HUT65614A - Process for the oligonucleotide modulation of arachidonic acid metabolism - Google Patents

Process for the oligonucleotide modulation of arachidonic acid metabolism Download PDF

Info

Publication number
HUT65614A
HUT65614A HU9203422A HU342292A HUT65614A HU T65614 A HUT65614 A HU T65614A HU 9203422 A HU9203422 A HU 9203422A HU 342292 A HU342292 A HU 342292A HU T65614 A HUT65614 A HU T65614A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
oligonucleotide
lipoxygenase
cells
analog
arachidonic acid
Prior art date
Application number
HU9203422A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9203422D0 (en
Inventor
David J Ecker
Stanley T Crooke
Christopher K Mirabelli
Clarence Frank Bennett
Original Assignee
Isis Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Isis Pharmaceuticals Inc filed Critical Isis Pharmaceuticals Inc
Publication of HU9203422D0 publication Critical patent/HU9203422D0/hu
Publication of HUT65614A publication Critical patent/HUT65614A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6839—Triple helix formation or other higher order conformations in hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/11—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of two atoms of oxygen (1.13.11)
    • C12Y113/11012—Linoleate 13S-lipoxygenase (1.13.11.12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01004—Phospholipase A2 (3.1.1.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/04—Phosphoric diester hydrolases (3.1.4)
    • C12Y301/04003—Phospholipase C (3.1.4.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y303/00—Hydrolases acting on ether bonds (3.3)
    • C12Y303/02—Ether hydrolases (3.3.2)
    • C12Y303/02006—Leukotriene-A4 hydrolase (3.3.2.6)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/88—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving prostaglandins or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/15—Nucleic acids forming more than 2 strands, e.g. TFOs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

A találmány olyan kóros állapotok terápiájára, diagnosztizálására és kutatására szolgáló vegyszerekre vonatkozik, amelyek az arachidonsav szintézisének vagy metabolizmusának szabályozására alkalmazhatók. Közelebbről a találmány az arachidonsav szintézisében vagy métábólizmusában szereplő fehérjék szintézisét meghatározó néhány hírvivő RNS-sel vagy DNS-sel való antiszensz oligonukleotid kölcsönhatásra vonatkozik. Úgy találtuk, hogy ezek az oligonukleotidok az RNS vagy DNS aktivitását és ezen keresztül az arachidonsav szintézisét és metabolizmusát is befolyásolják. Ennek eredménye lehet a tünetek enyhítése és a terápiás.
Az arachidonsav és a rokonszerkezetű zsírsavak metabolitjai széleskörű biológiai aktivitást mutatnak, ami érinti a test minden egyes szervét. Az arachidonsavnak több mint harminc olyan metabolitja létezik, amely biológiai aktivitással rendelkezik. Ezeket a metabolitokat összefoglalóan eikozanoidoknak hívják.
Az arachidonsav a sejtben membrán-lipidekké észterezett formában tárolódik. Ha az arachidonsav felszabadul a membrán-lipidekből, akkor vagy visszaésztereződik membránlipidekké, vagy az oxidatív enzimek útján metabolizálódik. Két olyan oxidatív bioszintézis út létezik, amelyek a terápiás beavatkozás szempontjából fontos: a ciklo-oxigenáz bioszintézis út, amelyben a prosztaglandinok, a tromboxánok és a prosztaciklin keletkezik, valamint a lipoxigenáz bioszintézis út, amelyben a leukotriének, lipoxinok, hidroperoxieikozatetraénsavak és a mono- és di-hidroxi-eikozatetraénsavak (mono- és di-HETE-k) keletkeznek, (lásd az 1. ábrát).
Jóllehet a vérlemezke aktiváló faktor (PAF) nem közvetlen metabolitja az arachidonsavnak, mégis az egyik olyan bioszintézis útban keletkezik, amely a szabad arachidonsavhoz vezet. Tehát néhány esetben a szabad arachidonsav képződése is a lizo-paf képződését eredményezi, amely a PAF közvetlen prekurzora.
Az E sorozatba tartozó prosztaglandinok (PGE^, PGE2) hatékony értágítók és simaizom relaxánsok. Tehát a PGE2 elősegíti a vérnyomás csökkenését és relaxálja a hörgők, a légcső és a méh simaizmait. Ezen prosztaglandinok további hatása például a vérlemezke aggregáció gátlása, a mediátor emlősejtekből való felszabadulásának gátlása, a véráram megnövelése a vesében, a fokozott vizeletkiválasztás, az ACTH keringő koncentrációjának megnövekelése, valamint a gyomorsav elválasztás gátlása. A PGE-k fájdalmat okoznak, ha bőr alá injekciózzák, és érzékenyítik az afferens idegvégződéseket a kémiai anyagokra vagy mechanikus behatásokra.
A prosztaglandin D2, a PGEl-hez hasonlóan, a vérlemezke aggregációt gátolja. A PGD2 fokozza a hisztamin felszabadulását a bazofil sejtekből, elősegíti a kemokinézist és fokozza a többi mediátor kemotaktikus válaszát a polimorf leukocitákban. A prosztaciklin (PGI2) egy hatékony értágító és általános simaizom relaxáns hatású anyag. A PGI2 legalább 30-50-szer hatékonyabb, mint a PGE2 és PGD2 a vérlemezke aggregáció gátlásában. A PGI2 gátolja a gyomorsav kiválasztást, relaxálja a hörgők és a méh simaizmait, és fokozza a vér áramlását a vesében. Tehát a PGE2, PGI2 és kisebb mértékben a PGD2 nagyon fontosak a normál homeosztázis fenntar tásában, és számos klinikai szituációban jótékony hatásuk van.
Az F sorozatba tartozó prosztaglandinok, azaz a PGF2a, általában a PGE-vel ellentétes biológiai hatást mutatnak a simaizom szöveteken. A PGF2a összehúzza a hörgők és a légcső simaizmait, összehúzza mind a terhes, mind a nem-terhes méh simaizmait, és összehúzza a gyomor-bél rendszer simaizmait. Az alacsonyabbrendű főemlősökben a PGF2a a leukolítikus hormon.
A tromboxán A2 (TXA2) egy erős simaizom-összehúzó anyag, összehúzza az összes vizsgált simaizom-csíkokat, beleértve az érfalak, a hörgők és a légcső simaizmait. A TXA2 elősegíti a vérlemezke aggregációt és csökkenti a véráramot a vesében.
A peptidoleukotriének (C4, D4 és E4 leukotriének) általában erős simaizom összehúzó anyagok, míg a leukotrién B4 (LTB4) a keringő neutrofilek és monociták kemotaktikus faktora. Az LTB4 elősegíti a lizoszomális enzimek felszabadulását, valamint a szuperoxid-anion keletkezését a neutrofil sejtekből, és mindkettő helyi szövetkárosodást okoznak [Ford-Hutchinson, A.W. , Crit. Rév. in Immunoi. , .10, 1-12 (1989)]. A lipoxinokról kimutatták, hogy a tengerimalac parenhimális szöveteit összehúzzák, gátolják a természetes ölősejteket, és serkentik a szuperoxidok képződését a neutrofil sejtekben.
A vérlemezke aktiváló faktor (PAF) a vérlemezkék aggregációját indukálja, növeli az érfal permeabilitását, hörgő-összehúzóként működik, csökkenti a véráramot a vesé ben, csökkenti a keringést a bélfodrokban, és az ezidáig leírt leghatásosabb fekélykeltő anyag [Rosam és munkatársai, Natúré, 319. 54-56 (1986)]. A PAF inaktiválja a gyulladásos sejteket mozgató neutrofil és eozinofil kemotaxist és degranulációt [Braque és munkatársai, ISI Atlas of Science: Pharmacology, 187-198 (1987)].
AZ EIKOZANOIDOK PATOFIZIOLÓGIÁJA
Légzőrendszer
A leukotriéneknek a légzőszervekre gyakorolt hatását alaposan tanulmányozták, a leukotriéneknek az azonnali típusú hiperszenzitivitási reakciókban, például az asztmában játszott feltételezett szerepe miatt. A peptidoleukotriének magas szintjét mutatták ki az orrváladékben és a tüdő mosófolyadékában asztmában, allergiás náthában, cisztás fibrózisban és krónikus bronchitiszben szenvedő betegek esetében [Dahlen és munkatársai, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 80, 1712-1716 (1983)]. A C4 és D4 leukotriének hatásos simaizom összehúzó anyagok, elősegítik a hörgők összehúzódását számos fajnál, beleértve az embereket is [Dahlen és munkatársai, Natúré, 288, 484-486 (1980)]. A C4 és D4 leukotrién (LTC4 és LTD4) körülbelül azonos aktivitást mutat a hörgők összehúzásában, és körülbelül ezerszer olyan aktív, mint a hisztamin [Dahlen és munkatársai, Natúré, 288, 484-486 (1980); Sirois és munkatársai, Prost. Leuk. Med., 7, 327-240 (1981)]. Az LTC4 és az LTD4 általában aktívabb a perifériális légutak összehúzásában, mint a centrális légutak összehúzásában. Tengerimalac légcső-csíkokban az LTE4 körülbelül tízszer kevésbé aktív mint az LTC4 és az
LTD4. Az LTC4 és az LTD4 által okozott hörgőösszehúzódás a specifikus sejtfelszíni receptorokkal való kölcsönhatás következménye [Mong és munkatársai, Eur. J. Pharmacol., 102, 1-11 (1984)]. Az mind a mai napig vita tárgya, hogy az LTC4 és az LTD4 különböző receptorokra hat-e. Az E4 leukotrién úgy tűnik, hogy hörgő-összehúzó anyagként működik, az LTD4 receptorokkal lépve kölcsönhatásba. A B4 leukotrién viszonylag gyenge összehúzódást okoz az izolált légcsőben és a tüdő működő szövetében. Az LTB4 által okozott összehúzódást részben blokkolják a ciklo-oxigenáz inhibitorok, ami arra utal, hogy a kontrakció csak másodlagos a prosztaglandinok felszabadulásához képest.
A peptidoleukotriénekhez hasonlóan a vérlemezke aktiváló faktor egy hatásos hörgőösszehúzó anyag. A PAF emellett növekedést okoz az embereknél más anyagok légúti reaktivitásában, ami az inhalálást követően legalább 7 napig tart [Cuss és munkatársai, Láncét, 2, 189 (1986)]. A PGF2a és TXA2 prosztanoidok is összehúzzák a légutak simaizmait, és úgy tekinthető, hogy hozzájárulnak az asztmatikus válasz kialakulásához.
A leukotriének érfal-összehúzóként is működnek, azonban a különböző érágyak esetében lényeges különbség van. Az LTC4 és LTD4 számos fajban hatékony összehúzó! a szív koszorúereknek [Roth and Leffer, Prostaglandins, 26, 573-581 (1983); Bürke és munkatársai, J. Pharmacol. Exper. Therap., 221. 235-241 (1982); Letts and Piper, Br. J. Pharmacol., 76, 169-176 (1982)]. Csakúgy mint a tüdő esetében, az LTE4 körülbelül tízszer kevésbé aktív, mint az LTC4 és az LTD4, míg az LTB4-nek egyáltalán nincsen aktivitása. Emberekben az LTC4 és az LTD4 hatékony összehúzol a tüdő vénáinak, és gyengén húzzák össze a tüdő artériáit [Schellenberg and Foster, Prostaglandins, 27, 475-482 (1984)]. 2 nmol/1 LTC4 intravénás beadása egészséges önkéntesekbe az átlagos artériás nyomás csökkenését, a szívműködés gyorsulását, a koszorúerekben a véráramlás csökkenését, valamint a szívkoszorúér ellenállás növekedését okozta [Marone és munkatársai, Biology of the Leukotrienes, szerk. R. Levi and R.D. Krell, Ann. New York Acad Sci., 254, New York Academy of Sciences, New York, 321-333 (1988)]. Az LTD4-ről is hasonló hatásokat írtak le. Az LTC4 és az LTD4 közvetlenül megnöveli az érfal permeabilitását, valószínűleg azáltal, hogy a kapilláris endoteliális sejtek visszahúzódását elősegíti.
Egyre növekszik azoknak a bizonyítékoknak a száma, amelyek azt sugallják, hogy a leukotriének hozzájárulnak a szívizom iszkémiát követő kardiális reperfúziós sérüléséhez [Barst and Mullane, Eur. J. Pharmacol., 114, 383-387 (1985); Sasaki és munkatársai, Cardiovasc. Rés. 22, 142-148 (1988)]. A kardiális reperfúziós sérülés kísérleti modelljeiben a duális ciklooxigenáz/lipoxigenáz inhibitorokról kimutatták, hogy csökkentik a miokardiális infarktus méretét. A hozzáférhető bizonyítékok azt sugallják, hogy a duális inhibitorok jótékony hatása az LTB4 bioszintézis gátlásában nyilvánul meg. Ezeket az adatokat azonban óvatosan kell értelmezni, mivel a vizsgálatokban használt anyagok mind a ciklooxigenázt, mind a lipoxigenázokat gátolták, amellett, hogy saját antioxidáns tulajdonságokkal is rendelkeztek. Az 5-LO vagy LTB4 antagonisták specifikus inhibitorai kellenek ahhoz, hogy ezeket a megfigyeléseket igazoljuk. A leuktriének az endotoxikus sokk patológiás mediátoraként is szerepelnek, amennyiben a szelektív LTD4 receptor antagonista állati modellekben jelentősen növeli a túlélést [Smith és munkatársai, Circ. Shock, 25, 21-31 (1988)]. Az LTD4 antagonisták endotoxikus sokk modellekben mutatott jótékony hatásai részben azon tulajdonságuknak köszönhető, hogy az LTD4 által okozott megnövekedett kapilláris permeabilitást visszafordítják.
A vérlemezke aktiváló faktor és a tromboxán A2 összehúzzák a szívkoszorúereket, és ezzel csökkentik a koszorúér perfúziót; ennek az eredménye a csökkent szív-teljesítmény, a vérnyomáscsökkenés és az akut keringési összeomlás. A PAF elősegíti a ST-szegmens depressziót. A sokk kísérleti modelljeiben összefüggés van az endotoxinnal indukált hipotenzió és a PAF szint között. A PAF-nak az endotoxikus sokkban játszott szerepét alátámasztja még az a megfigyelés, hogy a PAF antagonisták csökkentik a sokk állatmodelljeiben megfigyelt hipotenziót [Braquet és munkatársai, ISI Atlas of Science: Pharmacology, 187-198 (1987)].
Gasztro-intesztinális rendszer
A tengerimalac csípőbél a klasszikus szövet a peptidoleukotriének (SRS-A) által okozott simaizom összehúzódás mérésére. Az LTC4 és LTD4 emellett a tengerimalac gyomrot is összehúzza. Az LTB4-nek egyik szövetre sincs hatása. A fajok és izomrétegek között lényeges különbség van abból a szempontból, hogy hogyan reagálnak a leukotriénekre. A humán * · · * » «· .*· \?·\.· · ·· ··♦ »·· gasztro-intesztinális nyálka szintetizálja és bocsátja ki a leukotriéneket, ami fokozódik, sérülésre vagy gyulladásos folyamatra adott válaszként. Kísérleti állatmodellekben a leukotrién receptor antagonistákról leírták, hogy csökkentik az etanol, indometacin és aszpirin által okozott gasztro-intesztinális károsodást. A leukotriének által okozott gasztro-intesztinális károsodás részben az erős érösszehúzó tulajdonságaiknak köszönhető, ezáltal elterelik a véráramot a nyálkától. Számos vizsgálatban mutatták ki az LTB4 és egyéb peptidoleukotriének megnövekedett szintjét olyan betegekben, akik gyulladásos bélbetegségben szenvedtek. A gyulladásos bélbetegségek állatmodelljeiben az 5-LO inhibitorok csökkentik a kár mértékét és a gyulladást.
Amint azt már említettük, a PAF az eddig leírt leghatékonyabb fekélykeltő anyag patkányokban. A PAF-ról azt is feltételezik, hogy a nekrotizáló enterokolitiszben is szerepet játszik [Wallace és munkatársai, Gastroenterology, (1987), nyomdában].
Központi idegrendszer
A leukotriének a kalcium-ionofórokkal serkentett normál agyszövetben szintetizálódnak és szabadulnak fel, ami arra utal, hogy neuromodulátorként működnek. Az LTC4 és az LTD4 a kisagyi purkinje sejtek elnyújtott ingerlését okozza [Palmer és munkatársai, J. Pharmacol. Exp. Ther., 219, 91-96 (1981)]. A valószínű neuromodulátor szerepük mellett a leukotriének az idegszövet sérülését, azaz például agyi iszkémiát követő patológiájához is hozzájárulhatnak, mivel az agyi erek hatékony összehúzói. Az LTB4, LTC4 és az LTB4 csökkenti a vér-agy gátat, megnövelve az érfal permeabilitását (az LTB4 a leghatékonyabb) [Black, Prostaglandins Leukotriene Med., 14, 339-340 (1984)].
