HUP9902027A2 - Beültethető akrilamid kopolimer hidrogél terápiás használatra - Google Patents

Abstract

A hidrőgél egy N-szűbtitűált metakrilamid vagy akrilamid, egykeresztkötő ágens és egy kőmplex cűkőr vagy ennek származéka, egyszövetadhéziós peptid vagy egy antitestekkel készült pőlimerkőnjűgátűm kőpőlimerje, mely pőlimer heterőgén, elasztikűsandefőrmálható és legalább körülbelül 80%-ős egyensúlyi víztartalőmmalrendelkezik. Felhasználható szöveti regenerációhőz és szervkijavításáhőz, példáűl a fejlődő és felnőtt idegrendszerben. ŕ

Description

Beültethető akrilamid kopolimer hidrogél terápiás használatra

Kivonat '^^l£ÉL6^rÁ'iSY'

A hidrogél egy N-szubsztituált metakrilamid vagy akrilamid, egy keresztkötő ágens és egy komplex cukor vagy ennek származéka, egy szövetadhéziós peptid vagy egy antitestekkel készült polimer konjugátum kopolimeije, mely polimer heterogén, elasztikusán deformálható és legalább körülbelül 80%-os egyensúlyi víztartalommal rendelkezik. Felhasználható szöveti regenerációhoz és szerv kijavításához, például a fejlődő és felnőtt idegrendszerben.

Beültethető akrilamid kopolimer hidrogél terápiás használatra

A találmány polimer hidrogélre vonatkozik. Részletesebben, a találmány porózus, beültethető, terápiás használatra való polimer hidrogélre vonatkozik, amely például lágy szervek bármely részének intemális szövetcseréjéhez, seb gyógyulásához, szövet regenerációjához és általában szövet helyreállításához, különösen a fejlődésben lévő és a felnőtt idegrendszerben és más hasonló terápiákban használható. A találmány célja, hogy főképpen olyan polimer hidrogélt szolgáltasson, amely a beültetés során porózus mátrixszá alakul, mely biológiai fluidumokkal és molekulákkal van feltöltve, így egy úgynevezett organoid hidrogél képződik, és a szövet és a véredények ezt követő benövése által fokozatosan a gazdaszervezetbe integrálódik. A találmány továbbá élő szöveti sejtek, prekurzor sejtek vagy genetikailag módosított sejtek ilyen polimer hidrogélbe történő bejuttatására szolgáló eljárásra is vonatkozik, melynek célja olyan biohibrid anyagok előállítása, melyek háromdimenziós sejtkultúrákhoz vagy szövet rekonstrukcióhoz használhatóak. A találmány továbbá egy olyan eljárásra is vonatkozik, amely segítségével a találmány szerinti polimer hidrogél előállítható, illetve vonatkozik a fent említett eljárással előállított biohibrid anyagokra. Végül a találmány egy olyan eljárásra is vonatkozik, mely a központi idegrendszer, különösen a gerincvelő és az optikai ideg, vagy a perifériális idegek vagy más szövetek sérült részeinek kezelésére használható úgy, hogy ezen részekbe beültetésre kerülnek a találmány szerinti polimer hidrogél vagy biohibrid anyagok.

Jelenleg szerv transzplantációja az egyetlen alternatíva szervi hibák enyhítésére és a szervek funkciójának és teljesítőképességének helyreállítására vagy javítására. Azonban a transzplantációs terápiák hátrányai közé tartoznak többek között a következők: betegség átvitelének a lehetősége donorból a recipiensbe, a donor szervek kis száma és korlátozott hozzáférhetősége, és a lehetséges immunológiai keresztreakciók.

így például a gerincvelő átültetése sem klinikailag, sem biológiailag nem megvalósítható és következésképpen az SCI betegek kezelése nem lehetséges, bár egyedül az Egyesült Államokban 250,000 krónikus paralízises beteg van és az SCI betegek száma évente 10,000-rel nő.

Másrészt hiányzó sejtek vagy szöveti szervek hiányzó részének cseréje vagy helyreállítása céljából sejtek testbe történő beültetésével, átültetésével vagy injektálásával új szövetek képződése nem érhető el megfelelő formában, mivel hiányzik egy olyan támaszként szolgáló extracelluláris mátrix, mely a gazdaszervezettel kapcsolatban lévő integrált struktúrába történő szövetteijeszkedés és -szerveződés számára egy szükséges szövetváz. Ráadásul a sejteket egy fiziológiailag ekvivalens környezetbe kell helyezni, amely lehetővé teszi a tápanyagok, az oxigén, a humorális és celluláris komponensek diffúzióját, így fenntartva a sejtek számára a beültetés után a nagyfokú életképességet és növekedési potenciált.

A találmány szerinti porózus hidrogélek olyan deformálható porózus polimer mátrixok, melyek intersticiális fluidummal vagy vízzel vannak töltve, és így biztosítják a szükséges szövetvázat és hidratált teret, melyen keresztül a sejtek szaporodhatnak és szupracelluláris szöveti szerkezetekbe gyűlhetnek megfelelő hisztológiai struktúrában, hogy funkcionális, új szövet képződjék.

Az irodalomban fellelhetők az intraspinális transzplantáció különböző kísérleti stratégiái, amelyek a gerincvelő károsodásait igyekszenek helyreállítani (állat modellek) különböző beültetett anyagok felhasználásával, melyek két nagy csoportra oszthatók: (1) biológiai szövetek, (2) prosztetikus anyagok.

Az (1) kategóriába tartozik az átültetett donor szövet transzplantátumok felhasználása, mely transzplantátum lehet öröklött autograft vagy homograft, allograft vagy xenograft, a gerincvelő sérüléseinek áthidalása céljából, mint például magzati idegszövet esetében, vagy (a) szilárd transzplantátumként (pl. Bregman, Dev. Brain Res., 34, 265, 1987; Houlé és Reier, J. Comp. Neurol., 269, 535, 1988) vagy (b) szuszpenziós transzplantátumokként, melyek kevert idegi szövet sejtjeit tartalmazzák (pl. Goldberg és Bernstein, J. Neuroscience Res., 19, 34, 1988; Hoovler és Wrathall, Acta Neuropathol., 81, 303, 1991); kultúrából származó érzékelő neuronokkal ··:· ·..· ...· ·..· ··;· rekombinált Schwann sejtek felhasználása (Kuhlengel és mtsai., J. Comp. Neurol., 293, 74, 1990); éretlen asztrociták felhasználása (pl. Bernstein és Goldberg, Res. Neurol. Neurosci., 2, 261, 1991); idegszövet sejtek prekurzorainak (Monteros és mtsai., Dev. Neurosci., 14, 98, 1992) és a halhatatlanná tett sejtvonalak felhasználása (Zompa és mtsai., Int. J. Dev. Neurosci., 11, 535, 1993); olyan perifériális idegszegmens felhasználása, mely magában foglal kultúrából származó nem-idegi sejteket (Wrathall és mtsai., Acta Neuropathol., 57, 59, 1982); vagy embrionális idegszövet felhasználása (Horvat és mtsai., Res. Neurol. Neurosci., 2, 289, 1991). A (2) kategóriába tartozó prosztetikus anyagok magukba foglalják a tiszta kollagén mátrixokat (de la Torre és Goldsmith, Brain Res., Bull., 35, 418, 1994; Marchand és Woerly, Neurosci. 36, 45, 1990; Gelderg, Brain Res. 511, 80, 1990), melyek neuroaktív ágenseket (Goldsmith és de la Torre, Brain Res., 589, 217, 1992) vagy tenyésztett idegi transzplantátumokat tartalmaznak (Bernstein és Goldberg, Brain Res. 377, 403, 1986); kezelt nitrocellulóz implantátumokat (Schreyer és Jones, Dev. Brain Res., 35, 291, 1987; Honié és Johnson, Neurosci. Lett. 103, 17, 1989); kollagén implantátumokat (faino és mtsai., J. Neurocytol., 23, 433, 1991) és poli(akrilnitrilvinilldorid)-ból polimer vezetőcsatomákat (Xu és mtsai., J. Comp. Neurol., 351, 145, 1995), amely körülveszi a Schwann sejteket.

