HUT77450A - Kémiai vegyületek - Google Patents

Description

A találmány tárgya illesztett kétkomponensű rendszer gazdaszervezet kezelésére, ahol (i) az első komponens egy tumorhoz társult antigénhez kötődn képes célzó egység, az előgyógyszert antineoplasztikus gyógy szerré alakítani képes mutáns enzimhez kapcsolt állapotban, és (ii) a második komponens az enzim hatására antineoplasztikus gyógyszerré alakuló előgyógyszer.

A találmány szerinti rendszerben

- a mutáns enzim egy, a természetes szubsztrátumát ionpár-kölcsönhatás révén felismerő természetes gazda-enzim olyan mutánssá alakított formája, ahol a mutáns enzim és a komplementer előgyógyszer kialakítása során ez a kölcsönhatás meg van fordítva {fordított polaritás),

- az első komponens a gazdaszervezetre nézve lényegében nem immunogén, és

- a második (előgyógyszer) komponens olyan anyag, amit a természetes, mutánssá nem alakított gazda-enzim nem képes

- 2 1 ···· ·« * * ·· «· * ·* · ··»· jelentős mértékben antineoplasztikus gyógyszerré alakítani a gazdaszervezetben.

158/1042

2,2.20

KÖZZÉTÉTELI

Képviselő: Dr . Jalsovszky Györgyné ügyvéd PÉLDÁNY

Társképviselő: Dr.Tóth-Urbán László ügyvéd

158/1042

KÉMIAI VEGYULETEK

ZENECA LIMITED, London, Nagy-Britannia

Feltalálók:

TAYLORSON Christopher John, London,

EGGELTE Hendrikus Johannes, Harrow, Middlesex,

TARRAGONA-FIOL Antonio, London,

RABIN Brian Róbert, London,

BOYLE Francis Thomas, Macclesfield, Cheshire,

HENNÁM John Frederick, Macclesfield, Cheshire,

BLAKEY Dávid Charles, Macclesfield, Cheshire,

MARSHAM Peter Róbert, Macclesfield, Cheshire,

HEATON Dávid William, Macclesfield, Cheshire,

DAVIES Dávid Huw, Macclesfield, Cheshire,

SLATER Anthony Michael, Macclesfield, Cheshire,

Nagy-Britannia

HENNEQUIN Laurent Francois Andre, Cergy Cedex, Franciaország

Elsőbbségei:

napja: 1995	. 12.	21 .
1994	. 12.	23 .	(9426192.2)	GB
1995	. 08.	16.	(9516810.0)	GB
bejelentés	száma	: PCT/GB95/02991

A nemzetközi közzététel száma: WO 96/20011

- 2 A találmány gazdaszervezetben lévő enzimek (elsősorban ribonukleázok) olyan, természetben elő nem forduló mutáns formáiára vonatkoznak, amelyek antitest-irányított enzimes előgyógyszer-terápiában (a továbbiakban: ADEP-terápia vagy ADEPT) hasznosíthatók.

Az orvostudományban régóta törekednek úgy célra irányítani a gyógyszereket, hogy azok szelektíven öljék el a rákos sejteket a beteg szervezetében. Ennek egyik lehetséges módja az ADEP-terápia. Az ADEP-terápiában enzimhez konjugált tumorszelektív antitesteket alkalmaznak. A konjugátumot (rendszerint intravénás úton) beadják a betegnek, és megvárják, amíg az kiürül az általános keringésből, és a tumor helyén/helyein lokalizálódik. Ezután a betegnek olyan előgyógyszert adnak be, amit a tumor helyén lokalizálódott enzim a tumoros sejtet elölő citotoxikus anyaggá alakít. Minthogy egy enzim-molekula számos citotoxikus anyag-molekula képződését képes katalizálni, többszöröződés lép fel. Ezen túlmenően minthogy a tumorok rendszerint mikroheterogenitást mutatnak az enzimes úton többszörözötten képződött citotoxikus anyag az antitest által felismert antigént nem mutató tumorsejteket is elöli. A WO 88/07378 sz. nemzetközi közzétételi iratban ismertetett rendszerben enzim-komponensként kartoxipeptidáz

G2 (CPG2) prokarióta enzimet alkalmaznak. A prokarióta enzimeket alkalmazó rendszerek hátránya, hogy a normál bélflóra olyan prokarióta szervezeteket tartalmazhat, amelyek nemszelektív citotoxikus anyag képződését segíthetik elő.

Az ismert rendszerek alkalmazásával kapcsolatos további probléma, hogy a konjugátum ismételt beadása a kezelt szervezetben immunválaszt vált ki, ami rontja a terápia hatá- 3 sósságát. Antitest-komponensként rendszerint egér monoklonális antitestet használnak, ami az immunogenitás csökkentése céljából ismert módszerekkel humanizálható. Az enzimkomponens immunogenitásának csökkentése azonban még több problémát vet fel. Ennek oka az, hogy emberi gazdaszervezet keringő testnedvei természetes állapotban nem tartalmazhatják az enzimkomponenst, mert ellenkező esetben az előgyógyszer túl korán alakul át citotoxikus anyaggá, és megszűnik a tumor-szelektivitás. A probléma megoldására az Akzo cég a WO 90/02939 sz. nemzetközi közzétételi iratban humán enzimek használatát javasolja ADEP-terápia céljára azzal, hogy a szelektivitás fenntartása érdekében olyan enzimeket (például lizozimot) kell választani, ami normál körülmények között nincs jelen a cirkulációban. Az Akzo cég enzimként a humán lizozimot választotta, amihez viszont a szubsztrátum-igény miatt [ az enzim - endoglükozidáz lévén - az N-acetil-glükózamin β₁__ί kapcsolódású polimerjeit (NAG-chitin) hasítja] az adott funkcionalitást tartalmazó előgyógyszereket kell előállítani. Továbbá, a sejtbe való belépés megelőzésére az oligomerre taurin-maradékokat vittek fel azon az alapon, hogy a szulfonsavak megakadályozzák az anyag belépését a sejtbe, és így (huszadrészére) csökkentik a citotoxicitást (lásd a WO

90/02939 sz. közzétételi irat 13. ábráját).

Az emlős-enzimek, például lúgos foszfatáz (Senter és munkatársai: 4 975 278 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) vagy humán enzimek, például β-glükuronidáz (Behringwerke, 4 236 237 sz. német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírás) vagy lizozim (Akzo, WO 90/07929 sz. nemzetközi közzétételi irat) használata az ADEP-terápiában azzal

- 4 az előnnyel jár, hogy ezek a nem emlős-enzimeknél kevésbé vagy egyáltalán nem immunogének. Az emlős vagy humán enzimek használatának hátránya viszont az, hogy ezek endogén anyagként jelen vannak a beteg szervezetében, így a kezeléshez felhasznált antitest-enzim konjugátumon kívül ezek is gyógyszerré alakíthatják az előgyógyszert, ami fokozza a terápia toxicitását. A lúgos foszfatázzal együtt használható előgyógyszerek mind egerekben [ Doyle T.W. és Vyas D.M.: Cancer Treatment Reviews 17, 127-131 (1990)] , mind emberekben [ Hande és munkatársai: Clinical Pharmacology and Therapeutics 53, 233 (1993)] konjugátum beadagolása nélkül is hamar átalakulnak a megfelelő gyógyszerré, ami annak tulajdonítható, hogy szervezetük széles eloszlásban tartalmaz endogén lúgos foszfatázt. Ez a tény egyértelműen igazolja az adott enzimmel kapcsolatos problémákat. A β-glükuronidázzal és lizozimmal együtt használható előgyógyszerekkel kapcsolatban nem ismertettek humán vizsgálati adatokat. Glükuronidáz és lizozim a vérplazmában és más szövetekben van jelen. Az idézett Akzo közlemény szerint a tej, a könnyek, a nyál, a lép, a leukociták és a monociták is tartalmaznak lizozimot. Az idézett

Behringwerke közlemény szerint az aktivált makrofágok, granulociták és vérlemezkék glükuronidázt választanak ki. Minthogy az emberi test széles eloszlásban tartalmazza ezeket a sejteket, számolni kell az előgyógyszer nemkívánt aktiválódásával.

Ezt alátámasztja az idézett Behringwerke közleményben szereplő adat (lásd a 3. táblázatot), amely szerint egerek lépőben

- ami a fenti sejteket nagy mennyiségben tartalmazza - Doxorubicin előgyógyszer beadása után viszonylag nagy mennyiségű szabad gyógyszer halmozódik fel.

A humán enzimeknek a fenti típusú ADEP-terápiában való felhasználhatóságát korlátozza az a tény, hogy csak túlnyomórészt sejtközötti eloszlású enzimek alkalmazhatók, és az enzimekkel együtt felhasznált előgyógyszereket a toxicitás minimumra szorítása céljából kívül kell tartani a sejteken.

Ezek a tényezők jelentősen korlátozzák az ADEPT rendszer kialakítására szóbajöhető lehetőségek számát. Noha a lizozim kisméretű enzim, az ADEP-terápiában való alkalmazása több hátránnyal jár. A lizozim nem az aktív gyógyszert, hanem annak egy ismeretlen farmakológiai hatású származékát szabadítja fel. Az idézett Akzo közleményben közölt példa szerint szabad Doxorubicin helyett Dox-(GlcNAc) vagy Dox- (GlcNAc) ₅ szabadul fel. A glükuronidáz már képes az aktív gyógyszert (például adriamicint) felszabadítani a glükuronid előgyógyszerekből, amelyek tumorellenes aktivitását igazolták [ Bosslet K. és munkatársai: Cancer Research 54, 2151-59 (1994)] . A humán glükuronidáz azonban nagy (150-300 kilodalton) molekulatömegű enzim, így felhasználásával csak igen nagyméretű célzó konjugátum alakítható ki. Ez a tény a szövetekbe (például tumorokba) való bejutáskor okozhat problémákat, jól ismert ugyanis, hogy a kisebb méretű fehérjék gyorsabban hatolnak be a szilárd tumorokba. További hátrány származik abból, hogy a glükuronidáz glükozidáltsága következtében gyors az ADEP-terápiában felhasznált antitest-glükuronidáz konjugátum vér-clearence. A gyors vér-clearance eredményeként kevés konjugátum lokalizálódik a tumor xenograftokhoz. A nagy molekulatömeg és a gyors vér-clearance együttes hatása oda vezethet, hogy a beteg szervezetében a konjugátum csak gyengén lo- 6 kalizálódik a tumorokhoz. így a glükuronidáz az ADEP-terápiában nem tekinthető ideális enzimnek.

A találmány azon a felismerésen alapul, hogy egy gazdaszervezetben lévő enzimnek (például az általános keringésben jelenlévő természetes humán ribonukleáznak) olyan mesterséges formája is kialakítható, amely képes a gazdaszervezetben lévő természetes enzim (a továbbiakban: gazda-enzim) által csak jelentéktelen mértékben felismert, ADEP-terápiára alkalmas előgyógyszert felismerni. Minthogy a mesterséges enzim aminosav-összetétele szempontjából nagymértékben hasonló a natív gazda-enzimhez, a bakteriális enzimeknél (például a CPG2-nál) sokkal kevésbé immunogén. A mesterséges enzim a természetben nem fordul elő, így jelentősen csökken a természetes flóra vagy a humán enzimek által előidézett nemszelektív előgyógyszer-aktiválás lehetősége. A megoldás további előnye, hogy a humán vagy emlős enzimek széles választékára alkalmazható, mert használatának nem szab gátat az enzim természetes eloszlása, és a sejtekbe behatoló előgyógyszerek felhasználását is lehetővé teszi.

A felsorolt felismerések egy része a jelen bejelentés legkorábbi elsőbbségi időpontja után publikált WO

95/13095 sz. nemzetközi közzétételi iratban (Wellcome Foundation) már említésre került. Ez a közzétételi irat az ADEP-terápiában mutáns emlős enzimek használatát javasolja a megfelelő natív enzimekkel nem aktiválható előgyógyszerek aktiválására, a találmány szerinti megoldást azonban nem ismerteti.

Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy ha egy enzim szubsztrátum-kötő vagy katalitikus helyén vagy ahhoz közel elhelyezkedő, töltéssel bíró maradékot egy ellenkező töltés-

sel bíró maradékra cserélünk, olyan mutáns enzimhez jutunk, amelynek katalitikus centruma érintetlen marad, és a mutáns enzim a natív enzimtől csupán abban különbözik, hogy az utóbbiéhoz hasonló, de ellenkező töltésű komplementer szubsztrátumra nézve specifikus.

Az idézett Wellcome közleményben ismertetett (metotrexát és melfalan alapú) előgyógyszer/gyógyszer kombinációknál az aktív transzportfolyamatok gátlásával előzik meg az előgyógyszer behatolását a sejtekbe. Ez a felhasználható előgyógyszer/ gyógyszer kombinációk választékát az aktív transzportfolyamatokat a kívánt módon befolyásoló anyagokra korlátozza. Ezzel szemben a találmány szerint alkalmazott fordított polaritás alapján az előgyógyszerek (amelyek vagy hatnak az aktív transzportfolyamatokra, vagy nem) töltésének megfelelő megválasztásával gátolhatjuk meg az előgyógyszer sejtbe jutását, így a találmány szerinti megoldásban az előgyógyszer/gyógyszer kombinációk szélesebb választéka használható fel.

A találmány tárgya tehát illesztett kétkomponensű rendszer gazdaszervezet kezelésére, ahol (i) az első komponens egy tumorhoz társult antigénhez kötődni képes célzó egység, az előgyógyszert antineoplasztikus gyógyszerré alakítani képes mutáns enzimhez kapcsolt állapotban, és (ii) a második komponens az enzim hatására antineoplasztikus gyógyszerré alakuló előgyógyszer.

A találmány szerinti rendszerben

- a mutáns enzim egy, a természetes szubsztrátumát ionpár-kölcsönhatás révén felismerő természetes gazda-enzim olyan

- 8 mutánssá alakított formája, ahol a mutáns enzim és a komplementer előgyógyszer kialakítása során ez a kölcsönhatás meg van fordítva ( fordított polaritás ) ,

- az első komponens a gazdaszervezetre nézve lényegében nem immunogén, és

- a második (előgyógyszer) komponens olyan anyag, amit a természetes, mutánssá nem alakított gazda-enzim nem képes jelentős mértékben antineoplasztikus gyógyszerré alakítani a gazdaszervezetben.

A találmány szerinti rendszer első komponensében szereplő mutáns enzim előnyösen a kezelendő gazdaszervezet valamely enzimének mutánsa lehet.

A találmány szerinti rendszerben szereplő célzó egység előnyösen egy antitest vagy egy antitest-fragmens lehet. A találmány szerinti rendszerben antitest-fragmensként előnyösen F(ab’)₂ fragmens szerepelhet.

A találmány szerinti rendszerben szereplő mutáns enzim előnyösen mutáns ribonukleáz lehet. A mutáns enzim különösen előnyös képviselője a 66-os helyzetben negatív töltést hordozó aminosavat tartalmazó humán ribonukleáz. Kiemelkedően előnyös az a mutáns ribonukleinsav, amelynek a 66-os helyzetben lévő, negatív töltést hordozó aminosavja Glu.

A találmány szerinti rendszerben szereplő mutáns enzim további előnyös képviselője a mutáns glükuronidáz.

A találmány tárgya továbbá illesztett kétkomponensű rendszer gazdaszervezet kezelésére, ahol (i) az első komponens egy tumorhoz társult antigénhez kötődni képes célzó egység, az előgyógyszert antineoplasztikus gyógyszerré alakítani képes enzimhez kapcsolt állapotban, és

- 9 ··· · (ii) a második komponens az enzim hatására antineoplasztikus gyógyszerré alakuló előgyógyszer, és ebben a rendszerben

- az enzim egy gazda-enzim mutáns formája,

- az első komponens a gazdaszervezetre nézve lényegében nem immunogén, és

- az előgyógyszer olyan anyag, amit a természetes, mutánssá nem alakított gazda-enzim nem képes jelentős mértékben antineoplasztikus gyógyszerré alakítani a gazdaszervezetben.

Az olyan előgyógyszer, amit a természetes, mutánssá nem alakított gazda-en-zim nem képes jelentős mértékben antineoplasztikus gyógyszerré alakítani a gazdaszervezetben megjelölés azt jelenti, hogy a beadott előgyógyszer a gazdaszervezetben nem fejt ki a nem célrairányultságnak betudható toxikus hatásokat.

A lényegében nem immunogén megjelölés azt jelenti, hogy az első komponens egynél több alkalommal is bejuttatható a gazdaszervezetbe anélkül, hogy a gazdaszervezetben jelentős mértékű (mint például a bakteriális enzimhez kapcsolt egér antitest emberi szervezetbe juttatásakor fellépő) immunválaszt idézne elő.

A mutáns enzim előnyösen a kezelendő gazdaszervezettel azonos fajhoz tartozó élőlény enzimjének mutáns formája lehet. Esetenként azonban a kezelendő gazdaszervezetétől eltérő fajhoz tartozó élőlény gazda-enzimjének mutáns formáját is felhasználhatjuk, feltéve, hogy az enzim szerkezete a fajok közötti eltérés következtében nem változott meg nemkívánt immunogenicitást előidéző mértékben.

-10A célzó egység előnyösen egy antitest, különösen előnyösen egy antitest fragmens, például F(ab')₂ fragmens lehet. A célzó egységet ismert módszerekkel, például hetero-bifunkcionális kapcsoló reagensek felhasználásával, génfúzióval vagy bármely más alkalmas módon kapcsolhatjuk az enzimhez. Az antitest a kezelendő gazdaszervezettel azonos fajhoz tartozó élőlény antitestje lehet (például az egerek kezelésére szánt rendszerek egér antitestet tartalmazhatnak), az antitest azonban olyan, előzetesen manipulált (esetenként más élőlény-fajból származó) anyag is lehet, amit a kezelendő gazdaszervezet nem tekint jelentős mértékben idegennek (így például a humán gyógyászatban felhasználandó rendszerekben kiméra, CDR-ojtott vagy beburkolt egér antitestek is alkalmazhatók).

Majmokon és humán betegeken végzett előklinikai vizsgálatok azt mutatták, hogy mind a rágcsáló antitestek variábilis tartományainak humán antitestek konstans tartományaiba való átültetésével (kiméra antitestek), mind a rágcsáló antitestek antigén-kötő hurokrészeinek (CDR-ek) humán antitestekbe való beépítésével (CDR-ojtás) nagymértékben csökkenthető a rágcsáló antitestek immunogenicitása. Még CDR-ojtás esetén is igen sok (50-nél több) aminosav lép át a rágcsáló antitest szekvenciájából a humán keretbe. Ennek ellenére mind majmokon, mind humán betegeken jelentősen csökkent az immunogenicitás. Ez a tény azt támasztja alá, hogy ha egy gazda-enzim katalitikus helyén igen kevés aminosavat változtatunk meg, olyan mutáns képződik, amely várhatóan csak minimális mértékben immunogén, és biztosan kevésbé immunogén a nemgazda-enzimeknél [ lásd: A. Mountain és J.R. Adair: Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 10, 1-142 (1992), ··» ·

-11G. Winter és W.J. Harris: Trends in Pharmacological Sciences

14, 139-143 (1993), I.I. Singer és munkatársai: J. Immunoi. 150, 2844-57 (1993), J. Hakimi és munkatársai: J. Immunoi.

147, 11352-59 (1991), J.D. Isacs és munkatársai: The Láncét

340, 748-752 (1992)] . A konstans régió például humán IgA, IgE, IgG vagy IgM tartomány lehet. Előnyösnek bizonyult a hu mán IgG2 és 3 (elsősorban az IgG2), de az IgGl és IgG4 izoti pus is felhasználható. Természetesen önmagukat a humán antitesteket (például a genetikai módosítással humán antitest-termelővé tett egerekben képződötteket) is felhasználhatjuk

A gazda-enzim mutációjával az enzim aktív helye és az előgyógyszer közötti kölcsönhatás módját változtatjuk meg a natív gazda-enzimhez képest. A mutációt bármely alkalmas módszerrel, például kémiai vagy biotechnológiai génszintézis sel vagy célra irányított mutagén kezeléssel létrehozhatjuk.

Mutációval előnyösen az enzim aktív helyének polaritását változtatjuk meg úgy, hogy az a komplementer polaritású előgyógyszerek gyógyszerré alakítására váljon alkalmassá; ezeket az előgyógyszereket a nemmutáns gazda-enzim lényegében nem alakítja át. Előnyösen olyan természetes gazda-enzimet választunk, amely természetes szubsztrátumát ionpár-kölcsönhatás révén ismeri fel, és ezt a kölcsönhatást fordítjuk meg a mutáns enzim és a komplementer előgyógyszer tervezésekor. A találmány szerinti rendszerben szereplő enzim előnyösen mutáns ribonukleáz, különösen előnyösen fordított polaritású humán ribonukleáz lehet (lásd a 12-15. ábrát).

A humán ribonukleáz 66-os helyzetű lizin-maradéka pozitív töltést hordozó maradék, ami az enzim természetes

RNS-szubsztrátumán lévő negatív töltést hordozó foszfátcso-12portokkal lép kölcsönhatásba. Ennek a maradéknak a polaritását (például génsebészeti úton vagy kémiai szintézissel) megfordítva az enzimben negatív töltést hordozó maradékot (például glutaminsav-maradékot) alakítunk ki. A képződött fordított polaritású enzim felismeri azokat a találmány szerinti előgyógyszereket, amelyeket a nemmutáns gazda-enzim nem képes lényeges mértékben felismerni. A szubsztrátum-kötő és előgyógyszer-átalakító sajátságok optimalizálása céljából más maradékok is módosíthatók a natív enzim aktív helyének tartományában. A találmány tárgyát képezik a ribonukleáz enzim így kialakított mutáns formái is. A találmány szerinti célra különösen előnyösen alkalmazható enzimként a ribonukle áz, mert móltömege kicsi (mintegy 13 600 dalton, ami jó tumorba hatolást tesz lehetővé), és az enzim hőhatással és pro teolízissel szemben kellően stabil.

A találmány szerinti rendszerben szereplő előgyógy szer előnyösen a 11. ábrán bemutatott (1) általános képletű mustár-ribonukleotid lehet - a képletben

Q oxigénatomot vagy -NH- csoportot (különösen előnyösen -NHcsoportot) jelent,

A egy -X-Y- képletű csoportot jelent, amelyben

Y —SO₂ — vagy -CO- csoportot vagy vegyértékkötést (előnyösen -CO- csoportot) jelent, azzal a feltétellel, hogy ha Q oxigénatomot jelent, akkor Y nem jelenthet -SO₂- csoportot, és X -(CH₂)_n- csoportot jelent, amelyben n értéke 1-4 (n értéke előnyösen 1, vagy ha X vegyértékkötést jelent, n értéke előnyösen 2), és amelynek bármely szénatomjához adott esetben 1-4 szénatomos alkil-szubsztituens kapcsolódhat (a királis atomok R és/vagy S konfigurációjúak lehetnek), vagy

-13ha Y -CO- csoportot jelent és n értéke 1, akkor az X csoport szénatomjához adott esetben szubsztituensként alanin-, Valin-, leucin-, izoleucin-, metionin-, fenilalanin-, triptofán-, szerin-, treonin-, cisztein-, aszparagin-, glutamin-, lizin-, arginin- vagy hisztidin-oldallánc kapcsolódhat (a ki ralis atomok R és/vagy S konfigurációjúak lehetnek).

R¹ a 11. ábrán bemutatott uracil- vagy citozincsoportot jelent,

3

R és R egymástól függetlenül hidrogénatomot vagy 1-4 szénatomos alkilcsoportot (előnyösen metilcsoportot) jelent, R é; R³ különösen előnyösen egyaránt hidrogénatomot jelent,

R⁴ és R⁵ egymástól függetlenül klóratomot, mezilcsoportot vagy tozilcsoportot (előnyösen mindkettő klóratomot) jelent, és

R , R , R és R egymástól függetlenül hidrogénatomot, 1-4 szénatomos alkilcsoportot (előnyösen metilcsoportot), 1-4 szénatomos alkoxicsoportot (előnyösen metoxicsoportot), fluoratomot vagy klóratomot (előnyösen klóratomot) jelent, mimellett a felsorolt csoportok közül előnyösen R és R jelentése lehet hidrogénatomtól eltérő, de ezek a csoportok különösen előnyösen egyaránt hidrogénatomot jelentenek.

Az (1) általános képletű mustár-ribonukleotidok előnyös képviselői azok a vegyületek, amelyekben Q -NH- csoportot jelent,

X -(CH₂)_n- csoportot jelent, ahol n értéke 1-4,

Y -CO- csoportot jelent,

R¹ uracil- vagy citozincsoportot jelent,

R es R hidrogénatomot jelent,

R⁵ és R⁶ klóratomot jelent, és ··» · • · ·· · * · • · · · ·

-14R⁷, R⁸, R⁹ és R¹⁰ hidrogénatomot jelent, valamint ezek sói.

Kiemelkedően előnyösnek bizonyult az 0-[ (2R, 3S,4R,

5R)-2-(2-amino-acetamido-metil)-5-(2,4-dioxo-l,2,3,4-tetrahidro-pirimidin-l-il)-4-hidroxi-2,3,4,5-tetrahidrofuran-3-il] -0-[ 4-(bisz/2-klór-etil/-amino)-fenoxi] -hidrogén-foszfát (a 7. ábrán bemutatott reakciósor végterméke), és ennek a vegyületnek a citozin-analógja.

A leírásban és az igénypontokban az alkilcsoport megjelölésen az egyenes és elágazó láncú csoportokat egyaránt értjük. Az egyedi alkilcsoportok megnevezésekor azonban külön utalunk az esetleges láncelágazásra, így például a propilcsoport megjelölés csak az egyenesláncú, az izopropilcsoport megjelölés csak az elágazó láncú csoportot jelenti. Hasonlóan értelmezzük az egyéb általános megjelöléseket is.

Az (1) általános képletű vegyületek egyes képviselői egy vagy több aszimmetrikus szénatomot tartalmaznak, ennek megfelelően optikailag aktív izomerek és racém elegyek formájában létezhetnek. Oltalmi igényünk az (1) általános képletű vegyületek összes olyan optikailag aktív és racém formájára kiterjed, amelyeket a találmány szerinti mutáns enzimek szubsztrátumokként képesek kezelni.

Az optikailag aktív izomereket jól ismert szerves kémiai módszerekkel (például optikailag aktív kiindulási anyagok felhasználásával vagy a racemátok rezolválásával) állíthatjuk elő. Szintén jól ismert laboratóriumi módszerekkel dönthetjük el azt, hogy egy adott anyag a vizsgált mutáns enzim szubsztrátumának minősül-e vagy sem.

-15A mutáció pontjait a következőkben két betűből és egy számból álló kóddal jelöljük, ahol az első betű a természetes enzim aminosavját jelenti (az egybetűs nomenklatúra szerint), az azt követő szám az aminosav helyzetét jelöli, és a szám utáni betű a bevitt új aminosavat jelenti. A D253K kódjel például azt jelenti, hogy a 253-as helyzetben az aszparaginsav (D) helyén lizin (K) van. Az egy adott enzimen belül végrehajtott többszörös mutációt szögletes zárójelben tüntetjük fel.

A leírásban és az igénypontokban - ha mást nem közlünk, vagy a szövegkörnyezetből egyértelműen más nem tűnik ki - a CPB megjelölésen a következőket értjük:

(i) az enzim érett, pro és prepro formáit toldalékok-kai (például c-myc) vagy anélkül, (ii) bármely karboxipeptidázt, amely a C-terminális részen

Lys-t vagy Arg-t tartalmazó peptid-szubsztrátumra nézve specifikus;

pancreas- és plazma-eredetű CPB enzimeket (előnyös a pancreas-eredetű enzim).

A találmány szerinti mutáns CPB-k bármely fent említett CPB-ből levezethető, a találmány szerinti tulajdonságokkal rendelkező mutánsok lehetnek. A pancreas-eredetű HCPB következő mutánsai bizonyultak előnyöseknek: D253K, D253R és

- különösen előnyösen - [ G251N,D253R] . A más CPB-k ennek megfelelő mutánsai szintén előnyösek. A találmány szerinti mutáns CPB-kben más olyan konzervatív mutációk [beillesztés, szubsztitúció (csere) és/vagy elhagyás] is megjelenhetnek, amelyek a kulcs-mutációra visszavezethető sajátságokat nem módosítják jelentős mértékben. A leírásban a konzervatív a-16·«*· V · ··♦· • · · » -*·· J ··*·** minosav-szubsztitúció (csere) megjelölésen olyan aminosav-cserét értünk, ami [ Dayhoff és munkatársai számitásmódja szerint; lásd: Atlas of Protein Sequence and Structure (1971)

95-96. oldal és 9-10. ábra] a véletlenszerű csere valószínűségénél több mint tízszer nagyobb valószínűséggel fordul elő a természetben.

A CPB-ket többek között a következő közlemények ismertetik: J.E. Főik: The Enzymes III. kötet 57. oldal (Academic Press, 1971), M. Coll és munkatársai: EMBO Journal 10,

1-9 (1991), D.L. Eaton és munkatársai: J. Bioi. Chem. 266,

21833-21838 (1991), K. Yamamoto és munkatársai: J. Bioi.

Chem. 267, 2575-2581 (1992), 5 364 934 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Genetech) és WO 95/14096 sz.

nemzetközi közzétételi irat (Eli Lilly).

A találmány szerinti vegyületek különböző szervetlen és szerves savakkal és bázisokkal sókat képezhetnek. Oltalmi igényünk ezekre a sókra is kiterjed. A sók közül példaként a következőket soroljuk fel: ammóniumsók, alkálifémsók (így nátrium- és káliumsók), alkáliföldfémsók (így kalciumés magnéziumsók), szerves bázisokkal (így diciklohexilaminnal és N-metil-D-glükaminnal) képezett sók, aminosavakkal (így argininnel és lizinnel) képezett sók, továbbá szerves és szervetlen savakkal, így sósavval, hidrogén-bromiddal, kénsavval, foszforsavval, metánszulfonsavval, toluolszulfonsavval, maleinsavval, fumársavval és kámforszulfonsavval képezett sók. A sók közül előnyösek a nemtoxikus, élettanilag elfogadható sók, azonban a vegyületek egyéb sói is hasznosíthatók például a termék elkülönítésére és tisztítására.

-17A sókat szokásos módszerekkel állíthatjuk elő, például úgy, hogy a termék szabad sav- vagy szabad bázis-formáját egy vagy több ekvivalens alkalmas bázissal vagy savval reagáltatjuk a sót nem oldó reakcióközegben, vagy olyan oldószerben (például vízben), amit utóbb ismert módon (például csökkentett nyomáson végzett lepárlással vagy fagyasztva szárítással) eltávolítunk. A sóképzéshez ioncserés módszereket is felhasználhatunk; például egy adott só kationjait ioncserélő gyantán átvezetve más kationokra cseréljük. A találmány szerinti vegyületeket gyógyászati készítményekké, például orálisan adagolható tablettákká, kapszulákká vagy elixírekké, rektálisan adagolható kúpokká, parenterálisan vagy intramuszkulárisan adagolható steril oldatokká vagy szuszpenziókká alakíthatjuk.

A találmány szerinti vegyületeket optimális gyógyhatást kifejtő dózisokban adhatjuk be a kezelést igénylő betegeknek (állatoknak vagy embereknek). Noha a szükséges dózis a betegség jellegétől és súlyosságától, a beteg testtömegétől, a beteg számára előírt speciális étrendtől, a párhuzamos kezelésektől és szakember számára jól ismert más tényezőktől függően betegről betegre változhat, a kezeléshez szükséges napi dózis rendszerint körülbelül 1-4000 mg lehet, amit egy részletben vagy több részletre elosztva adhatunk be. A kezeléshez szükséges napi dózis előnyösen körülbelül 100-4000 mg, különösen előnyösen körülbelül 500-3000 mg lehet.

A találmány szerinti konjugátumok és előgyógyszerek rákterápiás alkalmazásának leghatásosabb adagolási módja és dózisa több tényezőtől, például a betegség súlyosságától, a beteg általános egészségi állapotától, a betegnek a terápiára ·· »

-leadott reakcióitól és a kezelőorvos megítélésébe tartozó egyéb tényezőktől függően változik. A konjugátumok és az előgyógyszerek terápiás dózisát tehát betegenként egyénre szabottan kell beállítani. A konjugátum hatásos dózisa körülbelül a 20-200 mg/m tartományba esik. Az előgyógyszer hatásos dózisa az adott vegyület jellegétől és az előgyógyszerből felszabaduló gyógyszer (alapgyógyszer) toxicitásától függően változik. Minthogy az előgyógyszer az alapgyógyszernél kevésbé toxikus, az alapgyógyszer MTD-értéke (minimális toxikus dózis)

- ha ismert - kiindulási pontként használható az előgyógyszer dózisának megválasztásához. Olyan fenolmustár-alapú előgyógyszerek esetén, ahol az alapgyógyszerre vonatkozó klinikai adatok nem állnak rendelkezésre, a terápiás dózistartomány meghatározása az előbbinél bizonytalanabb, és állatokon végzett standard toxikológiai elővizsgálatokat, majd a betegen kis induló dózis felhasználásával végzett dózisnöveléses elővizsgálatokat igényel. A terápiás dózis azonban rendszerint az 500-2000 mg/m tartományba esik.

Nyilvánvaló, hogy a fenti dózistartományok alapján szükség esetén dózisegységeket készíthetünk osztott adagolás céljára. Miként már közöltük, a tényleges dózis a betegség jellegétől és súlyosságától, a beteg testtömegétől, a beteg speciális étrendjétől és hasonló tényezőktől függően változik.

A fenti kombinációkat előnyösen gyógyászati készítmények formájában adjuk be. A gyógyászati készítményeket például úgy állíthatjuk elő, hogy körülbelül 1-100 mg (1) általános képletü vegyületet (vagy ezek elegyét vagy gyógyászatilag alkalmazható sóját) gyógyásztilag alkalmazható hordozóa-19-

nyaggal, hígítószerrel, excipienssel, kötőanyaggal, konzerválószerrel, stabilizálószerrel, ízesítőszerrel stb. egyesítve a kívánt kezelési módnak megfelelő dózisegységgé alakítunk. A gyógyászati készítmények hatóanyagtartalmát a fent közölt dózistartományok figyelembevételével választjuk meg.

A tabletták, kapszulák és hasonló készítmények előállításához például a következő adjuvánsokat használhatjuk: kötőanyagok (például tragakantagumi, akáciagumi, kukoricakeményítő és zselatin), excipiensek (például mikrokristályos cellulóz), szétesést elősegítő anyagok (például kukoricakeményítő, előzselatinált keményítő és alginsav), csúsztatószerek (például magnézium-sztearát), édesítőszerek (például szacharóz, laktóz és szacharin), ízesítőszerek (például borsmenta, gaulteria-olaj és meggyaroma). Kapszulák előállításához a fent felsoroltakon kívül folyékony hordozóanyagokat, például hosszú szénláncú olajokat is felhasználhatunk. A dózisegységek bevonás vagy a dózisegység fizikai formájának más módosítása céljából különböző egyéb anyagokat is tartalmazhatnak. A tablettákat például sellakkal és/vagy cukorral vonhatjuk be.

A szirupok vagy elixírek a hatóanyag mellett édesítőszerként szacharózt, konzerválószerként metil- és propil-parabént, színezéket, továbbá ízesítőanyagot, például meggy- vagy narancsaromát tartalmazhatnak.

Az injekciós célokra alkalmas steril készítményeket szokásos gyógyszerészeti módszerekkel állíthatjuk elő például úgy, hogy a hatóanyagot hordozóanyagban [ így injekciós célokra alkalmas vízben, természetes növényi olajban (például szezámolajban, kókuszolajban, földimogyoró-olajban vagy gyapotmag-olajban) vagy szintetikus olajos hordozóanyagban (így e-20til-oleátban)] oldjuk vagy szuszpendáljuk, és a készítményhez szükség esetén pufferanyagokat, konzerválószereket, antioxidánsokat és/vagy hasonló segédanyagokat adunk.

A találmány tárgyát képezi a fenti rendszer gazdaszervezetekben lévő neopláziás sejtek növekedésének visszaszorításában való használatra, ahol a használat során a gazdaszervezetnek hatásos mennyiségű első komponenst adunk be, az első komponenst lényegében teljes mértékben kiürülni hagyjuk az általános keringésből, majd a gazdaszervezetnek hatásos mennyiségű második komponenst adunk be. A komponenseket előnyösen intravénásán adjuk be.

A találmány tárgya továbbá eljárás gazdaszervezetekben lévő neopláziás sejtek növekedésének visszaszorítására oly mődon, hogy a gazdaszervezetnek a fentiek szerinti első komponens hatásos mennyiségét adjuk be, az első komponenst lényegében teljes mértékben kiürülni hagyjuk a gazdaszervezet általános keringéséből, majd beadjuk a fentiek szerinti második komponens hatásos mennyiségét.

A találmány tárgya továbbá gyógyászati készítmény, amely a fentiekben meghatározott első komponenst tartalmazza tumorhoz való lokalizálódásra hatásos mennyiségben, gyógyászatilag alkalmazható hordozóanyaggal, hígítószerrel és/vagy egyéb segédanyagokkal együtt. A készítmény előnyösen intravénás adagolásra alkalmas gyógyszerforma lehet. A készítményben az első komponens előnyösen száraz szilárd anyag formájában szerepel, amit felhasználás előtt alkalmas hígítószerrel elegyítünk .

A találmány tárgya továbbá gyógyászati készítmény, amely a fentiekben meghatározott második komponenst tártál-21mazza tumorgátlásra hatásos mennyiségben, gyógyászatilag alkalmazható hordozóanyaggal, hígitószerrel és/vagy egyéb segédanyagokkal együtt. A készítmény előnyösen intravénás adagolásra alkalmas gyógyszerforma lehet. A készítményben a második komponens előnyösen száraz szilárd anyag formájában szerepel, amit felhasználás előtt alkalmas hígítószerrel elegyítünk .

A találmány tárgyát képezik a fentiekben meghatározott első komponenst tartalmazó gyógyászati készítmények is.

A találmány tárgyát képezik a fentiekben meghatározott második komponenst tartalmazó gyógyászati készítmények is.

A gyógyászati készítmények előnyös formái a steril, intravénásán adagolható kompozíciók.

A találmány tárgyát képezik a fentiekben meghatározott első komponensek is.

A találmány tárgyát képezik továbbá a fentiekben meghatározott mutáns enzimek.

A találmány tárgyát képezi továbbá a pQR162 plazmid. A pQR162 plazmidot a Budapesti Megállapodás előírásainak megfelelően 1994. augusztus 16-án NCIMB 40778 számon helyeztük letétbe az ipari és tengeri baktériumok nemzeti gyűjteményében (National Collection of Industrial and Maríné Bacteria

Ltd., 23 St.Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Scotland, Nagy-Britannia).

A találmány tárgyát képezi továbbá a pCG330 (más néven pICI1698) plazmidot tartalmazó E. coli MSD, amit a Budapesti Megállapodás előírásainak megfelelően 1994. november

-22«··· · · · · ···· ···· ··· · • · · * · ·

23-án NCIMB 40694 számon helyeztünk letétbe a fenti törzsgyűj teményben.

Az A5B7 antitestet hibridómaként, 93071411 számon

1993. július 14-én helyeztük letétbe az ECACC, PHLS Centre fór Applied Microbiology and Research intézetben (Porton

Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Nagy-Britannia) a Budapesti Megállapodás előírásainak megfelelően. Előnyösnek bizonyult a humanizált A5B7 antitest F(ab’)₂ fragmense.

Az ADEP-terápiában felhasználható további antitesteket a következőkben soroljuk fel: BW 431/26 antitest [ lásd: H.J. Haisma és munkatársai: Cancer Immunoi. Immunother. 34,

343-348 (19929], L6.96.5 és IF5 antitest (lásd: 302 473 sz.

európai szabadalmi leírás), 16.88 antitest (lásd: WO 90/07929 sz. nemzetközi közzétételi irat), B72.3 antitest (lásd:

392 745 sz. európai szabadalmi leírás), CEM231 antitest (lásd: 382 411 sz. európai szabadalmi leírás). A HMFG-1 és a HMFG-11 antitest (Unipath Ltd., Basingstoke, Hants, Nagy-Britannia) tejzsír-gömböcskék membránjain lévő nyálszerű glükoprotein molekulával reagál, és emlő- és petefészek-rákban használható célzóanyagként. Az SM3 antitest (Chemicon International Ltd., London, Nagy-Britannia) a nyál magfehérjéjével reagál, és emlő- és petefészek-rákban használható célzóanyagként. A 85A12 (Unipath Ltd., Basingstoke, Hants, Nagy-Britannia) és a ZCEA1 antitest (Pierce Chemical Company, Chester, Nagy-Britannia) a CEA tumor antigénnel reagál. A PR4D1 antitest (Serotec, Oxford, Nagy-Britannia) vastagbél-tumorhoz társult antigénnel reagál. Az E29 antitest (Dako Ltd., High Wycombe, Nagy-Britannia) epitélium membrán antigénnel reagál. A C242 antigén a CANAG Diagnostics cégtől (Gothenberg, Svéd-23ország) szerezhető be. A WO 95/13095 sz. nemzetközi közzétételi irat (Wellcome) 3. táblázata számos további antitest adatait sorolja fel.

Az ADEP-terápiára alkalmas antitesteket az általuk felismert tumorsejtek általában csekély mértékben építik be a sejtbe. így a célra irányított előgyógyszer-aktiváló enzim a sejt felületén marad, és a tumor helyén alakít ki hatóanyagot a keringő előgyógyszerből. Az antitest sejtbe való beépülését ismert módon vizsgálhatjuk [ lásd például Jafrezou és munkatársai: Cancer Research 52, 1352 (1992) és Press és munkatársai: Cancer Research 48, 2249 (1988)] .

A találmány egy további hasznosítási területe az első és a második komponens felhasználása in vitro diagnosztikai célokra. így például egy adott antigént úgy mutathatunk ki, hogy a vizsgált biológiai mintát a találmány szerinti, célzó egységet (például az antigénhez kötődni képes antitestet) tartalmazó első komponens hatásának tesszük ki. Ezután a meg nem kötött első komponenst (például mosással) eltávolítjuk, majd felvisszük a második komponenst (azaz az előgyógyszert), és az előgyógyszer átalakított mennyiségének mérése alapján számszerúsítjük az első komponens megkötött mennyiségét. Az előgyógyszerből kialakult alapgyógyszer mennyiségét bármilyen ismert módszerrel, például nagynyomású folyadékkromatográfiás útn mérhetjük. A módszerről további információ található D.M. Kémény A practical Guide to ELISA c. kézikönyvében (Pergamon Press, 1991).

A találmány tárgyát képezi továbbá az A5B7 antitest rekombináns murin F(ab')₂ fragmense, ahol a fragmens a csuk-24lótartományban három láncközi diszulfid kötést tartalmaz a nehéz láncok között.

A találmány tárgyát képezi továbbá az A5B7 antitest rekombináns murin F(ab')₂ fragmense, ahol a nehéz és a könnyű lánc szekvenciája rendre a szekvencia-jegyzékben szereplő 25.

és 26. szekvenciának felel meg. Sutter és munkatársai megállapítása szerint [ Gene 113, 223-230 (1992)] az antitest csuklótartományába további ciszteineket kell beiktatni annak érdekében, hogy a rekombináns termelődésekor jó dimerképződést érjünk el. A rekombináns úton képződött fragmenst az különbözteti meg a proteolitikus úton képződött anyagtól, hogy az előbbiben nem jelennek meg a teljes antitest szennyezései. Esetenként a rekombináns úton képződött anyagnak nagyobb lehet a CEA antigénre vonatkoztatott kötő-affinitása (Pharmacia

Biacore készüléken végzett mérés alapján).

A találmány tárgya továbbá eljárás a fentiekben ismertetett első komponens előállítására egy tumorhoz társult antigénhez kötődni képes célzó egység és egy, előgyógyszert antineoplasztikus gyógyszerré alakítani képes enzim összekapcsolása útján. A találmány értelmében enzimként gazda-enzim mutáns formáját használjuk. A mutáns enzimet és a célzó egységet ismert módon, például hetero-bifunkcionális reagensek felhasználásával vagy génfúzióval kapcsolhatjuk össze.

A mutáns enzimet és a célzó egységet ismert kifejezési módszerekkel alakíthatjuk ki. Egyes kifejező rendszerekben gazdasejteket (például E. coli-, élesztő- vagy emlős-sejteket) vektorral transzformáinak [ lásd: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, 1990)] . A találmány szerinti célra azonban más kifejező rendszereket is használhatunk, például

-25transzgén nemhumán emlősöket, amelyek kialakítására a kívánt - előnyösen vektorból kivágott, az állat tejébe kifejezett fehérjét irányító emlős promotort tartalmazó - gént emlős zigóta pronukleuszába visszük be [ rendszerint a pronukleusz két nukleuszának egyikébe (általában a hím nukleuszba) mikroinjektáljuk] , és a zigótát kihordó anyaszervezetbe ültetjük be.

A kihordó anya által világra hozott állatok egy része a beépített gént (ami az egyik kromoszómába integrálódott) fogja tartalmazni és kifejezni. A beépített gént tartalmazó állatokat rendszerint továbbtenyésztjük, könnyen elszaporítható törzstenyészetet képezve. A kívánt fehérjét előnyösen egyszerűen a transzgén nőstények tejéből nyerjük ki. Ezt a módszert részletesebben ismertetik a következő közlemények: Simons és munkatársai: Bio/Technology j5, 179-183 (1988), Wright és munkatársai: Bio/Technology % 830-834 (1991), 4 873 191 és 5 322 775 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás. Az egér-embriók genetikai manipulációját Hogan és munkatársai ismertetik (Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, 1986).

Kifejezésre a transzgén növény-technikát is felhasználhatjuk, amit például a következő közlemények ismertetnek: W.F. Swain: TIBITECH 9, 107-109 (1991), J.C.K. Ma és munkatársai: Eur. J. Immunology 24, 131-138 (1994), A. Hiatt és munkatársai: FEBS Letters 307, 71-75 (1992), M.B. Hein és munkatársai: Biotechnology Progress J_, 455-461 (1991), K.

Duering: Plánt Molecular Biology 15, 281-294 (1990).

Kívánt esetben a gazda-géneket standard módszerekkel, így a következőkben röviden ismertetendő eljárással (részletesebb ismertetésre lásd például: Gene Targeting: A

-26Practical Approach, IRL Press, 1993) inaktiválhatjuk vagy módosíthatjuk. A célgént (vagy annak egy részét) előnyösen egy vektorba klónozzuk, mimellett a génbe működésének letörésére szelekciós markert (például Neo-t) illesztünk. A vektort linearizáljuk, majd (rendszerint elektroporálással) embrionikus törzssejtekbe (a továbbiakban: ES sejtek), például 129/Ola egértörzsből származó ES sejtekbe transzformáljuk. Ezután a törzssejtek egy részében homológ rekombinációs események zajlanak le. A letört gént tartalmazó törzssejteket expandáltatjuk, majd csírahólyagba (például C57BL/6J egérből származó csírahólyagba) injektáljuk, és kifejlesztés céljából kihordó anyába implantáljuk. A kiméra utódokat bevonó színjelzőkkel azonosítjuk. A kimérákat tenyésztjük, és annak meghatározására, hogy az ES sejtek szerepelnek-e a csíravonalban, olyan egerekkel párosítjuk, amelyeknek az ES-eredetű és a gazda csírahólyag-eredetű gaméták at megkülönböztetni képes genetikai markerük van. Az ES sejt-eredetű gaméták fele hordozza a génmódosítást. Az utódokból (például Southern biot technikával végzett) szűréssel kiválogatjuk a génletörést tartalmazó egyedeket (a populáció kb. 50 %-a). Ezek a kiválogatott utódok heterozigótásak, ennek megfelelően az ezután kiválogatott másik heterozigótás és homozigótás utódokkal (a populáció kb. 25 %-a) tenyészthetők. A génkieséses transzgén állatok az ismert módszerekkel, például DNS pronukleuszokba való mikroinjektálásával, szferoplaszt-fúzióval [ Jakobovits és munkatársai: Natúré 362, 255-258 (1993)] vagy az ES sejtek lipid-közvetített transzfekciójával [ Lamb és munkatársai: Natúré Genetics 5, 22-29 (1993)] kialakított transzgén állatokkal keresztezhetők, és így olyan transzgén állatok hozhatók

-27···· · ·* · ··· · ···· ··· · »····· létre, amelyekben egy kiesett endogén gént egy idegen gén helyettesit .

A célzott génletörést tartalmazó ES sejtek egy specifikus változtatást tartalmazó cél-génszekvenciával (amit transzformálás előtt előnyösen vektorba klónozunk és linearizálunk) transzformációval tovább módosíthatók. Homológ rekombináció után a módosított gént bejuttatjuk a genomba. Ezeket az ES sejteket azután a fent ismertetett módon használhatjuk fel transzgén állatok létrehozására.

A fenti szövegkörnyezetben a gazdasejt megjelölésen az expressziós technológiára alkalmas bármely prokarióta vagy eukarióta sejtet értünk, amelyek közül példaként a következőket soroljuk fel: baktériumok, élesztők, növényi sejtek, továbbá nemhumán emlős zigóták, oociták, csírahólyagok,

ES sejtek, és más, transzgén technológiára alkalmas sejtek.

Esetenként - a szövegkörnyezettől függően - a gazdasejt megjelölés a transzformált nemhumán emlős zigótákból, oocitákból, csírahólyagokból, ES sejtekből, növényi sejtekből és transzgén technológiára alkalmas más sejtekből kifejlesztett transzgén növényekre vagy nemhumán emlősökre is kiterjed.

A találmány tárgyát képezik a fentiekben meghatározott első komponensek bármelyikét és a fentiekben meghatározott mutáns enzimek bármelyikét kódoló polinukleotid szekvenciák is. A találmány tárgyát képezik továbbá a fenti polinukleotidokat tartalmazó vektorok, valamint a fenti polinukleotidokat tartalmazó sejtek.

A találmányt a következőkben kiviteli példák és ábrák alapján ismertetjük részletesebben.

Αζ 1. ábra a pQR177 plazmid kialakítását szemlélteti .

A 2. ábra a bovin ribonukleáz tisztítását szemlélteti. A rekjombináns RN-áz tisztaságát ezüsttel jelzett, 0,1 % SDS-t és 16 % poli(akril-amid)-ot tartalmazó gélen vizsgáltuk. Az A és a G sáv a kereskedelemben kapható RN-áz (M =

700 dalton) sávja. A C E sáv Echerichia coli [ pQR163] tenyészetek periplazmikus extraktumából izokratikus eluálással elkülönített, és különböző koncentrációjú (0,5, 2, illetve 0 mmól) IPTG-vel indukált pozitív töltésű fehérjék sávja. Az F sáv az Escherichia coli [pKK223.3] sejteket tartalmazó tenyészetből származó, egyébként a 3-5. sávnak megfelelő fehérjék sávja (ez a sáv kontrollként szerepel). A B sáv a tisztított, majd ioncserés kromatográfiának alávetett RN-áz sávj a.

A 3. ábra a pATF4 plazmádhoz vezető PCR technikát szemlélteti. A PCR reakcióban felhasznált 3-6. primerrel (a) a bovin szignál szekvenciát és egy hexapeptidet kódoló szekvenciát viszünk be a humán pankreasz-eredetű ribonukleáz gén 5' helyzetébe, és (b) a HP-RN-áz enzim hét utolsó aminosavját kódoló szekvenciát és egy termináló kodont viszünk be. Az 5.

és 6. primerrel restrikciós helyeket is beviszünk EcoRI számára .

A 4. ábrán a kifejezett (expresszált) R4A.K6A humán pankreasz-eredetű RN-áz PAGE-sel végzett tisztaságvizsgálatát mutatjuk be. Az A és az F sáv 2-2 pg A RN-áz felvitelével kapott sáv, a B és a C sáv a pATF4 plazmidot tartalmazó

E. coli sejtek periplazmikus teréből elkülönített, változó mennyiségben felvitt pozitív töltésű fehérjék sávja, a D és

az E sáv 1 gg, illetve 500 ng tisztított HP-RN-áz felvitelével kapott sáv.

Az 5. ábrán a pATFZ44 rekombináns PCR-el való kialakításának körét mutatjuk be.

A 6. ábrán egy előgyógyszer és az annak megfelelő gyógyszer LoVo sejtekre kifejtett toxicitását hasonlítjuk össze.

A 7. ábrán egy uracil-alapú előgyógyszer szintézisét szemléltetjük.

A 8. ábrán oligonukleotid primereket mutatunk be.

A 9. ábrán egy uracil-alapú előgyógyszer-analóg szintézisét szemléltetjük.

A 10. ábrán egy citidin-alapú előgyógyszer-analóg szintézisét szemléltetjük.

A 11. ábrán a találmány szerinti előgyógyszerek ál talános képletét mutatjuk be.

A 12. ábra a ribonukleáz A - szubsztrátum komplex aktív helyének sematikus diagramja, ahol a B, R és P betűjel zés rendre bázis-, ribóz- és foszfát-kötő alhelyet jelent. A Bj^ alhely pirimidinekre specifikus, míg a B₂ alhely a purinokat részesíti előnyben. A 3'-pirimidin-mononukleotidok a B_;R;Pi alhelyekhez kötődnek, az 5'-purin-mononukleotidok a B₂R₂P₁ alhelyekhez kötődnek, míg a 3'-AMP a B₂R₂P₂ alhelyekhez kötődik. Az enzim által hidrolizált foszfodiészter-kötésben lévő foszfátcsoport a P_x alhelyhez kötődik. Az ábrán az egye: helyekben ismerten szereplő maradékokat is feltüntettük.

