HUP0200562A2 - A strain of baccilus pumilus for controlling plant diseases - Google Patents

Description

73.313/PA ’Μ’

Növényi betegségek elleni védekezésre szolgáló Bacillus pumilus törzs

A találmány tárgya biopeszticidek szakterületére esik. Közelebbről, a találmány tárgya a Bacillus pumilus NRRL B-30087 nyilvántartási számon letétbe helyezett új törzse, amely in vivo képes meggátolni a gombás növényi megbetegedések széles körét. A találmány tárgya továbbá egy olyan gombaölő készítmény, amely ezt az új Bacillus törzset, antibiotikumokat, e törzs tisztított vagy nem tisztított frakciót önmagában vagy más kémiai és biológiai peszticidekkel együtt tartalmazza. A találmány továbbá az NRRL B-30087 nyilvántartási számon letétbe helyezett törzs NRRL B-21661 nyilvántartási számon (CCRC 910106) letétbe helyezett törzzsel együtt kifejtett szinergetikus gombaölő hatására vonatkozik.

Általánosan ismert, hogy különféle mikroorganizmusok olyan biológiai aktivitást mutatnak, amely növényi betegségek elleni védekezésre használható. Jóllehet nagy fejlődés történt a mezőgazdasági és kertészeti szempontból fontos különféle növényi betegségek elleni védekezésre szolgáló biológiai peszticidek azonosításának és kifejlesztésének szakterületén, az alkalmazásban lévő peszticidek legnagyobb része még mindig szintetikus vegyület. E kémiai gombaölő szerek egy részét a Környezetvédelmi Iroda (Environmental Protection Agency, EPA) rákot okozó anyagként osztályoz, és mint ilyen a vadvilágra és más, nem a célfaj2 hoz tartozó egyedre toxikus. Továbbá a patogének rezisztenciát szerezhetnek a kémiai peszticidekkel szemben. Lásd, például, Scwinn és mtsai.: Advances In Plant Pathology: Phytopathora infestans, The Cause of Late Blight of Potato, p. 244, Academic Press, San Diego, Calif. (1991) .

biológiai védekezés kiváló alternatívát kínál a szintetikus kémiai gombaölő szerekkel szemben. A biopeszticidek (élő szervezetek és az ilyen szervezetek által természetes úton előállított vegyületek) biztonságosabbak, biológiai úton jobban lebonthatók és kifejlesztésük kevésbé költséges.

Az egyik ilyen általánosan alkalmazott biopeszticid a gram— pozitív Bacillus thuringiensis baktérium. A peszticid hatású B. thuringiensis törzsekről ismert, hogy a spóraképződés során kristályos fehérjéket termelnek, amelyek specifikusan toxikusak a rovarok és a nematódák bizonyos rendjeire és fajaira (lásd, például az US 4,999,192 és US 5,208,017 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat). A B. thuringiensis által termelt fehérjeszerű endotoxinok is rovarölő szerként hatnak a kukoricabogár és más bogarakkal szemben (például US 518709 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás és Johnson, TJ. és mtsai., (1993), J. Econ. Entomol. 86:330-333). A B. thuringiensis endotoxinok tisztított kristályokként, kimosott sejt pelletekként, és expresszált fehérjékként tűnnek hatásosnak. Warren és mtsai., a WO 96/10083 számú PCT közzétételi iratban nem-endotoxin fehérjéket ismertetnek, amelyeket a Bacillus cereus és a B. thuringiensis vegetatív szakaszukban termelnek. A Vipl és Vip2-nek nevezett vegetatív fehérjék hatékony aktivitással bírnak a kukoricabogárral (északi és nyugati kukoricabogár3 ral) szemben. Lásd, például Estruch és mtsai. (1997), NatureBiotechnology 15: 137-141.

A B. thuringiensis egyik hőstabil metabolitja, amelyet bétaexotoxinnak neveznek, szintén peszticid tulajdonságokat mutatnak. Burgjeron és Biache (1979), Entomophaga 11:279-284 egy olyan béta-exotoxinról számoltak be, amely hatásos volt az amerikai burgonyabogárral (Leptinotarsa decemlineate) szemben. Továbbá az ismert B. thuringiensis béta-exotoxinok nem specifikus peszticid aktivitást mutatnak, nemcsak a nematódákat pusztítják el, hanem a legyeket, sereghernyókat, atkákat és a kukoricabogarat is. A szigma-exotoxin hasonló szerkezettel rendelkezik, mint a béta-exotoxin és az amerikai burgonyabogárral szemben hatásos. Lásd, Argauer és mtsai. (1991), J. Entomol. Sci. 26: 206-213. Az alfa-exotoxin a Musca domestica lárvájára toxikus (Cluthy (1980), FEMS Microbiol. Lett. 8:1-7). A gamma-exotoxinok különféle proteolitikus enzimek, kitinázok és proteázok. A gammaexotoxinok toxikus hatásai csak a béta-exotoxinnal vagy a deltaendotoxinnal együtt nyilvánulnak meg. Lásd, Forsberg, C., „Bacillus thuringiensis: Its effects on Environmental Quality National Research Council of Canada, Publication No. NRCC 15385, pp. 91-109 (1976). Stonard és mtsai. (1994), ACS Symposium

Series 551:25, egy vízoldható másodlagos metabolitot ismertetnek, amely a Bacillus cereus törzs felülúszójában hatásos a kukoricabogárral szemben.

A zwittermicin A egy vízben oldódó, savas körülmények között stabil egyenes aminopoliol molekula, amely széles spektrumú aktivitással rendelkezik számos gomba-eredetű és bakteriális növényi betegséggel szemben. A zwittermicin A a B. thuringiensis aktivitásának fokozására is ismert. Manker és mtsai. (WO 96/39037 számú PCT közzétételi irat) voltak az elsők, akik meghatározták a zwittermicin A B. thuringiensis—fokozó képességeit és tulajdonságait. Ezt követően Schnepf és mtsai. is ismertették, hogy a zwittermicin A fokozta a B. thuringiensis hatását (US 5702703 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) .

A bacilusokról ismert, hogy gomba elleni és baktérium elleni másodlagos metabolitokat termelnek. Lásd, Korzybski és mtsai. „Antibiotics isolated from the genus Bacillus (Bacillaceae), Antibiotics — Origin, Nature and Properties, American Society for Microbiology, Washington, D.C. Vol. Ill (1978), and Berdy, CRC Handbook of Antibiotic Compounds, Vols. I-XIV, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1980-87). A B. pumilus által termelt vegyületek magukban foglalják a mikrococcin P-t, pumilint és a tetaint.

Kawaguchi és mtsai., az US 4250170 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban egy új, Bad 1lus—ból származó vízoldható antibiotikumot izoláltak, amely a gram-pozitív és gram-negatív baktériumok széles tartományával szembeni aktivitással rendelkezik. Stabb és mtsai., (1990) Applied Environ. Microbiol. 60:4404-4412 bizonyos Bacillus fajhoz tartozó törzseket (ilyenek a B. subtilis, B. cereus, B. mycoides, B. thuringiensis) azonosítottak, amelyek gomba elleni aktivitást mutatnak. E törzsekről kimutatták, hogy zwittermicin A-t és/vagy kanozamint termelnek. Lásd, Milner és mtsai., Appl. Environ. Microb. 62:3061-3066 (1996). Ezek antibiotikus szerek, amelyek hatásosak a talajeredetű betegségek okozta elrothadással szem ben, amelyeket a Phytopa thora medicaginis, P. nicotianae, P. aphanidermatum vagy Scierotinia minor okoz (Lásd, Stabb és mtsai., előzőleg megadott). A zwittermicin-A egy vizoldható, savas körülmények között stabil egyenes aminopoliol molekula. Lásd, He és mtsai., (1994) Tetrahedron Lett. 35(16):2499-2502. A zwittermicin-A széles spektrumú aktivitással rendelkezik számos gomba eredetű és bakteriális növényi patogénnel szemben. A Kanozamin (Milner és mtsai., 1996) a gomba eredetű növényi patogének széles tartományát és néhány bakteriális fajt is gátol .

Handelsman és mtsai., az US 5,049,379 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetik, hogy a zwittermicin-A-t termelő B. cereus hogyan védekezik a lucerna és a szójabab esetén bekövetkező rothadás ellen. Amikor a magot B. cereus ATCC 53522-vel vonták be, a gyökérrothasztó gombák patogén aktivitását sikerült gátolni. Hasonlóan, bizonyos B. cereus törzsek spóra-alapú készítményeinek alkalmazása a szójabab magokon vagy a magokat körülvevő talajon a szójabab hozam növekedését mutatja a szántóföldeken. Lásd, Osburne és mtsai. (1995) Am. Phytopathol. Soc. 79(6) :551-556. A biopeszticideket alkalmazó eljárások jól ismertek a szakterületen és magukban foglalják, például a nedvesíthető porokat, száraz folyásra képes anyagokat, mikrokapszulázást, és a mikrobák, a teljes fermentlé vagy a megfelelő tenyészetekből származó antibiotikus frakciók folyékony készítményeit. Lásd, például Rossall US 5,061,495 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírását és Handelsmann és mtsai. US 5,049,379 számú amerikai egyesült ál lamokbeli szabadalmi leírását.

Tsuno és mtsai. (1986) J. Antibiotics XXXIX(7):1001-1003 a B. pumilusból származó új amino-cukor antibiotikumot ismertettek, amely a baktériumok széles tartományával szemben rendelkezik in vitro aktivitással.

Khmel, I.A. és mtsai. (1995) az SU 1817875 számú oroszországi szabadalmi leírásban egy új Bacillus pumilus VKM CR-333D törzset ismertetnek, amelyet gombaeredetű fitopatogének és baktériumok elleni védekezésre alkalmaztak.

Leifert és mtsai., J. Appl. Bacteriol. 78:97-108 (1995) arról számoltak be, hogy két Bacillus törzs, a B. subtilis CL27 és a B. pumilus CL 45 segítségével Botrytis-elleni és Alternaria-elleni antibiotikumokat termeltek. A teljes fermentlé és a sejtmentes szűrlet is hatásos volt a Botrytisszel és az Alternariával szemben az in vitro vizsgálatokban, és hatásos volt a Botrytisszel szemben az in vivo Astilbe-n végzett növényi vizsgálatokban. Leifert és mtsai. (1997) az US 5,597,565 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi lírásban olyan B. subtilis, B. pumilus és B. polymyxa törzseket ismertetnek, amelyek különösen hatékonyak a gombák, például Alternaria brassicicola és a Botrytis cinerea okozta betakarítás utáni betegségek gátlásában. Ők ismertetik továbbá a sejtmentes tenyészszűrletben előállított antibiotikumok jelenlétét és aktivitásukat különböző pH-értéken, de a vegyületeket nem azonosították. A B. subtilis-ból származó vegyületek alacsony pH-η elvesztik aktivitásukat, míg a B. pumilus extraktumokból nyert aktivitás csak 5,6 pH érték alatt fejti ki hatását. Leifert és mtsai. (1998) US 5,780,080 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás olyan káposztákat ismertetnek, amelyek B.

subtilis, B. pumilus és B. polymyxa törzsekkel kezelhetők az Alternaria brassicicola és a Botrytis cinerea gátlására.

Loeffler és mtsai. (1986) J. Phytopathology 115:204-213 olyan B. subtilis, B. pumilus, B. licheniformis és B. coagulans törzseket ismertetnek, amelyek különféle gomba elleni és antibakteriális aktivitással rendelkező antibiotikumokat termelnek. A B. pumilus bacilizint és iturin A-t termelt. A bacilizin 270 molekulatömeggel rendelkező nagyon kicsi vegyület, amely csak az élesztőket gátolja. Az iturinek, amelyek poláris oldószerekben oldódnak széles gomba elleni és antibakteriális aktivitással rendelkeznek.

Az US 5,344,647 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban Rossall széles gomba elleni aktivitással rendelkező Bacillus subtilis törzseket ismertet. Ezenfelül az US 5,061,495 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban Rossall egy olyan B. subtilisból származó új antibiotikumot biztosít, amelynek a molekulatömege 63500 dalton, pH 5 érték alatt csapadékot képez és a gram-pozitív baktériumokkal és gombákkal (Botrytis és Erysiphe) szembeni aktivitással rendelkezik. Sholberg és mtsai. (1995) Can. J. Microbiol. 41:247-252, Swinburne és mtsai. (1975) Trans. Brit. Mycol. Soc. 65:211-217, Singh és Deverall, (1984) Trans. Br. Mycol. Soc. 83:487-490, Ferreira és mtsai. (1991) Phytopathology 81:283-287 és Baker és mtsai. (1983) Phytopathology 73:1148-1152. E publikációk mindegyike a Bacillus fajok és a Bacillus subtilis alkalmazását ismertetik a gomba eredetű növényi patogének biológiai védekező szereként. Pusey és mtsai. (1988) Plant Dis. 72:622-626, Pusey és mtsai. US 5,047,239 számú amerikai egyesült államokbeli sza badalmi leírás és McKeen és mtsai. (1986) Phytopathology 76:136139 a betakarítás utáni gyümölcsrothadás elleni védekezést ismertet a B. subtilis alkalmazásával. McKeen és mtsai., előzőleg megadott, az alacsony molekulatömegű iturin gyűrűs polipeptidekhez hasonló antibiotikumokat mutatnak be, amely hozzájárul a B. subtilis említett gombaölő aktivitásához.

