HUP0200896A2 - Pseudomycin derivatives and their use in the preparation of pharmaceutical compositions for inhibiting fungal activity - Google Patents

Pseudomycin derivatives and their use in the preparation of pharmaceutical compositions for inhibiting fungal activity Download PDF

Info

Publication number
HUP0200896A2
HUP0200896A2 HU0200896A HUP0200896A HUP0200896A2 HU P0200896 A2 HUP0200896 A2 HU P0200896A2 HU 0200896 A HU0200896 A HU 0200896A HU P0200896 A HUP0200896 A HU P0200896A HU P0200896 A2 HUP0200896 A2 HU P0200896A2
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
pseudomycin
pharmaceutically acceptable
hydrate
acceptable salt
ester derivative
Prior art date
Application number
HU0200896A
Other languages
English (en)
Inventor
Matthew David Belvo
Palaniappan Kulanthaivel
James William Martin
Thomas Johnjr Perun
Douglas Joseph Zeckner
Original Assignee
Lilly Co Eli
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lilly Co Eli filed Critical Lilly Co Eli
Publication of HUP0200896A2 publication Critical patent/HUP0200896A2/hu
Publication of HUP0200896A3 publication Critical patent/HUP0200896A3/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

P02 00896
73333-SZE
Természetes pszeudomicin-származékok és ezek alkalmazása gombák gátlására adható gyógyászati készítmények előá^í^^r^| p£|_£)A|^
A találmány tárgyát a természetből elkülönített pszeudomicin-származékok képezik, ideértve a pszeudomicin A' és B'-t; a találmány tárgyát képezi továbbá e vegyületek alkalmazása gyógyászati készítmények előállítására.
A gombás fertőzések számos betegséget idézhetnek elő, csökkentve így az életkörülmények minőségét, továbbá fokozva a humán betegek halálozási arányát, különösen a károsodott immunrendszerrel rendelkező betegek esetében. A gombás fertőzések száma humán személyeknél nagy mértékben növekedett az elmúlt 20 évben. Ez részben annak tulajdonítható, hogy nagy mértékben megnövekedett azon személyek száma, akiknél az immunrendszer legyengült állapotban van vagy szervátültetés, kemoterápiás rákkezelés, AIDS, idős kor vagy hasonló rendellenesség vagy állapot miatt az immunrendszer korlátozottan működőképes. Ezen személyek ki vannak téve a gombás kórokozók támadásának, minthogy a gombák a lakosság körében nagyszámmal fordulnak elő, csak a jól működő immunrendszer ezeket korlátok között tartja. Ezen kórokozókat nehéz elpusztítani, minthogy a rendelkezésre álló gombaellenes szerek egy része nagy mértékben toxikus, vagy csak a gombák szaporodását gátolja. így például a polién származékok fungicid hatással rendelkeznek, azonban toxikusak, ezzel szemben az azol-származékok kevésbé toxikusak, azonban csak fungisztatikus hatást mutatnak. Ami még aggasztóbb, újabban megjelentek az azol és polién-származékokkal szemben rezisztens Candida törzsek is, ami nagy mértékben korlátozza ezen törzsekkel szemben alkalmazható terápiás lehetőségeket.
A Pseudomonas syringae a gombaellenes vagy antibiotikus hatású származékok több csoportját termeli, ezek közül említjük meg a pseudomicineket, sziringomicineket, sziringotoxinokat és sziringosztatinokat, amelyek lipodepsinonapeptidek. A P. syringae-hoz tartozó természetes törzsek, és transzpozícióval létrehozott mutánsok termelik ezen lipodepszinonapeptideket. Számos olyan pszeudomicin, sziringomicin és egyéb lipodepszipeptid típusú gombaellenes származékot különítettek el, és határoztak meg kémiailag, amelyek széles spektrumú gombaellenes hatással rendelkeznek, ideértve a humán személyeknél és növényeknél nagymértékű káros hatást kifejtő kórokozók elleni hatékonyságot. így például a pseudomicin A, B, C és C származékokat elkülönítették, tisztították, és ezen származékok szerkezetét különböző módszerekkel megállapították, ezek közül megemlítve az aminosav szekvenálást az NMR és tömegspektrometriás vizsgálatokat [lásd például Ballio és munkatársai közleményét [A Pseudomonas syringae új bioaktív lipodepszipeptid származékai: a pszeudomicinek, FEBS Lett., 355, 96-100 (1994)], valamint az 5 576 298 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást. A pszeudomicinek, sziringomicinek, sziringotoxinok és sziringosztatinok a gombaellenes hatású vegyületek szerkezetileg különálló családjait képezik.
A pszeudomicinek, sziringomicinek, sziringotoxinok vagy sziringosztatinok közül egyik származék sem került forgalomba gombaellenes kezelésre. Nem kívánatos mellékhatások és egyéb, a nagyobb léptékű termeléssel és a készítmény előállítással kapcsolatos egyéb problémák mindeddig megakadályozták, hogy a pszeudomicinek, sziringomicinek, sziringotoxinok vagy sziringosztatinok alkalmazhatók legyenek az állatokat, embereket és növényeket megtámadó gombás fertőzésekkel szemben. Változatlanul fennáll az igény olyan gombaellenes szerek iránt, amelyek alkalmazhatók az eddig ismert gombaellenes szerekkel nem kezelhető fertőzések esetében és alkalmazhatók az állatoknál, humán személyeknél vagy növényeknél fellépő fertőzésekkel szemben.
A találmány összefoglalása
A találmány tárgyát a P. syringae által termelt természetes pszedumicin termék képezi. Ezen pszeudomicin-származék depszinonapeptid gyűrűt tartalmaz, amelynek szekvenciája: Ser-Dab-Asp-Lys-Dab-aThr-Dhb-HOAsp-CIThr, még közelebbről, amelyben LSer-D-Dab-L-Asp-L-Lys-L-Dab-L-aThr-Z-Dhb-L-Asp(3-OH)-L-Thr(4-CI) szekvencia található, ahol a CIThr-ben lévő karboxilcsoport és a szerinben lévő hidroxilcsoport a gyűrűt lakion kötés révén zárja. Az (IA) képletű pszeudomicin A' 3,4-dihidroxi-pentadekánsav csoportot tartalmaz, ahol a karboxilcsoport az N-terminális szerinben lévő aminocsoporttal amidkötést létesít.
Az (IB) képletű pszeudomicin B' 3-hidroxi-dodekánsav-csoportot tartalmaz, amelyben a karboxilcsoport az N-terminális szerinben lévő amincsoporttal amidkötést létesít.
A találmány szerinti természetes pszeudomicin termékek alkalmazásával, így a pszeudomicin A'-vel, pszeudomicin B'-vel vagy ezek elegyével gátolható a gombák káros hatása, vagy csökkenthetők az arra rászoruló betegeknél a gombás fertőzések szimptómái. A találmány szerinti származékok segítségével elpusztíthatok a gombák, csökkenthető a gombás fertőzések káros hatása, enyhíthető a láz, és/vagy fokozható a betegek általános jó közérzete. A találmány szerinti származékok különböző gombák ellen, mint a Candida parapsilosis, Candida albicans, Cryptococcus neoformans és/vagy Histoplasma capsulatum ellen eredményesen alkalmazhatók.
A találmány részletes ismertetése Pszeudomicinek
Mint a fentiekben említettük, a pszeudomicin vagy természetes pszeudomicin termék kifejezés a Pseudomonas syringae baktériumból elkülönített gombaellenes szerek családjának egy vagy több tagjára vonatkozik. A pszeudomicin egy lipodepszipeptid, egy olyan gyűrűs peptid, amelyben egy vagy több szokatlan, ritkán előforduló aminosav van jelen, és egy vagy több hidrofób vagy zsírsav oldalláncot hordoz. Közelebbről, a pszeudomicinek lipodepszinonapeptidek, amelyekben egy laktonkötéssel zárt gyűrűs peptid rész van jelen, és amelyben olyan ritkán előforduló aminosavak, mint 4-klór-treonin, 3-hidroxi-aszparaginsav, dehidro-2-amino-vajsav és 2,4-diamino-vajsav található. Feltételezhető, hogy ezek a ritkán előforduló aminosavak játszanak szerepet a pszeudomicinek kedvező biológiai tulajdonságainál, így a szérumban mutatott stabilitásnál és gomba-pusztító hatásuknál.
Mindegyik pszeudomicinnél azonos gyűrűs peptid mag található, azonban eltérő hidrofób oldalláncok kapcsolódnak ezen maghoz. Mindegyik pszeudomicinben jelen van a gyűrűs nonapeptid csoport, amelynek szekvenciája: Ser-Dab-Asp-Lys-Dab-aThr-Dhb-HOAsp-CIThr (vagyis szerin; 2,4-diaminovajsav; aszparaginsav; lizin; 2,4-diamino-vajsav; alloTreonin, dehidro-2-amino-vajsav; 3-hidroxi-aszparaginsav; 4-klór-treonin), ahol a CIThr-ben lévő karboxilcsoport és a szerinben lévő hidroxilcsoport a gyűrűt laktonkötés révén zárja. A lipofil csoport az N-terminális szerin aminocsoportjához kapcsolódik. A pszeudomicin A-ban a szerinben lévő aminocsoport egy 3,4-dihidroxi-tetradekanoil-csoportban lévő karboxilcsoporttal képez amidkötést, a B pszeudomicin esetében az amidkötés egy 3-monohidroxi-tetradekanoil-csoporttal, a C pszeudomicin esetében az amidkötés egy 3,4-dihidroxi-hexadekanoil-csoporttal, és a C pszeudomicin esetében az amidképzés egy 3-monohidroxi-hexadekanoil-csoporttal történik. A szerinben lévő karboxilcsoport a gyűrűben lévő Dab-bal képez amidkötést.
Pszeudomicin A' és B’
Mint a fentiekből kitűnik, a pszeudomicin A' és pszeudomicin B' megjelölések olyan gombaellenes szerekre vonatkoznak, amelyeket a Pseudomonas syringae baktériumból különítettünk el. A pszeudomicin A' és B' olyan pszeudomicinek, amelyekben a Ser-Dab-Asp-Lys-Dab-aThr-Dhb-HOAsp
-CIThr szekvenciát tartalmazó jellegzetes depszinonapeptid gyűrű van jelen, és ahol a CIThr-ben lévő karboxilcsoport és a szerin hidroxilcsoportja laktonkötés révén zárja a gyűrűt. A pszeudomicin A'-ben 3,4-dihidroxi-pentadekánsav-csoport van jelen, amelyben lévő karboxilcsoport az N-terminális szerinben lévő am incsoporttal létesít amidkötést. A pszeudomicin B'-ben 3-hidroxi-dodekánsav csoport van jelen, ennek karboxilcsoportja az N-terminális szerinben lévő aminocsoporttal létesít amidkötést.
A pszeudomicinek biológiai hatása
A pszeudomicinek számos kedvező biológiai hatással rendelkeznek, ideértve azt, hogy különböző gombákat elpusztítanak, így a növényeknél és állatoknál jelentkező számos gombás kórokozót. Közelebbről, a pszeudomicinek hatásos antimikotikus szerek olyan gombák esetében, amelyek a legyengült immunrendszerrel rendelkező személyeknél fertőzést idéznek elő. Ezen gombák közül említjük meg a különböző Candida fajtákat, ideértve a C. parapsilosist, C. albicanst, C. glabrata-t, C. tropicalis-t és C. krusei-t. Ide tartoznak egyéb fajták is, mint Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus és Histoplasma capsulatum is. Egy gombaellenes szer biológiai hatása esetében az az előnyös, ha a szer képes a gombát elpusztítani, és nemcsak a szaporodását gátolni, különösen vonatkozik ez a patogén gombákra; ilyen kedvező hatással rendelkezik a pszeudomicin A' és/vagy B'.
A pszeudomicinek toxikusnak mutatkoztak igen sokféle növényt károsító gombával szemben, megemlíthető itt a Rynchosporium secalis, Ceratocystis ulmi, Rizoctonic solani, Sclerotinia sclerotiorum, Verticillium albo-atrum, Verticillium dahliae, Thielaviopis basicola, Fusarium oxysporum és Fusarium culmorum [lásd Harrison, L. és munkatársai: Pseudomycins, a family of novel peptides from Pseudomonas syringae possessing broad-spectrum antifungal activity, (Pszeudomicinek, Pseudomonas syringae-böl származó, széles spektrumú gombaellenes hatású új peptidcsalád) J. of General
Microbiology, 7, 2857-2865 (1991)]. Ezen túlmenően a P. syringae MSU 16H-ról kimutatták, hogy nagyobb védelmet biztosít, mint a Ceratocystic ulmi-val fertőzött szilfákban található vad törzs, amely gomba a holland szilfa betegség előidézője [lásd például Lám és munkatársai: Proc. Natl. Sci., USA, 84, 6447-6451 (1987)].
Pseudomonas syringae
A Pseudomonas syringae megjelölés sokféle baktériumot foglal magában, amelyek általában növényekkel vannak kapcsolatban. A P. syringae közül némelyik növényi kórokozó, némelyik azonban csak gyengén kórokozó vagy saprophyta. Számos különböző P. syringae izolátum termel egy vagy több citotoxikus szert, amelyek segítik ezen baktériumoknak a természetben való túlélését, ahol ezen baktériumoknak gombákkal és egyéb baktériumokkal kell megküzdeni. A P. syringae által termelt sejt toxikus szerekhez tartoznak olyan gombaellenes szerek, mint a pszeudomicinek, a sziringomicinek, a sziringotoxinok és sziringosztatinok.
