HUT69149A - Hbv surface proteins with reduced host carbohydrate - Google Patents
Hbv surface proteins with reduced host carbohydrate Download PDFInfo
- Publication number
- HUT69149A HUT69149A HU9303064A HU9303064A HUT69149A HU T69149 A HUT69149 A HU T69149A HU 9303064 A HU9303064 A HU 9303064A HU 9303064 A HU9303064 A HU 9303064A HU T69149 A HUT69149 A HU T69149A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- protein
- yeast
- hbsag
- carbohydrate
- hepatitis
- Prior art date
Links
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 title claims description 48
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 title claims description 37
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 title claims description 13
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 title description 20
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 66
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 65
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 65
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 51
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 45
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 45
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 43
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 42
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 39
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 31
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 24
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 23
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 19
- 102400000368 Surface protein Human genes 0.000 claims description 17
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims description 11
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 claims description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- 230000000656 anti-yeast Effects 0.000 claims description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims 4
- 229940124872 Hepatitis B virus vaccine Drugs 0.000 claims 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 38
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 35
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 33
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 32
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 24
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 description 21
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 19
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 19
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 18
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 15
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 15
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 13
- 101150038242 GAL10 gene Proteins 0.000 description 12
- 101150115433 SLC26A5 gene Proteins 0.000 description 12
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 12
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 12
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 11
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 11
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 10
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 10
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 10
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 101710205625 Capsid protein p24 Proteins 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 9
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 9
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 9
- 101710149279 Small delta antigen Proteins 0.000 description 9
- 102100022563 Tubulin polymerization-promoting protein Human genes 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 9
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 8
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 7
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- SBKVPJHMSUXZTA-MEJXFZFPSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-5-amino-2-[[2-[[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]amino]-5-oxopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 SBKVPJHMSUXZTA-MEJXFZFPSA-N 0.000 description 6
- 101710187573 Alcohol dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 6
- 101710133776 Alcohol dehydrogenase class-3 Proteins 0.000 description 6
- 101000713368 Bovine immunodeficiency virus (strain R29) Protein Tat Proteins 0.000 description 6
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 6
- 108010038049 Mating Factor Proteins 0.000 description 6
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 6
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 6
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 102100024023 Histone PARylation factor 1 Human genes 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N clarithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@](C)([C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)OC)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N 0.000 description 5
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 108010005335 mannoproteins Proteins 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 4
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 4
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 4
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 101150078509 ADH2 gene Proteins 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 3
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 3
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 3
- 101000896148 Enterobacteria phage T4 Baseplate central spike complex protein gp27 Proteins 0.000 description 3
- 101000597227 Escherichia phage Mu Probable terminase, small subunit gp27 Proteins 0.000 description 3
- 101000912555 Escherichia phage lambda Tail fiber protein Proteins 0.000 description 3
- 101150037782 GAL2 gene Proteins 0.000 description 3
- 102100021735 Galectin-2 Human genes 0.000 description 3
- 101100229073 Gallus gallus GAL5 gene Proteins 0.000 description 3
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 3
- 101000764556 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Probable tape measure protein Proteins 0.000 description 3
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 3
- 101150075484 MNN9 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 3
- 101150012394 PHO5 gene Proteins 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 3
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 3
- 101100029551 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PGM2 gene Proteins 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N 4-(3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl)pentanoic acid Chemical compound OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 241001533413 Deltavirus Species 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 101800001466 Envelope glycoprotein E1 Proteins 0.000 description 2
- 102100039555 Galectin-7 Human genes 0.000 description 2
- -1 HBV nucleic acid Chemical class 0.000 description 2
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000608772 Homo sapiens Galectin-7 Proteins 0.000 description 2
- FSBIGDSBMBYOPN-VKHMYHEASA-N L-canavanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCONC(N)=N FSBIGDSBMBYOPN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- FSBIGDSBMBYOPN-UHFFFAOYSA-N O-guanidino-DL-homoserine Natural products OC(=O)C(N)CCON=C(N)N FSBIGDSBMBYOPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 101800000385 Transmembrane protein Proteins 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 2
- 235000021309 simple sugar Nutrition 0.000 description 2
- 229940083575 sodium dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HEGSGKPQLMEBJL-RQICVUQASA-N (2r,3s,4s,5r)-2-(hydroxymethyl)-6-octoxyoxane-3,4,5-triol Chemical compound CCCCCCCCOC1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RQICVUQASA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 101150040471 19 gene Proteins 0.000 description 1
- GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 3-[dimethyl-[3-[[(4r)-4-[(3r,5s,7r,8r,9s,10s,12s,13r,14s,17r)-3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]propyl]azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CC(O)CS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 0.000 description 1
- 102100026277 Alpha-galactosidase A Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 101000906736 Escherichia phage Mu DNA circularization protein N Proteins 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 102000048120 Galactokinases Human genes 0.000 description 1
- 108700023157 Galactokinases Proteins 0.000 description 1
- 101710170470 Glycoprotein 42 Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102100024594 Histone-lysine N-methyltransferase PRDM16 Human genes 0.000 description 1
- 101000718525 Homo sapiens Alpha-galactosidase A Proteins 0.000 description 1
- 101000686942 Homo sapiens Histone-lysine N-methyltransferase PRDM16 Proteins 0.000 description 1
- 101000589519 Homo sapiens N-acetyltransferase 8 Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 101710189818 Non-structural protein 2a Proteins 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000009569 Phosphoglucomutase Human genes 0.000 description 1
- 101710151911 Phosphoprotein p30 Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 238000012356 Product development Methods 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000877 Sex Attractant Substances 0.000 description 1
- 101000764570 Streptomyces phage phiC31 Probable tape measure protein Proteins 0.000 description 1
- 101000895926 Streptomyces plicatus Endo-beta-N-acetylglucosaminidase H Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N Tunicamycin II Natural products O1C(CC(O)C2C(C(O)C(O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)C(O)C(O)C(NC(=O)C=CCCCCCCCCC(C)C)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1NC(C)=O YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010082433 UDP-glucose-hexose-1-phosphate uridylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- HXXFSFRBOHSIMQ-FPRJBGLDSA-N alpha-D-galactose 1-phosphate Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O HXXFSFRBOHSIMQ-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000011072 cell harvest Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000007705 chemical test Methods 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000009567 fermentative growth Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 108010090279 galactose permease Proteins 0.000 description 1
- 101150073818 gap gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001279 glycosylating effect Effects 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108091000115 phosphomannomutase Proteins 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- PIJVFDBKTWXHHD-HIFRSBDPSA-N physostigmine Chemical compound C12=CC(OC(=O)NC)=CC=C2N(C)[C@@H]2[C@@]1(C)CCN2C PIJVFDBKTWXHHD-HIFRSBDPSA-N 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000005664 protein glycosylation in endoplasmic reticulum Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000000754 repressing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000005476 soldering Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N triflic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C(F)(F)F ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N tunicamycin Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@@H](O)[C@@H](CC(O)[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)O1)O)NC(=O)/C=C/CC(C)C)[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1NC(C)=O ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N 0.000 description 1
- MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N tunicamycin Natural products CC(C)CCCCCCCCCC=CC(=O)NC1C(O)C(O)C(CC(O)C2OC(C(O)C2O)N3C=CC(=O)NC3=O)OC1OC4OC(CO)C(O)C(O)C4NC(=O)C MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/29—Hepatitis virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
Description
CSÖKKENT GAZDA-SZÉNHIDRÁT TARTALMÚ HBV FELÜLETI PROTEINEK
MERCK & CO. , INC., Rahway, New Jersey,
Amerikai Egyesült Államok
Feltalálók:
KNISKERN Peter J., Lansdale, Pennsylvania,
HAGOPIAN Árpi, Lansdale, Pennsylvania,
Amerikai Egyesült Államok
A nemzetközi bejelentés napja: 1992. 04. 27.
Elsőbbsége:
1991. 04. 29. (692,924)
Amerikai Egyesült Államok
A nemzetközi bejelentés száma: PCT/US92/03472
A nemzetközi közzététel száma: WO 92/19471
78188-2037-SI
A hepatitis B vírus számos fertőző humán májbetegség kórokozója. A HBV-vel fertőzött egyének többsége átesik a betegség heveny szakaszán, majd felgyógyul. Azonban a fertőzött egyének bizonyos százalékából nem ürül ki a fertőző vírus, és ezek krónikus fertőzéshordozóvá válnak. A HBV fertőzés járványos a világ sok táján, az újszülöttek nagy gyakorisággal már megszületésük előtt fertőződnek a krónikusan fertőzött anyáktól, és sok esetben maguk is krónikusan fertőzöttek maradnak. Ezek számát világszerte 300 millió felettire becsülik. Az ilyen betegséghordozók közül évente százezrek halnak meg a krónikus hepatitis B hosszútávú következményeitől (májcirrhosis és/vagy hepatocelluláris karcinoma).
A hepatitis B delta vírus egy olyan kórokozó, amely HBV-fertőzéssel együtt akut, heves lefolyású, rendszerint halálos kimenetelű betegséget okoz. A delta vírus saját genetikai anyagában nem kódol virion-burokként szolgáló proteineket, hanem a vírus az együtt fertőző HBV által kódolt burok-proteinekkel képez kapszidot, ezáltal a HBV proteinekhez igen hasonló szerkezeti és immunológiai sajátságokat mutat, amelyeket alább ismertetünk. Jelenleg nem ismert, hogy egyéb fertőző ágensek mutatnak-e hasonló rokonságot a HBVvel. Nyilvánvaló azonban, hogy a szélesebb szerológiai reaktivitással vagy nagyobb immunológiai potenciállal rendelkező proteinek különféle rendszerekben használhatók a HBV—vei csak gyenge, vagy részleges antigén kereszt-reaktivitást mutató ágansek által okozott betegségek (vagy fertőzések) diagnosztizálására vagy megelőzésére (vagy kezelésére).
A HB virion a strukturális proteinek két csoport jából épül fel, a mag-proteinekből és a burok- vagy felületi proteinekből. A burok-proteinek azonkívül, hogy a virion, azaz a Dane-részecske fő felületi proteinjeit képezik, az Ausztrália antigén, vagy 22 nm-es antigén fő komponensét is jelentik. Ezek a burok-proteinek a legalább 389 aminosavat kódoló, nagy virális nyilt leolvasási keret (ORF) transzlációs termékei. Ez az ORF három doménre oszlik, amelyek mindegyike egy ATG kodonnal kezdődik, azaz in vivő transzlációs iniciációs helyként képes működni. A fenti doméneket preSl (108 aminosav), preS2 (55 aminosav) és S (226 aminosav) doménnek nevezik a génen belül elfoglalt 5'-3' helyzetük sorrendjében. így ezek a domének három polipeptidet határoznak meg, amelyek neve S vagy HBsAg (226 aminosav), preS2+S (281 aminosav) és preSl+preS2+S (389 aminosav) , ezek mint p24/gp27, p30/gp33/gp36, illetve p39/gp43 (valamint fő, középső és nagy proteinként) is ismertek.
A HBV burok-proteinek a meghatározott peptid felismerő helyekhez N-glükozidos kötéssel kapcsolódó szénhidrát—oldalláncokkal (glikán) rendelkező glükoproteinek [Heermann és munkatársai, J. Virol. 52., 396 (1984) és Stibbe és munkatársai, J. Virol. 46, 626 (1983)]. így a természetes fertőzés során keletkező HBV polipeptidek magukban foglalják a p24/gp27-et (az S polipeptidet és annak glükozilezett származékát), a gp33/gp36-ot (a csak a preS2 doménben glükozilezett preS2+S polipeptidet, és a preS2 és S doménben is glükozilezett preS2+S polipeptidet), és a p39/gp42-t (a preSl+preS2+S peptidet és annak a preSl doménben glükozilezett származékait). A jelenleg kapható plazma-eredetű vak- 4 cinák a látszólag csak a p24 monomert és annak gp27 glükozilezett származékát magában foglaló S domént tartalmazó proteinekből állnak, míg az élesztőből származó vakcinákat sikerült úgy továbbfejleszteni, hogy azok kizárólag csak az S polipeptidet tartalmaznak (amely kizárólag nem-glűkozilezett p24 polipeptidből áll).
A 22 nm-es HBsAg részecskéket a fertőzést krónikusan hordozók plazmájából tisztították. Ezeket a fertőzés-hordozókat - mivel plazmájuk a részecskékre nézve pozitív - HBs + —nak nevezzük. Ha a fertőzött egyének kielégítő immunválaszt produkálnak, fertőzésmentessé válhatnak, és HBs“-ok lesznek. HBs-sel szembeni antitest képzésük szempontjából ezeket az egyéneket anti-HBs+-nak nevezzük. Ily módon az anti-HBs+ összefüggésben van a betegségből való felépüléssel, és az ezzel a betegséggel való újbóli fertőzéssel szembeni immunitással, és a HBV-vel való újrafertőzéssel szembeni immunitással. Ezért az anti-Hbs HB vakcinák általi stimulálása vagy kialakítása várhatóan HBV fertőzéssel szembeni védelmet biztosít.
Ez a .feltételezés kísérletileg vizsgálható volt. Az emberen kívül a csimpánz egyike azon kevés fajnak, amely HBV fertőzésre teljesen érzékeny, amit a mérhető markerek, például a HBs+ és a máj enzim megemelkedett szérum-szintje tükröznek. A csimpánzokat tisztított HBs részecskékkel vakcinálták három dózisban, majd intravénásán HBsAg részecskékkel fertőzték. Amíg az ál-vakcinált állatok akut HBV fertőzés tüneteit mutatták, a HBsAg-vakcinált állatok a fertőzés tüneteitől teljesen mentesek maradtak. Ezért ebben a kisér5 leti rendszerben a p24-ből (vagy p24-ből és p27-ből) álló HBsAg részecskék képesek voltak védő immunitás indukálására. A fenti megfigyelések alapján számos cég gyártott HBsAg részecskékből álló HB vakcinákat.
