HUP0101593A2 - Fagocitózis gének és alkalmazásaik - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya a C. elegans fagocitózisának jelátviteli útjábanrésztvevő CED-6 fehérje, a fehérje humán homológjai és funkcionálisfragmensei és az ezeket kódoló izolált nukleinsavak valamint ezekterápiás alkalmazásai. A találmány továbbá az említett nukleinsavattartalmazó expressziós vektorokra és transzfektált emlős sejtvonalakrais vonatkozik. A találmány a fentebb leirt fehérjéket, nukleinsavakatés transzfektált sejteket alkalmazó vizsgáló eljárásokat is biztosítjaolyan vegyületek azonosítására, melyek fokozzák vagy gátolják azt ajelátviteli utat, melyben a CED-6 és homológjai részt vesznek. Ó

Description

‘ 70.689/PA

SJI.G.4K. KOZ2ÉTÉTEU· ;··.· I¹ : .

ΛΧ PÉLDÁNY ·’ ’ ' ' ^r

H-1062 Budapest Andrássy út 113.

Telefon: 34-24-950, Fax: 34-24-323

Fagocitózis gének és alkalmazásaik

A találmány a CED-6 fagocitózis génekre és felhasználásukra vonatkozik.

A fagocitózis vagy bekebelezés az endocitózis speciális formája, melynek segítségével az eukarióták igen nagy részecskéket vagy akár teljes sejteket is felvesznek. Ez egy alapvető biológiai folyamat, mely az egysejtű szervezetektől, mint például amőbáktól az emlősökig megőrződött. [Metchnikoff, E. 1891, Lectures of comparative pathology of inflammation; Pasteur Institute (1891), 1968-as kiadás, New York, Dover Publication]. A fagocitózist kezdetben két célból, a táplálkozás és a védelem céljából alkalmazták, majd a mezoderma megjelenése után egy olyan mechanizmussá fejlődött, mely a támadó szervezetekkel szemben a gazda védelmére és az idegen részecskék és sejt törmelék eltakarítására szolgált [Metchinkoff, (1891)]. Napjainkban a fagocitózis jelentősége megnövekedett a programozott sejthalálon (apoptózis) áteső sejtek megsemmisítésében betöltött szerepének köszönhetően. Mivel az apoptózis számos humán betegségben részt vesz, a fagocitózis szabályozásának megértése igen kívánatos, mivel új terápiás beavatkozási módszerhez vezethet ezeknél a betegségeknél. Következésképpen igény van egy fagocitózist szabályozó gén és fehérje izolálására. Továbbá szükség van az apoptotikus sejtek fagocitózisával kapcsolatos betegségek terápiás kezelésére is.

A C. elegánsban végzett genetikai vizsgálatokkal több, mint egy tucat, a programozott sejthalálban szer<epe*t· jíátszó *gént azonosítottak. Mi a pozícionálási módszert alkalmaztuk a C. elegáns CED-6 gén klónozására és funkcionális jellemzésére. Kimutatjuk, hogy a CED-6 fehérje egy foszfotirozin-kötő domént és néhány potenciális SH3 kötőhelyet tartalmaz. Továbbá bemutatjuk, hogy a CED-6 a bekebelező sejtekben hat, és úgy működik, hogy elősegíti a kezdeti és megmaradó elpusztult sejtek eltávolítását is. A CED-6 overexpressziója részben szuppresszálhatja a CED-1 és CED7 bekebelezési rendellenességét, mely alapján feltételezhető, hogy a CED-6 e két géntől downstream működik. A CED-6 adapter molekulaként működik egy olyan jelátviteli útban, mely az apoptotikus sejtek bekebelezését közvetíti. Olyan izolált és jellemzett humán CED-6 homológokat is azonosítottunk, ide értve egy splice variánst is, melyről kimutattuk, hogy hasonló folyamatban vesz részt az emlős sejtekben.

A találmány tárgya egy izolált fehérje, mely a C. elegáns CED-6 fehérjéje, vagy egy ezzel funkcionálisan ekvivalens fehérje, és a fehérje humán homológjai, melyekre ezután hlCED-6, h2CED-6 és h3CED-6 néven hivatkozunk.

A találmány tárgya továbbá a CED-6, hlCED-6, h2CED-6 és h3CED-6 funkcionális fragmense, például a foszfotirozin-kötő doménnek és/vagy a prolin/szerin-gazdag régiónak megfelelő fragmentum.

A találmány tárgyát képezi továbbá a CED-6-t és a CED-6 humán homológjait kódoló izolált nukleinsav, valamint a fentebb ismertetett CED-6, hlCED-6, h2CED-6 és h3CED-6 funkcionális fragmenseit kódoló izolált nukleinsav.

A találmány tárgya továbbá egy olyan nukleinsav, mely bármely fentebb említett nukleinsavhoz képest antis'zeris’z,* vagy *mely bármely fentebb említett nukleinsavhoz képes hibridizálni kevéssé szigorú, közepesen szigorú vagy nagyon szigorú körülmények között, vagy ezek a fragmensei vagy részei.

A találmány továbbá a CED-6, hlCED-6, h2CED-6 és h3CED-6-t vagy az említett fehérjék fentebb említett funkcionális fragmentumait kódoló nukleinsavat tartalmazó expressziós vektorokra is vonatkozik.

A találmány tárgyát képezik a CED-6, hlCED-β, h2CED-6 és/vagy h3CED-6-t kódoló nukleinsavak közül eggyel vagy többel transzfektált emlős sejtvonalak.

A találmány továbbá a fentebb leírt fehérjéket, nukleinsavakat és transzfektált sejteket alkalmazó vizsgáló eljárásokat is biztosít olyan vegyületek azonosítására, melyek fokozzák vagy gátolják azt a jelátviteli utat, melyben a CED-6, hlCED-6, h2CED-6 vagy h3CED-6 részt vesz.

A találmány továbbá a fentebb leírt transzfektált sejteket alkalmazó vizsgálóeljárást biztosít a CED-6, hlCED-6, h2CED-6 vagy h3CED-6 gének expresszióját fokozó vagy gátló vegyületek azonosítására.

A találmány tárgyát képezik a CED-6, hlCED-6, h2CED-6 és/vagy h3CED-6 egy epitopjával reagáló antitestek.

A találmány továbbá eljárást biztosít betegségek kezelésére, melyek kóroktanához az apoptotikus vagy más beteg sejt bekebelezési elégtelensége hozzájárul, úgymint gyulladás, autoimmun betegség vagy rák, mely eljárás során egy betegnek egy vagy több fentebb említett fehérjét vagy nukleinsavat vagy olyan vegyületet adunk be, mely a CED-6, hlCED-6, h2CED-6 vagy h3CED-6 ·· · · · · · · J · enhanszere.

A találmány továbbá olyan betegségek kezelési eljárását biztosítja, melyeknél az apoptotikus sejtek bekebelezésének csökkenése jótékony hatású, mint például a neurodegeneratív betegségek, stroke, sarlósejtes vérszegénység, mely eljárás során egy betegnek egy vagy több fentebb említett fehérjét vagy nukleinsavat vagy olyan vegyületet adunk be, mely a CED-6, hlCED-6, h2CED-6 vagy h3CED-6 inhibitora.

A találmány eljárást biztosít humán vagy állati betegség diagnosztizálására a CED-6-t, hlCED-6-t, h2CED-6-t vagy h3CED-6-t kódoló nukleinsavat vagy ezek komplementerét vagy a CED-6, hlCED-6, h2CED-6 vagy h3CED-6 elleni antitestet alkalmazva egy genetikai rendellenesség kimutatására.

A találmány továbbá eljárást biztosít olyan fehérjék azonosítására, melyek kölcsönhatásba lépnek a CED-6, hlCED-β, h2CED-6 vagy h3CED-6 fehérjékkel azokban a jelátviteli utakban, melyekben ezek a fehérjék rész vesznek.

A találmány tárgya továbbá egy fúziós fehérje, melyben a CED6, hlCED-6, h2CED-6 vagy h3CED-6 vagy ezek egy funkcionális fragmense, mint például a foszfotirozin-kötő dómén vagy szerin/prolin-gazdag régiót fuzionáltuk egy másik fehérjéhez, mint például egy epitop részhez vagy egy riporter gén termékéhez .

A találmány továbbá eljárást biztosít annak meghatározására, hogy egy vegyület enhanszere vagy inhibitora a jelátviteli útnak, melyben a CED-6 részt vesz, oly módon, hogy megfigyeljük a vegyület hatását a megváltoztatott CED-6 expresszióval rendelkező C. elegáns férgekre.

Az ábrák rövid ismertetése ...... *'

Az 1A-1E. ábra a CED-6 lókusz vázlatos bemutatása. Az 1A. ábra a CED-6 genetikai térképe. A CED-6-t és néhány közelében lévő és szintén a CED-6 térképezésére használt gént mutatunk be. Az 1B. ábra a kozmidnentés. A kozmidokat vagy szubklónozott DNS fragmenseket (lásd C.,D.) hordozó transzgénikus állatokat elhalt sejtekre vizsgáltuk meg három csoport embrióban. Azokat, melyeknek olyan embrióik voltak, melyek részben vagy egyáltalán nem tartalmaztak elhalt sejteket, tekintettük mentő (javító) transzgénikus vonalaknak. A vizsgált tizenhárom kozmidból négyet mutatunk be. A mentő fragmentumok vastagon szedettek. A számok a mentő vonalak számát/tesztelt vonalak számát képviselik. Az IC. ábra az F56D2 kozmid szubklónozása és mentése. A CED-6 régió restrikciós térképét legfelül mutatjuk be. Középen, különböző restrikciós fragmentumokat teszteltünk arra a képességükre, hogy a CED-6(nl813) által okozott bekebelezési rendellenességet kijavít ják-e. Az 1D. ábra a 10 kb-os Xhol fragmentum szubklónozása és mentése. Az Xhol fragmentum restrikciós térképét legfelül mutatjuk be. Középen az Xhol fragmentumon végzett mutációkat és mentési képességet mutatjuk be. Egy X jelzi a frameshift mutációt (lásd részletesebben a Kísérleti eljárásoknál). Az 1E. ábra az Xhol fragmentumok transzkriptumait mutatja. Az Xhol fragmentumrégióban lévő transzkriptumok intron/exon szerkezete. Téglalapok: exonok; V jelek: intronok. AAA: poll(A) farok. Az F56D2.7 5' végének RT-PCR termékei az SLl-t és az SL2-t is tartalmazzák.

A 2A. és 2B. ábra azt mutatja, hogy az F56D2.7 a CED-6-t kódolja. A 2A. ábra a C. elegáns CED-6 teljes hosszúságú cDNS-ét (1. azonosítószámú szekvencia) és aminoé'áv-SzékvSnciá j át (2. azonosítószámú szekvencia) mutatja. A kettős aláhúzás a foszfotirozin-kötő (PTB) dómén nukleinsav-szekvenciáját (3. azonosítószámú szekvencia) és aminosav-szekvenciáját (4. azonosítószámú szekvencia) mutatja; az egyszeres aláhúzás a prolin/szerin-gazdag régió nukleinsav-szekvenciáját (5. azonosítószámú szekvencia) és aminosav-szekvenciáját (6. azonosítószámú szekvencia) jelzi. A szaggatott vonal a töltéssel rendelkező régiót jelzi. A csillagok a prolinokat mutatják a PxxP jelzésű szekvenciában, az üres háromszögek a szaggatottan aláhúzott régióban a töltéssel rendelkező gyököket mutatják. Az árnyalt négyszögek a poliadenilációs szignált jelzik. Az SL1 és SL2 mindegyike a transz-splicing akceptor helyhez kapcsolható. Bemutatjuk a CED-6(nl813)-ban azonosított egy bázispáros deléciót. A 2B. ábra egy Southern biot, mely egy RFLP-t mutat be a CED6(n2095)-ből származó 4,1 kb-os fragmentumon. Az Xhol próba egy allélspecifikus RFLP-t azonosít a CED-6(n2095)-ben, mely az F56D2.7-t tartalmazó 4,1 kb-os HindlII fragmentumot érinti. A jobb alsó részen a HindlII-mal emésztett genomi fragmentumokat mutatjuk be az Xhol fragmentum régióban. A lap jobb felső részén az Xhol fragmentum és az ez által a régió által lefedett három gén található. A Southern lenyomaton látható három HindlII fragmentumot, a 4,1 kb-osat, 0,4 kb-osat és 9,9 kb-osat, jelezzük. Baloldalon, a vad típusú N2-ből, a CED-6(nl813)-ból és a CED32 6(n2095)-ből egymástól függetlenül izolált genomiális DNS-t Pvel jelzett Xhol-fragmentummal próbáztuk. Az n2095 alléiról kimutattuk, hogy hiányzik belőle a 4,1 kb-os fragmentum, és van egy extra 2,1 kb-os fragmentuma, a 0,4 kb-os fragmentumok nem ·· · · · · ··{· érintették egyik alléit sem (adatok egy kül’öngé’lerT, melyet nem mutatunk be).

A 3A-C. ábra azt mutatja, hogy a CED-6 tartalmaz egy foszfotirozin-kötő domént. A 3A. ábra mutatja be a CED-6 PTB (4. azonosítószámú szekvencia) illesztését más PTB doménhez. A PTB dómén illesztés az She fehérje NMR szerkezetén alapul. A fekete téglalapok a szekvenciák több mint 50%-ánál kimutatott azonos aminosavakat mutatják. A szürke téglalapok a szekvenciák több mint 50%-ánál kimutatott hasonló aminosavakat mutatják. Ebből a szempontból az aminosavak következő sorozatait tekintjük hasonlónak: G, A, C, S, T; E, D, Q, N; R, K, Η; V, M, L, I; F, Y, W. Az a az She NMR szerkezete alapján feltételezett hélixeket, apa β-rétegeket jelzi. Az állandó gyököket (melyek az összes bemutatott szekvenciában megtalálhatóak) csillaggal *-gal emeltük ki. A 3B. ábra a CED-6 összehasonlítását mutatja más PTB domént tartalmazó fehérjékkel. Prolinban gazdag régiók és töltéssel rendelkező régiók követik a PTB doméneket és más régiókat. A PTB doméneket a százalékos azonosságra hasonlítottuk össze. A 3C. ábra bemutatja a három PTB dómén evolúcióját. Az A. ábra szerinti illesztést a GCG programban lévő Seqlab csomagot alkalmazva mutattuk be, és az evolúciós fát grafikusan szerkesztettük.

A 4. ábra a CED-6 genetikai mozaik analízisének eredményeit (alsó táblázat) és a C. elegáns sejt leszármazását mutatja be (fent). A csíravonal és a szomatikus buroksejtek leszármazását is bemutatjuk. Olyan testfal izomsejteket is bemutatunk, melyeket a duplikáció elvesztésének meghatározására alkalmaztunk. A sötét négyzetek a duplikáció elvesztését jelzik a csírasejtekben, és a sötét négyzetek a duplikáció elvesztését jelzik a szó matikus buroksejtekben. A fekete nyíl···* a·’ Wgriácfyobbodott sejtmagvacskával rendelkező szomatikus buroksejteket jelzi az elülső ivarmirigy távolabbi karjában. A fehér nyíl az elülső ivarmirigy közelebbi karjában felhalmozódott elhalt sejteket jelzi.

Az 5A-D. ábra olyan eredményeket nyújt, melyek azt mutatják, hogy a CED-6 cDNS hősokk overexpressziója kijavítja a bekebelezési rendellenességet a szómában és a csiravonalban is. Az 5A. ábra a sejthalált mutatja be az embrionális fejlődés alatt. A bevonalkázott téglalap egy hisztográf, mely a festődé sejtek számát jelzi minden 50. percben az embrionális fejlődés alatt. A nyilak a hősokk időpontját és a bekebelezési fenotipus megfigyelésének időpontját jelzik. Az 5B. ábra azt mutatja, hogy a CED-6 cDNS overexpressziója elősegíti a bekebelezést a sejthalál korai és késői stádiumában is. Hősokk promóter által irányított CED-6 cDNS transzgént hordozó transzgénikus állatokat kezeltünk hővel, mielőtt a sejthalál a jelzett időpontban bekövetkezett. Fiatal L1 lárvák fejében vizsgáltuk az elhalt sejteket. Hősokk kezelés nélküli állatokat is vizsgáltunk. A többi kontroll kísérlet az N2-t, a CED-6(nl813)-t (hőkezeléssel vagy anélkül) és a hővel kezelt lacZ transzgént hordozó CED-6(nl813)-t tartalmazta. A sötét körök az elhalt sejtek kialakulása után hősokkal végzett kísérleteket jelzik, és az üres körök a sejthalál megtörténte előtti hősokkot és a hősokk nélküli kísérleteket jelzik. Az 5C. ábra azt mutatja be, hogy a CED-6 cDNS overexpressziója a bekebelezési rendellenességet kijavítja a csíravonalban. A nyíl a hősokk időpontját jelzi, ekkor a transzgénikus állatok az L4 vedlés utáni 24. órában lévő fejlődési állapotban voltak. Az el halt sejteket különböző időpontokban vizs<jalt*úk' a hősokk és a hősokk utáni 60. óra között. Az 5D. ábra azt mutatja, hogy a CED-6 cDNS overexpressziója elősegíti a bekebelezést több órával az elhalt sejtek képződése után a csíravonalban. Kifejlett transzgénikus állatokat hővel kezeltünk, ahogy azt jelezzük. Az elhalt sejteket egyik ivarmirigykarban vizsgáltuk 12 órával a hősokk után. Az N2-t és a CED-6(nl813)-t tartalmazó kontroll kísérleteket a C. ábrán jelezzük.

A 6. ábra olyan eredményeket nyújt, melyek azt mutatják, hogy a CED-6 overexpressziója részlegesen szuppresszálja a bekebelezési rendellenességet a CED-l-ben és a CED-7-ben is az embrionális fejlődés alatt. A CED-6 overexpresszálódott a CED-1 és CED-7 három allélének genetikai háttérénél. A hősokk és az elhalt sejtek vizsgálatának idejét az 5A. ábrán mutatjuk be. Mindegyik genetikai háttérrel rendelkező állatot hővel kezeltük a sejthalál megtörténte előtt, vagy nem volt hőkezelés. Az elhalt sejteket fiatal L1 lárvák fejében vizsgáltuk meg. A lacZ szintén expresszálódott mindegyik genetikai háttérnél. Mindegyik mutánst hősokkal is kezeltünk, hogy megvizsgáljuk a hő hatását az elhalt sejtek expressziójára.

A 7. ábra a bekebelezési gének episztatikus útjának modellje. A CED-6 overexpressziójának nincs nyilvánvaló hatása az elhalt sejtek expressziójában a CED-2-re, 5-re és 10-re, viszont a CED1-re és CED-7-re igen. Feltételezhető, hogy a CED-6 a CED-l-től és CED-7-től lefele (downstream) hat. A CED-2, 5 és 10 eltérő reakcióutakon hat, vagy a CED-6-tól lefelé hat.

A 8. ábra egy folyamat térkép, mely azt mutatja be, hogy az F56 kozmidból származó Xhol fragmentum kijavítja (menti) a CED-6 bekebelezési rendellenességet. ...... “

A 9A-B. vázlatos ábrák, melyek azt ábrázolják, hogy a C05D2.7 szerkezete a CED-6. A 9A. ábra az Xhol fragmentum restrikciós térképét és mentését mutatja. A 9B. ábra mutatja a transzkriptumokat.

A 10. ábra egy oszlopgrafikon, mely azt ábrázolja, hogy a CED-6 overexpressziója kijavítja a CED-6 mutáns bekebelezési rendellenességét.

A 11. ábra olyan grafikonokat tartalmaz, melyek azt ábrázolják, hogy a CED-6 overexpressziója a CED-6 mutáns bekebelezési rendellenességét kijavítja az embriogén fejlődés alatt.

A 12. ábra egy olyan oszlopgrafikon, mely azt mutatja be, hogy a CED-6 elősegítheti a fennmaradó elhalt sejtek bekebelezését .

A 13. ábra azt mutatja be, hogy a CED-6 elősegíti a fennmaradt elhalt sejtek bekebelezését, és valószínűleg a bekebelezést végző sejteken belül hat.

A 14. ábra egy vázlat, mely azt mutatja, hogy a CED-6 a jelátviteli útban ható adapter fehérje lehet.

A 15. ábra olyan grafikonokat ábrázol, melyek azt jelzik, hogy a CED-6 overexpressziója kijavítja a bekebelezési rendellenességet a felnőtt ivarmirigyben, és a CED-6 a szomatikus buroksejtekben hathat.

A 16. ábra azt mutatja be, hogy a CED-6 overexpressziója részben szuppresszálja a CED-1 mutánsok bekebelezési rendellenességét .

A 17. ábra azt mutatja, hogy a CED-6 cDNS overexpressziója részben szuppresszálja a CED-7 mutánsok bekebelezési rendelle nesseget.

A 18. ábra a hlCED-6 konszenzus DNS szekvenciáját (7. azonosítószámú szekvencia) (2416 bp) mutatja, melyben a start és stop kodont vastagon szedtük és az alternatív splice szekvencia alá van húzva.

A 19. ábra a h2CED-6 (alternatív splice) DNS szekvenciáját (13. azonosítószámú szekvencia) mutatja be, a start és stop kodonokat vastagon szedtük.

A 20. ábra a hlCED-6 aminosav-szekvenciáját mutatja, az alternatív splicing-on átesett régiókat aláhúzva.

A 21. ábra a h2CED-6 (alternatív splice) aminosavszekvenciáját (14. azonosítószámú szekvencia) mutatja.

A 22. ábra a hlCED-6 cDNS (7. azonosítószámú szekvencia) és a hlCED-6 (8. azonosítószámú szekvencia) aminosav-szekvenciáját mutatja be, jelezve a PTB dómén nukleinsav- (9. azonosítószámú) és aminosav-szekvenciáját (10. azonosítószámú szekvencia), a töltéssel rendelkező régiót, és a prolin/szerin-gazdag nukleinsav- (11. azonosítószámú szekvencia) és aminosav-szekvenciát.

A 23. ábra a CED-6 és hlCED-6 illesztését mutatja.

A 24. ábra 47,5 %-ban illetőleg 31,6 %-ban azonos régiók illesztését mutatja.

A 25A. ábra a humán többszövetes northern lenyomat (MTN), a 25B. ábra egy humán többszövetes northern (MTN) lenyomat II, és a 25C. ábra egy humán rák sejtvonal többszövetes Northern (MTN™) lenyomatát mutatja. A hlCED-6 expressziós mintázatát mutatjuk be normális humán szövetekben és rák sejtvonalakban Northern blottolással.

A 26. ábra a pGA3015 plazmid térképe, melyben egy CED-6 frag mentumot klónoztunk a GFP-hez C-terminális fúziókéntΓ

A 27. ábra a pGA3064 plazmid térképe, melyben a CED-6-t Cterminális fúziójaként' klónoztuk a GFP-hez.

A 28A-28F. ábra a szekvenált hbc3123 EST klón, egy cDNS könyvtárból izolált PCR fragmentum I, és a PCR fragmentumot alkalmazva azonosított három EST szekvencia DNS illesztése (Genework) . A hbc3123 EST kiónt megszekvenáltuk és elemeztük. A három EST kiónt Genbank keresésen keresztül azonosítottuk izolált PCR fragmentumot alkalmazva.

A 29. ábra a humán h3CED-6 aminosav szekvenciáját (16. azonosítószámú szekvencia) mutatja összehasonlítva a hlCED-6-tal (8. azonosítószámú szekvencia).

A 30A-B. ábrák a humán h3CED-6-t kódoló nukleinsavszekvenciát (15. azonosítószámú szekvencia) mutatják a hlCED-6tal (7. azonosítószámú szekvencia) összehasonlítva.

A 31A-B. ábrák azt mutatják, hogy a h3CED-6 overexpressziója kijavít egy bekebelezési rendellenességet. A 31A. ábra azt mutatja, hogy a hCED-6 overexpressziója kijavítja a CED-6(nl813) embriók bekebelezési rendellenességét. Transzgénikus nőstények által lerakott embriókat hősokkoltunk, mielőtt az embrionális sejthalál előfordult, és feljegyeztük az L1 lárvák fejében fennmaradó elhalt sejtek számát. Mindegyik folt egy állatot képvisel. A 31B. ábra azt mutatja, hogy a hCED-6 overexpressziója kijavítja a CED-6(nl813) állatok csírasejt bekebelezési rendellenességét. A transzgénikus állatokat 36 órával az L4/felnőtt vedlés után hősokkoltuk, és az elhalt csírasejteket 12 órával a hősokk után számoltuk. A kiértékelt állatok számát mindegyik oszlop tetején jelezzük.

·· ··*· V.*· J ** * < 4 * **»'

A 32A-J. ábrák az EST-ek, CED-6, “ -hCED-6 'n^kleinsavszekvenciák közötti összehasonlítást mutatják, és egy 2416 bp-os konszenzus szekvencia konszenzus-szerkezetét készítettük el az EST RACE-ből és telephibridizációból kapott szekvenciainformációt felhasználva. A szekvenciát aal599394 templátot és a többszörös illesztésnél feltüntetett primereket alkalmazva állítottuk össze. Az Rcc a reverz komplementert képviseli. A CED-6-t és a hCED-6-t felül jelöltük, a pGAlOl többszörös illesztését telephibridizációval szereztük meg.

A h2CED-6 alternatív splice-t kódoló cDNS-eket és azokat a további szekvenciákat, melyek a h2CED-6-ból történő Ó3CED-6 előállításához szükségesek a Belgian Coordinated Collection of Microorganisms (BCCM) at Laboratórium voor Moleculaire Biologie plasmidencollective-nél (LMBP), Universiteit Gent, K. L. Ledeganckstraat 35, B 9000, Gent, Belgium, a Budapesti Szerződésnek megfelelően 1998. június 8-án helyeztük letétbe LMBP 3868 illetőleg LMBP 3869 nyilvántartási számon.

Azokat a primereket, melyek abban segítenek, hogy ezekből a letétbehelyezett cDNS-ekből a releváns inszertumokat megkapjuk, a 14. példában mutatjuk be.

• « · · ······ ··· ·· · ·· · Aminosav- és nukleotidszekvenciák

1. azonosító- számú szekv.	C. elegáns CED-6 nukleinsav-szekvencia (pl. 2A. ábra)
2. azonosító-	C. elegáns CED-6 aminosav-szekvencia (pl. 2A.
számú szekv.	ábra)
3. azonosító-	A C. elegáns CED-6 PTB doménjét kódoló
számú szekv.	nukleotidszekvencia (pl. 2A. ábra) _ __
4. azonosító-	A C. elegáns CED-6 PTB doménjét kódoló amino-
számú szekv.	sav-szekvencia (pl. 2A. ábra)
5. azonosító-	C. elegáns CED-6 prolin/szerin-gazdag régió-
számú szekv	jának nukleotidszekvenciája (2A. ábra)
6. azonosító-	C. elegáns CED-6 prolin/szerin-gazdag régió-
számú szekv	jának aminosav-szekvenciája (2A. ábra)
7. azonosító-	A hlCED-6-t kódoló nukleotidszekvencia (pl.
számú szekv.	22. ábra, 18. ábra)
8. azonosító-	A hlCED-6 aminosav-szekvenciája (például 20.
számú szekv.	és 22. ábra)
9. azonosító-	A hlCED-6 PTB doménjét kódoló
számú szekv.	nukleotidszekvencia (pl.22. ábra)
10. azonosítószá-	A hlCED-6 PTB doménjét kódoló aminosav-
mú szekv.	szekvencia (pl. 22. ábra)
11. azonosítószá-	A hlCED-6 prolin/szerin-gazdag régióját kódo-
mú szekv.	ló nukleotidszekvencia (pl. 22. ábra)
12. azonosító-	A hlCED-β prolin/szerin-gazdag régióját kódo-
számú szekv.	ló aminosav-szekvencia (pl. 22. ábra)
13. azonosító-	A h2CED-6-t kódoló nukleotidszekvencia (pl.
számú szekv.	19. ábra)
14. azonosító-	A h2CED-6 aminosav-szekvenciája (például 21.

számú szekv.	ábra)	• · · · · ·	1 · ·
15. azonosító- számú szekv.	A h3CED-6-t kódoló nukleotidszekvencia 30A-B. ábra)	(pl.
16. azonosító- számú szekv.	A h3CED-6 aminosav-szekvenciája ábra)	(például	29.

C. elegáns CED-6

A programozott sejthalált hagyományosan két különböző, egymás utáni folyamatra osztjuk fel: a sejt elpusztítása és az elpusztult sejtek eltávolítása. Azonban ez a két esemény nagyon szorosan összekapcsolódik. In vivo, az apoptotikus morfológiát mutató sejteket általában más sejtek hamar bekebelezik [Wyllie A. H. et al., Int. Rev. Cytol. 68., 251-306 (1980); Lockshin R.A. Cell Death in Biology and Pathology, R. A. Lockshin és I. D. Browen (szerk.), London: Clapman and Hall, 79-122 (1981); Duvall és Willie, Immunol. Today 7, 115-119 (1986); Robertson és Thompson, J. Embriói. Exp. Morph. 67, 89-100 (1982); Hedgecock et al., Science 222, 1277-1279 (1983); Ellis et al., Genetics 129, 79-94 (1991). A bekebelezés a Caenorhabditis elegáns fonálféregben szintén egy gyors és hatékony folyamat: az elpusztuló sejteket a szomszédos sejtek bekebelezik és egy órán belül teljesen eltávolítják [Sulston és Horvitz, Dev. Biol. 56, 110-156 (1977); Robertson és Thomson (1982)]. A bekebelezéshez nincs szükség professzionális fagocitákra. Az apoptotikus sejtek gyors eltávolítása fontos, mivel ez meggátolja, hogy a pusztuló sejtek a lízisük alatt potenciálisan káros tartalmukat kibocsássák, mely károsíthatná á' körülvevő szövetet és egy gyulladásos válaszreakciót eredményezne [Duvall et al., Immunology 56, 351-358 (1985); Savill et al., J. Clin. Invest. 83, 865-875; Grigg et al.,

...............

• · · · · ····· ····· · ·· ·

Lancet 358, 720-722 (1991); Savill et al., Immunol. Today 14, 131-136 (1993)].

A C. elegáns fonálférget kiterjedten alkalmazzák a programozott sejthalál vizsgálatára [Hengartner, Cell Death in C. elegáns II, Plain View, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 383-415 (1997)]. A genetikai vizsgálatok több mint egy tucat olyan gént azonosítottak, melyek az apoptózis szabályozásában és végrehajtásában közreműködnek a C. elegánsban. Hat gén, a CED-1, CED-2, CED-5, CED-6, CED-7 és CED-10 működik közre a pusztuló sejtek bekebelezésében [Hedgecock et al. (1983); Ellis et al. (1991); Horvitz et al. (1994) Cold Spring Harbour Symp. Quant. Biol. 59, 377-385 (1994)]. Ezeknek a géneknek bármelyikére mutáns állatokban számos apoptotikus sejtet nem sikerül bekebelezni, és több órán át erős refraktilis korongokként fennmaradnak, melyek differenciális interferencia kontraszt optikával (DIC) könnyen azonosíthatók [Hedgecock et al. (1983), Ellis et al. (1991)]. A hat bekebelezési gén egyike sem abszolút létfontosságú a bekebelezéshez, mivel számos pusztuló sejt még megfelelően eltávolítódik ezekben a mutánsokban. A különböző kettős mutánsokkal végzett genetikai elemzés alapján feltételezhető, hogy ez a hat gén két részben redundáns csoportot alkothat, az egyik a CED-l-ből, CED-6-ból és CED-7-ből áll; a másik a CED-2-bó'l, CED5-ből és CED-10-ből [Ellis et al (1991)]. A fennmaradó elhalt sejtek száma drámaian megnő a csoportok közötti kettős mutánsokban, viszont az ugyanabban a csoportban lévő kettős mutánsokban nem. Annak a megértéséhez, hogy ezek a gének hogyan vesznek részt a bekebelezés szabályozásában, a molekuláris természetük megértése szükséges.

...............

• · · · · ·«··· ··· ·· · ·· ·

Más fajokban különböző feltételezett apoptotikus receptort azonosítottak az elmúlt néhány évben; ezek közé tartozik az ABC1 ATP-kötő kazetta transzporter [Luciani és Chimini, EMBO J. 15, 226-235 (1996)], adhéziós molekulák, úgymint a vitronektin receptor [Savill et al., Nature 343, 170-173 (1990)] és CD36 [Asch et al., J. Clin. Invest. 79, 1154-1061 (1987); Savil et al., J. Clin. Invest 90, 1513-1522 (1992); Ren et al., J. Exp. Med. 18, 1857-1862 (1995); Drosophila croquemort [Franc et al., Immunity 4, 431-443 (1996)], A osztályú tisztító (scavenger) receptorok [Platt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 12456-12460 (1996)], lektinek [Duvall et al., 1985] és egy előre megjósolt receptor, mely képes felismerni a foszfatidil—szerint az apoptotikus sejtek külső felszínén [Fadok et al., J. Immunoi. 148, 2207-2216 (1992); Fadok et al., J. Immunoi. 149, 4029-4035 (1992) ] .

Jelenleg keveset tudunk azokról a molekulákról, melyeket a bekebelező sejtek használnak a jelek átviteléhez a felszíni receptoroktól a citoszkeletonba, és arról, hogy ezek a molekulák hogyan szabályozzák a lokális citoplazmatikus átrendeződéseket és a dinamikus kiterjedéseket, melyek a fagocitózishoz szükségesek [Savil et al.(1993)]. A bekebelezés genetikai elemzése C. elegánsban azonosíthatja az ebben a folyamatban résztvevő géneket. Valójában Wu és Horovitz [Nature 392, 501-504 (1998)] kimutatták, hogy a C. elegáns CED-5 homológ a humán DOCK180-nal, és lehetséges, hogy ez szabályozza a citoszkeleton átrendeződést a bekebelezés alatt.

Az apoptózis folyamata a betegségek széles körének kóroktaná ban szerepet játszik vagy a patológiájához kapcsolódik, ide ért18 • · · · · · ··♦♦ ··· ·· · ·· ♦ ve a rákot, autoimmun betegségeket, különböző neurodegeneratív betegségeket, úgymint az amiotrófiás laterális szklerozist, Huntington kór, Alzheimer kór, stroke, miokardiális szívinfarktus és AIDS [Thompson, Science 267, 1456-1462 (1995)]. Tehát az apoptózis alapját képező molekuláris események jobb megértése új terápiás találmányokhoz vezethet. Míg jelenleg a figyelem nagy része azokra a génekre és fehérjékre összpontosul, melyek a halál folyamatának elpusztítás! lépését szabályozzák, nagyon valószínű, hogy az apoptotikus sejtek eltávolításáról bebizonyosodik, hogy szintén döntő az apoptotikus program helyes általános működéséhez, és egy másik belépési pontot kínál a terápiás beavatkozáshoz (ahogy azt itt leírjuk).

A pusztuló sejtek felismerése és bekebelezése rendkívül gyors és hatékony. Állatokban lényegében lehetetlen olyan apoptotikus tulajdonságokat mutató sejtet találni, mely még nincs egy másik sejtben benne. Az apoptotikus sejteknek ez a gyors felismerése és fagocitózisa az in vivo programozott sejthalál kritikus pontja: a be nem kebelezett apoptotikus testek egy második nekrózison eshetnek át, mely gyulladáshoz vezet. Az apoptotikus testek eltávolításának hiánya a testet új epitopoknak (például kaszpázgenerált fehérjefragmentumokból származó epitopoknak) teszi ki, mely lehetséges, hogy elősegíti az autoimmun betegség kialakulását. Gyakran figyelhetünk meg fennmaradó apoptotikus testeket a kemoterápiás beavatkozást követően (mely nagymértékű apoptózishoz vezet), és különösen sok van belőle a szolid tumorokban, melyeknél az elhalt sejtek kitisztulása lelassul.