A prosztaglandinok hozzájárulnak a sérüléssel, gyulladással, fejfájással együttjáró fájdalomérzet kialakulásához, megmagyarázva ezzel a nem-szteroid gyulladásellenes hatóanyagok jótékony terápiás hatását ezekben a betegségekben. Alacsonyabb dózisoknál az E2 és PGF2 prosztaglandinok érzékenyítik a fájdalomérző receptorokat a mechanikai és kémiai behatásokra, és ezzel hiperalgéziát okoznak.
Fedőszövet rendszer
A leukotriének jellegzetes gyulladásos reakciókat okoznak az emberi bőrben. 0,15 - 1,5 nmol LTB4 humán bőrbe való injekciózása ödémás területek kialakulását okozza, amelyek az injekciózás után 30 perccel jelennek meg, és legalább 4 óra hosszat tartanak. A hisztológia egy jellegzetes polimorfonukleáris leukocita beszűrődést mutat a bőrben [Camp és munkatársai, Br. J. Pharmacol., 80, 497-502 (1983)]. Még 5 ng LTB4 topikális alkalmazása egy késleltetett gyulladásos reakciót okoz, ami 12 óra elteltével jelentkezik először, és több napig tart. A beszűrődés először polimorfonukleáris leukocitákat tartalmaz, de a gyulladásos reakció későbbi állapotaiban a mononukleáris leukociták dominálnak. Az LTB4 ismételt topikális adagolására tachifilaxis fejlődik ki [Dowd és munkatársai, (1987)].
Az LTB4-gyel ellentétben a peptidoleukotriének egy azonnali érzéki reakciót okoznak az intradermális adagolásra, de ennek nincs utólagos következménye. A leukotriéneknek a humán megbetegedésekben való szerepére a legjobb bizonyítékok a pszoriázisból származnak. Leukotriéneket találtak a pszoriatikus léziókban. A benaxoprofénről, egy 5-lipoxigenáz inhibitorról kiderült, hogy hatásos olyan betegeknél, akik súlyos pszoriázisban szenvednek, és nem reagálnak a standard kezelésre [Kragballe and Herlin, Arch. Dermatol., 119, 548552 (1983)]. A benaxoprofént azonban az elfogadhatatlan mellékhatásai miatt kivonták a piacról.
Az El és E2 prosztaglandinok értágulást és kiütéseket okoznak, ha a bőrbe injekciózzák őket [Crunckhorn and Willis, Br. J. Pharmacol., 41, 49-56 (1971)]. A prosztaciklin (PGI2) megnöveli az ér más mediátorok által okozott permeabilitását. A D2 prosztaglandin sokkal gyengébb, mint a PGE-k, az intradermális injekciózást követő vörösödés és kiütésesedés kiváltásában.
A PAF a humán bőrben egy hatásos gyulladáskeltő anyag. A PAF pikomólnyi mennyiségének a humán bőrbe való injekciózása egy kétfázisú válaszreakciót okoz, az első válasz az injekciózás után 5 perccel jelentkezik, majd 3-6 óra elteltével egy késői válasz következik [Archer és munkatársai, Br. J. Dermatol., 112, 285-290 (1985)]. A PAF-ot pszoriázisban szenvedő betegek léziós bőrének hámlásából és kamrafolyadékából izolálták [Mailet és munkatársai, Adv. in Prostaglandins, Thromboxanes, Leukotrienes and Related Compounds, 17B, 640-642 (1987)].
Izom- és csontrendszer
Leukotriéneket és arachidonsav monohidroxi származékokat magas szinten detektáltak reumatoid artritiszben, esi*9 ·’ '·· -:.
- 12 golyaizület-gyulladásban és köszvényben szenvedő betegek ízületi folyadékából [Klickstein és munkatársai, J. Clin. Invest., 66, 1166-1170 (1980); Davidson és munkatársai, Ann. Rheum. Dis. 42 , 677-679 (1983)]. Az ízületi folyadékban levő lipoxigenáz termékek magas koncentrációja hozzájárulhat a neutrofil beszűrődéshez, és az aktivált neutrofilekből a megnövekedett enzim-felszabaduláshoz az ízületi üregbe. Az 5-lipoxigenáz inhibitorokról kimutatták, hogy csökkentik a szövetkárosodást rágcsálók kollagénnel indukált artritiszében. A leukotrién bioszintézis gátlása csökkenti a neutrofil és monocita beszűrődést az ízületi térbe, valamint csökkenti az ezen sejtek által okozott szövetkárosodást.
Jelenleg használt terápiás szerek a lipidmetabolizmus szabályozására
Az eikozanoidoknak a test fő szervrendszereire gyakorolt különböző hatásaiból, valamint ezeknek a különböző kóros állapotokkal való összefüggéséből nyilvánvaló, hogy az arachidonsav metabolizmusának inhibitorai hatalmas terápiás jelentőséggel bírhatnak. Jelenleg több különböző típusú anyag van a piacon, amelyek gátolják az arachidonsav metabolizmusát. Azonban mindegyik típusnak számos hátrányos tulajdonsága van, a fajlagosság hiánya következtében. Emellett a legtöbb jelenleg is piacon levő anyag nem képes gátolni sem a lipoxigenáz bioszintézis utat, sem a vérlemezke aktiváló faktort.
A ciklooxigenáz enzim aszpirinnel, ibuprofénnel, naproxénnel, indometacinnal és hasonlő nem-szteroid analgetikumokkal való gátlásáról jól ismert, hogy számos különböző • »·
- 13 kóros állapotban jótékony hatása van. A nem-szteroid gyulladáscsökkentő anyagok a fő erősségei a reumatoid artrítisz kezelésének. Ezekről az anyagokról kiderült, hogy nagyon hatékonyan enyhítik a reumatoid artrítisz által okozott tüneteket, például a fájdalmat és a duzzadást, azonban nagyon kevéssé változtatják meg a betegség lefolyását. Emellett a ciklooxigenáz inhibitorok megkülönböztetés nélkül gátolják mindenféle prosztaglandin keletkezését, és így néha jótékony hatással rendelkeznek. Ez talán részben számos mellékhatásuk, például a fekélykeltő aktivitásuk mechanizmusa is. A ciklooxigenáz inhibitoroknak nem hatnak más leukotriének vagy a vérlemezke aktiváló faktor keletkezésére, és ezáltal számos különböző betegség kezelésében űrt hagynak.
A glükokortikoid aktivitást mutató szteroidok gyulladáscsökkentő aktivitással is rendelkeznek, valószínűleg azáltal, hogy gátolják az arachidonsav felszabadulását a sejtmembránokból. Jelenleg leginkább a szteroidokat alkalmazzák. Használják számos különböző gyulladásos, allergiás és nem-immun betegség kezelésére, például a reumatoid artritisz, oszteoartritisz, bőrfarkas, anafilaxia, csalánkiütés, kontakt dermatitisz, asztma, pszoriázis, krónikus fekélyes kolitisz, agyvizenyő, szeptikus sokk, rosszindulatú betegségek és hepatitisz kezelésére is. A mellékvese-elégtelenség helyettesítő terápiájának kivételével a glükokortikoid terápia nem gyógyító hatású. Emellett a hosszú ideig tartó glükokortikoid kezelés jelentős és gyakran életveszélyes mellékhatásokat okoz. Mivel a glükokortikoidokat többnyire krónikus betegségek kezelésére alkalmazzák, ezért a mellékhatá14 sok korlátozzák a felhasználhatóságot.
Az arachidonsav prukrzorait képező esszenciális zsírsavak étellel való bejutása mértékének megváltoztatása közepes hatást mutat a gyulladásos és kardiovaszkuláris megbetegedésekben [Bonaa és munkatársai, New Engl. J. Med., 322, 795-801 (1990); Rangi és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunoi., 85, 484-489 (1990)]. A halolajak eikozapentaénsavat (EPA) tartalmaznak, amely gyenge szubsztrátja a ciklooxigenáznak, és a ciklooxigenáz kompétítiv inhibitoraként működik. Az EPA-t az arachidonsavhoz hasonlóan metabolizálják a lipoxigenázok, de sokkal kevesebb aktív metabolit keletkezik [Terano és munkatársai, Biochem. Pharmacol., 33, 3071-3076 (1984)]. Az EPA tehát verseng az arachidonsawal a sejtmembránba való beépülésért, majd azt követően a lipoxigenázok általi metabolizálódásért. Nehéz elérni, hogy teljesen megszüntessük a linolsav, linolénsav és arachidonsavak felvételét a táplálkozás során, ez korlátozza a halolaj terápiák használhatóságát.
Az 5-lipoxigenáznak egy vaskomplex-képező reagenssel, egy hidroxámsav származékkal való gátlása jelenleg klinikai vizsgálat alatt van. Visszatekintve, ez a megközelítés nem mutatott igazán ígéretes eredményeket. A mai napig nincs olyan hatóanyag, amely képes lenne befolyásolni az arachidonsav sejtmembránokban való tárolódását vagy az abból való felszabadulást a lipoxigenáz bioszintézis úton keresztül, és bizonyítottan hasznos terápiás ágens lenne. A mai napig van egy nagy, kielégítetlen igény egy biztonságos, hatékony módszerre, amely befolyásolná az arachidonsav szintézisét vagy ·*♦· metabolizmusát. Egy olyan eszköz, amely az arachidonsav bioszintézis út kritikus pontjaiban működő fehérjék termelődését szabályozza, ahelyett hogy közvetlenül gátolnánk a specifikus enzimeket, leküzdené ezt a problémát, amivel a korábbi kutatók találkoztak.
A találmány tárgya tehát eljárás immunológiai, kardiovaszkuláris és más betegségek kezelésére az arachidonsav és rokon vegyületek szintézisének és metabolizmusának megzavarásával.
A találmány tárgya továbbá eljárás olyan antiszensz oligonukleotidok előállítása, amelyek képesek az arachidonsav és rokon vegyületei szintézisében és metabolizmusában szerepet játszó fehérjéket kódoló RNS működését gátolni.
A találmány tárgya továbbá olyan módszerek az arachidonsav szintézis vagy metabolizmus működési zavarainak diagnosztizálására.
A mellékelt 1. ábrán az arachidonsav szintézis és metabolizmus sémáját látjuk.
A 2. ábrán a vérlemezke aktiváló faktor bioszintézis útjának sémáját láthatjuk.
A 3. ábrán a humán 5-lipoxigenáz mRNS szekvenciája látható.
A 4. ábrán egy humán ízületi folyadék PLA2 mRNS szekvenciája látható.
Az 5. ábrán egy humán 5-lipoxigenáz aktiváló fehérjes z ekvenc i a 1átható.
A 6. ábrán egy humán LTA4 hidroláz mRNS szekvenciája látható.
• ·
- 16 A 7. ábrán egy humán foszfoinozitid-fajlagos foszfolipáz C mRNS-szekvencia látható.
A 8. ábrán az 5-lipoxigenáz HL-60 sejtekben való indukciójának grafikus sémája látható.
A 9. ábrán az 5-lipoxigenáz HL-60 sejtekben való expressz ió ja antiszensz oligonukleotidokkal való gátlásának a grafikus sémája látható.
A 10. ábrán az 5-lipoxigenáz patkány bazofil leukémia sejtekben való expressziója antiszensz oligonukleotidokkal való gátlásának grafikus sémája látható.
A 11. ábrán az 5-lipoxigenáz D3 vitaminnal differenciált HL-60 sejtekben való expressziója antiszensz oligonukleotidokkal való gátlásának grafikus sémája látható.
A 12. ábrán az 5-lipoxigenáz RBL-1 patkány sejtekben való expressziója antiszensz oligonukleotidokkal való gátlásának grafikus sémája látható.
A 13. ábrán az 5-lipoxigenáz mRNS specifikus régióinak RBL-1 sejtekben történő antiszensz oligonukleotidokkal való gátlásának grafikus sémája látható.
A 14. ábrán az A431 sejtekből kiválasztott PLA2 HPLC elemzésének grafikus sémája látható.
A 15. ábrán a PLA2 primer humán keratinociták által okozott megnövekedett szekréciójának grafikus ábrázolása látható.
A találmány tárgyát olyan oligonukleotidok és oligonukleotid analógok képezik, amelyek fajlagosan hibridizálódnak az 5-lipoxigenázt, az 5-lipoxigenázt aktiváló fehérjét (FLAP), a foszfolipáz A2-t, a foszfolipáz C-t, az LTA4 hidrolázt és más, lipid metabolizmust szabályozó fehérjéket kódoló nukleinsavakkal. Az oligonukleotidot és oligonukleotid analógot úgy tervezzük, hogy közvetlenül a mRNS-hez vagy egy kiválasztott génhez kötődjön, háromszálú szerkezet létrehozása közben, és ezáltal módosítsa a génről keletkező mRNS mennyiségét.
Az említett kapcsolatot általában ”antiszensz-ként ismerjük. Az oligonukleotidok és oligonukleotid analógok képesek az RNS vagy DNS működését gátolni, akár fehérjévé való transzlációjukat, a citoplazmába való transzlokációjukat, vagy bármely más olyan aktivitásukat, amely nélkülözhetetlen a biológiai funkciójukhoz. Ha az RNS vagy DNS nem képes összes funkcióját vagy azoknak egy részét teljesíteni, ennek eredménye az, hogy az arachidonsav metabolizmus szabályozó genomrész nem expresszálódik helyesen, és ezzel szabályozza az említett metabolizmust.
Az az előnyös, ha specifikus génekre irányítjuk az antiszensz támadást. Felfedezték, hogy az 5-lipoxigenázt, 5lipoxigenáz aktiváló fehérjét, a foszfolipáz A2~t, az LTA4 hidrolázt, a foszfolipáz C-t és a koenzim-A-tól független transzacilázt kódoló gének különösen jól használhatók ebben a megközelítésben.
A találmány szerinti megoldás tehát az arachidonsav métábólizmusának gátlására vonatkozik, ami abban áll, hogy az állatot egy olyan oligonukleotiddal vagy oligonukleotid analóggal hozzuk érintkezésbe, amely képes az arachidonsav szintézist vagy metabolizmust befolyásoló fehérjét kódoló nukleinsawal hibridizálódni. Azok az oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok az előnyösek, amelyek az 5-lipoxigenázt, 5-lipoxigenáz aktiváló fehérjét, a foszfolipáz A2~t, az LTA4 hidrolázt, a foszfolipáz C-t és a koenzim-A-tól független transzacilázt kódoló RNS-hez vagy DNS-hez hibridizálódnak.
Az antiszensz oligonukleotidok nagyon Ígéretes terápiás anyagok számos humán megbetegedés kezelésében. Elméletileg sokkal egyszerűbb olyan vegyületeket tervezni, amelyek egy primer szerkezettel, például egy RNS molekulával lépnek kapcsolatba a bázispárosodás révén, mint olyan molekulákat, amelyek egy enzim aktív helyével lépnek kapcsolatba. Az oligonukleotidok fajlagosan kötődnek akár a pre-mRNS, akár az érett mRNS komplementer szekvenciájához, a Watson-Crick bázispárosodás szabályai szerint, gátolva ezzel a genetikai információ áramlását a DNS-től a fehérje felé. Az antiszensz oligonukleotidoknak azok a tulajdonságai, amelyek a kiválasztott szekvenciára fajlagossá teszik őket, ugyanakkor különlegesen változtathatővá is teszik őket. Mivel az antiszensz oligonukleotidok monomer egységek hosszú láncai, ezért ezek könnyen szintetizálhatok bármely kiválasztott RNS-szekvencia alapján. Számos újabb vizsgálat igazolta az antiszensz oligonukleotidoknak kiválasztott fehérjék vizsgálatában biokémiai eszközként való használhatóságát [Rothenberg és munkatársai, J. Natl. Cancer Inst., 81, 1539-1544 (1989); Zon, G. Pharmaceutical Rés., 5, 539-549], Az oligonukleotidok kémiájában bekövetkezett fejlődés következtében lehetséges az olyan nukleáz rezisztens oligonukleotidok és oligonukleotid analógok szintézise, amelyeket a sejtek job bán felvesznek, így ma már megfontolható az antiszensz oligonukleotidok újtípusú gyógyhatású anyagokként való felhasználása.