A HB vakcinák hozzáférhető mennyiségének növelése céljából, a virális burok-proteinek expressziója érdekében számos gyártó cég áttért a rekombináns DNS módszerre. A mikroba-rendszerek közül az Escherichia colit és a Saccharomyces cerevisiae-t alkalmazzák leggyakrabban a különböző rekombináns eredetű proteinek expresszálására. Az immunoiógiailag aktív HBsAg részecskék E. coliban való expresszálására irányuló számos kísérlet nem vezetett eredményre. A S. cerevisiae azonban alkalmasnak bizonyult az immunoiógiailag aktív HBsAg részecskék expresszálására. Ezek a (kizárólag p24—bői álló) részecskék vakcinává formálva képesek voltak a csimpánzokat megvédeni a különböző szerotípusokba tartozó, élő HBV-vel való fertőzésektől. Ezenkívül az élesztőből származó S részecskék immunoiógiailag ugyanolyan aktívak és hatásosak voltak humán klinikai kísérletekben a betegség vagy fertőzés megelőzésére, mint a plazma-eredetű HBsAg [Stevens és munkatársai, JAMA 257, 2612-2616 (1987)] . Eszerin a S. cerevisiae gazdaként! alkalmazása a rekombináns HBsAg szintézisének irányítására megalapozottnak látszott. Ezenkívül a humán gyógyszerek és vakcinák élesztőben való expresszálása igen hasznos lehet a termékfejlesztés szempontjából, mivel az élesztő endotoxintól mentes, emberre nézve nem patogén, ipari méretekben fermetálható, és számos olyan biztonsági intézkedés mellőzhető, amelyre a folyamatos ·· ·« ·« ♦ · ♦ · *1 • A · · * • · · · · · * : ·.«· *·.* · emlős sejtvonalak alkalmazása esetén szükség van (mivel ezek közül sok virálisan transzformált, egérben rákkeltő lehet, és mindegyikük tartalmaz proonkogéneket).
A S. cerevisiae (pékélesztő) egy euklariota, amely glúkoproteinek szintézisére képes. A proteinek glükozilezése élesztőben több tudományos cikk tárgyát is képezi napjainkban [lásd például Kukuruzinska és munkatársai, Ann. Rév. Biochem. 56, 915-944 (1987); Tannen és munkatársai, BBA 906, 81-99 (1987)]. Ez a glükozilezés, vagyis a glukánok kapcsolódása a polipeptidben lévő megfelelő receptor aminosavakhoz vagy specifikus szerin- vagy treonin-maradékokon (Ser illetve Thr) (O-kötéssel) vagy specifikus aszparagin-maradékokon (Asn) (N-kötéssel) megy végbe. A Ser vagy Thr maradékokhoz O-kötésen keresztüli addíció specificitása még nem teljesen tisztázott, és empirikusan határozzák meg minden egyes esetben.
Az N-kötésen keresztüli glükozilezéshez a szignálszekvencia jól definiált, ez egy Asn-X-Thr vagy Asn-X-Ser aminosav-szekvencia (ahol X tetszőleges aminosavat jelent). A különféle autológ, natív, glükozilezett proteinek (többek között mannoproteinek vagy mannopeptidek) szintézisén kívül az élesztő rekombináns módszerekkel expresszált heterológ vagy idegen proteinek glükozilezésére is képes (ha a heterológ protein tartalmazza az N-kötésen vagy O-kötésen keresztüli glükozilezéshez szükséges megfelelő glükozilezési szignál-szekvenciát).
A természetes fertőzés során keletkezett preS2+S polipeptidek legfeljebb két mag [kb. 3 kilodalton (kD) mére·· ··· · ♦ · . · · • ··· · · · • · · · ♦ · • ♦« · · ·
- 7 tű], N-kötött glukánt tartalmaznak, egyet az S régióban, és egy másikat a preS2 dómén 4-es helyzetű Asn aminosav-maradékán. Az S doménben lévő felismerő hely nem glükozilezett sem a Recombiovax HBR-ben, sem az élesztőben szintetizált rekombináns preS2+S-ben. Azonban a preS2 dómén 4-es helyzetű aminosav-maradékán lévő helyet az élesztő felismeri és glükozilezi.
A preSl dómén egy N-kötött glűkozilezési helyet tartalmaz a preSl régió 4-es helyzetű aminosav-maradékában és az adw szerotípus számára egy potenciális helyet a 26-os helyzetű aminosav-maradéknál. Szakemberek számára magától értetődő, hogy a preS2 glükozilezése melletti érveket a preS2 régióban, valamint a preSl és az S doménben is eltérő szekvenciákra irányuló javaslatok követték.
A rekombináns preS2+S-t szintetizáló élesztő egy mag-glukánt visz be a polipeptidbe, amely hasonló ahhoz, amely a virális fertőzés során a natív polipeptidbe kerül. Ha azonban az élesztő gazdasejt a glűkozilezés szempontjából vad típusú (azaz tartalmazza a natív glükozilezéshez szükséges összes komplement enzimet, ami a szokásosan alkalmazott összes élesztő törzs esetében fennáll), a fenti glukánok jelentős számban nagyszámú további mannóz-maradékkal meghosszabbodnak, hasonló módon ahhoz, ami az élesztőben akkor megy végbe, amikor saját szerkezeti mannoproteinjeit szintetizálja. A glukánok fenti meghosszabodását - ha az egy idegen gén termékben, például a preS2+S polipeptidben megy végbe - hiperglükozilezésnek nevezik. Szakemberek számára magától értetődő, hogy az élesztő melletti érvek egyéb gaz8 • ·♦· · ♦ · • · · · · · • ·« ·· · dasejtekre (például rovarsejtekre, gombákra, stb.) is érvényesek, amelyek glükozilezési sémája eltérő lehet.
Ezenkívül kimutatták, hogy a vad típusú élesztő gazdasejtekben expresszált HBV felületi proteinek 22 nm-es részecskéinek rekombináns formái jelentős mennyiségű (legalábbis részben az élesztő gazdasejt szerkezeti mannoproteinjeiből és mannopeptiodjeiből származó) élesztősejt szénhidrátot zárnak magukba a 22 nm-es részecskékben. Ez a magába zárt szénhidrát potenciálisan problémát okozhat annyiban, hogy a visszatartott szénhidrát a glükozilezett proteineken lévő élesztő szénhidrát maradékok elleni antitestek keletkezését indukálhatja, és a visszatartott élesztő szénhidrátot tartalmazó immunogén vakcina reagálhat a legtöbb emlős fajban jelenlévő anti-élesztő antitestekkel, ezáltal hatékonysága mint immunogén és mint vakcina potenciálisan csökken.
A HBV preS és S polipeptidekben, és azok megfelelő részecskéiben az alábbi megközelítések szerint a hiperglükozilezés és a komplett mannoproteinek és mannopeptidek viszszatartása kiküszöbölhető, vagy a glükozilezés korlátozható.
Először, az N-kötött hiperglükozilezés megelőzhető vagy korlátozható a rekombináns gazda szaporodása során, ha a tápközegben valamely exogén ágens (például tunikamicin) van jelen. Másodszor, rekombináns vagy természetes eredetű polipeptidek kémiailag (például vízmentes trifluor-metánszulfonsawal vagy vízmentes hidrogén-fluoriddal) vagy enzimatikusan (például N-glukanázzal, Endo-F-fel vagy Endo-Hval) vagy fizikailag (például ultrahangos kezeléssel) dezglükozilezhetők. Harmadszor, a glükozilezés felismerési he- 9 lye DNS-szinten mutagenezissel megváltoztatható vagy törölhető, ezáltal a mag-glükozilezés és ennek következtében a hiperglükozilezés megelőzhető. Ilyen módosított preS+S ORF—eket - amelyekben a glükozilezést felismerő szekvenciát megváltoztatták (élesztőben működő, megfelelő promoterek irányítása alatt) - élesztő gazdasejtekbe transzformáltak. A kapott preS+S polipeptidekből hiányzik a glükozilezés. Negyedszer, szelektálhatok olyan gazdasejtek, amelyekből hiányoznak a glükozilezéshez szükséges kritikus enzimek, ez a találmány szerinti megoldás egyik jellemzője is. Ballou L.
és munkatársai [J. Bioi. Chem. 255, 5986-5991 (1980)] találtak egy olyan élesztő törzset (mnn9- mutánst), amelyből hiányzik a glükozilezés egyik kritikus enzimje, amely az N-kötött glukánok lánchosszabbodásához (hiperglükozilezéshez) szükséges; a kémiai vizsgálatok azt mutatták, hogy ez a mutáns láncon kívüli mannóz-maradékok nélküli, csak mag-szénhidrátot tartalmazó mannoproteineket készít [Ballou C.E. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83., 3081-3085 (1986) és Tsai P. és munkatársai, J. Bioi. Chem. 259, 3805-3811 (1984)]. Az S vagy preS+S polipeptid ORF-et (élesztőben működő, megfelelő promoterel által irányított transzkripciót) alkalmaztak a fenti mnn9- mutáns élesztő transzformálására.
A kapott preS+S polipeptid csak mag-glükozilezést tartalmaz, és nincs benne hiperglükozilezés.
Annak ellenére, hogy az élesztőben expresszált S polipeptidek nem glükozilezettek, sem nem hiperglükozilezettek, a belőlük kialakult részecskék élesztő mannopeptidekből származó jelentős mennyiségű szénhidrátot zárnak magukba.
Ezért az S polipeptidek valamint a preS-t tartalmazó polipeptidek expressziója hiperglükozilezésre képtelen élesztősejtekben csökkent mennyiségű szénhidrátot eredményez az expresszált 22 nm-es részecskékben.
A S. cerevisiae nagy változékonyságot mutat azon képességében, hogy immunológiailag aktív 22 nm-es részecskéket expresszáljón. Ezek a részecskék vakcinává formálva bizonyítottan képesek a csimpánzokat teljes mértékben védeni élő HBV fertőzéssel szemben. Ezenkívül az élesztő eredetű HBsAg immunológiailag ugyanolyan hatékony volt humán klinikai kísérletekben, mint a plazma eredetű HBsAg. Ezért a S. cerevisiae gazda speciesként! alkalmazása rekombináns HBsAg szintézisének irányítására erősen megalapozott.
Számos rekombináns mikrobás expressziós rendszerben számos különféle polipeptid szintézise bizonyítottan veszélyes a gazdasejtre nézve. Ennek következtében szelekciós nyomás hat az ilyen polipeptidek expressziója ellen, úgy, hogy az ilyen rekombináns tenyészetek méretnagyítása során csak azok a sejtek szaporodnak fel, amelyek már nem expreszszálják az idegen polipeptidet, vagy csak olyan kevés idegen polipeptidet expresszálnak, hogy a tenyészetből a polipeptid kinyerése gazdaságtalan lesz. Bizonyos esetekben a károsító hatás olyan erős, hogy ha az expressziót egy erős konstitutív promoter hajtja, az újonnan transzformált sejtek nem szaporodnak és nem képeznek telepet szelektív lemezeken. Ezt a káros hatást kivédhetjük, ha az ilyen polipeptidek szintézisének irányítására indukálható promotert alkalmazunk. A S. cerevisiaeben számos indukálható gén van. Négy jól ismert • *·· · !
• · · · · · • ·« · * · indukálható genetikus rendszer a galaktóz (GÁL) hasznosítási gének, az alkohol-dehidrogenáz 2 (ADH2) gén, az alfa párosodási faktor gén és a pho5 gén.
A S. cerevisiae-nek 5 génje van, amely a szaporodás során a galaktóz szénforráskénti hasznosításáért felelős enzimeket kódolja. A GÁLI, GAL2, GAL5, GAL7 illetve GAL10 gén a galaktokinázt, galaktóz-permeázt, a foszfoglukomutáz fő izozimjét, az α-D-galaktóz-l-foszfát uridil-transzferázt, illetve az uridin difoszfo-galaktóz-4-epimerázt kódolja. Galaktóz távollétében a fenti enzimek csak igen kis mértékben expresszálódnak. Ha a sejteket glükózon tenyésztjük, majd a tenyészethez galaktózt adunk, ez a három enzim koordináltan indukálódik, legalább 1000-szeres mennyiségben (kivéve a GAL5-öt, amely mintegy 5-szőrös mennyiségben indukálódik) az RNS transzkripció szintjén. A GÁLI, GAL2, GAL5, GAL7 és GAL10 géneket molekulárisán klónozták és szekvenálták. A megfelelő kódoló régiók 5'-végén a szabályozó és promoter szekvenciákat a lacZ gén kódoló régióinak szomszédságába helyezték. Ezekkel a kísérletekkel meghatározták azokat a promoter és szabályozó szekvenciákat, amelyek a galaktóz indukálásához szükségesek és elegendőek.