A szakirodalomból ismertek olyan P. syringae törzsek, amelyek egy vagy több pszeudomicint termelnek. így például az MSU 174-es vadtörzs (egy Montana-i árpaföldröl elkülönítve) és transposon mutagenezissel ebből létrehozott mutáns törzs [aholis a mutagenézishez TN905-t (MSU 16H) alkalmaztak) az 5 576 298 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban kerültek ismertetésre (meagdás időpontja: 1996. november 19.) (szabadalmas: Strobel G. és munkatársai). Ezen pszeudomicinekkel és a mutagenézissel a szakirodalomban részletesen foglalkoznak [Strobel, Harrison és munkatársai: J. Pseudomycins, a family of novel peptides from Pseudomonas syringae possessing broad-spectrum antifungal activity (Pszeudomicinek, Pseudomonas syringae-ből nyert széles spektrumú gombaellenes hatású új peptidcsalád), Gen. Microbiology, 137, 2857-2865 (1991); továbbá Lamb és munkatársai Transposon mutagenesis and tagging of fluorescent pseudomonas: Antimycotic production is necessary for control of Dutch elm disease, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 6447-6451 (1987)]. A P. syringae különböző törzseinek tenyésztését és ezek alkalmazását gombaellenes szerek előállítására Hilton M.D. és munkatársai ismertetik (Pseudomycin production By Pseudomonas Syringae, US szabadalom száma: ). Az MSU 174 és MSU 16H tenyészetek a Montana
State University-nél vannak letétbe helyezve [Bozeman, Montana, USA], és beszerezhetők az American Type Culture Collection-től is (Parklawn Drive, Rockville, MD, USA). Fenti közleményeket találmányunknál referenciaként tekintjük.
A találmány tárgyát egy törzs, egy izolátum, biológiailag tisztított P. syringae tenyészet képezi, amely pszeudomicin A'-t és/vagy B'-t termel legalább mintegy 10 pg/ml mennyiségben. A biológiailag tisztított Pseudomonas syringae tenyészet az MSU 16H, 25-B1, 67H1 vagy 7H9-1 mikroorganizmusok biológiailag tisztított tenyészete, vagy ezen törzsek mutánsa, variánsa, izolátuma vagy rekombinánsa, amely tenyészetek pszeudomicin A'-t és/vagy B'-t termelnek. Az MSU 174 és MSU16H tenyészeteket a fentiekben ismertetett helyekről szereztük be.
A pszeudomicin A' és/vagy B' termelésére alkalmas P. syringae törzs elkülöníthető környezeti forrásokból, ideértve a növényeket, mint az árpát, citrus növényeket, liliomféleségeket, valamint olyan forrásokat, mint a talaj, víz, levegő és por. Egy előnyös törzs növényekből izolálható. A környezeti forrásokból elkülönített P. syringae törzseket vad típusú törzsként említjük. A leírásban alkalmazott vad típus kifejezés a természetben előforduló normális P. syringae populáció domináns genotípusát jelenti (vagyis olyan P. syringae törzseket vagy izolátumokat, amelyek a természetben találhatók, és nem laboratóriumi körülmények között lettek előállítva). Mint a többi mikroorganizmus esetében is, a találmány szerinti megoldáshoz alkalmazott, A' és/vagy B' pszeudomicint termelő P. syringae törzs-tenyészetek jellemzői, így az MSU 174, MSU16H, MSU 206, 25-B1, 7H9-1 és 67 H1 tenyészeteké változóak. így ezen törzsek leszármazottai, például rekombinánsok, mutánsok és variánsok a szakember számára jól ismert módszerrel nyerhetők.
A P. syringae törzsek mutánsai szintén alkalmasak pszeudomicin A' és/vagy B' előállítására. A mutáns megnevezés a törzs fenotípusában bekövetkező hirtelen örökletes változást jelenti, ami bekövetkezhet spontán módon vagy ismert mutagén szerek hatására, így előidézhető besugárzással vagy különböző kémiai szerekkel. A találmány szerinti P. syringae mutánsok különféle mutagén szerek segítségével állíthatók elő, ideértve a besugárzást, mint az ultraibolya fénnyel vagy röntgensugárral történő besugárzást; megemlítjük itt a kémiai mutagén szereket, egy adott hely szempontjából specifikus mutagenézist, valamint a transzpozonok által közvetített mutagenézist. A kémiai mutagénekre példaként említjük meg az etil-metánszulfonátot (EMS), diepoxioktánt, N-metil-N-nitro-N'-nitrozoguanint (NTG), valamint a salétromos savat.
A találmány szerinti pszeudomicin A'-t és/vagy B'-t termelő P. syringae mutánsok oly módon tenyészthetők, hogy a baktériumot olyan mennyiségű mutagén szerrel kezeljük, amely eredményesen hoz létre mutánsokat, amelyek nagy mennyiségben termelnek pszeudomicin A'-t és/vagy B'-t, vagy egyéb pszeudomicineknél nagyobb mennyiségben termelnek A'-t és/vagy B'-t, vagy kedvező tenyésztési körülmények között termelnek pszeudomicin A'-t és/vagy B'-t. A választott mutagén szer mennyisége és típusa változtatható, azonban előnyös megoldás szerint NTG-ből készült széria hígítást használunk, ahol az NTG mennyisége 1-100 pg/ml. A találmány szerinti előnyös mutánsokhoz tartoznak azok, amelyek minimális tápközegben nagy mennyiségben termelik a pszeudomicin A'-t és/vagy B'-t. A pszeudomicin A'-t és/vagy B'-t nagy mennyiségben termelő mutánsok előnyösen legalább mintegy 10 μg/ml pszeudomicin A'-t és/vagy B'-t termelnek.
A környezetből előállított izolátumok, mutáns törzsek és egyéb P. syringae törzsek között válogatást végezhetünk a kedvező szaporítási szokások, táptalaj, tápanyagforrás, szénforrás, szaporítási körülmények és aminosav igény alapján válogatva. Előnyösen olyan A'-t és/vagy B'-t termelő P. syringae törzset választunk, amely minimális tápközegben, mint N21 közegben tenyészik, és/vagy amely törzs esetében a pszeudomicin A' és/vagy B' termelése mintegy 10 pg/ml-nél nagyobb. Az előnyös törzseket glicint és/vagy adott esetben lipidet, burgonya terméket vagy ezek kombinációját tartalmazó tápközegben tenyésztve a törzsek pszeudomicin A'-t és/vagy B'-t termelnek.
A P. syringae törzsek átalakításával rekombináns törzsek alakíthatók ki, ezt a szakember számára jól ismert laboratóriumi körülmények között végezhetjük. A rekombináns technológia segítségével a P. syringae törzsek oly módon alakíthatók át, hogy ezen törzsek által termelt antibiotikumok mellett azok egyéb különböző géntermékeket is expresszáljanak. így például a törzseket egy rekombináns vektorral transzformálva olyan törzseket hozhatunk létre, amelyek olyan antibiotikummal szemben válnak rezisztenssé, amely esetben általában érzékenységet mutatnak. Az ily módon átalakított törzsek nemcsak pszeudomicineket, mint pszeudomicin A'-t és/vagy B'-t fognak termelni, hanem rezisztenciát előidéző enzimet is, ami lehetővé teszi, hogy a transzformált törzseket a vad típusú sejtektől elkülönítsük. Ezen kívül hasonló technológiák segítségével az ismert törzseket átalakíthatjuk úgy, hogy a sejtekbe az endogén pszeudomicin-bioszintézis gének több másolatát visszük be, és így nagyobb pszeudomicin, így pszeudomicin A' és/vagy B' hozamot érhetünk el. A találmány tárgyát képezik a P. syringae 25-B1, 67-H1 és 7H9-1 törzsek származékai, így a természetes variánsok, a mesterségesen létreho
- 10 zott variánsok, mutánsok és rekombinánsok, amelyek pszeudomicineket, így pszeudomicin A'-t és/vagy B'-t nagy mennyiségben termelnek.
A Pseudomonas syringae tenyésztése
A leírásban szereplő vizes tápközeg kifejezés vizes alapú elegyet jelent, amely a találmány szerinti baktériumok szaporodásához szükséges ásványi anyagokat és szerves vegyületeket tartalmazza. Az előnyös tápközegek hatásos mennyiségben tartalmaznak három vagy ennél kevesebb aminosavat, előnyösen glutaminsavat, glicint, hisztidint vagy ezek kombinációját. Egy előnyös megoldás szerint a tápközeg hatásos mennyiségben tartalmaz glicint és adott esetben egy vagy több burgonyaterméket és lipidet. A glicin alkalmazható egyedüli aminosavként vagy többféle aminosav elegyében, mint hidrolizált fehérjében. A lipidek közül előnyösen használható a szójababolaj vagy egy zsírsav. A célszerűen alkalmazható burgonya termékek közül említjük meg a burgonya dextróz főzetet, burgonya dextrint, burgonya fehérjét, a kereskedelmi forgalomban beszerezhető tört burgonya vegyes tápot. A tápközegben jelen lévő ásványi anyagok közül előnyösek a sóelegyek, amelyeket általában alkalmaznak a sejttenyészetekben és a fermentációhoz, így eredményesen alkalmazható a Czapek-féle ásványisó oldat (amely például KCI, MgSO4 és FeSO4 tartalmú). A táptalajban lévő szerves vegyületekhez tartozik előnyösen a glükóz, továbbá az oldható keményítő, de jelen lehetnek egyéb szerves vegyületek is. A tápközeg pH-ja előnyösen mintegy 4 és 6,5 között van, még előnyösebben ez az érték mintegy 4,5 - 5,7, legelőnyösebben mintegy 5,2.
A tápközegben jelen lévő komponensek mennyisége nem játszik döntő szerepet a baktérium szaporodása vagy a pszeudomicin A' és/vagy B' termelése szempontjából, mégis kívánatos, hogy némely tápanyag bizonyos szintet elérjen. A glicin előnyös mennyisége mintegy 0,1 g/liter és mintegy 10 g/liter között van, előnyösen ez az érték mintegy 0,3 - 3 g/liter, még előnyösebben 1
- 11 g/liter. A lipidek előnyös mennyisége mintegy 1 g/liter és mintegy 10 g/liter között van olaj termékre, mint szójabab olajra számítva, még előnyösebben ez az érték mintegy 0,5 - 2 g/liter szójabab olaj. A zsírsav és zsírsav-észter előnyös mennyisége mintegy 0,5 g/liter és mintegy 5 g/liter között van. A burgonya termékek előnyös mennyisége mintegy 12 g/liter és mintegy 36 g/liter között van, előnyösen mintegy 24 g/liter burgonya dextróz főzet, mintegy 5 g/liter - 50 g/liter, előnyösen mintegy 30 g/liter kereskedelmi forgalomban beszerezhető tört burgonya elegy, mintegy 1 g/liter - 30 g/liter, előnyösen 20 g/liter burgonya dextrin, vagy mintegy 1 g/liter -10 g/liter, előnyösen 4 g/liter burgonya fehérje van a tápközegben. A tápközeg előnyösen szervetlen komponenseket is tartalmaz, így előnyösen mintegy 0,02 - 2 g/liter kálium-kloridot, még előnyösebben ez a mennyiség 0,2 g/liter KOI; mintegy 0,02 - 2 g/liter magnézium-szulfátot, előnyösen MgSO4-7H2O-t tartalmaz, ennek mennyisége még előnyösebben mintegy 0,2 g/liter; valamint mintegy 0,4 - 40 mg/liter, még előnyösebben mintegy 4 mg/liter FeSO4-t, előnyösen FeSO4 7H2O-t tartalmaz. Amennyiben jelen van, az oldható keményítő mennyisége mintegy 0,5 - 50 g/liter, még előnyösebben mintegy 5 g/liter. A glükóz mennyisége előnyösen mintegy 2-80 g/liter, még előnyösebben mintegy 20 g/liter.
Általában a P. syringae-t szabályozott pH-körülmények között és hőmérsékleten tenyésztjük. A P. syringae tenyésztését és a Pseudomycin A' és/vagy B' termelését mintegy 15 °C - 35 °C közötti hőmérsékleten végezzük, előnyösen a hőmérsékletet mintegy 20 °C - 30 °C-on, még előnyösebben mintegy 22 °C - 27 °C-on, legelőnyösebben mintegy 25 °C-on tartjuk. A P. syringae tenyésztését és a pszeudomicin A' és/vagy B' termelését mintegy 4 - 9 pH közötti tartományban, előnyösen mintegy 4-6, még előnyösebben mintegy 4,5 - 5,5 pH-η végezzük. Általában a P. syringae nem szaporodik,
- 12 amennyiben a hőmérséklet 37 °C felett vagy 10 °C alatt van, vagy ha a pH 9 feletti vagy 4-es érték alatti.
Pszeudomicin A' és B' termelése