Az antiszensz oligonukleotidok ideális megoldást kínálnak a korábbi megközelítések során tapasztalt problémákra. Úyg tervezhetők meg, hogy szelektíven gátoljanak egy adott izoenzimet, gátolhatják az enzim keletkezését, és elkerülik az olyan aspecifikus mechanizmusokat, mint például a szabad gyökök eltávolítását. Az enzim mechanizmusának teljes megismerése szükséges ahhoz, hogy specifikus inhibitorokat tervezzünk hozzá.
A jelenlegi anyagok, amelyek az arachidonsav metabolizmusát befolyásolják, számos elfogadhatatlan mellékhatással rendelkeznek a fajlagosság hiányának következtében, illetve korlátozott hatással rendelkeznek a betegség kezelésében. A találmányban elkerüljük a kutatók által korábban tapasztalt problémákat azáltal, hogy az enzim termelődését gátoljuk, ahelyett hogy az enzimet közvetlenül gátolnánk, és így érjük el a tarápiás hatást. Számos, számunkra érdekes enzim vesz részt az arachidonsav szintézisében vagy metabolizmusában. Ezek közül hatot választottunk ki, mint a legkritikusabb célpontokat, azon az alapon, hogy kulcsszerepet játszanak az arachidonsav szintézisben, illetve azon az alapon, hogy szelektívek a fajlagos arachidonsav metabolitok előállításában. Amint az az 1. ábrán látható, az arachidonsav bioszintézis út kulcspontjaiban számos fehérjét azonosítottunk. Az oligonukleotidokat vagy oligonukleotid analógokat úgy terveztük, hogy közvetlenül kötődjenek az mRNS-hez • * • · · · · · • · ·♦ ·······
- 20 vagy egy génhez, hozzanak létre egy háromszálas szerkezetet, amely módosítja a génről keletkező mRNS mennyiségét.
Az arachidonsav egy esszenciális zsírsav, amelyet vagy közvetlenül a táplálékból kell fölvenni, vagy a táplálékkal linói-, illetve linolénsavat kell fölvenni, és ezek metabolizálódnak arachidonsawá az emlős szövetekben. Az arachidonsav észterezett formában tárolódik a membrán lipidekben. Ilyen lipidek lehetnek a neutrális lipidek, azaz a trigliceridek és digliceridek; a foszfolipidek, azaz a foszfatidil-kolin, foszfatidil-etanol-amin, foszfatidil-inozit és a foszfatidil-szerin; valamint a koleszterin-észterek. Az észterezett arachidonsav nem hozzáférhető a ciklooxigenáz és a lipoxigenáz bioszintézis utak metabolizmusa számára. Tehát a prosztaglandinok és a leukotriének szintézisében a sebességkorlátozó lépés a sejtmembránból való felszabadulás. A legtöbb emlős sejtben a prosztaglandin és leukotrién szintézis számára az arachidonsav legfőbb forrásának a foszfolipidek tűnnek. A specifikus agonistákkal serkentett sejtek arachidonsavat szabadítanak fel a membrán foszfolipidekből, számos különböző bioszintézis úton (1. ábra). Egy adott szövetben az összes típusú bioszintézis út működhet, azonban valószínűleg a szabad arachidonsav előállításának legközvetlenebb útja, azaz a foszfolipáz A2 szolgáltatja a legnagyobb tömegű felszabadított arachidonsavat. Néhány sejttípusban a foszfolipáz C/diglicerid lipáz bioszintézis út jelentősen hozzájárulhat a membrán lipidekből felszabadult arachidonsav mennyiségéhez [Bell és munkatársai, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 76, 3238-3241;
* ·♦
- 21 Mahadeppa and Holub, Biochemical and Biophysical Research Communications, 134. 1327-1333 (1986)].
Számos újabban végzett vizsgálat azt mutatja, hogy a foszfolipidek, amelyekből az arachidonsav felszabadul, eltérőek a ciklooxigenáz és lipoxigenáz bioszintézis utak esetén [Humes és munkatársai, Journal of Biological Chemistry, 257, 1591-1594; Chilton and Connell, Journal of Biological Chemistry, 263. 5260-5265 (1988); Skerrett és munkatársai, J. Immunoi., 144, 1052-1061 (1990)]. Tehát az eltérő lipidek módosítása különböző hatással lehet a prosztaglandinok és leukotriének bioszintézisére. Pontosabban a foszfatidil-kolin egy külön alfaja, amely éter kötést tartalmaz az 1-es pozícióban (l-O-alkil-2-arachidonil-foszfatidil-kolin) tűnik a humán neutrofilekben folyó LTB4 szintézise esetén a fő arachidonsav forrásnak [Chilton and Connel, Journal of Biological Chemistry, 263, 5260-5265]. Ennek a lipidfajtának foszfolipáz A2~vel történő hidrolízise eredményezi a szabad arachidonsavat és az 1-0-alkil-lizofoszfatidil-kolint, amely a vérlemezke aktiváló faktor közvetlen prekurzora (2. ábra). Akár ezen lipidfajta szintézisének gátlása a koenzim A-tól független transzacilázzal, akár a lipid hidrolízisének gátlása a foszfolipáz A2 gátlásán keresztül, gátolja a leukotriének és a vérlemezke aktiváló faktorok termelődését.
A membrán lipidekből felszabaduló arachidonsav újra észterezhető lipidekké egy aciltranszferáz enzimmel, illetve tovább metabolizálható számos oxigenáz segítségével. Terápiásán a két legfontosabb oxigenáz csoport a ciklooxigenáz és a lipoxigenázok. A ciklooxigenáz az arachidonsavba oxi22 gént visz be és ciklizálja, így hozza létre a ciklikus endoperoxid intermedier PGH2-t, amely a prosztaglandinok szintézisének első lépése (1. ábra). Az emlős sejtekben számos lipoxigenáz enzim létezik, amelyeket annak a kettős kötésnek a pozíciója alapján lehet osztályozni, ahova az oxigént beviszi, azaz van 5-lipoxigenáz, 12-lipoxigenáz és 15-lipoxigenáz. Jóllehet a 12- és 15-lipoxigenáznak van némi biológiai aktivitása, a legjobban jellemzett lipoxigenáz termékek az 5-lipoxigenázzal keletkeznek. Az 5-lipoxigenáz termékek, a leukotriének, komoly biológiai aktivitással rendelkeznek, és számos kóros állapot kialakulásában szerepet játszanak.
Az 5-lipoxigenáz aktivációs mechanizmusának részeként az enzim egy kalciummal indukált transzlokáción esik át a citoszol frakcióból a membránba, ahol kölcsönhatásba lép egy fajlagos membrán fehérjével, amelyet 5-lipoxigenáz aktiváló fehérjének (FLAP) nevezünk. Az 5-lipoxigenáz és a FLAP kölcsönhatása szükségesnek tűnik a sejtekben folyó leukotrién szintézishez [Rouzer és munkatársai, Journal of Biological Chemistry, 256. 1436-1442; Dixon és munkatársai, Natúré, 343, 282-284].
Az azonosított antiszensz oligonukleotid célpontok az 5-lipoxigenáz, az 5-lipoxigenáz aktiváló fehérje, a foszfolipáz C specifikus izoenzimei, a foszfolipáz A2, az LTA4 hidroláz és a koenzim A-tól független transzaciláz fajlagos izoenzimjei. Ezek a célpontok számos fontos mellék-bioszintézis megközelítést jelentenek az arachidonsav metabolizmusához. A lipoxigenáz bioszintézis utat és a vérlemezke aktiváló faktor szintézist vagy úgy közelítjük meg, hogy gátol·· «
- 23 juk a prekurzor l-0-alkil-2-arachidonil-foszfatidil-kolin foszfolipidek bioszintézisét (koenzim A-tól független transzaciláz), vagy úgy, hogy gátoljuk az arachidonsav felszabadulását a membrán foszfolipidekből (foszfolipáz A2 és foszfolipáz C). A lipoxigenáz bioszintézis út is gátolható specifikusan, ha gátoljuk az arachidonsav leukotriénekké való alakulását (5-lipoxigenáz és LTA4 hidroláz) , vagy ha aktiváljuk az 5-lipoxigenázt (5-lipoxigenáz aktiváló fehérje) . Amint az a kiválasztott pontokból látható, az arachidonsav metabolizmusa módosításának eszköze függ a kiválasztott fehérjétől.
A lipoxigenázok a dioxigenázok azon csoportjába tartoznak, amelyek egy molekula oxigént építenek be a telítetlen zsírsavakba. A lipoxigenázokat a szubsztrát molekula oxigénezésének helye alapján lehet osztályozni. Az 5-lipoxigenáz (5-LO) egy olyan dioxigenáz, amely egy molekula oxigént épít be az arachidonsav C5-ös kettőskötésére, így keletkezik az 5-hidroperoxi-6,8,11,14-eikozatetraénsav (5-HPETE). A tisztított 5-LO az 5-HPETE-t konjugált trién epoxiddá is átalakítja, az 5,6-leukotrién A4~gyé. Tehát az első két enzimatikus lépést a leukotrién B4 és a peptidoleukotriének (leukotrién C4, leukotrién D4 és leukotrién E4) bioszintézis útjában egyetlen enzim végzi el.
Az 5-lipoxigenázt (5-LO) homogenitásig tisztították számos különböző sejttípus citoszol frakciójából [Rouzer and Samuelsson, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 82. 6040-6044 (1985); Hogaboom és munkatársai, Mól. Pharmacol., 30, 510-519 (1986); Ueda és munkatársai, Journal of Biological Chemistry, 261. 7982-7988 (1986)]. A tisztított enzim molekulatömege 74-80 kD, poli(akril-amid) gélelektroforézissel meghatározva. Az 5-lipoxigenáz egy önpusztító enzim, amennyiben önmagát irreverzibilis módon inaktiválja az enzimes reakció során. Ennek pontos mechanizmusa nem ismert. Az 5-LO mind az arachidonsavat, mind az 5-HEPTE-t tudja szubsztrátként használni az LTA4 szintéziséhez. Patkány bazofil 5-LO-val szemben az exogén 5-HPETE körülbelül 50-szer kisebb aktivitást mutat az LTA4 szintézis szubsztrátjaként, mint az 5-lipoxigenáz reakcióban működő enzimek által előállított 5-HPETE.
A tisztított enzimet mind kalciummal, mind ATP-vel, valamint számos ismeretlen sejtfaktorral aktiválni lehet, amelyeket a tisztítás során eltávolítunk az enzimből [Rouzer és munkatársai, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 82, 7505-7509 (1985); Hogaboom és munkatársai, Mól. Pharm., 30, 510-519 (1986)]. Mind az ATP, mind a serkentő faktorok fokozzák az enzim kezdeti sebességét anélkül, hogy stabilizáló hatást fejtenének ki az enzimre. Az ATP-vel való serkentésben valószínűleg nem szerepel fehérje foszforilezés, és a foszfodiészter-kötés hidrolízise sem tűnik követelménynek, mivel mind az ADP, mind az AMP serkentő hatással rendelkezik. Az egyik mechanizmus, melynek révén a kalcium aktiválja az 5-LO-t, az az 5-LO sejtmembránhoz való kötődésének elősegítése [Rouzer and Samuelsson, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84., 7393-7397 (1987); Wong és munkatársai, Biochemistry, 27, 6763-6769 (1988)]. A legtöbb olyan agonista, amely serkenti a leukotrién bioszintézist, megnöveli az intracelluláris kalciumtartalmat, tehát az 5-LO-nak a citoszolból a sejtmembránba való transzlokációja egy fontos szabályozó esemény lehet a leukotrién bioszintézisben. Ezt a hipotézist alátámasztja még az a megfigyelés is, hogy ha a sejteket kalcium-ionofórral kezeljük, akkor ez az 5-LO membránba való transzlokációját és az ezzel együtt fellépő leukotrién termelést okozza [Rouzer and Kargman, Journal of Biological Chemistry, 263, 10980-10988 (1988)].
A humán 5-lipoxigenáz cDNS-t és genomiális kiónját [Dixon és munkatársai, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85, 416-420 (1988); Matsumoto és munkatársai, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85, 26-30 (1988); Fűnk és munkatársai, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 86, 2587-2591 (1989)], valamint a patkány 5-LO cDNS szekvenciáját és az ebből következő aminosav sorrendjét is publikálták [Balcarek és munkatársai, Journal of Biological Chemistry, 263, 1393713941 (1988)]. A patkány 5-LO genomiális kiónját izoláltuk, és részlegesen meghatároztuk a szekvenciáját. Az 5-LO hírvivő RNS-e körülbelül 2700 bp hosszú. A humán 5-LO 674 aminosav hosszú, a számított molekulatömege 77 839, míg a patkány 5-LO 670 aminosavból áll. A humán és patkány 5-LO fehérje szekvenciák 93 %-ban azonosak, míg a cDNS szekvenciák több mint 80 %-ban. A fő transzlációs iniciációs starthely 65 bázispárral az AUG transzláció iniciációs kodon előtt van. A humán 5-LO mRNS 434 bp 3' nem-transzlálódó szekvenciát tartalmaz a poliadenilezési hely előtt. Az 5-LO 2 olyan domént tartalmaz, amelyek 50-60 %-os homológiát mutatnak a kalcium-dependens membránkötő fehérjék, például a lipokortin 17 aminosavból álló konszenzus szekvenciájával. Az 5-LO és a kalcium-dependens membránkötő fehérjék közötti hasonlóság megmagyarázhatja az 5-LO kalcium-dependens transzlokációját a citoszolból a membránba.
A humán 5-LO gén több mint 80 000 bázispár méretű. A gén 14 exont és 13 intront tartalmaz, amelyeknek mérete legalább 192 bp, de 26 kbp-nál több is lehet, és emiatt ez az ismert legnagyobb gének közé tartozik. Az 5-LO gén nem tartalmaz sem TATA sem CCAAT szekvenciákat a transzkripciós iniciációs hely közvetlen közelében, és ez a tulajdonság számos ellátási (housekeeping) génre jellemző. A feltételezett promoter régió 8 helyet tartalmaz az Spl transzkripciós faktor kötődéséhez.
Amint azt az előzőekben tárgyaltuk, mivel az 5-LO a leukotrién A4, leukotrién B4 és a peptidoleukotriének bioszintézisében részt vesz, ezért az 5-LO gátlása hasznos lehet az arachidonsav metabolizmus gátlásában. Bizonyos antiszensz oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok azonosíthatók, mint amelyek jól használhatók erre a célra.
Amint azt az előzőekben jeleztük, az 5-lipoxigenáznak egy membrán faktorra van szüksége ahhoz, hogy a leukotriéneket szintetizálja [Rouzer and Samuelsson, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 82., 6040-6044]. Egy új leukotrién bioszintézis inhibitornak, az MK886-nak az azonosítása, amelynek nincs közvetlen hatása az 5-lipoxigenázra, vezetett egy 18 kD méretű membrán fehérje azonosítá sára, amely aktiválja az 5-lipoxigenázt. Ennek neve 5-lipoxigenáz aktiváló fehérje (FLAP) [Miller és munkatársai, Natúré, 343. 276-281 (1990); Rouzer és munkatársai, Journal of Biological Chemistry, 265. 1436-1442 (1990)]. A FLSP cDNS egy 161 aminosavból álló fehérjét kódol, amely nagy mennyiségben tartalmaz hidrofób aminosavakat (3. ábra) [Dixon és munkatársai, Natúré, 343, 282-284 (1990)]. A FLAP mRNS-e 1 kb méretű.
Számos kísérlet igazolja, hogy érintetlen sejtekben a FLAP nélkülözhetetlen a leukotrién szintézishez. Az 5-lipoxigenáz cDNS-sel transzfektált oszteoszarkóma sejtek expresszálnak 5-lipoxigenáz aktivitást, de nem szintetizálnak leukotriéneket, ha kalcium-ionoforral serkentjük őket. Viszont a mind 5-lipoxigenáz, mind FLAP cDNS-sel transzfektált sejtek expresszálnak 5-lipoxigenáz enzimaktivitást, és kalcium-ionoforral való serkentés után termelnek leukotriéneket [Dixon és munkatársai, Natúré, 343, 282-284], Másrészt kimutatták, hogy az MK886 a kalcium-ionoforral való kezelés után képes megakadályozni az 5-lipoxigenáz transzlokációját a citoszolból a membránba, valamint ezt követően a leukotriének keletkezését. Az MK886 analógok sorrendbe állított hatékonysága nagyon jól korrelál a leukotrién szintézis gátlásával és az 5-lipoxigenáz transzlokáciőjával [Rouzer és munkatársai, Journal of Biological Chemistry, 265, 14361442]. Ezek az adatok azt sugallják, hogy a FLAP ellen irányított antiszensz oligonukleotidok egy alternatív stratégiát jelentenek a leukotrién termelődés gátlásában.