A 13. ábrán egy reverz polaritású mutáns enzim aktív helyén lévő előgyógyszert szemléltetünk. Az ábrán csillaggal jelöltük a fordított polaritású maradékot (ez a natív

-30•··· · «· « «» I « • · ·· ·· ··· *« ribonukleáz 66-os helyzetű lizin-maradéka), X pedig a fordított polaritású maradék által felismert pozitív töltésű csoportot jelent.

A 14. ábrán az előgyógyszer fordított polaritású mutáns enzimmel való hasítását szemléltetjük.

A 15. ábra a natív humán RN-áz hatásmechanizmusát mutatja be.

A 16. ábra a CpA és a C>p RN-áz szubsztrátum szerkezetét mutatja be.

A 17. ábrán egy citozin-alapú előgyógyszer szintézisét szemléltetjük.

A 18. ábra pankreasz-eredetű HCPB klónozását mutatj a be .

A 19. ábra pankreasz-eredetű HCPB szekvenálását mutatja be.

A 20. ábra a pICI1266 vektort szemlélteti.

A 21. ábrán génklónozást szemléltetünk pICI1266 kifejező vektorral.

A 22. ábrán egy előgyógyszer és a megfelelő gyógyszer citotoxicitási adatait szemléltetjük.

A 23. ábrán egy tenyésztőközeg összetételét mutatjuk be.

A 24. ábrán a natív ribonukleáz és egy ribonukleinsav-fragmens közötti kulcsfontosságú aminosav-kölcsönhatásokat szemléltetjük. A P_o helyzetben lévő pozitív töltésű Lys66 a negatív töltésű foszfodiészter kötéssel lép ionos kölcsönhatásba, míg a P_x helyen lévő maradékok a katalitikus folyamat szempontjából jelentősek.

-31Α 25. ábrán egy mustár-előgyógyszer és egy mutáns RNS-áz közötti kölcsönhatást szemléltetjük. A natív RNS-áz hatására lezajló átalakulás kiküszöbölésére a 66-os helyzetű kulcs-aminosavat negatív töltésű glutaminsavra cseréltük. Ez a Glu-66 ionos kölcsönhatásba lép az előgyógyszer pozitív töltésű X csoportjával, létrehozva ezáltal a fordított polaritású kölcsönhatást. Az R₂ és B₂ helyzetekben végrehajtott további mutációkkal vélhetően fokozható az előgyógyszerrel való kölcsönhatás.

A 26. ábrán a ribóz 5' helyzetéhez kapcsolódó két olyan lehetséges pozitív töltésű csoportot mutatunk be, amely kölcsönhatásba léphet a P_o helyzetben lévő Glu-66-tal.

	A 27-33. ábrán kémiai szintéziseket	mutatunk be.
	Az alkalmazott rövidítések jelentése	a következő
Ac	acetil
ADEPT	antitest-irányítású enzimes előgyógyszer-terápia
BOC	terc-butoxi-karbonil
BP-RN-áz	bovin pankreasz-eredetű ribonukleáz
CPB	karboxipeptidáz B
DCCI	1,3-diciklohexil-karbodiimid
DMAP	4-(dimetil-amino)-piridin
DMF	N,N-dimetil-formamid
DMSO	dimetil-szulfoxid
Et	etil
EDCI	1-(3-/dimetil-amino/-propil)-3-etil-	karbodiimíd
HCPB	humán CPB
HOBT	1-hidroxi-benzotriazol
HP-RN-áz	humán pankreasz-eredetű ribonukleáz
PCR	polimeráz láncreakció

• ·· ·

-32TFA trifluor-ecetsav

THF tetrahidrofurán

1. referencia-példa

Rekombináns érett bovin pankreasz-eredetű ribonukleáz előállítása

A rekombináns bovin pankreasz-eredetű ribonukleázt a bovin pankreasz-eredetű ribonukleáz (BP-RN-áz) prekurzort kódoló szekvenciából állítottuk elő Tarragona-Fiol és munkatársai módszerével [ Gene 118, 239-245 (1992)] . A fehérjét E. coli-ból fejeztük ki egy, a pQR163-ban lévő kétcisztronos kifejező fragmens tac promotorának vezérlésével. A kétcisztronos fragmenst tartalmazó plazmidot pQR162-vel jelöltük (NCIMB

40678) .

2. referencia-példa

Arg4Ala,Lys6Ala humán pankreasz-eredetű ribonukleáz előállítása

A humán pankreasz-eredetű ribonukleáz (HP-RN-áz) gént kódoló szekvenciát humán szájüregi hámsejtekből kivont genomiális DNS-ből álítottuk elő a Tarragona-Fiol és munkatársai által ismertetett PCR technikával [ Protein and Peptide Letters .1, 76-83 (1994)] . A közlemény a HP-RN-áz előállítására egy mesterségesen képezett HP-RN-áz E. coliban való kifejezését ismerteti. Annak érdekében, hogy a rekombináns humán pankreasz-eredetű enzim kifejeződését az E. coli periplazmikus terébe irányítsuk, a bovin pankreasz-eredetű RN-áz szignált az 5' helyzetben a humán génhez kötöttük. A rekombináns enzim kifejezésére irányuló kezdeti kísérleteink sikertelenek voltak. Ezért az E. coli-ban való kifejezhetőség lehetővé tétele céljából a HP-RN-áz gén génsebészeti kialakítására hely-33irányított mutagenezist alkalmaztunk. Az így kapott mesterséges enzim a homológ bovin enziméhez hasonló kinetikai jellemzőkkel rendelkezik.

(a) Az Arg4Ala,Lys6Ala HP RN-ázt kódoló érett szekvencia klónozása

A restrikciós enzimekkel való emésztést, a defoszforilezést, a ligálást, a transzformálást és a kisléptékű plazmid DNS tisztítást Maniatis és munkatársai módszerével [ Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, New York, 1982)] végeztük.

Az oligonukleotidokat Cyclone DNS-szintetizátorral szintetizáltuk .

A HP RN-áz gén érett szekvenciáját szájüregi hámsejtekből kivont genomiális DNS-ből állítottuk elő PCR technikával. Az eljárást röviden a következőkben ismertetjük:

Szájban lévő 10 ml 0,9 %-os sóoldatot 20 másodpercig erélyesen keverve hámsejteket választottunk le. 1,5 ml szájüregi hámsejt-szuszpenziót centrifugálással pelleteztünk, és a pelletet 100 μΐ 10 mmólos NaCL + 10 mmólos EDTA oldatban újra szuszpendáltuk. Ismételt centrifugálás után a sejtpelletet 75 μΐ 20 mmólos NaOH oldatban újra szuszpendáltuk, és 30 percig 100°C-on inkubáltuk. A sejttörmeléket pelleteztük, és a felülúszót -20°C-on tároltuk. A PCR-inkubálásokhoz templátként rendszerint az így kapott anyag 2-3 μΐ-es alikvotjait használtuk. A PCR inkubáláshoz az érett HP-RN-áz szekvencia 5' és

3' végével komplementer két prímért (a 8. ábrán szereplő 1. és 2. prímért, szekvenciájuk a szekvencia-jegyzékben feltüntetett 5. és 6. szekvenciának felel meg) használtunk egyen-34ként 5-5 pmól mennyiségben. A PCR inkubáláshoz felhasznált további anyagok a következők voltak: humán genomiális DNS,

0,2 mmólos dNTP-k, lx koncentrációjú Stratagene ^(R) pufferoldat [ a lOx koncentrációjú pufferoldat összetétele: 200 mmól Trisz-HCl (pH 8,2), 100 mmól KC1, 60 mmól (NH₄)₂SO₄, 20 mmól MgCl₂, 1 % Triton X-100^(R) és 100 μg/ml nukleázmentes bovin szérum albumin] , és 2,5 egység pfu polimeráz (Stratagene) . A PCR-t 30 ciklusban végeztük, ahol az egyes ciklusok műveletei a következők voltak: denaturálás 92°C-on 30 másodpercig, illesztés 55°C-on 30 másodpercig, kiterjesztés 75°C-on 1 percig. A kapott PCR termékeket agaróz gél-elektroforézissel elemeztük és választottuk szét. A kívánt DNS fragmenst tartalmazó gélszeletet kivágtuk, és a DNS-t centrifugális egységekkel (Spin-X , Costar) kivontuk. Annak érdekében, hogy a teljes rekombináns enzim kifejeződését az Escherichia coli JM107 sejtek periplazmikus terébe irányítsuk, a humán gén 5' helyzetéhez bovin pankreasz-eredetű RN-áz szignál-szekvenciáját kapcsoltuk, míg a 3' véghez a HP-RN-áz utolsó hét aminosavját kódoló szekvenciát és egy termináló kodont kapcsoltunk PCR technikával. Ezután újabb PCR inkubálást végeztünk a következő anyagok felhasználásával: PCR-val kialakított, az utolsó 7 aminosavat kódoló szekvencia nélküli érett HP-RN-áz génszekvencia mint templát, átfedő primerek sorozata (a 3. ábrán feltüntetett 3-6. primer, szekvenciájuk a szekvencia-jegyzékben szereplő 7-10. szekvenciának felel meg) különböző koncentrációkban (a legbelsőtől a legkülső primerig haladva 0,1, 0,5 és 50 pmól), nukleotidok 0,2 mmól mennyiségben, lx koncentrációjú Stratagene pufferoldat (összetételét lásd fent), és 2,5 egység pfu polimeráz (Stratagene). Az inkubálást a

-35fent ismertetett körülmények között végeztük. A PCR termékeket a fent közölt módon kezeltük, és a kívánt fragmenst tartalmazó géldarabot kivágtuk, majd a fragmenst leoldottuk a gélről. Ezt a fragmenst EcoRI-vel hasítottuk, majd előzetesen emésztett és defoszforilezett pUC18-ba ligáltuk, lehetővé téve így a kettősszálú DNS didezoxi 3-mal való szekvenálását.

Ezután az egybeolvadt gént a pKK223.3.3 vektorba ligáltuk (lásd az 1. példát). A bovin szignál szekvenciába egy, az 5'től a nyitott leolvasási keretig terjedő hexapeptidet kódoló DNS-szekvencia épült be. Ezt használjuk a promotor transzkripciójának iniciálásával képződött mRNS szekunder szerkezetének letörésére. Az indukálást, a kifejezést és a rekombináns enzim tisztítását a fent közöltek szerint végeztük. Az utóbbi eljárás után kapott periplazmikus fehérjék elemzése nem mutatott ki rekombináns RN-áz aktivitással rendelkező terméket.

Nem volt várható, hogy ezekben a kísérletekben a humán enzim nem fejeződik ki, mert a bovin szignál-szekvenciát már sikerrel tudtuk alkalmazni a rekombináns bovin enzim transzlokációjának a periplazmikus térbe való irányítására. A natív humán és bovin enzim N-terminális szekvenciájának egybevetése a 4-es és a 6-os helyzetben mutatott ki eltérést, ahol a bovin enzim alanin-maradékai helyén a humán enzimben arginin-maradék, illetve lizin-maradék szerepel. Ismert, hogy az érett szekvencia kezdeti helyein megjelenő pozitív töltésű aminosavak transzfer-leállító szignálokként hathatnak, és így megakadályozhatják a torábbi transzlokációt. A probléma kiküszöbölésére olyan eljárást dolgoztunk ki, amellyel a humán enzim 4-es és 6-os helyzetű arginin- és lizin-maradékát ala-36nin-maradékokra cseréltük. A kívánt helyettesítéseket tartalmazó pATF3 rekombináns klón kialakítására RCPCR technikát használtunk (lásd a 3. ábrát); a kívánt mutáció bevitelére a

8. ábrán feltüntetett E-H. prímért használtuk (szekvenciájuk a szekvencia-jegyzékben szereplő 11-14. szekvenciának felel meg). Az így kapott kiméra plazmidot használtuk templátként a kettősszálú DNS szekvenálásban annak igazolására, hogy a 4-es és 6-os helyzetbe alanin-maradékokat kódoló szekvencia valóban kialakult. EcoRI-vel végzett hasítás és pKK223.3-mal való ligálás eredményeként a pATF4 kiméra kifejező vektort kaptuk (lásd a 3. ábrát), és ezt használtuk fel a módosított humán enzim kifejezésére.

(b) A rekombináns Arg4AlaLys6Ala HP RN-áz kifejezése E. coliban és az enzim tisztítása:

Escherichia coli sejteket pATF4-el transzformálva, és IPTG indukciót használva a sejtekben kifejeztük a módosított rekombináns humán enzimet, amit a homológ bovin enzim termelésénél leírtak szerint különítettünk el a periplazma-tartalomból. A periplazma-tartalomból elkülönített mesterséges rekombináns HP-RN-ázt homogenitásig tisztítottuk (lásd a

4. ábrát). A rekombináns enzim N-terminális szekvenálásával megállapítottuk, hogy a bovin szignál szekvencia helyesen hasadt. Ez azt is igazolja, hogy az Arg-4 és a Lys-6 maradék egyaránt alanin-maradékokra cserélődött.

A kinetikai jellemzőket CpA és C>p szubsztrátumon vizsgáltuk (lásd a 16. ábrát). A Km.kcat és kcat/Km kinetikai paramétereket kereskedelmi minőségű és rekombináns bovin pankreasz-eredetű RN-áz azonos körülmények között mért paramétereivel vetettük egybe. Az adatokat a következő tábláza-37tokban közöljük, amelyekből megállapítható, hogy a mesterséges HP-RN-áz enzim kinetikai jellemzői nem térnek el jelentős mértékben a homológ bovin enzimekétől.

Az enzimek kinetikai paraméterei CpA szubsztrátumon (pH 7,0) kcat/Km (mmól ¹ /s ^x)

Rec.HP-RN-áz R4A:K6A	1700	(480)
Rec.BP-RN-áz	2800	(370)
BP-RN-áz	2300	(600)

Az enzimek kinetikai paraméterei C>p szubsztrátumon (pH 7,0)

	kcat/Km	(mmól 1 /s T)
Rec.HP-RN-áz R4A:K6A	4,2	(0,8)
Rec.BP-RN-áz	3, 9	(0, 9)
BP-RN-áz	2, 3	(0,5)

(zárójelben a standard hiba)

3. referencia-példa

Murin A5B7-bovin pankreasz-eredetű ribonukleáz konjugátum szintézise és elkülönítése

A tumorhoz társult antigénekhez kötődni képes antitestek egyik jellemző képviselője az egér monoklónos A5B7 antitest. Az A5B7 antitest a humán karcioembrionikus antigénhez (CEA) kötődik, és különösen jól alkalmazható vastagbélés végbél-karcinóma célbavételére. Az A5B7 antitest a Dako

Ltd. cégtől (16 Manor Courtyard, Hughenden Avenue, High Wycombe, Bucks HP13 5RE, Nagy-Britannia) szerezhető be. A teljes IgG antitestből ismert módon állíthatók elő antitest fragmensek [ a F(ab')₂ fragmens például Mariani M. és munkatársai módszerével állítható elő; Molecular Immunology 28, 69-77 (1991)] . Általában az antitest (vagy antitest fragmens) /enzim konjugátumnak legalább kétértékűnek kell lennie,

38azaz képesnek kell lennie arra, hogy legalább két tumorhoz társult antigénhez (amelyek azono-sak vagy eltérőek lehetnek) kapcsolódjon. Az antitest-molekulák ismert módszerekkel, például CDR-ojtás-sál (239 400 sz. európai szabadalmi leírás) vagy teljes variábilis régiók humán konstans régiókra való ojtásával (4 816 567 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) humanizálhatok. Humanizálással csökkenthető a kiindulási antitestek (vagy antitest-fragmensek) immunogén hatása. Az A5B7 antitest egy humanizált változatát a WO

92/01059 sz. nemzetközi közzétételi irat ismerteti.

A monoklónos A5B7 antitestet termelő hibridómát

1993. július 14-én 93071411 számon helyezték letétbe az European Collection of Animál Cell Cultures, Division of Biologics, PHLS Centre fór Applied Microbiology and Research (Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Nagy-Britannia) gyűjteményben. Az A5B7 antitest ismert módszerekkel állítható elő a letétbe helyezett hibridómából [ lásd például: Fenge C., Fraune E. és Schuegerl K.: Production of Biologicals from Animál Cells in Culture 262-265. oldal (szerk: Spier R.E., Griffiths J.R. és Meininger B., kiadó: butterowrth-Heinemann, 1991), és Anderson B.L., Gruenberg M.L.: Commercial Production of Monoclonal Antibodies 175-195. oldal (szerk: Seaver

S., kiadó: Marcel Dekker, 1987)] . A jó antitest-termelő képesség fenntartása érdekében esetenként a sejteket határhígítással időről időre újra kell klónozni.

A murin A5B7 derivatizálásához kapcsolóként SATA^!RI-t (S-acetil-tioglikolsav-N-hidroxi-szukcinimid-észter, a Sigma cég A9043 katalógusszámú gyártmánya) használtunk.

-39A bovin pankreasz-eredetű ribonukleáz (BP-RN-áz) derivatizálásához kapcsolóként SMPB-t [ 4-(p-maleimido-fenil)vajsav-N-hidroxi-szukcinimid-észter, a Sigma cég M6139 katalógusszámú gyártmánya] használtunk.

SATA-t (Sigma) DMSO-ban (Fisons) oldva 10 mg/ml koncentrációjú oldatot készítettünk. 50 mg A5B7-ből A pufferoldattal (100 mmól foszfát, 100 mmól NaCl, 1 mmól EDTA, pH

7,2) 5,4 mg/ml koncentrációjú oldatot készítettünk, és 309 μg (30,9 μΐ) SATA-oldatot (az A5B7-re vonatkoztatva négyszeres moláris fölösleg) adtunk hozzá. Az elegyet 40 percig szobahőmérsékleten állni hagytuk. A kapott oldatot a reagens fölöslegének eltávolítása céljából szobahőmérsékleten 210 ml Sephadex G25^<R) géllel (Pharmacia) töltött, 2,6 x 38 cm méretű oszlopon bocsátottuk át. 23,5 ml oldatot kaptunk, ami 2,09 mg/ml derivatizált A5B7-et tartalmazott. A SATA-val derivatizált A5B7-hez dezacetilezés céljából 1,0 ml (10 térfogat %) pufferoldatot (500 mmól hidroxilamin HCl, 500 mmól nátrium-foszfát, 30 mmól EDTA, pH 8,0) adtunk, és az elegyet 40 percig szobahőmérsékleten tartottuk. A fehérjetartalmat 280 nm-en végzett UV abszorbancia-méréssel (feltételezett e = 1,4) vagy Bradford Protein Assay felhasználásával határoztuk meg.

A kapcsolótag-sűrűséget Ellman-féle -SH elemzéssel határoztuk meg, és 1,2 kapcsolótag/mól A5B7-nek találtuk.

BP-RN-ázt (Sigma) 6,0 ml B pufferoldatban (100 mmól nátrium-foszfát, 100 mmól NaCl, pH 7,2) újra szuszpendálva 8,33 mg/ml koncentrációjú szuszpenziót készítettünk.

SMPB-t (Sigma) DMSO-ban oldva 10 mg/ml koncentrációjú oldatot készítettünk. 50 mg BP-RN-ázt tartalmazó oldatot

6500 mg (650 ml) SMPB-oldattal elegyítettünk (a BP-RN-ázra

-40vonatkoztatva ötszörös moláris SMPB-fölösleg), és az elegyet 120 percig szobahőmérsékleten állni hagytuk. A reagensek fölöslegét gélpermeációs kromatográfiával (210 ml Sephadex G25 géllel töltött 2,6 x 30 cm méretű oszlopot használva) eltávolítottuk. A derivatizált fehérje koncentrációját 280 nm-en végzett UV abszorbancia-méréssel (feltételezett e = 0,6) határoztuk meg. A kapcsolótag-sűrűséget fordított Ellman-féle elemzéssel határoztuk meg úgy, hogy a maleimido-derivatizált BP-RN-ázhoz ismert mennyiségű 2-merkapto-etanolt adtunk, és mértük a reagálatlan -SH csoportok mennyiségét.

A konjugálást úgy végeztük, hogy azonos tömegű dezacetilezett derivatizált A5B7-et és derivatizált BP-RN-ázt mértünk össze, az elegyet ionmentes vízzel 1,0 mg/ml koncentrációra hígítottuk, és nitrogén atmoszférában kevertük. A reakciót szobahőmérsékleten 20 órán át végeztük, majd 1 mg/ml koncentrációjú vizes glicin oldat beadagolásával leállítottuk. A nyers konjugátumot puffer-csere céljából 50 mmólos foszfátpufferbe (pH 8,0; C pufferoldat) dializáltuk, majd a kapott oldatot C pufferoldattal egyensúlyba hozott, 30 ml Q

Sepharose géllel (Pharmacia) töltött, 1,6 x 15 cm méretű oszlopra vittük fel. Az oszlopot az A5B7 és a BP-RN-áz fölöslegének eltávolítása céljából C pufferoldattal mostuk, majd a konjugátumot 1 ml/perc sebességgel átbocsátóit 0,5 mólos

NaCl oldattal leoldottuk.

A kapott konjugátum tisztaságát SDS-PAGE-sel határoztuk meg. Összesen 5,75 mg konjugátumot kaptunk, ami (lézer —denzi tömet riás mérés alapján) 88,4 % konjugátumból és

11,6 % szabad derivatizált A5B7-ből állt.

··» ·

4. referencia-példa

Murin A5B7 F(ab')₂-bovin pankreasz-eredetű ribonukleáz konjugátum szintézise és elkülönítése

Az A5B7 F(ab')₂ derivatizálásához kapcsolóként SATA-t (S-acetil-tioglikolsav-N-hidroxi-szukcinimid-észter, a

Sigma cég A9043 katalógusszámú gyártmánya) használtunk.

A bovin pankreasz-eredetű ribonukleáz (BP-RN-áz) derivatizálásához kapcsolóként SMPB-t [ 4-(p-maleimido-fenil)-vajsav-N-hidroxi-szukcinimid-észter, a Sigma cég M6139 katalógusszámú gyártmánya] használtunk.

SATA-t (Sigma (DMSO-ban (Fisons) oldva 10 mg/ml koncentrációjú oldatot készítettünk. 18,20 mg F(ab')₂ fragmensből A pufferoldattal (100 mmól foszfát, 100 mmól NaCl, mmól EDTA, pH 7,2) 2,14 mg/ml koncentrációjú oldatot készítettünk, és 167 μg (16,7 μΐ) SATA oldatot (az A5B7 F(ab')₂-re vonatkoztatva négyszeres moláris fölösleg) adtunk hozzá. Az elegyet 40 percig szobahőmérsékleten állni hagytuk, majd az oldatot Amicon YM10^(R) membránon (letörési móltömeg: 100 000) 2,0 ml-re (9 mg/ml) betöményítettük. A reagensek fölöslegének eltávolítására az oldatot szobahőmérsékleten 50 ml Sephadex G25 géllel töltött 1,6 x 16 cm méretű oszlopon bocsátottuk át. Összesen 10 ml 1,04 mg/ml koncentrációjú derivatizált A5B7 F(ab')₂ oldatot kaptunk. A SATA-val derivatizált A5B7

F(ab')₂-höz dezacetilezés céljából 1,0 ml (10 térfogat %) pufferoldatot (500 mmól hidroxilamin-HCl, 500 mmól nátrium-foszfát, 30 mmól EDTA, pH 8,0) adtunk, és az elegyet 40 percig szobahőmérsékleten tartottuk. A fehérjetartalmat 280 nm-en végzett UV abszorbancia-méréssel (feltételezett e = 1,4) vagy Bradford Protein Assay felhasználásával határoztuk meg.

-42A kapcsolótag-sűrűséget Ellman-féle -SH elemzéssel határoztuk meg, és 1,2 kapcsolótag/mól F(ab')₂~nek találtuk.

BP-RN-ázt 2,0 ml B pufferoldatban (100 mmól nátrium-foszfát, 100 mmól NaCl, pH 7,2) újra szuszpendálva 7,50 mg/ml koncentrációjú szuszpenziót készítettünk.

SMPB-t (Sigma) DMSO-ban (Fisons) oldva 10 mg/ml koncentrációjú oldatot készítettünk. 15 mg BP-RN-ázt tartalmazó oldathoz 1949 mg (1,95 ml) SMPB oldatot (a BP-RN-ázra vonatkoztatva ötszörös moláris fölösleg) kevertünk, és az elegyet 120 percig szobahőmérsékleten állni hagytuk. A reagensek fölöslegét gélpermeációs kromatográfiával (50 ml Sephadex G25 géllel töltött, 1,6x16 cm méretű oszlopot használva) eltávolítottuk. A derivatizált fehérje koncentrációját 280 nm-en végzett UV abszorbancia-méréssel (feltételezett e =

0,6) határoztuk meg. A kapcsolótag-sűrűséget fordított Ellman-féle elemzéssel határoztuk meg úgy, hogy a maleimido-derivatizált BP-RN-ázhoz ismertmennyiségű 2-merkapto-etanolt adtunk, és mértük a reagálatlan -SH csoportok mennyiségét.

A konjugálást úgy végeztük, hogy azonos tömegű dezacetilezett derivatizált A5B7 F(ab')₂-t és derivatizált BP-RN-ázt mértünk össze, az elegyet ionmentes vízzel 1,0 mg/ml koncentrációra hígítottuk, és nitrogén atmoszférában kevertük. A reakciót szobahőmérsékleten 20 órán át folytattuk, majd 1 mg/ml koncentrációjú vizes glicin oldat beadagolásával leállítottuk.

A nyers konjugátumot puffer-csere céljából C pufferoldatba (50 mmól Trisz, pH 8,0) dializáltuk. 5 ml (6,5 mg) így kapott oldatot C pufferoldattal egyensúlyba hozott Mono Q HR5/5^<r> oszlopra (Pharmacia) vittünk fel. Az oszlopot az

-43• ·· «

Α5Β7 F(ab')₂ fölöslegének eltávolítása céljából C pufferoldattal mostuk, majd a konjugátumot és a BP-RN-áz maradékát 1 ml/perc sebességgel átbocsátott sóoldat-gradienssel (0-1,0 mól, az oszlop térfogatának 20-szorosa) eluáltuk. A konjugátum és a maradék enzim szétválasztása végett a konjugátumot tartalmazó frakciókat egyesítettük, 60 ml S200 GPC^(R> géllel (Pharmacia) töltött oszlopra vittük fel, és 1 ml/perc sebességgel vezetett foszfáttal pufferolt sóoldattal eluáltuk.

A kapott konjugátum tisztaságát SDS-PAGE-sel határoztuk meg. Összesen 0,70 mg konjugátumot kaptunk, ami (lézer-denzitometriás mérés alapján) 99,5 % konjugátumot és 4,5 % szabad derivatizált A5B7 F(ab’)₂-t tartalmazott.

A murin A5B7 F(ab')₂ fragmenst az 5. referencia-példában leírt eljárással vagy a következő módon állítottuk elő:

780 ml 5,4 mg/ml koncentrációjú A5B7 antitest oldatot (lásd a 3. referencia-példát) 130 kilodalton szűrési határú membránnal felszerelt spirálbetétes Amicon CH₂ készülékben 7 térfogatrész pufferoldattal (0,1 mól nátrium-foszfát, 3 mmól EDTA, pH 6,4) szemben diaszűrve emésztésre előkészítettünk. A kapott anyagot (280 nm-en végzett ABS szerint 3682 mg) 0,22 μΜ-ra szűrtük, és felhasználásig 4°C-on tároltuk. 9 ml 10 mg/ml koncentrációjú kristályos papain szuszpenziót (a Boehringer Mannheim cég 1080140 katalógusszámú gyártmánya) 100 mmól L-ciszteint tartalmazó pufferoldattal (0,1 mól nátrium-foszfát, 3 mmól EDTA, pH 6,4) kevertünk össze, és az elegyet 30 percig 37°C-on tartottuk. Ezután a cisztein fölöslegét méretkizárásos kromatografálással eltávolítottuk [ ehhez 2,6 cm átmérőjű, 30 cm hosszú, kb. 160 ml össztérfoga-44ÍR 1 tú Pharmacia G25M oszlopot használtunk, amin 3 ml/perc sebességgel pufferoldatot (0,1 mól nátrium-foszfát, 3 mmól

EDTA, pH 6,4) bocsátottunk át] . Az effluenst 1 percenként frakciókra bontottuk, és a frakciókat 280 nm-en végzett optikai sűrűség-méréssel és egyszerű DTNB foltvizsgálattal szabad cisztein jelenlétére vizsgáltuk. A redukált papaint tartalmazó, szabad cisztein-mentes frakciókat egyesítettük, és fehérjetartalmát 280 nm-en végzett optikai sűrűség-méréssel (feltételezett e = 2,5) vizsgáltuk. Összesen 332,8 ml 1,65 mg/ml koncentrációjú oldatot (tehát összesen 54 mg fehérjét) kaptunk. Az emésztést 37°C-on végeztük, a redukált papaint és az A5B7-et 1:60 tömegarányban használva. A teljes rendelkezésre álló papain-mennyiséget és 655 ml antitest oldatot használtunk, a becsült fehérje-koncentráció 4,9 mg/ml volt. 20 óra elteltével a reakciót az elegy térfogatának tizedét kitevő térfogatú, 50 %-os etanollal készített 100 mmólos N-etil-maleimid oldat beadagolásával leállítottuk. A F(ab')₂ ^-t 400 ml Protein A Sepharose FF géllel (Pharmacia) töltött, 5 cm x 20 cm méretű oszlopon választottuk el a Fc-től és a nyomnyi mennyiségű emésztetlen antitesttől. Az oszlopot előzetesen pufferoldattal (25 mmól nátrium-foszfát, 150 mmól nátrium-klorid, pH 7,33) hoztuk egyensúlyba; a kezelést addig folytattuk, amíg az effluens pH-ja és vezetőképessége meg nem felelt a kezelő pufferoldaténak (19,7 mS 15°C-on). Az emésztéskor kapott nyers elegyet 1:1 térfogatarányban hígítottuk az oszlop kezelésére használt pufferoldattal, majd két (660 ml és 840 ml térfogatú) részre osztottuk, és az egyes oldatrészleteket 6,5 ml/perc sebességgel (lineáris áramlási sebesség: 0,33 ml/cm /perc) vittük fel a Protein A oszlopra. Az efflu• ·· *

-45enst 10 ml-es frakciókba gyűjtöttük. A tisztítandó oldat felvitele után az oszlopot az egyensúlyba hozáshoz felhasznált pufferoldattal mostuk mindaddig, amíg a 280 nm-en mért abszorbancia meg nem közelítette az alapvonalat. Ezután az oszlopot a megadott sorrendben a következő pufferoldatokkal mostuk: 50 mmólos nátrium-acetát puffer (pH 4,0), 50 mmólos nátrium-acetát puffer (pH 4,0), 50 mmólos citromsav-puffer (pH 3,5), 50 mmólos citromsav-puffér (pH 2,8). A mosás során 280 nm-en mértük a minták optikai sűrűségét, és az elkülönített frakciókat 30 percen belül 0,4 mólos dinátrium-hidrogén-ortofoszfát oldattal semlegesítettük. A frakciók mintáit SDS(R)

-PAGE-sel elemeztük (Coomassie-vel festett Pharmacia Excel gélt használtunk). A F(ab')₂ a 4,0 pH-jú pufferoldattal oldódott le, az emésztetlen A5B7 pedig a legkisebb pH-értékű effluensekben jelentkezett. A F(ab')₂-t tartalmazó frakciókat egyesítettük, és 30 kilodaltonos Amicon CH2 membránt és 7 térfogatrész diaszűrő közeget használva pufferoldatba (100 mmól nátrium-foszfát, 100 mmól nátrium-klorid, 1 mmól EDTA, pH 7,2) diaszűrtük. Összesen 845 mg F(ab')₂-t kaptunk 2 mg/ml koncentrációjú oldat formájában.

5. referencia-példa

Rekombináns murin A5B7 F(ab')₂ előállítása mielóma sej tekben

Ebben a példában a cDNS A5B7 hibridómából való előállítását, a specifikus Fd és L láncfragmensek PCR-val való elkülönítését, a fragmensek teljes DNS szekvenciájának meghatározását, a mielóma-sejtekben való ezt követő együttes kifejezést (azaz rekombináns F(ab’)₂ fragmens-képzést), a mieló-46» » *· - * b « ·« · « « ··♦ · • · « « · é · · ma-sejtek fermentálását, és a rekombináns F(ab')₂ fehérje tisztítását ismertetjük.

Genetikailag tervezett antitestek mielóma-sejtekben való termelésére a szakirodalom számos módszert ismertet [lásd például: Neuberger és munkatársai: Natúré 312, 604-608 (1984), Williams és Neuberger: Gene 43, 319-324 (1986),

Wright és Shin: Methods 2^, 125-135 (1991), Traunecker: Trends in Biotechnology % 109-113 (1991) és Bebbington és munkatársai: Bio/Technology Π), 169-175 (1992)] . Ebben a példában lényegében a Bebbington és munkatársai által leírt, szelektív markerként glutamin szintetáz (GS) gént alkalmazó eljárást követjük.

a) mRNS előállítása hibridóma sejtekből:

Számos eljárásmód ismert poliA + mRNS eukarióta sejtekből való elkülönítésére [ Sambrook J., Fritsch E.F.,

Maniatis T.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold

Spring Harbor Laboratory Press, 2. kiadás, 1989, 8. fejezet

3. oldal; a továbbiakban: Maniatis] . Az ott ismertetett egyik eljárás - amelynek reagenskészletét a Pharmacia cég fórgalmazza - viszonylag kevés (10 vagy kevesebb) sejt lízisén, majd a poliA + mRNS oligo dT oszlophoz való kötésén alapul. A nemkívánt sejtkomponenseket kis sótartalmú oldattal lemossák, majd a mRNS-t nagy sótartalmú oldattal, megnövelt hőmérsékleten eluálják.

10⁷ A5B7 hibridóma sejtből kiindulva Quickprep^IRi mRNS készlet (a Pharmacia Biotechnology Ltd. cég gyártmánya) felhasználásával mRNS-t készítettünk. A mRNS koncentrációjának becslésére a termék mintáját Uvikon 930 spektrofotométeren (a Kontron Instruments cég gyártmánya) a 300-220 nm

-47tartományban pásztáztuk, faktorként 260 nm-en 40 gg/ml/optikai sűrűség-egységet használtunk. A mRNS-t etanolban kicsapva

2,5 μg tömegű alikvotok formájában tároltuk.

b) cDNS szintézis:

A cDNS szintézisére Gubler és Hofman módszerét használtuk, amelynek alapja a primerrel ellátott mRNS-ről történő reverz transzkripció, az ezt követő kezelés RNS-áz H-val primerképzés céljából, és a második szél szintézise DNS polimeráz I-el. A cDNS szintézisének más módszereit az idézett Maniatis szakkönyv 8. fejezete ismerteti.

gg mRNS, 0,5 gg oligo dT (12-18 tagszámú oligomerek elegye, gyártja a Pharmacia Biotechnology Ltd.) és 2,5 egység placenta-eredetű RNS-áz inhibitor (gyártja a Life

Technologies Ltd.) 10 μΐ RNS-áz-mentes vízzel készített oldatát 70°C-on inkubáltuk, majd jéggel lehűtöttük. Ezután az első cDNS-szál szintézisére az elegyhez 4 μΐ 5x H-RT pufferoldatot [összetétele: 250 mmól Trisz (pH 8,3), 200 mmól KC1, 30 mmól MgCl₂ és 0,5 mg/ml bovin szérum albumin] , 2 μΐ 0,1 mólos

DTT (ditio-treit) oldatot, 1 μΐ dNTP elegyet (dATP, dCTP, dGTP és dTTP 20 mmólos oldata) és 4 μΐ Superscript^<R) reverz transzkriptáz oldatot (gyártja a Life Technologies Ltd.) adtunk, és az elegyet 1 órán át 42°C-on inkubáltuk. A második szál kialakítására az elegyhez 1,5 μΐ fenti összetételű dNTP elegyet, 92,5 μΐ RNS-áz-mentes vizet, 30 μΐ 5x-ös pufferoldatot [összetétele: 125 mmól Trisz (pH 7,5), 500 mmól KCl, 25 mmól MgCl₂, 50 mmól (NH₄)₂SO₄ és 0,5 mg/ml β-NAD] , 1 μΐ T4

DNS-ligázt (10 egység, gyártja a Life Technologies Ltd), 4 μΐ

-48DNS polimeráz I-et (40 egység, gyártja a Life Technologies

Ltd.) és 1 μΐ RNS-áz-H-t (2,7 egység, gyártja a Life Technologies Ltd.) adtunk, és az inkubálást 2 napig 16°C-on folytattuk. Ezután az elegyhez 2 μΐ T4 DNS polimerázt (10 egység, gyártja a Life Technologies Ltd.) adtunk, és 5 percig 16°C-on inkubáltuk annak érdekében, hogy tompavégű cDNS képződjön.

Ezt követően 10 percig 70°C-on való inkubálással leállítottuk az enzimek működését.

c) Antitest génfragmensek elkülönítése PCR technikával :

Az A5B7 Fd és L láncfragmensének elkülönítésére templátként a fenti cDNS-t használtuk. Az Fd fragmens közvetlenül a csuklószekvencia (C-terminális treonin) után zárult le. Ezt a továbbiakban proteolitikus típusú Fd-nek nevezzük.

A proteolitikus Fd megjelölésen ebben a példában olyan rekombináns Fd-t értünk, amely ekvivalens a 4. referencia-példában leírtak szerint proteolitikusan termelt Fd-vel.

Templátként mind az első cDNS-szál kialakításakor, mind pedig a második szál kialakítása után kapott anyagot felhasználhatjuk. Az anyagot önmagában vagy kétszer desztillált vízzel legföljebb 1:100 arányban hígított formában használhatjuk. Az Fd és L láncfragmensek képzéséhez a szekvencia-jegyzékben szereplő 17-24. szekvenciának megfelelő szekvenciájú oligonukleonukleotidokat használtuk. Mindegyik antitest fragmens esetén az 5' régió oligonukleotidja (az Fd fragmens esetén a 17. szekvenciának, az L fragmens esetén a 18. szekvenciának megfelelő oligonukleotid) egy-egy, restrikciós enzimmel hasítható helyet (az Fd fragmens esetén HindlII, az L lánc esetén EcoRI helyet) , a transzláció iniciálásának maxi····

malizálására egy konszenzus Kozák szekvenciát (GCCGCCACC) és a természetes murin szignál szekvencia egy részét kódolta. A proteolitikus típusú Fd fragmens esetén a 3' régió oligonukleotidja (szekvenciája a 19. szekvenciának felel meg) az antitest csuklótartományának 3' végével komplementer volt, tandem transzláció-terminátor kodonok (TAG és TAA) közvetlenül a csukló utáni beépítésére alkalmas mutációkat kódolt, és ezen a szekvencián tói egy EcoRI restrikciós enzimmel hasítható helyet tartalmazott. Az L lánc 3' régióját a kódoló régió végével komplementer oligonukleotid (szekvenciája a 20. szekvenciának felel meg) határozta meg, ami egy további transzláció-terminátor kodont (TAA) és egy EcoRI restrikciós helyet iktatott be. Ezen kívül mindegyik fragmenshez egy egy részlegesen átfedő és komplementer oligonukleotid-párt (az Fd fragmenshez a 210. és 22. szekvenciának megfelelő szekvenciájú, az L lánchoz a 23. és 24. szekvenciának megfelelő szekvenciájú oligonukleotidot) használtunk annak érdekében, hogy mindkét DNS láncba csendes mutációkat vezessünk be. A csendes mutációk az Fd fragmens esetén a CHl-ről egy BamHI hely, az L lánc esetén pedig a VL eltávolítását eredményezték, a kódolt aminosav-szekvencia megváltozása nélkül. Mindegyik 5' és 3' oligonukleotidot a megfelelő mutagén oligonukleotiddal használtuk, és így mindegyik antitest-lánc 2-2 mutáns fragmensét alakítottuk ki. Tisztítás után a 2-2 fragmenst azonos arányban összekevertük, és a keverékeket templátokként használtuk egy második PCR reakcióban az 5' és 3' régió adott oligonukleotidjaival együtt. Ezen reakciók termékeiként kaptuk a teljes hosszúságú, belső BamHI helyeket nem tartalmazó Fd és L láncfragmenseket.

-50···· · ·· · ···· ···· ··· · • · · · · · • · ··· * · ·· ·

Általában úgy jártunk el, hogy 100 μΐ reakcióelegyhez [összetétele: 10 mmól Trisz-HCl (pH 8,3), 50 mmól KCl,

0,1 % zselatin, 1,5 mmól MgCl₂, egyenként 1,25 mmól dATP, dCTP, dGTP és dTTP, egyenként 1 pmól megfelelő oligonukleotid-pár és 2,5 egység Taq DNS polimeráz (Amplitaq, gyártja a Perkin-Elmer Cetus cég)] 5 μΐ cDNS-t adtunk. Az egyes reakcióelegyekre 100-100 μΐ ásványolajat rétegeztünk, és 25 ciklusban 1,5 percig 94°C-on, 1,0 percig 50 vagy 55°C-on és 2,0 percig 72°C-on inkubáltuk, végül 10 percig 72°C-on inkubáltuk. Kontrollként ugyanezeket a reakciókat DNS nélkül is elvégeztük .

A PCR technikával kapott elegyek elemzése céljából mindegyik elegyből 5-5 μΐ térfogatú mintát vettünk, a mintákat 0,8 %-os agaróz gélen (gyártja a Sigma Chemica Company

Ltd.) futtattuk, majd a gélt 1 pg/ml koncentrációjú etidium-bromid oldattal (gyártja a BDH Laboratory Suppliers) megfestettük, és a géltt UV fénnyel átvilágítva láthatóvá tettük a

DNS-eket. A PCR technikával kapott összes reakcióelegy esetén megjelentek az A5B7 cDNS-re jellemző sávok, jelezve, hogy az

Fd és L láncfragmensek megtöbbszörözése sikerrel járt. A kontroll elegyekben a DNS sáv hiánya azt igazolta, hogy a felhasznált reagensek nem tartalmaztak szennyező DNS-t.

A PCR technikával kapott összes reakcióelegyet

Centricon 100 mikrokoncentrátoron (gyártja az Amicon Ltd.) tisztítottuk. Az elegyeket betöltöttük a koncentrátorba, és térfogatukat kétszer desztillált vízzel 2 ml-re egészítettük ki. Az egységet H1000B rotorral ellátott Sorval RT6000B^(R| padkatetős centrifugán 500 g gyorsuláson 5 percig centrifua · · ·

-51gáltuk, és az áteresztett anyagot elöntöttük. A maradékot újból 2 ml végtérfogatra hígítottuk, és a centrifugálást megismételtük. Ezt a műveletet még egyszer megismételtük. Ezzel az eljárással a megtöbbszörözött DNS-ből eltávolítottuk az oligonukleotidok fölöslegét és a puffer-komponenseket. Az így tisztított DNS-eket közvetlenül felhasználtuk további PCR reakciókban. A megfelelő fragmenspárokat azonos arányban összekevertük, és ezek alikvotjait használtuk a további PCR reakciókban a megfelelő 5' és 3' oligonukleotidokkal együtt.

d) A PCR-val kialakított fragmensek szubklónozása (R) pBluescriptba

A második PCR reakciósorozatban kapott elegyek futtatásos elemzésekor két, körülbelül 775 bp és 730 bp méretű

DNS láncot észleltünk, amelyek megfeleltek a teljes hosszúságú Fd, illetve L láncnak. Ezeket a termékeket a fent közöltek szerint Centricon 100 mikrokoncentrátoron tisztítottuk.

Mindkét kapott DNS-terméket 1,5 ml oldatban (összetétele: 50 μΐ 3 mólos nátrium-acetát oldat desztillált vízzel 500 μΐ-re hígítva + 1 ml abszolút etanol) kicsaptuk. Az oldatot legalább 10 percig jégen tartottuk, majd MSE MicroCentaur^<R) centrifugán 10 percig 11 600 g gyorsuláson centrifugáltuk. A felülúszót elöntöttük, és a pelletet mosás céljából 1 ml 70 térfogat %-os desztillált vizes etanollal elegyítettük és 5 percig tovább centrifugáltuk. A felülúszót elöntöttük, és a

DNS pelletet csökkentett nyomáson szárítottuk. Ezután az egyedi DNS pelleteket desztillált vízben újra szuszpendáltuk.

A PCR-val előállított Fd terméket 200 μΐ reakcióelegyben [ összetétele: 20 mmól Trisz-acetát (pH 7,9), 10 mmól magnézium-acetát, 50 mmól kálium-acetát, 1 mmól ditio-treit (DTT) és

-5225-25 egység Hindin és EcoRI (gyártja a Promega Corporation)] EcoRI-gyel és HindlII-mal emésztettük. Az L lánc-terméket 30 μΐ reakcióelegyben [összetétele: 90 mmól Trisz-HCl (pH 7,5), 10 mmól magnézium-klorid, 50 mmól nátrium-klorid és 10 egység EcoRI] EcoRI-gyei emésztettük. Az elegyeket 1 órán át 37°C-on inkubáltuk.

(R)

Az emésztett fragmenseket 0,75 %-os SeaPlaque GTG agaróz gélen (gyártja a FCM BioProducts Ltd.) elektroforézissel tisztítottuk, majd a kívánt termékeket tartalmazó gélszeleteket kivágtuk. Az agaróz gélszeleteket 2 percig 65°C-on inkubálva leoldottuk a termékeket, az oldat térfogatát desztillált vízzel 450 μΐ -re egészítettük ki, és 50 μΐ 3 mólos nátrium-acetát oldatot adtunk hozzá. Ezt az oldatot azonos térfogatú, Trisz-pufferrel (pH 7,6) egyensúlyba hozott elfolyósított fenollal (gyártja a Fisons Scientific Equipment) extraháltuk, és az elegyet a vizes és a fenolos fázis szétválasztása céljából MSE MicroCentaur centrifugán 2 percig 11 600 g gyorsuláson centrifugáltuk. A kapott vizes fázist 50:50 térfogatarányú fenol/kloroform eleggyel, ezután kloroformmal extraháltuk, majd a terméket a fentiekben közöltek szerint etanolba kicsaptuk. Az egyes tisztított pelleteket 10-10 μΐ desztillált vízben újra szuszpendáltuk, és a termék minőségének és koncentrációjának megállapítása céljából a szuszpenziók 1-1 μΐ-es mintáját 0,8 %-os agaróz gélen elektroforézisnek vetettük alá.

Az Fd és L láncok cDNS-einek kezdeti klónozására (R) pBluescriptet használtunk. Ez a fagemid vektor egyedülálló

EcoRI és HindlII klónozó helyeket, ampicillin rezisztencia-53gént, és mind ColEI, mind fi replikációs origót tartalmaz, tehát kettősszálú és egyszálú DNS kialakítására egyaránt alkalmas. 5 μg pBluescript KS-DNS-t 100 μΐ reakcióelegyben [összetétele: 90 mmól Trisz-HCl (pH 7,5), 10 mmól MgCl₂, 50 mmól NaCl] 30 egység EcoRI-gyel (gyártja a Promega Corporation) 1 órán át 37°C-on kezelve teljességig emésztettünk, vagy 1 00 μΐ reakcióelegyben [összetétele: 20 mmól Trisz-acetát (pH 7,9), 10 mmól magnézium-acetát, 50 mmól kálium-acetát, 1 mmól ditio-treit (DTT) és 25-25 egység EcoRI és HindlII (gyártja a Promega Corporation)] 1 órán át 37°C-on tartva EcoRI-gyel és HindlII-mal teljességig emésztettünk. Az

EcoRI-gyel emésztett plazmidhoz az 5' helyzetű foszfátcsoportok eltávolítása céljából 2 μΐ borjúbél-eredetű lúgos foszfatázt (2 egység, Boehringer Mannheim-gyártmány) adtunk, és az elegyet további 30 percig 37°C-on inkubáltuk. Ezután az elegyet a foszfatáz-aktivitás megszüntetésére 10 percig 70°C-on inkubáltuk. Az EcoRI-gyel és HindlII-mal hasított plazmidot a fent közöltek szerint SeaPlaque GTG agaróz gélen tisztítottuk

25-50 ng emésztett Fd vagy L-láncú PCR terméket 10 μΐ oldatban [ összetétele: 30 mmól Trisz-HCl (pH 7,8), 10 mmól

MgCl₂, 10 mmól DTT, 1 mmól ATP és 1,5 egység T4 DNS ligáz (gyártja a Promega Corporation)] 50 ng, előzetesen EcoRI-HindlI-vel vagy EcoRI/CIP-pel kezelt pBluescript-hez ligáltunk. A reakciót 2,5 órán át 16°C-on végeztük. A kapott reakcióelegyek 1-1 μΐ-es alikvotjával 20-20 μΐ kompetens E. coli

DH5oc sejtet (forgalmazza a Life Technologies Ltd.) transzformáltunk a forgalmazó előírásai szerint. A transzformált sejteket 100 μg/ml ampicillint, 1 mmól IPTG-t és 0,2 % X-gal-t

-54tartalmazó L-agarra szélesztettük, és éjszakán át 37°C-on inkubáltuk. A klónozott inszerteket tartalmazó kiónokat azon az alapon különítettük el, hogy ezek - a szülő-plazmidot tartalmazó sejtek kék színével ellentétben - az adott közegen fehér telepeket képeznek.

e) A cDNS kiónok DNS szekvencia-analízise:

A színük alapján azonosított potenciális Fd és L-láncú cDNS kiónokat kiemeltük az agarlemezekből, és nagyléptékű plazmid DNS előállítására használtuk. 500 ml űrtartalmú

Erlenmeyer lombikokba 200-200 ml 10 μg/ml ampicillint is tartalmazó L-táptalajt töltöttünk, és minden lombikot egy-egy kiónnal oltottunk be. A tenyészeteket rázatás közben éjszakán át 37°C-on inkubáltuk. A növekedés után az egyes tenyészeteket GS3 rotorral felszerelt Sorvall RC5C centrifugán 4°C-on 10 percig 5000 g gyorsuláson centrifugálva pelleteztük a sejteket. Az egyes tenyészetekből kapott sejtpelleteket 20-20 ml

TE pufferoldatban újra szuszpendáltuk, és bordás centrifugacsövekbe töltve SS-34 rotorral felszerelt Sorvall RC5C centrifugán 4°C-on 10 percig 2000 g gyorsulással centrifugáltuk.

Az egyes mosott pelleteket 3 ml jéghideg 25 %-os szacharóz oldatban [ 50 mmól Trisz-t (pH 8,0) is tartalmaz] újra szuszpendáltuk, és jégen tartottuk. A szuszpenziókhoz 1,0-1,0 ml 10 mg/ml koncentrációjú friss lizozim oldatot adtunk, az egyes centrifugacsövek tartalmát a csövek görgetésével összekevertük, és még 5 percig jégen inkubáltuk. Ezután a csövekbe 1,0-1,0 ml 0,5 mmólos etilén-diamin-tetraecetsav nátriumsó (EDTA) oldatot (pH 8,5) juttattunk, és a csövek tartalmát finoman összekevertük. Végül a csövekbe 5,0-5,0 ml jegelt Triton XM^(R) oldatot [ összetétele: 0,1 % Triton X-100, 62,5 mmól

-55EDTA, 50 mmmól Trisz (pH 8,0)] juttattunk, a csövek tartalmát finoman összekevertük, és még 10 percig jégen inkubáltuk. Ezután az elegyeket SS-34 rotorral felszerelt Sorvall RC5C centrifugán 4°C-on 30 percig 39 000 g gyorsulással centrifugálva pellet formájában eltávolitottuk a sejttörmeléket. A plazmid DNS-t tartalmazó felülúszót 16 g cézium-klorid (Boehringer Mannheim-gyártmány) és 150 μΐ 10 mg/ml koncentrációjú etidium-bromid oldat elegyéhez adtuk, és a kapott elegy térfogatát TE pufferoldattal 18,5 ml-re egészítettük ki. A kapott oldatot 18,5 ml űrtartalmú hullámtetós polietilén centrifugacsőbe (Sorvall Instruments-gyártmány) töltöttük. A centrifugacsövet lezártuk, és TV865B (titán, függőleges) rotorral felszerelt Sorvall OTD65B centrifugán 18°C-on 16 órán át 180 000 g gyorsulással centrifugáltuk.

Centrifugálás után a plazmid DNS a kialakult

CsCl/EtBR sűrűség-gradiensben különálló narancsszínű sávként jelent meg. A plazmid DNS-t a csőfalon átszúrt hipodermális fecskendővel különítettük el a gradiensből. A gradiensből vett mintát TE pufferoldattal 3-4-szeresére hígítottuk, és az elegyhez azonos térfogatú izopropanolt adva, majd 10 percig jégen inkubálva kicsaptuk a DNS-t. A kicsapott DNS-t SS-34 rotorral felszerelt Sorvall RC5C centrifugán 4°C-on 17 000 g gyorsulással centrifugálva pelleteztük, és a felülúszót elöntöttük. A kapott pelletet 70 térfogat %-os etanollal mostuk, és 5 percig újra centrifugáltuk. Ezután a pelletet csökkentett nyomáson megszárítottuk, 1,8 ml TE pufferoldat és 200 μΐ mólos nátrium-acetát oldat elegyében újra szuszpendáltuk, és azonos térfogatú fenollal extraháltuk. A fázisokat 17 000 g gyorsuláson 2 percig végzett centrifugálással választottuk

-56el egymástól. A vizes fázist azonos térfogatú kloroformmal újra extraháltuk, majd -20°C-on azonos térfogatú etanolt hozzáadva és 10 percig jégen inkubálva kicsaptuk a DNS-t. A tisztított DNS-t a fent közölt módon pelleteztük, 5 ml 70 %-os etanollal mostuk, és a pelletet csökkentett nyomáson szárítottuk. A szárított pelletet 500 μΐ kétszer desztillált vízben újra szuszpendáltuk, és a DNS-tartalom becslésére a termék hígított mintáját UV spektrofotométeren a 300-220 nm tartományban pásztáztuk, extinkciós koefficiensként 260 nm-en μg/ml/optikai sűrűség-egységet figyelembe véve. Megjegyezzük, hogy plazmid DNS-ek tisztítására számos kereskedelmi forgalomban lévő reagenskészlet (például a Hybaid Ltd. Qiagén nevű gyártmánya) is felhasználható.

