JPH06501377A - アラキドン酸代謝のオリゴヌクレオチド変調 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 アラキドン酸代謝のオリゴヌクレオチド変調發盟Ω盆野 本発明は、アラキドン酸の合成または代謝の変調に反応する疾患状態のための治 療、診断および検査試薬に間する。特に、本発明は、アラキドン酸合成または代 謝を調節するタンパク質の合成に開υしたある種のメブセンジャーリボ核酸また はＤＮＡとのアンチセンスオリゴヌクレオチド相互作用に関する。これらのオリ ゴヌクレオチドはＲＮＡまたはＤＮＡの活性の変調を導き、それによってアラキ ドン酸の合成および代謝の変調を導くことが分かった。ａ和および治療効果が生 じる。

光里Ｑ背員 エイコサノイド アラキドン酸および関連脂肪酸の代謝は、体内の全ての器官系に影響を及ぼす広 範囲の生物学的活性を示す、生物学的活性を示すアラキドン酸の代謝産物は３０ 種類を越えて存在する。これらの代謝産物を集合的にエイコサノイドと称する。

アラキドン酸は細胞中において膜脂質にエステル化されて貯蔵されている。膜脂 質からいったん放出されると、アラキドン酸は再度エステル化されて膜脂質に戻 るかまたは種々の酸化酵素によって代謝されることかできる。治療上の介入に重 要となる２種類の酸化経路があり、すなわち、グロスタグランジン、トロンボキ サンおよびプロスタサイクリンを生じるシクロオモシゲナーセ経路並びにロイコ トリエン、リボキシン、ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸およびモノ−お よびジヒドロキシエイコサテトラエン酸（モノ−およびジーＨＥＴＥ’ｓ）を生 じるリボキシゲナーセ経路である。（図１を参照されたい）、血小板活性化因子 （ＰＡＦＩはアラキドン酸の直接代謝産物ではないか、それは、遊離アラキドン 酸を生じる経路の一つによって生じる。したかつて、ある場合には、遊離アラキ ドン酸の生成によって乙、ＰＡＦの直接前駆物質であるリゾＰ、ＡＦが生じる。

Ｅ系列＜ＰＧＥ１、ＰＧＥ、）のグロスタグランジンは効力のある血管拡領薬お よび平、ｆ筋弛Ｍ薬である。ρｊ疋ば、ＰＧＥ２は血圧低下を促進し且つ気管支 、気管および子宮の平滑ＩＷｆ！：弛緩させる。これらのプロスタグランジンの 他の作用としては、血小板凝５ＩＫＩｌ害、肥満細胞からの媒介物質放出阻害、 増加腎血流、利尿、増加ＡＣＴＨ循環４度および胃酸分泌阻害がある。ＰＧＥｓ は、皮肉に注射された場合に痛みを引き起こし、そして化学物質または機械的刺 激の作用に対して心性神経末端を感作する。

ＰＧＥ１様のグロスタグランジンＤ２は、血小板凝集阻害剤である。ＰＧＤ２は 好塩基球からのヒスタミンの放出を増大させ、化学運動性を促進し、そして多形 白血球中の他の媒介物質の走化性応答を増大させる。プロスタサイクリン（Ｐの 平滑筋を弛緩させ、そして腎血流分増加させる。したがって、ＰＧＥ２、ＰＧＩ ２およびある程度劣るＰＧＤ２は、正常な恒常性を維持するのに重要であつ且つ 多数の臨床的状況において有益な効果を有する。

Ｆ系列の１０スタグランシン、すなわち、ＰＧＦ２αは、一般的には、平滑筋組 織に対してＰＧＥとは反対の生物学的活性を示す、ＰＧＦ２αは気管支および気 管の平滑筋を収縮させ、！ｆ＠および非妊娠双方の子宮平滑筋を収縮させ、そし て胃腸の平滑筋を収縮させる。亜霊長類て゛のＰＧＦ２αは白血球溶解Ｎｅｕｔ ｏｌｙｔｉｃ）ホルモンて゛ある。

トロンボキサンＡ　２（ＴＸＡ２ｉは効力のある平滑筋収縮性刑て゛あつ、血管 系、気管支および気管を含ｆ：試験さｎた平滑筋試験片全部？収縮させる。ＴＸ 　Ａ２は血小板凝集を促進し且つ腎血流を減少させる。

概して、ペプチドロイコトリエン（ロイコトリエンＣ４、Ｄ４およびＥ４）は、 効力のある平滑ｖＪ収絹性剤であるか、ロイコトリエンＢ　（ＬＴＢ４）は循環 好よび好中球からのスーパーオキシドアニオン発生を促進し、その双方が局所組 織の損傷を引き起こす（フォード・ハンチンソン（Ｆｏｒｄ−Ｈｕｔ、ｃｈｉｎ ｓｏｎ）、、Ａ、Ｗ、、Ｃｒ１ｔ、Ｒｅｖ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｉ、１０：１ 〜１２．１９８９）。リボキシンはモルモットの実質試験片と収縮させ、ナチュ ラルキラー細胞を阻害し、そして好中球でのスーパーオキシド発生を刺激するこ とが分かった。

血小板活性化因子（Ｐ　Ａ　Ｆ　）は、血小板凝集を誘導し、血管透過性を増大 させ、気管支収縮薬として作用し、腎血流を減少させ、腸間膜循環を減少させる し、そして更に記載される最も効力のある胃潰瘍発生源である（ロザム（Ｒｏｓ ａｍ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３１９　：　５４〜５６．１９８６）、ＰＡＦは炎症 性細胞を活性化して、好中球および好酸球の走化性並びに脱顎粒反応を促進する （プラークト（Ｂｒａｑｕｅｔ）ら、ＩＳＩ　Ａｔ１ａｓ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃ ｅ：Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏ　ｙ、Ｌ８７〜１９８．１９８７）。

エイコサノイドめ病　生理学 呼吸系 呼吸系に対するロイコトリエンの作用は、ロイコトリエンが喘息などの即時型過 敏症反応において果たしていると提案された役割ゆえに、広範囲に研究されてき た。高４度のペプチドロイコトリエンは、喘息、アレルギー性鼻炎、嚢胞性線維 症および慢性気管支炎を患っている患者の鼻分泌物および肺洗浄液中で検出され てきた（ダーレン（Ｄａｈｌｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、８０：　１７１２〜１７１６．１９８３）、ロイコトリ エンＣ４およびＤ４は効力のある平滑筋収縮性荊であり、ヒトを含む様々な種に おいて気管支収縮を促進する（ダーレンら、Ｎａｔｕｒｅ、２８８：４８４〜４ ８６．１９８０）、０イコトリエンＣ４およびＤ４　（ＬＴＣ４およびＬＴＤ４ ）は、気管支収縮を促進する場合にはほぼ等しい効力かあり、ヒスタミンよりも 約１０００倍大きい効力かある（ダーレンら、Ｎａｔｕ　ｒｅ、２８８：　４８ ４〜４８６、　１９８０；シロイス（Ｓｔｒｏｉｓ）ら、Ｐｒｏｓｔ、Ｌｅｕｋ 、’、ｖ＋ｅｄ。

、７：３２７〜３４０．１９８１）、概して、ＬＴＣ４およびＬＴＤ４は、中心 の気道よりもむしろ末梢気道の収縮を促進する場合に一層活性である０モルモ。

トの気管の試験片において、ＬＴＥ４は、ＬＴＣ４およびＬＴＤ４よりも約１０ 昨夕ない効力かある。ＬＴＣ４およびＬＴＤ４によって生じた気管支収縮は、特 異的ＩｔｌｉＩ胞表面受容体との相互作用に依る〈マング（Ｍ　ｏ　ｎ　ｇ　） ら、Ｅｕｒ、Ｊ。

Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、、１０２：　１〜１１．１９８４）、ＬＴＣ４およびしＴ Ｄ４に対して別個の受容体が存在するかどうかということはなお議論の余地があ る。

ロイコトリエンＥ４は、ＬＴＤ４受容体との相互作用によって気管支収縮性剤と して作用すると考えられる。ロイコトリエンＢ４は、単離された気管および肺実 質について比較的弱い収縮を生じる。ＬＴＢ４によって引き出された収縮は、シ クロオキシゲナーゼの阻害剤によって一部分は阻止され、収縮が７０スタグラン ジンの放出に対して二次的であることか示唆される。

ペプチドロイコトリエンと同機に、血小板活性化因子は効力のある気管支収縮性 剤である。更に、ＰＡＦは、ヒトにおける池の薬剤に対する気道の反応性の増加 を誘導し、最大７日ｒｒＩまて゛継続して吸入を行うことができる（ロス（Ｃｕ ｓｓ）ら、Ｌａｎｃｅｔ、２：　１８９．１９８６）、更に、プロスタノイドＰ ＧＦ２αおよびＴＸＡ２は気道平滑筋を収縮し、喘息の応答に対して寄与するも のとして関係している。

心違血萱系 ロイコテリエンは血管収縮薬としても作用するが、しがしながら、種々の血管床 に２著な相違か存在する。ＬＴＣ４およびＬＴＤ４は、様々な種において冠状動 脈の効力のある収ａ薬である（ロス（Ｒｏ　ｔ　ｈ　）およびレファー（Ｌｅｆ ｆｅｒ）、Ｐｒｏｓｔａ　Ｉａｎｄｔｎｓ、２６：う７３〜５８１．１９８３： バーク（Ｂｕｒｋｅｌら１．Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、Ｅｘｐｅｒ。

工旦！ニュ旦−，２２１＋２３５〜２４１．ｌ９８２；しγツ（Ｌｅｔｔｓ）お よびパイパー（Ｐｉｐｅｒ）、Ｂｒ、Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、、７６：１６９ 〜１７６．１９８２＞、賛の場合のように、ＬＴＥ４はしＴｅ３およびＬＴＤ４ よりも約１０昨夕ない効力があり、ＬＴＢ４は活性を伴わない。ヒトにおいて、 ＬＴＣ４およびＬＴＤ４は、肺静脈に対して効力のある収縮性剤て゛あつ、肺動 脈の弱い収縮性物質である（シェレンハーグ（Ｓｃｈｅ　Ｉ　ｌ　ｅｎｂｅｒｇ ｌおよびフォスター（Ｆｏｓｔｅｒ）、Ｐｒｏｓｔａ　Ｉａｎｄｉｎｓ、２７： ４７”＋＼４８２．１９８４）、普通の６！頃なヒト被験者に対してＬＴＣ４を ２ナノモル静脈内注射することにより、平均動脈圧の降下、心拍数の増加、冠血 流の減少および冠状血管抵抗の増加か生じた（マロンｆＭａｒｏｎｅｌら、旦上 立上立盈り−ｏｆ　ｔｈｅ　Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｓ、Ｒ，レヴイ（Ｌｅｖｉ） およびＲ，Ｄ。

クレル（Ｋｒｅ　Ｉ　ｌ　）監修、Ａｎｎ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄ、Ｓｃ ｆ、５２４、ニューヨーク・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋＡｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）−ニューヨーク、３２１〜３３３ 頁、１９８８）、同様の効果がＬＴＤ４に間して報告された。ＬＴＣ４およびＬ ＴＤ４は、恐らくは毛細管内皮細胞の収縮を促進することによって血管透過性を 直接増大させる。

ロイコトリエンか心筋虚血に続く心臓の再Ｊ流損傷の一因であることを示唆する 証拠がますます増えている（バースト（Ｂａｒｓｔ）およびマレン（Ｍｕ　ｌ　 １ａｎｋ　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、、１１４　：　３８３〜３８７． １９８５：ササキ（Ｓａｓａｋｉ）ら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ、Ｒｅｓ、、２２ ：１４２〜１４８．１９８８＋、心臓再濯流損傷の実験モデルにおいて、二重の シクロオキシゲナーゼ／リポキシゲナーゼ阻害剤は心筋梗塞の程度を減少させる ことが分かった。利用可能な証拠により、二重阻害剤の有益な効果はＬＴＢ４生 合成の阻害によるということが示唆される。しかしながら、これらのデータは、 研究で用いられた化合物か固有の酸化防止特性を有することに加えてシクロオキ シゲナーゼおよびリボキシゲナーセ双方を阻害したので注意して解釈しなければ ならない、５−ＬＯまたはＬＴＢ４アンタゴニストの特異的阻害剤はこれらの発 見を実証するのに必要とされる。更に、ロイコトリエンは、選択的ＬＴＤ　４受 容体アンタゴニストか実験動物モデルでの生存率を有意に増加させるという点で 、内毒素性ショックの病的媒介物質として関係している（スミス（Ｓｍｉｔｈ） ら、Ｃｉ　ｒｃ、５ｈｏｃｋ、２う：２Ｌ〜３１．ｌ９８８＋、内毒素性ショッ クモデルでのＬＴＤ４アンタゴニストの有益な効果は、一部分は、ＬＴＤ４によ りて引き起こされた増大乙た毛細管透過性を逆転させるそれらの能力に依ること がある。

血小板活性化因子およびトロンボキサンＡ２は冠状血管を収縮させ、それによっ て冠の潅流を減少させ：煙路的な結果は、減少した心拍出量、血圧の低下および 急性循環虚脱て′ある。Ｐ、ＡＦは、更に、ＳＴ上セグメント下を促進する。シ ョックの実験動物モデルでは、内毒素に誘導された低血圧とＰＡＦＪ度との一定 の関係か存在する。内毒素性ショックにおけるＰＡＦの役割に関する更に別の支 持は、Ｐ　、Ａ　Ｆアンタゴニストかシボ・Ｙりの実験動物モデルで観察された 低血圧を減少させるという発見であった（ブラークトら、１５１　Ａｔ１ａｓ　 ｏｆＳｃｉｅｎｃｅ：Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏ　、１８７〜１９８．１９８７）。

！脹玉 モルモット回腸は、ペプチドロイコトリエンによる平滑筋収縮を測定するための 古典的組織である（ＳＲ５−Ａｔ、更に、ＬＴＣ４およびしＴＤ４はモルモット の胃を収縮させる。ＬＴＢ４は両組織に対する作用を伴わない。種および筋肉層 の間には、ロイコトリニジに対するそれらの反応性に謬著な相違かある。ヒト胃 腸粘膜はロイコトリエンを合成し且つ放出し、それはｆｌＩｋ客または炎症性反 応に応答して増加する。実験動物モデルにおいて、ロイコトリエン受容体アンタ ゴニストは、エタノール、インドメタシンおよびアスピリンによって引き起こさ れた胃腸の損傷を減少させることが報告された。ロイコトリエンによって引き起 こされた胃腸の損傷は、一部分はそれらの強力な血管収縮特性に依ることかあり 、したかつて、血流は粘膜を迂回する。いくつかの研究は、炎症性腸疾患を患う 患者て・のＬＴＢ４およびペプチドロイコトリエンの上昇を実証した。炎症性腸 疾患の実験動物モデルにおいて、５−ＬＯ阻害剤は損傷および炎症の程度を減少 させる。

既述したように、ＰＡＦは、更に記載されたラットでの最も効力のある潰瘍発生 層である。更に、ＰＡ、Ｆは壊死性全腸炎に関係することが機業されている（ウ ォーレス（Ｗａｌｌａｃｅｌら、Ｇａ５ｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏ　ｙ、１９８７ 印刷中）。

ロイコトリエンは、カルシウムイオノフオアによって刺激された正常な脳組織か ら合成され且つ放出され、それらが神経調節器として機能することかできるとい うことか示唆される。しＴｅ３およびＬＴＤ４は、小脳のプルキンエ細胞を長時 間興奮させる（バルマー（ＰａＩｍｅｒｌら１．１．Ｐｈａｒｍａｃｏ　Ｉ。