Az A2 foszfolipázok (EC. 3.1.1.4) az enzimeknek egy eltérő csoportjába tartoznak, amelyek hidrolizálják a membrán foszfolipidekhez kötött az sn-2 zsírsavésztereket, így állítanak elő szabad zsírsavakat, például az arachidonsavat és a lizofoszfolipideket. A foszfolipáz A2 (PLA2) számos különböző kígyó és méhméregben megtalálható, és az emlős pankreatikus folyadékba szekretálódik lipolitikus enzim formájában. A PLA2 enzimek megtalálhatók a legtöbb emlős szövetben is, és az aktivált vérleroezkékből, valamint gyulladásos sejtekből az extracelluláris térbe szekretálódnak. A PLA2-nek több szerepe van az emlős sejtekben, beleértve a sejtmembránok átmodellezését, a felületaktív anyagok bioszintézisét, emésztő enzimek a pankreatikus folyadékban, valamint az észterezett arachidonsav felszabadulása sejt foszfolipidekké. A szabad arachidonsav PLA2 által történő felszabadítását tartják a sebességkorlátozó lépésnek a prosztaglandin bioszintézisében, valamint a kritikus első lépésnek a leukotrién, valamint a vérlemezke aktiváló faktor bioszintézisében. A gyulladásos mediátorok prekurzórainak felszabadulása mellett a PLA2 magas koncentrációban közvetlenül toxikus lehet a sejtekre, mivel elősegíti a sejtek lízisét. A PLA2-nek a sejtekben játszott többszörös szerepe megmagyarázhatja, miért van szükség többféle PLA2 enzimre a sejtekben. A gyulladásos váladékokban talált PLA2 izoenzÍrnek [Przanski and Vadas, J. Rheumatol., 15, 1601-1603 (1988)] különösen érdekesek mint az antiszensz oligonukleotidok célpontjai. Ez az enzim nem csak szerepet játszhat az arachidonsav sejtmembránokból való felszabadulásában az eikozanoid bioszintézishez, de lehet közvetlen citotoxikus hatása is a felszabadulás helyén.
Újabban Seilhamer és munkatársai [Journal of Biological Chemistry, 264, 5335-5338 (1988)], valamint Kramer és munkatársai [Journal of Biological Chemistry, 264, 5768-5775 (1989)] írták le a reumatoid artritiszben szenvedő betegek ízületi folyadékában levő PLA2 CDNS, illetve genomiális klónozását. A humán ízületi folyadékból izolált PLA2 gén (SFPLA2) 4,5 kb méretű, és 800 bp méretű mRNS-sé processzálódik. A cDNS egy 144 aminosavból álló fehérjét kódol, amelyből az első 20 aminosav a sejtből való szekréció során szignál peptidként hasad le. Az SF-PLA2 aminosav szekvenciája eltér a pankreatikus PLA2 szekvenciájától, sokkal közelebbi rokonságban áll a ΙΙ-es csoportba tartozó PLA2 enzimekkel, mint azokkal, amelyek a csörgőkígyó mérgében találhatók.
A PLA2 egy, a nem-pankreatikus szövetekben és folyadékokban kismennyiségben előforduló fehérje, amely az összes fehérjének 0,01-0,001 %-át képezi. Az SF-PLA2 mRNS-e szintén egy kismennyiségben előforduló mRNS, amely korlátozott szöveteloszlást mutat. A korlátozott szöveteloszlás, a kismenynyiségben előforduló mRNS, és az enzimaktivitás és a gyulladásos rendellenességek súlyossága közötti szoros kapcsolat az SF-PLA2~t az antiszensz oligonukleotid terápia vonzó célpontjává teszi.
Az antiszensz oligonukleotid analógok és oligonukleotidok néhány alkalmazása nyilvánvaló. Például, mivel a gamma-interferon megnöveli a PLA2 szintézis mértékét az interferon szabályozó elemeinek az 5’-nem átíródó régiójában való jelenléte esetében, ezért az antiszensz oligonukleoti dók alkalmazhatók lehetnek a PLA2-nek gamma-interferonnal kezelt humán keratinocitákból való felszabadulásának gátlására.
Az antiszensz oligonukleotid terápia hasznos lehet még a bőr gyulladásos megbetegedéseinek kezelésében, mivel az SF-PLA2 szekretálódik a humán epidermális karcinóma sejtekből és a primer humán epidermális keratinocitákból. Emellett a PLA2 közvetítő szerepet játszhat a gamma-interferon bőrben kifejtett gyulladásos aktivitásában, mivel a gamma-interferonnal indukálja a PLA2 felszabadulását az emberi keratinocitákból.
A leukotrién A4 hidroláz (LTA4 hidroláz) katalizálja a leukotrién A4 5-lipoxigenázzal való hidrolízisét leukotrién B4~gyé, amely egy hatékony gyulladásos közvetítő. Az LTA4 hidroláz egy citoszol fehérje, amelyet homogenitásig tisztítottak emberi tüdőből, [Ohishi és munkatársai, Journal of Biological Chemistry, 262. 10200-10205 (1987)], humán leukocitákból [Radmark és munkatársai, Journal of Biological Chemistry, 259, 12339-12345 (1984)] és humán eritrocitákból [McGee and Fitzpatrick, Journal of Biological Chemistry, 260, 12832-12837]. A tüdőből és leukocitákból tisztított enzimek eltértek az eritrocita ΙΖΓΑ4 hidroláztól, amennyiben más volt a molekulatömegük, kinetikai tulajdonságaik és a szubsztrát-preferenciájuk. A humán antiszensz oligonukleotid terápia szempontjából a leukocita enzim sokkal érdekesebb, mint az eritrocita LTA4. Az eritrocitákban nincs 5-lipoxigenáz, amely az LTA4 szintézishez szükséges, ennélfogva ezek a sejtek az aktivált neutrofilekből felszabadult LTA4~re támaszkodnak. A humán LTA4 hidroláz cDNS-szekvenciája már ismert [Fűnk és munkatársai, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84., 6677-6681 (1987); Minami és munkatársai, Journal of Biological Chemistry, 262, 1387313876 (1987)]. A 2250 nukleotidból álló mRNS 610 aminosavból álló fehérjét kódol (5. ábra), amelyben semmiféle szekvencia-hasonlóság nincsen a többi epoxid hidrolázokkal. Ennélfogva az LTA4 hidroláz antiszensz oligonukleotidokkal való gátlásának nem lesz hatása a mikroszomális epoxid hidrolázokra.
A foszfolipáz C-k (EC 3.1.4.3) az enzimek egy olyan csoportja, amely az sn-3 foszfodiészter kötést hidrolizálja a membrán foszfolipidekben, és ezáltal diacil-glicerint, valamint foszforilezett poláris vég-csoportokat hoz létre. Az emlős foszfolipáz (PCL) enzimek specificitást mutatnak a poláris vég-csoport iránt, amelyet hidrolizálnak, például foszfatidilkolin, foszfatidilinozit, stb. Újabban nagy érdeklődés nyilvánul meg azok iránt a PCL enzimek iránt, amelyek szelektíven hidrolizálják a foszfoinozitid lipideket, arra adott válaszként, hogy agonisták foglalják el a receptort. A foszfatidil-inozit-4,5-bifoszfát hidrolízise két másodlagos hírvivő molekulát hoz létre: a diacil-glicerint, amely a protein kináz C aktiválásához szükséges ko-faktor, és az inozit-1,4,5-triszfoszfátot, amely egy oldható másodlagos hírvivő molekula, és amely elősegíti az intracelluláris, nem-mitokondriális kalcium raktárak felszabadulását [Berridge, Ann. Rév. Biochem., 56, 159-193 (1987). A felszabadult diacilglicerin tovább metabolizálódhat arachidonsawá, a digliceril-lipáz és a monogliceril-lipáz egymást követő hatására. így a foszfolipáz C-k nemcsak fontos enzimek a másodlagos hírvivő molekulák előállításában, hanem fontos szerepet játszhatnak a kiválasztott szövetekben az eikozanoid bioszintézishez szükséges arachidonsav előállításában is.
Az emlős szövetek a foszfoinozitid-specifikus PLC több különböző formáját tartalmazzák [Crooke and Bennett, Cell Calcium, 10, 309-323 (1989); Rhee és munkatársai, Science, 244, 546-550 (1989)]. Azt állítják, hogy mindegyik enzim a sejtfelszíni receptorok eltérő csoportjához kötődik, azaz a PLC-α a vazopresszin receptorokhoz, a PLC-delta a növekedési faktor receptorokhoz kötődik, stb. [Aiyar és munkatársai, Biochem. J., 261, 63-70 (1989); Crooke and Bennett, Cell Calcium, 10, 309-323 (1989); Margolis és munkatársai, Cell, 57, 1101-1107 (1989); Wahl és munkatársai, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 86, 1568-1572 (1989)]. A PI-PLC enzimek heterogenitása következtében lehetséges szelektíven gátolni a gyulladást előidéző agonisták szignál transzdukciós bioszintézis útját anélkül, hogy érintenénk a nem-gyulladásos agonisták szignál-transzdukciós bioszintézis útját.
A mai napig a hat különböző PI-PLC enzim cDNS-ét klónozták. Az enzimek mérete különböző, 504 és 1250 aminosav között változik, és jelentősen eltérnek egymástól, annak ellenére, hogy a mutatott biokémiai tulajdonságaik hasonlóak. Az öt enzim közül négy (PLC-B, PLC-deltal, PLC-delta2 és PLC-α) két, körülbelül 250 aminosavból álló domént tartalmaz, amelyek 50-80 %-ban hasonlóak. A PLC-α olyan szekven ciákat tartalmaz, amelyek csak 35 %-os hasonlóságot mutatnak az első doniénhez [Crooke and Bennett, Cell Calcium, 10, 309323 (1989)]. A különböző PI-PLC enzimek DNS szekvenciáinak jelentős különbözősége lehetővé teszi, hogy csak egyetlen PI-PLC enzimet célozzunk meg az antiszensz technológiával anélkül, hogy a többi enzimet érintenénk. A humán cDNS kiónt csak a PLC-delta2-re ismertették (6. ábra) [Ohta és munkatársai, FEBS Lett., 242, 31-35 (1988)]. A többi patkány cDNS klón. A genomiális kiónt egyik PI-PLC enzimre sem írták le.
Az összes eddig vizsgált emberi szövet egy vagy több PI-PLC enzimet expresszál. Egyetlen emlős sejttípusban általában egynél több enzim létezik. A PI-PLC enzimek eloszlása szövet szelektivitást mutat. A PLC-B főleg az idegszövetben található, és az agy fő enzimei közé tartozik. A PLC-deltal az agyban és számos perifériális szövetben található. A PLC-delta2 az immunsejtekben található, míg a PLC-a úgy tűnik, hogy főleg a perifériális szövetekben található. A mai napig nem írtak le kizárólag a gyulladásos sejtekben található PI-PLC enzimet. A PI-PLC-delta2 valószínűleg egy fontos enzim az immunkompetens sejtekben [Emori és munkatársai, Journal of Biological Chemistry, 264, 21885-21890]. Ez a fehérje viszonylag bőségesen előforduló fehérje, az összes citoszol fehérjének 0,1-0,05 %-át képezi. Jelenleg nincsen hozzáférhető információ a PI-PLC enzimek, mRNS genetikai szabályozásáról, illetve a fehérje stabilitásáról.
A koenzim A-tól független transzaciláz katalizálja a és 22 szénatomos többszörösen telítetlen zsírsavak transzferét a diacil-foszfolipidekről a lizofoszfolipidekre · · t · · · · • · · · · · • 9 · · ► « · · · « · • · · · ····*··
- 34 (7. ábra). Az arachidonsav egy 20 szénatomos zsírsav, amelyben négy kettőskötés van az 5-ös, 8-as, 11-es és 14-es pozíciókban. A koenzim-A-tól független transzaciláz egy fontos enzim az arachidonsavat tartalmazó foszfolipid észterekben, amelyek prekurzorként szolgálnak a vérlemezke aktiváló faktorok és leukotriének bioszintézisében (7. ábra). A koenzim-A-tól független transzaciláz egy integrális membrán fehérje, amely a mikroszomális membránban található, látszólagos molekulatömege gélszűréses kromatográfia alapján 50-60 kDa. Az enzim egyedülálló abban, hogy az aktivitásához nem szükséges koenzim-A, eltérően a többi zsírsav transzaciláztól vagy aciltranszferáztól. Emellett, meglehetősen erős specificitást mutat mind a donor lipidfajtákra, mind az akceptor lipidfajtákra vonatkozóan. Az enzim a diacil-foszfatidilkolin fajtákat részesíti előnyben, amelyek donor lipidként 20 vagy 22 szénatomos többszörösen telítetlen zsírsavakat tartalmaznak az sn-2 pozícióban [Sugiura és munkatársai, Journal of Biological Chemistry, 262, 1199-1205 (1987)]. A foszfatidil-etanol-amin kevésbé aktív donor lipid, mint a foszfatidilkolin, és a foszfatidilinozit nem szolgál zsírsav donorként. A 20 szénatomszámnál rövidebb zsírsavak, például a palmitinsav és a linolénsav, sokkal kisebb hatékonysággal transzferálódnak. Az enzim az akceptor lizofoszfolipidek irányában is specificitást mutat. A poláris csoportként inozitot, szerint és foszfátot tartalmazó lizofoszfolipidek nem szolgálnak akceptorként a koenzim A-tól független transzacilezéshez. Az 1-O-alkil-lizofoszfatidil-kolin az előnyben részesített akceptor lipid az 1-alkenil-lizofosz• · · *· » » · · · « * · · · « · ·« ·· »·» ·««·
- 35 fatidil-kolin, 1-acil-lizofoszfatidil-kolin, az 1-alkenil-lizofoszfatidil-etanol-amin, az 1-alkil-lizofoszfatidil-etanol-amin és az l-acil-lizofoszfatidil-etanol-amin esetében, és akceptor lipidként mindegyik körülbelül 50 %-át mutatja az 1-alkil-lizofoszfatidil-kolinnak.
Egy állatot, amelyről feltételezhető, hogy olyan betegségben szenved, amely az 5-lipoxigenáz, az 5-lipoxigenáz aktiváló fehérje, az SF-PLA2, a PI-PLC-delta2, a leukotrién A4 hidroláz és a koenzim A-tól független transzaciláz szintjének csökkentésével befolyásolható, oly módon kezelünk, hogy egy a találmány szerinti oligonukleotidot adagolunk neki. A szakterületen jártas szakember számára az optimális dózis, az adagolás módszere és az ismétlések száma könnyen meghatározható. Az ilyen kezelést általában addig végezzük, ameddig a gyógyulást el nem érjük, vagy a kóros állapot enyhülését nem észleljük. Néhány betegség esetében hosszú időtartamú kezelés szükséges.
A találmányban oligonukleotidokat és oligonukleotid analógokat használunk az arachidonsav metabolizmusának befolyásolására képes fehérjéknek megfelelő RNS vagy DNS működésének antiszensz módszerrel való gátlására. Leírásunkban az oligonukleotid kifejezésen olyan polinukleotidot értünk, amely a természetben előforduló bázisokból és ciklofuranozil-csoportokból keletkezik, amelyeket természetes foszfodiészter kötés tart össze. Ez a kifejezés jól megfelel a természetben előforduló, illetve olyan szintetikus vegyületeknek, amelyek a természetben előforduló alegységekből vagy közeli homológjaikból épülnek fel.
• «· ·« 4*· ♦ · e «*· » 9 · ·» ♦ · · · « · *· · · ··»··» * Az oligonukleotid analóg kifejezésen olyan egységeket értünk, amelyek az oligonukleotidokhoz hasonlóan működnek, de amelyeknek a természetben elő nem forduló, nem közeli homológ részei is vannak. így az oligonukleotid analógok tartalmazhatnak megváltoztatott cukorcsoportokat vagy cukrokat összekapcsoló kötéseket. Ilyenek példáuk a foszforotioát és egyéb kéntartalmú kötésfajták, amelyek alkalmazása ismert a szakterületen. Néhány előnyös megvalósítási mód szerint az oligonukleotidnak legalább néhány foszfodiészter kötését olyan struktúrával helyettesítjük, amely úgy működik, hogy növeli a készítménynek azt a tulajdonságát, hogy a sejtnek abba a részébe hatoljon be, ahol a befolyásolandó aktivitású RNS vagy DNS található. Az az előnyös, ha az ilyen helyettesítések foszforotioát, metil-foszforotioát kötéseket, vagy rövid szénláncú alkil vagy cikloalkil struktúrákat tartalmaznak. Egyéb előnyös megvalósítási módok szerint a foszfodiészter kötéseket más struktúrákkal helyettesítjük, amelyek egyszerre rendelkeznek azzal a tulajdonsággal, hogy nem-ionosak és nem királisak. A szakterületen jártas szakember képes egyéb, a találmány szerinti eljárás végrehajtásához szükséges kötések kigondolására.