DNS szekvencia-analízishez ezt a tisztított plazmid DNS-t használtuk. A kettősszálú DNS szekvenálását Sanger didezoxi-láncletöréses módszerével [ Proc. Nat. Acad. Sci. USA

74, 5463 (1977)] , kereskedelemben kapható szekvenáló reagenskészlet (például a United States Biochemical Company Sequenase nevű terméke) felhasználásával végeztük, a forgalmazó utasításai szerint.

A DNS szekvencia-analízishez az Fd, illetve L-láncú cDNS kiónt tartalmazó plazmid DNS 2-4 μg-os alikvotjait használtuk. Az egyes alikvotokat 100 μΐ végtérfogatú elegyben (összetétele: 0,2 mól NaOH, 0,2 mmól EDTA) 10 percig szobahőmérsékleten tartva denaturáltuk. A denaturált DNS-t 10 μΐ 3 mólos nátrium-acetát oldat (pH 5,0) és 275 μΐ etanol hozzáadásával és jégen való 10 perces inkubálással kicsaptuk. A kicsapott DNS-t a plazmid DNS-nél fent közöltek szerint különí-

tettük el. Ezután a denaturált DNS-eket szekvenálás céljára 10 % DMSO-t tartalmazó 10 μΐ Sequenase^(R) pufferoldatban [ öszszetétele: 40 mmól Trisz (pH 7,5), 25 mmól MgCl₂, 50 mmól NaCl] 0,5-0,5 pmól megfelelő primer jelenlétében 2 percig 65 °C-on inkubáltuk, majd fokozatosan 30°C alatti hőmérsékletre hűtöttük. Az így kapott, prímért tartalmazó templátokat használtuk fel a szekvenálási reakciókban a reagenskészlet forgalmazójának előírásai szerint, azzal az eltéréssel, hogy a jelző és a termináló elegyekhez 10 % DMSO-t is adtunk.

A szekvenálási reakciók termékeit 6 % poli(akril-amid):8 mól karbamid összetételű denaturáló gélen végzett nagy felbontású elektroforézis után autoradiográfiával elemeztük [ Sanger és Coulson: FEBS Lett. 87, 107 (1978)] .

A klónozott cDNS-ek teljes Fd és L láncának szekvenciáját a szekvencia-jegyzékben közöljük (a 25. sz. szekvencia a proteolitikus típusú Fd lánc, a 26. sz. szekvencia az L lánc szekvenciája). A proteolitikus típusú Fd-t tartalmazó plazmidot pAFl-el, az L láncot tartalmazót pedig pAF3-mal jelöltük. Mindkét fragmensben igazoltuk a BamHI hely hiányát eredményező csendes mutáció fennállását. A DNS szekvenciát ismert DNS szekvenciák konstans régióira vonatkozó adatokkal [Kábát E.A., Wu, T.T., Bilofsky, H., Reid-Milner M., Perry H.: Sequences of Proteins of Immunological Interest

4. kiadás (Public Health Service N.I.H., Washington DC,

1987)] egybevetve megállapítható, hogy az antitest egy IgGl κ izotípus.

f) Szubklónozás mielóma kifejező vektorokba:

Az Fd és L lánc mielóma sejtekben való együttes kifejezésére alkalmas vektorok képzésére a GS-System rend-58szert (gyártja: Celltech Biologics) használtuk (lásd a WO 87/04462, WO 89/01036, WO 86/05807 és WO 89/10404 sz. nemzetközi közzétételi iratot).

Az eljárás lényege a következő: az Fd láncot pEE6 vektor [a pEE6.hCMV vektor (Stephens és Cockett: Nucleic Acids Research Ί_, 7110 /1989/) olyan származéka, amelyben a hCMV promotortól felfelé lévő HindlII hely BglII hellyé van alakítva] HindlII-EcoRI régiójába, az L láncot pedig a pEE12 vektor [a Bebbington és munkatársai (Bio/Technology 10, 169-175 /1992/) által leírt pSV2.GS vektorhoz hasonló olyan vektor, amiben az eredetileg jelenlévő restrikciós helyek egy részét helyirányított mutagenezissel eltávolítva a multikapcsoló tartományban egyedi helyeket alakítottak ki] EcoRI helyébe klónozzuk. Ezután a pEE6-ból egy BglII-BamHI Fd kifejező kazettát a pEE12 vektor BamHI régiójába illesztünk. Más megoldás szerint az Fd kifejező kazettát tartalmazó BglII-Sall fragmenst az L láncot tartamazó pEE12 plazmid BamHI-Sall régiójába illeszthetjük.

Az egyedi vektorok (a proteolitikus Fd-t tartalmazó pEE6 és az L láncot tartalmazó PEE12) kialakítására a pAFl és pEE6 plazmidot a fent közöltek szerint EcoRI-gyel és HindlII-mal, a pAF3 és pEE12 plazmidot pedig EcoRI-gyel emésztettük.

Ezután az emésztett termékekből Seaplaque GTG agarózon elkülönítettük az egyedi vektor és inszert fragmenseket, majd egymáshoz ligáltuk, és a fent közöltek szerint kompetens DH5oc sejtek transzformálására használtuk. A transzformált sejteket

100 μρ/πιΐ ampicillint tartalmazó L agarra szélesztettük. A transzformánsok telepeit PCR technikával szűrtük. A telepe-59ket 200 μΐ desztillált vízbe helyeztük, és az elegyet Vortex keverővei összekevertük. Ezután a szuszpendált sejteket 1 percig 100°C-on tartottuk, majd 2 percig 11 600 g gyorsuláson centrifugáltuk. Az így kapott felülúszót használtuk fel a PCR reakciókban. Az egyes PCR reakciókban a CMV promotoron belül primelő oligonukleotidot (szekvenciája a 27. szekvenciának felel meg) használtunk, az Fd 3' régiójával komplementer oligonukleotiddal (szekvenciája a 19. szekvenciának felel meg) vagy az L lánc 3’ régiójával komplementer oligonukleotiddal (szekvenciája a 20. szekvenciának felel meg) együtt. Mindkét esetben csak azokból a klónokból képződnek specifikus, mintegy 2,0 kbp méretű PCR termékek, amelyek az antitest fragmens gént a CMV promotortól lefelé nyúló kifejezési irányban tartalmazzák. Az egyes PCR reakciókhoz 20 μΐ térfogatú elegyeket [összetételük: 20 pmól 27. szekvenciájú oligonukleotid, 20 pmól 19. vagy 20. szekvenciájú oligonukleotid, 10 mmól Trisz-HCl (pH 8,3), 50 mmól KC1, 0,1 % zselatin, 1,5 mmól MgCl₂, 1,25-1,25 mmól dATP, dCTP, dGTP és dTTP és 0,5 egység Taq DNS polimeráz (Amplitaq , Perkin-Elmer Cetus gyártmány)] állítottunk össze, amelyekre 20-20 μΐ ásványolajat rétegeztünk, és 25 ciklusban 1,5 percig 94°C-on, 1,0 percig 50°C-on és 2,0 percig 72°C-on, végül 10 percig 72°C-on inkubáltuk. Kontroli-reakciókat is végeztünk, amelyekben az alap-plazmidot használtuk, és a reakcióelegyhez nem adtunk DNS-t. A PCR reakciók termékeit agaróz gélen végzett elektroforézissel elemeztük, és a potenciális kiónokat a 2,0 kbp méretű termék jelenléte alapján azonosítottuk. A nagyléptékű plazmád DNS előállításához ezeket a potenciális kiónokat

-60használtuk, és EcoRI-HindlII vagy EcoRI restrikciós enzimmel való emésztés alapján jellemeztük. Az inszert szekvenciáját a fent ismertetett DNS szekvencia-analízissel határoztuk meg.

Az izolátumokat pAF4-gyel (proteolitikus típusú Fd-t tartalmazó pEE6) és pAF6-tal (L láncot tartalmazó pEE12) jelöltük.

A ko-expresszáló vektorok kialakítására 5-7,5 pg Fd plazmád pAF4-et 50 mmól trisz-HCl-t (pH 7,9), 10 mmól magnézium-kloridot, 150 mmól nátrium-kloridot és 1 mmól DTT-t tartalmazó oldatban 1 órán át 37°C-on 30-30 egység BglII-mal (Pharmacia gyártmány) és BamHI-gyel (New England Biolabs gyártmány) emésztettünk. Az emésztés lezajlását agaróz gélen végzett elektroforézissel igazoltuk. 5 μg L lánc plazmád pAF6-ot a fenti összetételű oldatban 1 órán át 37°C-on 25 egység BamHI-gyel (New England Biolabs gyártmány) emésztettünk. Ezután a DNS-t 2 egység CIP jelenlétében 40 percig 37 °C-on inkubálva defoszforileztük, majd 10 μΐ Strataclean^(R) gyantával (gyártja a Stratagene Ltd.) háromszor extraháltuk. Az Fd kifejező kazetta fragmenst és a fő pAF6 plazmid sávot SeaPlaque GTG agaróz géleken tisztítottuk. A tisztított termékeket a megfelelő kombinációban ligáltuk, és az így kapott termékkel a fentiekben közöltek szerint kompetens DH5a sejteket transzformáltunk.

g) A ko-expresszáló vektorok azonosítása:

A fentiek szerint kapott transzformátumokból 100-100 telepet különítettünk el, és a telepeket kétszeres ismétlésben, 50-esével egy-egy 100 μg/ml ampicillint tartalmazó

L-agarlemezre helyezett, 9 cm átmérőjű nitrocellulóz korongra (Schleichter and Schull gyártmány) helyeztük. Egy harmadik,

«Μ ·* szűrő nélküli lemezsorozatra a kiválasztott telepek törzstenyészetének kialakítására kenetet vittünk fel. Éjszakán át 37 °C-on való inkubálás után a nitrocellulóz szűrőket leemeltük, és a baktériumsejteket Grunstein és Hugness módszerével (lásd: Maniatis, 1. fejezet 102. oldal) in situ lizáltuk. A szűrőket 3MM papírra (Whatman gyártmány) helyeztük, és 2 percig 10 %-os SDS oldatban, 5 percig 3 mólos NaOH + 1 mólos NaCl oldatban, majd kétszer 2 percig 1 mólos Trisz pufferoldatban (pH 6,8) áztattuk. A lizált sejteket tartalmazó szűrőket 20x SSC oldattal (összetétele: 3 mól NaCl +0,3 mól nátrium-citrát) megnedvesített 3MM papírra helyeztük, és crosslink működési módra beállított Spectrolinker XL készülékben (gyártja a Spectronics Corporation) 120 000 μόοηΐβ energiájú ultraibolya fénnyel besugározva a DNS-t keresztkötésekkel a szűrőkhöz kapcsoltuk. A szűrőket levegőn szárítottuk, majd a későbbiekben ismertetendő kimutatási próbákban hasztuk. A törzstenyészet-lemezeket felhasználásig 4°C-on tároltuk .

Az Fd és L láncot tartalmazó kiónokra specifikus hibridizációs próbák kialakításához az Fd és L láncra specifikus oligonukleotidokat (szekvenciájuk a 22. és 24. szekvenciának felel meg) használtunk. Szintetikus oligonukleotidból úgy képezhető hibridizációs próba, hogy az oligonukleotidba

T4 polinukleotid kináz felhasználásával γ P ATP-ből radioaktív 5'-helyzetű foszfátcsoportot visznek be. 20 μΐ reakcióelegyhez [ összetétele: 100 mmól Trisz (pH 7,5), 10 mmól MgCl₂,

0,1 mmól spermidin, 20 mmól DTT, 7,5 μιηόΐ ATP, 0,5 μπιόΐ γ³²Ρ ATP és 2,5 egység T4 polinukleotid kináz (gyártja a Pharmacia »·» · ···* * *· • · · · * ·

-62Biotechnology Ltd.)] 20 pmól oligonukleotidot adtunk, és az elegyet a hibridizációban való felhasználás előtt 30 percig 37°C-on, majd 10 percig 70°C-on inkubáltuk. A hibridizációs próbák oligonukleotidekből való előállításának módszereit az idézett Maniatis-szakkönyv 11. fejezete ismerteti. A radioaktívan jelzett oligonukleotid 10 μΐ-es alikvotját 10 ml 6x SSC oldat (1 mól NaCl +0,1 mól nátrium-citrát), 0,1 % SDS (nátrium-dodecil-szulfát) és 0,25 % Marvei^(R> (csökkentett zsírtartalmú szárított tejpor) elegyéhez adtuk, és ezt az elegyet használtuk próba-oldatként.

A kiválasztott kiónokat tartalmazó, fentiek szerint előkezelt szűrőket kétszeres ismétlésben, 90 ml 6x SCC oldat, 0,1 % SDS és 0,25 % Marvei^(R| elegyében 65°C-on 3 órán át forgó üvegcsöves Techne HB-1 hibridizáló készülékben előhibridizáltuk. Ezután mindkét szűrősorozathoz 10-10 ml próba-oldatot (az egyikhez VH, a másikhoz VL próba-oldatot) adtunk, és az inkubálást ugyanebben a készülékben éjszakán át 65°C-on folytattuk. Inkubálás után mindkét szűrősorozatot ugyanebben a készülékben, 65°C-on 15 percig 100 ml 6x SSC oldat és 0,1 % SDS elegyével, 30 percig 100 ml 3x SSC oldat és 0,1 % SDS elegyével, végül 30 percig 100 ml lx SSC oldat és 0,1 % SDS elegyével mostuk. A kimosott szűrőket levegőn szárítottuk, és gyors wolframát intenzifikáló szűrővel felszerelt Hyperfilm MP^(r) (Amersham International gyártmány) berendezésben -7 0°C-on felvettük azok autoradiogramját. A filmet Kodak gyártmányú automatikus filmfeldolgozóval előhívtuk, és a mindkét próbával való hibridizálódás alapján azonosítottuk a potenciális F(ab')₂ kifejező kiónokat. Az Fd és L láncra specifikus

-63A potenciális ko-expresszáló kiónokat leemeltük a törzstenyészetet hordozó lemezekről, és nagyléptékű plazmid DNS előállítására használtuk fel. Az egyedi kifejező kazetták elhelyezkedését EcoRI és HindlII enzimmel végzett emésztéses restrikciós elemzéssel vizsgáltuk. Csak az L és Fd kifejező kazettát tandem (tehát nem konvergens) elrendezésben tartalmazó kiónokat találtunk. A kialakított ko-expressziós vektort pAF8-cal (proteolitikus Fd-t és L-t tartalmazó pEE12) jelöltük .

h) Mielóma sejtek transzfektálása:

DNS eukarióta sejtekbe való bevitelére számos módszer ismert [ Bebbington C.: Methods 2^, 136-145 (1991)] . Az utóbbi években a kalcium-foszfát-DNS koprecipitációs eljárást egyre inkább kiszorította az elektroporálás. Ehhez az eljáráshoz alkalmas gazdasejtnek bizonyultak az NSO mielóma sejtek [Methods in Enzymology 73B, 3-46 (1981), ECACC katalógusszám: 85110503], mert semmiféle endogén úton kiválasztott antitest fehérjét nem tartalmaznak. Várható, hogy a glutaminmentes közegen fejlődő telepek egy része az Fd és L láncokat együtt kifejező (ko-expresszáló) plazmidokkal való transzfektálás után funkcionális A5B7 antitest fragmenseket fog kifejezni .

Transzfektálás előtt 40 pg pFA8 plazmid DNS-t linearizálás céljából 400 μΐ reakcióelegyben [összetétele: 10 mmól Trisz-HCl (pH 7,9), 10 mmól magnézium-klorid, 150 mmól nátrium-klorid, 1 mmól DTT és 100 pg/ml acetilezett bovin szérum albumin] 37°C-on 1,75 órán át 200 egység Sall-gyel (New England Biolabs gyártmány) emésztettünk. Emésztés után

-64az egyedi DNS-eket etanolban kicsaptuk, és 50 μΐ desztillált vízben újra szuszpendáltuk.

NSO sejteket Nunc vagy Costar gyártmányú, 160 cm² területű szövettenyésztő lombikokban, 5 % szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában, 37°C-on csaknem teljes egybefolyásig 50 ml nemszelektív táptalajon [ Dulbecco által módosított

Eagle-táptalaj (gyártja a Life Technologies Ltd.), amihez a gyártó által előírt forrásból származó 10 % borjú-magzatszérumot is adtunk] tenyésztettünk. Transzfektálás előtt a lombikot kézhez vagy asztallaphoz ütögetve újra szuszpendáltuk az NSO sejteket, és a sejtszuszpenziót 50 ml űrtartalmú kúpos centrifugacsőbe (Falcon gyártmány) töltöttük. A sejtszuszpenzióból 40 μΐ-nyi mintát vettünk, és Coulter számlálón, a számlálási mérettartományt 10 μπι és 20 μπι közé beállítva közelítőleg meghatároztuk az elegy sejtkoncentrációját. A sejteket Sorval RT6000C típusú padkatetős centrifugán 5 percig 500 g gyorsuláson centrifugálva pelleteztük, majd 45 ml jéghideg foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) mostuk, és újra centrifugáltuk. A mosott sejtekből jéghideg PBS-tal l,3xl0^? sejt/ml koncentrációjú szuszpenziót készítettünk, amit jégen tároltunk. 0,4 cm úthosszú elektroporáló küvettákba (gyártja:

Bio-Rad Laboratories Ltd.) buborékmentesen 50-50 μΐ Sall-gyel emésztett plazmád DNS-t és 800-800 μΐ NSO sejtszuszpenziót (10 sejt) töltöttünk, az anyagokat összekevertük, és a küvettákat 5 percig jégen inkubáltuk. Ezután a küvettákat papírzsebkendővel szárazra töröltük, Gene Pulser^<R) elektroporáló készülékbe (gyártja: Bio-Rad Laboratories Ltd.) helyeztük, és a mintákra a gyártó utasításai szerint két egymást követő * «·· · *· ·

impulzust (1500 V, 3 μΓβΓβά) gyakoroltunk. Elektroporálás után a küvettákat ismét 5 percre jégre helyeztük, majd tartalmukat 30-30 ml előmelegített nemszelektív táptalajjal kevertük össze. 20 ml így kapott sejtszuszpenziót négy darab lapos aljú, 96 mélyedéses sejttenyésztő lemez (Nunc gyártmány) mélyedéseiben osztottunk szét, egy-egy mélyedésbe 50 μΐ sejtszuszpenziót töltöttünk. További 10 ml sejtszuszpenziót 30 ml nemszelektív táptalajjal hígítottunk, és a kapott elegyet öt darab 96 mélyedéses sejttenyésztő lemez mélyedéseibe osztottuk szét. A hígított sejtszuszpenzió maradékát nemszelektív táptalajjal 10 ml-ről 40 ml-re hígítottuk, és a kapott sejtszuszpenziót szintén öt darab 96 mélyedéses sejttenyésztő lemez mélyedéseibe töltöttük. A sejteket éjszakán át, 5 % szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában 37°C-on inkubáltuk. Ezután a tenyésztő lemezek összes mélyedésébe 150-150 μΐ glutamin-mentes szelekciós táptalajt [ Bebbington és munkatársai: Bio/

Technology 10, 169-175 (1992)] töltöttünk, a glutamin fokozatos kiürítésére a lemezeket visszahelyeztük az inkubátorba, és addig tartottuk ott, amíg a telepek szabad szemmel láthatóvá nem váltak.

i) Sej tvonal-expanzió:

Ehhez a művelethez a 96 mélyedéses tenyésztőlemezek azon mélyedéseinek tartalmát használtunk fel, ahol mélyedésenként csak 1 telep jelent meg. A mélyedések tartalmának fel-le pipettázásával szuszpendáltuk a sejteket, minden egyes mélyedésből 100-100 μΐ szuszpenziót vettünk, és a kivett mintákat 24 mélyedéses tenyésztőlemez mélyedéseibe töltöttük. A tenyésztőlemez mélyedéseibe 1-1 ml szelekciós táptalajt is

-66ft fc··· ·· · » · • * #♦ · töltöttünk. A 96 mélyedéses tenyésztőlemezek azon mélyedéseibe, ahonnan telepeket távolítottunk el, a sejtvonalak fenntartására 100-100 μΐ szelekciós táptalajt juttattunk. A 24 mélyedéses lemezeket mintegy 50 %-ban egybefolyó sejtnövekmény kialakulásáig 5 % szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában 37°C-on inkubáltuk. Ekkor a tenyészetek felülúszóiból 100-100 μΐ mintát vettünk, és a későbbiekben ismertetendő ELISA vizsgálattal anti-CEA kötőképességre vizsgáltuk. A kötőképességet mutató sejtvonalakat tovább expandálhattuk úgy, hogy a mélyedések tartalmát fel-le pipettázással szuszpendáltuk, és 25 cm területű szövettenyésztő lombikokba 1-1 ml így kapott szuszpenziót töltöttünk. A lombikokba 1-1 ml szelekciós táptalajt is töltöttünk, majd a lombikokat ferde helyzetben, a sejteket a lombik alja felé koncentrálva inkubáltuk. Néhány napos inkubálás után a lombikokhoz 3-3 ml szelekciós táptalajt adtunk, és a lombikokat 50-75 %-ban egybefüggő sejtnövekmény kialakulásáig vízszintes helyzetben inkubáltuk. Ekkor a táptalajt eltávolitottuk a sejtektől, a sejteket 5 ml szelekciós táptalajjal óvatosan mostuk, a mosófolyadékot elöntöttük, és 5 ml friss szelekciós táptalajjal pótoltuk. A lombikokat 24 órára visszahelyeztük az inkubátorba. Ezután a lombikok ütögetésével összegyűjtöttük a sejteket, és 10-20 μτη érzékelési tartományra beállított Coulter számlálóval vagy hemocitométer felhasználásával [ utóbbi esetben a mintát tripánkék oldattal (Life Technologies gyártmány) festettük, majd az életképes (nem festődött) sejteket mikroszkóp alatt megszámláltuk] meghatároztuk a sejtsűrűséget. A sejteket kb. 300 g gyorsuláson 5 percig végzett centrifugálással pelleteztük.

• J··

-67A felülúszót elkülönítettük, és antitest-fragmensek kifejeződésének vizsgálatára (lásd utóbb) 4°C-on tároltuk. A sejtekből 50 % dializált borjú magzat-táptalajt, 40 % glutaminmentes DMEM táptalajt és 10 % DMSO-ot tartalmazó eleggyel 1-2 x 10⁶ sejt/ml koncentrációjú sejtszuszpenziót készítettünk. A szuszpenzió 1 ml-es részleteit csavartetős fagyasztócsövekbe (Nunc gyártmány) töltöttük, éjszakán át -70°C-on fagyasztottuk, majd hosszú tartamú tárolásra folyékony nitrogénbe helyeztük.

Western biot analízis:

A Western biot analízist a következőképpen végeztük :

Az egyes felülúszó-minták 15 μΐ térfogatú alikvotjait azonos térfogatú, redukálószert (50 mmól DTT) tartalmazó vagy nem tartalmazó pufferoldattal [ összetétele: 62,5 mmól

Trisz (pH 6,8), 8,1 % SDS, 10 % szacharóz és 0,05 % brómfenolkék] kevertük össze. A mintákat 15 percig 100°C-on inkubáltuk, majd Multiphor II készülékben (gyártja: LKB Produkter AB) a gyártó utasításainak megfelelően elektroforézisnek vetettük alá egy 8-18 % (gradiens) akrilamidot tartalmazó gélen (Excel gélrendszer, gyártja: Pharmacia Biotechnology Products). Elektroforézis után az elkülönített fehérjéket No(R) vablot készüléken (gyártja: LKB Produkter AB) a gyártó utasításait követve Hybond C-Super membránra (gyártja: Amersham International) vittük fel. Felvitel után a membránt levegőn szárítottuk.

Az antitest fragmensek jelenlétét anti-murin F(ab')₂ antitest-peroxidáz konjugátummal (az ICN Biomedicals

67-430-1 katalógusszámú gyártmánya) mutattuk ki. Noha ezt az

-68antitestet murin F(ab')₂-vel szemben fejlesztették ki, kitűnt, hogy az elsődlegesen a κ L lánchoz kötődik. A murin

A5B7 antitest fragmenseket ECL detektáló rendszerrel (gyártja: Amersham International) tettük láthatóvá a gyártó utasításait követve.

Az analízis eredménye szerint a felülúszóban lévő anyag 90 %-a F(ab')₂ fehérje volt.

k) ELISA analízis:

Az ELISA analízis standard műveleteit a Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (szerk: Burdon R.H. és van Kippenberg P.H.) 15. kötete (Tijssen P.:

Practice and Theory of Enzyme Immunoassays; Elsevier Science Publishers B.V., 1985) ismerteti. További információk találhatók Harlow E. és Lane D.P. Antibodies - A Laboratory Manual c. könyvében (kiadó: Cold Spring Harbor Laboratory,

1988) .

A fent ismertetett felülúszókban a következő használati utasítást követve mutattuk ki az anti-CEA-megkötő anyag jelenlétét:

l) Anti-CEA-megkötő anyag kimutatása ELISA analízissel :

1. Készítsünk bevonó puffért [ 1 kapszula karbonát-bikarbonát puffer (a Sigma cég C-3041 jelű gyártmánya) 100 ml kétszer desztillált vízben] .

2. Egy-egy 96 mélyedéses lemezre számítva adjunk 5 μΐ CEA törzsoldatot (0,2 mg/ml, Dako-gyártmány) 10 ml bevonó pufferhez.

-693. Nunc Maxisorp ^(R) mikrotitráló lemez mélyedéseibe mérjünk 100-100 μΐ hígított CEA oldatot.

4. Inkubáljuk a lemezeket éjszakán át 4°C-on (vagy 2 órán át szobahőmérsékleten).

5. Mossuk a lemezeket négyszer 5 percig 0,01 % nátrium-azidot tartalmazó foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBSA).

6. Szárítás után mérjünk a lemez mélyedéseibe 150-150 μΐ 1 % bovin szérum albumint (a Sigma cég A-7888 sz. gyártmánya) tartalmazó PBSA oldatot. Inkubáljuk a lemezeket 2 órán át szobahőmérsékleten.

7. Mossuk a lemezeket négyszer 5 percig PBSA oldattal.

8. Vigyük fel a lemezre a felülúszó mintáit, illetve a standardokat (proteolitikus A5B7 F(ab')₂ kétszeres sorozathígításai) . Hígítsuk a mintákat táptalajjal vagy PBS oldattal. Vak mintákként használjunk PBSA + 1 % BSA elegyet és hígítószert.

9. Inkubáljuk a lemezeket éjszakán át 4°C-on.

10. Mossuk a lemezeket hatszor 5 percig PBSA + 0,5 % Tween 20 oldattal.

11. Készítsünk szekunder antitest oldatot [20 μΐ kecske-eredetű anti-egér IGG F(ab')₂ peroxidázzal (ICN 67-430-1) konjugálva, 40 ml PBSA + 1 % BSA + 0,5 % Tween 20 oldatban], és mindegyik mélyedésbe mérjünk be 100 μΐ oldatot.

12. Inkubáljuk a lemezeket szobahőmérsékleten 2 órán át.

13. Mossuk a lemezeket hatszor 5 percig PBSA + 0,5 % Tween 20 oldattal.

14. 1 kapszula foszfát-citrát-perborát puffért (a Sigma cég P-4922 sz. gyártmánya) 100 ml kétszer desztillált vízben oldva készítsünk előhívó oldatot. Adjunk a pufferoldathoz 30

-70mg/100 ml o-fenilén-diamin-dihidrokloridot (OPD, a Sigma cég P-8287 sz. gyártmánya). Mindegyik mélyedésbe mérjünk be 100 μΐ így kapott elegyet.

15. Inkubáljuk a lemezeket szobahőmérsékleten, fénytől védve 15 percig.

16. Mindegyik mélyedésbe 50 μΐ 2 mólos kénsavoldatot bemérve állítsuk le a reakciót.

17. Lemez-leolvasó készülékkel 490 nm-en olvassuk le az optikai sűrűség-értékeket.

m) A fajlagos termelési sebesség (SPR) kiszámítása:

Az egyes minták anti-CEA-megkötő aktivitását Softmax adatkezelő program segítségével számszerűsítettük. Minthogy a Western biot analízis eredménye szerint az antitest L láncának túlnyomó része {>90 %-a) F(ab')₂-ként van jelen, az így kapott számadatot a felülúszóban lévő A5B7 F(ab')₂ fragmens mennyiségével közelítőleg azonosnak tekintettük. A kapott számadatok alapján kiszámítottuk a fajlagos termelési sebesség-értékeket μg/10⁶ sejt/24 óra egységekben, és az így kapott értékek alapján rangsoroltuk a sejtvonalakat termelékenységük szerint. Az elkülönített legkedvezőbb termelékenységű sejtvonalak fajlagos termelési sebessége jellemzően 4-10 μg/10⁶ sejt/24 óra volt.

A rekombináns A5B7 F(ab)_? tisztítása:

A rekombináns A5B7 F(ab)₂ ^_t 500 mg-os r-Protein-A betét (például a NyGene által forgalomba hozott betét) felhasználásával tisztítottuk meg a mielóma-táptalaj felülúszójának egyéb komponenseitől. Első lépésben a betétet citrátpufferrel (100 mmól citromsav, pH 2,8) mostuk, majd foszfát-71pufferrel (150 mmól nátrium-klorid + 10 mmól nátrium-foszfát, pH 7,4) egyensúlyba hoztuk. Az utóbbi kezelést addig végeztük, amíg a mosófolyadék pH-ja el nem érte a pufferoldat pH-ját. Mindkét pufferoldatot felhasználás előtt 0,45 μιη száltávolságú Millipore szűrőn előszűrtük.

A rekombináns A5B7 F(ab)₂-t tartalmazó, 1,8 liter mielóma-táptalajt szintén előszűrtük, majd 1:1 arányban a fenti foszfát-pufferrel hígítottuk. Ezt a hígított táptalajt felvittük a Protein-A betétre, és a meg nem kötött anyagot tartalmazó mosófolyadékot összegyűjtöttük. A felvitel befejezése után a betétet addig mostuk a fenti foszfát-pufferrel, amíg a 280 nm-en mért abszorbancia vissza nem tért az alapvonalra .

Ezután a puffért előszűrt 100 mmólos nátrium-acetát pufferra (pH 4,0) cseréltük. Az utóbbi puffer felhasználásával kapott eluátumot 45 ml-es frakciókba gyűjtöttük. Amikor a 280 nm-en mért abszorbancia ismét visszatért az alapvonalra, a mosáshoz felhasznált puffért 100 mmólos citromsav-pufferra (pH 2,8) cseréltük.

A frakciók optikai sűrűségét 280 nm-en mértük, és a jelentős abszorbanciát mutató frakciókat pH 7,0-re titráltuk, majd SDS PAGE-sel elemeztük.

A rekombináns A5B7 F(ab)₂-t tartalmazó frakciókat egyesítettük. Az egyesített elegyet Amicon YM10 membrán felhasználásával betöményítettük, pufferoldatba (100 mmól nátrium-klorid, 10 mmól nátrium-foszfát és 3 mmól EDTA-dinátriumsó, pH 7,4) dializáltuk, és 4°C-on tároltuk. Összesen 73 mg F(ab)₂-t kaptunk, nemredukáló SDS-PAGE elemzés alapján 90 %-osnál nagyobb tisztaságú anyag formájában.

-72A fenti tisztítási műveletben felhasznált mielómasejt-felülúszót lényegében Bebbington és munkatársai módszerével [ Bio/Technology 10, 169-175 (1992)] alakítottuk ki. A GS táptalajokat (katalógusszám: 51435) és az adalékot (katalógusszám: 58672) a JRH Biosciences Europe cégtől (Hophurst Lane, Crawley Down, W. Sussex RH10 4FF, Nagy-Britannia) szereztük be. A fermentáció végén a felülúszót a szemcsés anyagok eltávolítására 0,45 μιη száltávolságú szűrőn szűrtük, és felhasználásig (jellemzően legföljebb 24 órán át) 4°C-on tároltuk .

6. referencia-példa

Uracil-alapú előgyógyszer-analóg szintézise a 9.

ábrán bemutatott műveletsorral mg (7) képletű vegyületet 0,5 ml 0,1 N sósavoldatban oldottunk. A kívánt (9) képletű végterméket kaptuk. Az elegyet fél órán át fénytől védve 25°C-on tartottuk. A kapott törzsoldatot jégen tároltuk, és alikvotjait pufferes hígítás után használtuk a mutáns RN-ázzal való vizsgálatokban.

A (7) képletű vegyületet a következőképpen állítottuk elő uridinből:

2',3¹-O-Metoxi-etilidén-uridin [ (1) képletű vegyület] előállítása:

g uridin, 1 g p-toluol-szulfonsav-monohidrát és 15 ml ortoecetsav-trimetil-észter elegyét 16 órán át 20°C-on kevertük. A reakcióelegyet metanolos nátrium-metoxid oldattal enyhén meglúgosítottuk, majd betöményítettük. A kapott gumiszerű anyagot szilikagél oszlopon (Merck 9385) kromatografálva tisztítottuk, eluálószerként kezdetben 96:4, majd 92:8 térfogatarányú kloroform/metanol elegyet használtunk.

-73• ·* ·

NMR spektrum adatai (DMSO-d₆) : 11,38 (s, 1H) , 7,75 (d, 1H) , 5,95 (d) és 5,80 (d, összesen 1H) , 5,62 (d, 1H) ,

4,70-5,10 (m, 3H), 4,18 (q) és 4,04 (q, összesen 1H), 3,60 (m, 2H), 3,15 (s) és 3,28 (s, összesen 3H), 1,57 (s) és 1,49 (s, összesen 3H).

5'-Azido-5'-dezoxi-2', 3'-O-metoxi-etilidén-uridin [ (2) képletű vegyület] előállítása:

7,0 g (23,3 mmól) 2',3'-O-metoxi-etilidén-uridin 80 ml vízmentes piridinnel készített oldatához 0°C-on 1,9 ml (24 mmól) metán-szulfonil-kloridot adtunk. Az elegyet 16 órán át 4°C-on kevertük, majd az oldószert csökkentett nyomáson lepároltuk. A maradékot kloroformban oldottuk, vízzel mostuk, a szerves fázist elválasztottuk, szárítottuk, és betöményítettük. Az így kapott nyers reakcióterméket 100 ml vízmentes dimetil-formamidban oldottuk, és 3,25 g (50 mmól) nátrium-azidot adtunk hozzá. Az elegyet 7 órán át 85°C-on kevertük, ezután az oldószert csökkentett nyomáson lepároltuk. A gumiszerű maradékot kloroformban oldottuk, az oldatot vizes nátrium-hidrogén-karbonát oldattal mostuk, vízmentes nátrium-szulfát fölött szárítottuk, végül bepároltuk. A nyers 5'-azido-vegyületet kaptuk, amit közvetlenül felhasználtunk a következő lépésben .

3'-O(és 2¹-O)-Acetil-5'-azido-5¹-dezoxi-uridin [ (3) képletű vegyület] előállítása:

Az előző lépésben kapott nyers azidvegyületet 100 ml 70 %-os ecetsavban oldottuk. 15 perc elteltével az oldószert csökkentett nyomáson lepároltuk. Az ecetsav nyomainak eltávolítása végett a maradékot abszolút etanolban oldottuk,

-74és az oldatot bepároltuk. Nyers (3) képletű vegyületet kaptunk 2’- és 3'-regioizomerek elegye formájában.

NMR spektrum adatai( 2'-acetoxi- és 3'-acetoxi-vegyület 2:1 arányú elegye, DMSO-d₆) : 11,40 (s, 1H), 7,70 (d,

1H), 5,60-5,95 (m, 3H), 5,22 (t, 0,33H), 5,03 (dd, 0,66H),

4,41 (q, 0,66H), 4,24 (q, 0,33H), 4,14 (q, 0,66H), 3,94 (m,

0,33H), 3,62 (m, 2H) , 2,08 (s, 0, 66H) , 2,06 (s, 0,33H).

3'-O(és 2¹-0)-Acetil-5¹-azido-5'-dezoxi-2¹O(és 3'-0)-tetrahidropiranil-uridin előállítása:

Az előző reakcióban kapott nyers acetátot 80 ml vízmentes diklór-metánban oldottuk, és az oldathoz 6 ml dihidropiránt és 500 mg p-toluol-szulfonsav-monohidrátot adtunk. Az elegyet 3 órán át 25°C-on kevertük. Az ekkor végzett vékonyrétegkromatográfiás elemzés szerint a kiindulási anyag elfogyott. A reakcióelegyet diklór-metánnal hígítottuk, vizes nátrium-hidrogén-karbonát oldattal mostuk, a szerves fázist szárítottuk, majd csökkentett nyomáson bepároltuk. A nyers terméket (2'- és 3'-regioizomerek elegye) szilikagél-oszlopon kromatografálva tisztítottuk, eluálószerként kezdetben 97:3, majd 95:5 térfogatarányú kloroform/metanol elegyet használtunk .

5'-Amino-5'-dezoxi-2¹-0(és 3'-0)-tetrahidropiranil-uridin [ (4) képletű vegyület] előállítása:

Az előző reakcióban kapott azid intermediert 100 ml tetrahidrofuránban oldottuk, és az oldathoz 6,5 g (25 mmól) trifenil-foszfint, majd 0,45 ml vizet adtunk. Az elegyet 16 órán át 25°C-on kevertük, ezután tömény ammóniát adtunk hozzá, és a reakciót még 24 órán át folytattuk. A reakcióelegyet szárazra pároltuk, és a maradékot oszlopkromatografálással »·· ·

-75tisztítottuk. Eluálószerként kezdetben 9:1, azután 1:1 térfogatarányú kloroform/etanol elegyet használtunk. A kívánt terméket kaptuk 2'- és 3'-regioizomerek elegye formájában.

¹-[ N-(Benzil-oxi-karbonil)-glicil] -amino-5'-dezoxi-2'-0(és 3'-0)-tetrahidropiranil-uridin [ (5) képletű vegyidet] előállítása:

g 5’-amino-5'-dezoxi-2’-0(és 3'-0)-tetrahidropiranil-uridin vízmentes tetrahidrofuránnal készített oldatához

3,1 g (9,2 mmól) N-(benzil-oxi-karbonil)-glicin-p-nitro-fenil-észtert adtunk. Az oldatot 16 órán át 25°C-on kevertük, ezután bepároltuk, és a gumiszerű maradékot szilikagél oszlopon kromatografálva tisztítottuk. Eluálószerként 96:4 térfogatarányú kloroform/metanol elegyet használtunk. 3, 6 g (75 %) kívánt terméket kaptunk regioizomerek elegye formájában.

NMR spektrum adatai (DMSO-d₆) : 11,36 (s, 1H) , 8,02 (széles, 1H), 7,70 (2d, 1H), 7,32 (m, 6H), 5,90 (d) és 5,70 (d, összesen 1H), 5,64 (d, 1H) , 5,444 (d) és 5,20 (d, összesen 1H), 5,02 (s, 2H), 4,75 (m, 1H), 3,20-4,25 (m, 9H), 1,351, 80 (m, 6H) .

Tömegspektrum (FAB) : m/e 519 (M⁺H⁺) (a C₂₄H₃₀N₄O₉ képlet alapján számított M⁺: 518) .

A fenti termék 3'-O(és 2¹-0)-foszforamidit-származékának előállítása:

1,9 g (3,67 mmól), a fenti reakcióban kapott termék és 1,5 ml diizopropil-etil-amin 30 ml vízmentes diklór-metánnal készített oldatához N,N-diizopropil-metil-foszfonamidil-kloridot adtunk. Az elegyet 5 órán át 25°C-on kevertük, majd kloroformmal hígítottuk, és vizes nátrium-hidrogén-karbonát oldattal mostuk. A kloroformos oldatot elválasztottuk, szári»··· «te* *

-76tottuk és bepároltuk. A kapott gumiszerű anyagot oszlopkromatografálással tisztítottuk, eluálószerként kezdetben 98:2:0, majd 96:2:2 térfogatarányú kloroform/trietil-amin/metanol elegyet használtunk. 1,9 g kívánt foszfortartalmú intermediert kaptunk.

A teljesen védett foszfát-intermedier [ (6) képletű vegyület] előállítása:

1,9 g (2,4 mmól), az előző reakcióban kapott foszforamidit és 0,7 g (3,6 mmól) 4-(dipropil-amino)-fenol 40 ml vízmentes acetonitrillel készített oldatához 0,5 g (0,4 ml) tetrazolt adtunk. Az elegyet fénytől védve 16 órán át 25°C-on kevertük, ezután 0,4 ml 70 %-os terc-butil-hidroperoxidot adtunk hozzá. 15 perc elteltével a reakcióelegyet bepároltuk, a maradékot kloroformban oldottuk, és az oldatot vizes nátrium-hidrogén-karbonát oldattal mostuk. A kloroformos fázist elválasztottuk, szárítottuk és bepároltuk. A gumiszerű maradékot szilikagél oszlopon kromatografálva tisztítottuk, eluálószerként kezdetben etil-acetátot, azután 93:7 térfogatarányú etil-acetát/metanol elegyet használtunk. A megfelelő frakciók bepárlásával 1,5 g kívánt terméket kaptunk 2'- és 3'-regioizomerek elegye formájában.

NMR spektrum adatai (DMSO-d₆) : 11,43 (s, 1H), 8,10 (sz, 1H) , 7,75 (m, 1H) , 7,45 (m, 1H) , 7,35 (s, 5H) , 7,00 (m,

2H) , 6,60 (m, 2H) , 5,90 (m, 1H) , 5,69 (m, 1H) , 5,17 (m) és

4,97 (m, összesen 1H) , 5,02 (s, 2H) , 4,69 (szs) és 4,57 (szs, összesen 1H), 4,53 (m) és 4,23 (m, összesen 1H) , 4,08 (m,

1H) , 3,15-3,85 (m, 13H) , 1,35-1,75 (m, 10H) , 0,88 (t, 6H) .

Tömegspektrum (FAB) : m/e 787 (M⁺) és 788 (M⁺H⁺) (a

C₃₇H5₀N5O₁₂P képlet alapján számított M⁺: 787).

• · ··

A THP-nal védett előgyógyszer-analóg [ (7) képletű vegyület] előállítása:

mmól, a fenti reakcióval kapott, teljesen védett intermediert 20 ml etanol és 10 ml ciklohexén elegyében oldottunk, és az oldathoz 150 mg 20 %-os palládium/csontszén katalizátort adtunk. Az elegyet 1 órán át visszafolyatás közben forraltuk, ezután szűrtük, és csökkentett nyomáson bepároltuk. A kapott gumiszerű anyagot szilikagél oszlopon kromatografálva tisztítottuk, eluálószerként 9:1 térfogatarányú kloroform/metanol elegyet használtunk. A szabad glicil-származékot kaptuk.

mmól, az előző reakcióban kapott, metilcsoporttal védett foszfátvegyületet ezután 30 ml terc-butil-aminban oldottunk. A reakcióelegyet 16 órán át visszafolyatás közben forraltuk, majd bepároltuk, és a maradékot szilikagél oszlopon kromatografálva tisztítottuk. Eluálószerként kezdetben 9:1, majd 7:3 térfogatarányú kloroform/metanol elegyet használtunk. A kívánt THP-nal védett előgyógyszer-analógot kaptuk 2'- és 3'-regioizomerek elegye formájában.

A 2'- és 3'-regioizomerek szétválasztása:

A szétválasztást Partisii ODS-2 nagynyomású folyadékkromatográfiás oszlopon végeztük, az oszlopot metanol és 0,1 mólos ammónium-forrniát oldat 60:40 arányú elegyével izokratikusan eluáltuk. A megfelelő eluátumfrakciókat egyesítettük és fagyastztva szárítottuk. A kívánt (7) képletű 3'-regioizomert kaptuk.

NMR spektrum adatai (DMSO-d₆) : 8,85 (s, 1H) , 8,25 (s, 1H), 7,75 (d, 1H) , 6,95 (d, 2H) , 6,5 (d, 2H) , 5,85 (d,

-781Η) , 5,6 (d, 1H) , 4,5 (m, 2H) , 4,3 (m, 1H) , 4,07 (m, 1H) , 3,2-3,6 (m, 6H) , 3,1 (m, 4H) , 1,2-1,6 (m, 10H) , 0,8 (m, 6H) .

7. referencia-példa

Citidin-alapú előgyógyszer-analóg szintézise a 10.

ábrán bemutatott műveletsorral

A (13) képletű citidin-alapú előgyógyszer-analógot a 6. referencia-példában leírtakhoz hasonlóan állítottuk elő, azonban (7) képletű vegyület helyett (12) képletű vegyületből indultunk ki. A feldolgozás során a reakcióelegyet csökkentett nyomáson bepároltuk, a maradékot kloroformban oldottuk, az oldatot vizes nátrium-hidrogén-karbonát oldattal mostuk, nátrium-szulfát fölött szárítottuk, szűrtük, majd a szűrletet bepároltuk. A maradékot gyors oszlopkromatografálással tisztítottuk a megadoptt oldószer-eleggyel eluálva.

A (12) képletű kiindulási anyag előállítása:

Az (1) képletű N⁴-benzoil-2',3'-O-metoxi-etilidén-citidint D.P.L. Green éls munkatársai módszerével [ Tetrahedron 2 6, 1031 (1970)] állítottuk elő.

A (2) képletű N⁴-benzoil-5'-O-metánszulfonil-2',3'-O-metoxi-etilidén-citidint a következőképpen állítottuk elő:

9,85 g (25,0 mmól) N⁴-benzoil-2' , 3'-O-metoxi-etilidén-citidin 100 ml piridinnel készített oldatához keverés közben, 0°C-on 1,9 ml (25 mmól) metánszulfonil-kloridot adtunk. Az elegyet 16 órán át 25°C-on kevertük, majd csökkentett nyomáson bepároltuk. A maradékot kloroformban oldottuk, a szerves oldatot vizes nátrium-hidrogén-karbonát oldattal mostuk, nátrium-szulfát fölött szárítottuk, majd bepároltuk.

• · · ·

-79Α (3) képletű 3'-O-acetil-5'-azido-N⁴-benzoil-5'-dezoxi-citidint (a 2'-O-acetil-izomerrel alkotott elegyként) a következőképpen állítottuk elő:

A nyers (2) képletű vegyületet 100 ml vízmentes dimetil-formamidban oldottuk. Az oldathoz 3,25 g (50 mmól) nátrium-azidot adtunk, és az elegyet 7 órán át 80°C-on kevertük. Az oldatot bepároltuk, a maradékot kloroformban oldottuk, a szerves oldatot vizes nátrium-hidrogén-karbonát oldattal mostuk, szárítottuk, majd bepároltuk. A kapott maradékot 120 ml 70 %-os ecetsavban oldottuk. 15 perc elteltével az oldószert csökkentett nyomáson lepároltuk, és a kapott nyers terméket oszlopkromatografálással tisztítottuk. Eluálószerként 95:5, majd 92:8 térfogatarányú kloroform/metanol elegyet használtunk. 6 g kívánt terméket kaptunk.

A (4) képletű 3'-O-acetil-5'-azido-N⁴-benzoil-2'-0-tetrahidropiranil-5'-dezoxi-citidint (a 3¹-O-tetrahidropiranil-izomerrel alkotott elegy formájában) a következőképpen állítottuk elő:

g, a fentiek szerint kapott (3) képletű vegyületet 100 ml metilén-klorid és 4 ml dihidropirán elegyében oldottunk. Az elegyhez 0,5 g p-toluol-szulfonsav-monohidrátot adtunk, 16 órán át 25°C-on kevertük, majd a fentiek szerint feldolgoztuk. A nyers terméket oszlopkromatografálással tisztítottuk, eluálószerként 98:2 térfogatarányú kloroform/metanol elegyet használtunk. A kívánt terméket kaptuk.

Az (5) képletű 5'-azido-5'-dezoxi-2'-O-tetrahidropiranil-citidint (a 3'-O-tetrahidropiranil-izomerrel alkotott elegy formájában) a következőképpen állítottuk elő:

-809,0 g szennyezett (4) képletű vegyületet 60 ml metanolban oldottunk, és az oldathoz 3,5 g nátrium-metoxidot adtunk. Az elegyet 1 órán át 25°C-on kevertük, majd bepároltuk, és a maradékot gyors oszlopkromatografálással tisztítottuk. 3,7 g terméket kaptunk.

Megjegyezzük, hogy a 2' és 3' izomert már ebben a lépésben (valamint a következő lépések többségében) kromatografálással elválaszthatjuk egymástól.

A (6) képletű 5'-azido-N⁴-(benzil-oxi-karbonil)-5'-dezoxi-2'-O-tetrahidropiranil-citidint (a 3'-O-tetrahidropiranil-izomerrel alkotott elegy formájában) a következőképpen állítottuk elő:

3,7 g (5) képletű citidin-vegyületet 80 ml vízmentes piridinben oldottunk, és az oldathoz katalitikus mennyiségű dimetil-amino-piridint és 2 ml Z-Cl-t adtunk. Az elegyet 16 órán át 25°C-on kevertük, majd feldolgoztuk. A terméket szilikagél oszlopon kromatografálva tisztítottuk, eluálószerként 95:5 térfogatarányú kloroform/metanol elegyet használtunk. 2,3 g kívánt terméket kaptunk.

A (7) képletű 5'-(N-/benzil-oxi-karbonil/-amino)-5'-dezoxi-2'-O-tetrahidropiranil-citidint (a 3’-O-tetrahidropiranil-izomerrel alkotott elegy formájában) a következőképpen állítottuk elő:

3,06 g (6) képletű azidvegyület 30 ml tetrahidrofuránnal készített oldatához 1,7 g trifenil-foszfint adtunk, és az elegyet 24 órán át 50°C-on kevertük. Az elegyhez 5 ml vizet adtunk, és még 1 órán át 50°C-on kevertük. A reakcióelegyet bepároltuk, és a maradékot szilikagél oszlopon kromatografálva tisztítottuk. Eluálószerként kezdetben 9:1, majd 1:1

-81térfogatarányú kloroform/metanol elegyet, végül tiszta metanolt használtunk. 0,9 g kívánt terméket kaptunk.

A (8) képletű N⁴-(benzil-oxi-karbonil)-5'-(N-/benzil-oxi-karbonil/-glicil)-amino-5'-dezoxi-2'-O-tetrahidropiranil-citidint (a 3'-O-tetrahidropiranil-izomerrel alkotott elegy formájában) a következőképpen állítottuk elő:

0,9 g (7) képletű aminvegyületet 30 ml vízmentes diklór-metánban oldottunk, és az oldathoz 700 mg N-(benzil-oxi-karbonil)-glicin-p-nitro-fenil-észtert adtunk. Az elegyet 16 órán át 25°C-on kevertük, majd bepároltuk, és a maradékot oszlopkromatografálással tisztítottuk. Eluálószerként kezdetben 97:3, majd 95:5 térfogatarányú kloroform/metanol elegyet használtunk. 1 g kívánt terméket kaptunk.

A (9) képletű N⁴-(benzil-oxi-karbonil)-5'-(N-/benzil-oxi-karbonil/-glicil)-amino-5'-dezoxi-2'-O-tetrahidropiranil-citidil-3'-(N,N-di-izopropil-metil)-foszfonamidátot (a 3'-izomerrel alkotott elegy formájában) a következőképpen állítottuk elő :

g (8) képletű alkoholt 30 ml vízmentes diklór-metánban oldottunk, és az oldathoz 1,7 ml EtN(iPr)₂~t, majd 34 ml Cl-P (OMe) N (iPr) ₂-t adtunk. Az elegyet 6 órán át 25°C-on kevertük, majd feldolgoztuk. A maradékot szilikagél oszlopon kromatografálva tisztítottuk, eluálószerként kezdetben

98:2:0, majd 97:2:1 térfogatarányú kloroform/trietil-amin/metanol elegyet használtunk. 1,1 g kívánt terméket kaptunk.

A (10) képletű (metil)(4-/N,N-dipropil-amino/-fenil)[ N⁴-(benzil-oxi-karbonil)-5'-(N-/benzil-oxi-karbonil/-glicil)-amino-5'-dezoxi-2'-O-tetrahidropiranil-citidil-3'] -

-82-foszfátot (a 3'-izomerrel alkotott elegy formájában) a következőképpen állítottuk elő:

1,1 g (9) képletű foszfonamidát-vegyületet 30 ml vízmentes acetonitrilben oldottunk, és az oldathoz 200 mg 4(N,N-dipropil-amino)-fenolt, majd 420 mg tetraholt adtunk. Az elegyet 16 órán át 25°C-on kevertük, ezután 0,3 ml 70 %-os terc-butil-hidroperoxidot adtunk hozzá. 15 perc elteltével a reakcióelegyet feldolgoztuk, és a nyers terméket szilikagél oszlopon kromatografálva tisztítottuk. Eluálószerként kezdetben etil-acetátot, majd 97:3 térfogatarányú etil-acetát/metanol elegyet használtunk. 0,85 g kívánt terméket kaptunk.

A (11) képletű (metil)(4-/N,N-dipropil-amino/-fenil)(5'-dezoxi-5'-/glicil-amino/-2'-O-tetrahidropiranil-citidil-3')-foszfátot (a 3'-izomerrel alkotott elegy formájában) a következőképpen állítottuk elő:

0,85 g (10) képletű bisz(benzil-oxi-karbonil)-vegyületet 30 ml etanol és 15 ml ciklohexén elegyében oldottunk. Az oldathoz 400 mg 20 %-os palládium/csontszén katalizátort adtunk, és az elegyet 4 órán át keverés és visszafolyatás közben forraltuk. Az elegyet szűrtük, a szűrletet bepároltuk, és a gumiszerű maradékot szilikagél oszlopon kromatografálva tisztítottuk. Eluálószerként kezdetben 95:5, majd

5:1 térfogatarányú kloroform/metanol elegyet, végül tiszta metanolt használtunk. 100 mg kívánt terméket kaptunk.

