BG98187A - Нвv повърхностни протеини с редуциран гостоприемников карбохидрат - Google Patents
Нвv повърхностни протеини с редуциран гостоприемников карбохидрат Download PDFInfo
- Publication number
- BG98187A BG98187A BG98187A BG9818793A BG98187A BG 98187 A BG98187 A BG 98187A BG 98187 A BG98187 A BG 98187A BG 9818793 A BG9818793 A BG 9818793A BG 98187 A BG98187 A BG 98187A
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- protein
- hepatitis
- yeast
- viral
- carbohydrate
- Prior art date
Links
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 title claims abstract description 39
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 32
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 title abstract description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 50
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 27
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 19
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 45
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 42
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 40
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 38
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 35
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 16
- 102400000368 Surface protein Human genes 0.000 claims description 9
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims description 8
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000000656 anti-yeast Effects 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 claims description 3
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims 3
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 claims 1
- SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N hepatitis b vaccine Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1N=CN=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N 0.000 claims 1
- 229940124736 hepatitis-B vaccine Drugs 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 claims 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 abstract description 58
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 19
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 abstract description 4
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 abstract description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 abstract description 3
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 abstract description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 abstract 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 56
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 28
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 19
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 10
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 10
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 9
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 9
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 8
- 229910021426 porous silicon Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 5
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 5
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 3
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- -1 heptoxy isobutylbenzoate Chemical compound 0.000 description 3
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 101150002557 Adnp gene Proteins 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 240000005209 Canarium indicum Species 0.000 description 2
- 235000004322 Canarium indicum Nutrition 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 241001533413 Deltavirus Species 0.000 description 2
- GYHNNYVSQQEPJS-UHFFFAOYSA-N Gallium Chemical compound [Ga] GYHNNYVSQQEPJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 101100001057 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) adn2 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000994 depressogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- HEGSGKPQLMEBJL-RQICVUQASA-N (2r,3s,4s,5r)-2-(hydroxymethyl)-6-octoxyoxane-3,4,5-triol Chemical compound CCCCCCCCOC1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RQICVUQASA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150090724 3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150106774 9 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150096273 ADE2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100022385 Activity-dependent neuroprotector homeobox protein Human genes 0.000 description 1
- 240000004246 Agave americana Species 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100054862 Caenorhabditis elegans adm-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100491335 Caenorhabditis elegans mat-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000288673 Chiroptera Species 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 1
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N D-alpha-tocopherylacetate Chemical compound CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N 0.000 description 1
- MNQZXJOMYWMBOU-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde Chemical compound OC[C@@H](O)C=O MNQZXJOMYWMBOU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000020897 Formins Human genes 0.000 description 1
- 108091022623 Formins Proteins 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000048120 Galactokinases Human genes 0.000 description 1
- 108700023157 Galactokinases Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102100024023 Histone PARylation factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024594 Histone-lysine N-methyltransferase PRDM16 Human genes 0.000 description 1
- 101000755474 Homo sapiens Activity-dependent neuroprotector homeobox protein Proteins 0.000 description 1
- 101000686942 Homo sapiens Histone-lysine N-methyltransferase PRDM16 Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 1
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000009569 Phosphoglucomutase Human genes 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- 101100194625 Rattus norvegicus Rgs19 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 208000008765 Sciatica Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000877 Sex Attractant Substances 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010082433 UDP-glucose-hexose-1-phosphate uridylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000256856 Vespidae Species 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 101150087698 alpha gene Proteins 0.000 description 1
- HXXFSFRBOHSIMQ-FPRJBGLDSA-N alpha-D-galactose 1-phosphate Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O HXXFSFRBOHSIMQ-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000002781 deodorant agent Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002085 enols Chemical class 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 244000144992 flock Species 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 108010090279 galactose permease Proteins 0.000 description 1
- 101150073818 gap gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 238000005858 glycosidation reaction Methods 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000001279 glycosylating effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 239000013541 low molecular weight contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010005335 mannoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000006151 minimal media Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 108091000115 phosphomannomutase Proteins 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000005067 remediation Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000979 retarding effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 235000021309 simple sugar Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000018553 tannin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001864 tannin Polymers 0.000 description 1
- 239000001648 tannin Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N triflic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C(F)(F)F ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/29—Hepatitis virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
Abstract
За продуциране на хепатит в вирусни (нвv) повърхностни протеини във формата на частици със съществено редуцирано карбохидратно съдържимо, днк, кодираща нвv повърхностни протеини, се експресира в рекомбинантен дрождев гостоприемник, който е несъвършен в способността си да гликозилира протеини. Тези нвv повърхностни протеини показват антигенни сайтове, генетично кодирани от областта на отворена четяща рамка на нвv вирионната обвивка, и съдържат съществено редуцирано ниво на включения карбохидрат в сравнение с нвsаg частици, продуцирани от "дивиятип" дрождеви клетки. Тези частици са приложими като ваксини както за пасивно, така и за активно третиране или за предотвратяване на заболяване и/илиинфекция, причинена от нвv или други агенти, серологично свързани с нвv.
Description
Хепатит В вируса/HBV/ θ инфекциозен агент, отговорен за различни видове заболявания на черния дроб у човекаАого индивиди, които са инжектирани от HBV, страдат като преминават през остра фаза на заболяването, което е последвано от възстановяване. Обаче, известен процент от инфектираните не успяват да се освободят напълно от инфекцията,порада което се превръщат в хронични носители на тази инФекция. HBV е ендемична за много ттасти на света. с широк обхват на случаите на пеоинатаино поенасяне на инфекцията от майки,хронични носителки на инфекцията към новорелените, които често остават хронично инфектирани.Изследвани са над тепета милиона от носителите по света,ката -стотици хиляда от тях умират всяка година поради продължителните заболявания,следствие от хроничния хепатит / цироза и/или хепатонелуларен карцином /.
_ ρ _ ·· · · · ·· ······ ···· ···· ··· ··· · · · · ·· • ···· ·· · · ···· • · ······ η Π ...... “ΐ, ·· ”** вирусът на хепатит ΰ делта е агент,които по време на съвместна с HBV инфекция,е отговорен за остър взрив на заболяването с предимно фатален край.Делта вирнеа не кодира /от своя собствен генетичен материал/ протеини, които да служат като обвивка за вириона^нещо повече,вирусът капсулира с повърхностните протеини, кодирани от коинфектирашият HBV /причиняваш инжекция успоредно с делта вируса /,поради което споделящ тесни структурни и имунологич ни взаимовръзки с HBV протеините,които са описани по-долу.^е е известно дали други агенти на инфекцията споделят аналогични взаимовръзки с НВУ.Обаче е ясно,че протеини с широка експанзия на серологична реактивност или повишена имунологична потенциалност могат да бъдат приложими в систем и за диагностика или предотвратяване /или лечение/ на заболявания /или инфекции/ от клас от агенти с доли слаба или частична антигенна кръстосана реактивност с HEV.
НВ вирионът е съставен от две групи структуони ттоотеини, същински протеини и повърхностни ппотеини, В допълнение в качест вото си на голяма повърхност на протеините.повърхностните ттоотеини също са голяма съставна част на Австралийския антиген, или 22нм частици Дези повърхностни протеини са транслационни продукти от дългата отворена четяща рамка на вириона /OPF/ .кодираща най-малко 389 амино киселини /аа/Дази ОДР е разделена на три области.всяка от които започва с ATG кодонрпособен да Функционира като тоанслационен инициаторен сайт ин вивоЛези области се отнасят като pre^l /108 аа/, рге^2 /55 аа/ и ^/226 аа/ в техният съответен 5 -3 ред в гена. 1ака тези области определят три полипептида,отнасящи се като или ΗΒζΑ^ /226 aa/,preS2 + £/?81 аа/ и pre 81 рге$2 + й /389 аа/ .също отнасящи се като р24 /jp27 .рЗО/^рЗЗ/^рЗб и р39/^р 42 съответно /също като големият, среден и го.лям протеини/.
·· · « · ·· ······ ···· · · · · ·· · • ·· · · · · · · • ···· ·· ·· ··· · • · ··· ··· _.-»··· * · ····· ·· ··
Повърхностните протеини на HBV Са гликопротеини с карбохидратни странични вериги /гликани/,присъединени Т7рез tl-гликозидни линкери към дефинирани сайтове, разпознаваеми от пептида /1/Д'аке
HBV полипептидите,продуциранк по време на инфекцията включват видовете р24Лр?7 / полипептид? и неговите гликозилирани производни/ cjp33/cjp36 / pre 62 +-5 по липепти да. гликозилиран в pre S2 областта само и същия полипептид. гликозилиран в така както и pre S? областт та /, и p39/(jp42 / pre S1 +рге$2 + S пептид и неговите производни, гликозилирани в pre S1 об^ласттаЛ
Напоследък чодхо.шглг поллчечи от п^аз^ата ваксини се съставят
от протеини, съдържащи фактически само S областта /включваща р?4 мономер и неговите гликозилирани производни ^р27 /.докато получените от дрожди ваксини,развити успешно към днешна дата,са съставени изключително от полипептида /включващ изключително негликозилирани р24 видове Λ
Частичките с големина 22пм от НВ5А^ f С0 пречистени от плазма! та на постоянните носители. Бидейки частично позитивни в условията ь на тяхната плазма, тези постоянни носители се отнасят като 4¾4%
Адо инфектираните индивиди са показали задоволителен изгонен отговор, те могат да отстранят инфекцията и да станат НВ5 4В условията на тяхното формиране на антителата към НВ^ .тези индивиди са отбелязани като анти НВ5 +„По този начин, анти НВ^ θ свързан с възстановя ване от заболяване и с имунитет спрямо повторна инфекция с HBV, Поради това, стимулирането или Нормирането на анти НВ5црез НВ ваксини се очаква да осигури защита против HBV инфекция.
Тази хипотеза е била тестувана експериментално.^свен човека, шимпанзето е един от малкото видове,който е напълно податлив на
HBV инфекцията, което се отразява с количествено определими маркери като НВ -ни повишени нива на чернодробните ензимиДимпанзетате са • · • · • · · ·
ваксинират с три дози от •Й3$^’т*^титти и*след това се се провокират интревенозно с инфекциозен HBV, Докато раздразнените с ваксината животни показват белези на остра HBV инФекчия, НВ<А^ -ваксинираните животни са запазени напълно от инфекция, поради това,в тази експериментална система, HBsA^ ттаетиките.съставени от р.24 /или р24 и р27/ се достатъчни за индуциране на протективен имунитет«Подтикнати от тези небдадения,няколко производителя са произвели НБ ваксини, съставени от НВ$Ап против.
За да се увеличи снаб,диването с подходящи ваксини,производителите са се обърнали към рекомбинантната ДНК технология.която да посредничи при получаване на повърхностни протеини.Сред микроби алните системи, най-широко използвани са Е,с01ί и S.cene^iSise с оглед експресия на получените по чекомбинантен път протеини Лого опити за експресия на имунополично активни НВ$Д) частици в Е.соЬ са били неуспешни,Обаче, ^,cere/isi«e. показва изключителна много странност в способността си да експресира имунологично активни частици Д'ези частици /съставени изключително от р?б /.когато
ране на шимпанзетата от провокациите ча живи HBV от различни серотипове.Нещо повече,получените от дролтди честипи се също имунология но активни и като ефективни при предпазване от заболяване или инфекция при клинични изпитания на хора като получени от плазма /з/. Поради това,полезността на S.cerei/ιί ic<e като гостоприемников вид за насочена синтеза на рекомбинантни твърдо установена.
В допълнение,експресията на терапевтични агенти за хора и ваксини в дрожди може да бъде много полезна за получаненето не продукта, доколкото дрождите са свободни от^ЦЧЖини.непа то гении са за хората могат да бъдат култивирани в индустриален машаб и няма необходимост от многото действия, които съпътстват използването на култивирани клетки от бозайници/много от които са трансформирани с вирус.веро-
ятно туморогенни за • · • · ·· · · · ·· ·
мишки и всички от тях съдържат протоонкогеш £ .cere/хлебните дрожди / са еукариоти,които са епос ни да синтезират гликопротеини.Протеиновата гликозилация в дрождите е била обект на множество обзорни статии напоследък f Зф!.
i#*·
Тази гликозилация или допълването на пликаните да към подходяш ι цептор на аминокиселините /а а/ в полипептидната верига става ка1 то при специфични серинови / Ser/ или треонинови /Т^г/ остатъци /0 -свързани / или при спеиитшч ен аспарагинов / Мп/ остатък / TS свързан /.Специфичността на О-свързания допълнителен елемент πρι Ser или Т&г остатъци не е добре разбрано и е установено емпирично на базата на сравнението.
Сигналната последователност за М_свъгзаната гликозилат.тия
е добре дефинирана като както аминокиселинната последователност Αςπ -X-Tfir , така и като А$п -X-Ser /където X е която и да е амино киселина/. В допълнение към много синтезирани автоложни, нативни, гликозилирани протеини или маннопептипи /. дрожчите съп са способни да гликозилапират хетероложни или чужди протеини.ет пресирани чрез рекомбинентна технология /ако хетероложния протет съ,държа подходящасигнална последователност за гликозилиране аа която и да е -^-свързана или О-свързана гликозилация /.