Az oligonukleotid analógok közé tartalmazhatnak olyan vegyületek, amelyekben legalább néhány módosított bázis található. így például a természetben előforduló purinoktól és pirimidinektől eltérő purinok és pirimidinek is használhatók. Hasonlóképpen, a nukleotid alegységek ciklofuranozil alegységén végzett módosítások is lehetségesek, mindaddig, amíg a találmány lényegéhez tartoznak.
* · · · Β t · · · · <· * » ··« ·»»·
Az ilyen analógokat legjobban úgy lehet leírni, hogy funkcionálisan felcserélhatők a természetes oligonukleotidokkal (illetve a természetes oligonukleotidok alapján szintetizált oligonukleotidokkal), de amelyek egy vagy több helyen eltérnek a természetes szerkezettől. A találmány az összes ilyen analógra vonatkozik, mindaddig, amíg hatékonyan hibridizálódnak annak a génnek az RNS-éhez vagy DNS-éhez, amely az arachidonsav metabolizmust befolyásolni képes fehérjét kódolja. A találmány szerinti oligonukleotid és oligonukleotid analógok előnyösen 3-50 alegységet tartalmaznak. Az ilyen oligonukleotidok és oligonukleotid analógok még előnyösebben 8-25 alegységet, legelőnyösebben 12-22 alegységet tartalmaznak. Az nyilvánvaló, hogy az alegységet úgy definiáljuk, hogy az egy cukor-bázis kombináció, amely megfelelő módon kötődik a szomszédos alegységekhez foszfodiészter vagy egyéb kötéseken keresztül.
A találmány szerinti oligonukleotidokat és oligonukleotid analógokat az ismert szilárd fázisú szintézis módszerrel egyszerűen állíthatjuk elő. Az ilyen szintézishez szükséges berendezéseket számos cég árul, például az Applied Biosystems is. A szintézishez bármely egyéb módszer is használható, az oligonukleotidok aktuális szintézise a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló.
Az is közismert, hogy hasonló technikák használhatók más oligonukleotid analógok, például a foszforotioátok és alkilezett származékok előállítására.
A szakterületen jártas szakember számára érthető, hogy a találmány értelmében a hírvivő RNS-eket annak a DNS·· · • · · · · • * · · » ·
- 38 nek a nyitott leolvasási kerete (ORF) alapján azonosítjuk, amelyről átíródnak, és ezek a mRNS-ek nemcsak a DNS ORF információt tartalmazzák, hanem a kapcsolódó ribonukleotidokat is, amelyek a szakember számára ismert régiókat képeznek, ilyen például az 5’ nem-transzlálódó régió, a 3' nemtranszlálódó régió és az exon/intron kapcsolódásnál levő ribonukleotidok. Tehát az oligonukleotidokat és oligonukleotid analógokat a találmány értelmében úgy lehet megtervezni, hogy részben vagy teljesen ezekhez a kapcsolódó ribonukleotidokhoz, illetve az információhordozó ribonukleotidokhoz kötődjenek. Az előnyös megvalósítási módokban az oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg specifikusan hibridizálódik egy transzkripciós iniciációs helyhez, egy transzlációs iniciációs helyhez, illetve egy exon/intron illeszkedéshez. Legelőnyösebb, ha az oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg specifikusan az 5' cap hellyel közvetlenül szomszédos szekvenciákhoz hibridizálódik.
A találmány szerint az oligonukleotid specifikusan hibridizálódik egy olyan fehérjét kódoló nukleinsavhoz, amely fehérje az arachidonsav metabolizmusát befolyásolja. Az előnyös megvalósítási módokban az említett fehérjék lehetnek az 5-lipoxigenáz, az 5-lipoxigenázt aktiváló fehérje, a foszfolipáz A2, az LTA4 hidroláz, a foszfolipáz C, és a koenzim A-tól független transzaciláz. A megfelelő szekvenciát tartalmazó oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok, illetve ezek részei, hasznosak a találmány szempontjából. Például a 3. ábrán egy humán 5-lipoxigenáz mRNS szekvenciát mutatunk be; a 4. ábrán egy humán ízületi folyadék39 bán található PLA2 mRNS szekvencia látható; az 5. ábrán egy humán 5-lipoxigenáz aktiváló fehérje szekvenciája látható; a
6. ábrán egy humán LTA4 hidroláz mRNS szekvenciája látható;
a 7. ábrán egy humán foszfoinozitid-specifikus foszfolipáz C mRNS szekvenciája látható. A találmányban használt oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok ezeket a szekvenciákat vagy egyes részüket tartalmazzák. Tehát előnyös ha ezen szekvenciák közül bármelyiket (vagy ezeknek az analógjait) használjuk, a fentiekben leírtak szerint, illetve bármely hasonló nukleotidot használunk, amelyet a szakterületen jártas szakember a kiválasztott antiszensz cél alapján meg tud tervezni, az arachidonsav szintézisének vagy befolyásolásának céljából.
A találmány számos előnyös megvalósítási módját ismertetjük az alábbi példákban. A módosításhoz kiválasztott cél mRNS az 5-lipoxigenáz mRNS-e. A szakterületen jártas szakember számára azonban nyilvánvaló, hogy a találmány nem ennyire korlátozott, hanem általánosan alkalmazható. Az 5lipoxigenáz enzim termelődésének gátlása vagy befolyásolása várhatóan jelentős terápiás előnyt jelent a kóros állapot kezelésében. A készítmények hatékonyságának megbecsléséhez sorozat-vizsgálatra van szükség.
1. példa
Az 5-lipoxigenáz celluláris vizsgálatához a humán HL-60 promielocitikus leukémia sejtvonalat használjuk. Ezek a sejtek különböző ismert anyagokkal indukálhatok, hogy monocita-szerű sejtekké vagy neutrofil-szerű sejtekké diffe40 renciálódjanak. közismert, hogy a sejtek 1,3 % dimetilszulfoxiddal (DMSO) végzett kezelése a sejteknek neutrofilekké való differenciálódását segíti elő. Úgy találtuk, hogy a bazális HL-60 sejtek 5-lipoxigenáz fehérjét szintetizálnak, illetve leukotriéneket szekretálnak (amely az 5-lipoxigenáz terméke) a kimutatási módszerek legnagyobb érzékenységi szintjén kimutatható mennyiségben. A sejtek DMSO-val indukált differenciálódása az 5-lipoxigenáz fehérje és a leukotrién bioszintézis megjelenését okozza a DMSO hozzáadása után 48 órával. Az 5-lipoxigenáz mRNS és a leukotrién B4 kalcium-ionofórral serkentett HL-60 sejtekből való felszabadulásának indukciós kinetikája látható a 8. ábrán. A sejtek differenciálódását 1,25-dihidroxi-D3 vitaminnal is előidézhetjük, és ennek eredménye egy 8-10-szeres növekedés a 5-lipoxigenáz enzimaktivitásban, az 1,25-dihidroxi-D3 vitamin hozzáadása után legalább 24 órával. Tehát az 5-lipoxigenáz fehérje szintézisének indukciója tesztrendszerként használható az antiszensz oligonukleotidok analizálására, amelyek ezekben a sejtekben kölcsönhatásba lépnek az 5-lipoxigenáz szintézissel.
Az 5-lipoxigenáz bioszintézis gátlásának egyik hatása a felszabadult leukotrién mennyiségének csökkenése a serkentett sejtekből. A DMSO-val differenciálódásra bírt HL-60 sejtek az A23187 kalcium-ionofórral való serkentés hatására leukotrién B4~et bocsátanak ki. A sejt tápközegébe kibocsátott leukotrién B4 mennyiségét radioimmun-vizsgálattal lehet meghatározni, kereskedelmi forgalomban levő diagnosztikai kitekkel (New England Nuclear, Boston, MA). A leukotrién B4 termelődését a HL-60 sejtekben a DMSO hozzáadása után 48 órával lehet kimutatni, aminek célja az, hogy a sejtek neutrofil-szerű sejtekké differenciálódjanak. A sejteket (2 x 105 sejt/ml) növekvő koncentrációjú antiszensz oligonukleotidokkel kezeljük 48-72 óra hosszat 1,3 % DMSO jelenlétében. A sejteket mossuk, majd 5 x 106 sejt/ml mennyiségben szuszpendáljuk Dulbecco féle foszfáttal pufferolt sóoldatban, amely 1 % lipidmentesitett szarvasmarha szérum albumint tartalmaz. A sejteket 10 μπιοί/ΐ A23187 kalcium-ionoforral serkentjük 15 percig, majd az 5 x 105 sejtből keletkező leukotrién B4 mennyiségét radioimmun-vizsgálattal határozzuk meg, a gyártó előírásai szerint.
2. példa
Az antiszensz oligonukleotidok második tesztrendszere azt a tényt használja ki, hogy az 5-lipoxigenáz egy •‘önpusztító” enzim, amely a szubsztráttal való reakció során inaktiválja saját magát. Az 5-lipoxigenázt expresszáló differenciálódott HL-60 vagy egyéb sejteket 10 μιηοΐ/ΐ A23187 kalcium-ionoforral kezelve elősegítjük az 5-lipoxigenáz transzlokációját a citoszolból a membránba, az enzim ezt követő inaktiválódásával együtt. Az aktiválást, és több katalitikus lépést követően az enzim katalitikusán inaktív lesz. Tehát, ha a sejteket kalcium-ionoforral kezeljük, akkor ez inaktiválja az endogén 5-lipoxigenázt. A sejteknek körülbelül 24 órára van szükségük, hogy magukhoz térjenek az A23187 kezelésből, ami a leukotrién B4 szintetizáló képességük alapján mérhető.
Az előzetes adatok azt mutatják, hogy az antiszensz oligonukleotidok kifejtik hatásukat ebben a modellrendszerben (9. ábra). A HL-60 sejteket 72 óra hosszat DMSO-val végzett kezeléssel differenciálódásra bírjuk, 10 μπιο1/1 A23187tel kezeljük, majd háromszor mossuk foszfáttal puffereit sóoldatban az ionofór eltávolítása céljából. A sejteket (1 x 106 sejt/ml) RPMI-1640 táptalajban szuszpendáljuk, amely 10 % borjúmagzat szérumot tartalmaz, és az oligonukleotidokat 25 μιηοΐ/ΐ vagy 75 μιηοΐ/l koncentrációban adjuk hozzá. Az alábbi oligonukleotidokat használjuk (N jelentése foszfodiészter kötés, S jelentése foszforotioát kötés):
2N és 2S: 5 ’-ACGGTGACCGTGTAGGAGGGCATGGCGCGG-3 '
8N és 8S: 5'-AATGGTGAATCTCACGTGTGCCACCAGCAG-3'
2IN és 2IS: 5'-AGGTGTCCGCATCTA-3'
22N és 22S: 5'-TCGGCGCGGCGGTCCAGGTGTCCGCATCTA-3'
Az eredmények azt mutatják, hogy a foszfodiészter oligonukleotidok nem aktívak a vizsgálatban, míg az analóg foszforotioát oligonukleotid különböző mértékű aktivitást mutat (9. ábra). A legaktívabb oligonukleotid a 8S, a H intron intron/exon kapcsolódási helyének 3' oldalára irányul.
3. példa
Az antiszensz oligonukleotidoknak az érintetlen sejtekre kifejtett legközvetlenebb, könnyen mérhető hatása az 5-lipoxigenáz fehérjeszintézis specifikus gátlása. Ennek a technikának a kivitelezéséhez a sejteket 35S-metioninnal jelezzük (50 μ<2ΐ/ιη1) 2 óra hosszat 37 °C-on, hogy újonnan szintetizált jelzett fehérjéket kapjunk. A sejteket feltár juk az össz-sejtfehérje oldatba vitele céljából, majd az 5lipoxigenázt 5-lipoxigenáz-antitesttel immunológiailag kicsapjuk. Az immunkomplexeket protein A Sepharose gyöngyökkel kötjük meg. Az immunológiailag kicsapott fehérjéket SDS poli(akril-amid) gélelektroforézissel elválasztjuk, majd autoradiográfiásan exponáljuk. Az immunológiailag kicsapott 5lipoxigenáz mennyiségét pásztázó denzitometriával határozzuk meg.
Ezeknek a kísérleteknek egy előre várható eredménye a következő: a kontroll sejtekből kicsapott 5-lipoxigenáz fehérje mennyiségét 100 %-nak vesszük. Ha a sejteket 48 óra hosszat 1 gmol/l, 10 μιηοΐ/ΐ és 30 μπιοί/ΐ hatásos antiszensz oligonukleotiddal kezeljük, akkor ez az immunológiailag kicsapott 5-LO mennyiségét az immunológiailag kicsapott kontroll 5, 25 illetve 75 %-ára csökkenti.
4. példa
Az 5-lipoxigenáz enzim aktivitásának mérése a sejthomogenizátumokban szintén hasznos a jelenlevő, leukotriének szintézisére képes enzim mennyiségének meghatározására. Egy radiometrikus vizsgálati módszert fejlesztettünk ki a sejthomogenizátumokban levő 5-lipoxigenáz enzimaktivitás mérésére fordított fázisú HPLC alkalmazásával. A sejteket ultrahangos besugárzással olyan pufferben zúzzuk össze, amely proteáz-inhibítorokat és EGTA-t tartalmaz. A sejthomogenizátumot 8000 g-vel centrifugáljuk 15 percig, majd a felülúszóban vizsgáljuk az 5-lipoxigenáz aktivitást. A citoszol fehérjéket 10 μιηοΐ/ΐ 14C-vel jelzett arachidonsav, 2 mmol/1 » *
ΑΤΡ, 50 μιηοΐ/l szabad kalcium és 50 mmol/1 bisz-Trisz puffer (pH=7,0) összetételű oldatban inkubáljuk 10 percig 37 °C-on. A reakciót azonos térfogatú aceton hozzáadásával állítjuk le, majd a zsírsavakat etil-acetáttal extraháljuk. A szubsztrátot és a reakciótermékeket fordított fázisú HPLCvel választjuk el Novapak C18 oszlopon (Waters Inc., Millford, MA). A radioaktív csúcsokat radio-kromatográfiás detektorral mutatjuk ki (Beckman modell 171). A di-HETE-re, 5-HPETE-re és 5-HETE-re átalakult arachidonsav mennyiségét használjuk az 5-lipoxigenáz aktivitás mértékeként.
Az előzetes adatok, amelyekben az enzimaktivitás mértékét használjuk az antiszensz oligonukleotidok 5-lipoxigenáz-expresszióra gyakorolt hatásának kimutatására, a 10. ábrán láthatók. Egy patkány bazofil leukémiás sejtvonalat, a RBL-l-et használjuk a vizsgálatban, amely nagy mennyiségben expresszálja az 5-lipoxigenáz aktivitást bazális körülmények között. A sejteket 48 óra hosszat 50 ^mol/l oligonukleotiddal vagy 24 óra hosszat 50 μπιοί/ΐ oligonukleotiddal kezeljük, és további 24 óra hosszat inkubáljuk. A sejteket kinyerjük, majd az 5-lipoxigenáz enzimaktivitás mennyiségét meghatározzuk, 10 μg, az 5000 g-vel végzett centrifugálással kapott felülúszóból származó fehérjének a felhasználásával. A használt oligonukleotidok foszforotioát kötéseket tartalmaznak, szekvenciájuk az alábbi:
r5L0-lS: 5'-AGGCATGGCTCTGGGAAGTG-3'
H5L0-27S: 5'-CGACTCCGTGCTGGCTCTGA-3'
Az r5LO-lS oligonukleotid megfelel azoknak a szekvenciáknak, amelyek a patkány 5-lipoxigenáz mRNS AUG transz lációs iniciációs kodonjához hibridizálnak, míg a H5LO-27S egy kontroll oligonukleotid, olyan random szekvenciával rendelkezik, amely nem hibridizál semmilyen ismert celluláris RNS-hez. Az eredmények azt mutatják, hogy mindegyik kezelési körülmény mellett az 5-lipoxigenázra specifikus antiszensz oligonukleotid az enzim aktivitását 48, illetve 56 %-kal csökkenti. A H27S kontroll oligonukleotid nem csökkenti jelentősen az 5-lipoxigenáz aktivitást, ha egyetlen dózisban adjuk, illetve 17 %-kal, ha kétszeres dózisban adjuk (10. ábra).
