromatograrn alapján, az egyes görbeszakaszok alatti területek arányából számítottuk ki. Az eredményeket all. táblázatban közöljük.The yield of each product, and the amount of over 25 non-ala faded cholic calculated based kromatograrn shown in Figure 8, the ratio of the area under each curve sections. All the results. in Table.
10. táblázatTable 10
11. táblázatTable 11
-20183 201-20183 201
12. példaExample 12
A 9. példában közöltek szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy az Arthrobacter CA-35-A589-47 törzs helyett Arthrobacter CA-35-A-1448 törzset (FERM-P 5 No. 5526, ATCC No. 31656) használunk fel. 49,30 g szilárd anyagot kapunk, amely a fermentációs termékek és az át nem alakult kólsav elegye.The procedure described in Example 9 was followed except that Arthrobacter CA-35-A-1448 (FERM-P 5 No. 5526, ATCC No. 31656) was used instead of Arthrobacter CA-35-A589-47. . 49.30 g of a solid are obtained which is a mixture of fermentation products and unconverted sulfuric acid.
Az elegyet a 6. példában ismertetett körülmények között nagysebességű folyadékkromatográfiás elemzés- 10 nek vetjük alá.The mixture was subjected to high performance liquid chromatography under the conditions described in Example 6.
A kromatogramot a 9. ábrán mutatjuk be. A kromatogram A, B, C és D csúcsa — hiteles mintákkal végzett összehasonlítás alapján - rendre a 7a-hidroxi-3,12-diketo-50-kolánsavnak, 3a,7a-dihidroxi-12-keto-50-kolán- 15 savnak, 7a,12a-dihidroxi-3-keto-50-kolánsavnak és kólsavnak felel meg.The chromatogram is shown in Figure 9. The peaks A, B, C and D of the chromatogram are 7a-hydroxy-3,12-diketo-50-collanoic acid, 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-50-collanoic acid, respectively, by comparison with authentic samples, Corresponds to 7a, 12a-dihydroxy-3-keto-50-cholanoic acid and colic acid.
Az A, B, C és D csúcsnak megfelelő frakciókat elkülönítjük, majd vékonyrétegkromatográfiásan vizsgáljuk.The fractions corresponding to peaks A, B, C and D were separated and subjected to thin layer chromatography.
A B, C és D csúcsnak megfelelő frakciók csak egy vegyü- 20 letet tartalmaznak, míg az A csúcsnak megfelelő frakció a 7a-hidroxi-3,12-diketo-5j3-kolánsav mellett egy további azonosítatlan anyagot is tartalmaz.The fractions corresponding to peaks B, C and D contain only one compound, whereas the fraction corresponding to peaks A contains, in addition to 7a-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholanoic acid, an additional unidentified material.
Az egyes termékek hozamát, valamint az át nem alakult kólsav mennyiségét a 9. ábrán feltüntetett kroma- 25 togram alapján, az egyes görbeszakaszok alatti területek arányából számítottuk ki. Az eredményeket a 12. táblázatban közöljük.The yields of each product as well as the amount of unconverted cholic acid were calculated on the basis of the chromatogram shown in Figure 9, as a proportion of the areas under each curve. The results are shown in Table 12.
13. példaExample 13
A 9. példában közöltek szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy az Arthrobacter CA-35-A589-47 törzs helyett Arthrobacter CA-35-A-1475 törzset (FERM-P No. 5527, ATCC No. 31657) használunk fel. 49, 35 g szilárd anyagot kapunk, amely a fermentációs termékek és az át nem alakult kólsav elegye.Example 9 was repeated except that Arthrobacter CA-35-A589-47 was used in place of Arthrobacter CA-35-A589-47 (FERM-P No. 5527, ATCC No. 31657). 49.35 g of a solid are obtained which is a mixture of fermentation products and unconverted sulfuric acid.
A kapott elegyet a 6. példában ismertetett körülmények között nagysebességű folyadékkromatográfiás elemzésnek vetjük alá.The resulting mixture was subjected to high performance liquid chromatography under the conditions described in Example 6.