Пре $2 полипептидите,които са получени по време на природно инфектиране съдържат не повече от ? “същински“ /са. 3 кг. лодалтона /кД/ по размер / BL-свързани гликани, един в област и втори - при Арп при аминокиселинният остатък от pre !?2 областт Сайта на разпознаване в областта не е гликозилиран нито в ^есс в!йах НВ®ИИЕИг инуо в рекомбинантните preSs +S синтезирани в дрожди.Сбаче, сайта при амино киселинен остатък 4 от рге^Р облас та се разпознава при и гликозилира от дрожди.
Областта pre S1 съдържа
Ь^е^ързан^рл^козилепнонен сайт πρι
аминокиселинен остатък 4 от рге^.1 областта и потенциален сайт при аа остатък 26' за серотип adv/. ЯСно е за специалиста от областта, че доводите, изложени по-рано за pre £2 глико зила пия също ще следват различни последователности в preS2 областта,както и за онези в pre 91 и? областите.
Дрождите, синтезиращи рекочбинантни preS2 + S прибавят същински гликан,който е аналогичен на онзи, лобавян къч природния полипептид по врече на вирусната инжекция.Обаче,ако лрождевата клетка- гостоприечник е див тип /т, е. съдържа пълния ко1тпле· мент от ензими, необходими за ггоипопната гликозилапия. какъвто е случая за фактически всички широко използвани доождеви щамове Λ значителен брой от тези плика ни са удължени с голям брой от допълнителни манозни остатъци по начин, идентичен на този.използван от дрождите при създаване на тяхните собствени манопротеини.Това тлт4ПТ)П ТТРТ4 допълнение от г лика на, когато това се слугува на генен продукт като pre£2 + S полипептид, се отнася както хипергликозилация,- Очевидно е за специалиста в областта, че аргументите,важащи за дрождите,могат да се приложат и за други гостоприемникови клет ки / напр. инсекти,гъби и др, /.които могат да бъдат обект за разделяне на гликозилационните образци,
Нещо повече,демонстрирано е,че реко^бинентните форми от 22 пм частици на HBV повърхностни протеини, експресирвни в дивия тип дрождеви клетки-госто приемник, поисъецинявет съществени количества от карбохидратите на дрождевите клетки /получавайки най-малко част от структурните маночротеини от дрождевата клетка-гостопоием ник / в рамките на 22пм частичка, Т03и карбохидрат може да предиз вика потенциални проблеми в с'тисъл, че карбохидрата може да причини продуциране на антитела срещу дрождевия карбохидрат в глико• · · · w - зилираните протеини, и ваксинапниЯТ’ й*д/но?6н’съдържаш включеният дрождев карбохи.црвт ще пеагирар с анти-дрождеви антитела.ттрекотавени у ловенето видове бозайници и пооади това потенциално намаляващ ефективността като имуноген и ваксина.
Хиперглико зидащият е и хвашането на пълни манопротеини и манопептиди може да бъде елиминирано или гликозиданията ограничена в HBV рге^и$ полипептиди и техните кореспондиращи настини, посредством който и да е от следните подходи.
Най-напред, N-свързана хипергликозилация може да бъде предотвратена или ограничена по поеме на растежа на оекомбинантния гостоприеиник в присъствие на екзогенен агент в култиваттионната среда /напр. туникамицинЛВторо, полипептиди с рекомбинантен или природен произход може да 'ъде дегликозилиран както химично / напр с безводна трифлуорметан-сулФонова киселина или безводен Флуоротака и водород~7уижГпо ензимен път. Врето,разпознаваемия сайт за глико зила ция може да бъде променен или делетиран чрез мутагенезис на ниво ДНК, така ие да бъде предотвратена същинската гликозилация и поради това и хипергликозиданията. Nb-ива мо.диФиттиоани pre ξ+3 ОК? , в които разпознаваемите последователности за гликозилация са изменени /насочени хем от подходящи промотори,активни в дрождите/, са трансформирани в дрождеви клетки-гостоприемници.Получените в резултат pre Sполипептиди не са гликозилирани.Четвърто, клетките-гостоприемници могат да бъдат идентифицирани по това пали са носители на критичното ниво ензиг®.необходими за гликозилация, което илюстрира настоящето изобретение без каквото и да е ограничение на товаДакъв един щам дрожди е идентифициран /мпп9мутант /5/ по отсъствие на критичното ниво на ензимите в гликозилационния обмен, необходим за елонгиране /хипергликозилиране / на
,, ·· · ·· ······ ···· · · · ♦ · · · ··· ······ • ···· ·· ·· ··· ·
Ж- свързани гликани? хюптчни изо»<едве*ния^иб«азват,че този wtbht изгражда манопротеини без манозни остатъци, външни за веригата и съдържа само същински кагбохидрат /б ,7/. ORP за или pre^ + S полипептида /транскрибция,н8сочена от подходящи ттоомотори.активни в дрождите / е използван за транспониране на такива маттп2. мутантни ,дрожди. Слученият в резултат pre £+5полипептид съдържа само същинска глико^илашия и не съдържа хипергликозилати.
b'igKap полипептидите да ке са нито гликозилирани,нито хипергликозилирани,когато се експресират в дрождите,съставените от тях частички съдържат значително ниво от хванатия карбохидрат, получен от дрождев манопептидЛЬради това ексчгесията на полипеп тидите както pre съдържащи полипептиди в црождеви клетки.които не могат да се хипергликозилират, резултират в повишено ниво на карбохидрата в едепресираните Р?пм частички,
Srcere/iS'^ показва значителна много странност в своята способност да експресира имунологично активни тт есТипки Дези частички,когато са включени във ваксинална (Форма, доказват способ ност напълно да предпазват шимпанзетата срещу ттповокация с живи НВУ.Лещо повече,получените от дрожди с& имунологично ефективни в клинични изпитания на хора както полудените от плазма
Его защо, приложимостта на S«cerev>Vo£ като видове гостоприемници занасочена синтеза на ^еком^инантнен твърдо
В различни рекомбинантни микробнални експпесионни системи синтезата на много различни полипептиди е покачено. че е унищожителна за клетката-гостоприемния Като последствие от това.налице е селективно подтискане срещу ексггоесията на такива полипептиди така че само клетки, които акумулират в голям 'ттяб са онези.коит са преустановили експресията на тту?кдия полипептид или експресират толкова малко от яи-дия полипептид.че културата става чеикономич• · чен източник на този полипептид, Е някои случаи унищожителния ей® ефект е толкова силен,че когато експресията се води от строго конститутивен промотор,новотрансфоруганите клетки не могат ца се па размножават и формират колонии върху селективните среди.Тези унищожителни ефекти могат ца бъдат преодоляни с използването на индуктивен промотор за насочване синтезата на такива полипептиди. Много индуктивни гени съществуват в S.cerel/ίЧетири добре охарактеризирани индуктивни генетични системи са галактозоЙЩ* използващите гени ,алкохол дехидрогеназния 9 /АДНр/ ген,генът на алфа, кръстосване и
cereviS/oQ притежава 5 гена,които кодират ензими,отговор ни за използване на галактозата като карбоно източник на растеж. GALi ,Q®, QAJg ,QAIp и GALio гените респективно кодират галактокиназа, галактозо пермеаза, големият изозим на фосфоглюкомутаза, а-Д-галактоза-1-фосфат уридилтрансфераза и уоидин дийосФо-галактозо-4-епимераза.Д отсъствие на галактоза е открита много малка степен на експресия на. тези ензими.Ако клетките са расли на глюкоза и след това .мх галактоза се добавя къч културата.тези три ензима се индуцират координирано, от най- малко 1000-нратно / с изключение на θ·А1б,който се индуиира около 5-кратно / на нивото на РНК транскрибцията, GAEi, GAI?, G-Al5,GAI? и GAP)ο гените са клонирани молекулярно и car съгласувани .-Регулаторните и промоторни последователности при 5 -сайтовете от кодираните респективно области се поставят ст>седно на кодиращите области от ^acZ гена.Тези експерименти са дефинирали онези промотори и регулаторни последователности, които са необходими и достатъчни за галактозната индукция.
cereVi^cit притежава съшо 3 гена,всеки от които кодира един изоензим на алкохол дехидрогеназата I АДН /, Един от тези
- 10 ., ., . .. ·· ···· ···· ·· · » · · · • · · ··· · · · • ···· ·· ·· ··· · • · ··· ··· • ·· ·.··· ·· ·· ензими е отговорен за способността на Ь, cerei/i$iap- да използва етанол като карболов източник по booms на окислителния поохтос при растека. Това е езимът ДДЩ. Експресията на АДН2 гена,които кодира АДНП изозим,се подтиска катаболитно от гкоза,така че фактически няма транскрибиия на .АДН 2 гена по воеие на култивирането в присъствие на гликоза в количество 0,1;ό /^/.При изчерпване наглюкозния източник и в присъствие на каобонови източници,които не подтискат развитието на микроорганизма,тоанскрибнията на АДЕ2 гена се инцуцира 100 до 1000 коатно.Този ген е бил молекулярно клониран и съгласуван, като онези псомоторни и регулаторни последователности,които санеобход иг-ти и достатъчни за отстраняване репресията на теанскрибцията.
са завършени.
Факторът на кръстосването атба е полов феромон на . cerel/iVae който е необходим за кръстосване мехцу МАТ и МАТа клетките.Този тридекапептид се експресира като поепроферомон,конто е насочен към ендоплазматичния ретикулум,гликозилиран и протеолитично/образуван/ насочен към неговата финалназряла форма,която сесекретиоа от клиите. Този биохимичен път на обмяната е използван като експресионна стратегия за външни полипептиди. Факторът на алфа кръстосването е клониран молекулярно и неговият промотор с пре-про-лидерна последователност е използвана да експресира и секретира различни полипептиди. Като че pfco-5 ценният промотор е показано че е индуцируеи при ниски концентрации на фосфата и това също има приложимост1 при физиологично регулирана експресия на чудците протеини в дродеи.
Както това се очаква от тяхното пресичане в ендоплазмаичния ретикулум и апарата на Годели,чудехте протеини могат да претърпят и Фф- и 0-свързани глггкозилаиионни събития.
·· ··· ·
-ромоторът за срактора на
КОНГО са ψΘΗ0ΤΗίΗ4η0 cL.
«··· · · · · · · · ··· ··· ··· • ···· · · · · ··· · ’<ръигоина:-1н«е>Л(Ш е -активен -само в клеягИ*/ шьхЦс са 4 генетични лок^са в ^.сегеиЬ·0^ известни като SIP.които синтезпоат протеини,необходими за репресия на на други нормално слаби копия на а и <£ инспормацгхЯ,
Чувствителните на температура / ^9 / увреждания,които пречат на това сьоит^е на репресия,сън^ств^ватв гзнния продукт поне а едно място. В този мутант,развитието при 35° отменя репресията,резултираща в клетки,денотипично a/ct ,в които поомотора на фактора за кръстосване алфа е неактивен, при тешепатура,повишена до 23 С , клетките фенотипично ревертират до ,така че този промотор става активен.Използването на щамове с tsувреждания е демонстрирано s за контролирана експресия на няколко различни чужди пептиди.
Обект на настоящето изобретение е да осигури HBV повърхностен протеини,който формира частипи със съществено редуцирано карбохидратно съдържимо.Друг обект на настоящето изобрететенне е да осигури метод за получаване на деождев гостоприемник,чиито HBV повърхностни протеини формират частички и които съдържа съществено редуцирано карбохидратно съдъркимо.Здин допълни^лен^бект на настоящето изобретение е да осигури ваксина срещу HBV,включваща HBV повърхностни протеинови частици със съществено еедуипрано карбохпдратно съдържимо както за пасивна,така и за активна профилактика или лечение на заболяването и/или инфекции,причинени от HBV или други инфекции,причинени от HBV или други агенти,сепологично свързани /сродни / на НБУ. Друг обект на настоящето изобретение е да обезпечи условия за ж.моон обхват от пекомбинантни гостоприемникови клетки и за пречистване на НБУ повърхностни ппотеини.Тези и други обекти на настоящето изобретение са/шиз биха станали очевщгпи от
ОБЩО ЗА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
HBV. повърхностните протеини се експресирани в рекомбинантен дрождев гостоприемник,който е генетически дефицитен по своята способност да гликозилира протеините,Експресията на HBV повърхностните протеини в дрождевите клетки резултира във формиране на характерни частици«Формирането на тези частици в дрождевите клетки резултира в улавяне ншхихраиа на клетъчните субстанции вътре в частиците, Използвайки див тип црождеви гостоприемници.съществена част от клетъчните карбохицрати могат да бъдат уловени в рамките на НВ\,А^ частиците, С оглед тдиклиттност на продукцията на HBV ваксина, състояща се от частиц и.съцьржатпи съществени количества карбохидрат, НБУ повърхностните ггоотеиниса по лучени и пречистени от рекомбинанти дрождеви гостоприемници, които са генетично дефи? цитни по отношение на тяхната способност да гликозилират протеини? HBV повърхностните протеини,продуцирани от такъв гостоприемник, формира частици, които съдържат значително по-малко карбохицрати от частиците, продуцирани от дивият тип лреждеви клетки,Тези повърхностни протеини са приложими като ваксини за лечение и/или предотвратяване на HBV свързани инжекции,и като антиген за имунологична .диагностика с редуцирана реактивност с природно срещани анти-дрождеви антитела.
КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ЧЕРТИТЕ
ФИГУРА 1, показва схематично плазмида p^l/ipGALiоНВ^А^-тАДГ.^ който с©двржа pGALio промотор, водещ транс кри бцията на НВдА^ О^Г ·· ·· • · · · • · · последвано от фАДЖ • ··· · · · · · ··· тер,тин8тор и ееяе^тивем» маркер’ *
ЙИ.2+
ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Настоящето изобретение е насочено към метод за получаване чс
HBV повърхностни протеинови частици,чието съдържание на включените карбохидрати е съществено редуцирано, за използване като ваксиГ ни срещу HBV,
Частици серотип ad ία/ са използвани като източник на HBV нуклеинова киселина за изолиране на вирусни ORP,Очевидно е за специалиста в областта,че това изобретение се разпростира до използване на нуклеинови киселини от HBV щамове или е свързано с други серологични активности, които произтичат от генетичните раз личия.Ендогенната полимеразна реакция се използва за гтоолучиране на ковалентно затворена циклична ,двойно верижна ДНК от HBV геномг формираща природно съществуващата в НВ вириона.ДНК θ изолирана., разградена до съставките си с ^οοψ и клочирана в ад! сайта , ι У-Ъдбират се, на рВН322,като по този начин продуцирайки pHBV/ АД ^-п^екомбина.нтните плазмиди, съдържащи HBV генома в циклични размествания,Ферш сайта от Pre So бластта.Пълният ОДД1,кодиращ 55 аминокиселини от пре$2 областта и 226 амино киселини от $ област1 най-напред се конструира рррез пречистване на 0.8 кило бази Фпагме /кЬр/, получен следвайки разграждане с рНВУ/АДУ7-.ф е EqqRI и Апп Този фрагмент кодира пре£2 +S подапептида,който не притежава еди ствено иницииращия кодон, амино-крайни 3 ам^ино киселини ,карбон ки-крайни 3 амино кис елини и транслиращият тецминаторен кодон.
Олигонуклеотидите се синтезират и свързват към този Фрагмент, конвертирайки го до Жnd ΠΙ фрагмент, съ,държащ 10 вр пое- 1.4 ·· ·· · ·· ·»···· ···· ···· ·· · ··· · · · · · · нетранслирана 5 Фланкираща последоватеятост/чодттенаг^^Ао^тги и пълната preζ2+£ θΚ? е избрвна така.и е теоминираптият кодон да бъде директно присъединен към природния Hi пс|П1 сайт в AW транскрибтивния терминатор, като по този наиин съзпава пълното природно, получено от дрождите съединяване без каквито и да са допълнителни бази,Очевидно е за специалиста в областта.че за експресия на HBV повърхностни и сродни гпзотеини. може да бъде използван всеки подходящ активен в дрожди трансрибтивен терминатор.който да бъде заместен хякарж® в AW ..
5* фланкиращата последователност за конструиране на АСААААСААА /6ВД±ДМС :1 / е избрана да кореспондира на тази за не-транслирана^ лидерна последователност / HTL / от дрождевия ген ОАР^з /GAP / /8/ и е също решение за GAP генното семейство. Конструирането е проведено по същия начин, така пе ла бъде присъединен AJTL· да-пектно към иницииращия кодон на рге^РЛБ ОЦР без интервенция на която и да е допълнителна база Аради това, очевидно е за специалиста в областта, че за експресия на KBV повърхностни протеини.подбора на МЗТК последователности се простира до други последователности,което става на подходящи експресионни нива.
ДНК секвенционният анализ изявява 2 замествания на базите, което резултира в амино киселинни различия от preS2 +£ после,цователк ностг, кодирана от ДНК на рНВрГе GAP347/19T /9/, 3ε Д0 Се установят идентичните полипептиди за двете конструкции,тези нуклеотидни замествания, които са '1 вместо С при база 64 от 846вр ORF На HBV pre 2+ /кодиращ Р^е вм^есто Феи / и G вместо А их при база 352 /кодиращ Ндс, вместо G-fn / са променени през сайт-насоиена мутагенеза /10/.Кодираните амино киселинни последователности за оптимизи15 -
раната конструкция след това се плове’^ява*,Омевйдно е’за’специалиста в областта,че това изобретение не ограничава обхвата си до тази последователност и се простира до която и да е поелелователност, където ДНК кодира полипептид с HBV- свързана антигенност,
Големият ДНК фрагмент от 3,3 квр, който съдържа pLLCip и НВ$А^ кодиращата област, се разделят от preS? кодиращият ДНК фрагмент след препаративна агарозна гел електрофореза.Синтетичен ДНК олигонуклеотид след това се лигатира с р-ВТСдд -HBsAg Фрагмента. 1'ози синтетичен ДНК олигонуклеотид съдържа 5’ Дсо^В и 3* $ту1 лепливи краища, така че да обезпечи Hi nd III сайт следваш веднага след 5 сайта. В допълнение, синтетичният ДНК олигонуклеотид съдържа HBsAo ATG-кодон плюс деветте следващи нуклеотида и 91 ггоед9 ’ ходни нуклеотида,включително StvJ сайта.
1ози олигонуклеотид изгражда отново пълният кодираш легион от и позволява неговотопоследващо отстраняване в цялост, от рПС19 базовия вектор чрез разграждане с Hi пНШ.
pllCig - фрагмента с лигатирания синтетичен ДНК олигонуклеотид, описан по-горе,се използва за трансформация на Ε<Οο(ί.
Подбрани са рекомбинантни плазчилц. които постигат пълната рекон кодираща област. Пълната НВ отворена четяща рамка /ОКР/ Се отстранява от рекомбинантния плазмид чрез разграждане с Н1д£Ш , последвано от пречистване и изолиране на 0,7 квр ΗΒςΑ^ ДНК чрез препаративна агарозна гел електрофореза за илониеане в САП· 10 промоторен експресионен вектор,
Експресионният блок / pGAIio - ^АДЕИ / води експресията за външни гени, инсертирани в уникалния HindIII сайт надолу от галактозо-индуктивния &АДю промотор, НВ^ О^Р / с Щп0Ш край/ описан по-горе, се лигатира в Hindlll сайта на вектора,Тази екс ггоесио нна касета се инсертира между рС1/1 /Ведо5 , по-горе/ и по-горе/ и този вектор се въвежда в щам на y>.cere//>'q£ •· ·· · ·· ······ • · · · ···· · · · ··· ··· ·· · • ···· ·· · · ··· ·
G£52 или СЛз4 и трансформираните ’клонове ’б 0 ’ Под бира Ф’,
Следвайки мутагенезиса фрагментът поливаш както така pre + описани по-горе, се използва за конструиране на експресноне блок, както е описано по-рано / 11/ , който е съставен от а/
1,1 квр от CAP 491 промотор , в/ 10 вр полудена от .дрожди Фланкираща последователност , с/ 1230 вр от вирусната за preSl + pre ^1+Вили 846 двойки бази от вирусния ОЬ?Р за pre Аз +5 или 681 вр от вирусния за 6, и d/ 0,4 квр от црожцевия ΔΜ1 тео^натор.
WA..·
За конструиране на НВ^ ексттоесионния блок са използвани различни експресионни вектора,GAP блок ,опи-
сан по-рано /11/ е съставен от около 1.1 квр от гличералцехид-Зфосфат дехидрогеназан/ САРДН / промотор и около 350 вр от дрождевия алкохол дехидрогеназен ι /да / терминнтор в рВР322 като основа, с уникален Н1по|Ш- сайт между пвомотора и терминатора, HBsAq OPP от Пример 2 се лигатира в уникалния Н1поШ· сайт и неговото присъствие и ориентация,еопределено чрез рестрикпионен ендонуклеазен анализ и Соутерн блот.
Обратно, GM10 пвомотора /12/ се замества за 1,1 квр GAP промотора в горната конструкция, или АДНр /1,?5^вр/ промотора /13 / се замества за GAP промотор /вж, ^г^ра 1 /,
Във всеки случай, експвесионният блок, съдържащ спепиФимни промотор,HBgAj О^Р и АДН тер,тинатор. се клонир? в совалковия вектор pGl/1 /Ве^ S по-горе/ М за създаване на двожцев експвесионен вектор, който след това се използва за трансформация на «сеге както е описано по-долу,Тези трансФорманти са установени казо за мразен резерв за оценка и последващо експериментиране.
Парентален щам се получава както следва · щам с тип кръстосване C/5 / -bB347*i^·/ мпп , SLICZ / се смесва с щам 2150-Р-З а-тип /{еи?. , sde{ / ирез с'1_осв8не на щамовете върху пълна среда на </ВД, Зд подбор на диплоиди.смесените ^алтове повторно се посяват
GT52 или ···· ___ __ -и трансформираните клонове се подбират
Следвайки мутагенезиса«Фрагментът кодипаш лакто така pre + описани по-горе, се използва за констоуипане на експресионе: блок, както е описано по-рано / 11./ , който е съставен от а/
1,1 квр от GAP 491 промотор , в/ 10 вр полмттена от .дрожди Фланкираща последователност , с/ 1230 вр от вирусната за рге$1 + pre 11+^или 846 двойки бази от вирусния за pre 12+5 или 681 вр < от вирусния за 6, и 6/ 0,4 квр от цооклевия АДЙ1 тепана тор.
За конструиране на ексггоесионния блок са използвани различни експреснонни вектора. GAP' 491р1?8Ж^$§§еиящ блок дописан по-рано /11/ е съставен от около 1.1 квр от глипералдехид-3фосфат дехидрогеназен/ ФАРДН / промотор и около 250 вр от дрождевия алкохол дехидрогеназен Р /.АДЕН/ терминнгор в рЗР$22 като основа, с уникален HlndJIP сайт между промотора и терминатора. HBsAo OPP от Пример 2 се лигатира в уникалния ЖпоШ· сайт и неговото присъствие и ориентация,еопределено чрез рестрикпионен ендонуклеазен
анализ и Соутерн блот.
Обратно, GAL1Q ппомотора /12/ се замества за 1,1 квр ЗАР промотора в горната конструкция, или АДЕЕр /1,?5т(вр/ промотора /'13 /' се замества за GAP промотор /вж, ^г^ра 1 /.
Ььв всеки случай, експпесионният блок, съдържаш спепиФични промотор,HBsAj ОДР и АДН тер^шнатор. се тотонира в совалковия вектор pGl/1 /Bg^c, по-горе/ ±4: за създаване на дпождев ексгтоесионен вектор, който след това се използва за трансформация на .cere както е описано по-долу.Тези трансФорманти са установени казо замразен резерв за оценка и последвало експериментиранег
Парентален щам СЛЗ? се получава както следва · щам с тип кръстосване С/δ / W347-i^/ мпто. SlICZ / се смесва с щам ^150-Р-З а-тип /fen2 , adei ί чрез смесване на щамовете върху пълна сведа на 38 подбор на диплоиди.смесените чамове повтовно се посяват върху 1еи снимачна среда, съ.дьп-аща 2м захароса като единствен карбонов източник,След изолкпаче на единиттчи колонии.диплоидите се спорулират и асцитите се оасрясват по стандартни техники. КНУ» 107 щамът се изолира като единствена спора и се характеризира като ade1 , 1еи2~ и мпп9~ / чрез техника, на ^иФт I.