A professzionális fagociták amellett a képességük mellett, hogy az apoptotikus sejteket felismerik és bekebelezik, specifi19 ...............

··«· · · ··· • · · · · · · · · · ··· ·· · ·· · kus felszíni receptorokat hordoznak, úgymint Fc-t [Ravetch, Cell 78, 553-560 (1994); Greenberg et al ., J. Exp. Med. 177, 529-534 (1993), és C3 [Bianco et al., J. Exp. Med. 141, 1278-1290 (1975), Greenberg, Trends in Cell Biol. 5, 93-99 (1995)] receptorok, melyek felismerik az antigén-opszonizált részecskéket, és kiváltják a fagocitózisukat. Az inhibitor vizsgálatok kimutatták, hogy az Fc-receptor által közvetített fagocitózishoz tirozin foszforiláció szükséges [Greenberg et al. (1993); Greenberg (1995)]. Munkánk alapján feltételezzük, hogy az apoptotikus sejtek bekebelezését szintén egy tirozin kináz jelátviteli út közvetítheti. Mivel ez a két reakcióút egyértelműen eltérő receptorokat alkalmaz a sejtfelszínen, bizonyára végső fokon ugyanabba a downstream bekebelezési rendszerbe fut össze, és így van legalább néhány közös jelátviteli molekulájuk.

A találmány egy olyan izolált fehérjére vonatkozik, mely egy adapter molekula az apoptotikus sejtek fagocitózisát szabályozó jelátviteli útban.

A találmány egy különös megvalósítási módjában a C. elegáns fonálféregből származó izolált fehérjére vonatkozik, mely egy olyan, jelátviteli útban működő molekula, amely elősegíti az apoptotikus sejtek fagocitózisát, és mely fehérje a 2A. ábrán bemutatott aminosav-szekvenciát (2. azonosítószámú szekvencia), vagy egy olyan aminosav-szekvenciát tartalmaz, mely a 2A. ábrától csak konzervatív aminosav-cserékben különbözik. Ahogy fentebb említettük, a 2A. ábrán bemutatott aminosav-szekvencia a C. elegáns CED-6 fehérje szekvenciája, melynek kódoló DNS-ét szin tén bemutatjuk.

A találmány egy másik tárgyát egy olyan nukleinsav képezi, ··· · · · · · · • · · · · · ·*|* mely a 2A. ábrán bemutatott aminosav-szekvencíat kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazza, például a 2. azonosítószámú szekvenciát, a 2A. ábra hozzávetőleg 22. helyzetétől a hozzávetőleg 1500. helyzetig tartó nukleotidszekvenciát, vagy a 2A. ábrán bemutatott teljes nukleotidszekvenciát tartalmazza.

A találmány egy további megvalósulási módjában egy olyan izolált fehérjét biztosit, mely a 2A. ábra szerinti aminosavszekvenciával rendelkező fehérje egy fragmentuma vagy része, vagy egy olyan fehérje, mely a 2A. ábrában bemutatottól csak konzervatív aminosav-cserékben különbözik. Például a rész tartalmazhatja a foszfotirozin-kötő doménnek megfelelő aminosavszekvenciát (4. azonosítószámú szekvencia) (a 2A. ábrán körülbelül a 46. aminosavtól körülbelül a 193. aminosavig), vagy a prolin/szerin-gazdag régiónak megfelelő aminosav-szekvenciát (6. azonosítószámú szekvencia) (a 2A. ábrán körülbelül a 242. aminosavtól a körülbelül a 339. aminosavig).

A C. elegáns CED-6 fehérjéjének PTB doménjét vagy a prolin/szerin-gazdag régióját kódoló nukleinsavak szintén az igényelt találmány részét képezik.

A találmány egy további tárgyát egy olyan izolált nukleinsav képezi, mely az 1., 3., 5., 7., 9., 11·/ 13., 15. számú nukleotidszekvenciákhoz képes hibridizálódni kevéssé, közepesen vagy nagyon szigorú körülmények között. Nyilvánvalóan a kevéssé szigorú körülmény hozzávetőleg a következőt jelenti: 0,2-2 X SSC, 0,1% SDS, 25-50°C.

A találmány egy további megvalósulási módjában egy olyan fú ziós fehérjét biztosít, mely a fúzió részeként egy 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú aminosav-szekvenciával · · · ·*· · vagy a 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú aminosav-szekvenciától csak konzervatív aminosav-cserékben különböző aminosav-szekvenciával rendelkező fehérjét tartalmaz. A fehérje például egy epitop részhez vagy egy riporter gén termékéhez lehet fuzionálva.

A találmány egy további tárgyát az 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13., 15. nukleinsav-szekvenciák valamelyikét tartalmazó expressziós vektorok képezik. Előnyösen a vektorok egy riporter gént, mint például a zöld fluoreszcencia fehérje génjét foglalják magukban, mely a találmány szerinti nukleinsavhoz viszonyítva úgy helyezkedik el, hogy a nukleinsav expressziója a riporter gén expresszióját eredményezze. Előnyösen a CED-6 és a riporter gén fúzióját fejezzük ki.

Érthető módon a nukleinsav kifejezés, ahogy itt alkalmazzuk, genomiális DNS-t, RNS-t és cDNS-t foglalhat magában.

Pozícionális klónozási módszereket alkalmaztunk a C. elegáns CED-6 gén klónozására és a nukleotidszekvencia meghatározására. Továbbá ezek a módszerek funkcionálisan is jellemezték a fehérjét. A nyilvánosan hozzáférhető szekvencia adatbázisokban keresve meghatároztuk, hogy a CED-6 fehérje az N-terminális felében egy feltételezett foszfotirozin-kötő domént tartalmaz, és a Cterminális felében egy prolin/szerin-gazdag régiót, mely egy potenciális SH3-kötő dómén.

A genetikai mozaik analízis valamint a mentési és overexpressziós kísérletek kimutatták, hogy a CED-6 autonóm módon hat a bekebelező sejtekben, és elősegíti az apoptotikus sejtek bekebelezését. További adatbázisos keresések igazolták, hogy a funkcionális régiók meglepő módon evolúciósán konzerválódtak.

·**♦· · · * · ·«··« w « · ·· ♦ · ' így klónoztuk , a C. elegáns CED-6 gén két humán homológját, és kimutattuk, hogy ekvivalens funkciójuk van.

A. C. elegáns CED-6 molekuláris klónozása

Ellis és munkatársai korábbi genetikai kísérletei [Ellis et al., Genetics 129, 79-94 (1991)] a CED-6 gént a daf-4 lókusz közelébe helyezték a 3-as kromoszómán (1A. ábra). A daf-4 körüli régiót nagyrészt megszekvenálta a C. elegáns genom szekvencia konzorcium [Wilson et al., Nature 368, 32-38 (1994)] A CED-6 pontos fizikai elhelyezkedésének meghatározásához tizenhárom átfedő kozmidot gyűjtöttünk össze ebben a régióban, melyek együttesen durván 0,3 Mbp-t tettek ki. Csiravonal transzformációs eljárást alkalmazva [Mello és Fire, Methods in cell biology, 452482, San Diego Academic Press (1995)], ezeket a kozmidokat a CED-6(nl813) bekebelezési rendellenességének kijavítására (mentésére) teszteltük, a transzgénikus állatok által lerakott háromszoros embriókat a fennmaradó elhalt sejtek jelenlétére vizsgálva. Háromszoros embriókat választottunk a kezdeti vizsgálatokhoz, mivel az elhalt sejtek ebben a fejlődési állapotban nagy számban vannak jelen, és könnyen láthatóak. Két olyan átfedő kozmidot találtunk, az F56D2-t és az F43F12-t, mely képes a CED6(nl813) bekebelezési rendellenesség kijavítására. További, az F56D2-ből származó DNS fragmenseket alkalmazó mentési kísérletekről állapítottuk meg, hogy tartalmazzák a javítási (mentési) aktivitást.

A GENEFINDER™ génjósló program két gén jelenlétét feltételezte ebben a régióban, melyeket a C. elegáns genomszekvencia konzorcium a GenBankba F56D2.7 és C05D2.6 nevek alatt nyújtott be. RT-PCR-t és a cDNS könyvtárak szkrínelésének kombinációját alkalmazva (lásd lentebb) az F56D2.7 létezését és intron/exon mintázatát igazoltuk. Mindemellett úgy találtuk, hogy a C05D2.6 jelenleg inkább két génnek felel meg és- nem egynek, és a felső transzkriptum vége és az alsó transzkriptum kezdete közötti kicsi távolság (>»bp) alapján feltételezhető, hogy a C05D2.6A/B egy kétgénes operon lehet (Zorio et al., Nature 372, 270-272 (1994)]. Megállapítottuk, hogy a C05D2.6B transz-splicingon esik át az alsó SL2 splice leader felé, mig a C05D2.6A felső transzkriptum sokkal általánosabb SL1 splice leader felé esik át a transz-splicingon (1E. ábra).

A CED-6 lókusz

Annak meghatározására, hogy a három, Xhol fragmentumon lévő gén közül melyik felel meg a CED-6-nak, számos belső deléciót és pontmutációt tartalmazó szerkezetet hoztunk létre. A C05D2.6A/B operon nagy részének deléciója nem volt káros a CED-6 mentésre, mig egy az F56D2.7 3-as exonjában frameshift-mutáció megszűntette a fragmentum mentési (javítási) aktivitását (1E. ábra). Annak a lehetőségnek a kizárására, hogy az F56D2.7 a CED-6 egy többkópiás szuppresszora, és annak a gyanúnak az igazolására, hogy az F56D2.7 a CED-6 lókusznak felelhet meg, két ismert CED-6 alléit, az nl813-t és az n2095-t nukleotidcserékre elemeztük ebben a régióban. A Southern-blot elemzés egy allélspecifikus restrikciós fragmentum hossz polimorfizmust tárt fel, mely érinti az F56D2.7-t a CED-6(n2095) mutánsokban (2A. ábra). Az n2095ben megfigyelt hibridizációs mintázatok alapján egyetlen nukleotidból álló deléciót állapítottunk meg az F56D2.7 4-es exonjában a CED-6(nl813)-ban. Ez a mutáció egy leolvasási keret eltolódást és egy csonkolt fehérjét eredményez (2B. ábra).

Összességében a genomiális mentés és a mutációs adatok alapján határozottan feltételezhető, hogy az F56D2.7 megfelel a CED-6nak.

A CED-6 transzkriptumok azonosítása

A CED-6 megjósolt intron/exon szerkezetének igazolására egy kevert állapotú cDNS könyvtárat szkrineltünk, és 10, a CED-6 gének megfelelő kiónt azonosítottunk. Ezek közül több SL2 splice leadert tartalmazott az 5' végen, azt sejtetve, hogy a CED-6 egy alsó (downstream) gén lehet az operonban. RT-PCR-t végeztünk kevert állapotú RNS-en a PCR lépésben SL1 és SL2 transz-splicing leadereket alkalmazva primerként. Érdekes módon, a PCRamplifikált fragmentumok szekvencia-analízise feltárta, hogy az SL1 és SL2 transz-splicing leaderek a CED-6 transzkriptum 5' végén találhatóak (2B. ábra). A CED-6 operonban az alsó gén a megjósolt F56D2.1 gén. Az SLl-transz-splicingon átesett mRNS jelenléte alapján feltételezhető, hogy a CED-6 egy második alsó (downstream) promóterről is átíródhat, függetlenül a felső géntől. Egy downstream promóter léte megmagyarázná, hogy a Xhol fragmentum miért képes kijavítani a CED-6 mutánsokat, még akkor is, ha nem tartalmazza a teljes CED-6 operont.

A CED-6 fehérje agy foszfotirozin-kötő domént és egy szerin/prolin-gazdag régiót tartalmaz.

A teljes hosszúságú CED-6 cDNS-ről megjósoltuk, hogy egy 429 aminosavból álló fehérjét kódol (2B. ábra). A megjósolt CED-6 szekvenciával végzett keresés nyilvános szekvencia adatbázisban, azt jelezte, hogy a CED-6 N-terminális fele egy feltételezett foszfotirozin-kötő (PTB) domént tartalmaz. A PTB domének elő tudják segíteni a megfelelő elsődleges szekvenciakörnyezetben elhelyezkedő foszforilezett tirozingyökök kötődését. A PTB dómén szerepe hasonlít az SH2 doménjéhez, de szerkezete eltérő. Illesztéseket hajtottunk végre a CED-6 PTB dómén és számos más fehérjében megtalálható PTB dómén között (3A. ábra)· A másodla gos szerkezetet megjósló programok azt sejtették, hogy ezeknek a szerkezeti elemeknek a nagy része megvan a CED-6 PTB doménben is.

Amellett, hogy ismert fehérjékhez hasonlít, a CED-6 PTB dómén szignifikáns szekvenciahasonlóságot mutat számos EST (expressed sequence tag) megjósolt transzlációs termékével (3A., B. ábra). Valójában a CED-6 és számos EST között a hasonlóság mértéke nagyobb, mint a CED-6 és bármely korábban jellemzett fehérje között (3A. és 3B. ábra). Továbbá néhány esetben a szekvenciahasonlóság a CED-6 és az EST-ek között a PTB doménen is túlterjed (3B. ábra). A CED-6 egy prolin/szerin-gazdag régiót is tartalmaz a C-terminális felében, egy 24 aminosavból álló szakaszon keresztül 42 %-os szerintartalommal, és prolinban gazdag régiók csoportjaival (2B. ábra, 3B. ábra). Ezeket a prolinban gazdag régiókat néhány PxxP szekvenciajelzés jellemez (2A. ábra), melyekről kimutattuk, hogy elősegítik az SH3 doménekkel való kölcsönhatást [Ren et al. (1993); Yu et al., Cell 76, 933-945 (1994); Grabs et al., J. Biol. Chem. 272,

13419-13425 (1997)]. A PTB és a prolinban gazdag régiók között egy rövid, töltéssel rendelkező gyökökben gazdag szakasz (41 % töltéssel rendelkező aminosav 46 aminosavon keresztül) van. Ez az erős töltéssel rendelkező régió szintén megtalálható néhány más PTB-t tartalmazó fehérjében, ezek közé tartozik az egér p96, She és C. elegáns M110.5 (3B. ábra).

···**··· « *«·*·*/·

A CED-6 konzerválódása a fajok között

Úgy találtuk, hogy ezek az EST-ek a CED-6 fehérjével a PTB domént felülmúló homológ régióval rendelkeznek. Egy C. briggsae EST klón 72 %-os azonosságot mutat a CED-6-tal 132 aminosavon keresztül az N-terminális végnél, és 64 %-os azonosságot mutat a CED-g-tal 103 aminosavon keresztül a C-terminális végnél (3B. ábra) . Három átfedő humán EST kiónt is kaptunk, melyeket egy szekvenciába szerkesztettünk össze. A humán EST fúziós szekvencia 54%-os azonosságot mutatott a CED-6 PTB doménjével, és szintén tartalmazott egy nagy töltéssel rendelkező régiót a PTB dómén után jobbra. Az evolúciós fa azt mutatta, hogy a CED-6 egy alcsoportot képez a humán, Drosophila és C. briggsae-ből származó EST kiónokkal, mely alapján feltételezhető, hogy ezek a fehérjék funkcionálisan megőrződtek. Az egér p96, Drosophila Disabled és C. elegáns M110.5 egy másik alcsoportot képezett (3C. ábra). A fa azt is jelezte, hogy az She alcsoport a p96 alcsoportnál jobban hasonlít a CED-6 alcsoporthoz.

A CED-6 sejt autonóm módon működik a bekebelező sejtekben

Egy genetikai mozaik analízist hajtottunk végre, hogy meghatározzuk, vajon a CED-6 a bekebelező sejtekben vagy az elpusztuló sejtekben működik-e. A kényelem kedvéért a felnőtt ivarmirigy egy pár sejtjét, csírasejteket és szomatikus buroksejteket alkalmaztunk (4A. ábra). Az oogenezis során nagyszámú oocita esik át a programozott sejthalálon, és normálisan ezeket a pusztuló sejteket a szomatikus buroksejtek bekebelezik [Hengartner 1997]. Ebben az elemzésben a csírasejtek és a szomatikus buroksejtek között a CED-6 és a vad típus genetikai hátterének mozaikos mintázatát hoztuk létre. Ncl-1 mutánst alkalmaztunk a mozaikos min27 ·· · · · ····· ··« · · C ·· · tázat azonosítására egysejtes felbontásban, mivel az állatok

Ncl-1 mutáns szomatikus sejtjei rendellenesen megnagyobbodott sejtmagvacskákat mutatnak, melyek Nomarski optika alatt könnyen azonosíthatók [Herman, Genetics 108, 165-189 (1984); Hedgecock és Herman, Genetics 141, 989-1006 (1995)]. Egy dpy-17(el64)CED6(nl813)mec-14(u55)ncl-1(el865)unc-36(e251)III;sDp3 törzset szerkesztettünk. Ez a féregtörzs vad típusú fenotípust mutat, mivel az sDp3(III;f) duplikáció ezeknek a mutációknak mindegyikét lefedi [Rosenbluth et al., Genetics 109, 493-511 (1985)]. Abból a célból, hogy a CED-6 mutáns csírasejtekkel és vad típusú szomatukus buroksejtekkel rendelkező állatokat azonosítsunk, olyan állatokat kell találni, melyekben a P2, P3 és P4 vonalak bármelyikében a duplikáció hiányzik, de nem hiányzik az EMS, MS vagy bármely MS utáni vonalban, mely duplikáció elveszítéséhez fog vezetni a szomatikus buroksejtekben (4. ábra). Ezeket az állatokat úgy kaphatjuk, hogy a létrehozott törzs számos állatát átnézzük azokra az állatokra, mely csak a Dpy Unc utódokat raknak. A duplikáció elvesztésével Pl vonalban rendelkező állatok szintén csak Dpy Unc utódokat hoznak létre, azonban ezek az állatok nem mozaikos állatok a jelen célból, mivel a Pl vonalban a duplikáció elveszítése CED-6 mutáns hátteret eredményez a csírasejtekben és a szomatikus buroksejtekben is. 1000 dpy17 (el 64) CED-6(nl813)mec-14(u55)ncl-1(el865)unc-36(e251)III; sDp3 állatból hat olyat azonosítottunk, mely Dpy Unc utódokat rak le. Ennek a hat állatnak a megfigyelése Nomarski optika alatt azt jelezte, hogy egy állatból hiányzott a duplikáció a P4-ben, egy ből a P3-ban, háromból a P2-ben, és egyből a Pl-ben. Az öt állat egyike sem mutatott elhalt sejteket az ivarmirigyben, kivéve ·· · · · ····· ··· ·· · ·· · egyet, melynek a Pl^-ben elveszetta duplikációja, mely alapján feltételezhető, hogy a CED-6 nem szükséges a csíravonalban a bekebelezéshez. Mivel annak az eshetősége, hogy a duplikácio elvesztése az összes sejtosztódásnál hozzávetőleg azonos [Hedgecock és Herman (1995), az sDp3 elvesztésének mértéke 0,15 % sejtosztódásokként. CED-6 mutáns szomatikus buroksejtekkel és vad típusú csírasejtekkel rendelkező állatokat kerestünk. 500 állatból négy állatot azonosítottunk megnagyobbodott nukleolusszal az ivarmirigy egyik karjában lévő szomatikus buroksejtekben, és a négy állat közül egy sem rendelkezett duplikációvesztéssel a vonalat létrehozó csírasejtekben (4. ábra) , úgy tűnt, hogy három állat rendelkezett duplikációvesztéssel a buroksejtekben az elülső karban, de a hátulsó karban nem. Felhalmozódott elhalt sejteket csak az elülső ivarmirigykarban figyeltünk meg, de ezeknek az állatoknak a hátulsó ívarmirigykarjában nem (4. ábra, táblázat). Egy állat rendelkezett duplikációvesztéssel a hátsó ivarmirigykart körülvevő buroksejtekben, de az elülső kart körülvevő sejtekben nem. Ennek az állatnak a hátulsó karjában felhalmozódott elhalt sejtek voltak, de az elülső karban nem (4. ábra). Ezeknek az eredményeknek az alapján feltételezhető, hogy CED-6 szükséges a szomatikus buroksejtek vagy a bekebelező sejtek számára, hogy megsemmisítsék a pusztuló sejteket a felnőtt ivarmirigyben.

A CED-6 elősegíti az elhalt embriogén és csírasejtek bekebelezését

Abból a célból, hogy egyértelműen bizonyítsuk, hogy az F56D2.7 cDNS valóban megfelel a CED-6-nak, teszteltük, hogy a teljes hosszúságú F56D2.7 cDNS kijavítja-e a CED-6 mutánsok be29 ···· · · · · · ·· · · · ·««·· ·«· · · « · kebelezési rendellenességét, és transzgénikus állatokat hoztunk létre, melyek az F56D2.7 cDNS-t hordozzák a C. elegáns hsp-16.2 és hsp-16.48 hősokk promóterek szabályozása alatt (lásd a példákat) . Együtt használva, ez a két promóter csaknem az összes szomatikus sejtben irányítja az expressziót, beleértve azokat a sejteket, melyek normálisan esnek át a programozott sejthalálon, és azokat a sejteket is, melyek normálisan bekebelezik a pusztuló sejteket. A javítás vizsgálatára transzgénikus anyaállatok által lerakott embriókat rövid hősokk impulzusnak tettünk ki, éppen mielőtt az első egyedfejlődési sejthalálok megtörténtek volna, és számoltuk a hősokkolt állatokban látható megmaradt elhalt sejteket a kikelés után. (4. ábra). Ahogy vártuk, az F56D2.7 cDNS szignifikánsan és specifikusan lecsökkentette a CED-6 mutánsokban látható fennmaradt elhalt sejtek számát, igazolva, hogy az F56D2.7 a mutációk által érintett gén, melyet a CED-6(nl813) és CED-6(n2095) mutánsokban kimutattunk. Az F56D2.7 cDNS mentését csíravonalban is teszteltük (5C. ábra). Kifejlett hermafroditákat rövid hősokk impulzusnak tettünk ki, mielőtt a csíravonalsejt-halál jelentkezett volna, és a fennmaradó elhalt sejtek számát mértük a hősokk után 12 órával és tovább. Az állatok nagy részében az ivarmirigyekben nem találtunk elhalt sejteket, mely alapján feltételezhető, hogy a CED-6 cDNS a CED-6 bekebelezési rendellenességet a csíravonalban is kijavítja.

Az apoptotikus sejtek felismerése és bekebelezése a C. elegáns programozott sejthalálban egy nagyon korai esemény [Robertson és Thomson, Embryol. Ex. Morph. 67, 89-100 (1982)]. CED-6 mutánsokban a citoplazma növekedése blokkolódik, mely az elhalt sejtek fennmaradását eredményezi [Ellis et al. (1991)].

·.. · · v

Ezek az elhalt sejtek végső soron azért eltűnnek az állatból. Annak meghatározására, hogy vajon a CED-6 csak egy szűk időszakban hat-e a sejthalál korai stádiumában vagy vajon a jelátviteli útat fel lehet használni az elhalt sejtek bekebelezésére több órával azután is, hogy a sejthalál megtörtént, teszteltük, hogy az F56D2.7 cDNS elősegiti-e a fennmaradó elhalt sejtek bekebelezését. A CED-6-t három órával az embriók kikelése előtt overexpresszáltuk, akkor, amikor az embriófejlődés alatt a legtöbb programozott sejthalálon áteső sejt elpusztul, hozzávetőleg öt órán át (5A. ábra), és megvizsgáltuk az elhalt sejteket az L1 lárvák fejében három órával a hősokk után. Úgy találtuk, hogy az elhalt sejtek száma szignifikánsan szuppresszálódott (5B. ábra). A kontroll kísérletek, melyeknél nincs hőkezelés vagy lacZ overexpresszió, nem mutattak szembetűnő hatást az elhalt sejtek kifejeződésére, mely alapján feltételezhető, hogy a CED-6 overexpressziója elő tudja segíteni az elhalt sejtek bekebelezését a szómában (5B. ábra). Azt is megvizsgáltuk, hogy vajon a CED-6 overexpressziója elő tudja-e segíteni a sejthalál után órákkal képződő elhalt sejtek bekebelezését a csíravonalban (5D. ábra) . Hősokk promóterek által irányított CED-6 cDNS-t hordozó kifejlett transzgénikus állatokat hővel kezeltünk különböző időpontokban az elhalt sejtek ivarmirigyben történt felhalmozódása után, és az elhalt sejtek számát 12 órával a hősokk után vizsgáltuk meg. Úgy találtuk, hogy az elhalt sejtek mindegyik időpontban megfelelően eltávolíthatók voltak, mely alapján feltételezhető, hogy a CED-6 overexpressziója elősegíti a csíravonalban felhalmozódott elhalt sejtek bekebelezését órákon át, akár napokig (5D. ábra). Arra a következtetésre jutottunk, hogy a jelát31 ···· · · ··· ·· · · · ····· • · · ·« · · viteli út, melyben a CED-6 részt vesz, ellátja az elhalt sejtek eltávolításának feladatát, és nincs egy specifikus időintervallum, ami alatt a CED-6 a programozott sejthalál folyamata során működik.

A mozaikos CED-6 fehérjeexpresszió alátámasztja, hogy a CED-6 a bekebelező sejtekben működik

A találmány eljárásokat foglal magában, annak gyors kimutatására, hogy a CED-6 működik-e a bekebelező sejtekben. Ez az eljárás azon alapul, hoy a pusztuló sejtek nem tudják expresszálni a fehérjéket, így a fehérjeexpresszió mozaikos mintázatát hozzák létre. Azonban ezt az elméletet csak a szómában lehet alkalmazni, és a csírasejtben nem, mivel a csíravonalban minden csírasejt egyetlen szinciciális citoplazmát alkot [Hirsch et al., Developmental Biology 4_9, 200-210 (1976) ] , így azok a csírasejtek, melyek a transzgéneket hordozzák, bejuttatják a kifejezett fehérjéket a citoplazmába, következésképpen az összes újonnan képződött oocitába. Mindemellett a fehérje-expresszió mozaikos mintázata létrehozható a csíravonalban, mivel úgy találtuk, hogy a transzgének nem jól expresszálódnak a csírasejtekben. A hősokk promóterek expressziós mintázatát az ivarmirigyben vizsgáltuk meg. Hősokk promoter által irányított lacZ transzgéneket hordozó felnőtt állatokon hősokkot alkalmaztunk 24 órával az L4 vedlések után. Ezt követően a lacZ expressziót béta-gal festéssel vizsgáltuk meg a csírasejtekben és a buroksejtekben is. Úgy találtuk, hogy a szomatikus buroksejtek kékre festődtek, és a festődés 60 órán át tartott a hősokk után, a csírasejtekben viszont a hősokk után egyetlen időpontban sem figyeltünk meg festődést. Ehhez hasonló eredményeket figyeltek meg a korábbi vizsgálatok ban is [Stringham et al., Molecular Biology of the cell 3, 221233 (1992)]. A CED-6 hősokk utáni expresszióját a csiravonalban hősokk-kezelt transzgénikus állatok által tojt háromszoros embriókban is megvizsgáltuk a bekebelezési rendellenesség javítási aktivitására. Úgy találtuk, hogy az embriók nagy része CED-6 mutáns fenotipusú, mely alapján feltételezhető, hogy CED-6 nem fejeződik ki jól a csiravonalban. Mivel a CED-6 transzgén nem fejeződik ki nagyon jól az ivarmirigyben, ez felhasználható eszközt nyújt annak tesztelésére, hogy a CED-6 müködik-e a szomatikus buroksejtekben. Ahogy a 4. és 5. ábrán leírtuk, az állatok nagy részénél nem figyeltünk meg elhalt sejteket az ivarmirigyben a hőkezelés utáni különböző időpontokban, és ez a jelenség kezelés után 60 órán át vagy tovább tartott (5C ábra) . Ezzel az eredménnyel szemben, hőkezelés nélkül ezeknél a transzgénikus állatoknál elhalt sejtek halmozódnak fel az ivarmirigyben, hasonlóan a CED-6(nl813) mutáns esethez. A lacZ overexpressziója nincs hatással a CED-6 mutáns elhalt sejtjeinek kifejeződésére (5C. ábra). Ezek az eredmények alátámasztják a mozaikos analízisből származó következtetésünket, azt, hogy a CED-6 a bekebelező sejtekben, a szomatikus buroksejtekben hat. Ez az eljárás egyszerű módja annak kimutatására, hogy vajon egy gén a bekebelező vagy a pusztuló sejtekben működik-e.

A CED-6 aktív helye a CED-l-hez és CED-7-hez viszonyítva

Annak megértésére, hogy a CED-6 gentikailag kölcsönhatásban áll-e valamely más bekebelezési génnel, A CED-6-t CED-1, 7, 2, 5 és 10 genetikai háttérnél overexpresszáltuk. A hősokk promóterek által irányított CED-6 cDNS-t hordozó extrakromoszómális elrendezéseket CED-6(nl813) háttérből vittük át a vad típusú N2 hát ·· · · · ···>* ·· · V « ♦ · térbe, és ezt követően a CED-1, 7, 2, 5 és 10 mutáns háttérbe. A CED-6-t ezután overexpresszáltuk azt az eljárást követve, melyet a CED-6 bekebelezési rendellenesség javítására (mentésére)· alkalmaztuk a CED-6 cDNS overexpresszálásával, ahogy az 5A. ábrán leírtuk. Úgy találtuk, hogy a CED-6 overexpressziója részben szuppresszálja a CED-7(nl997) bekebelezési rendellenességét. Annak megértésére, hogy vajon a szuppresszió allélspecifikus-e, két további alléit, a CED-7(nl996)-t és a CED-7(nl892)-t teszteltük, és hasonló eredményeket értünk el, mely alapján feltételezhető, hogy a szuppresszió nem allélspecifikus (6. ábra). Ugyanebből a célból a CED-1 három allélját, az nl506-t, nl995-t és nl735-t szintén teszteltük, és azt állapítottuk meg, hogy a CED-6 overexpressziója részben szuppresszálja a három CED-1 alléi bekebelezési rendellenességét (6. ábra). Különböző kontroll kísérleteket hajtottunk végre, hogy igazoljuk, hogy ez a mentés specifikus a CED-6-ra. CED-6 transzgénnel rendelkező transzgénikus állatokat teszteltünk hősokk kezelés nélkül; a lacZ overexpresszióját CED-1 vagy CED-7 bekebelezési mutáns háttérnél szintén teszteltük. Az eredmények azt mutatják, hogy az elhalt sejtek hasonló számát értük el, mint a CED-1 vagy CED-7 mutánsoknál. A hőkezelés lecsökkentette az elhalt sejtek expresszióját a CED-7(nl997)-nél. A CED-6 ovrexpressziója még inkább lecsökkentette az elhalt sejtek kifejeződését. Ezek az adatok azt sejtetik, hogy a CED-1 és CED-7 mindegyikének bekebelezési rendellenességének részleges szuppressziója specifikus a CED-6-ra. Azt is megfigyeltük, hogy a CED-6 overexpressziója nincs nyilvánvaló hatással az elhalt sejtek számára a CED-2-nél, 5-nél és 10-nél. Ezeknek az eredményeknek az alapján feltételez hető, hogy a CED-6 lefele (downstream) működik a CED-l-től és CED-7-től, és a CED-2, 5 és 10 vagy a CED-1, 6 és 7 után vagy egy másik reakcióútban működik (6. ábra).

A CED-6 expresszié» szabályozása

Az SL2-t a CED-6 DNS 5' végénél mutattuk ki, mely alapján feltételezhető, hogy a CED-6 egy operon alsó génje [Huang and Hirsch, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 8640-8644 (1989); Spieth et al., Cell 7_3, 521-532 (1993); Zorio et al., Nature 372, 270272 (1994); Blumenthal et al., TIG II, 132-136 (1995)]. Korábban kimutattuk, hogy egy 10 kb-os Xhol fragmentum kijavítja a CED-6 mutáns bekebelezési rendellenességét. A plazmid azonban csak a CED-6-t, egy operon alsó (downstream) généjét tartalmazza, a felsőt nem. A CED-6 expressziója a CED-6 gén 2 kb-os felső (upstream) régiójától, az operon egy intergénes régiójától függhet. Egy operon intergénes régiója néhány esetben promőterként alkalmazható az alsó gén expressziójához [Blumenthal és Steward (1997 C. elegáns II), Cold Spring Harbor; Cold Spring Harbor Laboratory Press 117-145].

A CED-6 a bekebelezés jelátviteli útjában ható adapter molekula

A fehérjefoszforiláció a sejtek egy jól meghatározott mechanizmusa, melyben a jeleket az egyik fehérjétől a másikhoz juttatják, és létfontosságú az extracelluláris jelek sejtek belsejébe vitelében. A PTB dómén egy másik olyan dómén az SH2 dómén mellett, mely képes kölcsönhatásba lépni egy foszforilezett tirozin gyökkel [Kavanaugh és Williams, Science 266 (1994); Blaikie et al., J. Bioi. Chem. 269, 32031-32034 (1994)]. Néhány PTB domént tartalmazó fehérjéről úgy találták, hogy adapter mo35 · *..* ϊ* ‘S’ **<* lekulaként működnek a jelátviteli útban. Ezek közé tartozik pél dául az She, Sck, Numb, FE65, disabled, DOC-2, P96 és IRS-1 (Bork és Margolis, Cell 80, 693-694 (1995); Geer és Pawson TIBS 20, 277-280 (1995)]. Számos fehérjéből származó prolingazdag régióról kimutatták, hogy multiprolin hélixet képez, és kölcsönhatásba lép az SH3 doménnel [Ren et al. (1993); Gout et al., Cell 75, 25-36 (1993); Yu et al. (1994)]. Az SH3 kötődőmén biológiai elemzése és kristályos szerkezetének elemzése alapján feltételezhető, hogy a PxxP szekvencia jelzés létfontosságú az SH3 doménnel való kölcsönhatásához [Ren et al. (1993); Yu et al. (1994); Grabs et al. (1997)]. A CED-6 PxxP jelzést tartalmazó prolinban gazdag régiók szakaszait tartalmazta, mely azt sejteti, hogy képes kölcsönhatásba lépni az SH3 doménnel. A CED-6 egy adapter molekula, mely közvetlenül vagy közvetve viszi át a jelet a receptorról az effektorra vagy a citoszkeleton molekulákra, hogy beindítsa a bekebelezési folyamatot.

A CED-6 partnereinek kölcsönhatásai

A PTB doménről kimutatták, hogy specifikus kölcsönhatásban áll egy NPXY(p) motívummal [Kvanaugh és Williams (1994); Zhou et al., Nature 378, 584-592 (1995); Geer és Pawson (1995)]. Számos receptor, így az EGF receptor, TrkA, inzulin receptor, IGF-1 receptor tartalmazza ezt a motívumot a karboxil-terminális végén [Geer és Pawson (1995)]. Kimutatták, hogy ezekből a receptorokból származó jelek e motívum foszfotirozin gyökének az adapter molekulák, így például az She és inzulin receptor szubsztrát 1, PTB doménjeivel való kölcsönhatásán keresztül vivődik át. Úgy találtuk, hogy CED-7 intracelluláris régiójában volt egy NPXY(p) motívum. Ez azt sejteti, hogy a CED-7 a CED-6-tal ugyanabban a genetikai útban működik [Ellis et al., (1991)]. Kimutattuk, hogy a CED-7 a CED-6-tól felfelé (upstream) működhet (7. ábra). A CED-7 egy ABC transzportért kódol, és úgy találták, hogy ennek emlős homológja, az ABC1 szükséges a makrofágoknak ahhoz, hogy bekebelezzék a pusztuló sejteket [Luciniani és Chimini (1996)], mely alapján feltételezhető, hogy a CED-7 a bekebelező sejtekben működik. Lehetséges, hogy a CED—6 fizikai kölcsönhatásban all a CED-7-tel egy PTB doménen és a CED-7 NPXY(p) motívumán keresztül, hogy a bekebelezési folyamat jelátvitelét szabályozza.