A kromatogramot a 10. ábrán mutatjuk be. A kromatogram A, B, C és D csúcsa - hiteles mintákkal végzett összehasonlítás alapján - rendre a 7a-hidroxi-3,12-diketo-50-kolánsavnak, 3a,7a-dihidroxi-12-keto-50-kolánsaviak, 7a,12a-dihidroxi-3-keto-50-kolánsavnak és kólsavnak felel meg.The chromatogram is shown in Figure 10. The peaks A, B, C and D of the chromatogram are, according to comparison with authentic samples, 7a-hydroxy-3,12-diketo-50-cholanoic acid, 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-50-cholanoic acid, 7a, 12a, respectively. corresponds to -dihydroxy-3-keto-50-cholanoic acid and colic acid.
Az A, B, C és D csúcsnak megfelelő frakciókat elkülönítjük, majd vékonyrétegkromatográfiásan vizsgáljuk. Valamennyi frakció csak egy vegyületet tartalmaz.The fractions corresponding to peaks A, B, C and D were separated and subjected to thin layer chromatography. Each fraction contains only one compound.
Az egyes termékek hozamát, valamint az át nem alakult kólsav mennyiségét a 10. ábrán feltüntetett kromatogram alapján, az egyes görbeszakaszok alatti területek arányából számítottuk ki. Az eredményeket a 13. táblázatban közöljük.The yields of each product and the amount of unconverted sulfuric acid were calculated from the ratio of the areas under each curve on the chromatogram shown in Figure 10. The results are reported in Table 13.
12. táblázatTable 12
13. táblázatTable 13
-212-212
183 201183,201
14. példaExample 14
A 9. példában közöltek szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy az Arthrobacter CA-35-A589-47 törzs helyett Arthrobacter CA-35-A-1766-15 törzset (FERM-P No. 5528, ATCC No. 31658) használunk fel. 49,27 g szilárd anyagot kapunk, amely a fermentációs termékek és az át nem alakult kólsav elegye.The procedure of Example 9 was followed except that Arthrobacter CA-35-A-1766-15 (FERM-P No. 5528, ATCC No. 31658) was used instead of Arthrobacter CA-35-A589-47. up. 49.27 g of a solid is obtained which is a mixture of fermentation products and unconverted sulfuric acid.
Az elegyet a 6. példában ismertetett körülmények között nagysebességű folyadékkromatográfiás elemzésnek vetjük alá.The mixture was subjected to high performance liquid chromatography under the conditions described in Example 6.
A kromatogramot a 11. ábrán mutatjuk be. A kromatogram A, B és D csúcsa — hiteles mintákkal végzett összehasonlítás alapján - rendre a 7a-hidroxi-3,12-diketo-50-kolánsavnak, 3a,7a-dihidroxi-l2-keto-5/?-kolánsavnak és kólsavnak felel meg.The chromatogram is shown in Figure 11. The peaks A, B and D of the chromatogram, when compared with authentic samples, correspond respectively to 7a-hydroxy-3,12-diketo-50-cholanoic acid, 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid and colic acid. .
Az A, B és D csúcsnak megfelelő frakciókat elkülönítjük, majd vékonyrétegkromatográfiásan vizsgáljuk. Valamennyi frakció csak egy vegyületet tartalmaz.The fractions corresponding to peaks A, B, and D were separated and analyzed by TLC. Each fraction contains only one compound.
Az egyes termékek hozamát, valamint az át nem alakult kólsav mennyiségét all. ábrán feltüntetett kromatogram alapján, az egyes görbeszakaszok alatti területek arányából számítottuk ki. Az eredményeket a 14. táblázatban közöljük.The yield of each product and the amount of unconverted colic acid are indicated. is calculated from the ratio of the areas under each curve section. The results are shown in Table 14.
15. példaExample 15
A 9. példában közöltek szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy az Arthrobacter CA-35-A589-47 törzs helyett Arthrobacter CA-35-M-965-3 törzset (FERM-PExample 9 was followed except that Arthrobacter CA-35-M-965-3 (FERM-P) was substituted for Arthrobacter CA-35-A589-47.
No. 5529, ATCC No. 31659) használunk fel. 49,36 g szilárd anyagot kapunk, amely a fermentációs termékek és az át nem alakult kólsav elegye.No. 5529, ATCC No. 31659). 49.36 g of a solid is obtained which is a mixture of fermentation products and unconverted sulfuric acid.
Az elegyet a 6. példában ismertetett körülmények 10 között nagysebességű folyadékkromatográfiás elemzésnek vetjük alá.The mixture was subjected to high performance liquid chromatography (HPLC) under the conditions described in Example 6.