Щамът КНУ107 /с1г-0/ е получен от щам ЬНУют /cir*/ както е описано от
чрез интегриране на разрушения игаЗ ген. Счупеният в резултат щам, КНУ-107игаЗ ,се култивира в богата среда, за да позволи акумулиране на спонтанни мутации и се подбира резистентен на. канавани: мутантЩ^утантният щам , GH55, се доказва, че е сап! с помошта на. комплементационен тест, G-AIiiOpGAId експресиончия блок се интегрира в HI&3 гена от CFB5 Мза получаване на крайния го сто приемнико в щам СБЬз /Мета Геи2-2, 112 игаЗд с?п1 &ls3zs: : СА1,1 ОрСАД-ИРДз.ciг* Тези трансформенти се установяват като запазен резерв за изпитван' и последващи експериментиране,
Рекомбинантните .дрожди от замразените оезерви се култивират в среда на УЕНД / 16/, След култивиране в статтионаона. Фа за,, дрож девите клетки се събират, Приготвят се лизали. се на натриево-додецилсулфат-полиакриламине гел електрофореза / S^S-PAGE / и се въздейства с антитела до HBsA^ t Намерен е един полипептид с молекулярно тегло около 24 кД в съответствие с предсказаното молекулно тегло на транслац ионния продукт otS ORP, Нещо повече , лизатите на рекомбинантни, но не парентални дрожди, са позитивни за чрез радиоимунни изпитвания / ^и$г!а ' /.Електронно микроскопскс изследване на частИино пречистени дрождеви лизати показва висока плътност на типичните ттаСТици,>8
• ··«· · · · · ··· ♦ • · · · · ··· ···· ·· ··· ·· ·· ··
Полученият от дрождите поомотор инитшира транскрипцията, на НВ Aq и свързаните с него гени. ^Ьоади това,очевидно е за специалиста в областта,че всяка активна поомоторна последователност в дрожди / т.е включително от че лимитираните за GAL· I. GAI 10 ? АДН 2, -Н|то 5, и др. / може да *ъце заместена за GAP 491 поомотор. Освен това,очевидно е за специалиста в обтастта.че подходяща систе ма за изпитване, т.е, имуноблшт или ЩА или ензим-сварзана имунопроба/ ЕВА / би била поиложииа с оглед изпитване експресията на НВ Ао и свързаните полипептиди в тази система.така.че виенето за съзряване на културата с оглед получаване ча максимален добив да може да бъде оптимизирано,
Промотора GAP 491 е използван за експресия ча няколко чужди протеина в дрожди, включително HBsA$ / В}ффег /,1Я/. На основата на нашите предишни резултати от експресията на HBsAj до около 40^ от разтворимия дрождев протеин /11Лние използвахме този промотор за водене на експресията на HBsAj и свързаните протеини в подходящи дрождеви гостоприемникови клетки.
Очевидно е за специалиста в областта.че подбора на подходящи щамове дрожди за експресия на HBV повърхностни протеини обхваща широк кръг от тях. Подходящи дрождеви щамове включват.но че се ограничават до онези с генетични и Фенотипични характеристики като протеазни недостатъчности. и променена способност за гликози лация.
С оглед контрол и определяне гликозилашята на пекомбинантните експресирани в дрожди HBV протеини, щамът S.cereVibioe CJV52 /Мата {еи2-2,112 ига.ЗА сап{ fcs3A : ί GALj.OpGALi -ига 3,ctr° / се използва така,както е конструиран по-горе.
_ 1 P _
Експресно нният плазлтид pCi / ΐρβλι^Β Ой*. Ле използва за трансформация на /Ертр игаЗД carff Ιιΐ8·8Δ : : GALiOpGAH -игаЗ , cJ г /, Ле нсгор5 играни те клонове се подбират от минимална среда Леи -/, съдържаш 1.М сорбитол. Тези клонирани трансформанти са установени като замразен резерв в глиперол за последваща оценка и по-нататъшни експерименти.
За да се осигури кнотрол на гликозилацията на ,дивия тип, експреснонният плазмид съто бе използван да трансФормира дрождевия щам СП54 ,който бе изолиран по установени техники от щам ЕГ 52,и който е спонтанен ревертант към МД-БЕръ/ и това е див тип за гликозилация, но иначе е с идентичен генотип с шам θϊ^2 /,
Трансформираните клонални изолати се оставят като замразен резерв в 17% г.лицерол за последваща оценка и по-нататъшно експериментиране .
Клоновете от трансформираните .дрожди.съдъвчащи експоесиончите плазмиди,се посяват в 1еи ” селективна агарна среда /съдържала 1^ сорбитол за мпп9- - трансформанти / и се инкубират на 30°С за 2 дни. Тези дрожди се инокулират в 5-7 мл култура в комплексна 7ЕНД среда /съдържаща 0,1- 1М сорбитол / плюс 2% галактоза за GALio плазмиди и културите се инкубират на 30°С с аевация за 12-18 часа. Колбите, съдържащи 50 мл комплексна «УЕНД среда с 1^ сорбитол /от тук нататък наричана УЕНД$/? Се инокулират от горната култура / до начално Αθθθ =0,1 / и се инкубират на 20°С с разклащане /-850 грм / за 48-72 часа до крайно Α^θθ От 10-16. Цзобите от 10 к единици се диспергират в туб епруветки и дрождевите клетки се утаяват през центрофугиране при 2 ОООхо за 10 минути.Пробите се изпитват както директно, така и след замразяване пои -700^.¾ време на изпитването, утаените клетки се оесуспендират в 0,4 мл от фосфат-буферирана сол / РВ?> / съдържаща 2мМ Фенилметил сулФонил флуорид / PMSF / и се прехвърлят в 1,5 м^ епруветки на ЕпендорФ.
- 20 Дрождевите клетки се чазрушавад^ч^в’ ’ не 900300 мс| промити стъклени топчета /0,45 мм/ и разбъркването им в миксер за 15 чин 2/ добавяне на TRITON Х-Ю0 до 0.5^ ,
3/ разбъркване в миксер за 2 чин и 4/ инкубиране на 4°0 за Ю чин. Клетъчните остатъци и стъклените топчета се отстраняват и супернатантите се изпитват за протеин/по метода на ^Ъури /1Q/ и RIA . специфична за pre $2+? /20/21 / или £ /ΑΗ^Τ^ΙΑ^ /,
Клоновете от трансформираните дрожди мпттР“ ,съдържащи експресионните плазми,пи, се поставят в селективни агавни пластинки, съ държащи сорбитол и се инкубират на 30°С за 2-2 дни. '1'ези прожди се инонулират в 5-7 мл култури от комплексна УЕВД$ среда /плюс 2^ галактоза за ОА^ 10 промоторен плазмид / и културите се инкубират при 30°С с разклащане /250 грм / за 48-72 гт9С9 от начално = 0,1 до от 10-16. Утроените ппоби от 10 Αθθθ епинипи се прехвърлят в епруветки и дрождевите клетки се утаяват чрез центрофугиране при 2000 xcj за W ”ин. дробите или се изпитват директно или се съхраняват замразени при -70°С,
Имуноблотинчовия анализ на полипептида. получен от всички к у* клонове, описан по-горе, в гостоприемчици с мш9” Генотип,показват ивица с размер на молекулите от около 24 кД.
За рекомбинантните протеини,пробите на гликозилапия за качество и количество са функция от и в огромна зависимост от вида на гостоприемниковата клетка, и в рамките на вида -от клетъчната линия, Ко този начин,очевидно е за специалиста в областта,че подбора на щама гостоприемник се разширява до видовете и клетъчните .пинии различни от 5.cereyi схе , зз които мутациите на ензимите в метаболитния път на гликозилиране може па бъде идентифициран. Очевидно е също за специалиста в областта, ч е подбора, на гостоприемчиковите щамове от A. cerei/is'iQcce разширява до всички щамове, в които
- 21.
• · · · · • · · · · ·· • ·· • ·· • ·· • · · ♦ · • · · · · · • · · • · · · * · · • · · · мутациите на ензимите от метаболитния път ча гликозилиране може да бъдат идентифицирани.
След това трансформираните клонове се скринират за присъствие на HBsA^ ДНК и експресия ча р?4 HB;Aj, Клетките се култивират в YEHflS среда /също съдържаща гала^тоза за GALip поомоторен плазмид за индуц иране експресията.неследвано от глюкозно изчерпване/. Приготвят се лизатите,разтделят се в натриев цодетти сулФат-полиакриламид целулоза.
гел електроФорезис / ^Д$ -FACE / и v/esWn блот до нитроНродуктът р?4 се установява. тте е спемФипен за протеин поради присъствието му само в индипипаните трансФорманти и
тяхната реактивност с анти -р94 серум. Бдин от тези клонове се подбира за по-нататъшна анализиране. Нешо повече,.лизатите на транс формантите,но не родителски 5 .cerevis’iae ^са позитивни за чрез радиоимуноизследване.
Това подчертава приложимостта на експпесиончия вектор.който използва CAL· р промотор за насочване ча експресията, ча НВ Aq и съответните протеини на S. cerev'FiQC. θ*τθΡ7πΗ0 θ спечиалиста в областта, че регулируеми GALip промотор . или С-А]ц . GAIp . САТщ или MEL1 промотори , които Фунтпт ионират по един нез?бележите лен начин, позволяват растежа на реком^инантните S.ceneiMifle култури ,ца нарастне до тат’ъв обем на продякмята преди синтезата на рекомбинантия протеин да. бъде инициирана., така че да бъдат сведеш до минимум негативните ефекти от гостоприе^лтиковата клетка «Нещо повече,очевидно е за специалиста в областта.че експресионеч вектор, съ,държащ друг регулаторен промотор, включващ,.но не лимтирац до АДН2 и фактора, не кръстосване елфа.Физиологично интпппгоуем или депресивен sa от други средства .по.же да бъде използван за насочеш експресия на 5' И' prej-съ,държащи пептипу.
·· ·· · ·· ······ • · · · ···· · · · • · · · ♦ · · · · • ···· ·· · · ··· ·
Нещо човече, очевидно е зе спщпиялиста^в^юбластта.че конститутивния промотор по-лесно потенцира от САРДН. включвайки.но без да е ограничен до _СУС1 , води експресия на Си pre-S-съдържащ полипептиди до по-нисък процент от клетъчни протеини»така че негативните физиологични ефекти на суперекспресия се задължителни. Очевидно е за специалист^евп8^^с^§^иЧ^г^^^|^П]^^^-'гг( блот радиоимунопроба, би било подходходяшо да се приложат за изследване експресията наби pre-S - съдържащите полипептиди в тази сис тема, така че времето за събиране на узрялата култура за гглуча ване на максимален добив 'юже па бъде оптимизирано.
Ицуно-аФинитетна колона,свързана с кози антитела.които оазн познават частичната Форма на ΗΒςΑ^, Се използва за пречистване на %и ^-свързаните протеини . от трансформирани cere РЧ’em . Елуираният продукт е позитивен за НВ^А^ црез радиоимунопроба. и е специална форма, киенихе когато се наблюдава под електронен 'микроскоп, Такава специална Форма, която съдържа както S антигени или
HB$Ag и ргеΗΒςΑ$ самостоятелно, е ефективна като HBV ваксина агент.
и диагностичен
Дрож,девите клетки.транс^опчипани с експресионни вектори, кодиращи хепатит В вирусни повърхностни протеини или техни взри анти, се култивират и се събират спец ^ова.Клетките могат да.
бъдат съхранявани след това по желание чрез промиването ич в бдФерен разтвор, като PBQ, , и не клетъчна паста.която обикновено се съхранява замразена при -70°0,
Пречистването на HBSA^ и сродните протеини обикновено започва както следва ‘ Парче от пресна или замразена клетъчна паста се суспендира в буфер,за предпочитане Τψ^,πρπ висока стойност на pH, достигаща между 8,5 и около 11,0, за предпочитане около 10.5 /буферът може също така да съдържа подходящи протеазчи инхибитори^
След това клетките се разрушават за предпочитане с механични средства.В1ето,цът на внимателното разрушаване е установено,че не е подходящ за използване в голям мащаб. Разрушаването в хомогенизатор с високо на .лягане /около W 000 до 00 000 psi ,с помощта на f·' хомогенизатор на Q αυίί η или Mcml-fed/ се предпотгита поради ефикасността му.
Разрушаването на дрождевите -плетки води до получаване на суров екстракт,Последния се довежда до подходящо ρΗ,ρΗ се довежда w др 8,0 -11,0, като за предпочитане е W.5, желателно е в тази точка да се добави детергент.което ще улесни разделянето на клетъчните мембрани на дрождите от нежеланите клетъчни разрушения/парченпа/. Показано е.че preS?. + $ протеин, както и други Форми на повърхностни протеини,може да се асоциира с клетъчните дрождеви мембрани. Различни неутрални или нейонни детергенти могат да бъдат използвани,включително, но не ограничено до детергенти от Τ^ΙΤΟΝ-ΓΙ серията, ΊΤΙΤΟΓΊ-.Χ серия,BRICI серия, ТДДОЕЕИ или BEiASOLсериите,дезоксихолет, октилглюкопиранозид или НОШДЕГ -Кр-40. Двойно натоварените в йонно отношение детергенти като С^АРЗ или СНАР$О СЪщо се приложими и подходящи агенти.
Ако- се употреби детергент, за предпочитане е А-Ю0 при концентрация от около 0,5%, Следва да се подчертае,че методът по настоящето изобретение не изисква детергент на този етап и добавянето му е незадължително.
Екстрактите след това могат да бъдат третирани на горещо.яко по време на лизиса не присъстват протеазни инхибитори Дретирането на горещо е ефективно над температурния обхват и за ' целия интервал на третиране, Обикновено температурния интервал е 4-5 до 60°С, за предпочитане 50°С, Продължителността на горещото третиране обикновено е от 2Q до 40 мин с 30 ”ин предпочитано време. Екстракта се третира, на горещо в подходящи съдове.като съдовете
- 24 ·· ·· · ·· ······ ···· ···· ·· · се потапят в гореша баня или се използладеоплзойяеннц^ртец това материала се охлажда до около 1О°С,за предпочитане през прехвър ляне в ледено студена баня или чеез използване на топлообменник.