A S. cerevisiae 3 olyan gént is tartalmaz, amelyek mindegyike az alkohol dehidrogenáz (ADH) egy izozimjét kódolja. A fenti enzimek egyike, az ADHII felelős azért, hogy a S. cerevisiae oxidatív szaporodása során szénforrásként képes etanolt hasznosítani. Az ADHII izozimet kódoló ADH2 gén expressziója katabolit-represszált a glükóz által, úgy, hogy a fermentatív szaporodás során látszólag nincs ADH2 gén ··< «· • « * * • ··< ♦ · · • ♦ · · · • · ·· ·
- 12 transzkripció 0,1 vegyes% glükóz-koncentráció jelenlétében. Amikor a glükóz elfogy, nem-represszáló szénforrás jelenlétében az ADH2 gén transzkripciója 100-1000-szeresen indukálódik. Ezt a gént molekulárisán klónozták és szekvenálták, és meghatározták azokat a szabályozó és promoter szekvenciákat, amelyek a transzkripció derepressziójához szükségesek és elegendőek. Az alfa párosodási faktor a S. cerevisiae egy szex-feromonja, amely a MATa és MATa sejtek közötti párosodásihoz szükséges. Ez a tridekapeptid mint preproferomon expresszálódik, amely a durva endoplazmatikus retikulumba kerül, glükozileződik és proteolitikusan végső, érett formává alakul, amely a sejtből kiürül. Ezt a biokémiai utat alkalmazzák stratégiaként az idegen polipeptidek expressziójára. Az alfa párosodási faktort molekulárisán klónozták és promoterét a pre-pro-leader szekvenciával számos polipeptid expresszálására és szekretálására alkalmazták. Hasonlóképpen kimutatták, hogy a pho5 gén is indukálható alacsony foszfátkoncentrációknál, és ez is hasznosítható idegen proteinek fiziológiásán szabályozott expressziójára élesztőben.
Durva endoplazmatikus retikulumon és Golgi-készüléken való átjutásuk alapján várható, hogy az idegen proteinekben végbemehetnek mind az N-, mind az O-kötött glükozilezési folyamatok. Az alfa párosodási faktor promoter csak olyan sejtekben aktív, amelyek fenotípusa a. A S. cerevisiae-ben 4 SIR néven ismert genetikus lókusz van, amely az a és a információ egyéb, normális esetben néma példányainak repressziójához szükséges proteineket szintetizálja.
A fenti repressziós eseménnyel interferáló, hőmér13
• · ·· * séklet-érzékeny (ts) léziók a fenti lókuszok legalább egyikének gén termékében jelen vannak. Ebben a mutánsban a 35 °C-on való tenyésztés módosítja a repressziót, és fenotípusosan a/α sejteket eredményez, amelyekben az alfa párosodási faktor inaktív. A hőmérséklet 23 °C-ra való eltolódása hatására a sejtek fenotípusosan α-vá revertálnak, úgy, hogy a promoter aktívvá válik. A ts SIR lézióval rendelkező törzsek alkalmazását számos idegen polipeptid szabályozott expreszsziójára kimutatták.
A találmány egyrészt olyan HBV felületi proteinekre vonatkozik, amelyek jelentősen csökkent mennyiségű magukba zárt szénhidrátot tartalmazó részecskéket képeznek.
A találmány másik tárgya eljárás HBV felületi proteinek előállítására élesztő gazdasejtben, amely felületi proteinek részecskéket képeznek, amelyek lényegesen csökkent mennyiségű magukba zárt szénhidrátot tartalmaznak.
A találmány továbbá HBV elleni vakcinára vonatkozik a HBV vagy a HBV-vel szerológiailag rokon egyéb fertőző ágens által okozott betegség és/vagy fertőzés megelőzésére vagy kezelésére, amely vakcina lényegesen kevesebb magába zárt szénhidrátot tartalmazó HBV felületi protein részecskékből áll.
A találmány továbbá rekombináns gazdasejtek üzemi méretű tenyésztésére és a rekombináns HBV felületi proteinek tisztítására alkalmas körülményekre vonatkozik. A találmány fenti és egyéb tárgyai az alábbi leírásból nyilvánvalóvá válnak.
A HBV felületi proteineket nagy koncentrációban exp··«·
- 14 resszáltuk rekombináns élesztő gazdasejtekben, amelyekből genetikailag hiányzik a protein glükozilezésének képessége. A HBV felületi proteinek expressziója élesztősejtekben a jellegzetes részecskék képződését eredményezi. A fenti részecskék élesztősejtekben való képződése közben az élesztősejt anyagait a részecskék magukba zárják. Vad típusú élesztő gazdasejteket alkalmazva a HBsAg részecskék az élesztő szénhidrát-tartalmának jelentős részét magukba zárják. A jelentős szénhidrát-tartalmú részecskékből álló HBV vakcina képződésének megakadályozására a HBV proteineket olyan rekombináns élesztő gazdasejtben állítjuk elő és tisztítjuk, amely genetikusán képtelen a proteinek glükozilezésére. Az ilyen gazdasejben termelődött HBV felületi proteinek olyan részecskéket képeznek, amelyek lényegesen kevesebb szénhidrátot tartalmaznak, mint a vad típusú élesztősejtekben termelt részecskék. Az így nyert HBV felületi proteinek vakcinaként alkalmazhatók a HBV-vel kapcsolatos fertőzések kezelésére és/vagy megelőzésére, és antigénként immunológiai diagnosztizálásra csökkent reaktivitással a természetes anti-élesztő antitestekkel szemben.
Az 1. ábra a HBsAg ORF transzkripcióját elősegítő pGALlO promotert, az azt követő tADHl terminátort és a LEU2+ szelekciós markert tartalmazó pCl/lpGALlOBHsAg-tADH-1 plazmidot mutatja sematikusan.
A találmányt részletesen az alábbiakban ismertetjük.
A találmány szerinti eljárás HBV felületi protein részecskék előállítására vonatkozik, amelyek lényegesen kevesebb mennyiségű magukba zárt szénhidrátot tartalmaznak, és amelyek HBV elleni vakcinaként alkalmazhatók.
A virális ORF-ek izolálására HBV nukleinsav forrásként Dane részecskéket (adw szerotípus) alkalmaztunk. Szakemberek számára magától értetődő, hogy a találmány értelmében a vírusok genetikai eltérése miatt az egyéb szerológiai reaktivitással rendelkező HBV törzsekből vagy rokon vírusokból származó nukleinsavak is alkalmazhatók. A HBV-genom kovalensen zárt cirkuláris kettős szálú DNS-ének előállítására a HB virionban natívan jelenlévő, bevágott és betöltött nukleinsav formából az endogén polimeráz reakciót alkalmaztuk. A DNS-t izoláltuk, EcoRI-gyel teljesen emésztettük, és a pBR322 EcoRI helyére klónoztuk, így kaptuk a pHBV/ADW-1 plazmidot. Szelektáltuk azokat a rekombináns plazmidokat, amelyek a HBV genomot cirkulárisán permutált formában tartalmazzák a PreS régió EcoRI helyén. A preS2 régió 55 aminosavját és az S régió 226 aminosavját kódoló teljes ORF-et úgy szerkesztettük meg, hogy először tisztítottuk a pHBV/ADW-1 EcoRI-gyel és Accl-gyel való emésztése után kapott 0,8 kilobázispár (kbp) hosszúságú fragmenst; ez a fragmens kódolja a preS2+S polipeptidet, és csak az iniciációs kodon, az amino-terminális 3 aminosav, a karboxilterminális 3 aminosav és a transzlációs terminátor kodon hiányzik belőle.
Oligonukleotidokat szintetizáltunk és a fenti fragmenshez ligáltuk, ezáltal azt egy 10 bp hosszúságú, élesztőből származó nem-transzlatált 5' határoló szekvenciát tartalmazó Hindin fragmenssé alakítottuk, és a teljes preS2+S ORF-et úgy választottuk meg, hogy a terminátor kodont köz vétlenül a természetes Hindin helyhez kapcsoltuk az ADH1 transzkripciós terminátorban, ezáltal teljesen natív, minden további közbeékelődő bázis nélküli élesztő eredetű kapcsolódást hoztunk létre. Szakember számára érthető, hogy a HBV felületi és rokon proteinjei expresszálására bármely megfelelő, élesztőben működő transzkripciós terminátor helyettesítheti az ADHl-et.
A szerkesztéshez használt 5' határoló szekvenciát ACAAAACAAA 1 10 (1. számú szekvencia) úgy választottuk meg, hogy az megfeleljen a GAP63 (GAP) élesztő gén nem-transzlatált leader (NTL) szekvenciájának [Holland, J. Bioi. Chem. 225, 2596 (1980)], és a GAP gén család számára is konszenzus szekvencia legyen. A szerkesztést úgy végeztük, hogy az NTLt minden további közbeékelődő bázis nélkül, közvetlenül kapcsoltuk a preS2+S ORF iniciációs kodonjához. Ezért szakemberek számára nyilvánvaló, hogy a HBV felületi proteinek expressziójára NTL szekvenciaként minden olyan szekvencia alkalmazható, amely megfelelő expressziós szintet eredményez.
DNS-szekvencia analízissel két bázis-szubsztitució mutatható ki, amely két aminosav eltérést eredményez a pHBpreSGAP347/19T DNS által kódolt preS2+S szekvenciához viszonyítva [Valenzuela és munkatársai, Biotechnology 3.(4) , 317-320 (1985)]. Abból a célból, hogy mindkét konstrukció esetén azonos polipeptideket vizsgáljunk, a fenti nukleotid—szubsztitúciókat - amely szerint a HBV preS2+S 846 bp • ·
- 17 hosszúságú ORF-jében a 64-es helyzetű bázis C helyett T (és Leu helyett Phe-t kódol) és a 352-es helyzetű bázis A helyett C (Gin helyett His-T kódol) - hely-irányított mutagenezissel megváltoztattuk [Zoller és mt, Nucleic Acids Research 10, 6487-6500 (1982)1. Ezután igazoltuk az optimalizált konstrukció által kódolt aminosav-szekvenciát. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány nem korlátozódik erre a szekvenciára, hanem minden olyan szekvenciára kiterjed, amelyben a DNS egy HBV-vel rokon antigén tulajdonsággal rendelkező polipeptidet kódol.
EcoRI-gyel és Styl-gyel végzett emésztés után a preS2-t kódoló DNS fragmenstől elválasztottuk a pUC19-et és a HBsAg kódoló régiót tartalmazó 3,3 kbp hosszúságú nagy DNS fragmenst, és preparatív agaróz gél-elektroforézissel tisztítottuk. A szintetikus DNS oligonukleotidot ezután a pUC19-HBsAg fragmenssel ligáltuk. A szintetikus DNS oligonukleotid fragmens 5' EcoRI és 3' StyI ragadós véget tartalmaz, valamint közvetlenül az 5' EcoRI hely után egy Hindin hellyel rendelkezik. Ezenkívül a szintetikus DNS oligonukleotid tartalmazza a HBsAg ATG kodont plusz 9 nukleotidot előtte (5' irányban) és 21 nukleotidot utána (3' irányban), beleértve az StyI helyet.
Ezzel az oligonukleotiddal rekonstruáltuk a HBsAg teljes kódoló régióját és ezután lehetővé vált annak intakt eltávolítása a pUC19 alapú vektorból, HindlII-mal végzett emésztéssel.
A ligáit szintetikus DNS oligonukleotidot tartalmazó pUC19-HBsAg DNS fragmenst E. coli transzformálására al kalmaztuk. Szelektáltuk azon rekombináns plazmidokat, amelyek a teljes rekonstruált HBsAg kódoló régióval rendelkeztek. A rekombináns plazmidból HindlII-mal végzett emésztéssel eltávolítottuk a teljes HBsAg nyílt leolvasási keretet (ORF), majd egy GAL10 promoternek az expressziós vektorba való klónozásához preparatív agaróz gél-elektroforézissel izoláltuk és tisztítottuk a 0,7 kbp hosszúságú HBsAg DNS-t.
Az idegen gén expresszióját elősegítő expressziós kazettát (pGALlO-tADHl) a galaktózzal indukálható GAL10 promotertől 3' irányban illesztettük be az egyetlen Hindin helyre. A fent ismertetett HBsAg ORF-et (a HindlII véggel) a vektor HindlII helyére ligáltuk. Ezt az expressziós kazettát a pCl/1 E. coli ingázó vektor Sphl helyei közé inszertáltuk (Beggs, supra) és a vektort S. cerevisiae CF52 vagy CF54 törzsbe beépítettük, majd a transzformált kiónokat szelektáltuk.
A mutagenezist követően a fenti S-t vagy preS+S-t kódoló fragmenst alkalmaztuk egy expressziós kazetta szerkesztésére [Kinskern és munkatársai, Gene 46., 135-141 (1986)], amely (a) kb. 1,1 kbp hosszúságú GAP491 promoterből, (b) egy 10 bp hosszúságú, élesztőből származó határoló szekvenciából, (c) a preSl+preS2+S virális ORF-jének 1230 bázispárjából, vagy a preS2+S virális ORF-jenek 846 bázispárjából, vagy az S virális ORF-jének 681 bázispárjából, és (d) kb. 0,4 kbp hosszúságú élesztő ADH1 terminátorból áll.
A HBsAg expressziós kazetták szerkesztésére három különböző expressziós vektort alkalmaztunk. Az ismert GAP 491 promoter expressziós kazetta [Kniskern és munkatársai, • · · · · · • · · • · · « · • · ·
- 19 Gene 46, 135-141 (1986)] mintegy 1,1 kbp hosszúságú glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz (GAPDH) promoterből és mintegy 350 bp hossuúságú élesztő alkohol-dehidrogenáz I (ADH1) terminátorból áll egy pBR322 plazmid vázban, egyetlen Hindin hellyel a promoter és a terminátor között. A 2. példa szerinti HBsAg ORF-et az egyetlen HindlII helyre ligáitűk, és jelenlétét és orientációját restrikciós endonukleázos analízissel és Southern blottal erősítettük meg.
Alternatív módon a 0,5 kbp GAL10 promoterrel [Schultz és munkatársai, Gene 54, 113-123 (1987)] helyettesítettük az 1,1 kbp GAP promotert a fenti szerkezetben, vagy a GAP promoter helyett az 1,25 kbp ADH2 promotert [Kniskern és munkatársai, Hepatology 8., 82-87 (1988)] alkalmaztuk (lásd 1. ábrát).