A (12) képletű (4-/N,N-dipropil-amino/-fenil)(5'-dezoxi-5'-/glicil-amino/-2'-O-tetrahidropiranil-citidil-3')-hidrogénfoszfátot a következőképpen állítottuk elő:

100 mg (11) képletű foszfátvegyületet 25 ml terc-butil-aminban oldottunk, és az oldatot 8 órán át visszafo• * ··

lyatás közben forraltuk. Az elegyet bepároltuk, és a maradékot nagynyomású folyadékkromatografálással (Magnum 20 reverz fázisú oszlop, eluálószer: metanol és 0,1 mólos ammónium-formiét oldat 60:40 térfogatarányú elegye) tisztítottuk.

		NMR spektrum	adatai	(DMSO-d6) : 9,1	(s, 1H), 8,19
(s,	1H) ,	7,6 (d, 1H),	7,2 (m,	3H) , 6,95 (d,	2H) , 6,45 (d,
2H) ,	5, 8	(d, 1H), 5,72	(d, 1H)	, 4,71 (m, 1H)	, 4,45 (m, 1H),
4,22	(m,	1H), 4,1 (m,	1H), 3,8	(t, 1H), 3,7-	3,15 (m, 2H) ,
3, 51	(s,	2H) , 3,35-3,5	(m, 1H)	, 3,0 (m, 4H),	1,8-1,2 (m,
10H)	, o,	8 (m, 6H) .

Tömegspektrum (FAB): m/e (MH⁺) 639.

8. referencia-példa

Az A5B7 F (ab ') ₂~BP-RN-áz konjugátum lokalizálása

LoVo tumor xenograftokhoz

A 14. referencia-példában leírtak szerint előállított murin A5B7 F(ab')₂-BP RN-áz konjugátumba Iodogen reagens (gyártja: Pierce and Warriner Ltd., Chester, Nagy-Britannia) felhasználásával, hordozómentes I-dal radioaktív jódatomot építettünk be. A reakciót a gyártó útmutatásai szerint végeztük. A jelzett anyagot Lindmo és munkatársai módszerével [ J. Immunoi. Meth. 72, 77-89 (1984)] LoVo tumorsejtekhez kapcsolva megállapítottuk, hogy in vitro körülmények között az anyag immunreaktivitásának több mint a felét megőrizte. Thymusmentes szőrtelen egerekbe (nu/nu:Alpk törzstenyészet) szubkutan 1x10 LoVo tumorsejtet injektáltunk. 7 nap elteltével, amikor az állatokban már kifejlett LoVo tumor xenograftok képződték, az állatoknak intravénásán 10 μΟί I-dal egyenértékű mennyiségű (körülbelül 10 μg) konjugátumot adtunk be. Ezután meghatározott időközönként 3-3 állatot le·-> ·

-84öltünk, az állatokból kiemeltük a tumort, továbbá vér- és egyéb szövetmintákat vettünk, ezeket lemértük, és γ-számlálóval meghatároztuk radioaktivitásukat. A konjugátum eloszlását a tumorban és az egyéb szövetekben a következő táblázatban közöljük. A táblázatban megadott számadatok 3 egéren mért eredmények átlagértékei, % injektált dózis/g szövet egységekben .

A5B7 F(ab')₂-BP-RN-áz lokalizációja tumorhoz és más szővetek-

Szövet	4 óra	24 óra	48 óra	72 óra	96 óra
Tumor	2,54	3,27	1,00	0,66	0,41
Vér	6, 83	1,06	0,25	0,12	0,06
Máj	1,81	0, 62	0,12	0,07	0,06
Vese	2,76	0,55	0,23	0,18	0, 11
Tüdő	2,85	0,28	0,15	0,09	0, 08

Az eredményekből egyértelműen megállapítható, hogy az A5B7 F(ab ' )₂-RN-áz konjugátum specifikusan a LoVo xenograftokhoz lokalizálódik. 24 óra elteltével 1 g tumorszövethez már több konjugátum kapcsolódik, mint a többi szövetekhez, a vért is beleértve. A tumorban észlelt konjugátumszintek az A5B7 F(ab')₂-CPG2 konjugátum szintjeihez hasonlóak voltak [ Blakey és munkatársai: Br. J. Cancer 69, suppl. XXI., 14. (1994)] . A fenti CPG2 konjugátum LoVo xenograft modellben mért szintjei elegendőnek bizonyultak ahhoz, hogy a kombináltan adagolt mustár-típusú előgyógyszer csökkenthesse a tumorméretet, és jelentősen késleltethesse a tumornövekedést [ Blakey és munkatársai: Br. J. Cancer 69, supp. XXI., 14. (1994) ► ···

-85és Proc. of the American Association fór Cancer Research 35,

507 (1994)] .

9. referencia-példa

Hippurin-L-glutaminsav szintézise a 28. ábrán bemu tatott műveletsorral

2,06 g (4,2xl0*³ mól) (3) képletű hippuril-L-glutaminsav-dibenzil-észter és 0,77 g 50 % nedvességtartalmú 30 % -os palládium/csontszén katalizátor elegyét tetrahidrofuránban 1,5 órán át hidrogén atmoszférában kevertük. Az elegyet Celiten^1R) keresztül szűrtük, és a szűrletet szárazra pároltuk. A maradékot dietil-éterrel eldörzsöltük. 1,02 g (78 %) kívánt terméket kaptunk 169-171°C-on olvadó fehér kristályok formájában. [ a] _D ²⁰ -2,5°.

NMR spektrum adatai (DMSO-d₆) : 12,3 (sz, 2H) , 8,7 (t, 1H) , 8,2 (t, 1H) , 7,9 (m, 2H) , 7,5 (m, 3H) , 4,3 (m, 1H) ,

3,9 (m, 2H) , 2,3 (t, 2H) , 1,9 (m, 2H) .

A kiindulási anyagként felhasznált (3) képletű vegyületet a következőképpen állítottuk elő: 0,90 g (5xl0^-3 mól) hippursav és 2,50 g (5x10 mól) L-glutaminsav-dibenzil-észter 35 ml dimetil-formamiddal készített oldatához 0,73 g (5,5xl0^-3 mól) 1-hidroxi-benzotriazolt, 1,4 ml (5,5xl0^-3 mól) trietil-amint és 1,05 g (5,5x10 ³ mól) 1-(3-/dimetil-amino/-propil)-3-etil-karbodiimid-hidrokloridot adtunk. Az elegyet éjszakán át szobahőmérsékleten kevertük, majd 400 ml vízbe öntöttük, és kétszer 100 ml etil-acetáttal extraháltuk. Az extraktumokat egyesítettük, telített vizes nátrium-hidrogén-karbonát oldattal, vízzel, 2 N vizes sósavoldattal, végül ismét vízzel mostuk. A szerves fázist magnézium-szulfát fö•»··

-86lött szárítottuk, majd bepároltjuk. Sárga olaj formájában 2,06 g (84 %) kívánt kiindulási anyagot kaptunk.

NMR spektrum adatai (DMSO-d₆) : 8,7 (t, 1H) , 8,4 (d,

1H), 7,9 (m, 2H), 7,5 (m, 3H), 7,35 (m, 10H), 5,15 (s, 2H),

5,05 (s, 2H) , 4,4 (m, 1H) , 3,9 (t, 2H) , 2,0 (m, 4H) .

10. referencia-példa

Hippuril-L-aszparaginsav előállítása

1,28 g (2,7x10 mól) hippuril-L-aszparaginsav-dibenzil-észter és 0,51 g 50 % nedvességtartalmú 30 %-os palládium/csontszén katalizátor elegyét tetrahidrofuránban, hidro(R) gén atmoszférában 3 órán át kevertük. Az elegyet Celiten szűrtük, és a szűrletet szárazra pároltuk. A maradékot dietil-éterrel eldörzsöltük. 0,62 g (78 %) 200-202°C-on olvadó törtfehér, kristályos anyagot kaptunk. [ a] _D ²⁰ +7,9°.

NMR spektrum adatai (DMSO-d₆) : 12,5 (sz, 2H), 8,7 (t, 1H), 8,2 (d, 1H), 7,7 (m, 2H), 7,5 (m, 3H), 4,6 (m, 1H),

3, 9 (d, 2H), 2,7 (m, 2H) .

A kiindulási anyagot a következőképpen állítottuk elő: 0,90 g (5x10 ³ mól) hippursav és 2,31 g (5x10 ³ mól) L-aszparaginsav-dibenzil-észter 35 ml dimetil-formamiddal készített oldatához 0,73 g (5,5x10 ³ mól) 1-hidroxi-benzotriazolt, 1,4 ml (9,7x10 ³ mól) trietil-amint és 1,05 g (5,5x10 ³ mól) 1-(3-/dimetil-amino/-propil)-3-etil-karbodiimid-hidrokloridot adtunk. Az elegyet 4 órán át szobahőmérsékleten kevertük, majd 450 ml vízbe öntöttük, és kétszer 100 ml etil-acetáttal extraháltuk. Az extraktumot telített vizes nátrium-hidrogén-karbonát oldattal, vízzel, 2 N vizes sósavoldattal, végül ismét vízzel mostuk. A szerves fázist magnézium-szulfát • » · ·

-87• · t ·· · fölött szárítottuk, és szárazra pároltuk. 1,90 g (80 %) kívánt terméket kaptunk sárga olaj formájában.

NMR spektrum adatai (DMSO-d₆) : 8,7 (t, 1H) , 8,45 (d, 1H) , 7,9 (m, 2H) , 7,5 (m, 3H) , 7,3 (m, 10H) , 5,15 (s,

2H), 5,05 (s, 2H) , 4,8 (m, 1H) , 3,9 (m, 2H) , 2,9 (m, 2H) .

11. referencia-példa

Rekombináns HCPB Hipp-Arg-ra kifejtett enzimhatásának mérése

A 20. referencia-példában leírtak szerint előállított tisztított humán CPB hippuril-L-arginint (Hipp-Arg) hippursavvá alakító aktivitását spektrofotometriás úton mértük.

A natív HCPB enzim Km és kcat értékének meghatározására 0,75 mmól és 0,125 mmól közötti koncentrációjú Hipp-Arg oldatokat és 1 μg/ml CPB enzimet felhasználva 254 nm-en mértük a Hipp-Arg hippursavvá alakulásának kezdeti sebességét. A méréseket 37°C-on, 0,25 mmólos Trisz-HCl pufferoldatban (pH 7,5) végeztük, 1,0 ml össztérfogatú, 1 cm-es úthosszú küvettákkal ellátott Perkin-Elmer λ2 spektrofotométeren. A Km és Vmax értékeket Enzfitter számítógépes program (Biosoft

Perkin-Elmer) segítségével számítottuk ki. A kcat értékeket úgy számítottuk ki, hogy a Vmax értékeket osztottuk a reakcióelegy enzimtartalmával. Humán CPB Hipp-Arg-ra kifejtett enzimhatásának vizsgálatakor a következő értékeket kaptuk:

Km = 0,18 mmól, kcat = 65 s ¹.

Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a rekombináns

HCPB enzimatikusan aktív, és képes a Hipp-Arg-ban lévő amidkötés hasításával hippursavat felszabadítani.

-88·»··

12. referencia-példa

Arginin-mustár előgyógyszer szintézise a 27. ábrán bemutatott műveletsorral

Az (5c) képletű (2S) , 2-{ 3-[ 4-(bisz/2-klór-etil/-amino)-fenoxi-karbonil] -propionil-amino} -5-guanidino-pentánkarbonsav előállítása

275 mg (0,44 mmól) (4c) képletű (2S) , 2-{ 3-[ 4-(bisz/2-klór-etil/-amino)-fenoxi-karbonil] -propionil-amino} -5-(2-nitro-guanidino)-penténkarbonsav-benzil-észter 8 ml 1:1 térfogatarányú etil-acetát/metanol eleggyel készített oldatát 200 mg 10 %-os palládium/csontszén katalizátor jelenlétében Parr készülékben, 5,6 bar hidrogénnyomáson 6 órán át hidrogéneztünk. Az elegyet szűrtük, és a szerves fázist bepároltuk.

A kapott olajos anyagot diklór-metán és dietil-éter elegyéből kristályosítottuk.. 180 mg (84 %) (5c) képletű vegyületet kaptunk fehér szilárd anyag formájában.

NMR spektrum adatai (CD₃OD) : 1,55-1,7 (m, 3H) , 1,8-1,9 (m, 1H) , 2,6-2,7 (m, 2H) , 2,75-2,85 (m, 1H) , 2,9-2,95 (m, 1H) , 3,1-3,2 (m, 2H) , 3,6-3,7 (m, 4H) , 3,7-3,8 (m, 4H) ,

4,3 (dd, 1H), 6,75 (dd, 2H) , 6,95 (dd, 2H) .

Tömegspektrum (ESI) : 512-514 (MNa⁺) .

Elemzés a C₂₀H₂₉N₅O₄Cl₂. 1,5 H₂O képlet alapján:

számított: C: 47,91 %, H: 6,43 %, N: 13,97 %, talált: C: 47,7 %, H: 6,21 %, N: 24,26 %.

A (4c) képletű kiindulási anyagot a következőképpen állítottuk elő:

654 mg ( 1 mmól) (2c) képletű (2S),2-amino-5-(2-nitro-guanidino)-penténkarbonsav-benzil-észter 10 ml kloroformmal készített oldatához 120 mg (2 mmól) (1) képletű di-89hidrofurán-2,5-diont adtunk, majd az elegybe 202 mg (2 mmól) trietil-amint csepegtettünk. Az elegyet 2 órán át szobahőmérsékleten kevertük, ezután az oldószert lepároltuk, és a nyers maradékot vízben oldottuk. A vizes oldatot 2 N vizes sósavoldattal pH 2,5-re savanyítottuk, és etil-acetáttal extraháltuk. A szerves fázist vizes nátrium-klorid oldattal mostuk, magnézium-szulfát fölött szárítottuk, majd bepároltuk. A szilárd maradékot dietil-éterrel eldörzsöltük és kiszűrtük. 280 mg (68 %) (3c) képletű (2S),2-(3-karboxi-propionil-amino)-5-(2-nitro-guanidino)-penténkarbonsav-benzil-észtert kaptunk.

NMR spektrum adatai (CD₃OD) : 1,52-1, 68 (m, 2H) ,

1,7-1,8 (m, 1H), 1,85-1,95 (m, 1H), 2,45-2,7 (m, 4H), 3,153,3 (m, 2H), 4,5 (m, 1H) , 5,15 (dd, 2H) , 7,25-7,4 (m, 5H) .

Tömegspektrum (ESI): 432 (MNa)⁺

204 mg (0,5 mmól) (3c) képletű vegyület 5 ml kloroformmal készített szuszpenziójához 135 mg (0,5 mmól) (6) képletű 4-(bisz/2-klór-etil/-amino)-fenolt, 19 mg (0,5 mmól) EDCI-t, majd 18 mg (0,75 mmól) DMAP-t adtunk. Az elegyet 6 órán át szobahőmérsékleten kevertük, majd az oldószert lepároltuk. A maradékot etil-acetát és víz között megoszlattuk, és a vizes fázist 2 N vizes sósavoldattal pH 3-ra savanyítottuk. Etil-acetátos extrahálás után a szerves fázist vízzel mostuk, magnézium-szulfát fölött szárítottuk, majd bepároltuk. A maradékot gyorskromatografálással tisztítottuk, eluálószerként 95:5 térfogatarányú diklór-metán/metanol elegyet használtunk. 281 mg (90 %) (4c) képletű vegyületet kaptunk fehér hab formájában.

NMR spektrum adatai (CD₃OD) : 1,55-1,7 (m, 2H) , 1,7-1,8 (m, 1H) , 1,85-1,95 (m, 1H) , 2,55-2,75 (m, 2H) , 2,8-2,9

(m,	2H) ,	3,15-3,25	(m,	2H) , 3,6-3,7	(m, 4H), 3,7-3,	. 8 (m, 4H) ,
4,5	(dd,	1H), 5,15	(dd,	2H), 6,7 (d,	2H) , 6,95 (d,	2H) , 7,32
(m,	5H) .

Tömegspektrum (ESI) : 647-649 (MNa⁺) .

13. referencia-példa

Borostyánkősav-mono-{ 4-(Ν,Ν-bisz(2-klór-etil)-amino] -fenil} -észter előállítása

225 mg (2,25 mmól) borostyánkősav 10 ml kloroformmal készített szuszpenziójához keverés közben 203 mg (0,75 mmól) 4-[ Ν,Ν-bisz (2-klór-etil) -amino] -fenolt [ a 27 . ábrán szereplő (6) képletű vegyület] , majd 75 mg (0,75 mmól) trietil-amint adtunk. Az elegyet éjszakán át kevertük, majd az oldószert lepároltuk. A nyers maradékot etil-acetát, dietil-éter és víz keverékében oldottuk, és az oldat pH-ját keverés közben 3-ra állítottuk. A szerves fázist vízzel és vizes nátrium-klorid oldattal mostuk, magnézium-szulfát fölött szárítottuk, majd bepároltuk. A kapott olajos anyagot dietil-éter és hexán elegyéből kristályosítottuk. A fehér szilárd anyagot kiszűrtük, és csökkentett nyomáson szárítottuk. 210 mg (83 %) cím szerinti vegyületet kaptunk, amit a leírásban intermedier-nek is nevezünk. Op.: 98-100°C.

Tömegspektrum (ESI) : 356-358 (MNa⁺) .

NMR spektrum adatai (CDC1₃) : 2,8 (dd, 2H) , 2,9 (dd,

2H) , 3,65 (dd, 4H) , 3,75 (dd, 4H) , 6,65 (d, 2H) , 7,0 (d, 2H) .

Elemzés a C₁₄H₁₇C1₂O₄N. 0,2 H₂O képlet alapján:

számított: C: 49,78 %, H: 5,19 %, N: 4,15 %, talált: C: 49,9 %, H: 5,3 %, N: 4,2 %.

• ··

-9114. referencia-példa

Humán pankreasz-eredetű karboxipeptidáz B (HCPB) klónozása

A standard molekuláris biológiai műveleteket, így a restrikciós enzimekkel való emésztést, a ligálást, a kináz-reakciókat, a defoszforilezést, a polimeráz láncreakciót (PCR), a baktérium-transzformálást, a gél-elektroforézist, a pufferkészítést és a DNS termelését, tisztítását és elkülönítését Maniatis és munkatársai módszerével [ Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor, New York, 1989)] vagy az egyes reagensek gyártói által megadott használati útmutatást követve végeztük. Az enzimeket a legtöbb esetben a New England BioLabs cégtől szereztük be, de más cégtől beszerzett enzimeket, illetve ekvivalens műveleteket is alkalmazhatunk. Az oligonukleotid szekvenciákat Applied Biosystems 380A típusú DNS-szintetizátoron állítottuk elő 5'-(dimetoxi-tritil)-bázisban védett nukleozid-2-ciano-etil-N,N'-di-izopropil-foszforamiditekből és szabályozott pórusméretű üveghordozóhoz kötött védett nukleozidokból 0,2 μτηόΐοε méretben, az Applied Biosystems Inc. cég használati útmutatóját követve.

A humán pankreasz-eredetű karboxipeptidáz B-t kódoló szekvenciát kgt 10 vektorba klónozott humán pankreasz-eredetű cDNS-könyvtárból (Clontech, Humán pancreas 5' STRETCH cDNA, HL1163a) alakítottuk ki PCR technikával, és pBluescript II KS+ plazmid vektorba (Stratagene gyártmány) klónoztuk .

!

Jellemzően a következőképpen jártunk el: A cDNS könyvtár 5 μΐ térfogatú alikvotját (amelynek faktora 10⁸ pfu/ml-nél nagyobb volt) 100-100 pmól BPT1 és BPB1 oligonukleotid primerrel (szekvenciájuk a 46. és 47. sz. szekvenciának felel meg) , 200 μιηόΐ dNTP-kkel, Taq polimeráz reakcióhoz használatos pufferoldattal és 2,5 egység Taq polimerázzal összekeverve 100 μΐ végtérfogatú keveréket készítettünk. A keveréket a Taq enzim beadagolása előtt 10 percig 94°C-on inkubáltuk, majd 30 ciklusban 1,5 percig 94°C-on, 2 percig 50 °C-on és 2 percig 72°C-on inkubálva, végül 9,9 percig 72°C-on inkubálva végrehajtottuk a PCR reakciót.

A két oligonukleotid prímért úgy terveztük, hogy a gén 5' végétől felfelé, a pre-szekvencia kezdete és a pro-szekvencia kezdete között a 46. szekvenciájú BPT1 primer, a gén 3' végétől visszafelé pedig a 47. szekvenciájú BPB1 primer tegye lehetővé a PCR-extenziót. A BPT1 és BPB1 primer alkalmas megtervezésével egyúttal két egyedi restrikciós helyet (SacI és Xhol) is beépítettünk a PCR termékébe.

A PCR technikával kapott termék alikvotját agaróz gélen végzett elektroforézissel vizsgáltuk a helyes méretű (mintegy 1250 bázispár) DNS jelenlétére, és azt tapasztaltuk, hogy az főtömegében a helyes méretű DNS-t tartalmazza. A reakcióelegy maradékát Centricon 100 mikrokoncentráló oszlop (Amicon gyártmány) segítségével tisztítottuk és választottuk el a reagensek fölöslegétől, majd a DNS-t etanol és nátrium-acetát elegyével végzett kicsapással és centrifugálással elkülönítettük, csökkentett nyomáson szárítottuk, és ezután desztillált vízben újra szuszpendáltuk. Az elkülönített DNS-t

-93SacI és Xhol restrikciós enzimekkel emésztettük, majd agaróz gélen elektroforézisnek vetettük alá. A gélből kivágtuk a kívánt méretű (mintegy 1205 bázispárból álló) DNS-t tartalmazó sávot, és abból Geneclean üvegemulzióval (Stratec Scientific-gyártmány) vagy más hasonló reagenssel elkülönítettük a terméket.

pBluescript^<R> II KS + kettősszálú DNS-t (Stratagene gyártmány) SacI restrikciós enzimmel emésztettünk, és a terméket - az 5' helyzetű foszforilcsoportok eltávolítására és a transzformálás utáni re-ligáció és vektor-háttér csökkentésére - borjúbél eredetű lúgos foszfatázzal defoszforileztük. A DNS terméket üvegemulzió felhasználásával tisztítottuk meg az enzimes reakció szennyezőanyagaitól, majd Xhol restrikciós enzimmel emésztettük. A terméket agaróz gélen elektroforézisnek vetettük alá, a kívánt méretű (mintegy 2850 bázispárból (R) álló) DNS-t tartalmazó sávot kivágtuk, majd Geneclean (Stratec Scientific-gyártmány) üvegemulzióval vagy más hasonló reagenssel elkülönítettük és tisztítottuk.

Mindkét restrikciós enzimmel kezelt és tisztított

DNS-ből mintát vettünk, és a minták tisztaságát és közelítő koncentrációját agaróz gélen való elektroforézissel vizsgáltuk, ismert standardokkal összehasonlítva. Az így vizsgált DNS-akból ligációs elegyeket készítettünk a HCPB gén vektorba való klónozására. A vektor/inszert mólarányt körülbelül l:2,5-re állítottuk be (1 mól pBluescript^(R| II KS + -hoz tehát kb. 2,5 mól HCPB PCR terméket használtunk), a végső DNS koncentrációt körülbelül 2,5 ng^l-re állítottuk be, és a reakciót T4 DNS ligáz, 1 mmól ATP és enzim-puffer jelenlétében végeztük.

-94A ligálási reakció után a DNS elegyet E. coli DH5oc törzsbeli sejtek (Gibco-BRL, maximális hatékonyságú kompetens sejtek) transzformálására használtuk. A sejtek alikvotjait L-agar táptalajon (ami a plazmid vektor szelektálására 100 gg/ml ampicillint tartalmazott) szélesztettük, és éjszakán át 37°C-on inkubáltuk. A kívánt inszerteket hordozó plazmidokat tartalmazó telepeket hibridizáció útján azonosítottuk.

Körülbelül 200 telepet emeltünk ki, és a telepeket kétszeres ismétlésben L-agar táptalaj-lemezeken (a táptalaj a plazmid vektor szelektálására 100 gg/ml ampicillint tartalmazott) előnedvesített steril nitrocellulóz szűrőkre (Schleichter and Schull gyártmány) helyeztük. A telepeket éjszakán át 37°C-on inkubáltuk. A lemezpár egyikét 4°C-on tároltunk (ezt telepképzéshez élő sejt-forrásként használtuk), a másik lemezt pedig denaturáló és a telepekből származó DNS-t a nitrocellulózhoz rögzítő kezelésnek vetettük alá. A nitrocellulóz szűrőt leemeltük az agarlemezről, és Whatman szűrőpapírra helyezve egymás után

1.	10		%-os SDS oldatban	2 percig,
2 .	o,	5	mólos	NaOH +	1,5	mólos	NaCl	oldatban	7	percig,
3 .	0,	5	mólos	NaOH +	1,5	mólos	NaCl	oldatban	4	percig,
4 .	o,	5	mólos	NaOH +	1,5	mólos	NaCl	oldatban	2	percig,
5. 0, cig,	5	mólos	Trisz	(pH	7,4) +	1,5 :	mólos NaCl		oldatban

6. 2xSSC oldatban (standard nátrum-kloridos cifrát oldat) 2 percig áztattuk. Ezután a szűrőt lOxSSC oldatban áztatott /R\

Whatman szűrőpapírra helyeztük, és a denaturált DNS-t í R1

Spectrolinker XL-1500 UV crosslinker készüléken ultraibolya

-95fénnyel besugározva keresztkötésekkel a nitrocellulózhoz kapcsoltuk. A szűrőket szobahőmérsékleten levegőn megszáradni hagytuk, majd 6xSSC oldatban 60°C-on, enyhe keverés közben (például Techne HB-1D hibridizátort használva) előhibridizáltuk. Az előhibridizálás a nemspecifikus DNS kötőhelyeket blokkolja a szűrőn.

Annak meghatározására, hogy a telepek közül melyek tartalmazzák a kivánt DNS inszerteket, a nitrocellulóz szűrőhöz kötött DNS-t pankreasz eredetű cDNS könyvtár HCPB PCRtermékéből (előállítását lásd fent) készített ³²P-DNS próbával hibridizáltuk. Körülbelül 50 ng DNS-t T7 DNS polimeráz felhasználásával, összesen 50 μΐ térfogatú reakcióelegyben (Pharmacia T7 Quickprime készlet) 50 μθί ³²P-dCTP-vel (aktivitása: kb. 3000 Ci/mmól) jeleztünk, és az elegyet 15 percig 37°C-on tartottuk. Ezután a jelzett próbát a kettősszálú DNS denaturálására 2 percig 95°C-on tartottuk, majd azonnal 10 ml 60°C-os 6xSSC oldathoz adtuk, és az így kapott oldattal helyettesítettük az előhibridizáló oldatot a szűrőn. A szűrőket enyhe keverés közben körülbelül 3 órán át 60°C-on inkubáltuk, majd a hibridizáló oldatot leöntöttük, és a szűrőket két alkalommal 15-15 percig 60°C-os 2xSSC oldattal mostuk. A szűrőket finoman szárazra itattuk, tapadóiilmmel (Sárán^<R) borítóval vagy hasonló anyaggal) fedtük, és éjszakán át szobahőmérsékleten röntgenfilmre (például Kodak Xomat-AR5 filmre) exponáltuk. A film előhívása után a kívánt inszerteket tartalmazó telepeket a legsötétebb foltot adó (legerősebb expozíciójú) telepekként azonosítottuk. Ebben a kísérletsorozatban a telepek mintegy 15 %-a adott pozitív hibridizációs reakciót.

Ezekből 12 telepet választottunk ki további szűrés céljára. A

-96kiválasztott telepeket leemeltük a két szűrősorozatról, 100 pg/ml ampicillint tartalmazó L-agar táptalajra vittük fel, és

100 pg/ml ampicillint tartalmazó L-táptalajon tenyésztettük.

A kiválasztott izolátumokat PCR technikával vizsgáltuk a helyes méretű inszertek jelenlétére. Az eljárásban BPT1 és BPB1 prímért (szekvenciájuk a 46. és 47. szekvenciának felel meg), valamint primelésre egy közbülső BPT2 prímért (szekvenciája a 48. szekvenciának felel meg) és BPBl-et használtunk. A BPT2 prímért úgy terveztük, hogy a primelés az érett gén kezdete előtt, a pro-szekvencia végénél menjen végbe, és Xbal restrikciós hely épüljön be a molekulába.

PCR szűrővizsgálat céljára a kiválasztott izolátumokból telepeket emeltünk ki, 200 μΐ desztillált vízben diszpergáltuk, és zárt Eppendorf^(R| csőben 10 percig 100°C-on tartottuk. Ezután a szuszpenziókat a sejttörmelék pelletezése céljából mikrocentrifugán 10 percig centrifugáltuk, és 1 μΐ így kapott felülúszót használtunk DNS templátként a PCR szűrővizsgálatban. Jellemzően a következőképpen jártunk el: 1 μΐ felülúszót 20-20 pmól BPT1 és BPB1 (vagy BPT2 és BPB1) oligonukleotid primerrel, 200 pmól (végkoncentráció) dNTP-kkel,

Taq polimeráz reakciókhoz használatos pufferoldattal és 0,5 egység Taq polimerázzal összekeverve 20 μΐ végtérfogatú keveréket készítettünk. A keveréket 25 ciklusban 1,5 percig 94°C-on, 2 percig 50°C-on és 2 percig 72°C-on inkubálva, végül 9,9 percig 72°C-on inkubálva végrehajtottuk a PCR reakciót.

A PCR technikával kapott termékeket agaróz gélen végzett elektroforézissel vizsgáltuk a helyes méretű DNS (a

BPT1 primertől a BPB1 primerig mintegy 1250 bázispár, és a

-97ΒΡΤ2 primertől a BPB1 printerig mintegy 900 bázispár, lásd a 18. ábrát) jelenlétére. A 12 klón közül tízből képződött helyes méretű DNS termék a PCR technika során. A tíz klón közül hatot használtunk fel plazmid DNS előállítására (100 μg/ml ampicillint tartalmazó L-táptalajon éjszakán át 37°-on tartott tenyészet 100 ml-éből indultunk ki, és Qiagen Maxi reagenskészletet használtunk). A kapott plazmid DNS preparátu(D \ mókát a PCR termék inszertjének tartományában USB Sequenase

DNS-szekvenáló reagenskészlettel (bakteriofág T7 DNS polimerázt is tartalmaz) szekvenáltuk. Mindegyik kiónt 8 külön oligonukleotid primer (a 676, 336, 337, 679, 677, 1280, 1279 és

1281 jelű primer, szekvenciájuk a 48-55. szekvenciának felel meg) felhasználásával szekvenáltuk. A szekvenáló primerek elhelyezkedését a HCPB szekvenciában a 19. ábrán szemléltetjük;

a 336, 1279, 676, 1280, 677 és 1281 primer előre, a 337 és

9 primer vissza irányú.

A vizsgált hat kiónból négynél észleltük egy 1263 bázispárból álló, SacI és Xhol restrikciós helyet tartalmazó azonos szekvencia (az 56. sz. szekvencia) jelenlétét. A további kísérletekben ezt a szekvenciát használtuk. A DNS szekvenciáról leolvasható polipeptid szekvenciája a szekvencia-jegyzéken feltüntetett 57. szekvenciának felel meg, ahol a számozás (1-től) az érett fehérje-szekvencia kezdetétől indul. A -95-ös számú aminosav a feltételezett pro-enzim szekvencia kezdetét jelzi. A klónozott, PCR-val képezett DNS-ben az enzimszekréció leader szekvenciájának (pre-szekvenciájának) csak egy része van jelen. A polipeptid szekvenciában a

253 helyzetben aszparaginát maradék található, ami - a teljes szekvenciát más emlős karboxipeptidáz A és B szekvenciákkal

-98egybevetve - B-típusú specificitást jelez [ lásd a Catasus és munkatársai által 255-ként számozott aminosavat és az ahhoz fűzött értékelést; Biochem. J. 287, 299-303 (1992)] . A klónozott szekvencia 135-ös helyzetében lévő cisztein maradék azonban más publikált humán pankreasz-eredetű karboxipeptidáz-B szekvenciákban nem észlelhető [ lásd Yamamoto és munkatársai: Journal of Biological Chemistry 267, 2575-2581 (1992), ahol a szerző kimutatja, hogy az általa vizsgált szekvenciában - más emlős pankreasz-eredetű karboxipeptidáz-B aminosav-szekvenciákkal egybevetve - a 244-es hely után hiány van] . 1 19. ábrán az enzim felismerési helyében található aszparaginát aminosav maradék és az érett enzim 135-ös helyzetében lévő cisztein maradék közelítő elhelyezkedését is feltüntettük

A fenti kiónok egyikét 1995. november 23-án NCIMB

40694 számon helyeztük letétbe a National Collection of Industrial and Maríné Bacteria Ltd. (23 St Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Scotland) gyűjteményben. Az ebből a klónból származó plazmid pICI1698 néven ismert.

15. referencia-példa

Érett HCPB-(His)₆-c-Myc kifejezése E. coliban Érett HCPB E. coliban való kifejezésére a pICI1698-ból származó érett gént fehérjetermékek baktériumok periplazmájába való szabályozott kiválasztását lehetővé tevő plazmid vektorba vittük át. Ezt a pICI266 jelű szekréciós vektort a szabályozott kifejezésre alkalmas MSD522 baktérium gazdaszervezetben 1993. október 11-én NCIMB 40589 számon helyeztük letétbe a National Collection of Industrial and Maríné Bacteria Ltd. (Aberdeen AB2 1RY, Scotland) gyűjteményben. A pICI266 plazmid térképét a 20. ábrán szemléltetjük. A plaz• ·

-99midnak tetraciklin rezisztencia- és indukció-génjei (TetA és TetR), a beépített gén kifejezésére alkalmas AraB operátor és promotor szekvenciája, és a kifejezést szabályozó AraC génje van. A promotor szekvenciáját a PelB transzláció leader szekvencia követi, ami az azt követő polipeptid szekvenciát a periplazmába irányítja. A gén klónozási helyén számos egyedi restrikciós hely van, amit egy T4 fág transzkripciót leállító szekvencia követ. Ennek a régiónak a DNS-szekvenciáját és a gén klónozási jellemzőit a 21. ábrán szemléltetjük.

Az érett HCPB szekvencia pICI266 plazmidba való klónozására PCR technikával alakítottunk ki HCPB DNS-t, és az érett gén kezdetén lévő kodon módosításával az E. coli által preferált kodont iktattunk be. Ezen kívül a kifejező szerkezet azonosításának és tisztításának megkönnyítésére az enzimhez (His)₆-c-myc C-terminális peptid-toldalékot illesztettünk. A toldalék 6 hisztidinből, egy tripeptid-kapcsolóból (EPE) és egy c-myc-ből származó peptid-szekvenciából (EQKLISEEDL) áll, amit a 9E10 antitest felismer [ lásd Evan és munkatársai: Mól. Cell Bioi. .5, 129-136 (1985), az antitest a

Cambridge Research Biochemicals-tól szerezhető be] . A C-terminális részt egy Asp hozzáadásával egészítettük ki. A hat hisztidin-maradéknak lehetővé kell tennie a kifejezett fehérje tisztítását fémkelát oszlopon [ például Nj_-NTA agaróz oszlopon (Qiagen gyártmány)] . Ezen túlmenően a PCR technikában használt primerekkel (azaz az FSPTS1 és 6HIS9E10R1BS1 printerrel, amelyek szekvenciája az 58. és 59. szekvenciának felel meg) egyedi restrikciós helyeket (Fspl, illetve EcoRI) építettünk a gén 5' és 3' végébe annak érdekében, hogy elősegítsük a PCR termék beépülését a kifejező vektorba.

-100A pICI266-ba klónozandó módosított gént PCR technikával alakítottuk ki. A reakciókhoz 100-100 pmól FSPTS1 és

6HIS9E10R1BS1 prímért körülbelül 5 ng pICI1698 DNS-el, 200 μπιόΐ (végkoncentráció) dNTP-kkel, Taq polimeráz reakcióhoz használatos pufferoldattal és 2,5 egység Taq polimerázzal összekeverve 100 μΐ végtérfogatú keveréket készítettünk. A keveréket a Taq enzim beadagolása előtt 10 percig 94°C-on tartottuk, majd 30 ciklusban 1,5 percig 94°C-on, 2 percig 50 °C-on és 2 percig 72°C-on inkubálva, végül 9,9 percig 72°C-on inkubálva végrehajtottuk a PCR reakciót. A PCR technikával kapott termék alikvotját agaróz gélen végzett elektroforézissel vizsgáltuk a helyes méretű (mintegy 1000 bázispár) DNS jelenlétére, és azt tapasztaltuk, hogy az főtömegében a helyes méretű DNS-t tartalmazza. A reakcióelegy maradékát Centricon 100 mikrokoncentráló oszlopon (Amicon gyártmány) tisztítottuk és választottuk el a reagensek fölöslegétől, majd a DNS-t etanol és nátrium-acetát elegyével végzett kicsapással és centrifugálással elkülönítettük, csökkentett nyomáson szárítottuk, és desztillált vízben újra szuszpendáltuk. Az elkülönített DNS-t Fspl és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztettük, majd agaróz gélen elektroforézisnek vetettük alá. A gélből kivágtuk a kívánt méretű (mintegy 1000 bázispárból álló) DNS-t tartalmazó sávot, és abból Geneclean™ üvegemulzióval vagy más hasonló reagenssel elkülönítettük a terméket.

A pICI266 kettősszálú DNS-t, amit standard DNS technológiával, Qiagen plazmid reagenskészlet vagy hasonló reagensek felhasználásával állítottunk elő, KpnI restrikciós

-1 Öltél jes legyen. Ezután az enzim inaktiválására az elegyet 10 percig 65°C-on tartottuk, majd jégen lehűtöttük. A KpnI által kialakított 3' nyúlványt a forgalmazó (New England BioLabs) útmutatását követve, dNTP-k jelenlétében T4 DNS polimerázzal <

percig 16°C-on végzett inkubálással enzimesen emésztettük. A reakció leállítására az elegyet 15 percig 70°C-on tartva inaktiváltuk az enzimet. A DNS terméket üvegemulzió felhasználásával tisztítottuk meg az enzimes reakció szennyezőanyagaitól, a termék alikvot részét agaróz gél-elektroforézisnek alávetve meghatároztuk a kitermelést, és a maradékot EcoRI restrikciós enzimmel emésztettük. Ismét ügyeltünk arra,, hogy az emésztés teljes legyen. Ezután agaróz gél-elektroforézissel, a megfelelő sáv kivágásával, és üvegemulzióval végzett kezeléssel [ Geneclean -t (Stratec Scientific-gyártmány) vagy hasonló terméket használva] elkülönítettük és tisztítottuk a helyes méretű (mintegy 5600 bázispárból álló) DNS-t.

Mindkét restrikciós enzimmel kezelt és tisztított

DNS-ből mintát vettünk, és a minták tisztaságát és közelítő koncentrációját agaróz gélen való elektroforézissel vizsgáltuk, ismert standardokkal összehasonlítva. Az így vizsgált DNS-akból ligációs elegyeket készítettünk a HCPB gén vektorba való klónozására. A vektor/inszert mólarányt körülbelül l:2,5-re állítottuk be (1 mól pICI266-hoz tehát kb. 2,5 mól HCPB PCR terméket használtunk), a végső DNS koncentrációt körülbelül 2,5 ng/^l-re állítottuk be, és a reakciót T4 DNS ligáz, 1 mmól ATP és enzim-puffer jelenlétében, a tompavégű DNS-ak (Fspl a T4 DNS polimerázzal kezelt KpnI-hez) ligálására alkalmas körülmények között végeztük.

-102A ligálási reakció után a DNS elegyet E. coli DH5ot törzsbeli sejtek (Gibco-BRL, maximális hatékonyságú kompetens sejtek) transzformálására használtuk. A sejtek alikvotjait L-agar táptalajon (ami a plazmid vektor szelektálására 10 gg/ml tetraciklint tartalmazott) szélesztettük, és éjszakán át 37°C-on inkubáltuk. A kívánt inszerteket hordozó plazmidokat tartalmazó telepeket hibridizáció útján azonosítottuk.

Körülbelül 350 telepet emeltünk ki, és a telepeket kétszeres ismétlésben L-agar táptalaj-lemezeken (a táptalaj a plazmid vektor szelektálására 100 μg/ml tetraciklint tartalmazott) előnedvesített steril nitrocellulóz szűrőkre (Schleichter és Schull gyártmány) helyeztük. A telepeket éjszakán át 37°C-on inkubáltuk. A lemezpár egyikét 4°C-on tároltuk (ezt telepképzéshez élő sejt-forrásként használtuk), a másik lemezt pedig denaturáló és a telepekből származó DNS-t a nitrocellulózhoz rögzítő kezelésnek vetettük alá. A nitrocellulóz szűrőt leemeltük az agarlemezről, és Whatman^(R| szűrőpapírra helyezve egymás után

1. 10 %-os SDS oldatban 2 percig,

2 .	0,5	mólos	NaOH	+	1,5	mólos	NaCl	oldatban	7	percig,
3 .	0,5	mólos	NaOH	+	1,5	mólos	NaCl	oldatban	4	percig,
4 .	0,5	mólos	NaOH	+	1,5	mólos	NaCl	oldatban	2	percig,

5. 0,5 mólos Trisz (pH 7,4) +1,5 mólos NaCl oldatban 2 percig,

6. 2xSSC oldatban (standard nátrium-kloridos cifrát oldat) 2 percig áztattuk. Ezután a szűrőt lOxSSC oldatban áztatott (R)

Whatman szűrőpapírra helyeztük, és a denaturált DNS-t

Spectrolinker XL-1500 UV crosslinker készüléken ultraibolya

-103fénnyel besugározva keresztkötésekkel a nitrocellulózhoz kapcsoltuk. A szűrőket szobahőmérsékleten levegőn megszáradni hagytuk, majd 6xSSC oldatban 60°C-on, enyhe keverés közben (például Techne HB-1D hibridizátort használva) előhibridizáltuk. Az előhibridizálás a nemspecifikus DNS kötőhelyeket blokkolja a szűrőn.

Annak meghatározására, hogy a telepek közül melyek tartalmazzák a kívánt DNS inszerteket, a nitrocellulóz szűrőhöz kötött DNS-t pankreasz eredetű cDNS könyvtár HCPB PCR-termékéből (előállítását lásd fent) készített ³²P-DNS próbával hibridizáltuk. Körülbelül 50 ng DNS-t T7 DNS polimeráz felhasználásával, összesen 50 μΐ térfogatú reakcióelegyben (Pharmacia T7 Quickprime készlet) 50 μ(3ΐ ³²P-dCTP-vel (aktivitása: kb. 3000 Ci/mmól) jeleztünk, és az elegyet 15 percig 37°C-on tartottuk. Ezután a jelzett próbát a kettősszálú DNS denaturálására 2 percig 95°C-on tartottuk, majd azonnal 10 ml 60°C-os 6xSSC oldathoz adtuk, és az így kapott oldattal helyettesítettük az előhibridizáló oldatot a szűrőn. A szűrőket enyhe keverés közben körülbelül 3 órán át 60°C-on inkubáltuk, majd a hibridizáló oldatot leöntöttük, és a szűrőket két alkalommal 15-15 percig 60°C-os 2xSSC oldattal mostuk. A szűrőket finoman szárazra itattuk, tapadófilmmel (Saran^(R) borítóval vagy hasonló anyaggal) fedtük, és éjszakán át szobahőmérsékleten röntgenfilmre (például Kodak Xomat-AR5^(R) filmre) exponáltuk. A film előhívása után a kívánt inszerteket tartalmazó telepeket a legsötétebb foltot adó (legerősebb expozíciójú) telepekként azonosítottuk. Ebben a kísérletsorozatban a telepek mintegy 50 %-a adott pozitív hibridizációs reakciót. Ezekből 12 telepet választottunk ki további szűrés céljára. A <♦·

-104kiválasztott telepeket leemeltük a két szűrősorozatról, 100 gg/ml tetraciklint tartalmazó L-agar táptalajra vittük fel, és 100 μg/ml tetraciklint tartalmazó L-táptalajon tenyésztettük .

A kiválasztott izolátumokat PCR technikával vizsgáltuk a helyes méretű inszertek jelenlétére. Az eljárásban FSPTS1 és 6HIS9E10R1BS1 prímért (szekvenciájuk az 58. és 59. szekvenciának felel meg), valamint primelésre egy belső BPB2 prímért (szekvenciája az 51. szekvenciának felel meg) és FSPTl-et használtunk. A BPB2 prímért úgy terveztük, hogy a primelés az érett génen belül menjen végbe, és körülbelül 430 bázispárból álló fragmens képződjön.

PCR szűrővizsgálat céljára a kiválasztott izolátumokból telepeket emeltünk ki, 200 μΐ desztillált vízben diszpergáltuk, és zárt Eppendorf^<R) csőben 10 percig 100°C-on tartottuk. Ezután a szuszpenziókat a sejttörmelék pelletezése céljából mikrocentrifugán 10 percig centrifugáltuk, és 1 μΐ így kapott felülúszót használtunk DNS templátként a PCR szűrővizsgálatban. Jellemzően a következőképpen jártunk el: 1 μΐ felülúszót 20-20 pmól FSPTS1 és 6HIS9E10R1BS1 (vagy FSPTS1 és

BPB2) oligonukleotid primerrel, 200 μπιόΐ (végkoncentráció) dNTP-kkel, Taq polimeráz reakciókhoz használatos pufferoldattal és 0,5 egység Taq polimerázzal összekeverve 20 μΐ végtérfogatú keveréket készítettünk. A keveréket 25 ciklusban 1,5 percig 94°C-on, 2 percig 50°C-on és 2 percig 72°C-on inkubálva, végül 9,9 percig 72°C-in inkubálva végrehajtottuk a PCR reakciót.

-105A PCR technikával kapott termékeket agaróz gélen végzett elektroforézissel vizsgáltuk a helyes méretű DNS (az FSPTS1 primertől a 6HIS9E10R1BS1 primerig mintegy 1000 bázispár és az FSPTS1 primertől a BPB2 primerig mintegy 430 bázispár) jelenlétére. Mind a 12 kiónból a helyes méretű DNS termék képződött a PCR technika során. A kiónok közül hatot használtunk fel plazmid DNS előállítására (100 gg/ml tetraciklint tartalmazó L-táptalajon éjszakán át 37°C-on tartott tenyészet 100 ml-ebol indultunk ki, és Qiagen Maxi reagenskészletet használtunk). A kapott plazmid DNS preparátumokat a PCR termék inszertjének tartományában USB Sequenase¹”¹ DNS-szekvenáló reagenskészlettel (bakteriofág T7 DNS polimerázt is tartalmaz) szekvenáltuk. [Más megoldás szerint a DNS ABI automata szekvenáló készülékkel is szekvenálható.] A klónokat több külön oligonukleotid primer felhasználásával szekvenáltuk. A primerek közül hárommal (az 1504, 1590 és 1731 jelű primerrel, szekvenciájuk a 60., 61. és 62. szekvenciának felel meg) a kifejező vektor és a beillesztett gén közötti klónozó kapcsolatokat ellenőriztük, és a beillesztett gén kezdetének és végének szekvenciáját határoztuk meg. A többi primerrel, köztük a 679, 677, 1802 és 1280 jelű primerrel (szekvenciájuk az 51., 52., 63. és 53. szekvenciának felel meg) a beillesztett gén maradékának szekvenciáját határoztuk meg. Ez a módosított érett HCPB gént tartalmazó plazmid a pICI1712 plazmid. A klónozott gén fentiek szerint meghatározott szekvenciáját és az arról leolvasott aminosav-szekvenciát a PelB szekvencia kezdetétől a (His)₆-c-myc toldalék végéig a szekvencia-jegyzékben 64. számon szerepeltettük. A DNS-akat a PelB-ben lévő első kodont 1-esnek véve, a pepiidet

-10 6alkotó aminosavakat az érett HCPB kezdetét 1-esnek véve számoztuk .

A módosított HCPB szabályozott kifejezésére a pICI1712 plazmid DNS-t kalcium-kloridos transzformációra alkalmas E. coli törzsekbe transzformáltuk. Az ilyen törzsek egy része fő szénforrásként arabinózt tartalmazó táptalajon képtelen növekedni, ezért azok kromoszómájából kiiktatták az arabinóz (Ara) operont. Az egyik ismert, előnyös törzs az

MSD213 törzs [ a Casadaban és munkatársai által leírt MC1000 törzs, Journal of Molecular Biology 138, 179-208 (1980)], amelynek részleges genotípusa F-Ara A(Ara-Leu) ALacX74 GalV

GalK StrR. További előnyös törzs az MSD525 (más jelölés szerint MC1061) törzs, amelynek genotípusa AraD139 Δ(Ara Leu)

7697 ALac74 GalU HsdR RpsL. A The E. coli Genetic Stock

Centre, Department of Biology, Yale University (CT, USA) gyűjteményből hasonló genotípusba tartozó más olyan E. coli törzsek is beszerezhetők, amelyek képesek géneket szabályozottan kifejezni a pICI266 plazmidban lévő AraB promotorból.

A transzformáláshoz a sejteket 10 μg/ml tetraciklint tartalmazó L-agar táptalajon éjszakán át 37°C-on végzett tenyésztéssel szelektáltuk. A táplemezekről egyedi telepeket emeltünk ki, szélesztéssel tisztítottuk, 10 μg/ml tetraciklint tartalmazó L-agar táptalajon tartottuk fenn, és 10 μg/ml tét raciklint tartalmazó L-táptalajon növesztettük.

Valamennyi pICI1712-vel transzformált kifejező tör zset azonos módon vizsgáltunk a klónozott HCPB gén kifejeződésének megtörténtére. A vizsgálat menete a következő volt:

-1 ΟΤΙ) 25 ml űrtartalmú Universal tartályba töltött, 10 μg/ml· tetraciklint tartalmazó 10 ml L-táptalajt egyetlen teleppel oltottunk be, és éjszakán át rázás közben 37°C-on inkubáltuk.

2) 250 ml űrtartalmú Erlenmeyer lombikba 75 ml 10 μg/ml tetraciklint tartalmazó L-táptalajt töltöttünk, a táptalajt 37°C-ra előmelegítettük, majd 0,75 ml (1 térfogat %) fenti tenyészettel oltottuk be. Az inkubálást rázás közben 37 °C-on folytattuk, és a növekedést a fényabszorbancia 540 nm-en való mérésével követtük. A tenyészet exponenciális növekedési szakaszában a klónozott fehérje kifejeződésének indukálására volt szükség, amit 0,4 és 0,6 optikai sűrűség-egység között (540 nm-en mérve), rendszerint a beoltást követő 90-150. percben végeztünk.

3) Amikor a tenyészet optikai sűrűsége elérte a kívánt értéket, a lombikokat 30 percig szobahőmérsékletű térbe helyezve a tenyészeteket körülbelül 30°C-ra hagytuk hűlni. Ezután a tenyészetekhez 1 tömeg/térfogat % végkoncentrációnak megfelelő mennyiségű arabinózt adtunk, és az inkubálást rázás közben 30°C-on 4-6 órán át folytattuk.

4) Inkubálás után ismét mértük a tenyészet optikai sűrűségét, majd a sejteket centrifugálással összegyűjtöttük. Az optikai sűrűségmérés eredménye alapján kiszámítottuk a sejtpellet újraszuszpendálásához szükséges, fehérjék akrilamid-gélre való felviteléhez használt Laemmli-pufferoldat [ 2 %

SDS-t, 2 % β-merkapto-etanolt, 10 % glicerint és 0,1 % brómfenol-kéket tartalmazó 0,125 mólos Trisz-HCl pufferoldat (pH 6,8)] mennyiségét. 1-nél kisebb optikai sűrűség esetén 0,1 ·· ·

-108optikai sűrűség-egységenként 10 μΐ Laemmli-pufferoldatot, 1-nél nagyobb optikai sűrűség esetén 0,1 optikai sűrűség-egységenként 15 μΐ Laemmli-pufferoldatot használtunk.

5) Újraszuszpendálás után a mintákat 10 percig 100 °C-on tartva denaturáltuk, majd a viszkózus sejttörmeléket centrifugálással elválasztottuk a felülúszótól. A felülúszóból (rendszerint 20 μΐ térfogatú) mintát vettünk, és a mintát a fehérjék elektroforetikus szétválasztására (rendszerint 17 %-os) SDS akrilamid gélre vittük fel. Általában két párhuzamos futtatást végeztünk, és az egyik lemezen (Coomassie-val vagy hasonló festékkel végzett festés után) az összfehérjét mutattuk ki, míg a másik lemezt Western analízissel specifikus termékek jelenlétére vizsgáltuk.