A CED-6 szintén tartalmaz egy prolin/szerin-gazdag régiót néhány PxxP szekvenciajelzéssel, mely lehetséges, hogy az SH3 doménnel való kölcsönhatását közvetíti. Feltételezték, hogy az SH3 dómén fehérje-fehérje kölcsönhatásokat közvetít a membránkötött receptoroktól downstream a jelátvivő molekulák között [Koch et al., Science 252, 252-673 (1991); Pawson és Schlessinger, Current Biology 3, 434-442 (1993)]. Egy SH3 domént tartalmazó fehérje valószínűleg kölcsönhatásba lép a CED-6-tal, és szabályozza a bekebelezés jelátviteli útját. Néhány fehérje közvetlenül vagy közvetve állhat kölcsönhatásban a CED-6 fehérjével. A CED-1 a CED-6-tól felfelé (upstream) működhet (6. és 7A. ábra). A CED-1 és CED-6 közötti kapcsolat a gén klónozásától függ. Léteznie kell egy foszforilezett tirozin gyökkel rendelkező fehérjének, mely kölcsönhatásba lép a CED-6 PTB doménjével. Ez a foszforilezett fehérje vagy egy tirozin kináz vagy egy tirozin kináz szubsztrátja, és egy tirozin kináznak is részt kell vennie a bekebelezés jelátviteli útjában, hogy a foszforilezett fehérjék aktivitását korlátozza. Néhány fagocitózisos vizsgálat emlős rendszerekben kimutatta, hogy egy tirozin kináz jelátviteli út · · ♦ · · *, : ν * ·♦*· létfontosságú szerepet játszhat az opszonin által közvetített fagocitózis folyamatában [Roshenshine és Finlay, BioAssays 15, 17-24 (1993); Greenberg, Trends in Cell Biology 5, 93-99 (1995)]. Eredményeink azt sejtetik, hogy hasonló eset lehetséges a PCD-kiváltott bekebelezésnél is. A fagocitózisnak ez a két típusa végül is bizonyos hasonlóságot mutat.

A CED-6 a bekebelező sejtekben működik

Egy genetikai mozaik elemzést hajtottunk végre, hogy megállapítsuk, hogy a Ced-6 a bekebelező sejtekben működik. Ezt a következtetést egy pár sejt, csírasejt és szomatikus sejt megfigyelésére alapoztuk. Már korábban kimutattuk, hogy a CED-6 overexpressziója elősegítheti az elhalt sejtek bekebelezését. Mivel azok a sejtek, melyek órákkal előtte elpusztultak, nem valószínű, hogy megtartják a fehérjeexpresszáló képességüket [Estus (1994); Freeman (1994)], az elhalt sejtek eltüntetése nagyon valószínű, hogy a bekebelező sejtekben végbemenő CED-6 expressziónak köszönhető. Ezeknek az eredményeknek az alapján feltételezhető, hogy a CED-6 a szómában is a bekebelező sejtekben működik. Korábban kimutatták, hogy a CED-6 overexpressziója a CED-6 bekebelezési rendellenességet képes kijavítani a szómában és a csíravonalban (5. ábra), ami azt sejteti, hogy a CED-6 mindkét helyen hasonló módon működik.

A CED-6 elő tudja segíteni az elhalt sejtek bekebelezését

A CED-6 overexpressziója elősegíti a sejthalál nagyon korai stádiumában lévő pusztuló sejtek és a sejthalál után órákkal kialakult elhalt sejtek bekebelezését. Kimutatták, hogy az elhalt sejteknek az apoptotikus sejtek egy jellemző morfológiájával rendelkeznek, például membránhólyagosodással. Az elhalt sejtek membránfelszínén a bekebelező sejtek számára a felismerés céljából bemutatott antigének valamennyire különbözhetnek a korai pusztuló sejtek membránfelszínén lévőktől. Attól függetlenül, hogy a pusztuló sejteken lévő ligandumok és a bekebelező sejteken lévő receptorok megegyeznek vagy nem a két helyzetben, a bekebelezéshez a CED-6-ra szükség van. Néhány állatban egy pár elpusztult sejt nem a hősokknál távolítódott el, hanem később a hősokk után. Ezek az elpusztult sejtek egyre inkább az oociták között és a spermatéka közelében helyezkedtek el. Ezeknek az elhalt sejteknek a bekebelezési rendellenessége annak lehet köszönhető, hogy nincsenek kapcsolatban a buroksejtekkel. Arra a következtetésre jutottunk, hogy az elhalt sejtek, ép mint a PCD korai stádiumában elpusztuló sejtek, ki tudják váltani a fagocitózist. Mec-4 mutáns állatokban hat tapintásérző neuron nekrotikusan elpusztul egy csatorna-rendellenesség miatt, mely ezekben a sejtekben elégtelen ozmotikus nyomáshoz vezet [Driscoll és Chalfie, Nature 349, 588-593 (1991)]. Chung és

Driscoll kimutatta, hogy a duzzadó elhalt sejtek eltávolítása CED-6 háttérnél jelentősen lelassul, ami arra utal, hogy a CED-6 a nekrotikusan pusztuló sejtek eltávolításában is részt vesz. Tehát lehetséges, hogy hasonlóak a jelek az elpusztult sejtek felszínén, mely lehetővé teszi, hogy a bekebelező sejtek felismerjék ezeket a pusztulás módjától függetlenül, és a jelátviteli út, melyben a CED-6 részt vesz, arra használható, hogy válaszoljon ezekre a jelekre, hogy a bekebelezést kiváltsa. Az a tény, hogy a bekebelezés ilyen korán kiváltódik, és ilyen gyorsan befejeződik, a természet ügyes tervezése, mely különösen fontos azokban a szövetekben, melyekben nagymértékű a sejthalál.

A bekebelezési program konzerválódása

Az egyik szekvencia-illesztésben egy C. briggsae EST klón nagyon konzervatív az N- és C-terminális régiójában, mely azt sejteti, hogy ez az EST klón a CED-6 egy valódi homológját képviselheti (3B. ábra). A Drosophila és humán EST kiónok is nagyon kozervatívak a CED-6 -hoz képest, de főként a PTB dómén régióban (3A és B. ábra). ezek az eredmények annak a lehetőségét sejtetik, hogy ezek a PTB dómén fehérjék a CED-6 funkcionális homológjai ezekben a fajokban. Ennek eredményeként a C. elegáns CED6 gén két humán homológját klónoztuk és jellemeztük.

CED-6-t expresszáló expressziós vektorok és transzfektált em lős sejtek

A C. elegáns CED-6 DNS-ének fragmenseit kereskedelemben kapható, az 1. táblázatban lentebb felsorolt vektorokba inszertáltuk, ezek közé a riporter génnel, a zöld fluoreszcencia fehérjével (GFP) rendelkező vektorok tartoznak.

1. táblázat: GFP-CED-6 expresszió MCF7-ben CED-6 fragmentumok klónozása pEGFP-ben

	... bp-tól - ...-bp-ig _ __
Vektor	2-1591	22-1492	598-1581	598-1494	22-745	744-1581	744-1494
TA-PCR	pGAl	pGA2	pGA3	pGA4	pGA5	pGA6	pGA7
pAs2	pGAlOll		pGA1013
pGAD414
pEGFP-Cl(*)	pGA3011		pGA3013		pGA3015
pEGFP-C3(*)						pGA3036
pEGFP-N3(*)					pGA3045
pEGFP-N3(*)		pGA3162		pGA3064			PGA3067

* kereskedelemben kapható a Clontechtől

A GFP fluoreszcencia láthatóvá tétele MCF7 sejtekben

MCF7 (ATTC: HTB-22) humán tüdőrák sejteket ültettünk LAb Tec kivájt fedőlemezre (Nalge Nunc International), és lipofectAMINE-t (GibcoBRL) alkalmazva transzfektáltuk. 18 óra múlva a kivájt fedőlemezeket egy inverz mikroszkóp alá helyeztük, és a GFP fluoreszcenciát láthatóvá tudtuk tenni.

GFP-CED-6 expressziója

A féreg CED-6 sejtszint alatti elhelyezkedését GFP fúziós fehérjéket alkalmazva vizsgáltuk. Különböző fragmentumokat alkalmazva kimutattuk, hogy a CED-6 tisztán citoplazmás elhelyezkedésű. Ez az elhelyezkedés megszűntethető, amikor csak a CED-6 PTB-t alkalmazzuk, mely azt jelzi, hogy a C-terminális rész vehet részt a helyes célba juttatásban. Mivel az aktuális expressziós szintek sejtről sejtre változnak, az erősen expresszáló sejtekben egy apoptotikus fenotípust és a fagocitózis megnövekedett mértékét figyelhetjük meg. Továbbá a lamellákban való elhelyezkedés volt megfigyelhető néhány bekebelezést végző sejtben. A fenti transzfektált MCF7 sejtek felhasználhatóak mérőeljárások végrehajtására azon vegyületek azonosítása céljából, melyek gátolják vagy fokozzák a CED-6-t, ezeket később ismertetjük.

A C. elegáns CED-6 humán homológjai

A találmány szerint egy olyan izolált fehérjét biztosítunk, mely az apoptotikus sejtek fagocitózisát szabályozó jelátviteli útban egy adapter molekula.

A találmány egy másik megvalósulási módjában egy olyan izolált fehérjét biztosítunk, mely a C. elegáns CED-6 egy humán homológja, mely a 20. vagy

22. ábrán bemutatott aminosav41 ··· *·' : ·.. · ··/· szekvenciát tartalmazza (8. azonosítószámú szekvencia), vagy egy olyan aminosav-szekvenciát, mely a 20. ábrán bemutatott szekvenciától csak konzervatív aminosav-cserékben tér el (hlCED-6).

A találmány a hlCED-6-t, h2CED-6-t vagy a h3CED-6-t (8., 14., 16. azonosítószámú szekvenciák) vagy funkcionális ekvivalensüket kódoló nukleinsavat (DNS, RNS, cDNS vagy genomiális DNS, 7., 13., 15. azonosítószámú szekvencia) is biztosítja. Például a találmány magában foglalja a 18., 19. vagy 22. ábrán bemutatott, a körülbelül 430. nukleotidhelyzettől a körülbelül 1344.

nukleotidhelyzetig terjedő nukleotidszekvenciát tartalmazó nukleinsavat, vagy az ezeken az ábrákon bemutatott teljes nukleotidszekvenciát. A találmány magában foglalja a nukleotidszekvencia nyitott leolvasási keretét, mely a C. elegáns CED-6-t, CED-6-t, h2CED-6-t vagy a h3CED-6-t kódolja. A találmány egy olyan fehérjét is biztosít, mely a 20. ábrán, 22. ábrán vagy a 29. ábrán bemutatott aminosav-szekvenciával (8., 14., 16. azonosítószámú szekvencia) rendelkező fehérje egy fragmentuma. A fragmentum a 8., 14., 16. azonosítószámú szekvenciák foszfotirozin-kötő doménjének megfelelő aminosav-szekvenciát tartalmazhatja. Például a 8. azonosítószámú vagy 16. azonosítószámú szekvenciák PTB doménje a 15-157. aminosavaknak felel meg. A találmány a hlCED—6 és/vagy h3CED—6 prolin/szerin gazdag dóménjeinek nukleinsav- és aminosav-szekvenciáira is vonatkozik (a 201-276. aminosavak a 20., 22. vagy 29. ábrán). Hasonlóan a 8. vagy 16. azonosítószámú szekvenciák erősen töltéssel rendelkező régióit is magában foglalja a találmány (például a 20. , 22., és 29. ábrák 161-195. aminosavai). A találmány magában foglalja az ezeket a fragmentumokat kódoló nukleinsavakat is.

A h3CED-6 egy splicing variánsát is azonosítottuk (ezt követően h2CED-6-ként hivatkozunk rá), mely variáns a 21. ábrán bemutatott aminosav-szekvenciát tartalmazza (14. azonosítószámú szekvencia), vagy egy olyan aminosav-szekvenciát, mely a 21. ábrán bemutatottól csak konzervatív aminosav-cserékben tér el. A találmány a h2CED-6-t (13. azonosítószámú szekvencia) vagy funkcionális ekvivalensét kódoló nukleinsavat (DNS, RNS, cDNS vagy genomiális DNS) is biztosítja, például a 19. 22. ábrán bemutatott körülbelül 430. nukleotidhelyzettől a körülbelül 206. nukleotidhelyzetig terjedő nukleotidszekvenciát tartalmazó nukleinsavat, vagy a 19. ábrán bemutatott teljes nukleotidszekvenciát (13. azonosítószámú szekvencia).

A humán CED-6 aminosav-szekvenciáját (16. azonosítószámú szekvencia) is bemutatjuk a 26. ábrán. A 16. azonosítószámú szekvencia (humán CED-6) és a 8. azonosítószámú szekvencia (hlCED-6) a 150. aminosavban különbözik. A humán CED-6-t kódoló nukleinsav-szekvenciát (15. azonosítószámú szekvencia) a 30A-B. ábrán mutatjuk be. Az igényelt találmány magában foglalja a 15. és/vagy 16. azonosítószámú szekvenciát, a 15. azonosítószámú szekvencia nyitott leolvasási keretét, az itt leírt funkcionális fragmensek (például szerin/prolin-gazdag régió, PTB dómén vagy erős töltéssel rendelkező dómén) nukleotid- és aminosavszekvenciáját .

A találmány egy olyan fúziós fehérjét is biztosít, melyben a fúzió egyik része a 8., 14. vagy 16. azonosítószámú szekvenciákban bemutatott aminosav-szekvenciával vagy egy olyan aminosavszekvenciával rendelkező fehérje, mely ettől az aminosavszekvenciától csak konzervatív aminosav-cserékben különböző ami nosav-szekvenciával. A fehérjéhez például egy epitop rész vagy egy riporter gén expressziós terméke lehet fuzionálva.

A találmány magában foglalja a CED-6 fehérjéket (például C. elegáns CED-6, hlCED-6, h2CED-6 és/vagy h3 CED-6), és a CED-6 aminosav-szekvenciájával analóg aminosav-szekvenciákkal rendelkező polipeptidek. Ezeket a polipeptideket CED-6 analógokként (például homológok) , ortológokként vagy mutánsokként vagy szármzékokként definiáljuk. Az analóg aminosav-szekvenciákat úgy határozzuk meg, hogy olyan aminosav-szekvenciákat jelentenek, melyek elegendően azonosak a CED-6 (például C. elegáns CED-6, hlCED-6, h2CED-6 vagy h3CED-6) aminosav-szekvenciával ahhoz, hogy a CED-6 biológiai aktivitásával rendelkezzenek. Például egy analóg polipeptid előállítható néma cserékkel az aminosavszekvenciában, ahol egy vagy több aminosav-gyök különbözik a CED-6 aminosav-gyökeitől, de még rendelkezik a CED-6 biológiai aktivitásával. Ilyen eltérések például a CED-6 aminosavszekvencia gyökeinek addíciói, deléciói vagy szubsztitúciói. A találmány analóg peptideket is magában foglal, melyek többékevésbé rendelkeznek a találmány szerinti CED—6 fehérjék bioló giai aktivitásával.

Az igényelt CED-6 fehérjék és nukleinsavak magukban foglalják az itt meghatározott homológokat is. A homológ fehérjéket és nukleinsav-szekvenciákat a szakterületen jártas szakember által ismert eljárásokat alkalmazva határozhatjuk meg. Először homológra kereséseket végezhetünk az NCBI-nél a GenBank (87.0 változat), EMBL (39.0 vált.), dbEST SwissProt (30.0 változat) adatbázisokban a BLAST hálózati szolgáltatást vagy más EST adat bázist alkalmazva. Altshul S. F. et al., Basic Local Alignment

Search Tool, J. Mol. Biol. 215, 403 (1990), mely cikk kitanítása referenciaként a leírásba épül. A nukleotidszekvenciák számítógépes elemzését lehet végrehajtani a Genetics Computing Group (GCG, 8.0 változat) szoftver MOTIFS és FindPatterns szubrutinjaival. Fehérje és/vagy nukleotid összehasonlításokat végezhetünk Higgins és Sharp szerint (Higgins D. G. és P. M. Sharp, Description of the method used in CLUSTAL, Gene 73., 237-244 (1988)]. A CED-6 fehérjével és/vagy a CED-6 fehérjét kódoló nukleinsav-szekvenciákkal homológ fehérjéket és/vagy nukleinsavszekvenciákat úgy határozzuk meg, hogy azok olyan molekulák, melyek több mint 70%-os szekvencia-azonosságot és/vagy hasonlóságot mutatnak (például 75%-os, 80%-os, 85%-os, 90%-os vagy 95%-os homológia).

A CED-6 fehérjék biológiai aktivitását úgy határozzuk meg, hogy az azt jelenti, hogy képes szabályozni vagy befolyásolni az apoptotikus sejtek fagocitózisát.

Az igényelt CED-6 fehérjék magukban foglalják a CED-6 fehérjék itt leírt biológiailag aktív fragmenseit is. Az ilyen fragmensek a CED-6 teljes hosszúságú aminosav-szekvenciájának csak egy olyan részét foglalhatják magukban, mely rendelkezik még az apoptotikus sejtek fagocitózisának módosítási vagy szabályozási képességével. Például a CED-6 fehérje deléciós mutánsait tartalmazó polipeptid-framentumok jól ismert laboratóriumi módszerekkel tervezhetők meg és expresszálhatók. Az ilyen polipeptid-fragmentumok biológiai aktivitásra tesztelhetek, ahogy azt a leírásban ismertetjük.

A CED-6 fehérjékkel és analógjaikkal szemben antitestek termeltethetek a szakterületen jártasak számára ismert módszereket alkalmazva. Ezeket a poliklonális, monoklonális, kiméra antitesteket és fragmentumait immunaffinitásos tisztításhoz vagy fehérjeelegyben lévő CED-6 fehérjék azonosítására alkalmazhatjuk a szakterületen jártasak számára ismert módszereket alkalmazva. Ezeket az antitesteket vagy antitest-fragmentumokat arra is alkalmazhatjuk, hogy CED-6 fehérjék vagy homológjaik jelenlétét mutassuk ki más szövetekben, szokásos immunkémiai módszerekkel.

Részletesebben, a fent leirt fehérjék biológiailag aktív származékait vagy analógjait, ide értve a C. elegáns CED-6-ból, hlCED-6-ból, h2CED-6-ból vagy h3CED-6-ból származó fragmentumokat és funkcionális doméneket, melyekre peptidutánzatként hivatkozunk, a szakterületen jártasak által ismert módszerekkel lehet megtervezni és előállítani. (Lásd például a 4 612 132, 5 643 873 és 5 654 276 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat, melyek kitanítása referenciaként a leírásba épül). Ezek az utánzatok például egy specifikus CED-6, hlCED-6 vagy h2CED-6 vagy h3CED-6 aminosav-szekvencián alapulhatnak, és megtartják a megfelelő aminosav-szekvencia relatív térbeli helyzetét. Ezek a peptidutánzatok a megfelelő peptidvegyület biológiai aktivitásához hasonló biológiai aktivitással rendelkeznek, viszont biológiai előnnyel rendelkeznek a megfelelő CED-6 aminosav-szekvenciához képest egy vagy több következő tulajdonságot tekintve: szolubilitas, stabilitás es a hidrolízissel és proteolízissel szembeni érzékenység.

A peptidutánzatok előállításának módszerei közé tartozik az N-terminális aminocsoport, a C-terminális karboxil-csoport módosítása, és/vagy az aminokötés kicserélése nem amino-kötéssé a pepiidben. Kettő vagy több ilyen módosítás összekapcsolható egy ···*'·.· : ·.. · peptid utánzat molekulában. A peptidek peptidutánzatok előállítására végzett módosításait írták le az 5 643 873 és az 5 654 276 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, melyek kitanítása referenciaként a leírásba épül. A hl, h2 vagy h3 CED-6 fehérjéknek az igényelt találmányba tartozó más formáit képezik azok, melyek funkcionálisan ekvivalensek. Ez a kifejezés, ahogy itt használjuk, bármely olyan nukleinsav-szekvenciára és az általa kódolt aminosavra vonatkozik, mely a hl, h2 vagy h3 CED-6 fehérjék és/vagy azok funkcionális doménjeinek biológiai aktivitását utánozzák. A biológiailag aktív kifejezést arra alkalmazzuk, hogy leírjunk egy, ^az apoptotikus sejtek fagocitózisát szabályozni képes fehérjét.

Egy polipeptid konjugátum vagy fúziós fehérje alakjában is lehet, mindegyiket jól ismert módszerekkel állíthatjuk elő. Fúziós fehérjéket készíthetünk a rekombináns DNS technológia ismert módszerei szerint. Például fúziós fehérjék expresszálhatók egy olyan nukleinsav molekuláról, mely a fehérje biológiailag aktív részét kódoló szekvenciákat és fúziós partnerét, például egy immunglobulin molekula egy részét kódolják. Például néhány kiviteli alak hozható létre egy immunglobulin szekvenciákat kódoló nukleinsavnak egy megfelelő expressziós vektorba, fág vektorba vagy más kereskedelmi forgalomban megvásárolható vektorokba történő illesztésével. A kapott szerkezetet egy megfelelő gazdasejtbe illeszthetjük az expresszióhoz. Az expresszi© után a fúziós fehérje egy sejtből affinitás mátrix segítségével izolálható vagy tisztítható. A fent említett nukleinsavakat, ide értve az 1., 3., 5-, 7., 9., 11., 13· vagy 15. azonosítószámmal· jelölt szekvenciákat tartalmazó, adott esetben a fentebb említett ri portergénnel együtt tartalmazó expressziós vektorok is a találmányhoz tartoznak.

A találmány magában foglalja az itt leírt CED-6 (például C. elegáns CED-6, hlCED-6, h2CED-6 vagy h3CED-6) fehérjéket kódoló izolált nukleinsav-szekvenciákat, és a biológiailag aktív CED-6 fehérjéket kódoló nukleinsav—szekvenciák fragmentumait. A nukle insav—szekvenciák itt leírt fragmentumai próbaként használhatóak fel. A találmány specifikusan biztosítja a CED-6 fehérjéket kódoló DNS/RNS szekvenciákat, ezeknek a szekvenciáknak a teljes komplementer szálait és ezek allélváltozatait. A találmány szintén magában foglalja azokat a nukleinsav-szekvenciákat, genomiális DNS-t, cDNS-t, RNS-t vagy ezek kombinációját, melyek lényegében komplementerek a CED-6-t kódoló DNS szekvenciákkal, és melyek specifikusan hibridizálnak a CED-6 DNS szekvenciákkal a szakterületen jártasak számára ismert szigorúságú körülmények között, mely körülmények elegendőek a lényeges nukleinsavazonosságú DNS szekvenciák azonosítására. Ahogy itt meghatározzuk, a lényegében komplementer azt jelenti, hogy a szekvenciának nem kell visszatükröznie a CED-6 (például C. elegáns CED-6, hlCED-6, H2CED-6 vagy h3CED-6) DNS pontos szekvenciáját, viszont elegendően hasonlónak kell lennie a szekvenciához ahhoz, hogy szigorú körülmények között hibridizáljón a CED-6 DNS-sel. A szigorú körülményeket például Ausubel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology (Current Protocols 1994) művében írják le. Például a nem komplementer bázisok szúrhatok a szekvenciába, vagy a szekvenciák hosszabbak vagy rövidebbek lehetnek, mint a CED-6 DNS, feltéve, hogy a szekvencia megfelelő számú komplementer bázissal rendelkezik ahhoz, hogy a CED-6 hibri48

.. · ··#· dizáljon vele. A hibridizációs körülményekre a leírásban is nyújtunk példákat.

A humán CED-6 klónozása

A C. elegáns CED-6 gén klónozása és a nyitott leolvasási keret teljes szekvenálása után nagy kiterjedésű kereséseket hajtottunk végre a nyilvánosan hozzáférhető humán adatbázisokban. Ezek stastisztikailag szignifikáns homológiákat tártak fel számos EST-tel a fehérje karboxi-terminális régiójánál, és egy EST homológiát mutatott a PTB dómén karboxi-terminális végével és a töltéssel rendelkező régió kezdetével. Ezeket az EST-eket alkalmaztuk arra, hogy primereket szerkesszünk az 5' RACE-hez egy Clontechtől származó Marathon-ready cDNS vastagbél-végbél adenokarcinóma könyvtárt alkalmazva. Ezt követő további szekvencia-analízis és adatbázis keresések további EST-eket tártak fel, melyek lehetővé tették a h3CED-6 egy hozzávetőleg 2400 bp-os konszenzus szekvenciájának megszerkesztését (6.ábra). A további szekvencia analízis a szekvencia 18. ábrán bemutatott splice variánsát (2hCED-6) mutatta ki, az ábrán az alternatív splicingon átesett részt aláhúztuk. A h2CED-6 DNS-t a 19. ábrán mutatjuk be, és az aminosav-szekvenciát a 21. ábrán. A h2CED-6 aminosavszekvenciája összhangban áll azzal, hogy ez a hl vagy h3CED-6 domináns negatív változata, mely antagonizálja a hl vagy h3CEDot.

A CED-6, hlCED-h, h2CED-6 vagy h3CED-6 inhibitorainak és enhanszereinek azonosítására szolgáló mérőéi jiárásk

A C. elegáns CED-6 klónozása és funkcionális jellemzése lehetővé tette olyan mérőeljárás eljárások kifejlesztését, melyek lehetővé teszik olyan vegyületek azonosítását, melyek gátolhat ják vagy fokozhatják a CED-6, hlCED-6, h2CED-6 vagy h3CED-6 aktivitását, vagy gátolják vagy fokozzák ezeknek a fehérjéknek a transzkripcióját. Ezek a vizsgálatok tartalmazhatják az apoptotikus részecskék fagocitózis szintjének kimutatását, az aktin-citoszkeleton szint mérését vagy a CED-6 fehérjék transzkripciós szintjének kimutatását egy riportergénen, mint például a GFP-n keresztül.

A fagocitózis inhibitorainak és/vagy enhanszereinek azonosítására szolgáló mérőeljárás egy CED-6-tal, hlCED-6-tal, h2CED-6tal vagy h3CED—6-tal vagy a CED-6 jelátviteli út más tagjával stabilan vagy átmenetileg transzfektált sejtvonalból állhat. A sejtvonalakat a tisztított fehérjével vagy az antiszensz RNS-t kifejező vektorral is mikroinjektálhatjuk. Az expressziós termék egy GFP-vel képzett fúziós fehérje lehet. A mérőeljárásban nem transzformált sejteket is alkalmazunk. A sejtvonal egy fibroblaszt sejtvonal lehet, mint például COSI, BHK 21, L929, CV1, Swiss 3T3, HT144, IMR32 vagy más fibroblaszt sejtvonal. A sejtvonal egy epitéliális sejtvonal is lehet, így HEPG2, MDCK, MCF7, 293, Hela, A549, SW48, G361 vagy más epitéliális sejtvonal. A sejtvonal egy primer vonal is lehet, így humán dermális FIB-ek, dermális keratinociták, leukociták, monociták, makrofágok vagy más primer sejtvonal. A sejteket egyéb génekkel (mint lektin, CD14, SRA, CD36, ABC1, CED5, DOCK180 génje), kétszeresen transzfektálhatjuk, mely gének gerinces (ember, hal, egér) vagy gerinctelen eredetűek (C. elegáns) lehetnek.

A fagocitózis mérőeljárásk abból állnak, hogy ezekhez a sejtekhez részecskéket és/vagy apoptotikus sejteket adunk azok és azt felveszik. A részecskék különböző méretű, alakú és ··· *·* í · ··/* antigenicitású, opszonizált, hővel vagy kémiailag elölt baktériumok és élesztők lehetnek. A részecske vagy sejt egy különböző méretű, alakú és antigenicitású, opszonizált, fluoreszcensen jelölt, hővel vagy kémiailag elölt baktérium és élesztő lehet. A sejt egy apoptotikus neutrofil granulocita, limfocita, apoptotikus eritrocita vagy más apoptotikus sejt lehet. Ezeket a sejteket opszonizálhatjuk és/vagy festékekkel vagy fluoreszcens festékekkel jelölhetjük. Az elölt baktériumokra vagy élesztő sejtekre és az apoptotikus sejtekre apoptotikus részecskékként hivatkozunk.

1. mérőeljárás

A sejteket, melyeket CED-6-tal vagy más itt leirt génnel, például az 1., 3., 7., 9., 11., 13. vagy 15. azonosítószámú szekvenciájú nukleinsavakkal transzfektáltunk, egysejtrétegen vagy szuszpenzióban tenyésztjük. A transzfektált sejtekhez apoptotikus részecskéket adunk. A fagocitózist az apoptotikus részecskék felvételének mértékével követhetjük. Ezt mikroszkóppal, fluoreszcens mikroszkóppal, kvantitatív spektrofluorometriával és áramlási citometriával mérhetjük. A sejteket és/vagy részecskéket továbbá festékekkel, fluoreszcens festékekkel, antitestekkel és antitestekhez kapcsolt fluoreszcens festékek festékeivel jelölhetjük meg a kimutatás és a mérés előtt. Az apoptotikus részecskék felvételének csökkenése vagy növekedése a transzfektált gén vagy gének hatásának mérése a fagocitózisban.

2. mérőeljárás

Vegyületeket adhatunk az 1. mérőeljáráshoz, hogy teszteljük azok hatását a fagocitózis reakcióútban résztvevő génekre. Átmenetileg vagy stabilan transzformált sejteket növesztünk szusz51 ··· ·· · *«···/♦ penzióban vagy egysejtrétegben. A vegyületek sorozatát adjuk a sejtekhez, mielőtt hozzáadnánk az apoptotikus részecskéket. A vegyületek hatását úgy mérhetjük, hogy összehasonlítjuk az apoptotikus részecske felvétel mértékét a vegyületet hozzáadva vagy anélkül. A méréseket az 1. mérőeljárásnál írtuk le.

3. mérőeljárás

A sejtek képesek az apoptotikus részecskék fagocitózisára részecskék bekebelezésével. Ez az aktin-citoszkeleton újraszerveződését foglalja magában. Emlős sejteket transzformálhatunk átmenetileg vagy stabilan CED-6-tal vagy bármely, a CED-6 fagocitózis jelátviteli útban résztvevő génnel, például az 1., 3., 5., 7., 9-, 11-, 13. vagy 15. azonosítószámú szekvenciák bármelyikében bemutatott nukleotidszekvenciával rendelkező nukleinsavval. A sejtek az 1. mérőéijárásban leírt sejtek lehetnek. A géneket egy GPF fúziós termékként expresszálhatjuk. A sejteket kétszeresen transzferálhatjuk (lásd 1. mérőeljárás). Az aktincitoszkeleton újraszerveződését falloidinhez kapcsolt fluoreszcens festékekkel tehetjük láthatóvá, mely az F-aktinnal lép kölcsönhatásba. A citoszkeleton újraszerveződésével a transzfektált gén vagy gének bekebelezés-indukcióját mérjük. A transzfektált sejteket az 1. mérőeljárásban leírt módon részecskékkel vagy apoptotikus sejtekkel kezelhetjük. A citoszkeleton újraszerveződését mikroszkóppal vagy fluoreszcens mikroszkóppal tehetjük láthatóvá.

4. mérőeljárás

A 3. mérőeljáráshoz vegyületeket adhatunk, hogy teszteljük a hatásukat azokra a génekre, melyek részt vesznek a fagocitózis úthoz és a bekebelezéshez kapcsolódó citoszkeleton újraszervező désben. Ezek a vegyületek fokozhatják vagy gátolhatják a bevitt gének által kiváltott bekebelezést vagy a citoszkeleton újraszerveződést. Átmenetileg vagy stabilan transzformált sejteket növesztünk szuszpenzióban vagy egysejtrétegben. A vegyületek sorozatát adjuk a sejtekhez. A vegyületek hatását úgy mérhetjük, hogy összehasonlítjuk az aktin-citoszkeleton újraszerveződését a vegyületet hozzáadva vagy anélkül. A méréseket az 1., 2. és 3. mérőeljárásnál írtuk le. Ebben a tesztben a fagocitózis kiváltására apoptotikus részecskéket adhatunk be a 2. mérőeljárásnál leírt módon.

5. mérőeljárás

Nem transzfektált vagy transzfektált sejtvonalakat, mint például a lentebb leírtakat, tisztított CED-6 fehérjével, például a 2., 4., 6·, 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosav-szekvenciával rendelkező fehérjével vagy a CED-6 útból származó bármely fehérjével vagy az említett fehérjéket tartalmazó fúziós fehérjével mikroinjektálhatunk. A mikroinjektálást primer sejtvonalakon vagy fibroblaszt sejtvonalakon vagy más epitéliális sejtvonalakon hajthatjuk vége. Az 14. mérőeljárásokat végezhetjük el ezeken a mikroinjektált sejtvonalakon.

6. mérőeljárás

A fentebb leírt transzfektált vagy nem transzfektált sejtvonalakat egy olyan vektorral mikroinjektálhatjuk, mely a CED-6 antiszensz RNS-t expresszálja, ide értve bármely fentebb említett fehérje szerinti antiszensz RNS-t vagy a CED-6 útban résztvevő gének antiszensz RNS-ét. A mikroinjektálást primer sejtvonalakon vagy fibroblaszt sejtvonalakon vagy az epitéliális sejt vonalakon hajthatjuk végre. A sejtvonalakat a mikroinjektálás előtt más génnel is transzfektálhatjuk. Az 1-5. mérőeljárást hajthatjuk végre ezeken a mikroinjektált sejteken.

7. mérőeljárás

A 6. mérőeljárásban leírt sejtvonalakat CED-6 antiszensz RNSt vagy a CED-6 reakcióútban résztvevő gének valamely antiszensz RNS-ét expresszáló vektorral mikroinjektálhatjuk. A mikroinjektálást makrofágokon végezhetjük el. Az antiszensz RNSnek a CED-6 gén vagy a CED-6 útban részt vevő gének gátlása által kifejtett inhibitor hatásait az 1-6. mérőeljárásban leírt módon követhetjük nyomon és mutathatjuk ki. A vegyületeket a negatív fenotípusok mentésével izolálhatjuk.

Fagocitózis mérőeljárások CED-6 inhibitorok / enhanszerek szűrésére C. elegánsban

A C. elegáns CED-6 gén elősegíti a pusztuló embriogén csírasejtek és a fennmaradó elhalt sejtek bekebelezését. C. elegánst alkalmazhatunk olyan vegyületek kimutatására és izolálására, melyek fokozó vagy gátló hatásúak a fagocitózisra és a bekebelezésre. Különösen olyan férgek alkalmazhatóak, melyeknek hiányzik a CED-6 aktivitásuk vagy egyéb módon megváltozott aktivitással rendelkeznek, vagy alternatív lehetőségként CED-6, hlCED-6, h2CED-6, 3hCED DNS-sel transzfektált vagy transzferált transzgénikus férgeket alkalmazhatunk.