Очевидно е за специалиста в областта. ττθ съгласно мето па по изо бретението, ре да, по който се провежда температурното третиране и отстраняване на клетъчните остатъци може да бъде разменен без значителен ефект като резултат от тази процедура,Обратно,целите д дрождеви клетки могат да бъдат нагряти в неутрален pH буфер,разрушени и към тях да се добави детергент както е описано по-горе.
Отстраняването на клетъчните останки от горещо третирания cvров екстракт е необходимо за да се предотврати Физическото запушване по време на последващия етап на предаственв,Останките могат да бъдат отстранени чрез центрофугиране.миироФилтрапия ида Филтрационно получаване на пречистен екстракт,Центрофугирането и микроФилтраттият? са. по-предпочитани метода.Центрофугирането може па бъде проведено за различно по продължителност време при различни условия на центрофугиране.Центрофугиране при около 3000 х за минути при 4°С е намерено за подходящо,Важно е също така да се
РРЗ-
реда екстракта преди центрофугирането за редударане на типично вискозната природа на суровия екстракт.Разреждането не изисква каквато и да е последвала процедура, в цялостния процес,
Микрофилтрацията притежава преимущество,което Филтрадаята и диализата могат да предоставят едаювременно,Няколко типа дажроФилтрационни уданида са подходящи за приложение в този етап.като KIOSFK) от Н.сго^оп ^пс. ида дайто и да е вид от плавни Фиброзни пакети на ΑμΪοοπ или А/С· Techno^о^у.Преппотпттаният метод на микроФилтрация е прокарването на екстракта през /Μΐ^ΐроге /мембрана,да се постави минроФиптрачионната единица с размер на порите около 0,1 микрона до О,п микрона при тоттка на налагането около 2 до 7 ρ^Ι,ο помощта на буфер. състоят се от около 0, 1Μ ΤίφΕ3, • · · · pH около 10,4 и около 0,1$ ΤΡΙΤΟII.X’-lQJ?/ • · · ·
Супернатантата от центрофугирането или Филтрата от микро филтрацията чоже да бъде концентрирана преда следващата стъпка от цялостната процедура.Концентриоането мо.же да бъде постигнато по няколко метода, включително, но без да се ограничава от, даализ, Филтрация,лиоФилизация, ултраФилтрация и даафилтрация.Предпочита ният метод на концентриране от настоящето изобретение е да се пропусне прочистеният екстракт през 10 мол. тегло Фиброзна ултра.Ф Филтрационна система.Обема на прелистения екстракт е типично ре дуциран около 6,5 кратно за микроФилтрационния продукт и около 2 кратно за разредения,центрофугиран поо.дукт,получавайки концентриран продуктАед концентрирането, продукта се дааФилтрира до по-нататъшно отстраняване на контаминантите с ниско молекулно тегло.Диа филтрацията се провежда с помошта на Фиброзна система с молекулно тегло на Фибрите около 10 ,
Ако е добавен ΤξΙΤΟΜ Х-ЮО,. той М_р“.е да бъде отстранен по няколко обичайни метода,, включително,но без ца се ограничава от диализ,добавяне на същински органични разтворители, хроматограФски отделяне и контакт с гел или квучук,спетгиФиттно свързващи датарганти като Ехтгахйо^е! /Pierce / и ХАД каучук / ^ом1соп /.Предпочитаният метод по това изобгетение за отстраняване на Τ^ΙΤΟΙΙ Х-ЮО е дахкЕХЦИКЛИЗиря третираният на горешо екстракт, съ,държащ ТЕЦТОДГ Х-ЮО да циркулира през пакет от ХАД-2 или ХАД-4 кау^дак /полистирен давинилбензен /.Третираният на горещо екстракт циркулира, през ад пакета за около 10 ж часа при 4°С и след това се събира в подходящ съд, например,стъклена бутилка,която 'ό-’έ да се запечатва.
Ако клетките са разрушени в буфер с високо ниво на ΤΉ,ρΗ на горещо третираният екстракт . или екстракта съдържащ протеазни инхибитори, след това се довежда до стойност на pH 7,0 -7,9 за
- 26 ··· ··· · · · • ···· ·· ·· ··· · • · · · · ··· ···· ·· ··· ·· ·· · · предпочитане около 7,7 .Довеждайки pH до около 7.7 следващо горещото третиране при високи стойности на pH съгласно метода по изобретението, това удвснява абсорбцияте на повърхностните протеини към широките пори на силиция,използван в следващия етап.Регулирането на pH на третирания на горещо екстракт може да бъде процедено преди етапа на отстраняване на TRITON Х-иоо без да се предизвика страничен нежелан е^ект, ^Ьради това.би било задължително
за специалиста в областта, ч е съгласно метода по изобретението, реда по който е дадено регуписането на 'ΡφίΑοπ Х-100 могат да бъдат разместени
pH и отстраняването не без забележим еФект върху кочтаминантите.получавайки
Предпочитаният метод за елиминиране резултата от процедурата.
След това е лесно да се отстранят съществено пречистени на контаминантите е да се адсорбира върху щироко порест силиций, йай-предпочитан метод от това изобсетение е да се адсорбира НВ^ върху широко порест силиции с сазмер на порите около 100 до 1500 ангстрьома и размер на частичките на силиция от оизло 30 до 130 микрона /Ал1соп/. 'Ьвърхностния поотеин влиза в порите и се за,държа там. Поради това клетъчните кочтаминанти лесно могат да бъдат отмити.
Дцсорбцията на повърхностните поотеини върху широко порест силиций може да бъде проведена хроматограФски и,пи не-хрома то графски, по маниера на еднократното /баtcli / адсообиране и отстраняване на продукта. Хрома тографски, процеса протича чрез прекарване на екстракта с регулирано pH през легло от широко порест силиций в апарат за колонна хроматография.Обикновено, един литър от третирания на горещо екстракт се прилага за 5 см запълнена колона.съдържаща околоЗОО мл /около 100 сухо телло / широко порест силитдтй при скорост на протока около 200 мл/час.
*· · · ο «· ····«· • · · · · · · · ·· · • ··· · · · · · ··· · • · ··· ···
Не хроматографска адсорбиия върху”шир0копорест силиций се осъществява посредством смесване не. третирания на горещо екстракт със силиций в подходящи съдове, като напр.стъклени колби,които могат· да се затварят плътно, Предпочитан начин' е добавянето на 300 мл широкопорест силиций към около един литър третиран на горещо екстракт в стъклената колба и инкубация при непрекъснато бъркане. Адсорбцията завършва около 1,5 чеса при 4 - 8°^.макар че е възмож но да се използват различни температури при различна, ппоцължите.тгнос на иннубиране.
Промиването на абсорбирания с повърхностен протеин силиций от неабсорбирания материал съшо може да стане нехроматограФски, или силиция може да бъде поставен в колона,както е описало по-горе, за хроматографска абсорбция.Цикличното промиване се осъществява ч чрез изсушаване на третирания на горещо екстракт от широкопорестия силиций и добавяне на няколко обема от буфера,което няма да причини освобождаването на адсорбиран върху силиция.Предпочитаният буФер е Изсушаването и прорязването се повтарят тпикратно до петкратно,
Хромато градското прорязване на адсорбиралия повърхностен протеин силиций се провежда чрез прекарване на РП8 през силиция при ниска скорост от около 200 мл/час докато екстинпията при 200 пм е константна величина.
НВ$А^ се елуира от промития широко порест силиций с помощта на буферен разтвор с pH между около 8,5 до 9,0.Повърхностните протеини се десорбират с помощта /за предпочитане / на буферен разтво] състоящ се от около 0,05 И Взрат при pH около 8,7, Дзсорбцията на HB^Ag може да бъде улеснена при повишена температура в широк обхва; Десорбцията при около 55°0 се предпочита.
Не хроматографеката десорбция се провежда чрез смесване на
1200 мл от 0,05 М Бо ратен буфер при pH 8,7 с около 700 мл от про- 94 • · ·· ···· мития широко порест силиций.
• · · · · · върху’ДРйтъ е ’2ДсТ5обир#н*НВ5А^ t Десорб цията продължава около 25 ^ънути, След това елуата, се събира,ета пите на десорбция се повтарят .двукратно и елуат8 се охлажда.
Хроматографската десорбция се провежда чрез затопляне на заредената колона с промития силиций до около 55°С, 0,05 М Бордтен буфер при pH 8,7 се затопля до 55°С и след това се прилага към колоната при скорост на протока от около 500 мл/час. След това елуата се събира и охлажда.Обема на елуата обикновено е грубо ек вивалентен на обема на горещо третирания екстракт,приложен към широкопорестия силиций.
Концентрацията на елуирания θ обикновено желана. Предпочитаният метод на концентриране е да се прекара елуата през диафилтрационна фиброзна система с молекулно тегло на Фибрите 10 с помощта на боратен буфер и при pH 8,7.Обема на елуирания повърхностен протеин може да бъде редуциран до 16 пъти с помощта на тази система.Диайилтрационния остатък може да бъде стерилизиран чрез микрофилтрация,ако това е необходимо.
Карбохидратното съдържимо на HB$Aj е определено по метода на
Диво1£ ,М,. ei, al./22/ Основният принцип на тази ппотте.дура е. че прости захари,алигозахариди, полизахариди и техни произво.дни.включително метилови естери със свободни или потенциално свободни редукционни групи,дават оранжево жълт цвят когато се третират с фенол и концентрирана сярна киселина.Количеството на цветният продукт при константна фенолна къдъжяник концентрация е пропорционално на количеството на присъстващата захар.
За да се определи карбохидратното съдържание на проба от ΗΒΨ повърхностни протеини, 1мл от разтвор,съдържащ между 10 до 70jwj>
протеин се поставя в епруветка за тестуване.Приготвя се серия от
·· ·· · ·· ······ ···· · · · ··· · • ···· · · · · ··· · • · ······ • · · · ·· · · · ···· карбохидратни стандарти и празна проба, ЕциН мл от 5% фенолен разтвор се добавя към всяка проба,епруветките се разбъркват и се добавят 5 мл 95^ -ен разтвор на сярна киселина с последвало разбъркване. Епруветките се инкубират на стайна температура за 10 мин, разбъркват се и се инкубират на 25 до 30°С за 20 мин.Пробите се поставят на спектрофотолтетър ί за хексози и метиливани хексози , и Α^θθ за пентози,урониева киселина и нейнитЕ метилирани производни/ и количеството на карбохидрата в НВ$А^ пробите се опре деля чрез сравняване с карбохидратни стандарти.
HBs^ ,продуциран в диявия тип рекомбинентни дрождеви клетки / CF54 / , и HB-SAg ггродуциран в CFfep рекомбинантни дрождеви клетки,се анализират за карбохи кратно съдържимо както е описано по-горе.На базата на тези везултети,съотношението на количеството на карбохидрата спрямо протеина присъстващ във всяка проба,се изчислява чрез делене на микрограмовете от кзвбохидрата на грамовете на протеина в пробите. Това ичислено съотношение показва че HBsA^ получен в гекомбинантиите .дрождеви клетки мшг 9' янно съдържат една десета от карбохидратното съдържимо на НВуА^, получено от векомбинантиите див тип .дрождеви клетки.Тези резултати показват ,че получен в мпп 9 мутантни .дрождеви клетки микропостокарбохидрат,когато се дрождеви клетки.
съ,държа съществено редуцирано количество сравнява с нВс,^ получен от дивия тип
Средните примери илюстрират настоящето изобретение.без обаче да го ограничават ..Намиралите се в прилепите литературни препратки са дадени в приложената справка.
- 30 ПРИМЕР 1
Кдониране__на...HBV ДНК в_ рВ^.рз
HBV Ддпе частици /сецотип асЬР се изолират и пречистват от човешка плазма /като носител/ и двойно верижна ДНК Се синтезира в Дапе частич ките от ендогенната полимераза съгласно метода на Дандирс и кол. /23/ и Хруска и кол./34/. ДНК Се иволира след разграждане с протеиназа Kg Д .последвано от екстракция с Фенол/ хлороформ и етанолна преципитапия. HBV гечо^-гчата ДНК се разгражда С , като в резултат се получава 3,3 квр Фрагмент,който се клонира в Bco-Hl сайт от рВВззЗ за Формиране на pHBV/АДШ -1.Присъствието на HBV ДНК се потвърждава след разграждане с Ec.qPI блот трансфер до нитроцелулоза и хибридизация с /^Р /белязани специфични олигонуклеотидни проби.
ПРИМЕР ?
Кдониране на pre $3+9 гена в р&АР - <£АДН _р експресионен вектор
Плазмидът pHBV /АДМ-4 /описан в Пример 1 / се разгражда с ЕсоЩ и АссД , и фрагмента с размер 0,8 квр се пречиства чрез препаративна агарозна гел електрофореза.Също така. , плазми,дьт рМС се разгражда с и ВамН! и линеарният вектор се пречист ва чрез препаративна агарозна гел електрофореза.