Annak érdekében, hogy pszeudomicin A'-t és/vagy B'-t termelhessünk, egy vad típusú vagy mutáns P. syringae törzset rázás közben hatásos menynyiségű, három vagy ennél kevesebb aminosavat tartalmazó tápközegben tenyésztünk. A három vagy ennél kevesebb aminosav előnyösen lehet glutaminsav, glicin, hisztidin vagy ezek kombinációja. Egy előnyös megoldás szerint a táptalajban glicin és adott esetben egy vagy több burgonyatermék és lipid van jelen. A tenyésztést a P. syringae szaporodása és a pszeudomicin A' és/vagy B' termelése szempontjából előnyös körülmények között végezzük. Az előnyös körülmények között megemlítjük a mintegy 22 °C - 27 °C közötti hőmérsékletet, a tenyésztést célszerűen mintegy 36 - 96 óra hosszat folytatjuk. Amennyiben fenti körülmények között megy végbe a tenyésztés, úgy a P. syringae sejtsűrűsége mintegy 10-15 g/liter száraz tömeget is elérhet, a pszeudomicin A' és/vagy B' termelt mennyisége pedig legalább mintegy 10 pg/ml-t tesz ki.
A pszeudomicin A' és/vagy B1 termelése szempontjából előnyös, ha a P. syringae tenyészetben az oxigéntartalmat szabályozzuk. Előnyös, ha az oxigénszintet mintegy 5 % - 50 % telítettségen, előnyösen mintegy 30 %-os telítettségen tartjuk. A tápközegben az oxigén koncentrációja szabályozható levegő, tiszta oxigén vagy oxigéntartalmú gázelegyek átfújásával. A rázás ütemének beállításával szintén szabályozhatjuk az oxigén bevitel sebességét.
A pszeudomicin A' és/vagy B' termelése szempontjából előnyös, ha a P. syringae tenyésztése közben a pH-t szabályozzuk. A pszeudomicinek, mint a pszeudomicin A' és/vagy B' lúgos pH mellett labilisak, és számottevő bomlás következhet be, amennyiben a tápközeg pH-ja mintegy 12 óra hosszat mintegy 6-os érték felett van. Előnyösen a tápközeg pH-ját mintegy 6-os pH alatt
- 13 tartjuk, előnyösen ez az érték mintegy 5,5-nél kevesebb, még előnyösebben 4,0 pH felett van. A pH-t előnyösen mintegy 5 - 5,4 értéken tarjuk, még előnyösebben mintegy 5,0 - 5,2 értéken. Feltételezzük anélkül, hogy a találmányt ezzel korlátozni szándékoznánk, hogy a bázikus pH-η végbemenő pszeudomicin bomlás a laktongyűrű felszakadásával, és a CIThr-nek Thr-ré való alakulásával függ össze.
A P. syringae képes pszeudomicin A'-t és/vagy B'-t termelni akkor is, ha szakaszos előállítást végzünk. Azonban a pszeudomicin termelést fokozza, ha félfolyamatosan tápláljuk be a glükózt, és adott esetben savat vagy bázist, mint ammónium-hidroxidot adagolunk be a pH szabályozására. A P. syringae által történő pszeudomicin termelés fokozható folyamatos tenyésztési módszerek segítségével, ahol automatikusan táplálunk be glükózt, és adott esetben a pH szabályozására savat vagy bázist, mint ammónium-hidroxidot adagolunk.
A pszeudomicin A' és/vagy B' kimutatása, meghatározása, elkülönítése és/vagy tisztítása a szakember számára jól ismert módszerek segítségével történhet. így például egy tápközegben vagy elkülönített vagy tisztított termékben a pszeudomicin aktivitás szintje meghatározható a Candida gombákkal szemben mutatott gombaellenes hatás alapján. A pszeudomicinek előállítására és vizsgálatára számos módszer ismert. így például a pszeudomicinek elkülöníthetők és tisztíthatok kromatográfiás művelettel, mint HPLC módszerrel.
Gyógyászati alkalmazás
Készítmények előállítása, a pszeudomicin A' vagy B' gombaellenes hatásának vizsgálata
A pszeudomicin A' és a pszeudomicin B' külön-külön in vitro és in vivo körülmények között hatásos, ezért eredményesen alkalmazhatók szisztémás gombás fertőzések vagy gombás börfertözések leküzdésére. A találmány
- 14 szerinti megoldással a gombák aktivitása gátolható oly módon, hogy a gombákat pszeudomicin A'-vel és/vagy B'-vel vagy ezek gyógyászatilag megfelelő sójával hozzuk érintkezésbe. Egy előnyös megoldás szerint különböző gombák, így C. parapsilosis, C. albicans, Cryptococcus neoformans és Histoplasma capsulatum szaporodását gátolhatjuk. Mint a fentiekben említettük, a találmány szerinti vegyületet egy parazitával vagy gombával hozunk érintkezésbe, ez a találmány szerinti vegyületnek a parazitával vagy gombával való kezelését vagy nyilvánvaló érintkeztetését jelenti. Azonban az érintkezés kifejezés nem foglal magában semmilyen gátlási mechanizmust.
A találmány szerinti kezelési eljárásnál eljárhatunk úgy is, hogy a gombafertőzés esetében hatásos mennyiségű pszeudomicin A'-t és/vagy B'-t vagy ennek gyógyászatilag megfelelő sóját, hidrátját vagy észterét adjuk azon személynek, akinek ilyen kezelésre szüksége van. Eredményesen kezelhetők különböző gombák, ideértve a C. parapsilosist, C. albicanst, Cryptococcus neoformanst és Histoplasma capsulatumot. Pszeudomicin A'-t és/vagy B'-t tartalmazó készítményt adva megfelelő mennyiségben a kezelt személynek, csökkenthető a gombás fertőzés kellemetlen hatása, mérsékelhetők a gombás fertőzéssel kapcsolatos szimptómák, és a kezelés eredményeként a gombás fertőzés teljes mértékben eliminálható is.
Számos beteg, akinek gombaellenes kezelésre van szüksége, a fertőzés súlyos szimptómáit mutatja, így a betegeknek magas lázuk van, és rendszerint gondos és intenzív kezelésre van szükségük. Némely gomba súlyos fertőzést okozhat. így például a Candida spp. nyálkahártya vagy egyéb szisztémás fertőzést okozhat. Egyre gyakrabban jelentkeznek azonban azolés polién-származékokkal szemben rezisztens Candida törzsek. Az Aspergillus életveszélyes szisztémás fertőzéseket idéz elő. A Cryptococcus meningitis kialakulásáért felelős. Ilyen súlyos gombás fertőzések léphetnek fel azon személyeknél, akiknél az immunrendszer működése legyengült, így
- 15 például akik szerv- vagy csontvelő-átültetést kaptak, rákbetegségnél kemoterápiás kezelés alatt állnak, súlyosabb műtétek után vannak vagy HIV-fertőzésük van. Ezen betegek esetében gombaellenes kezelésként általában pszeudomicin A' és/vagy B' tartalmú készítményt adunk intravénás úton több napon keresztül, vagy ennél hosszabb időn át a fertőzés leküzdésére.
A gombaellenes hatás vonatkozásában a hatásos mennyiség kifejezés a találmány szerinti vegyület azon mennyiségét jelenti, amely képes a gombák szaporodását vagy aktivitását gátolni, vagy a gombás fertőzés szimptómáit csökkenteni. A gombás fertőzések szimptómáinak csökkentése alatt azt értjük, hogy csökken a láz, a beteg eszméletére tér, és javul a beteg közérzete. Előnyösen a szimptómák oly módon csökkenthetők, hogy a gombák elpusztításával a fertőzést megszüntetjük, vagy a fertőzést az érintett személy által tolerálható szintre vagy a kezelt személy immunrendszere által kezelhető szintre csökkentjük. A leírásban alkalmazott gátlás kifejezés a gombák aktivitásának gátlását, a gombák szaporodásának leállítását, csökkentését vagy profilaktikus akadályozását, vagy a gomba jelenlétéből adódó bármely jellegzetesség vagy következmény gátlását jelenti.
A beadott dózis nagysága különböző tényezőktől függ, mint a fertőzés súlyosságától és természetétől, a kezelt beteg korától és általános egészségi állapotától, továbbá a kezelt személynek a gombaellenes szerrel szemben mutatott tűrőképességétől. Általában a gombás fertőzés leküzdésére a kezelt személynek (humán vagy egyéb állat, ideértve az emlősöket, mint - a korlátozás szándéka nélkül említve - macskákat, lovakat és szarvasmarhát, valamint madárféleségeket), hatásos mennyiségű készítményt adunk be. Ezen tényezőktől függően állítjuk össze a napi dózisrendet, a beadandó napi dózis adható egy adagban, vagy a nap folyamán több kisebb adagra elosztva. A kezelés időtartama mintegy 2-3 naptól mintegy 2-3 hétig tartó ideig változhat, vagy akár ennél hosszabb ideig is tarthat. A tipikus napi dózis (egy adagban vagy
- 16 több kisebb adagra osztva) a találmány szerinti hatóanyagból mintegy 0,01 mg/kg -100 mg/kg testtömeg mennyiséget tartalmaz. Az előnyös napi dózis általában mintegy 0,1 mg/kg - 60 mg/kg, az ideális mennyiség mintegy 2,5 mg/kg és mintegy 40 mg/kg között van. Súlyos fertőzések esetében a hatóanyag adható intravénás infúzió formájában is, így például 0,01-10 mg/kg/óra hatóanyagot beadva.
A találmány tárgyát képezik azon gyógyászati készítmények is, amelyek formájában a találmány szerinti gombaellenes vegyületek betegek kezelésére adhatók. A gyógyászati készítmények egy vagy több gyógyászatilag megfelelő vivöanyagot, hígítószert, hordozót, segédanyagot és egyéb adalékanyagot, továbbá pszeudomicin A'-t és/vagy B'-t tartalmaznak. Ezen készítményekben a hatóanyag 0,1 - 99,9 tömeg%-ot tesz ki, általában a hatóanyag mennyisége mintegy 10 % - 30 tömeg%. A gyógyászatilag megfelelő kifejezés azt jelenti, hogy a vivőanyag, hígítószer vagy segédanyag a készítményben lévő egyéb komponensekkel kompatibilis és nem káros a kezelt személyre nézve.
A készítmény adalékanyagként tartalmazhat különböző olajokat, így például petróleumolajat, állati, növényi vagy szintetikus eredetű olajokat, mint például földimogyoróolajat, szójababot, ásványolajat vagy szezámolajat. A gyógyászatilag megfelelő vivőanyagok közül megemlítjük a keményítőt, cellulózt, glükózt, laktózt, szacharózt, zselatint, malátát, magnézium-sztearátot, nátrium-sztearátot, glicerin-monosztearátot, nátrium-kloridot, szárított lefölözött tejet, glicerint, propilénglikolt, vizet és etanolt. A készítményekkel szokásos műveleteket végezhetünk, így ezeket sterilezhetjük vagy a készítmények tartalmazhatnak szokásos adalékanyagokat, mint konzerválószereket, stabilizálószereket, nedvesítőszereket vagy emulgeálószereket, az ozmózisnyomás beállítására alkalmas sókat és pufferanyagokat. A gyógyászatilag megfelelő vivöanyagokat és készítményeket a szakirodalom ismerteti [Martin:
- 17 Remington's Pharmaceutical Sciences, 15. kiadás, Mack Publishing Co., Easton, 1405-1412 és 1461-1487. oldalak (1975)].
A leírásban szereplő gyógyászatilag megfelelő só kifejezés a fent ismertetett vegyületek azon sóira vonatkozik, amelyek az élő szervezetre nézve lényegében nem toxikusak. A gyógyászatilag megfelelő sókra példaként említjük meg a találmány szerinti vegyületeknek szervetlen vagy szerves savakkal, vagy szervetlen bázisokkal képzett sóit. Ezen sókat savaddíciós sók és bázis addíciós sók néven ismerjük.
A savaddíciós sók képzéséhez általában alkalmazott szervetlen savakhoz tartozik a sósav, hidrogén-bromid, hidrogén-jodid, kénsav és foszforsav, alkalmazhatók erre a célra szerves savak, mint p-toluolszulfonsav, metánszulfonsav, oxálsav, p-bróm-fenil-szulfonsav, szénsav, borostyánkősav, citromsav, benzoesav és ecetsav. Ezen gyógyászatilag megfelelő sókra példaként megemlíthetők a szulfát, piroszulfát, hidrogén-szulfát, szulfit, hidrogén-szulfit, foszfát, mono-hidrogénfoszfát, dihidrogén-foszfát, metafoszfát, pirofoszfát, klorid, bromid, jodid, acetát, propionát, dekanoát, kaprilát, akrilát, formát, izobutirát, kaproát, heptanoát, propiolát, oxalát, malonát, szukcinát, szuberát, szebakát, fumarát, maleát, butin-1,4-dioát, hexin-1,7-dioát, benzoát, klór-benzoát, metil-benzoát, dinitro-benzoát, hidroxi-benzoát, metoxi-benzoát, italát, szulfonát, xilolszulfonát, fenil-acetát, fenil-propionát, fenil-butirát, citrát, laktát, gamma-hidroxi-butirát, glikolát, tartarát, metánszulfonát, propánszulfonát, naftalin-1-szulfonát, naftalin-2-szulfonát sók és a mandulasavval képzett sók. A gyógyászatilag megfelelő savaddíciós sók közül előnyösek a szervetlen savakkal, mint sósavval és hidrogén-bromiddal, valamint a szerves savakkal, így maleinsavval és metánszulfonsavval képzett sók.
A bázis addíciós sókhoz tartoznak a szervetlen bázisokkal, mint ammóniummal vagy alkálifém- vagy alkáliföldfém-hidroxiddal, -karbonáttal vagy -hidrogén-karbonáttal képzett sók. A találmány szerinti sók előállításához al
- 18 kalmas bázisokhoz tartozik a nátrium-hidroxid, kálium-hidroxid, ammónium-hidroxid, kálium-karbonát, nátrium-karbonát, nátrium-hidrogén-karbonát, kálium-hidrogén-karbonát, kalcium-hidroxid és kalcium-karbonát. Különösen előnyösek a kálium- és nátriumsók.