E megoldások leginkább az axonális regeneráció elősegítésére irányulnak különböző szövet-szubsztrátokat, mint új axonok forrásait felhasználva, vagy komplex prosztetikus szubsztrátokat használva, amelyek az axonok növekedéséhez támasztékként és irányadóként szolgálnak, de nem irányulnak a klinikailag lényeges kérdésre, a gerincvelő és agyszövet olyan módon történő kijavítására, amely a gazdaszövet túlnyomó részének a regenerációján és a sebgyógyulás újraformálásán alapul, mint például az üszkösödés vagy sebesedés sérülést követő eltávolítása.

Ismertek az idegrendszerben implantátumokként használatos polimer hidrogélek (Woerly és mtsai., Biomaterials, 11, 97, 1990; Woerly és mtsai., Biomaterials, 12, 197, 1991; Woerly és mtsai., J. Neural Transpl. Plast. 3, 21, 1992; Woerly és mtsai., Cell Transpl., 2, 229, 1993; Woerly és mtsai., J. Neural Transpl. Plast., 5, 245, 1995). Ezek a hidrogélek vízben, szabad radikális polimerizációval készültek, ammonium perszulfát és nátrium-metabiszulfit vagy perszulfát és aszkorbinsav, mint redox iniciátorok, illetve hidroxietil-metakrilát (pHEMA), glicidil-metakrilát (pGMA) vagy N-hidroxipropil-metakrilamid (pHPMA) vagy a fent említett monomereket tartalmazó kompozíció felhasználásával és keresztkötő ágensekkel, ami lehet vagy etilénglikol és tetraetilénglikol-dimetakrilát vagy metilén-bisz-(akrilamid). Ezek a gélek jellemzően homogének, átlátszóak és kettős porózussággal rendelkeznek, tehát vannak nyitott (könnyen megközelíthető pórustérfogat) és zárt pórusai, mint azt a higanyporozimetriás adatok és a pásztázó elektronmikroszkóppal végzett vizsgálatok mutatták. Ezen gélek pórusszerkezete a körkeresztmetszet szerint jellemzően párhuzamos hengeres kapillárisokból áll, mint az az 1. ábrán látható, az átlagos pórusátmérőjük 7-13pm. A frakcionális porozitás a pHEMA hidrogélek esetében 50% és 85% közé, a pGMA hidrogélek esetében 60% és 65% közé és a pHPMA hidrogélek esetében 70% és 94% közé esik. A hidrogél pórustérfogatának legalább 50%-át a pHEMA esetében 1.2-4pm, a pGMA esetében 6-13pm és a pHPMA esetében 1014jim nagyságú pórusok foglalják el. Úgy találták, hogy biológiai aktivitásuk függött a kollagén keresztkötésű hálózatba történő bevitelétől vagy kopolimerizációjától. Jelentkezők agyába kísérleti jelleggel implantátumot helyeztek el, ami megmutatta, hogy bizonyos mértékű szövethelyreállítás elérhető a szövet homogén gélmátrixba történő benövése mértékének megfelelően. Ez a reakció a monomer kompozíció és a hozzátett funkciós csoportok szerint változik. Mindazonáltal a homogén hidrogélek gyakran indukálják szálszerű tok képződését, ami az implantátum gazdaszervezettől történő elszigeteléséhez vezethet. Ez ezen gélek mechanikai tulajdonságainak köszönhető, melyek nem illenek megfelelően egyrészt az élő idegszövethez, másrészt a makropórusok Ids térfogatú frakciójához. A gerincvelőben ezek a homogén hidrogélek nem integrálódnak a gazdaszervezetbe és egy kötőszövet és gliális forradás által hamar betokozódnak anélkül, hogy axonok vagy szöveti komponensek penetrációja megtörtént volna, mint az a 2. ábrán látható. Ezen felül van egy fizikai szempont, ami limitálja a létrehozható felület felszínéh ami a sikeres szöveti kölcsönhatás fontos paramétere és az ilyen homogén gélekben a hengeres pórusok generálják. Állandó térfogatú gél esetén a felület felszíne egy határértéket ér el, ami egy olyan pórus •··· · · « · ····· • · · ··· ·· J maximális sugara, amely a gél teljes térfogatát elfoglalja. Másrészt a felület felszínének a pórusméret csökkentése általi növelése a teljes üres tér csökkenéséhez fog vezetni, ami összeegyeztethetetlen a szövetbenövéssel és biomassza akkumlációval.

Harvey és mtsai. (Brain Res., 671, 119, 1995) egy poli-(2-hidroxietil-metakrilát) polimer szivacsról számolnak be, amelyet agyi implantátumként használnak szöveti regenerációhoz és axon növekedéshez. E terméket legjobban a polimer hálózathoz adott kollagénnel, mint szöveti biológiai ragasztóanyaggal és a Schwann sejtek beékelődése után lehet használni.

A 4,902,295 számú USA szabadalmi bejelentés egy olyan eljárást ismertet, mely segítségével hasnyálmirigy szöveti sejtjeiből mesterséges szövetet állítanak elő. Az eljárás során mátrix prekurzorokat, gél prekurzorokat és promotorokat polimerizálnak életképes sejtekkel vizes fázisban. Mindegyik polimer prekurzor illetve promoter olyan biológiai vegyidet, amely alkalmas a testben a gyors biodegradációra és nincs hosszú távú stabilitásuk a beültetés után.

Bellamkonda, R.; Ranieri, J.P.; Bouche, N.; Aebischer, P. (Hydrogel-Based Three-dimensional Matrix for Neural Cells, J. Biomed. Mat. Res. 1995, 29, 663-671) egy olyan eljárást írnak le, amellyel idegszöveti sejteket immobilizálnak agarózba és extracelluláris-ekvivalens (Matrigel®) gélekbe. Ezek biológiai és biodegradálható anyagok.

Krewson, C.E.; Chung, S.W.; Dai, W.; Saltzman, W.M. (Cell Aggregation and Neurite Growth in Gels of Extracellular Matrix Molecules. Biotechnol. Bioeng. 1994, 43, 555-562) munkájukban egy eljárást ismertetnek, amely során PC12 sejteket vagy csak kollagént, vagy fibronektinnel vagy lamininnel kombinált kollagént tartalmazó gélekben, valamint kollagénből és agarózból álló gélekben szuszpendálnak. Ezen gélek biodegradálhatóak.

Cascone, M.G.; Laus, M.; Ricci, D.; Sbarbati del Guerra, R. (Evaluation of Poly(vinyl alcohol) Hydrogels as a Component of Hybrid Artificial Tissues, J. Mát. Sci. Mat. Med. 1995, 6, 71-75) egy olyan eljárást írnak le, amely fizikai keresztkötésű ···· · · · · · ···· • ·· ··· ·· I polivinilalkohol hidrogéleket használ, és egy fagyasztás-olvasztás ciklus segítségével fibroblaszt sejteket építenek bele.

Wald, H.L.; Sarakinos, G.; Lyman, M.D.; Mikos, A.G.; Vacanti, J.P.; Langer, R. (Cell Seeding in Porous Transplantation, Biomat. 1993, 14, 270-278) egy hepatocita sejtek poli-L-tejsavból készült degradálható polimer habba történő körülzárására szolgáló eljárást ismertetnek, amit egy mikroinjekciós technikával végeznek. Ez az eljárás nem képez nem-degradálható mátrixot és nem tesz lehetővé a polimer mátrixban egyenletes sejteloszlást.