Western analízis céljára a gélen futtatott fehérjéket Bio-Rad típusú (vagy más hasonló) félszáraz elektroforetikus átvivő készülék segítségével nylon membránra (például az Applied Biosystems-től beszerezhető Problot membránra) vittük át, ügyelve arra, hogy a membrán az analízis előtt és alatt nyirkos legyen. A fehérjék átvitele után a további kötődések megakadályozására a membránt szobahőmérsékleten, enyhe keverés közben 5 órán át 5 % kis zsírtartalmú tejport (Marvei -t vagy hasonló terméket) tartalmazó foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) kezeltük. Ezután a membránt három alkalommal szobahőmérsékleten, enyhe keverés közben 5 percig mostuk 0,05 % Tween 20-at tartalmazó PBS-tal. Ezután a mosott membránt 0,05 % Tween 20-at és 0,5 % kis zsírtartalmú tejport tartalmazó PBS-tal megfelelően (jellemzően 1:10 000 /ascites esetén/ vagy 1:40 /hibridóma tenyészet felülúszó esetén/ ai

-10 9rányban) hígított primer antitesttel, azaz monoklónos 9E10 egér anti-c-myc pepiiddel (lásd fent) éjszakán át szobahőmérsékleten, enyhe keverés közben inkubáltuk. Ezután a membránt szobahőmérsékleten, enyhe keverés közben háromszor legalább 5-5 percig mostuk 0,05 % Tween 20-at tartalmazó PBS-tal. A mosott membránt ezután 0,05 % Tween 20-at és 0,5 % kis zsírtartalmú tejport tartalmazó PBS-tal megfelelően (jellemzően 1:10 000 arányban) hígított szekunder antitesttel, azaz torma peroxidázzal jelzett anti-egér IgG-vel (jellemzően kecskében kifejlesztett anyag, mint például a Sigma cég A4416 jelű terméke) szobahőmérsékleten, enyhe keverés közben legalább 3 órán át inkubáltuk. A membránt szobahőmérsékleten, enyhe keverés közben háromszor legalább 10-10 percig mostuk 0,05 %

Tween 20-at tartalmazó PBS-tal. A membránt az Amersham ECL^(R) Western detektáló készlet használati útmutatójának megfelelően feldolgoztuk, majd első lépésben 30 másodpercig, ezután pedig a kifejezett fehérje-sávok tiszta leképezését lehetővé tevő időszakokig Amersham Hyperfilm^<R) ECL-re exponáltuk. Analízis céljára a membránra felvitt, peroxidázzal jelzett fehérjéket hasonló érzékenységgel kimutató más módszereket is alkalmazhatunk.

A Coomassie-val megfestett gélek vizsgálata azt igazolta, hogy a,pICI266-ba klónozott, toldalékkal ellátott HCPB (pICI1712) az MSD213 és MSD525 E. coli törzsekben jól kifejeződött. A géleken - a csak a pICI266 vektort tartalmazó kiónokkal összehasonlítva - egy további, körülbelül 35 000 dalton tömegű fehérjének megfelelő erős sáv is megjelent. Egy azonos méretű fehérje sávja a c-myc peptid-toldalék Westernanalízissel való kimutatásakor erős jelet adott.

-11016. referencia-példa

Érett HCPB kifejezése E. coliban

Az érett HCPB klónozására és E. coliban való kifejezésére a 15. referencia-példában leírthoz nagymértékben hasonló módszert használtunk. Klónozó vektorként ebben az esetben is pICl266-ot használtunk, de most az érett HCPB gén PCR-val való előállításának kiindulási anyaga a pICI1712 plazmid (a toldalékkal ellátott gént tartalmazó kifejező vektor) volt. A PCR reakcióban az FSPTS1 és 6HIS9E10R1BS1 primerek helyett két, 2264 és 2265 jelű oligonukleotidot (szekvenciájuk a szekvencia-jegyzékben szereplő 65. és 66. szekvenciának felel meg) használtunk. A PCR reakciót a 15. referencia-példában leírtakhoz hasonló körülmények között végeztük, de pICI1698 helyett pICI1712 DNS-t használtunk. Az első (a felső szálhoz használt), 2264 jelű oligonukleotidot úgy terveztük, hogy a primelés a pICI1712-n menjen végbe, a PelB leader szekvenciában Ncol restrikciós enzim kötőhely legyen jelen, és a beillesztett érett HCPB gén kezdetéig folytatódjon (a szekvencia-jegyzékben szereplő 64. szekvencia 36-66. DNS-bázisa). A második (az alsó szálhoz használt), 2265 jelű oligonukleotidot úgy terveztük, hogy a primelés az érett HCPB gén végénél, a (His)₆-c-myc toldalék-szekvencia kezdete előtt (a szekvencia-jegyzékben szereplő 64. szekvencia 965-987. DNS-bázisaival komplementer szekvencián) menjen végbe, és a gén végénél a TAA TAA-val komplementer transzlációt leállító kodonokat, majd ezután egy EcoRI (GAATTC) restrikciós enzim kötőhelyet és kitöltő bázisokat iktasson be. Ez az oligonukleotid a PCR során a génbe primel vissza, és lehetővé teszi az érett génszekvencia elkülönítését.

φ -111Α PCR termék alikvotját agaróz gél-elektroforézissel a helyes méretű (körülbelül 970 bázispárból álló) DNS jelenlétére elemezve azt tapasztaltuk, hogy az túlnyomórészt a helyes méretű DNS-nek megfelelő sávot szolgáltat. A reakciótermék maradékát a 15. referencia-példában leírtakhoz hasonlóan tisztítottuk. Az elkülönített DNS-t Ncol és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztettük, és a helyes méretű (körülbelül 940 bázispárból álló) sávot a 15. referencia-példában leírtakhoz hasonlóan tisztítottuk.

A 15. referencia-példában leírtakhoz hasonlóan előállított pICI266 kettősszálú DNS-t Ncol és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztettük, gondosan ügyelve arra, hogy az emésztés mindkét esetben teljes legyen. A helyes méretű (körülbelül 5600 bázispárból álló) DNS-t a 15. referencia-példában leírtakhoz hasonlóan tisztítottuk.

A restrikciós enzimekkel kezelt és a tisztított

DNS-ek mintáinak tisztaságát és koncentrációját agaróz gél-elektroforézis alapján, ismert standardokkal összehasonlítva becsültük. Az így vizsgált anyagokból ligációs elegyeket készítettünk, és a HCPB gént a 15. referencia-példában leírtakhoz hasonlóan a pICI266 vektorba klónoztuk.

A ligálási reakció után a DNS-eleggyel DH5ct E. coli törzset transzformáltunk, majd telepeket emeltünk ki, és ezeket hibridizációval vizsgáltuk. Ezeket a műveleteket a 15. referencia-példában leírtakhoz hasonlóan végeztük.

Ezután a kiónok közül 6-ot használtunk fel plazmid DNS előállítására a 15. referencia-példában leírthoz hasonló eljárással, majd a plazmid DNS preparátumokat a PCR termék tartományában szekvenáltuk. A kiónokat hat külön oligonukleo%,· .:. ·..· β. * • -112tid primerrel (1504, 1802, 679, 1280, 677 és 1731 jelű oligonukleotidok, szekvenciájuk rendre a szekvencia-jegyzékben szereplő 60., 63., 51., 53., 52. és 62. szekvenciának felel meg) szekvenáltuk. A szekvenálási eredmények alapján kiválasztottunk egy kiónt, amely a kívánt érett HCPB gén szekvenciájának megfelelő plazmidot tartalmazza, és ezt pICI1736-tal jelöltük.

A klónozott gén igazolt szekvenciáját és az arról leolvasott aminosav-szekvenciát a PelB szekvencia kezdetétől az EcoRI restrikciós enzimhelyig a szekvencia-jegyzékben 67.

számon szerepeltettük. A DNS-akat a PelB-ben lévő első kodont

1-esnek véve, a peptidet alkotó aminosavakat az érett HCPB kezdetét 1-esnek véve számoztuk.

Az érett HCPB szabályozott kifejezésére a pICI1736 plazmid DNS-t a 15. referencia-példában leírtakhoz hasonló módon kalcium-kloridos transzformációra alkalmas E. coli törzsekbe transzformáltuk. Az összes pICI1736-tal transzformált kifejező törzset a 15. referencia-példában leírtakhoz hasonlóan vizsgáltuk a klónozott HCPB gén kifejeződésének megtörténtére. Ebben az esetben azonban a Western analízisben a c-myc peptid-toldalékra specifikus 9E10 monoklónos antitest nem használható, mert az érett HCPB-nek nincs C-terminális toldaléka. Ezért primer antitestként nyulakban kifejlesztett olyan anti-bovin karboxipeptidáz A-t használtunk (a Biogenesis cég gyártmánya), ami az előzetes vizsgálatokban humán pankreasz-eredetű karboxipeptidáz B-vel keresztreakciót adott. Szekunder antitestként torma peroxidázzal jelzett, kecskékben kifejlesztett anti-nyúl IgG antitestet használtunk (a Sigma cég A9169 jelű terméke vagy hasonló anyag).

-113A Coomassie-val megfestett gélek vizsgálata azt igazolta, hogy a pICI266-ba klónozott érett HCPB (pICI1736) kifejeződött az MSD213 és MSD525 E. coli törzsekben. A géleken - a csak a pICI266 vektort tartalmazó kiónokkal összehasonlítva - egy további, körülbelül 34 000 dalton tömegű fehérjének megfelelő sáv is megjelent. Egy azonos méretű sáv az anti-bovin karboxipeptidáz A-val végzett Western analízis során pozitív jelet adott.

17. referencia-példa

Érett HCPB kifejezése COS sejtekből

PCR technikával, pICI1698 felhasználásával (lásd a

14. referencia-példát) preHCPB-t kódoló gént alakítottunk ki.

A PCR reakcióhoz 10 μg pICI1689 templátot, 100-100 pmól, a szekvencia-jegyzékben feltüntetett 34. és 35. szekvenciájú oligonukleotidot és 100 μΐ puffért [ összetétele: 10 mmól

Trisz-HCl (pH 8,3), 50 mmól KC1, 1,5 mmól MgCl₂, 0,125-0,125 mmól dATP, dCTP, dGTP és dTTP és 2,5 egység Taq DNS polimeráz (Amplitaq, Perkin-Elmer Cetus gyártmány)] használtunk. A reakcióelegyre 100 μΐ ásványolajat rétegeztünk, és az elegyet 25 ciklusban 1 percig 94°C-on, 1 percig 53°V-on és 2,5 percig 72°C-on inkubáltuk. Végül az elegyet 10 percig 72°C-on inkubáltuk. A 985 bázispárból álló PCR-terméket 1 %-os agaróz gélen (Agarose type I, a Sigma cég A-6013 katalógusszámú gyártmánya) végzett elektroforézissel választottuk el, majd a terméket tartalmazó sávot kivágtuk a gélből, és Geneclean ^(R| II reagenskészlet felhasználásával (a Stratech Scientific Ltd.től vagy a Bio 101 Inc.-tői beszerzett termék) elkülönítettük a kívánt DNS-fragmenst. A Geneclean reagenskészlet a követke-114-

ző egységekből áll: 1) 6 mólos nátrium-jodid oldat; 2) nátrium-kloridot, Trisz-t és EDTA-t tartalmazó tömény oldat nátrium- klorid/etanol /víz mosófolyadék készítéséhez; 3) Glassmilk^(R), azaz speciális szilikát-mátrix vízzel készített, 1,25 ml térfogatú szuszpenziója (üvegemulzió) 1,5 ml térfogatú üvegcsébe töltve. Ez a DNS-tisztítási eljárás Vogelstein és Gillespie módszerén alapul [ Proceedings of the National Academy of Sciences USA 76. kötet, 615. oldal (1979)] . A DNS tisztítására azonban a Molecular Cloning - a Laboratory Manual kézikönyvben [ II. kiadás, Sambrook, Fritsch és Maniatis; Cold Spring Harbor Laboratory, 1989] ismertetett módszerek bármelyikét is felhasználhatjuk. A Geneclean-eljárás menete röviden a következő: 1 térfogatrész gélszelethez 3 térfogatrész nátrium-jodid oldatot (a reagenskészlet egyik komponense) adunk. A keveréket 10 percig 55°C-on tartva megolvasztjuk az agarózt, majd 5-10 μΐ Glassmilk-et adunk hozzá, alaposan összekeverjük, és 10 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A Glassmilk-et lepergetjük, és háromszor 500 μΐ New

Wash-al (a reagenskészlet egyik komponense) mossuk. A mosópuffert eltávolítjuk a Glassmilk-ből, majd a Glassmilk-et levegőn megszáradni hagyjuk. A megszáradt Glassmilk-et 5-10 percig 55°C-on 5-10 μΐ vízzel inkubálva leoldjuk a DNS-t. A leoldott DNS-t tartalmazó vizes felülúszót centrifugálással elkülönítjük. Az eluálási lépést megismételhetjük, és a felülúszókat egyesítjük.

A preHCPB gént 100 mmól Trisz-HCl-t (pH 7,5), 10 mmól magnézium-kloridot, 50 mmól nátrium-kloridot, 0,025 %

Triton Χ-100-at és 25-25 egység HindlII-t és EcoRI-t (New

-115England Biolabs gyártmány) tartalmazó 100 μΐ reakcióelegyben órán át 37°C-on EcoRI-el és HindlII-mal emésztettük. Az emésztett fragmenst agaróz gél-elektroforézissel és a fent ismertetett Geneclean technikával tisztítottuk, majd pBluescript^(R)-be (a Stratagene Cloning Systems terméke) klónoztuk.

μg pBluescript ^(R)KS + DNS-t 100 μΐ térfogatú reakcióelegyben a fent közöltek szerint 25-25 egység EcoRI-el és HindlII-mal teljesen emésztettünk. Az emésztett plazmidhoz az

5' helyzetű foszfátcsoportok eltávolítására 1 μΐ 10 egység/μΐ koncentrációjú borjúbél-eredetű lúgos foszfatázt (a New England Biolabs terméke) adtunk, és az inkubálást 37°C-on még 30 percig folytattuk. A foszfatáz-aktivitást 70°C-on 10 percig végzett inkubálással megszüntettük. Az EcoRI-HindlII-mal hasított plazmidot agaróz gélről tisztítottuk a korábbiakban közöltek szerint. 50 ng EcoRI-HindlII-mal emésztett preHCPB gént 20 μΐ oldatban [ ami 30 mmól Trisz-HCl-t (pH 7,8), 10 mmól MgCl₂-t, 10 mmól DTT-t, 1 mmól ATP-t, 50 pg/ml BSA-t és

400 egység T4 DNS-ligázt (New England Biolabs Inc.) tartalmaz] a fentiek szerint hasított plazmid DNS-el ligáltunk. A reakciót 4 órán át 25°C-on végeztük. A reakcióelegy 1 μΐ térfogatú mintájával 20 μΐ kompetens E. coli DH5a sejtet [maximális hatékonyságú kompetens DH5a sejtek, Life Technologies

Ltd.) transzformáltunk a sejteket szolgáltató cég útmutatója szerint. A transzformált sejteket 100 pg/ml ampicillint tartalmazó L-agaron szélesztettük. A potenciális preHCPB kiónokat PCR technikával azonosítottuk. Minden egyes kiónt a preHCPB gén előállításánál leírtak szerint vetettünk alá PCR

-116reakciónak, azzal a különbséggel, hogy a 25 ciklusból álló reakció előtt a sejteket tartalmazó elegyet 5 percig 94°C-on inkubáltuk (forrón indított eljárás), és a szekvencia-jegyzékben szereplő 34. és 35. szekvenciájú oligonukleotid helyett a szekvencia-jegyzékben szereplő 36. és 37. szekvenciájú oligonukleotidot használtunk. A PCR reakció végén kapott elegy 10 μΐ térfogatú mintáját 1 %-os agaróz gélen végzett elektroforézissel elemeztük. A preHCPB gént tartalmazó kiónokat egy 1,2 kb méretű PCR-termék megjelenése alapján azonosítottuk. Az 1,2 kb méretű terméket szolgáltató kiónokat használtuk fel a plazmid DNS nagyléptékű előállításához, és az inszert szekvenciáját DNS szekvencia-analízissel határoztuk meg. A preHCPB gént pBluescript^(R|-ben tartalmazó plazmidot pMF15-nek neveztük.

A HCPB eukarióta sejtekben való kifejezésére alkalmas vektorok kialakítására a GS-System^<R)-t (Celltech Biologics) használtuk (lásd a WO 87/04462, WO 89/01036, WO 86/05807 és WO 89/10404 sz. nemzetközi közzétételi iratot). Ehhez a preHCPB gént a pEE12 vektor [a pSV2.GS vektorhoz (lásd: Bebbington és munkatársai: Bio/Technology 10, 169-175 /1992/) hasonló olyan vektor, amiből a pSV2.GS vektorban eredetileg jelenlévő restrikciós helyek egy részét helyirányított mutagenezissel eltávolították, és így a multikapcsoló tartományban egyedi restrikciós helyeket hoztak létre] HindiII-EcoRI régiójába kell klónozni. A kifejező vektor kialakítására a pEE12 és a pMF15 plazmidot a fent közöltek szerint EcoRI-el és HindlII-mal emésztettük. Az egyes emésztési termékekből a megfelelő (pEE12-ből származó) vektort és (pMF15-ből származó) inszertet 1 %-os agaróz gél felhasználásával elkülönítet-117tük, majd egymáshoz ligáltuk, és kompetens DH5a sejtek transzformálásához használtuk. A transzformált sejteket 100 μg/ml ampicillint tartalmazó L-agaron szélesztettük. A telepeket a fent közöltek szerint PCR technikával szűrtük, a CMV promotoron belül és a HCPB génben prímelő oligonukleotidok (a szekvencia-jegyzékben szereplő 38. és 39. szekvenciájú oligonukleotid) felhasználásával. A nagyléptékű plazmid DNS-termeléshez az 1365 kb méretű PCR-terméket képező kiónokat használtuk, és az inszert szekvenciáját DNS szekvencia-analízissel határoztuk meg. A preHCPB szekvenciát pEEl2-ben tartalmazó plazmidot pMF48-nak neveztük.

A fenti eljárással egy második eukarióta kifejező plazmidot, a preproHCPB prepro-szekvenciáját tartalmazó pEE12 plazmidot is kialakítottunk. A kezdeti PCR reakcióban a szekvencia-jegyzékben feltüntetett 40. és 41. szekvenciájú oligonukleotidot használtuk, és így a pMF18-ból (amit a 19. referencia-példa ismertet) elkülönítettük a prepro szekvencia génjét. Ebben az esetben forrón indított PCR technikát alkalmaztunk úgy, hogy először az elegyet Taq DNS polimeráz távollétében 5 percig 94°C-on inkubáltuk. Ezután az elegyhez 2,5 egység Taq DNS polimerázt adtunk, és a fent közöltek szerint, 25 ciklusban végrehajtottuk a PCR reakciót. A kapott, 360 bázispárból álló fragmenst pBluescript-be klónozva pMF66~ot, majd pEE12-be klónozva (szűrés PCR technikával, a 40. és 41. szekvenciájú oligonukleotid felhasználásával) pMF67-et állítottunk elő.

Eukarióta sejtekben való kifejezésre a preHCPB és a prepro szekvencia kifejezésére alkalmas géneket tartalmazó vektorokat COS-7 sejtekbe ko-transzfektáltuk. A COS sejtek

-118origohiányos SV40 vírussal transzformált afrikai zöldmajom vese-sejtvonalból (CV-1) származnak, és azokat széles körben alkalmazzák különféle fehérjék rövidtávú tranziens kifejezésére, mert SV40 replikációs origót tartalmazó körkörös plazmidokat képesek replikáin! igen nagy másolatszámmal. Két széles körben hozzáférhető COS sejtklón - a COS-1 és a COS-7 klón - ismert. A COS sejtek transzfektálásának módszerét Bebbington ismerteti a Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2_, 141 (1991) közleményben. HCPB kifejezésére a COS-7 sejteket (2 X 10e5) egy hatmélyedéses tenyésztőlemezen, 10 % hővel inaktivált borjú magzatszérumot (FCS) tartalmazó 2 ml Dulbecco-féle módosított Eagle-táptalajban (DMEM) 4-4 pg pMF48 és pMF67 plazmid vektorral transzfektáltuk a lipofekció - polinukleotidok kationos lipid-közvetített átvitele néven ismert módszer szerint [ lásd Felgner és munkatársai:

Methods: A Companion to Methods in Enzymology 5, 67-75 (1993)] . A sejteket CO₂ inkubátorban 20 órán át 37°C-on inkubáltuk. A plazmid DNS 200 μΐ szérummentes táptalajjal (OPTI-MEM Reduced Serum Médium, a Gibco BRL 31985 katalógusszámú terméke) készített elegyéhez 12 μΐ LIPOFECTIN reagenst (a

Gibco BRL 18292-011 katalógusszámú terméke) adtunk, az elegyet enyhén összekevertük, és szobahőmérsékleten 15 percig inkubáltuk. A sejteket 2 ml OPTI-MEM szérummentes táptalajjal mostuk. Ezután a DNS/LIPOFECTIN inkubátumhoz 600 μΐ OPTI-MEM szérummentes táptalajt adtunk, a kapott elegyet a sejtekre rétegeztük, és a sejteket CO₂ inkubátorban 6 órán át 37°C-on inkubáltuk. A DNS-tartalmú táptalajt 10 % FCS-t tartalmazó mormál DMEM táptalajra cseréltük, és a sejteket a fenti kö-119rülmények között még 72 órán át inkubáltuk. A sejtek felülúszójából 250 μΐ mintát vettünk, és a mintát a 11. referencia-példában leírtak szerint Hipp-Arg-gal szemben HCPB aktivitásra vizsgáltuk (5 órás vizsgálat). A LIPOFECTIN reagenssel kezelt, de plazmid DNS-el nem kezelt COS sejtek felülúszói a szubsztrátum 1,2 %-át hidrolizálták, míg a preHCPB-t és a prepro szekvenciát kifejező plazmidok keverékével transzfektált COS sejtek felülúszói a Hipp-Arg szubsztrátum 61 %-át hidrolizálták. A csak preHCPB plazmiddal transzfektált COS sejtek felülúszói a csak LIPOFECTIN reagenssel kezelt COS sejtek felülúszóihoz hasonló mértékében hidrolizálták a Hipp-Arg szubsztrátumot.

A LIPOFECTIN reagens egy liposzóma-készítmény, ami

1:1 tömegarányban tartalmaz N-[ 1-(2,3-dioleil-oxi)-propil] -N,N,N-trimetil-ammónium-kloridot (DOTMA, egy kationos lipid) és dioleoil-foszfatidil-etanol-amint (DOPE) membránon szűrt vízben. Ez a reagens lipid-DNS komplex képzése közben spontán kötődik a DNS-ekhez [ lásd: Felgner és munkatársai: Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 84, 7431 (1987)] .

18. referencia-példa proHCPB kifejezése E. coliban

A proHCPB klónozására és E. coliban való kifejezésére a 15. referencia-példában leírthoz nagymértékben hasonló eljárást alkalmaztunk. Klónozó vektorként ebben az esetben is pICI266-ot használtunk, és a pro-HCPB gén PCR technikával való kialakítására kiindulási anyagként a 14. referencia-példában leírt pICI1698 plazmidot alkalmaztuk. A PCR reakciókban az FSPTS1 és 6HIS9E10R1BS1 primer helyett a 2310 és 2265 jelű oligonukleotidokat (szekvenciájuk a szekvencia-jegyzékben

-120-

szereplő 68. és 66. szekvenciának felel meg) használtuk, és a reakciót a 15. referencia-példában leírtakhoz hasonló körülmények között végeztük.

Az első (a felső szálhoz használt), 2310 jelű oligonukleotidot úgy terveztük, hogy a primelés a pICI1698-on menjen végbe, és Ncol restrikciós enzim kötőhelyet iktasson be a PelB leader szekvenciától (a szekvencia-jegyzékben szereplő 64. szekvencia 51-66. DNS-bázisa) a beillesztett pro-HCPB gén (a szekvencia-jegyzékben szereplő 56. szekvencia

40-57. DNS-bázisa) felé. A második (az alsó szálhoz használt) , 2265 jelű oligonukleotidot úgy terveztük, hogy a primelés az érett HCPB gén végénél, a (His)₆-c-myc toldalék szekvencia kezdete előtt (a szekvencia-jegyzékben szereplő

64. szekvencia 965-987. DNS-bázisaival komplementer szekvencián) menjen végbe, és a gén végénél a TAA TAA-val komplementer transzlációt leállító kodonokat, majd ezután egy EcoRI (GAATTC) restrikciós enzim kötőhelyet és kitöltő bázisokat iktasson be. Ez az oligonukleotid a PCR során a génbe príméi vissza, és lehetővé teszi a pro-gén szekvencia elkülönítését.

A PCR termék alikvotját agaróz gél-elektroforézissel a helyes méretű (körülbelül 1240 bázispárból álló) DNS jelenlétére elemezve azt tapasztaltuk, h ogy az túlnyomórészt a helyes méretű DNS-nek megfelelő sávot szolgáltat. A reakciótermék maradékát a 15. referencia-példában leírtakhoz hasonlóan tisztítottuk. Az elkülönített DNS-t Ncol és EcoRI enzimmel emésztettük, és a helyes méretű (körülbelül 1210 bázispárból álló) DNS-sávot a 15. referencia-példában leírtakhoz hasonlóan tisztítottuk.

» · ·· »

-12 ΙΑ 15. referencia-példában leírtakhoz hasonlóan előállított pICI266 kettősszálú DNS-t Ncol és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztettük, gondosan ügyelve arra, hogy az emésztés mindkét esetben teljes legyen. A helyes méretű (körülbelül 5600 bázispárból álló) DNS-t a 15. referencia-példában leírtakhoz hasonlóan tisztítottuk.

A restrikciós enzimekkel kezelt és a tisztított

DNS-ek mintáinak tisztaságát és koncentrációját agaróz gél-elektroforézis alapján, ismert standardokkal összehasonlítva becsültük. Az így vizsgált anyagokból ligációs elegyeket készítettünk, és a pro-HCPB gént a 15. referencia-példában leírtakhoz hasonlóan a pICI266 vektorba klónoztuk.

A ligálási reakció után a DNS-eleggyel DH5a E. coli törzset transzformáltunk, majd telepeket emeltünk ki, és ezeket hibridizációval vizsgáltuk. Ezeket a műveleteket a 15.

referencia-példában leírtakhoz hasonlóan végeztük.

Négy pozitív hibridizációs reakciót adó izolátumot PCR technikával vizsgáltunk a helyes méretű inszertek jelenlétére. Az eljárásban a 2310 és 2265 jelű prímért (szekvenciájuk a 68. és 66. szekvenciának felel meg), valamint primelésre egy belső primer-párt (1279 és 679 jelű primer, szekvenciájuk az 54. és 51. szekvenciának felel meg) használtunk, •és az eljárást a 15. referencia-példában leírtakhoz hasonlóan végeztük. A PCR termékeket agaróz gél-elektroforézissel vizsgáltuk a helyes méretű DNS (a 2310 primertől a 2265 primerig körülbelül 1200 bázispár, és a 1279 primertől a 679 primerig körülbelül 580 bázispár) jelenlétére. A PCR reakcióban az összes klónból helyes méretű DNS termékek képződtek.

-122Ezután mind a négy kiónt plazmid DNS előállítására használtuk, majd a plazmid DNS preparátumokat a 15. referencia-példában leírtak szerint a PCR termék tartományában szekvenáltuk. A kiónok szekvenálásához hat külön oligonukleotid prímért, azaz az 1504, 1802, 679, 1281, 1590 és 1592 jelű prímért (szekvenciájuk rendre a szekvencia-jegyzékben feltüntetett 60., 63., 51., 55., 69. és 70. szekvenciának felel meg) használtunk. A szekvenálás eredményei alapján kiválasztottuk a kívánt pro-HCPB génszekvenciát hordozó plazmidot tartalmazó kiónt, amit pICI1738-nak neveztünk.

A pICI1738-ba klónozott pro-HCPB gén igazolt szekvenciáját és az arról leolvasott aminosav-szekvenciát a PelB szekvencia kezdetétől az EcoRI restrikciós helyig a szekvencia-jegyzékben 71. számon szerepeltettük. A DNS-akat a PelBben lévő első kodont 1-esnek véve, a pepiidet alkotó aminosavakat az érett HCPB kezdetét 1-esnek véve számoztuk.

A pro-HCPB szabályozott kifejezésére a pICI1738 plazmid DNS-t a 15. referencia-példában leírtakhoz hasonlóan kalcium-kloridos transzformációra alkalmas kompetens E. coli kifejező törzsekbe transzformáltuk. Az összes pICI1738-cal transzformált kifejező törzset a 15. referencia-példában leírtak szerint vizsgáltuk a klónozott HCPB gén kifejeződésének megtörténtére. Ebben az esetben azonban a c-myc peptid-toldalékra specifikus 9E10 monoklónos antitest nem használható a Western analízisben, mert a pro-HCPB-nek nincs C-terminális toldaléka. Ezért primer antitestként nyulakban kifejlesztett olyan anti-bovin karboxipeptidáz A-t használtunk (a Biogenesis cég gyártmánya), ami az előzetes vizsgálatokban humán pankreasz-eredetű karboxipeptidáz B-vel keresztreakciót a-123-

dott. Szekunder antitestként torma peroxidázzal jelzett, kecskékben kifejlesztett anti-nyúl IgG antitestet használtunk (a Sigma cég A9169 jelű terméke vagy hasonló anyag).

A Coomassie-val megfestett gélek vizsgálata azt igazolta, hogy a pICI266-ba klónozott pro-HCPB (pICI1738) kifejeződött az E. coli sejtekben. A géleken - a csak a pICI266 vektort tartalmazó kiónokkal, és a toldalékkal ellátott HCPB-t szolgáltató kiónokkal· (lásd a 15. referencia-példát) öszszehasonlítva egy további, körülbelül 40 000 dalton tömegű fehérjének megfelelő sáv is megjelent. Egy azonos méretű sáv az anti-bovin karboxipeptidáz A-val végzett Western analízis során pozitív jelet adott.

19. referencia-példa proHCPB kifejezése COS sejtekben

A 17. referencia-példában leírt PCR technikával, templátként pICI1689-et, valamint a 34. és 40. szekvenciájú oligonukleotidokat felhasználva preproHCPB gént (1270 bázispárból álló termék) állítottunk elő. A gént EcoRI-el és HindlII-mal emésztettük, és a 17. referencia-példában leírtak szerint először pBluescript KS+-ba klónozva pMF18-at, majd DH5oc-ban lévő pEE12-be klónozva pMF49-et alakítottunk ki. A pEE12 plazmidot a 17. referencia-példában leírt módon,

LIPOFECTIN reagens felhasználásával COS-7 sejtekbe transzfektáltuk, majd a sejtek felülúszóiból 250 μΐ mintát vettünk, és a mintát a 11. referencia-példában leírtak szerint Hipp-Arggal szemben HCPB aktivitásra vizsgáltuk (5 órás vizsgálat), majd 50 mmólos Trisz-HCl (pH 7,6) + 150 mmólos NaCl oldatban 1 órán át 4°C-on 700 μg/ml tripszinnel aktiváltuk. Ilyen kö-124* ··· · « ·· · rülmények között a Hipp-Arg szubsztrátum teljes mértékben elhidrolizálódott, míg a csak LIPOFECTIN reagenssel (plazmid

DNS nélkül) kezelt COS sejtek felülúszói tripszinnel aktiválva csak a Hipp-Arg szubsztrátum 30 %-át hidrolizálták el.

20. referencia-példa

Natív HCPB tisztítása

A natív és a különböző mutáns enzimek kezdeti tisztítására két módszert dolgoztunk ki. Először az előnyösebb módszert ismertetjük.

A rekombináns enzimet tartalmazó rekombináns E. coli sejtpépet kiemeltük a -70°C-os hűtőtárolóból, és felengedni hagytuk. A sejtpép tömegét (grammokban) mértük, és a pépet

A pufferoldatban [200 mmól trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-hidroklorid (Trisz-HCl) , 20 % szacharóz (C₁₂H₂₂O_L1) , pH 8,0] újraszuszpendálva a sejtpép kezdeti tömegével egyenlő térfogatra hoztuk. A sejtszuszpenziót időnkénti enyhe keverés közben szobahőmérsékleten 20 percig inkubáltuk, majd azonos térfogatú desztillált vizet adtunk hozzá, és alaposan összekevertük. A sejtszuszpenziót időnkénti enyhe keverés közben szobahőmérsékleten ismét 20 percig inkubáltuk. Az így, ozmotikus feltöréssel kapott nyersanyagot 90 percig 4°C-on 98000 g gyorsuláson centrifugálva derítettük, majd a felülúszót leöntöttük a pelletezett oldhatatlan frakcióról. A felülúszóhoz 0,1 mg/ml végkoncentráció eléréséhez szükséges mennyiségű dezoxiribonukleáz 1-et adtunk. Az elegyet folytonos rázatás közben szobahőmérsékleten inkubáltuk mindaddig, amíg viszkozitása az affinitás-oszlopra való felvitelt lehetővé tevő értékre nem csökkent. Affinitás-oszlopként karboxipeptidáz inhibitorral kezelt, CNBr-dal aktivált Sepharose oszlopot hasz-125náltunk, amit a Pharmacia cég útmutatója szerint alakítottunk ki CNBr-dal aktivált Sepharose 4B-ből (Pharmacia-gyártmány) és burgonyagumóból származó karboxipeptidáz inhibitorból (a

Sigma cég C-0279 számú terméke). A felülúszó pH-ját 8,0-ra állítottuk, és a felülúszót felvittük a pufferoldattal (10 mmól Trisz-HCl, 500 mmól NaCl, pH 8,0) előzetesen egyensúlyba hozott affinitás-oszlopra. A felülúszó felvitele után az oszlopot addig mostuk, amíg az effluens abszorbanciája vissza nem tért az alapvonalra, majd a megkötött anyagot elúciós pufferoldattal (100 mmól Na₂CO₃, 500 mmól NaCl, pH 11,4) leoldottuk az oszlopról. Az eluátumfrakciókat -20°C-on fagyasztottuk, és anti-c-myc-toldalék antitesttel (9E10), majd anti-egér-torma-peroxidáz konjugátummal (a Sigma cég A-9044 számú terméke) végzett Western foltanalízissel azonosítottuk a rekombináns karboxipeptidázt tartalmazó frakciókat [ ezek a frakciók az analízis során 4-klór-naftollal és hidrogén-peroxiddal kezelve színreakciót adnak] .

A rekombináns karboxipeptidáz B-t tartalmazó frakciókat egyesítettük, betöményítettük, pH-ját 7,5-re állítottuk, majd hirtelen lefagyasztottuk, és -20°C-on tároltuk. Kívánt esetben az így kapott mintát ismert módszerekkel, például ioncserés és gélpermeációs kromatografálással tovább tisztíthatjuk.

A második tisztítási módszer esetén - az előnyös módszerben alkalmazott periplazma-feltörés helyett - az E. coli sejteket teljesen lizáljuk.

A rekombináns enzimet tartalmazó rekombináns E. coli sejtpépet lizáló pufferoldatban (50 mmól Trisz-HCl, 15 % szacharóz, pH 8,0) újraszuszpendáltuk. A szuszpenzióhoz 1 • a ··

4·

fc #·· · > · · « · t · a

-12 6mg/ml végkoncentrációban lizozimot, és ezzel egyidőben 25 ml szuszpenzióra számítva 80 μΐ 25 %-os lítium-dodecil-szulfát (LDS) oldatot adtunk. A szuszpenziót időnkénti rázogatás közben 30 percig jégen inkubáltuk, majd 1 mg/ml végkoncentrációban dezoxiribonukleáz 1-et adtunk hozzá, és időnkénti rázogatás közben újabb 30 percig jégen inkubáltuk.

Ezután a szuszpenziót 200 ml térfogatú részletekre osztottuk, és a sejtek szétroncsolásának teljessé tétele érdekében tízszer 30 másodperces löketekben, egy-egy löket között 30 másodperces szünetet tartva ultrahanggal sugároztuk be. A kezelt szuszpenziókat 90 percig 4°C-on 98000 g gyorsuláson centrifugáltuk, és a felülúszót leöntöttük a pelletezett oldhatatlan frakcióról. A felülúszó pH-ját 8,0-ra állítottuk, és felvittük az előzetesen pufferoldattal (10 mmól Trisz-HCl, 50 mmól NaCl, pH 8,0) egyensúlyba hozott affinitás-oszlopra. A felülúszó felvitele után az oszlopot addig mostuk, amíg az effluens abszorbanciája vissza nem tért az alapvonalra, majd a megkötött anyagot elúciós pufferoldattal (100 mmól Na₂CO₃, 500 mmól NaCl, pH 11,4) leoldottuk az oszlopról. Az eluátumfrakciókat -20°C-on fagyasztottuk, és anti-c-myc-toldalék antitesttel (9E10), majd anti-egér-torma-peroxidáz konjugátummal (a Sigma cég A-9044 számú terméke) végzett Western foltanalízissel azonosítottuk a rekombináns karboxipeptidázt tartalmazó frakciókat (ezek a frakciók az analízis során 4-klór-naftollal és hidrogén-peroxiddal kezelve színreakciót adnak). A rekombináns karboxipeptidáz B-t tartalmazó frakciókat egyesítettük, betöményítettük, pH-ját 7,5-re állítottuk, majd hirtelen lefagyasztottuk, és -20°C-on tároltuk. Kívánt esetben az így kapott mintát ismert módsze• ··· «Μ * · · ♦ Μ ·« • * »« i « · Λ » · · « θ' *·· ·* · «

-127rekkel, például ioncserés és gélpermeációs kromatografálással tovább tisztíthatjuk.

A kétféle tisztítási módszerrel kapott egyesített frakciók mintáit SDS-PAGE-sel és Coomassie-val festett nitrocellulóz lemezen futtatva mindkét esetben a rekombináns karboxipeptidáz B molekulatömegének megfelelő molekulatömegű, Coomassie-val festődő sávot kaptunk. A sávokat automata fehérje/peptid szekvenáló berendezésben Edman-féle lebontásos módszerrel szekvenálva az adott tisztítandó rekombináns karboxipeptidáz B-nek megfelelő szekvenciákhoz jutottunk.

21. referencia-példa

Murin A5B7 F (ab¹)_?-HCPB fúziós fehérje kifejezése

COS sejtekben

Ebben a példában a következő műveleteket ismertetjük: cDNS előállítása az A5B7 hibridómából; specifikus Fd és könnyű láncfragmensek elkülönítése PCR technikával; a kapott fragmensek teljes DNS szekvenciájának meghatározása; Fd-HCPB fúziós gén, valamint a könnyű láncfragmens és az Fd-HCPB fúziós fehérje eukarióta sejtekben való együttes termelésére alkalmas ko-expresszáló vektor előállítása; F(ab')₂-HCPB kifejezése COS sejtekben HCPB prepro szekvenciájával végzett ko-transzfekció útján.

A műveletsor a)-e) lépése megegyezik az 5. referencia-példában leírt műveletsor a)-e) lépésével.

f) Fd-HCPB fúziós DNS szekvencia előállítása:

A HCPB szekvenciához PCR technikával az Fd szekvencia C-terminális régióját a szekvencia-jegyzékben szereplő

25. szekvencia Ncol restrikciós helyétől (497-es helyzet) kó-128*·»· • ·· ·· ♦·' • ·· ··*« doló gént csatlakoztattunk. Ebben az eljárásban egy 8 aminosavas kapcsoló szekvencia (VPEVSSVF) DNS-ét építettük be. Az

5. referencia-példában ismertetett pAFl plazmidot a 17. referencia-példában leírt, forrón indított PCR-nak vetettük alá, a szekvencia-jegyzékben feltüntetett 42. és 43. szekvenciájú oligonukleotidok felhasználásával. 338 bázispárból álló terméket kaptunk. Hasonlóan, PCR technikával, a szekvencia-jegyzékben feltüntetett 44. és 34. szekvenciájú oligonukleotidok felhasználásával pICI1698-ból egy 998 bázispárból álló terméket alakítottunk ki. Mindkét terméket a 17. példában leírtak szerint, agaróz gél-elektroforézis és Geneclean felhasználásával különítettük el, és 0,2-0,2 ng így kapott anyagot használtunk fel egy második, 50 μΐ össztérfogatban végzett, forrón indított PCR reakcióban, ahol az elegyet 10 ciklusban 1 percig 94°C-on és 4 percig 63°C-on tartottuk, végül 2 percig 94°C-on tartottuk. Az elegyhez 100-100 pmól szegélyező oligonukleotidot (a szekvencia-jegyzékben szereplő 42. és 34.

szekvenciájú anyag) adtunk 50 μΐ pufferoldatban, 2,5 egység Amiplitaq-kal együtt. Az elegyet 3 percig 94°C-on tartottuk, majd 25 ciklusban 2,5 percig 94°C-on, 2 percig 55°C-on és 2 percig 72°C-on kezeltük, végül 10 percig 72°C-on tartottuk. A kapott, 1336 bázispárból álló terméket a korábbiakban leírtak szerint elkülönítettük, majd EcoRI-el és HindlII-mal hasítottuk, és DH5a-ban lévő pBluescript^|R>-be klónozva (a kiónokat PCR-val szűrtük, a szekvencia-jegyzékben szereplő 36. és 37. szekvenciájú oligonukleotidok felhasználásával) pMF35-öt állítottunk elő. A teljes Fd.-HCPB fúziós szekvencia kialakítására 10-10 μg pAFl és pMF35 plazmidot 100 μΐ pufferoldatban • ·

-12 9[ összetétele: 50 mmól kálium-acetát, 20 mmól Trisz-acetát (pH 7, 9) , 10 mmól MgCl₂, 1 mmól DTT, 40 egység EcoRI és 20 egység Ncol] 2 órán át Ncol-el és EcoRI-el hasítottunk. A pAFl-ből származó 3,4 kb méretű vektor-fragmenst elkülönítettük, a 17.

referencia-példában leírtak szerint borjúbél eredetű lúgos foszfatázzal kezeltük, majd a pMF35-ből származó tisztított,

1,2 kb méretű fragmenshez ligáltuk. A kapott vektort DH5ot-ba klónoztuk (az anyagot PCR technikával, a szekvencia-jegyzékben szereplő 36. és 37. szekvenciájú oligonukleotidok felhasnzálásával egy 1922 bázispárból álló inszert jelenlétére szűrtük). Az így kapott terméket pMF39-nek neveztük. A pMF39

EcoRI-HindlII fragmensét DH5a-ban lévő pEE6-ba [ a pEE6.hCMV (lásd: Stephens és Cockett: Nucleic Acids Research 17, 7110 /1989/) olyan származéka, ahol a hCMV promotor fölött elhelyezkedő HindlII helyet BglII hellyé alakították] klónoztuk, és az anyagot PCR technikával, a szekvencia-jegyzékben szereplő 38. és 39. szekvenciájú oligonukleotidok felhasználásával egy körülbelül 2200 bázispárból álló inszert jelenlétére szűrtük. A kapott terméket pMF43-nak neveztük.

A ko-expresszáló vektor kialakítására 10 μρ pMF43-at 100 μΐ pufferoldatban [összetétele: 10 mmól Trisz-HCl (pH

7, 9) , 150 mmól NaCl, 10 mmól MgCl₂, 1 mmól DTT és 100 μρ/ιηΐ BSA] 20 egység BglII-vel és 40 egység Sall-el hasítottuk, majd a 4348 bázispárból álló fragmenst agaróz gél-elektroforézissel elkülönítettük, és a korábbiakban leírtak szerint Geneclean -nal tisztítottuk. Hasonlóan, az 5. referencia-példa e) pontjában leírt pAF6-ot 40 egység BamHI-el és 40 egység Sall-el hasítottuk, a 7,8 kb méretű vektor-fragmenst ···

-130elkülönítettük, a pMF43 BglII-Sall fragmenséhez ligáltuk, majd ezt DH5a-ba klónoztuk. A telepeket PCR technikával, két oligonukleotid-pár (a szekvencia-jegyzékben szereplő 18. és 45., illetve 17. és 39. szekvenciájú oligonukleotidok) felhasználásával szűrtük. A 360 bázispár és 1,3 kb méretű PCR termékeket adó kiónokat DNS-szekvenálással azonosítottuk. A helyes szekvenciájú kiónt pMF53-nak (könnyű lánc/Fd-HCPB ko-expresszáló vektor DH5a-ban) neveztük.

g) A5B7 F (ab ¹)y-HCPB kifejezése COS sejtekben:

Megismételtük a 17. referencia-példában a COS-7 sejtek ko-transzfektálására leírt eljárást, azzal a különbséggel, hogy pMF48 helyett pMF53-at használtunk a prepro szekvenciát kódoló plazmid (pMF67) mellett. A COS sejtek felülúszóít a 11. és 17. referencia-példában leírtak szerint vizsgáltuk HCPB aktivitásra. A LIPOFECTIN reagenssel plazmid DNS távollétében kezelt sejtek felülúszói a szubsztrátum 1,2 %-át hidrolizálták el, míg a könnyű lánc/Fd-HCPB szekvenciát és a prepro szekvenciát kifejező plazmidok keverékével transzfektált COS-sejtek felülúszói a Hipp-Arg szubsztrátum 34 %-át hidrolizálták el. A csak pMF53-mal transzfektált COS sejtek felülúszói a csak LIPOFECTIN reagenssel kezelt COS sejtek felülúszóihoz hasonló mértékben hidrolizálták a Hipp-Arg szubsztrátumot. A Western analízis során [ lásd a h) pontot] két, körülbelül 80 kDa és 160 kDa tömegű fehérjéből álló sáv vált láthatóvá, amelyek rendre az Fab'-HCPB-nek és az F(ab') ₂-(HCPB) ₂-nek feleltek meg. A CEA ELISA analízis során [ lásd az i) és j) pontot] a fenti felülúszókat használtuk a CEA-megkötő anyagok jelenlétének kimutatására a j) pontban közölt használati utasítás szerint.

-131h) Western biot analízis:

A Western biot analízist a következőképpen végeztük:

Az egyes felülúszó-minták 20 μΐ térfogatú alikvotjait azonos térfogatú, redukálószert tartalmazó vagy nem tartalmazó pufferoldattal [összetétele: 62,5 mmól Trisz (pH

6,8), 1 % SDS, 10 % szacharóz és 0,05 % brómfenolkék] kevertük össze. A mintákat 10 percig 65°C-on inkubáltuk, majd Múl(R) tiphor II készülékben (gyártja: LKB Produkter AB) a gyártó utasításainak megfelelően elektroforézisnek vetettük alá egy 8-18 % (gradiens) akrilamidot tartalmazó gélen (Excel^(R1 gélrendszer, gyártja: Pharmacia Biotechnology Products). Elektroforézis után az elkülönített fehérjéket Novablot^(R| készüléken (gyártja: LKB Produkter AB) a gyártó utasításait követve Hybond C-Super membránra (gyártja: Amersham International) vittük fel. Felvitel után a membránt levegőn szárítottuk.

Az antitest fragmensek jelenlétét anti-murin F(ab')₂ antitest-peroxidáz konjugátummal (az ICN Biomedicals 67-430-1 katalógusszámú gyártmánya) mutattuk ki. A murin A5B7 antitest fragmenseket ECL^(R) detektáló rendszerrel (gyártja: Amersham International) tettük láthatóvá, a gyártó utasításait követve.

i) ELISA analízis:

Az ELISA analízis standard műveleteit a Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (szerk.: Burdon R.H. és van Kippenberg P.H.) 15. kötete (Tijssen P.:

Practice and Theory of Enzyme Immunoassays; Elsevier Science Publishers B.V., 1985) ismerteti. További információk találhatók Harlow E. és Lane D.P. Antibodies - A Laboratory • · · ·

-132Manual c. könyvében (kiadó: Cold Spring Harbor Latoratory,

1988).

j) Anti-CEA ELISA:

A következő használati utasítást követtük:

1. Készítsünk bevonó puffért [ 1 kapszula karbonát-bikarbonát puffer (a Sigma cég C-3041 jelű gyártmánya) 100 ml kétszer desztillált vízben] .

2. Egy-egy 96 mélyedéses lemezre számítva adjunk 5 μΐ CEA törzsoldatot (0,2 mg/ml, Dako-gyártmány) 10 ml bevonó pufferhez .

3. Nunc Maxisorp mikrotitráló lemez mélyedéseibe mérjünk

100 μΐ hígított CEA oldatot (50 ng/mélyedés/100 μΐ).

4. Inkubáljuk a lemezeket éjszakán át 4°C-on (vagy 2 órán át szobahőmérsékleten).

5. Mossuk a lemezeket négyszer 5 percig 0,01 % nátrium-azidot és 0,05 % Tween 20-at tartalmazó foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBSA).

6. Szárítás után mérjünk a lemezek mélyedéseibe mélyedésenként 200 μΐ 1 % bovin szérum albumint (a Sigma cég A-7888 számú gyártmánya) és 0,05 % Tween 20-at tartalmazó PBSA oldatot. Inkubáljuk a lemezeket 2 órán át szobahőmérsékleten.

7. Mossuk a lemezeket négyszer 5 percig 0,05 % Tween 20-at tartalmazó PBSA oldattal.

8. Vigyük fel a lemezekre a felülúszó mintáit, illetve a standardokat [ proteolitikus A5B7 F(ab')₂ kétszeres sorozathígításai] . Hígítsuk a mintákat táptalajjal vagy PBS oldattal.

Vak mintákként használjunk 1 % BSA-t tartalmazóü PBSA oldatot és hígítószert.

-1339. Inkubáljuk a lemezeket 3 órán át szobahőmérsékleten.

10. Mossuk a lemezeket hatszor 5 percig 0,5 % Tween 20-at tartalmazó PBSA oldattal.

11. Készítsünk szekunder antitest oldatot [20 μΐ kecske-eredetű anti-egér IgG F(ab')₂ peroxidázzal (ICN 67-430-1) konjugálva, 40 ml 1 % BSA-t és 0,5 % Tween 20-at tartalmazó PBSA oldatban] , és mindegyik mélyedésbe mérjünk be 100 μΐ oldatot

12. Inkubáljuk a lemezeket szobahőmérsékleten 1 órán át.

13. Mossuk a lemezeket hatszor 5 percig 0,5 % Tween 20-at tartalmazó PBSA oldattal.

14. 1 kapszula foszfát-citrát-perborát puffért (a Sigma cég P-4922 sz. gyártmánya) 100 ml kétszer desztillált vízben old va készítsünk előhívó oldatot. Adjunk a pufferoldathoz 30 mg/100 ml o-fenilén-diamin-dihidrokloridot (OPD, a Sigma cég

P-8287 sz. gyártmánya). Minden mélyedésbe mérjünk be 150 μΐ így kapott elegyet.

15. Inkubáljuk a lemezeket szobahőmérsékleten, fénytől védve percig.

16. Minden mélyedésbe 50 μΐ 2 mólos kénsavoldatot bemérve ál

Irtsuk le a reakciót.

17. Lemez-leolvasó készülékkel 490 nm-en olvassuk le az opti kai sűrűség-értékeket.

1. példa

Bovin Lys66Glu pankreasz-eredetű ribonukleáz előál

Irtása

a) A 66-os kodonban Lys-»Glu szubsztitúciót tartalmazó RN-áz génszekvencia kialakítása rekombináns gyűrűs polimeráz láncreakcióval (RCPCR):

-134A PCR inkubáláshoz templátként bovin pankreasz-eredetű RN-ázt kódoló pre-szekvenciát tartalmazó plazmidot [ pQR162, NCIMB No. 40678, lásd még Tarragona-Fiol és munkatársai: Gene 118, 239-245 (1992)] használtunk. A PCR inkubálásokhoz szükséges primereket cianoetil-foszforamiditek felhasználásával állítottuk elő Cyclone típusú DNS-szintetizátoron (Milligen/Millipore gyártmány) , a foszfit-triészter módszer szerint. A primereket úgy terveztük, hogy PCR inkubálásokban felhasználva kettősszálú, lineáris DNS molekulákat szolgáltassanak, amelyekből kombináció, denaturálódás és újra-anellálódás révén az eredeti tompavégű termékeken kívül diszkrét, kohézív, egyszálú láncvégekkel rendelkező kettősszálú DNS is képződik. Az utóbbi láncvégek anellálódása révén rekombináns DNS-gyűrűk alakulnak ki. Az így képződött molekulák kompetens E. coli sejtekbe transzformálhatok.

Techne PHC-1 termociklizátorban két PCR inkubálást végeztünk, az elegyet 25-30 ciklusban 1,5 percig 92°C-on, 1,5 percig 55°C-on és 6 percig 75°C-on, a reakció végén pedig 10 percig 75°C-on tartva. Az egyik inkubáláshoz a szekvencia“jegyzékben szereplő 1. és 2. szekvenciájú oligonukleotidot (a 8. ábrán feltüntetett A és B prímért), a másik inkubáláshoz a szekvencia-jegyzékben szereplő 3. és 4. szekvenciájú oligonukleotidot (a 8. ábrán feltüntetett C és D prímért) használtuk. A reakciókat 50 μΐ össztérfogatú elegyben végeztük, 10 ng pQR162 templát, 50-50 pmól primer, 5 μΐ 10 x pufferoldat [ összetétele: 200 mmól Trisz-HCl (pH 8,2), 100 mmól

KCl, 60 mmól (NH₄)₂SO₄, 20 mmól MgCl₂, 1 % Triton X-100 és 100 μg/ml nukleázmentes BSA] és 2,5 egység pfu polimeráz (Pyro-135coccus furiosus-eredetű termostabil polimeráz, a Stratagene cég gyártmánya) felhasználásával. A reakcióelegyere a párolgás megakadályozása céljából azonos térfogatú paraffinolajat rétegeztünk.

A PCR termékeket 1 %-os agaróz gélen elemeztük. Az egyes PCR inkubálásokban képződött, körülbelül 3,1 kb méretű DNS fragmenseket kivágtuk a gélből, és a DNS-t Spin-X centrifugán (Costar gyártmány) végzett centrifugálással elválasztottuk az agaróztól. A két kivont DNS fragmenst etanollal kicsaptuk, és 20 μΐ vízben újra szuszpendáltuk. A két szuszpenzió 10-10 μΐ térfogatú alikvotját egyesítettük, és pufferoldattal [összetétele: 10 mmól Trisz-HCl (pH 8,8), 10 mmól

NaCl és 1 mmól Na₂EDTA] 50 μΐ végtérfogatra hígítottuk. Az egyesített DNS-fragmenseket 5 percig 92°C-on denaturáltuk, majd 2 órán át 55-57°C-on újra anelláltuk. Az így képződött rekombináns gyűrűket használtuk fel a kompetens sejtek alikvotjának transzformálására.