Hangsúlyozni szeretnénk, hogy a találmány szerinti sók képzésében résztvevő ellenion nem játszik döntő szerepet mindaddig, amíg a só egészében véve gyógyászatilag megfelelő és amíg az ellenion a sónál egészében véve nem idéz elő nemkívánatos tulajdonságokat.
A pszeudomicin A' és/vagy B' adható parenterálisan, így például intramuszkuláris, szubkután vagy intraperitoneális injekció formájában, nazálisán vagy orális úton. Ezen kívül a pszeudomicin A és/vagy B' adható helyi kezelés formájában is a bőr felszínére, vagy pedig a nyálkahártyára felvive a gombák elpusztítására vagy szaporodásuk gátlására.
A parenterális beadásra szánt készítmények pszeudomicin A'-t és/vagy B'-t tartalmaznak, valamint fiziológiai szempontból megfelelő hígítószert, mint ionmentesített vizet, fiziológiás sóoldatot, 5 %-os dextróz oldatot, és egyéb általában ismert hígítószert. A készítmény tartalmazhat ciklodextrint és/vagy szolubilizálószert, mint poli(etilénglikol)-t vagy poli(propilénglikol)-t, vagy egyéb ismert szolubilizálószert. Ezen készítmények készülhetnek steril üvegcsében, amely a gombaellenes szert és a segédanyagokat száraz por vagy liofilizált por formájában tartalmazza. A felhasználás előtt fiziológiailag megfelelő hígítószert adunk a porhoz, majd az oldatot fecskendőbe felszívva azt a kezelt betegnek beadjuk.
A találmány szerinti gyógyászati készítmények ismert módszerrel készülnek, ismert és könnyen beszerezhető komponensek alkalmazásával. A találmány szerinti készítmények előállítása során a hatóanyagot általában vivöanyaggal elkeverjük, vagy abban feloldjuk, vagy egy vivöanyagba bezárjuk, ahol a vivőanyag képezhet kapszulát, tasakot, papír vagy egyéb tartályt.
- 19 Amennyiben a vivöanyag hígítószerként is szerepel, úgy az lehet szilárd, félszilárd vagy folyékony anyag, ami a hatóanyag szempontjából vivőanyagot, hígítószert vagy közeget képez. A készítmények készülhetnek tabletták, drazsék, porok, gyógycukorkák, tasakok, elixírek, szuszpenziók, emulziók, oldatok, szirupok, aeroszolok (szilárd por formájában vagy folyékony közegben) akár 10 tömeg% hatóanyagot is tartalmazó kenőcsök formájában, lágy és kemény zselatin kapszulák, kúpok, steril injekciós oldatok és sterilen csomagolt porok formájában.
Orális beadásra a gombaellenes vegyületet zselatin kapszulákba töltjük, vagy tabletták formájában készítjük el. Ezen tabletták tartalmazhatnak megkötőszert, diszpergálószert vagy egyéb alkalmas vivőanyagot is, amivel a pszeudomicin A'-t és/vagy B'-t tartalmazó, megfelelő méretű tabletták elkészíthetők. Gyermekgyógyászati célra vagy idősek számára a gombaellenes vegyület készíthető ízesített folyékony szuszpenzió, oldat vagy emulzió formájában. Egy orális célra szánt előnyös készítményhez használhatunk linolénsavat, cremophor RH-60-at és vizet, célszerűen 8 % linolénsavat, 5 % cremophor RH-60-at, 87 % steril vizet és mintegy 2,5 - 40 mg/ml mennyiségben pszeudomicin A'-t és/vagy B'-t.
Helyi alkalmazásra a gombaellenes szer készülhet száraz por formájában is, amit a bőr felszínére viszünk fel, vagy pedig készülhetnek folyékony készítmények, ideértve a szolubilizáló vizes folyadékokat vagy nemvizes folyadékokat, így például alkohollal vagy glikollal készült folyadékokat.
Pszeudomicin A' vagy B' tartalmú készítmények alkalmazása
A találmány tárgyához tartozik egy készlet is, amely a találmány szerinti gyógyászati készítményeket tartalmazza, és a találmány szerinti kezeléshez használható. A készlet tartalmazhat egy üvegcsét, amelyben a találmány szerinti készítmény és megfelelő vivőanyag van jelen szárított formában vagy folyékony alakban. A készlet ezen kívül instrukciókat tartalmaz felirat alakjá
- 20 ban az üvegcsén és/vagy a dobozban elhelyezett ismertetés formájában, ami tájékoztat a vegyületek alkalmazásának módjáról. Az instrukciók nyomtathatók az üvegcsét tartalmazó dobozra is. Az instrukciók tájékoztatást nyújtanak a szükséges dózisról, a beadás módjáról, ami az egészségügyi területen dolgozók számára megkönnyíti a gyógyszer beadását. Az egészségügyi területen dolgozók kifejezésen a gyógyszer beadására jogosult orvost, ápolónőt vagy technikust értjük.
A találmány tárgyát képezi egy pszeudomicin A'-t és/vagy B'-t tartalmazó gyógyászati készítmény is, ami injekció formájában adható be. A találmány szerint egy pszeudomicin A'-t és/vagy B'-t tartalmazó készítmény alkalmazható injekció formájában beadható gyógyszer előállítására is. A találmány tárgyához tartozik a pszeudomicin A'-t és/vagy B'-t tartalmazó készítmények előállítására szolgáló eljárás is, ahol a készítmény injekció formájában beadható alakban készül. így például szokásos műveletekkel folyékony vagy szilárd készítmények alakíthatók ki különböző módon. Folyékony készítmény állítható elő oly módon, hogy pszeudomicin A'-t és/vagy B'-t megfelelő oldószerben, így vízben feloldunk, ahol az oldat megfelelő pH-jú, és adott esetben pufferanyagokat vagy egyéb segédanyagokat tartalmaz.
Mezőgazdasági alkalmazás
A P. syringae NRRL B-12050 által termelt antibiotikumok eredményesnek mutatkoztak a holland szilfa betegség kezelésére [lásd a 4 342 746 és a 4 277 462 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat]. Közelebbről, a P. syringae MSU 16H nagyobb védelmet biztosít a Ceratocystis ulmi által (a holland szilfabetegség okozója) fertőzött szilfák védelmére, mint a vad típusú törzsek [lásd például Lám és munkatársai: Proc. Natl. Sci., USA 84, 6447-6451 (1987)]. Szabad területen nevelt szilfáknál végzett vizsgálatok igazolják a kedvező eredményeket profilaktikus szinten. így a találmány szerinti pszeudomicinek eredményesen alkalmazhatók a holland szilfa betegség
- 21 megelőző kezelésére. A pszeudomicinekről kimutatták, hogy számos növénykárosító patogén gombával szemben toxikus hatást fejtenek ki, ezen növényi patogén gombák közül megemlítjük a Rynchosporium secalis-t, Ceratocystis ulmi-t, Rizoctonia solani-t, Sclerotinia sclerotiorum-ot, Verticillium albo-atrum-ot, Verticillium dahliae-t, Thielaviopis basicola-t, Fusarium oxysporum-ot és Fusarium culmorum-ot [lásd Hamson, L. és munkatársai: Pseudomycins, a family of novel peptides from Pseudomonas syringae possessing broad-spectrum antifungal activity (Pszeudomicinek, P. syringae-ból származó, széles spektrumú gombaellenes hatású új peptidcsalád), J. General Microbiology, 7, 2857-2865 (1991)]. Következésképpen az elkülönített pszeudomicin A' és/vagy B' (ideértve e vegyületek hidrátjait, szolvátjait és észtereit) eredményesen alkalmazhatók lehetnek növényi gombák kezelésére (különösen V. albo-atrum, Rhizoctonia solani és F. oxysporum esetében), a kezelés végezhető közvetlenül vagy preventív módon. Általában a fertőzött növényeket oly módon kezeljük, hogy a pszeudomicin vegyületeket tartalmazó vizes szuszpenziót injekció formájában vagy spray formájában visszük fel a növényekre vagy juttatjuk be a növényekbe. Az injekciók beadásának módjai a szakember számára jól ismertek (így például fúrópisztollyal). A hatóanyag hatásos mennyiségének a növények felületére való juttatásánál bármely módszer alkalmazható a szuszpenzió felpermetezésére. A szuszpenzió tartalmazhat a szakember számára jól ismert általában alkalmazott adalékanyagokat, így szolubilizálószereket, stabilizálószereket, nedvesítöszereket és ezek kombinációit.
A növények kezelését végezhetjük elkülönített pszeudomicin A' és/vagy B' vegyületeket tartalmazó száraz készítménnyel is. A száraz készítmény a szakember számára ismert bármely módszerrel felvihető a növények felszínére, így például permetezéssel vagy tartályból való kirázással.
- 22 A találmány jobb megértését szolgálják az alábbi példák. A példák a találmány szerinti megoldás szemléltetését szolgálják a találmány oltalmi körének korlátozása nélkül.
Példák Letétbe helyezett biológiai anyagok
A P. syringae MSU 16H nyilvánosan hozzáférhető az American Type Culture Collection-nál (Parklawn Drive, Rockville, MD, USA, letéti szám: ATCC 67028. P. syringae 25-B1, 7H9-1 és 67 H1 törzsek; letétbe helyezés időpontja: 2000. március 23.; ezen törzsek az alábbi számok alapján hozzáférhetők:
25-B1 Állományi szám PTA-1622
7H9-1 Állományi szám PTA-1623
H1 Állományi szám PTA-1621.
1. példa Pszeudomicin A* és B' előállítása
A pszeudomicin A' és/vagy B' előállítását fermentációs úton végezzük, egy P. syringae törzset fermentációs közegben tenyésztve.
Alkalmazott anyagok és módszerek Inokulum készítése
Folyékony nitrogén gözfázisában tárolt sejtek alikvot részét felolvasztjuk, majd ezzel két 900 ml-es CSM tápközeg adagot beoltunk. A CSM tápközeg összetétele (g/l-ben): dextróz (5), maltóz (4), Difco Triptin szója tápközeg (30), Difco keményítő (élesztő) extraktum (3), valamint MgSO4-7H2O (2). 2-literes lombikokban lévő, egyenként 900 ml-es tápközeg adagokat mintegy 0,5 ml sejt szuszpenzióval oltunk be. A lombikok tartalmát rázás közben 24 óra hosszat 25 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A két lombik egyesített tartalmával 150 liter térfogatú fermentorban lévő 115 liter steril fermentációs tápközeget oltunk be.
- 23 Fermentációs lépés: a fermentációs tápközeg összetétele (g/l-ben): dextróz (20), oldható keményítő (5), Burgonyapüré (Basic American Foods Country Style Potato Pearls, azonnal oldódó) (30), glicin (1), MgSO4-7H2O (0,2), KCI (0,2), valamint FeSO4-7H2O (0,004), a tápközeg csapvízzel készül. Sterilezés előtt a tápközeg pH-ját 5,2-es értékre állítjuk. A fermentációt 25 °C hőmérsékleten 68 óra hosszat folytatjuk. A feloldott oxigén mennyiségét 30 %-os levegő telítettség érték felett tartjuk a levegő áramlás és a keverőlapát sebességének folyamatos szabályozásával. H2SO4 vagy NaOH beadagolásával a tápközeg pH-ját 4,0 és 5,4 érték között tartjuk.
A szakaszos módszer variációi:
Az egyszerű szakaszos eljárást különböző módon variálva állítunk elő pszeudomicin A'-t és/vagy B'-t. A kezdeti beoltást követő 24 óra eltelte után a fermentorokba dextrózt adagolhatunk 60 ml/óra ütemben. A betáplálást a fermentáció teljes ideje alatt folytathatjuk. Másik megoldásként úgy járunk el, hogy a feloldott oxigén mennyiségét 5 %-os levegő telítettségi szinten tartjuk a beoltást követő 24 órától kezdve egészen a fermentációs periódus végéig. Az oldott oxigén 5 %-os szinten való tartását oly módon biztosítjuk, hogy a fermentorba vezetett levegőhöz közömbös nitrogéngázt (N2) adagolunk. Mindegyik esetben a gáz beadagolást a fermentlébe süllyesztett egyetlen permetező csövön keresztül végezzük, ahol a cső nyílása a fermentorban lévő fenék keverő turbina alatt helyezkedik el.
Eredmények és következtetések
A P. syringae-ből különböző fermentációs módszerekkel állítható elő pszeudomicin A' és/vagy B'.
2. példa Pszeudomicin A* és B' elkülönítése és tisztítása
A P. syringae törzs szaporítására használt fermentléböl a pszeudomicin A' és B' elkülönítésére és tisztítására alkalmas módszereket dolgoztunk ki.
- 24 Felhasznált anyagok és módszerek
A 4x100 liter térfogatú fermentlét a fermentáció befejezése után Membralox kerámia szűrőn (0,45 pm) átszűrjük, így szűrletet (A frakció) és szilárd szuszpenziót (B frakció) kapunk. A B frakciót (135 liter) 0,1 % TFA-t tartalmazó, azonos térfogatú acetonnal 120 percig extraháljuk, majd hagyjuk leülepedni. A tiszta acetonos extraktumot szűréssel elkülönítjük, majd vákuumban betöményítjük, így egy vizes oldatot képező C frakcióhoz jutunk (88 liter). Először az A) frakciót visszük fel HP20 gyantával töltött oszlopra (10 liter), ahol a gyantát előzőleg vízzel szuszpendáltuk; majd az oszlopot 0,1 % TFA-t tartalmazó 15 %-os acetonitrillel mossuk (20 liter térfogatú). Ezt követően a C frakciót töltjük fel ugyanezen oszlopra, majd az oszlopot 20 liter térfogatú, 0,1 % TFA tartalmú 15 %-os acetonitrillel mossuk át.