Mikos, A.G.; Bao, Y.; Cima, L.G.; Ingber, D.E.; Vacanti, J.P.; Langer, R. (Preparation of Poly(glycolic acid) Bonded Fiber Structures for Cell Attachment and Transplantation, J. Biomed. Mat. Res. 1993, 27, 183-189) hepatociták tenyésztésére szolgáló, kötött szálakat tartalmazó poliglikolsav hálózatok képzésére szolgáló eljárást ismertetnek. Ez a polimer biodegradálható és a sejtek mátrixba történő bevitelére szolgáló eljárás különbözik a megkötéstől.

Puerlacher, W.C.; Mooney, D.; Langer, R; Upton, J.; Vacanti, J.P.; Vacanti, C.A. (Design of Nasoseptal Cartilage Replacements Synthetized from Biodegradable Polymers and Chondrocytes, Biomat. 1994, 15, 774-778) és Freed, L.E.; Marquis, J.C.; Nohria, A. Emmanual; Mikos, A.G.; Langer, R. (Neocartilage Formation In Vitro and In Vivo Using Cells Cultured on Synthetic Biodegradable Polymers, J. Biomed. Mat. Res. 1993, 27, 11-23). Ezen közlemények olyan eljárást ismertetnek, amely segítségével kapilláris hatással porcsejtek vihetők poliglikolsav (PGA) vagy politejsav (PLLA) vagy PGA-PLLA mátrixokba. Ez az eljárás biodegradálható polimer anyagokat szolgáltat, bár a sejtek nem oszlanak el egyenletesen a polimerben és az eljárás nem teszi lehetővé a sejtsűrűség szabályozását.

Cao, Y.; Vacanti, J.P.; Ma, X.; Paige, K.T.; Upton, J.; Chowanski, Z.; Schloo, B.; Langer, R.; Vacanti, C.A. (Generation of Neo-Tendon Using Synthetic Polymers Seeded with Tenocytes, Transpl. Proc. 1994, 26, 3390-3391) egy olyan eljárást írnak le, mely segítségével tenocita sejteket domborított, nem-szőtt poliglikolsav hálóba oltanak be.

• · · ··· ··· · · ···· ·»·* ··* · *·

Mooney, D.J.; Park, S.; Kaufman, P.M.; Sano, K.; McNamara, K.; Vacanti, J.P.; Langer, R. (Biodegradable Sponge for Hepatocyte Transplantation, J. Biomed. Mat. Res. 1995, 29, 959-965) és Takeda, T.; Kim, T.H.; Lee, S.K.; Langer, R.; Vacanti, J.O. (Hepatocyte Transplantation in Biodegradable Polymer Scaffolds Using the Baltimatian Dog model of Hyperuricosuria, Transpl. Proc. 1995, 27, 635-636) olyan eljárást ismertetnek, amellyel hepatocita sejteket nemezeit poliglikolsav polimer lemezekbe vagy politejsavból és polivinilalkoholból és politejsav-glildolsavból készített polimer szivacsokba lehet abszorbeálni adszorpció és kapilláris hatás segítségével. Ez az eljárás biodegradálható polimer anyagot szolgáltat, bár a sejtek nem oszlanak el egyenletesen a polimerben és az eljárás nem teszi lehetővé a sejtsűrűség szabályozását.

Woerly, S.; Plant, G.W.; Harvey, A.R. (Cultured Rat Neuronal and Glial Cells Entrapped within Hydrogel Polymer Matrices: A Potential Tool for Neural Tissue Replacement, Neurosci. Lett. 1996, 205, 197-201) egy olyan eljárást írnak le, amely segítségével poli-[N-(2-hidroxipropil)-metakrilamid]-ból álló, esetleg kollagént, mint járulékos szubszttátot tartalmazó homogén átlátszó polimer gélekbe idegszöveti sejteket fognak be. Ez az eljárás tartalmazza a sejtszuszpenzió polimer keverékhez történő hozzáadását és a sejt-polimer keverék szobahőmérsékleten vagy inkubátorban 37°C-on történő polimerizációját. Az így kapott gél optikailag átlátszó és a sejtek véletlenszerűen diszpergáltak a keresztkötésű gélben. Immuncitokémiai vizsgálatok azt mutatták, hogy 6 nap elteltével a sejtek életképessége in vitro körülmények között 0 és 6% között ingadozott.

A találmány célja, hogy kiküszöbölje a technika állásához tartozó megoldások hátrányait oly módon, hogy egy nem-biológiai prosztetikus eszközt, mint például nemdegradálható polimer hidrogélt használ, amely olyan térkitöltő anyagként és tartószerkezetként funkcionál, amely stimulálja a szöveti regenerációt, a morfogenézist és az újjáalakítást szervhez való struktúrává.

• · · · ♦ · f w· r <

· ·:· ·..· ...· ·„· ·τ

A találmány egy másik célja, hogy javítsa a szövet szövetalakulattá gyógyulásának képződését, ami egy stabil polimer mátrixban a sejtszaporodás, a sejtbeszivárgás és szövetszerveződés szabályozása által érhető el.

A találmány egy célja, hogy a szöveti regenerációt polimer mátrixok segítségével oldja meg, amely nagyon előnyös lenne és fontos klinikai és gazdasági hatással bírna az olyan emberek esetében, akik gerincvelői (SCI) vagy agyi sérülésekben, illetve fejlődéstanilag fogyatékos gerincvelőtől (spina bifida, azaz gerinchasadék) szenvednek.

A találmány feladata továbbá, hogy olyan polimer mátrixokat szolgáltasson, amelyek az optikai ideg és a perifériális idegek regenerációjához alkalmasak

A találmány továbbá egy olyan eljárást szolgáltat, amely olyan nemdegradálható szintetikus polimer hidrogél mátrixot szolgáltat, amely anizotrop pórusszerkezettel, hatékony felszíni területtel és jó szövetadhézióval és kompatibilitással rendelkezik és amely lágy szöveti struktúrákba, különösen az idegrendszerbe történő beültetésre készült és amely fokozatosan a szerv részévé válik.

A találmány tárgyát továbbá egy olyan szintetikus polimer mátrix terápiás használata képezi, amely szabályozott pórusszerkezettel rendelkezik és felületaktív ágenseket hordoz.

A találmány elsődleges célja, hogy egy olyan polimer mátrixot szolgáltasson, amely új, vízben nem oldható polimer hidrogélből készül és a duzzadt állapotában lágy szervek javításakor használható szöveti regenerációhoz prosztetikus eszközként.

A találmány egy másik megvalósítási formájában olyan eljárást szolgáltat, amelynek során a hidrogél termék előállítása úgy történik, hogy a végső prosztetikus eszköz alakjával megegyező öntőformában készül.

Egy találmányi ismérvnek megfelelően a találmány célja, hogy a technika állásához tartozó megoldások hátrányait vagy azok egy részét kiküszöbölje és egy olyan polimer neuroprotézist szolgáltasson, amely szokásos sebészeti eljárások felhasználásával beültethető az agyba vagy gerincvelőbe.

A találmány egy további célja, hogy egy olyan eljárást szolgáltasson, amely segítségével sejteket vagy genetikailag módosított sejteket a polimer hálózatba lehet juttatni.

A találmány további célja, hogy egy olyan polimer keveréket szolgáltasson, amely élő sejtekkel keverhető, ennek következtében kombinálódnak a polimer mátrix fizikai jellemzői a hidrogél típusú viselkedéssel (porozitás, stabilitás, vezetőfelület, permeabilitás) és a sejtszintű biológiai faktorokkal (pl. növekedési faktorokkal).

A találmány egy másik ismérvének megfelelően olyan biohibrid eszközöket szolgáltat, amelyek lágy szervek szöveti részének cseréjére használhatók.

A találmány egy további tárgya, hogy egy háromdimenziós kultúra-rendszert szolgáltasson, amely különféle sejtek szaporítására használható in vitro körülmények között, hosszú időtartamra.

A találmány egy másik célja, hogy támasztó mátrixokat szolgáltasson, amelyek biológiailag aktív molekulák szövethez vagy szervekhez történő kapcsolódására szolgálnak.