8. mérőeljárás

Vegyületek sorozatát alkalmazhatjuk a CED-6 mutáns férgeken vagy a CED-6 útban mutációkat hordozó férgeken. A vegyületek által kiváltott bekebelezés helyreállítását az L1 lárvák feji régiójában és a férgek ivarmirigyében fennmaradó elhalt sejtek számolásával, Nomarski mikroszkópot alkalmazva tesszük láthatóvá .

9. mérőeljárás

Vegyületek sorozatát alkalmazhatjuk humanizált CED-6 mutáns férgeken. A humanizált férgek humán CED-6 gént expresszáló és a C. elegáns génre mutáns férgek. A humán CED-6 kijavítja a mutáns fenotípust. A CED-6 fenotípust gátló vagy fokozó vegyületek úgy választhatók ki, hogy a bekebelezési fenotípust Nomarski mikroszkópot alkalmazva láthatóvá tesszük, és az elhalt sejteket megkeressük, ahogy korábban leírtuk.

Gyógyászati alkalmazások

Az apoptózis folyamata a betegségek széles körének kóroktanában szerepet játszik vagy patológiájához kapcsolódik, ide értve a rákot, autoimmun betegségeket, különböző neurodegeneratív betegségeket, úgymint az amiotrófiás laterális szklerózist, Huntington kórt, Alzheimer kórt, stroke-ot, miokardiális szívinfarktust és AIDS-et [Thompson, Science 267, 1456-1462 (1995)]. Tehát az apoptózis alapját képező molekuláris események jobb megértése új terápiás találmányokhoz vezethet. Míg jelenleg a figyelem nagy része azokra a génekre és fehérjékre összpontosul, melyek a sejthalál folyamatának elpusztítási lépését szabályozzák, nagyon valószínű, hogy bebizonyosodik, hogy az apoptotikus sejtek eltávolítása szintén döntő fontosságú az apoptotikus program helyes általános működésében, és egy másik kiindulási pontot kínál a terápiás beavatkozáshoz (ahogy azt itt leírjuk).

A pusztuló sejtek felismerése és bekebelezése rendkívül gyors és hatékony. Állatokban lényegében lehetetlen egy olyan apoptotikus tulajdonságokat mutató sejtet találni, mely még

...... ·.« · ··*' nincs egy másik sejtben benne. Az apoptotikus sejteknek ez a gyors felismerése és fagocitózisa az in vivo programozott sejthalál kritikus pontja: a be nem kebelezett apoptotikus testek egy második nekrózison esnek át, mely gyulladáshoz vezet. Az apoptotikus testek eltávolításának rendellenessége a testet új epitopoknak (például kaszpáz-generált fehérjefragmentumokból származó epitopoknak) teszi ki, mely lehetséges, hogy hozzájárul az autoimmun betegség kialakulásához. Fennmaradt apoptotikus testek gyakran megfigyelhetőek a kemoterápiás beavatkozást követően (mely nagymértékű apoptózishoz vezet), és különösen sok van belőlük a szolid tumorokban, melyeknél az elhalt sejtek kitisztulása lelassul.

Valószínű, hogy az apoptotikus sejtek helyes szabályozásának rendellenessége emberi betegségekhez vezet. A fagocitózisban résztvevő gének tehát lehetséges, hogy a jelenleg még nem klónozott öröklődő betegségek génjeinek felelnek meg. A helyes fagocitózis helyreállítása hatásos terápiája lehet a gyulladásos és autoimmun betegségek bizonyos típusainak. Ennek megfordítása, hogy a bekebelezési rendszer helytelenül olyan sejteket is felismer, melyeknek fenn kellene maradniuk, és a testből kitisztítja azokat. Az ilyen sejtek bekebelezésének megakadályozása nagy terápiás értékű lehet. Ilyen betegségek például a neurodegeneratív betegségek és a stroke, valamint a sarlósejtes vérszegénység.

Mindemellett a bekebelezés aktiválását néhány olyan esetben is alkalmazhatjuk, melynél javasolt az apoptózis alkalmazása, például a ráknál. Azaz a ráksejteken belül az elő-bekebelezési jel specifikus aktiválása a sejtek eltávolításához (és pusztulá-

sához) vezet anélkül, hogy szükség lenne a fennálló apoptotikus rendszer aktiválására. Ez különösen hasznos lehet a nagyon rezisztens tumoroknál, melyeknél a központi apoptotikus rendszer lényeges elemei már inaktiváltak.

Tehát a találmány egy másik tárgya eljárás például gyulladás, autoimmun betegség és rák kezelésére, mely során egy betegnek egy olyan anyag hatásos mennyiségét adjuk be, mely az apoptotikus sejtek fagocitózisát fokozza, különösen egy olyan anyagot, mely fokozza a hlCED-6, h3CED-6 vagy annak a jelátviteli útnak az aktivitását, melyben az részt vesz. Ilyen anyagok közé tartoznak a hlCED-6 vagy a h3CED-6 maga, a hlCED-6-t vagy h3CED-6-t kódoló nukleinsav, a hl, h2, h3CED-6 antiszensz nukleinsava. vagy olyan vegyületek, melyeket a korábban említett mérőeljárások valamelyikével a CED-6, hlCED-6, h2CED-6 vagy h3CED-6 vagy ezek transzkripciójának enhanszereiként azonosítottunk.

Továbbá a találmány lehetővé teszi például a neurodegeneratív betegségek, stroke és sarlósejtes vérszegénység kezelési eljárását, a betegnek egy olyan anyag megfelelő mennyiségét beadva, mely gátolja az apoptotikus sejtek fagocitózisát, különösen egy olyan anyagot beadva, mely gátolja a hlCED-6, h3CED-6 vagy annak a jelátviteli útnak az aktivitását, melyben az részt vesz. Ilyen anyagok közé tartoznak a h2CED-6 vagy a h2CED-6-t kódoló nukleinsav, a hlCED-6 vagy h3CED-6 antiszensz nukleinsava vagy olyan vegyületek, melyeket a korábban említett mérőeljárások valamelyikével a CED-6, hlCED-6, h2CED-6 vagy h3CED-6 vagy ezek transzkripciójának inhibitoraiként azonosítottunk.

A találmány tárgyát képezik a fent említett terápiás anyagokat és gyógyászatilag elfogadható hordozókat tartalmazó gyógyá·’**. ·*··· · ⁵⁷ */’ * < c :.:. szati készítmények is.

Az itt leírt különböző terápiás kezelések végrehajtására egy hl, h2 vagy h3CED-6-t vagy funkcionális részét vagy doménjét kódoló nukleinsavat kell bevinnünk egy emlős sejtbe, például emlős szomatikus sejtbe, emlős csírasejt-vonalba (spermába vagy petesejtbe) . Ez úgy hajtható végre, hogy a teljes hosszúságú fehérjét vagy az itt leírt doménjeit vagy azok funkcionális ekvivalensét kódoló izolált nukleinsavat egy nukleinsav vektorba, például egy DNS vektorba, így plazmidba, vírusba vagy más alkalmas replikonba (például egy virális vektorba) visszük be, melyek egyetlen vagy több másolatban lehetnek jelen a sejtben.

A nukleinsav a sejtekbe megfelelő, a szakterületen ismert módszerekkel transzfektálható vagy transzformálható, így például elektroporációval, fertőzéssel, lipoinfekcióval és közvetlen DNS felvétellel. Ilyen eljárásokat ismertet részletesen például Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2. kiadás (1989); Ausubel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology (Current Protocol, 1994). A hl, h2 vagy h3CED6 egy sejtbe olyan virális vektorokat alkalmazva vihető be, melyek ezek közül a fehérjék közül egyet vagy többet kódolnak. Általánosságban a nukleinsav-szekvenciát a virális vektor genomjába építjük be. Az itt leírt hl, h2, vagy h3CED-6 fehérjét vagy a fehérjét kódoló nukleinsavat tartalmazó virális vektort érintkezésbe hozhatjuk egy sejttel, és a fertőzés megtörténhet. A sejtet ezután kísérletesen az apoptotikus sejtek fagocitózisának vizsgálatára vagy a korábban említett mérőeljárásokban alkalmazhatjuk, vagy egy betegbe implantálhatjuk terápiás alkalmazás céljából. A sejt lehet mozgó, úgymint

:.. : :

• · · · · ····< hemopoetikus sejt, vagy nem mozgó, így szilárd tumor vagy fibroblaszt. A sejt a betegből (például vérből, csontvelőből) kapott biológiai mintában lehet jelen, és a betegség kezelésére alkalmazható, vagy sejtkultúrából· nyerhető.

A mintát, miután érintkezésbe hoztuk a hl, h2, h3CED-6 fehérjét vagy azt kódoló nukleinsav-szekvenciát tartalmazó virális vektorral, a sejttenyészetbe vagy a betegbe vihetjük vissza vagy újra beadhatjuk a szakterületen jártasak számára ismert módon. Egy betegbe vagy egy kísérleti állatmodellbe (például patkányba, egérbe, majomba, csimpánzba) való bejuttatás esetében egy ilyen kezelési eljárást néha ex vivo kezelésnek vagy terápiának nevezik. Gyakran a sejtet a betegből vagy az állatból kivesszük, és miután érintkezésbe hoztuk a találmány szerinti aktivált mutánst tartalmazó virális vektorral, visszahelyezzük a betegbe vagy az állatba. Az ex vivo terápiát leírták például Kasid és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 473 (1990); Rosenberg et al., New Engl. J. Med. 323, 570 (1990); Williams et al., Nature 310, 476 (1984); Dick et al., Cell £2, 71 (1985); Keller et al., Nature 318, 149 (1985) és Anderson et al., 5 399 346 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (1994).

Ahol a sejtet in vitro hozzuk érintkezésbe, a sejtet, mely a hl CED-6, h2CED-6 vagy h3CED-6 nukleinsav-szekvenciát tartalmazó virális vektort tartalmazza, egy betegbe vagy kísérleti állatmodellbe implantáljuk a bejuttatás céljából vagy in vitro kísérletekben alkalmazhatjuk, hogy a hl, h2, h3CED-6 által közvetített sejteseményeket tanulmányozzuk.

Különböző virális vektorokat alkalmazhatunk, hogy a nukleinsavat emlős sejtbe vigyük be. A virális vektorok közé tartozik a retrovirus, adenovirus, parvovirus (például adeno—asszociált vírusok) , koronavírus, negatív szálú RNS vírusok, úgy mint ortomyxovírus (például influenzavírus), rhabdovírus (például veszetség és vezikuláris sztomatitisz vírus), paramixovirus (például kanyaró és Sendai), pozitív szálú RNS vírusok, mint például pikornavírus és alfavírus, és kétszálú DNS vírusok, ide értve az adenovírust, herpeszvírust (például Herpes Simplex 1-es és 2-es típusát, Epstein-Barr vírust, citomegalovírust) , és a poxvírust (például vakolnia, fowlpox és kanaripox). Egyéb vírusok közé tartoznak például a Norwalk vírus, togavírus, flavivírus, reovirusok, papovavírus, hepadnavírus, és hepatitisz vírus. Retrovírusok közé tartoznak például a madár leukózis szarkóma, emlős C-tipusú, B-típusú vírusok, D-tipusú vírusok, HTLV-BLV csoport, lentivirus, spumavirus [Coffin J. M: Retroviridae: The viruses and their replication, Fundamental Virology, Harmadik kiadás, B. N. Fields et al. szerk., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, (1996)]. Egyéb példák közé tartoznak az egérféle leukémia vírusok, egérféle szarkóma vírusok, egér emlős tumor vírus, szarvasmarha leukémia vírus, macska leukémia vírus, macska szarkóma vírus, madár leukémia vírus, humán T-sejt leukémia vírus, bábuin endogén vírus, Gibbon majom leukémia vírus, Mason Pfizer majom vírus, majom immundefficiencia vírus, majom szarkóma vírus, Rous szarkóma vírus, lentivírusok és bakulovírusok.

A hl, h2 vagy h3 CED-6-t kódoló nukleinsav bejuttatásának előnyben részesített módszerét a genetikailag módosított virális vektorok alkalmazásával hajtjuk végre. Ezek a vektorok eszközként szolgálnak a nukleinsavak sejtciklusban lévő és nyugalmi állapotú sejtekbe való bevitelére, és úgy vannak módosítva, hogy csökkentsék a citotoxicitást és javítsák a genetikai stabilitást. A szakterületen jártas szakemberek számára ismert a géntechnológiával módosított Herpes simplex 1-es típusú virus [D.M. Krisky et al., Gene Therapy 4(10), 1120-1125 (1997)], adenovirus [A. Amalfitanl et al., Journal of Virology 72(2), 926-933 (1998)], legyengített lentivírus [R. Zufferey et al., Nature Biotechnology 1_5(9), 871-875 (1997)] és adenovirális/retrovirális kiméra vektorok [M. Feng et al., Nature Biotechnology 15 (9), 866-870 (1997)].

Az igényelt találmány ennél fogva magában foglalja a korábban említett hl, h2 vagy h3CED-6 fehérje vagy nukleinsav különböző terápiás alkalmazásait.

A fehérjét a szakterületen ismert eljárásokkal adhatjuk be. Például a beadás módja előnyösen a célsejtek helyénél történik, így a beadás lehet orron keresztül (mint például az ADA-t expresszáló vektor beadásánál) vagy injekcióval (mint egy szuicid tumorgént expresszáló vektor beadásánál). A beadás egyéb módjai (parenterális, nyálkahártyán keresztüli, szisztémás, implantátum, intraperitoneális, és így tovább) a szakterületen általánosan ismertek. A hatóanyagokat előnyösen egy gyógyászatilag elfogadható hordozóban, úgymint sóoldatban, steril vízben, Ringer oldatban és izotóniás nátrium-klorid oldatban adjuk be.

A találmány diagnosztikai reagenseket is biztosít, melyeket az apoptotikus sejtek fagocitózisában lévő rendellenességhez kapcsolódó betegség diagnózisában lehet alkalmazni. Például a 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14., vagy 16. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosav-szekvenciával rendelkező fehérjék va lamely epitopja elleni antitestet alkalmazhatjuk diagnosztikai reagensként annak meghatározására, hogy egy betegben rendellenesség van-e a hlCED-6-ban, h2CED-6-ban vagy h3CED-6-ban vagy azok expressziójában. Továbbá a genetikai szinten lévő rendellenességek is kimutathatók az 1., 3., 5., 7., 9., 11 ·, 13. vagy 15. azonosítószámú szekvenciában bemutatott szekvenciával vagy részével rendelkező nukleinsavat próbaként alkalmazva.

Egyéb, a CED-6 jelátviteli útban aktív fehérjék azonosítása

A CED-6-t, hlCED-6-t, h2CED-6-t vagy h3CED-6-t alkalmazhatjuk az apoptotikus sejtek fagocitózisát elősegítő jelátvitel más tagjainak azonosítására. Számos lehetséges módszer létezik ennek végrehajtására, és egy előnyben részesített módszer az úgynevezett kéthibrides rendszer, melyet Chien és munkatársai fejlesztettek ki [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1994)], mely lehetővé teszi azoknak a fehérjéknek az azonosítását, melyek a számunkra érdekes fehérjéhez kötődnek.

Ez a módszer egy olyan transzkripciós faktor in vivo funkcionális rekonstrukcióján alapul, mely egy riporter gént aktivál. Pontosabban, a módszerben egy megfelelő gazdasejtet, előnyösen élesztőt állítunk elő, mely egy olyan promoter szabályozása alatt álló riportergént tartalmazó DNS szerkezettel rendelkezik, melyet egy DNS-kötő doménnel és egy aktiváló doménnel rendelkező transzkripciós faktor szabályoz; a gazdasejtben egy találmány szerinti nukleinsav-szekvencia fragmenséből vagy a teljes szekvenciából és a transzkripciós faktor DNS-kötő doménjéből vagy aktiváló domnjéből álló első fúziót kódoló első hibrid DNS szekvenciát expresszálunk, és a gazdasejtben legalább egy, a vizsgálandó feltételezett kötőfehérjéket a transzkripciós faktornak az • · · · · ····· • · · ·· · *« ί első fúzióba be nem épített DNS kötő doménjével vagy aktiváló doménjével együtt kódoló második hibrid DNS szekvenciát expresszáljuk; kimutatjuk a vizsgálat alatt álló fehérje kötődését a találmány szerinti fehérjével úgy, hogy a gazdasejtben detektáljuk valamely riportergén terméket; adott esetben izoláljuk a kötőfehérjét kódoló második hibrid DNS szekvenciát.

Példák

Ebben a vizsgálatban az N2 Bristol törzset használtuk vad típusú referencitörzsként. Az összes törzset Brenner által leírt módon tartottuk fenn [Brenner (1974)], kivéve, hogy a férgeket NGM-lite agar közegben keltettük ki. A törzseket 20°C-on tartottuk fenn és keltettük, hacsak másképp nem jelezzük. A következő mutációkat alkalmaztuk ebben a vizsgálatban: LG I: cedl(el735), ced-l(nl995) és ced-l(nl506) [Ellis et al. (1991)]; LG III: dpy17(el64), ced-6(nl813, n2095), mec-14(u55) , ncl-l(el865) ced7(nl997), ced-7(n(1892) , ced-7(nl996) [Ellis et al. (1991)], unc-36(e251) [Brenner (1974)] és sDp3(III,f) [Rosenbluth et al., (1985)]; vagy LG IV:ced-2(el752) [Hedgecock et al. (1983)], ced5(nl812' és ced-10(nl993) Ellis et al. 1991)]. AZ összes mutációt Hodgkin művében (197) leírták.

1. példa: A bekebelezés analízise és mennyiségi meghatározása

Az állatokat 30 mM NAN₃-mal elaltattuk, és agarlemezekre rögzítettük, hogy Nomarski optikás mikroszkópot alkalmazva megvizsgáljuk [Suston és Horvitz (1977); Avery és Horvitz (1987)]. Az embrionális fejlődés alatt létrejött elhalt sejtek bekebelezésének mennyiségi meghatározása céljából megszámoltuk a fennmaradó elhalt sejteket, melyek olyan fiatal L1 lárvák feji régiójában voltak láthatóak, melyeknek még csak négy sejtjük van az ivarmi63 ···· · ♦ ··· ♦..· ·..· : · ··:· rigyben (azaz a megelőző négy órában keltek ki) . A csíravonal bekebelezési rendellenességének mennyiségi meghatározására a disztális karban (ahol a csírasejtek pusztulása előfordul) és a proximális karban (ahol a fennmaradó elhalt csírasejtek láthatóak néha, mivel a fejlődő oociták magukkal viszik) számoljuk.

2. példa: Csiravonal transzformáció és a ced-6 genomiális mentése

Transzgénikus állatokat hoztunk létre Mello és munkatársai által kifejlesztett csíravonal mikroinjektálási eljárást alkalmazva. W03A5, F20F10, F48E8, R02F2, W02G12, T06H6, C48E6, C44D7, F56D2, F43F12, C05D2, T06C9, C05H8 kozmidokat injektáltunk egyenként vagy csoportosan (mindegyik kozmid végső koncentráció a 20 ng/μΐ), ced-6(nl813) állatokba. A pRF4 plazmidot alkalmaztuk (50-80 ng/μΐ végső koncentrációban) domináns koinjektálási markerként ([Mello et al. (1991)]; a pRF4 mutáns rol-6(sul006gf) kollagén gént hordoz, és egy domináns hengeres (Rol) fenotípust biztosít. A stabilan átvitt extrakromoszómális elrendezéseket hordozó transzgénikus vonalakat tartottuk meg a további elemzéshez. A mentési vizsgálatához transzgénikus állatok által lerakott háromszoros embriókat vizsgáltunk meg Nomarski optikával az elhalt sejtekre. A kevesebb vagy elhalt sejtek nélküli embriókat létrehozó transzgénikus vonalakat tekintettük úgy, hogy kijavítódtak (mentődtek) . A ced-6 elhelyezkedésének további pontosításához az F56D2-ben, számos deléciós szerkezetet hoztunk létre, és más fragmentumokat szubklónoztunk a pBluescript SK(+)II-be. Ezeknek a kiónoknak 50-90 ng/pg-ját 81-100 ng/μΐ pRF4 injektálási markerrel együtt oltottuk be a ced-6(nl813) férgekbe, és a mentési képességüket a fentebb leírt módon teszteltük.

·· · · · ···· ·· · ·· · ·· i

3. példa: ced-6 oDNS-ek izolálása

A teljes hosszúságú ced-6 cDNS-ek izolálásához egy kevert állapotú C. elegáns lambda' Zap eDNS könyvtárat szkrineltünk [R. Barstead ajándéka, Oklahoma Medical Research Foundation, Oklahoma City, OK] ismert eljárásokat alkalmazva [Sambrook et al. (1989)]. ³²P-jelölt próbát készítettünk templátként a 10kb-os mentő Xhol genomiális fragmentumot alkalmazva. Pozitív fágokat transzformáltunk a plazmidklónokba in vivo kivágási eljárást alkalmazva. Az izolált plazmidklónokból az F56D2.7 gént képviselő kiónokat Southern blottal azonosítottuk. Ebből a célból egy Pvel jelölt próbát hoztunk létre RT-PCR termékből, mely a megjósolt F56D2.7 három exonját képviselte. Az RT-PCR-hez használt primerek: GAATGTTCTCATTTATTG (29. azonosítószámú szekvencia) és (GGATTCAAACGATCCGATG (17. azonosítószámú szekvencia).

A körülbelül 300 000 tarfoltból 10 F56D2.7 cDNS-nek megfelelő plazmidklónt izoláltunk. Ezeket a kiónokat az inszertum mindkét vége felől megszekvenáltuk szegélyező T3 és T7 primereket alkalmazva. Az 5' végen részleges SL2 szekvenciával és ép poli(A) véggel rendelkező kiónt azonosítottunk teljes hosszúságú F56D2.7 cDNS-ként. Ezeknek a szekvencia eredményeknek és a Sau3A I restrikciós emésztés mintázatának elemzése alapján feltételeztük, hogy ezek a kiónok egy transzkriptumot képviselnek.

4. példa: Reverz transzkripciós PCR

Reverz transzkripciós (RT)-PCR kísérleteket hajtottunk végre, hogy meghatározzuk a mentő Xhol genomiális fragmentumban kimutatott vagy jósolt transzkriptumok 5' végét. Reverz transzkripciót hajtottunk végre a következő primerekkel:

cO5D2.6a: GAATCTGTCCATCGCATTGC (18. azonosítószámú szekvencia), • · ♦ · · ···>· • · · ·· · ·· 4

GAATTTCTTTGGGTAGACA (19 azonosítószámú szekvencia); C05D2.6b: GCTCTGAAGAACTGTGA (20. azonosítószámú szekvencia), GACGAGGTGAAGCGATTGTG (21. azonosítószámú szekvencia); Í56D2.7: GGGATCAAACGAATCATC(22. azonosítószámú szekvencia).

Ezeket a primereket ezután az SL1 (GTTTAATTACCCAAGTTTGAG (23. azonosítószámú szekvencia)) vagy SL2 (GGTTTTAACCCAGTTACTCAAG (24. azonosítószámú szekvencia) primerekkel együtt alkalmaztuk az ezt követő PCR amplifikációnál. Teljes C. elegáns kevert állapotú RNS-t izoláltunk a korábban leírt módon. RT-PCR-t hajtottunk végre Superscript Preamplication System-t (Gibco BRL) alkalmazva .

5. példa: ced-6 mutációk azonosítása

Annak meghatározására, hogy a ced-6 alléi egy nagy, fizikailag kimutatható polimorfizmust okoz-e, N2, ced-6(nl813) Southern lenyomatait hoztuk létre, és a ced-6(n2095) genomiális DNS-t különböző restrikciós enzimekkel emésztettük. A mentő Xhol genomi fragmentumból létrehozott próba új allélspecifikus sávokat mutatott ki a ced-6(n2095)-ben négy különböző restrikciós enzimet alkalmazva. A ced-6(n2095)-ben az új restrikciós mintázatok elemzése azt jelzi, hogy ez az alléi egy komplex átrendeződést hordoz ebben a régióban, mely az F56D2.7 legalább egy részét lefedi, de nincs hatással a szomszédos C05D2.6b transzkriptumra.

A pontmutációk azonosítására az F56D2.7-ben, az N2, ced6(nl813) és ced-6(n2095) mutánsokból származó F56D2.7 átfedő fragmentumait PCR-rel amplifikáltuk, és PCR termék szekvenáló kittel (Amersham) közvetlenül megszekvenáltuk. Az átfedő PCR fragmentumok lefedték a teljes F56D2.7 transzkripciós egységet és a körülbelül 1 kb-os upstream genomi szekvenciát. A PCR : ·«···:· amplifikációnál és szekvenálásnál alkalmazott primerek szekvenciái igény esetén hozzáférhetőek.

6. példa: Hőaokk kísérletek

Annak tesztelésére, hogy a ced-6 cDNS menti-e a bekebelezési rendellenességet, a teljes hosszúságú FD56D2.7 cDNS KpnI/Sall fragmentumát a hspl6-2 és hspl6-41 promótereket hordozó PPD49.78 és pPD49.83 MCSII-jének KpnI/SacI helyére inszertáltuk a pLQhsl és pLQhs2 szerkezeteket létrehozva. A két szerkezetet együtt injektáltuk be 50 ng/μΐ koncentrációban, mindegyiket 80 ng/μΐ pRF4-gyel, hogy stabilan átvitt extrakromoszómális elrendezéseket hozzunk létre. A kontroll kísérleteinkhez pPD50.21-t és pPD50.15-t, a pPD49.78 és pPD49.83 két származékát alkalmaztuk, melyekben a lacZ nyitott leolvasási keretet helyeztük a hősokk promóterek szabályozása alá. Ezeket a szerkezeteket hordozó transzgénikus vonalakat hoztuk létre a fentebb leírt módon.

Az embrionális fejlődés alatt előforduló sejthalál előtt a ced-6 overexpresszálására kifejlett állatokat tettünk E. colival beoltott tálcára, és hagytuk, hogy petéket rakjanak egy órán át. A tálcákat ezt követően parafilmmel lezártuk, és hősokknak vetettük alá 33°C-os vízfürdőbe téve 45 percig. Egy 75 perces 20°C-on történő helyreállítás után a kifejlett állatokat levettük a tálcákról. A hősokk után 12-14 órával a kikelő L1 lárvákat a feji régióban lévő elhalt sejttestekre kiértékeltük.

Az embrionális fejlődés alatt történt elhalt sejtek képződése utáni ced-6 overexpresszálásra az összes fejlődési stádiumban lévő embriót (de nem lárvát) tartalmazó féregtálcákat leparafilmeztük, és hősokknak vetettük alá 33°C-os vízfürdőbe téve 45 percig. A hősokk után három órával a frissen kikelt L1

:.. :: .· : .

...· ·..· : ·„ · ··;· lárvákat a feji régióban lévő elhalt sejttestekre kiértékeltük.

Abból a célból, hogy meghatározzuk a ced-6 sejthalál előtti overexpressziójának hatását a pusztuló csírasejtek bekebelezésére, L4 stádiumú transzgénikus állatokat új tálcákra vittünk át, és 20°C-on tartottuk. Az L4 vedlés után 24 órával a féreglemezeket parafilmmel lezártuk, és 45 percen át 33°C-on hősokkoltuk a fentebb leírt módon. Az állatokat elpusztult csírasejtekre vizsgáltuk a hősokk után 12 órával, és 18, 24, 36 és 60 órával a hősokk után szintén.

Az elhalt csírasejtek képződése utáni ced-6 overexpresszióhoz L4 állapotú transzgénikus állatokat gyűjtöttünk, és különböző tálcákra helyeztük, minden lemezre néhányat. 24 órával az L4 vedlés után egy tálca férget 45 percig hősokkoltunk a fentebb leírt módon. Hasonló módon 36, 42, 48 és 60 órával az L4 vedlés után, mindegyik tálca férget egy időpontban hővel kezeltük. Az állatokat 12 órával a hősokk után az elhalt csírasejtekre vizsgáltuk.

A ced-6 overexpresszálására más bekebelezési mutáns háttérben, a ced-6-t vagy lac-Z-t expresszáló extrakromoszómális elrendezéseket ced-6(nl813)-ból egy vad típusú háttérbe vittük át, és ezután ced-1(el735)ced-1(nl506), ced-1(nl995), ced-7(1892), ced-7(nl996), ced-7(nl997), ced-2(nl752), ced-5(nl812) vagy ced10(nl993) mutánssal kereszteztük, hogy megfelelő transzgénikus mutáns törzseket hozzunk létre. Hősokk kísérleteket hajtottunk végre a fentebb leírt módon.

7. példa: Genetikai mozaik analízis

1000 dpy-17(el64) ced-6(nl813( mec-14(u55) ncl-l(el865) unc36(e25)III; sDp3(III,f) férget egyenként féregtálcákra helyez68 .«.· ·..· : ·~· ^:·ί· tünk. Ezeknek az állatoknak az utódait boncoló mikroszkóp alatt megvizsgáltuk, hogy azonosítsuk azokat az állatokat, melyek csak DPY UNC utódokat hoznak létre. A kifejlett állatokat Nomarski optika alatt vizsgáltuk meg közvetlenül az azonosítás után. Először a szomatikus buroksejteket vizsgáltuk, majd a D és C vonalakból származó testfal izmot. Amikor az összes testfal izomsejt vad típust mutatott, a P4 vonalban a duplikáció elveszett. Amikor a testfal a D vonalból származó izomsejtek vad típusúak voltak, míg a C vonalból származók ncl fenotípust mutattak, a duplikáció biztos, hogy elveszik a P3 utódvonalban. Amikor a D és C vonalból származó testfal izomsejtek ncl fenotípust mutatnak, a duplikáció biztos, hogy elveszik a P2 vonalból. Az elhalt sejteket az ivarmirigyek mindkét karjában szintén megvizsgáltuk a bekebelezési fenotípust. Azért, hogy olyan állatokat találjunk, melyek a szomatikus buroksejtekben duplikációvesztettek, de a csírasejtekben nem, dpy-17(el64) ced-6(nl813) mec-14(u55) ncl-l(el865) unc-36(e25)III; sDp3(III,f) állatokat vizsgáltunk meg Nomarski optika alatt a duplikáció elvesztésére a szomatikus buroksejtekben. Ugyanebben az időpontban az ivarmirigyekben szintén megvizsgáltuk az elhalt sejteket a bekebelezési fenotípusra.

8. példa: A CED-6 humán homológjainak azonosítása

A ced-6 szekvenciával (18. ábra, a hCED-6 konszenzus DNS szekvencia) végzett kiterjedt keresések (tblastn) a nyilvánosan hozzáférhető adatbázisokban (ES, Genbank, EMBL, Swissprot és PÍR) statisztikusan szignifikáns homológiákat tárt fel a fehérje karboxi-terminális régiójánál néhány EST-tel (AA443368, AA431995, R33389, R53881). Egy EST (T48513) homológiát mutatott ··· ♦ · «·· ·*·* *♦·* ί ·„ · ··/· a PTB dómén karboxi-terminálisával és a töltéssel rendelkező régió kezdetével. Az 5' RACE analízishez egy Clontechtől származó Marathon-ready cDNS vastagbél-végbél adenokarcinóma könyvtárt alkalmaztunk. A RACE-hez alkalmazott primerek helyzetét és a szekvenálását a 18. ábrán jelezzük. Ezt követő klónozással és szekvencia analízissel további szekvencia információkat kaptunk. Ezt a további szekvencia információt és további adatbázis kereséseket (blastn) alkalmazva egy további EST-et találtunk, mely lehetővé tette számunkra, hogy egy hozzávetőleg 2400 bp-os konszenzust szerkesszünk. Ezt a szekvenciát tovább hosszabbítottuk és telephibridizációval és további RACE termékek szekvenálásával igazoltuk.

9. példa: RNS lenyomatok (Lásd a 25. ábrát, a hCED-6 expressziós mintázata normális humán szövetekben és rák sejtvonalakban northern blottolással: A) Humán többszövetes (MTN) lenyomat B) Humán többszövetes northern (MTN) lenyomat II C) Humán rák sejtvonal többszövetes TM northern (MTN ) lenyomat)

Humán többszövetes northernt (MTN-1, Clontech), mely mindegyik sávban 2 mg poliA+ RNS-t tartalmazott nyolc különböző szövetből (szív, agy, placenta, tüdő, máj, vázizom, vese és hasnyálmirigy) és egy MTN-II humán többszövetes northernt, mely mindegyik sávban 2 mg poliA+ RNS-t tartalmazott lépből, tímuszból, prosztatából, heréből, petefészekből, vékonybélből, vastagbélből és perifériális leukocitából, a gyártó útmutatásai szerint hibridizáltuk, és 0,1 x SSC-ben, 0,2 % SDS-ben 55 C-on kimostuk. Szintén a Clontechtől származó, humán rák sejtvonalakból (G361 melanoma, A549 tüdő karcinóma, SW480 vastagbél-végbél .*:··* ν· ^:·ί· adenokarcinóma, Burkitt limfóma, Molt 4 Raji leukémia, K562 limfoblaszt leukémia, HeLA S3 és HL6 promielotikus leukémia) származó poliA+ RNS lenyomatokat teszteltünk·

10. példa: Teljes hosszúságú humán ced-6 cDNS izolálása

Több humán EST kiónt, többek között a hbc3123-t azonosítottuk különböző adatbázisok keresésén keresztül. A hbc3123 EST kiónt teljesen megszekvenáltuk. A PTB dómén régiója alapján egy pár prímért a P (ACAATTGCCAAGCTTCATAG; 30. azonosítószámú szekvencia) és Q (CTGTTTTCTTGTTTCAACATC; 31. azonosítószámú szekvencia) prímért terveztünk, és ezt követően a specifitásukra teszteltük humán genomi DNS-t alkalmazva templátként. Az eredmény azt mutatta, hogy a primerek specifikusak. Agy, szív, vese, máj, tüdő, hasnyálmirigy, placenta, vázizom szöveteket magában foglaló lambda gtlO cDNS könyvtárak sorozatát teszteltük P és Q prímeteket alkalmazva, hogy kimutassuk, hogy a ced-6 expresszálódik-e ezen szövetek valamelyikében.

A Q prímért és egy lambda gtlO vektorral szembeni prímért használtunk fel arra, hogy izoláljunk néhány PCR fragmentumot agy és hasnyálmirigy cDNS könyvtárakat alkalmazva. Ezeket a PCR fragmentumokat ugyanennek a primerkészletnek az alkalmazásával újra amplifikáltuk és szekvenáltuk. A szekvencia analízis alapján feltételezhető, hogy ezek a PCR fragmentumok lehetővé teszik a cDNS meghosszabbítását a humán ced-6 kódoló régió iníciációs kodonjától felfelé (upstream). A leghosszabb PCR fragmentumot ezután elküldtük a humán ES adatbázisba, hogy még több olyan EST kiónt keressünk, mely átfed az izolált PCR fragmentumokkal, de a hbc3123 Est kiónnal nem. Ennek a három EST kiónnak a GenBank neve R65982, R65983 illetőleg AA159394. Ez a három EST a PCR frag71 ·“< - · * · meritummal és a hbc3123-mal alkotja a teljes hosszúságú humán CED-6 kódoló szekvenciát, és körülbelül 450 bp-os 5' UTR-t. A megszekvenált humán ced-6 cDNS-ről a hbc3123 EST klón szekvencia adataival, az izolált PCR fragmensek szekvencia adataival és a humán EST projektből származó humán cDNS régióján lévő számos EST klón szekvencia adataival igazoltuk, hogy helyes. Ezek a humán ced-6 cDNS adatok javasolták és irányították a 8. és 9. példában bemutatott kísérletek elvégzését. Lásd a 32. ábrát.