Az oszlopot ezután 30 percig eluáljuk, e művelethez 0,1 % TFA-t tartalmazó 15 -> 20 % acetonitril lineáris gradienst használunk, majd ezután 60 percig az eluálást 0,1 % TFA-tartalmú 20 -> 35 %-os acetonitrillel végezzük; áramlási sebesség: 1 liter/perc. 1 literes térfogatú frakciókat fogunk fel. A 6-tól 9-ig terjedő frakciókat egyesítjük (4 liter térfogat), így 24 g D jelzésű frakcióhoz jutunk. A D frakcióból egy adagot (mintegy 1 g-ot) fordított fázisú oszlopon kromatografálunk (Dynamax C-ie 41,4x250 mm), a művelethez 3-as pH-jú trietil-ammónium-foszfát puffer/acetonitril/metanol elegyet használunk mobil fázisként (gradiens eluálás 65:17:18 -> 30:35:35); az eluálást 45 percig végezzük; áramlási sebesség: 40 ml/perc. A megfelelő frakciókat egyesítjük, a térfogatot 75 ml-re csökkentjük, majd C18-as oszlopon ismét kromatográfiát végzünk a fentiek szerint, ez esetben a gradiens összetétele 80:10:10 -> 46:27:27; így 113 mg E frakciót és 116 mg F frakciót kapunk. Az E és F frakciókat C18-as oszlopon (Dynamax 21,4 x 250 mm) tovább kromatografálva 45 mg pszeudomicin A'-t és 62 mg pszeudomicin B'-t kapunk.
- 25 Eredmények és következtetések
Az egyéb pszeudomicinek tisztításához alkalmazott HPLC módszerekkel a fermentléből tiszta pszeudomicin A' és B' nyerhető ki.
3. példa A pszeudomicin A' és B' szerkezetének meghatározása
A pszeudomicin A' és B' szerkezetét NMR tömegspektrométerrel határoztuk meg.
Pszeudomicin A' szerkezetének meghatározása Alkalmazott módszerek és eredmények
A pszeudomicin A' molekula összegképletét nagy feloldású FABMS módszerrel határoztuk meg, eredmény: C52H89CIN12O20 [az m/z értéke 1237,6112 a C52H89CIN12O20 összegképletre számítva (M+H)+, Δ = 2,4 ppm], A pszeudomicin A molekula képletét a pszeudomicin A' képletével összehasonlítva ebben egy további CH2 csoport jelenlétét mutathatjuk ki. Ebből arra következtethetünk, hogy a pszeudomicin A'-ben az N-terminális szerin feltehetően 3,4-dihidroxi-pentadekánsavval van acilezve a pszeudomicin A-ban szereplő 3,4-dihidroxi-tetradekánsav helyett. Ezt a feltételezést támasztja alá az a tény, hogy az eddigiekben jellemzett pszeudomicineknél a vegyületben egy határozott, jól azonosítható nonadepszipeptid gyűrű jelentkezik, és a vegyieteknél észlelt különbség csak a hidrofób oldalláncnál mutatkozik meg.
Ennek értelmében a pszeudomicin A' NMR spektrum adatai gyakorlatilag azonosak az összes többi pszeudomicinével, így a pszeudomicin A, B, C és C vegyületek NMR adataival. Az 1H, 13C és 2D NMR spektrumok részletes tanulmányozása után, beleértve a pszeudomicin A'-re vonatkozó TOCSY és HMQC adatokat is, azt találtuk, hogy a pszeudomicin A' hidrofób oldalláncában 3,4-diol funkciós csoport van jelen; a protonoknak és a protont hordozó szénatomoknak a molekulában elfoglalt helye tisztázható volt (lásd az 1. táblázatot).
- 26 A pszeudomicin A' szerkezetét az alábbi tömegspektrometriás és NMR adatok alapján határoztuk meg, és az (IA) képlettel mutatjuk be.
1. táblázat
Pszeudomicin A'-re vonatkozó 1H és 13C-NMR adatok; H2O+CD3CN-ben
Aminosav Helyzet δκ Sc
Ser NH 8.28 -
a 4.59 54.0
I Γ ..pl 4.50 65.5
P2 4.41
Dab-1* NH 8.48 -
a 4.15 53.1
βι 1.98
Y 2.91 37.4
NH: 7.50 -
Asp NH 8.34 -
a 4.54 51.5
βΐ 2.86 36.0
J32 2.80
Lys NH 7.80 -
a 4.16 54.6
_β. 1.75 30.8
Y1 1.31 23.2
Y2 1.22
Aminosav Helyzet Sh 5c
δ 1.54 27.2
ε 2.83 40.4
nh2 7.34 -
Dab-2* NIH 8.09 -
a 4.28 52.1
81 2.11 28.7
I__________________________________________________________________________________________ 02 1.96
Y 2.89 37.6
nh2 -
Thr NH 7.63 -
a 4.28 59.8
8 3.92 68.6
Y 1.16 20.4
Dhb NH 9.45 -
8 6.49 133.9
_ϊ_____ 1.69 13.5
Hyd. Asp NH 7.85 -
a 4.94 56.9
8 4.78 71.6
CIThr NH 7.88
a 4.87 56.0
8 4.31 72.3
I I Yl 3.50 45.6
Y2‘ 3.42
Side chain 2a 2.47 39.4
2b 2.30
3 3.76 72.6
4 3.39 75.1
5 1.41 33.3
6-14 1.21 32.4.
30.2X4.
29.9.
27.2.
26.4.
23.2
15 0.81 14.3
* A Dab-1-re és Dab-2-re vonatkozó adatok egymással felcserélhetök.
- 28 A pszeudomicin B' szerkezetének meghatározása
A pszeudomicin B' szerkezetének meghatározása szintén a tömegspektrum és NMR spektrum adatok értelmezése alapján történt. A molekula összegképletét: C49H83CIN12O19 [m/z 1179,5685 a C49H84CIN-12O19 összegképletre számítva (M+H)+, Δ - 1,8 ppm] nagy feloldású FAB-MS adatok alapján határoztuk meg. Ez a képlet két CH2 csoporttal kevesebbet mutatott a pszeudomicin B képletéhez viszonyítva. Az 1H, 13C és 2D NMR adatok részletes vizsgálata, ideértve a TOCSY és HMQC spektrum adatok értékelését is azt mutatta, hogy az ismert pszeudomicinekhez hasonló aminosav összetétellel állunk szemben. Ezen túlmenően az NMR adatok 3-hidroxi-dodekánsav jelenlétére utaltak (lásd a 2. táblázatot). A spektrum adatokból megállapítható volt a pszeudomicin B' szerkezete, ezt az (IB) képlettel mutatjuk be. A pszeudomicin B' (IB) képletét az alábbi tömegspektrum és NMR spektrum adatok alapján határoztuk meg.
2. táblázat
A pszeudomicin B'-re vonatkozó 1H és 13C-NMR adatok;
H2O+CD3CN-ben
Aminosav Helyzet Őh 5c
Ser NH 8.31 -
a 4.64 53.5
01 4.54 65.8
¢2 4.35
Aminosav Helyzet 5h δε
Dab-1* NH 8.52 -
a 4.13 53.3
Pl 2.02 28.7
β2 _______________
Y 2.94 37.3
NH? 7.54 -
Asp NH 8.30 -
a 4.56 51.6
Pi 2.86 36.0
P2 2.80
Lys NH 7.90 -
a 4.09 54.9
P 1.75 29.8
Y1 1.28 23.2
Y2 1.18
δ 1.52 27.3
E 2.82 40.4
NH, 7.34 -
Dab-2* NH 8.24
a 4.35 51.8
Pl 2.12 29.2
P2 1.99
Y 2.90 37.7
NH2 -
Thr NH 7.75 -
a 4.23 60.4
P 3.93 68.2
Y 1.18 20.5
Dhb NH 9.45 -
P 6.57 134.8
Y 1.68 13.7
Hvd. Asp NH 7.79 -
a 4.95 57.1
P 4.71 72.0
Aminosav Helyzet δκ δο
ClThr NH 7.98
a 4.87 55.8
β 4.31 72.5
γΐ 3.48 45.6
Υ2 3.42
Side chain 2a 2.33 43.8
2b 2.24
3 3.85 69.6
4 1.37 37.6
5-11 1.20 32.4,
30.1,
30.1,
29.8.
23.2
12 0.81 14.4
* A Dab-1-re és Dab-2-re vonatkozó adatok egymással felcserélhetök.
Következtetések
A pszeudomicin A' és B' a nonadepszipeptidek osztályához tartozó új vegyületeket képviselnek. Ezen molekulák az ismert pszeudomicinek szerkezetéhez hasonlóak, mindössze a hidrofób oldalláncban mutatkozik eltérés, azonban ezen vegyületek kulcsszerepet játszhatnak ezen gombaellenes vegyület csoport szerkezettel összefüggő hatásának felderítésénél.
4. példa
A Pseudomonas syringae elkülönítése, jellemzése és mutagenézise
A gombaellenes szerek előállítása során a környezetből P. syringae-t és ennek mutánsait különítettük el és alkalmaztuk.
- 31 Felhasznált anyagok és módszerek
Az MSU 174 és MSU 16-H törzseket az 5 576 298 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint különítettük el és jellemeztük (a szabadalom megadásának időpontja: 1996. november 19., Stroebel G. és munkatársai szabadalma); ezen törzsekkel foglalkoznak az alábbi közlemények: Hamson, L. és munkatársai: Pseudomycins, a family of novel peptides from Pseudomonas syringae possessing broad-spectrum antifungal activity, (Pszeudomicinek, Pseudomonas syringae-ből származó, széles spektrumú gombaellenes hatású új peptidcsalád, J. of Gen. Microbiology, 7, 2857-2865 (1991), továbbá Lamb és munkatársai Transposon mutagenesis and tagging of flurescent pseudomonas: Antimycotic production is necessary for control of Dutch elm disease, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 6447-6451 (1987). Fenti közleményeket találmányunknál referenciaként tekintjük.
Kémiailag előidézett mutagenézis segítségével ezen vad típusú törzsekből és mutánsaikból további törzsek lettek előállítva. Az MSU 174, MSU 16H és 25-B1 törzseken mutagenézist végeztünk. A mutagenézisnek alávetett törzseket CSM tápközegben tenyésztjük, majd a tenyészetet mutagenezist előidéző vegyületet: 1-metil-3-nitro-1-nitrozo-guanidint (NTG vagy MNNG) tartalmazó tápközegbe visszük, ahol a mutagenézist előidéző vegyület koncentrációja 0, 1, 2, 4, 16 vagy 32 pg/ml. Az így nyert sejteket fagyasztva tároljuk a további vizsgálat és elkülönítés előtt.
Mutagenizált sejteket különítünk el egy vagy több pszeudomicin, így pszeudomicin A' és/vagy B' termelése szempontjából kedvező tenyésztési körülmények között. Kémiailag mutagenizált P. syringae sejteket, mint a mutagenizált 25-B1 törzset felolvasztjuk, és 6 sejt/ml koncentrációra hígítjuk N21SM tápközeggel (lásd az 5. táblázatot). Ezen tápközeg némely esetben egy vagy több, szelekcióhoz alkalmas komponenst, így foszfát különböző koncentrációját tartalmazza. 50 μΙ térfogatú mutagenizált sejtet 96-lyukú
- 32 gömbölyű fenekű mikrotiter lemezre viszünk fel átlagban 0,3 sejt/lyuk koncentrációra számítva. A párolgás csökkentésére minden egyes lyukba szilikon olajat töltünk. Rázás közben a lemezeket 25 °C hőmérsékleten 6-12 napig inkubáljuk.
5. táblázat Az N21SM tápközeg összetétele
Komponensek g/liter
Glükóz 20
Ammónium-szulfát 0,5
Mononátrium-glutamát vagy L-glutaminsav 2
L-hisztidin 2
Glicin 0,5
Oldható keményítő 5
KH2PO4 0,2
Czapek-féle szervetlen sóoldat 2 ml
MES puffer 9,8
A pH 5,0 értékre van állítva
Az inkubálást követően minden egyes nyílásból alikvot részt (általában 5 Tl-t) széria hígításnak vetünk alá (így például 1:56, 1:196, 1:320, 1:686 és/vagy 1:1715 arányban), majd a hígítások gombaellenes hatását Candida albicans-sal szemben vizsgáljuk folyékony közegben mikrotiter lemezen biológiai módszerrel. A lemezeket 37 °C hőmérsékleten egy éjszakán át inkubáljuk, ezután ellenőrizzük a C. albicans szaporodásának gátlását. A megfelelő törzseket kiválasztjuk, ezeket CSM tápközegbe oltjuk (lásd a 6. táblázatot), majd 25 °C hőmérsékleten 1-3 napig tenyésztjük.
6. táblázat Teljes Streptomyces tápközeg (CSM)
Komponensek Koncentráció g/liter
Glükóz 5
Maltóz 4
Difco Triptin szója főzet 30
Difco keményítő extraktum 3
MgSO4-7H2O 2
pH-állítás nélkül
A kiválasztott törzseket 13 ml N21SM tápközeget tartalmazó fermentációs lombikokba oltjuk, majd 25 °C hőmérsékleten mintegy 66 óra hosszat tenyésztjük. A fermentléből alikvotot veszünk ki, ezt az alikvot térfogatával azonos térfogatú acetonitrillel 1 óra hosszat extraháljuk majd centrifugáljuk, ezután dekantáljuk és HPLC vizsgálatot végzünk, ellenőrizve egy vagy több pszeudomicin, mint pszeudomicin A' vagy B' jelenlétét (az 1-3. példákban ismertetett módszer szerint). Azokat a törzseket, amelyek egy vagy több pszeudomicint, így pszeudomicin A'-t vagy B'-t termelnek, elkülönítjük, újra fermentáljuk, majd nagyobb léptékű tenyésztésre előkészítjük.
Eredmények
A fent ismertetett módszerek szerint eljárva egy vagy több pszeudomicint, így pszeudomicin A'-t vagy B'-t termelő törzset különítettünk el.
Következtetés
A fentiekben ismertetett kiválasztási módszerek eredményesen alkalmazhatók olyan P. syringae törzsek elkülönítésére és minimális tápközegen
- 34 való szaporítására, amelyek egy vagy több pszeudomicint, így pszeudomicin A'-t vagy B'-t termelnek.
5. példa P. syringae tenyésztése és pszeudomicinek termelése
A P. syringae-t burgonya terméket nem tartalmazó N21 tápközegben fermentálva (szemben a szakirodalomban P. syringae tenyésztésére alkalmazott burgonyatartalmú táptalajjal) elkülönítésre alkalmas koncentrációban pszeudomicinek termelhetők.
Pszeudomicinek termelése N21 tápközegben, rázott lombikokban Felhasznált anyagok és módszerek