Ｅｘ　、Ｔｈｅｒ、、２１９：９Ｌ　〜９６．ｔ９８１）、神経調節器としての 可能な役割に加えて、ロイコトリエンは大脳虚血などの傷害に続ぐ神経組織の病 理学の一因となることかでき、それは、それらか大脳血管の効力のある収縮薬で あるという理由による。ＬＴＢ４、ＬＴＣ４およびＬＴＤ４は、血管透過性を増 加させることによって血液脳関門を減少きせ、ＬＴＢ４か最も効力かある（グラ ／プロスタグランジンは、傷害、炎症および頭痛に関係した痛みの一因となって おり、したがって、これらの疾患において非ステロイド系抗炎症薬の泊唆上の利 点か明らかになる。一層低い投与量での１０スタグランジンＥ２およびＰＧＦ２ −は、機械的および化学的刺激に対して痛み受容体を感作して痛覚過敏分生じる 。

支直系 ロイコトリエンはヒトの皮膚において２著な炎症性応答を生じる。ヒトの皮膚に ＬＴＢ４を０．１５〜１．５ナノモル注射することにより、浮出した水腫部分が 生じ、それは注射して３０分後に現れ、そして少なくとも４時間持続した０組織 学により、真皮中への顕著な多形核白血球浸潤か実証された（カンプ（Ｃａｍｐ ｌら、Ｂｒ、Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃｏ　１．．８Ｑ：４９７〜５０２．１９８３） 、５ｎｇ程度の少量のＬＴＢ４の局所塗布により、遅延型炎症性反応が生じ、そ れは１２時時間軸最初に現れ、そして数日間持続した。最初に、浸潤は多形核白 血球から成ったか、炎症性反応のｆ＆後の段階では単核白血球か優勢であった。

タキフィラキシーはＬＴＢ４の反復局所投与に応答して現れる（ダウト（Ｄｏｗ ｄ）ら、１９８７）。

ＬＴＢ４とは対照的に、ペプチドロイコトリエンは皮肉注射によって即時型発赤 反Ｚを生じ、後に続発症を伴わない。ヒトの疾患でのロイコトリエンとの関連に ついての最もよい根拠は乾庸にある。ロイコトリエンは乾庸の病巣で発見された 。５−リポキシゲナーゼ阻害剤であるヘノキサ１０フエンは、標準的な治療に応 答しなかった重い乾ＪＦ４患者において有効であることか分かった（クラーグハ レ（Ｋ、Ｉａｇｂａｌｌｅ）およびハーソン（Ｈｅｒｌ　ｆｎ）、Ａｒｃｈ。

Ｄｅｒｍａｔｏｌ、、１１９：５４８〜５５２．１９８３）、ｔかしなから、ベ ノキサグロフェンは許容できない副作用のために市場から退けられた。

グロスタグランジンＥ１およびＥ２は、皮膚に注射された場合に血管拡張および 膨疹を引き起こす（クランコーン（Ｃｒｕｎｋｈｏｒｎ）およびライリス（Ｗｉ 　ｌ　ｌ　ｉｓ）　、Ｂｒ、Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃｏ　１．．４１　：４９〜５６ ．１９７１）、プロスタサイクリン（ＰＧＩ２）は、池の媒介物質によって血管 透過性を増大させる。グロスタグランジンＤ２は、皮肉注射に続く赤みおよび膨 疹を促進することではＰＧＥ’　ｓよりもはるかに弱い。

ＰＡ、Ｆはヒトの皮膚における効力のある前炎症性剤である。ヒトの皮膚中にＰ ＡＦをピコモル量注射することによつ二相応答か促進され、初期のに答は注射し て５分後に生じ、後の相の応答が３〜６時間後に生じた（アーチャー（Ａｒｃｈ ｅｒＪら、Ｂｒ、、Ｊ、Ｄｅｒｍａｔｏ　１．．１１２：２８１５〜２９０゜１ ９８５）、ＰＡＦは、乾廁患者の病巣の皮膚からのスケールおよびチェンバー液 から単離さｔｌ、ｆ、ニー（マレ−（Ｍａｌｌｅｔ）ら、Ａｄｖ、１ｎＰｒｏｓ ｔａ　Ｉａｎｄｊｎｓ、Ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅｓ。

Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｓ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、第１ ７Ｂ巻：６４０〜６４２．１９８７）。

大垣筋糸 高濃度のロイコトリエンおよびアラキドン酸のモノヒドロキシ誘導体は、慢性関 節リウマチ、を椎関節炎および痛風の患者由来の滑液中で検出された（クリ７ク スタイン（Ｋｌ　１ｃｋｓｔ、ｅｉｎ）ら、Ｊ、ＣＩ　ｉｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、 ６６：１１．６６〜１，１７０．１９８０＋デビンドソン（Ｄａｖｊｄｓｏｎ） ら、ＡｎｎＲｈｅｕｍ、Ｄｉｓ、、４２：６７７〜６７９．１９８３）、滑液中 の高濃度のりボキンゲナーゼ生成物は、好中球浸潤および活性化好中球から滑液 腔中への増加した酵素放出の一因となることかある。５−リポキシゲナーゼの阻 害剤はＭ歯類動物におけるコラーゲンに誘導された関節炎での組織損傷を減少さ せることが分かった。ロイコトリエン生合成の阻害は、滑液腔中への好中球およ び単球浸潤並びにこれらの細胞によって引き起こされた結果としての組織損傷を 減少させる。

漬質代−を変：、する　在の汗　薬 それは、アラキドン酸の代謝阻害か測り知れない治療上の有用性を有するであろ う様々な病理学的条件において生体の主要器官系およびそれらの関連性に対する エイコサノイドの広範囲の効果によって明らかである。現在、市場にはアラキド ン酸代謝を変調する多数の種類の薬剤がある。しかしながら、各種類に関して、 それらの特異性の欠如による多数の不適当な作用かある。更に、現在市場にある 大部分の薬剤は、リポキシゲナーゼ経路かまたは血小板活性化因子を阻害するこ とができない。

アスピリン、イブプロフェン、ナグロキセン、インドメタシンおよび関連非ステ ロイド系鎮痛薬による酵素シクロオキシゲナーゼの阻害は、種々の疾患状態にお いて有益な作用を及ぼすことが十分に実証された。非ステロイド系抗炎症薬は慢 性関節リウマチの治療のメーンステーである。これらの薬剤は、慢性関節リウマ チに関係した症状、例えば、痛みおよび腫脹を緩和するのに極めて有効であるこ とが分かったか、しかしながら、それらは疾患の経過をほとんど変化させない。

更に、シクロオキシゲナーゼの阻害剤は、いくつかは有益な作用を及ぼすもので あるグロスタグランジン全部の産生を無差別に阻止する。これは、一部分はそれ らの多数の９１作用、例えば、それらの潰瘍発生活性の機序であることがある。

シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、ロイコトリエンかまたは血小板活性化因子に対 して効果かなく、したかって、種々の疾患の治療において無益なままである。

更に、グルココルチコイド活性を示すステロイドは、恐らくは細胞膜からのアラ キドン酸の放出を阻害することによって抗炎症活性を示す、ステロイドは、現在 入手可能な薬剤の最も広範に処方されている種類の一つである。それらは様々な 炎症性疾患、アレルギー性疾患および非免疫媒介疾、＠、、例えば、慢性関節リ ウマチ、変形性関節症、狼遣、アナフィラキシ−５じんま疹、接触皮膚炎、喘息 、乾庸、慢性７Ｉ瘍性大腸炎、脳水腫、敗血症性シヨ・ｌり、悪性疾、俄および 肝炎を０唆するのに用いられる。１％ｌｉ腎不全の治療のための代用治療を除い ては、グルココルチコイド療法は治癒的ではない、更に、グルココルチコイドに よる長期間の治療は、実質的なおよびしばしば生命を脅かす副作用を導く、グル ココルチコイドの多数の用途は浸住疾７否の治療用であるので、それらの副作用 はそれらの有用性を制限する。

必須脂肪酸前駆物質の食餌摂取量のアラキドン酸への変化により、炎症性および 心臓血管疾患俄における適度な活性か実証された（ボナ（Ｂｏｎｎａ）ら、Ｎｅ ｗ　Ｅｎ　、Ｊ、Ｍｅｄ、、３２２．７９５〜８０１．１９９０；ランギ（Ｒａ ｎｇｉ）ら、Ｊ、Ａ１１ｅｒ　Ｃ１１ｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、８５：４８４〜４ ８９．　１９９０）。負波はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を含み。

それはシクロオキシゲナーゼに不十分な基質であり且つシクロオキシゲナーゼの 拮抗阻害剤として牛用する。ＥＰ、Ａはアラキドン酸と同様にリポキシゲナーゼ によって代謝されるが、はるかに少ない活性代謝産物を生じる（チラノ（Ｔｅｒ ａｎ、ｏ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ５．３３：３０７１〜３０ ７６．１９８４）。したかって、ＥＰＡは、細胞、襖中への収り込みおよび引き 続きのりボキシケナーセによる代謝に関してアラキドン酸と拮抗する。リノール 酸、リルン酸およびアラキドン酸の食餌摂取量を完全に制限することは難しく、 したがって、電油療法の有用性は制限される。

鉄錯生成試薬であるしドロキサム酸誘導体による５−リポキシゲナーゼの阻害は 、現在臨床試験が行われている。歴史的に、この方法では期待される結果より６ 少なく生じた。こｔ′Ｌまて゛のところ、細胞膜からのアラキドン酸の貯蔵また は放出の変調に関する現在の薬剤も、リポキシゲナーゼ経路による代謝も、治療 用薬剤として有用であると証明されたものはなかっな。アラキドン酸の合成また は代１１４ご変調する安全て゛且つ有効な方法を提供する必要性は大きいが、ま た実現されていない、特異的酵素を直接阻害しようとするよつらむしろアラキド ン酸経路の臨界屯でタンパク質の生成を変調する手段によって、従来の技術者か 遭遇した問題が克服されるて島ろう。

魚叩Ω亘些 本発明の主要な目的は、アラキドン酸および関連化合物の合成または代謝の混乱 による免疫学的疾患、心臓血管疾患および他の疾患のための治療法を提供するこ とである。

本発明のもう一つの目的は、アラキドン酸および関連化合物の合成および代謝に Ｉ！Ｉｌｌしたタンパク質をコードしているＲ、ＮＡの機能を阻害することがで きるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することである。

更に別の目的は、アラキドン酸合成または代謝の機能不全の診断用手段を提供す ることである。

本発明のこれらのおよび他の目的は本明細書の論評から明らかになるものである 。

図面の簡単な説明 図１は、アラキドン酸の合成および代謝の模式図である。

図２は、血小板活性化因子合成経路の模式図である。

図３は、ヒトラーリボキシゲナーセｍＲＡＮ配列である。

図４は、ヒト滑液ＰＬＡ２ｍＲＡＮ配列である。

図５は、ヒト５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質配列である。

図６は、ヒトＬＴＡ４ヒドロラーゼｍＲＮＡ配列である。

図７は、ヒトホスホイノシチド特異的ホスホリバーセＣｍＲＮＡ配列である。

図８は、ＨＬ−６０細胞におけるヲーリボキシゲナーセ誘導の動力学を示すグラ フである。

図９は、ＨＬ−６０細胞における５−リポキシゲナーゼ発現のアンチセンスオリ ゴヌクレオチド阻害を示すグラフである。

図１０は、ラット好塩基球性白血病細胞における５−リポキシゲナーゼ発現のア ンチセンスオリゴヌクレオチド阻害を示すグラフである。

図１１は、ビタミンＤ３で分化したＨＬ−６０細胞における５−リポキシゲナー ゼ発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害を示すグラフである。

図１２は、ＲＢＬ−１うｙｌ′−細胞における５−リポキシゲナーゼ発現のアン チセンスオリゴヌクレオチド阻害を示すグラフである。

図１３は、ＲＢＬ−１ラント細胞における５−リボキシゲナー＋！’ｍＲＮＡの 特異的領域のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害を示すグラフである。

図１４は、Ａ４３１．４ＩＢ胞から分泌されたＦＬＡＰの高速液体クロマトグラ フィー分析を示すグラフである。

図１５は、主要なヒトゲラチノサイトによって引き起こされたＦＬＡＰの増加し た分泌を示すグラである。

北咀Ｏ！些 本発明により、５−リポキシゲナーゼ、５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質 （ＦＬＡＰ）、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＣ，ＬＴＡ４ヒドロラーゼ および脂質代謝を調節する池のタンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリ ッド形成するオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体を提供する。

オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、ｍＲＮＡに対してまた は三重鎖構造を形成する選択された遺伝子に対して直接結合するように設計され 、それによって遺伝子から製造されるｍＲＮＡの量を変調する。

前述の関係を一般的に「アンチセンス」と称する。オリゴヌクレオチドおよびオ リゴヌクレオチド類似体は、ＲＮ、ＡまたはＤＮＡの機能であるそのタンパク質 中への翻訳、細胞質中への翻訳またはその生物学的機能全体に必要な何等かの池 の活性のいずれかを阻害することかできる。ＲＮＡまたはＤＮＡがその機能の全 部または一部分を達成することができない結果として、適切に発現されるべきゲ ノム制御アラキドン代謝の一部分が欠損し、したかって、前記の代謝か変調され る６ アンチセンス攻撃に特異的な遺伝子に的を絞ることか好ましい。５−リポキシゲ ナーゼ、５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質、ホスホリパーゼＡ２、ＬＴＡ ４ヒドロラーセ、ホスホリパーゼＣおよび補酵素Ａ非依存トランスアシラーセを コードする遺伝子はこの研究に関して特に有用てｂるということか分かった。

アラキドン酸合成または代謝を変調することかできるタンパク質をコードする核 酸とハイブリッド形成しうるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似 体と被験動物とを接触させることを含む、アラキドン酸代謝を変調する方法を提 供する。５−リポキシゲナーゼ、５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質、ホス ホリパーゼＡ２、ＬＴＡ４ヒドロラーゼ、ホスホリパーゼＣ、トロンボキサンシ ンターセおよび補酵素Ａ非依存トランスアシラーセをコードするＲＮＡまたはＤ ＮＡとハイブリッド形成しうるオリゴヌクレオチドまたは類似体が好ましい。

ユ明ム註岨望説朋 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、多数のヒト疾患の治療用の治療薬として大 いに期待されている。概念的に、塩基の対合によってＲＮＡ分子などの一次構造 と相互作用する化合物を設計することは、酵素の活性部位と相互作用する分子を 設計することよりもはるかに容易である。オリゴヌクレオチドは、ワトソンーク リック型塩基対によって定義される前ｍＲＮＡかまたは成熟ｍＲＮＡの相補的配 列に対して特異的に結合して、ＤＮＡからタンパク質への遺伝情報の流れを阻害 する。更に、アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的配列に対して特異的になる それらの性質は異常に変化しゃすい８アンチセンスオリゴヌクレオチドは４種類 のモノマー性単位を有する長鎖であるので、それらは何等かの標的ＲＮＡ配列に 対して容易に合成することかできる。多数の最近の研究により、標的タンパク質 を研究するための生化学的手段としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの有用 性が実証された（ローテンベルブ（Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｊ、Ｎａｔｌ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、、８１：１５３９〜１５４４．１９８９；シン（Ｚｏ ｎ）、Ｇ、、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｒｅｓ、、５：５３９〜５４９） 、オリゴヌクレオチド化学、ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドの合成および 増大した細胞取り込みを示すオリゴヌクレオチド類似体の最近の発達ゆえに、現 在、治療法の新規の形態としてアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を考える ことか可能である。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは先行技術の方法において遭遇した問題に対す る理想的な解決法を与える。それらは、与えられたイソ酵素を選択的に阻害する ように設計することかでき、それらは酵素の産生を阻害し、そしてそれらによっ て遊離基捕捉などの非特異的櫟序が避けられる。酵素の機序を完全に理解するこ とは、特胃的阻Ｗ削！−設計するのに必要ではない。