A kromatogramot a 12. ábrán mutatjuk be. A kromatogram A, B és D csúcsa — hiteles mintákkal végzett összehasonlítás alapján — rendre a 7a-hidroxi-3,12-di15 keto-5/?-kolánsavnak, 3«,7a-dihidroxi-12-kűto-5/3-kolánsavnak és kólsavnak felel meg.The chromatogram is shown in Figure 12. The peaks A, B, and D of the chromatogram, based on comparison with authentic samples, were for 7α-hydroxy-3,12-di15 keto-5β-cholanoic acid, 3β, 7α-dihydroxy-12-keto-5β-cholanoic acid, respectively. and it corresponds to colic acid.
Az A, B és D csúcsnak megfelelő frakciókat elkülönítjük, majd vékonyrétegkromatográfiásan vizsgáljuk. Az A csúcsnak megfelelő frakció a 7a-hidroxi-3,12-diketo-5020 kolánsav mellett egy további azonosítatlan anyagot is tartalmaz, míg a B és a D csúcsnak megfelelő frakció csak egy vegyületet tartalmaz.The fractions corresponding to peaks A, B, and D were separated and analyzed by TLC. The fraction corresponding to Peak A contains, in addition to 7a-hydroxy-3,12-diketo-5020 collanic acid, an additional unidentified substance, while the fraction corresponding to Peak B and D contains only one compound.
Az egyes termékek hozamát, valamint az át nem alakult kólsav mennyiségét a 12. ábrán feltüntetett kroma25 togram alapján, az egyes görbeszakaszok alatti területek arányából számítottuk ki. Az eredményeket a 15. táblázatban közöljük.The yields of each product and the amount of unconverted cholic acid were calculated from the proportion of areas under each curve on the basis of the chromium togram shown in Figure 12. The results are shown in Table 15.
14. táblázatTable 14
15. táblázatTable 15
-22183 201-22183 201
16. példaExample 16
A 9. példában közöltek szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy az Arthrobacter CA-35-A589-47 törzs helyett Arthrobacter CA-35-Y-37-12 törzset (FERM-P 5 No. 5530, ATCC No. 31660) használunk fel. 49,33 g szilárd anyagot kapunk, amely a fermentációs termékek és az át nem alakult kólsav elegye.The procedure of Example 9 was followed except that Arthrobacter CA-35-Y-37-12 (FERM-P 5 No. 5530, ATCC No. 31660) was substituted for Arthrobacter CA-35-A589-47. we use it. 49.33 g of a solid is obtained which is a mixture of fermentation products and unconverted sulfuric acid.
Az elegyet a 6. példában ismertetett körülmények között nagysebességű folyadékkromatográfiás elemzés- 10 nek vetjük alá.The mixture was subjected to high performance liquid chromatography under the conditions described in Example 6.
A kromatogramot a 13. ábrán mutatjuk be. A kromatogram A, B, C és D csúcsa — hiteles mintákkal végzett összehasonlítás alapján - rendre a 7of-hidroxi-3,12-diketo-5/3-kolánsavnak, 3a,7a-dihidroxi-12-keto-5/?-kolán- 15 savnak, 7a,12a-dihidroxi-3-keto-5|3-kolánsavnak és kólsavnak felel meg.The chromatogram is shown in Figure 13. The peaks A, B, C and D of the chromatogram are, according to comparison with authentic samples, 7O-hydroxy-3,12-diketo-5/3-cholanoic acid, 3α, 7α-dihydroxy-12-keto-5β-cholan, respectively. - 15 acids, 7a, 12a-dihydroxy-3-keto-5β-cholanic acid and colic acid.
Az A, B, C és D csúcsnak megfelelő frakciókat elkülönítjük, majd vékonyrétegkromatográfiásan vizsgáljuk. Valamennyi frakció csak egy vegyületet tartalmaz. 20The fractions corresponding to peaks A, B, C and D were separated and subjected to thin layer chromatography. Each fraction contains only one compound. 20
Az egyes termékek hozamát, valamint az át nem alakult kólsav mennyiségét a 13. ábrán feltüntetett kromatogram alapján, az egyes görbeszakaszok alatti területek arányából számítottuk ki. Az eredményeket a 16. táblázatban közöljük. 25The yields of each product and the amount of unconverted sulfuric acid were calculated from the ratio of the areas under each curve on the chromatogram shown in Figure 13. The results are shown in Table 16. 25
17. példaExample 17
Az 1. példában közöltek szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy az Arthrobacter CA-35 törzs helyett Brevibacterium CA-6 törzset (FERM-P No. 5144, ATCC No. 31661) használunk fel.The procedure described in Example 1 was followed except that Brevibacterium CA-6 (FERM-P No. 5144, ATCC No. 31661) was used in place of the Arthrobacter CA-35 strain.