A minden esetben egy specifikus promotert, a HBsAg ORF-et és az ADH1 terminátort tartalmazó expressziós kazettát a pCl/1 ingázó vektorba [Beggs, supra; Rosenberg és munkatársai, supra] klónoztuk, és az így kapott élesztő expressziós vektort alkalmaztuk S. cerevisiae transzformálására az alábbiakban ismertetett módon. A transzformánsokat a további kiértékelésig és az azt követő kísérletek elvégzéséig fagyasztott törzstenyészetként tartottuk.
A szülő CF52 törzset az alábbiak szerint kaptuk: az a párosodási típusú CZ5/LB347-1C (mnn9-, SUCZ-) törzset az a típusú 2150-2-3 (leu2“, adel-) törzzsel pároztattuk úgy, hogy a törzseket YEHD komplett táptalajos lemezen összekevertük. A diploidok szelektálására a párosított törzseket egyetlen szénforrásként 2 % szacharózt tartalmazó leu- • « • · ·
- 20 minimál táptalajra oltottuk replika módszerrel. Az egyes telepek izolálása után a diploidokat spóráztattuk, és a tömlőket standard módszerrel szétvágtuk. A KHY-107 törzset egyetlen spóra formájában izoláltuk és mint cir+, adel+, leu2 és mnn9“ törzset jellemeztük. (Schiff festési módszerrel) .
A KHY-107 (cir 0) törzset a KHY-107 (cir+) törzsből származtattuk a Broach által leírtak szerint [Methods in Enzymology 101, Part C, 307-325 (1983)]. A kapott törzset egy elroncsolt ura3 gén beépítésével ura3-vá tettük. A kapott KHY-107ura3Á törzset komplett tápközegben tenyésztettük, hogy elősegítsük a spontán mutációkat, és szelektáltunk egy kanavanin-rezisztens mutánst. A mutáns CF55 törzs a kompiementációs vizsgálatok szerint canl volt. A CF55 HIS3 génjébe beépítettük a GAL10pGAL4 expressziós kazettát [Methods in Enzymology 185. 297-309 (1990)], így kaptuk a kívánt CF52 gazdatörzset (Mata leu2-2,112 ura3A canl his3A::GAL10pGAL4-URA3, cir°). A kapott transzformánsokat fagyasztott törzstenyészet formájában tároltuk a kiértékelésig és a további vizsgálatokig.
A fagyasztott törzstenyészetből származó rekombináns élesztőt YEHD közegben [Carty és munkatársai, J. Industrial Micro. 2, 117-121 (1987)] tenyésztettük. A stacioner fázis elérése után az élesztősejteket összegyűjtöttük. Lizátumot állítottunk elő, nátrium-dodecil-szulfát/poliakrilamid gél—elektroforézissel (SDS-PAGE) rezolváltuk, és HBsAg-vel szembeni antitestekkel immunblottoltuk. Egy mintegy 24 kD móltömegu polipeptidet találtunk, az S ORF transzlációs tér «44« 44 ·· «4·4 * · · 4
4 4« 4 4 4 mékének várt molekulatömegével összhangban. Ezenkívül, a nem szülői, de rekombináns élesztő lizátumai radioimmunvizsgálat (AusriaR) szerint S-re pozitívok voltak. A részlegesen tisztított élesztő lizátumok elektronmikroszkópos vizsgálata a tipikus HBsAg részecskék nagy sűrűségét mutatta.
Az élesztőből származó promoter iniciálja a HBsAg és a rokon gének transzkripcióját. Szakemberek számára ezért nyilvánvaló, hogy a GAP491 promoter helyett bármely egyéb, élesztőben működő promoter szekvencia (például GÁLI, GAL10, ADH2, Pho5, stb.) is alkalmazható. Szakember számára az is nyilvánvaló, hogy megfelelő vizsgálati rendszert, például immunblotot vagy RIA-t vagy enzim-kötött immunvizsgálatot (EIA) kell alkalmazni annak érdekében, hogy a HBsAg és a rokon proteinek expresszióját ebben a rendszerben ellenőrizzük, hogy a sejttenyészetből a sejtek összegyűjtésének időpontját a maximális hozam elérése érdekében optimalizálhassuk.
A GAP491 promoter élesztőben alkalmas számos idegen protein, például a HBsAg expresszálására [Bittér és munkatársai, Gene 32, 263-274 (1984); Wampler és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6830-6834 (1985)]. Saját korábbi eredményeink alapján, amely szerint sikerült a HBcAg-t az oldható élesztő protein mintegy 40 %-áig expresszálni [Kniskern és munkatársai, supra], ezt a promotert alkalmaztuk a HBsAg és a rokon proteinek expressziójának elősegítésére megfelelő élesztő gazdasejtben.
Szakember számára nyilvánvaló, hogy a megfelelő élesztő törzs kiválasztásához a HBV felületi proteinek exp«44* ti ·* · ··4 · « * * • · · 4 4 · ·
- 22 resszálására számos törzs jöhet számításba. Megfelelnek a genetikus és fenotípusos jellemzőkkel, mint például proteáz hiánnyal és megváltozott glikozilezési képességgel rendelkező élesztő törzsek.
A rekombináns élesztő által expresszált HBV proteinek glikozilezésének szabályozására és meghatározására S. cerevisiae CF52 törzset (Mata leu2-2, 112 ura3A canl his34::GAL10pGAL4-ura3, cir°) alkalmaztunk, amelyet a fent ismertetett módon konstruáltunk meg.
A CF52 (Mata leu2-2, 112 ura3A canl his3A::GAL10pGAL4-ura3, cir°) transzformálására pCl/lpGAL10HBsAg-tADH-l expressziós plazmidot alkalmaztunk. A transzformált kiónokat 1 mol/1 szorbitot tartalmazó minimál táptalajon (leu) szelektáltuk. Az így kapott transzformáns kiónokat 17 %-os glicerinben fagyasztva tartottuk a további vizsgálatok és kísérletek elvégzéséig.
A kontroll vad típusú glikozilezéshez az expressziós plazmiddal transzformáltuk a CF54 törzset is, amelyet a CF52 törzsből standard módszerekkel izoláltunk, és amely spontán MNN9+-vá revertál (ezért glikozilezés szempontjából vad típusú, egyébként pedig a CF52 törzzsel azonos genotípusú). A transzformált izolált kiónokat 17 % -os glicerinben fagyasztva tartottuk a soron következő vizsgálatok és kísérletek elvégzéséig.
Az expressziós plazmidot tartalmazó transzformált élesztő kiónokat leu szelektív agar lemezre szélesztettük (amely az mnn9 transzformások számára 1 mol/1 szorbitot tartalmazott), és 30 °C-on 2-3 napon keresztül inkubáltuk. A ···· kapott élesztőt 5-7 ml komplett (0,1-1 mol/1 szorbitot és a GAL10 alapú plazmidok számára 2 % galaktózt tartalmazó) YEHD tápközegbe [Carty és munkatársai, supra] inokuláltuk, és a tenyészeteket 30 °C-on, levegőztetés közben 12-18 órán keresztül inkubáltuk. Az 50 ml komplett YEHD tápközeget és 1 mmol/1 szorbitot (továbbiakban YEHDS-t) tartalmazó lombikokat a fenti tenyészetekkel inokuláltuk (a kezdeti zavarosság Agoo = θ»1)» és 30 °C-on, rázatás közben (350 fordulat/perc) 48-72 órán keresztül Αθθθ = 10-16 zavarosságig folytattuk a tenyésztést. Az A^qq = 10 egység zavarosságú mintákat kémcsövekbe szétosztottuk, és az élesztősejteket 2000 g-vel 10 percen keresztül centrifugálva ülepítettük. A mintákat vagy azonnal vizsgáltuk, vagy -70 °C-on fagyasztva tároltuk. A vizsgálat elvégzésekor az üledéket 0,4 ml, 2 mmol/1 fenilmetil-szulfonil-fluoridot (PMSF) tartalmazó, foszfáttal pufférőit sóoldatban (PBS) újra szuszpendáltuk, és 1,5 ml-es Eppendorf-csövekbe helyeztük. Az élesztősejteket (1) 200300 mg mosott üveggyöngy (0,45 mm) hozzáadásával és Vortex keverőben 15 perces keveréssel, (2) 0,5 % TRITON X-100 hozzáadásával, (3) Vortex keverőben 10 percen keresztül keveréssel, és (4) 4 °C-on 10 percen keresztüli inkubálással feltártuk. A sejttörmeléket és az üveggyöngyöket eltávolítottuk, és a felülúszót proteintartalomra [Lowry és munkatársai, J. Bioi. Chem. 193, 265 (1951)] és preS2+S specifikus RIA-val [Hansson és munkatársai, Infect. Immunoi. 26, 125-130 (1979) ; Machida és munkatársai, Gastroenterology 86, 910-918 (1984)] vagy S specifikus RIA-val (AUSRIAR) vizsgál tuk .
• ·4 ·»··
- 24 Az expressziós plazmidokat tartalmazó transzformált élesztő mnn9“ kiónokat 1 mol/1 szorbitot tartalmazó leu szelektív agar lemezre szélesztettük és 30 °C-on 2-3 napon keresztül inkubáltuk. A kapott élesztőtenyészetet 5-7 ml komplett YEHF tápközegbe (plusz 2 % galaktóz a GAL10 promoter plazmidok számára) inokuláltuk (a kezdeti zavarosság Agoo = θ'1)» és 30 °C-on, rázatás közben (350 fordulat/perc) 48-72 órán keresztül A^qq = 10-16 zavarosságig inkubáltuk a tenyészeteket. Az Αζθθ = 10 egység zavarosságú mintákból bemértünk 3 kémcsőbe, és az élesztősejteket 2000 g-vel 10 percen keresztül centrifugálva ülepítettük. A mintákat vagy azonnal vizsgáltuk, vagy -70 °C-on fagyasztva tároltuk a vizsgálat elvégzéséig.
Mindegyik rekombináns kiónból származó polipeptid immunbiot analízise mnn9 fenotípusú gazdasejtben egy sávot adott, amelynek látszólagos móltömege mintegy 24 kD.
A rekombináns proteinek esetén a kvalitatív és kvantitatív glükozilezési séma a gazdasejt fajának függvénye, és attól nagymértékben függ, és egy fajon belül is függ a sejtvonaltól. Szakemberek számára nyilvánvaló, hogy a gazda törzs S. cerevisiae-től eltérő, egyéb faj és sejtvonal is lehet, amelynek glükozilezési útjában az enzimek mutációja kimutatható. Szakember számára az is teljesen nyilvánvaló, hogy a S. cerevisiae gazda törzs bármely olyan törzs lehet, amelynek glükozilezési útjában az enzimek mutációja kimutatható .
A transzformált törzseket ezután szűrtük a HBsAg DNS jelenlétére és a p24 HBsAg expressziójára. A sejteket YEHDS tápközegen tenyésztettük (amely a GAL10 promoter plazmidok számára galaktózt is tartalmazott a glükóz kiürülése után az expresszió indukálására). Előállítottuk a lizátumokat, majd nátrium-dodecil-szülfát/poliakrilamid gél-elektroforézissei (SDS-PAGE) rezolváltuk, és Western blottal nitrocellulózra vittük. Vizsgálataink szerint a p24 termék az S proteinre specifikus, mivel csak az indukált transzformánsokban volt jelen, és anti-p24 szérummal reagált. Az ilyen kiónok egyikét kiválasztottuk további analízis céljára. Ezenkívül, a transzformánsok lizátumai - a szülői S. cerevisiae-vel ellentétben - HBsAg-re pozitívak voltak radioimmunológiai vizsgálat szerint.
Ez megvilágítja az expressziós vektor szerepét, amely a GAL10 promotert használja a HBsAg és hasonló felületi proteinek expressziójára S. cerevisiae-ben. Szakemberek számára nyilvánvaló, hogy a szabályozható GAL10 promoter, vagy hasonló módon működő GÁLI, GAL2 vagy MEL1 promoter is lehetővé teszi a rekombináns S. cerevisiae tenyészet előállítását ipari méretekben a rekombináns protein szintézisének megindulása előtt, ezáltal a gazdasejtre kifejtett negatív hatások minimalizálhatók. Szakember számára az is nyilvánvaló, hogy egyéb, fiziológiásán indukálható vagy egyéb módon derepresszálható regulátor promotert - például ADH2-t vagy alfa párosodási faktort - tartalmazó expressziós vektor is alkalmazható az S-t és preS-t tartalmazó peptidek közvetlen expresszálására. Szakemberek számára továbbá az is nyilvánvaló, hogy a GAPDH-nál kevésbé hatásos konstitutív promoter - például a CYC1 - az S-t vagy preS-t tartalmazó polipep tidek expresszióját csak a sejt-proteinek kisebb %-áig segíti elő, ezáltal a túlzott expresszió negatív fiziológiai hatásai kiküszöbölhetők. Szakember számára nyilvánvaló, hogy egy megfelelő vizsgálati rendszert, például Western blotot vagy radioimmunológiai vizsgálatot kell alkalmazni az S-t és preS-t tartalmazó polipeptidek expressziójának vizsgálatára ebben a rendszerben, hogy a tenyészet összegyűjtésének időpontnak optimalizálával maximális hozamot érhessünk el.