A találmány további célja, hogy olyan porózus hidrogéleket is szolgáltasson, amelyek olyan deformálható porózus polimer mátrixok, melyek intersticiális fluidummal vagy vízzel vannak telítve, ennek következtében a szükséges szöveti vázat és hidratált teret tudják nyújtani, mely segítségével a sejtek szaporodni tudnak és egy megfelelő hisztológiai szerkezetben szupercelluláris struktúrákba tudnak rendeződni, hogy funkcionális szövetet képezzenek.

A találmány egy másik célja, hogy egy olyan komponenst szolgáltasson, amely gyógyszereket és makromolekulákat szabályozottan kibocsátó rendszerekhez alkalmas, különös tekintettel gyulladásgátló anyagokra, mint például az indomethacin, citokinek stimulátoraira, mint például bakteriális lipopoliszacharidok, szteroidokra, mint például a metil-prenizolon és neuroaktív faktorokra, mint például a fibroblaszt növekedési faktorok.

Egy másik találmányi ismérv szerint a találmány célja, hogy olyan anyagot is szolgáltasson, amely erős biológiai tapadóképességgel és h^mosztatikus tulajdonságokkal rendelkezik és alkalmas intemális lágy szövetbe való elhelyezésre, gyors rögzítésre és ugyanakkor hemosztázisra.

A találmány egy elsődleges célja, hogy egy olyan polimer mátrixot szolgáltasson, amely a testbe történő hosszú távú beültetés fenntartásához mechanikai és kémiai stabilitással rendelkezik anélkül, hogy degradálódna, ami másrészről károsíthatja az új szöveti hálózatot, amely a szerv egy részének kicserélésekor a mátrixba nőtt.

A találmány további célja, hogy egy mechanikai komplianciával rendelkező mátrixot nyújtson, amely lehetővé teszi, hogy a polimer mátrixot egy kezelő vágja, méretezze és kezelje anélkül, hogy megváltozna a mátrix belső szerkezete és mechanikai tulajdonságai.

A találmány egy másik célját olyan duzzadásra képes anyag szolgáltatása képezi, amely vizes közegben nagy duzzadó kapacitással rendelkezik és amely a találmány céljainak megfelelően szignifikáns mennyiségű biológiai komponenst tud adszorbeálni, mint például adhéziós molekulákat, mint például a CAM és L1 molekulák, vagy vezető molekulákat, mint a szemaforinok vagy netrinek megfelelő oldószerben feloldva, következésképpen a fent említett molekulák a polimer mátrix által képzett hálózat felületére adszorbeálódnak.

A találmány olyan új hidrofil polimer hidrogéleket szolgáltat, melyek porózus, lágy, nagy abszorpciós képességű polimer mátrixok, és amelyek elasztikusán deformálhatok és legalább körülbelül 80%-os, előnyösen legalább 96%-os egyensúlyi víztartalommal rendelkeznek.

A találmány olyan polimer keverékeket is szolgáltat melyek élő sejtekkel keverhetők.

A találmány célja, hogy terápiás célt szolgáló polimer hidrogélt is szolgáltasson, amely a következők kopolimege, egy (a) N-szubsztituált metakrilamid vagy akrilamid, (b) keresztkötő ágens és (c) a következő csoportból kiválasztott polimerizálható anyag: cukor, cukor származék, szövetadhéziós pepiid, szövetdifferenciáló molekulák és fehérjék, mint például csont morfogenetikus fehérjék, és lipidszármazékok elleni antitestekkel készült polimer konjugátum, amely elasztikusán deformálható és legalább körülbelül 80%-os, előnyösen legalább 96%-os egyensúlyi víztartalommal rendelkezik.

Az N-szubsztituált metakrilamid vagy akrilamid (a) előnyösen a következő csoportból van kiválasztva: N-monoalkil és Ν,Ν-dialkil metakrilamidok és akrilamidok, a keresztkötő ágens (b) akrilamidból vagy ennek prekurzorából áll és a polimerizálható anyag (c) egy cukor, mely a következő csoportból van kiválasztva: glükózamin, N-acetil-glükózamin, és a neuraminsav, valamint ennek polimer formái, mint például a polisziálsav N-acetil származéka.

A találmány olyan eljárásra is vonatkozik, mely terápiás használatra való polimer hidrogél előállítására szolgál, amely áll (a) egy keresztkötő ágens szabad radikális polimerizációs iniciátort tartalmazó pórus-formáló oldószerben történő feloldásából, így képezve egy oldatot, (b) egy N-szubsztituált metakrilamid vagy akrilamid az (a) lépésben kapott oldathoz történő hozzáadásából, így képezve egy keveréket és (c) egy cukor, cukor származék, szövetadhéziós pepiid, morfogenetikus fehérjék vagy származékok bioaktív peptidek vagy lipidszármazékok elleni antitestekkel készült polimer konjugátum oldatának a (b) lépésben kapott keverékhez történő hozzáadásából.

A találmány egy előnyös megvalósítási formája szerint a találmány tartalmazza oldat képzése céljából az azo-bisz-(izobutironitril) és a metilén-bisz-(akrilamid) feloldását az oldószerben, az oldat összekeverését N-2-(hidroxipropil)metaknlamiddal, glükózamin vagy N-acetil-glükózamin vagy N-acetil-neuraminsav hozzáadását, valamint ebből a kis molekulasúlyú visszamaradt termékek és az iniciátor nyomok eltávolítását.

A találmány egy másik megvalósítási formája szerint az eljárás élő szöveti sejtek vagy genetikailag módosított sejtek a (c) lépésben kapott termékhez történő hozzáadását és a sejtek az előbb említett termékben történő hatékony sokszorozódását is tartalmazza.

A találmány egy másik megvalósítási formára is kiterjed, amely szerint a találmány szerinti polimer hidrogél olyan sejteket vagy genetikailag módosított sejteket tartalmaz, melyek a hidrogéllel együtt polimerizálódnak.

A találmány egy olyan eljárást is szolgáltat, amely károsodott agyi szövetek vagy gerincvelői sérülések kezelésére szolgál és amely a károsodott agyi szövetek vagy gerincvelő emberi szervezetben vagy állatban történő eltávolítását és a károsodott agyi szövetek vagy gerincvelő találmány szerinti polimer hidrogéllel történő cseréjét tartalmazza.

A találmány szerinti hidrogél kovalens keresztkötéseket tartalmazó, nem átlátszó, előnyösen tiszta, elkülönített struktúrájú heterogén anyag, amelyet körülbelül 1-10, előnyösen 3-5pm nagyságú polimer részecskék képeznek és így egy viszonylag durva porozitású felületet (makropórusok) szolgáltat, amely esetében a hidrogél rendeltetése a gazdaszövettel való érintkezés és egy viszonylag finom porozitású felületet (mezopórusok), amely esetében a rendeltetése a benövő szövettel való érintkezés.

Ez előnyösen egy szivacsszerű struktúrát eredményez, amely makropórusos szerkezetű; a frakcionális porozitása például legalább 80-90% (a gél teljes térfogatába bejutó higany térfogata); speciális felszíni területtel rendelkezik, előnyösen több száz négyzetméter/gramm gél tartományban; közepes pórusátmérőjű (térfogatú), például körülbelül 15-35pm; a lOpm-es vagy nagyobb pórusok térfogata megegyezik a hidrogél frakcionális porozitásúnak 90-95%-ával, mivel a gél teljes pórustérfogatának legnagyobb frakcióját a 10-50pm tartományba eső pórusok alkotják; hiperpórusos karakterű (a gél frakcionális porozitása a gél térfogatának legalább 50%-a) 20-30pmtől.