A kapott szilárd anyagot, amely a fermentációs tér- 35 mékek és a kólsav elegye, az 1. példában ismertetett körülmények között nagysebességű folyadékkromatográfiás elemzésnek vetjük alá.The resulting solid, which is a mixture of fermentation products and sulfuric acid, was subjected to HPLC by the conditions described in Example 1.
A kromatogramot a 14. ábrán mutatjuk be.The chromatogram is shown in Figure 14.
Az E, A, B és D csúcsnak megfelelő frakciókból el- 40 különítjük a termékeket, és az egyes termékek kémiai szerkezetét tömegspektrum, infravörös spektrum és NMR-spektrum felvételével vizsgáljuk. A spektrumadatok egyértelműen igazolják, hogy a felsorolt frakciók rendre 7a-hidroxi-3,12-diketo-A4-kolénsavat, 7a-hidroxi- 45From the fractions corresponding to peaks E, A, B and D, the products are separated and the chemical structure of each product is analyzed by mass spectra, infrared spectra and NMR spectra. The spectral data clearly indicate that the fractions listed are respectively 7a-hydroxy-3,12-diketo-A 4 -cholinic acid, 7a-hydroxy-
3,12-diketo-50-kolánsavat, 7a,3a-dihidroxi-12-keto-50kolánsavat, illetve kólsavat tartalmaznak. Az X és Y csúcsnak megfelelő frakciókban lévő vegyületeket nem azonosítottuk.They contain 3,12-diketo-50-cholanoic acid, 7a, 3a-dihydroxy-12-keto-50-cholanoic acid, and cholic acid. Compounds in the fractions corresponding to X and Y peaks were not identified.
A 14. ábrán bemutatott kromatogramban az X és Y 50 csúcstól eltérő csúcsok alatti területek aránya (vagyis az E : A : B : D területarány) 12,2 : 22,2 : 44,9 : 20,7.In the chromatogram shown in Figure 14, the ratio of areas below the peaks other than X and Y 50 (i.e., the ratio E: A: B: D) is 12.2: 22.2: 44.9: 20.7.
18. példaExample 18
Az 1. példában közöltek szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy az Arthrobacter CA-35 törzs helyett Corynebacterium CA-53 törzset (FERM-P No. 5532, ATCC No. 31662) használunk fel. 82 g szilárd anyagot kapunk, amely a fermentációs termékek és az át nem alakult kólsav elegye.The procedure of Example 1 was followed except that Corynebacterium CA-53 (FERM-P No. 5532, ATCC No. 31662) was used in place of the Arthrobacter CA-35 strain. 82 g of a solid are obtained which is a mixture of fermentation products and unconverted cholic acid.
A kapott elegyet nagysebességű folyadékkromatográfiás elemzésnek vetjük alá. Az elemzést az 1. példában közöltek szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy eluálószerként a 30:70 térfogatarányú víz — metanol elegy (pH = 2,5) helyett 30:70 térfogatarányú, 4,0 pHértekíí víz - metanol elegyet használunk fel.The resulting mixture was subjected to high performance liquid chromatography. The analysis was carried out as described in Example 1, except that 30:70 v / v water / methanol (pH 4.0) was used instead of 30:70 water / methanol (pH 2.5).
A kromatogramot a 15. ábrán mutatjuk be. A kromatogram A, B, C és D csúcsa - hiteles mintákkal végzett összehasonlítás alapján — rendre a 7a-hidroxi-3,12-diketo-5/5-kolánsavnak, 3a,7a-dihidroxi-12-keto-5j3-kolánsavnak, 7a-hidroxi-3,12-diketo-Δ4 -kolénsavnak és kólsavnak felel meg.The chromatogram is shown in Figure 15. The peaks A, B, C and D of the chromatogram are, according to comparison with authentic samples, 7a-hydroxy-3,12-diketo-5/5-cholanoic acid, 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5β-cholanoic acid, 7a corresponds to -hydroxy-3,12-diketo-Δ 4 -cholenic acid and colic acid.