11. példa: A humánCED-6 emberi szöveteken belüli megoszlása

Ez egy további példa a humán szöveti eloszlásra. Két PTB doménnal szembeni prímért alkalmaztunk annak kimutatására, hogy a cDNS könyvtárak tartalmaznak-e humán ced-6-t. A két prímért templátként humán genomi DNS-t alkalmazva teszteltük, ezek a primerek specifikusak, mivel semmilyen háttér amplifikációt nem mutattunk ki. Ennek a szövetmegoszlási vizsgálatnak az eredménye a következők:

I. A cDNS könyvtárból kapott információ

Szövet	humán ced-6 cDNS jelenléte
Agy	++
Szív	++
Vese	++
Máj	+
Tüdő	++
Hasnyálmirigy	++
Méhlepény	++
Vázizom	++

II. A humán EST projektből kapott információk

Szövet	EST kiónok a humán EST projektből
Agy	2
Here	3
Hasnyálmirigy	4
HCC sejtvonal	1
Aorta	1
Méhlepény	13
Magzat	1 _________________
összegyűjtött minta	2

12. példa: A FISH-ként ismert módszert hajtottuk végre, a humán ced-6-t a 2q32.3-q33 kromoszómapozicióba lokalizáltuk.

13. példa: A C. elegáns és hűmén ced-6 homológok közötti funkcionális megőrződés; a hCED overexpressziója kijavítja a CED-6 mutánsok bekebelezési rendellenességét a C. elegánsban

Számításba véve, hogy a jelátviteli utak általában konzerválódtak az evolúció során, azt gondoltuk, hogy a humán ced-6 homológ (melyre ezek után hced-6-ként hivatkozunk, és a hlCED-6-t és/vagy h3CED-6-t foglalja magában), szintén részt vehet az apoptotikus sejtek fagocitózisos eltávolításának elősegítésében emlősökben. Ennek a kérdésnek a megválaszolására humán és féreg ced-6 géneket teszteltünk a funkcionális megőrződésre a hced-6 overexpresszálásával C. elegánsban, és annak meghatározásával, hogy vajon az képes-e funkcionálisan helyettesíteni az endogén ced-6 gént. Kimutattuk, hogy egy C. elegáns ced-6 cDNS overexpressziója a hspl6—2 és hspl6—41 hősokk promóterek szabá lyozása alatt hatásosan kijavítja a transzgénikus ced-6 mutáns embriókban a bekebelezési rendellenességet. Hasonló vizsgálatot ···· · * · · · • · · · · · ··>· ··· «· · ·· alkalmaztunk a hced-6 biológiai aktivitásának tesztelésére C.

elegánsban: a hspl6-2 és hspl6-41 szabályozása alatt lévő hced-6 nyitott leolvasási keretet hordozó szerkezeteket hoztunk létre, és mindkét szerkezetre transzgénikus ced-6(nl813) mutáns állatokat teszteltük a bekebelezési rendellenesség javítására késői embriókban és fiatal lárvákban. Úgy találtuk, hogy a transzgénikus nőstények által lerakott hősokkal kezelt embriók néhány elhalt sejtet tartalmaztak, de a hősokkal· nem kezelt embriók nem (31A. ábra). Ezeknek a megfigyeléseknek alapján feltételezhető, hogy a hced-6 helyettesíteni tudja, jól lehet ebben a vizsgálatban csak gyengén, a C. elegáns ced-6-t, mely alátámasztja azt a koncepciónkat, hogy a C. elegáns és a humán ced-6 funkcionálisan konzerválódott. A további, 13. példában bemutatott mérések a mentést sikeresnek mutatták.

Bizonyos vizsgálatokban korábban részleges javítás vagy akár a mentés hiányát figyelték meg, még azokban az esetekben is, ahol a funkcionális megőrződést megállapították. Például Wu és Horvitz, Nature 392, 501-504 (1998a) megállapították, hogy a

DOCK180, a C. elegáns CED-5 emlős homológja hatásosan kijavítja a CED-5 mutánsok disztális csúcssejt migrációját, de a bekebelezési rendellenességet nem.

Kísérleti eljárások

A hced-6 nyitott leolvasási keretét PCR-ral amplifikáltuk a start és stop kodonokat szegélyező oligonukleotidokat alkalmazva, és a pPD49.78 és pPD49.83 hősokk vektorokba szubklónoztuk, melyeket előtte KpnI-gyel és Sacl-gyel emésztettünk (lásd korábban) . A két szerkezetet ezután ced-6(nl813) állatokba injektáltuk, a korábban leírt módon, hogy stabilan transzformált transzgénikus vonalakat hozzunk létre.

A bekebelezési rendellenesség kijavításának kiértékelésére embriókban és felnőtt csíravonalakban, a transzgénikus állatokat hősokknak tettük ki, és az elhalt sejtek számát a korábban itt leírt módon mennyiségileg meghatároztuk.

2. táblázat

A humán ced-6 homológ overexpressziója lecsökkenti a fennmaradt elhalt sejtek számát a ced-6(nl813) késői állapotú embriókban

Genotípus	Fennmaradt elhalt sejtek
	- hősokk	+ hősokk
Vad típus (N2)	-	-
ced-6(nl813)	+++	++
ced-6(nl813)hs::hced-6	+++	+

Az izolált PCR fragmentumok egyikét a hbc3123 EST kiónhoz fuzionáltuk. A pLQhced-6.1 fúziós cDNS-nek 130 nukleotidja van az ATG iníciációs start kodontól felfelé. Két prímért, a Hhsl-t (GGGGTACCGAATTCTGATGGCAAC (27. azonosítószámú szekvencia)) és a Hhs3-t (CGAGCTCGATCAATAGTGAAGGTGAGG (28. azonosítószámú szekvencia) alkalmaztuk a humán ced-6 cDNS nyitott leolvasási keretének amplifikálására. A PCR fragmentumot egymás után KpnI-gyel és Sacl-gyel emésztettük, és a ppD49.78 és ppD49.83 hősokk vektorok mindegyikének KpnI és SacI helyeire inszertáltuk. A pLQhsl és pLQhs2 hősokk szerkezetek 50 ng/ml-ét egy pRF4 markerrel (80 ng/μΐ) együtt oltottuk a kifejlett ced-6(hl813) hermafroditák csíravonalába. A hced-6-t megvizsgáltuk arra a képességére, hogy kijavítja-e a bekebelezési rendellenességet a ced-6(nl813) transzgénikus állatok ebrió utódaiban az itt leírt bevezetett eljárást alkalmazva.

Ά hCED-6-nak azt a képességét, hogy a ced-6(nl813) bekebelezési rendellenességét kijavitja-e, a felnőttek ivarmirigyeiben is teszteltük. L4-vedlásen átesett felnőtt transzgénikus állatokat szedtünk ki, és friss tálcára helyeztük. 36 órával később ezeket az állatokat egy 45 perces hősokkal kezeltük 33°C-on. 12 órával a hősokk után, az elhalt sejteket az egyik ivarmirigykarban megszámoltuk. Kontroll kísérleteket, azaz hősokk nélküli transzgénikus állatokat, azonos fejlődési állapotú hősokkal kezelt vagy nem kezelt ced.6(nl813) állatokat is használtunk. Ezek a kísérletek azt mutatták, hogy a hced6 overexpressziója kijavítja a CED-6 mutánsok bekebelezési rendellenességét a C. elegánsban egy csiravonalban. Ezek a kísérletek igazolják, hogy a humán ced-6-ok (például h3CED-6) működése kiváltja az apoptotikus sejtek fagocitózisát. 31A. és 31B. ábra.

14. példa: A szekvenciákat mindkét letétbe helyezett szerkezetből a T3 vagy a T7 primereket alkalmazva kaphatjuk meg (vagy az egyiket vagy mindkettőt alkalmazhatjuk, az aktuális inszertum különböző helyeinél vannak). Mindkettő a kereskedelemben a Clontechtől beszerezhető (1227 és 1228 számon), és a szekvenciát lentebb bemutatjuk.

T7 primer: 5' (TAATACGACTCACTATAGGGAGA)3' (25. azonosítószámú szekvencia)

T3 primer: 5'(ATTAACCCTCACTAAGGGA)3' (26. azonosítószámú szekvencia)

Irodalmi hivatkozások:

Avery, L., and Horvitz, H. (1987). A cell that dies during wild-type C. elegáns development can function as a neuron in a ced-3 mutant. Cell 51, 1071-1078.

Blaikie, P., Immanuel, D., Wu, J., Li, N., Yajnik, V., and Margolis, b. (1994). A region in She distinct from the SH2 domain can bind tyrosine-phosphorylated growth factor receptor. The Journal of Biological Chemistry 269,32031-32034.

Blumenthal, T. (1995). Trans-splicing and polycistronic transcription in Caenorbabditis elegáns. TIG 11,132-136.

Blumenthal, T., and Steward, K. (1997). RNA processing and gene structure. In C. ELEGÁNS II, D. L. Riddle, T. Blumenthal, B. J. Meyer and J. R. Priess, eds. (Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press), pp. 117-145.

Bork, P., and Margolis, B. (1995). A phosphotyrosine interaction domain. Cell 80, 693-694.

Brennar, S. (1974). The genetics at Caenorhabdidt elegant. Genetics 77, 71-94.

Driscoll, M„ and Chalfle, M. (1991). The mec-4 gene is a member of a family of Caenorhabdilit elegant genes that can mutate to induce neumnal degeneration. Nature 349, 588-593.

Driscoii, M. (1992). Molecular genetics of ceil death in the nematode CaenorhabdUit elegáns. The Journal of Neurobiology 23,1327-1351

Duvall, E„ Wyllie, A. H, and Morris, R. G. (1985). Macrophage recognition of cells undergomg programmed cell death (apoptosis). Immunology 56,351-358.

Ellis, R. E., Jacobson, D. M., and Horvitz, H. R. (1991). Genes required for the engulfment of cell corpses during programmed cell death in Caenorhabditis elegáns. Genetics 129, 79-94.

Fadok, V. A., Savill, J. S., Haslett, C., Bratton. D. L., Doherty, D. E., Campbell, P. A., and Henson, P. M. (1992). Different populations of macrophages use either the vitronectin receptor or the phosphatidylserine receptor to recognize and remove apoptotic cells. The Journal of Immunology 149, 4029-4035.

Fadok, V. A., Voelker, D. R., Campbell, P. A., Cohen, J. J., Bratton, D. L., and Henson, P. M. (1992). Exposure of phosphatidylserine on the Surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. The Jouma! of Immunology 148, 2207-2216.

Finan, P., Shimizu, Y., Gout, I., Hsuan, J., Truong, 0., Butcher, C., Bennett, P., Waterfield, M. D., and Kellie, S. (1994). An SH3 domain and proline-rich sequence mediate an interaction between two components of the phagocyte NADPH oxidase complex. The Journal of Biochemical Chemistry 269, 13752-13755.

Franc, N. C., Dimarcq, J.-L., Lagueux, M., Hoffmann, J., and Ezekowitz, R. A. B. (1996). Croquemort, A novel Drosophila hemocyte/macrophage receptor that recognizes apoptotic cells. Immunity 4,431-443.

Frise, E., Knoblich, J., Younger-Shepherd, S., Jan, L., and Jan, Y. (1996). The Drosophila Numb protein inhibits signaling of the Notch receptor during cell-cell interaction in sensory organ lineage. Proc Natl Acad Sci U S A 93(15), 11925-11932.

Geer, P. v. d., and Pawson, T. (1995). The PTB domain: a new protein module implicated in signal transduction. TIBS 20,277-280.

Gout, I., Dhand, R., Hiles, I. D., Truong, 0., Totty, N. F., Hsuan, J., Booker, G. W., Campbell, L. D., and Waterfield, M. D. (1993). The GTPase dynamin binds to and is activated by a subset of SH3 domains. Cell 75, 25-36.

Grabs, D., Slepnev, V. I., Songyang, Z., David, C., Lynch, M., Cantley, L. C., and Camilli, P. D. (1997). The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence. The Journal of Biological Chemistry 272,13419-13425.

Greenberg, S., Chang, P., and Silverstein, S. (1993). Tyrosine phosphorylation is required for Fc receptor-mediated phagocytosis in mouse macrophages. J Med Med 177, 529-534.

Greenberg, S., Chang, P., and Silverstein, S. (1994). Tyrosine phosphorylation of the gamma subunit of Fc gamma receptors, p72syk, and paxillin during Fc receptor-mediated phagocytosis in macrophages. J Biol Chern 269, 3897-3902.

Greenberg, S. (1995). Signal transduction of phagocytosis. Trends in Cell Biology 5, 93-99.

Grigg, J., Savill, J., Sarraf, C., Haslett, C., and Silverman, M. (1991). Neutrophil apoptosis and clearance from neonatal lungs. Lancet 338, 720-722.

Hedgecock, E. M., Sulston, J. E., and Thomson, J. N. (1983). Mutations affecting programmed cell deaths in the nematode Caenorhabditis elegáns. Science 220, 1277-1279.

Hedgecock, E. M., and Herman, R. K. (1995). The nuc-1 gene and genetic mosiac of Caenorhabditis elegáns. Genetics 141, 989-1006.

Hengartner, M. 0., and Horvitz, H. R. (1994). C. elegáns cell survival gene ced-9 encodes a functional homologue of the mammalian proto-oncogene bcl-2. Cell 76, 665-676.

Hengartner, M. 0. (1997). Cell Death. In C. ELEGÁNS II, D. L. Riddle, T. Blumenthal, B. J. Meyer and J. R. Priess, eds. (Plainview: Cold Spring Harbor Laboratory Press), pp. 383-415.

Herman, R. K. (1984). Analysis of genetic mosiac of the nematode Caenorhabditis Elegáns. Genetics 108,165-180.

Hirsh, D„ Oppenheim, D„ and Klass, M. (1976). Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegáns. Developmental Biology 49, 200-219

Horvitz, J. E. S. a. H. R. (1977). Post-embtyonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegáns. Developmental Biology 56, 110-156

Huang, X.-Y., and Hirsh, D. (1989). A second trans-splicedRNA leader sequence in the nematode Caenorhabditis elegáns. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 8640-8644.

Kavanaugh, W. M., and Williams, L. T. (1994). An alternative to SH2 domains for binding tyrosine-phosphorylated proteins. Science 266.

Kavanaugh, W. M„ Turek, C. W., and Williams, L. T. (1995). PTB domain binding to signaling proteins through a sequence motif containing phosphotyrosine. Science 268, 1177-1179.

Kimble, J., and Hirsh, D. (1979). The postembryonic cell lineages of the hermaphrodite and male gonads in Caenorhabdilis elegáns. Developmental Biology 70, 396-417.

Koch, C. A., Anderson, D., Moran, M. F,, Ellis, C., and Pawson, T. (1991). SH2 and SH3 Domains: elements that control interactions of cytoplasmic signaling proteins.

Science 252, 252-673.

Kramer, J. M., French, R. P., Park, E., and Johnson, J. J. (1990). The Caenorhabditis elegáns rol-6 gene, which interacts with the sqt-1 collagen gene to determine organismal morphology, encodes a collagen. Molecular and cellular Biology 10, 2081-2089.

Lockshin, R. A. (1981). Cell death in metamorphosis. In Cell death in biology and pathology, R. A. Lockshin and I. D. Browen, eds. (London: Chapman & Hall), pp. 79-122.

Luciani, Νί.-F., and Chimili, G. (1996). The ATP binding cassette transporter ABC1, is required for the engulfment of corpses generated by apoptotic cell death. The EMBO Journal 15,226-235.

Mello, C., and Fire, A. (1995). DNA transformation. In Methods in Cell Biology, H. F. Epstein and D. C. Shakes, eds. (San Diego: Academic Press), pp. 452-482.

Morris, R. G., Duvall, E., Hangreaves, A. D., and Wyllie, A. H. (1984). Hormone-induced cell death. 2. Surface changes in thymocytes undergoing apoptosis. American Journal of Pathology 115,426-436.

Morris, R. G., Hargreaves, A. D., Duvall, E., and Wyllie, A. H. (1984). Hormone-Induced Cell Death..

Pawson, T., and Schlessinger, J. (1993). SH2 and SH3 domains. Current Biology 3, 434-442.

Platt, N., Suzuki, H., Kurihara, Y., Kodama, T., and Gordon, S. (1996). Role for the class A macrophage scavenger receptor in the phagocytosis of apoptotic thymocytes in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93,12456-12460.

Ravetch, J. V. (1994). Fc Receptor: Rubor Redux. Cell 78, 553-560.

Ren, Y., Silverstein, R. L., Allen, J., and Savill, J. (1995). CD36 Gene Transfer Confers Capacity for Phagocytosis of Ceils Undergoing Apoptosis. J. Exp. Med. 18, 1857-1862.’

Roberson, A., and Thomson, N. (1982). Morphology of programmed cell death in the ventral nerve cord of Caenorhabditis elegáns Larvae. J. Embryol.Exp.Morph 67, 89-100.

Rosenbluth, R. E., Cuddeford, C., and Baillie, D. L. (1985). Mutagenesis in Caenorhabditis elegáns. II. A spectrum of mutational events induced with 1500 R of r-radiation. Genetics 109, 493-511.

Rosenshinc, I., and Finlay, B. B. (1993). Exploitation of Host Signal Transduction Pathways and Cytoskeletal Functions by Invasive Bacteria. BioEssays 15, 17-24.

Rotello, R. J., Fernandez, P.-A., and Yuan, J. (1994). Anti-apogens and anti-engulfens: monoclonal antibodies reveal specific antigens on apoptotic and engulfment cells during chicken embryonic development. Development 120, 1421-1431.

Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual (Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press)..

Savill, J., Wyllie, A., Henson, J., Walport, M., Henson, P., and Haslett, C. (1989). Macrophage phagocytosis of aging neutrophils in inflamation. Programmed cell death in the neutrophil leads to its recognition by macrophages. J Clin Invest 83, 865-875.

Savill, J., Dransfield, I., Hogg, N., and Haslett, C. (1990). Vitronectin receptor-mediated phagocytosis of cells undergoing apoptosis. Nature 343, 170-173.

Savill, J., Hogg, N., Ren, Y., and Haslett, C. (1992). Thrombospondin cooperates with CD36 and the vitronectin receptor in macrophage recognition of neutrophils undergoing apoptosis. J Clin Invest 90, 1513-1522.

Savill, J., Fadok, V., Henson, P., and Haslett, C. (1993). Phagocyte recognition of cells undergoing apoptosis..

Songyang, Z., and Cantley, L. C. (1995). Recognition and specificity in protein tyrosine kinase-mediated signaling. TIBS 20, 470-475.

Songyang, Z., Margolis, B., Chaudhuri, M., Shoelson, S. E., and Cantley, L. C. (1995). The phosphotyrosine interaction domain of SHC recognizes tyrosine-phosphorylated NPXY motif. The Journal of Biological Chemistry 270, 14863-14866.

Spieth, J., Brooke, G., Kuersten, S., Lea, K., and Blumenthal, T. (1993). Operons in C. elegáns', polycistronic mRNA precursors are processed by trans-splicing of SL2 to downstream coding region. Cell 73, 521-532.

Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., and Hirsh, D. (1985). Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegáns. Molecular and Cellular biology 5, 3484-3496.

Stringham, E. G., Dixon, D. K., Jones, D., and Candido, E. P. M. (1992). Temporal and spatial expression patterns of the small heat shock (hsp 16) genes in transgenic Caenorhabditis elegáns. Molecular Biology of the Cell 3,221-233.

Sulston, J. (1976). Post-embryonic development in the ventral cord of Caenorhabditis elegáns. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 275, 287-297.

Sulston, J. E., and Horvitz, H. R. (1977). Post-embryonic Cell Lineages of the Nematode, Caenorhabditis elegáns. Developmental Biology 56, 110-156.

Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., and Thomson, J. N. (1983). The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegáns. Developmental Biology 100, 64-119.

Wilson, R., Ainscough, R., Anderson, K., Baynes, C., Berks, M., Bonfield, J., Burton, J., Connell, M., Copsey, T., Cooper, J., Coulson, A., Craxton, M., Dear, S., Du, Z., Durbin, R., Favello, A., Fraser, A., Fulton, L., Gardner, A., Green, P., Hawkins, T., Hiller, L., Jier, M., Johnston, L., Jones, M., Kershaw, J., Kirsten, J., Laisster, N., Latrellie, P., Lightning, J., Lloyd, C., Mortimore, B., O'Callaghan, M., Parsons, J., Percy, C., Rifken, L., Roopra, A., Saunders, D., Shownkeen, R., Sims, M., Smaldon, N., Smith, A., Smith, M., Sonnhammer, E., Staden, R., Sulston, J., Thierry-Mieg, J., Thomas, K., Vaudin, M., Vaughan, K., Waterston, R., Watson, A., Weinstock, L., Wilkinson-Sproat, J„ and Wohldman, P. (1994). 2.2 Mb of contiguous nucleotide sequence from chromosome III of C. elegáns. Nature 368, 32-38.

Wolf, G., Trub, T., Ottinger, E., Groninga, L., Lynch, A., White, M. F., Miyazaki, M., Lee, J., and Shoelson, S. E. (1995). PTB domain ofIRS-1 and She have distinct but overlapping binding specificities. The Journal of Biological Chemistry 270, 27407-27410.

Wyllie, A. H., Kerr, J. F. R-, and Currie, A. R. (1980). Cell Death: The significance of apoptosis. International Review of Cytology 68,251-306.

Xu, X.-X., Yang, W., Jackowski, S., and Rock, C. 0. (1995). Cloning of a novel phosphoprotein regulated by colony-stimulating factor 1 shares a domain with the Drosophila disabled gene product. The Journal of Biological Chemistry 270, 14184-14191.

Yenush, L., and White, M. F. (1997). The IRS-signalling system during insulin and cytokine action. BioEssay 19,491-500.

Yu, H., Chen, J. K., Feng, S., Dalgamo. D. C., Brauer, A. W., and Schreiber, S. L. (1994). Structural basis for the binding of proline-rich peptides to SH3 domains. Cell 76, 933-945.

Zhou, M.-M., Ravichandran, K. S., Olejniczak, E. T., Petros, A. M., Meadows, R. P., Sattler, M., Harlan, J. E., Wade, W. S., and Fesik, S. J. B. S. W. (1995). Structure and ligand recognition of the phosphotyrosine binding domain of She. Nature 378, 584-592.

Zorio, D. A. R., Cheng, N. N., Blumenthal, T., and Spieth, J. (1994). Operons as a common form of chromosomal organization in C. elegáns. Nature 372,270-272.

Bár a találmányt részletesen bemutattuk, és azt annak előnyös megvalósítási módjaira hivatkozva írtuk le, nyilvánvaló, hogy a szakterületen jártasak különböző formai és részletekre vonatkozó változtatásokat tehetnek anélkül, hogy a találmány lényegétől és a csatolt igénypontjaiban meghatározott oltalmi körtől eltérné nek.

Szekvenciálisba <110> Cold Spring Harbor Laboratory DEVGEN NV <120> Fagocitózis gének és alkalmazásaik <130> CSHL97-07pAM <140> PCT/US99/01361 <141> 1999-01-21 <150> GB 9820816.8 <151> 1998-09-24 <150> GB 9812660.0 <151> 1998-06-11 <150> US 09/096,347 <151> 1998-06-11 <150> US 09/096,731 <151> 1998-06-11 <150> US 60/072,324 <151> 1998-01-23 <160> 71 <170> FastSEQ for Windows Version 3.0 <210> 1 <211> 1728 <212> DNA <213> Caenorhabditis elegáns <220>

<221> CDS <222> (22)...(1500) <400> 1 tctaaacttt ttctatatca g atg Met 1 cga tcg gtc tcc gga att gtc

Arg Ser Val Ser Gly Ile Val tct tea age ccg tcg acg agt

Ser Ser Ser Pro Ser Thr Ser acc gga aga acg tgg att cat Thr Gly Arg Thr Trp Ile His 45 gtg gaa tat gtt gca egg ttc

Val Glu Tyr Val Alá Arg Phe

65 aat gga agt gac gtg gca aga

Asn Gly Ser Asp Val Alá Arg

80

gca Alá	aaa Lys	gac Asp	att Ile 5	tac Tyr	aag Lys	acc Thr	ttc Phe	aaa Lys 10	51
ggt	gga	aat	aat	att	aat	gga	gaa	gga	99
Gly	Gly	Asn	Asn	Ile	Asn	Gly	Glu	Gly
		20					25
gca	cca	caa	gta	aaa	tat	cgt	ggt	ggg	147
Alá	Pro	Gin	Val	Lys	Tyr	Arg	Gly	Gly
	35					40
ccg	cca	gat	tat	ett	atc	aat	ggc	cat	195
Pro	Pro	Asp	Tyr	Leu	Ile	Asn	Gly	His
50					55
ott	gga	tgc	gtc	gaa	act	cca	aaa	gca	243
Leu	Gly	Cys	Val	Glu	Thr	Pro	Lys	Alá
				70
gaa	gcg	atc	cac	gcg	att	cga	ttt	caa	291
Glu	Alá	Ile	His	Alá	Ile	Arg	Phe	Gin
			85					90

Ara Ásd Leu Lys Arg Ser Glu Gin Thr Arg Glu Thr Alá Lys Leu Gin*.-·.

loo 105 : ·..'··** aaa gtg gaa att ege ate teg ate gac aat gtg atc att gcg gat att387

Lvs Val Glu He Arg He Ser He Asp Asn Val He He Ala Asp He HO H5120 aag aca aaa gcg cca atg tac act ttt cca ttg gga aga ata teg ttt435

Lys Thr Lys Ala Pro Met Tyr Thr Phe Pro Leu Gly Arg He SerPhe

125 130135 tgt get gat gat aaa gat gac aag cga atg ttc tea ttt att get ege483

Cys Ala Asp Asp Lys Asp Asp Lys Arg Met Phe Ser Phe He AláArg

140 145150 gee gag ggt get agt ggg aag ccg tet tgt tac gcg ttc aca tea gaa531

Ala Glu Gly Alá Ser Gly Lys Pro Ser Cys Tyr Alá Phe Thr SerGlu

155 160 165170 aag eta get gaa gat atc act eta act atc gga gag get ttt gat etc579

Lys Leu Ala Glu Asp He Thr Leu Thr He Gly Glu Alá Phe AspLeu

175 180185 gcc tac aag aga ttc ett gat aaa aat cga acg tet ttg gag aat cag627

Alá Tyr Lys Arg Phe Leu Asp Lys Asn Arg Thr Ser Leu Glu AsnGin

190 195200 aag oaa ata tac att ttg aag aaa aag att gtg gag ett gaa acc gag675

Lys Gin He Tyr He Leu Lys Lys Lys He Val Glu Leu Glu ThrGlu

205 210215 aat caa gtg etc att gag cga tta gca gaa get cta egg get aat agt723

Asn Gin Val Leu He Glu Arg Leu Ala Glu Ala Leu Arg Alá AsnSer

220 225230 aaa get gat tat gag aac acg ggt ccc cca atc tat cca gga tta ggt771

Lys Alá Asp Tyr Glu Asn Thr Gly Pro Pro He Tyr Pro Gly LeuGly

235 240 245250 cet cca gca ett cca ett tet ccg atg cet caa gga cet cca cca aac819

Pro Pro Alá Leu Pro Leu Ser Pro Met Pro Gin Gly Pro Pro Pro Asn

255 260265 att cet cca tcc tea ata tat tcc atg cca cgt gcc aac gat ett cca867

He Pro Pro Ser Ser He Tyr Ser Met Pro Arg Alá Asn Asp LeuPro

270 275280 cca act gaa atg get cca act etc cet cag att tet aca tea tea aat915

Pro Thr Glu Met Ala Pro Thr Leu Pro Gin He Ser Thr Ser SerAsn

285 290295 gga gca tea cca tcc gtg age ccg gca tcc aca tea cca tet gga cca963

Gly Alá Ser Pro Ser Val Ser Pro Alá Ser Thr Ser Pro Ser GlyPro

300 305310 get cca tea att cet cca ccg aga cet cet gca ctg get cet ccg cca1011

Alá Pro Ser He Pro Pro Pro Arg Pro Pro Ala Leu Alá Pro ProPro

315 320 325330 cca gtt get cca ege aga aac ccc gtt gtt tea ccg aaa aac tcc acg1059

Pro Val Alá Pro Arg Arg Asn Pro Val Val Ser Pro Lys Asn SerThr

335 340345 gcg gga ttg ttg gat gga ttg gag ttg ggg tea get gag ccg gca aaa1107

Alá Gly Leu Leu Asp Gly Leu Glu Leu Gly Ser Ala Glu Pro AláLys

350 355360 aaa get cet agt aat att ttc gat gat teg ttt gat ccc aga get gga 1155

gaa Glu

aaa Lys 380

365

370

cca Pro

375

gac Asp

ttc Phe

1203

aag Lys

age Ser

act Thr

gca Ala

get Ala 385

gag Glu

tat Tyr

aat Asn

ttc Phe 390

ggt Gly

geg Ala

etc

agt

ggc

att

caa

aat

ggt

aaa

gaa

gca

cca

cca

tea

gee

tcc

get

1251

Leu 395

Ser

Gly

He

Gin

Asn 400

Gly

Lys

Glu

Ala

Pro 405

Pro

Ser

Ala

Ser

Ala 410

gaa

ett

etc

get

tet

gaa

gca

ate

get

cgt

ett

cca

aag

cca

gaa

tcc

1299

Glu

Leu

Leu

Ala

Ser 415

Glu

Ala

He

Ala

Arg 420

Leu

Pro

Lys

Pro

Glu 425

Ser

tea

tet

gta

cca

ccc

aaa

aag

acc

get

gca

gag

tat

gat

gca

atg

ate

1347

Ser

Ser

Vai

Pro 430

Pro

Lys

Lys

Thr

Ala 435

Ala

Glu

Tyr

Asp

Ala 440

Met

He

aat

gaa

gtg

gag

aag

aag

ett

gee

geg

atg

agt

agt

gga

tea

ttt

gag

1395

Asn

Glu

Vai 445

Glu

Lys

Lys

Leu

Ala 450

Ala

Met

Ser

Ser

Giy 455

Ser

Phe

Glu

ttc

ggg

cag

ett

caa

acc

ggg

gac

ett

ggc

gga

ate

gaa

ggc

gaa

age

1443

Phe

Gly 460

Gin

Leu

Gin

Thr

Gly 465

Asp

Leu

Gly

Gly

He 470

Glu

Gly

Glu

Ser

gat

tat

gga

aca

cca

teg

gat

cgt

ttg

aat

ccg

aaa

atg

atg

aat

ttg

14 91

Asp 475

Tyr

Giy

Thr

Pro

Ser 480

Asp

Arg

Leu

Asn

Pro 485

Lys

Met

Met

Asn

Leu 4 90

aag caa taa gtttatttcc ttttttttaa attttccaat tttctacgtt1540

Lys Gin * tcacggtgat ttttttccat tgcattcttg tactattctt gtatcattct tttactagca1600 gggtttggcc gaacggcttg ccaaatttat tagctgaatg tatttatttg cacgctatca1660 tttttaaaaa ttacttactt acttacatgt gaaaaataaa ctggaatgtc tcatggctaa1720 aaaaaaaa1728 <210> 2 <211> 492 <212> PRT <213> Caenorhabditis elegáns <400> 2

Met Ala Lys Asp lie Tyr Lys Thr Phe Lys Arg Ser Vai Ser Gly He 15 1015

Vai Gly Gly Asn Asn He Asn Gly Glu Gly Ser Ser Ser Pro Ser Thr 20 2530

Ser Ala Pro Gin Vai Lys Tyr Arg Gly Gly Thr Gly Arg Thr Trp lie 35 4045

His Pro Pro Asp Tyr Leu He Asn Gly His Vai Glu Tyr Vai Ala Arg 50 5560

Phe Leu Gly Cys Vai Glu Thr Pro Lys Ala Asn Gly Ser Asp VaiAla

70 7580

Arg Glu Ala He His Ala He Arg Phe Gin Arg Asp Leu Lys ArgSer

9095

Glu Gin Thr Arg Glu Thr Ala Lys Leu Gin Lys Vai Glu lie Arg lie 100 105110

Ser He Asp Asn Vai lie He Ala Asp He Lys Thr Lys Ala Pro Met 115 120125

Tyr Thr Phe Pro Leu Gly Arg He Ser Phe Cys Ala Asp Asp Lys Asp 130 135140

Asp Lys Arg Met Phe Ser Phe lie Ala Arg Ala Glu Gly Ala SerGly

145 150 155160

Lys Pro Ser Cys Tyr Ala Phe Thr Ser Glu Lys Leu Ala Glu AspHe

165 170175

180 195 190:.Asp Lys Asn Arg Thr Ser Leu Glu Asn Gin Lys Gin lie Tyr lie Lev 195 200205

Lys Lys Lys lie Vai Glu Leu Glu Thr Glu Asn Gin Vai Leu He Glu 210 215220

Arg Leu Ala Glu Ala Leu Arg Ala Asn Ser Lys Ala Asp Tyr GluAsn

225 230 235240

Thr Gly Pro Pro He Tyr Pro Gly Leu Gly Pro Pro Ala Leu ProLeu

245 250255

Ser Pro Met Pro Gin Gly Pro Pro Pro Asn He Pro Pro Ser Ser lie 260 265270

Tyr Ser Met Pro Arg Ala Asn Asp Leu Pro Pro Thr Glu Met Ala Pro 275 280285

Thr Leu Pro Gin lie Ser Thr Ser Ser Asn Gly Ala Ser Pro Ser Vai 290 295300

Ser Pro Ala Ser Thr Ser Pro Ser Gly Pro Ala Pro Ser lie ProPro

305 310 315320

Pro Arg Pro Pro Ala Leu Ala Pro Pro Pro Pro Vai Ala Pro ArgArg

325 330335

Asn Pro Vai Vai Ser Pro Lys Asn Ser Thr Ala Gly Leu Leu Asp Gly 340 345350

Leu Glu Leu Gly Ser Ala Glu Pro Ala Lys Lys Ala Pro Ser Asn lie 355 360365

Phe Asp Asp Ser Phe Asp Pro Arg Ala Gly Glu Lys Lys Ser Thr Ala 370 375380

Ala Glu Tyr Asn Pro Phe Gly Ala Asp Phe Leu Ser Gly He GinAsn

385 390 395400

Gly Lys Glu Ala Pro Pro Ser Ala Ser Ala Glu Leu Leu Ala SerGlu

405 410415

Ala lie Ala Arg Leu Pro Lys Pro Glu Ser Ser Ser Vai Pro Pro Lys 420 425430

Lys Thr Ala Ala Glu Tyr Asp Ala Met lie Asn Glu Vai Glu Lys Lys 435 440445

Leu Ala Ala Met Ser Ser Gly Ser Phe Glu Phe Gly Gin Leu Gin Thr 450 455460

Gly Asp Leu Gly Gly lie Glu Gly Glu Ser Asp Tyr Gly Thr Pro Ser 465 470 475480

Asp Arg Leu Asn Pro Lys Met Met Asn Leu Lys Gin 485490 <210> 3 <211> 435 <212> DNA <213> Caenorhabditis elegáns <220>

<221> CDS <222> (1) ... (438) <400> 3 cat ccg cca gat tat ctt ate aat ggc His Pro Pro Asp Tyr Leu He Asn Gly 15 ttc ctt gga tgc gtc gaa act ccaaaa

Phe Leu Gly Cys Vai Glu Thr ProLys

2025 aga gaa geg ate cac geg att egattt

Arg Glu Ala He His Ala lie ArgPhe

3540 gaa caa acg egg gag acg geg aaactg

Glu Gin Thr Arg Glu Thr Ala LysLeu

5055 teg ate gac aat gtg ate att geg gat

Ser lie Asp Asn Vai lie lie Ala Asp

cat His 10	gtg Vai	gaa Glu	tat Tyr	gtt Val	gca Ala 15	egg Arg	48
gca Ala	aat Asn	gga Gly	agt Ser	gac Asp 30	gtg Val	gca Ala	96
caa Gin	ege Arg	gat Asp	ctg Leu 45	aaa Lys	ega Arg	tet Ser	144
caa Gin	aaa Lys	gtg Val 60	gaa Glu	att lie	ege Arg	ate He	192
att He	aag Lys	aca Thr	aaa Lys	geg Ala	cca Pro	atg Met	240

tac Tyr

act Thr

ttt Phe

cca Pro

ttg Leu 85

gga Gly

aga Arg

ata He

teg Ser

ttt Phe 90

tgt Cys

get Ala

gat Asp

gat Asp

aaa Lys 95

gat’* Asp

** 2’88

gac

aag

ega

atg

ttc

tea

ttt

att

get

ege

gcc

gag

ggt

get

agt

ggg

336

Asp

Lys

Arg

Met

Phe

Ser

Phe

He

Ala

Arg

Ala

Glu

Gly

Ala

Ser

Gly

100

105

HO

aag

ccg

tet

tgt

tac

geg

ttc

aca

tea

gaa

aag

eta

get

gaa

gat

ate

384

Lys

Pro

Ser

Cys

Tyr

Ala

Phe

Thr

Ser

Glu

Lys

Leu

Ala

Glu

Asp

He

115

120

125

act

eta

act

ate

gga

gag

get

ttt

gat

etc

gcc

tac

aag

aga

ttc

ett

432

Thr

Leu

Thr

He

Gly

Glu

Ala

Phe

Asp

Leu

Ala

Tyr

Lys

Arg

Phe

Leu

130

135

140

435 gat Asp 145 <210> 4 <211> 145 <212> PRT <213> Caenorhabditis elegáns <400> 4

His Pro Pro Asp Tyr Leu lie Asn Gly 15

Phe Leu Gly Cys Vai Glu Thr Pro Lys 2025

Arg Glu Ala He His Ala He Arg Phe 3540

Glu Gin Thr Arg Glu Thr Ala Lys Leu 5055

Ser lie Asp Asn Vai lie lie Ala Asp 6570

Tyr Thr Phe Pro Leu Gly Arg He Ser 85

Asp Lys Arg Met Phe Ser Phe He Ala

100105

Lys Pro Ser Cys Tyr Ala Phe Thr Ser

115120

Thr Leu Thr lie Gly Glu Ala Phe Asp 130135

Asp

145 <210> 5 <211> 291 <212> DNA <213> Caenorhabditis elegáns <220>

<221> CDS <222> (1).., (294) <400> 5 ggt ccc cca ate tat cca gga tta ggt

Gly Pro Pro He Tyr Pro Gly Leu Gly 1 5

His Vai Glu Tyr Vai Ala Arg 10 15

Ala Asn Gly Ser Asp Vai Ala 30

Gin Arg Asp Leu Lys Arg Ser 45

Gin Lys Vai Glu He Arg lie 60

He Lys Thr Lys Ala Pro Met 75 80

Phe Cys Ala Asp Asp Lys Asp 90 95

Arg Ala Glu Gly Ala Ser Gly 110

Glu Lys Leu Ala Glu Asp He 125

Leu Ala Tyr Lys Arg Phe Leu 140 cct cca gca ett cca ett tet 48

Pro Pro Ala Leu Pro Leu Ser

15 ccg atg cct caa gga cct cca cca aac att cct cca tcc tea ata tat Pro Met Pro Gin Gly Pro Pro Pro Asn He Pro Pro Ser Ser lie Tyr 20 25 30

Ser Met Pro Arg Ala Asn Asp Leu Pro Pro Thr Glu Met Ala Pro Thr;,,J*.