A plazmidokat mini-preparátumokként elkülönítettük [ lásd: Maniatis és munkatársai: Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, New York (1982)] , és templátokként használtuk kettősszálú DNS szekvenálására a didezoxi-láncletöréses módszerben [ lásd: Sanger és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74,

5463-5467 (1977)] . Egy, a módosított kódoló szekvenciát téves beékelődések nélkül tartalmazó plazmidot pQR176-nak neveztünk. Ezt a plazmidot pufferoldat jelenlétében, 20 μΐ végtérfogatú elegyben 20 egység EcoRI-el emésztettük. A módosított kódoló szekvenciát tartalmazó DNS fragmenst a fentiek szerint

-13 6különítettük el agaróz gélről, majd 20 μΐ végtérfogatú reakcióelegyben, 20 egység T4 DNS ligáz és puffer jelenlétében előzetesen emésztett és defoszforilezett pKK223.3-hoz [ Pharmacia Biotech gyártmány; ez a vektor tartalmazza a tac promotort, amit a lac represszor szabályoz, és izopropil-p-D-tiogalaktozid (IPTG) hozzáadásával indukálható; lásd még: Brosius és Holy: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6929 (1984)] ligáltuk. A ligáit termékekkel kompetens E. coli sejtek alikvotját transzformáltuk. A különböző rekombináns telepekből kapott plazmidokat restrikciós enzim-analízisnek vetettük alá az inszertek méretének a tac promotorhoz viszonyított helyzetének meghatározása céljából. A helyes szerkezetet pQR177-nek neveztük (lásd az 1. ábrát).

b) Lys66Glu bovin pankreasz-eredetű RN-áz termelése és tisztítása:

A génsebészeti úton kialakított szekvencia termelését és tisztítását a bovin pankreasz-eredetű ribonukleáz A E. coliban való kifejezésére kidolgozott módszerek szerint végeztük (Tarragona-Fiol és munkatársai: Gene, 1992) . Ez a rendszer a bovin pankreasz-eredetű ribonukleáz szignál-szekvenciáját hasznosítja a ribonukleáz vagy génsebészeti mutánsa termelésének az E. coli periplazmájába való irányítására. A periplazma oxidatív környezete elősegíti a fehérje helyes összekulcsolódását, amelynek eredményeként teljesen aktív rekombináns RN-áz fejeződik ki. A rekombináns enzim vagy a génsebészeti mutánsok erős nettó pozitív töltése elősegíti azok gyors megtisztítását az endogén periplazma-fehérjéktől. A mutáns fehérjék kifejezése és azt követő, homogenitásig való

-137tisztítása a közeg beoltásától számítva 48 óra alatt megy végbe.

A pQR177 plazmid két riboszóma kötőhelyet (RBS) tartalmaz, amelyek egyikét a vektor tac promotora szolgáltatja, mig a második cisztron leolvasására szolgáló másik az első cisztron kódoló szekvenciájában helyezkedik el. A pQR177-et befogadó E. coli sejtek IPTG-vel való indukálása révén képződő mRNS kétcisztronos, és a tac promotortól indul.

Az első cisztron egy 6 aminosavból álló peptidet (Met-Phe-Leu-Glu-Asp-Asp) kódol. Az első cisztron stop kodonja és a második cisztron start kodonja átfed, így a riboszómák folytatják az mRNS leolfvasását, és pre-RN-ázt termelnek. Az RN-áz szintetikus prekurzor formája a periplazmához transzlokálódik, és - miként N-terminális szekvenálással igazolható - a szignál szekvencia helyesen hasad le. A periplazma oxidatív környezete lehetővé teszi az RN-áz helyes összekulcsolódását és a natív enzim kialakulását, amit az igazol, hogy teljesen aktív enzim képződik.

Escherichia coli [ pQRl77] sejteket 100 μρ/πιΐ Ap-t tartalmazó 5 liter táptalajon 8 órán át 28°C-on tenyésztettünk. Amikor a sejtek a növekedés exponenciális szakaszában voltak, az elegyhez 0,5 mmól végkoncentrációban IPTG-t adtunk, és a sejtek tenyésztését rázás közben, éjszakán át 28 °C-on folytattuk. A periplazma fehérjéit módosított szferoplaszt/ozmotikus sokk módszerrel szabadítottuk fel. Az éjszakán át 5 liter térfogatban tenyésztett sejteket 10 percig 10 °C-on, 8300 g átlagos gyorsuláson végzett centrifugálással pelleteztük. A sejtpelletet 60 ml pufferoldatban [ összetétele: 200 mmól Trisz-HCl (pH 7,5), 20 tömeg/térfogat % RN-áz• ·

-138-mentes szacharóz, 1 mmól Na₂EDTA] újra szuszpendáltuk, és a szuszpenziót 30 percig szobahőmérsékleten tartottuk. A szuszpenzióhoz azonos térfogatú steril vizet adva és az elegyet alaposan összekeverve ozmotikus sokkot hoztunk létre. Az elegyet újabb 30 percig szobahőmérsékleten tartottuk, majd 10°C-on, átlagosan 100 000 g gyorsuláson 90 percig végzett centrifugálással pelleteztük a szferoplasztokat.

A periplazma-kivonatból S-Sepharose^(R) FF adszorbensen végzett kationcserés kromatografálással nyertük ki az összes pozitív töltésű fehérjét. A pufferoldatként 50 mmólos MES oldatot (pH 6,5), ’’ B puf feroldatként 50 mmól MES-t és 1 mól NaCl-t tartalmazó oldatot (pH 6,5) használtunk. A rekombináns RN-ázt Mono-S adszorbensen (Pharmacia-LKB gyártmány), 17,5 mmól NaCl/perc gradiens fenntartásával végzett kationcserés kromatografálással különítettük el a pozitív töltésű fehérjék elegyéből. A rekombináns RN-áz PAGE-SDS elektroforézissel, ezüst-festéssel végzett tisztaságvizsgálatának eredményei azt igazolják, hogy ezzel a technikával a fehérje homogenitásig tisztítható (lásd a 2. ábrát). A rekombináns enzim RN-áz aktivitását citidilil-3':5'-adenozin (CpA) és citidin-23'-ciklikus monofoszfát (C>p) hidrolízise alapján vizsgáltuk, és azt tapasztaltuk, hogy fajlagos aktivitása megegyezik a kereskedelemben kapható enzimével (lásd a példa végén lévő táblázatot). A fehérjekoncentrációt az optikai sűrűség 278 nm-en való mérésével határoztuk meg (0,71 sűrűség-érték 1 mg/ml RN-áznak felel meg). A C>p hidrolízisének kinetikáját a 286 nm-en mért abszorbancia időbeli növekedésének követésével mértük [ lásd: Witzel és Barnard: Biochem. Biophys. Rés. Commun. Ί_, 295-299 (1962)] . A K_m és k_cat paraméter

-139meghatározására a kezdeti sebességet és szubsztrátum-koncentrációt használtuk, és azok standard hibáját a Wilkinson által ismertetett analízisen [Biochem. J. 80, 324-332 (1961)] alapuló számítással határoztuk meg. A különböző ribonukleázok felhasználásával kapott paraméterek közötti eltéréseket Student-féle t-próbával elemeztük. A C>p hidrolízisének sebességét szobahőmérsékleten mértük, 0,1 cm úthosszú küvettába (Hellma) töltött 250 μΐ össztérfogatú mintán. A vizsgált reakcióelegyek változó mennyiségű C>p-t tartalmaztak pufferoldatban [ 0,1 mól 1,3-bisz(trisz/hidroxi-metil/-metil-amino)-propán (pH 7,0) + 50 mmól NaCl, 1 = 0,1] oldva; a reakciót az enzim hozzáadásával indítottuk meg. A táblázat adatai azt igazolják, hogy a génsebészetileg kialakított Lys66GluRN-áz enzim kinetikai jellemzői nem térnek el jelentősen a kereskedelmi bovin enziméitől.

Vizsgált enzim k_cat/K_m (mmól¹ s')

BP-RN-áz

Lys66Glu BP-RN-áz

3,4 (0,9)

4,7 (0,1) . példa

Arg4Ala,Lys6Ala,Lys66Glu humán pankreasz-eredetű ribonukleáz előállítása

PCR inkubálást végeztünk a következő anyagok felhasználásával: 2 ng pATF3 plazmid (az Arg4Ala,Lys6Ala HP-RN-áz gént tartalmazza, lásd a 2. referencia-példát) mint templát, 5-5 pmól 15. és 16. szekvenciájú oligonukleotid mint primerek, 0,2-0,2 mmól nukleotidok, PCR pufferoldat és 2,5 ·* ·

-14 0egység pfu polimeráz. Az 5 percig 92°C-on végzett kezdeti denaturálás után 30 denaturálás (92°C, 1 perc) - összekapcsolás (55°C, 1 perc) - extenzió (75°C, 1 perc) ciklust végeztünk. A PCR fragmenst az 1. példában leírtak szerint géllel kivontuk, és 37°C-on 1 órán át 10-15 egység EcoRI-el emésztettük. Az enzim hőkezeléses inaktiválása után az EcoRI fragmenst EcoRI-el emésztett és defoszforilezett pUC18-ba ligáltuk. A kapott plazmidot pATFZl-nek neveztük. A pATFZl plazmidot a mutáns

HP-RN-áz gén DNS-szekvenciájának kialakítására használtuk.

Az Arg4Ala,Lys6Ala,Lys66Glu HP-RN-áz kialakítására az 1. példában leírt RCPCR inkubálásokat végeztük el, azonban templátként pATFZl-et, oligonukleotid primerekként pedig az 1-4. szekvenciájú oligonukleotidok helyett a szekvencia-jegyzékben szereplő 30-33. szekvenciájú oligonukleotidokat használtuk. A kapott plazmidot pATFZ3-nak neveztük. Az Arg4Ala,-Lys6Ala,Lys66Glu HP-RN-áz génjét 10-15 egység EcoRI-el és 10-15 egység Ncol-el végzett emésztéssel kivágtuk, majd kifejezés céljára előzetesen EcoRI-el és Ncol-el emésztett és defoszforilezett pICI266-hoz (NCIMB 40589) ligáltuk. A ligálást, a kifejezést és a tisztítást az 1. példában leírtak szerint végeztük, azzal a különbséggel, hogy a pATFZ3-ból a fragmenst Ncol-el és EcoRI-el végzett kettős emésztéssel vágtuk ki, ezt előzetesen defoszforilezett és EcoRI-el és Ncol-el emésztett pICI266-hoz ligáltuk, és az indukcióhoz IPTG helyett 1 % arabinózt használtunk. A kapott szerkezetet pATFZ44-nek neveztük (lásd az 5. ábrát). A mutáns enzim kifejezését és tisztítását az 1. példában leírtak szerint végeztük, azzal a különbséggel, hogy az indukcióhoz IPTG helyett 1 % arabinózt használtunk.

• ·

-1413. példa

Ο—[ (2R, 3S, 4R, 5R) -2- (2-Amino-acetamido-metil) -5-(2,4-dioxo-l,2,3,4-tetrahidro-pirimidin-l-il)-4-hidroxi-2,3,4,5-tetrahidrofuran-3-il] -0-[ 4-(bisz/2-klór-etil/-amino)-fenoxi] -hidrogén-foszfát (a 7. ábrán bemutatott szintézis végterméke) előállítása mg (0,034 mmól), a 7. ábrán feltüntetett (4) képletű vegyületet 0,01 mólos N,N-dimetil-formamidos hidrogén-klorid oldatban oldottunk, és az oldathoz 60 mg 30 %-os palládium/csontszén katalizátort adtunk dimetil-formamidos szuszpenzió formájában. Az elegyet 2 óra 45 percig hidrogén atmoszférában kevertük. Az elegyet Celiten szűrtük, és a szűrletet 30°C alatti hőmérsékleten szárazra pároltuk. A nyers terméket vízmentes diklór-metánban szuszpendáltuk, és az elegyet centrifugáltuk. A diklór-metános felülúszót elöntöttük. Ezt a műveletet megismételtük, majd a szilárd maradékot szárítottuk. 9,4 mg kívánt terméket [ a 7. ábrán feltüntetett (5) képletű vegyület] kaptunk.

NMR spektrum adatai (DMSO-d₆, CD₃COOD) : δ 3, 3 (1H,

m) , 3,5 (3H, m) , 3,62 (8H, s) , 4,05 (1H, m) , 4,25 (1H, m) , 4,53 (1H, m) , 5,62 (1H, d) , 5,72 (1H, d) , 6,63 (2H, d) , 7,05 (2H, d) , 7, 63 (1H, d) .

A (4) képletű vegyületet a következőképpen állítottuk elő:

2'-O-Benzil-5'-bróm-5'-dezoxi-uridin [ (1) képletű vegyület] előállítása:

334 mg (1 mmól) 2'-O-benzil-uridin [Wagner és munkatársai: J. Org. Chem. 39, 24-30 (1974)], 500 mg szén-tetrabromid és 4 ml dimetil-formamid elegyéhez 20°C-on, argon at-142moszférában, 5 perc alatt 340 mg trifenil-foszfin 2 ml dimetil-formamiddal készített oldatát adtuk. Az elegyet 2 órán át 20°C-on kevertük, majd 60 ml vízbe öntöttük, és etil-acetáttal kétszer extraháltuk. A szerves extraktumokat egyesítettük, vízzel mostuk, szárítottuk, majd bepároltuk. Az olajos maradékot 20 g Merck Art. 9385 típusú szilikagélen kromatografáltuk, eluálószerként 5 % metanolt tartalmazó toluolt használtunk. 160 mg (40 %) 2'-O-benzil-5'-bróm-5'-dezoxi-uridint kaptunk.

NMR spektrum adatai (DMSO-d₆) : δ 11,4 (s, 1H) , 7,6 (d, 1H) , 7,3 (m, 5H) , 5,95 (dd, 1H) , 4,6 (q, 2H) , 4,0-4,2 (m,

3H), 3,6-3,8 (m, 2H) .

5¹-Azido-2'-O-benzil-5'-dezoxi-uridin [ (2) képletű vegyület] előállítása:

4,3 g 2'-O-benzil-5'-bróm-5'-dezoxi-uridint 86 ml dimetil-formamidban oldottunk, és az oldathoz 7 g nátrium-azidot adtunk. Az elegyet 45 percig 60°C-on kevertük. Az elegyet lehűtöttük, dekantálással elválasztottuk a reagálatlan nátrium-azidtól, majd szárazra pároltuk. A maradékot etil-acetátban oldottuk. Az oldatot vízzel kétszer mostuk, szárítottuk, és szárazra pároltuk. A maradékot Merck Art. 9385 típusú szilikagélen kromatografáltuk, eluálószerként 10 % metanolt tartalmazó toluolt használtunk. ‘1,5 g tiszta 5'-azido-2'-O-benzil-5'-dezoxi-uridint kaptunk.

NMR spektrum adatai	(DMSO-d6) : δ	11,4 (s,	1H), 7,6
(d, 1H), 7,3 (m, 5H), 5,9 (d,	1H), 5,6 (d,	1H), 5,4	(d, 1H),
4,65 (q, 2H), 3,9-4,2 (m, 3H),	3,6 (d, 2H)

2'-Q-Benzil-5¹ -(karbobenzoxi-glicil-amino)-5¹-dezoxi-uridin [ (3) képletű vegyület] előállítása:

**·*

-1431,5 g 5'-azido-2'-O-benzil-5'-dezoxi-uridin, 25 ml tetrahidrofurán és 1,3 g (benzil-oxi-karbonil)-glicin-N-hidroxi-szukcinil-észter elegyéhez 1,5 g 50 %-os víztartalmú 10 %-os platina/csontszén katalizátort adtunk, és az elegyet 4

ÍR) órán át hidrogén atmoszférában kevertük. Az elegyet Celiten keresztül szűrtük, és a szűrletet szárazra pároltuk. A maradékot etil-acetátban oldottuk, az oldatot 5 %-os citromsav oldattal kétszer, vízzel, végül nátrium-hidrogén-karbonát oldattal kétszer mostuk, szárítottuk, majd szárazra pároltuk. A maradékot 1:1 térfogatarányú éter/etil-acetát eleggyel eldörzsöltük. 960 mg (42 %) szilárd terméket kaptunk.

NMR spektrum adatai (DMSO-d₆) : δ 11,3 (s, 1H) , 8,0

(t,	1H)	, 7,6	(d,	1H), 7,4	(m,	10H), 5,	9 (d,	1H), 5,6 (d,	1H) ,
5,4	(d,	1H) ,	5,0	(s, 2H),	4,6	(q, 2H),	4,0	(m, 2H) , 3,9	(m,
1H) ,	3,	6 (d,	2H) ,	3,5 (m,	2H) .

A 7. ábrán feltüntetett (4) képletű vegyület előállítása :

a) 135 mg (0,64 mmól) benzil-oxi-diklór-foszfint [ Scott és munkatársai: J. Org. Chem. 55, 4904-4911 (1990)]

4,0 ml vízmentes diklór-metánban oldottunk. Az oldatot -20°C-ra hűtöttük, és 0,091 ml (0,64 mmól) di-izopropil-amin és 0,11 ml (0,64 mmól) di-izopropil-etil-amin 2,0 ml vízmentes diklór-metánnal készített oldatát adtuk hozzá. Az oldatot 45 percig -20°C-on kevertük, majd 30 perc alatt szobahőmérsékletre hagytuk melegedni, és további 30 percig szobahőmérsékleten kevertük. Az így kapott oldatot 280 mg (0,53 mmól) 2'-O-benzil-5'-(karbobenzoxi-glicil-amino)-5'-dezoxi-uridin és 0,336 ml (2,14 mmól) di-izopropil-etil-amin 3,0 ml diklór-metánnal készített, 0°C-ra hűtött oldatába csepegtettük. A ka·»» · * · ·· • : . . · :

·.,· ........

-144pott oldatot 10 percig 0°C-on, majd 2 órán át szobahőmérsékleten kevertük. Ezután a reakcióelegyet diklór-metánnal hígítottuk, telített vizes nátrium-hidrogén-karbonát oldattal kétszer mostuk, majd bepároltuk. A kapott olajos maradékról két alkalommal toluolt desztilláltunk le. Az így kapott termék közvetlenül felhasználható a következő reakcióban.

b) Az előző lépésben kapott nyers terméket 2,5 ml vízmentes diklór-metánban oldottuk, és az oldathoz 125 mg (0,534 mmól) 4-[ N,N-bisz (2-klór-etil) -amino] -fenol 3,0 ml vízmentes diklór-metánnal készített oldatát adtuk. Ezután az elegyhez 3,2 ml 0,46 mólos tetrazol oldatot (oldószer: vízmentes acetonitril) adtunk, és az elegyet 2 órán át szobahőmérsékleten kevertük. Ezután az elegyhez 0,11 ml 70 %-os vizes terc-butil-hidroperoxid oldatot (0,801 mmól) adtunk, és az oldatot még 1 órán át szobahőmérsékleten kevertük. A reakcióelegyet diklór-metánnal hígítottuk, majd telített vizes nátrium-hidrogén-karbonát oldattal, híg vizes nátrium-biszulfit oldattal és telített vizes nátrium-klorid oldattal egyszer-egyszer mostuk. Az elegyet szárítottuk, szárazra pároltuk, és a nyers terméket Merck Art. 9385 típusú szilikagélen kromatografáltuk. Eluálószerként 2 % metanolt tartalmazó diklór-metánt, majd 3,5 % metanolt tartalmazó diklór-metánt használtunk. 118 mg tiszta terméket kaptunk.

NMR spektrum adatai (DMSO-d_É) : 5 (diasztereoizomerek elegye) 3,37 (1H, m) , 3,42 (2H, d) , 3,67 (8H, d) , 4,12 (1H, m) , 4,33 (1H, m) , 4,56 (2H, m) , 5,0 (2H, s) , 5,14 (3H, m), 5,59 (1H, d) , 5,91 (1H, d) , 6,64 (2H, dd) , 7,05 (2H, t) , 7,28 (15H, m), 7,45 (1H, t), 7,62 (1H, dd), 8,13 (1H, szs),

11, 35 (1H, s) .

-145♦ · *· . példa

Murin A5B7 F(ab ¹)₂~Lys66Glu bovin pankreasz-eredetű ribonukleáz konjugátum szintézise és elkülönítése

A 4. referencia-példában leírtak szerint jártunk el, azzal a különbséggel, hogy bovin pankreasz-eredetű ribonukleáz helyett az 1. példában ismertetett Lys66Glu bovin pankreasz-eredetű ribonukleázt használtunk.

5. példa

Murin A5B7 F (ab ') ₂-Arg4Ala,Lys6Ala,Lys66Glu humán pankreasz-eredetű ribonukleáz konjugátum szintézise és elkülönítése

A 4. referencia-példában leírtak szerint jártunk el, azzal a különbséggel, hogy bovin pankreasz-eredetű ribonukleáz helyett a 2. példában ismertetett Arg4Ala,Lys6Ala-Lys66Glu humán pankreasz-eredetű ribonukleázt használtunk.

6. példa

Humanizált A5B7 F (ab ¹ ) ₂-Arg4Ala,Lys6Ala,Lys66Glu humán pankreasz-eredetű ribonukleáz konjugátum szintézise és elkülönítése

Az 5. példában leírtak szerint jártunk el, azzal a különbséggel, hogy murin A5B7 F(ab')₂ helyett humanizált A5B7 F(ab')₂-t használtunk.

A humanizált A5B7 F(ab')₂-t a következőképpen állítottuk elő: Az 5. referencia-példában leírt eljárást követtük az f) lépéstől, de az Fd és a könnyű lánc murin szekvenciáit (a szekvencia-jegyzékben szereplő 25. és 26. szekvenciát) a szekvencia-jegyzékben szereplő 28. és 29. szekvenciával (humanizált szekvenciák) helyettesítettük.

-146·· **

Ά fenti humanizált szekvenciákat például a következő közleményekben ismertetett módszerekkel állíthatjuk elő:

Edwards: Am. Biotech. Láb. _5, 38-44 (1987); Jayaraman és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4084-4088 (1991);

Fogúét és Lubbert: Biotechniques 13, 674-675 (1992); és

Pierce: Biotechniques 16, 708 (1994) .

7. példa

A 3. példa szerinti uracil-alapú előgyógyszer, a megfelelő gyógyszer, és az előgyógyszer + Arg4Ala,Lys6Ala-Lys66Glu HP-RN-áz mutáns enzim citotoxicitásának vizsgálata in vitro körülmények között

Az RN-áz-előgyógyszer és a megfelelő gyógyszer tumorsejtekre kifejtett differenciális toxicitását a következőképpen vizsgáltuk: 96 mélyedéses mikrotitráló lemezek mélyedéseibe töltött LoVo kolorektális tumorsejteket (2500 sejt/mé lyedés) 5x10 mól és 5x10 mól közötti végkoncentrációjú előgyógyszerrel vagy gyógyszerrel együtt 1 órán át 37°C-on inkubáltunk. Ezután a sejteket mostuk, és további 3 napon át 37 °C-on inkubáltuk. Ezután a mélyedésekbe TCA-t juttattunk, majd az elpusztult sejteket kimostuk, és SRB festék hozzáadásával, P. Skehan és munkatársai módszerével [ J. Natl. Cancer Inst. 82, 1107 (1990)] meghatároztuk a lemezekhez tapadt sejtfehérjék mennyiségét. A vegyületek hatásosságát a sejtnövekedést 50 %-ban gátló koncentráció (IC₅₀) alapján értékeltük .

A LoVo sejtek gyógyszerrel végzett kezelésekor 1 μmól körüli IC₅₀ értékeket mértünk. Ezzel szemben az előgyógyszer lényegesen kevésbé volt citotoxikus, IC₅₀ értéke körül·« · • -147belül 30 μιηόΐ volt (lásd a 6. ábrát) . Az RN-áz előgyógyszer tehát tumorsejtekkel szemben körülbelül 30-szor kevésbé citotoxikus, mint a mutáns RN-ázzal való hasítás révén kialakult gyógyszer.

Az előgyógyszert tartalmazó vizsgáló mélyedésekhez akár szabad Arg4Ala,Lys6Ala,Lys66Glu HP-RN-ázt (10 μg enzim), akár A5B7 F (ab' )₂-Arg4Ala,LysőAla,Lys66Glu HP-RN-áz konjugátumot (10 μg enzim) adva az aktív gyógyszeréhez hasonló mértékű citotoxicitást észleltünk, ami azt jelzi, hogy a mutáns enzim hatására az előgyógyszerből valóban felszabadul a hatásosabb gyógyszer.

Ezek a vizsgálatok azt igazolják, hogy egy viszonylag hatástalan előgyógyszer mutáns humán RN-áz alkalmazásával nagyhatású, az ADEP-terápiában tumorsejtek elölésére alkalmas citotoxikus gyógyszerré alakítható.

8. példa

RN-áz előgyógyszer és antitest-mutáns RN-áz konjugátum tumorellenes hatása egér xenograftokon

Az RN-áz előgyógyszer és az Arg4Ala,LysőAla,Lys66Glu HP-RN-áz konjugátum (vagy a LysőőGlu bovin pankreasz-eredetű RN-áz) tumorellenes hatását a következőképpen vizsgáltuk: Thymushiányos szőrtelen egerekbe szubkután 10⁷ LoVo tumorsejtet injektáltunk. Amikor a tumorok átmérője elérte a 4-5 mm-t, az állatoknak intravénásán, 10-100 mg/kg dózisban beadtuk a konjugátumot. A konjugátum tumorhoz való lokalizálódásához és a konjugátum maradékának a véráramból és a normál szövetekből való kiürüléséhez elegendő időt (1-4 napot) hagytunk, majd az állatoknak intravénásán vagy intraperitone-148álisan, 100-1000 mg/kg dózisban beadtuk az előgyógyszert. A konjugátummal és az elógyógyszerrel végzett kombinált kezelés hatására a tumorok lényegesen lassabban növekedtek, mint a kezeletlen, vagy az egyébként azonos mennyiségben csak konjugátummal, vagy csak elógyógyszerrel kezelt állatokon lévő tumorok. A vizsgálatok eredményei azt igazolták, hogy az Arg4Ala,Lys6Ala,Lys66Glu HP-RN-áz konjugátum elógyógyszerrel kombinálva tumorellenes hatást idéz elő.

9. példa

Betegek klinikai kezelésére használható dózisok

A találmány szerinti konjugátumok és előgyógyszerek rákterápiában alkalmazandó leghatásosabb adagolási módja és dózistartománya számos tényezőtől, köztük a betegség súlyosságától, a beteg általános állapotától és a kezelésre adott reakciójától, valamint a kezelőorvos megítélésétől függ. Ennek megfelelően a konjugátumok és az előgyógyszerek dózisát a beteg személyére kell titrálni. Mindazonáltal a konjugátum hatásos dózisa várhatóan a 20-200 mg/m körüli tartományba esik. Az előgyógyszer hatásos dózisa az adott gyógyszer jellegétől és az alapgyógyszer toxicitásától függ. Minthogy az előgyógyszer az alapgyógyszernél kevésbé toxikus, az alapgyógyszer minimális toxikus dózisa (MTD) - ha ismert - kiindulási pontként szolgálhat az előgyógyszer dózisának meghatározásához. Fenolmustár-alapú előgyógyszerek esetén, ahol az alapgyógyszerről klinikai adatok nem állnak rendelkezésre, a terápiás dózistartomány kevésbé biztos, és meghatározásához esetenként standard toxikológiai állatkísérletekre, majd betegeken végzett, kis dózisról induló dózisnöveléses vizsgála-149tokra van szükség. Mindazonáltal az előgyógyszerek terápiás dózisa az 500-2000 mg/m² tartományba eső érték lehet.

10. példa

A 3. példa szerinti uracil-alapú előgyógyszer (RN-áz előgyógyszer) natív és mutáns (Lys66Glu) bovin pankreasz

-eredetű RN-ázzal végzett enzimes bontásának kinetikai vizsgálata

Az RN-áz előgyógyszer és a megfelelő fenolmustár alapgyógyszer abszorbanciáját Perkin Elmer Lambda 2 spektrofotométerrel pásztáztuk a 200-350 nm tartományban, és kiválasztottuk azt a hullámhosszat, ahol (a foszfát-kötés lehasadása miatt) a legnagyobb a két abszorbancia közötti különb ség. Ezt a hullámhosszat 256 nm-nek találtuk. Ezen a hullámhosszon - 0,2 mmól és 2 mmól közötti előgyógyszer-koncentrációk és 5 μg/ml· és 80 μg/ml közötti RN-áz enzimkoncentrációk felhasználásával - mértük az előgyógyszer alapgyógyszerré alakulásának kezdeti sebességét, és a mért adatokból meghatároztuk a K_m és V_max paraméter értékét. A méréseket pufferoldatban (0,025 mól Trisz-HCl + 0,01 % Brij-35, pH 7,5), 37°C-on, 250 μΐ össztérfogatú mintákon végeztük, 0,1 cm út.hosszú küvettákban (Hellma) . V_max értékét a reakcióelegyben lévő RN-áz mennyiségével osztva kiszámítottuk k_cat értékét. Mindkét enzim citidin-2',3'-gyűrűs monofoszfáttal (C>p, standard szubsztrátum) szembeni enzimaktivitását is meghatároztuk úgy hogy 0,5 mmól és 6 mmól közötti C>p koncentrációk és 5 μg/ml és 35 μρ/ιηΐ RN-áz enzimkoncentrációk alkalmazásával 284 nm hullámhosszon mértük az abszorbancia változását. Az eredményeket a következő táblázat tartalmazza.

-150RN-áz előgyógyszer és C>p natív és mutáns (Lys66Glu) BP-RN-ázzal végzett enzimes bontásának kinetikai adatai

	kcat/Km (mmól	-1 -1. S )
Sszubsztrátum	Natív enzim	Mutáns enzim
A 3. példa szerinti RN-áz előgyógyszer	0,37	18
C>p	3, 0	3, 0

Az eredményekből megállapítható, hogy míg a natív és a mutáns bovin RN-áz lényegében azonos sebességgel alakítja át a standard C>p szubsztrátumot, a mutáns RN-áz a natív enzimnél lényegesen gyorsabban hidrolizálja az előgyógyszert. így a Lys66Glu mutáció beiktatása az RN-ázba nem érinti a bovin enzim foszfátkötés-hasító képességét, ugyanakkor azonban olyan enzimet szolgáltat, amely specifikusan képes a 3. példa szerinti RN-áz előgyógyszert hatásos gyógyszer felszabadulása közben hasítani.

11. példa

A 3. példa szerinti uracil-alapú előgyógyszer (RN-áz előgyógyszer) natív és mutáns (Arg4Ala,Lys6Ala,Lys66Glu) humán pankreasz-eredetű RN-ázzal végzett enzimes bontásának kinetikai vizsgálata

A kinetikai méréseket a 10. példában leírtakhoz hasonlóan végeztük, azzal a különbséggel, hogy enzimként natív

HP-RN-ázt és Arg4Ala,Lys6Ala,Lys66Glu HP-RN-ázt, közegként pedig 0,1 mól 1,3-bisz[ trisz (hidroxi-metil)-metil-amino] -propánt és 50 mmól NaCl-t tartalmazó pufferoldatot (pH 7,0) használtunk. Az eredményeket a következő táblázat tartalmazza • · · · •151-

	kCat/Km (mmól	-1 -1. S )
Sszubsztrátum	Natív enzim	Mutáns enzim
A 3. példa szerinti RN-áz előgyógyszer	0,2	3, 6
Op	1,2	1,2

Az eredményekből megállapítható, hogy míg a natív és a mutáns humán RN-áz lényegében azonos sebességgel alakítja át a standard C>p szubsztrátumot, a mutáns RN-áz a natív enzimnél lényegesen gyorsabban hidrolizálja az előgyógyszert. így a Lys66Glu mutáció beiktatása a humán pankreasz-eredetű RN-ázba nem érinti a humán enzim foszfátkötés-hasító képességét, ugyanakkor azonban olyan enzimet szolgáltat, amely specifikusan képes a 3. példa szerinti RN-áz előgyógyszert hatásos gyógyszer felszabadulása közben hasítani.

12. példa

Citozin-alapú előgyógyszer szintézise a 17. ábrán bemutatott eljárással

A 3. példában leírtak szerint jártunk el, azzal a különbséggel, hogy kiindulási anyagként a 7. ábrán szereplő (4) képletű vegyület helyett a 17. ábrán szereplő (6) képletű vegyületet használtuk. A 17. ábrán szereplő (6) képletű vegyületét a 7. ábrán szereplő (4) képletű vegyület előállításánál leírtak szerint szintetizáltuk, azzal a különbséggel, hogy 2'-O-benzil-uridin helyett N⁴-(benzil-oxi-karbonil)-2 '-O-benzil-citidint [a 17. ábrán feltüntetett (2) képletű vegyületet] használtunk. Az utóbbi vegyületet 2'-O-benzil-citidínből [ Christensen és Broom: J. Org. Chem. 37, 3398-3401

-152(1972)] állítottuk elő a 7. referencia-példában a (6) képletű vegyület előállítására ismertetett eljárással.

13. példa

Natív és mutáns (Lys66Glu) bovin pankreasz-eredetű

RN-áz enzimek hatásának vizsgálata a 6. és 7. referencia-példa szerinti uridin- és citidin-alapú előgyógyszer-analógokon

A vizsgálatokat a 10. példában leírtak szerint végeztük azzal a különbséggel, hogy a mérések során a hőmérsékletet 25°C-on tartottuk. Az eredményeket a következő táblázat tartalmazza.

RN-áz előgyógyszer-analógok és C>p natív és mutáns (Lys66Glu)

BP-RN-ázzal végzett	enzimes bontásának kinetikai adatai
Szubsztrátum	kcat/Km (mmól 1 s'1) Natív enzim Mutáns enzim

A 6. referencia-példa sze-
rinti előgyógyszer-analóg	1	(0,2)	25	(6)
A 7. referenca-példa szerinti előgyógyszer-analóg	5, 5	(0,3)	109	(11)
C>p	3,0		3, 0

Az eredményekből megállapítható, hogy míg a natív és a mutáns bovin RN-áz lényegében azonos sebességgel alakítja át a standard C>p szubsztrátumot, a mutáns RN-áz a natív enzimnél lényegesen gyorsabban hidrolizálja az előgyógyszer-analógokat. így a Lys66Glu mutáció beiktatása az RN-ázba nem érinti a bovin enzim foszfátkötés-hasító képességét, ugyanakkor azonban olyan enzimet szolgáltat, amely specifikusan képes a 6. és 7. referencia-példa szerinti RN-áz előgyógyszer-153-analógokat hasítani, jelezve a hatásos gyógyszerek és a meg felelő előgyógyszerek felszabadulását.

14. példa

A találmány szerinti előgyógyszer-vegyületeket tar talmazó jellemző gyógyászati készítmények

A) Kapszulák:

Egy jellemző, kapszulánként 50 mg hatóanyagot tartalmazó, szárazon töltött kapszulás készítmény kapszulánként 50 mg hatóanyagot, 149 mg laktózt és 1 mg magnézium-sztearátot tartalmaz, 1-es méretű száraz zselatin kapszulába töltve

A hatóanyagot 60-as száltávolságú szitán áthaladó porrá törjük, majd 60-as száltávolságú szitán keresztül rászitáljuk a laktózt és a magnézium-sztearátot. A komponenseket körülbelül 10 percig homogenizáljuk, majd a keveréket 1-es méretű száraz zselatin kapszulákba töltjük.

B) Tabletták:

Egy jellemző tablettás készítmény tablettánként 25 mg hatóanyagot, 82 mg USP minőségű előzselatinált keményítőt 82 mg mikrokristályos cellulózt és 1 mg magnézium-sztearátot tartalmaz.

C) Kúpok:

A rektális adagolásra alkalmas kúpok jellemzően 0,08-1,0 mg hatóanyagot, 0,25-0,5 mg dinátrium-kalcium-edetá tót és 775-1600 mg poli(etilén-glikol)-t tartalmazhatnak. Má kúp-készítményekben a dinátrium-kalcium-edetátot például 0,04-0,08 mg butilezett hidroxi-toluollal, és a poli(etilén-glikol)-t például 675-1400 mg hidrogénezett növényi olajjal (így Suppocire L, Wecobee FS, Wecobee M vagy Witepsols kereskedelmi nevű anyaggal) helyettesíthetjük.

-154D) Injekciós készítmények:

Egy jellemző injekciós készítmény 10 mg hatóanyagot, 0,01 ml benzil-alkoholt és 1,0 ml injekciós célokra alkalmas vizet tartalmaz.

15. példa

D253K HCPB-(His)₆-c-myc klónozása és kifejezése E. coli sejtekből

A D253K-HCPB klónozására és E. coli sejtekben való kifejezésére a 15. referencia-példában leírthoz nagymértékben hasonló módszert használtunk. Klónozó vektorként ebben az esetben is pICI266-ot alkalmaztunk, és a pro-HCPB gén PCR-val való előállításához kiindulási anyagként a 14. referencia-példában ismertetett pICI1698 plazmidot alkalmaztuk. Ebben az esetben azonban a gén PCR-val végzett amplifikációja során az érett gén 253-as aminosav-helyzetében lévő kodonját helyspecifikus mutagenezissel aszparaginátról lizinre (GAC-ról AAA-ra) cseréltük (D253K módosítás). A 15. referencia-példában leírtakhoz hasonlóan két PCR elegyet készítettünk. Az első reakcióban primerekként FSPTSl-et (lásd a szekvencia-jegyzékben szereplő 58. szekvenciát) és 1398-at (lásd a szekvencia-jegyzékben szereplő 72. szekvenciát), a második reakcióban pedig primerekként 6HIS9E10RlBSl-et (lásd a szekvencia-jegyzékben szereplő 59. szekvenciát) és 1397-et (lásd a szekvencia-jegyzékben szereplő 73. szekvenciát) használtunk.

A kiindulási DNS mindkét reakcióban pICI1698 volt. A 1398 és 1397 prímért (72. és 73. szekvencia) úgy terveztük, hogy a 253-as helyzetű aminosav-kodon köré kapcsolódjanak, iktassák be a GAC AAA cserét a DNS szekvenciába, és képezzenek komplementer szekvenciát a két PCR termék végein. A másik két • ·· ·

-155- ..........

felhasznált primert (FSPTS1 és 6HIS9E10R1BS1, 58. és 59. szekvencia) a 15. referencia-példában ismertettük. A két PCR termékelegy alikvot részeit agaróz gél-elektroforézissel a helyes méretű (körülbelül 750 és 250 bázispárból álló) DNS-ek jelenlétére és azok közelítő koncentrációjának megállapítására elemeztük, és azt találtuk, hogy a termékelegyek főtömegükben a helyes méretű anyag sávját szolgáltatják. Ezután az első két PCR termék körülbelül 4-4 ng-ját, 200 μιηόΐ végkoncentrációban dNTP-ket, Taq polimeráz reakció-puffért és 2 egység Taq polimerázt felhasználva újabb PCR-t indítottunk be egy 80 μΐ végtérfogatú elegyben. A Taq enzim hozzáadása előtt az elegyet 10 percig 94°C-on tartottuk, majd az elegyet 10 ciklusban 1 percig 94°C-on és 4 percig 63°C-on tartva végrehajtottuk a PCR inkubálást. A ciklusok végrehajtása után az elegyhez 120-120 pmól FSPTS1 és 6HIS9E10R1BS1 primert (58. és

59. szekvencia), további dNTP-ket (körülbelül +100 μιηόΐ), Taq polimeráz reakció-puffért és 4 egység Taq polimerázt adva az elegy térfogatát 120 μΐ-re egészítettük ki. Az elegyet a Taq enzim hozzáadása előtt 10 percig 94°C-on tartottuk, majd az elegyet 30 ciklusban 1,5 percig 94°C-on, 2 percig 50°C-on és 2 percig 72°C-on tartva végrehajtottuk a PCR inkubálást. A reakció végén az elegyet 9,9 percig 72°C-on inkubáltuk.

A PCR termék alikvot részét agaróz gél-elektroforézissel a helyes méretű (körülbelül 1000 bázispárból álló) DNS jelenlétére elemeztük, és azt találtuk, hogy az főtömegében a helyes méretű DNS-nek megfelelő sávot ad. A reakcióelegyben lévő termék maradékát a 15. referencia-példában leírtak szerint tisztítottuk. Az elkülönített DNS-t Fspl és EcoRI enzim-156mel emésztettük, és a helyes méretű (körülbelül 1000 bázispárból álló) termék sávját a 15. referencia-példában leírtak szerint tisztítottuk.

A 15. referencia-példában leírtak szerint előállított pICI266 kettősszálú DNS-t KpnI restrikciós enzimmel emésztettük, majd tompa végén T4 DNS polimerázzal kezeltük, gondosan ügyelve arra, hogy az emésztés teljes legyen. Ezután a tisztított DNS-t EcoRI restrikciós enzimmel emésztettük. A helyes méretű (körülbelül 5600 bázispárból álló) DNS-t a 15. referencia-példában leírtak szerint tisztítottuk.

Mindkét restrikciós enzimmel kezelt és tisztított

DNS-ből mintát vettünk, és a minták tisztaságát és közelítő koncentrációját agaróz gélen való elektroforézissel vizsgáltuk, ismert standardokkal összehasonlítva. Az így vizsgált DNS-akból ligációs elegyeket készítettünk a HCPB gén pICI266 vektorba való klónozására. Ezt a műveletet a 15. referencia-példában leírtak szerint végeztük.

A ligálási reakció után a DNS eleggyel a 15. referencia-példában leírtak szerint DH5a E. coli törzset transzformáltunk, majd a tenyészetből telepeket emeltünk ki, és azokat hibridizációra vizsgáltuk.

Hat pozitívan hibridizálódó izolátumot a 15. referencia-példában leírtak szerint PCR technikával vizsgáltunk a helyes méretű inszertek jelenlétére. Az eljárásban FSP1TS1 és 6HIS9E10R1BS1 prímért (szekvenciájuk az 58. és 59. szekvenciának felel meg), valamint primelésre egy belső FSPTS1 prímért (szekvenciája az 58. szekvenciának felel meg) és 679-et (szekvenciája az 51. szekvenciának felel meg) használtunk. A PCR termékeket agaróz gél-elektroforézissel a helyes méretű

-157(az FSPTS1 primertől a 6HIS9E10R1BS1 primerig körülbelül 1000 bázispár és az FSPTS1 primertől a 679 primerig körülbelül 430 bázispár) DNS jelenlétére vizsgáltuk. Valamennyi klónból a helyes méretű DNS termék képződött a PCR reakció során.

Ezután mind a hat kiónt felhasználtuk plazmid DNS előállítására, és kettőt közülük a 15. referencia-példában leírtak szerint szekvenáltunk a PCR termék régiójában. A kiónok szekvenálásához nyolc külön oligonukleotid prímért (1281, 677, 1504, 679, 1802, 1590, 1280 és 1731 prímért, szekvenciájuk rendre a szekvencia-jegyzékben szereplő 55., 52., 60.,

51., 63., 61., 53.és 62. szekvenciának felel meg) használtunk. A szekvenálás eredményei alapján kiválasztottuk a kívánt D253-HCPB génszekvenciát tartalmazó plazmidot, amit pICI1713-nak neveztünk.

A pICI1713-ban lévő klónozott D253K-HCPB gén igazolt szekvenciáját a leolvasott aminosav-szekvenciával együtt a PelB szekvencia kezdetétől az EcoRI restrikciós helyig a szekvencia-jegyzékben 74. számon szerepeltettük. A DNS-akat a PelB első kodonját 1-esnek véve, a pepiidet alkotó aminosavakat az érett HCPB kezdetét 1-esnek véve számoztuk.

A D253K-HCPB szabályozott kifejezésére a pICI1713 plazmid DNS-t a 15. referencia-példában leírtak szerint kalcium-kloridos transzformációra alkalmas E. coli kifejező törzsekbe transzformáltuk. Az összes pICI1713-mal transzformált kifejező törzset a 15. referencia-példában leírtak szerint vizsgáltuk a klónozott D253K-HCPB gén kifejeződésének megtörténtére. Minthogy a D253K-HCPB C-terminális (His)₆-c-myc toldalékot hordoz, a Western analízisben - a 15. referencia-pél-158dában leírtakhoz hasonlóan - a c-myc peptid-toldalékra specifikus 9E10 monoklónos antitestet használtunk.

A Coomassie-val megfestett gélek vizsgálata azt igazolta, hogy a pICI266-ba klónozott, toldalékkal ellátott D253K-HCPB (pICI1713) kifejeződött az E. coli törzsekben. A géleken - a csak pICI266 vektort tartalmazó kiónokkal, valamint a toldalékkal ellátott HCPB-t termelő klónokkal (lásd a

15. referencia-példát) összehasonlítva - egy további, körülbelül 35 000 dalton tömegű fehérjének megfelelő erős sáv jelent meg. Egy azonos méretű fehérjét tartalmazó sáv a c-myc toldalék Western-analízissel való kimutatásakor erős jelet adott.

16. példa

D253R HCPB-(His)₆-c-myc klónozása és kifejezése E. coli sejtekből

A D253R-HCPB klónozására és E. coli sejtekben való kifejezésére a 16. referencia-példában leírthoz nagymértékben hasonló módszert használtunk. Klónozó vektorként ebben az esetben is pICI266-ot alkalmaztunk, és a pro-HCPB gén PCR-val való előállításához kiindulási anyagként a 15. referencia-példában ismertetett pICI1712 plazmidot használtuk. Ebben az esetben azonban a gén PCR-val végzett amplifikációja során az érett gén 253-as aminosav-helyzetében lévő kodonját helyspecifikus mutagenezissel aszparaginátról argininre (GAC-ról

CGC-re) cseréltük (D253R módosítás). A 15. és 16. referencia-példákban leírtakhoz hasonlóan két PCR elegyet készítettünk. Az első reakcióban printerekként 2264-et (lásd a szekvencia-jegyzékben szereplő 65. szekvenciát) és 2058-at (lásd a szekvencia-jegyzékben szereplő 75. szekvenciát), a második

-159reakcióban pedig printerekként 6HIS9E10RlBSl-et (lásd a szekvencia-jegyzékben szereplő 59. szekvenciát) és 2054-et (lásd a szekvencia-jegyzékben szereplő 76. szekvenciát) használtunk. A kiindulási DNS mindkét reakcióban pICI1712 volt.

A 2058 és 2054 prímért (75. és 76. szekvencia) úgy terveztük, hogy a 253-as helyzetű aminosav-kodon köré kapcsolódjanak, iktassák be a GAC —» CGC cserét a DNS szekvenciába, és képezzenek komplementer szekvenciát a két PCR termék végein. A másik két felhasznált prímért (2264 és 6HIS9E10R1BS1, 65. és 59. szekvencia) a 15. és 16. referencia-példa ismerteti. A két PCR termékelegy alikvot részeit agaróz gél-elektroforézissel a helyes méretű (körülbelül 750 és 250 bázispárból álló) DNS-ak jelenlétére és azok közelítő koncentrációjának megállapítására elemeztük, és azt találtuk, hogy a termékelegyek főtömegükben a helyes méretű anyag sávját szolgáltatják.

Ezután az első két PCR termék körülbelül 4-4 ng-ját, 200 μιηόΐ végkoncentrációban dNTP-ket, Taq polimeráz reakció-puffért és 2 egység Taq polimerázt felhasználva újabb PCR-t indítottunk be egy 80 μΐ végtérfogatú elegyben. A Taq enzim hozzáadása előtt az elegyet 10 percig 94°C-on tartottuk, majd az elegyet 10 ciklusban 1 percig 94°C-on és 4 percig 63°C-on tartva végrehajtottuk a PCR inkubálást. A ciklusok végrehajtása után az elegyhez 120-120 pmól 2264 és 6HIS9E10R1BS1 prímért (65. és

59. szekvencia), további dNTP-ket (körülbelül +100 pmól), Taq polimeráz reakció-puffért és 4 egység Taq polimerázt adva az elegy térfogatát 120 μΐ-re egészítettük ki. Az elegyet a Taq enzim hozzáadása előtt 10 percig 94°C-on tartottuk, majd az elegyet 30 ciklusban 1,5 percig 94°C-on, 2 percig 50°C-on és • ·« · ti *· • · · · · · « · ·· • »* ·

percig 72°C-on tartva végrehajtottuk a PCR inkubálást. A reakció végén az elegyet 9,9 percig 72°C-on inkubáltuk.

A PCR termék alikvot részét agaróz gél-elektroforézissel a helyes méretű (körülbelül 1000 bázispárból álló) DNS jelenlétére elemeztük, és azt találtuk, hogy az főtömegében a helyes méretű DNS-nek megfelelő sávot ad. A reakcióelegyben lévő termék maradékát a 15. referencia-példában leírtak szerint tisztítottuk. Az elkülönített DNS-t Ncol és EcoRI enzimmel emésztettük, és a helyes méretű (körülbelül 1000 bázispárból álló) termék sávját a 15. referencia-példában leírtak szerint tisztítottuk.

A 15. referencia-példában leírtak szerint előállított pICI266 kettősszálú DNS-t Ncol és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztettük, gondosan ügyelve arra, hogy az emésztés teljes legyen. A helyes méretű (körülbelül 5600 bázispárból álló) DNS-t a 15. referencia-példában leírtak szerint tisztítottuk .

Mindkét restrikciós enzimmel kezelt és tisztított

DNS-ből mintát vettünk, és a minták tisztaságát és közelítő koncentrációját agaróz gélen való elektroforézissel vizsgáltuk, ismert standardokkal összehasonlítva. Az így vizsgált DNS-akból ligációs elegyeket készítettünk a HCPB gén pICI266 vektorba való klónozására. Ezt· a műveletet a 15. referencia-példában leírtak szerint végeztük.

A ligálási reakció után a DNS eleggyel a 15. referencia-példában leírtak szerint DH5a E. coli törzset transzformáltunk, majd a tenyészetből telepeket emeltünk ki, és azokat hibridizációra vizsgáltuk.

» *« ·

-161- *··* »··*··* · ·

A kiónok közül hármat használtunk fel plazmid DNS előállítására, és azokat a 15. referencia-példában leírtak szerint szekvenáltuk a PCR termék régiójában. A kiónok szekvenálásához kilenc külön oligonukleotid prímért (1281, 677, 1504, 679, 1802, 1590, 1280, 1731 és 1592 prímért, szekvenciájuk rendre a szekvencia-jegyzékben szereplő 55., 52., 60., 51., 63., 61., 53., 62. és 70. szekvenciának felel meg) használtunk. A szekvenálás eredményei alapján kiválasztottuk a kívánt D253R-HCPB génszekvenciát tartalmazó plazmidot, amit pICI1746-nak neveztünk.

A pICI1746-ban lévő klónozott D253R-HCPB gén igazolt szekvenciáját a leolvasott aminosav-szekvenciával együtt a PelB szekvencia kezdetétől az EcoRI restrikciós helyig a szekvencia-jegyzékben 77. számon szerepeltettük. A DNS-akat a PelB első kodonját 1-esnek véve, a peptidet alkotó aminosavakat az érett HCPB kezdetét 1-esnek véve számoztuk.

A D253R-HCPB szabályozott kifejezésére a pICI1746 plazmid DNS-t a 15. referencia-példában leírtak szerint kalcium-kloridos transzformációra alkalmas E. coli kifejező törzsekbe transzformáltuk. Az összes pICI1746-tal transzformált kifejező törzset a 15. referencia-példábana leírtak szerint vizsgáltuk a klónozott D253R-HCPB gén kifejeződésének megtörténtére. Minthogy a D253R-HCPB C-terminális (His)₆-c-myc toldalékot hordoz, a Western analízisben - a 15. referencia-példában leírtakhoz hasonlóan - a c-myc peptid-toldalékra specifikus 9E10 monoklónos antitestet használtunk.

A Coomassie-val megfestett gélek vizsgálata azt igazolta, hogy a pICI266-ba klónozott, toldalékkal ellátott

D253R-HCPB (pICI1746) kifejeződött az E. coli törzsekben. A • 4 4

-162géleken - a csak a pICI266 vektort tartalmazó kiónokkal, valamint a 15. referencia-példa szerinti, toldalékkal ellátott HCPB-t szolgáltató klónokkal összehasonlítva - egy további, körülbelül 35 000 dalton tömegű fehérjének megfelelő erős sáv is megjelent. Egy azonos méretű fehérje sávja a c-myc peptid-toldalék Western analízissel való kimutatásakor erős jelet adott.

A terméket a 17. példában ismertetendő módszerrel tisztítottuk.

17. példa

Mutáns D253K-HCPB-(His) ₆-c-myc fehérjék megtisztítása az E. coli sejtektől

Először egy 20 liter térfogatban végzett fermentációs eljárást ismertetünk a D253K karboxipeptidáz B-analóg sejtpépben való előállítására. MSD 1924 jelű E. coli K12 törzset pZen 1713 (más néven pICI1713, lásd a 15. példát) plazmáddal transzformáltunk, és a képződött MSD 2230 (MSD 1924 pZen 1713) törzset glicerines fagyasztókeverékben -80°C-on tároltuk.

Az MSD 2230 törzset 10 μg/ml L-tetraciklint tartalmazó agarlemezeken szélesztettük, és különálló egyedi telepek képzése céljából éjszakán át 37°C-on tenyésztettük. A 10 μg/ml L-tetraciklint tartalmazó agar felületéről 6 egyedi MSD

2230 telepet emeltünk le, a telepeket 10 ml 10 pg/ml L-tetraciklint tartalmazó táptalajban újra szuszpendáltuk, és 100-100 μΐ így kapott tenyészettel azonnal beoltottunk hat 250 ml-es Erlenmeyer lombikba töltött 75 ml 10 μ9/ιη1 L-tetraciklint tartalmazó táptalajt. Az elegyeket 300 lengés/perc se-163-

bességgel oda-vissza mozgó rázógépen 15-16 órán át 37°C-on tenyésztettük, majd a lombikok tartalmát egyesítettük, és a kapott eleggyel U30D típusú fermentorba (gyártja a B. Braun cég, Melsungen, Németország) töltött 15 1 növesztő táptalajt oltottunk be (a táptalaj összetételét a 23. ábrán adtuk meg).