5. példa
Az antiszensz oligonukleotidokat arra nézve is vizsgáljuk, hogy képesek-e gátolni az 5-lipoxigenáz aktivitást 1,25-dihidroxi-D3-vitaminnal differenciálódásra bírt HL-60 sejtekben. Az oligonukleotid kezeléshez a sejteket háromszor mossuk szérummentes táptalajban (Opti-MEM), majd 4xl06 sejt/ml koncentrációban szuszpendáljuk. A sejtszuszpenzióból 5 ml-t 25 cm2-es szövettenyésztő lombikba teszünk minden egyes oligonukleotid kezeléshez. Az egyes lombikokhoz 32 jumol/l kereskedelmi forgalomban levő DOTMA-t adunk az oligonukleotid felvétel javítására, valamint 1-1 μιηοΐ/l-t az egyes antiszensz oligonukleotidokból. A sejteket 4 óra hosszat inkubáljuk a DOTMA és az oligonukleotid jelenlétében 37 °C-on, majd centrifugáljuk (400xg, 10 perc), a sejtek kiülepítésére. A sejtüledékeket újra szuszpendáljuk 10 ml RPMI 1640 táptalajban, amely 10 % borjúembrió szérumot, 100 Mmol/l oligonukleotidot és 0,1 gmol/l 1,25-dihidroxi-D3-vi • ♦
- 46 tamint tartalmaz. A 84 óráig tartó differenciálódást követően az 5-lipoxigenáz aktivitást a 4. példában leírtak alapján határozzuk meg, 100 Mg sejthomogenizátum felhasználásával.
Az ebben a sorozatban használt antiszensz oligonukleotidok foszforotioát oligonukleotidok, amelyeknek szekvenciája az alábbi:
5’ISIS 1820 CGGTCCAGGTGTCCGCATCT
- az 5' lezáró szekvenISIS 1821 CATGGCGCGGGCCGCGGG
ISIS 1822 GACCGTGTAGGAGGGCAT
Az ISIS 1820, ISIS 1821
5-lipoxigenáz aktivitást (60,9, ciákhoz hibridizál,
- az AUG kodonhoz hibridizál,
- az AUG kodonhoz hibridizál.
és ISIS 1822 csökkenti az
67,9 illetve 58,8 százalékkai), az oligonukleotiddal nem kezelt sejtekhez viszonyítva (11. ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy az antiszensz oligonukleotidok jól használhatók az 5-lipoxigenáz expresz szió gátlására humán sejtvonalban.
6. példa
Az antiszensz oligonukleotidok patkány sejtekben is hatásosan gátolják az 5-lipoxigenáz expressziót. A patkány bazofil leukémia sejtek (RBL-1) konstitutív módon hússzor annyi 5-lipoxigenáz aktivitást expresszálnak, mint a differenciálódott HL-60 sejtek. Az RBL-1 sejteket 1 gmol/l oligonukleotiddal kezeljük 16 μπιοί/ΐ DOTMA jelenlétében 4 óra hosszat, szérummentes táptalajban. A sejteket ezután 5 μπιοί/ΐ oligonukleotiddal inkubáljuk borjúembrió szérumot tartalmazó DMEM táptalajban. Az 5-lipoxigenáz felezési ideje körülbelül 24 óra, ezért a sejteket 5 napig kezeljük az oligonukleotiddal. 5 nap elteltével a sejteket ultrahangos besugárzással feltárjuk, és a sejtlizátumokban található 5-lipoxigenáz aktivitást a 4. példában leírtak alapján meghatározzuk.
Az ISIS 2177, ISIS 1827 és ISIS 1831 oligonukleotidok mind 35 %-kal csökkentik az 5-lipoxigenáz aktivitás (12. ábra). Mindegyik oligonukleotid foszforotioát kötéseket tartalmaz, és szekvenciájuk az alábbi:
5'-.................3’
ISIS 2177 AAGGCATGGCTCTGGGAAGTG - az AUG kodonhoz
(1. sz. szekvencia) hibridizál,
ISIS 1827 ACATGGGCTA CCAGCAGCTGGGTGG - az intron/exon
(2. sz. szekvencia) kapcsolódáshoz hibridizál,
ISIS 1831 TTGACTCTGTCACTCAAGAG - az exon/intrcn
(3. sz. szekvencia) kapcsolódáshoz hibridizál.
7. példa
Az antiszensz oligonukleotid inhibíciós reakciók egy másik kísérletsorozata azt bizonyítja, hogy az mRNS specifikus régiói sokkal érzékenyebbek az antiszensz oligonukleotidokkal való gátlásra. RBL-1 sejteket kezeltünk oligonukleotidokkal a 6. példában leírtak alapján, és a sejteknek vizsgáltuk az 5-lipoxigenáz aktivitását, 5 nappal az oligonukle» ·
otid kezelés után. A sejteket ISIS 2817, ISIS 2821 és ISIS 2822 oligonukleotidokkal kezeltük, de csak az ISIS 2821 oligonukleotid hibridizálódott a 3' nem-transzlálódó szekvenciákhoz, és gátolta az 5-lipoxigenáz aktivitást (13. ábra). Mindegyik oligonukleotid foszforotioát oligonukleotid volt, szekvenciájuk pedig az alábbi:
5'ISIS 2817 GGAAGGCATGGCTCTGGGAA
- az AUG kodonhoz (4. sz. szekvencia) hibridizál
ISIS 2821 GCCTGCCCAGAGAGCTGCTG
- a 3’ nem transzlálódó (5. sz. szekvencia) régióhoz hibridizál
ISIS 2822 GGAAGATCTACAGCCTGCCA
- a 3' nem transzlálódó (6. sz. szekvencia) régióhoz hibridizál
8. példa
Az 5-lipoxigenáz termelődésének gátlását egérben a következő eljárással lehet igazolni. Az arachidonsav topikális alkalmazásának eredménye a leukotrién B4, a leukotrién C4 és a prosztaglandin E2 gyors termelődése a bőrben, amit ödéma és sejtes beszűrődés követ. Az 5-lipoxigenáz bizonyos inhibitorairól kimutattuk, hogy ebben a vizsgálatban aktivitást mutatnak. A vizsgálathoz 2 mg arachidonsavat viszünk egy egér fülére, és kontrollként a másik fület vizsgáljuk. A polimorfonukleáris sejt beszűrődés mieloperoxidáz aktivitását vizsgáljuk az arachidonsav adagolása után 1 órával vett biopsziából készült homogenizátumban. Az ödémás választ úgy értékeljük mennyiségileg, hogy mérjük egy lukasztó biopsziában a fül vastagságát és nedves tömegét. A biopszia-minták • ·
- 49 bán termelődő leukotrién B4 mennyiségének mérését az 5-lipoxigenáz szövetbeli aktivitásának közvetlen mérésével végezzük. Az antiszensz oligonukleotidokat topikálisan alkalmazzuk mindkét fülre az arachidonsav adagolása előtt 12 vagy 24 órával, hogy lehetővé tegyük a vegyületek optimális aktivitásának megnyilvánulását.
9. példa
Az 5-lipoxigenáz expressziójának gátlását vizsgáltuk az allergiás és gyulladásos rendellenességek, valamint trauma kezelésére.
A találmány oltalmi körébe tartozó jellemző molekulákat az alábbiakban írjuk le. Az ebben a példában ismertetett első három molekula előnyösen kötődik az 5-lipoxigenáz mRNS-hez. Egy negyedik molekula az 5-lipoxigenáz génhez kötődik, és ezzel egy háromszálas szerkezetet hoz létre, ami befolyásolja az 5-lipoxigenáz génről keletkező mRNS mennyiségét.
1) Az első jellemző molekulában a nukleotid szekvencia komplementer az 5-lipoxigenáz mRNS-nek azzal a részével, amely az iniciációs kodonnál kezdődik és belenyúlik a leolvasási keretbe, az 5-lipoxigenáz mRNS-nek összesen 15 ribonukleotidjához hibridizálódik:
MetProSer
51 -.CGCCATGCCCTCCTACACGGTCACCGTGGCCACT.... 3'
3'-TACGGGAGGATGTGC-5'
2) A második jellemző molekula komplementer azzal a
egybefüggő oligonukleotiddal, amelyek megelőzik az 5-li- poxigenáz mRNS transzlációs terminációs szignálját.
SerValAlalle
5'-...CCGAACAGTGTGGCCATCTGAGCACAC...-3'
3'-TCACACCGGTAG-5’
3) A harmadik jellemző molekula komplementer az
5-lipoxigenáz mRNS 5* végéhez közeli 30 egybefüggő ribonukleotiddal, és tartalmazza az első jellemző, 5-lipoxigenáz elleni szekvenciát:
5'-..CCCCGGCCCGCGCCATGCCCTCCTACACGGT....-3'
3'-GGGGCCGGGCGCGGTACGGGAGGATGTGCCA...-5'
4) A negyedik jellemző molekula az 5-lipoxigenáz génhez kötődik és egy háromszálas szerkezetet hoz létre, amely befolyásolja a gén expresszióját.
5'-GGGCGGGGGCGGGGGCGGGGGCGGGGGCGGGGGCAGCCGGGAGCCTGGA-3' 3'-CCCGCCCCCGCCCCCGCCCCCGCCCCCGCCCCCGTCGGCCCTCGGACCT-5'
PYYYYYPYYYYYPYYYYYPYYYYYPYYPP
Ahol több specifikus megvalósítási módot írtunk le, ott a jelen találmányt csak az alábbiakban megadott igénypontok korlátozzák.
10. példa
Számos PLA2 izoenzim létezik, amelyek emlős sejtekben expresszálódnak. Mielőtt az antiszensz oligonukleotidokat vizsgáltuk az ízületi folyadékban található PLA2 gátlása szempontjából, szükséges volt azokat a humán sejt* *· • · * ·*·· vonalakat azonosítani, amelyek a megfelelő izoenzimeket expresszálják. Több mint húsz humán sejtvonalat vizsgáltunk át az SF-PLA2 jelenléte szempontjából Northern biot elemzéssel és polimeráz láncreakcióval. Két olyan sejtvonalat azonosítottunk, amelyek expresszálják az SF-PLA2~t, az A431 sejteket és a primer humán keratinocitákat. Amint az az SF-PLA2 cDNS szekvenciájából előre megmondható (4. ábra), mindkét sejtvonal PLA2~t választ ki a táptalajba. A PLA2 enzim aktivitása mérhető az Escherichia coli módszerrel vagy az 1-palmitoil-2-14C-arachidonil-foszfatidil-etanol-aminnal, a 11. példában leírtak alapján. A kiválasztott enzim pH optimuma, kalcium-igénye és szubsztrát-specifitása ugyanaz, mint amit az SF-PLA2~re ismertettek [Kramer és munkatársai, Journal of Biological Chemistry, 264, 5768-5775].
A szövetten^észet felülúszójának fordított fázisú HPLC-vel való elemzése azt mutatta, hogy az A431 sejtekből csak egyetlen PLA2 izoenzim válassztódik ki. A sejttenyészet felülúszóját centrifugálással tisztítjuk (14000xg, 10 perc). A tisztított felülúszót (2 ml) C4 szilikáthordozós oszlopra visszük fel, amelyet 0,1 %-os TFA-val hoztunk egyensúlyba. A fehérjét 60 ml lineáris (0 %-tól 100 %-ig) acetonitril-gradienssel eluáljuk, 1 ml/perc áramlási sebesség mellett. A frakciókat összegyűjtjük (1 ml-es) és vizsgáljuk a PLA2 aktivitásukat, a 11. példában leírtak alapján. Az eredmények azt mutatják, hogy csak egy PLA2 enzim választódik ki az A431 sejtekből (14. ábra). Tehát a vizsgálat, amely alkalmas arra, hogy vizsgáljuk az SF-PLA2 szintézis oligonukleotid gátlását, a következő: az A431 sejteket egybefüggésig nö***** « • · 9 ·· · • · V · Μ
·..·%.·
- 52 vesztjük 24 lyukas lemezeken 1 /xmol/l oligonukleotid és 40 /xmol/1 DOTMA jelenlétében hat óra hosszat szérummentes táptalajban. A táptalajt DMEM táptalajra cseréljük, amely 1 mg/ml szarvasmarha szérumalbumint és 10 μπιοί/ΐ oligonukleotidot tartalmaz. A szövettenyésztő táptalajba kiválasztódott PLA2 mennyiségét, 24 órával azután, hogy az 1 mg/ml BSA-t tartalmazó DMEM-et hozzáadtuk, a 11. példában leírtak alapján határozzuk meg.
Igazoltuk, hogy a gamma-interferon igen, de az interleukin-lB, a tumor nekrózis faktor-α vagy a forskolin és izobutil-metilxantin nem növelte az SF-PLA2 szekrécióját a táptalajba (15. ábra). Ez alátámasztja azt a megfigyelésünket, hogy a gamma-interferon megnöveli a PLA2 szintézist, ha egy interferon szabályozó elem jelen van az SF-PLA2 gén 5'-nem-átíródó régiójában. Az antiszensz oligonukleotidok tehát használhatók a PLA2 ganma-interferonnal kezelt humán keratinocitákból való felszabadulásának gátlására. A 24 lyukas lemezeken növekedő sejteket 1 μιηοΐ/ΐ antiszensz oligonukleotiddal és 32 μιηοΐ/l DOTMA-val kezeljük 4 óra hosszat szérummentes táptalajon. A szérummentes táptalajon végzett négyórás kezelést követően a táptalajt KGM-re cseréljük (Clonetics, San Diego, CA) , 5 μιηοΐ/ΐ oligonukleotidot adunk hozzá, és további 3 óra hosszat inkubáljuk. A gamma-interferont hozzáadjuk a sejtekhez (300 egység/ml), majd a sejtekből szekretálódó PLA2 enzimaktivitás mennyiségét a gamma-interferon hozzáadása után 24 órával határozzuk meg.
Az a tény, hogy az SF-PLA2 szekrécióját ki lehetett mutatni humán epidermális karcinóma sejtvonalból (A431 sej• · · t
- 53 tek), valamint primer humán epidermális keratinocitákból, arra utal, hogy azok az antiszensz oligonukleotidok, amelyek gátolják az SF-PLA2 expresszióját, hasznosak lehetnek a bőr gyulladásos rendellenességeinek kezelésében. Emellett az is kiderült, hogy a gamma-interferon indukálja a PLA2 felszabadulását humán keratinocitákból, valószínűleg oly módon, hogy részlegesen befolyásolja a gamma-interferon gyulladásos aktivitását a bőrben.
Az alábbi oligonukleotidok és oligonukleotid analógok lehetnek hasznosak az SF-PLA2 expresszió gátlásában:
5'-..................-3 '
TTCATGGTAAGAGTTCTTGGG (7- SZ . szekvencia)
TCTGCCCCGGCCGTCGCTCCC (8. sz. szekvencia)
CAAAGATCATGATCACTGCCA (9- sz. szekvencia)
TCCCATGGGCCTGCAGTAGGC (10. sz. szekvencia)
CCTGCAGTAGGCCTGGAAGGA (ii. sz. szekvencia)
GGAAGGTTTCCAGGGAAGAGG (12. sz. szekvencia)
CAGAGGACTCCAGAGTTGTAT (13. •sz. szekvencia)
GGGTGGGTATAGAAGGGCTCC (14· sz. szekvencia)
11. példa
A PLA2 enzimaktivitás in vitro biokémiai vizsgálatait viszonylag könnyen végre lehet hajtani, és nagyszámú vizsgálat elvégzéséhez sorozatvizsgálattá lehet fejleszteni. A legáltalánosabb vizsgálatokkal a radioaktívan jelzett zsírsavak felszabadulását mérik l4C-vel jelzett Escherichia coli-ból [Franson és munkatársai, J. Lipid Rés., 19, 18-23 (1978)] vagy tiszta foszfolipid szubsztrátumokból [Bennett és munkatársai, Biochem. Pharm. , 36, 733-740 (1987)]. A PLA2 celluláris vizsgálatával zsírsavaknak olyan sejtekből való felszabadulását mérjük, amelyeket radioaktívan előre jeleztünk arachidonsawal. Egy másik módszer szerint, azokban a sejtrendszerekben, amelyek PlJVj-t választanak ki az extracelluláris táptalajba, a PLA2~t a táptalaj közvetlen enzimvizsgálatával ki lehet mutatni, az előzőekben leírt módon. Kimutattuk a humán ízületi folyadék PLA2 expresszióját (humán SF-PLA2) az A431 humán epidermális karcinóma sejtvonalban.