40 45 S *·’# etc cct cag att tet aca tea tea aat gga gca tea cca tee gtg age192

Leu Pro Gin lie Ser Thr Ser Ser Asn Gly Ala Ser Pro Ser VaiSer

5560 ccg gca tee aca tea cca tet gga cca get cca tea att cct cca ccg240

Pro Ala Ser Thr Ser Pro Ser Gly Pro Ala Pro Ser He Pro ProPro

70 7580 aga cet cet gca ctg get cct ccg cca cca gtt get cca ege aga aac288

Arg Pro Pro Ala Leu Ala Pro Pro Pro Pro Vai Ala Pro Arg ArgAsn

9095 ccc291

Pro <210> 6 <211> 97 <212> PRT <213> Caenorhabditis elegáns <400> 6 Gly Pro Pro He 1

Pro Met Pro Gin 20 Ser Met Pro Arg 35

Leu Pro Gin He 50

Pro Ala Ser Thr 65

Arg Pro Pro Ala

Tyr Pro Gly Leu 5

Gly Pro Pro Pro

Ala Asn Asp Leu 40

Ser Thr Ser Ser 55

Ser Pro Ser Gly 70

Leu Ala Pro Pro 85

Pro

Gly Pro Pro Ala Leu Pro Leu Ser 10 15

Asn He Pro Pro Ser Ser He Tyr

30

Pro Pro Thr Glu Met Ala Pro Thr 45

Asn Gly Ala Ser Pro Ser Vai Ser 60

Pro Ala Pro Ser lie Pro Pro Pro

80

Pro Pro Vai Ala Pro Arg Arg Asn 90 95 <210> 7 <211> 2412 <212> DNA <213> human <220>

<221> CDS <222> (430)...(1343) <400> 7 ggtgatgagc ccttgggttc tcgctccgac tgetaaatte gettggeegg gtccaccttc60 tcgtggcctc actcgccaca cggatcagaa tccggagcag gcagttctct etattetgag120 gctcctgcgg ctgccggctg acttccctgt gtgcgggagg gaactctggg caggctggtt180 ttcttggaat gtgtttacga tgttgaatgg gacttgaaca ggaagctgga cgctgcagct240 ggaactagcg tgccaagtta tttatgattc catctgatat acataggaga gaaaetgata300 gaagaattet gatggcaact gtatgataga agetattata aagteaagtg tccattttct360 ttcaactata tttgagcata cccaggattt aagtegtgga actgaacatt tatttggctg420 atcctcatc atg aac cgt get ttt age agg aag aaa gac aaa aca tgg atg471

Met Asn Arg Ala Phe Ser Arg Lys Lys Asp Lys Thr Trp Met

1510 cat aca cct gaa get tta tea aaa cat ttc att ccc tat aat gca aag519

His Thr Pro Glu Ala Leu Ser Lys His Phe lie Pro Tyr Asn AlaLys

20 2530 ttt ett ggc agt aca gaa gtg gaa cag cca aaa gga aca gaa gtt gtg567

Phe Leu Gly Ser Thr Glu Vai Glu Gin Pro Lys Gly Thr Glu VaiVai

4045

aga Arg	gat Asp	get Alá	gta Val 50	agg Arg	aaa Lys	cta Leu	aag Lys	ttt Phe 55
gaa	ggc	cag	aaa	att	cet	aaa	gtg	gag
Glu	Gly	Gin 65	Lys	He	Pro	Lys	Val 70	Glu
gta	aaa	att	cta	gaa	ccc	aaa	aca	aag
Val	Lys 80	He	Leu	Glu	Pro	Lys 85	Thr	Lys

gca Alá	aga Arg	cat His	ate He	aag Lys 60	aaa Lys	tet;.. Ser···*	: :61^ ·’ · ·..· : - ··#
ttg	caa	ata	tea	att	tat	gga	663
Leu	Gin	He	Ser 75	lie	Tyr	Gly
gaa	gtt	caa	cac	aat	tgc	cag	711
Glu	Val	Gin 90	His	Asn	Cys	Gin

ett Leu 95

cat His

aga Arg

ata He

tet Ser

ttt Phe 100

tgt Cys

gca Ala

gat Asp

gat Asp

aaa Lys 105

act Thr

gac Asp

aag Lys

agg Arg

ata He 110

759

ttc

act

ttc

ata

tgc

aaa

gat

tet

gag

tea

aat

aaa

cat

ttg

tgc

tat

807

Phe

Thr

Phe

He

Cys 115

Lys

Asp

Ser

Glu

Ser 120

Asn

Lys

His

Leu

Cys 125

Tyr

gta

ttt

gac

age

gaa

aag

tgt

get

gaa

gag

ate

act

tta

aca

att

ggc

855

Val

Phe

Asp

Ser 130

Glu

Lys

Cys

Ala

Glu 135

Glu

He

Thr

Leu

Thr 140

He

Gly

caa

gca

ttt

gac

ctg

gca

tac

acg

aaa

ttt

cta

gaa

tea

gga

gga

aaa

903

Gin

Ala

Phe 145

Asp

Leu

Ala

Tyr

Thr 150

Lys

Phe

Leu

Glu

Ser 155

Gly

Gly

Lys

gat

gtt

gaa

aca

aga

aaa

cag

ate

gca

ggg

tta

caa

aaa

aga

ate

caa

951

Asp

Val 160

Glu

Thr

Arg

Lys

Gin 165

He

Ala

Gly

Leu

Gin 170

Lys

Arg

He

Gin

gac

tta

gaa

aca

gaa

aat

atg

gaa

ett

aaa

aat

aaa

gta

caa

gat

ttg

999

Asp 175

Leu

Glu

Thr

Glu

Asn 180

Met

Glu

Leu

Lys

Asn 185

Lys

Val

Gin

Asp

Leu 190

gaa

aac

caa

ctg

aga

ata

act

caa

gta

tea

gca

cct

cca

gca

ggc

agt

1047

Glu

Asn

Gin

Leu

Arg 195

lie

Thr

Gin

Val

Ser 200

Ala

Pro

Pro

Ala

Gly 205

Ser

atg

aca

cct

aag

teg

ccc

tec

act

gac

ate

ttt

gat

atg

att

cca

ttt

1095

Met

Thr

Pro

Lys 210

Ser

Pro

Ser

Thr

Asp 215

He

Phe

Asp

Met

He 220

Pro

Phe

tet

cca

ata

tea

cac

cag

tet

teg

atg

cct

act

ege

aat

ggc

aca

cag

1143

Ser

Pro

He 225

Ser

His

Gin

Ser

Ser 230

Met

Pro

Thr

Arg

Asn 235

Gly

Thr

Gin

cca

cct

cca

gta

cct

agt

aga

tet

act

gag

att

aaa

egg

gac

ctg

ttt

1191

Pro

Pro 240

Pro

Val

Pro

Ser

Arg 245

Ser

Thr

Glu

He

Lys 250

Arg

Asp

Leu

Phe

gga

gca

gaa

cct

ttt

gac

cca

ttt

aac

tgt

gga

gca

gca

gat

ttc

cct

1239

Gly 255

Ala

Glu

Pro

Phe

Asp 260

Pro

Phe

Asn

Cys

Gly 265

Ala

Ala

Asp

Phe

Pro 270

cca

gat

att

caa

tea

aaa

tta

gat

gag

atg

cag

gag

ggg

ttc

aaa

atg

1287

Pro

Asp

He

Gin

Ser 275

Lys

Leu

Asp

Glu

Met 280

Gin

Glu

Gly

Phe

Lys 285

Met

gga

cta

act

ett

gaa

ggc

aca

gta

ttt

tgt

etc

gac

ccg

tta

gac

agt

1335

Gly

Leu

Thr

Leu 290

Glu

Gly

Thr

Val

Phe 295

Cys

Leu

Asp

Pro

Leu 300

Asp

Ser

agg tgc tg acatcaagaa caagaaatcc tgattcatgt taaatgtgtt tgtatacaca 1393 Arg Cys tttaatattt tttattttaa actgtagatg tctatttagt tttcccaaaa aaactaaaca attttatgta caaggtcact atgtatttag taaatattta aacattaaat gatttgatat acccatattt ttttcttctt tgatacttta tctgtatttg tgaaaatttt aaacagctta aatttgtaat tagcatcttg gccatacctt tgttctgttt taaatactgt aatttctagc agtatttatt atttgtttta ttcattccaa tccctaaaaa actttaccaa tgatgaagat aaatctgtgg ttttgttaaa ctcagttaaa ctgtaaagta tgaaagacat aaatttgtat aaagataact ttaaaccaac tcacatcact aggtaaaatt agtaaatgca taaaggtagt atgagataag acatttggaa atatatttct atttttcacc cacccgttct gtcaaaaatc tttcctcacc gatcatactt attatacaaa tcattttcca ttttaaattc aaacatgtta gggaaaatgt ataaggatat aggtgatgtt gaaaaaatga tgatattact tatatgctat cctcactgca aaagtttatt acatgaatta tcattttcca ttcactattg ttatgttcct tacctgcctt gatggctagt tgaagagaca ctattcattg aaactttaaa aaattccaat agttatgatc aaatttgcta ataacatcta ctatagattc taaggactac ttgtgatgcc tcaatatttg aaaaaaaaaa atctgtaa&t ttctgttteM gtgtctgagt ttattaatga tgccaatgtc gacagatatc cataatgcca aataaaccaa agttatactc tttattaaaa agcatcatct agtatctact tcttctcata ctcttggttt gtaaattcaa aaaaaaaac

1633 1693

1753 1813

1873 1933 1993

2053 2113 2173 2233

2293 2353 2412 <210> 8 <211>

<212>

<213>

304

PRT human

Met 1

Pro

Gly

Ala

Gin 65 lie

Arg

Phe

Asp

Phe 145 Glu

Glu

Gin

Pro <400> 8

Asn Arg Ala Phe Ser Arg Lys Lys 5

Glu Ala Leu Ser Lys His Phe He 2025

Ser Thr Glu Vai Glu Gin Pro Lys 3540

Vai Arg Lys Leu Lys Phe Ala Arg

5055

Lys He Pro Lys Vai Glu Leu Gin 70

Leu Glu Pro Lys Thr Lys Glu Vai 85 lie Ser Phe Cys Ala Asp Asp Lys 100105 lie Cys Lys Asp Ser Glu Ser Asn 115120

Ser Glu Lys Cys Ala Glu Glu He 130135

Asp Leu Ala Tyr Thr Lys Phe Leu 150

Thr Arg Lys Gin He Ala Gly Leu 165

Thr Glu Asn Met Glu Leu Lys Asn

180185

Leu Arg He Thr Gin Vai Ser Ala 195200

Lys Ser Pro Ser Thr Asp He Phe 210215

Asp Lys Thr Trp Met His Thr 1015

Pro Tyr Asn Ala Lys Phe Leu 30

Gly Thr Glu Vai Vai Arg Asp 45

His lie Lys Lys Ser Glu Gly 60

He Ser lie Tyr Gly Vai Lys 75 80

Gin His Asn Cys Gin Leu His 90 95

Thr Asp Lys Arg He Phe Thr 110

Lys His Leu Cys Tyr Vai Phe 125

Thr Leu Thr He Gly Gin Ala 140

Glu Ser Gly Gly Lys Asp Vai 155 160

Gin Lys Arg He Gin Asp Leu 170 175

Lys Vai Gin Asp Leu Glu Asn 190

Pro Pro Ala Gly Ser Met Thr 205

Asp Met He Pro Phe Ser Pro 220

He 225 Pro

Glu

He

Thr

Ser His Gin Ser Ser Met Pro Thr 230

Vai Pro Ser Arg Ser Thr Glu lie 245

Pro Phe Asp Pro Phe Asn Cys Gly 260265

Gin Ser Lys Leu Asp Glu Met Gin 275280

Leu Glu Gly Thr Vai Phe Cys Leu 290295

Arg Asn Gly Thr Gin Pro Pro

235 240

Lys Arg Asp Leu Phe Gly Ala 250 255

Ala Ala Asp Phe Pro Pro Asp 270

Glu Gly Phe Lys Met Gly Leu 285

Asp Pro Leu Asp Ser Arg Cys 300 <210> 9 <211> 429 <212> DNA <213> human <220>

<222> (1)...(429) <400> 9 cat aca cct gaa get tta tea aaa cat

His Thr Pro Glu Ala Leu Ser LysHis ttt ett ggc agt aca gaa gtg gaacag

Phe Leu Gly Ser Thr Glu Vai GluGin

2025 aga gat get gta agg aaa eta aagttt

Arg Asp Ala Vai Arg Lys Leu LysPhe

3540 gaa ggc cag aaa att cct aaa gtggag

Glu Gly Gin Lys lie Pro Lys VaiGlu

5055 gta aaa att eta gaa ccc aaa acaaag

Vai Lys lie Leu Glu Pro Lys ThrLys

6570 ett cat aga ata tet ttt tgt gca gat

Leu His Arg He Ser Phe Cys Ala Asp ttc act ttc ata tgc aaa gat tet gag

Phe Thr Phe He Cys Lys Asp Ser Glu

100105 gta ttt gac age gaa aag tgt getgaa

Vai Phe Asp Ser Glu Lys Cys AlaGlu

115120 :* %>*··<

ttc att ccc tat aat gca aag48

Phe He Pro Tyr Asn AlaLys

1015 cca aaa gga aca gaa gtt gtg96

Pro Lys Gly Thr Glu VaiVai gca aga cat ate aag aaa tet144

Ala Arg His He Lys LysSer ttg caa ata tea att tat gga192

Leu Gin lie Ser lie TyrGly gaa gtt caa cac aat tgc cag240

Glu Vai Gin His Asn CysGin

7580 gat aaa act gac aag agg ata288

Asp Lys Thr Asp Lys ArgHe

9095 tea aat aaa cat ttg tgc tat336

Ser Asn Lys His Leu CysTyr

110 gag ate act tta aca att ggc384

Glu He Thr Leu Thr He Gly

125 caa gca ttt gac ctg gca tac acg aaa

Gin Ala Phe Asp Leu Ala Tyr Thr Lys 130 135 ttt eta gaa tea gga gga 429

Phe Leu Glu Ser Gly Gly

140 <210> 10 <211> 143 <212> PRT <213> human <400> 10

His Thr Pro Glu Ala Leu Ser Lys His Phe 1 510

Phe Leu Gly Ser Thr Glu Vai Glu Gin Pro 2025

Arg Asp Ala Vai Arg Lys Leu Lys Phe Ala 3540

Glu Gly Gin Lys He Pro Lys Vai Glu Leu 5055

Vai Lys He Leu Glu Pro Lys Thr Lys Glu 6570

Leu His Arg He Ser Phe Cys Ala Asp Asp 8590

Phe Thr Phe He Cys Lys Asp Ser Glu Ser 100105

Vai Phe Asp Ser Glu Lys Cys Ala Glu Glu 115120

Gin Ala Phe Asp Leu Ala Tyr Thr Lys Phe

130135

He Pro Tyr Asn Ala Lys 15

Lys Gly Thr Glu Vai Vai 30

Arg His He Lys Lys Ser 45

Gin lie Ser He Tyr Gly 60

Vai Gin His Asn Cys Gin 75 80

Lys Thr Asp Lys Arg He 95

Asn Lys His Leu Cys Tyr 110 lie Thr Leu Thr He Gly 125

Leu Glu Ser Gly Gly 140 <210> 11 <211> 228 <212> DNA <220>

<221> CDS <222> (1) .. . (228) «·· · · · <400> 11 gca cct cca gca ggc agt atg aca ccf aag teg ccc tee act gac ate48

Ala Pro Pro Ala Gly Ser Met Thr Pro Lys Ser Pro Ser Thr Asp He

1015 ttt gat atg att cca ttt tet cca ata tea cac cag tet teg atg cct96

Phe Asp Met He Pro Phe Ser Pro lie Ser His Gin Ser Ser MetPro

2530 act ege aat ggc aca cag cca cet cca gta cet agt aga tet act gag144

Thr Arg Asn Gly Thr Gin Pro Pro Pro Vai Pro Ser Arg Ser ThrGlu

4045 att He aaa

Lys egg

Arg gac Asp ctg Leu ttt

Phe gga Gly gca

Ala gaa

Glu cct

Pro ttt Phe gac

Asp cca

Pro ttt

Phe aac

Asn tgt

Cys

192 gga Gly gca Ala gca

Ala gat Asp ttc

Phe cct Pro 70 cca Pro gat Asp att lie caa

Gin tea Ser 75 aaa

Lys

228 <210> 12 <211> 76 <212> PRT <213> human <400> 12

Ala Pro Pro Ala Gly Ser 1 5

Phe Asp Met He Pro Phe 20

Thr Arg Asn Gly Thr Gin 35 lie Lys Arg Asp Leu Phe 50

Gly Ala Ala Asp Phe Pro

70

Met Thr Pro Lys Ser Pro Ser 10

Ser Pro He Ser His Gin Ser 25

Pro Pro Pro Vai Pro Ser Arg 40 45

Gly Ala Glu Pro Phe Asp Pro 55 60

Pro Asp lie Gin Ser Lys

Thr Asp He 15

Ser Met Pro 30

Ser Thr Glu

Phe Asn Cys <210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<221>

<222>

<223>

2278

DNA Human

CDS (430) ... (1206) <221> misc_feature <222> (1) .. . (2278) <223> n = A,T,C or G <400> 13 ggtgatgagc ccttgggttc tcgctccgac tgetaaatte gettggeegg gtccaccttc tcgtggcctc actcgccacá cggatcagaa tccggagcag gcagttctct etattetgag gctcctgcgg ctgccgcgct gacttccctg tgtggnggag ggaactctgg gcaggctggt tttcttggaa tgtgtttacg atgttgaatg ggacttgaac aggaagetgg acgctgcagc tggaactagc gtgccaagtt atttatgatt ccatctgata tacataggag agaaaetgat agaagaattc tgatggcaac tgtatgatag aagetatata aagteaagtg tccattttct ttcaactata tttgagcata cccaggattt aagtegtgga actgaacatt tatttggctg

120

180

240

300

360

420 '«Μ **·♦·J

Met Asn Arg Ala Phe Ser Arg Lys Lys Asp Lys Thr Trp MH. · J .·. .

5 10 .'»*'

cat His 15

aca Thr

cct Pro

gaa Glu

get Ala

tta Leu 20

tea Ser

aaa Lys

cat His

ttc Phe

att lie 25

ccc Pro

tat Tyr

aat Asn

gca Ala

aag Lys 30

519

ttt

ett

ggc

agt

aca

gaa

gtg

gaa

cag

cca

aaa

gga

aca

gaa

gtt

gtg

567

Phe

Leu

Gly

Ser

Thr 35

Glu

Val

Glu

Gin

Pro 40

Lys

Gly

Thr

Glu

Val 45

Val

aga

gat

get

gta

agg

aaa

eta

aag

ttt

gca

aga

cat

ate

aag

aaa

tet

615

Arg

Asp

Ala

Val 50

Arg

Lys

Leu

Lys

Phe 55

Ala

Arg

His

He

Lys 60

Lys

Ser

gaa

ggc

cag

aaa

att

cct

aaa

gtg

gag

ttg

caa

ata

tea

att

tat

gga

663

Glu

Gly

Gin 65

Lys

He

Pro

Lys

Val 70

Glu

Leu

Gin

He

Ser 75

lie

Tyr

Gly

gta

aaa

att

eta

gaa

ccc

aaa

aca

aag

get

gaa

gag

ate

act

tta

aca

711

Val

Lys 80

lie

Leu

Glu

Pro

Lys 85

Thr

Lys

Ala

Glu

Glu 90

He

Thr

Leu

Thr

att

ggc

caa

gca

ttt

gac

ctg

gca

tac

acg

aaa

ttt

eta

gaa

tea

gga

759

He 95

Gly

Gin

Ala

Phe

Asp 100

Leu

Ala

Tyr

Thr

Lys 105

Phe

Leu

Glu

Ser

Gly 110

gga

aaa

gat

gtt

gaa

aca

aga

aaa

cag

ate

gca

ggg

tta

caa

aaa

aga

807

Gly

Lys

Asp

Val

Glu 115

Thr

Arg

Lys

Gin

He 120

Ala

Gly

Leu

Gin

Lys 125

Arg

ate

caa

gac

tta

gaa

aca

gaa

aat

atg

gaa

ett

aaa

aat

aaa

gta

caa

855

He

Gin

Asp

Leu 130

Glu

Thr

Glu

Asn

Met 135

Glu

Leu

Lys

Asn

Lys 140

Val

Gin

gat

ttg

gaa

aac

caa

ctg

aga

ata

act

caa

gta

tea

gca

cct

cca

gca

903

Asp

Leu

Glu 145

Asn

Gin

Leu

Arg

He 150

Thr

Gin

Val

Ser

Ala 155

Pro

Pro

Ala

ggc

agt

atg

aca

cct

aag

teg

ccc

tec

act

gac

ate

ttt

gat

atg

att

951

Gly

Ser 160

Met

Thr

Pro

Lys

Ser 165

Pro

Ser

Thr

Asp

He 170

Phe

Asp

Met

He

cca

ttt

tet

cca

ata

tea

cac

cag

tet

teg

atg

cct

act

ege

aat

ggc

999

Pro 175

Phe

Ser

Pro

He

Ser 180

His

Gin

Ser

Ser

Met 185

Pro

Thr

Arg

Asn

Gly 190

aca

cag

cca

cct

cca

gta

cct

agt

aga

tet

act

gag

att

aaa

egg

gac

1047

Thr

Gin

Pro

Pro

Pro 195

Val

Pro

Ser

Arg

Ser 200

Thr

Glu

He

Lys

Arg 205

Asp

ctg

ttt

gga

gca

gaa

cct

ttt

gac

cca

ttt

aac

tgt

gga

gca

gca

gat

1095

Leu

Phe

Gly

Ala 210

Glu

Pro

Phe

Asp

Pro 215

Phe

Asn

Cys

Gly

Ala 220

Ala

Asp

ttc

cct

cca

gat

att

caa

tea

aaa

tta

gat

gag

atg

cag

gag

ggg

ttc

1143

Phe

Pro

Pro

Asp

He

Gin

Ser

Lys

Leu

Asp

Glu

Met

Gin

Glu

Gly

Phe

225

230

235

aaa

atg

gga

eta

act

ett

gaa

ggc

aca

gta

ttt

tgt

etc

gac

ccg

tta

1191

Lys

Met

Gly

Leu

Thr

Leu

Glu

Gly

Thr

Val

Phe

Cys

Leu

Asp

Pro

Leu

240

245

250

gac agt agg tgc tga catcaagaac aagaaatcct gattcatgtt aaatgtgttt 1246 Asp Ser Arg Cys * 255 gtatacacat tttgaatatt tctgtaattt tctgtttcta tgtctgagtt tattaatgat gccaatgtca acagatatca ataatgccac ataaaccaaa gttatactct ttattaaaaa gcatcatctg gtatctacta cttctcatat tcttggtttt taaattcaat aaaaaactcg gtcatttatt ttaatatttt ttattttaaa ctgtagatga ctatttagtt ttcccaaaag aactaaacat ttttatgtat aaggtcacta tgtatttaga aaatatttaa acattaaatt atttgatatt cccatattta tttcttcttt gatactttaa ctgtatttgt ag attattactt gaaaattttc aacagcttac atttgtaatt agcatcttga ccatacctta gttctgtttt aaatactgtt atttctagca gtatttatta tttgttttat tcattccaaa ccctaaaaaa ctttaccaaa gatgaagata aatctgtggc tttgttaaag taagaCaggt tcagttaaat tgtaaagtag gaaagacata aatttgtatt aagataactt taaaccaaca cacatcactg ggtaaaatta gtaaatgcaa aaaggtagtg tgagataagt catttggaat tatatttctc tttttcacca acccgttcta tcaaaaatct attattcatg ttcctcacct atcatacttt ttatacaaat cattttccag tttaaattct aacatgttac ggaaaatgta taaggatata ggtgatgtta aaaaaatgaa gatattacta atatgctatc ctcactgcat aagtttattt catgaattat cattttccaa tgtcaatgt*?* tcactat tga⁴ tatgttcctt acctgccttg atggctagtt gaagagacat tattcattgg aactttaaac aattccaata gttatgatca aatttgctat taacatctaa tatagattca aaggactact tgtgatgccc caatatttgg aaaaaaaaaa

,.?3S6 *.->·

1426

1486

1546

1606

1666

1726

1786

1846

1906

1966

2026

2086

2146

2206

2266

2278 <210>

<211>

<212>

<213>

258 PRT Human <400> 14

Met Asn Arg Ala Phe Ser Arg Lys Lys Asp Lys Thr Trp Met His Thr 15 1015

Pro Glu Ala Leu Ser Lys His Phe lie Pro Tyr Asn Ala Lys Phe Leu 20 2530

Gly Ser Thr Glu Vai Glu Gin Pro Lys Gly Thr Glu Vai Vai Arg Asp 35 4045

Ala Vai Arg Lys Leu Lys Phe Ala Arg His lie Lys Lys Ser Glu Gly 50 5560

Gin Lys lie Pro Lys Vai Glu Leu Gin He Ser He Tyr Gly VaiLys

70 7580

He Leu Glu Pro Lys Thr Lys Ala Glu Glu lie Thr Leu Thr HeGly

9095

Gin Ala Phe Asp Leu Ala Tyr Thr Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Lys 100 105110

Asp Vai Glu Thr Arg Lys Gin He Ala Gly Leu Gin Lys Arg He Gin 115 120125

Asp Leu Glu Thr Glu Asn Met Glu Leu Lys Asn Lys Vai Gin Asp Leu 130 135140

Glu Asn Gin Leu Arg lie Thr Gin Vai Ser Ala Pro Pro Ala GlySer

145 150 155160

Met Thr Pro Lys Ser Pro Ser Thr Asp He Phe Asp Met He ProPhe

165 170175

Ser Pro He Ser His Gin Ser Ser Met Pro Thr Arg Asn Gly Thr Gin 180 185190

Pro Pro Pro Vai Pro Ser Arg Ser Thr Glu He Lys Arg Asp Leu Phe 195 200205

Gly Ala Glu Pro Phe Asp Pro Phe Asn Cys Gly Ala Ala Asp Phe Pro 210 215220

Pro Asp He Gin Ser Lys Leu Asp Glu Met Gin Glu Gly Phe LysMet

225 230 235240

Gly Leu Thr Leu Glu Gly Thr Vai Phe Cys Leu Asp Pro Leu AspSer

245 250255

Arg Cys <210> 15 <211> 915 <212> DNA <213> Human <220>

<221> CDS <222> (1)...(915)

<400> 15 atg aac cgt ggt ttt age agg aag

Met Asn Arg Gly Phe Ser ArgLys cct gaa get tta tea aaa catttc

Pro Glu Ala Leu Ser Lys HisPhe ggc agt aca gaa gtg gaa cagcca

Gly Ser Thr Glu Vai Glu GinPro

3540 get gta agg aaa eta aag tttgca

Ala Vai Arg Lys Leu Lys PheAla

5055 cag aaa att cct aaa gtg gagttg

Gin Lys He Pro Lys Vai GluLeu

6570 att eta gaa ccc aaa aca aag gaa

He Leu Glu Pro Lys Thr Lys Glu gac aaa aca tgg atg cat aca* ' Í8

Asp Lys Thr Trp Met His Thr

15 ccc tat aat gca aag ttt ett 96

Pro Tyr Asn Ala Lys Phe Leu 30 gga aca gaa gtt gtg aga gat 144

Gly Thr Glu Vai Vai Arg Asp 45 cat ate aag aaa tot gaa ggc192

His lie Lys Lys Ser Glu Gly ata tea att tat gga gta aaa240

He Ser lie Tyr Gly VaiLys

7580 caa cac aat tgc cag ett cat288

Gin His Asn Cys Gin LeuHis

9095 aga ata tet ttt tgt gca gat gat

Arg He Ser Phe Cys Ala Asp Asp 100 ttc ata tgc aaa gat tet gag tea

Phe He Cys Lys Asp Ser Glu Ser

115120 gac age gaa aag tgt get gaagag

Asp Ser Glu Lys Cys Ala GluGlu

130135 ttt gac ctg gca tac agg aaattt

Phe Asp Leu Ala Tyr Arg LysPhe

145150 gaa aca aga aaa cag ate gca ggg

Glu Thr Arg Lys Gin He Ala Gly

165 gaa aca gaa aat atg gaa ett aaa

Glu Thr Glu Asn Met Glu LeuLys

180 caa ctg aga ata act caa gtatea

Gin Leu Arg He Thr Gin VaiSer

195200 cct aag teg ccc tcc act gacate

Pro Lys Ser Pro Ser Thr AspHe

210215 ata tea cac cag tot teg atgcct lie Ser His Gin Ser Ser MetPro

225230 cca gta cct agt aga tot act gag

Pro Vai Pro Ser Arg Ser Thr Glu

245 gaa cct ttt gac cca ttt aac tgt

Glu Pro Phe Asp Pro Phe Asn Cys

260 act gac aag agg ata ttc act336

Thr Asp Lys Arg He PheThr

110 aaa cat ttg tgc tat gta ttt384

Lys His Leu Cys Tyr VaiPhe

125 act tta aca att ggc caa gca432

Thr Leu Thr lie Gly GinAla

140 gaa tea gga gga aaa gat gtt480

Glu Ser Gly Gly Lys AspVai

155160 caa aaa aga ate caa gac tta528

Gin Lys Arg He Gin AspLeu

170175 aaa gta caa gat ttg gaa aac576

Lys Vai Gin Asp Leu GluAsn

190 cct cca gca ggc agt atg aca624

Pro Pro Ala Gly Ser MetThr

205 gat atg att cca ttt tet cca672

Asp Met He Pro Phe Ser Pro

220 ege aat ggc aca cag cca cct 720

Arg Asn Gly Thr Gin Pro Pro

235240 aaa egg gac ctg ttt gga gca 768

Lys Arg Asp Leu Phe Gly Ala

250255 gca gca gat ttc cct cca gat816

Ala Ala Asp Phe Pro Pro Asp

270 att caa tea aaa tta gat gag atg cag lie Gin Ser Lys Leu Asp Glu Met Gin

275 280 act ett gaa ggc aca gta ttt tgt etc

Thr Leu Glu Gly Thr Val Phe Cys Leu

290 295 tga ggg ttc aaa atg gga ofta, · · .«964.* j · Gly Phe Lys Met Gly L’éti.....