A hidrogélek makrostruktúrája és porozitása a részecskék méretének és a pórusszerkezetnek a szabályozásával változtatható, amely függ a felhasznált pórusképző oldat összetételétől és tulajdonságaitól, a polimer frakció térfogatától, a polimer-oldószer kölcsönhatásoktól, a polimerizáció hőmérsékletétől és a felhasznált keresztkötő monomer tulajdonságaitól, A sikeres biomassza-akkumláció és sejt kölcsönhatások egy ilyen optimális felszín/térfogat kölcsönhatás eredményei, mint azt a polimer részecskék mikro- és mezoporozitásából adódó higany-porozimetriás adatok mutatják.

A találmány szerinti anyag egy fontos utolsó ismérve a nyílt jellege és interkonnektivitása, amely alkalmassá teszi biomassza sejtákkuml áci óra és az élő szövettel fellépő sejtes, illetve molekuláris kölcsönhatásokra. A 3. ábrán látható pásztázó elektronmikroszkópos felvétel szerint ezen heterogén gélek nem-kerek pórusokkal rendelkező, tipikus kolloid-szerű háromdimenziós szerkezetet mutatnak, és látható a pórus-rendszer fala, amelyet a polimer aggregátumok felületének érintkezése szemléltet. A hatékony felszíni terület a részecske-felszín porozitásának függvénye. A homogén gélekkel ellentétben az ilyen heterogén gélek legfőbb előnye, hogy a részecskék által előállított felszíni terület gyakorlatilag nem korlátozott, mivel az aggregátumok mérete (1) úgy csökken, hogy a felszíni terület 1 értékéivel fordítottan arányos. További összehasonlításokat téve a homogén hidrogélekkel, a találmány szerinti heterogén hidrogélek sokkal nagyobb pórustérfogattal rendelkeznek és így sokkal célravezetőbbek a sejtbeszivárgáshoz és biomassza akkumlációhoz. A homogén hidrogélekkel még további összehasonlításokat téve, a találmány szerinti heterogén hidrogélek mechanikailag alkalmas tulajdonságokkal rendelkeznek ahhoz, hogy felnőtt és fejlődésben lévő idegszövettel társíthatok legyenek.

Ezen hidrogél mátrixok valóságos szövetspecifíkus szerkezetekkel rendelkeznek, mivel a sejtek közötti kölcsönhatás a gél-szerkezetet átfogó, szervezett szöveti hálózatot, ún. organoid hidrogélt eredményez.

A polimer mátrixok előállíthatok bármelyik következő komponens hatékony mennyiségének szimultán kicsapatásával vagy csapadék polimerizációjával és keresztkötő kopolimerizációjával: (i) N-szubsztituált metakrilamidok, mint például az N-monoalkil-metakrilamidok vagy N-szubsztituált akrilamidok, mint például az Nmonoalkil-akrilamidok vagy az Ν,Ν-diszubsztituált akrilamidok, mint például az N,Ndialkil-akrilamidok; (ii) egy keresztkötő ágens, mint például az akrilamid vagy ennek prekurzora vagy divinil vegyületek és hasonlók; (iii) egy szabad radikális polimerizációs iniciátor, mint például az azo-bisz-(izobutironitril), többféle peroxid, aszkorbinsav, peroxiszulfátok, szubsztituált azovegyületek és hasonlók, melyek a szakember által jól ismertek és mennyiségük a kopolimerre vagy terpolimerre vonatkozóan 0.01 tömeg% és 2 tömeg% között változhat; (iv) komplex cukrok, mint például a glükózamin vagy az N-acetil-glükózamin vagy az N-acetil-galaktózamin vagy az N-acetil-neuraminsav vagy a polisziálsav vagy más cukorszármazékok vagy szövetadhéziós oligopeptidek, amelyek például az Arg-Gly-Asp, Üe-Lys-Val-Ala-Val, Ala-His-Ala-Val-Ser-Glu, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg szekvenciákkal rendelkeznek, szövetdifferenciáló molekulákból származó oligopeptidek (pl. csont morfogenetikus fehérjék) vagy polimer konjugátumok mielin és axon-csatolt lipidek és származékaik elleni antitestekkel egy oldószerben, amely előnyösen aceton/dimetil-szulfoxid, aceton vagy aceton/etanol.

Az alkil csoportok előnyösen egy vagy két szénatomot tartalmaznak, például CiC2 hidroxialkil és aminoalkil radikálisok. Az N-szubsztituált kifejezést itt olyan Ci.g szubsztituensekre használjuk, amelyek tartalmazhatnak OH-t, amino csoportot vagy ezek kombinációját.

A reakciót általában 40-60°C-on és körülbelül 12 órán keresztül olyan polimerizáló edényekben hajtjuk végre, melyek légmentesen lezárt ampullákat tartalmaznak.

Az alább felsorolt ábrák a találmány jobb megértését segítik elő:

Az 1. ábra egy homogén gél mikroszkópos képét mutatja.

A 2. ábra egy gerincvelőbe ültetett homogén gél mikroszkópos képét mutatja.

A 3. ábra egy HPMA heterogén gél mikroszkópos képét mutatja.

A 4. ábra egy idegszövetbe ültetett 3. ábra szerinti gél mikroszkopikus képét mutatja.

A találmányt a továbbiakban példákon keresztül ismertetjük.

1. PÉLDA

AIBN-t (azo-bisz-(izobutironitrilt)) (1.2 tömeg%) és metilén-bisz-(akrilamidot) (1 mol%) száraz acetonban feloldottunk. Ehhez az oldathoz annyi aceton/dimetilszulfoxid (93:7 v/v) elegyében oldott N-2-(hidroxipropil)-metakrilamidot adtunk, hogy 30% v/v HPMA oldat keletkezzen. N-metakriloil-glükózamint (5 tömeg%) vagy 1metil-2-metakriloiol-amidoetil-2-acetamido-2-deoxdi-P-D-glükozidot (6.5 tömeg%) vagy 2-[l-metil-2-metakriloil-amidoetil]-5-acetamido-3,5-dideoxi-D-glicero-a-Dgalakto-2-nonulopiranozidonsavat (5.2 tömeg%) vagy metakriloil-glicil-glicil-arginilglicil-aszparagainsavat (1.4 tömeg%) dimetil-szulfoxidban feloldottunk és a polimerizációs keverékhez adtuk. A keveréket alaposan homogenizáltuk, fecskendőbe töltöttük és ampullákba injektáltuk. Ezután a reakcióelegyet nitrogénnel kitisztítottuk és az ampullákat lánggal lezártuk. Annak érdekében, hogy elkerüljük az oldószer párolgását, az ampulla leforrasztása előtt a keveréket szárazjég és etanol elegyében le lehet fagyasztani. A leforrasztott ampullákat ezután 50°C-os vízfürdőben, 24 órán keresztül állni hagytuk.

Előnyös, ha a találmány szerint az alacsony molekulasúlyú visszamaradt termékeket, mint például reagálatlan monomereket, a hálózatból kihagyott oligomereket és iniciátor nyomokat a felhasználás előtt a hidrogél termékből eltávolítjuk. Ez elérhető úgy, hogy a xerogéleket etanolban 20 órán keresztül, ezután etanol/víz (1:1 v/v) elegyében szintén 20 órán keresztül és egy héten át gyakran cserélt desztillált vízben áztatjuk, amíg a duzzadást egyensúlyt el nem éljük és az extrakció mértéke alacsony, előnyösen zérus nem lesz. A találmány egy másik fontos ismérve, hogy elkerüli a szennyeződéseket. A polimer gél előállítása előnyösen egy biológiai veszélyektől védett fülkében, szűrt levegőáramban történt. A mosási lépéseket előnyösen steril anyagok felhasználásával végeztük és a géleket 4°C-on, steril desztillált vízben tároltuk.