Az A, B és C csúcsnak megfelelő frakciókból elkülönítjük a termékeket, és a termékek kémiai szerkezetét tömegspektrum, infravörös spektrum és NMR-spektrum felvételével vizsgáljuk. A spektrum-adatok egyértelműen igazolják, hogy termékként rendre 7a-hidroxi-3,12-diketo-5d-kolánsavat, 3a,7a-dihidroxi-l 2-keto-50-kolánsavat és 7a-hidroxi-3,12-diketo-A4-kolénsavat kaptunk.The products are separated from the fractions corresponding to peaks A, B and C and the chemical structure of the products is analyzed by mass spectra, infrared spectra and NMR spectra. The spectral data clearly show that 7a-hydroxy-3,12-diketo-5d-cholanoic acid, 3a, 7a-dihydroxy-1,2-keto-50-cholanoic acid and 7a-hydroxy-3,12-diketo-A, respectively, are the product. 4- Choline acid was obtained.
1. összehasonlító példaComparative Example 1
Háromnyakú gömblombikba 10 g, a fentiek szerint előállított 3a,7a-dihidroxi-12-keto-5/?-kolánsavat mérünk be, és a vegyülethez lassú ütemben 100 ml etilén-glikolt és 20 ml vízben oldott 10 g kálium-hidroxidot adunk. Ezután az elegyhez 10 ml 85 %-os hidrazin-hidrátot adunk, majd a kapott elegyet 2 órán át 100 °C-on visszafolyatás közben forraljuk. Ezután az elegy hőmérsékletét fokozatosan növelve a forralást 4 órán át 185—190°C-on folytatjuk, és eközben kidesztilláljuk a hidrazin-hidrátot. A reakcióelegyet lehűtjük, vízzel hígítjuk, majd az elegy pH-ját 3-ra állítjuk. A kivált csapadékot leszűrjük, vízzel mossuk és levegőn szárítjuk. 8,5 g 3a,7a-dihidroxi-5/3kolánsavat (CDCA) kapunk.10 g of 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5? -Colanoic acid prepared as described above were added to a three-necked round bottom flask and 100 ml of ethylene glycol and 10 g of potassium hydroxide dissolved in 20 ml of water were added slowly. Thereafter, 10 ml of 85% hydrazine hydrate were added and the resulting mixture was refluxed for 2 hours at 100 ° C. The mixture was then heated at 185-190 ° C for 4 hours while gradually increasing the temperature of the mixture while distilling off the hydrazine hydrate. The reaction mixture was cooled, diluted with water and adjusted to pH 3. The precipitate was filtered off, washed with water and air dried. 8.5 g of 3a, 7a-dihydroxy-5/3-cholanoic acid (CDCA) are obtained.
2. összehasonlító példaComparative Example 2
Háromnyakú gömblombikba 3 g, a fentiek szerint előállított 7a-hidroxi-3,12-diketo-50-kolánsav 70 ml piridinnel készített oldatát mérjük be, és az oldathoz 1 mól p-íoluolszulfonil-kloridot adunk. A kapott elegyet 1Into a three-necked round bottom flask was added a solution of 3 g of 7a-hydroxy-3,12-diketo-50-collanoic acid prepared above in 70 ml of pyridine and 1 mol of p-toluenesulfonyl chloride was added. The resulting mixture was 1
16. tábláza?Table 16?