За реконструиране на 5<т-астта от ргеДЗ. +S θΡΡ. ®8Йк олигонуклеотидит се синтезират спетгиално. които възстановяват
9 9 9 9999
9 9 9 9 • · · · · · · • · · · · от jcoRI сайта нагоре към ATG през 10вр КТЪпоследователността през сайта Ηΐπέ III към ^соД! края, олигонуклеотида е следната :
Дзследователността на тези
AATTCAAGCT ТАСААААСАА AATGCACTGG /ЗВДЖ) : 4 /
GTTCGAATGT TTTGTTTTAC GTCACCTTAA /ЖДН0 : з /
За. реконструиране на З1 pre S2+S OFF ? втора част от които реконструират ОДР от /ЬсД сайта през транслапионния тетгтнатор през Hi nd III сайт към ВдмН! края, ^Ьследователността на тези олигонуклеотиди е : олигонуклеотида се синтезира, двойка
АТАСАТТТА AGCTTG . / $ВДДН0 : 4 /
10 15
TGTAAATTTC GAACCTAG / £Ш1ДН0 : 5 /
10 18
Олигонуклеотидните двойки се линеалипират,след това се лигатират към рПС ЕсоД! - Вам HI разграден вектор. Полуденият в резултат вектор /2,8 квр / се прелиства с поепаративна агарозна гел електрофореза, фрагментът от 0,8 квр от горните последователности се лигатира с този вектор, ПоиСЪСТвието и ориентацията на Pre$2 + ОДР се потвърждава от рестрикпионЕН ендонуклеазин анализ и So\4^£n блот, ДНК секвенционният анализ / 25 / изявява две замествания на базите, което резултира в амино киселинни различия от последователността, кодирана от ДНК ца плазмида HBpreSSAF347/19T. . За изпитване на идентичните полипептиди от двет( конструкции,тези замествания, които са Т вместо 0 при база 64 /кодиращи Pfie вместо 1еи / и С вместо А црИ база 352 /копират Жб вместо / се променят през сайт-насочена мутагенеза./?бЛ
Плазмид, съдържаш HBsAq кодиращ регион без preS?. кодираща област?се конструира както следва · Плез^дьт рЦСНВрГе5? + Q /описан по-горе/ се разгражда с ЖоЩ и Бту! рестрикционни ендонуклеази,- Големият ДНК фрагмент /3,3 квр / който съдържа ρΓϊΟ и кодираща област се отделя от рге$2 кодиращият ДНК фрагмент и се пречиства чрез препаративна агарозне гел електрофореза.След това синтетичните ДНК олигонуклеотидни двойки :
| AATTCAAGCT | ТАСААААСАА | AATGGAGAAC | ATCACATCAG |
| 1 10 | 20 | 30 | 40 |
| GATTC /8ВДДМ0 : б | / | ||
| 45 | |||
| GTTCGAATGT | TTTGTTTTAG | CTCTTGTAGT | GTAGTCCTAA |
| 1 10 | 20 | 30 | 40 |
GGATG / $ВДДН0 : 7 / се на лигатират с pLICHBsA^ фрагмент. 'Гази двойка съдържа 57 ГсрЩ и Ж £>ту I синтетична олигонуклеотидлепливи транша. така пе да обезпечи Ж n<jIII сайт непосредствено след
5/ Гс.рЩ сайта. В нуклеодита надолу,включително и допълнение,синтетичната ДЖ олигонуклеотидна двойка съдържа НВ^А^
ATG кодон, нагоре -10 вр нетранслирана лидерна последователност и $ту! сайта .
'Гази олигонуклеотипна двойка възстановява пълният копиращ per й5§?(и^пр9в о ля в а неговото последващо ичтактно отстраняване от рПС вектора т;оез оазгоаъцаче с Hi по|Ш.
ДНК векторът pLIC-HBsAg с лигатирача ЖК олигониклеотилна двойка, описана по-горе се използва зз торнсФолмилане на Е,со/1.
«о отволена четяща
Еекомбинантните плаз”иди се подбират сека. че па притежават пълнт реконструиран HBsAg кодиращ регион.Пълната HBs рамка /оу/ се отстранява от лекомбинантния плазжд чрез разграждане с Н1 пс1Ш, последвано от изолиране и пречистване на /0,7квр/ НВзА^ ДНК чрез препаративна агарозна гел електрофореза за клониране в експресионеч вектор.
ПРИМЕР 3
Клониране на
ORF в спи паз.литтни екепрроипччи врлтпрл
За конструиране на експоесионен блок се използват три различни експресионни вектора, GAP 491 промоторен експресионен блок,описан по-рано / .1.1/ е съставен от около 1,1 квр глицералдехид дехидрогеназен промотор / йАРДН / и около 350 вр от дрождева алкохол дехидрогеназен! /АДН I/ тер^нзтор в рВКЗЗЗ основа, с уникален сайт между промотора и терминатора .
НВс.А^ ΟξΡ от Пример 2 се лигатира в уникален Шд^ИДзайт , и неговото присъствие и ориентация се потвърждават с рестрикционен ендонуклеазен анализ блот.
Обратно, GAI10 /о,5 квр/ промотора/W се замества в горната конструктдея, и АДНр /1,25 квр / пломотора /13 / се замества с GAP промотора /вж. ^гура 1 /.
• · · · · ···· ···· ·· ·
Ьъв всеки случай,експреснонният блок^садъргжж ’специфичен про^отор НВзД^ и ДДН 1 терминатор,се т'лонира в совалков вектор pCl/l / Ве^ср ,по-горе и ^оШ-Легс , по-горе /, за съзнаване на прожцев ΘΚΟΠΡβο сионен вектор, който след това се използва за трансформация на
S . cerey'i^Ut както е описано по-долу.
ПРИМЕР д
Конструиране на дрождрв J. cere v CF^g /мпп9”/ мутентен щам
Щам S.cere^Mic*^ КНУ ι07 /cir4/ta3el+. феи?** и мпп9“ / се конструира както следва ·
Щамът C/5 / IB347-1C с кръстосване тип / мппО , се разбърква с щамът 2150-2-3 с кръстосване от а тип /^Аи2', )яс!е1 чрез размесването на шаловете върху пълна среда на УЕВД, За подбор на диплоидите,размесените щамове се препосяват върху минимална среда, съдържаща захарозе т'ато единствен каобонов източник . След изолиране на единични колонии, диплоипите спорулират и аспите се разрязват по стандартни ^езгники. Щамът КНУ-107 се изолира като единична спора и се характеризира като с!_е+, arjel^еи2 и мпп9~/ по техниката на Шиф /,
КНУю7 /с1г 0 / е получен о^ щам КНУ107 /с1г+/ както е описано от Вгоасп /2б/, Съхраненият щам е превърнат в игаЗ ирез интегриране на разградения игаЗ ген, Полученият в резултат щам КНУ-Ю7игаЗ_ , се култивира въпху богата среда за ка позволи акумулиране на спонтанни мутации и се подбира устойчив на канаванин мутант,Щутантният там .CFb5.всъщност е сап1Г потвърдено грез кочплементен ана.лиз«САД]_0р&АВ1_ егспресиончият блок се интегрира в гена • ·
- 35 Н1$з от CF55/26/ за получаване на крайния гостоприемников там
СГ52 / Шта еи?.-2 , 112 игаЗ\ сзп1. Fris За» · GALjOpGAI^ - ЖАр 7 с.1г /
ПРИМЕР 5
Транспортния на дрождите и мстачовяврне на посявката за r HBsAo в СГ52 мпп9₽ мутантни дрожди
Ш»·' ___________Л' ....... ...... — - -I ..............---Плазми,рът pCl/ pGAIk[oHB$Aj -тАДН } описан в ПрИмер 3 се използва за трансформиране на щам S .cere visile 0¾ .Клоновете се подбират върху у.птнимална хранителна среда / {еи- съ.дьржагаа 1М сорбитол / ,установени като замразен резерв / в 17% г.пицерол% и изпитани както е описано по-долу.
ПРИМЕР 6 с
Култивиране и експресия на НВ$А<^ гена след промотора iAS.O в дрожди 0^52 / мпп9~/
Клоновете от дрожди,съдържащи експресионен плззмид,описан в Пример 5 по-горе,се посяват на {еиселективна агарна среда,съдържаща 1М сорбитол и инкубирана на 30°С за 2-3 ,дни.Тези .дрожди се инонулират с 5-7 м! от комплексна УЕНД S / УЕНД -ь сорбитол % и културите се инкубират на 30°С с аерапия за 1.2-18 часа .Колбите, съ държащи 50 млУЕНД5 -ь 2% галактозна среда,се инокулират от горната култура / до начално = 0,1. / и се инкубират ня 20°С при раз клащане /350 грм/ за 72 часа до чрайно Αθθθ от 1П-16 • · · · · · • · ·· · · · · • · · · · · ··· ·· ·· ··
Пробите от Aggg единици се циспергират в епруветки и црожпевите клетки се центрофугират на ?000 х за 10 мин, ЧентроФугатите се изпитват директно или се оставят на -70°С за бъдещи изследвания.
По врама на изпитването, пробите се ресуспендират в 0,4 мл Фосфатно буферен разтвор,съдържащ 2мР HiSP , Дрожцевите клетки се разрушават чрез ί
1/ добавянето на 200-300 м^ стъклени топчета /0,45 мм/
2/ разбъркване в ликсер за и5 ήη
3/ добавяне на Тритон X—100 до 0.5% / /// /.
4/разбъркване в миксер за 2 минути, и
5/ инкубиране на 4°С за 10-15 минути.
Клетъчните останки и стъклените топчета се отстраняват чрез пентпофугиране при 13000 х о за 10 дин, Пояснената супепнатанта се отстранява и анализира за протеин Е чрез АИ5Ц1А пробата / ΑββοΉ / по метода на Лоури / и за HB^Aj /, Типичните резултати от изпитвачето са показани по-долу.
ТАБЛИЦА I
Описание на пробата
АИБПА ?
Р24 ниво
LIG/M& протеин Разруша- Лгноблот
------------- ване --------^ейкорни колби мпп9~ -мутант / 0,55, 0,61,0,53 / див тип ί МТШд+/ стъклени топчета ст.топчета
- 37 • ···· ·· ·· ··· · • · ··· · · · ···· · · · · · ·· ·· ··
ПРИМЕР 7
Широкомащабно култивиране на S. сегеу^ще /млп9~/ ,процупиращ
във Ферментори
Замразените рекомбинантни дрождеви култури се инокулират в 121Λ среда,съдържаща 1М сорбитол, Ианизките с културите се инкубират обратимо на 29°С за 7-3 дни. Културите се оесуспен,пират в УЕНД9 и ресуспендираните клетки се прехвърлят в 2^ ЕрЛенмайерови колби,съдържащи 500 мл «уЕНД и 2^ галактоза.Колбите се инкубират на 28°С и 350 грм в контролиран шейкерен инкубатор за 18-22 часа.Полудените култури след ^ова се изгглзват за инокулиране на съдовете за производство в промишлен мащаб.
Около 1- 5 $ V /1/ инокулум от една или ЛПРПЛеколби се прехвърля в 1.6 -Пили 950 Ь Ферментори.съдържащи 10 Ь или 700 от «уЕНДЗ, съответно. 16-6 Ферл,енторите работят при режим 160 60 1/мин въздух и 28°С, Ферменторите са готови за събипане на ппо дукцията след 40-46 паса след инокулирането със семенната култура. Степента на оптичната плъЖф^ 15,0 е,циници .Събирането на клетките се състои от концентрирането им с помощта на Филтруване прец фиброзен филтър,последвано от промиване на клетките в буфериран солен разтвор. Клетъчните промивки/даедно с клетките/ се изпитват както е описано по-долу или се съхраняват на студено при -70°С за по-нататъшно използване в процеса иши за анализ.
Малки проби /0,6 м^ / от 70% промити клетъчни разтвори се подлагат на ишххкаж разрушаване със стъклени топчета /о,45 0,52 мм/ в 1,5 мл епруветки на Ипендорф / PMSP /5,5 от ощд мМ резерв / се добавя като протеазеч инхибитор. Еднакви количества се отстраняват от епруветките сред разрушаване и замразяване на -
• ·
• ·· · · · · · · • · · · · · ·
-70°С за по-нататъшно използване в имнобдот анализ.
Добавя се TRIT0H Х-100 към останалите проби ло крайна концентрация от 0,5%, и пробите се смесват бързо и инкубират на 4°С за 20-40 мин .Клетъчните останки се отстраняват през центрофугиране и прояснения клетъчен ет'етг>якт се изпитва ва антиген % Awsrla и протеин / Доури/.