A fermentációt 37°C-on, 6,7 pH-értéken végeztük. Az elegy pH-ját 6,7-re állított automata érzékelővel, 6 mólos nátrium-hidroxid oldat vagy 2 mólos kénsavoldat automatikus utánadagolásával tartottuk állandó értéken. Az oldott oxigén tenzióját (dOT) 50 %-os levegő-telítettségre állítottuk be, és a fermentor keverőjének sebességét automatikusan 200 és 1000 fordulat/perc értékek között változtatva tartottuk állandó értéken. A fermentorba vezetett levegő áramlási sebességét 20 standard liter/perc értékre álítottuk be (ez a Tylan típusú anyagáram-szabályozón mérve 1,3 edénytérfogat/percnek felelt meg).

4,5 órával a beoltás után a fermentorba 28,5 órán át 190-210 ml/óra sebességgel 225 g/1 koncentrációjú élesztőkivonat oldatot vezettünk. Az élesztőkivonat beadagolásának megkezdése után 1,5 órával a fermentáció hőmérsékletét 25°C-ra csökkentettük. Amikor ezt a hőmérsékletet elértük (kb. 1 óra elteltével), a D253K karboxipeptidáz analóg kifejeződésének indukálására az elegyhez egyetlen adagban 50 %-os arabinózt adtunk olyan mennyiségben, hogy annak végkoncentrációja a fermentorban 0,5 % legyen. 1-2 órával az indukció után a fermentorba a 45-55 ml/óra sebességgel 714 g/1 glicerint és 143 g/1 ammónium-szulfátot tartalmazó elegyet vezettünk, és a bevezetést a sejtek elkülönítéséig fenntartottuk. A fenti körülmények között a fermentációt a fermentor beoltásától szá• ·

-164mított kb. 75 órán át folytattuk, és ezután a fermentor tartalmának alikvot részeit 1 literes centrifugaedényekbe töltve elkülönítettük a sejteket. A kimerült táptalajt Sorvall RC-3B típusú centrifugán 30 percig 4°C-on, 7000 g gyorsuláson végzett centrifugálással választottuk el a baktériumsejtektől. Ebben az eljárásban jellemzően körülbelül 20 g/1 száraz tömegű terméket kapunk.

A sejtpépet a következőképpen tisztítottuk: A D253K HCPB rekombináns enzimet tartalmazó rekombináns E. coli sejtpépet kiemeltük a -70°C-os hűtőtárolóból,és felengedni hagytuk. A sejtpép tömegét mértük, és 309 g-nak találtuk. A sejtpépet A pufferoldatban [200 mmól trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-hidroklorid (Trisz-HCl), 20 % szacharóz, pH 8,0] újraszuszpendálva 320 ml térfogatú szuszpenziót készítettünk. A sejtszuszpenziót időnkénti enyhe keverés közben 20 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd azonos térfogatú desztillált vizet adtunk hozzá, és alaposan összekevertük. A sejtszuszpenziót időnkénti enyhe keverés közben ismét 20 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten.

Az így kapott, ozmotikusán feltört nyersanyagot 90 percig 4°C-on, 98000 g gyorsuláson centrifugálva derítettük, majd a felülúszót leöntöttük a pelletezett oldhatatlan frakcióról. A kapott, 240 ml térfogatú felülúszóhoz 24 mg dezoxiribonukleáz 1 5 ml desztillált vízzel készített oldatát adtuk. Az elegyet folytonos rázatás közben 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk annak érdekében, hogy az elegy viszkozitása az affinitás-oszlopra való felvitelt lehetővé tevő értékre csökkenjen. Affinitás-oszlopként karboxipeptidáz in(R) hibítorral kezelt, CNBr-dal aktivált Sepharose oszlopot • · ··

-165-

használtunk, amit a Pharmacia cég útmutatója szerint alakítottunk ki CNBr-dal aktivált Sepharose 4B-ből (Pharmacia-gyártmány) és burgonyagumóból származó karboxipeptidáz inhibitorból (a Sigma cég C-0279 számú terméke). A felülúszót 1:1 térfogatarányban B pufferoldattal (10 mmól Trisz-HCl, 500 mmól nátrium-klorid, pH 8,0) hígítottuk, az elegy pH-ját 8,0-ra állítottuk, és egy éjszaka alatt 0,5 ml/perc sebességgel felvittük a karboxipeptidáz inhibitorral kezelt affinitás-oszlopra (az oszlopot előzetesen 4°C-on egyensúlyba hoztuk a B pufferoldattal). A felülúszó felvitele után az oszlopot addig mostuk, amíg az effluens abszorbanciája vissza nem tért az alapvonalra, majd a megkötött anyagot eluáló pufferoldattal (100 mmól nátrium-karbonát, 500 mmól nátrium-klorid, pH 11,4) 4°C-on leoldottuk az oszlopról. Az eluátumot 1 ml-es frakciókba gyűjtöttük. Az eluátumfrakciókból mintákat vettünk, a mintákat a rekombináns karboxipeptidáz jelenlétére elemeztük, majd a rekombináns enzimet tartalmazó frakciókat -20°C-on lefagyasztottuk. A rekombináns karboxipeptidázt tartalmazó frakciókat anti-c-myc-toldalék antitesttel (9E10), majd anti-egér-torma-peroxidáz konjugátummal (a Sigma cég A-9044 számú terméke) végzett Western foltanalízissel azonosítottuk (ezek a frakciók 4-klór-naftollal és hidrogén-peroxiddal kezelve színreakciót adnak).

Az elemzés adatai szerint a rekombináns karboxipeptidáz B a 11-44. frakcióban jelent meg. Ezeket a frakciókat egyesítettük, a pH-t 7,5-re állítottuk be, Millipore Centrifugai Ultrafree-20^(R) készüléken (kizárási móltömeg: 10 000) betöményítettük, majd hirtelen lefagyasztottuk, és -20°C-on tároltuk. Az itt tárgyalt tisztítási eljárással 0,95 ml tér-166fogatban 4,7 mg 80 %-os tisztaságú D253K mutáns karboxipeptidáz t kaptunk.

18. példa (2S),2-[ 3-(4-/bisz(2-klór-etil)-amino/-fenoxi-karbonil)-propionil-amino] -borostyánkősav [ a 27. ábrán feltüntetett (5a) képletű vegyület, aszparaginsav-fenolmustár előgyógyszer] előállítása

A szintézist a 12. referencia-példában leírtakhoz hasonlóan végeztük. A képletszámok a 27. ábrán feltüntetett megfelelő vegyületeket jelölik.

(2S) , 2-[ 3- (4-/bisz (2-klór-etil) -amino/-fenoxi-karbonil)-propionil-amino] -borostyánkősav-dibenzil-észtert [ (4a) képletű vegyület] 2 órán át 5,6 bar nyomáson hidrogéneztünk. A kívánt (5a) képletű vegyületet kaptuk 86 %-os hozammal.

NMR spektrum adatai (CD₃OD) : 2,65-2,75 (t, 2H) ,

2,8-2,9 (m, 4H), 3,7-3,75 (m, 4H) , 3,8-3,85 (m, 4H) , 4,75 (t,

1H), 6,7-6,8 (m, 2H), 7,0-7,1 (m, 2H).

Tömegspektrum (ESI): 471-473 (MNa)⁺

Elemzés a C₁₈H₂₂N₂O₇C1₂ . 1,4 H₂O képlet alapján:

számított: C: 45,56 %, H: 5,27 %, N: 5,90 %;

talált: C: 54,79 %, H: 5,60 %, N: 5,91 %.

A kiindulási anyagként felhasznált (4a) képletű vegyületet a következőképpen állítottuk elő:

(2S),2-Amino-borostyánkősav-dibenzil-észtert [ (2a) képletű vegyület] (1) képletű vegyülettel reagáltattunk, és a terméket dietil-éter/hexán elegyből átkristályosítottuk.

(2S),2-(3-Karboxi-propionil-amino)-borostyánkősav-dibenzil-észtert '(3a) képletű vegyület] kaptunk 80 %-os hozammal.

• ·

-167NMR spektrum adatai (CDC1₃) : 2,42-2,6 (m, 2H) , 2,6-2,75 (m, 2H), 2,85 (dd, 2H) , 3,1 (dd, 1H) , 4,9 (dd, 1H) ,

5,05 (dd, 2H) , 5,15 (s, 2H) , 6,7 (d, 1H) , 7,25-7,5 (m, 10H) .

Tömegspektrum (ESI): 436 (MNa)⁺

Elemzés a C₂₂H₂3NO₇. 0,4 H₂0 képlet alapján:

számított: C: 62,82 %, H: 5,70 %, N: 3,33 %;

talált: C: 63,2 %, H: 5,75 %, N: 2,9 %.

A (3a) képletű vegyületből a 27. ábrán feltüntetett körülmények között állítottunk elő (4a) képletű vegyületet 78 %-os hozammal. Az elegyet 3 órán át szobahőmérsékleten kevertük, és a terméket gyorskromatografálással (eluálószer: 70:30 térfogatarányú dietil-éter/hexán elegy) tisztítottuk.

NMR spektrum adatai (CDC1₃) : 2,55-2,65 (m, 2H) ,

2,8-2,9 (m, 2H) , 2,9 (dd, 1H) , 3,1 (dd, 1H) , 3,6 (dd, 4H) ,

3,7 (dd, 4H) , 4,9 (dd, 1H) , 5,05 (dd, 2H) , 5,15 (s, 2H) , 6,58 (d, 1H) , 6,65 (d, 2H) , 6,95 (d, 2H) , 7,25-7,4 (m, 10H) .

Tömegspektrum (ESI): 651-653 (MNa)⁺.

19. példa (2S),2-[ 3- (4-/bisz(2-klór-etil)-amino/-fenoxi-karbonil)-propionil-amino] -pentándikarbonsav [a 27. ábrán feltüntetett (5b) képletű vegyület, glutaminsav-fenolmustár előgyógyszer] előállítása

A szintézist a 12. referencia-példában leírtak szerint végeztük. A képletszámok a 27. ábrán feltüntetett megfelelő vegyületeket jelölik.

(2S),2-[ 3-(4-/bisz(2-klór-etil)-amino/-fenoxi-karbonil)-propionil-amino] -pentándikarbonsav-dibenzil-észtert [ (4b) képletű vegyület] 3 órán át 4,2 bar nyomáson hidrogé• ·

-168néztünk. A kívánt (5b) képletű vegyületet kaptuk 93 %-os hozammal .

NMR spektrum adatai (CD₃OD) : 1,9-2,0 (m, 1H) , 2,1-2,2 (m, 1H), 2,35-2,45 (m, 2H) , 2,55-2,7 (m, 2H) , 2,8-2,9 (m, 2H), 3,65-3,7 (m, 4H) , 3,72-3,8 (m, 4H), 4,4-4,5 (m, 1H) ,

6,75 (d, 2H), 6,95 (d, 2H) .

Tömegspektrum (ESI): 485-487 (MNa)⁺

A (4b) képletű kiindulási anyagot a következőképpen állítottuk elő:

(2S),2-Amino-pentándikarbonsav-dibenzil-észterből [ (2b) képletű vegyület] (2S),2-(3-karboxi-propionil-amino)-pentándikarbonsav-dibenzil-észtert [ (3b) képletű vegyület] állítottunk elő mennyiségi hozammal.

NMR spektrum adatai (CDC1₃) : 2,0-2,1 (m, 1H), 2,22,3 (m, 1H) , 2,3-2,5 (m, 4H) , 2,6-2,7 (m, 2H) , 4,65 (dd, 1H) ,

5,05 (s, 2H) , 5,15 (s, 2H) , 6,5 (d, 1H) , 7,3-7,4 (m, 10H) .

Tömegspektrum (ESI): 450 (MNa)⁺.

A (3b) képletű vegyületből 82 %-os hozammal állítottunk elő (4b) képletű vegyületet.

NMR spektrum adatai (CDC1₃) : 1, 95-2,05 (m, 1H) ,

2,2-2,3 (m, 1H) , 2,3-2,5 (m, 2H) , 2,6 (dt, 2H) , 2,8-3,0 (m,

2H) , 3,6 (dd, 4H) , 3,7 (dd, 4H) , 4,7 (dd, 1H) , 5,1 (s, 2H) ,

5,2 (s, 2H) , 6,3 (d, 1H) , 6,6 (d, 2H) , 6,95 (d, 2H) , 7,3-7,4 (m, 10H).

Tömegspektrum (ESI): 665-667 (MNa)⁺

20. példa

Mutáns és natív humán CPB-k Hipp-Asp és Hipp-Glu előgyógyszer-analógokat bontó hatásának vizsgálata

-169A tisztított humán PCB-mutánsok (D253K és D253R, lásd a 15-17. példát) és a 20. referencia-példában leírtak szerint előállított natív humán CPB hippuril-L-aszparaginsavat (Hipp-Asp, 10. referencia-példa), hippuril-L-glutaminsavat (Hipp-Glu, 9. referencia-példa) vagy hippuril-L-arginint (a Sigma Chemical Co. H6625 katalógusszámú terméke) hippursavvá alakító aktivitását nagynyomású folyadékkromatográfiás (HPLC) módszerrel vizsgáltuk.

250 μΐ térfogatú reakcióelegyeket készítettünk, amelyek 0,025 mólos Trisz-HCl pufferoldatban (pH 7,5) 4 μg na tív vagy mutáns humán CPB-t és 0,5 mmól Hipp-Asp-t vagy Hipp -Glu-t tartalmaztak. A mintákat 5 órán át 37°C-on inkubáltuk

Az elegyekhez 250 μΐ 0,2 % trifluor-ecetsavat tartalmazó

80:20 térfogatarányú metanol/desztillált víz elegyet adva le állítottuk a reakciót, és HPLC-val meghatároztuk a képződött hippursav mennyiségét.

A HPLC elemzést diódákkal sorbakapcsolt Hewlett

Packard 1090 Series 11 HPLC rendszeren végeztük. 25 cm hoszszúságú Hichrom Hi-RPB oszlopra 50 μΐ mintát vittünk fel, és szétválasztásra mobil fázisként 0,1 % trifluor-ecetsavat tar talmazó 40:60 térfogatarányú metanol/desztillált víz elegyet vezettünk át az oszlopon 1 ml/perc sebességgel. A képződött hippursav mennyiségét ismert mennyiségű hippursavat (a Sigma cég H6375 számú terméke) tartalmazó mintákkal felvett kalibrációs görbék segítségével határoztuk meg. Az eredményeket a alábbi táblázatban közöljük (a táblázatban megadott számadatok a 4 Hg enzimmel 5 órán át 37°C-on végzett reakcióban átalakult szubsztrátum %-át jelentik).

-170Mutáns és natív humán CPB-k szubsztrátum-átalakító aktivitása

Hippursavvá alakult hányad, % Hipp-Asp Hipp-Glu Hipp-Arg

Natív	CPB		0	0	100
D253K	mutáns	CPB	78	91	<2
D253R	mutáns	CPB	72	52	3

Az adatokból megállapítható, hogy ha a natív humán

CPB 253-as helyzetű aszparaginát-maradékát lizin- vagy arginin-maradékra cseréljük, megváltozik az enzim szubsztrátum-specifitása. A mutáns enzimek - a natív enzimmel ellentétben - képesek a Hipp-Asp-t és Hipp-Glu-t hippursavvá alakítani, a Hipp-Arg-t azonban nem. A legnagyobb aktivitást a D253K mutáns fejtette ki Hipp-Glu szubsztrátumon.

21. példa

Hipp-Asp és Hipp-Glu D253K HCPB-mutánssal végzett enzimes bontásának kinetikai vizsgálata

A 17. példa szerint előállított tisztított D253K HCPB K_m és k_cat értékét Hipp-Asp (10. referencia-példa) és Hipp-Glu (9. referencia-példa) szubsztrátumon határoztuk meg. A Hipp-Glu és Hipp-Asp szubsztrátumból 0,025 mólos Trisz-HCl pufferoldattal 0,25-8,0 mmól, illetve 0,25-5,0 mmól koncentrációjú oldatsorozatot készítettünk. Szükség esetén az oldatok pH-ját 1 N nátrium-hidroxid oldattal 7,5-re állítottuk.

500 μΐ térfogatú mintaoldathoz a reakció beindítására Hipp-Asp esetén 4 μg/ml, Hipp-Glu esetén pedig 0,5 pg/ml

D253K HPCB-t adtunk. A mintákat 5 órán át 37°C-on inkubáltuk.

Ezután 500 μΐ 0,2 % trifluor-ecetsavat tartalmazó 80:20 tér-171fogatarányú metanol/desztillált víz elegy hozzáadásával leállítottuk a reakciót, és a hippursav mennyiségét a 20. példában ismertetett HPLC módszerrel mértük.

A K_m és V_max értékeket ENZFITTER számítógépes program segítségével (Biosoft, Perkin Elmer) számítottuk ki. V_max értékét a reakcióelegyben lévő enzim koncentrációjával osztva (a HCPB molekulatömegét 34 kilodaltonnak tekintve) kiszámítottuk a k_cat értékeket. Az eredményeket az alábbi táblázatban közöljük.

Hipp-Asp és Hipp-Glu D253K HCPB-vel végzett bontásának kine-

tikai adatai
	Km, mmól kcat, s'1	kcat/Km, mmól 1 s’1
Hipp-Asp	2,7 0,26	0,1
Hipp-Glu	5,3 3,8	0,7
	Az adatok azt igazolják, hogy	ha a humán CPB 253-as

helyzetű aszparaginát-maradékát lizin-maradékra cseréljük, olyan enzimhez jutunk, amely a Hipp-Asp-t és a Hipp-Glu-t egyaránt megfelelő sebességgel képes hippursavvá alakítani. A Hipp-Glu szubsztrátumon mért k_cat/K_m hányados közel hétszerese a Hipp-Asp szubsztrátumon mért értéknek.

22. példa

Mutáns és natív HCPB-k glutaminsav-alapú előgyógyszert bontó hatásának vizsgálata

Vizsgáltuk, hogy a 17. példa szerint előállított tisztított D253K HCPB és a 20. referencia-példában ismertetett natív humán CPB képes-e enzimes úton glutaminsavat lehasítani a 18. példa szerint előállított glutaminsav-alapú e-172lőgyógyszerről. A hasítás során olyan intermedier (lásd a 13. referencia-példát) szabadul fel, amely nemenzimes úton spontán bomlik, hatásos fenolmustár-gyógyszer felszabadulása közben. A glutaminsav-alapú előgyógyszer intermedierré alakulását HPLC vizsgálattal mértük.

Az előgyógyszerből 0,025 mólos Trisz-HCl pufferoldattal (pH 7,5) 0,25-0,5 mmól koncentrációjú oldatsorozatot készítettünk. Szükség esetén az oldatok pH-ját 1 N vizes nátrium-hidroxid oldattal 7,5-re állítottuk. Az oldatok 250 μΐ térfogatú mintáit 2 percig 37°C-ra előmelegítettük, majd 0,25 mg/ml mutáns vagy natív HCPB hozzáadásával megindítottuk a reakciót. A mintákat 4 percig 37°C-on inkubáltuk. A reakciót

250 μΐ 98,8 % MeCN-t és 0,2 % trifluor-ecetsavat tartalmazó elegy beadagolásával leállítottuk, és a mintákat jégre helyeztük. A képződött intermedier mennyiségét HPLC-val határoztuk meg.

A HPLC elválasztást a 20. példában leírtak szerint végeztük, azzal a különbséggel, hogy az előgyógyszer (retenciós idő: 4,9 perc) és az intermedier (retenciós idő: 8,4 perc) szétválasztására mobil fázisként 0,1 % trifluor-ecetsavat tartalmazó 55:45 térfogatarányú MeCN/desztillált víz elegyet használtunk. A képződött intermedier mennyiségét ismert mennyiségű intermedierekkel felvett kalibrációs görbék segítségével határoztuk meg. Az 5,0 és 0,25 mmólos előgyógyszer-oldatból natív és mutáns (D253K) HCPB hatására képződött intermedier mennyiségét (ismételt vizsgálatok eredményei) az alábbi táblázatban közöljük.

• «

-173-

	előgyógyszer mennyisége
Előgyógyszer	koncent- Intermedier koncentrációja	, mmól
rációja, mmól	Natív HCPB	Mutáns	HCPB
5, 0	0, 0	0, 023	0,022
0,25	0, 0	0, 005	0,005

A mutáns enzim (D253K HCPB) előgyógyszet bontó reakciójának kinetikai állandóit (K_m, V_max és k_cat) a 21. példában említett ENZFITTER^(r| számítógépes program segítségével számítottuk ki a 0,25-5,0 mmólos szubsztrátum-oldatsorozaton mért adatokból. A következő értékeket kaptuk:

K,„ 1,25 mmól

V_max 1,17 x 10 ⁴ mmól ¹ s ¹ k_cat 0,016 s ¹

Az adatokból megállapítható, hogy ha a natív humán

CPB 253-as helyzetű aszparaginát-maradékát lizin-maradékra cseréljük, megváltozik az enzim szubsztrátum-specifitása, és a mutáns enzim - a natív enzimmel ellentétben - képes a glutaminsav-alapú előgyógyszert a megfelelő spontán bomló intermedierré alakítani. Minthogy az előgyógyszer citotoxicitása csekély (lásd a 23. példát), és az intermedier nemenzimes úton bomlik a tumorsejteket ölő (lásd a 23. példát) fenolmustár-gyógyszerré, az eredmények azt igazolják, hogy a CPB aktív helyet tartalmazó maradékainak mutációjával egy kevéssé citotoxikus előgyógyszert tumorsejtek elölésére alkalmas hatásos citotoxikus gyógyszerré alakítani képes mutáns humán enzim alakítható ki.

»*»·

-17423. példa

Glutaminsav-alapú előgyógyszer és fenolmustár-gyógyszer citotoxicitásának vizsgálata LoVo humán kolorektális tumorsejteken

A glutaminsav-alapú előgyógyszer és a megfelelő fenolmustár-gyógyszer tumorsejtekre kifejtett differenciális toxicitását a következőképpen vizsgáltuk:

mélyedéses mikrotitráló lemezek mélyedéseibe töltött LoVo kolorektális tumorsejteket (2500 sejt/mélyedés) 5xl0'⁴ mól és 5xl0~⁸ mól közötti végkoncentrációjú előgyógyszerrel vagy gyógyszerrel együtt 1 órán át 37°C-on inkubáltunk. Ezután a sejteket mostuk, és további 3 napon át 37°C-on inkubáltuk. Ezután a mélyedésekbe TCA-t juttattunk, majd az elpusztult sejteket kimostuk, és SRB festék hozzáadásával, P.

Skehan és munkatársai módszerével [ J. Natl. Cancer Inst. 82,

1107 (1990)] meghatároztuk a lemezekhez tapadt sejtfehérjék mennyiségét. A vegyületek hatásosságát a sejtnövekedést 50 %-bán gátló koncentráció (IC₅₀) alapján értékeltük.

A LoVo sejtek fenolmustár gyógyszerrel végzett kezelésekor 1 μιηόΐ körüli IC₅₀ értéket mértünk. Ezzel szemben az előgyógyszer lényegesen kevésbé volt citotoxikus, IC₅₀ értéke körülbelül 50 μπιόΐ volt (lásd a 22. ábrát) , A glutaminsav-alapú előgyógyszer tehát tumorsejtekkel szemben körülbelül 50-szer kevésbé citotoxikus, mint a mutáns HCPB-vel való hasítás révén képződő fenolmustár gyógyszer.

A glutaminsav-alapú előgyógyszert tartalmazó vizsgáló mélyedésekhez 100 μg, a 17. példa szerint előállított mutáns HCPB-t (D253K) adva az aktív gyógyszeréhez hasonló ··· ·

-175mértékű citotoxicitást észleltünk, ami azt jelzi, hogy a mutáns enzim hatására az előgyógyszer valóban a hatásosabb gyógyszerré alakul. Ezzel szemben a mélyedésekhez 100 μg natív humán CPB-t adva a glutaminsav-alapú előgyógyszer cito toxicitása nem növekedett számottevő mértékben. Ezek az ered mények azt igazolják, hogy a mutáns humán CPB enzim (D253K) szeketíven képes a viszonylag inaktív előgyógyszert tumorsej tek elölésére alkalmas, nagyhatású citotoxikus gyógyszerré a lakítani.

24. példa

Humanizált A5B7 F(ab')₂~D253K HCPB fúziós fehérje előállítása

Megismételtük a 21. referencia-példában leírt eljá rást, azzal a különbséggel, hogy a murin A5B7 könnyű lánc és Fd szekvenciák helyett humanizált A5B7-et képező szekvenciákat, HCPB szekvencia helyett pedig D253K szekvenciát használ tünk. A fúziós fehérjét a 21. referencia-példában leírtak szerint, a HCPB prepro szekvenciával végzett ko-transzfektálás útján fejeztük ki COS sejtekben. A fúziós fehérje nagyléptékű kifejezésére 750-750 μg plazmád vektort átmenetileg COS-7 sejtekbe (11) építettünk be, lényegében a 21. referencia-példában leírt módon. A termék tisztítása során a fúziós fehérjét tartalmazó felülúszót immobilizált A fehérjén bocsátottuk át, majd a megkötött fúziós fehérjét nagy pH-jú pufferoldattal leoldottuk, vagy a fúziós fehérjét tartalmazó felülúszót a rekombináns karboxipeptidáz enzim tisztításánál leírtak szerint immobilizált karboxipeptidáz-inhibítoron bocsátottuk át, majd a megkötött anyagot a 12. példában az enzim leoldására felhasználttal azonos, nagy pH-jú pufferoldat• · * ·

-17 6tal leoldottuk. Mindkét módszer esetén a kapott fúziós fehér jét gélpermeációs kromatografálással, ioncserés kromatografá lássál, hidrofób interakciós kromatografálással vagy ezek kombinálásával tovább tisztíthatjuk.

A 21. referencia-példában leírt eljárást tehát úgy ismételtük meg, hogy a murin Fd és könnyű lánc-szekvenciák (25. és 26. szekvencia) helyett a szekvencia-jegyzékben 28. és 29. számon szereplő humanizált szekvenciákat használtuk,

21. referencia-példában használt HCPB szekvenciát a 15. példában ismertetett, de (His)₆-c-myc toldalékot nem hordozó D253K szekvenciával helyettesítettük, és a PCR reakcióban templátként pICI1698 helyett a 15. példában ismertetett pICI1713-at használtuk.

A szekvencia-jegyzékben 28. és 29. számon szereplő humanizált szekvenciák előállítására például a következő mód szereket alkalmazhatjuk: Edwards: Am. Biotech. Láb. 5_, 38-44 (1987); Jayaraman és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA

88, 4084-4088 (1991); Fogúét és Lubbert: Biotechniques 13,

674-675 (1992); és Pierce: Biotechniques 16, 708 (1994) .

. példa

D253K HCPB előállítása rázott lombikban végzett fermentálással

MSD 213 E. coli törzset pICI1713 plazmiddal (lásd , 15. példát) transzformáltunk, és a kapott MSD 213 pZen 1713 törzset glicerines közegben -80°C-on tároltuk. Az MSD 213 pZen 1713 törzs alikvot részét L-tetraciklint tartalmazó agarlemezeken szélesztettük, és különálló egyedi telepek képzése céljából éjszakán át 37°C-on tenyésztettük. A tenyészet• 0 »·

-177•» « « • ·· • · « • · · · · bői egyetlen MSD 213 pZen 1713 telepet emeltünk ki, és ezzel egy 250 ml-es Erlenmeyer lombikba töltött 75 ml L-tetraciklines táptalajt oltottunk be. A lombikot oda-vissza mozgó rázógépen 16 órán át 37°C-on rázattuk, majd a lombik tartalmával kilenc 2 literes Erlenmeyer lombikba töltött 600 ml L-tetraciklin-tartalmú táptalajt oltottunk be úgy, hogy a kapott elegy 550 nm-en meghatározott optikai sűrűsége (OD₅₅₀) 0, 1 legyen. Ezután a lombikokat az oda-vissza mozgó rázógépen 20°C-on rázattuk mindaddig, amíg a tenyészet optikai sűrűsége el nem érte az OD₅₅₀ = 0,5 értéket. Ekkor a heterológ fehérje termelésének megindítására a tenyészetekhez 0,01 tömeg/térfogat % végkoncentráció eléréséhez szükséges mennyiségű L-arabinózt adtunk, és az inkubálást a fenti körülmények között 20 °C-on még 42 órán át folytattuk. A kimerült táptalajt Sorvall RC-3B typusú centrifugán végzett centrifugálással (7000 g, 3 perc, 4°C) elválasztottuk a baktériumsejtektől, és a sejtpépet -70°C-on tároltuk.

26. példa

ADEP-terápia alkalmazása autológ csontvelő-átültetésben

Az autológ csontvelő-átültetés során a beteg saját csontvelejének egy részét eltávolítják a szervezetből, majd a beteget intenzív radiokemoterápiás kezelésnek vetik alá, és a kezelés befejezése után a szervezetbe visszajuttatják az eltávolított csontvelőt. Egyes ráktípusok (például leukémiák,

B- és T-sejtvonal-limfómák, továbbá mellkas-, tüdő- és vastagbélrák) esetén a csontvelőbe rosszindulatú sejtek hatolnak be, amiket a túlélés esélyeinek növelése érdekében a csontvelő visszaültetése előtt el kell távolítani. Jelenleg az autó-178lóg csontvelőbe jutott tumorsejtek eltávolítására antitest-toxin konjugátumokat használnak [ Blakey D.C. és munkatársai: Prog. Allergy £5, 50 (1988)] .

A fenti célra különösen akkor alkalmas az ADEP-terápia, ha gyógyszer-komponensként rövid élettartamú reaktív mustár alkilezőszert használnak. A művelet a következőképpen hajtható végre: A tumorsejteket tartalmazó autológ csontvelőt a megfelelő antitest-enzim konjugátummal inkubáljuk. Miután a konjugátum szelektíven a tumorsejtekhez kötődött, a konjugátum maradékát kimossuk. Ezután beadagoljuk az előgyógyszert, amiből az antigén-pozitív tumorsejtek környezetében gyógyszer képződik, és ez szelektíven elöli a tumorsejteket. A normál csontvelő-sejteket a csontvelő hígításának optimalizálása révén védhetjük; ekkor a tumorsejteken képződő gyógyszer kialakulásának helye és a normál csontvelő-sejtek között kellő távolságot teremtünk ahhoz, hogy a gyógyszer még a csontvelő-sejtek elérése előtt kémiai bomlás révén inaktiválódjon. A normál csontvelő károsodásának visszaszorítására az elegyhez a reaktív mustár-gyógyszerre nukleofil reagensként ható fehérjét is adhatunk.

27. példa

Mutáns glükuronidáz felhasználása fordított polaritású ADEP-terápia céljára '

A humán glükuronidáz szintén olyan enzim, amiből a fordított polaritás elve alapján előgyógyszert hatásos gyógyszer felszabadítása közben hasítani képes, specifikus humán enzim képezhető. Bosslet és munkatársai már ismertettek egy natív humán glükuronidázzal hasítható adriamicin-glükuronid előgyógyszert [Cancer Rés. 54, 2151 (1994)], és egy sor ··· !

•-»1

-179alternatív előgyógyszer szintézisét is leírták, amelyekből hatásos gyógyszerek szabadíthatok fel (AU-50225/93 sz. osztrák szabadalmi bejelentés). Antitest-glükuronidáz konjugátum távollétében a vérben és a szövetekben lévő endogén natív glükuronidáz hatásos gyógyszerekké alakíthatja át ezeket az előgyógyszereket, ami csökkenti a megoldás specifikusságát. Cheng és Touster közleménye szerint [ J.B.C. 247, 2650 (1972)] a glükuronidáz aktív helye pozitív töltésű aminosavat tartalmaz, ami a 34. ábrán lévő (A) képleten bemutatott módon reagál a glükuronid-gyűrűn lévő negatív töltésű karboxil-csoporttal. A kapcsoló vagy a glükuronid-molekularész és a citotoxikus anyag közötti közvetlen kötés vagy pedig egy utóbb önmagától leváló kapcsolótag lehet; az utóbbira Bosslet és munkatársai fent idézett közleményei adnak példákat. Ha a glükuronid-gyűrűn lévő negatív töltésű karboxilcsoportot pozitív töltésű R csoportra cseréljük - ahol R például L-CH₂-NH₂ vagy L-CH₂-NHR' csoport lehet, amelyekben R' 1-4 szénatomos alkilcsoportot, L pedig (CH₂) ₀_₃ csoportot vagy más alkalmas kapcsoló tagot jelenthet -, olyan pozitív töltésű előgyógyszer alakul ki, ami a natív glükuronidáznak már nem szubsztrátuma. Ha a glükuronidáz aktív helyében lévő pozitív töltésű maradékot negatív töltésű aminosav maradékára (például glutamát- vagy aszparaginát-maradékra) cseréljük, az így kialakult mutáns glükuronidáz a 34. ábrán lévő (B) képleten bemutatott módon lép kapcsolatba a pozitív töltésű előgyógyszerrel, és azt - a példákban felsorolt RN-ázok-hoz és CPBkhez hasonlóan - szelektíven alakítja át a megfelelő gyógyszerré. A fordított polaritás elve tehát a humán glükuroni-180dáz/pozitív töltésű glükuronid alapú előgyógyszer-párokra is kiterjeszthető.

-181SZEKVENCIA-JEGYZÉK

1. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 30 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

GGTCTGCCCA TTCTCGCAGG CAACATTTTT

2. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 30 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

TGCTACCAGA GCTACTCCAC CATGAGCATC

3. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 30 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

AATGTTGCCT GCGAGAATGG GCAGACCAAT

4. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 29 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

CTGGGAGCAC ACGGCCTGGA CATCAGCCA

5. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 31 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris

-182(xi) A szekvencia leírása:

CGCGCGAATT CGGGTCCAGC CTTCCCCTGGG C

6. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 31 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

GGCCCGGAATT CCATCAAAGT GGACTGGCAC A

7. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 45 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

CGCTGTTGGT CCTGGTGCTG CTGCTGGTGC GGGTCCAGCC TTCCC

8. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 45 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

TGATGGCTCT GAAGTCCCTG GTCCTGTTGT CGCTGTTGGT CCTGG

9. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 46 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

GCGCGAATTC ATGTTCTTGG AGGATGATTG ATGGCTCTGA AGTCCC

10. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 48 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú

-183(D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

CGCGGAATTC CTAGGTAGAG TCTTCAACAG AAGCATCAAA GTGGACTG

11. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 33 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

AAGGAATCCG CTGCCGCTAA ATTCCAGCGG CAG

12. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 30 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

GGAAGGCTGG ACCCGCACCA GCAGCAGCAC

13. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 33 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

CTGGAATTTA GCGGCAGCGG ATTCCTTGCC CAG

14. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 30 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

CATATGGACT CAGACAGTTC CCCCAGCAGC

15. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 39 bázis • · ··

-184(B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

GTGTGAATTC CCATGGCGAA GGAATCCGCT GCCGCTAAA

16. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 34 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

GTGTGAATTC CTAGGTAGAG TCTTCAACAG AAGC

17. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 50 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

ATATAAAGCT TGCCGCCACC ATGAAGTTGT GGCTGAACTG GATTTTCCTT

18. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 48 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

ATCGAATTCG CCGCCACCAT GGATTTTCAA GTGCAGATTT TCAGCTTC

19. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 45 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

TGAGAATTCT TACTATGTAC ATATGCAAGG CTTACAACCA CAATC

20. szekvencia:

-185(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 35 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

GCGCCGAATT CTTATTAACA CTCATTCCTG TTGAA

21. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 30 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

GACCTGGAAC TCTGGATCTC TGTCCAGCGG

22. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 30 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

AGGTGTGCAC ACCGCTGGAC AGAGATCCAG

23. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 30 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

TGGTACCAGC AGAAGCCAGG TTCCTCCCCC

24. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 30 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

GGATTTGGGG GAGGAACCTG GCTTCTGCTG

-18625. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 777 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

AAG

CTT

GCC

GCC

ACC

ATG AAG

TTG Leu

TGG Trp

CTG Leu 5

AAC Asn

TGG Trp

ATT He

TTC Phe

CTT Leu 10

GTA Val

48

Met

Lys

ACA

CTT

TTA

AAT

GGT

ATC

CAG

TGT

GAG

GTG

AAG

CTG

GTG

GAG

TCT

GGA

96

Thr

Leu

Leu

Asn

Gly

He

Gin

Cys

Glu

Val

Lys

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

15

20

25

GGA

GGC

TTG

GTA

CAG

CCT

GGG

GGT

TCT

CTG

AGA

CTC

TCC

TGT

GCA

ACT

144

Gly

Gly

Leu

Val

Gin

Pro

Gly

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Alá

Thr

30

35

40

TCT

GGG

TTC

ACC

TTC

ACT

GAT

TAC

TAC

ATG

AAC

TGG

GTC

CGC

CAG

CCT

192

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Thr

Asp

Tyr

Tyr

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gin

Pro

45

50

55

CCA

GGA

AAG

GCA

CTT

GAG

TGG

TTG

GGT

TTT

ATT

GGA

kkC

AAA

GCT

AAT

240

Pro

Gly

Lys

Alá

Leu

Glu

Trp

Leu

Gly

Phe

He

Gly

Asn

Lys

Alá

Asn

60

65

70

75

GGT

TAC

ACA

ACA

GAG

TAC

AGT

GCA

TCT

GTG

AAG

GGT

CGG

TTC

ACC

ATC

288

Gly

Tyr

Thr

Thr

Glu

Tyr

Ser

Alá

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

He

80

85

90

TCC

AGA

GAC

AAA

TCC

CAA

AGC

ATC

CTC

TAT

CTT

CAA

ATG

AAC

ACC

CTG

336

Ser

Arg

Asp

Lys

Ser

Gin

Ser

He

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Thr

Leu

95

100

105

AGA

GCT

GAG

GAC

AGT

GCC

ACT

TAT

TAC

TGT

ACA

AGA

GAT

AGG

GGG

CTA

384

Arg

Alá

Glu

Asp

Ser

Alá

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Thr

Arg

Asp

Arg

Gly

Leu

110

115

120

CGG

TTC

TAC

TTT

GAC

TAC

TGG

GGC

CAA

GGC

ACC

ACT

CTC

ACA

GTC

TCC

432

Arg

Phe

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Leu

Thr

Val

Ser

125

130

135

TCA

GCC

AAA

ACG

ACA

ccc

CCA

TCT

GTC

TAT

CCA

CTG

GCC

CCT

GGA

TCT

480

Ser

Alá

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Ser

Val

Tyr

Pro

Leu

Alá

Pro

Gly

Ser

140

145

150

155

GCT

GCC

CAA

ACT

AAC

TCC

ATG

GTG

ACC

CTG

GGA

TGC

CTG

GTC

AAG

GGC

528

Alá

Alá

Gin

Thr

Asn

Ser

Met

Val

Thr

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

160

165

170

TAT

TTC

CCT

GAG

CCA

GTG

ACA

GTG

ACC

TGG

AAC

TCT

GGA

TCT

CTG

TCC

576

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Thr

Trp

Asn

Ser

Gly

Ser

Leu

Ser

175

180

185

« ·

-187-

AGC Ser

GGT Gly

GTG Val 190

CAC His

ACC Thr

TTC Phe

CCA Pro

GCT Alá 195

GTC Val

CTG Leu

CAG Gin

TCT Ser

GAC Asp 200

CTC Leu

TAC Tyr

ACT Thr

624

CTG

AGC

AGC

TCA

GTG

ACT

GTC

CCC

TCC

AGC

ACC

TGG

CCC

AGC

GAG

ACC

672

Leu

Ser

Ser

Ser

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Thr

Trp

Pro

Ser

Glu

Thr

205

210

215

GTC

ACC

TGC

ZVAC

GTT

GCC

CAC

CCG

GCC

AGC

AGC

ACC

ZVAG

GTG

GAC

ZVAG

720

Val

Thr

Cys

Asn

Val

Alá

His

Pro

Alá

Ser

Ser

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

220

225

230

235

AZVA

ATT

GTG

CCC

AGG

GAT

TGT

GGT

TGT

ZVAG

CCT

TGC

ATA

TGT

ACA

TAG

768

Lys

He

Val

Pro

Arg

Asp

Cys

Gly

Cys

Lys

Pro

Cys

He

Cys

Thr

Vég

240

245

250

TAA GAA TTC 777

Vég

26. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 732 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

GZVA

TTC

GCC

GCC

ACC

ATG Met 1

GAT Asp

TTT Phe

CZVA Gin

GTG Val 5

CAG Gin

ATT He

TTC Phe

AGC Ser

TTC Phe 10

CTG Leu

48

CTA

ATC

AGT

GCT

TCA

GTC

ATA

ATG

TCC

AGA

GGA

CZVA

ACT

GTT

CTC

TCC

96

Leu

He

Ser

Alá

Ser

Val

He

Met

Ser

Arg

Gly

Gin

Thr

Val

Leu

Ser

15

20

25

CAG

TCT

CCA

GCA

ATC

CTG

TCT

GCA

TCT

CCA

GGG

GAG

ZVAG

GTC

ACA

ATG

144

Gin

Ser

Pro

Alá

He

Leu

Ser

Alá

Ser

Pro

Gly

Glu

Lys

Val

Thr

Met

30

35

40

ACT

TGC

AGG

GCC

AGC

TCA

AGT

GTA

ACT

TAC

ATT

CAC

TGG

TAC

CAG

CAG

192

Thr

Cys

Arg

Alá

Ser

Ser

Ser

Val

Thr

Tyr

He

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

45

50

55

ZVAG

CCA

GGT

TCC

TCC

CCC

ZVZVA

TCC

TGG

ATT

TAT

GCC

ACA

TCC

ZVAC

CTG

240

Lys

Pro

Gly

Ser

Ser

Pro

Lys

Ser

Trp

He

Tyr

Alá

Thr

Ser

Asn

Leu

60

65

70

75

GCT

TCT

GGA

GTC

CCT

GCT

CGC

TTC

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACC

TCT

288

Alá

Ser

Gly

Val

Pro

Alá

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

80

85

90

TAC

TCT

CTC

ACA

ATC

AGC

AGA

GTG

GAG

GCT

GZVA

GAT

GCT

GCC

ACT

TAT

336

Tyr

Ser

Leu

Thr

He

Ser

Arg

Val

Glu

Alá

Glu

Asp

Alá

Alá

Thr

Tyr

95

100

105

-188-

TAC Tyr

TGC Cys

CAA CAT Gin His 110

TGG Trp

AGT AGT AAA CCA

CCG Pro

ACG Thr

TTC Phe

GGT Gly 120

GGA Gly

GGC Gly

ACC Thr

384

Ser

Ser

Lys 115

Pro

AAG

CTG

GAA

ATC

AAA

CGG

GCT

GAT

GCT

GCA

CCA

ACT

GTA

TCC

ATC

TTC

432

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Alá

Asp

Alá

Alá

Pro

Thr

Val

Ser

Ile

Phe

125

130

135

CCA

CCA

TCC

AGT

GAG

CAG

TTA

ACA

TCT

GGA

GGT

GGC

TCA

GTC

GTC

TGC

480

Pro

Pro

Ser

Ser

Glu

Gin

Leu

Thr

Ser

Gly

Gly

Alá

Ser

Val

Val

Cys

140

145

150

155

TTC

TTG

AAC

AAC

TTC

TAC

CCC

AAA

GAC

ATC

AAT

GTC

AAG

TGG

AAG

ATT

528

Phe

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Lys

Asp

Ile

Asn

Val

Lys

Trp

Lys

Ile

160

165

170

GAT

GGC

AGT

GAA

CGA

CAA

AAT

GGC

GTC

CTG

AAC

AGT

TGG

ACT

GAT

CAG

576

Asp

Gly

Ser

Glu

Arg

Gin

Asn

Gly

Val

Leu

Asn

Ser

Trp

Thr

Asp

Gin

175

180

185

GAC

AGC

AAA

GAC

AGC

ACC

TAC

AGC

ATG

AGC

AGC

ACC

CTC

ACG

TTG

ACC

624

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Met

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

190

195

200

AAG

GAC

GAG

TAT

GAA

CGA

CAT

AAC

AGC

TAT

ACC

TGT

GAG

GCC

ACT

CAC

672

Lys

Asp

Glu

Tyr

Glu

Arg

His

Asn

Ser

Tyr

Thr

Cys

Glu

Alá

Thr

His

205

210

215

AAG

ACA

TCA

ACT

TCA

CCC

ATT

GTC

AAG

AGC

TTC

AAC

AGG

AAT

GAG

TGT

720

Lys

Thr

Ser

Thr

Ser

Pro

Ile

Val

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Asn

Glu

Cys

220

225

230

235

ΤΑΑ ΤΑΑ GAA TTC 732

Vég Vég

27. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 30 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC

28. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 777 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

• ·

-18 9-

AAG

CTT

GCC

GCC

ACC

ATG Met 1

AAG Lys

TTG Leu

TGG Trp

CTG Leu 5

AAC Asn

TGG Trp

ATT He

TTC Phe

CTT Leu 10

GTA Val

48

ACA

CTT

TTA

AAT

GGT

ATC

CAG

TGT

GAG

GTG

CAG

CTG

CTG

GAG

TCT

GGA

96

Thr

Leu

Leu

Asn 15

Gly

He

Gin

Cys

Glu 20

Val

Gin

Leu

Leu

Glu 25

Ser

Gly

GGA

GGA

CTG

GTG

CAG

CCT

GGA

GGA

TCT

CTG

AGA

CTG

TCT

TGT

GCA

ACA

144

Gly

Gly

Leu 30

Val

Gin

Pro

Gly

Gly 35

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser 40

Cys

Alá

Thr

TCT

GGA

TTC

ACC

TTC

ACA

GAC

TAC

TAC

ATG

AAT

TGG

GTG

AGA

CAG

GCA

192

Ser

Gly 45

Phe

Thr

Phe

Thr

Asp 50

Tyr

Tyr

Met

Asn

Trp 55

Val

Arg

Gin

Alá

CCT

GGA

AAG

GGA

CTC

GAG

TGG

CTG

GGC

TTC

ATC

GGA

AAT

AAG

GCA

AAT

240

Pro 60

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu 65

Trp

Leu

Gly

Phe

He 70

Gly

Asn

Lys

Alá

Asn 75

GGA

TAC

ACA

ACA

GAG

TAC

TCT

GCA

TCT

GTG

AAG

GGA

AGA

TTC

ACA

ATT

288

Gly

Tyr

Thr

Thr

Glu 80

Tyr

Ser

Alá

Ser

Val 85

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr 90

He

TCC

AGA

GAC

AAG

AGC

AAG

TCC

ACA

CTG

TAC

CTG

CAG

ATG

AAT

ACA

CTG

336

Ser

Arg

Asp

Lys 95

Ser

Lys

Ser

Thr

Leu 100

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn 105

Thr

Leu

CAG

GCA

GAG

GAC

TCT

GCA

ATT

TAC

TAC

TGT

ACA

AGA

GAC

AGA

GGA

CTG

384

Gin

Alá

Glu 110

Asp

Ser

Alá

He

Tyr 115

Tyr

Cys

Thr

Arg

Asp 120

Arg

Gly

Leu

AGA

TTC

TAC

TTC

GAC

TAC

TGG

GGA

CAG

GGA

ACA

CTG

GTG

ACA

GTG

TCT

432

Arg

Phe 125

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp 130

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu 135

Val

Thr

Val

Ser

TCT

GCT

AGC

ACC

AAG

GGA

CCA

TCG

GTC

TTC

CCC

CTG

GCC

CCC

TGC

TCC

480

Ser 140

Alá

Ser

Thr

Lys

Gly 145

Pro

Ser

Val

Phe

Pro 150

Leu

Alá

Pro

Cys

Ser 155

AGG

AGC

ACC

TCC

GAG

AGC

ACA

GCC

GCC

CTG

GGC

TGC

CTG

GTC

AAG

GAC

528

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu 160

Ser

Thr

Alá

Alá

Leu 165

Gly

Cys

Leu

Val

Lys 170

Asp

TAC

TTC

CCC

GAA

CCG

GTG

ACG

GTG

TCG

TGG

AAC

TCA

GGC

GCT

CTG

ACC

576

Tyr

Phe

Pro

Glu 175

Pro

Val

Thr

Val

Ser 180

Trp

Asn

Ser

Gly

Alá 185

Leu

Thr

AGC

GGC

GTG

CAC

ACC

TTC

CCG

GCT

GTC

CTA

CAG

TCC

TCA

GGA

CTC

TAC

624

Ser

Gly

Val 190

His

Thr

Phe

Pro

Alá 195

Val

Leu

Gn Ser Ser Gly Leu Tyr 200

TCC

CTC

AGC

AGC

GTC

GTG

ACG

GTG

CCC

TCC

AGC

AAC

TTC

GGC

ACC

CAG

672

Ser

Leu 205

Ser

Ser

Val

Val

Thr 210

Val

Pro

Ser

Ser

Asn 215

Phe

Gly

Thr

Gin

-190-

ACC Thr 220

TAC Tyr

ACC TGC

AAC Asn

GTA Val 225

GAT Asp

CAC His

AAG Lys

CCC Pro

AGC AAC Ser Asn 230

ACC Thr

AAG Lys

GTG Val

GAC Asp 235

720

Thr

Cys

AAG

ACA

GTT

GAG

CGC

AAA

TGT

TGT

GTC

GAG

TGC

CCA

CCG

TGC

CCG

TAA

768

Lys

Thr

Val

Glu

Arg

Lys

Cyc

Cys

Val

Glu

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Vég

240

245

250

TAG

GAA

TTC

777

Vég

29.

szekvencia:

(i)

A szekvencia jellemzői:

(A)

hossz:

732

bázispár

(B)

típus:

nukleinsav

(C)

száltípus:

egyszálú

(D)

topológia:

lineáris

(xi)

A szekvencia leírása:

GAA

TTC

GCC

GCC

ACC

ATG

GAT

TTT

CAA

TGT

CAG

ATT

TTC

AGC

TTC

CTG

48

Met

Asp

Phe

Gin

Val

Gin

Ile

Phe

Ser

Phe

Leu

1

5

10

CTA

ATC

AGT

GCT

TCA

GTC

ATA

ATG

TCC

AGA

GGA

CAG

ACT

GTA

CTC

ACT

96

Leu

Ile

Ser

Ala

Ser

Val

Ile

Met

Ser

Arg

Gly

Gin

Thr

Val

Leu

Thr

15

20

25

CAG

AGT

CCA

AGT

AGT

CTC

AGT

GTA

AGT

GTA

GGT

GAT

AGG

GTA

ACT

ATG

144

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Val

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Met

30

35

40

ACT

TGT

AGG

GCC

AGT

AGT

AGT

GTA

ACT

TAT

ATC

CAT

TGG

TAT

CAG

CAG

192

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Thr

Tyr

Ile

H is Trp Tyr Gin Gin

45

50

55

AAA

CCA

GGT

CTC

GCC

CCA

AAA

AGT

TGG

ATC

TAT

GCC

ACT

AGT

AAC

CTC

240

Lys

Pro

Gly

Leu

Ala

Pro

Lys

Ser

Trp

Ile

Tyr

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

60

65

70

75

GCC

AGT

GGT

GTA

CCA

TCT

AGA

TTC

AGT

GGT

AGC

GGT

AGT

GGT

ACT

GAT

288

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

80

85

90

TAT

ACT

CTC

ACT

ATC

AGT

AGT

CTC

CAG

CCA

GAA

GAT

ATC

GCC

ACT

TAC

336

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

95

100

105

TAT

TGC

CAG

CAT

TGG

AGT

AGT

AAA

CCA

CCA

ACT

TTC

GGT

CAG

GGT

ACT

384

Tyr

Cys

Gin

His

Trp

Ser

Ser

Lys

Pro

Pro

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

110

115

120

AAA

GTA

GAA

GTA

AAA

CGT

ACT

GTG

GCT

GCA

CCA

TCT

GTC

TTC

ATC

TTC

432

Lys

Val

Glu

Val

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

125

130

135

• « ·· • ·

-191-

CCG Pro 140

CCA Pro

TCT Ser

GAT Asp

GAT Glu

CAG TTG AAA

TCT Ser

GGA ACT Gly Thr 150

GCC Alá

TCT Ser

GTT Val

GTG Val

TGC Cys 155

480

Gin 145

Leu

Lys

CTG

CTG

AAT

AAC

TTC

TAT

CCC

AGA

GAG

GCC

AAA

GTA

CAG

TGG

AAG

GTG

528

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Alá

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

160

165

170

GAT

AAC

GCC

CTC

CAA

TCG

GGT

AAC

TCC

CAG

GAG

AGT

GTC

ACA

GAG

CAG

576

Asp

Asn

Alá

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

175

180

185

GAC

AGC

AAG

GAC

AGC

ACC

TAC

AGC

CTC

AGC

AGC

ACC

CTG

ACG

CTG

AGC

624

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

190

195

200

AAA

GCA

GAC

TAC

GAG

AAA

CAC

AAA

GTC

TAC

GCC

TGC

GAA

GTC

ACC

CAT

672

Lys

Alá

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Alá

Cys

Glu

Val

Thr

His

205

210

215

CAG

GGC

CTG

AGT

TCG

CCC

GTC

ACA

AAG

AGC

TTC

AAC

AGG

GGA GAG TGT

720

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

220

225

230

235

TAA TAG GAA TTC 732

Vég Vég

30. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 30 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

AAGGTCACCT GCGAAAACGG GCAGGGCAAC

31. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 25 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: 'lineáris (xi) A szekvencia leírása:

CTGGAAACAG ACATTCTGGA CATCT

32. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 30 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris

-192(xi) A szekvencia leírása:

GCCCTGCCCG TTTTCGCAGG TGACCTTTTC

33. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 26 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

TGCTACAAGA GCAACTCCAG CATGCA

34. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 41 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

CTCTAGGAAT TCTTATTAGT ACAGGTGTTC CAGGACGTAG C

35. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 108 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

CCCAAGCTTG CCGCCACCAT GTTGGCAGTC TTGGTTCTGG TGACTGTGGC CCTGGCATCT GCTGCAACAG GACACAGTTA TGAGAAGTAC AACAAGTGGG AAACGATA

36. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:’ (A) hossz: 16 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

AACAGCTATG ACCATG

37. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 17 bázis • · * »»

-193(B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

GTAAAACGAC GGCCAGT

38. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 30 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC

39. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 23 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

CAGACTCTGC AGCAGGTCCA CAG

40. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 54 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

CCCAAGCTTG CCGCCACCAT GTTGGCACTC TTGGTTCTGG TGACTGTGGC CCTG

41. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 39 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

CTCATAACTG AATTCTTATT AACGAACCCG GCTATCAAA ·*♦ *

-1944 2. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 34 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

GGATCTGCTG CCCAAGCTTA CTCCATGGTG ACCC

43. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 80 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

CTTCTCATAA CTGTGTCCTG TTGCGAACAC GCTGCTCACC TCGGGCACTG TACATATGCA AGGCTTACAA CCACAATCCC

44. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 78 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

GGTTGTAAGC CTTGCATATG TACAGTGCCC GAGGTGAGCA GCGTGTTCGC AACAGGACAC AGTTATGAGA AGTACAAC

45. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 27 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris' (xi) A szekvencia leírása:

CCGTTTGATC TCGAGCTTGG TGCCTCC

46. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 20 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris ««· · • ·

-195(xi) A szekvencia leírása:

GTTGGAGCTG TTGGTTCTGG

47. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 22 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

CAAGGCCCTCG AGCTTTTCTCA AC

48. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 21 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

GTTTGATTCT AGAGTTCGTG C

49. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 22 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

TTGTAAAACG ACGGCCAGTG AG

50. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 24 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

GAAACAGCTA TGACCATGAT TACG

51. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 23 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú

-196» ··« * •· · (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

CAGACTCTGC AGCAGGTCCA CAG

52. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 19 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

GGACCTGCTG CAGAGTCTG

53. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 21 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

GCCTGTGCTC AATATTGATG G

54. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 23 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

CCGTGTTAAA GCAGAAGATA CTG

55. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 23 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

GCTACTGTGA AAGAACTTGC CTC

56. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 1263 bázis ··♦?