Egy olyan kísérlet eredményeit írjuk le az alábbiakban, melyben A431 sejteket kezeltünk antiszensz oligonukleotidokkal. Az A431 sejteket 100 mm-es Petri-csészékben szélesztettük, és hagytuk, hogy a növekedés során összenőjenek. A sejteket 36 órán át 37 °C-on 1, 10 és 50 μπιοί/ΐ antiszensz oligonukleotiddal kezeltük, amely az
5’GGTCTTCATGGTAAGAGTTCTTGG-3' szekvenciát tartalmazza. A foszfolipáz A2 enzimaktivitást nyers sejthomogenizátumban mértük az arachidonsav l-acil-2-[l-14C]-arachidonil-foszfatidiletanolaminból (a végkoncentráció 25 μιηοΐ/ΐ 1 mg/ml dezoxikolátban) történő felszabadulásával. Az antiszensz oligonukleotid a foszfolipáz A2 enzimaktivitását a kontroll 3, 60, illetve 95 %-ára csökkentette 1 μπιοί/ΐ, 10 μιηοΐ/ΐ, illetve 50 μπιοί/ΐ hatóanyaggal való kezelés után.
12. példa
PLA2 in vivő mérésére még nem dolgoztak ki vizsgá • · · ·
- 55 latokat. Az egyik legjobban elterjedőben levő, a PLA2 inhibitorok átvizsgálására végzett vizsgálatban tisztított PLA2 -t közvetlenül beleinjekciózunk patkánymancsba. A keletkező ödémát értékeljük a PLA2 aktivitás mértékeként. Ez a vizsgálat alkalmatlannak bizonyulhat az antiszensz vizsgálatokhoz. Más, a PLA2 szintézisét gátló antiszensz oligonukleotidok azonosítására esetleg alkalmasnak bizonyuló módszer lehet például a glikogénnel indukált aszcitesz nyulakban, a kazeinnel indukált peritonítisz patkányokban, valamint a Gram-negatív szeptikus sokk nyulakban. Mindegyik modellrendszerben a PLA2 szintje növekedését lehetett kimutatni.
13. példa
Az 5-lipoxigenáz aktiváló fehérjét közvetlenül lehet mérni, mennyiségileg meghatározva az immunoreaktív fehérjéket, ELISA módszert alkalmazva. Az Escherichia coli-ban expresszált FLAP elleni antitesteket használhatjuk a vizsgálathoz. Az Escherichia coli-ban expresszált FLAP-ot standardként is használhatjuk a vizsgálat mennyiségi beállításához. A vizsgálathoz a HL-60 sejteket 24-72 óra hosszat kezeljük antiszensz oligonukleotidokkal. A sejteket ultrahangos kezeléssel tárjuk fel, majd 15 percig 5000 g-vel centrifugáljuk. A felülúszó frakciót 100 000 g-vel centrifugáljuk 1 óra hosszat, majd a kapott csapadékot 1 %-os CHAPS detergenssel extraháljuk, amely 50 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,4, 140 mmol/1 NaCl, 0,5 mmol/1 DTT összetételű pufferben van oldva. Az oldatba vitt membrán fehérjét használjuk egy kompetitív ELISA vizsgálatban. Rekombináns FLAP-ot (25 ng) kötünk min den egyes mikrotiter lemez falára (éjszakán át, 4°C-on). A lemez lyukait azután blokkoljuk, 90 percig kezelve 5 %-os kecskeszérummal, amelyet 20 mmol/l-es TRIS-HC1 pH=7,4, 150 mmol/1 NaCl összetételű pufferben (TBS) oldunk. A sejtkivonatokat vagy a tisztított FLAP standardot l:2000-es hígításban inkubáljuk FLAP poliklonális antitesttel 100 μΐ össztérfogatban, 90 percig. A lyukakat TBS-sel mossuk, amely 0,05 % Tween 20-at tartalmaz (TBST), majd biotinilezett konjugált kecske anti-nyúl igG l:1000-es hígításával inkubáljuk 1 óra hosszat. A lemezeket ismét mossuk TBST-vel, majd a lemezekhez kötött, peroxidázzal jelzett streptavidin mennyiségét tetrametil-benzidin előhívással mérjük.
14. példa
Az 5-lipoxigenáz aktiváló fehérje aktivitásának antiszensz oligonukleotiddal való gátlását úgy is detektálhatjuk, hogy gátoljuk az 5-lipoxigenáz kalcium-ionofór által indukált transzlokációját a citoszolból a sejt membrán frakciójába, majd ezt követően gátoljuk a leukotrién képződést. A vizsgálathoz a HL-60 sejtek differenciálódását használjuk, az 1. példában leírtak alapján. A FLAP mRNS-sel hibridizálódó antiszensz oligonukleotidot adunk a HL-60 sejtekhez a DMSO hozzáadásával egyidőben, hogy a sejtek differenciálódjanak. A sejtekben a FLAP aktivitást a DMSO-nak a táptalajhoz való hozzáadása után 48-72 órával mérjük. A sejteket 10 μιηοΐ/ΐ kalcium-ionoforral serkentjük 15 percig 37 °C-on. A sejteket centrifugálással gyűjtjük össze (1000 g, 10 perc). A sejtek által szintetizált és a felülúszóba kibocsátott leukotrién B4 mennyiségét radioimmunvizsgálati módszerrel határozzuk meg, az 1. példában leírtak alapján. A sejtüledéket egyszer mossuk foszfáttal puffereit sóoldattal, majd a sejteket ultrahangos kezeléssel feltárjuk a 4. példában leírtak alapján. Az 5000 g-s felülúszót centrifugáljuk (100 000 g, 1 óra), majd a membrán frakcióhoz kötődő 5-lipoxigenáz mennyiségét (100 000 g-s üledék) Western biot elemzéssel határozzuk meg. A citoszol és membrán fehérjéket (mindegyik 100 gg) SDS poli(akril-amid) gélen választjuk el, nitrocellulóz papírra visszük át, és 5-lipoxigenáz antitesttel, majd 125I-protein A-val inkubáljuk [Bennett and Crooke, Journal of Biological Chemistry, 262, 13789-13797 (1987)]. A nitrocellulóz papírt ezután autoradiográfiásan exponáljuk, és az egyes sejtfrakciókban levő 5-lipoxigenáz mennyiségét úgy határozzuk meg, hogy az autoradiográfiákat lézer denzitométerrel olvassuk le.
15. példa
A leukotrién A4 hidrolázt úgy határozzuk meg, hogy közvetlenül enzimatikusan vizsgáljuk az antiszensz oligonukleotidokkal kezelt sejtek citoszol frakcióját [Ohishi és munkatársai, Journal of Biological Chemistry, 262, 1020010205 (1987)]. Röviden, az antiszensz oligonukleotidokkal kezelt HL-60 sejteket ultrahangos kezeléssel feltárjuk, majd a citoszol frakciókat centrifugálással izoláljuk (100 000 g, 1 óra). A reakcióelegy összetétele: 100 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,8 és enzim, 50 μΐ össztérfogatban. Miután az enzimet előinkubáltuk (3-4 perc, 37 °C), lítium-hidroxidot tartalma zó etanolban oldott leukotrién A4~et adunk hozzá 75 μιηοΐ/ΐ végkoncentrációban, az etanol végkoncentrációja pedig 2 %. Az enzimet 1 percig inkubáljuk 37 °C-on, és a reakciót 100 μΐ acetonitril/metanol/ecetsav 150:50:3 térfogatarányú elegyével állítjuk le, amely 0,3 nmol prosztaglandin B3~at tartalmaz belső standardként. A fehérjét kicsapjuk, oly módon hogy 30 percig -20 °C-on tartjuk az oldatot, majd 10 percig 10 000 g-vel centrifugáljuk. A felülúszó 120 μΐ-es alikvot részét kivesszük, és 20 μΐ 0,35 %-os dinátrium-EDTA-t adunk hozzá. A kapott oldat 50 μΐ-es alikvot részében keletkezett leukotrién B4 mennyiségét fordított fázisú HPLC-vel határozzuk meg. A mintákat izokratikusan eluáljuk, olyan oldószerrel, amelynek összetétele aceton/metanol/víz/ecetsav 3:1:3:0,006 térfogatarányban és 0,05 % dinátrium EDTA-t tartalmaz. A 270 nm-en mérhető abszorbancia alapján határozzuk meg a keletkező leukotrién B4 mennyiségét.
Egy olyan kísérlet eredményeit közöljük az alábbiakban, amelyben HL-60 sejteket egy foszforotioát antiszensz oligonukleotiddal kezeltünk, amely az
5'-TATCTCGGGCATGGCTCTGGG-3' szekvenciát tartalmazza, és azokhoz a szekvenciákhoz hibridizál, amelyek a leukotrién A4 hidroláz transzlációs iniciációjánál levő szekvenciának felelnek meg. A sejteket 10 μιηοΐ/ΐ, 30 μιηοΐ/ΐ és 75 μιηοΐ/ΐ oligonukleotiddal kezeljük 36 óra hosszat. A sejteket kinyerjük, és az LTA4 hidroláz mennyiségét meghatározzuk, az előzőkben leírt módon. Az antiszensz oligonukleotiddal való kezelés 0 %-kal, 15 %-kal, illetve 45 %-kal csökkenti az LTA4 hidroláz enzim aktivi59 tását.
16. példa
A sejtkivonatokban levő PI-PLC enzimaktivitás mérése során szubsztrétként radioaktívan jelzett foszfoinozitidokat használunk, amelyek kereskedelmi forgalomban vannak [Hoffman and Majerus, Journal of Biological Chemistry, 257, 6461-6469 (1982)]. A PI-PLC enzimvizsgálatokat nagyszámú vizsgálat elvégzését lehetővé tevő sorozatvizsgálatokká lehet fejleszteni. Az enzimvizsgálatok azonban nem tesznek különbséget a hatóanyagoknak a PI-PLC izoenzimekre gyakorolt hatásában, hanem a sejtkivonatban levő összes PI-PLC aktivitását mérik. Annak érdekében, hogy meghatározzuk az antiszensz oligonukleotidoknak a specifikus PI-PLC izoenzimekre gyakorolt hatását, szükséges egy immunkémiai vizsgálat alkalmazása. A PI-PLC-delta2-re specifikus antitesteket állítunk elő oly módon, hogy nyulakat immunizálunk egy peptiddel, például NH2-SKRKSTPERRTVQVT-COOH vagy hasonló peptidekkel, amelyek specifikusak a kürtőscsiga hemocianinhoz konjugált PI-PLCdelta2-re. A használt antitesteket kompetitív ELISA vizsgálatban használjuk, a 9. példában leírtak alapján.
17. példa
Az intakt sejtekben levő PI-PLC enzimaktivitást közvetlenül úgy mérhetjük, hogy meghatározzuk a 3H-inozitol-foszfátok képződését, 3-H-inozitollal előre jelzett sejtek agonistával való serkentése után.Az antiszensz oligonukleotidok PI-PLC-delta2 expressziójára gyakorolt hatásainak meg találásához HL-60 sejteket lehet használni. A sejteket 20 MCi/ml 3H-mioinozittál jelezzük 36 óra hosszat 37 °C-on. Azt az antiszensz oligonukleotidot, amely specifikusan hibridizálódik a PI-PLC-delta2 mRNS-hez, azaz az
5'-GTGGTGGACATTGTGGCCGCT-3'-t hozzáadjuk a sejtekhez, a 3H-mioinozittál való 36 órás jelzés alatt. A sejteket Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldattal (HBSS) mossuk a be nem épült 3H-mioinozit eltávolítása céljából, majd 5xl06 sejt/ml koncentrációban reszuszpendáljuk. A sejteket (0,3 ml) ezután a megfelelő agonistával serkentjük (fMet-Leu-Phe, epidermális növekedési faktor, GM-CSF, gamma-interferon, vérlemezke eredetű növekedési faktor, leukotrién D4 stb.) 2 percig 37 °C-on. A vízoldható inozit-foszfátokat 0,93 ml kloroform/metanol 1:2 térfogatarányú elegyével, majd ezt követően 0,3 ml kloroformmal és 0,3 ml vízzel extraháljuk. Az inozit-foszfátokat kromatográfiásan választjuk el Dowex AG1X8 tölteten, az előzőekben leírt módon [Berridge és munkatársai, Biochem. J., 212. 473-482 (1983)].
A sejtalapú vizsgálatokban az aktív vegyületek aktivitását különböző standard farmakológiai vizsgálatokban ellenőrizhetjük, például a tengeri moszattal indukált hashártyagyulladásban, arachidonsawal indukált egérfül gyulladásban, stb.
18. példa
A koenzim-A-tól független transzaciláz enzimaktivitás mérhető azoknak a sejteknek a mikroszomális frakciójában, amelyeket antiszensz oligonukleotidokkal kezeltünk, • * 3H-alkil-lizofoszfatidil-kolint használva szubsztrátként.
Úgy találtuk, hogy a humán promonocita leukémia sejtvonal, az U937, megfelelő forrás a koenzim-A-tól független transz aciláz aktivitás mérésére. A kezelést követően a sejteket különböző ideig mossuk foszfáttal puffereit sóoldattal, majd romol/1 TRIS-HC1 pH=7,0, 10 mmol/1 NaCl, 2 mmol/1 EGTA, 1 mmol/1 MgCl2, 0,1 mmol/1 leupeptin és 10 μg/ml aprotinin összetételű pufferben szuszpendáljuk 107 sejt/ml koncentrá cióban. A sejteket ultrahangos kezeléssel feltárjuk (30 %-os teljesítménnyel), majd a mikroszomális frakciót differen ciál-centrifugálással kinyerjük. A nyers homogenizátumot 20 percig 10 000
100 000 g-vel pott üledéket g-vel centrifugáljuk, majd a felülúszót centrifugáljuk 60 percig. A 100 000 g-vel ka mmol/1 foszfát, 150 mmol/1 NaCl pH=7,4 összetételű pufferben szuszpendáljuk, és így használjuk a vizsgálatokhoz. 10-50 μg fehérjét inkubálunk 1 μπιοί/ΐ 3H-l-0-alkil-lizofoszfatidil-kolinnal és 1 mg/ml szarvas marha szérum albuminnal 100 μΐ össztérfogatban, 10 percig 37 °C-on. A reakciókat úgy állítjuk le, hogy egymás után hozzá adunk 100 μΐ kloroform:metanol 1:2 térfogatarányú elegyet,
100 μΐ kloroformot és 100 μΐ 1 mol/l-es KCl-t. A mintákat vortexeljük, és 10 000 g-vel centrifugáljuk 4 percig. A szerves fázisban levő anyagot szilikagél G lemezekre csöp pentjük, majd egy olyan oldószer eleggyel kromatografáljuk, amelynek összetétele kloroform:metanol:ecetsav:víz (100:60:16:8). A lemezeket jódgőzzel festjük, az l-alkil-2
-arachidonil-foszfatidil-kolinnak megfelelő csíkot izolál juk, és a radioaktív anyag mennyiségét folyadék-szcintillá• *
- 62 ciós számlálóban meghatározzuk.
Az alábbiakban egy olyan kísérlet eredményeit írjuk le amelynek során U397 sejteket koenzim-A-tól független transzaciláz elleni antiszensz foszforotioát oligonukleotiddal kezeltünk. Az U397 sejteket 72 óra hosszat 37 °C-on 1, 10 és 50 Mmol/l antiszensz oligonukleotiddal kezeljük, amely 20 bázis hosszú, és a CAT szekvenciát tartalmazza a 10-12-es pozícióban, és ez megfelel a transzláció iniciációs pontjának. A sejteket összegyűjtjük, és vizsgáljuk benne a koenzim-A-tól független transzaciláz aktivitást, a fentiekben leírt módon. Ha a hatóanyagot 1, 10 és 50 gmol/l koncentrációban használjuk kezelésre, akkor ez 4, 22 és 72 %-kal csökkenti a transzaciláz aktivitást.
SZEKVENCIA-LISTA (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ:
(i) BEJELENTŐ: ISIS Pharmaceuticals (ii) A BEJELENTÉS CÍME: eljárás az arachidonsav-metabo- lizmus szabályozására oligonukleotidokkal (iii) SZEKVENCIÁK SZÁMA: 14 (ív) LEVELEZÉSI CÍM:
(A) CÍM: Woodcock Washburn
Kurtz Mackiewicz § Norris (B) UTCA: One Liberty Piacé - 46. emelet (C) VÁROS: Philadelphia (D) ÁLLAM: PA (E) ORSZÁG: USA (F) IRÁNYÍTÓSZÁM: 19103 (v) KOMPUTERREL OLVASHATÓ FORMA:
(A) HORDOZÓ: LEMEZ (3,5 INCH, 1,44 Mb) (B) KOMPUTER: IBM PS/2 (C) OPERÁTOR RENDSZER: PC-DOS (D) SOFTWARE: WORDPERFECT 5.0 (vii) ELSŐBBSÉGI ADATOK:
(A) A BEJELENTÉS SZÁMA: 516 969 (B) A BEJELENTÉS NAPJA: 1990. április 30.