ΠΕΙΦΕΡ 8 ши»·
Пречистване на протеина в специална Форма посредством
ХНЖАТОГРАФЖ
Рекомбинантни 7т,амове ^.cereEsicie , конетулпапи както е описано
в Пример 5, се култивират или в колби, или във Ферментор. Дрождевите клетки се събират посредством мкро^илтряттия в Ау1соп-ДС-10 единица,суспендират се в 2.Q мл буфер А / 0,1Μ Νθ^ΗΡΟ ,рН 7,?, 0,5М НаС? /, и се разрушават с налягане по седем пасажа при 75-85 паунда за квадратен инч.Разрушените клетки се суспендират /31 cjm сухо тегло / и суспенсията се разрежда със 120 мл буфер AfTriton X—100 се добавя до крайна чончентрация 0,5% / ι////' и суспенсията се прояснява през центрофугиране на 10 000 х j за мин. на 4°С. Прояснения бульон се декантира и инкубира със СеФароза 4В,присъединява се с антитела към Ηβ5^ / ?7/ зя 19 пяса при 4°С за адсорбиране на антигена върху каучука.Сдец периода на инкубация, промивката се затопля го стайна температура за всички останали последващи етапи и се дегазира под вакуум за 15 ”инути.Обезга• ···· ·· ·· ··· · • » · · · ··· •··· ·· ··· ·· ·· ·· зената промивна суспенсия се отдава върху ?,5 х 40 см колона,След като колоната се запълни окончателно,несвързания протеин се промива с буфер А, Антигенът се елуира е ЗМ KCGM в буфер А, Фракциите, съдържащи антиген се диализират срещу 0,007 М E^a^HPO^ , pH 7,2 , 0,15 М М?аС( при 4°С и се отдава до Формиране на диализна афинитетна про ба, съдържаща 1,08 му протеин в 20 мл. 16 мл от тази проба се разреждат по ^0 мс^/мл с 5,6 мл 0,006^ , pH 7,2, 0,15И NaC{, Продукта се стерилизира чрез Филтруване през ^1{(ех 0.22 р небрана. Идентичността на продукта в диализната аФинитетна проба се показва чрез откриване на НВ$Д^ с реактива Аи$^г1а^.
II
| ОПИСАНИЕ | РАЗРУШАВАНЕ | |
| НА ПРОБАТА | AUSTRIA . UG/i'S/PTOTEIN | |
| Фермешщж. | ||
| / 1,13 , 1,Ю, 1,06 / | Стъклени топчета | |
| мпп9~ | /з,1 , 4,4 / | Manion - Genltn |
| див тип | / 2,3 / | Manion-Cantin |
- tjo • · · · · · • · • · · · · • · ··· · ··
ПРИМЕР 9
Широко мащабно пречистване на оекомбинантни KBsA^
Около 250 о от заигра пена клетъчна паста /пподмципаща рекомбинантен протеин / се ресуспендира до 17% сухо тегло /обем /о^оло 1500 мл / във фосфат бутериран солен па отвор /РВ5/1 Клетките се нагряват до 45°С ирез имерсия във водна баня. Температура та се повея да до 45°С за 15 мин и след това се охлажда постехенно цо Ю0С. След това клетките се разрушават през двукратно прекарване ппез хомогенизатор на ОаиНп,
Следвайки хомогенизирането,10% Tri ion X-1 00 се по бавя по крайна концентрация 0,3% и се разчесва за около 15 мин. Клетъините екстракти след това се печтпотупипат ппи 3,6 х за 20 мин на 4°С и супепнатантата се събира.
След това супернатантаие се провежда над колона,съдържаща около 200о от
ента след това се прове.жда над колона, съдържаща около 150 широко порест силиций с размер на попите около 1500 ангстрьома и размер на настинките около 50 микрона, Използваните колони са 5 см в .диаметър / Р(тагмас1а / и иехпешгиихи работят при ниска скорост около 200 мл за час.
Силициевата колона слей нова се промива с докато се превърне в основна,
S протеина се елуира от силип иевата иОЛОН8 с помощта найнапред на студен боратен бмФер /50 мК pH 8,7 ,4°С / при ниска скорост от около 500 мл за пас, докато се види нарастване на . След като вече е започнало да нараства,колоната се загрява на 55°С и боратен буфер с 55°С температура се прокарва през колоната • · • · при скорост около 500 мл за минута, Елу?та,съдържащ поотеин /около 11 / се събира върху лед,След това елката се концентрира де около 200 мл чрез диатилтрапия срещу 50 боратен буФер на pH
8,7 , с помощта на ти Грозен Филтър слюлекм.пча тегло на отделните Фибри Ю5. S протеинът след това се Филтрува през 0,2 микронен Филтър и се съхранява, .продуктът е стабилен, без забележителна деградаций^ВДВДт^ на блот анализ.
11РЖЕР
10.
Изпитване на карбо хидрат но то съдържимо на карбохилпатни повърх· ностни протеини
Карбохидратното съдържимо на рекожбичантни повърхностни протеини се определя по метода на I^boIS /22/, Основният принцип на тази процедура е, че проба от захари, олигозахарици.по.пизахариди и техни производни, вълккп-^е^но 'ъ^и.пови естери със свободни или потенциално свободни редуциращи груп.дават оранжево жълто оцветяване когато се третират с Фенол и конвент-пир?на сярн? киселина, количеството на цвета, получен при константна ^енолна концет трация е пропорционално на количеството на присъстващите захари.
За определяне на кар^охидратното поисъствие на v дивт тип дрождеви щамове и у .дрождевия щем мпп9~т 1 мл от разтвор, съдържащ между 10 до 70 мс| протеин се поставя в епруветка за тестуване.Серии от карбохидратни стандарти и празни проби се изготвя1: така,че да съдържат различни количества карбохидрати.Един мл от 5$ фенолен разтвор се добавя към всяка проба,епруветките се разбъркват и се добавят 5 мл 96/ разтвоп н? сярн? киселина.с последващо разбъркване.Епруветките се инкубират на стайна температура • · · · · ·· ·· ··· · • · · · · ···
.... .. ... ·· ·· ··
СЕКВЕНЦИОНЕН ЛИСТИНГ
1/ ОСНОВНА ИНФОРМАЦИЯ
1/ ЗАЯВИТЕЛ : Κπί. SKern,B, J,
Hgcjopian, A,
11/ ЗАГЛАВИЕ HA ИЗОБРЕТЕНИЕТО : Хепатит В вирусни повърхностни протеини с редуцирано съ,държание на гостоприечникови карбохидрати
Ш/ БРОЙ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ : 9 iv/ АДРЕС ЗА КОРЕСПОНДЕНЦИЯ :
А/ АДРЕСАТ х Мегск ,, Inc,
В/ УЛИЦА : P.O. BqX poOO
С/ ГРАД х ?aUy
Д/ ЩАТ х NeJ Jersey
Е/ ДЪРЖАВА : IIS
Г / /IF : 07065 - 0900
V/ КОМПЮТЪРНО ЧЙТАЕМА ΦΟΒΙΑ
А/ СРЕДЕН ТИП Длопи диск
В/ КОМПЮТЪР х IBM PC сомрат1в{е
С/ ОПЕРАТИВНА СИСТЕМА : РС-Д0$/ М$_Д0$
Д/ СОФТУЕР : РайепДп ^e^eaSe.^ 1,0 . Version 1,95
VI/ ПОСЛЕДНИ ДАТИ ЗА ЗАЯВЯВАНЕ х
А/ НОМЕР НА ЗАЯБЯБАНЕ х несе зачита
В/ ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ : не се зачита
С/ КЛАСИФИКАЦИЯ х не се зачита
VHI/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПАТЕНТНИЯ ПРЕДСТАВИТЕЛ :
А/ ИИЕ : Pj’eij'jet , Utsnct I.
• · • · • · • · · · • · · • · · · • ·
В/ РЕГИСТРАЦИОНЕН НОМЕР*’*: 22640 •· • · • · ·· • ·· ·· ··
С/ БРОИ НА РЕФЕРЕНЦИИТЕ /НАДПИСИТЕ : 18346
1х/ ТЕЛЕКОМУНИКАЦИОННА ИНФОРМАЦИЯ :
А/ ТЕЛЕТОН : /908/ 594 - 4251
В/ ТЕЛЕФАКС : /908/ 594 - 4720
2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА SB? 1Д N0:1:
1/ секвенционна характеристика ί
А/ ДЪЛЖИНА : ю двойки бази
С* В / ТИП нуклеинова киселина
С/ ВИД НА ВЕРИГАТА : едноверижна
Д / ТОПОЛОГИЯ : линеарна
11/ МОЛЕКУЛЕН ТИП : ДНК /геномна /
И / ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SB? ТД но : 1 :
АСААААСААА
2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА SBO 1Д N0 : р :
1/ СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА :
А/ ДЪЛЖИНА : 30 двойки ^ази
В/ ТИП : нуклеинова киселина
С/ ВИД НА ВЕРИГАТА : едноверижна
Д/ ТОПОЛОГИЯ : линеарна
11/ МОЛЕКУЛЕН ТИП : ДНК / геномна/ х1/ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SB? 1Д N0 : :
AATTCAAGCT TACAAAACAA AAT6CAGTG6
2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА 5 И? 1Д N0:3:
1/ СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА :
А/ ДЪЛЖИНА : 30 двойки ^ази
В/ ТИП : нуклеинова киселина • · • · · · • · · • · · ·
С/ ВИД НА ВЕРИГАТА : е.цновеиижна
Д/ ТОПОЛОГИЯ : линеарна ц/ МОЛЕКУЛЕН ТИП : ДНК / геномна ί
ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : ГД НО :з:
GTTCGAATGT TTTGTTTTAC GTCACCTTAA
2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА ЗЩ ГД НО : 4 :
/ СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА :
А/ ДЪЛЖИНА : 15 двойки Нззи
В/ ТИП : нуклеинова киселина
С / ВИД НА ВЕРИГАТА : едноверижна
Д/ ТОПОЛОГИЯ : ДНК /геномна / х1/ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEQ 1Д МО :4:
АТАСАГТТАА GCTTG
2/ ИНФОРМАЦИЯ- ЗА СМ 1Д N0:5:
1/ СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА :
А/ ДЪЕЖНА : 1Θ двойки бази
В/ ТИП : нуклеинова киселина
С/ ВИД НА ВЕРИГАТА : едноверижна
Д/ ТОПОЛОГИЯ : линеарна
Й/ МОЛЕКУЛЕН ТИП : ДНК / геномна /
Х1/ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEQ ГД МО :5:
TGTAAATTTC GAACCTAG
-46··· ······ • ···· · · · · ··· · • · ··· · · · ···· ·· ··· · · ·· · ·
2/ ИНФОРМАЦИЯ ВА ЗД 1Д Μθ:ρ:
1/ СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА
А/ ДЪЛЖИНА : 45 двойки бази ь/ ТИП : нуклеинова киселина
С/ ВИД НА ВЕРИГАТА : е.цноверижна
Д/ ТОПОЛОГИЯ : линеарна
Ц/ МОЛЕКУЛЕН ТИП : геномна ДОК xi/ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : ЗД 1Д К0:б:
AATTCAAGCT ТАСААААСАА AATGGAGAAC ATCACATCAG GATTC
2/ ИНФОРМАЦИИ ЗА ад 1Д МО:?:
$/ СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА :
<**
А/ ДЪЛЖИНА : 45 двойки бази
Б/ ТИП : нуклеинови киселини
С/ ВИД НА ВЕЙКАТА : единична
Д/ ТОПОЛОГИЯ : линеарна н/ МОЛЕКУЛЕН ТИП : ДОК / геномна / xi/ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА S0O ГД КО:?:
GTTCGAATGT TTTGTTTTAC CTCTTGTAGT GTAGTCCTAA GGATC
2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА ДЕЦ 1Д Ц0:8:
А/ ДгЛ.мпЯА. ί 29 двойки 40зи
В/ ТИП : нуклеинова киселина
С/ ВИД НА ВЕРИГАТА :
едноверижна
Д/ ТОПОЛОГИЯ : линеарна
Й/ МОЛЕКУЛЕН ТИП : ДНК /геномна / х1/ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : 1Д W:g:
AATTGTCGAG AGCTAGCTGA ATTCCCGGG
2/ ИНФОРМАЦИЯ. ЗА SEQ 1Д NO :д:
1/ СЕКВЕНЦИОННА ИЛРАКТЕЖТЙКА :
*** А/ ДЪЛЖИНА : 29 двойки бази
В/ ТИП : нуклеинови киселина
С/ ВИД НА ВЕРИГАТА : е,цновери?кна
Д/ ТОПОЛОГИЯ : линеарна
И/ МОЛЕКУЛЕН ТИП : ДНК / геномна/ х1/ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : ГД ГДО:д:
AGCTCCCGGG AATTCAGCTA GCTGTCGAC
Claims (13)
1, Еукариотична ексгтпесионча система яа получаване на рекомбинантни полипептиди и протеини,съдържащи редуцирани нива на гостоприе'!никови карбо хидрати и гликопротеини.
бинантният полипептид или протеин е хепатит В вирусен полипептид или протеин.