A transzformált S. cerevisiae sejtek által termelt S és azzal rokon proteinek tisztítására kecske antitestekkel kötött immun-affinitási oszlopot alkalmaztunk, amely felismeri a szemcsés formájú HBsAg-t. Az eluált termék HBsAg-re pozitív volt radioimmunológiai vizsgálat szerint, és elektronmikroszkópos képe szerint szemcsés formában volt. Az ilyen szemcsés termék, amely mind HBsAg-t, mind preS-antigént, vagy csak HBsAg-t tartalmaz, HBV vakcinaként és diagnosztikai reagensként is használható.
A hepatitis B vírus felületi proteint vagy annak variánsát kódoló expressziós vektort tartalmazó élesztősejteket tenyésztettük, majd összegyűjtöttük. A sejteket kívánt esetben úgy tároltuk, hogy azokat pufferoldattal, például PBS-sel mostuk, majd a kapott sejt-pasztát rendszerint -70 °C-on fagyasztva tároltuk.
A HBsAg és a hasonló proteinek tisztítását tipikusan az alábbiak szerint végeztük. Egy adag friss vagy fagyasztott sejt-pasztát magas pH-tartományba eső, mintegy 8,5 és mintegy 11 közötti, előnyösen mintegy 10,5 pH-jú pufféróldatban, előnyösen TRlS-ben szuszpendáltunk (a puffer megfe lelő proteáz inhibitorokat is tartalmazhat). A sejteket ezután - előnyösen mechanikus eszközökkel - feltártuk. Ipari méretekben való alkalmazásra a kíméletes, üveggyöngyös feltárási módot nem találtuk megfelelőnek. Előnyösen nagynyomású homogenizátorral (mintegy 6,897·107-1,379-108 Pa nyomáson, Gaulin vagy Stansted homogenizátort alkalmazásával) végeztük a feltárást, mivel ezek gyorsan és hatékonyan dolgoznak.
Az élesztősejtek feltárásának eredményeként nyers extraktumot kaptunk. Ezután a nyers extraktum pH-ját beállítottuk. A pH-t 8,0 és 11,0 közötti értékre, előnyösen 10,5—re állítottuk be.
A nyers extraktumhoz ebben a stádiumban kívánt esetben detergenst adhatunk. A detergens hozzáadása előnyösen befolyásolja az élesztő sejtmembrán elválasztását a nemkívánatos sejttörmeléktől. Kimutatták, hogy a preS2+S protein, valamint a felületi proteinek egyéb formái a sejtmembránnal asszociálódhatnak. Sokféle semleges és nemionos detergens alkalmazható, többek között a TRITON-N, TRITON-X, BRIJ, TWEEN vagy EMASOL sorozatba tartozó detergensek, dezoxikolátok, oktil-glukopiranozid vagy NONIDET-Np-40. Ikerionos detergensek, például a CEAPS vagy CHAPSO is alkalmazhatók.
Abban az esetben, ha detergenst alkalmazunk, a detergens előnyösen TRITON-X-100 lehet, mintegy 0,5 % koncentrációban. Hangsúlyoznunk kell, hogy a találmány szerinti eljárásban nem szükséges detergenst alkalmazni ebben a lépésben, detergenst csak kívánt esetben alkalmazunk.
Az extraktumot ezután a lízis során hőkezelésnek • · ·« · · · • · · · · · vethetjük alá, ha proteázok nincsenek jelen. A hőkezelés meghatározott hőmérséklet-tartományban, meghatározott időn keresztül végezve hatásos. A hőkezelést általában 45 °C és 60 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 50 °C-on végezzük. A hőkezelés időtartama általában 20 perc és 40 perc között változhat, előnyösen 30 perc. Az extraktumot megfelelő edényben hőkezeljük, az edényt fűtött fürdőbe merítjük, vagy hőkicserélőt alkalmazunk. Az anyagot ezután mintegy 10 °C-ra hűtjük, előnyösen jeges vizes fürdőbe merítve, vagy hőkicserélőt alkalmazva. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti eljárás során a hőkezelés és a sejttörmelék eltávolítás műveleti sorrendje felcserélhető anélkül, hogy az eljárás eredményére jelentős hatással bírna. Alternatív módon a teljes élesztősejteket semleges pH-jú pufferben melegíthetjük, feltárjuk, és detergenst adunk hozzá.
A sejttörmelék eltávolítása a hőkezelt nyers extráktumból azért szükséges, hogy a további tisztítási lépések során elkerüljük a fizikai elzáródást. A törmeléket centrifugálással, mikroszűréssel, vagy szűréssel távolíthatjuk el, így tisztított extraktumot kapunk. Legelőnyösebb módszerek a centrifugálás és a mikroszűrés. A centrifugálást különböző centrifugális erőkkel és változó időtartamokon keresztül végezhetjük. Megfelelőnek találtuk a 4 °C-on 3000 g-vel 15 percen keresztül végzett centrifugálást. Előnyös lehet, ha az extraktumot a centrifugálás előtt hígítjuk, a nyers élesztősejt extraktum általában viszkózus jellegének csökkentésére. A hígítás nem okoz változást a soron következő tisztítási lépésekben.
• ·
- 29 A mikroszűrés előnye, hogy a szűrés és dialízis egyidejűleg végrehajtható. A fenti lépésben sokféle mikroszűrő típus alkalmazható, például a KROSFLO (Microgon Inc.), vagy az Amicon vagy A/G Technology által gyártott különféle üreges szálas szűrőbetétek. Előnyös mikroszűrési módszer az, amikor az extraktumot Prostak Durapore (Millipore) membránon vezetjük át, amely lemezes vagy keretes mikroszűrő egység, pórusmérete mintegy 0,1 mikron-0,2 mikron, a belépő nyomás mintegy 1,379·103-4,828·104 Pa, és mintegy 0,1 mol/1 TRIS-t (pH kb. 10,4) és mintegy 0,1 % TRITON Χ-100-at tartalmazó puffért alkalmazunk.
A centrifugálásból származó felülúszót vagy a mikroszűrésből származó szűrletet a következő lépés előtt koncentrálhatjuk. A koncentrálást sokféle módon végezhetjük, például dialízissel, szűréssel, liofilezéssel, ultraszűréssel vagy diaszűréssel. A koncentrálást előnyösen úgy végezzük, hogy a tisztított extraktumot egy 105 múltömeg kizárású, üreges szálú ultraszűrő rendszeren vezetjük keresztül. A tisztított extraktum térfogata a mikroszűrt termékre vonatkoztatva mintegy 6,5-szörösre, a hígított, centrifugált termékre vonatkoztatva mintegy 2-szeresre csökken, és koncentrált visszamaradó terméket eredményez. A koncentrálást követően a visszamaradó terméket diaszűrésnek vetjük alő, ezzel eltávolítjuk a kis móltömegű szennyeződéseket. A diaszűrésre 105 móltömeg kizárású, üreges szálú rendszert alkalmazunk.
TRITON X-100 hozzáadása esetén azt különféle ismert módszerekkel távolíthatjuk el, például dialízissel, bizonyos szerves oldószerek hozzáadásával, fagyasztással, kromatográ·· · · · · · · • · · 9 · • · « · · · · • 9 · · · ·
- 30 fiás elválasztással, és detergenseket specifikusan kötő géllel vagy gyantával, például Extractogel (Pierce) vagy XAD gyantával (Romicon) végzett kezeléssel. A TRITON X-100 eltávolítására a találmány szerinti előnyös megoldás értelmében a TRITON Χ-100-at tartalmazó, hőkezelt extraktumot XAD-2 vagy XAD-4 gyanta (polisztirol/divinil-benzol) szűrőbetéten cirkuláltatjuk keresztül. A hőkezelt extraktumot mintegy 10 órán keresztül, 4 °C-on cirkuláltatjuk a XAD szűrőbetéten keresztül, majd megfelelő edényben, például leforrasztható üveglombikban összegyűjtjük.
Abban az esetben, ha a sejteket magas pH értékű pufferben tárjuk fel, a hőkezelt extraktum vagy a proteáz inhibitorokat tartalmazó extraktum pH-ját ezután mintegy 7,0 és mintegy 7,9 közötti értékre, előnyösen mintegy pH 7,7 értékre állítjuk be. A magas pH értéken való hőkezelést követően a pH 7,7 beállítása a találmány szerinti eljárásban jelentősen elősegíti a burok-proteinek adszorpcióját egy következő lépésben alkalmazott, széles pórusú szilícium-dioxidon. A hőkezelt extraktum pH értékének beállítását a TRITON X-100 eltávolítása előtt elvégezhetjük anélkül, hogy ezzel az eljárás eredményét befolyásolnánk. Szakemberek számára ezért nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti eljárásban a pH beállítás és a TRITON X-100 eltávolítás sorrendje felcserélhető anélkül, hogy ezzel az eljárás eredményét lényegesen befolyásolnánk.
A HBsAg-t ezután a szennyeződésektől egyszerűen elválasztva lényegében tiszta HBsAg-t kapunk. A szennyeződések eltávolításának előnyös módja az, hogy a HBsAg-t széles pó- 31 rusú szilícium-dioxidon adszorbeáljuk. A találmány szerinti legelőnyösebb megoldás szerint a HBsAg-t mintegy 1000-1500 angstrüm pórusméretű, előnyösen mintegy 30-130 mikron részecskeméretű széles pórusú szilícium-dioxidon (Amicon) adszorbeáljuk. A felületi protein könnyen behatol a szilicium—dioxid pórusaiba, és ott megkötődik. így az élesztő celluláris protein szennyeződések mosással egyszerűen eltávolíthatok .
A felületi protein széles pórusú szilícium-dioxidon való adszorpcióját kromatográfiásan vagy nem-kromatográfiás, szakaszos módon hajthatjuk végre. A kromatográfiás adszorpció esetén a beállított pH-jú extraktumot oszlopkromatográfiás készülékben széles pórusú szilícium-dioxid ágyon vezetjük át. Általában 1 liter hőkezelt extraktumot viszünk fel egy mintegy 300 ml (kb. 100 g száraz tömegű) széles pórusú szilícium-dioxid gyöngyöt tartalmazó 5 cm-es, köpennyel ellátott oszlopra, mintegy 200 ml/óra átfolyási sebességgel.
A széles pórusú szilícium-dioxidon való nem-kromatográfiás, szakaszos adszorpció esetén a hőkezelt extraktumot megfelelő edényben, például lezárható üveglombikban összekeverjük a szilícium-dioxiddal. Előnyösen 300 ml széles pórusú szilícium-dioxidot adunk mintegy 1 1 hőkezelt extraktumhoz üveglombikban, és állandó keverés közben inkubáljuk. Az adszorpció előnyösen mintegy 1,5-4 órát vesz igénybe 8 °C—on, de más hőmérsékletek és eltérő idők is megfelelhetnek.
Az adszorbeált felületi proteint tartalmazó szilícium-dioxidot az adszorbeálatlan anyagtól mentesre moshatjuk nem-kromatográfiás módszerrel, vagy a szilícium-dioxidot egy
- 32 fent ismertetett kromatográfiás oszlopra tölthetjük a kromatográfiás mosás elvégzése céljából. A szakaszos mosást úgy végezzük, hogy a hőkezelt extraktumot leszívatjuk a széles pórusú szilícium-dioxidról, és néhány térfogatnyi puffért adunk hozzá, amelynek hatására a szilícium-dioxidon adszorbeált HBsAg nem válik szabaddá. Pufférként előnyösen PBS-t alkalmazunk. A szilícium-dioxidot leszívatjuk és a mosási lépést 3-5-ször megismételjük.
A szilícium-dioxidon adszorbeált felületi protein kromatográfiás mosását úgy végezzük, hogy a szilícium-dioxidon PBS-t folyatunk át mintegy 200 ml/óra átfolyási sebességet biztosítva, amíg a 280 nm-en mért extinkció állandó értéket ér el.
A HBsAg-t a mosott, széles pórusú szilícium-dioxidról mintegy 8,5-9,0 pH értékű pufferoldattal eluáljuk. A felületi proteineket előnyösen mintegy 0,05 mol/1 borát-puffert tartalmazó pufferoldattal deszorbeáljuk, amelynek pH értéke mintegy 8,7. A HBsAg deszorpciójának elősegítésére a hőmérsékletet tág határok között emelhetjük. A deszorpciót előnyösen 55 °C-on hajtjuk végre.
A nem-kromatográfiás deszorpciót úgy hajtjuk végre, hogy 1200 ml 0,05 mol/1 koncentrációjú borát-puffért (pH 8,7) mintegy 700 ml mosott, széles pórusú szilícium-dioxidon adszorbeált HBsAg-vel elegyítünk. A deszorpció mintegy 25 percet vesz igénybe. Az eluátumot ezután összegyűjtjük, és a deszorpciós lépést kétszer megismételjük, majd az eluátumot lehűtjük.
A kromatográfiás deszorpció elvégzésére a mosott * · 4 · • 4 · 4 « • · · · · · « » · · · «
- 33 szilícium-dioxidot tartalmazó, köpennyel ellátott oszlopot mintegy 55 °C-ra melegítjük. A 0,05 mol/1 koncentrációjú borát-puffért (pH 8,7) 55 °C-ra melegítjük, majd felvisszük az oszlopra, 500 ml/óra átfolyási sebességet biztosítva. Az eluátumot ezután összegyűjtjük és lehűtjük. Az eluátum térfogata általában közelítőleg azonos a széles pórusú szilícium-dioxidra felvitt hőkezelt eluátum térfogatával.
Az eluált HBsAg-t általában kívánatos koncentrálni. A koncentrálást előnyösen úgy végezzük, hogy az eluátumot egy 10^ móltömeg kizárású, üreges szálú diaszürő rendszeren vezetjük át, 0,05 mol/1 koncentrációjú borát-puffért (pH 8,7) alkalmazva. Az eluált felületi protein térfogata általában mintegy 16-szorosra csökken a fenti rendszer alkalmazásával. A diaszürőn visszatartott anyagot kívánt esetben mikroszűréssel sterilizálhatjuk.