(vili) A KÉPVISELŐ ADATAI:
(A) NÉV: John W. Caldwell (B) REGISZTRÁCIÓS SZÁM: 28 937 (C) HIVATKOZÁSI SZÁM: ISIS-182
(ix) TELEKOMMUNIKÁCIÓS ADATOK:
(A) TELEFONSZÁM: (215) 568-3100 (B) TELEFAX: (215) 568-3439 (2) INFORMÁCIÓ AZ 1. SZ. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (ív) ANTISZENSZ: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 1. SZ. SZEKVENCIA (2) INFORMÁCIÓ A 2. SZ. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 25 (B) TÍPUS: nukleinsav (iv) ANTISZENSZ: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 2. SZ. SZEKVENCIA (2) INFORMÁCIÓ A 3. SZ. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (iv) ANTISZENSZ: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 3. SZ. SZEKVENCIA (2) INFORMÁCIÓ A 4. SZ. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (iv) ANTISZENSZ: igen (Xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 4. SZ.
(2) INFORMÁCIÓ AZ 5. SZ. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (iv) ANTISZENSZ: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 5. SZ.
(2) INFORMÁCIÓ A 6. SZ. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (iv) ANTISZENSZ: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 6. SZ.
(2) INFORMÁCIÓ A 7. SZ. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (iv) ANTISZENSZ: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 7. SZ.
(2) INFORMÁCIÓ A 8. SZ. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav
SZEKVENCIA
SZEKVENCIA
SZEKVENCIA
SZEKVENCIA » »· ·« · ·* » * · a • · · · » • · · · · · * ♦ · » ··· ·♦ ·> ·
- 66 (iv) ANTISZENSZ: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 8. SZ.
(2) INFORMÁCIÓ A 9. SZ. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (iv) ANTISZENSZ: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 9. SZ.
(2) INFORMÁCIÓ A 10. SZ. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (iv) ANTISZENSZ: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 10. SZ.
(2) INFORMÁCIÓ A 11. SZ. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (iv) ANTISZENSZ: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 11. SZ.
(2) INFORMÁCIÓ A 12. SZ. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav
SZEKVENCIA
SZEKVENCIA
SZEKVENCIA
SZEKVENCIA * ·» 4» 4»4 * 4 4 44· • * !» 44 •4*4 ·
4« ·» 44«»
- 67 (iv) ANTISZENSZ: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 12. SZ.
(2) INFORMÁCIÓ A 13. SZ. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (iv) ANTISZENSZ: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 13. SZ.
(2) INFORMÁCIÓ A 14. SZ. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (iv) ANTISZENSZ: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 14. SZ.
SZEKVENCIA
SZEKVENCIA
SZEKVENCIA

Claims (18)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy az arachidonsav szintézisét vagy metabolizmusát befolyásoló fehérjéket kódoló nukleinsavakhoz képes hibridizálódni.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy mRNS-hez specifikusan képes hibridizálódni.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy specifikusan képes hibridizálódni egy génhez, és az említett génről készült mRNS mennyiségének befolyásolására háromszálas szerkezetet hoz létre.
  4. 4. A 2. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy specifikusan képes hibridizálódni egy transzkripciós iniciációs helyhez, egy transzlációs iniciációs helyhez vagy egy exon/intron illesztési ponthoz.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy specifikusan képes hibridizálódni az 5' lezáró szekvenciához és a szomszédos szekvenciákhoz.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy az említett fehérje 5-lipoxigenáz.
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy az említett fe69 hérje 5-lipoxigenáz aktiváló fehérje.
  8. 8. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy öli gonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy az említett fehérje foszfolipáz A2.
  9. 9. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy öli gonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy az említett fehérje LTA4 hidroláz.
  10. 10. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy az említett fehérje foszfolipáz C.
  11. 11. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy az említett fehérje koenzim-A-tól független transzaciláz.
  12. 12. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy körülbelül
    3-50 alegységből áll.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy körülbelül 8-25 alegységből áll.
  14. 14. A 13. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy 10-20 alegységből áll.
  15. 15. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy egy gyógyászatilag elfogadható hordozóban található.
  16. 16. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy a nukleotid egységek közötti kapcsoló csoportok közül legalább néhány ként tartalmaz.
  17. 17. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy a nukleotid egységek közötti kapcsoló csoportok közül legalább néhány foszforotioátcsoportot tartalmaz.
  18. 18. Oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy az alábbi szekvenciákat vagy azoknak legalább egy részét tartalmazza, és az említett rész specifikusan képes hibridizálódni az arachidonsav metabolizmusát vagy szintézisét befolyásoló fehérjét kódoló nukleinsavhoz:
HU9203422A 1990-04-30 1991-04-17 Process for the oligonucleotide modulation of arachidonic acid metabolism HUT65614A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US51696990A 1990-04-30 1990-04-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9203422D0 HU9203422D0 (en) 1993-01-28
HUT65614A true HUT65614A (en) 1994-07-28

Family

ID=24057818

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9203422A HUT65614A (en) 1990-04-30 1991-04-17 Process for the oligonucleotide modulation of arachidonic acid metabolism

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5530114A (hu)
EP (1) EP0527818A4 (hu)
JP (1) JP2635212B2 (hu)
KR (1) KR970004802B1 (hu)
AU (1) AU649673B2 (hu)
BR (1) BR9106391A (hu)
CA (1) CA2081769A1 (hu)
HU (1) HUT65614A (hu)
WO (1) WO1991016901A1 (hu)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5523389A (en) 1992-09-29 1996-06-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of human immunodeficiency virus
US20030045487A1 (en) * 2001-05-25 2003-03-06 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of phospholipase A2, group llA (synovial) expression
CA2179168A1 (en) * 1993-12-17 1995-06-22 Douglas A. Kniss Antisense oligonucleotides to suppress eicosanoid formation
US5855911A (en) 1995-08-29 1999-01-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal phosphodiester, phosphorothioate, and P-ethoxy oligonucleotides
US5955496A (en) * 1996-08-13 1999-09-21 The Regents Of The University Of California Dihydroxy-oxy-eicosadienoates
US6111085A (en) * 1996-09-13 2000-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbamate-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US6977244B2 (en) 1996-10-04 2005-12-20 Board Of Regents, The University Of Texas Systems Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
EP1003850B1 (en) 1997-06-06 2009-05-27 The Regents of the University of California Inhibitors of dna immunostimulatory sequence activity
US5874235A (en) * 1997-07-18 1999-02-23 The Johns Hopkins University Screening assays for cancer chemopreventative agents
US6174695B1 (en) 1997-08-12 2001-01-16 The Regents Of The University Of California Epoxide hydrolase inhibitor methods
US7704962B1 (en) 1997-10-03 2010-04-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Small oligonucleotides with anti-tumor activity
US7285288B1 (en) 1997-10-03 2007-10-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
US6103496A (en) 1998-05-29 2000-08-15 Vanderbilt University Isolated and purified 12R-lipoxygenase protein and nucleic acids
US6077709A (en) 1998-09-29 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of Survivin expression
US6335194B1 (en) 1998-09-29 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of survivin expression
EP1251181A1 (en) * 2001-04-20 2002-10-23 Warner-Lambert Company Non-recombinant cell lines capable of expressing predominantly cyclic nucleotide phosphodiesterase 4 (PDE4) subtype B and their use for the screening of PDE4 subtype-specific modulators
KR100496603B1 (ko) * 2001-12-13 2005-06-22 전길자 Ｎ-아실라이소포스파티딜콜린 화합물의 제조 방법
US7105657B2 (en) * 2002-11-08 2006-09-12 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Compositions and methods for inhibiting pancreatic cancer metastasis
US20070243632A1 (en) 2003-07-08 2007-10-18 Coller Barry S Methods for measuring platelet reactivity of patients that have received drug eluting stents
US7790362B2 (en) * 2003-07-08 2010-09-07 Accumetrics, Inc. Controlled platelet activation to monitor therapy of ADP antagonists
BRPI0413558A (pt) 2003-08-12 2006-10-17 3M Innovative Properties Co compostos contendo imidazo substituìdo por hidroxilamina
AU2004268625B2 (en) 2003-08-27 2011-03-31 3M Innovative Properties Company Aryloxy and arylalkyleneoxy substituted imidazoquinolines
AU2004270201A1 (en) 2003-09-05 2005-03-17 3M Innovative Properties Company Treatment for CD5+ B cell lymphoma
US7544697B2 (en) 2003-10-03 2009-06-09 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Pyrazolopyridines and analogs thereof
AR046046A1 (es) 2003-10-03 2005-11-23 3M Innovative Properties Co Imidazoquinolinas alcoxi sustituidas. composiciones farmaceuticas.
CA2545825A1 (en) 2003-11-14 2005-06-02 3M Innovative Properties Company Hydroxylamine substituted imidazo ring compounds
EP1685129A4 (en) 2003-11-14 2008-10-22 3M Innovative Properties Co OXIMSUBSTITUTED IMIDAZORING CONNECTIONS
CA2547020C (en) 2003-11-25 2014-03-25 3M Innovative Properties Company 1h-imidazo[4,5-c]pyridine-4-amine derivatives as immune response modifier
JP2007517035A (ja) 2003-12-29 2007-06-28 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー アリールアルケニルおよびアリールアルキニル置換されたイミダゾキノリン
EP1699788A2 (en) 2003-12-30 2006-09-13 3M Innovative Properties Company Imidazoquinolinyl, imidazopyridinyl and imidazonaphthyridinyl sulfonamides
WO2005094531A2 (en) 2004-03-24 2005-10-13 3M Innovative Properties Company Amide substituted imidazopyridines, imidazoquinolines, and imidazonaphthyridines
US20050267145A1 (en) * 2004-05-28 2005-12-01 Merrill Bryon A Treatment for lung cancer
US8017779B2 (en) 2004-06-15 2011-09-13 3M Innovative Properties Company Nitrogen containing heterocyclyl substituted imidazoquinolines and imidazonaphthyridines
US8026366B2 (en) 2004-06-18 2011-09-27 3M Innovative Properties Company Aryloxy and arylalkyleneoxy substituted thiazoloquinolines and thiazolonaphthyridines
WO2006038923A2 (en) 2004-06-18 2006-04-13 3M Innovative Properties Company Aryl substituted imidazonaphthyridines
WO2006065280A2 (en) 2004-06-18 2006-06-22 3M Innovative Properties Company Isoxazole, dihydroisoxazole, and oxadiazole substituted imidazo ring compounds and methods
JP5543068B2 (ja) 2004-12-30 2014-07-09 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー キラル縮合［１，２］イミダゾ［４，５−ｃ］環状化合物
EP1831221B1 (en) 2004-12-30 2012-08-08 3M Innovative Properties Company Substituted chiral fused 1,2 imidazo 4,5-c ring compounds
AU2006210392A1 (en) 2005-02-04 2006-08-10 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Aqueous gel formulations containing immune response modifiers
AU2006213746A1 (en) 2005-02-11 2006-08-17 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Oxime and hydroxylamine substituted imidazo(4,5-c) ring compounds and methods
AU2006232375A1 (en) 2005-04-01 2006-10-12 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 1-substituted pyrazolo (3,4-c) ring compounds as modulators of cytokine biosynthesis for the treatment of viral infections and neoplastic diseases
EP1869043A2 (en) 2005-04-01 2007-12-26 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Pyrazolopyridine-1,4-diamines and analogs thereof
WO2007021735A2 (en) * 2005-08-10 2007-02-22 William Llewellyn Use of phospholipid arachidonic acids for increasing muscle mass in humans
AU2006279325B2 (en) * 2005-08-18 2013-06-27 Accelalox, Inc. Methods for bone treatment by modulating an arachidonic acid metabolic or signaling pathway
WO2007050271A2 (en) * 2005-10-25 2007-05-03 Wyeth 5-lipoxygenase modulators
US7906506B2 (en) 2006-07-12 2011-03-15 3M Innovative Properties Company Substituted chiral fused [1,2] imidazo [4,5-c] ring compounds and methods
SG175390A1 (en) 2009-04-29 2011-12-29 Amarin Corp Plc Pharmaceutical compositions comprising epa and a cardiovascular agent and methods of using the same
JP6587934B2 (ja) 2012-03-28 2019-10-09 ソマロジック・インコーポレーテッド Ｐｄｇｆおよびｖｅｇｆ結合アプタマー、および、ｐｄｇｆおよびｖｅｇｆが介在する病気の治療へのそれらの使用
EP3044334B1 (en) * 2013-09-09 2020-08-12 Somalogic, Inc. Pdgf and vegf aptamers having improved stability and their use in treating pdgf and vegf mediated diseases and disorders

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4806463A (en) * 1986-05-23 1989-02-21 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of HTLV-III by exogenous oligonucleotides
KR927003044A (ko) * 1990-01-11 1992-12-17 크리스토퍼 케이. 미라벨리 Rna 활성과 유전자 발현을 검출하고 조절하는 조성물 및 그 방법

Also Published As

Publication number Publication date
WO1991016901A1 (en) 1991-11-14
JP2635212B2 (ja) 1997-07-30
EP0527818A4 (en) 1993-09-15
JPH06501377A (ja) 1994-02-17
BR9106391A (pt) 1993-04-27
US5530114A (en) 1996-06-25
HU9203422D0 (en) 1993-01-28
AU7760091A (en) 1991-11-27
AU649673B2 (en) 1994-06-02
KR970004802B1 (ko) 1997-04-04
EP0527818A1 (en) 1993-02-24
CA2081769A1 (en) 1991-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT65614A (en) Process for the oligonucleotide modulation of arachidonic acid metabolism
Barbour et al. Antisense inhibition of group II phospholipase A2 expression blocks the production of prostaglandin E2 by P388D1 cells.
Haeggstrom et al. Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease
Bingham III et al. A heparin-sensitive phospholipase A2 and prostaglandin endoperoxide synthase-2 are functionally linked in the delayed phase of prostaglandin D2 generation in mouse bone marrow-derived mast cells
Rådmark et al. 5-lipoxygenase: regulation and possible involvement in atherosclerosis
Bisogno et al. Fatty acid amide hydrolase, an enzyme with many bioactive substrates. Possible therapeutic implications
Sun et al. Phospholipases A2 and inflammatory responses in the central nervous system
Lee Biosynthesis and possible biological functions of plasmalogens
Krieg et al. 12‐Lipoxygenase isoenzymes in mouse skin tumor development
KR0157487B1 (ko) 단백질 키나아제 c의 올리고뉴클레오티드 조절
JP2003533978A (ja) トリグリセリド減少治療薬を同定するステアロイルＣｏＡデサチュラーゼを使用する方法と組成物
JP2002539156A (ja) ホスホリパーゼｄの活性の調節
Wu et al. Tumor necrosis factor-α induces the 85-kDa cytosolic phospholipase A2 gene expression in human bronchial epithelial cells
Zezulak et al. Specificity of gene expression in adipocytes
US6232110B1 (en) Coding sequence for protein phosphatase methylesterase, recombinant DNA molecules and methods
Hajra Dihydroxyacetone phosphate acyltransferase
US20070105808A1 (en) Inhibition of histone deacetylase
WO2000009754A2 (en) HUMAN STEAROYL-CoA DESATURASE-RELATED COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING SKIN DISORDERS
Vervoordeldonk et al. Aspirin inhibits expression of the interleukin-1β-inducible group II phospholipase A2
US20090181443A1 (en) Identification, cloning, expression, and a purification of three novel human calcium-independent phospholipase a2 family members possessing triacylglycerol lipase and acylglycerol transacylase activities
Zhu et al. Corticotrophin-releasing factor participates in S1PR3-dependent cPLA2 expression and cell motility in vascular smooth muscle cells
Ueda et al. Metabolic enzymes for endocannabinoids and endocannabinoid-like mediators
Lee et al. Partial purification of a diacylglycerol lipase from bovine aorta
Rice Secretory type II phospholipase A2 and the generation of intrauterine signals
Levallet et al. Alterations in proteoglycan synthesis selectively impair FSH-induced particulate cAMP-phosphodiesterase 4 (PDE4) activation in immature rat Sertoli cells

Legal Events

Date Code Title Description
DFD9 Temporary prot. cancelled due to non-payment of fee