5. Експресионна система съгласно ПретеНция 4,където хепатит В вирусния полипептид или протеин е повърхностен полипептид или протеин.
6. Едспресионна система съгласно ПреТенция 5,където хепатит В вирусния полипептид или протеин е HBs4j .
7. · Хепатит В вирусен повърхностен поотеин,който Формира частички със съществено ре.пуциряно^овррхностно карбохидратно или съдържание.
протеин съгласно претенция рекомбинантни дрождеви клетки,които са генетично гликопротеиново
8. Хепатит В вирусен повърхностен
7, продуциран в дефицитни на протеиново гликозилиране.
9. Хепатит В вирусен повърхностен
8, където генетичната недостатъчност на мпп9 гена.
протеин съгласно претенция прождевите клетки е в ··· ··· · · · • ···· · · · · ··· · • · ··· · · * ···· 9 · · · · ·· ·· · ·
10. Хепатит В вирусен повърхностен протеин съгласно претенция 7,където карбохидрата към протеиновото съотношение от пречистения повърхностен протеин е по-малко от 0,5.
11. Ваксина срещу хепатит В вирус за приложение на хора,която включва хепатит В вирусен повърхностен протеин,който Фор^тира паст тички със съществено редуцирано количество на включения карбохидрат или гликопротеин.
12,. Ваксина съгласно претенция 5. продупиоана в рекомбинантни дрождеви клетки, които са генетично дефицитни за протеинова гликозилация.
13. Ваксина съглесно претенция 12,където генетичния деФицит е в мпп9 гена.
14. Ваксина съгласно претенция И. където карбохи.прзтното към протеиново съотношение зт повърхностния протеин е по-малко от 0,5..
15.. Имунологично .диагностичен реагент, който включва хепатит В вирусен протеин,който Фор'пра частици със съществено редуцирано количество на включения гостоприемчиков карбохидрат или гликопротеин, който притежава редуцирана реактивност с природно срещаните анти-дрождеви антитела.
16'.. Имунологично диагностичен реагент съгласно претенция 15, където карбохидратното към протеиновото съотношение от пречистения повърхностен протеин е по-малко от 0,5.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US69292491A | 1991-04-29 | 1991-04-29 | |
| PCT/US1992/003472 WO1992019741A1 (en) | 1991-04-29 | 1992-04-27 | Hbv virus surface proteins with reduced host carbohydrate |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG98187A true BG98187A (bg) | 1994-06-30 |
| BG61700B1 BG61700B1 (bg) | 1998-03-31 |
Family
ID=24782605
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG98187A BG61700B1 (bg) | 1991-04-29 | 1993-10-29 | Нвv повърхностни протеини с редуциран гостоприемниковкарбохидрат |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5614384A (bg) |
| EP (1) | EP0516286B1 (bg) |
| JP (1) | JP2637877B2 (bg) |
| KR (1) | KR920019373A (bg) |
| CN (1) | CN1067680A (bg) |
| AT (1) | ATE215987T1 (bg) |
| AU (1) | AU650530B2 (bg) |
| BG (1) | BG61700B1 (bg) |
| CA (1) | CA2067290A1 (bg) |
| CZ (1) | CZ282769B6 (bg) |
| DE (1) | DE69232541D1 (bg) |
| FI (1) | FI934650A7 (bg) |
| HU (1) | HUT69149A (bg) |
| IE (1) | IE921385A1 (bg) |
| IL (1) | IL101651A0 (bg) |
| LT (1) | LT3367B (bg) |
| MX (1) | MX9201970A (bg) |
| NO (1) | NO933897L (bg) |
| NZ (1) | NZ242487A (bg) |
| PL (1) | PL171485B1 (bg) |
| SG (1) | SG55152A1 (bg) |
| SK (1) | SK118193A3 (bg) |
| WO (1) | WO1992019741A1 (bg) |
| YU (1) | YU45492A (bg) |
| ZA (1) | ZA923069B (bg) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0533263A3 (en) * | 1991-09-20 | 1994-06-08 | Merck & Co Inc | A multivalent hepatitis b virus vaccine |
| WO1995031558A1 (en) * | 1994-05-16 | 1995-11-23 | Merck & Co., Inc. | Process for producing hbv surface proteins |
| US6300065B1 (en) * | 1996-05-31 | 2001-10-09 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Yeast cell surface display of proteins and uses thereof |
| US6696251B1 (en) | 1996-05-31 | 2004-02-24 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Yeast cell surface display of proteins and uses thereof |
| AU2212100A (en) * | 1998-12-23 | 2000-07-12 | Merck & Co., Inc. | Improved recombinant hepatitis b surface antigen |
| KR100604994B1 (ko) | 2004-01-30 | 2006-07-26 | 한국생명공학연구원 | 알파1,6-만노실트랜스퍼라제를 코딩하는 한세눌라폴리모르파 기원의 신규 유전자 및 상기 유전자가 결손된한세눌라 폴리모르파 변이주를 이용한 재조합 당단백질생산 방법 |
| CN111187720A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-05-22 | 深圳康泰生物制品股份有限公司 | 表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母的细胞破碎方法及其在制备手足口病疫苗中的应用 |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4803164A (en) * | 1981-08-31 | 1989-02-07 | Genentech, Inc. | Preparation of hepatitis b surface antigen in yeast |
| US4707542A (en) * | 1983-08-22 | 1987-11-17 | Merck & Co., Inc. | Immunogenic HbsAg derived from transformed yeast |
| US4816564A (en) * | 1986-01-31 | 1989-03-28 | Merck & Co., Inc. | Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast |
| GB8613388D0 (en) * | 1986-06-03 | 1986-07-09 | Delta Biotechnology Ltd | Induction of galactose regulated gene expression in yeast |
| DE3719213C1 (de) * | 1987-06-09 | 1988-05-19 | Daimler Benz Ag | Bodennahe mehrpolige Stromversorgung fuer spurfuehrbare,gummibereifte,elektrisch antreibbare Fahrzeuge |
| US4963483A (en) * | 1987-10-13 | 1990-10-16 | Merck & Co., Inc. | Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast |
| US5135854A (en) * | 1987-10-29 | 1992-08-04 | Zymogenetics, Inc. | Methods of regulating protein glycosylation |
| ATE100142T1 (de) * | 1987-10-29 | 1994-01-15 | Zymogenetics Inc | Verfahren zur regulierung der proteinglycosylierung. |
| GB8726953D0 (en) * | 1987-11-18 | 1987-12-23 | Delta Biotechnology Ltd | Yeast expression system |
| NZ229260A (en) * | 1988-06-03 | 1994-02-25 | Merck & Co Inc | Hepatitis b virus, expression cassette for pre-s domain, host cells and |
| EP0414374B1 (en) * | 1989-07-25 | 1997-10-08 | Smithkline Biologicals S.A. | Novel antigens and methods for their preparation |
| CA2022109A1 (en) * | 1989-07-31 | 1991-02-01 | Cheryl A. Schulman | Enhanced expression of heterologous proteins in recombinant hosts in a non-growth media |
| CA2022108A1 (en) * | 1989-07-31 | 1991-02-01 | Cheryl A. Schulman | Enhanced growth and expression of heterologous proteins in recombinant hosts containing mutations in cell wall and/or plasma membrane biosynthesis |
| DE69013471T2 (de) * | 1989-12-05 | 1995-03-30 | Merck & Co Inc | Methode zur Stabilisierung von rekombinanten Hepatitis-B-Virus-Oberflächenproteinen aus Hefe. |
| IL101653A0 (en) * | 1991-04-29 | 1992-12-30 | Merck & Co Inc | Multiple hepatitis b virus surface proteins which form particles |
-
1992
- 1992-04-20 IL IL101651A patent/IL101651A0/xx unknown
- 1992-04-24 NZ NZ24248792A patent/NZ242487A/en unknown
- 1992-04-27 CZ CS932271A patent/CZ282769B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-04-27 SK SK1181-93A patent/SK118193A3/sk unknown
- 1992-04-27 WO PCT/US1992/003472 patent/WO1992019741A1/en not_active Ceased
- 1992-04-27 CA CA002067290A patent/CA2067290A1/en not_active Abandoned
- 1992-04-27 PL PL92301163A patent/PL171485B1/pl unknown
- 1992-04-27 HU HU9303064A patent/HUT69149A/hu unknown
- 1992-04-28 MX MX9201970A patent/MX9201970A/es unknown
- 1992-04-28 ZA ZA923069A patent/ZA923069B/xx unknown
- 1992-04-28 KR KR1019920007142A patent/KR920019373A/ko not_active Ceased
- 1992-04-28 AU AU15222/92A patent/AU650530B2/en not_active Ceased
- 1992-04-28 YU YU45492A patent/YU45492A/sh unknown
- 1992-04-28 CN CN92104290A patent/CN1067680A/zh active Pending
- 1992-04-29 SG SG1996008131A patent/SG55152A1/en unknown
- 1992-04-29 AT AT92303883T patent/ATE215987T1/de active
- 1992-04-29 EP EP92303883A patent/EP0516286B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-29 DE DE69232541T patent/DE69232541D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-30 JP JP4155566A patent/JP2637877B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-07-01 IE IE138592A patent/IE921385A1/en not_active Application Discontinuation
-
1993
- 1993-03-30 LT LTIP462A patent/LT3367B/lt not_active IP Right Cessation
- 1993-10-21 FI FI934650A patent/FI934650A7/fi unknown
- 1993-10-28 NO NO933897A patent/NO933897L/no not_active Application Discontinuation
- 1993-10-29 BG BG98187A patent/BG61700B1/bg unknown
-
1995
- 1995-01-04 US US08/368,287 patent/US5614384A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MX9201970A (es) | 1992-11-01 |
| CA2067290A1 (en) | 1992-10-30 |
| CZ227193A3 (en) | 1994-04-13 |
| SG55152A1 (en) | 1998-12-21 |
| SK118193A3 (en) | 1994-03-09 |
| WO1992019741A1 (en) | 1992-11-12 |
| NO933897D0 (no) | 1993-10-28 |
| HUT69149A (en) | 1995-08-28 |
| IE921385A1 (en) | 1992-11-04 |
| CZ282769B6 (cs) | 1997-10-15 |
| ZA923069B (en) | 1992-12-30 |
| CN1067680A (zh) | 1993-01-06 |
| EP0516286A1 (en) | 1992-12-02 |
| HU9303064D0 (en) | 1994-03-28 |
| LT3367B (en) | 1995-08-25 |
| BG61700B1 (bg) | 1998-03-31 |
| PL171485B1 (pl) | 1997-05-30 |
| FI934650A0 (fi) | 1993-10-21 |
| NZ242487A (en) | 1994-07-26 |
| JP2637877B2 (ja) | 1997-08-06 |
| FI934650A7 (fi) | 1993-10-21 |
| AU1522292A (en) | 1993-03-11 |
| LTIP462A (en) | 1994-10-25 |
| DE69232541D1 (de) | 2002-05-16 |
| YU45492A (sh) | 1994-06-10 |
| KR920019373A (ko) | 1992-11-19 |
| JPH06141872A (ja) | 1994-05-24 |
| NO933897L (no) | 1993-10-28 |
| AU650530B2 (en) | 1994-06-23 |
| EP0516286B1 (en) | 2002-04-10 |
| US5614384A (en) | 1997-03-25 |
| ATE215987T1 (de) | 2002-04-15 |
| IL101651A0 (en) | 1992-12-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR940005588B1 (ko) | 효모에서 b형 간염 바이러스 단백질을 제조하는 방법 | |
| EP0013828B1 (en) | Recombinant DNA, hosts transformed with it and processes for the preparation of polypeptides | |
| JPH06172393A (ja) | 宿主炭水化物含量が減少したＨＢｓＡｇエスケープ変異体ワクチン | |
| EP0182442B1 (en) | Recombinant dna molecules and their method of production | |
| CN110564751A (zh) | 微环dna疫苗设计及应用 | |
| BG98187A (bg) | Нвv повърхностни протеини с редуциран гостоприемников карбохидрат | |
| JPH06172392A (ja) | 粒子を形成する多重ｂ型肝炎ウイルス表層タンパク質 | |
| JPH05252976A (ja) | 組換え宿主細胞から得られる組換えｂ型肝炎ウイルス表面タンパク質の安定化方法 | |
| US6270955B1 (en) | Pharmaceutical compositions and methods for producing antibodies to hepatitis b virus and kits and methods for detecting antibodies to hepatitis b virus | |
| EP0533263A2 (en) | A multivalent hepatitis B virus vaccine | |
| JPH02449A (ja) | ペプチドの製造法 | |
| KR0178110B1 (ko) | 대장균에서 발현된 인간유래 한탄바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 이용한 백신 | |
| HRP950289A2 (en) | Process for producing hbv surface proteins | |
| JPS6312286A (ja) | フラジエリンをコ−ドするｄｎａおよび該ｄｎａを有するベクタ− | |
| HU196236B (en) | Process for producing polypeptides showing hepatitis b virus antigenicity |