P. syringae-t tenyésztünk 50 ml N21 tápközeget tartalmazó (lásd a 7. táblázatot) 250 ml térfogatú lombikban. A tenyésztés kezdetén alikvot menynyiségű P. syringae MSU 16H törzs inokulumával beoltást végzünk, majd a tenyésztést 25 °C hőmérsékleten 70 %-os nedvességtartalom mellett 7 napig folytatjuk, miközben a lombikokat 250 fordulat/perc sebességgel rázatjuk. Az inkubálás végén 4 ml fermentlét kiveszünk a lombikból, majd ezt 0,1 % foszforsav tartalmú 6 ml metanollal elegyítjük. Feltételezések szerint az alacsony pH stabilizálja a pszeudomicineket. Szűréssel vagy centrifugálással a szemcséket eltávolítjuk a tiszta oldatból, majd HPLC művelettel a pszeudomicinek koncentrációját fentiek szerint meghatározzuk.
- 35 7. táblázat Az N21 tápközeg összetétele
Komponensek g/liter
Szacharóz 35
Ammónium-szulfát 0,5
Mononátrium-glutamát 2
L-hisztidin 2
Glicin 0,5
Oldható keményítő 5
KH2PO4 0,2
Czapek-féle szervetlen sóoldat 2 ml
Keményítő extraktum 1
MES puffer 9,8
pH állítás 5,2-re
Ellenőrizzük néhány P. syringae törzs pszeudomicin termelését, e művelethez N21 tápközeget használunk metil-mirisztát hozzáadásával és anélkül. A vizsgált P. syringae törzsek közül értékeltük az MSU 16H, 25-B1, 67H1 és 7H9-1 jelzésű törzseket.
Eredmények
A különböző P. syringae törzseket metil-mirisztát hozzáadásával vagy enélkül tenyésztjük, a vizsgált törzsek egy vagy több pszeudomicint termeltek jelentős szinten, így például 10 Tg/ml koncentrációban pszeudomicin A-t, pszeudomicin B-t és/vagy pszeudomicin C-t. Némely törzs esetében a metil-mirisztát hozzáadása a pszeudomicin termelést fokozta.
- 36 Következtetések
A P. syringae különböző törzseit burgonya termékeket nem tartalmazó tápközegben tenyésztve ezek kereskedelmi szempontból jelentős mennyiségű pszeudomicin termelésére képesek, ez a termelés metil-mirisztát hozzáadásával stimulálható.
Pszeudomicin termelés 5000 liter térfogatban, N21 tápközeg alkalmazásával
A pszeudomicin termelési módszert 5000 literes szintre növeltük meg, a fermentálást burgonya termékeket nem tartalmazó tápközeggel végeztük.
Felhasznált anyagok és módszerek
Komplett Streptomyces tápközeget (CSM, lásd az 5. táblázatot) tartalmazó vegetatív szintű lombikokat fagyasztott P. syringae tenyészettel, általában 67 H1 törzzsel beoltunk, majd a lombikokat 25 °C hőmérsékleten 24 óra hosszat 250 fordulat/perc sebességgel rázatjuk. 24 óráig tartó inkubálás után a lombikok tartalmát nagyobb méretű lombikok beoltásához használjuk. Ezen nagyobb lombikokban CSN tápközeg van jelen, a lombikok tartalmát 25 °C hőmérsékleten 250 fordulat/perc sebességgel forgatjuk. A vegetatív-szintű tenyésztéshez használt három vagy négy lombikban lévő fermentlét egyesítjük, majd ebből 0,45 ml-t kivéve ezzel a nagyobb méretű lombikokat beoltjuk. Erre a célra 2,5 liter térfogatú Tunair™ típusú lombikokat használunk, amelyek mintegy 900 ml CSM tápközeget tartalmaznak. Minden egyes fermentorhoz két Tunair™ lombik tartalmát használjuk fel. A Tunair™ lombikokban az inkubálást 16 óra hosszat végezzük.
Ezután a Tunair™ lombikokban lévő tenyészeteket fém inokulum tartályban egyesítjük. Ezen egyesített tenyészetekkel oltjuk be a 15. táblázat szerinti tápközeget tartalmazó tankot, amit kiegészítünk 3 g/liter (összesen 4 g/liter) glicinnel, 1 g/liter szójabab olajjal és 1 g/liter keményítő extraktummal. A nagyléptékű tenyésztést 25 °C hőmérsékleten 3-4 napig végezzük. A te
- 37 nyésztés időtartama alatt a feloldott oxigén mennyiségét 30 %-os levegő telítettségre állítjuk a levegő beáramlás és a keverés szabályozásával. A pH-t 5,2 ±0,2 értékre állítjuk, a pH beállításához kénsavat vagy nátrium-hidroxidot használunk a szükségletnek megfelelően. A nagyléptékű tenyésztésnél 18 óra eltelte után (a fermentáció kezdetétől számítva) glükózt táplálunk be 200 ml/óra ütemben. 20 órával a nagyléptékű tenyésztés kezdete után ammónium-hidroxidot táplálunk be 20 ml/óra ütemben. A tenyésztés alatt a visszafutást gátló nyomás 3,4x104 Pa. A keverést 150 fordulat/percre állítjuk, a levegő beáramlás sebessége 0,5 scfm. Szükség esetén habzásgátló szert adunk a fermentorba. Ezen körülmények bizonyos változatait szintén vizsgáltuk. A nagyléptékű tenyésztésnél a fermentálás 3. vagy 4. napján a P. syringae tenyészetet elkülönítjük. A gombaellenes hatást a 6. példában leírtak szerint vizsgáljuk.
Eredmények és következtetések
Burgonya termékektől mentes tápközeg alkalmazásával és a fermentálást 5000 liter térfogatban végezve kereskedelmi szempontból jelentős mennyiségű pszeudomicineket tudtunk előállítani.
6. példa
Pszeudomicinek meghatározása és tisztítása
A pszeudomicinek kimutatása és meghatározása gombaellenes hatásuk alapján
Egy pszeudomicin vagy pszeudomicin elegy jelenlétét vagy mennyiségét a készítmény gombaellenes hatása alapján mutathatjuk ki és határozhatjuk meg. A gombaellenes hatást in vitro körülmények között határozzuk meg a minimális inhibitor koncentráció (MIC) alapján standard agar hígítási módszert vagy lemez diffúziós vizsgálatot alkalmazva. Egy vagy több pszeudomicint tartalmazó termék extrahálható sejttenyészetből vagy tisztított elegy
- 38 böl. A gombaellenes hatás vizsgálatához tipikus gombaként C. albicans-t használunk. A gombaellenes hatást akkor tekintjük jelentősnek, amennyiben a vizsgált készítmény 10-12 mm átmérőjű gátlási zónát hoz létre a Candida albicans x657-tel beoltott agar lemezeken.
A gombaellenes vizsgálatokat tápközeg hígítási módszerrel végezzük (a National Committee for Clinical Laboratory Standards útmutatása szerint) 96-lyukú mikrotiter lemezeken. Sabourauds és dextróz tápközeget 2,5x104 Candida/ml koncentrációra állítunk be. A vizsgálati vegyületeket vízben feloldjuk, és kétszeres hígítási oldatokban vizsgáljuk, ahol a legnagyobb koncentráció 20 pg/ml. A lemezeket 48 óra hosszat 35 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A 3. és 4. táblázatban mutatjuk be a minimális inhibitor koncentrációra (MIC) vonatkozó eredményeket, ahol a vizsgált vegyület a szaporodást teljes mértékben gátolta a kezeletlen kontrolihoz viszonyítva.
3. táblázat
Pszeudomicin A' gombaellenes hatása
Mikroorganizmus MIC (μ/ml)
Candida albicans 2,5
C. parapsilosis 5,0
Cryptococcus neoformans 1,25
Aspergillus fumigatus >20
Histoplasma capsulatum 5,0
4. táblázat Pszeudomicin B' gombaellenes hatása
Mikroorganizmus MIC (μ/ml)
Candida albicans 10
C. parapsilosis 10
Cryptococcus neoformans 1,25
Aspergillus fumigatus >20
Histoplasma capsulatum 1,25-5,0
A pszeudomicinek kimutatása és meghatározása HPLC módszerrel
Az egy vagy több pszeudomicint tartalmazó mintát szűréssel vagy centrifugálással tisztítjuk. A tisztított mintát Zorbax RxC8 oszlopon (3,5 T részecskék, 25 x 0,46 cm) kromatografáljuk; áramlási sebesség: 1 ml/perc. Az oszlopot 15 percig 0,2 % TFA tartalmú 20 -> 55 % acetonitril lineáris gradienssel, majd ezután 5 percig 0,2 % TFA-tartalmú 55 %-os acetonitrillel eluáljuk. Tipikusan az A' pszeudomicin mintegy 13,7 perc után (822 másodperc), a pszeudomicin B' pedig 12,4 perc után (744 másodperc) eluálódik. A pszeudomicinek kimutatását a 215 nm-nél mért abszorpció alapján végezzük, a kvantitatív meghatározás az UV csúcsok alatti terület integrálásával történik. A kimutatáshoz és meghatározáshoz mindegyik pszeudomicinböl standardot használunk.
7. példa Pszeudomicin A'-t és/vagy B'-t tartalmazó készítmények
Az alább bemutatott formálási példák kizárólag a szemléltetés célját szolgálják, és semmiképpen nem korlátozzák a találmány oltalmi körét. Az
- 40 alábbiakban alkalmazott hatóanyag kifejezés pszeudomicin A'-t és/vagy B'-t vagy ezek gyógyászatilag megfelelő sóját jelenti.
1. készítmény
Kemény zselatin kapszulákat készítünk az alábbi komponensekből:
Komponensek Mennyiség (mg/kapszula)
Hatóanyag 250
Keményítő, szárított 200
Magnézium-sztearát________________ 10
Összesen_________ 460 mg
2. készítmény
Tablettákat állítunk elő az alábbi komponensekből. A komponenseket elegyítjük, az elegyböl 665 mg tömegű tablettákat készítünk.
Komponensek Mennyiség ___________(mg/kapszula)
Hatóanyag________ 250
Cellulóz, mikrokristályos 400
Szilícium-dioxid, lepárolt 10
Sztearinsav 5
Összesen _____________665 mg
3. készítmény
Aeroszol oldatot állítunk elő az alábbi komponensekből. A hatóanyagot etanollal elegyítjük, az elegyet a -30 °C-ra lehűtött 22-es jelzésű hajtóanyag
- 41 egy részletével összekeverjük, majd az elegyet töltö készülékbe visszük. A szükséges mennyiséget ezután rozsdamentes acéltartályba töltjük, és a megmaradt hajtóanyaggal meghígítjuk. A tartóedényt ezután a szelepegységgel lezárjuk.
Komponensek Tömeg (g)
Hatóanyag 0,25
Metanol 27,75
22. hajtóanyag (klór-difluor-metán) 74,00
Összesen 100,00
4. készítmény mg hatóanyag tartalmú tablettákat állítunk elő az alábbi komponensekből.
Hatóanyag 60 mg
Mikrokristályos cellulóz 45 mg
Poli(vinil-pirrolidon) (10 %-os vizes oldat formájában) 4 mg
Nátrium-karboxi-metil-keményítő 4,5 mg
Magnézium-sztearát 0,5 mg
Talkum 1,0 mg
Összesen 150 mg
A hatóanyagot, keményítőt és cellulózt 0,32 mm nyílású szitán átszitáljuk, majd alaposan elkeverjük. Az így kapott port a polivinil-pirrolidont tartalmazó vizes oldattal elegyítjük, majd az elegyet 1,19 mm-es nyílású szitán áttörjük. Az így kapott granulátumot 50 °C hőmérsékleten szárítjuk, majd a
- 42 szárított anyagot 0,9 mm-es nyílású szitán áttörjük. A nátrium-karboxi-metil-keményítöt, magnézium-sztearátot és talkumot előzetesen 0,25 mm nyílású szitán átszitáljuk, majd a fenti granulátumhoz adjuk. Keverés után az elegyet tablettázó berendezésben préseljük, egyenként 150 mg tömegű tablettákat előállítva.
5. készítmény mg hatóanyag-tartalmú kapszulákat állítunk elő az alábbi összetétel szerint:
Hatóanyag 80 mq
Keményítő 59 mg
Mikrokristályos cellulóz 59 mg
Magnézium-sztearát 2 mg
Összesen 200 mg
A hatóanyagot, cellulózt, keményítőt és magnézium-sztearátot elegyítjük, az elegyet 0,32 mm nyílású szitán átengedjük, majd 200-200 mg-os adagokat kemény zselatin kapszulákba töltünk.
6. készítmény
Egyenként 225 mg hatóanyagtartalmú kúpokat állítunk elő az alábbi komponensekből:
Hatóanyag 225 mg
Telített zsírsav-gliceridek 2000 mg
Összesen 2225 mg
A hatóanyagot 0,25 mm nyílású szitán átszitáljuk, és előzőleg minimális melegítéssel megolvasztott zsírsav-gliceridekben szuszpendáljuk. Az elegyet ezután 2 g nominális kapacitású kúpöntő formába töltjük, és hagyjuk lehűlni.
7. készítmény ml-es adagokban 50 mg hatóanyagot tartalmazó szuszpenziót állítunk elő az alábbi komponensekből:
Hatóanyag 50 mg
Nátrium-karboxi-metil-cellulóz 50 mq
Szirup ____________________1,25 ml____________
Benzoesav-oldat 0,10 ml
ízanyag q.v.
Színezék q.v.
Tisztított víz, ad 5 ml
A hatóanyagot 0,32 mm nyílású szitán átszitáljuk, majd a fent megadott mennyiségű nátrium-karboxi-metil-cellulózzal és sziruppal elegyítve sima pasztát készítünk. A benzoeasav-oldatot, ízanyagot és színezéket egy adag vízzel meghígítjuk, majd keverés közben fenti pasztához adjuk. Az így nyert elegyet kellő mennyiségű vízzel a kívánt térfogatra feltöltjük.
8. készítmény
Intravénás készítményt állíthatunk elő az alábbiak szerint. Az alábbi komponensekből készült oldatot 1 ml/perc sebességgel adjuk be a kezelt személynek.
Hatóanyag 100 mg
Izotóniás nátrium-klorid-oldat 1000 mg
Az előnyös megoldások és műveletek bemutatásával a fentiekben ismertettük a találmányt. Hangsúlyozni szeretnénk azonban, hogy számos változtatás és módosítás végezhető a fentiekben ismertetett megoldások alapján, anélkül, hogy a találmány oltalmi körétől és elgondolásától eltérnénk.