285 ccg tta gac agt agg tgc 912

Pro Leu Asp Ser Arg Cys

300

915 <210> 16 <211> 304 <212> PRT <213> Human <400> 16

Met Asn Arg Gly Phe Ser Arg Lys Lys 15

Pro Glu Ala Leu Ser Lys His Phe lie

2025

Gly Ser Thr Glu Val Glu Gin Pro Lys 3540

Ala Val Arg Lys Leu Lys Phe Ala Arg

5055

Gin Lys lie Pro Lys Val Glu Leu Gin 6570

He Leu Glu Pro Lys Thr Lys Glu Val 85

Arg lie Ser Phe Cys Ala Asp Asp Lys 100105

Phe He Cys Lys Asp Ser Glu Ser Asn 115120

Asp Ser Glu Lys Cys Ala Glu Glu He 130135

Phe Asp Leu Ala Tyr Arg Lys Phe Leu 145150

Glu Thr Arg Lys Gin He Ala Gly Leu 165

Glu Thr Glu Asn Met Glu Leu Lys Asn 180185

Gin Leu Arg He Thr Gin Val Ser Ala 195200

Pro Lys Ser Pro Ser Thr Asp lie Phe 210215

He Ser His Gin Ser Ser Met Pro Thr

225230

Pro Val Pro Ser Arg Ser Thr Glu He 245

Glu Pro Phe Asp Pro Phe Asn Cys Gly 260265

He Gin Ser Lys Leu Asp Glu Met Gin 275280

Thr Leu Glu Gly Thr Val Phe Cys Leu

290295

Lys	Thr	Trp	Met	His 15	Thr
Tyr	Asn	Ala	Lys	Phe	Leu
			30
Thr	Glu	Val	Val	Arg	Asp
		45
He	Lys	Lys	Ser	Glu	Gly
	60
Ser	He	Tyr	Gly	Val	Lys
75					80
His	Asn	Cys	Gin	Leu	His
				95
Asp	Lys	Arg	lie	Phe	Thr
			110
His	Leu	Cys	Tyr	Val	Phe
		125
Leu	Thr	He	Gly	Gin	Ala
	140
Ser	Gly	Gly	Lys	Asp	Val
155					160
Lys	Arg	He	Gin	Asp	Leu
				175
Val	Gin	Asp	Leu	Glu	Asn
			190
Pro	Ala	Gly	Ser	Met	Thr
		205
Met	He	Pro	Phe	Ser	Pro
	220
Asn	Gly	Thr	Gin	Pro	Pro
235					240
Arg	Asp	Leu	Phe	Gly	Al a
				255
Ala	Asp	Phe	Pro	Pro	Asp
			270
Gly	Phe	Lys	Met	Gly	Leu
		285
Pro	Leu	Asp	Ser	Arg	Cys
	300

<210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence

100 <220>

<223> primer <400> 17 ggattcaaac gatccgatg

<210>	18
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Artificial
<220>
<223>	Primer

Sequence <400> 18 gaatctgtcc atcgcattgc

<210>	19
<211>	19
<212>	DNA
<213>	Artificial Sequence

<220>

<223> primer <400> 19 gaatttcttt gggtagaca <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> primer <400> 20 gctctgaaga actgtga <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> primer <400> 21 gacgaggtga agcgattgtg

<210>	22
<211>	18
<212>	DNA
<213>	Artificial Sequence

<220>

<223> primer <400> 22 gggatcaaac gaatcatc <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> primer

101 gtttaattac ccaagtttga g

<210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> primer <400> 24 ggttttaacc cagttactca ag <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> primer <400> 25 taatacgact cactataggg aga <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> primer <400> 26 attaaccctc actaaaggga <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> primer <400> 27 ggggtaccga attctgatgg caac <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> primer <400> 28 cgagctcgat caatagtgaa ggtgagg <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> primer <400> 29 gaatgttctc atttattg <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence

102 <220>

<223> primer <400> 30 acaattgcca gcttcatag <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> primer <400> 31 ctgttttctt gtttcaacat c <210> 32 <211> 148 <212> PRT <213> Caenorhabditis elegáns <400> 32 His Pro Pro Asp 1

Phe Leu Gly Cys 20 Arg Glu Ala lie

Glu Gin Thr Arg 50

Ser lie Asp Asn 65

Tyr Thr Phe Pro

Asp Lys Arg Met 100 Lys Pro Ser Cys

115 Thr Leu Thr He 130

Asp Lys Asn Arg 145

Tyr Leu He Asn 5

Vai Glu Thr Pro

His Ala He Arg 40

Glu Thr Ala Lys 55

Vai lie He Ala 70

Leu Gly Arg He 85

Phe Ser Phe He

Tyr Ala Phe Thr

120

Gly Glu Ala Phe 135

Gly His Vai Glu 10

Lys Ala Asn Gly 25

Phe Gin Arg Asp

Leu Gin Lys Vai

Asp He Lys Thr 75

Ser Phe Cys Ala 90

Ala Arg Ala Glu 105

Ser Glu Lys Leu

Asp Leu Ala Tyr

140

Tyr Vai Ala Arg 15

Ser Asp Vai Ala 30

Leu Lys Arg Ser 45

Glu He Arg lie

Lys Ala Pro Met 80

Asp Asp Lys Asp 95

Gly Ala Ser Gly 110

Ala Glu Asp lie 125

Lys Arg Phe Leu <210> 33 <211> 93 <212> PRT <213> Caenorhabditis Briggsae <400> 33 His Pro Pro Asp 1

Phe Leu Gly Cys 20 Arg Glu Ala He

Glu Gin Thr Arg 50

Ser He Asp Tyr 65

Tyr Gin Phe Gin

Phe Leu He Asn 5

Vai Glu Thr Ala

His Ala He Arg 40

Glu Thr Ala Lys 55

Vai Arg Vai Asp 70

Leu Pro Arg He 85

Gly His Vai Glu 10

Lys Glu Asn Gly 25

Phe Gin Arg Asp

Leu Gin Lys Vai 60

Asp Ala Lys Thr 75

Ser Phe Cys Ala 90

Tyr Gly Ala Arg 15

Thr Ala Vai Ala 30

Leu Lys Arg Ser 45

Glu He Lys He

Lys Thr Met Met

Asp

103 <210> 34 <2H> 107 <212> PRT <213> Human Est <220>

< 223> Xaa-any amino acid < 223> Xaa-any amino acid < 221> VARIANT < 222> (1) .. . (107) <223> Xaa - Any Amino Acid <400> 34

Phe Ala Arg His lie Lys Lys Ser 15

Val Glu Leu Gin He Ser lie Tyr 20

Thr Lys Glu Val Gin Xaa Gin Leu 3540

Ser Phe Cys Ala Asp Asp Lys Thr 5055

Cys Lys Asp Ser Glu Ser Asn Lys 6570

Glu Lys Cys Ala Glu Glu lie Thr 85

Leu Ala Tyr Arg Lys Phe Leu Glu 100 <210> 35 <2H> 171 <212> PRT <213> Human SHC <400> 35

His Pro Asn Asp Lys Val Met Gly 15

Tyr Met Gly Cys Val Glu Val Leu 20

Asn Thr Arg Thr Gin Val Thr Arg 3540

Ala Val Pro Gly Ala Lys Gly Ala 5055

Arg Pro Leu Ser Ser He Leu Gly 6570

Met Pro He Thr Leu Thr Val Ser 85

Ala Asp Cys Lys Gin He He Ala 100

Phe Ala Ser Gly Gly Asp Pro Asp 115120

Ala Lys Asp Pro Val Asn Gin Arg 130135

Glu Gly Leu Ala Gin Asp Val He

145150

Leu Arg Phe Lys Gin Tyr Leu Arg 165 <210> 36 <211> 165 <212> PRT <213> Drosophila SHC

Glu Glu Gly Gin Lys He Pro Lys 10 15

Gly Val Lys He Leu Glu Pro Lys 25 30

Pro Asn Cys Gin Leu His Arg He 45

Asp Lys Arg He Phe Thr Phe lie 60

His Leu Cys Tyr Val Phe Asp Ser 7580

Leu Thr He Gly Gin Ala Phe Xaa 9095

Ser Gly Gly

105

Pro Gly Val Ser Tyr Leu Val Arg 1015

Gin Ser Met Arg Ala Leu Asp Phe

2530

Glu Ala He Ser Leu Val Cys Glu 45

Thr Arg Arg Arg Lys Pro Cys Ser 60

Arg Ser Asn Leu Lys Phe Ala Gly 7580

Thr Ser Ser Leu Asn Leu Met Ala 9095

Asn His His Met Gin Ser He Ser

105HO

Thr Ala Glu Tyr Val Ala Tyr Val 125

Ala Cys His lie Leu Glu Cys Pro 140

Ser Thr lie Gly Gin Ala Phe Glu

155 160

Asn Pro Pro

170

104

Tyr Pro Asp Asp Val He Met Gly Val 15

Tyr Thr Gly Cys Val Glu Val Lys Thr 2025

Glu Thr Arg Thr Gin Leu Ala Arg Glu 3540

Ala Ala Gly Leu Lys Ser Ala Gly Lys 5055

Ser Asp Arg Pro Ser Met Gin His Ala 6570

Val Ser Ser Arg Ala Leu Ser Leu Ser 85

He Ala Asn His Asn Met Pro Arg He 100105

Asn Asp Thr Leu Asp Phe Leu Ala Tyr 115120

Trp Arg Ala Cys Tyr Val Leu Glu Cys 130135

Leu lie Val Thr He Gly Lys Ala Phe

145150

Ser Arg Leu Asn Asp 165 <210> 37 <211> 137 <212> PRT <213> Drosophila Numb <400> 37

Ala Asp Glu Glu Ala Val Arg Ser Ala 15

Tyr Leu Gly Cys Val Glu Val Phe Glu 2025

Glu Glu Ala Leu Lys Val Leu Arg Gin 3540

Gly Leu Leu His Val Ser Gly Asp Gly 5055

Thr Lys Gly Leu lie Val Asp Gin Thr 6570

Ala Pro Asp Arg Asn His Glu Arg Gly ⁸⁵

Gly Thr Thr Arg Arg Trp Met Cys His 100105

Ser Gly Glu Arg Leu Ser His Ala Val 115120

Leu Glu Arg Lys Gin Arg Arg Asp Lys

130135 <210> 39 <211> 141 <212> PRT <213> P96 <400> 38

Tyr Leu Leu Ala Arg Phe Lys Gly Asp 15

Leu He Gly He Asp Asp Val Pro Asp 2025

Gin Asp Ser Met Met Lys Leu Lys Gly 3540

Gin Gly Gin His Lys Gin Arg He Trp 5055 lie Lys lie He Asp Glu Lys Thr Gly

6570

Val Asn Lys He Ser Phe He Ala Arg 85

Phe Gly Tyr Val Cys Gly Gly Glu Gly

100105

Lys Thr Gly Gin Gin Ala Glu Pro Leu

Val Ala Phe Asn Val A«*g, · ; . ·. : ·.

........

Met Lys Ser Leu Asp Phe

He Asn Arg Val Cys Glu

Arg Leu Thr Asn Phe He

Thr Asn He He He Asn

80

Val Glu Thr Gly Glu Val

Phe Ala Ser Gly Gly Asp

110

Ala Lys Asn Glu Asp Glu

125

Gly Gly Gin Ser Glu Asp

140

Leu Arg Phe Asn Ala Leu

155 160

Cys Ser Phe Ser Val Lys 15

Arg Gly Met Gin Val Cys 30

Arg Arg Arg Pro Val Arg 45

Arg Val Val Asp Asp Glu 60

Glu Lys Val Ser Phe Cys 75 80

Ser Tyr He Cys Arg Asp 95

Phe Leu Ala Cys Lys Asp 110

Cys Ala Phe Ala Val Cys 125

Val Lys Tyr Lys Ala Lys 15

Arg Gly Asp Lys Met Ser 30

Ala Ala Ala Gly Arg Ser 45

Asn lie Ser Leu Ser Gly 60 lie Glu His Glu His Pro

80

Val Thr Asp Asn Arg Ala 95

His Gin Phe Phe Ala He 110

Val Asp Leu Lys Asp Leu

105 ...............

Phe Gin Val lie Tyr Asn Val Lys Lys Lys Glu Glu Asp t.j.

130 135 140 <210> 39 <211> 139 <212> PRT <213> Drosophila Disabled <400> 39

Asn Asp Pro Gly Arg Phe Phe Gly Asp Gly Val Gin Phe Lys Alá Lys 15 1015

Leu lie Gly lie Leu Glu Val Gly Glu Ala Arg Gly Asp Arg Met Cys

2530

Gin Glu Ala Leu Gin Asp Leu Lys Met Ala lie Arg Ala Ala Gly Glu

4045

His Lys Gin Arg lie Thr lie His Val Thr lie Asp Gly Leu Arg Leu

5560

Ara Asp Glu Lys Thr Gly Asp Ser Leu Tyr His His Pro Val HisLys

70 7580 lie Ser Phe lie Ala Gin Asp Met Thr Asp Ser Arg Ala Phe GlyTyr

9095 lie Phe Gly Ser Pro Asp Ser Gly His Arg Phe Phe Gly lie Lys Thr

100 105110

Asp Lys Ala Ala Ser Gin Val Val Leu Ala Met Arg Asp Leu Phe Gin 115 120125

Val Val Phe Glu Leu Lys Lys Lys Glu lie Glu

130135 <210> 40 <211> 139 <212> PRT <213> Caenorhabditis elegáns M110.5 <400> 40

Ser Asp Pro Phe Arg Phe Gin Asn Asn Gly lie Ser Tyr Lys Gly Lys 15 1015

Leu lie Gly Glu Gin Asp Val Asp Lys Ala Arg Gly Asp Ala Met Cys 20 2530

Ala Glu Ala Met Arg Thr Ala Lys Ser lie lie Lys Ala Ala Gly Ala 35 4045

His Lys Thr Arg lie Thr Leu Gin lie Asn lie Asp Gly lie Lys Val 50 5560

Leu Asp Glu Lys Ser Gly Ala Val Leu His Asn Phe Pro Val SerArg

70 7580 lie Ser Phe lie Ala Arg Asp Ser Ser Asp Ala Arg Ala Phe GlyLeu

9095

Val Tyr Gly Glu Pro Gly Gly Lys Tyr Lys Phe Tyr Gly lie Lys Thr 100 105110

Ala Gin Ala Ala Asp Gin Ala Val Leu Ala lie Arg Asp Met Phe Gin 115 120125

Val Val Phe Glu Met Lys Lys Lys Gin lie Glu

130135 <210> 41 <211> 79 <212> PRT <213> Drosophila EST <400> 41

Lys Lys Leu Glu Ile Thr Ile Ser lie Lys Gly Val Ala lie Gin Glu 15 1015

Pro Arg Thr His Lys lie Leu His Gin Phe Pro Leu Tyr Asn lie Ser 20 2530

Tyr Cys Ala Asp Glu Lys Gly Val Lys Lys Phe Phe Ser Phe lie Ala 35 4045

Glu Cys Phe Val Phe lie Ser Asn Lys Leu Ala Ser Asp lie Thr Leu 50 5560

106 <210> 42 <211> 429 <212> DNA <213> human EST R65983 <220>

<221> misc_feature <222> (1).··(429) <223> n = A,T,C or G <400> 42 cttgaaacgg gnaaccgggc cnctgcaagc nggaactacc gtgcccaagt tatttatgan ccccacctga tatacatggg agagaaactg atagaagaat tctgatggca actgtatgat agaagctata taaagtcaag tgtccatttt ctttcaacta tatttgagca tacccaggat ttaagtcgtg gaactgaaca tttatttggc tgatcctcat catgaaccgt gcttttagca ggaagaaaga caaaacatgg atgcatacac ctgaagcttt atcaaaacat ttcattccct ataatgcaaa gtttcttggc agtacagaag tggaacagcc aaaaggaaca gaagttgtga gagatgctgt aaggaaacta aagtttgcaa gacatntcaa gaaatctgaa ggccaaaaaa aaaaaaaag <210> 43 <211> 623 <212> DNA <213> PCR Fragment <400> 43 aagaattctg atggcaactg tatgatagaa gctattataa agtcaagtgt ccattttctt tcaactatat ttgagcatac ccaggattta agtcgtggaa ctgaacattt atttggctga tcctcatcat gaaccgtgct tttagcagga agaaagacaa aacatggatg catacacctg aagctttatc aaaacatttc attccctata atgcaaagtt tcttggcagt acagaagtgg aacagccaaa aggaacagaa gttgtgagag atgctgtaag gaaactaaag tttgcaagac atatcaagaa atctgaaggc cagaaaattc ctaaagtgga gttgcaaata tcaatttatg gagtaaaaat tctagaaccc aaaacaaagg aagttcaaca caattgccag cttcatagaa tatctttttg tgcagatgat aaaactgaca agaggatatt cactttcata tgcaaagatt ctgagtcaaa taaacatttg tgctatgtat ttgacagcga aaagtgtgct gaagagatca ctttaacaat tggccaagca tttgacctgg catacacgaa atttctagaa tcaggaggaa aagatgttga aacaagaaaa cag <210> 44 <211> 1711 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Human Est hbc 3123

120 180 240 300 360 420 480 540 600 623 <400> 44 caattgccag cttcatagaa tatctttttg tgcagatgat aaaactgaca agaggatatt 60 cactttcata tgcaaagatt ctgagtcaaa taaacatttg tgctatgtat ttgacagcga 120 aaagtgtgct gaagagatca ctttaacaat tggccaagca tttgacctgg catacacgaa 180 atttctagaa tcaggaggaa aagatgttga aacaagaaaa cagatcgcag ggttacaaaa 240 aagaatccaa gacttagaaa cagaaaatat ggaacttaaa aataaagtac aagatttgga 300 aaaccaactg agaataactc aagtatcagc acctccagca ggcagtatga cacctaagtc 360 gccctccact gacatctttg atatgattcc attttctcca atatcacacc agtcttcgat 420 gcctactcgc aatggcacac agccacctcc agtacctagt agatctactg agattaaacg 480 ggacctgttt ggagcagaac cttttgaccc atttaactgt ggagcagcag atttccctcc 540 agatattcaa tcaaaattag atgagatgca ggaggggttc aaaatgggac taactcttga 600 aggcacagta ttttgtctcg acccgttaga cagtaggtgc tgacatcaag aacaagaaat 660 cctgattcat gttaaatgtg tttgtataca catgtcattt attattatta ctttaagata 720

107 aatttcctca tagatcatac atattataca attcattttc ctttttaaat acaaacatgt ctgggaaaat ttataaggat caaggtgatg gtgaaaaaat agtgatatta aatatatgct ctcctcactg ccaaagttta ctacatgaat tctcattttc ccttcactat ttttatgttc aatacctgcc cagatggcta tctgaagaga tactattcat gtaaacttta ataaattcca ttagttatga gaaaatttgc ctataacatc atctatagat cataaggact ttttgtgatg tatcaatatt caaaaaaaaa tgatctgtaa ctttctgttt ttgtgtctga gtttattaat catgccaatg tggacagata aacataatgc ataataaacc tcagttatac tatttattaa taagcatcat tcagtatcta actcttctca ccctcttggt tggtaaattc aaaaaaaaaa tttttatttt ctactgtaga gttctattta gatttcccaa taaaactaaa tcattttatg cacaaggtca aaatgtattt tctaaatatt aaaacattaa ctgatttgat ctacccatat tattttcttc tttgatactt aatctgtatt c aaaaacagct tgaatttgta gttagcatct aagccatacc catgttctgt tataaatact ctaatttcta agagtattta taatttgttt atttcattcc attccctaaa ttactttacc tttgatgaag taaaatctgt tgttttgtta tactgt?aa.ag attgaa’A^ad* tgaaatttgt ttaaagataa ttttaaacca gttcacatca gcaggtaaaa ttagtaaatg tataaaggta aaatgagata aaacatttgg aaatatattt atatttttca ggcacccgtt aagtcaaaaa : .· rn :.:

• 90'0

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1711 <210> 45 <211> 478 <212> DNA <213> Human Est r65882 <220>

<221> misc_feature <222> (1)...(478) <223> n - A,T,C or G <400> 45 gctaaattcg cttggccggg tccaccttct cgtggcctca ctcgccacac ggatcagaat60 ccggagcagg cagttctctc tattctgagg ctcctgcggc tgccggctga cttccctgtg120 tgcgggaggg aactctgggc aggctggttt tcttggaatg tgtttacgat gttgaatggg180 acttgaacag gaagctggac gctgcagctg gaactagcgt gccaagttat ttatgattcc240 atctgatata cataggagag aaactgatag aagaattctg atggcaactg tatgatagaa300 gctatataaa gtcaagtgtc cattttcttt caactatatt tgagcatacc cagggtttaa360 gtcgtggaac tgaacattta tttggctgat cctcatcatg gaaccgtgct tttagcagga420 agaaagacaa aacatgggtg ctnacacctg aagnttatca aaacnttctt tccnattt478 <210> 46 <211> 415 <212> DNA <213> human est aal59394 <220>

<221>

<222>

misc_feature (1) . . . (415)

<223:	> n - A,T,C	or G
<400;	> 46
ggtgatgagc	ccttgggttc	tcgctccgac	tgetaaatte	gettggeegg	gtccaccttc	60
tcgtggcctc	actcgccaca	cggatcagaa	tccggagcag	gcagttctct	etattetgag	120
gctcctgcgg	cntgccngcg	tgacttcccg	tgtgtggngg	agggaactct	gggcaggctg	180
gttttcttgg	aatgtgttta	cgatgttgaa	tgggacttga	acaggaagct	ggaegetgea	240
gctggaacta	gcgtgccaag	ttatttatga	ttccatctgn	tatacatagg	agagaaaett	300
gatagaagaa	ttctgatggc	aactgtatga	tagaagetat	ataaagteaa	gtgtccattt	360
tctttcaact	atatttgagc	atacccagga	tttaagtegt	ggaactgaac	attat	415

<210> 47 <211> 507 <212> DNA <213> Human Est the 117484 <220>

<221> misc_feature <222> (1). . . (507) <223> n = A,T,C or G <400> 47 tgatgagccc ttgggttctc gctccgactg etaaattege ttggccgggt ccaccttctc

108 tcctgcggct gccggctgac ttccctgtgt gcgggaggga actctgggca ggctg<j£ttit.: IM J.J.

cttggaatgt gtttacgatg ttgaatggga cttgaacagg aagctggacg ctgcagctgg240 aactagcgtg ccaagttatt tatgattcca tctgatatac ataggagaga aactgataga300 agaattctga tggcaactgt atgatagaag ctatataaag tcaagtgtcc attttctttc360 aactatattt gagcataccc agggtttaag tcgtggaact gaacatttat ttggctgatc420 ctcatcatgg aaccgtgctt ttagcaggaa gaaagacaaa acatgggtgc tnacacctga480 agnttatcaa aacnttcttt ccnattt <210> 48 <211> 478 <212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> Human Est r65982 < 221> misc_feature < 222> (1) . . . (478) <223> n - A,T,C or G <400> 48 gctaaattcg cttggccggg tccaccttct cgtggcctca ctcgccacac ggatcagaat60 ccggagcagg cagttctctc tattctgagg ctcctgcggc tgccggctga cttccctgtg120 tgcgggaggg aactctgggc aggctggttt tcttggaatg tgtttacgat gttgaatggg180 acttgaacag gaagctggac gctgcagctg gaactagcgt gccaagttat ttatgattcc240 atctgatata cataggagag aaactgatag aagaattctg atggcaactg tatgatagaa300 gctatataaa gtcaagtgtc cattttcttt caactatatt tgagcatacc cagggtttaa360 gtcgtggaac tgaacattta tttggctgat cctcatcatg gaaccgtgct tttagcagga420 agaaagacaa aacatgggtg ctnacacctg aagnttatca aaacnttctt tccnattt478 <210> 49 <211> 237 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Human Est aa369714 <221> misc_feature <222> (1) . . . (237) <223> n « A,T,C or G <400> 49 tgatgagccc ttgggttctc gctccgactg ctaaattcgc ttggccgggt ccaccttctc 60 gtggcctcac tcgccacacg gatcagaatc cggagcaggc agttctntct attctgaggc 120 tcctncggct gccgcgctga cttccctgtg tgcgggaggg aactctgggc aggctggttt 180 tnttggaatg tgtttacgat tgttgaatgg gacttgaaca ggaagctgga cgctgca 237 <210> 50 <211> 353 <212> DNA <213> Human EST GA102 <400> 50 tacaagtcag tgtccatttt ctttcaacta tatttgagca tacccaggat ttaagtcgtg60 gaactgaaca tttatttggc tgatcctcat catgaaccgt gcttttagca ggaagaaaga120 caaaacatgg atgcatacac ctgaagcttt atcaaaacat ttcattccct ataatgcaaa180 gtttcttggc agtacagaag tggaacagcc aaaaggaaca gaagttgtga gagatgctgt240 aaggaaacta aagtttgcaa gacatatcaa gaaatctgaa ggccagaaaa ttcctaaagt300 ggagttgcaa atatcaattt atggagtaaa aattctagaa cccaaaacaa agg353 <210> 51 <211> 301 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

109 <221> misc_feature <222> (1)...(301) <223> n = A,T,C or G <400> agtttgcaag tatcaattta gcttcataga atgcaaagat aagtatccca g acatatcaag tggagtaaaa atatcttttt tctcagtcaa gatgttgtag aaatctgaag attctagaac gtgcagatga ataaacattt gggtggtttg gccagaaaat ccaaaacaaa taaaactgac gtgctatgta ttctgtttta tcctaaagtg ggaagttcaa aagaggatat tttgacagcg taagnccggg gagttgcaaa cacaatgcca tcactttcat aaaagtgtgt gattgtcctt

120

180

240

300

301 <210> 52 <211> 226 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Human Est Ő82787 <221> misc_feature <222> (1)...(226) <223> n - A,T,C or G <400> 52 caattcccag cttcatagna atatcttggg nctgcagata aataaacatt tgtgctatgt atttgacagc gnaaaagtgt gctgaagaga tcactttaac aattggccaa gcatttgnnc tggcatacag gaaatttctn gaatcaggag gaaaagatgt tgaaacaaga aaacagatcg cagggttaca aaaaagactc cangacttag aaacagaaaa tatggt

120 180 226 <210> 53 <211> 334 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Human Est aa307982 <400> gtgctgaaga tagaatcagg tccaagactt aactgagaat ccactgacat ctcgcaatgg gatcacttta aggaaaagat agaaacagaa aactcaagta ctttgatatg cacacagcca acaattggcc gttgaaacaa aatatggaac tcagcacctc attccatttt cctccagtac aagcatttga gaaaacagat ttaaaaataa cagcaggcag ctccaatatc ctag cctggcatac cgcagggtta agtacaagat tatgacacct acaccagtct aggaaatttc caaaaaagaa ttggaaaacc aagtcgccct tcgatgccta

120 180 240 300 334 <210> 54 <211> 431 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Human Est pGAlOl <400> 54 tctagaatca ggaggaaaag atgttgaaac aagaaaacag atcgcgaggg ttacaaaaaa60 gaatccaaga cttagaaaca gaaaatatgg aacttaaaaa taaagtacaa gatttggaaa120 accaactgag aataactcaa gtatcagcac ctccagcagg cagtatgaca cctaagtcgc180 cctccactga catctttgat atgattccat tttctccaat atcacaccag tcttcgatgc240 ctactcgcaa tggcacacag ccacctccag tacctagtag atctactgaa gattaaacgg300 gacctgtttg gagcagaacc ttttgaccca tttaactgtg gagcagcaga tttccctcca360 gatattcaat caaaattaga tgagatgcag gaggggttca aaatgggact aactcttgaa 420 aggcacagta t

110 < 211> 493 ···. J < 212> DNA < 213> Artificial Sequence < 220>

< 223> Human Est GA107 < 221> misc_feature < 222> (1)...(493) <223> η - Α,Τ,Ο or G <400> 55 aaaaataaag tacaagattt ggaaaaccaa ctgagaataa ctcaagtatc agcacctcca gcaggcagta tgacaggtaa gtcgccctcc actgacatct ttgatatgat tccattttct ccattttctc caatatcaca ccagtcttcg atgcctactc gcaatggcac acagccacct ccagtaccta gtacanctac tgagattaaa ngggacctgt ttggagcaga accttttgac ccatttaact gtggagcagc agatttccct ccagatattc aatcaaaatt agatgagatg caggaggggt tcaaaatggg actaactctt gaaggcacaa gtattttgtc tcgacccgtt agacagtagg tgctgacatc aagaacaaga aatcctgatt catgttaaat gtgtttgtat acacatgtca tttattatta ttactttaag ataggtatta ttcatgtgtc aatggttttt gaatatttta ata <210> 56 <211> 448 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Human Est aa443368 <400> 56 ccattttctc caatatcaca ccagtcttcg atgcctactc gcaatggcac acagccacct ccagtaccta gtagatctac tgagattaaa cgggacctgt ttggagcaga accttttgac ccatttaact gtggagcagc agatttccct ccagatattc aatcaaaatt agatgagatg caggaggggt tcaaaatggg actaactctt gaaggcacag tattttgtct cgacccgtta gacagtaggt gctgacatca agaacaagaa atcctgattc atgttaaatg tgtttgtata cacatgtcat ttattattat tactttaaga taggtattat tcatgtgtca atgtttttga atattttaat attttgaaaa ttttctcagt taaatttcct caccttcact attgatctgt aatttttatt ttaaaaacag cttactgt <210> 57 <211> 505 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Human Est aa431995 <400> 57 cagcaagtca acatttgaca tatagttatt tattagttga tcaaagcatg aatatttcaa ctttagtgca tagtcttttt tattcactga ttttattttg ctgtaacatt tcagatatta attattttat tctgttttac aggaggggtt caaaatggga ctaactcttg aaggcacagt attttgtctc gacccgttag acagtaggtg ctgacatcaa gaacaagaaa tcctgattca tgttaaatgt gtttgtatac acatgtcatt tattattatt actttaagat aggtattatt catgtgtcaa tgtttttgaa tattttaata ttttgaaaat tttctcagtt aaatttcctc accttcacta ttgatctgta atttttattt taaaaacagc ttactgtaaa gtagatcata cttttatgtt cctttctgtt tctactgtag atgaatttgt aattgaaaga catattatac aaatacctgc cttgtgtctg agttc

120

180

240

300

360

420

480

493

120 180 240 300 360 420 448

120 180 240 300 360 420 480 505 <210 58 <211> 558 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220 <223> Human Est GAI08

Ill <221> misc_feature <222> (1)..·(558) <223> n = A,T,C or G <400> 58 ggaggggttc aaaatgggac taactcttga aggcacacta cagtaggtgc tgacatcaag aacaagaaat cctgattcat catgtcattt attattatta ctttaagata ggtattattc attttaatat tttgaaaatt ttctcagtta aatttcctca tttttatttt aaaaacagct tactctaaag tagatcatac ctactgtaga tgaatttgta attgaaagac atattataca gttctattta gttagcatct tgaaatttgt attcattttc gatttcccaa aagccatacc ttaaaggata actttttaaa gtcaaactaa acatgttctg tttttaaacc aacaaacatg atcattnnat gtataaat ttttgtctcg gttaaatgtg atgtgtcaat ccttcactat ttttatgttc aatacctgcc cagatggcta ttctgaagag ttactattca acccgttaga tttgtataca gtttttgaat tgatctgtaa ctttctgttt ttgtgtctga gtttattaat acatgccaat ttggacagat

120 180 240 300 360 420 480 540 558 <210> 59 <211> 589 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Human Est GA109 <221> misc_feature <222> (1)...(589) <223> n - A,T,C or G <400> actgttcatt tttaatattt ttttatttta tacgctnnag nntttctatt agnatttccc gttcaaacta atatcatttt aatacccaca ataaacccaa attattattc ntaaaatttt aaaacntctt naattgntaa tatttntcat aaantccata aacannttcg anatataaac ngttcactaa agatatttaa tttannaagg ttattattnt gcgntcagnt ctcanttaaa tttcctcacc ttcactattn acnttaantt nnatcatact tttannttcc ttataantac atattataca aataccgacc ctgtaaattg atattcattt tccataggnc ccttaantat aactttttaa atttntaata ntttttaaac caacaaacan nttactattc actanttcac atcactgggt aaaagataan tttctaacng atnaaattat anggntataa gaatatttat ttantaactg ccagntgaa tttntaatat natcgttaat tttcgatttc ttacgatctn tgttttatta tacantccaa atgngnacan ctttaaacat aattccaata

120 180 240 300 360

420 480 540 589 <210> 60 <211> 312 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Human Est r33389 <400> 60 ctgattcatg ttaaatgtgt gtattattca tgtgtcaatg atttcctcac cttcactatt aggatcatac ttttatgttc gacatattat acaaatacct tttgtattca tt ttgtatacac atgtcattta tttttgaata ttttaatatt gatctgtaat ttttatttta ctttctgttt ctactgtagg gccttgtgtc tgaggttcta ttattattac tttaagatag ttgaaaattt tctcagttaa aaaacagctt actgtaaagt atggaatttg taattggaag ttaggtaggc catctggaaa

120

180

240

300

312 <210> 61 <211> 445 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Human Est r53881 <221> mise feature

112 <223> η = A,T,C or G qatattttga aaattttctc agttaaattt cctcaccttc actattgatc tgtaattttt attttaaaaa cagcttactg taaagtagat catactttta tgttcctttc tgtttctact qtagatgaat. ttgtaattga aagacatatt atacaaatac ctgccttgtg tctgagttct atttagttag catcttgaaa tttgtattca ttttccagat ggctagttta ttaatgattt cccaaaagcc ataccttaaa gataactttt taaattctga agggacatgc caatgtcaaa ctaaacatgt tctgttttta aaccaacaaa catgttacta ttcattggga cagntatcct tttatggtat taaatactgt tccacctcac cgggggnatg gtaaaccttn aaacctnatg gccncagggg caccnttttn cggcg

120 180 240 300 360 420 445 <210> 62 <211> 396 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Human Est r62236 <400> 62 aagataggta ttattcatgt gtcaatgttt ttgaatattt taatattttg aaaattttct cagttaaatt tcctcacctt cactattgat ctgtaatttt tattttaaaa acagcttact gtaaagtaga tcatactttt atgttccttt ctgtttctac tgtagatgaa tttgtaattg aaagacatat tatacaaata cctgccttgt gtctgagttc tatttagtta gcatcttgaa atttgtattc attttccaga tggctagttt attaatgatt tcccaaaagc cataccttaa agataacttt ttaaattctg gaagagacat gccaatgtca aactaaacat gttctgtttt taaaaccaac aaacatgtta actatttcat gggaca <210> 63 <211> 393 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

< 223> Human Est ho3749 < 221> misc_feature < 222> (1)...(393) <223> n - A,T,C or G <400> 63 taacataggt attattcatg tgtcaatgtt tttgaatatt ttaatatttt gaaaattttc tcagttaaat ttcctcacct tcactattga tctgtaattt ttattttaaa aacagcttac tgtaaagtag atcatacttt tatgttcctt tctgtttcta ctgtagatga atttgtaatt gaaagacata ttatacaaat acctgccttg tgtctgagtt ctatttagtt agcatcttga aatttgtatt cattttccag atggctagtt tattaatgat ttcccaaaag ccatacctta aaggataact ttttaaattc tggaaggnga catgccaatg tcaaactaaa catgttgcgt ttttaaaacc aacaaacatg ttactatttc atg <210> 64 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

< 223> Human Est OGAHO < 221> misc_feature < 222> (1)...(702) <223> n = A,T,C or G <400> 64 ctttaatgat ttcccaaaag ccatacctta aagataactt tttaaattct gaagagacat gccaatgtca aactaaacat gttctgtttt taaaccaaca aacatgttac tattcattgg acagatatca ttttatgtat aaatactgtt cacatcactg ggaaaatgta aactttaaac ataatcggac aagctcacta atttctagca ggtaaaatta taaggatata aattccaata ataaaccaaa tctattagag tatttattag taaatgcaag gtgatgttag ttatgatcag ttatactcta aatatttaat ttgttttata aaggtagtga aaaaatgaaa atttgctatt

120 180 240 300 360 396

120

180

240

300

360

393

120

180

240

300

360

113 atcatctgat ttgatattcc ctaaaaaaca tttggaatat atgctatcta tagat^cagt . atctactacc catatttact ttaccaaata tatttctcct cactgcataa ggactaetct?· tctcatattt tcttctttga tgaagatatt tttcaccaaa gtttattttg tgatgccctc ttggttttga tacttaaaaa tctgtggcac ccgttctaca tgaattatca atatttggta attcaatctg tatttgtttg gtaaaatcca aaaatnnnca tt <210> 65 <211> 502 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Human Est aa431753rrc <400> 65 □qtaaaatta taaggatata aattccaata ataaaccaaa tgtatttaga ctatttatta gtaaatgvaa ggtgatgtta gttatgatca gttatactct aaatatttaa tttgttttat aaaggtagtg aaaaaatgaa aatttgctat ttattaaaaa acattaaatt tcattccaaa tgagataagt gatattacta taacatctaa gcatcatctg atttgatatt ccctaaaaaa catttggaat atatgctatc tatagattca gtatctacta cccatattta ctttaccaaa tatatttctc ctcactgcat aaggactact cttctcatat tttcttcttt gatgaagata tttttcacca aagtttattt tgtgatgccc tcttggtttt gatactttaa aatctgtggc acccgttcta catgaattat caatatttgg taaattcaat ctgtatttgt tttgttaaag tcaaaaatct cattttccaa aa <210> 66 <211> 461 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

< 223> Human Est pGAlOl < 221> mise feature < 222> (1).7.(461) <223> n - A,T,C or G <400> 66 agtaaatgee aaggtgatgg ttagttaagg atcaggttaa aacctctaaa atattnaatn ttgttttata aaggtaggaa aaaatgaaaa tttgctattt attaaaaaac attaaatttc attccaaatg agataagtga tattactata acatctaagc atcatctgat ttgatattcc ctaaaaaaca tttggaatat atgctatcta tagattcagt atctactacc catatttact ttaccaaata tatttctcct cactgcataa ggactactct tctcatattt tcttctttga tgaagatatt tttcaccaaa gtttattttg tgatgccctc ttggttttga tactttaaaa tctgtggcac ccgttctaca tgaattatca atatttggta aattcaatct gtatttgttt tgttaaagtc aaaaatetea ttttccagtc gacgcgcccc c <210> 67 <211> 416 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Human Est aal59297rcc <221> misc_feature <222> (1)...(416) <223> n = A,T,C or G <400> 67 gatgatcagt tatactcnaa atattnaatt tgtnttataa aggtagtgaa aaaatgaaaa tttgctattt attaaaaaac attaaatttc attccaaatg agataagtga tattactata acatctaagc atcatctgat ttgatattcc ctnaaaaaca tttggaatat atgctatcta tagattcagt atctactacc catatttact ttaccaaata tatttctcct cactgcataa ggactactct tctcatattt tcttctttga tgaagatatt tttcaccaaa gtttattttg tgatgccctc ttggttttga tactttaaaa tctgtggcac ccgttctaca tgaattatca atatttggta aattcaatct gtatttgttt tgttaaagtc aaaaatetea ttttcc

*.‘48£T : .