····· · · · ···*· • · · ··· ·· ·

Olyan hibrid eszköz előállításához, amely mind a polimert, mind a donor szövet sejtjeit tartalmazza, a sejteket a polimer hidrogél porózus szerkezetébe lehet inokulálni a polimer hálózatba történő mikroszúrások segítségével az előbb említett sejtszuszpenziót tartalmazó Hamilton fecskendő felhasználásával. A sejtek fent említett polimer hidrogélbe történő bejuttatása elvégezhető mind in vitro módon, mind in vivo módon a célszerv megfelelő területére történő hidrogélbeültetés után a megfelelő időtartam elteltével. A sejteket emberi agy- vagy izomszövetből vagy halottból származó anyagból lehet izolálni.

2. PÉLDA

Sejtek in vitro inokulálása PHPMA hidrogélbe

Neuronokat izoláltunk patkány embriók agyhártya és véredény mentes agyféltekéiből DMEM-ben és ezeket apró szövetfragmensekre daraboltuk fel. A szöveteket Pasteur pipetta segítségével mechanikusan szétroncsoltuk egy DMEM tartalmú centrifugacsőben. A felülúszót eltettük és a kiülepedett szövetfragmenseket tovább roncsoltuk olyan Pasteur pipettával, amit lánggal kezeltünk a hegy szűkítése céljából. Néhány sejtreszuszpenziós/disszociációs ciklus után az összeöntött felülúszókat centrifugáltuk és a sejteket 10⁶ sejt/ΙΟΟμΙ médium töménységűre koncentráltuk. Ezt a frakciót jégen tartottuk, míg a sejtmegkötéshez fel nem használtuk. A sejtek polimer hidrogélbe történő hatékony és megbízható penetrációja érdekében a sejteket mikromanipulátorhoz kapcsolt Hamilton fecskendőbe juttattuk és minimális nyomáskárosodás mellett a kívánt koncentrációban inokuláltuk a duzzadt PHPMA hidrogélekbe binokuláris mikroszkóp alatt, aszeptikus körülmények mellett. A sejttartalmú hidrogéleket minimális térfogatú kultúra-médiumban tartottuk és 37°C-on, 5%-os CO2 tartalmú, nedvesített atmoszférában inkubáltuk. Mihelyt a sejtek elérték a növekedés megfelelő mértékét, a hibrid eszközt az agyba lehet ültetni, hogy hihetővé váljon a szövet újjáépítése és javítása.

A polimer keveréket élő sejtekkel is össze lehet keverni, így kombinálva a polimer mátrix fizikai tulajdonságait a hidrogél típusú viselkedéssel (porozitás, stabilitás, vezetőfelületek, permeabilitás) és a sejtszintű biológiai faktorokkal (pl. növekedési faktorok).

A sejtek polimer mátrixba történő bevitelét 0°C alatti hőmérsékleten történő gélmegkötési eljárással vittük véghez, azaz kriopolimerizációval, amely egy olyan porózus mátrixot szolgáltat, amelyben a sejtek immobilizáltak és újraszerveződésük, növekedésük és/vagy differenciációjuk érhető el, amely az ezt követő transzplantációhoz szükséges. Az oldószer olyan típusú izotónikus oldat vagy szöveti kultúra médium kell hogy legyen, amely általánosan használt sejt- és szövetkultúrákhoz és egy megfelelő fagyvédő anyaggal (glicerin/dimetil-szulfoxid vagy glicerin vagy dimetil-szulfoxid vagy polivinil-pirrolidon vagy hidroxietil-keményítő vagy karboximetil-cellulóz) van kombinálva. Az eljárás lehetővé teszi a végső sejtsűrűség szabályozását, amely a néhány sejttől megközelítőleg a szöveti sejtsűrűségig, körülbelül 1O⁹-1O¹⁰ sejt/cm³-ig tartományban lehet. Az eljárás a mátrix porozitásának változtatását és szabályozását is lehetővé teszi a hűtés mértékének és a sejttartalmú polimerizációs keverék hőmérsékletének a változtatásával (folyékony nitrogén vagy hűtött izopentán). Az eljárás kriogélekre jellemző makropórusos szivacsos szerkezetet szolgáltat olyan pórusmérettel, amely a szövet fejlődése és érése alatt lehetővé teszi a tápanyagok és makromolekulák (pl. növekedési faktorok) a polimer gél mátrixba megkötött sejtekhez és sejtektől történő diffúzióját, lehetővé teszi a sejtmigrációt, és egy olyan pórustérfogatot, amely alkalmas a hatékony biomassza akkumlációra, illetve az expanziót (sejtosztódást) és a szerveződést (sejt-sejt kapcsolatot).

3. PÉLDA

Asztrociták gélmegkötése HPMA kriopolimerizációja által

Kétnapos újszülött patkányok agykérgét 0.1%-os tripszin-EDTA-t és Hepes pufferrelt DMEM-ben 0.001%-os DNázt tartalmazó oldatban 30 percen át 37°C-on inkubáltuk és mechanikailag roncsoltuk, így kapva asztrocitákat. A sejteket 10⁶ sejt/lOml koncentrációban műanyag edényekbe helyeztük és 37°C-on, 10% magzati borjúszérum tartalmú DMEM-ben tartottuk. 7 in vitro nap után az asztrocitákat arattuk és Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldatban (HBSS, pH 7.4) szuszpendáltuk, amely 20% glicerint tartalmazott. A szuszpenziót 10⁶ sejt/ΙΟΟμΙ töménységűre koncentráltuk és 6°C-on tartottuk. A megkötési eljárást lamináris áramlású fülkében és steril anyagok felhasználásával végeztük. Az előpolimerizációs oldat 0.69g N-(2-hidroxipropil)metakrilamidot és 0.010g metilén-bisz-(akrilamidot) tartalmazott 2.3ml HBSS-ben feloldva, amely 20% glicerint és iniciátorokként ammónium-perszulfátot (100mg/ml HBSS; 4.3x10'³M) Ν,Ν,Ν',Ν'-tetrametiletilén-diaminnal HBSS-ben hígítva (1:1 v/v HBSS; 3.3x10’⁵M). A pH értéket 0.1N HCl-val 7.0-ra egyenlítettük ki és az előpolimerizációs oldatot nitrogénnel levegőtlenítettük és használat előtt 4°C-ra előhűtöttük. A sejteket a nagy-sűrűségű előpolimer keverékben szuszpendáltuk 10⁶ sejt/ml sejtsűrűségre és az elegyet alaposan elkevertük és egy Hamilton fecskendő segítségével két, egymástól szilikon gumi tömítőanyaggal elválasztott, 0.75mm-re levő előhűtött üveglemez közé injektáltuk 3ml végtérfogatra. A présformát folyékony nitrogénbe történő mártással körülbelül 1 perc alatt -170°C-ra hűtöttük le és a -15°C-os vízfürdőbe történő áthelyezés előtt 3 perc időtartamra a folyékony nitrogénben hagytuk. A polimerizációs reakció 5 óra alatt zajlott le a hűtött vízfürdőben, majd ezután a présformákat 37°C-os fürdőben felengedtük. A jég szétmállása után a géleket kivettük a présformából és a fagyvédő anyag, illetve a reagálatlan reakciótermékek eltávolítása céljából HBSS-sel mostuk, és 0.8mm átmérőjű kör alakú lemezekké vágtuk fel őket. A géllemezeket 37°C-on és 5% CO2 tartalmú, nedvesített atmoszférában inkubáltuk 10% magzati boíjúszérumot és 1% antibiotikumot (sztreptomicin-penicillin) tartalmazó DMEM-ben.

Polimer hidrogél hibrid szövetek ilyenfajta előállításának két fő előnye van a Woerly és mtsai. (1996) által közzétett eljáráshoz képest: az alacsony hőmérsékleten végbemenő polimerizáció által megelőzi a sejtmembrán károsodását és a sejtek körül • · ♦· · · «· · ·· f · • ·· ··* ·· · képződő jégkristályok eredményeképpen megnövekszik a porozitás és állandósul a pórusszerkezet (heterogén hidrogél). Mindennek eredményeképpen a sejtek megkötődnek az olyan polimer mátrixba, amely támasztékként szolgáló szerkezetet nyújt a szerveződéshez, nagy belső felszíni területtel rendelkezik, a sejtexpanzióhoz elegendő pórustérrel rendelkezik és permeabilitása megnőtt. Ezen felül a sejt polimer keverék fagyott állapotban eltartható a későbbi polimerizációhoz, mint ahogy azt fent leírtuk.