Claims (20)

  1. »
    Szabadalmi igénypontok
    1. Elkülönített pszeudomicin, amely pszeudomicin A'-t, ennek gyógyászatiig megfelelő sóját, hidrátját vagy észter-származékát, pszeudomicin B'-t, ennek gyógyászatilag megfelelő sóját, hidrátját vagy észterszármazékát vagy ezek elegyét tartalmazza.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti pszeudomicin, amely pszeudomicin A'-t vagy ennek gyógyászatilag megfelelő sóját, hidrátját vagy észter-származékát tartalmazza.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti (IA) képletű pszeudomicin vagy ennek gyógyászatilag megfelelő sója, hidrátja vagy észter-származéka.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti pszeudomicin, amely pszeudomicin B'-t vagy ennek gyógyászatilag megfelelő sóját, hidrátját vagy észter-származékát tartalmazza.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti (IB) képletű pszeudomicin vagy ennek gyógyászatilag megfelelő sója, hidrátja vagy észter-származéka.
  6. 6. (IA) képletű elkülönített vegyület vagy ennek gyógyászatilag megfelelő sója, hidrátja vagy észter-származéka.
  7. 7. (IB) képletű elkülönített vegyület vagy ennek gyógyászatilag megfelelő sója, hidrátja vagy észter-származéka.
  8. 8. Eljárás gombák aktivitásának gátlására, azzal jellemezve, hogy a kezelendő gombát olyan elkülönített pszeudomicinnel hozzuk érintkezésbe, ahol ezen pszeudomicin pszeudomicin A'-t, e vegyület gyógyászatilag megfelelő sóját, hidrátját, észter-származékát, pszeudomicin B'-t, e vegyület gyógyászatilag megfelelő sóját, hidrátját, észter-származékát vagy ezek elegyét tartalmazza.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezeléshez használt pszeudomicin pszeudomicin A'-t vagy ennek gyógyászatilag megfelelő sóját, hidrátját vagy észter-származékát tartalmazza.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezeléshez használt pszeudomicin (IA) képletű vegyület vagy ennek gyógyászatilag megfelelő sója, hidrátja vagy észter-származéka.
  11. 11. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezeléshez használt pszeudomicin pszeudomicin B'-t, vagy ennek gyógyászatilag megfelelő sóját, hidrátját vagy észter-származékát tartalmazza.
  12. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezeléshez használt pszeudomicin (IB) képletű vegyület vagy ennek gyógyászatilag megfelelő sója, hidrátja vagy észter-származéka.
  13. 13. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezelt gomba Candida parapsilosis, Candida albicans, Cryptococcus neoformans vagy Histoplasma capsulatum.
  14. 14. Eljárás gombák aktivitásának gátlására, azzal jellemezve, hogy a kezelendő gombát (IA) képletű elkülönített vegyülettel vagy ennek gyógyászatilag megfelelő sójával, hidrátjával vagy észter-származékával hozzuk érintkezésbe.
  15. 15. Eljárás gombák gátlására, azzal jellemezve, hogy a kezelendő gombát (IB) képletű elkülönített vegyülettel vagy ennek gyógyászatilag megfelelő sójával, hidrátjával vagy észter-származékával hozzuk érintkezésbe.
  16. 16. Az 1-7. igénypontok szerinti vegyületek alkalmazása gombák aktivitásának gátlására adható gyógyászati készítmények előállítására.
  17. 17. Az 1-7. igénypontok szerinti vegyületek alkalmazása gombák aktivitásának gátlására vagy gombás fertőzés szimptómáinak csökkentésére adható gyógyászati készítmények előállítására.
    k
  18. 18. Eljárás gombák gátlására növényeken vagy növényekben, azzal jellemezve, hogy a kezelendő növényt pszeudomicin A'-t, ennek gyógyászatilag megfelelő sóját, hidrátját, észterét, pszeudomicin B'-t, ennek gyógyászatilag megfelelő sóját, hidrátját, észter-származékát vagy ezek elegyét tartalmazó, elkülönített pszeudomicinnel hozzuk érintkezésbe.
  19. 19. Eljárás gombák gátlására növényeken vagy növényekben, azzal jellemezve, hogy a kezelendő növényt elkülönített (IA) képletú vegyülettel hozzuk érintkezésbe.
  20. 20. Eljárás gombák gátlására növényeken vagy növényekben, azzal jellemezve, hogy a kezelendő növényt elkülönített (IB) képletű vegyülettel hozzuk érintkezésbe.
    A meghatalmazott:
    * ''-'f
HU0200896A 1999-04-15 2000-04-14 Pseudomycin derivatives and their use in the preparation of pharmaceutical compositions for inhibiting fungal activity HUP0200896A3 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12944799P 1999-04-15 1999-04-15