: 5·κΓ *’*’

600

660

702

120

180

240

300

360

420

480

502

120 180 240 300 360 420 461

120 180 240 300 360 416 <210> 68

114

DNA

Artificial Sequence <220>

<223>

Human Est aa770228rcc <400> tatactctaa attaaaaaac atcatctgat atctactacc tctcatattt ttggttttga aattcaatct atatttaatt attgaatttc ttgatattcc catatttact tcttctttga tactttaaaa gtatttgttt tgttttataa attccaaatg ctaaaaaaca ttaccaaata tgaagatatt tctgtggcac tgttaaagtc aggtagtcaa agataagtga tttggaatat tatttctcct tttcaccaaa ccgttctaca aaaaatctca aaaatgaaaa tattactata atgctatcta cactgcataa gtttattttg tgaattatca ttt ttggctattt acatctaagc tagattcagt ggactactct tgatgccctc atatttggta

120

180

240

300

360

403 <210>

<211>

<212>

<213>

385

DNA

Artificial Sequence <220>

<223>

Human Est ho2853rcc <221>

<222>

<223>

misc_feature (1) ... (385)

A, T,C or G <400> tataagggta caaatgagat aaaaaacatt accaaatata gaagatattt ctgtgccacc gttaaagtca cngaaaaaan aagtgatatt tggaatatat tttctcctca ttcaccaaag cgttctacat aaaanntcaa gaaaattngc acctataaca gctatctata ctgcataagg tttattttgt gaattatcaa nntcc tatttattaa tcctaagcat gattcagtat actactcttc gatgccctct tatttggtaa aaaacattaa catctgattt ctactaccca tcatattttc tggttttgat attcaatctg atttcattcc gatantccct tatttacttt cttctttgat actttaaaat tatttgtttt

120 180 240 300 360 385 <210> 70 <211> 350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Human Est d60819rcc <400> 70 attatkraaa aacattaaat ktcatscsaa atgagataag tgatattact ataacatcta aqcatcatct gatttgatat yccctraaaa aasatktggr atatatgcta tctatagakt cagtatctac tacccatatt tactttacss aaatatattt ctcctcactg cataaggact actcttctca tattttcttc tttgatgaag atatttttca ccaaagttta ttttgtgatg ccctcttggt tttcatactt taaaatctgt ggcacccctt ctacatgaat atcaatattt ggtaaaktca atctgtattt gttttgttaa agtcraaaat ctcattttcc

120 180 240 300 350 <210> 71 <211> 380 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Human Est <400: aaacattaaa tcatcctgna attcagtatc ctactcntct gccctcttgg tgtccangcc tttgnanant tactacccat catattttct ntttgatact caaatgagat cccctnaaaa atttacttta tctttgatga ttaaaatctg aagtggatan acatttggna ccaaatatat agatattttc tggcacccgt tacctataac tatatgctat ttctcctcac accaaagttt tctacatgna atcctaagca ctatctatag tgcataagga attttgtgat ttatca

120

180

240

Claims (77)

115

Szabadalmi igénypontok ...... --

1. Izolált fehérje, melyet a következőkből álló csoportból választunk ki:

a) egy 2. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérje,

b) egy 4. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérje,

c) egy 6. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérje,

d) egy 8. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérje,

e) egy 10. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérje,

f) egy 12. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérje,

g) egy 14. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérje,

h) egy 16. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérje,

i) egy 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14., 16. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosav-szekvenciával legalább 40%-ban azonos aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje és

j) egy 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13. vagy 15. azonosítószámú szekvenciában bemutatott nukleinsav-szekvencia által kódolt aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje.

2. Izolált nukleinsav, melyet a következőkből álló csoportból választunk ki:

1. azonosítószámú szekvenciában bemutatott

116 * · H<r 4 »4« »*»· · · • · « · e • · « nukleotidokat tartalmazó nukleinsav, • 4 4

b) egy 3. azonosítószámú nukleotidokat tartalmazó nukleinsav, szekvenciában bemutatott

c) egy 7. azonosítószámú nukleotidokat tartalmazó nukleinsav, szekvenciában bemutatott

d) egy 9. azonosítószámú nukleotidokat tartalmazó nukleinsav, szekvenciában bemutatott

e) egy 11. azonosítószámú nukleotidokat tartalmazó nukleinsav, szekvenciában bemutatott

f) egy 13. azonos!tószámú nukleotidokat tartalmazó nukleinsav, szekvenciában bemutatott

g) egy 15. azonosítószámú nukleotidokat tartalmazó nukleinsav, szekvenciában bemutatott

h) egy 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13. vagy 15. azonosítószámú szekvenciában bemutatott nukleotidok komplementerét tartalmazó nukleinsav,

i) egy h) pont szerinti nukleinsavval kevéssé szigorú körülmények között hibridizálni képes nukleinsav,

j) a 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14., 16. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosav-szekvenciával legalább 40%-ban azonos aminosav-szekvenciát kódoló nukleinsav, és

k) a 2., 3., 5., 7., 9., 11., 13. vagy 15. azonosítószámú nukleinsav-szekvenciákkal legalább 40%-ban azonos nukleinsav.

3. Expressziós vektor, mely egy következőkből álló csoportból kiválasztott nukleinsavat tartalmaz:

a) egy 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13. vagy 15. azonosítószámú szekvenciában bemutatott nukleotidszekvenciát tartalmazó nukle insav,

117

b) egy 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13. vagy 15. azonosltoszafliú szekvenciában bemutatott nukleotidok komplementerét tartalmazó nukleinsav,

c) egy b) pont szerinti nukleinsavval kevéssé szigorú körülmények között hibridizálni képes nukleinsav,

d) egy 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosav-szekvenciával legalább 40%-ban azonos aminosav-szekvenciát kódoló nukleinsav, és

e) egy 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú aminosav-szekvenciát kódoló nukleinsav.

4. A3, igénypont szerinti expressziós vektor, mely egy riportergént kódoló DNS-t tartalmaz az említett vektorban úgy elhelyezve, hogy az említett nukleinsav expressziója az említett riportergén expresszióját eredményezi.

5. A 4. igénypont szerinti expressziós vektor, ahol az említett riportergén zöld fluoreszcencia fehérjét kódol.

6. Emlős sejtvonal, mely a következőkből álló csoportból kiválasztott nukleinsavval van transzfektálva:

a) egy 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13. vagy 15. azonosítószámú szekvenciában bemutatott nukleotidokat tartalmazó nukleinsav,

b) egy 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13. vagy 15. azonosítószámú szekvenciában bemutatott nukleotidok komplementerét tartalmazó nukleinsav,

c) egy b) pont szerinti nukleinsavval kevéssé szigorú körülmények között hibridizálni képes nukleinsav,

d) egy 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosav-szekvenciával legalább 40%-ban azonos aminosav-szekvenciát kódoló nukleinsav, és

118 :^,J···-: ·-'« i ·<·«» · ♦ ♦ » *

e) egy 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14. vagy 16. arzbnositoszamu aminosav-szekvenciát kódoló nukleinsav.

7. A 6. igénypont szerinti emlős sejtvonal, mely az említett nukleinsavat és egy riportergént tartalmazó expressziós vektorral van transzformálva, ahol az említett riportergén az említett vektorban úgy van elhelyezve, hogy az említett nukleinsav expressziója az említett riportergén expresszióját eredményezi.

8. A 7. igénypont szerinti emlős sejtvonal, ahol az említett riportergén zöld fluoreszcencia fehérjét kódol.

9. A 6. igénypont szerinti emlős sejtvonal, ahol az említett sejtvonalat a következőkből álló csoportból választjuk ki: egy fibroblaszt sejtvonal és egy epitéliális sejtvonal.

10. A 6. igénypont szerinti emlős sejtvonal, ahol az említett sejtvonalat a következőkből álló csoportból választjuk ki: COS1, BHK21, L929, CV1, SWISS 3T3, HT144, IMR32, HEPG2, MDCK, MCF7, 293, Hela, A549, SW48 és G361.

11. A 10. igénypont szerinti emlős sejtvonal, mely egy MCF7 sej tvonal.

12. A 7. igénypont szerinti emlős sejtvonal, mely egy MCF7 sejtvonal.

13. A 6. igénypont szerinti emlős sejtvonal, ahol az említett sejtvonal egy primer sejtvonal.

14. A 13. igénypont szerinti emlős sejtvonal, ahol az említet sejtvonalat a következőkből álló csoportból választjuk ki: humán dermális FIB-ek, dermális keratinociták, leukociták, monociták, és makrofágok.

15. Nem humán transzgénikus állat, mely egy fehérjét kódoló gént tartalmaz, ahol a fehérjét a következőkből álló csoportból

119 ' ** ^? ϊ *4 9 * · S-λ* ·*>♦ választjuk ki:

a) egy 2. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérje,

b) egy 4. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérje,

c) egy 6. azonosítószámú bemutatott aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje,

d) egy 8. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérje,

e) egy 10. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérje,

f) egy 12. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérje,

g) egy 14. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérje,

h) egy 16. azonosítószámú bemutatott szekvenciában aminosavszekvenciát tartalmazó fehérje,

i) egy 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14., 16. azonosítószámú aminosav-szekvenciával legalább 40%-ban azonos aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje és

j) egy 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13. vagy 15. azonosítószámú szekvenciában bemutatott nukleinsav-szekvencia által kódolt aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje.

16. Transzgénikus fonálféreg, melynek natív CED-6 gén funkciója teljesen vagy lényegében teljesen hiányzik, és mely egy következőkből álló csoportból kiválasztott nukleinsavval transzformált vagy transzfektált:

a) egy 7., 9., 11., 13. vagy 15. azonosítószámú szekvenciában

120 bemutatott nukleotidszekvenciát tartalmazó nukleinsav, .....

b) egy 7., 9., 11·, 13. vagy 15. azonosítószámú szekvenciában bemutatott nukleotidok komplementerét tartalmazó nukleinsav,

c) egy b) pont szerinti nukleinsavval kevéssé szigorú körülmények között hibridizálni képes nukleinsav,

d) egy 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosav-szekvenciával legalább 40%-ban azonos aminosav-szekvenciát kódoló nukleinsav, és

e) egy 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú aminosavszekvenciát kódoló nukleinsav.

17. A 16. igénypont szerinti transzgénikus fonálféreg, mely C. elegáns.

18. Eljárás annak meghatározására, hogy egy vegyület az apoptotikus sejtek fagocitózisát elősegítő jelátviteli út inhibitora vagy enhanszere, azzal jellemezve, hogy egy transzgénikus emlős sejtet, melyet a következőkből álló csoportból kiválasztott nukleinsavval transzformáltunk:

a) egy 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje, a 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú aminosav-szekvenciát kódoló nukleinsav, az 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13. vagy 15. azonosítószámú szekvencia által kódolt aminosav-szekvencia, vagy az 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13., 15. azonosítószámú nukleinsavszekvencia,

e) egy 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú aminosav-szekvenciát kódoló nukleinsav, apoptotikus részecskéknek tesszük ki, és mérjük az említett részecskék említett transzgénikus sejtek általi fagocitózisos

121 felvételének mértékét az említett vegyület jelenlétében·’éfe ’an’él^ kül, ahol a fagocitózis megnövekedett mértéke egy enhanszert jelez, és a fagocitózis csökkent mértéke egy inhibitort jelez.

19. A 18. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett apoptotikus részecskéket a következőkből álló csoportból választjuk ki: opszonizált apoptotikus neutrofil granulociták, opszonizált apoptotikus limfociták, opszonizált apoptotikus eritrociták, opszonizált elölt baktériumok és opszonizált elölt élesztő.

20. A 19. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett apoptotikus részecske jelölt.

21. A 20. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett jelet a következőkből álló csoportból választjuk ki: egy nem fluoreszcens festék, egy fluoreszcens festék, egy antitesthez kötött nem fluoreszcens festék és egy antitesthez kötött fluoreszcens festék.

22. A 18. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a transzgénikus emlős sejt egy fibroblaszt sejt vagy egy epitéliális sejt.

23. A 22. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a transzgénikus emlős sejtet a következőkből álló csoportból választjuk ki: COS1, BHK21, L929, CV1, SWISS 3T3, HT144, IMR32, HEPG2, MDCK, MCF7, 293, Hela, A549, SW48 és G361.

24. A 18. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett transzgénikus emlőssejt egy primer sejt.

25. A 24. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett transzgénikus emlős sejtet a következőkből álló csoportból választjuk ki: humán dermális FIB-ek, dermális

122 ·· · « · · · · £ « keratinociták, leukociták, monociták és makrofágok......

26. A 21. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a fagocitózissal bekebelezett apoptotikus részecskéket a következőkből álló csoportból kiválasztott eljárással mutatjuk ki: fénymikroszkópia, fluoreszcencia mikroszkópia, kvantitatív spektrofluorometria és áramlásos citometria.

27. A 18. igénypont szerinti eljárással, az apoptotikus sejtek fagocitózisát elősegítő jelátviteli út inhibitoraként vagy enhanszereként azonosított vegyúlet.

28. Eljárás annak meghatározására, hogy egy vegyúlet az apoptotikus sejtek fagocitózisát elősegítő jelátviteli út inhibitora vagy enhanszere, azzal jellemezve, hogy (1) egy emlős sejtbe a következőkből álló csoportból kiválasztott fehérjét visszük be:

a) egy 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje,

b) egy 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú szekvenciával legalább 40%-ban azonos aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje,

c) egy 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13. vagy 15. azonosítószámú szekvenciában bemutatott nukleotidszekvencia által kódolt aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje; vagy egy emlős sejtbe a fenti a)-c) csoportok bármelyikében lévő fehérje transzkripcióját gátló antiszensz RNS-t expresszáló vektort visszük be, és (2) az emlős sejtet apoptotikus részecskéknek tesszük ki, és mérjük az említett részecskék említett transzgénikus sejtek általi fagocitózisos felvételének mértékét az említett vegyúlet

123 jelenlétében és anélkül, ahol a fagocitózis megnövatódott: rrfé^t^ ke egy enhanszert jelez, és a fagocitózis csökkent mértéke egy inhibitort jelez.

29. A 28. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett apoptotikus részecskéket a következőkből álló csoportból választjuk ki: opszonizált apoptotikus neutrofil granulociták, opszonizált apoptotikus limfociták, opszonizált apoptotikus eritrociták, opszonizált elölt baktériumok és opszonizált elölt élesztő.

30. A 28. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett apoptotikus részecske jelölt.

31. A 30. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett jelet a következőkből álló csoportból választjuk ki: egy nem fluoreszcens festék, egy fluoreszcens festék, egy antitesthez kötött nem fluoreszcens festék és egy antitesthez kötött fluoreszcens festék.

32. A 28. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a transzgénikus emlős sejt egy fibroblaszt sejt vagy egy epitéliális sejt.

33. A 32. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a transzgénikus emlős sejtet a következőkből álló csoportból választjuk ki: COS1, BHK21, L929, CV1, SWISS 3T3, HT144, IMR32, HEPG2, MDCK, MCF7, 293, Hela, A549, SW48 és G361.

34. A 28. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett transzgénikus emlőssejt egy primer sejt.

35. A 34. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett emlős sejtet a következőkből álló csoportból választjuk ki: humán dermális FIB-ek, dermális keratinociták, leu

124 kociták, monociták és makrofágok.

36. A 30. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a fagocitózissal bekebelezett apoptotikus részecskéket a következőkből álló csoportból kiválasztott eljárással mutatjuk ki: fénymikroszkópia, fluoreszcencia mikroszkópua, kvantitatív spektrofluorometria és áramlásos citometria.

37. A 28. igénypont szerinti eljárással, az apoptotikus sejtek fagocitózisát elősegítő jelátviteli út inhibitoraként vagy enhanszereként azonosított vegyület.

38. Eljárás annak meghatározására, hogy egy vegyület az apoptotikus sejtek fagocitózisát elősegítő jelátviteli út inhibitora vagy enhanszere, azzal jellemezve, hogy egy következőkből álló csoportból kiválasztott emlős sejtet, (1) transzgénikus emlős sejt, melyet a következőkből álló csoportból kiválasztott nukleinsavval transzfektáltuk:

a) egy 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13. vagy 15. azonosítószámú szekvenciában bemutatott nukleinsav-szekvencia,

b) egy 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13. vagy 15. azonosítószámú szekvenciában bemutatott nukleotidokkal komplementer nukleinsavszekvencia,

c) egy b) pont szerinti nukleinsavval kevéssé szigorú körülmények között hibridizálni képes nukleinsav, (2) egy következőkből álló csoportból kiválasztott fehérjét expresszáló emlős sejt:

a) egy 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje,

b) egy 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú

125 szekvenciával legalább 40%—ban azonos aminosav sze-kVen-óiSt .-tál? talmazó fehérje és

c) egy 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13. vagy 15. azonosítószámú szekvenciában bemutatott nukleotidszekvencia által kódolt aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje, és (3) a következőkből álló csoportból kiválasztott fehérjét kódoló DNS-hez képest antiszensz RNS-t expresszáló vektort tartalmazó emlős sejt:

a) egy 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérje,

b) egy 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú szekvenciával legalább 40%-ban azonos aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje; és

c) egy 1., 3., 5., 7.,9., 11., 13.. vagy 15. azonosítószámú bemutatott nukleotidszekvencia által kódolt aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje, egy tesztelendő vegyületnek tesszük ki, és meghatározzuk vajon van-e az aktin-citoszkeleton szerveződésében valamilyen változás, ahol az aktin-citoszkeleton újrarendeződésének megnövekedése az enhanszert jelzi, és az aktin-citoszkeleton újrarendeződésében bekövetkezett csökkenés az inhibitort jelzi.

39. A 38. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az aktin-citoszkeletont egy F-aktinnal kölcsönhatásba lépő vegyülethez kapcsolt fluoreszcens festékkel tesszük láthatóvá.

40. A 39. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett linkervegyület falloiidin.

41. A 38. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a transzgénikus emlős sejt egy fibroblaszt sejt vagy egy

126

...· ·..* : ·..· *·:* epitéliális sejt.

42. A 41. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a transzgénikus emlős sejtet a következőkből álló csoportból választjuk ki: C0S1, BHK21, L929, CV1, SWISS 3T3, HT144, IMR32, HEPG2, MDCK, MCF7, 293, Hela, A549, SW48 és G361.

43. A 38. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett transzgénikus emlőssejt egy primer sejt.

44. A 43. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett transzgénikus emlős sejtet a következőkből álló csoportból választjuk ki: humán dermális FIB-ek, dermális keratinociták, leukociták, monociták és makrofágok.

45. A 38. igénypont szerinti eljárással, az apoptotikus sejtek fagocitózisát elősegítő jelátviteli út inhibitoraként vagy enhanszereként azonosított vegyület.

46. Eljárás annak meghatározására, hogy egy vegyület az apoptotikus sejtek fagocitózisát elősegítő jelátviteli útban résztvevő fehérjét kódoló gén expressziójának inhibitora vagy enhanszere, azzal jellemezve, hogy (a) a 7. igénypont szerinti transzgénikus emlős sejtet az említett vegyületnek tesszük ki;

(b) mérjük az említett riporter gén expressziójának szintjét, és (c) összehasonlítjuk az említett expressziót az említett riportergénnek az említett vegyület nélküli expressziószintjével, ahol a fagocitózis megnövekedett mértéke egy enhanszert jelez, és a fagocitózis csökkent mértéke egy inhibitort jelez.

47. A 45. igénypont szerinti eljárással az apoptotikus sejtek fagocitózisát elősegítő jelátviteli útban résztvevő fehérjét kó

127 doló gén expressziójának inhibitoraként vagy enhanaz’ér'eként —áz3 nősített vegyület.

48. A következőkből álló' csoportból kiválasztott fehérje epitopja ellen irányuló antitest:

a) egy 2. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérje,

b) egy 4. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérje,

c) egy 6. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérje,

d) egy 8. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérje,

e) egy 10. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérje,

f) egy 12. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérje,

g) egy 14. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérje,

h) egy 16. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérje,

i) egy 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosav-szekvenciával legalább 40%-ban azonos aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje és

j) egy 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13. vagy 15. azonosítószámú szekvenciában bemutatott nukleinsav-szekvencia által kódolt aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje.

49. A 48. igénypont szerinti antitest, mely egy monoklonális antitest.

128

50. Eljárás egy egyén kezelésére, akinek a követ-^éS4köőr-díl»Ó csoportból kiválasztott betegsége van: gyulladás, autoimmun betegség és rák, azzal jellemezve, hogy a betegnek a következőkből álló csoportból kiválasztott fehérje hatásos mennyiségét tartalmazó gyógyszert adunk be:

a) egy 8. azonosítószámú aminosav szekvenciát tartalmazó fehérje,

b) egy 8. azonosítószámú aminosav-szekvenciával legalább 40%ban azonos aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje, és

c) egy 7. azonosítószámú nukleotidszekvencia által kódolt aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje.

51. Eljárás egy egyén kezelésére, akinek a következőkből álló csoportból kiválasztott betegsége van: gyulladás, autoimmun betegség és rák, azzal jellemezve, hogy a betegnek, akinek arra szüksége van, egy olyan vegyület hatásos mennyiségét adjuk be, mely az apoptotikus sejtek fagocitózisát elősegítő jelátviteli út enhanszere.

52. Eljárás egy egyén kezelésére, akinek a következőkből álló csoportból kiválasztott betegsége van: gyulladás, autoimmun betegség és rák, azzal jellemezve, hogy a betegnek, akinek arra szüksége van, egy olyan vegyület hatásos mennyiségét adjuk be, mely az apoptotikus sejtek fagocitózisát elősegítő jelátviteli útban résztvevő fehérjét kódoló gén expressziójának enhanszere.

53. Eljárás egy egyén kezelésére, akinek a következőkből álló csoportból kiválasztott betegsége van: gyulladás, autoimmun betegség és rák, azzal jellemezve, hogy a betegnek, akinek arra szüksége van, egy 7., 13. és 15. azonosítószámú szekvenciából álló csoportból kiválasztott nukleinsav hatásos mennyiségét ad-

129 juk be. ........

54. Eljárás egy egyén kezelésére, akinek a következőkből álló csoportból kiválasztott betegsége van: neurodegenerativ betegség, stroke és sarlósejtes vérszegénység, azzal jellemezve, hogy egy betegnek, akinek erre szüksége van, a következőkből álló csoportból kiválasztott fehérje hatásos mennyiségét adunk be:

a) egy 8., 14., 16. azonosítószámú aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje,

b) egy 8., 14. vagy 16. azonosítószámú aminosav-szekvenciával legalább 40%-ban azonos aminosav szekvenciát tartalmazó fehérje és

c) egy 7., 13. vagy 15. azonosítószámú nukleotidszekvencia által kódolt aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje.

55. Eljárás egy egyén kezelésére, akinek a következőkből álló csoportból kiválasztott betegsége van: neurodegenerativ betegség, stroke és sarlósejtes vérszegénység, azzal jellemezve, hogy egy betegnek, akinek arra szüksége van, egy olyan vegyület hatásos mennyiségét adjuk be, melyet az apoptotikus sejtek fagocitózisát elősegítő jelátviteli út inhibitoraként azonosítottunk.

56. Eljárás egy egyén kezelésére, akinek a következőkből álló csoportból kiválasztott betegsége van: neurodegenerativ betegség, stroke és sarlósejtes vérszegénység, azzal jellemezve, hogy a betegnek, akinek arra szüksége van, egy olyan vegyület hatásos mennyiségét adjuk be, melyet az apoptotikus sejtek fagocitózisát elősegítő jelátviteli útban résztvevő fehérjét kódoló gén expressziójának inhibitoraként azonosítottuk.

57. Eljárás egy egyén kezelésére, akinek a következőkből álló

130 csoportból kiválasztott betegsége van: neurodegeneftátív berteg*ség, stroke és sarlósejtes vérszegénység, azzal jellemezve, hogy egy betegnek, akinek arra szüksége van, egy következőkből álló csoportból kiválasztott nukleinsav hatásos mennyiségét adjuk be:

a) egy 7., 13. vagy 15. azonosítószámú szekvencia szerinti nukleotidokat tartalmazó nukleinsav,

b) egy 7., 13· vagy 15. azonosítószámú szekvencia szerinti nukleotidokkal hibridizáló nukleinsav és

c) egy 8., 14. vagy 16. azonosítószámú szekvenciát kódoló nukleinsav.

58. Gyógyászati készítmény, mely egy következőkből álló csoportból kiválasztott fehérjét:

a) egy 8., 14. vagy 16. azonosítószámú aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje,

b) egy 8., 14. vagy 16. azonosítószámú aminosav-szekvenciával legalább 40%-ban azonos aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje és

c) egy 7., 13., vagy 15. azonosítószámú nukleotidszekvencia által kódolt aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje, és egy gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz.

59. Egy 27. igénypont szerinti vegyületet és egy gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmazó gyógyszerkészítmény.

60. Egy 37. igénypont szerinti vegyületet és egy gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmazó gyógyszerkészítmény.

61. Egy 45. igénypont szerinti vegyületet és egy gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmazó gyógyszerkészítmény.

62. Egy 47. igénypont szerinti vegyületet és egy gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmazó gyógyszerkészítmény.

131

63. Gyógyszerkészítmény, mely egy következőkből -átfíó* oso'pó’r't^ ból kiválasztott nukleinsavat tartalmaz:

a) egy 7., 13. vagy 15. azonosítószámú szekvencia szerinti nukleotidokat tartalmazó nukleinsav,

b) egy 7., 13. vagy 15. azonosítószámú szekvencia szerinti nukleotidokkal hibridizáló nukleinsav, és

c) egy 8., 14. vagy 16. azonosítószámú szekvenciát kódoló nukleinsav.

64. Eljárás az 1. igénypont szerinti fehérjékkel az apoptotikus sejtek bekebelezését elősegítő jelátviteli útban kölcsönhatásba lépő fehérjék azonosítására, azzal jellemezve, hogy

a) egy transzkripciós faktor által szabályozott promóter szabályozása alatt álló riportergént tartalmazó DNS szerkezettel rendelkező gazdasejtet hozunk létre, mely faktor egy DNS-kötő doménnel és egy aktiváló doménnel rendelkezik;

b) az említett gazdasejtben egy 2. igénypont szerinti nukleinsav fragmentumából vagy egészéből és az említett transzkripciós faktor említett DNS-kötő doménjéből vagy említett aktiváló doménjéből álló első fúziót kódoló első hibrid DNS szekvenciát expresszálunk;

c) az említett gazdasejtben egy feltételezetten kölcsönhatásba lépő fehérjét és a transzkripciós faktornak az első fúzióba be nem épített DNS kötő doménjét vagy aktiváló doménjét együtt kódoló legalább egy második hibrid DNS szekvenciát expresszálunk; és

d) meghatározzuk a vizsgált fehérje bármilyen kötődését az

1., 10. vagy 16. igénypont szerinti fehérjével úgy, hogy a ri

132 portergén termékét kimutatjuk az említett gazdasejtbtín.*· · ~ ’

65. C. elegáns fonálféregből származó izolált fehérje, mely a 2A. ábrán a körülbelül 242. aminosavgyöktől a körülbelül 338. aminosavgyökig terjedő aminosav-szekvenciát vagy az említett fehérjétől csak konzervatív aminosavcserékben különböző aminosavszekvenciát tartalmaz.

66. Izolált fehérje, mely a 20. ábrán a körülbelül 11. aminosavtól körülbelül a 190. aminosavig terjedő aminosav-szekvenciát vagy az említett fehérjétől csak konzervatív aminosavcserékben különböző aminosav-szekvenciát tartalmaz.

67. Eljárás egy olyan rendellenesség diagnosztizálására, mely az apoptotikus sejtek fagocitózisának rendellenességével kapcsolatos, azzal jellemezve, hogy egy nukleinsavat a betegből származó nukleinsav-mintának tesszük ki, és meghatározzuk a hibridizációt; ahol a nukleinsavat a következőkből álló csoportból választjuk ki:

a) egy 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13. vagy 15. azonosítószámú szekvenciában bemutatott nukleotidszekvenciát tartalmazó nukleinsav,

b) egy 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13. vagy 15. azonosítószámú szekvenciában bemutatott nukleotidok komplementerét tartalmazó nukleinsav,

c) egy b) pont szerinti nukleinsavval kevéssé szigorú körülmények között hibridizálni képes nukleinsav,

d) egy 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonositosz amu szekvenciában bemutatott aminosav-szekvenciával legalább 40%-ban azonos aminosav-szekvenciát kódoló nukleinsav és

e) egy 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú

133 aminosav-szekvenciát kódoló nukleinsav.

68. Eljárás egy olyan rendellenesség diagnosztizálására, mely az apoptotikus sejtek fagocitózisának rendellenességével kapcsolatos, azzal jellemezve, hogy egy betegből származó mintában kimutatunk egy fehérjét a fentebb említett fehérjék egyikének epitopjával szembeni antitesttel, ahol a fehérjét a következőkből álló csoportból választjuk ki:

a) egy 8. azonosítószámú aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje,

b) egy 14. azonosítószámú aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje,

c) egy 16. azonosítószámú aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje,

d) egy 8., 14. vagy 16. azonosítószámú aminosav-szekvenciával legalább 40%-ban azonos aminosav-szekvenciával rendelkező fehérjeszekvencia vagy egy 7., 13. vagy 15. azonosítószámú nukleinsav-savszekvencia által kódolt fehérjeszekvencia.

69. Fehérje, mely a következőkből álló csoportból kiválasz tott fehérjét tartalmaz:

a) egy 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú szekvenciában bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérje,

b) egy 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú amionosav-szekvenciával legalább 40%-ban azonos aminosavszekvenciát tartalmazó fehérje és

c) egy 1., 3., .5, 7., 9., 11., 13. vagy 15. azonosítószámú nukleotidszekvencia által kódolt aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje, ahol az említett fehérje egy másik fehérjéhez fuzionált.

134

70. A 69. igénypont szerinti fehérje, ahol az emli^ét't mádl’k fehérje egy epitoprész vagy egy riportergén terméke.

71. Eljárás annak azonosítására, hogy egy vegyület az apoptotikus sejtek fagocitózisát elősegítő jelátviteli út enhanszere-e, azzal jellemezve, hogy

a) egy C. elegánst, melyben a CED-6 expressziója rendellenes vagy egyéb módon szuppresszált, egy tesztelendő vegyületnek tesszük ki; és

b) mérjük a vad-típusú fenotípusba történő visszatérést.

72. Eljárás annak azonosítására, hogy egy vegyület az apoptotikus sejtek fagocitózisát elősegítő jelátviteli út enhanszere vagy inhibitora, azzal jellemezve, hogy

a) egy 17. igénypont szerinti transzgénikus C. elegánst egy tesztelendő vegyületnek tesszük ki; és

b) mérjük a fagocitózis aktivitás mértékét az L1 lárvák fejében és/vagy az ivarmirigyekben az apoptotikus elhalt sejtek számolásával .

73. Izolált fehérje, mely az apoptotikus sejtek fagocitózisát szabályozó jelátviteli útban egy adapter molekula.

74. Egy fehérje vagy nukleinsav alkalmazása terápiás alkalmazásra, például gyulladás, autoimmun betegség, vagy rák kezelésére, mely a 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje, a 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú szekvenciát kódoló nukleinsav, az 1., 3., 5., 7., 9-, 11-, 13. vagy 15. azonosítószámú szekvencia által kódolt aminosav-szekvencia vagy az 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13. vagy 15. azonosítószámú nukleinsav-szekvencia.

75. Egy fehérje vagy nukleinsav alkalmazása terápiás alkalma-

135 • · 4» '» · · «·« zásra, például neurodegeneratív betegségben, stsoké^hál sarlósejtes vérszegénységnél, mely a 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje, a 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú szekvenciát kódoló nukleinsav, az 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13. vagy 15. azonosítószámú szekvencia által kódolt aminosavszekvencia vagy az 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13. vagy 15. azono sítószámú nukleinsav-szekvencia.

76. Egy fehérje vagy nukleinsav alkalmazása egy következőkből álló csoportból kiválasztott betegség kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására: gyulladás, autoimmun betegség és rák, mely a 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje, a 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú szekvenciát kódoló nukleinsav, az 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13. vagy 15. azonosítószámú szekvencia által kódolt aminosav-szekvencia vagy az 1., 3., 5.,

7., 9., 11., 13. vagy 15. azonosítószámú nukleinsav-szekvencia.

77. Egy fehérje vagy nukleinsav alkalmazása egy következőkből álló csoportból kiválasztott betegség kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására: neurodegeneratív betegség, stroke és sarlósejtes vérszegénység, mely a 2., 4., 6., 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje, a 2-, 4., 6., 8., 10., 12., 14. vagy 16. azonosítószámú szekvenciát kódoló nukleinsav, az 1., vagy 15. azonosítószámú szekvencia

3., 5., 7.., 9., 11., által kódolt aminosavszekvencia vagy az 1., 3., 5., 7.,

9., 11., 13. vagy 15. azonosítószámú nukleinsav-szekvencia.

plflpA.

A meghatalmazott,;

szabadalmi ilgyvfrö az S.B.G. & K. Nemzetközi Szabadalmi Iroda tagja H-1062 Budapest, Anttóssy öt 113. Telefon: 34-24-950, Fax: 34-24-323