アラキドン酸の代謝を変調する現在の薬剤は、それらめ特異性の欠如によって多 数の許容できない副作用を示し、またはそれらは疾患を治療する場合に制限され た有効性力みを示す１本発明は、酵素を直接阻害するよりもむしろ、酵素の産生 を阻害することによって従来の技術者か遭遇した問題を克服して冶瞭効果を達成 する。目的のアラキドン酸の合成または代謝に関係した多数の酵素か存在してい る。これらの多数の酵素の内の６種類を、アラキドン酸合成におけるそれらの重 要な役割または特異的アラキドン酸代謝の発生におけるそれらの選択性に基づく 最も臨界的標的として選択した６図１で示したように、本発明者はアラキドン酸 経路の要所での多数のタンパク質を同定した６本発明において、オリゴヌクレオ チドまたはオリゴヌクレオチド類似体はｍＲＮＡに対してまたは三重ｇｉ槽構造 形成する遺伝子に対して直接結合するように設計されて、遺伝子から製造される ｍ　ＲＮ　Ａの量を変調する。

アラキドン酸は、食餌から直接かまたは、双方とも補乳動物組織中においてアラ キドン酸に代謝されることかできるリノールＨまたリルン酸の食餌摂取量によっ て得なければならない・必須脂肪酸である。アラキドン酸はＭ脂質にエステル化 されて貯蔵されている。これらには、中性脂質、例えば、トリグリセリドおよび ジグリセリド、リン脂質、ρ１えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエ タノールアミン、ホスファチジルイノシトールおよびホスファチジルセリン：並 びにコレステロールエステルかある。エステル化アラキドン酸は、シクロオキシ ゲナーセおよびリポキシゲナーゼ経路による代謝には利用できない、したがって 、グロスタグランジンおよびロイコトリエンの合成のための律速段階は細胞膜か らの放出である６大部分の（［Ｌ動物細胞において、プロスタクランジンおよび ロイコトリエンの合成のための主要なアラキドン酸源はリン脂質であると考えら れる。

特異的アゴニストによって刺激された細胞は、多数の異なる経路によって膜リン 脂質からアラキドン酸を放出する（図１）、与えられた組織種類において全部の 経路を用いてよいか、しかしながら、ａ離アラキドン酸生成のための最も直接的 な経路、すなわち、ホへホリバー上。八２は放出されたアラキドン酸の最大量の 原因であると考えられる。ある種の細胞種類において、ホスホリパーゼＣ／ジグ リセリドリパーゼ経路が、膜脂質から放出された多量の７ラキドン酸に有意に寄 与することかできる（ベル（Ｂｅ　Ｉ　Ｉ　）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．、へ ｃａｄ。

Ｓｃ　ｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、　、７６　：　３２３８〜３２４　Ｌ　：マハデヴアバ （Ｍａｈａｄｅｖａｐｐａ）およびホラブ（）（ｏｌ＋ｘｂ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ 、　−Ｂｉｏ　ｈｖｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、、１３４　：１３２７〜１３３３゜ １９８６）。

いくつかの最近の研究は、アラキドン＃！ｉと放出するリン脂質プールは、シク ロオキシゲナーセおよびリポキシゲナーゼ経路に対して様々であるということを 示唆している（ヒュームズ（Ｈｕｍｅｓ）ら、Ｊ、Ｂｔｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５ ７：１５９１〜ｌ　５９４　；チルトン（Ｃｈｉｌｔｏｎ）およびコネル（Ｃｏ ｎｎｅ　ｌ　ｌ）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６３：５２６０〜う２６５： １９８８　；スゲレット（Ｓｋｅｒｒｅｔｔ）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１４ ４：１０５２〜１，０６１．１．９９０）、　したかって、興なる脂質プールを 変調することは、プロスタグランジンおよびロイコトリエンの合成に対して種々 の効果を有していてよい。特に、１位にエーテル結合を有するホスファチジルコ リンの興なる亜種（１−Ｏ−アルキル、２−アラキトニルホスファチジルコリン ）は、ヒト好中球でのＬＴＢ４合成に用いられた主要なアラキドンＢ源であると 考えられる（チルトンおよびコネル、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６３：５２ ６０〜う２６う）、ホスホリパーゼＡ２によるこの脂質種の加水分解の結果、遊 離アラキドン酸および血小板活性化因子の直接の前駆物質である１−〇−アルキ ルリゾホスファチジルコリンを生じる（図２）。補酵素Ａ非依存トランスアシラ ーセの阻害によるこの脂質種の合成の阻害かまたはホスホリパーゼＡ２の阻害に よる脂質の加水分解の阻害は、ロイトリエンおよび血小板活性化因子双方の産生 を阻害するであろう。

膜脂質から放出されたアラキドン酸は、アシルトランスフエラーセによって再度 エステル化されて脂質中に戻されるかまたは種々のオキシゲナーゼによって更に 代謝されることができる。治療上、オキシゲナーゼの最も重要な二つの種類はシ クロオキシゲナーゼおよびリポキシゲナーゼである。シクロオキシゲナーゼはア ラキドン酸を酸素化し且つ環化して、プロスタグランジンの合成の第一段階であ る環状エンドペルオキシド中間体ＰＧＨ２を生成する（図１）、■乳動Ｓ細胞中 には多数のりボキシゲナーゼ酵素が存在し、それらが分子ｆＩ！ｉ素を挿入する 二重結合の位置によって分類され、すなわち、５−リポキシゲナーゼ、１２−リ ポキシゲナーゼおよび１５−リポキシゲナーゼである。１２−および１５−リポ キシゲナーゼ生成物は若干の生物学的活性を有するが、最もよく特徴化されたり ボキシゲナーセ生成物は５−リポキシゲナーゼから誘導されたものである。ラー リボキシゲナーゼ生成物であるロイコトリエンは効力のある生物学的活性を有し 且つ様々な疾患状態での病理学に寄与することにｒＩＪｊ係している。５−ツボ キシゲナーゼの活性化機序の一部分として、酵素か細胞質ゾル画分から膜へのカ ルシウムに誘導されたトランスロケーションを行うことは明らかであり、そこで それは５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質（ＦＬＡＰ）と称される特昇的膜 タンパク質と相互作用する。５−リポキシゲナーゼとＦＬＡ、Ｐとの相互作用は 、細胞中でのロイコトリエン合成に必要であると考えられる（ルーザー（Ｒｏｕ ｚｅｒ）ら、Ｊ、Ｂｉｏ　１．Ｃｈｅｍ、、２６う：１４３６〜１４４２　；デ ィクソン（Ｄｉｘｏｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３４３：２８２〜２８４）。

同定されたアンチセンスオリゴヌクレオチド標的は、５−リポキシゲナーゼ、５ −リポキシゲナーゼ活性化タンパク質、ホスホリパーゼＣの特異的イソ酵素、ホ スホリパーゼＡ　の特異的イン酵素、ＬＴＡ４ヒドロラーセおよび補酵素Ａ非依 存トランスアシラーセである。これらの標的は、アラキドン酸代謝に対するいく つかの重要な副経路研究方法を示す。リポキシゲナーゼ経路および血小板活性化 因子合成は、前駆物質リン脂質である１−０−アルキル、２−７ラキドニルホス フアチジルコリンの合成（補酵素Ａ非依存トランスアシラーセ）を阻害すること によってかまたは膜リン脂質からのアラキドン酸の放出（ホスホリバー−２’Ａ ２およびホスホリパーゼＣ）を阻害することによって接近する。リポキシゲナー ゼ経路は、更に、ロイコトリエンへのアラキドン酸の代謝（ラーリボキシゲナー セおよびＬＴＡ４ヒドロラーセ）またはラーリボキシゲナーセの活性化（５−リ ポキシゲナーゼ活性化タンパク質）を阻害することによって特異的に阻止するこ とができる。標的箇所め選択によって分かるように、アラキドン酸代謝の変調手 段は選択されたタンパク質に依存する。

生蚊Ω説囚 リポキシゲナーゼは、酸素１分子を不飽和脂肪酸中に収り込んでいる一群のジオ キシゲナーゼである。リポキシゲナーゼは、基質分子中の酸素化部位によって分 類することかできる。ラーリボキシゲナーセ（５−ＬＯ）は、酸素１分子をアラ キドン酸のＣ５二ｊｉ結合に取り込んで５−ヒドロペルオキシ−６，８，１１゜ １４−エイコサテトラエン酸（５−ＨＰＥＴＥ）を生じるジオキシゲナーゼであ る。更に、精！！！５−　Ｌ　Ｏは、５−ＨＰＥＴＥを共役トリエンエポキシド である５゜６−ロイコトリエンＡ４に変換する。したがって、ロイコトリエンＢ ４およびベアチドロイコトリエンｃロイコトリエンＣ４、ロイコトリエンＤ４お よびロイコトリエンＥ４）生合成経路における最初の二つの酵素的段階は単一の 酵素によって達成される。

５−リポキシゲナーゼ（ラーＬＯ）は多数の細胞種の細胞質ゾル画分から均一に 精製された（ルーザー（Ｒｏｕｚｅｒ）およびサムエルシン（Ｓａｍｕｅ　ｌ５ ｓｏｎ）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ｕ、ｓ。

Δ、、８２：６０４０〜６０４４．１９８う：ホカブーム（Ｈｏｇａｂｏｏｍ） ら、Ｍｏ１．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、、３０：５１０〜う１９，１９８６；ウエダ （Ｕｅｄａ）ら、Ｊ、Ｂｉ　ｏ　１．Ｃｈｅｍ、、２６１　：　７９８２〜７９ ８８．１９８６）、精製酵素は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ って測定される分子量７４〜８０ｋＤａを示す、５−リポキシゲナーゼは、それ 自体か酵素反応経過中に不可逆的様式で失活するという点で自殺酵素である。ラ ーＬＯ自体が失活する正確な機序は解明されていない、５−ＬＯはアラキドン酸 および５−ＨＥＰＴＥ双方を基質として用いてＬＴＡ４を合成することができる 。ラット好塩基球に関して、外因性ヲーＨＰＥＴＥは、ＬＴＡ４合成のための基 質としては、５−リポキシゲナーゼ反応から酵素によって供給された５−ＨＰＥ ＴＥよＱも約ヲＯ昨夕ない活性である。

精製酵素は、カルシウムおよびＡＴＰ双方によって並びに精製中に酵素から１＃ 去されるいくつかの未知の細胞性因子によって活性化される（ルーザーら、Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔ　＋、、へｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８２　：　７５０５〜７５０ ９゜１９８５　；ホガブームら、Ｍｏ１．Ｐｈａｒｍ、、３０：５１０−ラ１９ ．１９８６）。ＡＴＰおよび刺激因子双方が、酵素に対して安定化作用を及ぼす ことなく酵素の初期速度を増加させる。ＡＴＰによる刺激はタンパク賃リン酸化 に関係するとは考えられないし、ホスホジエステル結合の加水分解かＡＤＰおよ びＡＭＰか更に刺激となる場合の要件であるとも考えられない、カルシウムかラ ーＬＯを活性化する一つめ機序は、細胞膜に対する５−ＬＯの結合を促進するこ とである（ルーザーおよびサムエルシン、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓ ｃ　ｉ。

リエン生合成を促進する大部分のアゴニストは細胞内カルシウムを増加させ、し たかって、細胞質ゾルから４１［１１１ａ膜への５−ＬＯのトランスロケーショ ンは、ロイコトリエン生合成において重要な調ｎ＠所であることかできる。この 仮説は、カルシウムイオンフォアによる細胞の処理か、ロイコトリエン産生を伴 ってラーＬ○の膜へのトランスロケーションを引き起こすという観察によって更 に支持される（ルーザーおよびカーブマン（Ｋａｒｇｍａｒ＋ｌ　−Ｊ、Ｂｆｏ 　１．Ｃｈｅｍ、。

２６３：１０９８０＼１０９８８．１９８８）。

ヒト５−リポキシゲナーゼのｃＤＮＡおよびゲノムクーロン（ディクソンら、Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、ＬＪＳＡ、８５：４Ｌ６＋−４２０， １９８８７マツモト（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａ ｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８５：２６〜３０．１９８８：ファンク（Ｆｕｎｋ）ら、Ｐｒ ｏｃ　Ｎａｔ　１．　、八ｃａｄ、Ｓｃ　ｔ、ＵＳ、４．　８６　：　２５８７ 〜２５９１゜１９８９）並びにラントラーＬＯのＣＤＮＡ配列および予測された タンパク質配列は公表された（パル力しり（Ｂａｌｃａｒｅｋ）ら１．Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６３：１３９３７〜１３９４１．１９８８＋、本発明者は、 ヲーＬＯのう・ｌトゲツムクローンを単離し且つ部分的に配列順序決定また。５ −ＬＯのメ・ｌセージは長さが約２７００塩基である。ヒト５−ＬＯは長さか６ ７４アミノ酸で、計算分子量か７７．８３９であるか、ラントラ−ＬＯは長さか ６７０アミノ酸である。ヒトおよびラットの５−しＯのタンパク質配列は９３？ ＜同一であったが、ＣＤＮＡ配列は８０％を屹えて同一であった６主要な転写開 始出発部位は、翻訳開始コドンＡＩＪＧから６５ｂｐ上流である。ヒト５　ＬＯ ｍＲＮＡは、ポリアデニル化部位の前に４３４ｂｐの３゛−非翻訳配列を含む６ ヲーＬＯは、リボコルチンなどのカルシウム依存膜結合性タンパク質に関する１ ７アミノ酸の共通配列に対して５０〜６０％相同である２種類のドメインを含む 、ラーＬＯとカルシウム依存膜結合性タンパク質との類似性は、細胞質ゾルから 膜への５−ＬＯのカルシウム依存トランスロケーションを説明することかできる 。

ヒト５−ＬＯ遺伝子は８０．０００塩基を越える長さである。その遺伝子は、大 きさが１９２塩基対（ｂｐ）から２６ｋｂを上回る１４箇所のエキシンおよび１ ３箇所のイントロンを含み、その遺伝子を既知の最大遺伝子にさせる。５−ＬＯ 遺伝子は単一の複写遺伝子であると考えられる。５−ＬＯ遺伝子は、数種類のハ ウスキーピング遺伝子によって割り当てられた特徴であるＴＡＴＡまたはＣＣＡ Ａ、Ｔ配列を転写開始出発部位に極めて近接して含まない、推定上のブロモ−タ ー領域は、ＳＰ１転写因子に結合するための８箇所の部位を含む。

上記て′論及したように、５−ＬＯは、ロイコトリエンＡ４、ロイコトリエンＢ のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体はこの目的 に有用であるように同定することができる。

前記に示したように、５−リポキシゲナーゼは、ロイコトリエンの合成のために 膿因子を必要とする（ルーザーおよびサムエルシン、Ｐｒｏｃ、ＮａｔＩ　。

Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、８２　：　６０４０１−６０４４）、５−リポキ シゲナーゼに対して直接作用しない新規のロイコトリエン生合成阻害側であるＭ Ｋ８８６の同定は、５−リポキシゲナーゼを活性化する５−リポキシゲナーゼ活 性化タンパク質（ＦＬ、ＡＰｊと称される１８ｋＤａの幌タンパク賃の同定をも たらす（ミマー（Ｍｔｌｌｅｒ）ら−Ｎａｔ、ｕｒｅ、３４３：２７６〜２８Ｌ 、１９９０：ルーザーら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６う：　１４３６　＼ １４４２．　１９９０）、ＦＬＡ、ＰのｃＤＮ、Ａは１６１アミノ酸タンパク質 をコードし、高き量の疎水性７ミ／酸を有する（図３）（ディクソンら、Ｎａｔ ｕｒｅ、３４３：　２８２〜２８４．１９９０）、ＦＬＡＰのｍＲＮＡは長さか Ｉｋｂである。