Liu és mtsai. az US 5,403,583 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban egy Bacillus fajt (ATCC 55000) és a gomba eredetű növényi patogén, a Rhizoctonia solani elleni védekezésre szolgáló eljárást ismertetnek. Islam és Nandi (1985) J. Plant Dis. Protect. 92(3):241-246, a rizs barna foltosodását okozó Drechslera oryzae-val antagonista Bacillus fajt ismertetnek. Ugyanazon szerzők, Islam és Nandi (1985) J. Plant Dis. Protect. 92(3):233-240 a Bacillus faj in vitro antagonizmusát is ismertették a Drechslera oryzae, Alternaria alternata és a Fusarium roseum fajokkal szemben. A publikáció a tenyészet szűrletében lévő három alkotóelemet ismertet. A leghatásosabb antibiotikum a vízben és metanolban nagyon jól oldódott és UV 255 nm-en csúccsal és 260 nm-en vállal rendelkezik, amelyről kiderült, hogy egy polioxin-szerű lipopeptid. Cook és mtsai. (1987) Beltwide Cotton Production Research Conferences, Dallas, TX, pp. 43-45 publikációban egy Bacillus faj szuszpenziójának alkalmazását ismerteti a gyapot gyökerének rothadását okozó Phymatotriehum omnivorum által elpusztított gyapot növények számának csökkentésére.

B'Chir és Namouchi (1988) Revue Nématologique 11(2):263-266 publikációban, egy olyan Bacillus pumilust ismertetnek, amely nematódákat csapdába ejtő gombákat stimulál, ezáltal növelve azon képességüket, hogy csapdába csalják a nematódákat. B'Chir és Belkadhi (1986) Med. Fac. Landbouww. Rij ksuniv. Gent 51/3b:1295-1310, egy gomba (Fusarium) és a nematódák sejtes kölcsönhatásait ismertetik, amely a citrom- és narancsfélékben okoz fertőzést. A gomba kapcsolódik a B. pumilus-sal (együtt fordulnak elő) és amikor a nematóda is azon a helyen van a gomba erősebben hat. A B. pumilus úgy tűnik, hogy táplálékot biztosit a nematódák számára. Gokte és Swarup (1988) Indian J. Némától. 18(2):313-318, úgy mutatják be a B. pumilust, hogy az nematóda ellenes hatással bir, de nem ismertetik annak bármilyen gomba elleni aktivitását. Slabospitskaya és mtsai. (1992) Mikrobiol Zh (Kiev) 54(6):16-22, különféle Bacillus fajokat, beleértve a B. pumilust hasonlít össze azon képességük alapján, hogy kitinázokat termelnek, de nem ismertetik a növényi patogénekkel szembeni aktivitásukat. A B. pumilus termeli a legalacsonyabb szinten a kitinázt. Mclnroy és mtsai. (1995) Plant and Soil 173(2):337-342 publikációban számos baktérium típust, köztük számos Bacillus fajt és B. pumilust tanulmányoztak, amelyek endofiták a növényi szárban és gyökerekben. Azonban nem mutatták bizonyítékát annak, hogy ezek az endofita törzsek gomba elleni hatással rendelkeznének. Chermin és mtsai. (1995) Molecular Genetics, találtak egy olyan Bacillus pumilus-t, amely az aktivitás széles spektrumával rendelkezik növényi betegséget okozó baktériumokkal (például Xanthomonas, Pseudomonas, Erwinia) és gombákkal szemben. Fey és mtsai. (1991) Akad Landwirts Kart, olyan B. pumilus törzseket mutatnak be, amely a burgonyamagok számára biztosít némi védelmet a Rhizoctonia solani-val szemben.

A találmány tárgya egy új antibiotikum-termelő Bacillus faj, amely csak bizonyos specifikus növényi patogénekkel szemben mutat gomba elleni aktivitást, és nem mutat antibakteriális aktivitást. A találmány tárgya továbbá eljárás növények, gyümölcsök és gyökerek gombafertőzésekkel szembeni kezelésére vagy védelmére, amely egy antibiotikum-termelő Bacillus faj hatékony mennyiségének alkalmazási lépéséből áll. Az antibiotikum-termelő Bacillus faj a teljes fermentlében lévő szuszpenzióként vagy az antibiotikum-termelő Bacillus faj teljes fermentléből nyert részben tisztított antibiotikumot tartalmazó felülúszóként biztosítható. A találmány tárgya továbbá egy új vízoldható antibiotikum, amely specifikus gomba elleni aktivitást mutat, és antibakteriális aktivitást nem mutat.

A találmány tárgya továbbá egy új vegyület, amely fokozza a B. thuringiensis inszekticid aktivitását. A vegyületet a B. pumilus teljes fermentlevéből vagy felülúszójából izoláljuk, amely a B. thuringiensis-szel kombinálva fokozza annak inszekticid aktivitását. A találmány tárgya továbbá eljárás növények kezelésére a növényeken vagy a növényekben lévő rovar fertőzések elleni védelem céljából egy Bacillus bakteriális szuszpenzióval vagy egy Bacillus-tenyészet metabolit-tartalmú felülúszójával vagy tisztított metabolitokkal.

A találmány tárgya továbbá a B-30087 törzs B21661 (AQ 713) törzzsel történő kombinálása fungicidként történő alkalmazásra, ahol a törzsek együttes alkalmazása nagyobb hatékonyságot biztosít, mint amikor külön-külön alkalmaznánk őket.

Az 1. ábra az NRRL B-30087 nyilvántartási számon letétbe helyezett Bacillus faj részlegesen tisztított fungicid hatású frakciójának 400 MHz-en DzO-ban felvett NMR spektruma.

A 2. ábra a zwittermicin A 400 MHz-en D₂O-ban felvett ¹H NMR spektrumát mutatja.

A 3A-3C. ábrák a 9. példában ismertetettek szerinti Bacillusból izolált felülúszó kapilláris elektroferogramjai. Az elektroforézis körülményei: egy 56 cm-es bevonat nélküli kapillárist használtunk 40°C-on, 30 kV, pozitív polaritás, 100 μΑ 5,8-as pH-jú nátrium-foszfát puffer, UV detektálás 200 nm-en. A 3A ábra a Bacillus pumilus B-30087 teljes fermentlé kapilláris elektroferogramja. A 3B ábra a Bacillus pumilus B-30087 teljes fermentlé kapilláris elektroferogramja zwittermicin A standarddel feltöltve. A zwittermicin A csúcs a futási idő 3,25 perc körül tűnik elő; nem eluálódik együtt más a teljes fermentlében lévő csúccsal. A 3C ábra mutatja a zwittermicin A standard 3,28 perc körüli futási idejét.

A 4. ábra az NRRL B-30087 nyilvántartási számú részbentisztitott frakció (4A ábra), az NRRL B-30087 nyilvántartási számú részlegesen tisztított frakció és a zwittermicin A (4B ábra), és a zwittermicin A (4C ábra) kapilláris elektroforézis (CE) vizsgálat három elektroferogramjának összehasonlítása.

Az 5. ábra mutatja Β-30087-ből izolált, Bt fokozóként aktivitással rendelkező részlegesen tisztított aktív frakciójának 400 MHz-en D₂0-ban felvett ^XH NMR spektrumát.

A találmány a Bacillus faj egy új törzsének minden sajátosságával rendelkező törzs és azok mutánsainak vagy variánsainak biológiailag tiszta tenyészetét biztosítja, amely csak specifikus növényi patogének, például üszöggomba, lisztharmatok és peronoszpórák esetében rendelkezik gomba elleni aktivitással. Ezt az új B. pumilus törzset 1999 Január 14.-én az Agricultural

Research Culture Collection (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Ill. 61604, USA gyűjteményben és a Szabadalmi Eljárás Céljából a Mikroorganizmusok Letétbehelyezésének Nemzetközi Elismerésével kapcsolatos Budapesti Szerződés rendelkezései alapján az NRRL B-30087 nyilvántartási számon helyeztük letétbe. Az NRRL B-21661 nyilvántartási számmal jelzett törzset ugyanabban az intézetben 1997 Március 7.-én helyeztük letétbe. Ezt később az American Type Culture Collection (ATCC) segítségével Bacillus subtilis-ként azonosítottuk.

A találmány tárgya továbbá eljárás gomba okozta betegségek növényekben, növényi gyökerekben történő megakadályozására és kezelésére az ilyen bakteriális törzsek vagy antibiotikumottartalmazó felülúszók vagy az ilyen bakteriális törzsekből nyert tiszta antibiotikumok felhasználásával. A találmány továbbá magában foglal egy vízben oldódó, gomba elleni antibiotikumot, amelynek a molekulatömege kisebb, mint 10000 dalton, hőre gyengén bomlékony, pozitívan töltött, és UV abszorbanciával mért HPLC csúcs maximuma 280 nm-en és a válla 230 nm-en van. Az antibiotikum nem a zwittermicin A.

A találmány további megközelítései magukban foglalják a B. pumilus teljes fermentlé tenyészetét vagy felülúszóját, amelyet a B. thuring iensis-szel kombinálva a B. thuringiensis inszekticid aktivitását fokozza. A találmány továbbá magában foglalja a növények kezelésének eljárásait a növényeken vagy a növényekben lévő rovar-fertőzések elleni védekezés céljából a Bacillus bakteriális szuszpenziójával vagy a Bacillus tenyészetének metabolit-tartalmú felülúszójával vagy tisztított metabolitokkal.

A találmány egy további megközelítése a B. pumilus (NRRL B30087) törzs B. subtilis (NRRL B-21661) törzzsel fungicidként történő együttes alkalmazásának nem várt szinergetikus hatása. Meghatározások

Amint azt a leírásban és az igénypontokban használjuk az „egy határozatlan és az „a, „az határozott névelők egyes számú alakja magában foglalja a többes számú hivatkozásokat, kivéve, ha az összefüggés másképpen meg nem szabja. Például az „egy sejt kifejezés magában foglalja a sejtek sokaságát, beleértve azok keverékeit.

Amint azt a leírásban használjuk, a „tartalmaz kifejezés alatt azt értjük, hogy a készítmények és az eljárások felsorolt alkotóelemeket foglalnak magukban, de ez nem zár ki más elemeket. A „lényegében valamiből áll kifejezés, amikor készítmények és eljárások meghatározásához használjuk a bármely lényeges jelentés más alkotóelemeinek kizárását fogja jelenteni az összetétel esetén. így a leírásban megadottak szerinti lényegében alkotóelemekből álló készítmény nem zárja ki az izolálási és tisztítási eljárásból származó nyomnyi szennyeződéseket és a gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagokat, például a foszfátpufferolt sóoldatot, konzerválószereket és hasonlókat. A valamiből „áll kifejezés alatt kell érteni mindent, ami nagyobb menynyiségű, mint a más alkotórészek nyomnyi elemei és a lényeges eljárási lépéseket, amelyek a találmány szerinti készítményekhez vezetnek. Az ilyen átmeneti kifejezések mindegyike által meghatározott kiviteli példák a találmány oltalmi körébe tartoznak.

Az „izolált kifejezést a „biológiailag tiszta kifejezéssel felcserélhető módon használjuk és ez a más alkotórészektől, le gyen az sejtes, vagy másmilyen, elválasztott alkotóelemet jelenti, amelyben a törzs vagy a metabolit normális körülmények között a természetben előfordul.

Amint azt a leírásban használjuk a „biológiai védekezés kifejezés a patogén vagy rovar ellen egy második szervezet alkalmazásával történő védekezésként határozzuk meg. A biológiai védekezés ismert mechanizmusai magukban foglalják az olyan enterobaktériumokat, amelyek a gyökér felszínén a helyért versengő gombák által okozott gyökérrothadással szemben nyújtanak védelmet. Bakteriális toxinokat, például antibiotikumokat alkalmaznak a patogének elleni védekezésre. A toxin izolálható és közvetlenül alkalmazható a növényen vagy a baktérium fajokat adhatjuk a növényhez, így az a toxint in situ termeli.

A „gomba vagy „gombák kifejezés magában foglalja a maganyaggal ellátott spórát hordozó szervezetek széles választékát, amelyek nem rendelkeznek klorofillal. A gombákra példák az élesztő, penész, üszög és az ehető gombák.

A „baktériumok kifejezés magában foglal bármely olyan prokarióta szervezetet, amely nem rendelkezik körülhatárolt sej tmaggal.

A „fungicid hatás kifejezés egy anyag azon képességét jelenti, hogy növeli a gombák elpusztulását vagy gátolja a gombák növekedési sebességét.

Az „antibiotikum kifejezés magában foglal bármely olyan anyagot, amely képes elpusztítani vagy gátolni egy mikroorganizmust. Az antibiotikumok egy mikroorganizmus által vagy egy szintetikus eljárás vagy egy félszintetikus eljárás által állíthatók elő. A kifejezés, tehát magában foglal egy anyagot, amely gátol ja vagy elpusztítja a gombákat, ilyen például a zwittermicin A vagy a kanozamin.

A „gomba elleni kifejezés magában foglal bármely olyan anyagot, amely képes elpusztítani a gombákat, vagy gátolni azok növekedését.

A „tenyésztés kifejezés az organizmusok szaporítására utal különféle típusú közegben vagy közegen.

A „teljes fermentlé kifejezés a sejteket és a közeget is tartalmazó folyékony tenyészetre utal.

A „felülúszó a visszamaradó folyékony fermentlére utal, amikor a fermentlében növesztett sejteket centrifugálással, szűréssel, kiülepitéssel, vagy más a szakterületen jól ismert eszközzel távolítjuk el.