A HBsAg szénhidrát-tartalmát Dubois M. és munkatársai módszerével határozzuk meg [Anal. Chem. 28, 350 (1956)]. A fenti eljárás elve, hogy az egyszerű cukrok, oligoszacharidok, poliszacharidok és származékaik, például a metil-észterek, amelyek szabad, vagy potenciálisan szabad redukáló csoportokat tartalmaznak, fenollal és kénsavval kezelve narancssárga színreakciót adnak. A keletkezett szín intenzitása konstans fenol-koncentráció esetén arányos a jelenlévő cukor mennyiségével.
A felületi proteint tartalmazó minta szénhidrát-tartalmának meghatározására 1 ml, 10-70 /xg proteint tartalmazó oldatot kémcsőbe helyezünk. Előállítjuk az ismert mennyiségű szénhidrátot tartalmazó sorozatot és a vakpróbákat. Mindé- 34 gyik kémcsőbe 1 ml 5 %-os fenololdatot mérünk, és a kémcsövek tartalmát összekeverjük, hozzáadunk 5 ml 96 %-os kénsavoldatot, és ismét összekeverjük. A kémcsöveket szobahőmérsékleten 10 percen keresztül inkubáljuk, összekeverjük, majd 25-30 °C-on 20 percen keresztül inkubáljuk. A minták abszorpcióját spektrofotométeren mérjük (A49Q a hexózok és metilezett hexózok, Α4θθ a pentózok, uronsav és metilezett származékaik esetén) és a HBsAg minták szénhidrát-tartalmát a szénhidrát standardakkal összehasonlítva meghatározzuk.
Mind a vad típusú rekombináns élesztősejtek (CF54) által termelt HBsAg-t, mind a CF52 rekombináns élesztősejtekben termelődött HBsAg-t analizáltuk szénhidrát-tartalomra a fent leírtak szerint. A kapott eredményekből kiszámítottuk minden egyes mintára a szénhidrát mennyiségének a protein mennyiségéhez viszonyított arányát oly módon, hogy a mintában lévő szénhidrát mennyiségét (pg) osztottuk a minta protein-tartalmával (pg) . A számított arány szerint az mnn9~ rekombináns élesztősejtekben termelődött HBsAg szénhidráttartalma következetesen 1/10-e volt a vad típusú rekombináns élesztősejtekben termelt HBsAg szénhidrát-tartalmának. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az mnn9 mutáns élesztősejtek által termelt HBsAg lényegesen kevesebb szénhidrátot tartalmaz, mint a vad típusú élesztősejtekben termelődött HBsAg.
A találmányt közelebbről - a korlátozás szándéka nélkül - az alábbi példákkal kívánjuk ismertetni.
• «44
1. példa
HBV DNS klónozása pBR322-ben
A HBV Dane-részecskéket (adw szerotípus) humán plazmából (hordozó) izoláltuk és tisztítottuk, és a kettős szálú DNS-t endogén polimerázzal szintetizáltuk a Dane-részecskékben Lander és munkatársai [J. Virology 23., 368-376 (1977)] és Hruska és munkatársai [J. Virology 21, (1977)] módszere szerint. A DNS-t proteináz K-val SDS-ben végzett emésztés után izoláltuk, majd fenol/kloroform eleggyel extraháltuk és etanollal kicsaptuk. A HBV genomiális DNS-t EcoRI-gyel emésztve egyetlen 3,2 kbp fragmenst kaptunk, amelyet a pBR322 EcoRI helyére klónozva kaptuk a pHBV/ADW-1 plazmidot. A HBV DNS jelenlétét EcoRI-gyei végzett emésztéssel, Southern blottal nitrocellulóz szűrőre való átvitellel és [32P]-jelzett specifikus oligonukleotid próbákkal végzett hibridizálással igazoltuk.
2. példa
A preS2+S gén klónozása a pGAP-tADH-2 expressziós vektorba
Az 1. példa szerint előállított pHBV/ADW-1 plazmidot EcoRI-gyel és Accl-gyel emésztettük, és a 0,8 kbp fragmenst preparatív agaróz gél-elektroforézissel tisztítottuk. A pUC plazmidot is emésztettük EcoRI-gyel és BamHI-gyel, és a lineáris vektort preparatív agaróz gél-elektroforézissel tisztítottuk .
A preS2+S 5' végének rekonstruálására egy oligonukleotid párt szintetizáltunk, amely az ORF-et az ATG előtti EcoRI helytől egy 10 bp hosszúságú NTL szekvencián és egy
Hindui helyen keresztül egy EcoRI végig rekonstruálja. A fenti oligonukleotidok szekvenciája az alábbi:
AATTCAAGTC TACAAAACAA AATGCAGTGG (2. számú szekvencia)
10 20 30
GTTCGAATGT TTTGTTTTAC GTCACCTTAA (3. számú szekvencia) 1 10 20 30
A preS2+S ORF 3' részének rekonstruálására másik oligonukleotid párt szintetizáltunk, amely az ORF-et az AccI helytől a transzlációs terminációs kodonon és egy HindlII helyen keresztül a BamHI végig rekonstruálja. A fenti oligonukleotidok szekvenciája a kővetkező:
ATACATTTAA GCTTG (4. számú szekvencia)
10 15
TGTAAATTTC GAACCTAG (5. számú szekvencia)
10 18
Az oligonukleotid párokat illesztettük, majd az EcoRI-BamHI emésztett pUC vektorral ligáltuk. A kapott vektort (2,8 kbp) preparatív agaróz gél-elektroforézissel tisztítottuk. A fentiek szerint előállított 0,8 kbp hosszúságú EcoRI-AccI fragmenst ezzel a vektorral ligáltuk. A PreS2+S ORF jelenlétét és orientációját restrikciós endonukleázos analízissel és Southern blottal igazoltuk. A DNS—szekvencia analízisével [Sanger és munkatársai (1977)] két bázis-szubsztitúciót mutattunk ki, amely a HBpreSGAP347/19T plazmid DNS által kódolt szekvenciától két aminosav eltérést eredményezett. Hogy mindkét konstrukcióra azonos polipeptidet kapjunk, a fenti szubsztitúciókat - vagyis 64-es helyzetű bázisként C helyett T (Leu helyett His-t kódol) és 352 —es helyzetű bázisként A helyett C (Gin helyett His-t kódol) - hely-irányított mutegenezissel megváltoztattuk [Zoller és Smith, Nucleic Acids Research 10, 6487-6500 (1982)].
A HBsAg kódoló régiót preS2 kódoló régió nélkül tartalmazó plazmidot az alábbiak szerint konstruáltuk meg. A fenti pUCHBpreS2+S plazmidot EcoRI és StyI restrikciós endonukleázokkal emésztettük. A pUC-t és a HBsAg kódoló régiót tartalmazó nagy DNS fragmenst (3,3 kbp) elválasztottuk a preS2-t kódoló DNS fragmenstől és preparatív agaróz gél—elektroforézissel tisztítottuk. A pUCHBsAg fragmenst ezután az alábbi szekvenciájú szintetikus oligonukleotid párral ligáltuk:
AATTCAAGCT TACAAAACAA AATGGAGAAC ATCACATCAG GATTC
10 20 30 40 45 (6. számú szekvencia)
GTTCGAATGT TTTGTTTTAC CTCTTGTAGT GTAGTCCTAA GGATC
10 20 30 40 45 (7. számú szekvencia)
Ez a szintetikus oligonukleotid pár 5' EcoRI és 3' StyI ragadós végeket tartalmaz és közvetlenül az 5' EcoRI hely után egy Hindin hellyel rendelkezik. Ezenkvül ez a szintetikus oligonukleotid pár tartalmazza a HBsAg ATG kodont, az előtte (5' irányban) lévő 10 bp hosszúságú nem-transzlatált leader-szekvenciát és az utána (3' irányban) lévő, az StyI helyet magában foglaló 21 nukleotidot.
Ez az oligonukleotid pár rekonstruálja a HBsAg teljes kódoló régióját, és lehetővé teszi, hogy azt ezután a pUC alapú vektorból HindiII-mai végzett emésztéssel érin- 38 tétlenül eltávolítsuk.
A fenti DNS oligonukleotid párral ligáit pUC-HBsAg DNS vektort alkalmaztuk E. coli transzformálására. Szelektáltuk azokat a rekombináns plazmidokat, amelyek a teljes rekonstruált HBsAg kódoló régióval rendelkeztek. A rekombináns plazmidból HindlII-mal végzett emésztéssel eltávolítottuk a teljes HBsAg nyílt leolvasási keretet (ORF), majd a 0,7 kbp hosszúságú HBsAg DNS-t preparatív agaróz gél-elektroforézissel izoláltuk és tisztítottuk, expressziós vektorba történő klónozás céljára.
3. példa
HBsAg ORF klónozása három különböző expressziós vektorba
A HBsAg expressziós kazetták konstruálására három különböző expressziós vektort alkalmaztunk. A korábban ismertetett GAP491 promoter expressziós kazetta [Knoskern és munkatársai, Gene 46, 135-141 (1986)] egy kb. 1,1 kbp glicerinaldehid-3- foszfát dehidrogenáz (GAPDH) promoterből és egy mintegy 350 bp élesztő alkohol-dehidrogenáz I (ADH1) terminátorból áll egy pBR322 vázban, egyetlen Hindin helylyel a promoter és a terminátor között. A 2. példa szerinti HBsAg ORF-et az egyetlen HindlII hellyel ligáltuk, és jelenlétét és orientációját restrikciós endonukleázos analízissel és Southern blottal igazoltuk.
Alternatív megoldásként az 1,1 kbp GAP promotert a fenti szerkezetben a 0,5 kbp GAL10 promoterrel [Schultz és munkatársai, Gene 54., 113-123 (1987)]; illetve az 1,25 kbp ADH2 promoterrel [Knoskern és munkatársai, Hepatology 8, 8239 (1988)] helyettesítettük.
A specifikus promotert, a HBsAg ORF-et és az ADH1 termnátort minden esetben tartalmazó expressziós kazettát a pCl/1 ingázó vektorba [Beggs, supra; Rosenberg és munkatársai, supra] klónozva kaptuk az élesztő expressziós vektort, amelyet az alább ismertetett módon alkalmaztunk S. cerevisiae transzformálására.
4. példa
5. cerevisiae CF52 (mnn9“) mutáns élesztő törzs előállítása
A S. cerevisiae KHY (cir+, adel+, leu2~ és mnn9) törzset az alábbiak szerint állítottuk elő. Az ot párosodási típusú CZ5/LB347-1C (mnn9“, SUCZ”) törzset az a típusú 21502-3 (leu2“, adel-) törzzsel pároztattuk úgy, hogy a törzseket YEHD komplett táptalajos lemezen összekevertük. A diploidok szelektálására a párosított törzseket egyetlen szénforrásként 2 % szacharózt tartalmazó leu minimál táptalajra oltottuk replika módszerrel. Az egyes telepek izolálása után a diploidokat spóráztattuk, és a tömlőket standard módszerrel szétvágtuk. A KHY-107 törzset egyetlen spóra formájában izoláltuk és mint cir+, adel+, leu2 és mnn9 törzset jellemeztük (Schiff festési módszerrel).
A KHY-107 (cir 0) törzset a KHY-107 (cir+) törzsből származtattuk a Broach által leírtak szerint [Methods in Enzymology 101, Part C, 307-325 (1983)] . A kapott törzset egy elroncsolt ura3 gén beépítésével ura3~-vá tettük. A kapott KHY-107ura3A törzset komplett tápközegben tenyésztettük, hogy elősegítsük a spontán mutációkat, és szelek táltunk egy kanavanin-rezisztens mutánst. A mutáns CF55 törzs a komplementációs vizsgálatok szerint canl volt. A CF55 HIS3 génjébe beépítettük a GAL10pGAL4 expressziós kazettát [Methods in Enzymology 185, 297-309 (1990)], így kaptuk a kívánt CF52 gazdatörzset (Mata leu2-2,112 ura3A canl his3&: :GAL10pGAL4-URA3 , cir°).
5. példa
Élesztő transzformálása és oltóanyag előállítása
HBsAg expresszálására CF52 mnn9~ mutáns élesztőben
A 3. példa szerinti pCl/lpGALlOHBsAg-tADH-1 plazmidot alkalmaztuk a S. cerevisiae CF52 törzs transzformálására. A kiónokat 1 mol/1 szorbitot tartalmazó, leu minimál táptalajon szelektáltuk, 17 %-os glicerinben fagyasztott tenyészetként tartottuk fenn, és az alábbiak szerint vizsgáltuk .