-231-231
183 201 órán át 0°C-on tartjuk, majd 5 órán át visszafolyatás közben forraljuk. Ezután az elegyhez 3 n vizes sósavoldatot adunk, majd az elegyet 100 ml éterrel extraháljuk. Az extraktumból csökkentett nyomáson lepároljuk az étert. 2$ g Δ6- és/vagy A7-3,12-diketo-kolénsavat 5 kapunk. 2 g így kapott maradékot 10 ml 1 n vizes nátriumhidroxid-oldatban oldunk, az oldathoz 0,1 g Raney-nikkelt adunk, majd az elegybe 0,01 mól hidrogéngázt vezetünk, és a reakcióelegyet éjszakán át állni hagyjuk. Termékként 3a,12a-dihidroxi-5/5-kolánsavat 10 (dezoxi-kólsavat) és 3a,120-dihidroxi-5j3-kolánsavat kapunk 90 %-os hozammal.After 183 201 hours at 0 ° C, it is refluxed for 5 hours. Aqueous 3N hydrochloric acid was added and the mixture was extracted with ether (100 mL). The extract was evaporated under reduced pressure to give the ether. 2 g of Δ 6 - and / or Δ 7 -3,12-dichetocholenic acid 5 is obtained. The residue (2 g) was dissolved in 1N aqueous sodium hydroxide solution (10 ml), Raney nickel (0.1 g) was added and hydrogen gas (0.01 mol) was added and the reaction mixture was allowed to stand overnight. 3a, 12a-dihydroxy-5/5-cholanoic acid 10 (deoxycholic acid) and 3a, 120-dihydroxy-5β-cholanoic acid were obtained in 90% yield.
Claims (11)
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10676879A JPS5910197B2 (en) | 1979-08-21 | 1979-08-21 | Method for producing 3α,7α-dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid |
| JP11230779A JPS5910198B2 (en) | 1979-08-31 | 1979-08-31 | Method for producing 7α-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholanic acid |
| JP8225680A JPS578796A (en) | 1980-06-17 | 1980-06-17 | Preparation of 3alpha,7alpha-dihydroxy-12-keto-5beta-cholanic acid and/or its salt |
| JP8347880A JPS578795A (en) | 1980-06-19 | 1980-06-19 | Preparation of 3-substituted-7alpha-hydroxy-12-keto-5beta-cholanic acid and/or its salt |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU183201B true HU183201B (en) | 1984-04-28 |
Family
ID=27466682
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU205180A HU183201B (en) | 1979-08-21 | 1980-08-18 | Microbiological process for preparing derivatives of cholanic acid |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| HU (1) | HU183201B (en) |
-
1980
- 1980-08-18 HU HU205180A patent/HU183201B/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4226941A (en) | Process for the optical resolution of d,l-2-amino-4-methylphosphinobutyric acid | |
| GB2031896A (en) | A process for the optical resolution of D,L-2-amino-4- methylphosphinobutyric acid | |
| ITMI962063A1 (en) | PROCESS OF BIOTRANSFORMATION OF COLCHICINOID COMPOUNDS INTO THE CORRESPONDING 3-GLYCOSYLDERIVATES | |
| DE69322720T2 (en) | Process for the production of biotin | |
| EP0077544B1 (en) | Microbial process for producing 12-alpha-hydroxypregna-1,4-dien-3-one-20-alpha-carboxylic acid | |
| EP0187049A2 (en) | Micromonospora microorganisms and macrolide antibiotic production therewith | |
| US4359529A (en) | Microbial process for producing cholanic acid derivatives | |
| KR100225157B1 (en) | Novel microorganism which has ability of transforming to bile acid and process for bile acid | |
| JPS5831992A (en) | Novel physiologically active substance k-4 and its preparation | |
| EP0088007B1 (en) | Microbial process for producing 12-hydroxyandrosta-1,4-diene-3,17-dione | |
| DE3031334C2 (en) | Microbiological process for the production of cholanic acid derivatives | |
| US4923403A (en) | Microbiological process for degradation of steroids | |
| JP3209791B2 (en) | Oxazoline derivative and method for producing the same | |
| DE69620954T2 (en) | Process for the preparation of derivatives of dimethylol carboxylic acid | |
| JPH0262234B2 (en) | ||
| JPH0120873B2 (en) | ||
| JP2858939B2 (en) | Antibiotics AB3217A, AB3217B and AB3217C and their production | |
| JPH0120878B2 (en) | ||
| JP3112342B2 (en) | New compound UCE6 | |
| JPH0523250B2 (en) | ||
| JPS5863397A (en) | Preparation of 12beta-hydroxyandrosta-1,4-diene-3,17-dione | |
| JPS637795A (en) | Production of 7alpha-hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione | |
| JPS59166094A (en) | Preparation of physiologically active substance ml-236b | |
| JPS62175189A (en) | Production of oligosaccharide ester of fatty acid by fermentation method | |
| JPH0120875B2 (en) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HU90 | Patent valid on 900628 |