数回の実験により、Ｆ　Ｌ　Ａ　Ｐは完全な細胞中でのロイコトリエン合成に不 可欠であることか実証される。マーリボキシゲナーゼによってトランスフェクト した骨肉腫細胞は５−リボキシゲナーセ酵素活性を発現するか、カルシウムイオ ノフオアで刺激された場合、ロイコトリエンを合成しない、しかしながら、マー リボキシゲナーゼおよびＦＬＡＰｃＤＮＡ’　ｓによってトランスフェクトした 細胞は５−リボキシゲナーセ酵素活性を発現し、カルシウムイオンフォアによる 刺激に引き続いてロイコトリエンを生じる（ディクソンら、Ｎａｔｕｒｅ、３４ ３：２８２〜２８４）、　次に、ＭＫ８８６は、カルシウムイオンフォア処理お よび次のロイコトリエン産生に引き続いて、４１１１胞質ゾルから膜へのマーリ ボキシゲナーゼのトランスロケーションを妨げることかできることが分かった０ ＭＫ８８６類似体の階級順位効力は、ロイコトリエン合成の阻害と５−リボキシ ゲナーゼトランスロケーションの阻害とを蜘めてよく相関させた（ルーザーら、 ＝Ｊ、ＢｊｏｌＣｈｅｍ、、２６う：１４３６〜１４４２）、こｒ、らのデータ は、ＦＬＡＰに対して向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドかロイコトリ エン産生の阻害に関する代替計画であることを示唆する。

ホスホリパーゼＡ２（ＥＣ３，１，１，４１は、膜リン脂質の５ｎ−２脂肪アシ ルエステル結合を加水分解してアラキドン酸などの遊離脂肪酸およびリゾリン脂 質を生じる別種の群の酵素を生成する。ホスホリパーゼＡ２（ＦＬＡ２）は種々 のヘビおよびハチの＃液中に見出され、噌乳動物膵府中に脂肪分解酵素として分 泌される。更に、ＰＬＡ２＃素は大部分の１し動物ｌｆｉ織中で見出され且つ活 性化した血小板および炎症性細胞から［胞外媒質中に分泌される。ＰＬＡ、は需 乳動鞠細胞において、４１Ｂ胞膜の再生、界面活性剤生合成、膵液中の消化酵素 。炎症性応答の一部分としての簡小板および炎症性細胞からの放出並びに細胞性 リン脂質にエステル化されたアラキドン酸の放出を含む多数の役割を果たしてい る。ＦＬＡ２による遊離アラキドン酸の放出は、１０スタグランジン生合成の律 速段階並びにロイコトリエンおよび血小板活性化因子生合成の臨界的第一段階で あると提案されている。炎症媒介物質の前駆物質の遊離に加えて、高１度でのＰ 　Ｌ　Ａ　２は、細胞溶解を促進することによって細胞に対する直接的細胞毒で あることかできる。ＰＬＡ　が細胞中で果たしている多数の機能は、多数のＰＬ Ａ２酵素の要件を説明することかできる。炎症性滲出液中に見出されるＰＬＡ２ イソ酵素（グルザンス’ｒ　（Ｐｒｕｚａｎｓｋｉ　）およびヴエイダス（Ｖａ ｄａｓ）２．Ｊ。

Ｒｈｅｕｍａｔｏ　１．．１５　：１６０１〜１６０３．１９８８）は、アンチ センスオリゴヌクレオチド標的として特に関心を呼んでいる。この酵素は、エイ コサノイド生合成のために！Ａ胞膜からアラキドン酸を放出する場合の役割を果 たすことができるたけでなく、放出部位で直接の細胞毒性作用を有することかあ る。

近年、セイルハマ−（Ｓｅ　ｉ　ｌｈａｍｅｒ）ら（Ｊ、Ｂｉｏ　１．（：ｈｅ ｍ、。

２６４：う３３５〜５３３８．１９８９＞およびクラマー（Ｋｒａｍｅｒ）ら（ Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６４　：　５７６８〜５７７５．１９８９１は、 慢性関節リウマチ患者の滑液中に存在するヒトＰＬＡ２のｃＤＮＡおよびゲノム クローニングをそれぞれ報告しな。ヒト滑液からＪ＃離されたＦＬＡ２の遺伝子 （Ｓ−ドし、最初の２０アミノ酸は細胞からの分泌のためのシグナルペプチドと して処理される。５Ｆ−ＰＬＡ　のアミノ酸配列は膵臓のＦＬＡ２とは異なり、 ガラカラへと壽に存在するらのなどの第１Ｉ群のＦＬＡ２に一層近密に関連して いる。

された組織分布を示す低量のｍＲＮＡである。制限された組織分布、低量のｍＲ ＮＡ、酵素活性と炎症性疾うの苛酷さとの相開関係は、アンチセンスオリゴヌク 途は明らかである０例えば、カンマインターフェロンは、インターフェロン調節 要素の存在下において５′−非転写領域でのＰＬＡっ合成を増加させるので、ア ンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、カンマインターフェロン処理されたし トゲラチノサイトからのＦＬＡ２の放出を阻害することかできる。

更に、アンチセンスオリゴヌクレオチド雫法は皮膚の炎症性疾うめ治療において 有用であることかでき、そちはＳ　Ｆ−Ｐ　Ｌ　Ａ　２かヒト表皮癌細胞系およ び主要なヒト表皮ケラ千ノサイトから分泌されるという理由による。更に、Ｐ　 Ｌ　Ａ　２は、ガンマインターフェロンかヒトゲラチノサイトからのＰ　Ｌ　Ａ ２放出を誘導した後に、皮膚におけるガンマインターフェロンの炎症性活性を媒 介する役割を果たすゲナーセによって生成されるロイコトリエンＡ４の加水分解 を触′４ｘシて一効力のある炎症媒介物質で・あるロイコトリエンＢ　にする。

ＬＴＡ４ヒドロラーセは、ヒトの１ｌｉＩ＋（オーイシ（ｏｈｉｓｈｉ：１ら５ ．Ｊ、Ｂｉｏ　１．Ｃｈｅｒｎ、、２６２　：１０２００〜１０２０５．１９８ ７）、ヒト白血球（ラドマーク（Ｒａｄｍａｒｋｌら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ 、、２ヲ９：１２３３９〜１２３４５．１．９８４）およびヒト赤血球Ｃマンギ ー（〜１ｃＧｅｅ）およびフッｌツバトリｌ、Ｊり（Ｆｉｔｚｐａｔｒｊｃｋ） 、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ７Ｉｅｍ　、２６０・１２８３２〜１２８３７）から均一に 精製された細胞質ゾルタンパク璽である。

捧および白血球から精製された酵素は、分子量、動力学的性質および基買の選択 に関して赤血球ＬＴＡ４ヒドロラーセとは興なった。ヒトアンチセンスオリゴヌ クレオチド号法の見地から、白血球酵素は赤血球ＬＴＡ、ヒドロラーゼよりも興 弓 味深い、赤血球はＬＴＡ４合成に必要であるマーリボキシゲナーゼを欠いており 、したかつて、ごれらの細胞は、活性化好中球から放出されたＬＴ　Ａ４に顆ら なければならない、ヒトＬＴＡ　４ヒドロラーゼのｃＤＮＡ配列は知られている （ファンク（Ｆｕｎｋ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　ｌ　、、八ｃａｄ、Ｓｔ：　ｉ 、ＵＳＡ、８４゜６６７７〜６６８１．１９８７；ミナミ（Ｍｉｎａｍｉ）ら、 Ｊ、ＢｉｏｌチドｍＲＮＡは、池のエボキシドヒドロラーセに対する配列類似性 を含まない６１０アミノ酸タンパク質（図５）をコードする。したかつて、アン チセンスオリゴヌクレオチドによるｔ−ＴＡ４ヒドロラーセの阻害はミクロソー ムエポキシドヒドロラーゼに影響を及ぼさない。

ホスホリパーゼＣ（ＥＣ３，１，４，３）は、膜リン脂質の５ｎ−３ホスホジエ ステル結合を加水分解してジアシルグリセロールおよびリン酸化極性へンド基を 生じる一群の酵素である。補乳動物ホスホリパーゼＣ（ＰＬｃ）酵素は、加水分 解される極性ヘッド基、すなわち、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノ シトール等に特異性を示す、最近、アゴニストによる受容体占有に広答してホス ホイノシチド脂質を選択的に加水分解するこれらのＰＬＣ＃素か、大いに関心を 呼んでいる。ホスファチジルイノシトール４，５−ビスリン酸の加水分解によっ て、２種類の第二メツセンジャー分子、すなわち、プロテインキナーゼＣの活性 化に必要な補因子であるジアシルグリセロール、およびカルシウムの細胞内非ミ トコンドリア貯蔵物の放出を促進する可溶性第二メｌセ／シャー分子であるイノ シトール１．４．５−トリスリン酸を生じる（べり・ソジ（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ） 、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、５６：　Ｌう９〜１９３．１９８７）、 放出されたジアシルグリセロールは、シダリセロールリパーセおよびモノグリセ ロールリパーゼの逐次的作用によって更に代謝されて遊離アラキドン酸になるこ とかできる。したかって、ホスホリパーゼＣは、第二メ・・ｌセンシャー分子の 生成において重要な酵素であるのみならず、選択した組織でのエイコサノイド生 合成に利用可能なアラキドン酸を製造する場合に重要な役割を果たすことができ る。

補乳動物組織は多数の異なる形態のホスホイノシチド特異的ＰＬＣを含む（クル ーク（Ｃｒｏｏｋｅ）およびベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔｉ　Ｃｅ　Ｉ　ＩのｖＩ ｉ類の細胞表面受容体に結合すること、すなわち、ＰＬＣ−αはツク・／ブレ・ ンシン受容体に結合する、ＰＬＣ−δは成長因子受容体に結合する、等が提案さ れている（エイヤール（ＡｉｙａｒＪら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、２６１　：６ ３〜７０、Ｌ９８９．クルークおよびべ４　ソト、Ｃｅ１ｌ　Ｃａｌｃｉｕｍ、 １０：３０９〜３２３．１９８９；マーゴリス（Ｍａｒｇｏ　Ｉ　ｆｓ）ら、Ｃ ｅｌ＋、５７：１１．０１〜１１０７．１９８９：ヴアール（ＷａｈｌＪら、Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、８６　：　１５６８〜１５７２．１９８９）、Ｐ Ｉ−ＰしＣ酵素の不均一性ゆえに、前炎症性アゴニストのシグナル形質導入経路 を、非炎症性アゴニストのシグナル形質導入経路に影響を及ぼすことなく選択的 に阻害することが可能である。

これまでに、６種類の異なるＰＩ−ＰＬＣ酵素のｃＤＮＡがクローン化された。

酵素は大きさか５０４アミノ酸〜１２う０アミノ酸て゛あつ、類似の生化学的特 性を示す割りには顕著に異なる。５種類の酵素の内の４種類（ＰＬＣ−β、ＰＬ Ｃ〜δ１、ＰＬＣ−δ２およびＰＬＣ−α）は、５０〜８０％の配列類似性を示 す長さが約２５０アミノ酸の２種類のドメインを含む、ＰＬＣ−αは第一ドメイ ンに対してのみ類似性が３３％の配列を含む（クルークおよびベネット、Ｃｅｌ ｌＣａｌｃｉｕｍ、１０：３０９〜３２３．１９８９）、種々のＰＩ−ＰＬＣｕ ｔ素のＤＮＡ配列におけるｗｉ著な相違は、アンチセンス技術を用いる池の酵素 に影響を及ぼすことなく、１種類のＰＩ−ＰＬＣ＃素に的ご綬る選択を可能にす る。

ヒトｃＤＮＡクローンはＰＬＣ−δ２に関してのみ報告された（図６）（オーク （Ｏｈｔａ）ら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、、２４２：３１〜３５．１９８８）、残 りのものはラゾトｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンて′ある。ゲノムクローンはいずれの ｐｒ−ｐＬＣ酵素についても報告されなかった。

研究された浦乳動物組織全部か１種類以上のＰＩ−ＰＬＣｕ素を示す。概して、 一つのＮ頭の哺乳動物＃ｌｌ胞種には２種類以上の酵素が存在する。ＰＩ−ＰＬ Ｃ酵素はそれらの分布において組′ａ選択性を示す、ＰＬＣ−βは主として神経 組織中に見出され且つ脳の主要酵素である。ＰＬＣ−δ１は脳および多数の末梢 組織中に見出される。ＰＬＣ−δ２は免疫細胞中に見出され、そしてＰＬＣ−α は主として末梢組織中にあると考えられる。これまでに、炎症性細胞中で独占的 に見出されるＰＩ−ＰＬＣ酵素は報告されていなかった。しかしながら、ｐｒ− ｐＬｃ−δ２は免疫適格細胞中の重要な酵素であると考えられる。（エモリ（Ｅ ｍｏ　ｒ　ｉ　）ら、Ｊ、Ｂｉｏ　１．Ｃｈｅｍ、、２６４　：　２１８８５〜 ２１８９０１、タンパク質は、全４胞質ゾルタンパク質の０１〜０．０５％を含 む適度に豊富なタンパク質である。ＰＩ−ＰＬＣ！４１素の遺伝子調節、ｍＲＮ Ａまたはタンパク質安定性に関して入手可能な情報は阿もない。

補酵素Ａ非依存トランスアシラーセは、ＣおよびＣ２２ボリ不飽和脂肪酸のジア シル−リン脂質からリゾリン脂質への転移を触媒する（図７）、アラキドン酸は 、４個の二重結合か５位、８位、１１位および１４位にある２０炭素脂肪酸であ る。補酵素Ａ非依存トランスアシラーセは、血小板活性化因子およびロイコトリ エンの前駆物質として役立つアラキトニル含有エーテルリン脂質の生成において 重要な酵素である（図７）、補酵素Ａ非依存トランスアシラーゼは、ミクロソー ム膜に局在した膜内在住タンパク質であり、ゲル濾過クロマトグラフィーによっ て測定される見掛けの分子量は５０〜６０ｋＤａである（Ｃ，Ｆ、ベネット（Ｂ ｅｎｎｅｔｔ）、未公表データ）、酵素は、それが他の脂肪酸トランスアシラー ゼまたはアシルトランスフエラーセとは異なって活性に補酵素Ａを必要としない という点で独特である。更に、それは、供与体脂質種および受容体脂質双方に間 するかなり厳密な特異性を示す、酵素は、ＣまたはＣ２２ボリ不飽和脂肪酸を５ ｎ−２位に供与体脂質として含むジアシルホスファチジルコリン種を好む（スギ ウラ（Ｓｕｇｉｕｒａ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６２：　１１９９〜 １２０５．１９８７＞、ホスファチジル−エタノールアミンは供与体脂質種とし ての効力かホスファチジルコリンよりも劣っていたし、ホスファチジルイノシト ールは脂肪酸供与体として役立たなかった。２０個未満の炭素長さの脂肪酸、例 えば、パルミチン酸およびソノール酸ははるかに低い効率で転移しな。

更に、酵素は受容体リゾリン脂質に対して特異性を示した。極性ヘッド基として イノシトール、セリンおよびリン酸塩を含むリゾリン脂質は、補酵素Ａ非依存ト ランスアシル化の受容体として役立たなかった。１−０−アルキルリゾホスファ チジルコリンは好ましい受容体脂質種であり、１−アルキルリゾホスファチジル コリン、１−アシルリゾホスファチジルコリン、１−アルケニルリゾホスファチ ジルエタノールアミン、１−アルキルリゾホスファチジルエタノールアミンおよ び１−アシルリゾホスファチジルエタノールアミンはそれぞれ、受容体脂質とし ての１−アルキルリゾホスファチジルコリンの場合と同様の約５００６の活性を 示した。