6. példa
A GÁL10 promoter mögötti HBsAg gén expressziója CF52 (mnn9“) élesztő törzsben
Az 5. példa szerinti, expressziós plazmidot tartalmazó élesztő kiónokat 1 mol/1 szorbitot tartalmazó leu szelektív agar lemezre szélesztettük, és 30 °C-on 2-3 napon keresztül inkubáltuk. A kapott élesztőt 5-7 ml komplett, 1 mol/1 szorbitot tartalmazó YEHD tápközegbe inokuláltuk, és a tenyészeteket 30 °C-on, levegőztetés közben 12-18 órán keresztül inkubáltuk. 50 ml komplett YEHD tápközeget + 2 % galaktózt tartalmazó lombikokat a fenti tenyészettel inokuláltunk (a kezdeti zavarosság Αθθθ = 0,1), és 30 °C-on, rázatás közben (350 fordulat/perc) 72 órán keresztül Αςθθ =
- 41 10-16 zavarosság eléréséig folytattuk a tenyésztést. Az Αθθθ = 10 egység zavarosságú mintákat kémcsövekbe szétosztottuk, és az élesztősejteket 2000 g-vel 10 percen keresztül centrifugálva ülepítettük. Az üledéket vagy azonnal vizsgáltuk, vagy -70 °C-on fagyasztva tároltuk. A vizsgálat elvégzésekor az üledéket 0,4 ml, 2 mmol/1 PMSF-t tartalmazó, foszfáttal pufférőit sóoldatban újra szuszpendáltuk. Az élesztősejteket (1) 200-300 mg mosott üveggyöngy (0,45 mm) hozzáadásával, (2) Vortex keverőben 15 perces keveréssel, (3) 0,5 térfogat% TRITON X-100 hozzáadásával, (4) Vortex keverőben 2 percen keresztüli keveréssel, és (5) 4 °C-on 10-15 percen keresztüli inkubálással feltártuk. A sejttörmeléket és az üveggyöngyöket 13000 g-vel 10 percen keresztül centrifugálva eltávolítottuk, és a felülúszót proteintartalomra [Lowry és munkatársai, J. Bioi. Chem. 193, 265 (1951)] és HBsAg-re AUSRIAR vizsgálattal (Abbott) analizáltuk. Az alábbi eredményeket kaptuk.
I. táblázat
| Minta | AUSRIA, Mg/mg proteir | P24 | |
| ι Feltárás | Immunbiot | ||
| rázott lombik | |||
| mnn9_ mutáns | (0,55, 0,61, 0,53) | üveggyöngy | +++ |
| vad típusú | (1,8) | üveggyöngy | + |
| (MNN9+) |
• · · ·
7. példa
HBsAg termelő S. cerevisiae (mnní)·) tenyésztése üzemi méretben, férméntorban
A fagyasztott rekombináns élesztő tenyészetet 1 mol/1 szorbitot tartalmazó leu lemezekre oltottuk. A lemezeket megfordítva 28 °C-on 2-3 napon keresztül inkubáltuk. A lemezeken lévő tenyészetet YEHDS-ben újra szuszpendáltuk, és a szuszpendált tenyészetet 500 ml YEHDS-t és 2 % galaktózt tartalmazó 2 1-es Erlenmeyer-lombikba vittük. A lombikot 28 °C-on, 350 fordulat/perc sebességgel működő rázógépen 18-22 órán keresztül inkubáltuk. A kapott oltó tenyészeteket alkalmaztuk az előállítási szakaszban használt fermentorok inokulálására.
Egy vagy több lombikból 1-5 térfogat% inokulumot vittünk 10, illetve 200 1 YEHDS-t tartalmazó 16, illetve 250 1-es fermentorokba. A 16 1-es fermentort 500 fordulat/perc sebességgel, 5 1/perc levegőztetéssel és 28 ’C-on üzemeltettük. A 250 1-es fermentort 160 fordulat/perc sebességgel, 60 1/perc levegőztetéssel és 28 °C-on üzemeltettük. Az oltó tenyészettel való inokulálás után 40-46 óra elteltével a fermentorokból összegyűjtöttük a tenyészetet. Általában AggQ = = 15,0 egység zavarosságú tenyészeteket kaptunk. Az összegyűjtést úgy végeztük, hogy a sejteket üreges szálú szűrőberendezéssel koncentráltuk, majd puffrolt sóoldatokkal mostuk. A sűrű sejtszuszpenziókat az alábbiak szerint vizsgáltuk, vagy -70 °C-on fagyasztva tároltuk a további feldolgozás és analízis elvégzéséig.
A 20 % mosott sejtet tartalmazó szuszpenziókból · · ♦·
- 43 vett kis mintákat (0,6 ml) 0,45-0,52 mm átmérőjű üveggyöngyök alkalmazásával tártuk fel 1,5 ml-es Eppendorf-csövekben. Proteáz inhibitorként 200 mmol/1 koncentrációjú PMSF törzsoldatból 6,5 μΐ-t adtunk hozzá. A sejtek feltárása után a csövekből alikvot mintákat vettünk, és immunbiot analízishez -70 °C-on fagyasztottuk. A csövekben maradt mintához TRITON Χ-100-at adtunk 0,5 % végtérfogatban, a mintákat rövid ideig kevertük, majd 4 °C-on 20-40 percen keresztül inkubáltuk. A sejttörmeléket centrifugálással eltávolítottuk, és a tisztított sejt extraktumot antigénre (AusriaR) és proteinre (Lowry) vizsgáltuk.
8. példa
S protein tisztítása szemcsés formában immunaffinitási kromatográfiás eljárással
Az 5. példa szerint konstruált rekombináns S. cerevisiae-t lombikban vagy fermentorban tenyésztettük. Az élesztősejteket Amicon DC-10 egységen végzett mikroszűréssel összegyűjtöttük, 30 ml A-pufferben (0,1 mol/1 Na2HPO4, pH 7,2, 0,5 mol/1 NaCl) szuszpendáltuk és Stansted nyomószűrőn 5,172·105-5,862 · 105 Pa nyomás alkalmazása mellett hétszer átvezetve feltártuk. A feltárt sejtszuszpenziőt (31 g nedves sejttömeg) 120 ml A-pufferrel hígítottuk, 0,5 vegyes% végkoncentrációban Triton Χ-100-at adtunk hozzá, és a szuszpenziót 4 °C-on 10000 g-vel 20 percen keresztül centrifugálva derítettük. A derített tenyészlevet dekantáltuk, és HBsAg—vei szembeni antitestekkel kapcsolt Sepharose 4B-vel [McAleer és munkatársai, Natúré 307, 1778 (1984)] 4 °C-on 19 órán keresztül inkubáltuk, hogy az antigént a gyantán ad• 4 4 4 44 « · »9,· « 4 4 « t *9 * · β · 44 szorbeáljuk. Az inkubációs periódus után a szuszpenziót szobahőmérsékletre melegítettük az összes tovább lépés elvégzése céljából, és vákuumban 15 percen keresztül gázmentesítettük. A gázmentesített szuszpenziót 2,5 x 40 cm-es oszlopra öntöttük. Az oszlop teljes megtöltése után a nem kötött proteint A-pufferrel kimostuk. Az antigént 3 mol/1 koncentrációjú KSCN-t tartalmazó A-pufferrel eluáltuk. Az antigént tartalmazó frakciókat 0,007 mol/1 Na2HPC>4 (pH 7,2), 0,15 mol/1 NaCl pufferrel szemben 4 °C-on dializáltuk, és egyesítettük, 20 ml dializált affinitási eluátumot kaptunk, amely 1,08 mg proteint tartalmazott. A dializált affinitási eluátum 16 ml--ét 40 gg/ml koncentrációra hígítottuk 5,6 ml 0,006 mol/1 Na2HP04 (PH 7/2)/ 0,15 mol/1 NaCl pufferrel. A terméket Millex-GV 0,22 μ membránon szűrve sterilizáltuk. A dializált affinitási eluátumban a terméket a HBsAg detektálásával azonosítottuk, AusriaR reaktivitása alapján.
II. táblázat
| Minta | Ausria, ^g/ml protein | Feltárás |
| Fermentált | ||
| mnn9- | (1,13, 1,10, 1,06) | üveggyöngy |
| mnn9- | (3,1, 4,4) | Manton-Gaulin |
| vad típusú | (3,3) | Manton-Gaulin |
·· · · * Λ · ♦ · • ·4<« * « « • · · · · ·
9. példa
Rekombináns HBsAg tisztítása üzemi méretben
Mintegy 250 g (rekombináns S proteint termelő) fagyasztott sejt-pasztát 17 % nedves tömeg/térfogatban (kb. 1500 ml) újra szuszpendáltuk foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS). A sejteket vízfürdőbe merítve 45 °C-ra melegítettük. A sejteket 15 percen keresztül 45 °C-on tartottuk, majd jeges fürdőn mintegy 10 °C-ra hútöttük. A sejteket ezután Gaulin homogenizátoron kétszeri átvezetéssel feltártuk.
A homogenizálást követően 0,3 % végkoncentrációban 10 %-os Triton Χ-100-at adtunk hozzá, és a szuszpenziót mintegy 15 percen keresztül kevertük. A sejt extraktumot ezután 4 °C-on 3600 g-vel 20 percen keresztül centrifugáltuk, és a felülúszót összegyűjtöttük.
A felülúszót 200 g XAD-2 gyantával töltött oszlopon vezettük át a Triton X-100 eltávolítása végett. Az effluenst ezután közvetlenül mintegy 150 g széles pórusú szilícium-dioxidot (pórusméret mintegy 1500 angström, részecskeméret mintegy 50 gm) tartalmazó oszlopon vezettük át. Az alkalmazott oszlopok átmérője 5 cm (Pharmacia), és az átfolyási sebesség mintegy 200 ml/óra volt.
A szilícium-dioxidos oszlopot PBS-sel mostuk, amíg az A2qq az alapértéket elérte.
A szilícium-dioxidos oszlopról az S protein eluálására először hideg borát-puffért (50 mmol/1, pH 8,7, 4 °C) és mintegy 500 ml/óra átfolyási sebességet alkalmaztunk, amíg az Α2θθ értékben emelkedést észleltünk. Amikor az Α2θθ érték emelkedni kezdett, az oszlopot 55 °C-ra melegítettük, és az oszlopon 55 °C-os borát-puffért vezettünk keresztül, mintegy 500 ml/óra sebességgel. Az S proteint tartalmazó eluátumot (mintegy 1 liter) jégen gyűjtöttük össze. Az eluátumot ezután mintegy 200 ml-re koncentráltuk 50 mmol/1 borát-pufferrel (pH 8,7) szemben végzett diaszűréssel, 105 molekulatömeg kizárású üreges szálú diszűrő egységet alkalmazva. Az S proteint ezután egy 0,2 μιη pórusméretű szűrőn szűrtük, és tároltuk. A terméket stabilnak találtuk, Western blottal nem észleltünk jelentős mértékű bomlást.
10. példa
Rekombináns HBV felületi proteinek szénhidrát-tartalmának meghatározása
A rekombináns HBV felületi proteinek szénhidrát—tartalmát Dubois M. és munkatársai [Anal. Chem. 28, 350 (1956)] módszere szerint határoztuk meg. A módszer elve, hogy az egyszerű cukrok, oligoszacharidok, poliszacharidok és származékaik, például a metil-észterek, amelyek szabad, vagy potenciálisan szabad redukáló csoportokat tartalmaznak, fenollal és kénsavval kezelve narancssárga színreakciót adnak. A keletkezett szín intenzitása konstans fenol-koncentráció esetén arányos a jelenlévő cukor mennyiségével.
A vad típusú élesztő törzsben és az mnn9“ élesztő törzsben termelődött HBsAg szénhidrát-tartalmának meghatározására 1 ml, 10-70 μg proteint tartalmazó oldatot kémcsőbe helyeztünk. Előállítottuk az ismert mennyiségű szénhidrátot tartalmazó sorozatot és a vakpróbákat. Mindegyik kémcsőbe 1 ml 5 %-os fenololdatot mértünk, és a kémcsövek tartalmát összekevertük, hozzáadtunk 5 ml 96 %-os kénsavoldatot, és
- 47 ismét összekevertük. A kémcsöveket szobahőmérsékleten 10 percen keresztül inkubáltuk, összekevertük, majd 25-30 °C-on 20 percen keresztül inkubáltuk. A minták abszorpcióját spektrofotométerrel olvastuk le (A49Q a hexózok és metilezett hexózok, A4gQ a pentózok, uronsav és metilezett származékaik esetén) és a HBsAg minták szénhidrát-tartalmát a szénhidrát standardakkal összehasonlítva meghatároztuk.
A kapott eredményekből kiszámítottuk minden egyes mintára a szénhidrát mennyiségének a protein mennyiségéhez viszonyított arányát oly módon, hogy a mintában lévő szénhidrát mennyiségét (pg) osztottuk a minta protein-tartalmával ^g) , az eredményeket az alábbiakban közöljük.
III. táblázat: Szénhidrát/protein arány HBsAg-ben
| Élesztő törzs | Szénhidrát/protein arány |
| mnn9_ | 0,05 |
| glükozilezésre | 0,56 |
| vad típusú (MNN9+) |
A fenti arány szerint az mnn9 rekombináns élesztősejtekben termelődött HBsAg szénhidrát-tartalma következetesen 1/10-e volt a vad típusú rekombináns élesztősejtekben termelt HBsAg szénhidrát-tartalmának. Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy az mnn9 mutáns élesztősejtek által termelt HBsAg lényegesen kevesebb szénhidrátot tartalmaz, mint a vad típusú élesztősejtekben termelődött HBsAg.
Az azonosítási számokkal definiált szekvenciákat az alábbiakban ismertetjük.
1. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 10 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: DNS (genomiális) (xi) Szekvencia leírása:
ACAAAACAAA 10
2. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 30 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: DNS (genomiális) (xi) Szekvencia leírása:
AATTCAAGTC TACAAAACAA AATGCAGTGG 30
3. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 30 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris • · «
- 49 (ii) Molekula típusa: DNS (genomiális) (xi) Szekvencia leírása:
GTTCGAATGT TTTGTTTTAC GTCACCTTAA 30
4. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 15 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: DNS (genomiális) (xi) Szekvencia leírása:
ATACATTTAA GCTTG 15
5. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 18 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: DNS (genomiális) (xi) Szekvencia leírása:
TGTAAATTTC GAACCTAG 18
6. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 45 bázispár (B) típus: nukleinsav • « «* • · ·
| (C) szál típusa: egyes | |||
| (D) topológia: | lineáris | ||
| (ii) | Molekula típusa: | DNS (genomiális) | |
| (xi) | Szekvencia leírása: | ||
| AATTCAAGCT TACAAAACAA AATGGAGAAC ATCACATCAG GATTC | 45 |
. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 45 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: DNS (genomiális) (xi) Szekvencia leírása:
GTTCGAATGT TTTGTTTTAC CTCTTGTAGT GTAGTCCTAA GGATC 45
8. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 29 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: DNS (genomiális) (xi) Szekvencia leírása:
AATTGTCGAC AGCTAGCTGA ATTCCCGGG « * · f · * • · • · · ·
9. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 29 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: DNS (genomiális) (xi) Szekvencia leírása:
AGCTCCCGGG AATTCAGCTA GCTGTCGAC
Claims (16)
1. Eukariota expressziós rendszer rekombináns polipeptid és proteinek termelésére, amelyek a gazdasejt szénhidrátjából vagy glükoproteinjéből csökkent mennyiséget tartalmaznak.
2. Az 1. igénypont szerinti expressziós rendszer, azzal jellemezve, hogy az eukariota gazda élesztő.
3. A 2. igénypont szerinti expressziós rendszer, azzal jellemezve, hogy az élesztő gazdasejt Saccharomyces cerevisiae.
4. Az 1. igénypont szerinti expressziós rendszer, azzal jellemezve, hogy a rekombináns polipeptid vagy protein egy hepatitis B vírus polipeptid vagy protein.
5. A 4. igénypont szerinti expressziós rendszer, azzal jellemezve, hogy a hepatits B vírus polipeptid vagy protein egy burok-polipeptid vagy -protein.
6. Az 5. igénypont szerinti expressziós rendszer, azzal jellemezve, hogy a hepatitis B vírus polipeptid vagy protein a HBsAg.
7. Hepatitis B vírus felületi protein, amely lényegesen csökkent mennyiségű szénhidrátot vagy glükoproteint magukba záró részecskéket képez.
8. A 7. igénypont szerinti hepatitis B vírus felületi protein, azzal jellemezve, hogy protein glükozilezésre genetikusán deficiens rekombináns élesztősejtekben termelő dött .
• ·* ·
9. A 8. igénypont szerinti hepatitis B vírus felületi protein, azzal jellemezve, hogy az élesztősejtből genetikusán az mnn9 gén hiányzik.
10. A 7. igénypont szerinti hepatitis B vírus felületi protein, azzal jellemezve, hogy a szénhidrát/protein arány a tisztított felületi proteinben kisebb, mint 0,5.
11. Hepatitis B vírus elleni vakcina humán alkalmazásra, amely egy hepatitis B vírus felületi proteint tartalmaz, amely lényegesen csökkent mennyiségű szénhidrátot vagy glükoproteint magukba záró részecskéket képez.
12. A 11. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy protein glükozilezésre genetikusán deficiens rekombináns élesztősejtekben termelődött.
13. A 12. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemez- ve, hogy az élesztősejtből genetikusán az mnn9 gén hiányzik.
14. A 11. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy a felületi proteinben a szénhidrát/protein arány kisebb, mint 0,5.
15. Immunológiai diagnosztikai reagens, amely egy lényegesen csökkent mennyiségű gazdasejt szénhidrátot vagy glükoproteint magukba záró részecskéket képező, és a természetben előforduló anti-élesztő antitestekkel szemben csökkent reaktivitást mutató hepatitis B vírus proteint tartalmaz .
16. A 15. igénypont szerinti immunológiai diagnosztikai reagens, azzal jellemezve, hogy a tisztított felületi proteinben a szénhidrát/protein arány kisebb, mint 0,5.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US69292491A | 1991-04-29 | 1991-04-29 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9303064D0 HU9303064D0 (en) | 1994-03-28 |
| HUT69149A true HUT69149A (en) | 1995-08-28 |
Family
ID=24782605
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9303064A HUT69149A (en) | 1991-04-29 | 1992-04-27 | Hbv surface proteins with reduced host carbohydrate |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5614384A (hu) |
| EP (1) | EP0516286B1 (hu) |
| JP (1) | JP2637877B2 (hu) |
| KR (1) | KR920019373A (hu) |
| CN (1) | CN1067680A (hu) |
| AT (1) | ATE215987T1 (hu) |
| AU (1) | AU650530B2 (hu) |
| BG (1) | BG61700B1 (hu) |
| CA (1) | CA2067290A1 (hu) |
| CZ (1) | CZ282769B6 (hu) |
| DE (1) | DE69232541D1 (hu) |
| FI (1) | FI934650A7 (hu) |
| HU (1) | HUT69149A (hu) |
| IE (1) | IE921385A1 (hu) |
| IL (1) | IL101651A0 (hu) |
| LT (1) | LT3367B (hu) |
| MX (1) | MX9201970A (hu) |
| NO (1) | NO933897L (hu) |
| NZ (1) | NZ242487A (hu) |
| PL (1) | PL171485B1 (hu) |
| SG (1) | SG55152A1 (hu) |
| SK (1) | SK118193A3 (hu) |
| WO (1) | WO1992019741A1 (hu) |
| YU (1) | YU45492A (hu) |
| ZA (1) | ZA923069B (hu) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0533263A3 (en) * | 1991-09-20 | 1994-06-08 | Merck & Co Inc | A multivalent hepatitis b virus vaccine |
| WO1995031558A1 (en) * | 1994-05-16 | 1995-11-23 | Merck & Co., Inc. | Process for producing hbv surface proteins |
| US6300065B1 (en) * | 1996-05-31 | 2001-10-09 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Yeast cell surface display of proteins and uses thereof |
| US6696251B1 (en) | 1996-05-31 | 2004-02-24 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Yeast cell surface display of proteins and uses thereof |
| AU2212100A (en) * | 1998-12-23 | 2000-07-12 | Merck & Co., Inc. | Improved recombinant hepatitis b surface antigen |
| KR100604994B1 (ko) | 2004-01-30 | 2006-07-26 | 한국생명공학연구원 | 알파1,6-만노실트랜스퍼라제를 코딩하는 한세눌라폴리모르파 기원의 신규 유전자 및 상기 유전자가 결손된한세눌라 폴리모르파 변이주를 이용한 재조합 당단백질생산 방법 |
| CN111187720A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-05-22 | 深圳康泰生物制品股份有限公司 | 表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母的细胞破碎方法及其在制备手足口病疫苗中的应用 |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4803164A (en) * | 1981-08-31 | 1989-02-07 | Genentech, Inc. | Preparation of hepatitis b surface antigen in yeast |
| US4707542A (en) * | 1983-08-22 | 1987-11-17 | Merck & Co., Inc. | Immunogenic HbsAg derived from transformed yeast |
| US4816564A (en) * | 1986-01-31 | 1989-03-28 | Merck & Co., Inc. | Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast |
| GB8613388D0 (en) * | 1986-06-03 | 1986-07-09 | Delta Biotechnology Ltd | Induction of galactose regulated gene expression in yeast |
| DE3719213C1 (de) * | 1987-06-09 | 1988-05-19 | Daimler Benz Ag | Bodennahe mehrpolige Stromversorgung fuer spurfuehrbare,gummibereifte,elektrisch antreibbare Fahrzeuge |
| US4963483A (en) * | 1987-10-13 | 1990-10-16 | Merck & Co., Inc. | Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast |
| US5135854A (en) * | 1987-10-29 | 1992-08-04 | Zymogenetics, Inc. | Methods of regulating protein glycosylation |
| ATE100142T1 (de) * | 1987-10-29 | 1994-01-15 | Zymogenetics Inc | Verfahren zur regulierung der proteinglycosylierung. |
| GB8726953D0 (en) * | 1987-11-18 | 1987-12-23 | Delta Biotechnology Ltd | Yeast expression system |
| NZ229260A (en) * | 1988-06-03 | 1994-02-25 | Merck & Co Inc | Hepatitis b virus, expression cassette for pre-s domain, host cells and |
| EP0414374B1 (en) * | 1989-07-25 | 1997-10-08 | Smithkline Biologicals S.A. | Novel antigens and methods for their preparation |
| CA2022109A1 (en) * | 1989-07-31 | 1991-02-01 | Cheryl A. Schulman | Enhanced expression of heterologous proteins in recombinant hosts in a non-growth media |
| CA2022108A1 (en) * | 1989-07-31 | 1991-02-01 | Cheryl A. Schulman | Enhanced growth and expression of heterologous proteins in recombinant hosts containing mutations in cell wall and/or plasma membrane biosynthesis |
| DE69013471T2 (de) * | 1989-12-05 | 1995-03-30 | Merck & Co Inc | Methode zur Stabilisierung von rekombinanten Hepatitis-B-Virus-Oberflächenproteinen aus Hefe. |
| IL101653A0 (en) * | 1991-04-29 | 1992-12-30 | Merck & Co Inc | Multiple hepatitis b virus surface proteins which form particles |
-
1992
- 1992-04-20 IL IL101651A patent/IL101651A0/xx unknown
- 1992-04-24 NZ NZ24248792A patent/NZ242487A/en unknown
- 1992-04-27 CZ CS932271A patent/CZ282769B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-04-27 SK SK1181-93A patent/SK118193A3/sk unknown
- 1992-04-27 WO PCT/US1992/003472 patent/WO1992019741A1/en not_active Ceased
- 1992-04-27 CA CA002067290A patent/CA2067290A1/en not_active Abandoned
- 1992-04-27 PL PL92301163A patent/PL171485B1/pl unknown
- 1992-04-27 HU HU9303064A patent/HUT69149A/hu unknown
- 1992-04-28 MX MX9201970A patent/MX9201970A/es unknown
- 1992-04-28 ZA ZA923069A patent/ZA923069B/xx unknown
- 1992-04-28 KR KR1019920007142A patent/KR920019373A/ko not_active Ceased
- 1992-04-28 AU AU15222/92A patent/AU650530B2/en not_active Ceased
- 1992-04-28 YU YU45492A patent/YU45492A/sh unknown
- 1992-04-28 CN CN92104290A patent/CN1067680A/zh active Pending
- 1992-04-29 SG SG1996008131A patent/SG55152A1/en unknown
- 1992-04-29 AT AT92303883T patent/ATE215987T1/de active
- 1992-04-29 EP EP92303883A patent/EP0516286B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-29 DE DE69232541T patent/DE69232541D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-30 JP JP4155566A patent/JP2637877B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-07-01 IE IE138592A patent/IE921385A1/en not_active Application Discontinuation
-
1993
- 1993-03-30 LT LTIP462A patent/LT3367B/lt not_active IP Right Cessation
- 1993-10-21 FI FI934650A patent/FI934650A7/fi unknown
- 1993-10-28 NO NO933897A patent/NO933897L/no not_active Application Discontinuation
- 1993-10-29 BG BG98187A patent/BG61700B1/bg unknown
-
1995
- 1995-01-04 US US08/368,287 patent/US5614384A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MX9201970A (es) | 1992-11-01 |
| CA2067290A1 (en) | 1992-10-30 |
| CZ227193A3 (en) | 1994-04-13 |
| SG55152A1 (en) | 1998-12-21 |
| SK118193A3 (en) | 1994-03-09 |
| WO1992019741A1 (en) | 1992-11-12 |
| NO933897D0 (no) | 1993-10-28 |
| IE921385A1 (en) | 1992-11-04 |
| CZ282769B6 (cs) | 1997-10-15 |
| ZA923069B (en) | 1992-12-30 |
| CN1067680A (zh) | 1993-01-06 |
| EP0516286A1 (en) | 1992-12-02 |
| HU9303064D0 (en) | 1994-03-28 |
| LT3367B (en) | 1995-08-25 |
| BG61700B1 (bg) | 1998-03-31 |
| PL171485B1 (pl) | 1997-05-30 |
| FI934650A0 (fi) | 1993-10-21 |
| NZ242487A (en) | 1994-07-26 |
| JP2637877B2 (ja) | 1997-08-06 |
| BG98187A (bg) | 1994-06-30 |
| FI934650A7 (fi) | 1993-10-21 |
| AU1522292A (en) | 1993-03-11 |
| LTIP462A (en) | 1994-10-25 |
| DE69232541D1 (de) | 2002-05-16 |
| YU45492A (sh) | 1994-06-10 |
| KR920019373A (ko) | 1992-11-19 |
| JPH06141872A (ja) | 1994-05-24 |
| NO933897L (no) | 1993-10-28 |
| AU650530B2 (en) | 1994-06-23 |
| EP0516286B1 (en) | 2002-04-10 |
| US5614384A (en) | 1997-03-25 |
| ATE215987T1 (de) | 2002-04-15 |
| IL101651A0 (en) | 1992-12-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4816564A (en) | Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast | |
| EP0511855A1 (en) | HBsAg escape mutant vaccine | |
| US4963483A (en) | Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast | |
| EP0511854A1 (en) | Multiple hepatitis B virus surface proteins which form particles | |
| HUT69149A (en) | Hbv surface proteins with reduced host carbohydrate | |
| EP0344864A2 (en) | Method for producing nonhyperglycosylated hepatitis B virus protein | |
| JPH0734753B2 (ja) | 組換え宿主細胞から得られる組換えｂ型肝炎ウイルス表面タンパク質の安定化方法 | |
| EP0533263A2 (en) | A multivalent hepatitis B virus vaccine | |
| WO1994001132A1 (en) | VACCINE COMPRISING MIXED preS1+preS2+S AND CORE PARTICLE | |
| WO1995031558A1 (en) | Process for producing hbv surface proteins | |
| LV10493B (en) | Hepatitis b virus surface proteins with reduced host carbohydrate content |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFC4 | Cancellation of temporary protection due to refusal |