Amint azt a leírásban használjuk a „rovarok kifejezés magában foglal minden szervezetet, amely az „Insecta osztályba tartozik. A „kifejlődés előtti rovarok kifejezés egy szervezet bármely olyan alakjára utal, amely a kifejlett állapot előtt van, beleértve, például a petéket, lárvákat és a bábokat. Az „inszekticid hatás egy anyag azon képességére utal, hogy növeli a rovarok halálozási arányát vagy gátolja a növekedésük sebességét. A „nematicid hatás egy anyag azon képességére utal, hogy növeli a nematódák halálozási arányát vagy gátolja a növekedésük sebességét. A „peszticid hatás egy anyag azon képességére utal, hogy növeli a rovarok, nematódák és atkák halálozási arányát vagy gátolja a növekedésük sebességét.

A „pozitív kontrol kifejezés egy olyan vegyületet jelent, amelyről ismert, hogy peszticid aktivitással rendelkezik. A „pozitív kontrolok magukban foglalják, nem korlátozó jelleggel, a kereskedelemben kapható kémiai peszticideket. A „negatív kontrol kifejezés egy olyan vegyületet jelent, amelyről ismert, hogy nincs peszticid aktivitása. A negatív kontrolra példák a víz vagy az etil-alkohol.

Az „oldószer kifejezés magában foglal, bármely olyan folyadékot, amely más anyagot oldatban tart. Az „oldószerrel extrahálható kifejezés bármely olyan vegyületre utal, amely egy oldószerben oldódik, és amely ezután izolálható az oldószerből. Az oldószerekre példák, nem korlátozó jelleggel a szerves oldószerek, mint az etil-acetát.

A „metabolit kifejezés bármely olyan vegyületre, anyagra vagy egy mikroorganizmus fermentációjának melléktermékére utal, amely peszticid aktivitással rendelkezik. Az antibiotikum a fentiek szerinti meghatározás alapján egy olyan metabolit, amely specifikusan egy mikroorganizmussal szemben aktív.

A „készítmény kifejezés alatt a hatóanyag és más vegyület vagy összetétel, amely inert (például, egy detektálható anyag vagy jelzés) vagy aktív, például egy adjuváns kombinációját szándékozunk érteni.

A „frakció kifejezés alatt a felülúszó molekuláinak elválasztásához használt méret, polaritás vagy töltés alapján végzett frakcionálási vizsgálatból származó alikvótot szándékozunk érteni.

A „részlegesen tisztított frakció kifejezés a frakcionálási vizsgálatban összegyűjtött alikvótok egyike, amely képes egy biológiai vizsgálat során gátolni a csírázást vagy fokozni a B + aktivitást lepioloplaus-szal szemben.

A „hatékony mennyiség egy olyan mennyiség, amely elegendő a hasznos vagy kívánt eredmény eléréséhez. A hatékony mennyiség egy vagy több felhasználásban alkalmazható. A kezelés és a védekezés szempontjából a „hatékony mennyiség olyan mennyiség, amely elegendő a rovarfertőzés enyhítésére, stabilizálására, visszafordítására, lassítására vagy késleltetésére.

A leírásban egy törzs olyan biológiailag tiszta tenyészetét ismertetjük, amely rendelkezik az NRRL B-30087 nyilvántartási számon letétbe helyezett Bacillus faj és mutánsai új antibiotikum-termelő törzsének azonosító jegyeinek mindegyikével, amely csak bizonyos növényi patogénekre specifikus gomba elleni aktivitással rendelkezik, és nem rendelkezik antibakteriális aktivitással. Egyik megközelítésben a törzs az NRRL B-30087 nyilvántartási számon letétbe helyezett Bacillus pumilus és a törzs mutánsai.

Egy másik megközelítésben a törzs az NRRL B-30087 nyilvántartási számon letétbe helyezett törzs mutánsa vagy variánsa, amely rendelkezik az NRRL B-30087 nyilvántartási számon letétbe helyezett törzs azonosító jegyeinek (amint a későbbiekben megadjuk) összességével. A mutánst vagy a variánst a leírásban felcserélhető módon használjuk és a továbbiakban aszerint azonosíthatók, hogy egy olyan genommal rendelkeznek, amely erősen sztringens körülmények között az NRRL B-30087 nyilvántartási számon letétbe helyezett törzs genomjával hibridizál. A „hibridizáció kifejezés egy olyan reakcióra utal, amelyben egy vagy több polinukleotid reagál komplexet képezve, amely hidrogénkötéseken keresztül stabilizálódik a nukleotid maradékok bázisai között. A hidrogén-kötés Watson-Crick bázispárosodás, Hoogsteinkötődés, vagy bármely más szekvencia-specifikus módon megtörtén het. A komplex tartalmazhat két szálat duplex szerkezetet képezve, három vagy több szálat többszálú komplexet képezve, egy egyszerű önhibridizáló szálat, vagy ezek bármely kombinációit. A hibridizációs reakciókat különféle sztringens körülmények között végezhetjük. Általában a kevésbé sztringens hibridizációs reakciót 40 °C körül 10xSSC-ben vagy egy ezzel azonos ionerősségű/hőmérsékletű oldatban végezzük. A közepesen sztringens hibridizációs reakciót jellegzetesen 50 °C körül 6xSSC-ben oldatban, és az erősen sztringens hibridizációs reakciót általában 60 °C körül IxSSC-ben oldatban végezzük.

Az NRRL B-30087 nyilvántartási számon letétbe helyezett törzs mutánsa vagy variánsa egy olyan törzsként is megadható, amely olyan genom szekvenciával rendelkezik, amely 85 %-nál nagyobb, előnyösebben 90 %-nál nagyobb vagy előnyösebben 95 %-nál nagyobb szekvencia azonossággal bír az NRRL B-30087 nyilvántartási számon letétbe helyezett törzs genomjával. Egy polinukleotid vagy polinukleotid régió (vagy egy polipeptid vagy polipeptid régió) bizonyos százalékú (például, 80%, 85%, 90% vagy 95%) szekvencia azonossága egy másik szekvenciához, azt jelenti, hogy amikor egymás mellé állítjuk őket, akkor a bázisok (vagy aminosavak) hány százaléka azonos a két szekvencia összehasonlításakor. Ezt az összehasonlítást és a százalékos homológiát vagy szekvencia azonosságot a szakterületen ismert szoftverekkel határozhatjuk meg, amelyeket a CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F.M. Ausubel és mtsai., eds., 1987) a 7.7.18-as szakaszban, 7.7.1 táblázatban, 30-as mellékletben ismertetnek. A sorbaállításhoz előnyösen az alapbeállításokat használjuk. A sorbaállításhoz használt előnyös program a BLAST, amely alapparamétereket használ. Különösen előnyös programok a BLASTN és a BLASTP, amelyek a következő alapparamétereket alkalmazzák: genetikai kód = standard; szűrő = nincs; szál = mindkettő; vágási érték = 60; várakozás = 10; Mátrix = BLOSUM62; megjelenítés = 50 szekvencia, felsorolás = legközelebbi találat szerint; adatbázisok = nem redundáns, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS transzlációk+SwissProtein+Spupdate+PIR. A programok részletei a következő internetes címen találhatók meg: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST.

A találmány továbbá a fent említett tenyészetekből nyert felülúszókat biztosít. A felülúszó a szakterületen jól ismert eljárások segítségével nyerhetők, ilyenek a centrifugálás, szűrés, ülepítés és hasonlók.

Egy másik megközelítésben a találmány egy olyan izolált metabolitot foglal magában, amely vízben oldódó gomba elleni antibiotikum. A metabolitot a találmány szerinti és a már előzőekben ismertetett törzsekből izoláljuk. Ennek a következő kémiai jellemzőkkel kell rendelkeznie: 10000 daltonnál kisebb molekulatömeg, UV kimutatási csúcs 280 nm-nél és váll 230 nm-nél, sav és bázis stabilitás, 80°C felett enyhén hőérzékeny, és pozitívan töltött, specifikus növényi patogénekre rendelkezik aktivitással, de nem rendelkezik aktivitással a baktériumokkal szemben. A találmány továbbá eljárást biztosít az ilyen metabolit termelésére, ahol az eljárás a találmány szerinti törzs tenyésztéséből és az aktív metabolit későbbiekben ismertetett eljárások segítségével történő izolálásából áll.

A találmány egy további megközelítése az NRRL B-30087 nyil vántartási számon letétbe helyezett törzs egy részlegesen tisz titott aktív frakciója, amely gomba elleni aktivitással rendelkezik. Az aktív frakció nem azonos a zwittermicin A-val.

A találmány továbbá olyan készítményeket biztosít, amelyek a fenti törzsek bármelyikét (beleértve azok mutánsait vagy variánsait), felülúszókat, frakciókat és metabolitokat önmagában vagy egymással kombináltan egy hordozóval együtt tartalmazzák. Ezek a készítmények kiegészíthetők legalább egy kémiai vagy biológiai peszticiddel is. A készítmények különféle formulázással nyerhetik el alakjukat, ilyenek például, nem korlátozó jelleggel a nedvesíthető porok, szemcsés formulák, vizes szuszpenzió, emulgeálható koncentrátumok vagy mikrokapszulák.

Azért, hogy a készítmények jó diszperzióját és adhézióját érjük el a találmány keretein belül, előnyös lehet a teljes fermentlé, felülúszó, frakció és/vagy metabolit/antibiotikum formulázása olyan komponensekkel, amelyek segítik a diszperziót és az adhéziót. Ennek megfelelően az erre alkalmas formulázási eljárások szakember számára ismertek (nedvesíthető porok, szemcsék és hasonlók, vagy egy megfelelő közegben mikrokapszulázhatók és hasonlók, folyadékok, például vizes folyóképes anyagok és vizes szuszpenziók, és emulgeálható koncentrátumok) . Szakemberek számára más megfelelő formulázások is ismertek.

A hatóanyagot tartalmazó fent említett törzsek, metabolitok, frakciók, felülúszók és készítmények bármelyike alkalmazható a növények, gyökerek vagy gyümölcsök gombafertőzésének kezelésére és gombafertőzéssel szembeni megvédésére szolgáló eljárás biztosítására. Az eljárás a hatóanyagot tartalmazó törzs, metabolit, frakció, felülúszó vagy készítmények hatékony mennyiségének ön magában vagy egymással kombinálva és/vagy más biológiai vagy kémiai peszticiddel a fertőzött gyökéren, növényen vagy gyümölcsön történő alkalmazásából áll. E készítmények hatékony mennyisége az ilyen fertőzések megakadályozására is alkalmazható a növényen, gyökéren vagy gyümölcsön.

A találmány egy további megközelítése eljárást foglal magában gombabetegségekben szenvedő növények, gyökerek vagy gyümölcsök kezelésére vagy ezek gombabetegségekkel szembeni védelmére, amely egy olyan törzs vagy annak variánsa által termelt antibiotikum hatékony mennyiségének alkalmazásából áll, amely törzs rendelkezik az új NRRL B-30087 nyilvántartási számon letétbe helyezett Bacillus faj törzsének összes azonosító jegyével. Egy megvalósításban a törzs az NRRL B-30087 nyilvántartási számon letétbe helyezett Bacillus faj.

A találmány továbbá egy olyan vízoldható vegyületet biztosít, amely fokozza a Bacillus thuringiensis inszekticid aktivitását, ahol a vegyület 10000 daltonnái kisebb molekulatömeggel rendelkezik és a vegyület nem a zwittermicin A. A vegyület nem béta-exotoxin vagy más Bacillus thuringiensis által termelt exotoxin.

A vegyület anioncserélő gyanta, acetonitriles kicsapás és méretkizárásos kromatográfia (SEC) segítségével izolálható. A találmány a Bacillus törzs felülúszójának részlegesen tisztított frakcióját is biztosítja, amely az új vegyületet tartalmazza. Az új vegyület és aktív frakció a Bacillus fajokhoz tartozó Bacillus törzsekből izolálhatok, ilyenek például, nem korlátozó jelleggel a B. subtilis, B. cereus, B. mycoides, és a B. pumilus.

A részlegesen tisztított aktív frakció, annak ^XHNMR (vagy proton NMR) spektrumával azonosítható, amelyek lehetővé teszik egy vegyész számára, hogy meghatározza, ha egy vegyület teljesen tiszta. Amennyiben egy vegyület tiszta az egy protont jelző csúcs egy tetszés szerinti értékre fog integrálódni. A két protont jelző csúcsok, például a metilén-csoport esetében a kettő értékére fog ezután integrálódni. A három protont jelző csúcsok, például a metil-csoport esetében a három értékre fognak ezután integrálódni. Ez az eset áll fenn a 3. ábrán a tiszta zwittermicin A standard esetében. Azonban az aktív, részlegesen tisztított Bacillus thuringiens 1st fokozó anyag a csúcsok olyan csoportjával rendelkezik, amely kevesebb, mint egyre integrálódik, és ezáltal a nagyobb csúcsokból származó különálló vegyülethez tartoznak a spektrumban.

Az izolálás során a vegyület nem mutat inszekticid aktivitást. A Bacillus thuringiensis törzzsel történő kombinálás fokozza a Bacillus thuringiensis inszekticid hatását, amikor a növényeken és növényi gyökereken alkalmazzuk. A Bacillus thuringiensis egy mikroba törzs, egy kereskedelmi termék, genetikailag módosított növény, inszekticid hatás szempontjából aktív metabolit, inszekticid hatás szempontjából aktív felülúszó vagy egy delta endotoxin alakjában lehet jelen.