治療用には、ラーリボキシゲナーゼ、ヲーリボキシゲナーセ活性化タンパク質、 ５Ｆ−ＰＬＡ２、ＰＩ−ＰＬＣ−δ２、ロイコトリエンＡ４ヒドロラーゼおよび 補酵素Ａ非依存トランスアシラーセコ誠少させる二とによって変調することかて ゛きる疾患を有すると疑われる被験動物に、本発明によるオリゴヌクレオチドを 投与することによって治療する６当事者は、最適投薬量、投藁方法論および反復 率を容易に決定することかできる。このような治療は、概して、全治するかまた は疾俄状態の軽減か達成されるまで続けられる。長期間の治療は若干の疾恨に関 して適当である。

本発明では、アラキドン酸代謝を変調することかできるタンパク質に対応するＲ ＮＡおよびＤＮＡの機能のアンチセンス阻害で用いるためのオリゴヌクレオチド およびオリゴヌクレオチド類似体を用いる。本発明の内容において、′オリゴヌ クレオチド５という用語は、天竺に存在する塩基および本来のホスホジエステル 結合によって結合したシクロフラナシル基から生成されたポリヌクレオチドを！ 味する。この用語は、天竺に存在する種または天、χに存在するサブユニ・ト若 しくはそ７″Ｌちに近い同族体から生成された合成種を効果的に意味する。

−オリゴヌクレオチド類似体、という用語を本発明に関連して用いる場合、それ は、オリゴヌクレオチドと同機に機能するか近密に類似していない天然に存在し ていない部分を有する残基を意味する。したがって、オリゴヌクレオチド類似体 は変更された＠残基または糖量結合を有することかできる。これらを代表するも のは、当該技術分野て用いるのに知られているホスホロチオエートおよび他の硫 黄含：Ｉｒ種である。若干の好ましい態様により、オリゴヌクレオチドの少なく と６若干のホスホジエステル結合は、活性か変調されるＲＮＡまたはＤＮＡが位 置している細胞の領域中に組成物か滲出する能力を増大させるように機能する楕 円で１喚された。このような置換は、ホスホロチオエート結合、メチルホスホロ チオエート結合または短猪アルキル若しくはシクロアルキル構造を含むことか好 ましい、他の好ましい実施態様により、ホスホジエステル結合は、同時に実質的 に非イオン性且つ非キラルである池の構造で置換されている。当業者は、本発明 の実施で用いるための池の結合を選択することかできる。

オリゴヌクレオチド類似体としては、更に、少なくともある程度修飾された塩基 形態を含む種を挙げることができる。　％１えば、天竺に遣常見出されるもの以 外カプリンおよびピリミジンをそのように用いることかできる。同様に、ヌクレ オチドサブユニＶトのシクロフラナシル部分の修飾は、本発明の本質的見解に忠 実て′ある限りにおいて行うことができる。

このような類似体は、天然のオリゴヌクレオチド（または天竺の系列に治った合 成オリゴヌクレオチド）と機能的に交換しつると最もよく記載されているが、天 然の構造との相違か１種類以上ある。この種の類似体はいずれら、アラキドン代 謝を変調することかて′きるタンパク質の１種類に対応する遺伝子由来のＲＮＡ およびＤＮＡとハイブリッド形成するように効果的に機能する限りにおいて、本 発明に包含される１本発明によるオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド 類似体は−好ましくは、約３〜約う０個のサブユニ・ｌトを含む、このようなオ リゴヌクレオチドおよび類似体は、約８〜約２５個のサブユニットを含むのが更 に好ましく、なお一層好ましいのは、約１２〜約２２個のサブユニットを有する ことである。理解されるように、サブユニットは、隣接するサブユニットに対し てホスホジエステル結合または他の結合によって適当に結合した塩基−糖組み合 わせである。

本発明によって用いられるオリゴヌクレオチドおよび類似体は、便宜上および日 常的に、固相合成の周知の技法によって製造することができる。この種の合成用 装置は、アプライド・ハイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｉを含むいくつかの販売業者によって販売されている。この櫟の合成用の何等か の他の手段を用いてらよいか、しかしなから、オリゴヌクレオチドの実際の合成 は十分に日常的技術者の能力の範囲内である。

類似の技法を用いて他のオリゴヌクレオチド類似体、例えば、ホスホロチオエー トおよびアルキル化誘導体を製造することも周知て゛ある。

本発明により、当業者は、ＤＮＡから転写されるその読み取り枠（ＯＲＦＳ）に よって識別されたメンセンジャーＲＮＡは、Ｄ　Ｎ　Ａの０ＲＦｓからの情報た けでなく、５゛非翻訳領域、３′非翻訳領域およびイントロン／エキシン結合リ ボヌクレオチドとして当業者に知られている領域を形成する関連リボヌクレオチ ドら含むことを理解する。したがって、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレ オチド類似体は本発明によって明確に表すすことができ、それらは、これらの関 連リボヌクレオチド並びに情報のりボスクレオチドに対して全体的にまたは部分 的に的か絞られる。好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドまたは類似 体は、転写開始部位、翻訳開始部位またはイントロン／エキジン結合と特異的に ハイブリッド形成しうる。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌ クレオチド類似体はう゛キャンプ部位に隣接する配列と特異的にハイブリッド形 成しうる。

本発明により、オリゴヌクレオチドは、アラキドン酸の合成または代謝を変調す るタンパク質をコードしている核酸と特異的にハイブリ１ド形成しうる。好まし い実施５棟において、前記のタンパク質は、５−リポキシゲナーゼ、ラーリボキ ジゲナーゼ活性化タンパク質、ホスホリパーゼＡ２、ＬＴＡ４ヒドロラーゼ、ホ スホリパーゼＣおよび補＃素、Ａ非依存トランスアシラーセである。対応する配 列を含むオリゴヌクレオチド若しくは類似体またはその一部分は本発明において 存用て゛ある。例えば、図３は、ヒトラーリボキシゲナーセｍＲＡＳ配列であり ；図４は、ヒト滑ｉＰＬＡ２ｍＲＡＮ配列であり：図５は、ヒドラ−リポキシゲ ナーゼ活性化タンパク質配列であり：図６は、ヒトＬＴＡ４ヒドロラーセｍＲＮ Ａ配列であり：そして図７は、ヒトホスホイノシチド特異的ホスホリバーセＣｍ ＲＮＡ配列である１本発明において育用なオリゴヌクレオチドまたは類似体は、 これらの配列の１種類またはそれらの一部分を含む、したかつて、前記に記載の これらのオリゴヌクレオチド（またはそれらの類似体）のいずれか、または当業 者が２アラキドン酸の合成または代謝の変調に好ましいアンチセンス標的の知識 から製造することかできる類似のヌクレオチドのいずれかを用いることか好まし い。

本発明の若干の好ましい実施態様を、下記の実施例によって例証する。変調のた めの標的ｍＲＮＡ種は５−リポキシゲナーゼに関する。当業者は１本発明はそれ に制限されないが、しかしながら、それは〜般的に容易に評価しつるということ を理解する。酵素５−リポキシゲナーゼの産生の阻害または変調は、疾患の冶唆 において有意の治療上の利点を有することが期待される。組成物の有効性を評価 するために、１種類または一連の検定法が必要である。

寒謄倒 衷橿医上 ５−リポキシゲナーゼに関する細胞検定法は、ヒト前骨髄性白血病細胞系ＨＬ− ６０を用いる。これらの細胞は、様々な既知の薬剤によって単球様ＭＡ＠かまた は好中球様細胞に分化するように誘導することができる。１．３％ジメチルスル ホキシド（ＤＭＳＯ）を用いる細胞の処理は、好中球への＠胞の分化を促進する ことか知られている６現在２基本的ＨＬ−６０４［１］胞は、現在の検出法の下 限で５−リポキシゲナーゼタンパク質を合成しまたはロイコトリエン（ラーリボ キシゲナーセの下流生成物〉を分泌することが分かっている。ＤＭＳＯによる細 胞の分化は、ＤＭＳＯを添加して４８時間後に５−リポキシゲナーゼタンパク質 およびロイコトリエン生合成の出現を引き起こす、カルシウムイオノフオアに刺 激されたＨＬ−６０細胞からの５−リポキシゲナーゼｍＲＮＡおよびロイコトリ エンＢを８〜１０倍増加させる。したかって、５−リポキシゲナーゼタンパク質 合成の誘導は、これらの＋＄８１胞での５−リポキシゲナーゼ合成を妨げるアン チセンスオリゴヌクレオチドの分析用試験システムとして利用することができる 。

ラーリボキシゲナーセ生合成の阻害の効果は、刺激された細胞から放出されたロ イコトリエンの量の減少である。ＤＭＳＯで分化したＨＬ−６Ｃ１飽は、カルシ ウムイオンフォアＡっ３１８７による刺激によってロイコトリエンＢ４を放出す る。細胞媒質中に放出されたロイコトリエンＢ４は、ラジオイムノアンセイによ って商業的入手可能な診断用キット（二ニー・イングランド・ヌクレア（Ｎｅｗ 　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）、ボストン、ＭＡ）を用いて定量すること ができる。ロイコトリエンＢ４産生は、細胞を好中球様細胞に分化させるＤＭＳ Ｏを添加して４８時間後にＨＬ−６０細胞中で検出することができる。細胞（２ Ｘ１０’個細胞／ｍＬ）を、増加濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用い て１，３％ＤＭＳＯ存在下において４８〜７２時間処理する。細胞を、１％脱脂 ウシ血清アルブミンを含むダルベツコリン酸緩衝溶液中で洗浄し且つ５Ｘ１０’ 個細胞／ｍＬの濃度で再懸濁させる。

細胞を１０μＭカルシウムイオノオアＡ２３１８７で１５分間刺激し、そして５ ｘｌＯ’個細胞から生じたＬＴＢ４の量を、製造業者によって記載のラノオイム ノアソセイによって決定した。

実施例２ アンチセンスオリゴヌクレオチドの第二の試験システムは、５−リポキシゲナー ゼが、それ自体が基質との反応によって失活するという点で「自殺」酵素である という事実を利用する。分化したＨＬ−６０細胞または５−リポキシゲナーゼを 発現する池の細胞を、カルシウムイオノフオアである１０μＭのＡ２３１８７で 処理することは、素を引き続き防活性化して細胞質ゾルから膜への５−リポキシ ゲナーゼのトランスロケーションを促進する。活性化および数回の触媒作用の後 に、酵素は触媒的に失活する。したがって、カルシウムイオノフオアによる細胞 の処理は内因性５−リポキシゲナーゼを失活させる。ロイコトリエンＢ４を合成 するそれらの能力によって測定したところ、細胞はＡ２３１８７処理から回復す るのに約２４時間を要する。

予備的データは、アンチセンスオリゴヌクレオチドがこのモデルシステムにおい て効果を有することを実証するぐ図９）。ＨＬ−６０ＭＥ胞をＤＭＳＯで７２時 間分化させ、１０μＭのＡ２３１８７で処理し、そしてリン酸緩衝溶液中で３回 洗浄してカルシウムイオノフオアを除去した。細胞を、１０％ウシ胎児血清を含 むＲＰＭＩ−１６４０中にｌＸｌ０’個細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させ、オリゴ ヌクレオチドを最終濃度２５μＭかまたは７５μＭまで加えた。用いられたオリ ゴヌクレオチドを下記に示し、Ｎはホスホジエステル結合を示し且つＳはホスホ ロチオエート結合を示す。

結果は、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドは検定において不活性であったが 、しかしながら、項似のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは種々の程度の 活性を示したことを示唆している（図９）。最も活性なオリゴヌクレオチドであ る８Ｓは、イントロンＨのイントロン／エキジン結合の３′側を標的とした。

実施例３ アンチセンスオリゴヌクレオチドが完全な細胞に与える、容易に定量することが できる最も直接的な効果は、５−リポキシゲナーゼタンパク質合成の特異的阻害 である。この技法を実施するために、細胞を３５Ｓ−メチオニン（５０μＣｉ／ ｍＬ）を用いて３７℃で２時間標識して、新たに合成されたタンパク質として表 示する。細胞を抽出して全細胞性タンパク質を可溶化し、そして５−リポキシゲ ナーゼを５−リポキンゲナーゼ抗体によって免疫沈殿させる。免疫複合体をプロ ティンＡセファロースビーズを用いてトラップさせる。免疫沈殿タンパク質を５ ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分割し且つオートラジオグラフ ィーに暴露する。免疫沈殿した５−リポキシゲナーゼの量は走査型デンシトメト リーによって定量する。

これらの実験からの予測された結果は下記の通りであった。対照細胞から免疫沈 殿した５−リポキシゲナーゼタンパク質の量を１００％に規格化した。細胞を、 １μＭ、１０μＭおよび３０ＡｔＭの有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドで ４８時間処理することにより、免疫沈殿した５−ＬＯは、それぞれ対照の５％、 ２５％および７５％まで減少した。

細胞ホモジネート中の５−リポキンゲナーゼ酵素活性の測定は、ロイコトリエン を合成することができる存在する酵素の量を定量するのに更に有用である。現在 、ラジオメトリックアッセイが、逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて細胞 ホモジネート中の５−リポキンゲナーゼ酵素活性を定量するために開発されてい る。細胞を、プロテアーゼ阻害剤およびＥＧＴＡを含む緩衝液中において音波処 理によって破壊する。細胞ホモジネートをＳ、ＯＯＯＸｇで１５分間遠心分離し 、上澄み液の５−リポキシゲナーゼ活性を分析する。細胞質ゾルタンパク質を１ ０μＭ”　Ｃ−アラキドン酸、２ｍＭのＡＴＰ、５０μＭ遊離カルシウムおよび ５０ｍＭビス−トリス緩衝液、ｐＨ７，０を用いて３７℃で１０分間インキュベ ートする。反応を、等量のアセトンおよび脂肪酸の添加によって急冷し、酢酸エ チルで抽出する。基質および反応生成物を、ノヴアバク（Ｎｏｖａｐａｋ）Ｃ１ ８カラム（ウォーターズ・インコーポレーテノド（Ｗａｔｅｒｓ　Ｉｎｃ、）、 ミルフォード、ＭＡ）上の逆相高速液体クロマトグラフィーによって分離する。

放射性ピークをベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）１７１型ラジオ−クロマトグラフ ィー検出器によって検出する。ジーＨＥＴＥ’　ｓ、５−ＨＰＥＴＥおよび５− ＨＥＴＥに変換されたアラキドン酸の量を５−リポキシゲナーゼ活性の尺度とし て用いる。