A sejtfejlődés bármely állomásánál a keletkező hibrid mátrix tartalmaz egy szilárd fázist, amely magában foglalja a porózus mátrixot, a sejteket és a sejt extracelluláris mátrixot, valamint egy folyékony fázist, amely a sejtkultúra médiumból és az extracelluláris fluidumokból áll.

Amint ez a szakterületen járatos szakemberek számára érthető, ez az eljárás különbözik az úgynevezett sejt-betokosítási eljárástól, amely olyan mikro- vagy makrobetokosítási technikákat használ, ahol a sejtek egyszerűen körül vannak véve egy változó átmérőjű, gömb alakú polimer membránnal.

E leírásban a sejt(ek) kifejezés alatt értjük a szövetfragmenseket, sejtcsoportokat, embrióból, újszülöttből vagy felnőttből származó egyedi sejteket, genetikailag módosított sejteket, melyek lehetnek elsődleges vagy halhatatlanná tett sejtek, halhatatlanná tett sejtvonalakat, melyek származhatnak létező tumorsejtvonalakból vagy halhatatlanná tett prekurzor sejtvonalakból, családból vagy elődből származó sejteket, bármilyen szövet vagy szerv növekedési faktorral kiválasztott prekurzor sejtvonalait. A találmány szerinti eljárás és termék alkalmas mesterséges szövetek vagy szervek sokféle változatban történő előállítására transzplantációhoz vagy sokféle háromdimenziós kultúra rendszer előállításához.

1. TESZT

A találmány szerinti polimer hidrogélek biológiai toleranciáját patkányok átvágott gerincvelőjébe és agyi sérüléseibe történő beültetéssel vizsgáltuk. A teszteléshez szükséges mintákat a beültetéstől számított 1 héttől 10 hónapig terjedő időtartamban vettük. A biológiai tolerancia kiváló volt. Makroszkopikusan vizsgálva, a gélek jó stabilitást mutatva integrálódtak a gazdaszövetbe és néhány esetben a gazdaszerv sértetlennek tűnt. A mikroszkopikus vizsgálatok szerint ez a polimer hidrogél képződmény a félig és teljesen átvágott patkány gerincvelőbe történt beültetés helyén elősegíti a szövet újraszerveződését és az axoni regenerációt és ennélfogva a szöveti folytonosság 100%-ig terjedő helyreállítása érhető el (4. ábra). Az adatokat a következőkben foglaljuk össze: (i) a hidrogél integrációja és a szövet folytonosságának helyreállítása; a hidrogél a sérülés térfogatát állandó értéken tartja, így egy új szövet tud fejlődni és a sérülés kicserélődik a hidrogél porózus felületének sebhez történő tapadása által; (ii) a polimer teljes hozzáférhető felületével érintkező sima felület; (iii) a szomszédos gazdaszövetben minimális a hegesedés és a cisztás üregesedés hiányzik; (iv) gliális alapú szövethálózat benövése a polimer hálózatba, így megerősítve a gazdaszervezetbe beültetett implantátum kapcsolódását; (v) heterogén származású sejtek benövése; (vi) kapilláris benövés; (vii) az extracelluláris mátrix molekuláinak (kollagén, fibronekiin és laminin) a polimer hálózat felszínére történő lerakódása, mint azt az immunhisztokémia mutatja; és (viii) a bioimplantátumon keresztülhatoló axonális növekedés. A kiszedett hidrogéleken végzett infravörös spektroszkópiás vizsgálatok azt mutatták, hogy a natív hidrogél (nem beültetett) infravörös spektruma kicserélődött szomszédos gerincvelői szövet lipid- és fehéijevegyületeihez hasonló infravörös tulajdonságokra.

2. TESZT

A kriopolimerizációs eljárás lehetővé tette olyan heterogén gélek előállítását, melyek változatlan makropórusos szerkezetébe sejtek immobilizálhatók. Sejtjelöléses technikák felhasználásával végzett vizsgálatok, mint a sejtjelölés vagy az immuncitokémia azt mutatták, hogy a sejtek a polimer hálózatban egyenletesen és a gélen belül különböző szinteken oszlanak el vagy individuálisan elkülönült sejtek vagy kis csoportokjja rendeződött néhány sejt formájában. A túlélő sejteket három héten keresztül in vitro inkubáció során pozitív immunfestésnek vetettük alá fejlődő idegszöveti sejtek antigén profiljaival. Bár újszülött patkányok agyából izolált asztrociták hidrofil hidrogélekben nagyfokú megtartás mellett elfoghatok kriopolimerizációs reakció segítségével, valamint a megkötött sejtek képesek a túlélésre és a rendes differenciálódásra, mint ahogy ezt teszik egyrétegű kultúrák körülményei esetén: 10 nap in vitro körülmények után a megkötött sejtek életképessége 90%-nak mutatkozott sejtjelöléses technikákat alkalmazva. Ezenkívül a sejtek működőképesek, mivel a polimer mátrixban laminint és fibronektint szintetizálnak, mint ahogy azt egyrétegű kultúrákban is teszik.

A polimer hidrogél rendeltetése, hogy sérülésből, sebészeti beavatkozásból vagy veleszületett deformáltságból származó, a test lágy szerveinek szövetében jelentkező hiány vagy hiba cseréjéhez főképpen a szövet feszítőszerkezeteként és a szöveti kialakulás mintájaként szolgáljon egy új, funkcionálisan integrált szervhez való szövet képződésének elősegítésével. A polimer hidrogél további rendeltetése a sebgyógyulás tervezéséhez, valamint az olyan lágy szövetek, mint a máj, a hasnyálmirigy, a bőr és az izom újjáalakításához, regenerációjához és fejlődéséhez való felhasználás. Csont regenerációjához és javításához más anyagokkal kombinálva is felhasználható.

A polimer hidrogél egy másik alkalmazása olyan eljárások kifejlesztésében való felhasználása, melyek segítségével speciális humán idegrendszeri rendellenességhez alkalmazott terápia nyújtható, és a fent említett polimer hidrogél a betegség természetétől és típusától, illetve a működésbeli hiba mértékétől függően két különböző módon használható fel. Egyrészt szövetregenerációs mintaként használható fel, vagy egy sejttranszplantátum beültetése után sejthordozóként. A találmány szerinti polimer hidrogél egyik rendeltetése például a fejlődő vagy felnőtt állapotban lévő agy vagy gerincvelő speciális területeinek károsodott vagy veleszületett hibájának (pl. gerincvelő sérülése) kezeléséhez való felhasználás. Az eljárás jellemzően az alábbi lépéseket tartalmazza: a károsodott szövet vagy a sebhelyes szövet vagy az idegszövet bármelyik rosszul működő részének eltávolítása és az agyszövet vagy gerincvelői szövet a fent ismertetett polimer hidrogéllel történő kicserélése. A találmány szerinti polimer hidrogél felhasználható továbbá neuronhálózatok helyreállítására, melyek a fejlődő vagy felnőtt állapotban lévő központi idegrendszerben elhelyezkedő axonális utakkal vannak asszociálva. Például a septohippocampusos hálózatok, amelyek a memóriafunkciókban játszanak szerepet és például az Alzheimer-kór esetén vagy a Parkinson-kórban szerepet játszó nigro-striatális hálózatokban vagy a Huntingtonkórban a striatum részeként vagy a hormonális/reprodukciós rendellenes működésben, mely magában foglalja a hipofizis-hipotalamusz rendszert, gyengülnek. Ez az agyszövet hibás részének sebészeti eltávolításával és a találmány szerinti gél beültetésével, előnyösen az új funkcionális axoni hálózatok kialakulásának elősegítése céljából idegi sejttranszplantátumokkal végezhető el. Ugyanezen a módon kezelhetők az olyan deformáltságok, melyek a gerincvelői hálózatok hibás működésével járnak (pl. gerinchasadék), miszerint a szerv rendellenesen kialakult részét eltávolítjuk és a hibás részt a találmány szerinti ideggéllel, előnyösen idegi sejttranszplantátummal helyettesítjük. A találmány szerinti hidrogél másik alkalmazási lehetősége az optikai ideg és a perifériális idegek kezelése oly módon, hogy ugyanezen a módon elősegítjük a találmány szerinti polimer hidrogélen keresztül történő axonális újranövekedést.