A Bacillus thuringiensis Gram-pozitív, spóraképző baktérium, amelyet paraspórás kristályfehérje-zárványok jellemeznek. A fehérjék erősen toxikusak lehetnek a kártevőkre, és specifikusak lehetnek a toxikus aktivitásukban. Amint azt a későbbi igénypontokban használjuk a „Bacillus thuringiensis kifejezés mikroba törzseket, az ilyen törzseket tartalmazó kereskedelmi termékeket vagy a törzsekből izolált aktív metabolitokat vagy frakciókat tartalmazó izolátumokat, vagy genetikailag módosított vagy manipulált növényeket foglal magában, amelyek Bacillus thuringiensis inszekticid hatású fehérje vagy géntermék vagy egy delta endotoxint kódoló gént expresszálnak. A toxin géneket már izolálták és szekvenálták, és rekombináns DNS-alapú Bacillus thuringiensis termékeket állítottak elő és alkalmazták őket. A genetikai úton történő módosítási technikák és a Bacillus thuringiensis endotoxinok mezőgazdasági környezetbe való juttatásának új megközelítéseivel kapcsolatos fejlesztése és kereskedelmi gyártása folyamatos. Ezek magukban foglalják az endotoxin génekkel genetikailag módosított növények alkalmazását a kártevővel szembeni rezisztencia elérésére és a stabilizált ép mikroba sejtek, mint Bacillus thuringiensis endotoxint szállító hordozók alkalmazását (Gaertner és mtsai., (1988) TIBTECH 6:S4-S7). A Bacillus thuringiensis hozzáférhetővé tehető a célkártevők számára a célkártevők olyan vad-típusú Bacillus thuringiensisnek történő kitételével, amely természetes állapotában expresszálja a toxint. Másik lehetőségként a kívánt toxint kódoló gén egy megfelelő rekombináns gazdába transzformálható és abban expresszálható. A Bacillus thuringiensis toxinok inszekticid aktivitást megtartó fragmensei is alkalmazhatók.

A következő egyesült államokbeli szabadalmi leírások peszticid hatású Bacillus thuringiensis izolátumokat vagy olyan rekombináns mikrobákat ismertetnek, amelyek egy Bacillus thuringiensis toxint expresszálnak: US 5,006,335; 5,106,620; 5,045,469; 5,135,867; 4,990,332; 5,164,180; 5,126,133; 5,0 93,119; 5,208,017; 5,186,934; 5,18 5,148; 5,211,946;

4,948,734; 4,849,217; 4,996,155; 4,999,192; 4,966,765; 5,073,632; 5,196,342; 5,063,055; 5,080,897; 5,024,837; 5,147,640; 5,173,409 és 5,186,934.

A Bacillus thuringiensis kurstaki alfaj spóráinak és kristályainak készítményeit alkalmazzák már néhány éve kereskedelmi inszekticidekként a pikkelyesszárnyú krátevők esetében. Például a Bacillus thuringiensis kurstaki HD-1 variáns egy -deltaendotoxinnak elnevezett kristályt termel, amely számos pikkelyesszárnyú rovar lárvájára nézve toxikus. A Bacillus thuringiensis további fajait, nevezetesen az israelensist és a tenebrionist alkalmazzák a kereskedelemben a rovarok elleni védekezés céljából.

A Bacillus thuringiensis kristályfehérje gén klónozását és expresszióját Escherichia coli-ban S Schnepf, H. és mtsai. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2893-2897 publikációban ismertették. Az US 4,448,885 és 4,467,036 amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások mindegyike egy kristályfehérje expresszióját ismerteti E. coli-ban. Olyan hibrid Bacillus thuringiensis kristályfehérje géneket is összeállítottak, amelyek megnövekedett toxicitást mutatnak, és kiterjedt gazdatartománnyal rendelkeznek egy célkártevővel szemben. Lásd, US 5,128,130 és 5,055,294 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások. Az US 4,797,276 és 4,853,331 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás olyan Bacillus thuringiensis San Diego törzset (a.k.a. B.t. tenebrionis, a.k.a. M-7) ismertetnek, amely fedelesszárnyú kártevők ellen különféle környezetben történő védekezésre alkalmazható. Az US 4,918,006 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás kétszár nyúakkal szembeni aktivitással rendelkező Bacillus thuringiensist ismertet. Az US 4,849,217 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás olyan Bacillus thuringiensis izolátumokat ismertet, amelyek a lucernazsizsikkel szemben rendelkeznek aktivitással. Az US 5,151,363 és US 4,948,734 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás a Bacillus thuringiensis bizonyos izolátumait ismerteti, amelyek nematódákkal szemben rendelkeznek aktivitással.

Bacillus thuringiensis tenyészetek az Egyesült Államok Mezőgazdasági Minisztériumából (United States Department of Agriculture, Brownsville, Tex.) is hozzáférhetők. A kéréseket Az USDA, ARS, Cotton Insects Research Unit, P.O. Boksz 1033, Brownsville, Tex. 78520 USA vagy a Northern Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Ill., USA címre kell intézni.

Következésképpen a vegyület és az aktív frakció a Bacillus thuringiensis inszekticid aktivitását fokozza a rovarokkal szemben, ideértve, nem korlátozó jelleggel a nematódákat, legyeket, sereghernyót, atkákat, kolorádó burgonyabogarat és a kukoricabogarat .

Amint az szakember számára jól ismert, a hatóanyag készítmény formájában alkalmazható. Ennek megfelelően a találmány egy olyan készítményt biztosít, amely az új vegyületet és egy hordozóanyagot, például egy oldószert vagy mezőgazdaságilag megfelelő hordozóanyagot tartalmaz. Egy további kiviteli példában a készítmény a fentiekben ismertetettek szerinti Bacillus thuringiensis hatékony mennyiségét is magában foglalja. Egy még további kiviteli példában a készítmény legalább egy kémiai vagy biológiai peszticidet tartalmaz, amint azt a szakterületen általánosan alkalmazzák. A találmány oltalmi körébe tartozó készítmények jobb diszperziójának és adhéziójának elérése érdekében előnyös lehet a teljes fermentlé, felülúszó és/vagy metabolit olyan komponensekkel történő formulázása, amely a diszperziót és adhéziót segíti. A növényeken és a növényi gyökereken történő könnyű alkalmazás céljából a készítmények a következő készítményekké dolgozhatók fel: nedvesíthető por, vizes szuszpenzió, emulgeálható koncentrátum és mikrokapszulázott készítmény.

Az új vegyület, aktív frakció vagy ezeket tartalmazó készítmények a Bacillus thuringiensis inszekticid aktivitásának fokozására használhatók. így a találmány eljárást is biztosít a Bacillus thuringiensis inszekticid aktivitásának fokozására az új vegyület, aktív frakció vagy ezeket tartalmazó készítmények hatékony fokozó mennyiségének Bacillus thuringiensis-szel történő kombinálása segítségével. Egy további megközelítésben a legalább egy biopeszticid vagy vegyi peszticid hatékony mennyiségét adjuk a készítményhez.

A találmány tárgya továbbá az új vegyület, a fermentléként együtt alkalmazott NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs és NRRL B-21661 nyilvántartási számú törzs gyökéren vagy gyümölcsön történő alkalmazása gombaölő szerként, ahol az említett gombaölő szer erősebb hatással rendelkezik a vegyületek kombinációjának nem várt szinergetikus hatásának eredményeként. Előnyösebben a kombinációt 1:2 arányban (B-21661:B-30087) alkalmazzuk a Botrytis cinerea vagy a Peronospora parasitica esetében.

Még előnyösebben, a kombinációt 1:4 arányban alkalmazzuk a Botrytis cinerea vagy a Peronospora parasitica esetében. Egy még további kiviteli példában a készítmény legalább egy kémiai vagy biológiai peszticidet foglal magában, amint azt a szakterületen általánosan alkalmazzák. A találmány oltalmi körébe tartozó készítmények jobb diszperziójának és adhéziójának elérése érdekében előnyös lehet a teljes fermentlé, felülúszó és/vagy metabolit olyan komponensekkel történő formulázása, amelyek segítik a diszperziót és az adhéziót. A növényeken és a növényi gyökereken történő könnyű alkalmazás céljából a készítmények a következő készítményekké dolgozhatók fel: nedvesíthető por, vizes szuszpenzió, emulgeálható koncentrátum és mikrokapszulázott készítmény.

A leírás egészén a különféle publikációkra, szabadalmi leírásokra és közzétett szabadalmi leírásokra az azokat azonosító hivatkozások segítségével hivatkozunk. Az ilyen publikációk, szabadalmi leírások és közétett szabadalmi leírások kitanításait a rájuk való hivatkozással ezúton építjük be a leírásba, hogy teljesebben leírjuk a találmányhoz tartozó technika állását. PÉLDÁK

A következő példák a találmány bemutatására szolgálnak, és nem kívánják azt korlátozni.

1. Példa

Az NRRL B-30087 nyilvántartási számon letétbe helyezett törzs jellemzése.

Az NRRL B-30087 nyilvántartási számon letétbe helyezett törzset az összes sejt metil észterré alakított sejtes zsírsavai

FAME-k alapján azonosítottuk (Miller, L.T. (1982) „Single derivatization method for routine analysis of bacterial whole cell wall fatty acid methyl esters, including hydroxy acids J.

• * · « · ··** »* ,···

Clin. Microbiol. 16:584-586) és MIDI rendszert (Microbial Identification System, Inc., Newark, DE) alkalmazó gázkromatográf segítségével vizsgáltuk. A baktérium tenyészetek növesztéséhez alkalmazott eljárást és protokollokat és a készülék részletes leírását a MIDI adta meg (a sejt zsírsav gáz kromatográfiájával történő baktérium-azonosítás. Technical Note #101. MIDI, Inc., 115 Barksdale Professional Center, Newark, DE). Az izolátumokat TSA (BBL) lemezeken növesztettük 28°C-on 24 órán át, majd a sejteket összegyűjtöttük. 1 ml metanolos NaOH-t (15 w/v % NaOH 50 v/v % metanolban) adtunk hozzá, és a sejteket 100°C-on 30 percig szappanosítottuk el. A zsírsavak észterezését 2 ml 46 v/v %-os metanolban oldott 3,25 N HCl-val végeztük 80 °Con 10 percig. A FAME-kat 1,25 ml 1:1 (v/v) metil-terc-butil éter-hexánba extraháltuk, majd a szerves extraktumot 3 ml 1,2 w/v % NaOH-dal mostuk a gázkromatográfiás vizsgálat előtt. A gázkromatográf (Hewlett-Packard 5890A) egy lángionizációs detektorral és kapilláris oszloppal (Hewlett-Packard 19091B-102, 5 % fenil-metil-szilikonnal térhálósított; 25 m x 0,22 mm IS; filmvastagság, 0,33 11 m; 150-es fázisarány) és vivőgázként hidrogénnel volt ellátva. A Hewlett-Packard integrátor automatikusan integrálta a FAME csúcsokat és a bakteriális izolátumokat a MIDI Microbial Identification Software (Sherlock TSBA Library 3.80 verzió) segítségével nevezte el. A Xanthomonas maltophila ATCC 13637 FAME profilját használtuk referencia ellenőrzésként a MIDI meghatározásokhoz.

A MIDI profil három különálló futtatásának eredményei az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzset Bacillus pumilusként azonosította 0,875 hasonlósági indexponttal.

2. Példa

Az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs aktivitása a növényi patogénekkel szemben in vitro tenyészetben (zóna vizsgálat) .

Annak meghatározására, hogy az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs hatékony-e a növényi patogén gombák széles tartományával szemben a következő kísérleteket végeztük e növényi patogének felhasználásával: Botrytis cinerea, Alternaria brassicicola, Colletotrichum acutatum, Cladosporium carophylum, Monilinia fructicola, Venturia inaequalis, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum, Taphrina deformans, és Verticillium dahliae.

Az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs aktivitásának meghatározására egy agar diffúziós (zóna) vizsgálatban növényi patogén spórákat (a spórákat a petri-csészék felületéről kapartuk le, majd körülbelül lxlO⁵ spóra/ml-re hígítottuk (a patogéntől függően)) szórtunk szét 10 cm-es petri-csészében lévő burgonyadextróz-agar felületén. A Rhizoctonia solani és Sclerotinia sclerotiorum esetében a spórák helyett a micélium fragmenseket szórtuk szét a lemezeken. Körülbelül 7 mm-es kör alakú lyukakat távolítottunk el az agárból és szója, élesztő extraktum közegen 250 ml-es rázólombikokban 72 órán át növesztett NRRL B-30087 nyilvántartási számon letétbe helyezett törzs felülúszójának 125 1-es mintáját a lyukba helyeztük.

A felülúszót 10 perces 12000 ford./perc-en történő centrifugálással készítettük el. A jellegzetes eredmények állhatnak abból a zónából, ahol nincs növekedés és/vagy a patogének csökkent növekedésének zónájából a lyuk körül vagy egyáltalán nincs zóna.

A zóna méretét milliméterben mértük és, ha volt zóna, akkor feljegyeztük. Az eredményeket az 1. táblázat mutatja.

1. táblázat

Az NRRL B-30087 nyilvántartási számon letétbe helyezett törzs in vitro vizsgálata a gomba eredetű növényi patogénekkel szemben
Alternaria brassicicola	Nincs zóna
Botrytis cinerea	Nincs zóna
Cladosporium carpohilum	Nincs zóna
Colletotrichum acutatum	Nincs zóna
Fusarium oxysporum	Nincs zóna
Monilinia fructicola	Nincs zóna
Rhizoctonia solani	Nincs zóna
Sclerotinia sclerotiorum	Nincs zóna
Taphrina deformans	Nincs zóna
Venturia inaequalis	Nincs zóna
Verticillium dahliae	Nincs zóna
Pythium faj	Nincs zóna
Phytophthora infestans	Gyenge aktivitás (kicsi, zavaros zóna)
Phytophthora capsici	Nincs zóna
Didimella bryonia	Nincs zóna

Az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs felülúszója nem mutatott aktivitást a legtöbb gombaeredetű növényi patogénekkel szemben a zóna vizsgálatban.