アンチセンスオリゴヌクレオチドの５−リポキシゲナーゼ発現に対する効果を検 出する手段として酵素活性の定量を用いる予備的データを図１０に示す。基本的 条件下で高量の５−リボキンゲナーゼ活性を発現するラット好塩基球性白血病細 胞系であるＲＢＬ−１細胞を検定用に用いた。細胞を５０μＭオリゴヌクレオチ ドで４８時間かまたは５０μＭオリゴヌクレオチドで２４時間処理した後、追加 の５０μＭオリゴヌクレオチドを加え、そして細胞を更に２４時間インキュベー トした。細胞を採取し、５−リポキンゲナーゼ酵素活性の量は５０００ｘｇ上澄 み液のタンパク質１０μｇを用いた。用いられたオリゴヌクレオチドはホスホロ チオエート結合を含んでいた。オリゴヌクレオチドの配列は、 ｒ５Ｌｏ−Ｉｓ：５′−、ＡＧＧＣＡＴＧＧＣＴＣＴＧｑＧＡＡＧＴＧ−３Ｈ５ ＬＯ−２７Ｓ・５’　−ＣＧＡＣＴＣＣＧＴＧＣＴＧＧＣＴＣＴＧＡ−３′であ った。ｒ５ＬＯ−１５に対するオリゴヌクレオチドは、ラット５−リポキシゲナ ーゼｍＲＮＡの翻訳開始コドンＡＵＧにハイブリッド形成する配列に対応するが 、Ｈ５ＬＯ−２７３は、いずれの既知の細胞性ＲＮＡ’　ｓともハイブリッド形 成しないランダム配列を有する対照オリゴヌクレオチドである。結果は、双方の 処理条件下で、アンチセンスオリゴヌクレオチド−５−リポキシゲナーゼは酵素 活性を減少させ、それぞれ４８％および５６％であったことを実証する。対照オ リゴヌクレオチドＨ２７Ｓは、単一投与量として与えられた場合に５−リポキシ ゲナーゼ活性を有意に減少させなかったし、二倍の投与量として与えられた場合 に１７％まで活性を阻害した（図実施例５ アンチセンスオリゴヌクレオチドを、更に、１．２５−ジヒドロキシビタミンＤ ３で分化したＨＬ−６０細胞中の５−リポキシゲナーゼ活性を阻害するそれら能 力に関して試験した。オリゴヌクレオチド処理のために、細胞を無血清培地（Ｏ ｐｔ　ｉ　ＭＥＭ）中で３回洗浄し且つ４Ｘ１０’個細胞／ｍＩの濃度で再懸濁 させた。細胞懸濁液５ｍｌを、各オリゴヌクレオチド処理用の２５ｃｍ２の組織 培養フラスコに入れた。各フラスコに対して市販のＤＯＴＭＡを３２μＭを加え てオリゴヌクレオチド取り込みを増大させ、各アンチセンスオリゴヌクレオチド １μＭを加えた。細胞をＤＯＴＭＡおよびオリゴヌクレオチド存在下において３ ７℃で４時間インキュベートした後、４００Ｘｇで１０分間遠心分離して細胞を ペレットにした。細胞ベレットを、１０％ウシ胎児血清、１０μＭオリゴヌクレ オチドおよび０．１μＭの１゜２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を含むＲＰＭ１ １６４０培地１０ｍ１中に再懸濁させた。８４時間の分化後、５−リポキンゲナ ーゼ酵素活性を、細胞ホモジネート１００μｇを用いて実施例４に記載したよう に測定した。

この系列の実験で用いられたアンチセンスオリゴヌクレオチドは下記の配列を存 するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであった。

工ｓ１５１８２０　ＣＧＧＴＣＣｋＧＧＴＧＴＣＣＧＣｋＴＣＴ　−５’　キヤ 、、ブニハイフリソト形成する。　配列 工ＳＸ５１８２１　ＣＡＴＧＧＣＧＣＧＧＧＣＣにＣにＧＧ−ＡＵＧ：ｌドンニ ハイブリソド形成スル。　ＸＳ工Ｓ　１８２２　ＧＡＣＣＧＴＧＴＡＧＧＡＧＧ ＧＣＡＴ−ＡＵＧ：］トン１こハイプリン）’形５３２する。ｌ５ＩＳ　１８２ ０、［ＳＩＳ　１８２１およびｌ５ＩＳ　１８２２はオリゴヌクレオチド非処理 細胞と比較したところ、５−リポキンゲナーゼ酵素活性をそれぞれ６０．９％、 ６７．９％および５８．８％減少さた（図１１）。これらのデータは、ヒト細胞 系での５−リポキンゲナーゼ発現を抑制する場合のアンチセンスオリゴヌクレオ チドの有用性を実証しているアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ラット細胞に おいて５−リポキシゲナーゼ発現を阻害する場合にも有効である。ラット好塩基 球性白血病細胞（ＲＢＬ−１）は、分化したＨＬ−６０細胞と比較して２０＠を 越える５−リポキンゲナーゼ酵素活性を発現する。ＲＢＬ−１細胞を、１μＭオ リゴヌクレオチドを１６μＭのＤＯＴＭＡ存在下で用いて無血清培地中で４時間 処理した。次に、細胞を、ウシ胎児血清を含むＤ〜ｉＥＭ培地中の５μＭオリゴ ヌクレオチドと一緒にインキュベートした。５−リポキシゲナーゼの半減期は約 ２４時間であり、したがって、細胞をオリゴヌクレオチドで５日間処理した。５ Ｂ間の最後に細胞を音波処理し、そして細胞抽出物中の５−リボキンゲナーゼ活 性を実施例４に記載したように決定した。

オリゴヌクレオチドｒＳＩＳ　２１７７、ｌ５ＩＳ　１８２７および［５１Ｓ　 １８３１はいずれも５−リポキンゲナーゼ酵素活性を３５％減少した（図１２） 。オリゴヌクレオチドはいずれもホスホロチオエート結合を有し且つ下記の配列 を有した。

５＋−，１，、、、、、、、、、、、、，０，−３−一、へＵＧコドンにハイブ リッド形成する。

配列番号２　（１５１５１８２７）　ＡＣＡＴＧＧＧＣＴＡ　ＣＣＡＧＣＡＧＣ ＴＧＧＧ’！’ＧＧ−イントロン／エキラン結合にハイブリッド形成する配列番 号３　（工Ｓ工Ｓ　１８］１１　ＴＴＧＡＣＴＣＴＧＴＣＡＣＴＣＡＡＧＡＧ− イントロン／エキラン結合にハイブリッド形成する与えられたもう一つの系列の アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害反応は、ｍＲＮＡの特異的領域がアンチセ ンスオリゴヌクレオチドによる阻害に対して一層感受性であることを実証する。

ＲＢＬ−１細胞を実施例６に記載したようにオリゴヌクレオチドで処理し、そし てオリゴヌクレオチドによる処理の５日後に細胞の５−リポキシゲナーゼ酵素活 性を検定した。細胞をオリゴヌクレオチドｌ５ＩＳ　２８１７、ｌ５ＩＳ　２８ ２１およびｌ５ＩＳ　２８２２で処理したが、しかしながら、３′非翻訳配列に ハイブリッド形成するｌ５ＩＳ２８２１だけは５−リポキンゲナーゼ酵素活性を 阻害した（図１３）。オリゴヌクレオチドはいずれも下記の配列を有するホスホ ロチオエートオリゴヌクレオチドであった。

５＋−、、、、、、、＋、６．．．．．−３＋配列番号４　（工Ｓ工Ｓ　２８１ ７）　ＧＧＡＡＧＧＣＡＴＧＧＣＴＣＴＧＧＧＡＡ−ＡＵＧコドンにハイブリッ ド形成する。

配列番号５（ＸＳＸＳ　２８２１）　ＧＣＣＴＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧＣＴＧＣ！ ’Ｇ−３′非翻訳配列にハイブリッド形成する１ｊＪｌｌＩ号６　（ｘｓ工Ｓ　 ２８２２）　ＧＧｋｋＧｋＴＣｒｋＣＡＧＣＣＴＧＣＣｋ−３′非非翻訳列にハ イブリッド形成する実施例８ マウスでの５−リポキノゲナーゼ産生阻害は、下記のプロトコルにしたがって実 証することができる。アラキドン酸の局所塗布によって、ロイコトリＢ４、ロイ コトリエンＣ４およびプロスタグランジンＥ２が皮膚中に速やかに生じた後、水 腫および細胞浸潤が生じる。５−リポキンゲナーゼのある阻害は、この検定にお いて活性を示すことが分かった。検定用に、アラキドン酸２ｍｇをマウスの一方 の耳に塗布し、反対側の耳は対照として役立つ。多形核細胞浸潤は、アラキドン 酸を投与して１時間後の生検材料から得られたホモジネート中のミエロペルオキ シダーゼ活性によって検定される。水腫状の応答は、耳の厚みおよびパンチ生検 材料のａ潤重量の測定によって定量される。生検材料試験片中で生じたロイコト リエンＢ、の測定は、組織中の５−リポキシゲナーゼの直接測定として実施され る。アラキドン酸を投与する１２〜２４時間前にアンチセンスオリゴヌクレオチ ドを両耳に局所的に塗布して化合物の最適活性を可能にするう 実施例９ アレルギー性および炎症性疾患並びに外傷の治療に関する５−リポキシゲナーゼ 発現の阻害。

本発明の範囲内にある代表的な分子を下記に記載する。この実施例で記載した最 初の３種類の分子は、好ましくは、５−リポキンゲナーゼｍＲＮＡに結合する。

第四の分子は５−リポキンゲナーゼ遺伝子に結合して三重鎖構造を形成し、それ によって５−リポキシゲナーゼ遺伝子から製造されたｍＲＮＡの量を変調する。

　（１）第一の代表的な分子において、塩基配列は、開始コドンで開始し且つ読 取り枠中に延長し、５−リポキンゲナーゼｍＲＮＡの１５個のりポヌクレオチド 単位全部にハイブリッド形成する５−リポキシゲナーゼｍＲＮＡに対して相補的 である。

（２）第二の代表的な分子は、５−リポキンゲナーゼｍＲＮＡの翻訳終結シグナ ルに先行する１２個の相接するリボヌクレオチドに対して相補的であ（３）第三 の代表的な分子は、５−リポキンゲナーゼｍＲＮ　Ａの５′末端付近の３０ｍの 相接するリボヌクレオチドに対して相補的であり、更に、５−リポキシゲナーゼ に向けられた第一の代表的な分子に記載した配列を含む（４）第四の代表的な分 子は、遺伝子の発現を変調するであろう三重鎖構造を形成する５−リポキシゲナ ーゼ遺伝子のＤＮＡに対して結合する。

多数の特異的実施態様を示した場合、本発明は下記の請求の範囲によってのみ制 限されるものである。

実施例１０ 哺乳動物細胞中で発現される数種類のＰＬＡ２イソ酵素がある。アンチセンスオ リゴヌクレオチドを、滑液ＰＬＡ２の阻害について試験する前に、適当なイソ酵 素を発現するヒト細胞系を同定する必要があった。２０８ｍを越えるヒト細胞系 を、ノーザンブロノト分析およびポリメラーゼ鎖反応によって５Ｆ−ＰＬＡ２の 存在についてスクリーンした。２種項の細胞系が５Ｆ−ＰＬＡ２を発現すると同 定され１、へ４３１細胞および主要なヒトケラチノサイトであった。５Ｆ−ＰＬ Ａ２のｃ　Ｄ　Ｎ　、４配列から予測されたように（図４）、双方の細胞系はＰ ＬＡ２酵素を媒質中に分泌する。ＰＬＡ２酵素活性は大腸菌（Ｅ、ｃｏ　Ｉ　Ｏ 検定かまたは１−バルミトイル、２−目Ｃ−アラキドニルホスファチンルエタノ ールアミンによって実施例１１に記載したように測定することができる。分泌さ れた酵素のｐＨ最適条件、カルシウム要求性および基質特異性は、５Ｆ−ＰＬＡ ２に関して前に報告されたのと同一であった（クレー７−　（Ｋｒａｍｅ　ｒ） ら、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６４：５７６８〜５７７５）。

組織培養上澄み液の逆相高速液体クロマトグラフィー分析により、１種類のみの Ｐ　Ｌ　Ａ　２酵素がＡ４３１細胞から分泌されることが示された。細胞培養上 澄み液を、１４．ＯＯＯＸｇで１０分間遠心分離することによって透明にした。

透明の上澄み液（２ｍｌ）を、０．１％ＴＦＡで平衡にした０４ンリカマトリツ クス力ラムに適用した。タンパク質を、０％〜１００％アセトニトリル直線勾配 ６０ｍ１を１ｍｌ／分で用いてカラムから溶離した。画分を集め（１ｍｌ）且つ ＰＬＡ２酵素活性について実施例１１に記載したように検定した。結果は、１種 類のみのＰＬＡ２酵素がＡ４３１細胞から分泌されることを実証する（図１４） 。したがって、５Ｆ−ＰＬＡ、合成のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害を試 験するのに用いることができた検定法は、コンフルエンシーに増殖したＡ４３１ 細胞を、２４ウエルプレート中において熾血清培地中に４０μＭのＤＯＴＭＡを 加えた１μＭオリゴヌクレオチドを用いて６時間融合するように処理することで あった。培地を、ラン血清アルブミン１ｍｇ／ｍｌおよび１０μＭオリゴヌクレ オチドを含むＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ培地と置き換える。ＢＳＡをＩｍｇ／ｍｌ含むＤＭ ＥＭの添加２４時間後に組織培養培地中に分泌されたＰＬＡ２の量を実施例１１ に記載したように決定した。

本発明者は、インターフェロン−γはＳ　Ｆ　−Ｐ　Ｌ　Ａ　２の媒質中への分 泌を増加させたが、インターロイキン１β、腫瘍壊死因子−αまたはイソブチル メチルキサンタニシを加えたフロスコリンは増加させなかったことを実証した（ 図１５）。インターフェロン−γがＰＬＡ２合成を増加させるという本発明者の 発見を支持するのは、５Ｆ−ＰＬＡ２遺伝子の５′非転写領域にインターフェロ ン調節要素が存在することである。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチ ドを用いて、インターフェロン−γで処理したヒトケラチノサイトからのＰＬＡ ２の放出を阻害することができた。２４ウエルプレート中で増殖した細胞を、無 血清培地中に３２μＭのＤＯＴＭＡを加えた１μＭアンチセンスオリゴヌクレオ チドで４時間処理した。無血清培地中で４時間処理した後、その培地をＫＧＭ（ クロネティクス（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）、サン・ディエゴ、ＣＡ）および５μＭ オリゴヌクレオチドと置き換え、そして更に３時間インキュベートした。インタ ーフェロン〜γを細胞に加え（３００単位／ｍｌ）、そして細胞から分泌された ＰＬＡ２酵素活性の量を、インターフェロン−γを加えて２４時間後に決定した 。

本発明者がヒト表皮癌細胞系（Ａ４３１細胞）および主要なヒト表皮ケラチノサ イトからの５Ｆ−ＰＬＡ２分泌を検出することができたという事実は、５Ｆ−Ｐ ＬＡｚ発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドが皮膚の炎症性疾患の治 療において有用であろうということを示唆している。更に、本発明者は、インタ ーフェロン〜γがヒトケラチノサイトからのＰＬＡ２放出を誘導し、恐ら（は、 皮膚でのインターフェロン−γの炎症性活性を部分的に媒介しているということ を発見した。

下記のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は５Ｆ−ＰＬＡ２発 現を阻害するのに有用であった。

実施例１１ ＰＬＡ２酵素活性についてのインビトロの生化学的検定法は、実施するのに比較 的容易な検定法であり且つ高処理量検定法を形成することができる。

最も一般的な検定法では、１４ｃ−脂肪酸で予め標識した大腸菌（フランツ（Ｆ 　ｒ　ａ　ｎ　ｓ　ｏ　ｎ）ら、Ｊ、Ｌｉｐｉｄ、Ｒｅｓ、、１９：１８〜２３ ．１９７８）かまたは純粋なリン脂質基’Ｊｉ（ベネソト（Ｂｅｎｎｅ　ｔ　ｔ ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ、、３６：７３３〜７４０．１９８７）から の放射性標識した脂肪酸の放出を測定する。Ｐ　Ｌ　Ａ　２に関する細胞検定で は、放射性標識したアラキドン酸で予め標識した細胞からの脂肪酸の放出を測定 する。或いは、ＰＬＡ２を細胞外媒質中に分泌するこれらの細胞システムにおい て、ＰＬＡ２は、前記に記載したように培地の直接酵素検定によって検出するこ とができる。本発明者は、ヒト表皮癌細胞系Ａ４３１におけるヒト滑液ＰＬＡ２ 　（ヒト５Ｆ−ＰＬＡ２）の発現を確認した。