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUP0200896A2 true HUP0200896A2 (en) 2002-08-28
HUP0200896A3 HUP0200896A3 (en) 2002-09-30

Family

ID=22439989

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0200896A HUP0200896A3 (en) 1999-04-15 2000-04-14 Pseudomycin derivatives and their use in the preparation of pharmaceutical compositions for inhibiting fungal activity

Country Status (17)

Country Link
US (2) US6630147B1 (hu)
EP (1) EP1173471B1 (hu)
JP (1) JP2002542257A (hu)
CN (1) CN1191269C (hu)
AT (1) ATE393773T1 (hu)
AU (1) AU4188700A (hu)
BR (1) BR0009731A (hu)
CA (1) CA2369136A1 (hu)
DE (1) DE60038735T2 (hu)
DK (1) DK1173471T3 (hu)
EA (1) EA004308B1 (hu)
ES (1) ES2304954T3 (hu)
HU (1) HUP0200896A3 (hu)
MX (1) MXPA01010245A (hu)
NO (1) NO20014937L (hu)
PT (1) PT1173471E (hu)
WO (1) WO2000063237A2 (hu)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6919188B1 (en) * 1999-04-15 2005-07-19 Eli Lilly And Company Pseudomycin production by Pseudomonas syringae
AU8342001A (en) * 2000-08-18 2002-03-04 Univ Montana Res Dev Inst Pseudomycins useful against plant diseases

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5576298A (en) 1992-11-30 1996-11-19 Research And Development Institute, Inc. At Montana State University Peptides from pseudomonas syringae possessing broad-spectrum antibiotic activity
EP1171576B1 (en) * 1999-04-15 2007-07-11 Eli Lilly And Company Pseudomycin production by pseudomonas syringae
HUP0200897A2 (en) * 1999-04-15 2002-08-28 Lilly Co Eli Antifungal agents isolated from pseudomonas syringae
JP2003515610A (ja) * 1999-12-13 2003-05-07 イーライ・リリー・アンド・カンパニー シュードマイシンホスフェートプロドラッグ

Also Published As

Publication number Publication date
JP2002542257A (ja) 2002-12-10
AU4188700A (en) 2000-11-02
EA200101090A1 (ru) 2002-06-27
PT1173471E (pt) 2008-07-21
HUP0200896A3 (en) 2002-09-30
DE60038735T2 (de) 2009-07-02
US20040067879A1 (en) 2004-04-08
US6793925B2 (en) 2004-09-21
EP1173471B1 (en) 2008-04-30
BR0009731A (pt) 2002-03-05
CA2369136A1 (en) 2000-10-26
EP1173471A2 (en) 2002-01-23
US6630147B1 (en) 2003-10-07
DK1173471T3 (da) 2008-08-18
CN1191269C (zh) 2005-03-02
NO20014937D0 (no) 2001-10-10
NO20014937L (no) 2001-12-13
EA004308B1 (ru) 2004-02-26
CN1355812A (zh) 2002-06-26
WO2000063237A2 (en) 2000-10-26
ES2304954T3 (es) 2008-11-01
DE60038735D1 (de) 2008-06-12
ATE393773T1 (de) 2008-05-15
WO2000063237A3 (en) 2001-01-04
MXPA01010245A (es) 2002-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7098186B2 (en) Depsipeptide compound
EP0032009A1 (en) Derivatives of cyclic peptide nuclei
HUP0200897A2 (en) Antifungal agents isolated from pseudomonas syringae
ES2464723T3 (es) Compuesto cíclico y sal del mismo
US6630147B1 (en) Pseudomycin natural products
EP1198471A1 (en) Process for deacylation of lipodepsipeptides
US6660263B2 (en) Oocydin and methods of use for protection of plants from Oomyocyte pathogens
EP1171576B1 (en) Pseudomycin production by pseudomonas syringae
US7556960B2 (en) Pseudomycin production by pseudomonas syringae
US20010021520A1 (en) Antibiotic TKR459, production method, and microorganism
JP2000316592A (ja) 新規抗生物質ｔｋｒ２９９３およびその製造方法
HUP0202237A2 (hu) Amin, módosított pszeudomicin vegyületek, azokat tartalmazó gyógyászati készítmény és alkalmazásuk