3. Példa

Az NRRL B-30087 nyilvántartási számon letétbe helyezett törzs aktivitása a bakteriális növényi patogénekkel szemben.

Standard agardiffúziós vizsgálatot állítottunk be a 2. példában megadottak szerint. A bakteriális patogének vékony rétegét szórtuk szét burgonyadextróz-agar felületén. Az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs felülúszójának 125 1-es mintáját helyeztük el minden lyukba az előzőekben leírtak alapján. A zóna meglétét vagy a zóna méretét mértük milliméterben. 2. táblázat

A bakteriális növényi patogének in vitro gátlása (Zóna teszt)
Az NRRL B-30087 Ny.sz. felülúszó	Gátlási zóna (mm)
Pseudomonas syringae pv. Tomato	Nincs zóna
Xanthomonacampestris pv. Campestris	Nincs zóna
Erwinia carotovora Carotovora alfaj	Nincs zóna

Az NRRL B-30087 nyilvántartási számon letétbe helyezett törzs nem volt aktív az in vitro vizsgált bakteriális növényi patogének fajaival szemben. 4. Példa

Az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs aktivitása a növényi patogénekkel szemben növényeken végzett vizsgálatok során.

Az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs aktivitását bab üszöggombát, zöldbabon lévő Uromyces phaseoli-val_r és szürke penészt, bors növényen lévő Botrytis cinerea-val, paradicsom növényeken lévő Alternaria solani-val_r és saláta peronoszpórát Bremia lactucae-val; a káposztafélék peronoszpórát Peronospora parasitica-val, a paradicsomvészt Phytophthora infestans-val, és a szőlő porhanyós penészedését Uncinula necator-ral szemben vizsgáltuk. Alternaria solani

Alternaria solani patogént standard petri-csészén (10 cm) PDA-val növesztettünk. Gombatelepeket vágtunk ki a csészéből és spóraképződést segítő közegre (20 g szacharóz, 30 g kalcium32 karbonát, és 20 g agar/ 1 steril víz) helyeztük őket. Steril vizet adtunk a csészéhez, hogy részben elfedje a micélium blokkokat és a csészéket 22-26°C-on 14 órás megvilágítással két napig inkubáltuk. A micélium blokkok kiszedésével spórákat gyűjtöttünk egy steril vizet tartalmazó csőröspohárba. A spóra szuszpenziót 2xl0⁴ spóraszám/ml-re állítottuk be.

cm-es cserépben elültetett és lemezre helyezett 3-4 leveles állapotú paradicsom csíranövényeket (UC82-B) szórópisztolylyal szójalisztben, élesztő extraktum közegben 72 órán át egy 250 ml-es rázólombikban növesztett NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs fermentlevét kiengedve szórtuk be. A beszórás után a csíranövényeket minimum két óráig hagytuk száradni. Beoltott csíranövényeket helyeztünk egy 22'C-os Percival harmatképző kamrába az első 40 órára megvilágítás nélkül. A lemezeken lévő növényeket egy műanyag kupolával fedtük be, és 20-22”C-os Percival inkubátorban tartottuk 48 órán át 14 órás megvilágítás mellett. NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzstől mentes vizet, a patogén spóráival és anélkül, használtunk negatív kontrolként és pozitív patogén kontrolként. Továbbá egy kémiai fungicidet (például, Azoxystrobin, Abound®) is használtunk összehasonlítás céljából 100-250 ppm arányok mellett. A növényeket 0-tól 5-ig terjedő skálán pontoztuk, ahol az 5 jelenti a 100%-ban fertőzött növényeket és a 0 jelenti a tünetmentességet. A vizes A. solani kontrolon az összes levélen egyforma sérülések voltak és a sziklevelek szétváltak és nagyon fertőzöttek voltak (5-ös besorolás = teljes fertőzöttség, védekezés nem tapasztalható). Az NRRL B30087 nyilvántartási számú törzzsel kezelt növények nem különböztek a vizes kontroltól. Az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzzsel nem tapasztaltunk védekezést a patogénnel szemben (szintén 5-ös besorolás). A negatív kontrol nem volt fertőzött. A vegyi úton kezelt növények 0 és 1 közötti pontértékkel rendelkeztek.

Botrytis cinerea

A Botrytis cinerea patogént standard petri csészében (10 cm) PDA-val növesztettük és spórákat gyűjtöttünk malátával (0,5 g/1) és élesztő extraktummal (0,5 g/1) burgonyadextróz fermentlé (PDB) segítségével, majd IxlO⁶ értékre állítottuk be. Az alkalmazott növények 5 cm-es csészékben 3-5 teljes levélállapotig növesztett paprikanövények (Yolo Wonder) voltak. Az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs és a patogén alkalmazása az előzőekhez hasonlóan történt. A csészékkel telerakott lemezeket állandó 20°C-on megvilágítás nélkül inkubáltuk. Műanyag kupolákkal fedtük be őket és a pontozásig 2,5 napra (60-65 óra) magukra hagytuk őket.

Egy kémiai fungicidet (például Iprodione, Rovral®) alkalmaztunk az összehasonlítás végett 20-100 ppm arányban. A növényeket 0-tól 5-ig terjedő skálán pontoztuk, ahol az 5 jelenti a 100%ban fertőzött növényeket és a 0 jelenti a tünetmentességet. A vizes B. cinerea kontrolon az összes levélen egyforma sérülések voltak és a sziklevelek szétváltak és nagyon fertőzöttek voltak (5-ös besorolás = teljes fertőzöttség, védekezés nem tapasztalható) . Az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzzsel kezelt növények nem különböztek a vizes kontroltól. Az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzzsel nem tapasztaltunk védekezést a patogénnel szemben (szintén 5-ös besorolás). A negatív kontrol nem volt fertőzött. A vegyi úton kezelt növények 0 és 1 közötti

pontértékkel rendelkeztek. Bremia lactucae

A Bremia vizsgálatához saláta magokat ültettünk tőzeget, perlitet és vermikulitot tartalmazó sterilizált ültetési keverék vékony rétegébe, amelyet egy kicsi, tiszta műanyag növényládában helyeztünk el, amely 8 cm magas és négyzet alakú. 1 héttel az ültetést követően a saláta csiranövényeket NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs fermentlé vagy felülúszó mintájával szórtuk be. A növényeket hagytuk megszáradni, majd fertőzött saláta csiranövényről gyűjtött peronoszpóra spóra-szuszpenziót (2xl0⁴ spóra/ml) szórtunk a csiranövényekre. Kémiai standardaket, igy Aliette-t (fosetil-al) és Ridomil-t (metalaxil) is alkalmaztunk. Azonban az e vizsgálatokban alkalmazott Bremia lactucae izolátum előzetesen nem mutatott szenzitivitást a két kereskedelemben használt kémiai standarddel szemben. A műanyag ládákat szorosan illeszkedő fedéllel fedtük be és 15-16'C-on egy Percival inkubátorban 16 órán át megvilágítás nélkül inkubáltuk. Ezután a műanyag ládákat szobahőmérsékletre (20-26”C-ra) 6 napig fény alá helyeztük. A csiranövényekről levettük a fedőt, vízzel szórtuk be, visszafedtük és 15-16°C-ra visszatettük az inkubátorba, hogy éjszaka a spóraképződés megtörténjen. Az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs hatását a saláta peronoszpórát okozó kémiailag rezisztens törzzsel szemben a 3. táblázatban mutatjuk be. 3. táblázat

Pontok

1. ismétlés 2. ismétlés 3. ismétlés

NRRL B-30087 Minta 1 0,0 1,0 1,0

NRRL B-30087 Minta 2 1,0 1,0 0,0

Aliette 240 ppm	5,0	3, 0	···· ·· · ·♦ *· ·
Ridomil 125 ppm	3, 0	3,0	-
Víz ellenőrzésre	5,0	5,0	5,0

Az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs kiváló aktivitással rendelkezik a saláta peronoszpórával szemben a patogén csiranövényen történő gyenge spóraképződéssel vagy spóraképződés nélkül, míg ellenben a kontrol (vizes ellenőrzés) növények teljesen bespórásodtak a peronoszpórával. A kémiai standardek nem tudtak hatékonyan védekezni a patogénnel szemben.

Peronospora parasitica

Az NRRL B-30087 nyilvántartási számú Bacillus törzset az előzőek szerint egy 250 ml-es rázólombikban növesztettünk. Az Ix erősségű teljes fermentlét egy hetes, teljes sziklevél állapotban lévő karfiolra vagy kelbimbó növényekre szórtuk sűrített levegővel üzemelő szórópisztollyal. Három párhuzamos 15-25 csíranövény/csészét szórtunk be kezelésenként. A Peronospora parasitica peronoszpóra, l-5xl0⁴ spóra/ml spóra-szuszpenzióját szórtuk a káposztafélékre az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs első alkalmazása után. Kémiai standardaket, így Aliette-t (fosetil-al) és Ridomil-t (metalaxil) is alkalmaztunk. Azonban az e vizsgálatokban alkalmazott Peronospora parasitica izolátum előzetesen nem mutatott szenzitivitást a két kereskedelemben használt kémiai standarddel szemben.

A növényeket 16 órán keresztül 15-17°C-on tartottuk a fertőzés elősegítésére, majd a csiranövényeket 20-24C-on hat napig inkubáltuk. A csészéket éjszakára 15-17 °C —ra tettük vissza, hogy megtörténjen a spóraképződés. Minden növényt kiértékeltünk a 0-5 skálán alapuló beteg kontrol hányadának megbecsülésével. A 0

besorolás olyan növényt jelent, amely nem rendelkezik spóraképződést mutató sérülésekkel. Az ismétléseken keresztült átlagolt eredményeket a 4. táblázatban mutatjuk be.

4. táblázat

Pontok

1. ismétlés 2. ismétlés 3. ismétlés

NRRL B-30087 Minta 1	0,5	1,0	0,5
NRRL B-30087 Minta 2	0,5	0,5	1,0
Aliette 240 ppm	5,0	3,0	-
Ridomil 125 ppm	4,0	4,0	4,0
Víz ellenőrzésre	5, 0	3,0	5, 0

Az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs hatékonyabb védekezést biztosít a káposztafélék peronoszpórával szemben a kezeletlen ellenőrző mintához és a kémiai standardekhez képest. Uncinula necator

Szőlő csiranövényeket (Chardonnay) növesztettünk 5 cm-es cserepekben 6-9 igazi levél megjelenéséig. A lisztharmat tenyészetet 22-26°C-on 14 órás megvilágítással tartottuk fenn a szőlő csiranövényeken. A 2-4 legfiatalabb leveleken kívül minden levelet eltávolítottunk. NRRL B-30087 nyilvántartási számú törszet, kémiai fungicidet (Rally®, 25 ppm myclobutanil) és víz ellenőrző oldatot alkalmaztunk a többi patogén vizsgálat szerint. Minden kezelésnél 4-5 ismétlést alkalmaztunk. A lisztharmattal történő beoltáshoz a fenntartáshoz használt csiranövényeken lévő lisztharmatos leveleket ollóval eltávolítottuk és minden növényt egyénileg oltottunk be. A fenntartáshoz használt csiranövény felszínét óvatosan lekeféltük egy festőecsettel úgy, hogy a spórák a vizsgálati növények felső felszínére kerüljenek. A folya37

matot egy 3x világító nagyítású lencsékkel végeztük, hogy minden növény esetén biztosítsuk az egyenlő oltóanyagot. A lemezen lévő csészéket 20-24’C-on 16-24 órára sötétbe helyeztük. A lemezeket 22-26°C-on tartjuk 14 órás megvilágítási periódussal további 911 napon keresztül egészen addig, amíg a vizsgálatot leolvassuk. Amint az előzőkben a növények 0-5 pontot kaptak. Az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs felhasználásának eredményét az 5. táblázatban mutatjuk be. 5. táblázat

Pont

	1.	ismétlés	2. ismétlés	3. ismétlés	4. ismétlés
NRRL B-30087	0,	5	0, 0	1,0	1,0
Rally 25 ppm	o,	0	0, 0	0,0	0,0
Víz	5,	0	5, 0	3,0	4,0

Az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs hatékony védekezést nyújtott az Uncinula lisztharmattal szemben a kezeletlen ellenőrző oldathoz képest és majdnem olyan jó, mint a kémiai standard, Rally.

Phytophthora infestans

A paradicsomvészt okozó P. infestans vizsgálatát 5 cm-es négyzet alakú műanyag cserepekben növesztett 4-6 igazi levéllel rendelkező paradicsom csiranövényekkel (UC82-B) végeztük. Az előzőekben ismertetett módon növesztett NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs felhasználásait a paradicsom csiranövényeken végeztük. A P. infestans oltóanyagot a rozsmag agaron növesztett spóraképző telep lekaparásával állítottuk elő és az oltóanyag koncentrációt 0,7-l,0xl0⁴ spóratok/ml közé állítottuk be. A beoltott csiranövényeket lemezekre helyeztük és pontosan az A.

solani vizsgálat esetében leírtak szerint inkubáltuk. A csíranö vényeket 0-5 skálán értékeltük ki. Quadris®-t (azoxistrobin) alkalmaztunk 62,5-125 ppm arányban összehasonlítás céljából. Az

NRRL B-30087 nyilvántartási s nyét a 6. táblázatban mutatjuk 6. táblázat 1. ism.	zámú törzs alkalmazásának eredmébe. Pont 2. ism. 3. ism. 4. ism. 5. ism.
NRRL B-30087 Quadris 125 ppm Quadris 62,5 ppm Víz Az NRRL B-30087 védekezést biztosít a	2,0 1,5 1,5 0,5 0,0 0,0 0, 0 0,0 0,0 0,5 0,0 0,5 5,0 5,0 4,0 4,0 nyilvántartási számú törzs közel paradicsomvésszel szemben, mint	2,0 0, 0 0,0 5, 0 olyan jó a kémiai

standard, a Quadris, négy napos inkubálást követően.