Ａ４３１細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理する実験から予測された 結果を下記に記載する。Ａ４３１細胞を１００ｍｍペトリ皿に入れ、コンフルエ ンシーが得られるようにする。細胞を、配列５’　ＧＧＴＣＴＴＣＡＴＧＧＴＡ ＡＧＡＧＴＴＣＴＴＧＧ−３’を含む１μＭ、１０μＭおよび５０μＭのアンチ センスオリゴヌクレオチドを用いて３７℃で ３６時間処理する。ホスホリパーゼＡ２酵素活性は、１−アシル−２−［１１４ Ｃ］アラキトニルホスフアチジルエタノールアミン（デオキシコレートｍｇ／ｍ ｌ中２５μＭの最終濃度）からのアラキドン酸の放出によって粗製細胞ホモジネ ート中で測定された。アンチセンスオリゴヌクレオチドはホスホリパーゼＡ２酵 素活性を、１μＭ１１０μＭおよび５０μＭで処理後にそれぞれ３％、６０％お よび９５％まで減少させた。

実施例１２ ＰＬＡ２のためのインビボの検定法は十分に定義されていなかった。ＰＬ１八２ へのスクリーンとして流行している一つの検定法は、精製ＰＬＡ２をラントの足 に直接注射することである。結果として生じた水腫をＰＬＡ２活性の尺度として 定量する。この検定法はアンチセンス検定法として不適当てあった。Ｐ　Ｌ　Ａ 　２の合成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定するのに有用であ ると証明することができる別の検定法としては、ウサギにおいてグリコ−ケンで 誘導された腹水、ラットにおいてカゼインで誘導された腹膜炎およびウサギにお けるグラム陰性敗血症性ショックがある。それぞれのモデルシステムにおいて、 細胞外体液中のＰＬＡ２の上昇が実証された。

実施例１３ ５−リボキンゲナーゼ活性化タンパク質は、エライザ検定法を用いて免疫反応性 タンパク質の量を定量することによって直接的に検定することができる。大腸菌 において発現されたＦ　Ｌ　Ａ　Ｐに対して製造された抗体を検定用に用いる。

大腸菌で発現されたＦ　Ｌ　Ａ　Ｐを、検定を定量する標準として更に用いる。

検定用に、ＨＬ−６０細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで２４〜７２時間 処理する。細胞を音波処理によって破裂させ且つ５０００ｘｇで１５分間遠心分 離する。上澄み酸部分を１００．ＯＯＯｘｇで１時間遠心分離し、その１００． ０００Ｘｇベレットを、５０　ｍＭ　トリス−ＨＣＬ１４ＱｍＭのＮａＣｌ、０ ．５ｍＭのＤＴＴ；ｐＨ７，４中の１％ＣＨＡＰＳ界面活性剤で抽出する。可溶 化した、摸タンパク質を拮抗的エライザ検定において用いる。組換え体ＦＬＡＰ 　（（２５ｎｇ）を微量滴定プレートの各ウェルに対して４℃で一晩巾結合させ る。次に、プレートのウェルを、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ　＋ｐＨ７，４，１５ ０ｍＭのＮａＣ１（ＴＢＳ）中５％ヤギ血清で９０分間ブロックする。細胞抽出 物または精製Ｆ　Ｌ　Ａ　Ｐ標準を全容量１００μＬ中、稀釈度１　：　２００ ０のＦ　Ｌ　Ａ　Ｐ多クローン性抗体と一緒に９０分間インキュベートする。ウ ェルを、００５％トウィーン２０（ＴＢＳＴ）を含むＴＢＳで洗浄し且つ稀釈度 １　：　１０００のビオチニル化結合ヤギ抗ウサギＩｇＧと一緒に１時間インキ ュベートする。プレートをＴＢＳＴで再度洗浄し且つ稀釈度１　：　１０００の ペルオキシダーゼ結合ストレプタヴイジンと一緒に１時間インキュベートする。

プレートを再度ＴＢＳＴで洗浄し、そしてプレートに結合したペルオキシダーゼ 標識ストレブタヴイノンの童をテトラメチルベンツジンによる展開によって定量 する。

実施例１４ アンチセンスオリゴヌクレオチドによる５−リボキンゲナーゼ活性化タンパク質 （ＦＬＡＰ）活性の阻害は、更に、カルシウムイオノフオアで誘導された５−リ ポキシゲナーゼの細胞質ゾルから細胞の膜画分へのトランスロケーションの阻害 および引き続きのロイコトリエン生成の阻害によって検出することができる。検 定用に、ＨＬ−６０細胞モデルの分化を実施例１で記載したように用いる。ＦＬ ＡＰｍＲＮＡに対してハイブリッド形成するアンチセンスオリゴヌクレオチドを ＨＬ６０細胞培養物に加え、その時点でＤＭＳＯを加えて細胞を分化させる。細 胞のＦ　Ｌ　Ａ　Ｐ活性について、培地にＤＭＳＯを加えて４８〜７２時間命に 検定する。細胞を１０μＭカルシウムイオノフすアを用いて３７℃で１５分間刺 激する。細胞を１１００Ｏｘで１０分間遠心分離することによって集める。細胞 によって合成され且つ上澄み液中に放出されたロイコトリエンＢ４の量を実施例 １に記載したようにラジオイムノアッセイによって決定する。細胞ペレットをリ ン酸緩衝溶液で１回洗浄し、細胞を実施例４に記載したように音波処理によって 破裂させる。５０００Ｘｇ上澄み液をＩＯｏ、０００Ｘｇで１時ｒｊ１遠心分離 し、膜画分（１００゜０００ｘｇベレット）に結合した５−リポキシゲナーゼの 量をウェスターンプロットによって決定する。細胞質ゾルおよび膜タンパク質（ それぞれ１００μｇ）を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分割し、ニトロセ ルロース紙に移し、そして５−リポキノゲナーゼ抗体と一緒に、続いで２５ｉ− プロティンＡと一緒にインキュベートする（ベネソトおよびクルーク、±一旦、 ニトロセルロース紙をオートラジオグラフィーに暴露し、各細胞性画分中の５− リポキシゲナーゼの量をレーザーデンントメトリーによってオードラジオグラフ を走査することによって決定する。

実施例１５ ０イコトリエンＡ４ヒドロラーゼは、オーイシ（Ｏｈｉｓｈｉ）らによって記載 されたように（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６２：　１０２００〜１０２０５ ．１９８７）アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された細胞の細胞質ゾル画 分の直接酵素検定によって決定される。簡単には、アンチセンスオリゴヌクレオ チドで処理されたＨＬ−６０細胞を音波処理によって破裂させ、細胞質ゾル画分 を１００，０００ｘｇで１時間の遠心分離によって単離する。反応混合物は１０ ０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝７．８）および酵素を全容量５０μＬ中に 含む。酵素を３７℃で３〜４分間予めインキュベートした後、水酸化リチウムを 含むエタノール中のロイコトリエンＡ４を最終１度７５μＮ１および最終エタノ ール濃度２％まで加えた。酵素を３７℃で１分間インキュベートし、０．３ナノ モルのプロスタグランジンＢ２を内部標準として含むアセトニトリル／メタノー ル／酢酸、１５０　：　５０　：　３（Ｖ　／　Ｖ　／　Ｖ　）を１００μＬ加 えることによって反応を終結させた。タンパク質を一２０℃で３０分間のインキ ュベーションに続いて、１０．ＯＯＯＸｇで１０分間の遠心分離によって沈殿さ せる。上澄み液の１２０μＬ部分を取出し、０．３５％二ナトリウムＥＤＴＡを ２０μＬ加える。得られた溶液の５０μＬ部分中に生成されたロイコトリエンＢ ４の量を、Ｃ１８カラムを用いる逆相高速液体クロマトグラフィーによって決定 する。試料を、アセトニトリル／メタノール／水／酢酸（３：　１　：　３　： 　０．　００６．　ｖ／ｖ／ｖ／ｖ、０．　０５％二ナトリウムＥＤＴＡ）を含 む溶媒を用いて均一濃度によって溶離する。２７Ｑｎｍでの吸光度を監視して、 生成されたロイコトリエンＢ４の量を定量する。

ロイコトリエンＡ４ヒドロラーゼの翻訳の開始に対応する配列に対して１１イブ リツド形成する下記の配列 ５’−ＴＡＴＣＴＣＧＧＧＣＡＴＧＧＣＴＣＴＧＧＧ−３’を有するホスホロチ オエートアンチセンスオリゴヌクレオチドによるＨＬ６０細胞の処理から予測さ れた結果を記載する。細胞を１０℃Ｍ、３０℃Ｍおよび７５μＭのオリゴヌクレ オチドで３６時間処理した。細胞を採取し、ＬＴＡ４ヒドロラーゼの量を前記に 記載したように定量した。アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理は、ＬＴ Ａ、ヒドロラーゼ酵素活性を、それぞれ０％、１５％および４５％まで減少させ た。

′　実施例１６ 細胞抽出物中のＰＩ−ＰＬＯ酵素活性の検定では、商業的に入手可能な基質とし て放射性標識したホスホロイノシチドを利用する（ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ） およびマジエラス（Ｍａｊｅｒｕｓ）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５７：６ ４６１〜６４６９．１９８２）。Ｐ　Ｉ　−ＰＬ、Ｃの酵素検定は、高処理量検 定法を容易に形成することができる。しかしながら、酵素的検定法は特異的ＰＩ −ＰＬＯイソ酵素に対する化合物の効果を区別しないが、代わりに細胞抽出物中 の全ＰＩ−ＰＬＣ活性を測定する。特異的ＰＩ−ＰＬＯイソ酵素に対するアンチ センスオリゴヌクレオチドの効果を決定するには、免疫化学的検定法を用いるこ とが必要である。ＰＩ−ＰＬＣ−δ２に特異的な抗体は、 ＮＨ２−３ＫＲＫＳＴＰＥＲＲＴＶＱＶＴ　ＣＯＯＨｆ：　どｃＤペブチトマタ ハカサガイのヘモシアニンに結合したＰＩ−ＰＬＣ−δ２に特異的な類似のペプ チドでウサギを免疫することによって製造される。抗体を実施例９に記載したよ うに拮抗的エライザ検定法で用いる。

実施例１７ 完全な細胞中のＰＩ−ＰＬＯ酵素活性は、３Ｈ−イノシトールで予め標識した細 胞中のアゴニスト刺激後の３Ｈ−イノシトールリン酸の生成を定量することによ って直接的に測定することができる。ＰＩ−ＰＬＣ−δ２発現に対するアンチセ ンスオリゴヌクレオチドの効果をスクリーニングするためには、ＨＬ−６０細胞 を用いる。細胞に、３Ｈ−Ｅオイノシトール２０μＣｉ／ｍ＋を用いて３７℃で ３６時間標識する。ｐｌ−ＰＬＣ−６２ｍＲＮＡに特異的にハイブリッド形成す るアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、５′　〜ＧＴＧＧＴＧＧＡＣＡＴ ＴＧＴＧＧＣＣＧＣＴ−３’　を、３Ｈ−ミオイノ／トールで標識する３６時間 の間に細胞に加える。細胞をハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）て洗浄して、 取り込まれなかった３Ｈ−ミオイノ／トールを除去し、そして最終１度５Ｘ１０ ’個細胞／ｍｌで再懸濁させる。

次に、細胞（０，３ｍ１）を適当なアゴニスト（ｆＭｅ　ｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ、 表皮成長因子、ＧＭ−Ｃ８Ｆ、カンマ−インターフェロン、血小板で誘導された 成長因子、ロイコトリエンＤ４、等）を用いて３７℃で２分間刺激する。水溶性 イノシトールリン酸をクロロホルム／メタノール（に２．ｖ／ｖ）０．９３ｍ１ で、続いてりａロホルム０１３ｍ１および水０．３ｍｌで抽出する。イノシトー ルリン酸は、前記に記載したようにダウエクス（Ｄ。

ｗｅｘ）　ＡＧＩＸ８上のクロマトグラフィーによって分離される（ベリッジ（ Ｂｅｒｒｉｄｇｅ）　ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、２１２：４７３〜４８２．１ ９８３）。

次に、細胞基材検定における活性化合物を、種々の標準的な薬理学的検定、例え ば、カラゲーナンで誘導された腹膜炎、アラキドン酸で誘導されたマウス耳の炎 症、等の活性について試験することができる。

実施例１８ 補酵素Ａ非依存トランスアンラーゼ酵素活性は、アンチセンスオリゴヌクレオチ ドで処理した細胞由来のミクロソーム画分中で３Ｈ−１−アルキルリゾホスファ チジルコリンを基質として用いて測定することができる。本発明者は、ヒト前単 球性白血病細胞系Ｕ９３７が補酵素Ａ非依存トランスアシラーゼ活性を測定する のに良好な源であることを確認した。処理後に、細胞を種々の時間でリン酸緩衝 溶液中において洗浄した後、１０ｍＭビストリス：ｐＨ＝７．０、ｌＱｍＭのＮ ａＣ１，２ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＭｇＣ１ｚ、Ｑ、１ｍＭロイペプチンおよ び１０℃ｇ／ｍｌのアプロチニン中に１０７個細胞／ｍｌの濃度で懸濁させる。

細胞を３０％工率の音波処理によって破裂させ、ミクロソーム画分を示差遠心分 離によって得る。粗製ホモジネートを１０．０００Ｘｇで２０分間遠心分離した 後、上澄み液を１００．０００ｘｇで６０分間遠心分離する。ｉｏｏ、ＯＯＯｘ ｇベレットをｌＱｍＭリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ　；　ｐＨ＝７．４中に 再懸濁させ且つ検定用に用いる。１０〜５０℃ｇの間のタンパク質を、全容量１ ００μＬ中において１μＭの３Ｈ−１−アルキルリゾホスファチジルコリン、ウ シ血清アルブミンＩｍｇ／ｍｌと一緒に３７°Ｃで１０分間インキュベートした 。クロロホルム：メタノール（１：２）１００μＬ１クロロホルム１００μＬお よびＩＭ−ＫＣｌの１００μＬを順次に加えることによって反応を終結させた。

試料を旋回させ且つ１０．０００Ｘｇで４分間遠心分離する。有機相中の物質を シリカゲルＧプレート上にスポットし、そしてクロロホルム：メタノール：酢酸 ：水（１００・６０：１６：８）を含む溶媒を用いてクロマトグラフィーを行う 。プレートをヨウ素蒸気で染色し、１−アルキル、２−アラキドニルホスファチ ンルコリンに対応するバンドを集め、そして放射性物質の量を液体シンチレーシ ョン計数計で決定する。

補酵素Ａ非依存トランスアシラーゼに対するアンチセンスホスホロチオエートオ リゴヌクレオチドでＵ９３７細胞を処理することから予測された結果を下記に記 載する。Ｕ９３７細胞を、２０塩基長さで１０〜１２位に配列ＣＡＴを含み、翻 訳の開始に対応する１μＭ１１０μＭおよび５０℃Ｍのアンチセンスオリゴヌク レオチドを用いて３７℃で７２時間処理する。細胞を採取し且つ前記に記載した ように補酵素Ａ非依存トランスアシラーゼ活性について分析する。濃度１μＭ、 １０μＭおよび５０℃Ｍでの薬剤による処理は、補酵素Ａ非依存トランスアンラ ーゼ活性をそれぞれ４％、２２％および７２％まで減少させた。