A találmány nem korlátozódik a kiviteli példákra, hanem lehetségesek változtatások és módosítások anélkül, hogy a találmányi gondolattól eltérnénk és az igénypontok által definiált oltalmi kört túllépnénk.

Claims (24)

1. Terápiás használatra szolgáló polimer hidrogél azzal jellemezve, hogy (a) egy N-szubsztituált metakrilamidból vagy akrilamidból, (b) egy keresztkötő ágensből és (c) a következők közül kiválasztott kopolimerizálható anyagból: komplex cukor, cukorszármazék, szövetadhéziós pepiid és lipidszármazékok elleni antitestekkel készített polimer konjugátumok álló kopolimer, amely elasztikusán deformálható és legalább körülbelül 80%-os egyensúlyi víztartalommal rendelkezik.

2. Az 1. igénypont szerinti polimer hidrogél azzal jellemezve, hogy az (a) Nszubsztituált metaknlamidot vagy akrilamidot a következőket tartalmazó csoportból választjuk ki: N-monoalkil- és Ν,Ν-dialkil-metakrilamidok és aknlamidok, a (b) keresztkötő ágens akrilamid vagy ennek prekurzora és a (c) polimerizálható anyag egy cukor, amely a következőket tartalmazó csoportból van kiválasztva: glükózamin, N-acetil-glükózamin és a neuraminsav egy N-acetil származéka.

3. Az 2. igénypont szerinti polimer hidrogél azzal jellemezve, hogy az alkil csoport 1-2 szénatomot tartalmaz.

4. Az 3. igénypont szerinti polimer hidrogél azzal jellemezve, hogy az alkil csoport hidroxialkil vagy aminoalkil radikális.

5. Az 1. igénypont szerinti polimer hidrogél azzal jellemezve, hogy az egyensúlyi víztartalma legalább 96%.

6. Az 1. igénypont szerinti polimer hidrogél azzal jellemezve, hogy a hidrogél kovalens keresztkötéseket tartalmaz, alapjában véve nem átlátszó és heterogén anyagot képez.

····· · ·· ····· « · · ··· ·· *

7. A 6. igénypont szerinti polimer hidrogél azzal jellemezve, hogy a hidrogél tiszta, elkülönített struktúrájú, amit körülbelül l-lOpm nagyságú polimer részecskék képeznek és így egy viszonylag durva porozitású felületet szolgáltat, amely esetében a hidrogél rendeltetése a gazdaszövettel való érintkezés és egy viszonylag finom porozitású felületet, amely esetében a rendeltetése a benövő szövettel való érintkezés.

8. Az 1. igénypont szerinti polimer hidrogél azzal jellemezve, hogy a hidrogél makropórusos szerkezetű, amelynek frakcionális porozitása legalább 80-90%, speciális felszíni területtel rendelkezik, mely legalább száz négyzetméter/gramm körülbelül 15-35pm közepes pómsátmérőjű; a legalább 10pm-es pórusok térfogata megegyezik a hidrogél frakcionális porozitásának 90-95%-ával, és a 2030pm-es tartományba eső hiperpórusos karakterrel rendelkezik.

9. Eljárás terápiás használatra szolgáló polimer hidrogél előállítására azzal jellemezve, hogy az eljárás tartalmazza (a) egy keresztkötő ágens szabad radikális polimerizációs iniciátort tartalmazó oldószerben történő feloldását, így képezve egy oldatot, (b) egy N-szubsztituált metakrilamid vagy akrilamid az (a) lépésben kapott oldathoz történő hozzáadását, így képezve egy keveréket és (c) egy komplex cukrot, cukor származékot, szövetadhéziós peptidet, lipidszarmazékok elleni antitestekkel készült polimer konjugátumot tartalmazó polimerizálható anyag oldatának a (b) lépésben kapott keverékhez célravezető körülmények között történő hozzáadását.

10. A 9. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy tartalmazza az azo-bisz(izobutironitril) és metilén-bisz-(akrilamid) fenti oldószerben történő feloldását, így képezve egy oldatot, majd ennek összekeverését N-2-(hidroxipropil)metakrilamiddal, valamint glükózamin vagy N-acetil-glükózamin vagy N-acetilneuraminsav hozzáadását, illetve a kis molekulasúlyú visszamaradt termékek és iniciátor nyomok eltávolítását.

····· · · · ····· • ·· ··· ·· *

11. A 9. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a keresztkötő ágens a következő csoportból van kiválasztva: akrilamid, ennek prekurzorai és divinil keresztkötő ágensek.

12. A 9. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a polimerizációs iniciátor a következő csoportból van kiválasztva: azo-bisz-(izobutironitril), peroxidok, aszkorbinsav, peroxiszulfátok és szubsztituált aza vegyületek, és 0.01 és 2 tömeg% közötti tartományba eső mennyiségben használjuk, tekintettel a kialakítandó polimer hidrogélre.

13. A 12. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a polimerizálható anyag oldata komplex cukrot tartalmaz.

14. A 13. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a komplex cukor a következő csoportból van kiválasztva: glükózamin, N-acetil-glükózamin, a neuraminsav N-acetil származékai, polisziálsav és galaktozén.

15. A 12. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a polimerizálható anyag oldata szövetadhéziós pepiidet tartalmaz.

16. A 12. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a polimerizálható anyag oldata lipidszármazékok elleni antitestekkel készült polimer konjugátumot tartalmaz.

17. A 12. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az eljárást 40-60°C közötti hőmérsékleten, körülbelül 12 órán keresztül hajtjuk végre.

18. A 9. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy tartalmazza élő szöveti sejtek vagy genetikailag módosított sejtek a (c) lépésben kapott termékhez történő hozzáadását, és a termék sejtekkel együtt végrehajtott polimerizációját.

19. Az 1. igénypont szerinti kopolimerizált polimer hidrogél azzal jellemezve, hogy élő szöveti sejtekkel vagy genetikailag módosított sejtekkel együtt történik a polimerizáció.

20. Károsodott agyszövet vagy gerincvelő kezelésére szolgáló eljárás azzal jellemezve, hogy tartalmazza a károsodott humán vagy állati agyszövet vagy gerincvelő eltávolítását és a károsodott agyszövet vagy gerincvelő 1. igénypont szerinti polimer hidrogéllel történő cseréjét.

21. Terápiás használatra szolgáló kopolimer hidrogél azzal jellemezve, hogy a hidrogél (a) egy N-szubsztituált metakrilamid vagy akrilamid, (b) egy keresztkötő ágens és (c) egy polimerizálható szövetadhezív anyag kopolimeije.

22. Eljárás emlős hege és károsodott vagy működését tekintve hibás szövete kezelésére azzal jellemezve, hogy az eljárás tartalmazza a heg és a károsodott vagy működését tekintve hibás szövet eltávolítását és az 1. igénypont szerinti polimer hidrogéllel történő cseréjét.

23. A 22. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan ideghálózatok helyreállítására szolgál, amelyek a központi idegrendszerben elhelyezkedő axonális utakkal vannak asszociálva.

24. A 22. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az optikai ideg és perifériális idegek traumás sérüléseinek kezelésére szolgál.