Urcmyces phaseoli

Ά bab üszöggomba, U. phaseoli vizsgálatát zöldbab csiranövények (Provider változat) alkalmazásával addig végeztük, amíg az első elsődleges levelek 3/4-ig kibújtak. Az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs felhasználásait az előzőekben más gazda/patogén összetételek esetén leírtak szerint végeztük. Az üszöggomba patogén oltóanyagát száraz üszöggomba spórákként üvegcsékben -20°C-on tároltuk. Az oltóanyagot száraz üszöggomba spórák 0,01% Tween 20-at tartalmazó vízhez történő hozzáadásával készítettük el és mágneses keverővei legalább egy órát erőteljesen megkevertük. Az oltóanyagot 2-4xl0⁵ spóra/ml-re állítottuk be. Az elsődleges leveleket beoltottuk és a csiranövényeket lemezekre helyeztük és éjszakán át 20°C-on egy Percival harmatkép ző kamrában inkubáltuk. A csiranövényeket ezután további 8-10 napig inkubáltuk szobahőmérsékleten (20-26°C-on). A csiranövényeket 0-5 skálán osztályoztuk a jelenlévő spóraképző rozsdás üszöggombák előfordulását és komolyságát alapul véve.

Kémiai fungicidet, Break®-et (propikonazol) alkalmaztunk 40 ppm arányban az összehasonlításhoz. Az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzsből származó fermentlé alkalmazásának eredményét a 7. táblázatban mutatjuk be.

7. táblázat	Pont 2. ismétlés	3. ismétlés
1.	ismétlés
NRRL B-30087	0,5	0, 5	0,0
Break® 40 ppm	0,0	0, 0	0,5
Víz	5,0	5, 0	5, 0
Az NRRL B-30087	nyilvántartási számú törzs	közel olyan jó
védekezést biztosít	a bab üszöggombával szemben,	mint a kémiai
standard, a Break®.
5. Példa

Az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs által termelt gomba elleni metabolit.

Az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs teljes fermentlevét etil-acetát, butanol és vizes frakciókra választottuk szét. Mindegyik frakciót tátika üszöggombával szemben vizsgáltunk egy spóracsírázási vizsgálatban. A tátika üszöggomba spórákat a minták jelenlétében csíráztattuk 40 1 mintát és 20 1 patogén spórát tartalmazó depressziós mikroszkóp tárgylemezeken. Körülbelül 16 órával később a spórákat mikroszkóp alatt figyeltük meg, hogy lássuk, ha a spórák kicsíráztak. A csírázás hiánya (0 érték) a víz kontrolhoz (100 % csírázás és növekedés = 5-ös érték) képest a vizsgálandó minta aktivitását jelzi. A különféle NRRL B-30087 frakciókkal végzett üszöggomba csírázási vizsgálat eredményeit a 8. táblázatban mutatjuk be (az előzőek szerinti 05 értékkel osztályozva).

8. táblázat

				Pont
	1.	ismétlés	2.	ismétlés	3.	ismétlés
Etil-acetát		5,0		2,0		3, 0
n-Butanol		3,0		5,0		3, 0
Vizes		0,0		0,0		0, 0
Teljes fermentlé		0,0		0,0		0,0
Víz		4,0		5,0		5,0

Tisztán látszik, hogy a metabolit a vízoldható frakcióban van és nem extrahálható könnyen a butanolban vagy az etilacetátban.

A metabolit más tulajdonságait is meghatároztuk. A molekuláról kimutattuk, hogy áthaladt a 10000 molekulatömegű vágási értékkel rendelkező szűrőn, amely azt jelzi, hogy a metabolit molekulatömege kisebb, mint 10000 dalton. Az aktivitását nem vesztette el sem proteázokkal, sem savval vagy bázissal történő kezelés után. Az aktivitás gyengén csökkent 1 órán át tartó 80 Con történő melegítés során (a tátika üszöggombával szemben érték 0-1,5-re növekedett). Az aktivitás kationcserélő gyantán lekötődött, de nem kötődött le anioncserélő gyantán (a metabolit pozitívan töltött) .

6. Példa

Az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs fungicid frakciójának

részleges tisztítása.

Az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzsből származó teljes fermentlét 4200 ford./perc-en 15 percig centrifugáltuk és a felülúszót összegyűjtöttük. A felülúszóhoz aktív szenet adtunk (30 g) és jól összeráztuk mielőtt 20 percig 11,500 ford./perc fordulatszámon lecentrifugáljuk. A felülúszót egy rotabepárlón szárítottuk be, majd 15 ml vízben újból feloldottuk. A mintát ezután tovább tisztítottuk méretkizárásos kromatográfia (SEC) segítségével, hogy a komponenseket molekulatömeg szerint elválasszuk .

P-2 gyantát (130 g, BioRad) milliQ ionmentesített vízzel duzzasztottunk, hogy egy 2,5 cm x 80 cm oszlopba töltsük. A 15 ml koncentrátumot a P-2 oszlopra vittük fel, az oszlopot vízzel eluáltuk a nehézségi erő segítségével, majd 10 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. A P-2 oszlop paraméterei: tartomány = 2, hullámhossz = 226 nm, 16 mv.

Az eluált frakciókat az 5. példában ismertetett tátika üszöggomba csírázási vizsgálat alkalmazásával vizsgáltuk. A 1824 frakciókról találtuk azt, hogy teljesen gátolják a csírázást. Ezeket a frakciókat összeöntöttük és rotabepárlón beszárítottuk, majd 8 ml vízben újból feloldottuk és 0,2 m szűrőn szűrtük. Ezt egy második P-2 oszlopra vittük fel és az előzőekben leírtak szerint futattuk azzal a kitétellel, hogy 7 ml-es frakciókat gyűjtöttünk.

A 29-38 frakciókról találtuk azt, hogy gátolják a csírázást egy biológiai vizsgálat során. Ezeket a frakciókat leszárítottuk, majd ezután újból vízben oldottuk. Egy kis mennyiségű alikvótot (5 mg) amino oszlopot (4,6 mm x 15 cm, 5 m, 10 m pórusátmérő) alkalmazva HPLC-vel választottunk szét. Az oszlopot 0,01 M KH₂PO₄-ben ekvilibráltuk, majd 30 perces gradiensprogramot futtatunk 4 %-ról 44 % acetonitril/0,01 M KH₂PO₄-ig 1 ml/perc áramlási sebességgel és 200 nm-en történő UV detektálással.

Három csúcsot gyűjtöttünk össze és az 1-es csúcsot sótalanitottuk egy méretkizárásos HPLC oszlopon (Toso Haas, G1000 PW, 7,5 mm x 30 cm, 10 m), vízzel eluáltuk 1 ml/perc áramlási sebességgel 200 nm-en történő UV-detektálással. A méretkizárásos oszlopról egy csúcsot gyűjtöttünk össze és aktívnak találtuk a csírázási vizsgálatban. Amint az 1. ábra mutatja a félig tiszta aktív anyag ¹H-NMR spektrumát 400 MHz-en D₂O-ban vettük fel. 7. Példa

A fungicid komponens kémiai tulajdonságai másak, mint a zwittermicin A tulajdonságai.

A találmány szerinti fungicid hatású aktív frakcióról kapilláris elektroforézisen mutattuk ki, hogy más, mint a zwittermicin A. Az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs szójalisztet, dextrózt, élesztő extraktumot, KH₂PO₄, K₂HPO₄, NaCl és MgSO₄ x 7H₂O-t tartalmazó Bacillus tenyészközegben termelte a fermentlét. Szélesztett tenyészeteket alkalmaztunk a 250 ml rázólombikok beoltására. A lombikokat 210 ford./percen 30'C-on 4 napig rázattuk.

Az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs fermentlevét tiszta zwittermicin A-val egészítettük ki, majd kapilláris elektroforézisen (CE) futtattuk. Az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs 30 μΐ fermentlevét 10 μΐ zwittermicin A-val egészítettük ki. Az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs teljes ⁴³ ·'·%''. :. <' «Λ 4 \· » « fermentlé, az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs fermentleve kiegészítve a zwittermicin A-val és önmagában a zwittermicin A mindegyikének mintáját pH 5,8 nátrium-foszfát puffért alkalmazva CE-n futattuk. A kapott elektroferogramokat minden minta esetében a 3. ábrán mutatjuk be.

A részlegesen tisztított frakciókat ezután kapilláris elektroforézist alkalmazva összehasonlítottuk a zwittermicin Aval. A 4. ábra mutatja a B-30087 részlegesen tisztított fungicid komponensének, a 25 μΐ zwittermicin A-val kiegészített B-30087 részlegesen tisztított fungicid komponensének és önmagában a zwittermicin A-nak az elektroferogramjait.

A 2. ábrán bemutatott zwittermicin A és az 1. ábrán bemutatott B-30087 részlegesen tisztított fungicid hatású metabolitjának a ¹H-NMR spektrumát D₂O-ban 400 MHz-en vettük fel. Amint az 1. és 2. ábra mutatja a spektrum azt mutatja, hogy az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzsből származó fungicid hatású metabolit más, mint a zwittermicin A.

Az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzsből származó fungicid hatású metabolit ¹H-NMR segítségével megkülönböztethető az -exotoxintól. Az -exotoxin ¹H-NMR spektruma hét rezonanciával rendelkezik 5 ppm felett, amint az az Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis, L.A. Hickle and W.L. Fitch, eds., ACS Symposium Series 432, p. 131 (1990) publikációból látható. Ezzel ellentétben az 1. ábra azt mutatja, hogy az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzsből származó minta esetében nem jelenik meg protonrezonancia 5 ppm felett. 8. Példa

A B. thuringiensis működését fokozó anyag tisztítása

A működést fokozó anyagot a B-30087 fermentlevéből tisztítottuk félig a következők szerint. A működést fokozó anyagot 435 ml fermentlé anioncserélő gyantával, acetonitriles kicsapással és méretkizárásos kromatográfiával történő kezelés segítségével tisztítottuk félig. A fermentlét a sejtek eltávolítása érdekében centrifugáltuk és 14,5 g anioncserélő gyantát (AG 1-X8, 100-200 pórusméretű, acetát-alak) adtunk a felülúszóhoz és a keveréket 1 percig összerázzuk. Ezt 5000 ford./percen 20 percig centrifugáltuk és a felülúszót dekantáltuk és ezt használtuk a következő lépésben. Acetonitrilt adtunk a felülúszóhoz, hogy 50 %-os oldatot kapjunk, majd ezt 1 percig összeráztuk és 5000 ford./percen 20 percig centrifugáltuk. Az alsó sötétbarna réteg tartalmazza a Bacillus thuringiensist fokozó anyagot.

Az előzőekből kapott barna réteget két lépésben tovább tisztítottuk méretkizárásos kromatográfia segítségével. Először 130 g P-2 gyantát (BioRad) milliQ ionmentesített vízzel duzzasztottunk, hogy egy 2,5 cm x 80 cm-es oszlopba töltsük a töltetet. A barna réteget rotabepárlón körülbelül 4x töményebbre koncentráltunk és a koncentrátum 15 ml-ét a P2 oszlopra vittük fel. Az oszlopot MQ vízzel eluáltuk a nehézségi erő segítségével, majd 10 perces frakciókat gyűjtöttünk 12 órán át (UV detektálás 280 nm-en, abszorbancia tartomány 2,0, 10 mV) . A 26-28 frakciók további tisztítását a rotabepárlót alkalmazva a frakciók 3x-os töményítésével és az eredeti P2 oszlopra történő felvitelükkel végeztük. Az oszlopot MQ vízzel eluáltuk. 10 perces frakciókat gyűjtöttünk az első 80 percben, majd 2 perces frakciókat gyűjtöttünk az ezt követő két órán keresztül. A Bacillus thuringiensis-t fokozó aktivitást a 16-20 frakciókban eluáltuk (UV detektálás 220 nm-en, abszorbancia tartomány 2,0, 10 mV).

9. Példa

A működést fokozó anyag kémiai tulajdonságai másak, mint a zwittermicin A kémiai tulajdonságai.

A találmány szerinti működést fokozó anyagról kapilláris elektroforézisen mutatjuk ki, hogy más, mint a zwittermicin A. Az NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs szójalisztet, dextrózt, élesztő extraktumot, KH₂PO₄, K₂HPO₄, NaCl és MgSO₄ x 7H₂O-t tartalmazó Bacillus tenyészközegben termelte a fermentlét. Szélesztett tenyészeteket alkalmaztunk a 250 ml rázólombikok beoltására. A lombikokat 210 ford./percen 30°C-on 4 napig rázattuk. A Bacillus thuringiensis B-30087 fermentlevét tiszta zwittermicin A-val egészítettük ki, majd kapilláris elektroforézisen (CE) futtattuk. A B-30087 30 μΐ fermentlevét 10 pl zwittermicin A-val egészítettük ki. A B-30087 teljes fermentlevét (3A. ábra), a B-30087 fermentlevét kiegészítve a zwittermicin A-val (3B. ábra) és önmagában a zwittermicin A-t (3C. ábra) pH 5,8 nátrium-foszfát puffért alkalmazva CE-n futattuk. A CE elektroferogramokat a 4. ábrán mutatjuk be.