配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人、アイ・ニス・アイ・ニス・ファーマソイティカルズ（ＩｓＩｓ　 Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（１、発明の名称・アラキドン酸代謝のオリ ゴヌクレオチド変調（ｉ　ｉ　ｉ）配列の数：１４ （１ｖ）宛先： （Ａ）住所：ウッドコソク・ウォノユバーン・カーラ・マーｔ−−ウイノツ・ア ンド・ノリス（Ｗｏｏｄｃｏｃｋ　Ｗａｓｈｂｕｒｎ　ＫｕｒｔｚＭａｃｋｉｅ ｗｉｃｚ　＆　Ｎｏｒｒｉｓ）（Ｂ）地区：ワンーリバティ’ブレイス（Ｏｎｅ 　ＬｉｂｅｒｔｙＰｌａｃｅ）−４６階 （Ｃ）車名：フィラデルフィア （Ｄ）州名：ベンンルバニア （Ｅ）国名：米国 （Ｆ）郵便番号：１９１０３ （ｖ）コンピューター読取り形式： （Ａ）中型：小型ディスク、３．５インチ、記憶装置１．４４Ｍｂ（Ｂ）コンピ ューター：ＩＢＭ　ＰＳ／２（Ｃ）操作システム：　ＰＣ−ＤＯ３ （Ｄ）ソフトウエア：ワードパーフェクト（ＷＯＲＤＰＥＲＦＥＣＴ）　５．　 ０ （ｖｉｉ）先行出願資料： （Ａ　）出願番号・５１６．９６９ （Ｂ）出願口　１９９０年４月３０日 （ｖ　ｉ　ｉ　ｉ）弁理士／代理人情報：（Ａ）氏名、ジョン・ダブリュー・カ ードウェル（Ｊｏｈｎ　Ｗ。

Ｃａｌｄｗｅｌｌ） （Ｂ）登録番号：２８．９３７ （Ｃ）照会／事件整理番号：ｌ５ＩＳ−１８２（ｆｘ）通信情報： （Ａ）電話：　（２１５）５６８−３１００（Ｂ）ファクシミリ（’２１５）５ ６８−’３４３９（２）配列番号、ｌの情報： （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ；２１ （Ｂ）種層：核酸 （１Ｖ）アンチセンス：正 （ｘｉ）配列種類：配列番号：Ｉ ＡＡＧＧＣＡＴＧＧＣＴＣＴＧ（１；ＧＡＡＧＴ　Ｇ　２１（２）配列番号：２ の情報： （ｉ）配列の特徴・ （Ａ）長さ・２５ （Ｂ）種類：核酸 （ｉｖ）アンチセンス：正 （ｘｉ）配列種類、配列番号＝２ ＡＣＡＴＧＧＧＣＴＡ　ＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧ　ＧＧＴＧＧ　２５（２）配列番 号・３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２０ （Ｂ）種類：核酸 （ｉｖ）アンチセンス：正 （ｘｉ）配列種類　配列番号・３ ＴＴＧＡＣＴＣＴＧＴ　ＣＡＣＴＣＡＡＧＡＧ　２０（２）配列番号　４の情報 ・ （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ：２０ （Ｂ）種類　核酸 （ｉｖ）アンチセンス：正 （ｘ　ｉ）配列種類：配列番号　４ ＧＧＡＡＧＧＣＡＴＧ　ＧＣＴＣＴＧＧＧＡＡ　２０（２）配列番号　５の情報 （ｉ）配列の特徴： （４八）長さ・２０ （Ｂ）種類　核酸 （ｉｖ）アンチセンス：正 （ｘｉ）配列種類：配列番号、５ ＧＣＣＴＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧＣＴＧＣＴＧ　’２０（２）配列番号二６の情報 。

（１）配列の特徴： （Ａ）長さ：２０ （Ｂ）種類、核酸 （ｉｖ）アンチセンス：正 （ｘｉ）配列種類：配列番号：６ ＧＧＡＡ、ＧＡＴＣＴＡ　ＣＡＧＣＣＴＧＣＣＡ　２０（２）配列番号　７の情 報： （１）配列の特徴・ （Ａ）長さ、２１ （Ｂ）種Ｗｉ：核酸 （ｉｖ）アンチセンス：正 （ｘｉ）配列種類・配列番号＝７ ＴＴＣＡＴＧＧＴＡＡ　ＧＡＧＴＴＣＴＴＧＧ　Ｇ　２１（２）配列番号：８の 情報： （１）配列の特徴 （Ａ）長さ・２１ （Ｂ）種項：核酸 （ｉｖ）アンチセンス：正 （ｘ　ｉ）配列種類二配列番号、８ ＴＣＴＧＣＣＣＣＧＧ　ＣＣＧＴＣＧＣＴＣＣＣ２１（２）配列番号＝９の情報 ： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝２１ （Ｂ）種類：核酸 （ｉｖ）アンチセンス：正 （ｘｉ）配列種類：配列番号＝９ ＣＡＡ、ＡＧＡＴＣＡＴ　ＧＡＴＣＡＣＴＧＣＣＡ　２１（２）配列番号＝１０ の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２１ （Ｂ）種類：核酸 （１ｖ）アンチセンス：正 （ｘｉ）配列種類：配列番号、１０ ＴＣＣＣＡＴＧＧＧＣＣＴＧＣＡＧＴＡＧＧ　Ｃ２１（２）配列番号＝１１の情 報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２１ （Ｂ）種類：核酸 （ｉｖ）アンチセンス　正 （ｘｉ）配列種類、配列番号：１１ ＣＣＴＧＣＡＧＴＡＧ　ＧＣＣＴＧＧＡＡＧＧ　Ａ　２１（２）配列番号、１２ の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ、２１ （Ｂ）種類：核酸 （ｉｖ）アンチセンス：正 （ｘｉ）配列種類：配列番号・１２ ＧＧＡＡＧＧＴＴＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＡＧ　Ｇ　２１（２）配列番号：１３の 情報： （ｉ）配列の特徴； （Ａ）長さ：２１ （Ｂ）種類：核酸 （ｉｖ）アンチセンス：正 （ｘｉ）配列種類：配列番号：１３ ＣＡＧＡＧＧＡＣＴＣＣＡＧＡＧＴＴＧＴＡ　Ｔ　２１（２）配列番号・１４の 情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ・２１ （Ｂ）種類：核酸 （ｉｖ）アンチセンス・正 （ｘｉ）配列種類：配列番号：１４ ＧＧＧＴＧＧＧＴＡＴ　ＡＧＡＡＧＧＧＣＴＣＣ２１υ ＝汐！：乞　ｒタ　シ貫　＄；　８巨ご＝　２論　に且ご汐υ＆″　Ｑ″　υ− υ＞　υし　ＱΦ　Ｑ−１：　ご「　藁ミＱρ　＜＞　＜＞　ｌ５−ＣＪぶ　− 一　←４＜４Ｊｈａ、＋　１−ｎｕ　ｔｐ■　ベー　ベー　Ｑン　ロい　Ｑ−ト ーｏｐ　ｕｂ　ｕｓ　ｕｂ　ｕ’：ｓ　ＬＩＱＩ　ｕｓ　Ｌ５Ｃｕｓ　ｈｂ七： 　モご　知＝　兵汐　七２　Ｂ　仁＝　ご；　８；　兵ご°“ＣＪＯ（ＪＣＬ　 １ｊ−ＣＪ“　°“°“　■虻層Ｈ（ｉｌｌ　ＣＪｌ、Ｉ＜Ｖ＋　←Ｒ＜＞　Ｃ ＪＩ　＜ｐｓａ　１３　ｕｃｂ　ｔｐｍ　ｔｐ＞ｈｕ　ｈｌ　０か・ダＬＯも染 舵−、ＪＭＡ マＬＴＢ４−掩を 口　〜ＢＴ県尺７ −Ｆ像、８ しＴＦ３＋斥、性−（１９） −Ｌ勾、　ｉ。

Ｆｉｇ、１１ Ｆｉｇ、１２ Ｆ１９．１３ しし八ｌぞ杏４顎ＣＯ門） 補正嘗の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　４年１０月３０日１ｍｌ

Claims (46)

【特許請求の範囲】
1. １．アラキドン酸の合成または代謝を変調するタンパク質をコードしている核酸 と特異的にハイブリッド形成しうるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチ ド類似体。
2. ２．ｍＲＮＡと特異的にハイブリッド形成しうる請求項１に記載のオリゴヌクレ オチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。
3. ３．遺伝子と特異的にハイブリッド形成しうる、該遺伝子から製造されたｍＲＮ Ａの量を変調するための三重鎖構造を形成する請求項１に記載のオリゴヌクレオ チドまたはオリゴヌクレオチド類似体。
4. ４．転写開始部位、翻訳開始部位またはイントロン／エキソン結合と特異的にハ イブリッド形成しうる請求項２に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレ オチド類似体。
5. ５．５′キャップ部位および隣接する配列と特異的にハイブリッド形成しうる請 求項４に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。
6. ６．前記のタンパク質が５−リポキシゲナーゼである請求項１に記載のオリゴヌ クレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。
7. ７．前記のタンパク質が５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質である請求項１ に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。
8. ８．前記のタンパク質がホスホリパーゼＡ２である請求項１に記載のオリゴヌク レオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。
9. ９．前記のタンパク質がＬＴＡ４ヒドロラーゼである請求項１に記載のオリゴヌ クレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。
10. １０．前記のタンパク質がホスホリパーゼＣである請求項１に記載のオリゴヌク レオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。
11. １１．前記のタンパク質が補酵素Ａ非依存トランスアシラーゼである請求項１に 記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。
12. １２．約３個〜約５０個のサブユニットを含む請求項１に記載のオリゴヌクレオ チドまたはオリゴヌクレオチド類似体。
13. １３．約８個〜約２５個のサブユニットを含む請求項１２に記載のオリゴヌクレ オチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。
14. １４．約１０個〜約２０個のサブユニットを含む請求項１３に記載のオリゴヌク レオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。
15. １５．薬学的に許容しうる担体中の、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまた はオリゴヌクレオチド類似体。
16. １６．オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかのヌクレオチド間結合基が硫黄 含有種を含む請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類 似体。
17. １７．オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかのヌクレオチド間結合基がホス ホロチオエート残基を含む請求項１６に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴ ヌクレオチド類似体。
18. １８．下記の配列の１種類またはそれちの一部分を含み、該部分が、アラキドン 酸の合成または代謝を変調するタンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリ ッド形成しうるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。 ５′３′ ５−リポキシゲナーゼ配列： 【配列があります】（配列番号１） 【配列があります】（配列番号２） 【配列があります】（配列番号３） 【配列があります】（配列番号５） ５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質配列：【配列があります】 ＳＦ−ＰＬＡ２配列： 【配列があります】（配列番号７） 【配列があります】（配列番号８） 【配列があります】（配列番号９） 【配列があります】（配列番号１０） 【配列があります】（配列番号１１） 【配列があります】（配列番号１２） 【配列があります】（配列番号１３） 【配列があります】（配列番号１４） ＬＴＡ４ヒドロラーゼ配列： 【配列があります】 ＰＩ−ＰＬＣ−δ２配列： 【配列があります】
19. １９．藁学的に許容しうる担体中の、請求項１８に記載のオリゴヌクレオチドま たはオリゴヌクレオチド類似体。
20. ２０．オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかのヌクレオチド間結合基が硫黄 含有種を含む請求項１８に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド 類似体。
21. ２１．オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかのヌクレオチド間結合基がホス ホロチオエート残基を含む請求項２０に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴ ヌクレオチド類似体。
22. ２２．アラキドン酸の合成または代謝を変調するタンパク質をコードしている核 酸と特異的にハイブリッド形成しうるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオ チド類似体と動物とを接触させることを特徴とする動物におけるアラキドン酸の 代謝を変調する方法。
23. ２３．オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が、転写開始部位、 翻訳開始部位またはイントロン／エキソン結合と特異的にハイブリッド形成しう る請求項２２に記載の方法。
24. ２４．オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が、ｍＲＮＡの５′ キャップ部位および隣接する配列と特異的にハイブリッド形成しうる請求項２３ に記載の方法。
25. ２５．前記のタンパク質が５−リポキシゲナーゼである請求項２２に記載の方法 。
26. ２６．前記のタンパク質が５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質である請求項 ２２に記載の方法。
27. ２７．前記のタンパク質がホスホリバーゼＡ２である請求項２２に記載の方法。
28. ２８．前記のタンパク質がＬＴＡ４ヒドロラーゼである請求項２２に記載の方法 。
29. ２９．前記のタンパク質がホスホリパーゼＣである請求項２２に記載の方法。
30. ３０．前記のタンパク質が補酵素Ａ非依存トランスアシラーゼである請求項２２ に記載の方法。
31. ３１．オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が下記の配列の１種 類またはそれらの一部分を含み、該部分が、アラキドン酸の合成または代謝を変 調するタンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリッド形成しうる請求項２ ２に記載の方法。 ５′３′ ５−リポキシゲナーゼ配列： 【配列があります】（配列番号１） 【配列があります】（配列番号２） 【配列があります】（配列番号３） 【配列があります】（配列番号５） ５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質配列：【配列があります】 ＳＦ−ＰＬＡ２配列： 【配列があります】（配列番号７） 【配列があります】（配列番号８） 【配列があります】（配列番号９） 【配列があります】（配列番号１０） 【配列があります】（配列番号１１） 【配列があります】（配列番号１２） 【配列があります】（配列番号１３） 【配列があります】（配列番号１４） ＬＴＡ４シンターゼ配列： 【配列があります】 ＰＩ−ＰＬＣ−δ２配列： 【配列があります】
32. ３２．オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の少なくともいくつ かのヌクレオチド間結合基が硫黄含有種を含む請求項２２に記載の方法。
33. ３３．オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の少なくともいくつ かのヌクレオチド間結合基がホスホロチオエート残基を含む請求項３２に記載の 方法。
34. ３４．アラキドン酸合成または代謝の変化によって変調される疾患を有すると疑 われる動物を治療する方法であって、アラキドン酸の合成または代謝を変調する タンパク質をコードしている核酸と特異的にハイブリッド形成しうるオリゴヌク レオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と動物とを接触させることを特徴とす る前記の方法。
35. ３５．前記のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が、転写開始 部位、翻訳開始部位またはイントロン／エキソン結号と特異的にハイブリッド形 成しうる請求項３４に記載の方法。
36. ３６．前記のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が、ｍＲＮＡ の５′キャップ部位および隣接する配列と特異的にハイブリッド形成しうる請求 項３４に記載の方法。
37. ３７．前記のタンパク質が５−リポキシゲナーゼである請求項３４に記載の方法 。
38. ３８．前記のタンパク質が５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質である請求項 ３４に記載の方法。
39. ３９．前記のタンパク質がＬＴＡ４ヒドロラーゼである請求項３４に記載の方法 。
40. ４０．前記のタンパク質がホスホリパーゼＡ２である請求項３４に記載の方法。
41. ４１．前記のタンパク質がホスホリパーゼＣである請求項３４に記載の方法。
42. ４２．前記のタンパク質が補酵素Ａ非依存トランスアシラーゼである請求項３４ に記載の方法。
43. ４３．オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が薬学的に許容しう る担体中である請求項３４に記載の方法。
44. ４４．オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が下記の配列の１種 類またはそれらの一部分を含み、該部分が、アラキドン酸の合成または代謝を変 調するタンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリッド形成しうる請求項３ ４に記載の方法。 ５′３′ ５−リポキシゲナーゼ配列： 【配列があります】（配列番号１） 【配列があります】（配列番号２） 【配列があります】（配列番号３） 【配列があります】（配列番号５） ５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質配列：【配列があります】 ＳＦ−ＰＬＡ２配列： 【配列があります】（配列番号７） 【配列があります】（配列番号８） 【配列があります】（配列番号９） 【配列があります】（配列番号１０） 【配列があります】（配列番号１１） 【配列があります】（配列番号１２） 【配列があります】（配列番号１３） 【配列があります】（配列番号１４） ＬＴＡ４ヒドロラーゼ配列： 【配列があります】 ＰＩ−ＰＬＣ−δ２配列： 【配列があります】
45. ４５．オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の少なくともいくつ かのヌクレオチド間結合基が硫黄含有種を含む請求項３４に記載の方法。
46. ４６．オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の少なくともいくつ かのヌクレオチド間結合基がホスホロチオエート残基を含む請求項４５に記載の 方法。