» · «·

-197(B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

GAGCTCTTGG

GAAGGCGAGA

GAGTTGGCCA

CCTCACAGTA

CTAAAGCAGA

GCTCAGTTTG

GAAACGATAG

AGTGTTATCG

GGACAAAATA

CCTGCATTCT

GTGACAGAGC

TACATCTACA

TCTAGCTGCA

GCCTCTCGAA

ACCAAGGCCC

ATCCACTCGT

AACAATGCTG

GGCACCAAGT

GACGACTGGG

GGCAGATATG

CTGGCAATCA

GAG

TTCTGGTGAC

AGGTGTTCCG

GCACGACCCA

CAGTTGACTT

ATGAACTACA

ATAGCCGGGT

AGGCTTGGAC

GAACCACATT

AGCCTGCCAT

GCCAGTGGTT

TTCTCGACAA

CCTGGACCAA

TTGGCACAGA

ACCCCTGTGA

TGGCTGATTT

ACTCCCAAAT

AGTTGAATGC

ACACATATGG

CTTATGACCA

GCTTTCTCCT

AGTATGTTGC

TGTGGCCCTG

TGTTAACGTT

GATTGACTTC

CCGTGTTAAA

ATACAAGGTA

TCGTGCAACA

TCAACAAGTC

TGAGGGACGC

TTTCATGGAC

TGTAAGAGAG

GTTAGACTTT

GAGCCGATTT

CCCCAACAGA

TGAAACTTAC

CATCCGCAAC

GATGATCTAC

CCTGGCTAAA

CCCGGGAGCT

AGGAATCAGA

TCCAGAATCC

CAGCTACGTC

GCATCTGCTC

GAAGATGAAA

TGGAAGCCAG

GCAGAAGATA

CTGATAAGCA

GGACACAGTT

GCCACTGAGA

GCTATTTACC

TGTGGTTTCC

GCTGTTCGTA

TATGTCCTGC

TGGAGAAAGA aattttgatg

TGTGGACCTG

AAACTCTCTT

CCTTACTCAT

GCTACTGTGA

ACAACAATCT

TATTCCTTCA

CAGATCCGGG

CTGGAACACC

ATCATGGTGG

ATCACATTAA

ATTCTGTCAC

CTGTCACTGT

ACCTGAGAAA

ATGAGAAGTA

ATCCAGCCCT

TCCTGAAGGT

ATGCCAGAGA

CCTATGGACG

CTGTGCTCAA

CTCGCTCCAC

CTGGTTGGTG

CCGCAGAGTC

CCATCAAGGC

ATGCTTACAA

AAGAACTTGC

ATCCTGCTGC

CCTTTGAACT

CTACCTGCGA

TGTACTAGTT

TGAGCACTTT

CATAATCCGC

ACAAATCAAA

GGAGAATGTT

TGTGGTGGAG

CAACAAGTGG

CATCTCTCGC

TGGCAAAGCT

GTGGATTTCT

TGAGATCCAA

TATTGATGGC

CCATACTGGA

TGAAATTGGA

TGAAAAGGAG

ATATCTGACA

ACTCGGTGAG

CTCACTGCAC

TGGGGGCTCT

TCGAGATACA

GGAGACCTTC

GAGAAAGCTC

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1263

57. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 415 aminosav (B) típus: aminosav (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása:

Glu Leu Leu Val Leu Val Thr Val Alá Leu Alá Ser Alá His His Gly -105 -100 -95

Gly Glu His -90

Phe

Glu Gly Glu

Lys Val -85

Phe Arg Val Asn -8 0

Val

Glu Asp

Glu Asn His -75

Asp Phe Trp -60

Ile Asn Ile

Lys Pro Asp -55

Ile Arg Glu Leu Alá Ser -70 -65

Ser Val Thr Gin Ile Lys -50

Thr

Pro

Thr Gin

His Ser

Ile

Thr

Val Asp

Phe Arg Val -4 0

Lys Alá

Glu Asp

Thr Val -35

Thr Val

Glu Asn Val -30

Leu Lys Gin Asn Glu Leu Gin Tyr Lys Val Leu Ile Ser Asn Leu Arg -25 -20 -15

-198• A

·· «·

Asn

Val

Val -10

Glu

Alá Gin

Phe Asp -5

Ser Arg Val Arg

Alá 1

Thr

Gly

His

Ser

Gyr

Glu

Lys

Tyr

Asn

Lys

Trp

Glu

Thr

Ile

Glu

Alá

Trp

Thr

Gin

5

10

15

20

Gin

Val

Alá

Thr

Glu

Asn

Pro

Alá

Leu

Ile

Ser

Arg

Ser

Val

Ile

Gly

25

30

35

Thr

Thr

Phe

Glu

Gly

Arg

Alá

Ile

Tyr

Leu

Leu

Lys

Val

Gly

Lys

Alá

40

45

50

Gly

Gin

Asn

Lys

Pro

Alá

Ile

Phe

Met

Asp

Cys

Gly

Phe

His

Alá

Arg

55

60

65

Glu

Trp

Ile

Ser

Pro

Alá

Phe

Cys

Gin

Trp

Phe

Val

Arg

Glu

Alá

Val

70

75

80

Arg

Thr

Tyr

Gly

Arg

Glu

Ile

Gin

Val

Thr

Glu

Leu

Leu

Asp

Lys

Leu

85

90

95

100

Asp

Phe

Tyr

Val

Leu

Pro

Val

Leu

Asn

Ile

Asp

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Thr

105

110

115

Trp

Thr

Lys

Ser

Arg

Phe

Trp

Arg

Lys

Thr

Arg

Ser

Thr

H is Thr Gly

120

125

130

Ser

Ser

Cys

Ile

Gly

Thr

Asp

Pro

Asn

Arg

Asn

Phe

Asp

Alá

Gly

Trp

135

140

145

Cys

Glu

Ile

Gly

Alá

Ser

Arg

Asn

Pro

Cys

Asp

Glu

Thr

Tyr

Cys

Gly

150

155

160

Pro

Alá

Alá

Glu

Ser

Glu

Lys

Glu

Thr

Lys

Alá

Leu

Alá

Asp

Phe

Ile

165

170

175

180

Arg

Asn

Lys

Leu

Ser

Ser

Ile

Lys

Alá

Tyr

Leu

Thr

Ile

His

Ser

Tyr

185

190

195

Ser

Gin

Met

Met

Ile

Tyr

Pro

Tyr

Ser

Tyr

Alá

Tyr

Lys

Leu

Gly

Glu

200

205

210

Asn

Asn

Alá

Glu

Leu

Asn

Alá

Leu

Alá

Lys

Alá

Thr

Val

Lys

Glu

Leu

215

220

225

Alá

Ser

Leu

His

Gly

Thr

Lys

Tyr

Thr

Tyr

Gly

Pro

Gly

Alá

Thr

Thr

230

235

240

Ile

Tyr

Pro

Alá

Alá

Gly

Gly

Ser

Asp

Asp

Trp

Alá

Tyr

Asp

Gin

Gly

245

250

255

260

Ile

Arg

Tyr

Ser

Phe

Thr

Phe

Glu

Leu

Arg

Asp

Thr

Gly

Arg

Tyr

Gly

265 270 275

Phe Leu Leu Pro Glu Ser Gin Ile Arg Alá Thr Cys Glu Glu Thr Phe 280 285 290 • · · · • · · ·

-199-

Leu Alá He Lys Tyr Val Alá Ser Tyr Val Leu Glu His Leu Tyr Vég 295 300 305 307

58. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 35 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

GCCGGGTTTG CGCAACTGGT CACTCTTACG AGAAG

59. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 88 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

CCGGAATTCT TATTAGTTCA GGTCCTCCTCC AGAGATCAGC TTCTGCTCCT CGAACTCATG 60 GTGGTGATGG TGGTGGTACA GGTGTTCC 88

60. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 22 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

TTAGCGGATC CTGCCTGACG GT

61. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 23 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

GGCTGGATTC TCAGTGGCGA CTT

62. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 20 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú ···· · ·· · ··· · ···· ··· · • · · · · ·

-200(D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

ACCTCTAGGG TCCCCAATTA

63. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 23 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

CAAGTCGCCA CTGAGAATCC AGC

64. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 1053 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

ATG Met

AAA Lys

TAC Tyr -20

CTA Leu

TTG Leu

CCT Pro

ACG Thr

GCA Alá -15

GCC Alá

GCT Alá

GGA Gly

TTG Leu

TTA Leu -10

TTA Leu

CTC Leu

GCT Alá

48

GCC

CAA

CCA

GCC

ATG

GCG

GCA

ACT

GGT

CAC

TCT

TAC

GAG

AAG

TAC

AAC

96

Alá

Gin

Pro

Alá

Met

Alá

Alá

Thr

Gly

His

Ser

Tyr

Glu

Lys

Tyr

Asn

-5

-1

5

10

AAG

TGG

GAA

ACT

ATA

GAG

GCT

TGG

ACT

CAA

CAA

GTC

GCC

ACT

GAG

AAT

144

Lys

Trp

Glu

Thr

Ile

Glu

Alá

Trp

Thr

Gin

Gin

Val

Alá

Thr

Glu

Asn

15

20

25

CCA

GCC

CTC

ATC

TCT

CGC

AGT

GTT

ATC

GGA

ACC

ACA

TTT

GAG

GGA

CGC

192

Pro

Alá

Leu

Ile

Ser

Arg

Ser

Val

Ile

Gly

Thr

Thr

Phe

Glu

Tly

Arg

30

35

40

GCT.

ATT

TAC

CTC

CTG

AAG

GTT

GGC

AAA

GCT

GGA

CAA

AAT

AAG

CCT

GCC

240

Alá

Ile

Tyr

Leu

Leu

Lys

Val

Gly

Lys

Alá

Gly

Gin

Asn

Lys

Pro

Alá

45

50

55

ATT

TTC

ATG

GAC

TGT

GGT

TTC

CAT

GCC

AGA

GAG

TGG

ATT

TCT

CCT

GCA

288

Ile

Phe

Met

Asp

Cys

Gly

Phe

His

Alá

Arg

Glu

Trp

Ile

Ser

Pro

Alá

60

65

70

TTC

TGC

CAG

TGG

TTT

GTA

AGA

GAG

GCT

GTT

CGT

ACC

TAT

GGA

CGT

GAG

336

Phe

Cys

Gin

Trp

Phe

Val

Arg

Glu

Alá

Val

Arg

Thr

Tyr

Gly

Arg

Glu

75

80

85

90

• · · ·

-201-

• • ·

• · ·

• ·

•

ATC

CAA

GTG

ACA

GAG

CTT

CTC

GAC

AAG

TTA

GAC

TTT

TAT

GTC

CTG

CCT

384

Ile

Gin

Val

Thr

Glu 95

Leu

Leu

Asp

Lys

Leu 100

Asp

Phe

Tyr

Val

Leu 105

Pro

GTG

CTC

AAT

ATT

GAT

GGC

TAC

ATC

TAC

ACC

TGG

ACC

AAG

AGC

CGA

TTT

432

Val

Leu

Asn

Ile 110

Asp

Gly

Tyr

Ile

Tyr 115

Thr

Trp

Thr

Lys

Ser 120

Arg

Phe

TGG

AGA

AAG

ACT

CGC

TCC

ACC

CAT

ACT

GGA

TCT

AGC

TGC

ATT

GGC

ACA

480

Trp

Arg

Lys 125

Thr

Arg

Ser

Thr

His 130

Thr

Gly

Ser

Ser

Cys 135

Ile

Gly

Thr

GAC

CCC

AAC

AGA

AAT

TTT

GAT

GCT

GGT

TGG

TGT

GAA

ATT

GGA

GCC

TCT

528

Asp

Pro 140

Asn

Arg

Asn

Phe

Asp 145

Alá

Gly

Trp

Cys

Glu 150

Ile

Gly

Alá

Ser

CGA

AAC

CCC

TGT

GAT

GAA

ACT

TAC

TGT

GGA

CCT

GCC

GCA

GAG

TCT

GAA

576

Arg 155

Asn

Pro

Cys

Asp

Glu 160

Thr

Tyr

Cys

Gly

Pro 165

Alá

Alá

Glu

Ser

Glu 170

AAG

GAG

ACC

AAG

GCC

CTG

GCT

GAT

TTC

ATC

CGC

AAC

AAA

CTC

TCT

TCC

624

Lys

Glu

Thr

Lys

Alá 175

Leu

Alá

Asp

Phe

Ile 180

Arg

Asn

Lys

Leu

Ser 185

Ser

ATC

AAG

GCA

TAT

CTG

ACA

ATC

CAC

TCG

TAC

TCC

CAA

ATG

ATG

ATC

TAC

672

Ile

Lys

Alá

Tyr 190

Leu

Thr

Ile

His

Ser 195

Tyr

Ser

Gin

Met

Met 200

Ile

Tyr

CCT

TAC

TCA

TAT

GCT

TAC

AAA

CTC

GGT

GAG

AAC

AAT

GCT

GAG

TTG

AAT

720

Pro

Tyr

Ser 205

Tyr

Alá

Tyr

Lys

Leu 210

Gly

Glu

Asn

Asn

Alá 215

Glu

Leu

Asn

GCC

CTG

GCT

AAA

GCT

ACT

GTG

AAA

GAA

CTT

GCC

TCA

CTG

CAC

GGC

ACC

768

Alá

Leu 220

Alá

Lys

Alá

Thr

Val 225

Lys

Glu

Leu

Alá

Ser 230

Leu

His

Gly

Thr

AAG

TAC

ACA

TAT

GGC

CCG

GGA

GCT

ACA

ACA

ATC

TAT

CCT

GCT

GCT

GGG

816

Lys 235

Tyr

Thr

Tyr

Gly

Pro 240

Gly

Alá

Thr

Thr

Ile 245

Tyr

Pro

Alá

Alá

Gly 250

GGC

TCT

GAC

GAC

TGG

GCT

TAT

GAC

CAA

GGA

ATC

AGA

TAT

TCC

TTC

ACC

864

Gly

Ser

Asp

Asp

Trp 255

Alá

Tyr

Aső

Gin

Gly 260

Ile

Arg

Tyr

Ser

Phe 265

Thr

TTT

GAA

CTT

CGA

GAT

ACA

GGC

AGA

TAT

GGC

TTT

CTC

CTT

CCA

GAA

TCC

912

Phe

Glu

Leu

Arg 270

Asp

Thr

Gly

Arg

Tyr 275

Gly

Phe

Leu

Leu

Pro 280

Glu

Ser

CAG

ATC

CGG

GCT

ACC

TGC

GAG

GAG

ACC

TTC

CTG

GCA

ATC

AAG

TAT

GTT

960

Gin

Ile

Arg 285

Alá

Thr

Cys

Glu

Glu 290

Thr

Phe

Leu

Alá

Ile 295

Lys

Tyr

Val

GCC

AGC

TAC

GTC

CTG

GAA

CAC

CTG

TAC

CAC

CAC

CAT

CAC

CAC

CAT

GAG

1008

Alá

Ser 300

Tyr

Val

Leu

Glu

His 305

Leu

Tyr

His

His

His 310

His

His

His

His

Glu

-202TTC GAG GAG CAG AAG CTG ATC TCT GAG GAG GAC CTG AAC TAA TAA 1053

Phe Glu Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Vég Vég

315 320 325 327

65. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 31 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

GTTATTACTC GCTGCCCAAC CAGCCATGGC G

66. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 41 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

CTCTAGGAAT TCTTATTAGT ACAGGTGTTC CAGGACGTAG C

67. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) (B) (C) (D)

hossz: 999 bázis típus: nukleinsav

száltípus: topológia:

egyszálú lineáris

(xi)

i A szekvencia leírása:

ATG

AAA

TAC CTA TTG

CCT ACG GCA

GCC

GCT

GGA

TTG

TTA

TTA

CTC

GCT

48

Met

Lys

Tyr Leu Leu -20

Pro Thr Alá -15

Alá

Alá

Gly

Leu

Leu -10

Leu

Leu

Alá

GCC

CAA

CCA GCC ATG

GCG GCA ACT

GGT

CAC

TCT

TAC

GAG

AAG

TAC

AAC

96

Alá

Gin -5 ,

Pro Alá Met

Alá Alá Thr 1

Gly

His

Ser 5

Tyr

Glu

Lys

Tyr

Asn 10

AAG

TGG

GAA ACT ATA

GAG GCT TGG

ACT

CAA

CAA

GTC

GCC

ACT

GAG

AAT

144

Lys

Trp

Glu Thr Ile 15

Glu Alá Trp

Thr

Gin 20

Gin

Val

Alá

Thr

Glu 25

Asn

CCA

GCC

CTC ATC TCT

CGC AGT GTT

ATC

GGA

ACC

ACA

TTT

GAG

GGA

CGC

192

Pro

Alá

Leu Ile Ser 30

Arg Ser Val

Ile 35

Gly

Thr

Thr

Phe

Glu 40

Gly

Arg

GCT

ATT

TAC CTC CTG

AAG GTT GGC

AAA

GCT

GGA

CAA

AAT

AAG

CCT

GCC

240

Alá

Ile

Tyr Leu Leu 45

Lys Val Gly 50

Lys

Alá

Gly

Gin

Asn 55

Lys

Pro

Alá

• · · · • · · · · * · ·· ··· ·· ·· ·

-2 03-

ATT Ile

TTC Phe 60

ATG Met

GAC Asp

TGT Cys

GGT Gly

TTC Phe 65

CAT His

GCC Alá

AGA Arg

GAG Glu

TGG Trp 70

ATT Ile

TCT Ser

CCT Pro

GCA Alá

288

TTC

TGC

CAG

TGG

TTT

GTA

AGA

GAG

GCT

GTT

CGT

ACC

TAT

GGA

CGT

GAG

336

Phe

Cys

Gin

Trp

Phe

Val

Arg

Glu

Alá

Val

Arg

Thr

Tyr

Gly

Arg

Glu

75

80

85

90

ATC

CAA

GTG

ACA

GAG

CTT

CTC

GAC

AAG

TTA

GAC

TTT

TAT

GTC

CTG

CCT

384

Ile

Gin

Val

Thr

Glu

Leu

Leu

Asp

Lys

Leu

Asp

Phe

Tyr

Val

Leu

Pro

95

100

105

GTG

CTC

AAT

ATT

GAT

GGC

TAC

ATC

TAC

ACC

TGG

ACC

AAG

AGC

CGA

TTT

432

Val

Leu

Asn

Ile

Asp

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Thr

Trp

Thr

Lys

Ser

Arg

Phe

110

115

120

TGG

AGA

AAG

ACT

CGC

TCC

ACC

CAT

ACT

GGA

TCT

AGC

TGC

ATT

GGC

ACA

480

Trp

Arg

Lys

Thr

Arg

Ser

Thr

His

Thr

Gly

Ser

Ser

Cys

Ile

Gly

Thr

125

130

135

GAC

CCC

AAC

AGA

AAT

TTT

GAT

GCT

GGT

TGG

TGT

GAA

ATT

GGA

GCC

TCT

528

Asp

Pro

Asn

Arg

Asn

Phe

Asp

Alá

Gly

Trp

Cys

Glu

Ile

Gly

Alá

Ser

140

145

150

CGA

AAC

CCC

TGT

GAT

GAA

ACT

TAC

TGT

GGA

CCT

GCC

GCA

GAG

TCT

GAA

576

Arg

Asn

Pro

Cys

Asp

Glu

Thr

Tyr

Cys

Gly

Pro

Alá

Alá

Glu

Ser

Glu

155

160

165

170

AAG

GAG

ACC

AAG

GCC

CTG

GCT

GAT

TTC

ATC

CGC

AAC

AAA

CTC

TCT

TCC

524

Lys

Glu

Thr

Lys

Alá

Leu

Alá

Asp

Phe

Ile

Arg

Asn

Lys

Leu

Ser

Ser

175

180

185

ATC

AAG

GCA

TAT

CTG

ACA

ATC

CAC

TCG

TAC

TCC

CAA

ATG

ATG

ATC

TAC

672

Ile

Lys

Alá

Tyr

Leu

Thr

Ile

His

Ser

Tyr

Ser

Gin

Met

Met

Ile

Tyr

190

195

200

CCT

TAC

TCA

TAT

GCT

TAC

AAA

CTC

GGT

GAG

AAC

AAT

GCT

GAG

TTG

AAT

720

Pro

Tyr

Ser

Tyr

Alá

Tyr

Lys

Leu

Gly

Glu

Asn

Asn

Alá

Glu

Leu

Asn

205

210

215

GCC

CTG

GCT

AAA

GCT

ACT

GTG

AAA

GAA

CTT

GCC

TCA

CTG

CAC

GGC

ACC

768

Alá

Leu

Alá

Lys

Alá

Thr

Val

Lys

Glu

Leu

Alá

Ser

Leu

His

Gly

Thr

220

225

230

AAG

TAC

ACA

TAT

GGC

CCG

GGA

GCT

ACA

ACA

ATC

,TAT

CCT

GCT

GCT

GGG

816

Lys

Tyr

Thr

Tyr

Gly

Pro

Gly

Alá

Thr

Thr

Ile

Tyr

Pro

Alá

Alá

Gly

235

240

245

250

GGC

TCT

GAC

GAC

TGG

GCT

TAT

GAC

CAA

GGA

ATC

AGA

TAT

TCC

TTC

ACC

864

Gly

Ser

Asp

Asp

Trp

Alá

Tyr

Asp

Gin

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ser

Phe

Thr

255

260

265

TTT

GAA

CTT

CGA

GAT

ACA

GGC

AGA

TAT

GGC

TTT

CTC

CTT

CCA

GAA

TCC

912

Phe

Glu

Leu

Arg

Asp

Thr

Gly

Arg

Tyr

Gly

Phe

Leu

Leu

Pro

Glu

Ser

270

275

280

-204-

CAG ATC

CGG GCT ACC

TGC Cys

GAG Glu

GAG ACC

TTC CTG GCA ATC AAG

TAT Tyr

GTT Val

960

Gin

He

Arg Alá 285

Thr

Glu 290

Thr

Phe

Leu

Alá

He 295

Lys

GCC

AGC

TAC

GTC

CTG

GAA

CAC

CTG

TAC

TAA

TAA

GAA

TTC

999

Alá

Ser

Tyr

Val

Leu

Glu

His

Leu

Tyr

Vég

Vég

300

305

307

68. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 34 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

CCAACCAGCC ATGGCGCATC ATGGTGGTGA GCAC

69. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 23 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

GGCTGGATTC TCAGTGGCGA CTT

70. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 21 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

GGAGAAAGCC ATATCTGCCT G

71., szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 1284 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT 48

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Alá Alá Alá Gly Leu Leu Leu Leu Alá

-117 -115 -110 -105 • « · ·

GCC CAA Alá Gin -100

CCA Pro

GCC Alá

ATG Met

GCG Alá

CAT His -95

CAT His

GGT Gly

GGT Gly

GAG Glu

CAC His -90

TTT Phe

GAA Glu

GGC Gly

GAG Glu

96

AAG

GTG

TTC

CGT

GTT

AAC

GTT

GAA

GAT

GAA

AAT

CAC

ATT

AAC

ATA

ATC

144

Lys

Val

Phe

Arg

Val

Asn

Val

Glu

Asp

Glu

Asn

His

Ile

Asn

Ile

Ile

-85

-80

-75

-70

CGC

GAG

TGG

GCC

AGC

ACG

ACC

CAG

ATT

GAC

TTC

TGG

AAG

CCA

GAT

TCT

192

Arg

Glu

Leu

Alá

Ser

Thr

Thr

Gin

Ile

Asp

Phe

Trp

Lys

Pro

Asp

Ser

-65

-60

-55

GTC

ACA

CAA

ATC

AAA

CCT

CAC

AGT

ACA

GTT

GAC

TTC

CGT

GTT

AAA

GCA

240

Val

Thr

Gin

Ile

Lys

Pro

His

Ser

Thr

Val

Asp

Phe

Arg

Val

Lys

Alá

-50

-45

-40

GAA

GAT

ACT

GTC

ACT

GTG

GAG

AAT

GTT

CTA

AAG

CAG

AAT

GAA

CTA

CAA

288

Glu

Asp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asn

Val

Leu

Lys

Gin

Asn

Glu

Leu

Gin

-35

-30

-25

TAC

AAG

GTA

CTG

ATA

AGC

AAC

CTG

AGA

AAT

GTG

GTG

GAG

GCT

CAG

TTT

336

Tyr

Lys

Val

Leu

Ile

Ser

Asn

Leu

Arg

Asn

Val

Val

Glu

Alá

Gin

Phe

-20

-15

-10

GAT

AGC

CGG

GTT

CGT

GCA

ACA

GGA

CAC

AGT

TAT

GAG

AAG

TAC

AAC

AAG

384

Asp

Ser

Arg

Val

Arg

Alá

Thr

Gly

His

Ser

Tyr

Glu

Lys

Tyr

Asn

Lys

-5

1

5

10

TGG

GAA

ACG

ATA

GAG

GCT

TGG

ACT

CAA

CAA

GTC

GCC

ACT

GAG

AAT

CCA

432

Trp

Glu

Thr

Ile

Glu

Alá

Trp

Thr

Gin

Gin

Val

Alá

Thr

Glu

Asn

Pro

15

20

25

GCC

CTC

ATC

TCT

CGC

AGT

GTT

ATC

GGA

ACC

ACA

TTT

GAG

GGA

CGC

GCT

480

Alá

Leu

Ile

Ser

Arg

Ser

Val

Ile

Gly

Thr

Thr

Phe

Glu

Gly

Arg

Alá

30

35

40

ATT

TAC

CTC

CTG

AAG

GTT

GGC

AAA

GCT

GGA

CAA

AAT

AAG

CCT

GCC

ATT

528

Ile

Tyr

Leu

Leu

Lys

Val

Gly

Lys

Alá

Gly

Gin

Asn

Lys

Pro

Alá

Ile

45

50

55

TTC

ATG

GAC

TGT

GGT

TTC

CAT

GCC

AGA

GAG

TGG

ATT

TCT

CCT

GCA

TTC

576

Phe

Met

Asp

Cys

Gly

Phe

His

Alá

Arg

Glu

Trp

Ile

Ser

Pro

Alá

Phe

60

65

70

75

TGC

CAG

TGG

TTT,

GTA

AGA

GAG

GCT

GTT

CGT

ACC

TAT

GGA

CGT

GAG

ATC

624

Cys

Gin

Trp

Phe

Val

Arg

Glu

Alá

Val

Arg

Thr

Tyr

Gly

Arg

Glu

Ile

80

85

90

CAA

CTG

ACA

GAG

CTT

CTC

GAC

AAG

TTA

GAC

TTT

TAT

GTC

CTG

CCT

GTG

672

Gin

Val

Thr

Glu

Leu

Leu

Asp

Lys

Leu

Asp

Phe

Tyr

Val

Leu

Pro

Val

95

100

105

CTC

AAT

ATT

GAT

GGC

TAC

ATC

TAC

ACC

TGG

ACC

AAG

AGC

CGA

TTT

TGG

720

Leu

Asn

Ile

Asp

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Thr

Trp

Thr

Lys

Ser

Arg

Phe

Trp

110

115

120

-206-

AGA Arg

AAG Lys 125

ACT Thr

CGC Arg

TCC ACC

CAT ACT

GGA TCT

AGC Ser

TGC Cys 135

ATT Ile

GGC Gly

ACA Thr

GAC Asp

768

Ser

Thr

His 130

Thr

Gly

Ser

CCC

AAC

AGA

AAT

TTT

GAT

GCT

GGT

TGG

TGT

GAA

ATT

GGA

GCC

TCT

CGA

816

Pro

Asn

Arg

Asn

Phe

Asp

Alá

Gly

Trp

Cys

Glu

Ile

Gly

Alá

Ser

Arg

140

145

150

155

AAC

CCC

TGT

GAT

GAA

ACT

TAC

TGT

GGA

CCT

GCC

GCA

GAG

TCT

GAA

AAG

864

Asn

Pro

Cys

Asp

Glu

Thr

Tyr

Cys

Gly

Pro

Alá

Alá

Glu

Ser

Glu

Lys

160

165

170

GAG

ACC

AAG

GCC

CTG

GCT

GAT

TTC

ATC

CGC

AAC

AAA

CTC

TCT

TCC

ATC

912

Glu

Thr

Lys

Alá

Leu

Alá

Asp

Phe

Ile

Arg

Asn

Lys

Leu

Ser

Ser

Ile

175

180

185

AAG

GCA

TAT

CTG

ACA

ATC

CAC

TCG

TAC

TCC

CAA

ATG

ATG

ATC

TAC

CCT

960

Lys

Alá

Tyr

Leu

Thr

Ile

His

Ser

Tyr

Ser

Gin

Met

Met

Ile

Tyr

Pro

190

195

200

TAC

TCA

TAT

GCT

TAC

AAA

CTC

GGT

GAG

AAC

AAT

GCT

GAG

TTG

AAT

GCC

1008

Tyr

Ser

Tyr

Alá

Tyr

Lys

Leu

Gly

Glu

Asn

Asn

Alá

Glu

Leu

Asn

Alá

205

210

215

CTG

GCT

AAA

GCT

ACT

GTG

AAA

GAA

CTT

GCC

TCA

CTG

CAC

GGC

ACC

AAG

1056

Leu

Alá

Lys

Alá

Thr

Val

Lys

Glu

Leu

Alá

Ser

Leu

His

Gly

Thr

Lys

220

225

230

235

TAC

ACA

TAT

GGC

CCG

GGA

GCT

ACA

ACA

ATC

TAT

CCT

GCT

GCT

GGG

GGC

1104

Tyr

Thr

Tyr

Gly

Pro

Gly

Alá

Thr

Thr

Ile

Tyr

Pro

Alá

Alá

Gly

Gly

240

245

250

TCT

GAC

GAC

TGG

GCT

TAT

GAC

CAA

GGA

ATC

AGA

TAT

TCC

TTC

ACC

TTT

1152

Ser

Asp

Asp

Trp

Alá

Tyr

Asp

Gin

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ser

Phe

Thr

Phe

255

260

265

GAA

CTT

CGA

GAT

ACA

GGC

AGA

TAT

GGC

TTT

CTC

CTT

CCA

GAA

TCC

CAG

1200

Glu

Leu

Arg

Asp

Thr

Gly

Arg

Tyr

Gly

Phe

Leu

Leu

Pro

Glu

Ser

Gin

270

275

280

ATC

CGG

GCT

ACC

TGC

GAG

GAG

ACC

TTC

CTG

GCA

ATC

AAG

TAT

GTT

GCC

1248

Ile

Arg

Alá

Thr

Cys

Glu

Glu

Thr

Phe

Leu

Alá

Ile

Lys

Tyr

Val

Alá

285

290

295

AGC

TAC

GTC

CTG

GAA

CAC

CTG

TAC

TAA

TAA

GAA

TTC

1284

Ser

Tyr

Val

Leu

Glu

His

Leu

Tyr

Vég

Vég

300

305

307

72. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 25 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

-207GGTCATAAGC CCAGTCTTTA GAGCC

73. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 27 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

CCTGCTGCTG GGGGCTCTAA AGACTGG

74. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 1059 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

ATG Met

AAA Lys

TAC Tyr -20

CTA Leu

TTG Leu

CCT Pro

ACG Thr

GCA Alá -15

GCC Alá

GCT Alá

GGA Gly

TTG Leu

TTA Leu -10

TTA Leu

CTC Leu

GCT Alá

48

GCC

CAA

CCA

GCC

ATG

GCG

GCA

ACT

GGT

CAC

TCT

TAC

GAG

AAG

TAC

AAC

96

Alá

Gin

Pro

Alá

Met

Alá

Alá

Thr

Gly

His

Ser

Tyr

Glu

Lys

Tyr

Asn

-5

1

5

10

AAG

TGG

GAA

ACT

ATA

GAG

GCT

TGG

ACT

CAA

CAA

GTC

GCC

ACT

GAG

AAT

144

Lys

Trp

Glu

Thr

He

Glu

Alá

Trp

Thr

Gin

Gin

Val

Alá

Thr

Glu

Asn

15

20

25

CCA

GCC

CTC

ATC

TCT

CGC

AGT

GTT

ATC

GGA

CCC

ACA

TTT

GAG

GGA

CGC

192

Pro

Alá

Leu

He

Ser

Arg

Ser

Val

He

Gly

Thr

Thr

Phe

Glu

Gly

Arg

30

35

40

GCT

ATT

TAC

CTC

CTG

AAG

GTT

GGC

AAA

GCT

GGA

CAA

AAT

AAG

CCT

GCC

240

Alá

He

Tyr

Leu

Leu

Lys

Val

Gly

Lys

Alá

Gly

Gin

Asn

Lys

Pro

Alá

45

50

55

ATT

TTC

ATG

GÁC

TGT

GGT

TTC

CAT

GCC

AGA

GAG

TGG

ATT'

TCT

CCT

GCA

288

He

Phe

Met

Asp

Cys

Gly

Phe

His

Alá

Arg

Glu

Trp

He

Ser

Pro

Alá

60

65

70

TTC

TGC

CAG

TGG

TTT

GTA

AGA

GAG

GCT

GTT

CGT

ACC

TAT

GGA

CGT

GAG

336

Phe

Cys

Gin

Trp

Phe

Val

Arg

Glu

Alá

Val

Arg

Thr

Tyr

Gly

Arg

Glu

75

80

85

90

ATC

CAA

GTG

ACA

GAG

CTT

CTC

GAC

AAG

TTA

GAC

TTT

TAT

GTC

CTG

CCT

384

He

Gin

Val

Thr

Glu

Leu

Leu

Asp

Lys

Leu

Asp

Phe

Tyr

Val

Leu

Pro

100 105

-208-

GTG CTC AAT ATT

GAT Asp

GGC Gly

TAC Tyr

ATC Ile

TAC Tyr 115

ACC Thr

TGG ACC

AAG Lys

AGC Ser 120

CGA Arg

TTT Phe

432

Val

Leu Asn

Ile 110

Trp

Thr

TGG

AGA

AAG

ACT

CGC

TCC

ACC

CAT

ACT

GGA

TCT

AGC

TGC

ATT

GGC

ACA

480

Trp

Arg

Lys

Thr

Arg

Ser

Thr

His

Thr

Gly

Ser

Ser

Cys

Ile

Gly

Thr

125

130

135

GAC

CCC

AAC

AGA

AAT

TTT

GAT

GCT

GGT

TGG

TGT

GAA

ATT

GGA

GCC

TCT

528

Asp

Pro

Asn

Arg

Asn

Phe

Asp

Alá

Gly

Trp

Cys

Glu

Ile

Gly

Alá

Ser

140

145

150

CGA

AAC

CCC

TGT

GAT

GAA

ACT

TAC

TGT

GGA

CCT

GCC

GCA

GAG

TCT

GAA

576

Arg

Asn

Pro

Cys

Asp

Glu

Thr

Tyr

Cys

Gly

Pro

Alá

Alá

Glu

Ser

Glu

155

160

165

170

AAG

GAG

ACC

AAG

GCC

CTG

GCT

GAT

TTC

ATC

CGC

AAC

AAA

CTC

TCT

TCC

624

Lys

Glu

Thr

Lys

Alá

Leu

Alá

Asp

Phe

Ile

Arg

Asn

Lys

Leu

Ser

Ser

175

180

185

ATC

AAG

GCA

TAT

CTG

ACA

ATC

CAC

TCG

TAC

TCC

CAA

ATG

ATG

ATC

TAC

672

Ile

Lys

Alá

Tyr

Leu

Thr

Ile

His

Ser

Tyr

Ser

Gin

Met

Met

I le

Tyr

190

195

200

CCT

TAC

TCA

TAT

GCT

TAC

AAA

CTC

GGT

GAG

AAC

AAT

GCT

GAG

TTG

AAT

720

Pro

Tyr

Ser

Tyr

Alá

Tyr

Lys

Leu

Gly

Glu

Asn

Asn

Alá

Glu

Leu

Asn

205

210

215

GCC

CTG

GCT

AAA

GCT

ACT

GTG

AAA

GAA

CTT

GCC

TCA

CTG

CAC

GGC

ACC

768

Alá

Leu

Alá

Lys

Alá

Thr

Val

Lys

Glu

Leu

Alá

Ser

Leu

His

Gly

Thr

220

225

230

AAG

TAC

ACA

TAT

GGC

CCG

GGA

GCT

ACA

ACA

ATC

TAT

CCT

GCT

GCT

GGG

816

Lys

Tyr

Thr

Tyr

Gly

Pro

Gly

Alá

Thr

Thr

Ile

Tyr

Pro

Alá

Alá

Gly

235

240

245

250

GGC

TCT

AAA

GAC

TGG

GCT

TAT

GAC

CAA

GGA

ATC

AGA

TAT

TCC

TTC

ACC

864

Gly

Ser

Lys

Asp

Trp

Alá

Tyr

Asp

Gin

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ser

Phe

Thr

255

260

265

TTT

GAA

CTT

CGA

GAT

ACA

GGC

AGA

TAT

GGC

TTT

CTC

CTT

CCA

GAA

TCC

912

Phe

Glu

Leu

Arg

Asp

Thr

Gly

Arg

Tyr

Gly

Phe

Leu

Leu

Pro

Glu

Ser

270

275

280

CAG

ATC

CGG

GCT

ACC

TGC

GAG

GAG

ACC

TTC

CTG

GCA

ATC

AAG

TAT

GTT

960

Gin

Ile

Arg

Alá

Thr

Cys

Glu

Glu

Thr

Phe

Leu

Alá

Ile

'Lys

Tyr

Val

285

290

295

GCC

AGC

TAC

GTC

CTG

GAA

CAC

CTG

TAC

CAC

CAC

CAT

CAC

CAC

CAT

GAG

1008

Alá

Ser

Tyr

Val

Leu

Glu

His

Leu

Tyr

His

His

His

His

His

His

Glu

300

305

310

TTC

GAG

GAG

CAG

AAG

CTG

ATC

TCT

GAG

GAG

GAC

CTG

AAC

TAA

TAA

GAA

1056

Phe

Glu

Glu

Gin

Lys

Leu

Ile

Ser

Glu

Glu

Asp

Leu

Asn

Vég

Vég

315

320

325

327

TTC

1059

-20975. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 25 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

GGTCATAAGC CCAGTCGCGA GAGCC

76. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 27 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

CCTGCTGCTG GGGGCTCTCG CGACTGG

77. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 1059 bázis (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása:

ATG Met

AAA Lys

TAC Tyr -20

CTA Leu

TTG Leu

CCT Pro

ACG Thr

GCA Alá -15

GCC Alá

GCT Alá

GGA Gly

TTG Leu

TTA Leu -10

TTA Leu

CTC Leu

GCT Alá

48

GCC

CAA

CCA

GCC

ATG

GCG

GCA

ACT

GGT

CAC

TCT

TAC

GAG

AAG

TAC

AAC

96

Alá

Gin -5

Pro

Alá

Met

Alá

Alá 1

Thr

Gly

His

Ser 5

Tyr

Glu

Lys

Tyr

Asn 10

AAG

TGG

GAA

ACT

ATA

GAG

GCT

TGG

ACT

CAA

CAA

GTC

GCC

ACT

GAG

AAT

144

Lys

Trp

Glu

Thr

He 15

Glu

Alá

Trp

Thr

Gin 20

Gin

Val

Alá

Thr

Glu 25

Asn

CCA

GCC

CTC

ATC

TCT

CGC

AGT

GTT

ATC

GGA

ACC

ACA

TTT

GAG

GGA

CGC

192

Pro

Alá

Leu

He 30

Ser

Arg

Ser

Val

He 35

Gly

Thr

Thr

Phe

Glu 40

Gly

Arg

GCT

ATT

TAC

CTC

CTG

AAG

GTT

GGC

ATYA

GCT

GGA

CAA

AAT

AAG

CCT

GCC

240

Alá

He

Tyr 45

Leu

Leu

Lys

Val

Gly 50

Lys

Alá

Gly

Gin

Asn 55

Lys

Pro

Alá

ATT

TTC

ATG

GAC

TGT

GGT

TTC

CAT

GCC

AGA

GAG

TGG

ATT

TCT

CCT

GCA

288

He

Phe 60

Met

Asp

Cys

Gly

Phe 65

His

Alá

Arg

Glu

Trp 70

He

Ser

Pro

Alá

-210•«·« « ·· • · · ·

TTC Phe 75

TGC Cys

CAG TGG

TTT Phe

GTA Val 80

AGA Arg

GAG Glu

GCT Alá

GTT Val

CGT Arg 85

ACC Thr

TAT Tyr

GGA Gly

CGT Arg

GAG Glu 90

336

Gin

Trp

ATC

CAA

GTG

ACA

GAG

CTT

CTC

GAC

AAG

TTA

GAC

TTT

TAT

GTC

CTG

CCT

384

Ile

Gin

Val

Thr

Glu 95

Leu

Leu

Asp

Lys

Leu 100

Asp

Phe

Tyr

Val

Leu 105

Pro

GTG

CTC

AAT

ATT

GAT

GGC

TAC

ATC

TAC

ACC

TGG

ACC

AAG

AGC

CGA

TTT

432

Val

Leu

Asn

Ile Asp 110

Gly

Tyr

Ile

Tyr Thr 115

Trp

Thr

Lys

Ser Arg 120

Phe

TGG

AGA

AAG

ACT

CGC

TCC

ACC

CAT

ACT

GGA

TCT

AGC

TGC

ATT

GGC

ACA

480

Trp

Arg

Lys 125

Thr

Arg

Ser

Thr

His 130

Thr

Gly

Ser

Ser

Cys 135

Ile

Gly

Thr

GAC

CCC

AAC

AGA

AAT

TTT

GAT

GCT

GGT

TGG

TGT

GAA

ATT

GGA

GCC

TCT

528

Asp

Pro 140

Asn

Arg

Asn

Phe

Asp 145

Alá

Gly

Trp

Cys

Glu 150

Ile

Gly

Alá

Ser

CGA

AAC

CCC

TGT

GAT

GAA

ACT

TAC

TGT

GGA

CCT

GCC

GCA

GAG

TCT

GAA

576

Arg 155

Asn

Pro

Cys

Asp

Glu 160

Thr

Tyr

Cys

Gly

Pro 165

Alá

Alá

Glu

Ser

Glu 170

AAG

GAG

ACC

AAG

GCC

CTG

GCT

GAT

TTC

ATC

CGC

AAC

AAA

CTC

TCT

TCC

624

Lys

Glu

Thr

Lys

Alá 175

Leu

Alá

Asp

Phe

Ile 180

Arg

Asn

Lys

Leu

Ser 185

Ser

ATC

AAG

GCA

TAT

CTG

ACA

ATC

CAC

TCG

TAC

TCC

CAA

ATG

ATG

ATC

TAC

672

Ile

Lys

Alá

Tyr 190

Leu

Thr

Ile

His

Ser 195

Tyr

Ser

Gin

Met

Met 200

Ile

Tyr

CCT

TAC

CTA

TAT

GCT

TAC

AAA

CTC

GGT

GAG

AAC

AAT

GCT

GAG

TTG

AAT

720

Pro

Tyr

Ser 205

Tyr

Alá

Tyr

Lys

Leu 210

Gly

Glu

Asn

Asn

Alá 215

Glu

Leu

Asn

GCC

CTG

GCT

AAA

GCT

ACT

GTG

AAA

GAA

CTT

GCC

TCA

CTG

CAC

GGC

ACC

768

Alá

Leu 220

Alá

Lys

Alá

Thr

Val 225

Lys

Glu

Leu

Alá

Ser 230

Leu

His

Gly

Thr

AAG

TAC

ACA

TAT

GGC

CCG

GGA

GCT

ACA

ACA

ATC

TAT

CCT

GCT

GCT

GGG

816

Lys 235

Tyr

Thr

Tyr

Gly

Pro 240

Gly

Alá

Thr

Thr

Ile 245

Tyr

Pro

Alá

Alá

Gly 250

GGC

TCT

CGC

GAC

TGG

GCT

TAT

GAC

CAA

GGA

ATC

AGA

TAT

TCC

TTC

ACC

864

Gly

Ser

Arg

Asp

Trp 255

Alá

Tyr

Asp

Gin

Gly 260

Ile

Arg

Tyr

Ser

Phe 265

Thr

TTT

GAA

CTT

CGA

GAT

ACA

GGC

AGA

TAT

GGC

TTT

CTC

CTT

CCA

GAA

TCC

912

Phe

Glu

Leu

Arg 270

Asp

Thr

Gly

Arg

Tyr 275

Gly

Phe

Leu

Leu

Pro 280

Glu

Ser

CAG

ATC

CGG

GCT

ACC

TGC

GAG

GAG

ACC

TTC

CTG

GCA

ATC

AAG

TAT

GTT

960

Gin

Ile

Arg 285

Alá

Thr

Cys

Glu

Glu 290

Thr

Phe

Leu

Alá

Ile 295

Lys

Tyr

Val

··· *

-211-

e ·

• « ·

• ·

• ·

GCC

AGC

TAC

GTC

CTG

GAA

CAC

CTG

TAC CAC

CAC

CAT

CAC

CAC

CAT

GAG

1008

Alá

Ser

Tyr

Val

Leu

Glu

His

Leu

Tyr His

His

His

His

His

His

Glu

300

305

310

TTC

GAG

GAG

CAG

AAG

CTG

ATC

TCT

GAG GAG

GAC

CTG

AAC

TAA

TAA

GAA

1056

Phe

Glu

Glu

Gin

Lys

Leu

Ile

Ser

Glu Glu

Asp

Leu

Asn

Vég

Vég

315

320

325

327

TTC

1059

Claims (17)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Illesztett kétkomponensű rendszer gazdaszervezet kezelésére, ahol (i) az első komponens egy tumorhoz társult antigénhez kötődni képes célzó egység, az előgyógyszert antineoplasztikus gyógyszerré alakítani képes mutáns enzimhez kapcsolt állapotban, és (ii) a második komponens az enzim hatására antineoplasztikus gyógyszerré alakuló előgyógyszer, azzal jellemezve, hogy

   - a mutáns enzim egy, a természetes szubsztrátumát ionpár-kölcsönhatás révén felismerő természetes gazda-enzim olyan mutánssá alakított formája, ahol a mutáns enzim és a komplementer előgyógyszer kialakítása során ez a kölcsönhatás meg van fordítva (fordított polaritás),

   - az első komponens a gazdaszervezetre nézve lényegében nem immunogén, és

   - a második (előgyógyszer) komponens olyan anyag, amit a természetes, mutánssá nem alakított gazda-enzim nem képes jelentős mértékben antineoplasztikus gyógyszerré alakítani a gazdaszervezetben.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti rendszer, azzal jellemezve, hogy az első komponensben szereplő mutáns enzim a kezelendő gazdaszervezet valamely enzimének a mutánsa.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti rendszer, azzal jellemezve, hogy a célzó egység egy antitest vagy egy antitest-fragmens.

   ···· » *· > ***;

   ···«*·· * · »< Μ · • · · · · · · «· ··· ·· * · ·

   -2134. A 3. igénypont szerinti rendszer, azzal jellemezve, hogy az antitest fragmens egy F(ab')₂ fragmens.

   5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti rend- szer, azzal jeli e m e z v e , hogy a mutáns enzim egy mu- táns ribonukleáz. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti rend- szer, azzal jeli e m e z v e , hogy a mutáns enzim a 66-os

   helyzetben negatív töltésű aminosavat tartalmazó humán ribonukleáz .
4. 7. A 6. igénypont szerinti rendszer, azzal jellemezve, hogy a 66-os helyzetben lévő negatív töltésű aminosav Glu.
5. 8. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti rendszer, azzal j ellemezve, hogy a mutáns enzim egy mutáns glükuronidáz.
6. 9. Az 1. igénypont szerinti második komponens, ami egy (1) általános képletű mustár-ribonukleotid - a képletben

   Q oxigénatomot vagy -NH- csoportot jelent,

   A egy -X-Y- képletű csoportot jelent, amelynek Y csoportja kapcsolódik a Q csoporthoz, és ebben a képletben

   Y -S0₂- vagy -CO- csoportot vagy vegyértékkötést jelent, azzal a feltétellel, hogy ha Q oxigénatomot jelent, akkor Y nem jelenthet -S0₂- csoportot, és

   X -(CH₂)_n- csoportot jelent, amelyben n értéke 1-4, és amelynek bármely szénatomjához adott esetben 1-4 szénatomos alkilszubsztituens kapcsolódhat, vagy ha Y -CO- csoportot jelent és n értéke 1, akkor az X csoport szénatomjához adott esetben szubsztituensként alanin-, Valin-, leucin-, izoleucin-, metionin-, fenilalanin-, tripto··« » fán-, szerin-, treonin-, cisztein-, aszparagin-, glutamin-, lizin-, arginin- vagy hisztidin-oldallánc kapcsolódhat,

   R¹ uracil- vagy citozincsoportot jelent,

   R és R egymástól függetlenül hidrogénatomot vagy 1-4 szénatomos alkilcsoportot jelent,

   R⁴ és R⁵ egymástól függetlenül klóratomot, mezilcsoportot vagy tozilcsoportot jelent, és

   7 8 9 10

   R , R, R és R egymástól függetlenül hidrogénatomot, 1-4 szénatomos alkilcsoportot, 1-4 szénatomos alkoxicsoportot, fluoratomot vagy klóratomot jelent -, vagy sója.
7. 10. A 9. igénypont szerinti mustár-ribonukleotidok amelyekben

   Q -NH- csoportot jelent,

   X -(CH₂)_n- csoportot jelent, ahol n értéke 1-4,

   Y -CO- csoportot jelent,

   R¹ uracil- vagy citozincsoportot jelent,

   2 3

   R es R hidrogénatomot jelent,

   R és R klóratomot jelent, és

   R⁷, R⁸, R⁹ és R¹⁰ hidrogénatomot jelent, és sóik.
8. 11. Az 1. igénypont szerinti rendszer második komponense, amely O-[ (2R, 3S,4R, 5R)-2-(2-amino-acetamido-metil)

   -5-(2,4-dioxo-l,2,3,4-tetrahidro-pirimidin-l-il)-4-hidroxi-2, 3, 4,5-tetrahidrofuran-3-il] -O-[ 4-(bisz/2-klór-etil/-amino)-fenoxi] -hidrogén-foszfát vagy sója.
9. 12. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve , hogy az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti első komponenst tartalmaz.

   -21513. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy az 1. és a 9-11. igénypontok bármelyike szerinti második komponenst tartalmaz.
10. 14. A 12-13. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény steril formában.
11. 15. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti első komponens.
12. 16. Az 1., 2., 5., 6., 7. és 8. igénypontok bármelyike szerinti mutáns enzim.
13. 17. Eljárás neoplasztikus sejtek növekedésének gátlására gazdaszervezetben, azzal jellemezve, hogy a gazdaszervezetnek az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti első komponens hatásos mennyiségét adjuk be, az első komponenst a gazdaszervezet általános keringéséből lényegében teljes métékben kiürülni hagyjuk, majd a gazdaszervezetnek az 1. és 9-11. igénypontok bármelyike szerinti második komponens hatásos mennyiségét adjuk be.
14. 18. Az NCIMB 40678 számon letétbe helyezett pQR162 plazmid.
15. 19. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti első komponenst vagy az 1., 2., 5., 6., 7. és 8. igénypontok bármelyike szerinti mutáns enzimet kódoló polinukleotid szekvencia .
16. 20. A 19. igénypont szerinti polinukleotidot tartalmazó vektor.
17. 21. A 19. igénypont szerinti polinukleotidot tartalmazó sejt.