A zwittermicin A és B-30087 félig tisztított fokozó anyagának ¹H-NMR spektrumát D₂0-ban 400 MHz-en vettük fel. A spektrum azt jelzi, hogy a működést fokozó anyag más, mint a zwittermicin A.

10. Példa

A Bacillus thuringiensis-töl származó inszekticid hatás fokozódásának meghatározása.

A B. thuringiensis inszekticid hatásának fokozását a B. pumilus, NRRL B-30087 nyilvántartási számú törzs teljes fermentlevét alkalmazva a répa sereghernyón végzett szinergia vizsgálattal mutatjuk be. A vizsgálatokat 96-lyukú mikrotiter lemezeken végeztük. Mindegyik lyuk egy szilárd agar szubsztrátumot tartalmaz. 20 pl B-30087 fermentlevet vizsgáltunk egy biológiai vizsgálat során a B. thuringiensis kereskedelemben kapható készítményével, a Javelin-nel (0,25-1,50 pg/lyuk). A Javelin koncentrációk hígítási sorozatát külön is lefutattuk.

Az inszekticid aktivitás vizsgálatának céljából agar szubsztrátot készítettünk a mikrotiter lemez lyukaihoz Marrone és mtsai., (1985), J. Econ. Entomol. 78: 290-293 alapján. lonmentesített vizet alkalmaztunk negatív kontrolként. A tesztminták vagy a kontrol két ismétlését alkalmaztuk a vizsgálatok esetében. A lemezeket ezután füstelszívó kamrába helyeztük körülbelül 2-3 órára, hogy megszáradjanak.

Egytől három darab Spodoptera exigua első lárvaállapotban lévő lárváit adtuk a lyukakhoz. A mikrolemezt egy légmentesen záródó anyaggal, például Mylar® zártuk le és minden lyukat egy gombostű beszúrásával levegőztettük. A lemezeket 27”C-on 7 napig inkubáltuk.

Az inkubálás után a lyukakat a lárvák elhalálozásának megfigyelésével vagy a lárva kifejlődésének foka alapján pontoztuk. Az elpusztult lárvák számát feljegyeztük. A fejlődésben visszamaradt lárvákat 1-4 tartományban pontoztuk. A fejlődésben viszszamaradott lárvák pontozása a következő: 4 = kontrol méret; 3 = a kontrol méret 75 %-a; 2 = a kontrol méret 50 %-a; 1 = a kontrol méret 25 %-a. Az eredményeket a 9. táblázatban összegezzük. 9. táblázat

Minta Elpusztult lárvák Visszamaradottság

	száma/teljes	···· ·· · · · ···· mértéke
0,25 pg Javelin	1/8	4
0,50 pg Javelin	0/8	4
0,75 pg Javelin	1/8	2
1,0 pg Javelin	1/8	2
1,50 pg Javelin	1/8	2
B-30087 + 0,25 pg Javelin	3/8	2
B-30087 + 0,50 pg Javelin	0/8	3
B-30087 + 1,00 pg Javelin	7/8	2
B-30087 + 1,50 pg Javelin	8/8	1
Csak B-30087	0/8	4
Víz	0/8	4

A fenti eljárásokkal egy második vizsgálatot is végeztünk.

Az eredményeket alO. táblázatban foglaljuk össze.

10. táblázat

Minta	Elpusztult lárvák száma/telj es	Visszamaradottság mértéke
0,0625 pg Javelin	0/8	4
0,125 pg Javelin	0/8	4
0,187 pg Javelin	0/8	4
0,250 pg Javelin	0/8	3
0,375 pg Javelin	1/8	2
B-30087 + 0,0625 pg Javelin	1/8	3
B-30087 + 0,125 pg Javelin	2/8	3
B-30087 + 0,187 pg Javelin	5/8	2
B-30087 + 0,250 pg Javelin	8/8	1
B-30087 + 0,375 pg Javelin	8/8	1

Csak B-30087

0/8

Viz 0/8 4

A félig tisztított frakció inszekticid hatást fokozó tulajdonságának meghatározása céljából a mintát a fentiek szerinti 0,1 pg/lyuk Javelin és 40 μΐ/lyuk vizsgált frakciók alkalmazásával vizsgáltuk. Az eredményeket a 11. táblázatban mutatjuk be.

11. táblázat
Minta	Elpusztult lárvák száma/telj es	Visszamaradottság mértéke
10-es frakció	0/9	2
16-os frakció	16/16	1
18-as frakció	17/17	1
20-as frakció	14/14	1
25-ös frakció	1/10	2
30-as frakció	3/11	2
35-ös frakció	1/12	3
Javelin, 0,1 pg/lyuk	0/8	3
Víz 11. Példa	0/14	4
A B. pumilus (B-30087) kalmazása fungicidként.	és a B. subtilis (B-21661) együttes al-

Az NRRL B-30087 B. pumilus törzset az NRRL B-21660 5. subtilis törzzsel vizsgáltuk, hogy meghatározzuk vajon a fungicid hatás nagyobb-e ha együtt alkalmazzuk őket, mint amikor a törzseket külön-külön alkalmazzuk. Mindegyik törzset egy 10 literes vagy egy 5000 literes fermentorban növesztettük körülbelül 50 órán át szójaliszten alapuló közegben. Mindegyik törzset teljes fermentléként vizsgáltuk a paprikán lévő Botrytis cinerea szürke penésszel, és a káposztaféléken lévő Peronospora parasitica peronoszpórával szemben. A teljes fermentleveket lx, l/2x és l/8x hígításban vizsgáltuk. A két törzset ezután különféle kombinációkban vizsgáltuk egymással l/2x, l/4x és l/8x hígítással. Ellenőrzésként vizet (kontrol) és kémiai fungicidet (BREAK®, 20 ppm) is alkalmaztuk összehasonlítás céljából. A növényeket 0-5-ig pontoztuk (ahol 5 = 100 % betegség, védekezés nem figyelhető meg; és 0 = 100%-os védekezés, nincs betegség). Az eredményeket a 12. táblázatban mutatjuk be. 12. táblázat

Botrytis cinerea Peronospora parasitica Átlagos fertőzőttség Átlagos fertőzöttség (4 növény) (4 növény)

B-21661	IX 1/2X 1/4X 1/8X	0,3 0,3 1,2 1,7	nem vizsgáltuk 0, 5 1,0 2,0
B-30087	IX	1,7	nem vizsgáltuk
	1/2X	2,3	1,3
	1/4X	nem vizsgáltuk	3,7
	1/8X	nem vizsgáltuk	4,3
B-21661	1/4X + B-30087 1/2X	0,7	1,0
B-21661	1/8X + B-30087 1/2X	1,4	0,3

B-21661 1/4X + B-30087 1/4X nincs adat

0, 5

B-21661	1/2X +	B-30087	1/2X	nincs	adat	0, 3
B-21661	1/2X +	B-30087	1/4X	nincs	adat	0,3
B-21661	1/2X +	B-30087	1/8X	nincs	adat	0,5
BREAK®,	20 ppm			0,	2	nem vizsgáltuk
Víz				4,	6	5,0
A	Botrytis cinerea	vizsgálati	eredmények	statisztikai kü-

lönbségeket mutatnak, amikor a törzseket egymással kombinálva alkalmaztuk ahhoz képest, amikor csak önmagukban alkalmaztuk őket. Például a B-21661 1/4X és B-30087 1/2X esetében a 0,7-es pont statisztikailag más, mint az önmagában alkalmazott B-21661 1/4X 1,2-es értéke. A B-21661 1/8X és B-30087 1/2X 1,4-es értéke statisztikailag szintén más, mint az önmagában alkalmazott B21661 1/8X 1,7-es vagy a B-30087 1/2X 2,3-as értéke, és az együttes alkalmazás pontértéke kisebb, mint a mindegyik törzs önmagában történő alkalmazásából várt átlagérték. Ez a törzsek a fungicidként megnövelt hatékonyság érdekében történő együttes alkalmazásának szinergetikus hatását mutatja.

A B-21661 1/8X és B-30087 1/2X kombinációjának pontértékét mutató Peronospora parasitica vizsgálati eredmények messze jobbak voltak, mint azt az összegződő hatásból várható volna. 2,05 pontérték volna várható, ha csak a törzsek kombinációjából származó összegző hatást vennénk figyelembe. Azonban a jelenlegi érték 0,3, amely azt mutatja, hogy pontosan körülírt szinergetikus hatás áll fenn a törzsek kombinálásának alkalmazásával. A többi pontértékek is jobbak, mint a várt eredmények, például a B 21661 1/4X és B-30087 1/4X 0,5 pontértékkel rendelkezik, amely sokkal jobb, mint amit vártunk volna az egyes törzsek összegződő hatásából (2,35 becsült érték). Ehhez hasonló szinergiát mutatnak a B-21661 1/2X és B-30087 1/2X (0,3-as pontérték), B-21661 1/2X és B-30087 1/4X (0,3-as pontérték), és a B21661 1/2X és B-30087 1/8X (0,5-ös pontérték) kombinációi is. Ezek a vizsgálatok bizonyítják, hogy szinergetikus hatás lép fel, amikor a törzseket kombináljuk, és ez nem várt eredmény.

Nyilvánvaló, hogy míg a találmányt a fenti kiviteli példákkal egyetértésben ismertettük, addig az előző leírás és példák csak bemutatni, és nem korlátozni kívánják a találmány oltalmi körét. Más megközelítésben a találmány oltalmi körébe tartozó előnyök és módosítások szakember számára nyilvánvalóak és a találmányhoz tartoznak.

Claims (85)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Egy törzs biológiailag tiszta tenyészete, amely az NRRL B30087 nyilvántartási számon letétbe helyezett Bacillus pumilus törzs, vagy annak mutánsait azonosító összes tulajdonsággal és fungicid aktivitással rendelkezik.
2. 2. Az NRRL B-30087 nyilvántartási számon letétbe helyezett Bacillus pumilus törzs biológiailag tiszta tenyészete.
3. 3. Készítmény, amely az 1. igénypont szerinti biológiailag tiszta tenyészetet és egy hordozót tartalmaz.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amelyet nedvesíthető porként, szemcseként, vizes szuszpenzióként vagy emulgeálható koncentrátumként, vagy mikrokapszulázott készítményként formuláznak.
5. 5. Egy izolált metabolit, amelyet egy olyan törzs biológiailag tiszta tenyészetéből választunk el, amely az NRRL B-30087 nyilvántartási számon letétbe helyezett Bacillus pumilus törzs, vagy annak mutánsait azonosító összes tulajdonsággal és fungicid aktivitással rendelkezik.
6. 6. Egy felülúszó, amelyet egy olyan törzs biológiailag tiszta tenyészetéből választunk el, amely az NRRL B-30087 nyilvántartási számon letétbe helyezett Bacillus pumilus törzs, vagy annak mutánsait azonosító összes tulajdonsággal és fungicid aktivitással rendelkezik.
7. 7. Egy részlegesen tisztított frakció, amelyet a 6. igénypont szerinti felülúszóból választunk el.
8. 8. Egy készítmény, amely az 5. igénypont szerinti metabolitot és egy hordozót tartalmaz.
9. 9. Egy készítmény, amely a 6. igénypont szerinti felülúszót és egy hordozót tartalmaz.
10. 10. Egy készítmény, amely a 7. igénypont szerinti részlegesen tisztított frakciót és egy hordozót tartalmaz.
11. 11. A 8. igénypont szerinti készítmény, amelyet nedvesíthető porként, szemcseként, vizes szuszpenzióként vagy emulgeálható koncentrátumként, vagy mikrokapszulázott készítményként formuláznak.
12. 12. A 9. igénypont szerinti készítmény, amelyet nedvesíthető porként, szemcseként, vizes szuszpenzióként vagy emulgeálható koncentrátumként, vagy mikrokapszulázott készítményként formuláznak.
13. 13. A 10. igénypont szerinti készítmény, amelyet nedvesíthető porként, szemcseként, vizes szuszpenzióként vagy emulgeálható koncentrátumként, vagy mikrokapszulázott készítményként formuláznak.
14. 14. Eljárás egy növény, gyökér vagy gyümölcs gombafertőzésének megakadályozására vagy kezelésére, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti metabolit hatékony mennyiségének alkalmazásából áll.
15. 15. Eljárás egy növény, gyökér vagy gyümölcs gombafertőzésének megakadályozására vagy kezelésére, azzal jellemezve, hogy a 6. igénypont szerinti felülúszó hatékony mennyiségének alkalmazásából áll.
16. 16. Eljárás egy növény, gyökér vagy gyümölcs gombafertőzésének megakadályozására vagy kezelésére, azzal jellemezve, hogy a 7. igénypont szerinti részlegesen tisztított frakció hatékony menynyiségének alkalmazásából áll.

    54 ..........

    ·· · · · · · · · ··« ·
17. 17. Eljárás egy növény, gyökér vagy gyümölcs gombafertőzésének megakadályozására vagy kezelésére, azzal jellemezve, hogy a 8. igénypont szerinti készítmény hatékony mennyiségének alkalmazásából áll.
18. 18. Eljárás egy növény, gyökér vagy gyümölcs gombafertőzésének megakadályozására vagy kezelésére, azzal jellemezve, hogy a 9. igénypont szerinti készítmény hatékony mennyiségének alkalmazásából áll.
19. 19. Eljárás egy növény, gyökér vagy gyümölcs gombafertőzésének megakadályozására vagy kezelésére, azzal jellemezve, hogy a 10. igénypont szerinti készítmény hatékony mennyiségének alkalmazásából áll.
20. 20. Eljárás egy növény, gyökér vagy gyümölcs gombafertőzésének megakadályozására vagy kezelésére, azzal jellemezve, hogy a 11. igénypont szerinti készítmény hatékony mennyiségének alkalmazásából áll.
21. 21. Eljárás egy növény, gyökér vagy gyümölcs gombafertőzésének megakadályozására vagy kezelésére, azzal jellemezve, hogy a 12. igénypont szerinti készítmény hatékony mennyiségének alkalmazásából áll.
22. 22. Eljárás egy növény, gyökér vagy gyümölcs gombafertőzésének megakadályozására vagy kezelésére, azzal jellemezve, hogy a 13. igénypont szerinti készítmény hatékony mennyiségének alkalmazásából áll.
23. 23. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gombafertőzést okozó legalább egy mikroorganizmust a következők közül választjuk: Bremia lactucae; Peronospora parasitica;

    Phytophthora infestans; Uncinula necator és Uromyces phaseoli.
24. 24. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gombafertőzést okozó legalább egy mikroorganizmust a következők közül választjuk: Bremia lactucae; Peronospora parasitica; Phytophthora infestans; Uncinula necator és Uromyces phaseoli.
25. 25. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gombafertőzést okozó legalább egy mikroorganizmust a következők közül választjuk: Bremia lactucae; Peronospora parasitica; Phytophthora infestans; Uncinula necator és Uromyces phaseoli.
26. 26. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gombafertőzést okozó legalább egy mikroorganizmust a következők közül választjuk: Bremia lactucae; Peronospora parasitica; Phytophthora infestans; Uncinula necator és Uromyces phaseoli.
27. 27. A 21 vagy 22. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gombafertőzést okozó legalább egy mikroorganizmust a következők közül választjuk: Bremia lactucae; Peronospora parasitica; Phytophthora infestans; Uncinula necator és Uromyces phaseoli.
28. 28. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amely legalább egy kémiai vagy biológiai peszticidet is tartalmaz.
29. 29. A 7. igénypont szerinti készítmény, amely legalább egy kémiai vagy biológiai peszticidet is tartalmaz.
30. 30. A 8. igénypont szerinti készítmény, amely legalább egy kémiai vagy biológiai peszticidet is tartalmaz.
31. 31. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy továbbá legalább egy kémiai vagy biológiai peszticid hatékony mennyiségének alkalmazásából áll.
32. 32. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy továbbá legalább egy kémiai vagy biológiai peszticid hatékony mennyiségének alkalmazásából áll.
33. 33. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy továbbá legalább egy kémiai vagy biológiai peszticid hatékony mennyiségének alkalmazásából áll.
34. 34. Eljárás egy gomba elleni felülúszó előállítására, azzal jellemezve, hogy az NRRL B-30087 nyilvántartási számon letétbe helyezett törzs biológiailag tiszta tenyészetét növesztjük, majd a felülúszóból izoláljuk a gomba elleni metabolitot.
35. 35. Eljárás a 34. igénypont szerinti felülúszó részleges tisztítására, azzal jellemezve, hogy a felülúszó frakcionálásából és a gomba elleni frakciók azonosítására a frakciókon végzett biológiai vizsgálatok végrehajtásából áll.
36. 36. A 34. igénypont szerinti eljárással előállított felülúszó.
37. 37. A 7. igénypont szerinti részlegesen tisztított frakció, amely frakció a növényi patogén gombákkal szemben mutat aktivitást és a vizes frakcióban található, gyengén hőérzékeny, sav/bázis- és proteáz-stabil, pozitívan töltött, és 10000 daltonnái kisebb molekulatömege van.
38. 38. Az 5. igénypont szerinti izolált metabolit, amely metabolit a növényi patogén gombákkal szemben mutat aktivitást és a vizes frakcióban található, gyengén hőérzékeny, sav/bázis- és proteázstabil, pozitívan töltött, és 10000 daltonnái kisebb molekulatömege van.
39. 39. Egy vízoldható vegyület, amely fokozza a Bacillus thuringiensis inszekticid aktivitását, a vegyület molekulatömege kisebb, mint 10000 dalton és a vegyület nem a zwittermicin A.
40. 40. A 39. szerinti vegyület, amely Bacillus thuringiensis-t is tartalmaz.
41. 41. Egy készítmény, amely a 39. igénypont szerinti vegyületet és egy hordozót tartalmaz.
42. 42. Egy készítmény, amely a 40. igénypont szerinti vegyületet és egy hordozót tartalmaz.
43. 43. A 40. igénypont szerinti készítmény, amelyben a Bacillus thuringiensis mikrobatörzs, kereskedelemben kapható termék, genetikailag módosított növény vagy delta endotoxin formájában van jelen.
44. 44. A 40-43. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely legalább egy kémiai vagy biológiai peszticidet is tartalmaz.
45. 45. A 44. igénypont szerinti készítmény, amelyet nedvesíthető porként, szemcseként, vizes szuszpenzióként vagy emulgeálható koncentrátumként, vagy mikrokapszulázott készítményként formuláznak.
46. 46. Egy Bacillus faj teljes fermentlevének részlegesen tisztított frakciója, amely fokozza a Bacillus thuringiensis inszekticid aktivitását, és amely nem a zwittermicin A vagy a βexotoxin.
47. 47. A 46. igénypont szerinti részlegesen tisztított frakció, ahol a Bacillus faj a Bacillus pumilus.
48. 48. A 47. igénypont szerinti részlegesen tisztított frakció, ahol a Bacillus pumilus az NRRL B-30087 nyilvántartási számon letétbe helyezett Bacillus pumilus törzs.
49. 49. Egy készítmény, amely a 46-48. igénypontok bármelyike szerinti frakciót és egy hordozót tartalmaz.
50. 50. A 46-49. igénypontok bármelyike szerinti frakció, amely egy Bacillus thuringiensist is tartalmaz.
51. 51. A 50. igénypont szerinti frakció, ahol a Bacillus thuringiensis mikrobatörzs, kereskedelemben kapható termék, genetikailag módosított növény vagy delta endotoxin formájában van jelen.
52. 52. Egy készítmény, amely a 49. igénypont szerinti készítményt és egy Bacillus thuringiensist tartalmaz.
53. 53. A 46-48. igénypontok bármelyike szerinti frakció, amely legalább egy kémiai vagy biológiai peszticidet is tartalmaz.
54. 54. A 49. igénypont szerinti készítmény, amelyet nedvesíthető porként, szemcseként, vizes szuszpenzióként vagy emulgeálható koncentrátumként, vagy mikrokapszulázott készítményként formuláznak.
55. 55. Az 52. igénypont szerinti készítmény, amelyet nedvesíthető porként, szemcseként, vizes szuszpenzióként vagy emulgeálható koncentrátumként, vagy mikrokapszulázott készítményként formuláznak.
56. 56. A 53. igénypont szerinti készítmény, amelyet nedvesíthető porként, szemcseként, vizes szuszpenzióként vagy emulgeálható koncentrátumként, vagy mikrokapszulázott készítményként formuláznak.
57. 57. Eljárás Bacillus thuringiensis inszekticid aktivitásának fokozására, azzal jellemezve, hogy a 39. igénypont szerinti vegyület és a Bacillus thuringiensis hatékony mennyiségét alkalmazzuk egy növényen vagy gyökéren.
58. 58. Eljárás Bacillus thuringiensis inszekticid aktivitásának fokozására, azzal jellemezve, hogy a 46. igénypont szerinti vegyület és a Bacillus thuringiensis hatékony mennyiségét alkalmazzuk egy növényen vagy gyökéren.
59. 59. Eljárás növény vagy gyökér rovar általi fertőzéstől való

    59 .·♦.,* • · « · 4 ··*· ·· ·*· « megóvására vagy a fertőzés kezelésére, azzal jellemezve, hogy a 40. igénypont szerinti vegyület hatékony mennyiségét alkalmazzuk a növényen vagy gyökéren.
60. 60. Eljárás növény vagy gyökér rovar általi fertőzéstől való megóvására vagy a fertőzés kezelésére, azzal jellemezve, hogy a 44. igénypont szerinti készítmény hatékony mennyiségét alkalmazzuk a növényen vagy gyökéren.
61. 61. Eljárás növény vagy gyökér rovar általi fertőzéstől való megóvására vagy a fertőzés kezelésére, azzal jellemezve, hogy az 50. igénypont szerinti frakció hatékony mennyiségét alkalmazzuk a növényen vagy gyökéren.
62. 62. Eljárás növény vagy gyökér rovar általi fertőzéstől való megóvására vagy a fertőzés kezelésére, azzal jellemezve, hogy az 52. igénypont szerinti készítmény hatékony mennyiségét alkalmazzuk a növényen vagy gyökéren.
63. 63. Eljárás növény vagy gyökér rovar általi fertőzéstől való megóvására vagy a fertőzés kezelésére, azzal jellemezve, hogy az 53. igénypont szerinti frakció hatékony mennyiségét alkalmazzuk a növényen vagy gyökéren.
64. 64. Az 51. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább egy kémiai vagy biológiai peszticid alkalmazását is tartalmazza.
65. 65. A 49-50 igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább egy kémiai vagy biológiai peszticid alkalmazását is tartalmazza.
66. 66. Egy készítmény, amely

    a) az NRRL B-30087 nyilvántartási számon letétbe helyezett

    Bacillus pumilus törzs, vagy annak mutánsait azonosító ősz60 :···.’*.

    • ··· ·*< ♦ • 4 * · 4 szes tulajdonsággal rendelkező törzs teljes fermentlevét; és

    b) az NRRL B-21661 nyilvántartási számon letétbe helyezett Bacillus subtilis törzs, vagy annak mutánsait azonosító öszszes tulajdonsággal rendelkező törzs teljes fermentlevét tartalmazza és az említett törzsek szinergetikus fungicid aktivitással bírnak.
67. 67. A 66. igénypont szerinti készítmény, ahol a fungicid aktivitást a Botrytis cinerea és a Peronospora parasitica ellen fejtik ki.
68. 68. A 66. igénypont szerinti készítmény, amelyben az NRRL B21661 és B-30087 törzseket 1:2 arányban kombináljuk.
69. 69. A 66. igénypont szerinti készítmény, amelyben az NRRL B-

    21661 és B-30087 törzseket 1:4 arányban kombináljuk.
70. 70. A 66. igénypont szerinti készítmény, amelyben az NRRL B-

    21661 és B-30087 törzseket 1:2 arányban kombináljuk a Botrytis cinerea vagy a Peronospora parasitica patogénekkel szemben.
71. 71. A 66. igénypont szerinti készítmény, amelyben az NRRL B21661 és B-30087 törzseket 1:4 arányban kombináljuk a Botrytis cinerea vagy a Peronospora parasitica patogénekkel szemben.
72. 72. Eljárás növény, gyökér vagy gyümölcs gombafertőzésének megakadályozására vagy kezelésére, azzal jellemezve, hogy a 66. igénypont szerinti készítmény hatékony mennyiségét alkalmazzuk.
73. 73. Eljárás növény, gyökér vagy gyümölcs gombafertőzésének megakadályozására vagy kezelésére, azzal jellemezve, hogy a 67. igénypont szerinti készítmény hatékony mennyiségét alkalmazzuk.
74. 74. Eljárás növény, gyökér vagy gyümölcs gombafertőzésének megakadályozására vagy kezelésére, azzal jellemezve, hogy a 68.

    igénypont szerinti készítmény hatékony mennyiségét alkalmazzuk.

    61 *·· ·* u». ·♦ · - · * * ► ·#> *· **·> · * - · · *««
75. 75. Eljárás növény, gyökér vagy gyümölcs gombafertőzésének megakadályozására vagy kezelésére, azzal jellemezve, hogy a 69. igénypont szerinti készítmény hatékony mennyiségét alkalmazzuk.
76. 76. Eljárás növény, gyökér vagy gyümölcs gombafertőzésének megakadályozására vagy kezelésére, azzal jellemezve, hogy a 70. igénypont szerinti készítmény hatékony mennyiségét alkalmazzuk.
77. 77. Eljárás növény, gyökér vagy gyümölcs gombafertőzésének megakadályozására vagy kezelésére, azzal jellemezve, hogy a 71. igénypont szerinti készítmény hatékony mennyiségét alkalmazzuk.
78. 78. A 66. igénypont szerinti tenyészetből elválasztott felülúszó .
79. 79. Egy készítmény, amely a 78. igénypont szerinti felülúszót és egy hordozót tartalmaz.
80. 80. A 79. igénypont szerinti készítmény, amelyet nedvesíthető porként, szemcseként, vizes szuszpenzióként vagy emulgeálható koncentrátumként, vagy mikrokapszulázott készítményként formuláznak.
81. 81. A 66. igénypont szerinti készítmény, amely legalább egy biológiai vagy kémiai peszticidet is tartalmaz.
82. 82. A 79. igénypont szerinti készítmény, amely legalább egy biológiai vagy kémiai peszticidet is tartalmaz.
83. 83. A 81. igénypont szerinti készítmény, amelyet nedvesíthető porként, szemcseként, vizes szuszpenzióként vagy emulgeálható koncentrátumként, vagy mikrokapszulázott készítményként formuláznak.
84. 84. A 82. igénypont szerinti készítmény, amelyet nedvesíthető porként, szemcseként, vizes szuszpenzióként vagy emulgeálható koncentrátumként, vagy mikrokapszulázott készítményként formu62 «*»- *♦ ' · · * Μ«· láznak.
85. 85. Eljárás növény, gyökér vagy gyümölcs gombafertőzésének megakadályozására vagy kezelésére, azzal jellemezve, hogy a 69. igénypont szerinti készítmény hatékony mennyiségét alkalmazzuk.

    A meghatalmazott:

    •η ί'.ίίΐί· '.iáhcFnv 1'-